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特表2024-526356Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアントおよびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアントおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240709BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240709BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240709BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240709BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240709BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240709BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240709BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240709BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240709BHJP
C12Q 1/06 20060101ALN20240709BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/47 ZNA
C07K16/00
C07K19/00
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502451
(86)(22)【出願日】2022-07-15
(85)【翻訳文提出日】2024-03-14
(86)【国際出願番号】 EP2022069925
(87)【国際公開番号】W WO2023285686
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】21305993.4
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】22305328.1
(32)【優先日】2022-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524019243
【氏名又は名称】ディオジェンクス
(71)【出願人】
【識別番号】518095987
【氏名又は名称】アンスティチュート ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ レシェルシュ メディカル （アンセルム）
(71)【出願人】
【識別番号】513015441
【氏名又は名称】サントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック － セーエヌエールエス
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ － ＣＮＲＳ
【住所又は居所原語表記】３，ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ａｎｇｅ，Ｆ－７５０１６ Ｐａｒｉｓ １６，Ｆｒａｎｃｅ
(71)【出願人】
【識別番号】520100435
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・コート・ダジュール
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｃｏｔｅ ｄ’Ａｚｕｒ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】コロンバ，パトリック
(72)【発明者】
【氏名】ボティ，パオロ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS36
4B064AG01
4B064AG26
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA53
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアント、および特に糖尿病の処置のための医薬品としてのその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のＦＵ１ドメイン、ＦＵ２ドメイン、ＴＳＰドメインおよびＢＲドメインを含む、Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアント：ａ．ＦＵ１は、配列番号５、９、１３および１７にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ１ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
ｂ．ＦＵ２は、配列番号６、１０、１４、１８にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ２ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
ｃ．ＴＳＰは、配列番号７、１１、１５、１９に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＴＳＰドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、ならびに
ｄ．ＢＲは、配列番号８、１２、１６、２０に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＢＲドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである。
【請求項2】
少なくともＨ１０８ＫおよびＮ１０９Ｄのアミノ酸置換を有するＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインならびにＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインを含む；好ましくは配列番号６６を含むか、または本質的に配列番号６６からなる、請求項１に記載のスポンジンタンパク質の組換えバリアント。
【請求項3】
配列番号５のヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインおよび配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインを対応させてそれぞれアライメントした場合に、ＦＵ１ドメインまたはＦＵ２ドメインの各々において１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超えないアミノ酸置換を有する、請求項１または２に記載の組換えバリアント。
【請求項4】
Ｒｓｐｏ１の２１～３３の領域内、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４における同等領域内の、最初の１０～１４個のＮ末端アミノ酸の欠失、典型的にはＲｓｐｏ１の残基２１～３１の欠失を含む；好ましくは、配列番号２４のタンパク質を含むか、または配列番号２４のタンパク質からなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えバリアント。
【請求項5】
配列番号５のヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインにおけるＲ６６のアミノ酸置換、または、ヒトＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４のＦＵ１ドメイン配列における同等のアルギニン残基のアミノ酸置換を少なくとも含み、前記アミノ酸置換はＺＮＲＦ３結合を減少または消失させる；典型的には、ＺＮＲＦ３結合を減少または消失させる残基Ｒ６６の単一アミノ酸置換、典型的にはＲ６６Ａを有する、配列番号５のＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインを含む；例えば、配列番号２３を含むか、または本質的に配列番号２３からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換えバリアント。
【請求項6】
ＦＵ２とＴＳＰドメインとの間にＮ－グリコシル化部位を含んでいない、例えば、Ｒｓｐｏ１の残基Ｎ１３７、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４の同等の残基において変異を含み、この部位でのＮ－グリコシル化を抑制する；好ましくは、配列番号２２を含むか、または本質的に配列番号２２からなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えバリアント。
【請求項7】
前記ＦＵ１ドメインは、配列番号９のＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメインと１００％同一であり、前記ＦＵ２は、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３、Ｒｓｐｏ４、または、これらの機能的バリアントであって、ＬＧＲ４に対する結合親和性を少なくとも同じに維持するアミノ酸置換を有するバリアントのＦＵ２ドメインの中から選択される；好ましくは、配列番号９のＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメインおよび配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で、配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含む；より好ましくは、配列番号２５または配列番号２６を含むか、または本質的に配列番号２５または配列番号２６からなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えバリアント。
【請求項8】
配列番号４１のＲｓｐｏ１タンパク質と少なくとも同程度のレベルで以下の特性を１つ以上示す請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えバリアント：（ｉ）Ｒｓｐｏ１／ＬＧＲ４結合親和性インビトロアッセイにて測定し、例えばＳＰＲアッセイにより決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同一の親和性でＬＧＲ４レセプターに結合する；
（ｉｉ）例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する；および／または
（ｉｉｉ）例えばインビボのβ細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えバリアントと、前記組換えバリアントに対して、直接、またはペプチドリンカーを介して間接的に融合したＦｃ断片と、を含む；好ましくは、配列番号４２、４３、９２または９３を含むか、または本質的に配列番号４２、４３、９２または９３からなる、Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項10】
特に糖尿病、より好ましくはＩ型またはＩＩ型糖尿病を処置するための薬剤として使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えバリアント、または請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えバリアント、または請求項９に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項12】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項13】
請求項１１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項14】
（ｉ）前記組換えバリアントまたは融合タンパク質の発現条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養する工程、（ｉｉ）前記組換えバリアントまたは融合タンパク質を回収する工程、（ｉｉｉ）任意選択で、前記組換えバリアントまたは融合タンパク質を精製する工程を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えバリアントまたは請求項９に記載の融合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本開示は、Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアント、および特に糖尿病の処置のための医薬品としてのその使用に関する。
【0002】
〔背景〕
過去数十年の間に、糖尿病は、世界人口のほぼ９％に影響を及ぼす、流行している規模（epidemic dimension）である最も広範囲に及ぶ代謝障害の１つとなっている（ＷＨＯ、２０１６年）。２０４９年までに、糖尿病に罹患した人の数は、６億人に達すると予想される。糖尿病は高い血糖値を特徴とし、ほとんどの場合、膵臓が十分量のインスリンを分泌できないことに起因する。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）はインスリン産生β細胞の自己免疫介在性破壊によって引き起こされる一方、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）はインスリン作用に対する抵抗性および最終的なβ細胞不全／経時的損失に起因する。
過去数十年の間に、糖尿病は、世界人口のほぼ９％に影響を及ぼす、流行している規模（epidemic dimension）である最も広範囲に及ぶ代謝障害の１つとなっている（ＷＨＯ、２０１６年）。２０４９年までに、糖尿病に罹患した人の数は、６億人に達すると予想される。糖尿病は高い血糖値を特徴とし、ほとんどの場合、膵臓が十分量のインスリンを分泌できないことに起因する。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）はインスリン産生β細胞の自己免疫介在性破壊によって引き起こされる一方、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）はインスリン作用に対する抵抗性および最終的なβ細胞不全／経時的損失に起因する。
【0003】
糖尿病の現在の処置では正常血糖を厳密に回復することができず、Ｔ１Ｄの場合には外因性インスリン注射による欠損インスリン分泌の代わりはむしろ症状緩和のように見えることさえある。したがって、新たに機能するβ細胞を膵臓に補充し、および／または、残りのβ細胞の健全な状態を維持することは、両方の状態の処置のための重要な戦略となる。しかしながら、現在まで、特に１型糖尿病に罹患しているヒト患者において、膵臓β細胞の損失を予防する、または増殖を誘導する利用可能な処置がない。
【0004】
Ｒｓｐｏ１は、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３およびＲｓｐｏ４も含む、システインリッチな分泌タンパク質のファミリーに属する。それらは、図１に示すように、４つの構造的および機能的に異なるドメインを含む共通の構造的構成を共有する。Ｎ末端において、シグナルペプチド配列はＲ－スポンジン（spondin）タンパク質の標準的な分泌経路への正しい進入を保証している。成熟分泌形態は、Ｒ－スポンジン特異的レセプターＬＧＲ（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター）４～６との相互作用に重要な、２つのアミノ末端システインリッチフリン様リピート（ＦＵ１およびＦＵ２）を含む（de Lau, W. B., Snel, B. & Clevers, H. C. Genome Biol 13, 242, doi:10.1186/gb-2012-13-3-242 (2012)）。タンパク質の中央部にはトロンボスポンジン１型リピートドメイン（ＴＳＰ１）が１つあり、細胞外マトリックスの特定成分との相互作用に関与し、カルボキシ末端塩基性アミノ酸リッチドメインが続いているが、その役割はまだ明らかになっていない。Ｒ－スポンジンタンパク質は細胞増殖（Kim, K. A. et al. Science 309, 1256-1259, doi:10.1126/science.1112521 (2005). Da Silva, F. et al. Dev Biol 441, 42-51, doi:10.1016/j.ydbio.2018.05.024 (2018))、細胞指定(Vidal, V. et al. Genes Dev 30, 1389-1394, doi: 10.1101/gad.277756.116 (2016)）、および、性決定（Chassot, A. A. et al. Hum Mol Genet 17, 1264-1277, doi:10.1093/hmg/ddn016 (2008)）等のプロセスにおいて重要な役割を発揮することが報告されている。そして、標準的なＷＮＴシグナル伝達経路（ＷＮＴ／β－カテニンまたはｃＷＮＴ経路としても知られる）の中心的な調節因子として報告されている（Jin, Y. R. & Yoon, J. K. The R-spondin family of proteins: emerging regulators of WNT signaling. Int J Biochem Cell Biol 44, 2278-2287, doi:10.1016/j.biocel.2012.09.006 (2012)）。
【0005】
膵臓の成熟および機能におけるｃＷＮＴ経路の関与の可能性によって提起された大きな関心にもかかわらず（Scheibner et al 2019, Curr Opin Cell Biol. 61:48-55）、Ｒ－スポンジンタンパク質の役割および寄与は、この器官においてほとんど研究されていない。
【0006】
