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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】脂肪酸抱合体を有するポルフィリンナノ小胞
(51)【国際特許分類】
A61K 9/51 20060101AFI20240709BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20240709BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240709BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240709BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20240709BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240709BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20240709BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240709BHJP
A61K 51/04 20060101ALI20240709BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20240709BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
A61K9/51
A61K47/28
A61K47/34
A61K47/24
A61K47/22
A61K47/18
A61K41/00
A61P35/00
A61K51/04 100
A61K49/00
A61K9/127
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024501955
(86)(22)【出願日】2022-07-12
(85)【翻訳文提出日】2024-03-07
(86)【国際出願番号】 CA2022051087
(87)【国際公開番号】W WO2023283732
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】63/221,212
(32)【優先日】2021-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507148294
【氏名又は名称】ユニバーシティー ヘルス ネットワーク
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ガーン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ジュアン
(72)【発明者】
【氏名】ホー，ティファニー
(72)【発明者】
【氏名】ブー，ジアチュアン
(72)【発明者】
【氏名】ディング，リリ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC27
4C076CC29
4C076DD51
4C076DD52
4C076DD60
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE23F
4C076FF31
4C076FF68
4C084AA11
4C084AA12
4C084MA05
4C084MA24
4C084MA41
4C084MA66
4C084NA10
4C084NA11
4C084NA12
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC781
4C084ZC782
4C085HH03
4C085HH11
4C085JJ03
4C085JJ05
4C085KA07
4C085KA09
4C085KA16
4C085KA27
4C085KA29
4C085KB46
4C085KB56
4C085KB60
4C085KB65
4C085KB74
4C085LL18
(57)【要約】
ポルフィリン－リン脂質抱合体およびキレート剤－脂肪酸抱合体を含む二層ナノ小胞であって、キレート剤－脂肪酸抱合体が、一本鎖脂肪酸に結合されたアミノポリカルボン酸を含み、ポルフィリン－リン脂質抱合体が、好ましくはｓｎ－１またはｓｎ－２位で１つのリン脂質の脂質側鎖に共有結合された１つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む、二層ナノ小胞を本明細書において記載する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポルフィリン－リン脂質抱合体およびキレート剤－脂肪酸抱合体を含む二層ナノ小胞であって、前記キレート剤－脂肪酸抱合体が、一本鎖脂肪酸に結合されたアミノポリカルボン酸を含み、前記ポルフィリン－リン脂質抱合体が、好ましくはｓｎ－１またはｓｎ－２位で１つのリン脂質の脂質側鎖に共有結合された１つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む、二層ナノ小胞。
【請求項2】
前記アミノポリカルボン酸が、グリシネート、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ニコチアナミン、ＥＤＤＨＡ、またはＥＤＤＳである、請求項１に記載の二層ナノ小胞。
【請求項3】
前記アミノポリカルボン酸が、ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡである、請求項２に記載の二層ナノ小胞。
【請求項4】
前記一本鎖脂肪酸が、１０～２６個の炭素を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項5】
前記一本鎖脂肪酸が、１２～２２個の炭素を含む、請求項４に記載の二層ナノ小胞。
【請求項6】
前記一本鎖脂肪酸が、１４～１８個の炭素を含む、請求項５に記載の二層ナノ小胞。
【請求項7】
前記一本鎖脂肪酸が１６個の炭素を含む、請求項６に記載の二層ナノ小胞。
【請求項8】
前記一本鎖脂肪酸が、ヘキサデシルアミドである、請求項７に記載の二層ナノ小胞。
【請求項9】
前記キレート剤－脂肪酸抱合体が、ＥＤＴＡ－ヘキサデシルアミドまたはＤＴＰＡ－ヘキサデシルアミドである、請求項１に記載の二層ナノ小胞。
【請求項10】
１５％～６０％のキレート剤－脂肪酸抱合体を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項11】
２５％～５０％のキレート剤－脂肪酸抱合体を含む、請求項１０に記載の二層ナノ小胞。
【請求項12】
３０％～４０％のキレート剤－脂肪酸抱合体を含む、請求項１１に記載の二層ナノ小胞。
【請求項13】
約３０％のキレート剤－脂肪酸抱合体を含む、請求項１２に記載の二層ナノ小胞。
【請求項14】
１～６０モル％のポルフィリン－リン脂質抱合体を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項15】
２０～４０モル％のポルフィリン－リン脂質抱合体を含む、請求項１４に記載の二層ナノ小胞。
【請求項16】
約２７モル％のポルフィリン－リン脂質抱合体を含む、請求項１に記載の二層ナノ小胞。
【請求項17】
前記ポルフィリン－リン脂質抱合体中のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体が、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ピロフェオホルバイド、バクテリオクロロフィル、クロロフェルａ、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン、ロジン、ケトクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、ベンゾバクテリオクロリン、拡張ポルフィリンおよびポルフィリン異性体からなる群から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項18】
前記拡張ポルフィリンが、テキサフィリン、サフィリンまたはヘキサフィリンであり、前記ポルフィリン異性体が、ポルフィセン、反転ポルフィリン、フタロシアニン、またはナフタロシアニンである、請求項１７に記載の二層ナノ小胞。
【請求項19】
前記ポルフィリン－リン脂質抱合体中のリン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項20】
前記リン脂質が、１２～２２個の炭素のアシル側鎖を含む、請求項１９に記載の二層ナノ小胞。
【請求項21】
前記ポルフィリン－リン脂質抱合体中のポルフィリンが、ピロフェオホルバイド－ａ酸である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項22】
前記ポルフィリン－リン脂質抱合体中のポルフィリンが、バクテリオクロロフィル誘導体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項23】
前記ポルフィリン－リン脂質抱合体中のリン脂質が、１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンまたは１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項24】
前記ポルフィリン－リン脂質抱合体がｐｙｒｏ脂質である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項25】
前記ポルフィリン－リン脂質抱合体が、オキシ－バクテリオクロロフィル－脂質、テキサフィリン－リン脂質抱合体またはアザ－ホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）－リン脂質抱合体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項26】
前記ポルフィリンが、０～２０個の炭素の炭素鎖リンカーによってリン脂質上のグリセロール基に結合されている、請求項１～２３のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項27】
ＰＥＧ化乳化剤をさらに含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項28】
前記ＰＥＧ化乳化剤が、約１０００～約５０００の範囲の分子量を有する、請求項２７に記載の二層ナノ小胞。
【請求項29】
前記ＰＥＧ化乳化剤が、Ｎ－（メトキシポリエチレングリコール５０００カルバモイル）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ５０００－ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、ポリオキシエチレン４０ステアレート（ＰＥＧ４０Ｓ）およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２７に記載の二層ナノ小胞。
【請求項30】
ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質が、１～１０モル％の量で存在する、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項31】
ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質が、２～７モル％の量で存在する、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項32】
コレステロールをさらに含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項33】
前記二層ナノ小胞の残りの組成物が、コレステロールを実質的に含む、請求項３２に記載の二層ナノ小胞。
【請求項34】
前記コレステロールが、１～６０モル％の量で存在する、請求項３２に記載の二層ナノ小胞。
【請求項35】
実質的に球形である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項36】
直径が約７０～１２０ｎｍである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項37】
直径が約９０～１００ｎｍである、請求項３６に記載の二層ナノ小胞。
【請求項38】
前記ポルフィリン－リン脂質抱合体が、その中にキレートされた金属、任意選択により金属の放射性同位体を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞。
【請求項39】
緩衝液中の請求項１～３８のいずれか一項に記載の二層ナノ小胞を含む組成物。
【請求項40】
対象の標的領域に光線力学療法を実施する方法であって、ａ．請求項３９に記載の組成物を生成するステップと、
ｂ．前記組成物を前記対象に投与するステップと、
ｃ．前記標的領域を、前記組成物を励起してラジカルおよび／または活性酸素種を作製する波長の光で照射するステップと
を含む、方法。
【請求項41】
対象の標的領域をイメージングする方法であって、ａ．請求項３９に記載の組成物を生成するステップと、
ｂ．前記組成物を前記対象に投与するステップと、
ｃ．前記標的領域で蛍光または光音響シグナルを測定および／または検出するステップと
を含む、方法。
【請求項42】
対象に放射性同位体を輸送する方法であって、ａ．前記二層ナノ小胞がその中にキレートされた放射性同位体を有する、請求項３９に記載の組成物を生成するステップと、
ｂ．前記組成物を前記対象に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項43】
光線力学療法を実施するための請求項３９に記載の組成物の使用。
【請求項44】
イメージングを実施するための請求項３９に記載の組成物の使用。
【請求項45】
対象に放射性同位体を輸送するための請求項３９に記載の組成物の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２２１２１２号に対する優先権を主張するものである。
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２２１２１２号に対する優先権を主張するものである。
【0002】
本発明は、ポルフィリンおよび脂肪酸抱合体を含むナノ小胞ならびに前記ナノ小胞の使用方法に関する。
【背景技術】
【0003】
光線力学療法（ＰＤＴ）は、非毒性光感作物質と適当な波長の光との組合せを要し、酸素の存在下、細胞死および組織破壊のための活性酸素種を発生させる。ＰＤＴは、その二重選択性、腫瘍組織中の光感作物質の優先的蓄積、および光感作物質の活性化を局所領域に限定する標的領域へ空間的に集光された光のために、癌治療として魅力的である。ＰＤＴはまた、その低侵襲性、皆無かそれに近い瘢痕化、および必要に応じて同じ標的部位を複数回処置できることから、従来の癌治療を上回る多くの利点を提供する１－３。ほとんどの光感作物質は、腫瘍部位におけるその蓄積が治療のためのｄｒｕｇ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｒｖａｌ（ＤＬＩ）を誘導し、延長されたＤＬＩが細胞レベルの光感作物質（細胞－ＰＤＴ）の最適分布に使用される臨床レベルで全身投与される４。
【0004】
ポルフィリンは、自然界に存在する遍在化合物であり、光合成（クロロフィル）および酸素運搬（ヘム）などの多数の生物学的過程に関与する。ポルフィリンは、メチン架橋によって、その安定性および光学特性をもたらす環状構造に相互連結されたテトラピロール大員環である。ポルフィリンおよびその誘導体は、肺、食道、胆管、膀胱、卵巣、および子宮頸癌の治療のための有効なＰＤＴ剤として臨床的に承認された５－９。しかしながら、臨床上で使用される多くのポルフィリン系光感作物質は、低い化学的純度、弱い組織透過性、水準以下の腫瘍蓄積、および体液中にそれを凝集させて暗毒性および延長された光感受性をもたらす過剰な親油性など、その用途を制限する様々な欠点を持つ１０。
【0005】
ポルフィゾームは、よく特徴付けられ、生体適合性のある有機分子であり、ｉｎ ｖｉｖｏで酵素的に生分解性のポルフィリン－脂質で構成される自己組織化されたリポソーム様の二層ナノ小胞（約１００ｎｍの直径）である。１０００ｍｇ／ｋｇの用量のポルフィリン－脂質の投与は、マウスにおいて最小限の急性毒性を導き出した１１，１２。ポルフィゾームは、ナノ構造中に密集された高密度ポルフィリン光感作物質（＞８０，０００のポルフィリン／粒子）を含有し、結果として蛍光の「超高速」消光および一重項酸素の発生をもたらし１１、それによって極めて高い効率で特定の波長の光を熱に効果的に変換することができ、有機ナノ粒子において前例のない理想的な光熱および光音響特性が得られる。ポルフィゾームのナノ構造が解離すると、遊離ポルフィリンの蛍光および光活動性が回復し、低いバックグラウンド蛍光のイメージングおよび活性化可能な光線力学療法を可能にする。加えて、放射性同位体（例えば、６４Ｃｕ）または金属（例えば、マンガン）は、ポルフィリン環へロバストにキレート化することができ、それぞれ、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を可能にする１３－１５。結果として、ポルフィゾームの単純だがすべてを包含する性質は、マルチモーダルイメージングおよび治療のためのナノメディシン設計における新規のパラダイムを表す。
【0006】
ポルフィゾームは、光反応性消光条件で大量のポルフィリンを輸送し、優先的に蓄積し、最終的に腫瘍中で活性化させ、活性化が蛍光の非消光（unquenching）によって追跡され得るため、選択的ＰＤＴに潜在的によく適している１１。しかしながら、従来のポルフィゾームのＰＤＴ適用は、低速の細胞内取り込みおよび癌細胞中の無制御／予測不可の活性化によって制限され、標的部位内に局在する活性光感作物質の量に大きく依存する有効なＰＤＴに最適なＤＬＩを規定する上で課題が出てくる。したがって、有効なＰＤＴのためにポルフィゾームの腫瘍への蓄積および活性化を制御して誘発させるために積極的な試みを見つける必要がある。例えば、本発明者らは、葉酸共役ＰＳなどの活性標的を含むことが、３時間および２４時間のインキュベーション後のＫＢ細胞中のポルフィゾーム細胞内取り込みを有意に強化することができ、結果としてマウス腫瘍モデルにおいて有意に強化されたＰＤＴが得られたことを報告した１６。
【0007】
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、１９５３年以来、重金属中毒の治療に臨床上承認されてきた１７，１８。また、二価金属カチオンのキレート化が外因性の作用因子に対するグラム陰性菌の細胞壁の膜透過性を高めるため、様々な抗菌研究においても調査されてきた１９。加えて、ＥＤＴＡは、角膜、鼻、および腸上皮を通る薬物、タンパク質、およびペプチドの透過を促進する吸収促進剤と考えられる２０。これは、隣接する上皮細胞間の密着結合を一時的にゆるめることによって傍細胞透過性を改善するために使用されてきた２０。近年、ＥＤＴＡキレート化による療法も、心臓血管疾患、神経変性疾患、および癌の治療のために研究されている２１－２５。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
一態様において、ポルフィリン－リン脂質抱合体およびキレート剤－脂肪酸抱合体を含む二層ナノ小胞であって、キレート剤－脂肪酸抱合体が、一本鎖脂肪酸に結合されたアミノポリカルボン酸を含み、ポルフィリン－リン脂質抱合体が、好ましくはｓｎ－１またはｓｎ－２位で１つのリン脂質の脂質側鎖に共有結合された１つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む、二層ナノ小胞を提供する。
【0009】
一態様において、緩衝液中の本明細書に記載の二層ナノ小胞を含む組成物を提供する。
一態様において、対象の標的領域に光線力学療法を実施する方法であって、本明細書に記載の組成物を生成するステップと、組成物を対象に投与するステップと、標的領域を、組成物を励起してラジカルおよび／または活性酸素種を作製する波長の光で照射するステップとを含む、方法を提供する。
一態様において、対象の標的領域に光線力学療法を実施する方法であって、本明細書に記載の組成物を生成するステップと、組成物を対象に投与するステップと、標的領域を、組成物を励起してラジカルおよび／または活性酸素種を作製する波長の光で照射するステップとを含む、方法を提供する。
【0010】
一態様において、対象の標的領域をイメージングする方法であって、本明細書に記載の組成物を生成するステップと、組成物を対象に投与するステップと、標的領域で蛍光または光音響シグナルを測定および／または検出するステップとを含む、方法を提供する。
【0011】
一態様において、対象に放射性同位体を輸送する方法であって、二層ナノ小胞がその中にキレートされた放射性同位体を有する、本明細書に記載の組成物を生成するステップと、組成物を対象に投与するステップとを含む、方法を提供する。
【0012】
一態様において、光線力学療法を実施するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
一態様において、イメージングを実施するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
一態様において、イメージングを実施するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【0013】
一態様において、対象に放射性同位体を輸送するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
本発明の好ましい実施形態のこれらの特徴および他の特徴は、添付の図面が参照される以下の発明を実施するための形態においてより明らかになるであろう。
本発明の好ましい実施形態のこれらの特徴および他の特徴は、添付の図面が参照される以下の発明を実施するための形態においてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＥＤＴＡ－脂質ベースの新規ポルフィゾーム（ｅＮＰＳ）の概略図を示す。
【図2】Ａ）ＮＰＳの代表的なＴＥＭ画像、Ｂ）無傷のＮＰＳの吸収対破壊したＮＰＳの吸収、およびＣ）無傷のＮＰＳの蛍光発生対破壊したＮＰＳの蛍光発生を示す。
【図3】Ａ）蛍光顕微鏡画像およびＢ）細胞抽出後の定量的蛍光測定によって検出された、ＰＳと比較したｅＮＰＳ細胞内取り込みを示す。二元配置分散分析とボンフェローニ補正法を用いて有意差（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を決定した。
【図4】蛍光顕微鏡イメージングの下のＫＢ上皮細胞対正常線維芽細胞（ＮＦＢ）によるｅＮＰＳ取り込みを示す。
【図5】Ａ）ＤＴＰＡ－脂質Ｗ／Ｏ Ｇｄ３＋キレート化の化学構造およびそれらの対応するＴＥＭ画像、Ｂ）蛍光顕微鏡イメージング（スケールバー＝２０μｍ）によるｄＮＰＳ、ｅＮＰＳおよびＰＳの細胞内取り込みの比較、ならびにＣ）定量細胞取り込み分析を示す。二元配置分散分析とボンフェローニ補正法を用いて有意差（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）を決定した。
【図6】ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳ取り込みへの金属キレート化の効果を示す。Ａ）蛍光顕微鏡イメージングは、１ｍＭのＣａ２＋またはＭｇ２＋とのプレインキュベーションが、ＫＢ細胞中のｅＮＰＳ媒介による迅速な取り込みに影響しなかったことを明らかにした。Ｂ）Ｇｄ３＋キレート化は、ｄＮＰＳ取り込みに影響しなかった（ＤＰＳ対ＤＰＳ（Ｇｄ））。二元配置分散分析とボンフェローニ補正法を用いて有意差（＊ｐ＜０．０５）を決定した。
【図7】単一脂肪酸ＤＴＰＡ－脂質を様々な二重脂肪酸（double fatty acid）ＤＴＰＡ－脂質と置き換えることによるＮＰＳ取り込みへの脂質鎖の効果の調査を示す。Ａ）様々なＤＴＰＡ－脂質の化学構造およびこれらのＤＴＰＡ－脂質によって形成された対応するＮＰＳのＴＥＭ画像。Ｂ）ｄＮＰＳと比較した細胞内取り込み。
【図8】Ａ）ｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ～ＰＳの正規化された細胞取り込み、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、Ｂ）蛍光消光効率によって追跡した５０ｖｏｌ％のＦＢＳ中のｅＮＰＳ（ｎ＝３）、ＬＣ－ｅＮＰＳ（ｎ＝３）、およびＰＳ（ｎ＝３）の血清安定性を示す。
【図9】温度およびエネルギーに依存するＫＢ細胞中のｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの取り込みを示す。トランスフェリン（Ｔｆｎ）、ｅＮＰＳ、およびｄＮＰＳとインキュベートしたＫＢ細胞の蛍光顕微鏡画像：異なる温度で３時間、Ｂ）１時間、ＮａＮ３および２－ＤＧと共インキュベート。スケールバー＝２０μｍ。
【図10】Ａ）ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒおよびＢ）ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとの共インキュベーションによって共焦点顕微鏡の下、ＫＢ細胞上で調べたｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの細胞内局在性を示す。
【図11】種々の各時間分（３、６または２４時間）の５μＭのｅＮＰＳ、ＰＳ、およびＬＣ－ｅＮＰＳとのインキュベーションならびにそれに続く種々の線量の光照射の受光後のＫＢ細胞上でのｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＤＴ評価を示す。処置により光の線量は変動した。細胞の生存率をアラマーブルーアッセイによって評価した。
【図12】ＫＢ皮下マウスモデル上のｅＮＰＳ対ＰＳのｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを示す。
【図13】ＮＯＶＡＤＡＱ Ｐｉｎｐｏｉｎｔシステムによるハムスター頬の発癌モデル上のｅＮＰＳ対ＰＳの蛍光イメージングを示す。Ａ）時間依存蛍光画像、ならびにＢ）ｅＮＰＳおよびＰＳの腫瘍における時間による腫瘍蛍光強度追跡プロフィール。
【図14】ＥＤＴＡ－ヘキサデシルアミド（ＥＤＴＡ－脂質）の合成を示す。
【図15】３時間、６時間および２４時間のポストインキュベーションにおけるＰＳ、ｅＮＰＳ２およびｅＮＰＳ３（１μＭ）を含有するインキュベーション培地を除去した直後および３時間後および１８時間後の細胞の蛍光イメージングを示す。結果は、ポストインキュベーションの際にシグナル強調は出現せず、ｅＮＰＳが細胞内環境内で急速な活性化を経たことを示唆する。