インビトロ分析はＲｓｐｏ１の存在下で、β細胞増殖および機能がＭｉｎ６腫瘍由来細胞株において増加することを報告した（Wong, V. S., Yeung, A., Schultz, W. & Brubaker, P. L. R-spondin-1 is a novel beta-cell growth factor and insulin secretagogue. J Biol Chem 285, 21292-21302, doi:10.1074/jbc.M110.129874 (2010)）。しかしながら、同じグループからのさらに最近の研究は、矛盾する記載を報告した：マウスにおけるＲｓｐｏ１欠損がβ細胞量（cell mass）の増加および血糖コントロールの増強と関連する（Wong, V. S., Oh, A. H., Chassot, A. A., Chaboissier, M. C. & Brubaker, P. L. Diabetologia 54, 1726-1734, doi:10.1007/s00125-011-2136-2 (2011)、および、Chahal et al 201, Pancreas Vol 43(1) pp 93-102）。
【0007】
後者の研究とは対照的に、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０５０２８９は、組換えＲｓｐｏ１タンパク質による処置が、糖尿病のマウスモデルにおいて、機能的膵臓β細胞のインビボの増殖を誘導し、耐糖能を改善し、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を増加させることを報告している。さらに、ほぼ完全なβ細胞アブレーションを行い、Ｒｓｐｏ１タンパク質投与によって残りのβ細胞が正常血糖を維持できる機能的なβ細胞量の増殖および再構築を誘導できることが示唆された。最後に、Ｒｓｐｏ１はヒトのβ細胞増殖も誘導できることが示され、組換えＲｓｐｏ１タンパク質を用いたヒトの糖尿病の処置および予防のための新たな予想外の道が開かれた。
【0008】
レセプター結合および生物活性に重要なＲＳＰＯ１残基は、例えば、Wang et Al. GENES & DEVELOPMENT 27:1339-1344, 2013; Xie et Al. EMBO reports VOL 14 | NO 12 | 2013; Xu et Al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 290, NO. 4, pp. 2455-2465, January 23, 2015に報告されている。図１には、ＺＮＲＦ３およびＬＧＲ４両方のレセプターにおける結合および活性の鍵となる残基が示されるとともに報告されている。
【0009】
Ｒｓｐｏ１由来のタンパク質をさらに改良して、生物学的医薬品として使用するための開発可能な特性および薬理学的特性を最適化する必要性がまだある。
【0010】
したがって、本開示の目的は、例えば糖尿病の処置において薬剤として使用するためのＲ－スポンジンタンパク質の新規組換えバリアントを提供することである。
【0011】
〔詳細な説明〕
定義
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語を最初に定義する。詳細な説明の全体にわたって、追加の定義を示す。
定義
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語を最初に定義する。詳細な説明の全体にわたって、追加の定義を示す。
【0012】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および非天然アミノ酸（本明細書では「天然に存在しないアミノ酸」とも示す）、例えば、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を示す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素、を有する化合物を示し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。当該アナログは修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有することができるが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を示す。用語「アミノ酸」および「アミノ酸残基」は、全体を通して互換的に使用される。
【0013】
置換とは、天然に存在するアミノ酸を、別の天然に存在するアミノ酸または非天然アミノ酸で置換することを示す。例えば、合成ペプチドの化学合成の間、天然アミノ酸は、別の天然に存在するアミノ酸または非天然アミノ酸によって容易に置換されることができる。あるいは、コドンを別のアミノ酸残基をコードするコドンに変えるために、遺伝子コード配列を変異させることによって置換することもできる。変異したコード配列の発現によって得られるポリペプチドは、１つのアミノ酸置換（別の異なるアミノ酸で置換された１つのアミノ酸）を有する。
【0014】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」は、１つ以上の直鎖（「ポリペプチド鎖」とも示す）に配置されたアミノ酸からできており、球状形態に折り畳まれた任意の有機化合物をいう。これには、タンパク質性物質または融合タンパク質が含まれる。当該ポリペプチド鎖中のアミノ酸は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって一緒に結合してもよい。用語「タンパク質」はペプチド、単鎖ポリペプチド、または主に２つ以上のアミノ酸鎖からなる任意の複合タンパク質をさらに含むが、これらに限定されない。それはさらに、糖タンパク質または他の公知の翻訳後修飾を含むが、これらに限定されない。それはさらに、天然タンパク質の公知の天然または人工の化学修飾、例えば、糖鎖エンジニアリング、ペグ化（pegylation）、ヘシル化（hesylation）、ＰＡＳ化（PASylation）等、非天然アミノ酸の組込み、化学コンジュゲートまたは他の分子のためのアミノ酸修飾等を含むが、これらに限定されない。
【0015】
本明細書で使用される場合、用語「組換えタンパク質」は、対応するタンパク質を発現するために形質転換された宿主細胞から（例えば、トランスフェクトーマ等から）単離された融合タンパク質等の、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されるタンパク質を含む。
【0016】
本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」は、遺伝的融合によって、例えば別個のタンパク質の別個の機能的ドメインをコードする少なくとも２つの遺伝子断片の遺伝的融合によって、得られるかまたは得ることができる少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む組換えタンパク質を示す。したがって、本開示のタンパク質融合物は後述のＲ－スポンジンまたはそのバリアントの少なくとも１つ、および少なくとも１つの他の部分を含む。当該他の部分は、後述のＲ－スポンジンポリペプチドまたはそのバリアント以外のポリペプチドである。特定の実施形態において、当該他の部分はまた、非タンパク質部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、または他の化学部分もしくはコンジュゲート）であってもよい。好ましい実施形態において、第２の部分は抗体のＦｃ領域であり得、したがって、このような融合タンパク質は「Ｆｃ融合タンパク質」と示す。
【0017】
本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域（天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む）を定義するために使用され、好ましくは天然ヒトＦｃ領域に対して５、１０、１５、または２０以下のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。天然ヒトＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭアイソタイプのいずれでもあり得る。ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、ＩｇＧ抗体のＣ２２６またはＰ２３０の位置からカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むものとして定義される。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵ番号付け（EU index）である。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（残基Ｋ４４７）は例えば、Ｆｃ融合タンパク質の産生または精製の間に除去されてもよい。
【0018】
本明細書で使用される場合、２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）、ギャップの数および各ギャップの長さは２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は後述の数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【0019】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ニードルマンおよびブンシュのアルゴリズム（NEEDLEMANおよびWunsch）を使用して決定することができる。
【0020】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ペアワイズアラインメント；www.ebi.ac.ukで利用可能、Rice et al 2000 Trends Genet 16 :276-277）等のアルゴリズムを使用して決定してもよい。例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１０の「ギャップ開始ペナルティ（gap open penalty）」、０．５の「ギャップ伸長ペナルティ（gap extend
penalty）」、偽の「エンドギャップペナルティ（end gap penalty）」、１０の「エンドギャップ開始ペナルティ（end gap open penalty）」、および０．５の「エンドギャップ伸長ペナルティ（end gap extend penalty）」とともに使用してもよい。一般に、「パーセント同一性」は、一致する位置の数を比較される位置の数で割って、１００を掛けた関数である。例えば、１０個の配列位置のうち６個が、アラインメント後の２つの比較される配列の間で同一である場合、同一性は６０％である。％同一性は典型的には、分析が行われるクエリー配列の全長にわたって決定される。同じ一次アミノ酸配列または核酸配列を有する２つの分子は、任意の化学的および／または生物学的修飾にかかわらず同一である。
penalty）」、偽の「エンドギャップペナルティ（end gap penalty）」、１０の「エンドギャップ開始ペナルティ（end gap open penalty）」、および０．５の「エンドギャップ伸長ペナルティ（end gap extend penalty）」とともに使用してもよい。一般に、「パーセント同一性」は、一致する位置の数を比較される位置の数で割って、１００を掛けた関数である。例えば、１０個の配列位置のうち６個が、アラインメント後の２つの比較される配列の間で同一である場合、同一性は６０％である。％同一性は典型的には、分析が行われるクエリー配列の全長にわたって決定される。同じ一次アミノ酸配列または核酸配列を有する２つの分子は、任意の化学的および／または生物学的修飾にかかわらず同一である。
【0021】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は好ましくは哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ等）を含む。
【0022】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｒ－スポンジンタンパク質」は、対応するＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、Ｒｓｐｏ４遺伝子それぞれによってコードされる天然のＲ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、またはＲ－スポンジン４タンパク質（本明細書中ではＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、Ｒｓｐｏ４タンパク質とも称する）を指す。
【0023】
天然のＲ－スポンジンタンパク質は、典型的にはそのＮ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド（ＳＰ）、２つのシステインリッチフリン様ドメイン（ＦＵ１およびＦＵ２）、ＦＵ２ドメインとＴＳＰドメインとの間のＮ－グリコシル化部位、トロンボスポンジン（ＴＳＰ１）モチーフ（ＴＳＰ）、ならびに塩基性アミノ酸リッチ（ＢＲ）ドメインを含み、潜在的なＯ－グリコシル化部位を含む。
【0024】
図１は、異なるドメインＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲの概略とともに、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３およびＲｓｐｏ４アミノ酸配列のアラインメントを提供する。本明細書を通して、Ｒｓｐｏ１のアミノ酸位置、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３およびＲｓｐｏ４の「同等のアミノ酸位置」を言及する場合、「同等の」アミノ酸位置を特定するために図１のアラインメントを参照すべきである。同様に、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４の「同等の（または対応する）」Ｒｓｐｏ１のドメインは、図１のアラインメントを参照することで同定できる。ヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３およびＲｓｐｏ４の全長のアミノ酸配列（それらのシグナルペプチドを有する）は、それぞれ配列番号１～４に記載されている。ヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５～８に記載されている。ヒトＲｓｐｏ２のＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９～１２に記載されている。ヒトＲｓｐｏ３のＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３～１６に記載されている。ヒトＲｓｐｏ４のＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７～２０に記載されている。
【0025】
本明細書で使用する場合、用語「キメラタンパク質」は、特定のタンパク質内の１つ以上のドメインの、同じファミリーのタンパク質の同等のドメインによる置換を含むタンパク質をいう。例えば、Ｒｓｐｏ１のキメラタンパク質は、Ｒｓｐｏ２の対応するＦＵ１ドメインによりＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインが置換され、天然Ｒｓｐｏ１タンパク質と同一の他のドメイン（ＦＵ２、ＴＳＰ、またはＢＲドメインなど）を含む。
【0026】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリッドドメイン」は、いくつかのアミノ酸残基が同じファミリーの別のメンバーの同等の残基に変異されたタンパク質のドメインを指す。例えば、Ｒ－スポンジンタンパク質のハイブリッドＦＵ１ドメインは、１つ以上のアミノ酸残基をＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメインの同等の残基に置換するためになされた、いくつかの変異を有するＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメインに対応し得る。
【0027】
本開示のバリアント
本開示は、以下のＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインを含む、天然Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアントに関する。
・ＦＵ１は、配列番号５、９、１３および１７にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ１ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
・ＦＵ２は、配列番号６、１０、１４、１８にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ２ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
・ＴＳＰは、配列番号７、１１、１５、１９に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＴＳＰドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、ならびに
・ＢＲは、配列番号８、１２、１６、２０に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＢＲドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである。
本開示は、以下のＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインを含む、天然Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアントに関する。
・ＦＵ１は、配列番号５、９、１３および１７にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ１ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
・ＦＵ２は、配列番号６、１０、１４、１８にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ２ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
・ＴＳＰは、配列番号７、１１、１５、１９に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＴＳＰドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、ならびに
・ＢＲは、配列番号８、１２、１６、２０に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＢＲドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである。
【0028】
前記で定義した天然Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアントを、以下「本開示のバリアント」または「Ｒｓｐｏ１バリアント」と称する。
【0029】
読みやすくするために、以下に記載する本開示のバリアントの配列は、常にシグナルペプチド配列なしで記載する。しかしながら、本明細書に開示される全てのバリアントは、Ｎ末端シグナルペプチド（ＳＰ）配列、特にＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４の（ＳＰ）配列のうち１つ、典型的にはＲｓｐｏ１タンパク質のアミノ酸残基１～２０を含んでいても含まなくてもよい。本開示のバリアントはまた、その正常なシグナル配列を欠失し、代わりに異なるシグナル配列を有することがある。シグナル配列の選択は、組換えタンパク質が生産される宿主細胞の種類に依存し、異なるシグナル配列が天然シグナル配列の代わりになり得る。さらに、本開示のバリアントは、例えば精製のために、そのＣ末端に追加のペプチド配列を含み得る。本明細書に開示される全てのバリアントはまた、６個のヒスチジン残基を含む配列番号９０のポリヒスチジンタグのようなＣ末端タグを含み得る。
【0030】
前記バリアントの具体的な実施形態において、ドメインＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲは、それぞれ、配列番号１のヒトＲｓｐｏ１ドメインのＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインと少なくとも８０％の同一性を有する。
【0031】
具体的な実施形態において、ＴＳＰドメインおよびＢＲドメインは、それぞれ、対応するヒトＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよびＢＲドメインと１００％の同一性を有し、ＦＵ１ドメインおよびＦＵ２ドメインのアミノ酸配列は、対応するヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１およびＦＵ２アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、その違いはアミノ酸置換によるものである。
【0032】
具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、配列番号５のヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインおよび配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインを対応させてそれぞれアライメントした場合に、ＦＵ１ドメインまたはＦＵ２ドメインの各々において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超えないアミノ酸置換を有する。
【0033】
具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、以下を含むキメラタンパク質である：
（ｉ）配列番号９のＲｓｐｏ２のＦＵ１において１、２、３、５、６、７、８、９、または１０個を超えないアミノ酸置換を有するハイブリッドＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号６と同一であるか、または配列番号６と比較してＦＵ２ドメインに１、２、３、５、６、７、８、９、または１０個を超えないアミノ酸置換を含むＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメイン。
（ｉ）配列番号９のＲｓｐｏ２のＦＵ１において１、２、３、５、６、７、８、９、または１０個を超えないアミノ酸置換を有するハイブリッドＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号６と同一であるか、または配列番号６と比較してＦＵ２ドメインに１、２、３、５、６、７、８、９、または１０個を超えないアミノ酸置換を含むＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメイン。
【0034】
好ましくは、本明細書に記載された、本開示のバリアント、またはそれらの機能的同等物は、配列番号４１のＲｓｐｏ１タンパク質に少なくとも類似するレベルで、以下の特性の１つ以上を示す：
（ｉ）例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する；および／または
（ｉｉ）例えばインビボのβ細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する；
（ｉｉｉ）任意選択で、Ｒｓｐｏ１／ＬＧＲ４結合親和性インビトロアッセイにて測定し、例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイにより決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同一の親和性でＬＧＲ４レセプターに結合する；
（ｉｖ）任意選択で、Ｒｓｐｏ１／ＺＮＲＦ３結合親和性インビトロアッセイにて測定し、例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイにより決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同一の親和性でＺＮＲＦ３レセプターに結合する、
（ｖ）任意選択で、インビトロにて、例えばトップフラッシュアッセイ（Top Flash assay）で決定すると、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を増強する。
（ｉ）例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する；および／または
（ｉｉ）例えばインビボのβ細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する；
（ｉｉｉ）任意選択で、Ｒｓｐｏ１／ＬＧＲ４結合親和性インビトロアッセイにて測定し、例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイにより決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同一の親和性でＬＧＲ４レセプターに結合する；
（ｉｖ）任意選択で、Ｒｓｐｏ１／ＺＮＲＦ３結合親和性インビトロアッセイにて測定し、例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイにより決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同一の親和性でＺＮＲＦ３レセプターに結合する、
（ｖ）任意選択で、インビトロにて、例えばトップフラッシュアッセイ（Top Flash assay）で決定すると、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を増強する。
【0035】
本開示のバリアントは、特にヒトにおける糖尿病の処置、および／またはインビボもしくはインビトロでの膵臓β細胞の増殖を誘導するための医薬品として有利に使用することができる。
【0036】
Ａ．Ｎ末端残基のアミノ酸欠失
本発明者らは、驚くべきことに、Ｒｓｐｏ１タンパク質の残基２１～３１の欠失によって、配列番号４１の天然Ｒｓｐｏ１タンパク質と比較して、Ｍｉｎ６増殖アッセイにおいてより活発なタンパク質となることを見出した。従って、具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、Ｒｓｐｏ１の領域２１～３３内、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４における同等領域内の、最初の１０～１４個のＮ末端アミノ酸残基の欠失を含む。典型的には、本開示のバリアントは、Ｒｓｐｏ１の領域２１～３３内の１０～１４個のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有するＲｓｐｏ１タンパク質である。
本発明者らは、驚くべきことに、Ｒｓｐｏ１タンパク質の残基２１～３１の欠失によって、配列番号４１の天然Ｒｓｐｏ１タンパク質と比較して、Ｍｉｎ６増殖アッセイにおいてより活発なタンパク質となることを見出した。従って、具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、Ｒｓｐｏ１の領域２１～３３内、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４における同等領域内の、最初の１０～１４個のＮ末端アミノ酸残基の欠失を含む。典型的には、本開示のバリアントは、Ｒｓｐｏ１の領域２１～３３内の１０～１４個のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有するＲｓｐｏ１タンパク質である。
【0037】
より具体的には、本開示のバリアントは、配列番号２４のタンパク質を含むか、または配列番号２４のタンパク質からなる。当該タンパク質は、Ｒｓｐｏ１のアミノ酸残基２１～３１が欠失したヒトＲｓｐｏ１に対応する（実施例に開示されたバリアント＃００９を参照）。
【0038】
Ｂ．β細胞増殖を増大させるＦＵ１ドメインのアミノ酸置換。
【0039】
Ｒｓｐｏ１のＦＵ１ドメインにおける変異Ｒ６６Ａは、ＺＮＲＦ３に対するＲｓｐｏ１の結合を減少または消失させることがＸｉｅら（EMBO reports VOL 14 | NO 12 | 2013）に記載されている。
【0040】
本明細書で用いられるＺＮＲＦ３は、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼを指し、Ｗｎｔレセプター複合体の成分であるＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ６のユビキチン化ならびにそれに続く分解を仲介することによって、Ｗｎｔシグナル伝達経路の負の調節因子として働く。Ｒスポンジンは、標準的および非標準的の両方のＷｎｔシグナル伝達経路に作用する。Ｒスポンジンタンパク質、特にＲｓｐｏ１はＺＮＲＦ３と結合することが報告されており［、Ｒ－スポンジンのシグナル伝達活性に必要であると記載されている（Xie et Al. EMBO reports VOL 14 | NO 12 | 2013）。ＺＮＲＦ３タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおいて、アクセッション番号Ｑ９ＵＬＴ６およびＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｚ Ｇｅｎｅ番号８４１３３に記載されている。
【0041】
本発明者らは、Ｒｓｐｏ１の変異Ｒ６６Ａは、Ｍｉｎ６増殖アッセイにおいてＲｓｐｏ１の機能を消失させないだけでなく、その活性を驚くほど向上させることを見出した。
【0042】
具体的な実施形態において、有利には、本開示のバリアントは、配列番号５のヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメイン中の残基Ｒ６６、またはヒトＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４のＦＵ１ドメイン配列の同等のアルギニン残基のＺＮＲＦ３結合を減少または消失させるアミノ酸置換を少なくとも含む。
【0043】
任意のバリアントのＺＮＦＲ３に対する結合親和性は、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１タンパク質のＺＮＲＦ３に対する対応する結合親和性と比較され得る。ＺＮＲＦ３に対する結合親和性を測定する方法は実施例に記載されており、例えば、以下の実施例に開示されているようなＺＮＲＦ３結合アッセイが含まれる。本明細書で使用する場合、ＺＮＲＦ３結合の減少は、結合親和性が、参照の配列番号４１のＲｓｐｏ１で測定した対応する結合親和性よりも有意に低いこと、好ましくは少なくとも２０％低いこと、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％低いことを意味する。結合が検出可能なレベル以下であるか、非特異的結合タンパク質と同様である場合、結合は消失する。
【0044】
典型的には、本開示の前記バリアントは、ＺＮＲＦ３結合を減少または消失させる残基Ｒ６６の単一アミノ酸置換、典型的にはＲ６６Ａを有する、配列番号５のＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインを含む。具体的な実施形態において、本開示の前記バリアントは、ＺＮＲＦ３結合を減少または消失させる残基Ｒ６６の単一アミノ酸置換、典型的にはＲ６６Ａを有する、配列番号５のＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインを含み、前記ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインは、それぞれＲｓｐｏ１のＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインと９５％、好ましくは１００％同一である。
【0045】
例えば、本開示のバリアントは、配列番号２３を含むか、または本質的に配列番号２３からなる（以下の実施例に開示されるバリアント＃００８に対応する）。
【0046】
Ｃ．ＬＧＲ４および／またはＺＮＲＦ３に対する結合を増加させるためのＦＵ１およびＦＵ２ドメインのアミノ酸置換
本開示のバリアントは、配列番号４１の天然Ｒｓｐｏ１と比較して、ＬＧＲ４および／またはＺＮＲＦ３に対する結合親和性を高めるために、ＦＵ１および／またはＦＵ２ドメインにおいてアミノ酸置換をさらに含み得る。
本開示のバリアントは、配列番号４１の天然Ｒｓｐｏ１と比較して、ＬＧＲ４および／またはＺＮＲＦ３に対する結合親和性を高めるために、ＦＵ１および／またはＦＵ２ドメインにおいてアミノ酸置換をさらに含み得る。
【0047】
任意のバリアントのＬＧＲ４および／またはＺＮＦＲ３に対する結合親和性は、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１タンパク質のＺＮＲＦ３またはＬＧＲ４に対する対応する結合親和性と比較され得る。ＺＮＲＦ３またはＬＧＲ４に対する結合親和性を測定する方法は実施例に記載されており、例えば以下の実施例に開示されているようなＺＮＲＦ３結合アッセイが含まれる。本明細書で使用する場合、ＺＮＲＦ３またはＬＧＲ４結合の増加は、結合親和性が、参照の配列番号４１のＲｓｐｏ１で測定した対応する結合親和性よりも有意に高いこと、好ましくは少なくとも１０％高いこと、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％高いことを意味する。
【0048】
ＬＧＲ４および／またはＺＮＲＦ３への結合親和性に関連するアミノ酸残基、および可能性のあるアミノ酸変異は、特にWang et Al. GENES & DEVELOPMENT 27:1339-1344, 2013; Xie et Al. EMBO reports VOL 14 | NO 12 | 2013; Xu et Al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 290, NO. 4, pp. 2455-2465, January 23, 2015に記載されている。
【0049】
具体的な実施形態において、本開示の前記バリアントは、ＬＧＲ４への結合親和性を増強させるために、Ｒｓｐｏ１の位置Ｈ１０８、Ｎ１０９、Ｅ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２７、Ａ１２８、Ｓ１３３、Ａ１３６、Ｇ１３８、もしくはＳ１４３、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基において、１つ以上のアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態において、本開示の前記バリアントは、Ｒｓｐｏ１のＦＵ２、またはＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４（好ましくはＲｓｐｏ１）の対応する残基において、次のアミノ酸置換Ｈ１０８Ｋ、Ｈ１０８Ｒ、Ｎ１０９Ｄ、Ｎ１０９Ｅ、Ｅ１１６Ｖ；Ｌ１１８Ｆ；Ｐ１２７Ｄ；Ａ１２８Ｅ；Ｓ１３３Ｆ；Ａ１３６Ｌ；Ｇ１３８Ｅ；Ｓ１４３Ｖのうちの１つ以上を含む。より具体的には、本開示の前記バリアントは、配列番号６６（実施例に記載のバリアント＃０４９に対応する）、配列番号７０（実施例に記載のバリアント＃０５４に対応する）、配列番号７２（実施例に記載のバリアント＃０５６に対応する）、配列番号６７（実施例に記載のバリアント＃０５０に対応する）、配列番号２８（実施例に記載のバリアント＃０５１に対応する）、配列番号７４（実施例に記載のバリアント＃０６８に対応する）、または配列番号７５（実施例に記載のバリアント＃０６９に対応する）を含むか、または本質的に配列番号６６、配列番号７０、配列番号７２、配列番号６７、配列番号２８、配列番号７４、または配列番号７５からなる。
【0050】
具体的な実施形態において、本開示の前記バリアントは、ＺＮＲＦ３に対する結合親和性を高めるために、Ｒｓｐｏ１の位置Ｅ４５、Ｌ４６、Ｅ４９、Ｖ５０、Ｎ５１、Ｋ５５、Ｓ５７、Ｉ６２、Ｌ６３、Ｄ６８、Ｐ７７、Ｆ８４、Ｄ８５、Ｎ８８、もしくはＩ９５、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基において、１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、本開示の前記バリアントは、Ｒｓｐｏ１のＦＵ１、またはＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４（好ましくはＲｓｐｏ１）の対応する残基において、次のアミノ酸置換Ｌ４６Ｓ、Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｋ５５Ｒ、Ｓ５７Ｑ、Ｉ６２Ｆ、Ｌ６３Ｆ、Ｄ６８Ｇ、Ｐ７７Ｈ、Ｆ８４Ｙ、Ｄ８５Ｙ、Ｎ８８Ａ、もしくはＩ９５Ａのうちの１つ以上を含む。より具体的な実施形態において、本開示の前記バリアントは、配列番号６５（実施例に記載のバリアント＃０４８に対応する）、配列番号６７（実施例に記載のバリアント５０に対応する）、配列番号６８（実施例に記載のバリアント＃０５２に対応する）、配列番号６９（実施例に記載のバリアント＃０５３に対応する）、配列番号７１（実施例に記載のバリアント＃０５５に対応する）、配列番号７３（実施例に記載のバリアント＃０５７に対応する）を含むか、または本質的に配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３からなる。