【図16】高濃度のＥＤＴＡの共インキュベーションがＰＳの取り込みを増加できることを示す。結果は、ｅＮＰＳ媒介輸送の強化（図４）（５μＭのｅＮＰＳは、７μＭ以下のＥＤＴＡ－脂質を含有する）とは異なり、１ｍＭの遊離ＥＤＴＡは、ＰＳ取り込みに対して無視できるほどの効果しか示さなかった。
【図17】蛍光イメージングのために１ｍｏｌ％のポルフィリン脂質をドープしたリポソーム製剤中にＥＤＴＡ－脂質を混入させた場合、結果として得られた１％のｐｙｒｏ－ｅＮＰＳ（ｐｙｒｏ濃度に基づいて１μＭ）は、図４のＥＤＴＡ－脂質の混入においてｅＮＰＳが行ったものと同様の急速な取り込みを示したことを示す。ＥＤＴＡ－脂質は、１ｍｏｌ％のポルフィリン脂質を含有するリポソーム製剤中にＥＤＴＡ－脂質を混入させたとき、ナノ粒子の急速な取り込みを誘発させる上で同じ役割を果たす。
【図18】変動するｄｒｕｇ－ｌｉｇｈｔ－ｉｎｔｅｒｖａｌ（ＤＬＩ）におけるｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのｉｎ ｖｉｖｏのＰＤＴ効力の比較を示す。ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳ（３時間のＤＬＩ）は両方とも、ＰＳと比較して最大のｉｎ ｖｉｖｏのＰＤＴ効力を実証した。二元配置分散分析とテューキー事後検定を用いて、群間の有意差（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）を決定した。
【図19】注射後の様々な時点におけるｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのｉｎ ｖｉｖｏ蛍光活性化の比較を示す。ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳの両方は、ＰＳと比較して、すべての時点で最大のｉｎ ｖｉｖｏ蛍光活性化を実証した。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下の説明において、本発明の完全な理解が得られるように多数の具体的な詳細を記載する。しかしながら、本発明は、これらの具体的な詳細なしに実践することが可能であることを理解されたい。
【0016】
この研究では、本発明者らは、良好な血清安定性を維持しながら大きく改善されたポルフィゾーム細胞内取り込みを示した次世代ポルフィゾーム（ＮＰＳ）を作製するためのポルフィリンナノ小胞の構築のための非毒性ＥＤＴＡ－ヘキサデシルアミド抱合体（ＥＤＴＡ－脂質）を設計した。ＮＰＳが、ポルフィゾーム中の全脂質含有量の最大５０ｍｏｌ％のＥＤＴＡ－脂質を含有するとき、２４時間のインキュベーションで、癌細胞内在化において目覚ましい２０倍の強化が達成され、連続して、５μＭの濃度で、従来のポルフィゾーム（細胞生存率９７％）と比較してＰＤＴ効力の劇的な強化（細胞生存率７％）がもたらされた。このＮＰＳプラットフォームは、ＥＤＴＡ－脂質からジエチレントリアミン五酢酸－ヘキサデシルアミド抱合体（ＤＴＰＡ－脂質）まで拡張することもできる。結果として、異なる放射性同位体（例えば、９９ｍＴｃ）または金属イオン（例えば、ガドリニウム）は、ＤＴＰＡにロバストにキレート化でき、ポルフィゾームの固有の金属キレート化特性を補完する。興味深いことに、ＥＤＴＡ－脂質またはＤＴＰＡ－脂質によって強化されたポルフィゾームの細胞内輸送の主な機構は、典型的なＥＤＴＡ強化された細胞膜透過性について予測すると思われるようなＣａ２＋またはＭｇ２＋キレート化に依存しなかったことが発見された。この知見は、複数の証拠によって支持された：１）上皮細胞中のＮＰＳ媒介によって強化された取り込みと異なり、ＰＳと濃度１ｍＭのＥＤＴＡとの共インキュベーションは、ポルフィゾームの細胞間取り込みを強化しなかった；２）高濃度のＣａ２＋およびＭｇ２＋とのプレインキュベーション後のＥＤＴＡ－脂質ベースＮＰＳ（ｅＮＰＳ）は、ｅＮＰＳ強化された輸送を減少しなかった；３）ＤＴＰＡ－脂質含有ＮＰＳ（ｄＮＰＳ）は、Ｇｄ３＋キレート化の有無にかかわらず、両方ともｅＮＰＳと同様の強化された取り込みを示した。皮下ＫＢマウスモデルおよび生体関連ハムスター頬の発癌の両方における蛍光イメージング研究は、腫瘍において、ＰＳを上回るｅＮＰＳの急速でかつ強化された蓄積／活性化をさらに実証した。したがって、ＮＰＳプラットフォームは、癌のマルチモーダルイメージングおよび有効なＰＤＴのためのポルフィゾームを進歩させるために、ポルフィゾームの乏しい細胞内蓄積の限界を克服する可能性を実証する。
【0017】
一態様において、ポルフィリン－リン脂質抱合体およびキレート剤－脂肪酸抱合体を含む二層ナノ小胞であって、キレート剤－脂肪酸抱合体が、一本鎖脂肪酸に結合されたアミノポリカルボン酸を含み、ポルフィリン－リン脂質抱合体が、好ましくはｓｎ－１またはｓｎ－２位で１つのリン脂質の脂質側鎖に共有結合された１つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む、二層ナノ小胞を提供する。
【0018】
一部の実施形態では、アミノポリカルボン酸は、グリシネート、ＩＤＡ、ＮＴＡ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ニコチアナミン、ＥＤＤＨＡ、またはＥＤＤＳである。好ましくは、アミノポリカルボン酸は、ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡである。
【0019】
一部の実施形態では、一本鎖脂肪酸は、１０～２６個の炭素を含む。
一部の実施形態では、一本鎖脂肪酸は、１２～２２個の炭素を含む。好ましくは、一本鎖脂肪酸は、１４～１８個の炭素を含む。さらに好ましくは、一本鎖脂肪酸は、１６個の炭素を含む。一実施形態において、一本鎖脂肪酸は、ヘキサデシルアミドである。
一部の実施形態では、一本鎖脂肪酸は、１２～２２個の炭素を含む。好ましくは、一本鎖脂肪酸は、１４～１８個の炭素を含む。さらに好ましくは、一本鎖脂肪酸は、１６個の炭素を含む。一実施形態において、一本鎖脂肪酸は、ヘキサデシルアミドである。
【0020】
一部の実施形態では、キレート剤－脂肪酸抱合体は、ＥＤＴＡ－ヘキサデシルアミドまたはＤＴＰＡ－ヘキサデシルアミドである。
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、１５％～６０％のキレート剤－脂肪酸抱合体、好ましくは２５％～５０％のキレート剤－脂肪酸抱合体、さらに好ましくは３０％～４０％のキレート剤－脂肪酸抱合体、さらに好ましくは、約３０％のキレート剤－脂肪酸抱合体を含む。
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、１５％～６０％のキレート剤－脂肪酸抱合体、好ましくは２５％～５０％のキレート剤－脂肪酸抱合体、さらに好ましくは３０％～４０％のキレート剤－脂肪酸抱合体、さらに好ましくは、約３０％のキレート剤－脂肪酸抱合体を含む。
【0021】
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、１～６０モル％のポルフィリン－リン脂質抱合体、好ましくは２０～４０モル％のポルフィリン－リン脂質抱合体、さらに好ましくは、約２７モル％のポルフィリン－リン脂質抱合体を含む。
【0022】
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体中のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体は、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ピロフェオホルバイド、バクテリオクロロフィル、クロロフェルａ、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン、ロジン、ケトクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、ベンゾバクテリオクロリン、拡張ポルフィリンおよびポルフィリン異性体からなる群から選択される。
【0023】
好ましくは、拡張ポルフィリンは、テキサフィリン、サフィリンまたはヘキサフィリンであり、ポルフィリン異性体は、ポルフィセン、反転ポルフィリン、フタロシアニン、またはナフタロシアニンである。
【0024】
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体中のリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを含む。好ましくは、リン脂質は、１２～２２個の炭素のアシル側鎖を含む。
【0025】
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体中のポルフィリンは、ピロフェオホルバイド－ａ酸である。
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体中のポルフィリンは、バクテリオクロロフィル誘導体である。
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体中のポルフィリンは、バクテリオクロロフィル誘導体である。
【0026】
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体中のリン脂質は、１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンまたは１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンである。
【0027】
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体は、ｐｙｒｏ－脂質である。
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体は、オキシ－バクテリオクロロフィル－脂質、テキサフィリン－リン脂質抱合体またはアザ－ホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）－リン脂質抱合体である。
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体は、オキシ－バクテリオクロロフィル－脂質、テキサフィリン－リン脂質抱合体またはアザ－ホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）－リン脂質抱合体である。
【0028】
一部の実施形態では、ポルフィリンは、０～２０個の炭素の炭素鎖リンカーによってリン脂質上のグリセロール基に結合されている。
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、ＰＥＧ化乳化剤をさらに含む。好ましくは、ＰＥＧ化乳化剤は、約１０００～約５０００の範囲の分子量を有する。さらに好ましくは、ＰＥＧ化乳化剤は、Ｎ－（メトキシポリエチレングリコール５０００カルバモイル）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ５０００－ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、ポリオキシエチレン４０ステアレート（ＰＥＧ４０Ｓ）およびこれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、ＰＥＧ化乳化剤をさらに含む。好ましくは、ＰＥＧ化乳化剤は、約１０００～約５０００の範囲の分子量を有する。さらに好ましくは、ＰＥＧ化乳化剤は、Ｎ－（メトキシポリエチレングリコール５０００カルバモイル）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ５０００－ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、ポリオキシエチレン４０ステアレート（ＰＥＧ４０Ｓ）およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【0029】
一部の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質は、１～１０モル％の量で存在する。好ましくは、ＰＥＧまたはＰＥＧ－脂質は、２～７モル％の量で存在する。
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、コレステロールをさらに含む。
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、コレステロールをさらに含む。
【0030】
一部の実施形態では、二層ナノ小胞の残りの組成物は、コレステロールを実質的に含む。
一部の実施形態では、コレステロールは、１～６０モル％の量で存在する。
一部の実施形態では、コレステロールは、１～６０モル％の量で存在する。
【0031】
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、実質的に球形である。
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、直径が約７０～１２０ｎｍである。好ましくは、二層ナノ小胞は、直径が約９０～１００ｎｍである。
一部の実施形態では、二層ナノ小胞は、直径が約７０～１２０ｎｍである。好ましくは、二層ナノ小胞は、直径が約９０～１００ｎｍである。
【0032】
一部の実施形態では、ポルフィリン－リン脂質抱合体は、その中にキレートされた金属、任意選択により金属の放射性同位体を含む。
一態様において、緩衝液中の本明細書に記載の二層ナノ小胞を含む組成物を提供する。
一態様において、緩衝液中の本明細書に記載の二層ナノ小胞を含む組成物を提供する。
【0033】
一態様において、対象の標的領域に光線力学療法を実施する方法であって、本明細書に記載の組成物を生成するステップと、組成物を対象に投与するステップと、標的領域を、組成物を励起してラジカルおよび／または活性酸素種を作製する波長の光で照射するステップとを含む、方法を提供する。
【0034】
一態様において、対象の標的領域をイメージングする方法であって、本明細書に記載の組成物を生成するステップと、組成物を対象に投与するステップと、標的領域で蛍光または光音響シグナルを測定および／または検出するステップとを含む、方法を提供する。
【0035】
一態様において、対象に放射性同位体を輸送する方法であって、二層ナノ小胞がその中にキレートされた放射性同位体を有する、本明細書に記載の組成物を生成するステップと、組成物を対象に投与するステップとを含む、方法を提供する。
【0036】
一態様において、光線力学療法を実施するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
一態様において、イメージングを実施するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
一態様において、イメージングを実施するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【0037】
一態様において、対象に放射性同位体を輸送するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、生理的に相溶性の任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗生物質および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上、およびこれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容される担体は、薬剤の貯蔵寿命または有効性を強化する、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含んでもよい。
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、生理的に相溶性の任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗生物質および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上、およびこれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容される担体は、薬剤の貯蔵寿命または有効性を強化する、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含んでもよい。
【0038】
本明細書で用いる場合、「治療上有効な量」は、望ましい治療結果を達成するために必要な用量および特定の期間で効果的な量を指す。薬剤の治療上有効な量は、個人の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個人における望ましい応答を引き出す薬剤の能力などの因子に応じて変動し得る。治療上有効な量はまた、治療上有益な作用が薬剤の任意の毒性または有害作用を上回る量でもある。
【0039】
本発明の利点は、以下の実施例によってさらに例示される。本明細書に記載の実施例およびその具体的な詳細は、例示のみを目的として提供されるものであり、本発明の請求項を制限するものとは解釈すべきでない。
【実施例】
【0040】
方法および材料
材料および試薬
コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（１６：０ＰＥ－ＤＴＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ガドリニウム塩）（１６：０ＰＥ－ＤＴＰＡ（Ｇｄ））およびジエチレントリアミン五酢酸－ビス（ステアリルアミド）（ガドリニウム塩）（ＤＴＰＡ－ＢＳＡ（Ｇｄ））は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（ＵＳＡ）から購入した。他のすべての溶媒および試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ポルフィリン－脂質は、先に公開された方法にしたがって合成した１１。ＥＤＴＡ－ヘキサデシルアミド抱合体（ＥＤＴＡ－脂質）およびＤＴＰＡ－ヘキサデシルアミド抱合体（ＤＴＰＡ－脂質）は合成した（支援情報を参照）。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭまたはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手した。
材料および試薬
コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（１６：０ＰＥ－ＤＴＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ガドリニウム塩）（１６：０ＰＥ－ＤＴＰＡ（Ｇｄ））およびジエチレントリアミン五酢酸－ビス（ステアリルアミド）（ガドリニウム塩）（ＤＴＰＡ－ＢＳＡ（Ｇｄ））は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（ＵＳＡ）から購入した。他のすべての溶媒および試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ポルフィリン－脂質は、先に公開された方法にしたがって合成した１１。ＥＤＴＡ－ヘキサデシルアミド抱合体（ＥＤＴＡ－脂質）およびＤＴＰＡ－ヘキサデシルアミド抱合体（ＤＴＰＡ－脂質）は合成した（支援情報を参照）。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭまたはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手した。
【0041】
クロマトグラフィー精製を、フラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ、ＩｓｏｌｅｒａＴＭ）を用いて実施した。ＵＰＬＣ－ＭＳを、Ｗａｔｅｒｓ ２６９５コントローラ、２９９６フォトダイオードアレイ検出器、およびＷａｔｅｒｓ三連四重極（ＴＱ）質量検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｃ）Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃａｎａｄａ、カナダ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して実施した。ＵＰＬＣ条件は、以下の通りだった：溶媒Ａ）０．１％ ＴＦＡおよびＢ）アセトニトリル；カラム温度：６０℃；流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；５分で８０％Ａ＋２０％Ｂから０％Ａ＋１００％Ｂへの勾配、２分間１００％Ｂで維持、後続して１分間で８０％Ａ＋２０％Ｂに急変化で戻る。ＮＭＲスペクトルを、１Ｄ １Ｈ ＮＭＲ、２Ｄ ＣＯＳＹ １Ｈ ＮＭＲ ４００．１８ＭＨｚを測定するＢｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ ４００ Ｐｌｕｓ ＮＭＲ分光計で記録した。すべての測定は、内部標準テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を基準とした。
【0042】
ＥＤＴＡ一無水物の合成
エチレンジアミン四酢酸二無水物（３．２ｇ、０．０１２５ｍｏｌ）を添加し、後続して乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）をＡｒ下で添加し、８０℃に加熱した。１５分の攪拌後、水（０．２２５ｍＬ）をゆっくり添加し、反応混合物をＡｒ下で１時間４５分間還流させた。粗生成物を濾過し、ＤＭＦおよびエーテルで洗浄し、白色の固体（１．９５ｇ、６１％）を得た。分子構造は、1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.32 (s, 2H, CO2H), 3.72 (s, 4H), 3.43 (s, 4H), 2.83 - 2.74 (m, 2H), 2.58 (t, J = 6.1 Hz, 2H)によって特定した。
エチレンジアミン四酢酸二無水物（３．２ｇ、０．０１２５ｍｏｌ）を添加し、後続して乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）をＡｒ下で添加し、８０℃に加熱した。１５分の攪拌後、水（０．２２５ｍＬ）をゆっくり添加し、反応混合物をＡｒ下で１時間４５分間還流させた。粗生成物を濾過し、ＤＭＦおよびエーテルで洗浄し、白色の固体（１．９５ｇ、６１％）を得た。分子構造は、1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.32 (s, 2H, CO2H), 3.72 (s, 4H), 3.43 (s, 4H), 2.83 - 2.74 (m, 2H), 2.58 (t, J = 6.1 Hz, 2H)によって特定した。
【0043】
ＥＤＴＡ－ヘキサデシルアミド脂質（ＥＤＴＡ－脂質）
ＥＤＴＡ一無水物（１．４２ｇ、５．２ｍｍｏｌ）およびヘキサデシルアミン（１．２ｇ、５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（６０ｍＬ）中に溶解し、Ａｒ下、１００℃で１０時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、水中に注ぎ入れて沈殿させ、濾過した。粗生成物を水およびジエチルエーテルで洗浄し、白色の固体（１．２５ｇ、４９％）を得た。分子構造は、1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.01 (s, 1H, NH), 3.42 (s, 4H), 3.36 (s, 2H), 3.18 (s, 2H), 3.05 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 2.79 - 2.63 (m, 4H), 1.38 (s, 2H), 1.30 - 1.14 (m, 26H), 0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H)によって確認した。ＵＰＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）：５１６ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋．ｔｒ＝１．３ｍｉｎ。図１４参照。
ＥＤＴＡ一無水物（１．４２ｇ、５．２ｍｍｏｌ）およびヘキサデシルアミン（１．２ｇ、５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（６０ｍＬ）中に溶解し、Ａｒ下、１００℃で１０時間還流した。反応混合物を室温に冷却し、水中に注ぎ入れて沈殿させ、濾過した。粗生成物を水およびジエチルエーテルで洗浄し、白色の固体（１．２５ｇ、４９％）を得た。分子構造は、1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.01 (s, 1H, NH), 3.42 (s, 4H), 3.36 (s, 2H), 3.18 (s, 2H), 3.05 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 2.79 - 2.63 (m, 4H), 1.38 (s, 2H), 1.30 - 1.14 (m, 26H), 0.85 (t, J = 6.6 Hz, 3H)によって確認した。ＵＰＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）：５１６ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋．ｔｒ＝１．３ｍｉｎ。図１４参照。
【0044】
ＮＰＳ合成およびキャラクタリゼーション