【0051】
特定の実施形態において、本開示のバリアントは、以下を含む：
（ｉ）ＺＮＲＦ３に対する結合親和性を増強させるための、Ｒｓｐｏ１の位置Ｅ４５、Ｌ４６、Ｅ４９、Ｖ５０、Ｎ５１、Ｋ５５、Ｓ５７、Ｉ６２、Ｌ６３、Ｄ６８、Ｐ７７、Ｆ８４、Ｄ８５、Ｎ８８もしくはＩ９５、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基における１つ以上のアミノ酸置換；例えば、Ｒｓｐｏ１のＦＵ１、またはＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基、好ましくはＲｓｐｏ１の対応する残基における、次のアミノ酸置換：Ｌ４６Ｓ、Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｋ５５Ｒ、Ｓ５７Ｑ、Ｉ６２Ｆ、Ｌ６３Ｆ、Ｄ６８Ｇ、Ｐ７７Ｈ、Ｆ８４Ｙ、Ｄ８５Ｙ、Ｎ８８Ａ、またはＩ９５Ａの１つ以上、
（ｉｉ）ＬＧＲ４に対する結合親和性を増強させるための、Ｒｓｐｏ１の位置Ｈ１０８、Ｎ１０９、Ｅ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２７、Ａ１２８、Ｓ１３３、Ａ１３６、Ｇ１３８、もしくはＳ１４３、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基における１つ以上のアミノ酸置換；例えば、Ｒｓｐｏ１のＦＵ２、またはＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基、好ましくはＲｓｐｏ１の対応する残基における、次のアミノ酸置換；Ｈ１０８Ｋ、Ｈ１０８Ｒ、Ｎ１０９Ｄ、Ｎ１０９Ｅ、Ｅ１１６Ｖ；Ｌ１１８Ｆ；Ｐ１２７Ｄ；Ａ１２８Ｅ；Ｓ１３３Ｆ；Ａ１３６Ｌ；Ｇ１３８Ｅ；Ｓ１４３Ｖの１つ以上。
（ｉ）ＺＮＲＦ３に対する結合親和性を増強させるための、Ｒｓｐｏ１の位置Ｅ４５、Ｌ４６、Ｅ４９、Ｖ５０、Ｎ５１、Ｋ５５、Ｓ５７、Ｉ６２、Ｌ６３、Ｄ６８、Ｐ７７、Ｆ８４、Ｄ８５、Ｎ８８もしくはＩ９５、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基における１つ以上のアミノ酸置換；例えば、Ｒｓｐｏ１のＦＵ１、またはＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基、好ましくはＲｓｐｏ１の対応する残基における、次のアミノ酸置換：Ｌ４６Ｓ、Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｋ５５Ｒ、Ｓ５７Ｑ、Ｉ６２Ｆ、Ｌ６３Ｆ、Ｄ６８Ｇ、Ｐ７７Ｈ、Ｆ８４Ｙ、Ｄ８５Ｙ、Ｎ８８Ａ、またはＩ９５Ａの１つ以上、
（ｉｉ）ＬＧＲ４に対する結合親和性を増強させるための、Ｒｓｐｏ１の位置Ｈ１０８、Ｎ１０９、Ｅ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２７、Ａ１２８、Ｓ１３３、Ａ１３６、Ｇ１３８、もしくはＳ１４３、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基における１つ以上のアミノ酸置換；例えば、Ｒｓｐｏ１のＦＵ２、またはＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基、好ましくはＲｓｐｏ１の対応する残基における、次のアミノ酸置換；Ｈ１０８Ｋ、Ｈ１０８Ｒ、Ｎ１０９Ｄ、Ｎ１０９Ｅ、Ｅ１１６Ｖ；Ｌ１１８Ｆ；Ｐ１２７Ｄ；Ａ１２８Ｅ；Ｓ１３３Ｆ；Ａ１３６Ｌ；Ｇ１３８Ｅ；Ｓ１４３Ｖの１つ以上。
【0052】
そのようなバリアントの例としては、バリアント＃０５０（配列番号６７）、バリアント＃０５７（配列番号７３）、およびバリアント＃１０８～＃１１２が挙げられる。
【0053】
Ｄ．Ｎ－グリコシル化部位のアミノ酸欠失または置換
また、有利には、例えばＣＨＯ細胞株またはヒト細胞株などの哺乳動物細胞株の真核生物発現系で産生された場合であっても、得られるバリアントがＮ－グリコシル化されないように、本開示のバリアントは、ＦＵ２ドメインのＮ－グリコシル化部位を除去するためのアミノ酸欠失または置換を含み得る。
また、有利には、例えばＣＨＯ細胞株またはヒト細胞株などの哺乳動物細胞株の真核生物発現系で産生された場合であっても、得られるバリアントがＮ－グリコシル化されないように、本開示のバリアントは、ＦＵ２ドメインのＮ－グリコシル化部位を除去するためのアミノ酸欠失または置換を含み得る。
【0054】
好ましくは、本開示の前記バリアントは、Ｒｓｐｏ１の残基Ｎ１３７、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４の同等の残基においてアミノ酸置換を含み、この部位でのＮ－グリコシル化を抑制する、例えば、前記バリアントは、アミノ酸置換Ｎ１３７ＱもしくはＲｓｐｏ１、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４における同等のアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態において、本開示の前記バリアントは、配列番号２２（以下の実施例のバリアント＃００５に対応する）、配列番号５４（以下の実施例のバリアント＃０３０に対応する）を含むか、または本質的に配列番号２２、配列番号５４からなる。
【0055】
Ｅ．キメラまたはハイブリッドＲ－スポンジンタンパク質
本開示のバリアントはまた、キメラＲ－スポンジンタンパク質を包含し、任意選択で、前記Ｂ～Ｄに記載されるような１つ以上の改変（欠失またはアミノ酸置換）をさらに含む。
本開示のバリアントはまた、キメラＲ－スポンジンタンパク質を包含し、任意選択で、前記Ｂ～Ｄに記載されるような１つ以上の改変（欠失またはアミノ酸置換）をさらに含む。
【0056】
具体的な実施形態において、本開示のキメラバリアントは、配列番号９のＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメインと１００％同一である前記ＦＵ１ドメインと、Ｒｓｐｏ１のＦＵ２ドメイン、Ｒｓｐｏ３のＦＵ２ドメイン、Ｒｓｐｏ４のＦＵ２ドメイン、または、（参照としての配列番号４１のＲｓｐｏ１と比較して）ＬＧＲ４に対し少なくとも同一の結合親和性を維持するアミノ酸置換を有する、これらの機能的バリアントの中から選択される前記ＦＵ２ドメインとを含む。好ましくは、前記ＦＵ２ドメインは、配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインと１００％同一である。
【0057】
したがって、具体的な実施形態において、前記バリアントは、Ｒｓｐｏ２のＦＵ１ドメインと、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３、Ｒｓｐｏ４、またはそれらの機能的同等物の他のドメインとを組み合わせたキメラタンパク質である。
【0058】
具体的な実施形態において、前記バリアントは、Ｒｓｐｏ１のアミノ酸残基１４４～２６３からＣ末端領域（配列番号４９）を少なくとも含むキメラタンパク質である。
【0059】
典型的には、そのようなキメラバリアントの一例は、配列番号９のＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメインおよび配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号２５のバリアント（実施例に開示されるバリアント＃０３４に対応する）または配列番号２６のバリアント（実施例に開示されるバリアント＃０３５に対応する）である。
【0060】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ１のＦＵ１ドメインおよびＲｓｐｏ３のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号５０または５１のバリアント（実施例に開示されたバリアント＃０２６またはバリアント＃０２７に対応する）である。
【0061】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ３のＦＵ１ドメインおよびＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号５２もしくは５３（実施例に開示されたバリアント＃０２８もしくはバリアント＃０２９に対応する）、または配列番号５４のバリアント（バリアント＃０３０に対応し、Ｎ－グリコシル化を抑制するためのＮ１３７Ｑ変異をさらに含む）。
【0062】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ２のＦＵ１およびＦＵ２ドメイン、ならびに配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号５５のバリアント（実施例に開示されたバリアント＃０３１に対応する）である。
【0063】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ２のＦＵ２ドメインとＲｓｐｏ１由来のＲ－スポンジンタンパク質の残りの部分とを含むバリアントであり、好ましくは配列番号５６のバリアント（実施例に開示されたバリアント＃０３２に対応する）である。
【0064】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ１のＦＵ１ドメインおよびＲｓｐｏ２のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号５７のバリアント（実施例に開示されたバリアント＃０３３に対応する）である。
【0065】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ４のＦＵ１ドメインおよびＦＵ２ドメイン、ならびに配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号５８のバリアント（実施例に開示されたバリアント＃０３６に対応する）である。
【0066】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ４のＦＵ２ドメインとＲｓｐｏ１由来のＲ－スポンジンタンパク質の残りの部分とを含むバリアントであり、好ましくは配列番号５９のバリアント（実施例に開示されたバリアント＃０３７に対応する）である。
【0067】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ１のＦＵ１ドメインおよびＲｓｐｏ４のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号６０のバリアント（実施例に開示されるバリアント＃０３８に対応する）である。
【0068】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ４のＦＵ１ドメインおよびＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号６１または６２のバリアント（実施例に開示されたバリアント＃０３９またはバリアント＃０４０に対応する）である。
【0069】
このようなキメラバリアントの別の例は、Ｒｓｐｏ２のＦＵ１ドメインおよびＲｓｐｏ４のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含むバリアントであり、好ましくは配列番号６３のバリアント（実施例に開示されるバリアント＃０４２に対応する）。
【0070】
上述のキメラタンパク質に加えて、Ｒｓｐｏ１／ＺＮＲＦ３結合親和性に重要である、またはＺＮＲＦ３に対する結合親和性を増強させることが知られている位置において、Ｒｓｐｏ２のＦＵ１ドメインの１つ以上のアミノ酸残基をＲｓｐｏ１の対応する１つ以上のアミノ酸残基でさらに置換することによって、キメラタンパク質のＺＮＲＦ３結合活性を最適化することも可能である。
【0071】
典型的には、本開示のバリアントは、配列番号２５または配列番号２６のキメラバリアントと比較してＺＮＲＦ３に対する結合親和性を増強させるために、Ｅ４９、Ｖ５０、Ｄ６８、Ｄ８５の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含むことを除いて、配列番号５と同じ配列を有するハイブリッドＦＵ１ドメインを含む：好ましくは、本開示のバリアントは、配列番号２５または配列番号２６のキメラバリアントと比較してＺＮＲＦ３に対する結合親和性を増強させるために、Ｅ４９、Ｖ５０、Ｄ６８、Ｄ８５の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含むことを除いて配列番号５のハイブリッドＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインである；好ましくは、本開示のバリアントは、次のアミノ酸置換：Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｄ６８Ｇ、Ｄ８５Ｇ（Ｒｓｐｏ１のＦＵ１ドメインの残基に対応する）のうち１つ以上を含み、さらに、ＦＵ２ドメインが、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、Ｒｓｐｏ４、またはＬＧＲ４に対し少なくとも同一の結合親和性を維持するアミノ酸置換を有する、これらの機能的バリアントのＦＵ２ドメインの中から選択され、好ましくは、前記ＦＵ２ドメインは、配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインと１００％同一である。
【0072】
具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、位置Ｅ４９、Ｖ５０、Ｄ６８、およびＤ８５に１つ以上のアミノ酸置換、好ましくは次のアミノ酸置換：４９Ｋ、５０Ｄ、６８Ｇ、８５Ｇ（Ｒｓｐｏ２のＦＵ１ドメインの残基に対応する）を含むことを除いて、配列番号５（すなわち、Ｒｓｐｏ１のＦＵ１ドメイン）と同一の配列を有するハイブリッドＦＵ１ドメインを含み、さらに、ＦＵ２ドメインが配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインと１００％同一である。例えば、本開示のバリアントは、配列番号２７（実施例に開示されたバリアント＃０４７に対応する）を含むか、または本質的に配列番号２７からなる。
【0073】
具体的な実施形態において、上述の本開示のバリアントは、さらに、Ｅ４５Ｌ、Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｋ５５Ｒ、Ｄ６８Ｇ、Ｄ８５Ｇ、Ｎ８８Ａ、Ｈ１０８Ｋ、およびＮ１０９Ｄの中から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、ハイブリッドＲｓｐｏ１のＦＵ１およびＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインを含む。例えば、本開示のバリアントは、配列番号２８（Ｅ４５Ｌ；Ｅ４９Ｋ；Ｖ５０Ｄ；Ｋ５５Ｒ；Ｄ６８Ｇ；Ｄ８５Ｇ；Ｎ８８Ａ；Ｈ１０８Ｋ；およびＮ１０９Ｄ変異を有する、実施例に開示されたバリアント＃０５１に対応する）を含むか、または本質的に配列番号２８からなる。
【0074】
具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、例えば、Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｄ６８Ｇ、Ｄ８５Ｇのような、ＺＮＲＦ３に対する結合を増加させるための、位置Ｅ４９、Ｖ５０、Ｄ６８およびＤ８５での１つ以上のアミノ酸置換を有するＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインまたはハイブリッドＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインと組み合わせて、配列番号１０、１４もしくは１８の、ヒトＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応するＦＵ２ドメインを含む。
【0075】
Ｆ．Ｏ－グリコシル化を改善するためのＢＲドメインにおけるアミノ酸置換
本開示のバリアントは、配列番号４１のＲｓｐｏ１と比較して、Ｏ－グリコシル化を調節、最適化または改善するために、ＢＲドメインに１つ以上のアミノ酸置換をさらに含み得る。
本開示のバリアントは、配列番号４１のＲｓｐｏ１と比較して、Ｏ－グリコシル化を調節、最適化または改善するために、ＢＲドメインに１つ以上のアミノ酸置換をさらに含み得る。
【0076】
Ｏ－グリコシル化の改善に関連するアミノ酸残基としては、特に、Ｒｓｐｏ１のアミノ酸残基Ｔ２５３、Ｔ２５８、Ｓ２５９が挙げられる。
【0077】
具体的な実施形態において、本開示の上記バリアントは、Ｏ－グリコシル化を改善するために、Ｒｓｐｏ１の位置Ｇ２５２、Ｔ２５３、Ｌ２５７、Ｔ２５８、Ｓ２５９、Ａ２６０、Ａ２６３、または、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基において、１つ以上のアミノ酸置換を含む。より具体的には、本開示の上記バリアントは、Ｒｓｐｏ１の次のアミノ酸置換、Ｇ２５２Ｔ、Ｔ２５３Ｅ、Ｌ２５７Ｓ、Ｔ２５８Ｅ、Ｓ２５９Ｅ、Ａ２６０Ｔ、もしくはＡ２６３Ｔ、Ｓ２６８Ｅ、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基のうち１つ以上を有するＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含む。
【0078】
対照的に、バリアントがＣ末端ポリペプチドと融合する場合、Ｏ－グリコシル化部位を変異させることが有利であり得る。よって、具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、融合タンパク質であり、次のアミノ酸置換：Ｔ２５３Ａ、Ｔ２５８Ａ、Ｓ２５９Ａ、およびＳ２６８Ａの１つ以上を含む。
【0079】
具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、配列番号７６～８６のポリペプチドを含むか、または本質的に配列番号７６～８６のポリペプチドからなる。
【0080】
Ｇ．短縮された(truncated)Ｒ－スポンジン活性タンパク質