ＮＰＳを、ポルフィゾームを配合するための先に報告されたプロトコルにしたがって合成した１１。ポルフィリン－脂質（ピロフェオホルバイド－脂質）、コレステロール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ））、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ（ポリエテングリコール）（ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、およびＥＤＴＡ／ＤＴＰＡ脂質からなる種々のモル比の脂質成分をよく混合し、クロロホルムに溶解した。脂質混合物を、窒素ガスの緩流下で乾燥し、さらに１時間真空下に置いた。次いで乾燥脂質膜をＰＢＳ緩衝剤（１５０ｍＭ、ｐＨ７．５）で再水和し（濃度３ｍｇ／ｍＬ）、氷結解凍プロセスを９回経て、ポリカーボネート膜（孔径＝１００ｎｍ）に通して１０回押し出した。ＮＰＳの形態を決定するために、粒子を２％の酢酸ウラニル逆染色法で染色し、次いでＨｉｔａｃｈｉ Ｈ－７０００電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ））で走査した。サイズおよび分布は、動的光散乱（ＺＳ９０ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。分光学的研究において、ＰＬＰを、無傷／消光試料としてのＰＢＳ中または破壊／非消光試料としての０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中のいずれかで希釈した。無傷および破壊ＮＰＳの吸収および蛍光スペクトルを、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計Ｃａｒｙ ５０（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）およびＦｌｕｏｒｏｍａｘ－４（Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ，ＵＳＡ）（励起：４２０ｎｍ、発光：６３０～８００ｎｍ、スリット幅：５ｎｍ）によってそれぞれ測定した。ポルフィリン蛍光消光効率を、以下の式を使用して算出した。
消光効率＝（１－Ｆｉ／Ｆｄ）×１００％
ＦｉおよびＦｄは、無傷および対応する破壊ＮＰＳの蛍光強度を意味し、ポルフィリンの濃度は１μＭである。
ＮＰＳを、ポルフィゾームを配合するための先に報告されたプロトコルにしたがって合成した１１。ポルフィリン－脂質（ピロフェオホルバイド－脂質）、コレステロール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ））、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ（ポリエテングリコール）（ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、およびＥＤＴＡ／ＤＴＰＡ脂質からなる種々のモル比の脂質成分をよく混合し、クロロホルムに溶解した。脂質混合物を、窒素ガスの緩流下で乾燥し、さらに１時間真空下に置いた。次いで乾燥脂質膜をＰＢＳ緩衝剤（１５０ｍＭ、ｐＨ７．５）で再水和し（濃度３ｍｇ／ｍＬ）、氷結解凍プロセスを９回経て、ポリカーボネート膜（孔径＝１００ｎｍ）に通して１０回押し出した。ＮＰＳの形態を決定するために、粒子を２％の酢酸ウラニル逆染色法で染色し、次いでＨｉｔａｃｈｉ Ｈ－７０００電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ））で走査した。サイズおよび分布は、動的光散乱（ＺＳ９０ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。分光学的研究において、ＰＬＰを、無傷／消光試料としてのＰＢＳ中または破壊／非消光試料としての０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中のいずれかで希釈した。無傷および破壊ＮＰＳの吸収および蛍光スペクトルを、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計Ｃａｒｙ ５０（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）およびＦｌｕｏｒｏｍａｘ－４（Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ，ＵＳＡ）（励起：４２０ｎｍ、発光：６３０～８００ｎｍ、スリット幅：５ｎｍ）によってそれぞれ測定した。ポルフィリン蛍光消光効率を、以下の式を使用して算出した。
消光効率＝（１－Ｆｉ／Ｆｄ）×１００％
ＦｉおよびＦｄは、無傷および対応する破壊ＮＰＳの蛍光強度を意味し、ポルフィリンの濃度は１μＭである。
【0045】
細胞内取り込み評価
まず蛍光顕微鏡検査法を用いて、１０％のＦＢＳを有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養したＫＢ細胞上の粒子の細胞内取り込みを追跡した。簡単に言えば、インキュベーションの２４時間前に、５×１０４細胞／ウェルを８ウェルチャンバスライド中に播種した。細胞を、３７℃で４時間、ポルフィリン濃度が１μＭのＮＰＳおよびＰＳとインキュベートし、ＰＢＳで３回すすぎ、次いで新鮮な培地中で再培養した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００レーザー蛍光走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））を使用して、時間（インキュベーション培地の除去の直後、３時間後および１８時間後）ごとの細胞のポルフィリン蛍光変化を監視した。蛍光顕微鏡検査法は、ＫＢ上皮細胞対正常線維芽細胞（ＮＦＢ）中のｅＮＰＳ取り込みを検査するためにも使用した。
まず蛍光顕微鏡検査法を用いて、１０％のＦＢＳを有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養したＫＢ細胞上の粒子の細胞内取り込みを追跡した。簡単に言えば、インキュベーションの２４時間前に、５×１０４細胞／ウェルを８ウェルチャンバスライド中に播種した。細胞を、３７℃で４時間、ポルフィリン濃度が１μＭのＮＰＳおよびＰＳとインキュベートし、ＰＢＳで３回すすぎ、次いで新鮮な培地中で再培養した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００レーザー蛍光走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））を使用して、時間（インキュベーション培地の除去の直後、３時間後および１８時間後）ごとの細胞のポルフィリン蛍光変化を監視した。蛍光顕微鏡検査法は、ＫＢ上皮細胞対正常線維芽細胞（ＮＦＢ）中のｅＮＰＳ取り込みを検査するためにも使用した。
【0046】
ＮＰＳ対ＰＳの細胞取り込みをさらに比較するために、定量的な細胞取り込みの試験を実施した。インキュベーションの２４時間前に、ＫＢ細胞を、１０６細胞／ウェルで、１２ウェルプレート中に播種した。次いで細胞を、３７℃で、異なる時間分、ポルフィリン濃度を変えた様々なＮＰＳおよびＰＳとインキュベートした。ＰＢＳで３回すすいだ後、細胞をトリプシン処理し、懸濁液を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで２．５×１０５細胞を含有する細胞ペレットを５００μＬの溶菌緩衝液（ＤＭＳＯ）中で再懸濁し、１時間インキュベートした。溶液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ－４蛍光光度計を使用したポルフィリン蛍光測定のために上清を集めて、細胞中のポルフィリン分子の取り込みを定量化した。
【0047】
血清安定性評価
様々なｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳおよびＰＳ（１μＭ）の血清安定性を、３７℃での種々の時間分のＰＢＳ中５０ｖｏｌ％のＦＢＳとのインキュベーションと、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒミクロ平板プレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）（励起：４１０／８ｎｍ、発光：６７１／８ｎｍ、ゲイン＝２５００）を使用して試料の蛍光消光効率の変化を決定することによって評価した。
様々なｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳおよびＰＳ（１μＭ）の血清安定性を、３７℃での種々の時間分のＰＢＳ中５０ｖｏｌ％のＦＢＳとのインキュベーションと、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒミクロ平板プレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）（励起：４１０／８ｎｍ、発光：６７１／８ｎｍ、ゲイン＝２５００）を使用して試料の蛍光消光効率の変化を決定することによって評価した。
【0048】
ＮＰＳの細胞内取り込み経路の評価
種々の温度でのＫＢ細胞中のｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの取り込みを、蛍光顕微鏡を使用して評価した。ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳとの３時間の４、１８、および３７℃でのインキュベーションの後、細胞を画像化し、各温度条件における蛍光シグナルを比較して、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳが能動的にまたは受動的に癌細胞に取り込まれたかを決定した。これらの取り込みは、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）および２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）を使用することによって、アデノシン－三リン酸（ＡＴＰ）枯渇細胞条件下でさらに評価した。蛍光顕微鏡法が後続するｅＮＰＳおよびｄＮＰＳとの１時間の共インキュベーションの３０分前に、ＫＢ細胞をＮａＮ３および２－ＤＧとプレインキュベートした。正常およびＡＴＰ枯渇細胞条件間の蛍光の変化を評価した。
種々の温度でのＫＢ細胞中のｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの取り込みを、蛍光顕微鏡を使用して評価した。ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳとの３時間の４、１８、および３７℃でのインキュベーションの後、細胞を画像化し、各温度条件における蛍光シグナルを比較して、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳが能動的にまたは受動的に癌細胞に取り込まれたかを決定した。これらの取り込みは、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）および２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ）を使用することによって、アデノシン－三リン酸（ＡＴＰ）枯渇細胞条件下でさらに評価した。蛍光顕微鏡法が後続するｅＮＰＳおよびｄＮＰＳとの１時間の共インキュベーションの３０分前に、ＫＢ細胞をＮａＮ３および２－ＤＧとプレインキュベートした。正常およびＡＴＰ枯渇細胞条件間の蛍光の変化を評価した。
【0049】
ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの細胞内局在性を、共焦点顕微鏡下、ＫＢ細胞上で検査した。ミトコンドリアおよびリソソーム中のｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの細胞内局在性は、ミトコンドリアトラッカーのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭおよびリソソームトラッカーのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９を用いた共局在化評価によって評価した。オルガネラトラッカーとのインキュベーションの前に、ＫＢ細胞をナノ粒子と２４時間インキュベートした。これらのトラッカーに使用した濃度およびインキュベーション時間は、製造業者の勧告にしたがって最適化した。共焦点像の設定：ポルフィリンチャネル：励起：６３３ｎｍ／発光：６７０～７４０ｎｍ；Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒチャネル：励起：５５２／発光：５７３～６２０ｎｍ、およびＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒチャネル（励起：４８８ｎｍ／発光：５１０～６００ｎｍ）。
【0050】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤＴアッセイ
ｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＤＴ活性化を、処置後のＫＢ細胞の生存率を測定することによって決定した。ＫＢ細胞を５μＭのｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳと３、６、および２４時間インキュベートし、その後、６６０ｎｍの自家製ＬＥＤライトボックスを使用して光照射（６６０ｎｍ；放射照度：３０ｍＷ／ｃｍ２；線量：５および１０Ｊ／ｃｍ２）を行った。細胞の生存率を、蛍光測定に先立って細胞を５０μｇ／ｍＬのａｌａｍａｒｂｌｕｅと２時間インキュベートするａｌａｍａｒｂｌｕｅアッセイを使用して、光線処置後２４時間で評価した。次いでＣＬＡＲＩＯｓｔａｒミクロ平板リーダーを使用して、５４０ｎｍで励起し、５９０ｎｍで発光を集めることによって、ａｌａｍａｒｂｌｕｅ蛍光を測定した。普通の培地中で培養した細胞を、未処置の対照として使用した。ポルフィゾームで処置したが暗所で培養した細胞を使用して、各配合物の暗毒性を評価した。全試料の細胞生存率を未処置の対照に対して正規化した。
ｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＤＴ活性化を、処置後のＫＢ細胞の生存率を測定することによって決定した。ＫＢ細胞を５μＭのｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳと３、６、および２４時間インキュベートし、その後、６６０ｎｍの自家製ＬＥＤライトボックスを使用して光照射（６６０ｎｍ；放射照度：３０ｍＷ／ｃｍ２；線量：５および１０Ｊ／ｃｍ２）を行った。細胞の生存率を、蛍光測定に先立って細胞を５０μｇ／ｍＬのａｌａｍａｒｂｌｕｅと２時間インキュベートするａｌａｍａｒｂｌｕｅアッセイを使用して、光線処置後２４時間で評価した。次いでＣＬＡＲＩＯｓｔａｒミクロ平板リーダーを使用して、５４０ｎｍで励起し、５９０ｎｍで発光を集めることによって、ａｌａｍａｒｂｌｕｅ蛍光を測定した。普通の培地中で培養した細胞を、未処置の対照として使用した。ポルフィゾームで処置したが暗所で培養した細胞を使用して、各配合物の暗毒性を評価した。全試料の細胞生存率を未処置の対照に対して正規化した。
【0051】
Ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング
すべての動物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＵＨＮ）動物実験委員会、オンタリオ州のＡｎｉｍａｌ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｃｔ、およびカナダ動物管理協会によって考案された方針による人道的ケアを受けた。すべての動物実験は、ＵＨＮ動物実験委員会のプロトコルによって認可された。ＫＢ皮下マウスモデルおよびハムスター頬の発癌モデルを本実験全体にわたって使用した。
すべての動物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＵＨＮ）動物実験委員会、オンタリオ州のＡｎｉｍａｌ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｃｔ、およびカナダ動物管理協会によって考案された方針による人道的ケアを受けた。すべての動物実験は、ＵＨＮ動物実験委員会のプロトコルによって認可された。ＫＢ皮下マウスモデルおよびハムスター頬の発癌モデルを本実験全体にわたって使用した。
【0052】
ＫＢ異種移植モデルを開発するために、８週齢の雌の無胸腺ヌードマウスの右脇腹に、全身麻酔（酸素中イソフルラン）下、２００μＬのＰＢＳ培地中の２×１０６ＫＢを皮下接種した。動物を、ＵＨＮ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅのオートクレーブマイクロアイソレーターケージ中、病原体非含有条件で維持した。腫瘍サイズが直径４．０～５．０ｍｍの平均サイズに達したら、マウスを無作為に分類し（各郡ｎ＝３）、４ｍｇ／ｋｇのポルフィリンの用量のＰＳおよびｅＮＰＳを静脈内注射した。Ｉｎ ｖｉｖｏ全身イメージングを、５７５～６０５ｎｍ励起／６４５ｎｍロングパスエミッションフィルター（long-pass emission filter）を用いたＭａｅｓｔｒｏイメージングシステム（ＣＲＩ、ＵＳＡ）を使用して、種々の時点で実施し、マウスを２％（ｖ／ｖ）イソフルランによって麻酔しながら腫瘍の蓄積および活性化を比較した。低蛍光飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｎｄ（登録商標）、製品番号ＴＤ．９７１８４）を、ＮＰＳ投与の３日前に動物に与えた。
【0053】
ハムスター実験では、６～８週齢の雄のシリアンハムスター（Ｈａｒｉａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を使用して、ヒトにおける口腔癌の臨床症状を模倣するモデルを開発した２６。簡単に言えば、動物をイソフルランで麻酔しながら、ＤＭＳＯ中０．５％のＤＭＢＡ（７，１２－ジメチルベンズ（ａ）アントラセン）を非吸収性材料と共に両方の頬に適用した。適用前、キムワイプを口腔内に詰めて喉に伝い落ちるのを最小限にし、適用が完了した後で除去した。この手順を、１６～２０週間の間、週３回繰り返した。一般に、視認できる腫瘍は、ＤＭＢＡ適用から１０週間後に観察され、最大５～１０ｍｍのサイズまで達し得る。ＰＳおよびｅＮＰＳを、用量４ｍｇ／ｋｇのポルフィリン濃度で、橈側皮静脈を介してハムスターに投与し、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングのためのレーザー励起波長６６５ｎｍで前臨床蛍光内視鏡（ＰＩＮＰＯＩＮＴイメージングシステム、Ｎｏｖａｄａｑ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に供し、蛍光強度分析のためにリアルタイムビデオを記録した。
【0054】
統計分析
二元配置分散分析とボンフェローニ補正法を用いて、実験群間の統計的有意性を決定した。Ｐ値＜０．０５は有意とみなした。
二元配置分散分析とボンフェローニ補正法を用いて、実験群間の統計的有意性を決定した。Ｐ値＜０．０５は有意とみなした。
【0055】
結果および考察
ＥＤＴＡ－脂質ベースの新規ポルフィゾーム（ｅＮＰＳ）の設計および合成
ＥＤＴＡ部分をポルフィゾームのナノ構造中に組み込むために、ＥＤＴＡ一無水物をヘキサデシルアミンと結合させてＥＤＴＡ－モノＣ１６脂質抱合体（ＥＤＴＡ－脂質）を得ることによって、両親媒性ＥＤＴＡ－脂質を設計し、合成した（図１４）。化学構造は、ＮＭＲおよびｕＰＬＣ－ＭＳによって特定した（支援情報の合成およびキャラクタリゼーションを参照）。
ＥＤＴＡ－脂質ベースの新規ポルフィゾーム（ｅＮＰＳ）の設計および合成
ＥＤＴＡ部分をポルフィゾームのナノ構造中に組み込むために、ＥＤＴＡ一無水物をヘキサデシルアミンと結合させてＥＤＴＡ－モノＣ１６脂質抱合体（ＥＤＴＡ－脂質）を得ることによって、両親媒性ＥＤＴＡ－脂質を設計し、合成した（図１４）。化学構造は、ＮＭＲおよびｕＰＬＣ－ＭＳによって特定した（支援情報の合成およびキャラクタリゼーションを参照）。
【0056】
次いでポルフィゾーム配合物中のＥＤＴＡ－脂質の比率を変動させる（１８ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％）ことによって様々なｅＮＰＳを作製した。ｅＮＰＳの概略図を図１に示し、各配合物における成分の含有量を表１に列挙した。ＰＳの略語は、従来のポルフィゾーム配合物を意味する。
【0057】
【表1】
【0058】
ｅＮＰＳは、ポルフィゾームと同様の構造および光特性を示した
ポルフィゾーム配合物へのＥＤＴＡ－脂質（１８～５０ｍｏｌ％）の組み込みは、粒子形態（図２ＡのＴＥＭ画像に示したリポソーム様のナノ小胞構造）、粒径（Ｚ平均：９０～１００ｎｍ）および単分散性（ＰＤＩ：０．１４～０．１８）（表２）において無視できる効果しかもたらさず、ポルフィゾーム配合物中のＥＤＴＡ－脂質の相溶性を示した。加えて、ｅＮＰＳは、ＰＳと同様の吸収スペクトル（図２Ｂ）および高度の蛍光自己消光（１５０倍超）（図２Ｃおよび表２）を示し、無傷ポルフィゾームの光特性への影響が最小限であることを示した。
ポルフィゾーム配合物へのＥＤＴＡ－脂質（１８～５０ｍｏｌ％）の組み込みは、粒子形態（図２ＡのＴＥＭ画像に示したリポソーム様のナノ小胞構造）、粒径（Ｚ平均：９０～１００ｎｍ）および単分散性（ＰＤＩ：０．１４～０．１８）（表２）において無視できる効果しかもたらさず、ポルフィゾーム配合物中のＥＤＴＡ－脂質の相溶性を示した。加えて、ｅＮＰＳは、ＰＳと同様の吸収スペクトル（図２Ｂ）および高度の蛍光自己消光（１５０倍超）（図２Ｃおよび表２）を示し、無傷ポルフィゾームの光特性への影響が最小限であることを示した。
【0059】
【表2】
【0060】
ｅＮＰＳは、ＫＢ細胞中で急速でかつ強化された細胞内取り込みを示した
様々なｅＮＰＳおよびＰＳの細胞内取り込みを、イメージングに先立ってＫＢ細胞を１μＭの粒子と４時間インキュベートした、蛍光顕微鏡によって監視した。図３Ａに示すように、３０ｍｏｌ％超のＥＤＴＡ－脂質を含有するｅＮＰＳ２およびｅＮＰＳ３は、ＰＳと比較したとき、ＫＢ細胞中で急速な取り込みおよび有意に強化された蛍光を示した。無傷ｅＮＰＳで蛍光が高度に消光されるため、内在化後のｅＮＰＳ解離／活性化に時間のかかる過程であるかを監視するために、インキュベーション後、細胞を新鮮な培地中で連続的に培養した。図１５に示すように、ｅＮＰＳ２およびｅＮＰＳ３とのインキュベーション後の全細胞の蛍光シグナルは、ポストインキュベーション時間の増加（３時間、１８時間）と共にゆっくり蛍光が消えていくことを示した一方、ポストインキュベーションに際してシグナルの強化は現れず、ｅＮＰＳが細胞内環境内で急速な活性化を経ることを示唆する。
様々なｅＮＰＳおよびＰＳの細胞内取り込みを、イメージングに先立ってＫＢ細胞を１μＭの粒子と４時間インキュベートした、蛍光顕微鏡によって監視した。図３Ａに示すように、３０ｍｏｌ％超のＥＤＴＡ－脂質を含有するｅＮＰＳ２およびｅＮＰＳ３は、ＰＳと比較したとき、ＫＢ細胞中で急速な取り込みおよび有意に強化された蛍光を示した。無傷ｅＮＰＳで蛍光が高度に消光されるため、内在化後のｅＮＰＳ解離／活性化に時間のかかる過程であるかを監視するために、インキュベーション後、細胞を新鮮な培地中で連続的に培養した。図１５に示すように、ｅＮＰＳ２およびｅＮＰＳ３とのインキュベーション後の全細胞の蛍光シグナルは、ポストインキュベーション時間の増加（３時間、１８時間）と共にゆっくり蛍光が消えていくことを示した一方、ポストインキュベーションに際してシグナルの強化は現れず、ｅＮＰＳが細胞内環境内で急速な活性化を経ることを示唆する。
【0061】
ｅＮＰＳは細胞内での急速な活性化を示したが、ＰＳを上回るｅＮＰＳ強化された取り込みを定量化するために、定量的細胞抽出法をさらに適用して、様々な粒子の時間依存性の細胞内取り込みプロフィールを決定した。この方法を用いて、内在化されたｅＮＰＳおよびＰＳをＤＭＳＯ溶菌液中で完全に破壊し、それによって取り込み定量化のためのポルフィリン蛍光を消光しなかった。図３Ｂに示すように、ナノ粒子中のＥＤＴＡ－脂質の比率の増加によって取り込みが強化される明確な傾向が観察された。最大のＥＤＴＡ－脂質含有量（５０ｍｏｌ％）を有するｅＮＰＳ３は、すべての時点で最大の取り込みを実証した（ｐ＜０．０５）。濃度５μＭで、ＰＳと比較して２．１、５．５、３３．７、２６．１倍強化された取り込みが、３、６、１８および２４時間のインキュベーションでそれぞれ観察された。３０ｍｏｌ％のＥＤＴＡ－脂質を含有していたｅＮＰＳ２も、さらに長時間のインキュベーションで有意に強化された輸送を示し、例えば、１８時間および２４時間の５μＭの粒子とのインキュベーション後に、それぞれ１２．３倍および１１．３倍に強化された取り込み（ｐ＜０．０５）を示した。本発明者らは、すべての後続する研究における強化された輸送の評価に最適なｅＮＰＳ配合物としてｅＮＰＳ３を選択した。
【0062】
ｅＮＰＳは、上皮細胞中で選択的取り込みを誘発したが、線維芽細胞中では誘発しなかった
蛍光顕微鏡検査法を用いて、上皮細胞ＫＢ対正常ヒト線維芽細胞中のｅＮＰＳの取り込みを評価した。興味深いことに、ｅＮＰＳは、上皮細胞中で粒子取り込みを有意に強化したが、線維芽細胞中では強化しなかった（図４）。上皮細胞中のｅＮＰＳ強化された輸送が、細胞膜の透過率を増加し得る二価カチオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）とのＥＤＴＡ頭部基（５μＭのｅＮＰＳは７μＭのＥＤＴＡ－脂質を含有する）の相互作用によって引き起こされるかを調べるために、高濃度の遊離ＥＤＴＡ（１０００μＭ）を添加して普通のＰＳ（５μＭ）と共インキュベートし、ＰＳ取り込みへの任意の効果を調べた。結果（図１６）は、１ｍＭの遊離ＥＤＴＡが、無視できる強化しかＰＳ取り込みに与えなかったことを明らかにした。加えて、ＥＤＴＡ－脂質は、ＥＤＴＡ－脂質をリポソーム配合物に組み込んだとき、細胞中のリポソームの迅速な内在化を誘発する上で同じ役割を果たす（ＨＳＰＣ：ＥＤＴＡ－脂質：ｐｙｒｏ脂質：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００＝３２：４９：１：１５：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ））（図１７）。
蛍光顕微鏡検査法を用いて、上皮細胞ＫＢ対正常ヒト線維芽細胞中のｅＮＰＳの取り込みを評価した。興味深いことに、ｅＮＰＳは、上皮細胞中で粒子取り込みを有意に強化したが、線維芽細胞中では強化しなかった（図４）。上皮細胞中のｅＮＰＳ強化された輸送が、細胞膜の透過率を増加し得る二価カチオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）とのＥＤＴＡ頭部基（５μＭのｅＮＰＳは７μＭのＥＤＴＡ－脂質を含有する）の相互作用によって引き起こされるかを調べるために、高濃度の遊離ＥＤＴＡ（１０００μＭ）を添加して普通のＰＳ（５μＭ）と共インキュベートし、ＰＳ取り込みへの任意の効果を調べた。結果（図１６）は、１ｍＭの遊離ＥＤＴＡが、無視できる強化しかＰＳ取り込みに与えなかったことを明らかにした。加えて、ＥＤＴＡ－脂質は、ＥＤＴＡ－脂質をリポソーム配合物に組み込んだとき、細胞中のリポソームの迅速な内在化を誘発する上で同じ役割を果たす（ＨＳＰＣ：ＥＤＴＡ－脂質：ｐｙｒｏ脂質：コレステロール：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００＝３２：４９：１：１５：２（ｍｏｌ／ｍｏｌ））（図１７）。