本発明者らは、驚くべきことに、Ｒｓｐｏ１タンパク質の残基２１～３１および残基２４５～２６３の欠失は、Ｍｉｎ６増殖アッセイにおいて、配列番号４１の天然Ｒｓｐｏ１タンパク質と比較して同様の活性をもたらすことを見出した。このタンパク質は、活性を有する、最も短い天然Ｒｓｐｏ１タンパク質である。より具体的には、本開示のバリアントは、Ｒｓｐｏ１のアミノ酸残基３２～２２４を含むヒトＲｓｐｏ１断片に対応する配列番号９４のタンパク質を含むか、またはそのタンパク質からなる（実施例に開示されたバリアント＃１１６を参照）。
本発明者らは、驚くべきことに、Ｒｓｐｏ１タンパク質の残基２１～３１および残基２４５～２６３の欠失は、Ｍｉｎ６増殖アッセイにおいて、配列番号４１の天然Ｒｓｐｏ１タンパク質と比較して同様の活性をもたらすことを見出した。このタンパク質は、活性を有する、最も短い天然Ｒｓｐｏ１タンパク質である。より具体的には、本開示のバリアントは、Ｒｓｐｏ１のアミノ酸残基３２～２２４を含むヒトＲｓｐｏ１断片に対応する配列番号９４のタンパク質を含むか、またはそのタンパク質からなる（実施例に開示されたバリアント＃１１６を参照）。
【0081】
Ｈ．糖尿病の処置に用いるＲｓｐｏ３
さらに、本発明者らは、インビボにおいて、天然タンパク質Ｒｓｐｏ３が、少なくともＲｓｐｏ１と同様のレベルまで膵臓β細胞増殖を活性化することを決定した。従って、１つの態様において、本開示は、糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）の処置に使用するため、および／または、インビトロもしくはインビボのいずれかにおいて膵臓β細胞の増殖を誘導するための、Ｒｓｐｏ３ポリペプチド（例えば、配列番号３を含む）またはその機能的等価物に関する。
さらに、本発明者らは、インビボにおいて、天然タンパク質Ｒｓｐｏ３が、少なくともＲｓｐｏ１と同様のレベルまで膵臓β細胞増殖を活性化することを決定した。従って、１つの態様において、本開示は、糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病）の処置に使用するため、および／または、インビトロもしくはインビボのいずれかにおいて膵臓β細胞の増殖を誘導するための、Ｒｓｐｏ３ポリペプチド（例えば、配列番号３を含む）またはその機能的等価物に関する。
【0082】
本開示の好ましいバリアント
表１は、本開示の好ましいバリアント、それらのアミノ酸配列、および天然Ｒスポンジンタンパク質と比較した主な変更点を示している。
表１は、本開示の好ましいバリアント、それらのアミノ酸配列、および天然Ｒスポンジンタンパク質と比較した主な変更点を示している。
【0083】
【表1】
【0084】
保存的な改変および機能的等価物
天然Ｒ－スポンジン１タンパク質の同様の有利な特性を有する、これより前のセクションＡ～Ｆに記載されるようなバリアントの追加の機能的等価物、または天然ヒトＲ－スポンジン３タンパク質の同様の有利な特性を有する、これより前のセクションＧに記載されるようなＲｓｐｏ３ポリペプチドの機能的等価物は、候補分子をスクリーニングし、そしてそのような候補分子が、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３、または本明細書に開示されるような特定のバリアント（特に、上記の表１にて言及されるそれらの好ましいバリアント）のいずれかと比較した場合に、所望の機能的特性を維持しているかどうかを試験することによって、さらに同定され得る。
天然Ｒ－スポンジン１タンパク質の同様の有利な特性を有する、これより前のセクションＡ～Ｆに記載されるようなバリアントの追加の機能的等価物、または天然ヒトＲ－スポンジン３タンパク質の同様の有利な特性を有する、これより前のセクションＧに記載されるようなＲｓｐｏ３ポリペプチドの機能的等価物は、候補分子をスクリーニングし、そしてそのような候補分子が、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３、または本明細書に開示されるような特定のバリアント（特に、上記の表１にて言及されるそれらの好ましいバリアント）のいずれかと比較した場合に、所望の機能的特性を維持しているかどうかを試験することによって、さらに同定され得る。
【0085】
特定の実施形態において、本バリアントの機能的等価物は、本明細書に開示される好ましいバリアントの１つと少なくとも同じ親和性でＬＧＲ４レセプターに結合する。
【0086】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるような特定のバリアントの前記機能的等価物は、以下の活性の１つ以上を、配列番号４１のＲｓｐｏ１タンパク質に対して少なくとも９０％、１００％またはそれ以上示す：
（ｉ）例えばＳＰＲアッセイによって決定される、ＬＧＲ４レセプターへの結合親和性；
（ｉｉ）例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイで決定される、機能的β細胞の増殖の誘導；
（ｉｉｉ）例えばインビボのβ細胞増殖アッセイで決定される、機能的β細胞の増殖の誘導。
（ｉ）例えばＳＰＲアッセイによって決定される、ＬＧＲ４レセプターへの結合親和性；
（ｉｉ）例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイで決定される、機能的β細胞の増殖の誘導；
（ｉｉｉ）例えばインビボのβ細胞増殖アッセイで決定される、機能的β細胞の増殖の誘導。
【0087】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＲｓｐｏ３ポリペプチドの前記機能的等価物は、以下の活性の１つ以上を、配列番号３のＲｓｐｏ３タンパク質に対して少なくとも９０％、１００％またはそれ以上示す：
（ｉ）例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイによって決定される、ＬＧＲ４レセプターへの結合親和性；
（ｉｉ）例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイによって決定される、ＺＮＲＦ３レセプターへの結合親和性；
（ｉｉｉ）例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイで決定される、機能的β細胞の増殖の誘導；
（ｉｖ）例えばインビボのβ細胞増殖アッセイで測定される、機能的β細胞の増殖の誘導。
（ｉ）例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイによって決定される、ＬＧＲ４レセプターへの結合親和性；
（ｉｉ）例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイによって決定される、ＺＮＲＦ３レセプターへの結合親和性；
（ｉｉｉ）例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイで決定される、機能的β細胞の増殖の誘導；
（ｉｖ）例えばインビボのβ細胞増殖アッセイで測定される、機能的β細胞の増殖の誘導。
【0088】
活性を決定する際に使用するためのアッセイおよび条件のさらなる詳細を、下記の実験のパートに開示する。
【0089】
特定の実施形態において、特定のバリアントの前記機能的等価物は、上記の所望の活性を、表１に開示されるような対応する好ましいバリアントの１つに対して少なくとも９０％、より好ましくは１００％以上またはそれ以上示す。
【0090】
これより前のセクションで開示したようなバリアントの機能的等価物は、典型的には、非必須残基における対応するバリアントと比較して、アミノ酸置換、欠失または挿入によって得ることができる。特定の実施形態において、前記機能的等価物は、特に表１に記載のバリアントのうちの１つと比較して、天然または非天然アミノ酸によるアミノ酸置換のみによって、好ましくは天然アミノ酸による１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸置換のみによって、対応するバリアントとは異なる。
【0091】
他の実施形態において、前記機能的等価物は、配列番号２２～２８の少なくとも１つと９５％の同一性を有するポリペプチドであり、当該ポリペプチドは配列番号２２～２８の少なくとも１つのＦＵ１ドメインおよびＦＵ２ドメインと１００％同一である、ＦＵ１ドメインおよびＦＵ２ドメインを含む。
【0092】
より具体的な実施形態において、前記機能的等価物のアミノ酸配列は、大部分が保存的アミノ酸置換によって、本明細書、特に表１に開示されるようなバリアントと異なっていてもよく；例えば、バリアントにおける置換の少なくとも１０個（少なくとも９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個、等）が保存的アミノ酸残基の置換である。
【0093】
本開示の文脈において、保存的な置換は、以下のように反映されるアミノ酸のクラス内の置換によって定義されてもよい：
脂肪族残基 Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびＭ
シクロアルケニル関連残基 Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹ
疎水性残基 Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹ
負電荷を有する残基 ＤおよびＥ
極性残基 Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴ
正の電荷を有する残基 Ｈ、Ｋ、およびＲ
小さい残基 Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶ
非常に小さい残基 Ａ、Ｇ、Ｓ
ターンに関与する残基 Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、および形成Ｔ
フレキシブル残基 Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、およびＲ
より保存的な置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンを含む。親水性／親水性特性および残基の重量／サイズに関する保存も、表１の親バリアントと比較して、バリアント変異ポリペプチドにおいて実質的に保持されていてもよい。
脂肪族残基 Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびＭ
シクロアルケニル関連残基 Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹ
疎水性残基 Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹ
負電荷を有する残基 ＤおよびＥ
極性残基 Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴ
正の電荷を有する残基 Ｈ、Ｋ、およびＲ
小さい残基 Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶ
非常に小さい残基 Ａ、Ｇ、Ｓ
ターンに関与する残基 Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、および形成Ｔ
フレキシブル残基 Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、およびＲ
より保存的な置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンを含む。親水性／親水性特性および残基の重量／サイズに関する保存も、表１の親バリアントと比較して、バリアント変異ポリペプチドにおいて実質的に保持されていてもよい。
【0094】
具体的な実施形態において、バリアントの機能的等価物は、別の天然アミノ酸によって、好ましくは上記で定義した保存的アミノ酸置換によって置換された１、２または３アミノ酸残基を除いて、配列番号２２～２８のいずれか１つ（表１のバリアント）と同一であるポリペプチドを含む。
【0095】
さらに、当業者は、様々の種間またはＲｓｐｏファミリーの異なるメンバー間で保存された残基が、適切な構造を維持するために重要であり得、したがって、当業者がそのようなアミノ酸位置の変異を抑制することができることに感謝するであろう。例えば、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３およびＲｓｐｏ４の間の保存的な残基は、特に図１に示されており、本開示において特に指定されない限り、好ましくは変異させないことができる。
【0096】
または、多くの部位において、１つまたは２つ以上のアミノ酸位置は、種バリアント間で、および／またはＲｓｐｏファミリーの他のメンバー（Ｒｓｐｏ２、Ｒｐｏ３およびＲｓｐｏ４、等）の間での保存的なバリエーションを示す。当業者はそのような保存的な置換のいくつかが、Ｒｓｐｏ１の機能に悪影響を及ぼさず、したがって、そのような保存的なバリエーションを有する天然Ｒ－スポンジン１と比較して、変異していることを理解するのであろう。
【0097】
特定の実施形態において、本開示のバリアントは、天然Ｒ－スポンジンタンパク質と比較して、変異していない以下のアミノ酸残基を有するＦＵ２ドメインを含んでいる：配列番号１のヒトＲｓｐｏ１におけるＦ１０６、Ｈ１０８、Ｆ１１０、Ｎ１０９、Ｅ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２７、Ａ１２８、Ｓ１３３、Ａ１３６、Ｇ１３８、Ｓ１４３。
【0098】
特定の実施形態において、本開示のバリアントは、以下の位置の１つ以上において、天然ＢＲドメインと比較してアミノ酸変化を有さないＢＲドメインを含んでいる：配列番号１のヒトＲｓｐｏ１におけるＴ２５３、Ｌ２５７、Ｔ２５８、Ｓ２５９、Ａ２６０もしくはＡ２６３、または配列番号２のヒトＲｓｐｏ２、配列番号３のヒトＲｓｐｏ３もしくは配列番号４のヒトＲｓｐｏ４における対応する残基、典型的には、前記ＢＲドメインは、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号２０と１００％同一である。
【0099】
本開示の融合タンパク質
Ｒ－スポンジン１ポリペプチド以外の種々のポリペプチドは、種々の目的のため（例えば、タンパク質のインビボでの半減期を増加させるため、タンパク質の同定、単離および／または精製を容易にするため、タンパク質の活性を増強させるため、およびタンパク質のオリゴマー化を促進するため、等）に、本開示のバリアントまたは上記のその機能的等価物（特に、表１のバリアント）と融合することができる。
Ｒ－スポンジン１ポリペプチド以外の種々のポリペプチドは、種々の目的のため（例えば、タンパク質のインビボでの半減期を増加させるため、タンパク質の同定、単離および／または精製を容易にするため、タンパク質の活性を増強させるため、およびタンパク質のオリゴマー化を促進するため、等）に、本開示のバリアントまたは上記のその機能的等価物（特に、表１のバリアント）と融合することができる。
【0100】
多くのポリペプチドは、それらがその一部である組換え融合タンパク質の同定および／または精製を容易にすることができる。例えば、ポリアルギニン、ポリヒスチジンが含まれる。ポリアルギニンを含むポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーによる有効な精製を可能にする。例えば、特定の実施形態において、本開示のバリアント（より具体的には、表１に開示されるような好ましいバリアントのいずれか）は、ポリヒスチジンＣ末端タグ、および任意選択でペプチドリンカー、例えば配列番号９０（ＧＧＧＧＳＥＰＥＡＨＨＨＨＨＨ）のポリペプチドを含む。
【0101】
具体的な実施形態では、抗体のＦｃ領域、任意選択でＩｇＧ抗体、または実質的に類似のタンパク質を含むポリペプチドを、直接、または任意選択でペプチドリンカーを介して、本開示のバリアント（典型的には、表１に開示されたバリアントの１つ）またはその機能的等価物に融合させ、それによって本開示のＦｃ融合タンパク質を形成することができる。そのようなＦｃ領域の例は、ＩｇＧ４ Ｆｃ断片またはその誘導体であり、典型的には配列番号２９のポリペプチドである。
【0102】
具体的な実施形態において、本開示はまた、Ｆｃ断片が（Ｃ末端またはＮ末端のいずれかにおいて、任意選択でペプチドリンカーまたはそのバリアントを介して）配列番号６６のＲｓｐｏ１タンパク質に融合される（より具体的にはＦｃ断片が配列番号２９を含む）、Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【0103】
別の具体的な実施形態において、本開示はまた、Ｆｃ断片が（Ｃ末端またはＮ末端のいずれかにおいて、任意選択でペプチドリンカーまたはそのバリアントを介して）配列番号２４のＲｓｐｏ１タンパク質に融合される（より具体的にはＦｃ断片が配列番号２９を含む）、Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【0104】
別の具体的な実施形態において、本開示はまた、Ｆｃ断片が（Ｃ末端またはＮ末端のいずれかにおいて、任意選択でペプチドリンカーまたはそのバリアントを介して）配列番号９４のＲｓｐｏ１タンパク質に融合される（より具体的にはＦｃ断片が配列番号２９を含む）、Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【0105】
融合タンパク質はまた、１つ以上のペプチドリンカーを含んでいてもよい。一般に、ペプチドリンカーは複数のポリペプチドを連結して多量体を形成するのに役立つアミノ酸のストレッチ（stretch）であり、タンパク質の連結部分の所望の機能に必要とされる柔軟性または剛性を提供する。典型的には、ペプチドリンカーは約１～３０アミノ酸長である。ペプチドリンカーの例としては、－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、ＧＧＧＧＳ（配列番号４６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは１～８であり、典型的には３または４である）が挙げられるが、これらに限定されない。連結部分は例えば、Huston, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-83 (1988), Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6: 989-95 (1993), Newton, D. L., et al., Biochemistry 35: 545-53 (1996)、ならびに米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されている。
【0106】
特定の実施形態では、Ｆｃ融合体は、本開示のバリアントまたはその機能的等価物のＣ末端においてペプチドリンカーを介して間接的に融合される。他の実施形態では、Ｆｃ融合体は、本開示のバリアントまたはそれらの機能的等価物のＮ末端においてペプチドリンカーを介して間接的に融合される。
【0107】
特定の実施形態において、本発明者らは、活性のあるＦｃ融合タンパク質を生成するためにはリンカーの最適化が必要であることを示した。実際、本発明者は、リンカーの長さを拡大することにより、Ｆｃ融合タンパク質の生物学的活性が向上することを示した。
【0108】
Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分とＲ－スポンジン部分との間で使用され得る好ましいペプチドリンカーには、例えば（ＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ）（配列番号４４）または（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧ）（配列番号４５）のリンカーが含まれる。
【0109】
特定の実施形態において、配列番号２９のＦｃポリペプチドは、表１の好ましいバリアントのうちの１つのＣ末端において、ペプチドリンカーを介して直接または間接的に融合される。
【0110】
本発明者らは、驚くべきことに、本開示のバリアントのＮ末端においてペプチドリンカーを介して直接または間接的にＦｃポリペプチドを融合させると、Ｆｃ融合タンパク質の生産収率が増加することを示した。したがって、好ましい実施形態において、配列番号２９のＦｃポリペプチドは、表１の好ましいバリアントのうちの１つ、好ましくは配列番号２４、６６、または９４のバリアント、のＮ末端においてペプチドリンカーを介して直接または間接的に融合される。
【0111】
本開示はまた、Ｆｃ断片が（Ｃ末端またはＮ末端のいずれかにおいて、任意選択でペプチドリンカーを介して）配列番号１のＲｓｐｏ１タンパク質に融合される（より具体的にはＦｃ断片が配列番号２９を含む）Ｆｃ融合タンパク質に関する。具体的な実施形態において、本開示のバリアントは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９５のＦｃ融合タンパク質（それぞれ、バリアント＃０６３、バリアント＃０６４、バリアント＃１２１、バリアント＃１５５またはバリアント＃１５０に対応する）である。
【0112】
本開示によって意図されるバリアントまたはその機能的等価物の別の改変は、得られる分子の半減期を増加させるために、少なくともバリアント、または血清タンパク質（ヒト血清アルブミンまたはその断片など）に対する等価物とのコンジュゲートまたはタンパク質融合物である。このようなアプローチは、例えば、Ballanceら（欧州特許第0322094号）に記載されている。
【0113】
別の可能性は、得られる分子の半減期を増加させるために、血清タンパク質に結合できるタンパク質（ヒト血清アルブミンに結合しているタンパク質（すなわち、抗ＨＳＡ融合タンパク質））を含み、例えば、ＨＳＡまたはダルピン、ナノフィチン、フィノマー等の任意の他のドメインタイプ構造に結合するＦａｂまたはナノボディに由来する抗ＨＳＡ結合部分を含む、本開示の融合タンパク質である。このようなアプローチは、例えば、Journal of Controlled Release 301 (2019) 176-189; BioDrugs (2015) 29:215-239; J Pharmacol Exp Ther 370:703-714, September 2019; Biodrugs 2009; 23 (2): 93-109に記載されている。そのような融合タンパク質の例には、配列番号６４、配列番号８７または配列番号８８のポリペプチドが含まれる。
【0114】
他の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、Dennis et al 2002 (Journal of Biological Chemistry, 2002, Vol 277, No. 38, pp 35035-35043)において開示されているアルブミンに結合するペプチドのうちの１つ、特に配列番号９１（ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ）のコア配列を含むペプチドを含む。
【0115】
そのようなバリアントの例は、配列番号６４のポリペプチド（バリアント＃０４６）、または配列番号８７のポリペプチド（バリアント＃０９４）、または配列番号８８のポリペプチド（バリアント＃０９５）である。
【0116】
本開示の組換え融合タンパク質は、ロイシンジッパーまたは他の多量体化モチーフを含むポリペプチドを含み得る。既知のロイシンジッパー配列の中には、二量体化を促進する配列および三量体化を促進する配列がある。例えば、e.g. Landschulz et al. (1988), Science 240: 1759-64)を参照されたい。ロイシンジッパーは反復ヘプタドリピート（heptad repeat）を含み、多くの場合、４つまたは５つのロイシン残基が他のアミノ酸と共に散在する。ロイシンジッパーの使用および調製は、当該技術分野で周知である。
【0117】
本開示によって意図される、本明細書に開示されるバリアントまたは機能的等価物の別の改変は、ペグ化またはヘシル化またはＰＡＳ化等の関連技術である。
【0118】
より一般的には、バリアントまたはその機能的等価物は、Ｏ結合およびＮ結合オリゴ糖、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸およびヒアルロン酸、ならびにホモアミノ酸ポリマー、エラスチン様ポリペプチド、ＸＴＥＮおよびＰＡＳ等の非構造化タンパク質ポリマーを含む、天然および半合成多糖類を含む生分解性増量剤とコンジュゲートしてもよい。
【0119】
例えば、本開示のバリアントまたはそれらの機能的等価物は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにペグ化することができる。ペグ化するために、組換えタンパク質は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が組換えタンパク質に結合する条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（またはアナログ反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。本明細書で使用される場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミド等の、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている任意の形態のＰＥＧを包含することが意図される。タンパク質をペグ化するための方法は当該技術分野で公知であり、本開示のタンパク質に適用することができる。例えば、Jevsevar et al 2010 Biotechnol J. 5(1): 113-28,またはTurecek et al 2016 J Pharm Sci 2016 105(2): 460-375を参照されたい。したがって、特定の実施形態において、本開示のＲｓｐｏ１タンパク質はペグ化されている。
【0120】
本開示によって意図されるバリアントまたはそれらの機能的等価物の別の改変は、ＰＡＳ化である。例えば、Protein Engineering, Design & Selection vol. 26 no. 8 pp. 489-501, 2013を参照されたい。したがって、特定の実施形態において、本開示のＲｓｐｏ１タンパク質はＰＡＳ化されている。
【0121】
Ｘｔｅｎ技術は例えば、Nature Biotechnology volume 27 number 12 2009: 1186-1192に記載されており、レビューされている。
【0122】
［本開示のタンパク質をコードする核酸分子］
本開示のバリアントまたはそれらの機能的等価物をコードする核酸分子もまた、本明細書に開示される。
本開示のバリアントまたはそれらの機能的等価物をコードする核酸分子もまた、本明細書に開示される。
【0123】
下記の表１０および表１１の実施例は、本明細書に開示されるバリアントの特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の具体例を提供する。
【0124】
ヌクレオチド配列の例は、表１に記載されている実施例のいずれか１つのアミノ酸配列をコードするもの、特に配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号５０～８９、および配列番号９２～９５のいずれか１つをコードするものであり、核酸配列は表９から容易に誘導され、遺伝暗号を使用し、任意選択で宿主細胞種に依存するコドンの偏りを考慮に入れる。
【0125】
本開示はまた、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、またはヒトＨＥＫ２９３細胞株）におけるタンパク質発現のために最適化されている後者の配列に由来する核酸分子に関する。
【0126】
核酸は、細胞全体、細胞溶解物中に存在してもよく、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態の核酸であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該技術分野で周知の他の技術を含む標準的な技術によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製される場合、「単離される」または「実質的に純粋になる」。本開示の核酸は例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。一実施形態において、核酸は、ファージディスプレイベクター等のベクター中に、または組換えプラスミドベクター中に存在してもよい。
【0127】
本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。本開示のバリアントをコードするＤＮＡ断片が一度得られると、これらのＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、バリアントをコードするＤＮＡ断片は、別のＤＮＡ分子、または別のタンパク質をコードする断片（例えば、抗体定常領域（Ｆｃ領域）またはフレキシブルリンカー）に作動可能に連結してもよい。ヌクレオチド配列の例には、組換え融合タンパク質、特に、アミノ酸配列の配列番号１、またはＦｃ領域のコード配列と作動可能に連結されるそれらのバリアント（例えば、配列番号４２、配列番号４３、または配列番号９２～９５）のいずれか１つのコード配列を含むＦｃ融合タンパク質を含む。
【0128】
本文脈において使用される場合、用語「作動可能に連結される」は、２つのＤＮＡ断片が機能的な様式で、例えば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、またはタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように連結されることを意味することが意図される。
【0129】
［本開示のバリアントまたは融合タンパク質を産生するトランスフェクトーマの作製］
本開示のバリアントもしくはそれらの機能的等価物、および／または関連タンパク質は、例えば、当該技術分野で周知である組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション方法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させることができる。
本開示のバリアントもしくはそれらの機能的等価物、および／または関連タンパク質は、例えば、当該技術分野で周知である組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション方法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させることができる。
【0130】
例えば、本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、または対応するそれらの機能的等価物を発現させるために、部分的または全長組換えタンパク質をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学または生化学技術（例えば、ＤＮＡ化学合成、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、ＤＮＡを発現ベクターに挿入することができる。
【0131】
本文脈において、用語「作動可能に連結される」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が組換えタンパク質の転写および翻訳を調節するそれらの意図された機能に役立つように、抗体遺伝子をベクターにライゲーションされていることを意味することを意図している。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。タンパク質をコードする遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。
【0132】
組換え発現ベクターは、宿主細胞からの組換えタンパク質の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが組換えタンパク質のアミノ末端にフレームで連結されるように、バリアントをコードする遺伝子をベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドはＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４の天然シグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非Ｒスポンジンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【0133】
バリアントをコードする遺伝子に加えて、本明細書に開示される組換え発現ベクターは、宿主細胞における組換えタンパク質の発現を制御する調節配列を保持する。用語「調節配列」は、遺伝子をコードするタンパク質の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の因子に依存し得ることが、当業者によって理解されるだろう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはＰ－グロビンプロモーター等の非ウイルス調節配列を使用してもよい。さらに、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端リピート由来の配列を含む、ＳＲａプロモーター系等の異なる供給源由来の配列から構成される調節エレメントも存在する。
【0134】
バリアントをコードする遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子等のさらなる配列を保持してもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、すべてＡｘｅｌらによる米国特許第4,399,216号、第4,634,665号および第5,179,017号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等の薬物に対する耐性を付与する。選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ－宿主細胞において使用するための）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、および（Ｇ４１８選択のための）ｎｅｏ遺伝子が含まれる。
【0135】
本開示のバリアントまたは関連融合タンパク質の発現について、組換えタンパク質をコードする発現ベクターを、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される広範な技術（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等）を包含することが意図される。理論的には、原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて、本開示のタンパク質を発現させることが可能である。真核細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞、酵母または糸状菌）におけるタンパク質の発現については、このような真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞よりも、適切に折り畳まれて機能的な組換えタンパク質を会合させる（assemble）および分泌する可能性が高いため検討される。
【0136】
具体的な一実施形態において、本開示によるクローニングまたは発現ベクターは、好適なプロモーター配列に作動可能に連結された、表１に記載の（典型的には、配列番号２２～２８または配列番号５０～８９の）バリアントのコード配列、または融合タンパク質（典型的には、配列番号４２、４３、または９２～９５）のうちの１つを含む。
【0137】
本開示の組換えタンパク質を発現するための哺乳動物宿主細胞には、ＤＨＦＲ選択マーカー（Kaufman and Sharp, 1982に記載される）と共に使用される、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Urlaub and Chasin, 1980に記載される）、ＣＨＯＫ１ ｄｈｆｒ＋細胞株、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＳＰ２細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、宿主細胞において組換えタンパク質を発現させるのに十分な期間宿主細胞を培養し、そして任意選択で、宿主細胞が増殖する培養培地中にタンパク質を分泌させることによって組換えタンパク質が産生される。
【0138】
本開示のバリアントまたは関連融合タンパク質は、例えば、標準のタンパク質精製方法を使用して、分泌後に培養培地から回収および精製することができる。
【0139】
具体的な一実施形態において、本開示の宿主細胞は、好適なプロモーター配列にそれぞれ作動可能に連結される、配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号５０～８９および配列番号９２～９５のいずれか１つを含むバリアントのうちの１つの発現に好適なコード配列を有する発現ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞である。