【0063】
ＤＴＰＡ－脂質ベースの新規ポルフィゾーム（ｄＮＰＳ）
ＮＰＳプラットフォームが、ＥＤＴＡ－脂質の四酢酸頭部基を他の親水性頭部基と置き換えることによって構築できるかを調べるために、ジエチレントリアミン五酢酸－ヘキサデシルアミド（ＤＴＰＡ－脂質）をＮＰＳ構築のために合成した。結果として得られたｄＮＰＳ（表３の配合成分の詳細および図５ＡのＴＥＭ画像を参照）は、ｅＮＰＳと同様に強化された輸送挙動を示した。図５Ｂに示すように、５０ｍｏｌ％のＤＴＰＡ－脂質またはＥＤＴＡ－脂質のいずれかを含有するｄＮＰＳおよびｅＮＰＳは、３時間および６時間の両方のインキュベーション時間で、蛍光顕微鏡イメージング下、ＰＳと比較して同様に強化された蛍光シグナルを示し、ＥＤＴＡ－脂質頭部基へのカルボン酸基（ＤＴＰＡ中の５つの基対ＥＤＴＡ中の４つの基）の添加がそれらの取り込みに影響しなかったことが示唆される。定量的細胞内取り込み研究は、各時点（６、１８、または２４時間）におけるｄＮＰＳおよびｅＮＰＳの細胞内シグナル間の非有意差をさらに確定し（ｐ＞０．０５）、２つのナノ粒子の細胞取り込みプロフィールが類似していたことが示唆された（図５Ｃ）。同様に、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳは両方とも、すべての時点において、ＰＳと比較して有意に高い細胞内蓄積があった（ｐ＜０．０５）。これらのデータはまとめて、ＮＰＳプラットフォーム中のＥＤＴＡ－脂質の四酢酸基およびＤＴＰＡ－脂質の五酢酸頭部基の両方が、大きく改善されたＰＳ取り込みに関与することを示唆する。
ＮＰＳプラットフォームが、ＥＤＴＡ－脂質の四酢酸頭部基を他の親水性頭部基と置き換えることによって構築できるかを調べるために、ジエチレントリアミン五酢酸－ヘキサデシルアミド（ＤＴＰＡ－脂質）をＮＰＳ構築のために合成した。結果として得られたｄＮＰＳ（表３の配合成分の詳細および図５ＡのＴＥＭ画像を参照）は、ｅＮＰＳと同様に強化された輸送挙動を示した。図５Ｂに示すように、５０ｍｏｌ％のＤＴＰＡ－脂質またはＥＤＴＡ－脂質のいずれかを含有するｄＮＰＳおよびｅＮＰＳは、３時間および６時間の両方のインキュベーション時間で、蛍光顕微鏡イメージング下、ＰＳと比較して同様に強化された蛍光シグナルを示し、ＥＤＴＡ－脂質頭部基へのカルボン酸基（ＤＴＰＡ中の５つの基対ＥＤＴＡ中の４つの基）の添加がそれらの取り込みに影響しなかったことが示唆される。定量的細胞内取り込み研究は、各時点（６、１８、または２４時間）におけるｄＮＰＳおよびｅＮＰＳの細胞内シグナル間の非有意差をさらに確定し（ｐ＞０．０５）、２つのナノ粒子の細胞取り込みプロフィールが類似していたことが示唆された（図５Ｃ）。同様に、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳは両方とも、すべての時点において、ＰＳと比較して有意に高い細胞内蓄積があった（ｐ＜０．０５）。これらのデータはまとめて、ＮＰＳプラットフォーム中のＥＤＴＡ－脂質の四酢酸基およびＤＴＰＡ－脂質の五酢酸頭部基の両方が、大きく改善されたＰＳ取り込みに関与することを示唆する。
【0064】
Ｃａ２＋またはＭｇ２＋とのＥＤＴＡキレート化が、強化されたＰＳ取り込みにおいて役割を果たすかを調べるために、細胞のインキュベーション前に、ｅＮＰＳを高濃度のＣａ２＋またはＭｇ２＋で前処置した。図６Ａに示すように、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋処置ｅＮＰＳは、ＰＳと比較したとき、未処置ｅＮＰＳと同様に強化された取り込みを示した。加えて、Ｇｄキレート化ＤＴＰＡ－脂質（図５Ａ）によって作製されたｄＮＰＳ（Ｇｄ）は、金属非含有ｄＮＰＳと同様の細胞内取り込みを示した（図６Ｂ）。これらの結果は、図１６の１ｍＭの遊離ＥＤＴＡによって引き起こされたＰＳ取り込みの強化がなかったという先の観察とまとめて、ｅＮＰＳ強化輸送の機構が、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋とのＥＤＴＡキレート化に依存しないこと確定し、したがって作用機構がこれまで知られていないことを示唆する。
【0065】
【表3】
【0066】
キレート剤－脂質の脂質鎖がＮＰＳ取り込みに与える効果の評価
キレート剤－脂質の脂質鎖がＮＰＳ取り込みに与える効果を調べるために、１６：０ＰＥ－ＤＴＰＡ、１６：０ＰＥ－ＤＴＰＡ（Ｇｄ）およびＤＴＰＡ－ＢＳＡ（Ｇｄ）（これらの化学構造を図７Ａに示す）を含めた様々な二重脂質鎖を有するＤＴＰＡ－脂質をポルフィゾームに組み込み、ＤＰＳ１６ＰＥ、ＤＰＳ１６ＰＥ（Ｇｄ）およびＤＰＳＢＳＡ（Ｇｄ）を形成した。これらの配合物の成分およびキャラクタリゼーションを表３にまとめ、これらの代表的なＴＥＭ画像を図７Ａに示す。ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳ（単一脂肪酸脂質鎖を含有する）は、ｄＮＰＳ１６ＰＥ、ｄＮＰＳ１６ＰＥ（Ｇｄ）およびｄＮＰＳＢＳＡ（Ｇｄ）（二重脂肪酸脂質鎖を含有する）のバリエーションと比較して有意に高い取り込みを実証し（図７Ｂ）、ｅＮＰＳまたはｄＮＰＳ中の単一脂肪酸脂質鎖が、ＮＰＳの最大取り込み／非消光をもたらすことを示した。
キレート剤－脂質の脂質鎖がＮＰＳ取り込みに与える効果を調べるために、１６：０ＰＥ－ＤＴＰＡ、１６：０ＰＥ－ＤＴＰＡ（Ｇｄ）およびＤＴＰＡ－ＢＳＡ（Ｇｄ）（これらの化学構造を図７Ａに示す）を含めた様々な二重脂質鎖を有するＤＴＰＡ－脂質をポルフィゾームに組み込み、ＤＰＳ１６ＰＥ、ＤＰＳ１６ＰＥ（Ｇｄ）およびＤＰＳＢＳＡ（Ｇｄ）を形成した。これらの配合物の成分およびキャラクタリゼーションを表３にまとめ、これらの代表的なＴＥＭ画像を図７Ａに示す。ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳ（単一脂肪酸脂質鎖を含有する）は、ｄＮＰＳ１６ＰＥ、ｄＮＰＳ１６ＰＥ（Ｇｄ）およびｄＮＰＳＢＳＡ（Ｇｄ）（二重脂肪酸脂質鎖を含有する）のバリエーションと比較して有意に高い取り込みを実証し（図７Ｂ）、ｅＮＰＳまたはｄＮＰＳ中の単一脂肪酸脂質鎖が、ＮＰＳの最大取り込み／非消光をもたらすことを示した。
【0067】
コレステロールおよびＰＥＧ含有量がＮＰＳの細胞取り込みおよび血清安定性に与える効果の特性評価
ＮＰＳの血清安定性および可能な血液循環時間をさらに増加するために、ＬＣ－ｅＮＰＳと称する新規ｅＮＰＳ配合物を開発した。ＬＣ－ｅＮＰＳは、ＮＰＳと同じ比率のポルフィリン－脂質：ＥＤＴＡ－脂質を含むが、コレステロール（３０ｍｏｌ％）およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（５ｍｏｌ％）は含有量が増加した（表３）。５Ｍのナノ粒子との２４時間のインキュベーション後、ＬＣ－ｅＮＰＳは、ＰＳより１０倍強化された細胞内取り込みを維持したが、ｅＮＰＳと比較したとき５０％未満の細胞内取り込みを示した（図８Ａ）。無傷ポルフィゾーム中で蛍光が高度に消光するが、ポルフィゾームナノ構造が解離されたときは消光しないため、ＮＰＳの蛍光消光効率の変化を用いて粒子の安定性を追跡した。５０ｖｏｌ％のＦＢＳを含有するＰＢＳとのインキュベーション後、ＬＣ－ｅＮＰＳは、ｅＮＰＳと比較して高い安定性があるように見え、すべての時点でより高い蛍光消光があり、２４時間にわたって８５％の消光を維持し（図８Ｂ）、コレステロールおよびＰＥＧの含有量の、それぞれ３０％および５％への増加が、血清条件におけるｅＮＰＳの安定性を改善でき、細胞内取り込み効率が緩やかに減少することを示唆する。
ＮＰＳの血清安定性および可能な血液循環時間をさらに増加するために、ＬＣ－ｅＮＰＳと称する新規ｅＮＰＳ配合物を開発した。ＬＣ－ｅＮＰＳは、ＮＰＳと同じ比率のポルフィリン－脂質：ＥＤＴＡ－脂質を含むが、コレステロール（３０ｍｏｌ％）およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（５ｍｏｌ％）は含有量が増加した（表３）。５Ｍのナノ粒子との２４時間のインキュベーション後、ＬＣ－ｅＮＰＳは、ＰＳより１０倍強化された細胞内取り込みを維持したが、ｅＮＰＳと比較したとき５０％未満の細胞内取り込みを示した（図８Ａ）。無傷ポルフィゾーム中で蛍光が高度に消光するが、ポルフィゾームナノ構造が解離されたときは消光しないため、ＮＰＳの蛍光消光効率の変化を用いて粒子の安定性を追跡した。５０ｖｏｌ％のＦＢＳを含有するＰＢＳとのインキュベーション後、ＬＣ－ｅＮＰＳは、ｅＮＰＳと比較して高い安定性があるように見え、すべての時点でより高い蛍光消光があり、２４時間にわたって８５％の消光を維持し（図８Ｂ）、コレステロールおよびＰＥＧの含有量の、それぞれ３０％および５％への増加が、血清条件におけるｅＮＰＳの安定性を改善でき、細胞内取り込み効率が緩やかに減少することを示唆する。
【0068】
ＮＰＳの細胞内取り込みの機構の研究
次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＰＳの一般的な取り込み機構（受動または能動）を、温度およびエネルギー変調試験によって検査した。蛍光顕微鏡検査法を用いて、それらの取り込みを監視した。種々の温度条件でのｅＮＰＳおよびｄＮＰＳとのＫＢ細胞のインキュベーション後、１８℃および４℃と比較して、より強い蛍光シグナルが３７℃で観察され、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの急速な取り込みがほとんど能動プロセスを介したものだったことを示唆した（図９Ａ）。ＮａＮ３および２－ＤＧを使用してＡＴＰ枯渇細胞条件を作ることによって、普通の培養条件と比較して細胞内にｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの最小限の蛍光シグナルがあったことが観察された（図９Ｂ）。これは、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳが、主に能動的に細胞中へ輸送されることを示唆する。
次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＰＳの一般的な取り込み機構（受動または能動）を、温度およびエネルギー変調試験によって検査した。蛍光顕微鏡検査法を用いて、それらの取り込みを監視した。種々の温度条件でのｅＮＰＳおよびｄＮＰＳとのＫＢ細胞のインキュベーション後、１８℃および４℃と比較して、より強い蛍光シグナルが３７℃で観察され、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの急速な取り込みがほとんど能動プロセスを介したものだったことを示唆した（図９Ａ）。ＮａＮ３および２－ＤＧを使用してＡＴＰ枯渇細胞条件を作ることによって、普通の培養条件と比較して細胞内にｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの最小限の蛍光シグナルがあったことが観察された（図９Ｂ）。これは、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳが、主に能動的に細胞中へ輸送されることを示唆する。
【0069】
ＰＤＴ機構に関するｅＮＰＳの洞察を得るために、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳの細胞内局在性を、共焦点顕微鏡イメージング下、ＫＢ細胞上で検査した。ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳシグナルの点状パターンが明確に観察され、両方のナノ粒子が細胞質ゾル全体にわたって分散されなかったことを示唆する。ミトコンドリアおよびリソソームトラッカーを用いた共局在化によって、ｅＮＰＳおよびｄＮＰＳは、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭまたはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９のいずれかと共局在化したようには見えなかった（図１０）。さらに、小胞体、ゴルジ、およびエンドソームトラッカーなどの他のオルガネラトラッカーを用いた共局在化試験を検査する。
【0070】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤＴのためのＮＰＳの評価
ｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのＩｎ ｖｉｖｏのＰＤＴ活性化をＫＢ細胞中で評価した。結果を図１１に示し、５μＭのｅＮＰＳ、ＰＳ、およびＬＣ－ｅＮＰＳが、２４時間のインキュベーション後、細胞に最小限の暗毒性を有していたことを実証した。光線処置すると、ｅＮＰＳは、他の群と比較したとき、すべての時点で、細胞の生存率において最大の減少を誘導し、最大のＰＤＴ効力を有していたことを示唆した。ＬＣ－ｅＮＰＳはまた、細胞の生存率においてより大きな低下をもたらし、結果として生じる細胞死は、ＬＣ－ｅＮＰＳ粒子の濃度および光の線量に大いに対応していた。２４時間の細胞のインキュベーション後、５μＭのｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳは両方とも、５または１０Ｊ／ｃｍ２の線量で＞９５％の細胞死滅を引き起こした。しかしながら、ＰＳ処置細胞は、すべての実験条件（すべての濃度、インキュベーション時間、および光の線量）で最小限の細胞毒性を示した。ｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＤＴ効力傾向は、それらの取り込み効率とよく相関していた（図８Ａ）。したがって、ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳの強化輸送は、最終的に有効なＰＤＴを誘発した。
ｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのＩｎ ｖｉｖｏのＰＤＴ活性化をＫＢ細胞中で評価した。結果を図１１に示し、５μＭのｅＮＰＳ、ＰＳ、およびＬＣ－ｅＮＰＳが、２４時間のインキュベーション後、細胞に最小限の暗毒性を有していたことを実証した。光線処置すると、ｅＮＰＳは、他の群と比較したとき、すべての時点で、細胞の生存率において最大の減少を誘導し、最大のＰＤＴ効力を有していたことを示唆した。ＬＣ－ｅＮＰＳはまた、細胞の生存率においてより大きな低下をもたらし、結果として生じる細胞死は、ＬＣ－ｅＮＰＳ粒子の濃度および光の線量に大いに対応していた。２４時間の細胞のインキュベーション後、５μＭのｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳは両方とも、５または１０Ｊ／ｃｍ２の線量で＞９５％の細胞死滅を引き起こした。しかしながら、ＰＳ処置細胞は、すべての実験条件（すべての濃度、インキュベーション時間、および光の線量）で最小限の細胞毒性を示した。ｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＤＴ効力傾向は、それらの取り込み効率とよく相関していた（図８Ａ）。したがって、ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳの強化輸送は、最終的に有効なＰＤＴを誘発した。
【0071】
Ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＰＳによって強化された輸送および活性化の評価
ＮＰＳがｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍蓄積および活性化に与える影響を評価するために、等価用量のｅＮＰＳおよびＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ）を、ＫＢ皮下腫瘍を有するマウスに静脈内投与し、その後、Ｍａｅｓｔｒｏシステム（ＣＲＩ，ＵＳＡ）を使用して、２４時間にわたって動物全員ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行った。曝露時間２００ｍｓで５７５～６０５ｎｍの励起フィルターおよび６４５ｎｍのロングパスエミッションフィルターを使用して画像を獲得した。図１２に示すように、ｅＮＰＳは、注射してから３０分後の腫瘍中の有意な蓄積および活性化を実証し、２４時間安定したままだった（ｎ＝５）一方で、ＰＳは、５時間以内の腫瘍中で無視できる蛍光シグナルしか示さず、２４時間でさらに低いシグナルを示し、ｅＮＰＳが、成功裏の腫瘍蛍光イメージングのための腫瘍中のポルフィゾームの蓄積および活性化を有意に強化したことを示す。
ＮＰＳがｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍蓄積および活性化に与える影響を評価するために、等価用量のｅＮＰＳおよびＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ）を、ＫＢ皮下腫瘍を有するマウスに静脈内投与し、その後、Ｍａｅｓｔｒｏシステム（ＣＲＩ，ＵＳＡ）を使用して、２４時間にわたって動物全員ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行った。曝露時間２００ｍｓで５７５～６０５ｎｍの励起フィルターおよび６４５ｎｍのロングパスエミッションフィルターを使用して画像を獲得した。図１２に示すように、ｅＮＰＳは、注射してから３０分後の腫瘍中の有意な蓄積および活性化を実証し、２４時間安定したままだった（ｎ＝５）一方で、ＰＳは、５時間以内の腫瘍中で無視できる蛍光シグナルしか示さず、２４時間でさらに低いシグナルを示し、ｅＮＰＳが、成功裏の腫瘍蛍光イメージングのための腫瘍中のポルフィゾームの蓄積および活性化を有意に強化したことを示す。
【0072】
次いで、本発明者らは、ＤＭＢＡの反復処置によって生じ、ヒトの口腔癌の臨床症状を厳密に模倣する、より生物学的に関連したハムスター頬の発癌にＮＰＳ強化蛍光イメージングを適用した２６。ｅＮＰＳおよびＰＳを静脈内注射した後、ＮＯＶＡＤＡＱ Ｐｉｎｐｏｉｎｔシステム（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用してｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを実施し、ハムスター頬の腫瘍におけるポルフィリンの蛍光を視覚化した。図１３Ａに示すように、ｅＮＰＳの注射後１５分で腫瘍特異的な強い蛍光が検出され、３時間でピークが出現し、２４時間安定したままだった一方、ＰＳ基は、すべての時点で、かなり弱い腫瘍シグナルを示した。種々の時点における腫瘍蛍光強度は、Ｐｉｎｐｏｉｎｔシステムによって定量化され、図１３Ｂにプロフィール化した。すべての時点を通して、ｅＮＰＳ基（ｎ＝１２）対ＰＳ基（ｎ＝２）の腫瘍中で強化された蛍光シグナルが観察されたことが明確であり、具体的には、初期の時点の３時間で４．４倍に強化されたシグナルを、また２４時間で１．７倍の強化が観察された。これらのデータは、腫瘍中の、ＰＳを上回るｅＮＰＳの迅速かつ強化された蓄積および活性化をさらに実証した。したがって、ＮＰＳプラットフォームは、癌のイメージングおよび有効なＰＤＴのためのポルフィゾームを進歩させるために、ＰＳの乏しい腫瘍蓄積の限界を克服する可能性を提供する。
【0073】
Ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＤＴ
図１８を参照して、最適なレーザー処置パラメータを決定するためのｉｎ ｖｉｖｏのＰＤＴ予備実験後、様々なｄｒｕｇ－ｌｉｇｈｔ－ｉｎｔｅｒｖａｌにおけるｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのｉｎ ｖｉｖｏのＰＤＴ有効性の評価を実施した。皮下ＫＢ腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスにｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳまたはＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇのポルフィリン濃度）を静脈内注射した後、注射後１、３、および６時間で６７１ｎｍのレーザー照射（５０ｍＷ、１１５Ｊ／ｃｍ２）を行った。処置後のマウスの生存率および腫瘍サイズの変化を最長で４週間監視することによってＰＤＴ有効性を評価した。すべてのＰＤＴ処置群の腫瘍サイズは、対照群の腫瘍サイズと比較して統計的に低いことが判明した。ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳ（３時間のＤＬＩ）の両方は、ＰＳと比較して強化されたＰＤＴ有効性を実証した。３時間のＤＬＩでのｅＰＳおよびＬＣ－ｅＰＳ ＰＤＴ処置は、３時間のＤＬＩでのＰＳの２０％と比較して、有意に高い率の腫瘍の完全切除（それぞれ１００％および８０％）を示した。
図１８を参照して、最適なレーザー処置パラメータを決定するためのｉｎ ｖｉｖｏのＰＤＴ予備実験後、様々なｄｒｕｇ－ｌｉｇｈｔ－ｉｎｔｅｒｖａｌにおけるｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳ、およびＰＳのｉｎ ｖｉｖｏのＰＤＴ有効性の評価を実施した。皮下ＫＢ腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスにｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳまたはＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇのポルフィリン濃度）を静脈内注射した後、注射後１、３、および６時間で６７１ｎｍのレーザー照射（５０ｍＷ、１１５Ｊ／ｃｍ２）を行った。処置後のマウスの生存率および腫瘍サイズの変化を最長で４週間監視することによってＰＤＴ有効性を評価した。すべてのＰＤＴ処置群の腫瘍サイズは、対照群の腫瘍サイズと比較して統計的に低いことが判明した。ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳ（３時間のＤＬＩ）の両方は、ＰＳと比較して強化されたＰＤＴ有効性を実証した。３時間のＤＬＩでのｅＰＳおよびＬＣ－ｅＰＳ ＰＤＴ処置は、３時間のＤＬＩでのＰＳの２０％と比較して、有意に高い率の腫瘍の完全切除（それぞれ１００％および８０％）を示した。
【0074】
Ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光活性化
図１９を参照して、腫瘍部位でＰＤＴのために利用可能な、ＰＳと比較した、非消光または「活性」ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳの程度を評価するために、これらのナノ粒子の注射後の腫瘍蛍光活性化を監視した。皮下ＫＢ腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスにｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳまたはＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇのポルフィリン濃度）を静脈内注射した後、注射後１、３、および６時間で、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍蛍光イメージングを行った。ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳは両方とも、ＰＳと比較して、すべての時点で最大のｉｎ ｖｉｖｏ蛍光活性化を実証した。
図１９を参照して、腫瘍部位でＰＤＴのために利用可能な、ＰＳと比較した、非消光または「活性」ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳの程度を評価するために、これらのナノ粒子の注射後の腫瘍蛍光活性化を監視した。皮下ＫＢ腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスにｅＮＰＳ、ＬＣ－ｅＮＰＳまたはＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇのポルフィリン濃度）を静脈内注射した後、注射後１、３、および６時間で、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍蛍光イメージングを行った。ｅＮＰＳおよびＬＣ－ｅＮＰＳは両方とも、ＰＳと比較して、すべての時点で最大のｉｎ ｖｉｖｏ蛍光活性化を実証した。
【0075】
この研究では、ポルフィゾーム配合物中に一本鎖脂肪酸ＥＤＴＡ－脂質を導入することによって次世代ポルフィゾームプラットフォーム（ＮＰＳ）を開発し、これは、有意に強化された細胞内腫瘍細胞蓄積を実証し、有効性ＰＤＴをもたらす。ＮＰＳの強化された腫瘍蓄積および活性化は、皮下マウス腫瘍モデルおよび生体関連ハムスター頬発癌モデルの両方においても有効とされてきた。本発明者らの知る限りでは、これは、ＥＤＴＡ－脂質をナノ粒子配合物に組み込んで、それらの生物学的および治療特性を改善するための最初の報告である。重要なことには、ＥＤＴＡ－脂質によるナノ粒子の強化された輸送は、先に知られていない機構を介したものであり、単一脂肪酸ＤＴＰＡ－脂質抱合体まで拡張できるが、他の二重脂肪酸ＤＴＰＡ－脂質までは拡張できない。それらの光線療法の可能性は別として、ＮＰＳは、その優先的な迅速の取り込みおよび活性化された蛍光の誘導に起因して、蛍光誘導手術の適用に対して大きな将来性を示す。ＥＤＴＡ－脂質／ＤＴＰＡ－脂質の追加の金属／放射性同位体キレート化の能力は、ポルフィゾームの固有の金属キレート特性を補完し、ＮＰＳに、マルチモーダルイメージングおよび放射線療法のための広範囲の放射性同位体を輸送させる。したがって、ＮＰＳプラットフォームは、癌のマルチモーダルイメージングおよび有効なＰＤＴのためのポルフィゾームを進歩させるために、ポルフィゾームの乏しい細胞内蓄積の限界を克服する可能性を実証する。
【0076】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載してきたが、当業者であれば、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく変更が可能であることを理解するであろう。以下の参考文献一覧を含めた本明細書で開示したすべての文書は、参照により組み込まれる。
【0077】
参考文献一覧
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【国際調査報告】