【0140】
次に、後者の宿主細胞を、本開示の組換えバリアントまたは関連融合タンパク質の発現および産生に好適な条件下においてさらに培養してもよい。
【0141】
［医薬組成物］
別の態様において、本開示は、本明細書中に開示されるバリアントもしくは関連融合タンパク質、または機能的等価物を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。このような組成物は上記のように、（例えば、２つ以上の異なる）組換えバリアントまたは関連融合タンパク質の１つまたは組合せを含んでいてもよい。
別の態様において、本開示は、本明細書中に開示されるバリアントもしくは関連融合タンパク質、または機能的等価物を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。このような組成物は上記のように、（例えば、２つ以上の異なる）組換えバリアントまたは関連融合タンパク質の１つまたは組合せを含んでいてもよい。
【0142】
例えば、上記医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体と一緒に処方された、表１に記載の好適なバリアント（典型的には、配列番号２２～２８および配列番号５０～８９のいずれかのポリペプチドを含む）、もしくは融合タンパク質（例えば、配列番号４２～４３もしくは配列番号９２～９５）、またはそれらの機能的等価物のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を含む。
【0143】
本明細書に開示される医薬組成物は、併用療法、すなわち他の薬剤と組合せて投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの抗炎症剤または別の抗糖尿病剤と組合せた、本開示のバリアント、例えば、配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号５０～８９、および配列番号９２～９５のいずれか１つのポリペプチドを含む組換えタンパク質、またはそれらの機能的等価物を含んでいてもよい。併用療法に使用することができる治療薬の例は、本開示の組換えバリアントまたは関連融合タンパク質の用途のセクションにおいて以下にさらに詳細に記載される。
【0144】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容し得る担体」は、生理学的に適合性である任意のおよびすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。担体は、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与（例えば、注射または注入による）に適しているべきである。
【0145】
一実施形態において、担体は皮下経路または静脈内注射に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、本開示のバリアントは、化合物を不活性化し得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護するために、材料中において被覆されていてもよい。
【0146】
滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容し得る担体の一例である。他の好適な担体は当業者に周知である（Remington and Gennaro, 1995）。製剤は、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミンをさらに含んでいてもよい。
【0147】
医薬組成物の形態、投与経路、用量およびレジメンは、処置される状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重および性別等に当然依存する。
【0148】
本開示の医薬組成物は、経口、鼻腔内、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、非経口、局所、または直腸投与等のために製剤化することができる。有効成分としての本開示のバリアントは、単独で、または別の有効成分と組合せて、単位投与形態で、従来の医薬担体との混合物として、動物およびヒトに投与することができる。
【0149】
好適な単位投与形態には、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒および経口懸濁液または溶液等の経口経路形態、舌下および口腔投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下および鼻腔内投与形態ならびに直腸投与形態が含まれる。
【0150】
好ましくは、医薬組成物は、注射することができる製剤に薬学的に許容し得るビヒクルを含む。これらは特に、等張、滅菌、生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウム等、またはこれらの塩の混合物）、または乾燥、特に凍結乾燥組成物であってもよく、これらは場合に応じて、滅菌水または生理食塩水の添加で、注射溶液の構成を可能にする。
【0151】
投与のために使用される用量は、種々のパラメーターの作用として、特に使用される投与の様式、関連する病理、または代わりに所望の処置期間の作用として適合させることができる。
【0152】
医薬組成物を調製するために、治療有効量の本開示のバリアントを、薬学的に許容し得る担体または水性媒体中に溶解または分散させてもよい。
【0153】
注射使用に好適な医薬形態は、滅菌された水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌された注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌された粉末または凍結乾燥物を含んでいてもよい。すべての場合において、この形態は、滅菌されていなければならず、そして注射し易さが存在する程度に流体でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【0154】
遊離塩基または薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース、と好適に混合される水で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれら混合物中、ならびに油中において、分散液を調製することもできる。保存および使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含む。
【0155】
本開示のバリアントまたは関連融合タンパク質は、中性または塩形態の組成物に処方することができる。薬学的に許容し得る塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が挙げられ、これは無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等）で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）、および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等）からも誘導することができる。
【0156】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等）によってもたらされることができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、の組成物における使用によってもたらされることができる。
【0157】
滅菌された注射溶液は、活性化合物、すなわちＲｓｐｏ１タンパク質、の必要量を適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した種々の他の成分と共に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、基本的な分散媒および上記に列挙した成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへ種々の滅菌された有効成分を混合することにより調製される。滅菌された注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、有効成分の粉末と予め滅菌濾過された溶液から任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる。
【0158】
処方に際して、溶液は投与処方に適合した様式で、さらに治療的に有効である量で投与されるであろう。製剤は上記の種類の注射溶液等の種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も使用することができる。
【0159】
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は必要ならば好適に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。この関係で、使用できる滅菌水性媒体は本開示の観点から当業者に知られているのであろう。例えば、１用量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下溶解液に添加するか、または提案された注入部位に注入することができる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。処置される対象の状態に依存して、ある程度の用量のばらつきが必然的に生じ得る。いずれにしても、投与責任者が個々の対象に適した用量を決定する。
【0160】
本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物は、約０．０１ｍｇ～１０００ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ～１００ｍｇ／ｋｇを含むように、治療混合物内に処方してもよい。複数回投与もまた可能である。
【0161】
組換えタンパク質の注入または皮下注射のための溶液に好適な製剤は当技術分野で記載されており、例えば、Advances in Protein Chemistry and Structural Biology Volume 112, 2018, Pages 1-59 Therapeutic Proteins and Peptides Chapter One - Rational Design of Liquid Formulations of Proteins: Mark C.Manning, Jun Liu, Tiansheng Li, Ryan E.Holcombにてレビューされている。
【0162】
［本開示のバリアントまたは関連タンパク質の使用および方法］
本開示のバリアントもしくは関連タンパク質、またはそれらの機能的等価物は、インビトロおよびインビボでの有用性を有する。例えば、これらの組換えタンパク質は種々の障害を処置または予防するために、例えば、インビトロ、エクスビボもしくはインビボで培養中の細胞に投与することができ、または、対象に（例えば、インビボで）投与することができる。
本開示のバリアントもしくは関連タンパク質、またはそれらの機能的等価物は、インビトロおよびインビボでの有用性を有する。例えば、これらの組換えタンパク質は種々の障害を処置または予防するために、例えば、インビトロ、エクスビボもしくはインビボで培養中の細胞に投与することができ、または、対象に（例えば、インビボで）投与することができる。
【0163】
本明細書で使用される場合、用語「処置する（treat）」、「処置する（treating）」または「処置（treatment）」は、（１）疾患を抑制すること；例えば、疾患、状態または障害の病状または総体的症状を経験または示している個体における疾患、状態または障害を抑制すること（すなわち、病状および／または総体的症状のさらなる進展を停止させること）；および（２）疾患を改善すること；例えば、疾患の重症度を低下させる、または疾患の１つ以上の症状を軽減または緩和する等、疾患、状態または障害の病状または総体的症状を経験または示している個体における疾患、状態または障害を改善すること（すなわち、病状および／または総体的症状を逆転させること）のうちの１つ以上を示す。
【0164】
特に、糖尿病の処置に関して、より具体的には１型糖尿病に関して、用語「処置」は、膵臓β細胞の損失の抑制、ならびに／または膵臓β細胞（特に上記対象における機能的インスリンを分泌するβ細胞）の量の増加、ならびに／または、特に、疾患（例えば、１型糖尿病）により膵臓β細胞および／もしくはランゲルハンス島が損失している患者における血糖制御の改善を指してもよい。
【0165】
本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物は、インビボでの膵臓β細胞の増殖を誘導し、機能的なインスリン分泌ランゲルハンス島を再構成することができ、それにより、糖尿病患者、または機能的なインスリン分泌β細胞を必要とする患者、または高血糖に関連する障害を有する患者、またはグルコース刺激インスリン分泌が欠損している患者の処置に使用してもよい。
【0166】
本明細書で使用される場合、用語「糖尿病」は一般に、インスリン不足またはその作用に対する抵抗性を生じる任意の状態または障害を示す。
【0167】
糖尿病の例には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、および成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0168】
したがって、本開示は、必要とする対象において、上記に開示される障害の１つを処置するための方法に関する。当該方法は、上記に開示される本開示のバリアントもしくは関連タンパク質、または機能的等価物（典型的には、配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号５０～８９、および配列番号９２～９５のいずれかのポリペプチドを含む組換えタンパク質、またはそれらの機能的等価物）の治療有効量を上記対象に投与する工程を含む。
【0169】
特定の実施形態において、上記対象は、Ｒｓｐｏ１遺伝子発現が低い患者の中から選択されている。
【0170】
上記に開示される使用するためのバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物は、例えば上記の疾患の処置または予防のために、唯一の有効成分として投与してもよく、または、例えばサイトカイン、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗糖尿病剤または血糖降下剤、細胞療法製品（例えば、β細胞組成物）および免疫調節剤等の他の薬剤をアジュバントとしてもしくはそれらと組合せて、併用して投与してもよい。
【0171】
例えば、上記に開示される、使用のためのバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物は、細胞療法、特にβ細胞療法と組合せて使用してもよい。
【0172】
本明細書で使用される場合、用語「細胞療法」は、少なくとも治療有効量の細胞組成物の、それを必要とする対象へのインビボ投与を含む療法をいう。患者に投与される細胞は、同種または自家であってもよい。用語「β細胞療法」は、細胞組成物が有効成分としてβ細胞、特にインスリン分泌β細胞を含む、細胞療法を示す。当該β細胞は、Ｒｓｐｏ１タンパク質を使用して、以下に記載されるインビトロの方法で産生してもよい。
【0173】
特定の実施形態において、糖尿病患者、または機能的なインスリン分泌β細胞を必要とする患者、または高血糖に関連する障害を有する患者、またはグルコース刺激インスリン分泌不全の患者を処置するために使用するためのＲｓｐｏ１タンパク質、そのバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物は、β細胞組成物（特に幹細胞由来β細胞組成物）と組み合わせて、該β細胞組成物の前、同時、または後に投与される。
【0174】
特定の実施形態では、前記β細胞は、生体ドナー、死体ドナーから単離される。
【0175】
別の特定の実施形態では、前記β細胞は幹細胞由来β細胞である。幹細胞由来β細胞とは、多能性幹細胞、特に誘導多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞の分化によって得られるインスリン分泌β細胞を指す。一実施形態において、幹細胞がヒト幹細胞である場合、当該ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。幹細胞由来のβ細胞は、膵臓β細胞を示す少なくとも１つのマーカー（例えばＰＤＸ－１またはＮＫＸ６．１）を示し、インスリンを発現し、内因性の成熟β細胞に特徴的なグルコース刺激インスリン分泌反応（ＧＳＩＳ）をインビトロまたはインビボで示す。
【0176】
本明細書において、「インスリン分泌β細胞」という用語は、インスリンを分泌する内分泌前駆細胞またはその前駆細胞から分化した細胞を指す。インスリン分泌β細胞には、膵臓β細胞、およびインスリンを発現する膵臓β様細胞が含まれる。
【0177】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、（有糸分裂による）自己複製能と、３つの生殖細胞層（外胚葉、内胚葉、中胚葉）に由来する特殊な細胞型への分化能の両方を有する未分化細胞であり、身体のあらゆる組織の細胞を生み出す。特定の実施形態では、多能性幹細胞は誘導多能性幹細胞またはヒト胚性幹細胞である。
【0178】
本明細書において、「ｉＰＳ細胞」および「誘導多能性幹細胞」という用語は、互換的に使用され、例えば、１つ以上の遺伝子の強制発現を誘導することによって、非多能性細胞、典型的には成人の体細胞から人為的に（例えば、誘導または完全な逆転によって）誘導された多能性幹細胞を指す。
【0179】
「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」とは、本明細書では、胚盤胞期にあるヒト胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）由来のヒト幹細胞を指す。ヒト胚は受精後４～５日で胚盤胞期に達し、その時点で５０～１５０個の細胞から構成されている。胚性幹細胞は多能性幹細胞である。本発明によれば、ヒト胚性幹細胞は、確立された細胞株から得てもよいし、当業者に公知の異なる技術によって胚から単離してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるような方法および組成物に使用される幹細胞の供給源として、ヒト胚は破壊されなかった。
【0180】
幹細胞由来のβ細胞を作製する方法は当技術分野で周知であり、D′Amour, K. A. et al. (2006); Jiang, J. et al. (2007);およびKroon, E. et al. (2008), Rezania et al (2012, 2014), Felicia W. Pagliuca et al (2014)、ならびにＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１９９２号に記載されているプロトコルによって説明されるが、当該プロトコルに限定されるものではなく、関連部分は本開示に組み込まれる。多能性幹細胞をインスリン分泌β細胞に分化誘導するためのこれらのプロトコルには、インスリン分泌β細胞に分化誘導可能な膵臓前駆細胞又は内分泌前駆細胞などの前駆細胞に、幹細胞を分化誘導することが含まれる。
【0181】
細胞療法製品とは、処置目的で上記患者に投与される細胞組成物を示す。上記細胞療法製品は、治療有効用量の細胞、および任意選択で、追加の賦形剤、アジュバント、または他の薬学的に許容し得る担体を含む。
【0182】
好適な抗糖尿病剤または血糖降下剤には、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩレセプター遮断剤、コレステロール低下薬、ビグアニド、メトホルミン、チアゾリジンジオン、血糖降下剤スルファミド、ＤＰＰ－４阻害剤、α－グルコシダーゼ阻害剤、インスリンまたはその誘導体（短時間作用型、速効型または長時間作用型インスリンを含む）、ＧＬＰ１アナログ、カルバモイルメチル安息香酸の誘導体；典型的にはインスリンレセプター、ＳＬＧＴ２阻害剤、ＧＡＢＲ標的分子、およびＩＬ２Ｒ標的分子が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【0183】
上記によれば、本開示は、さらに別の態様を提供する：
本開示の治療有効量のバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物と、少なくとも１つの第２の薬物物質とを同時投与（例えば、同時にまたは連続して投与）する工程を含み、当該第２の薬物物質は例えば上記の、サイトカイン、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗糖尿病剤、細胞療法製品（例えば、β細胞組成物）である、上記に定義される方法。
本開示の治療有効量のバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物と、少なくとも１つの第２の薬物物質とを同時投与（例えば、同時にまたは連続して投与）する工程を含み、当該第２の薬物物質は例えば上記の、サイトカイン、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗糖尿病剤、細胞療法製品（例えば、β細胞組成物）である、上記に定義される方法。
【0184】
上記に開示された障害のうちの１つを処置するための方法の特定の実施形態において、それを必要とする対象において、前記方法は、治療有効量のβ細胞組成物（特に本明細書に開示されるような幹細胞由来のβ細胞組成物）と組み合わせて、治療有効量のＲｓｐｏ１タンパク質、または本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、または機能的等価物を、例えば、前記β細胞組成物の前、同時、または後に、前記対象に投与する工程を含む。
【0185】
特定の実施形態では、前記β細胞は、生体ドナーまたは死体ドナーから単離される。
【0186】
別の特定の実施形態では、前記β細胞は幹細胞由来β細胞である。幹細胞由来β細胞とは、幹細胞、特に誘導多能性幹細胞、ヒト胚性幹細胞または間葉系前駆細胞の分化によって得られるインスリン分泌β細胞を指す。一実施形態において、幹細胞がヒト幹細胞である場合、当該ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。
【0187】
β細胞またはランゲルハンス島を患者に移植する方法は、例えば、Shapiro, et al (2000) The New England Journal of Medicine. 343 (4): 230-238,およびShapiro et al (2017) Nature Reviews Vol 13 : 268-277に開示されている。
【0188】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のβ細胞は、分散細胞として、またはクラスターを形成された状態で前記患者に投与される。β細胞は、非限定的な例として肝臓、天然膵臓、腎被膜下腔、卵膜、腹膜、漿膜下腔、腸、胃、または皮下ポケットなど、被験体の適切な部位に移植することができる。
【0189】
具体的な実施形態において、前記β細胞組成物は、処置を必要とする対象に対して自己由来であり、好ましくは、処置を必要とする対象の体細胞から得られたｉＰＳに由来する。
【0190】
具体的な実施形態において、そのような処置を必要とする前記対象は、糖尿病、好ましくは１型糖尿病に罹患している対象である。
【0191】
別の実施形態において、本開示のバリアントもしくは関連タンパク質、またはそれらの機能的等価物は、膵臓β細胞および／またはランゲルハンス島の増殖を誘導するために、インビトロの方法において使用することができる。
【0192】
したがって、一態様において、本開示はさらに、以下の工程を含む、β細胞をインビトロで産生するための方法を提供する：
（ｉ）β細胞を提供する工程、
（ii）上記β細胞の増殖を誘導する条件下で、治療有効量の上記バリアントもしくは関連タンパク質、またはそれらの機能的等価物の存在下で上記β細胞を培養する工程。
（ｉ）β細胞を提供する工程、
（ii）上記β細胞の増殖を誘導する条件下で、治療有効量の上記バリアントもしくは関連タンパク質、またはそれらの機能的等価物の存在下で上記β細胞を培養する工程。
【0193】
上記製造方法の具体的な実施形態において、上記β細胞は初代細胞であり、好ましくはβ細胞療法またはランゲルハンス島の移植を必要とする対象由来の初代細胞である。
【0194】
他の具体的な実施形態において、工程（ｉ）で提供される上記β細胞は、上記ｉＰＳ細胞をβ細胞に分化させた後に、ｉＰＳ細胞から得られている。
【0195】
したがって、特定の実施形態において、本開示は、以下の工程を含む、誘導多能性幹細胞からβ細胞をインビトロで産生するための方法に関する：
（ｉ）誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供する工程、
（ii）上記ｉＰＳＣをランゲルハンス島のβ細胞にインビトロで分化させる工程、および、
（iii）増殖条件下において上記分化させたβ細胞を培養する工程、
ｉＰＳ細胞を分化するおよび／または、上記β細胞の増殖を誘導するために、工程（ii）および／または工程（iii）において十分な量の上記バリアントもしくは関連融合タンパク質、または機能的等価物を添加する。
（ｉ）誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供する工程、
（ii）上記ｉＰＳＣをランゲルハンス島のβ細胞にインビトロで分化させる工程、および、
（iii）増殖条件下において上記分化させたβ細胞を培養する工程、
ｉＰＳ細胞を分化するおよび／または、上記β細胞の増殖を誘導するために、工程（ii）および／または工程（iii）において十分な量の上記バリアントもしくは関連融合タンパク質、または機能的等価物を添加する。
【0196】
ｉＰＳＣをランゲルハンス島のβ細胞に分化させるための方法は、例えば、Pagliuca, et al. Cell 159, 428-439 (2014) and Rezania et al. Nat Biotechnol. 2014 Nov;32(11):1121-33)等で、当技術分野において既に説明されており、関連部分は本開示に組み込まれる。
【0197】
上記開示はさらに、例えば、糖尿病、好ましくは１型糖尿病を処置するための対象において、上記方法によって得ることができるまたは得られた上記β細胞を含む組成物、および細胞療法製品としてのその使用をさらに含む。β細胞またはランゲルハンス島を患者に移植するための方法は、例えば、Shapiro, et al (2000) The New England Journal of Medicine. 343 (4): 230-238, and Shapiro et al (2017) Nature Reviews Vol 13: 268-277に開示されている。
【0198】
本明細書に開示される組成物（例えば、本開示のバリアントを含む）および使用説明書からなるキットもまた、本開示の範囲内である。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬、または１つ以上のさらなる抗体もしくはタンパク質をさらに含むことができる。キットは、典型的にはキットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。用語「ラベル」は、キット上またはキットと共に供給される、または別にキットに付随する、任意の書面または記録された材料を含む。キットは上記で定義したように、患者がＲｓｐｏ処置に応答するグループに属するか否かを診断するためのツールをさらに含んでもよい。
【0199】
別の処置戦略は、ヒト対象の試料から単離されたβ細胞 β細胞を増殖させる薬剤としての、バリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物の使用に基づく。
【0200】
本開示は、以下の工程を含む、必要とする対象を処置するための方法に関する：
（ａ）対象から細胞を単離する工程、
（ｂ）任意選択で、上記細胞を増殖および／またはリプログラミングして、誘導多能性幹細胞にする工程、
（ｃ）上記ｉＰＳ細胞をβ細胞 β細胞に分化させる工程、
（ｄ）本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物（例えば、配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号５０～８９、および配列番号９２～９５のいずれかを含む組換えタンパク質、またはそれらの機能的等価物）の存在下で、任意選択で他の細胞と、上記β細胞 β細胞をインビトロで増殖させる工程、
（ｅ）任意選択で、増殖したβ細胞 β細胞を回収し、および／または増殖したβ細胞を処方し、治療有効量の上記増殖させたβ細胞を対象に投与する工程。
（ａ）対象から細胞を単離する工程、
（ｂ）任意選択で、上記細胞を増殖および／またはリプログラミングして、誘導多能性幹細胞にする工程、
（ｃ）上記ｉＰＳ細胞をβ細胞 β細胞に分化させる工程、
（ｄ）本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物（例えば、配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号５０～８９、および配列番号９２～９５のいずれかを含む組換えタンパク質、またはそれらの機能的等価物）の存在下で、任意選択で他の細胞と、上記β細胞 β細胞をインビトロで増殖させる工程、
（ｅ）任意選択で、増殖したβ細胞 β細胞を回収し、および／または増殖したβ細胞を処方し、治療有効量の上記増殖させたβ細胞を対象に投与する工程。
【0201】
本開示はさらに、本開示の上記バリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物（例えば、配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号５０～８９、および配列番号９２～９５のいずれか１つを含む組換えタンパク質、またはそれらの機能的等価物）の、β細胞をインビトロで増殖させる薬剤としての使用に関する。
【0202】
本開示はまた、ヒト、特に機能的β細胞を損失している対象、典型的には糖尿病に罹患している対象、におけるβ細胞の増殖を誘導するための薬剤としてインビボで使用するための、本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物（配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号５０～８９、および配列番号９２～９５のいずれか１つを含む組換えタンパク質、またはそれらの機能的等価物等）にも関する。
【0203】
したがって、本開示は、以下の工程を含む、糖尿病、例えば、１型糖尿病または機能的β細胞の損失を伴う別の障害、に罹患している対象の処置方法に関する：
（ｉ）上記対象において、有効量の本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、または機能的等価物（典型的には、配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号９２～９５、および配列番号５０～８９のいずれか１つを含む組換えタンパク質、またはそれらの機能的等価物）を投与する工程、および、
（ii）上記対象において有効量のβ細胞組成物を投与する工程、
上記有効量の上記バリアントまたは関連融合タンパク質は、上記β細胞組成物の増殖を増加させる能力を有する。工程（ｉ）および（ii）は同時にまたは連続して実施することができ、特に、工程（ｉ）または工程（ii）のいずれかを最初に上記対象に投与する。
（ｉ）上記対象において、有効量の本開示のバリアントもしくは関連融合タンパク質、または機能的等価物（典型的には、配列番号２２～２８、配列番号４２～４３、配列番号９２～９５、および配列番号５０～８９のいずれか１つを含む組換えタンパク質、またはそれらの機能的等価物）を投与する工程、および、
（ii）上記対象において有効量のβ細胞組成物を投与する工程、
上記有効量の上記バリアントまたは関連融合タンパク質は、上記β細胞組成物の増殖を増加させる能力を有する。工程（ｉ）および（ii）は同時にまたは連続して実施することができ、特に、工程（ｉ）または工程（ii）のいずれかを最初に上記対象に投与する。
【0204】
十分に説明された本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは例示に過ぎず、さらなる限定を意図するものではない。
【0205】
〔実施形態〕
Ｅ１． 以下のＦＵ１ドメイン、ＦＵ２ドメイン、ＴＳＰドメインおよびＢＲドメインを含む、Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアントであって、
ａ． ＦＵ１は、配列番号５、９、１３および１７にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ１ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
ｂ． ＦＵ２は、配列番号６、１０、１４、１８にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ２ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
ｃ． ＴＳＰは、配列番号７、１１、１５、１９に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＴＳＰドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、ならびに
ｄ． ＢＲは、配列番号８、１２、１６、２０に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＢＲドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
組換えバリアント。
Ｅ１． 以下のＦＵ１ドメイン、ＦＵ２ドメイン、ＴＳＰドメインおよびＢＲドメインを含む、Ｒ－スポンジンタンパク質の組換えバリアントであって、
ａ． ＦＵ１は、配列番号５、９、１３および１７にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ１ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
ｂ． ＦＵ２は、配列番号６、１０、１４、１８にそれぞれ示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４のＦＵ２ドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
ｃ． ＴＳＰは、配列番号７、１１、１５、１９に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＴＳＰドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、ならびに
ｄ． ＢＲは、配列番号８、１２、１６、２０に示されるヒトＲｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４のＢＲドメインのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するドメインである、
組換えバリアント。
【0206】
Ｅ２． Ｅ１に記載の組換えバリアントであって、各ドメインＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲは、配列番号１のヒトＲｓｐｏ１ドメインのＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインとそれぞれ少なくとも８０％の同一性を有する、組換えバリアント。
【0207】
Ｅ３． Ｅ１またはＥ２に記載の組換えバリアントであって、ＴＳＰドメインおよびＢＲドメインが、それぞれ対応するヒトＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよびＢＲドメインと１００％の同一性を有し、ＦＵ１ドメインおよびＦＵ２ドメインのアミノ酸配列が、対応するヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１およびＦＵ２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、差異はアミノ酸置換によるものである、組換えバリアント。
【0208】
Ｅ４． Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、配列番号５のヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインおよび配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインを対応させてそれぞれアライメントした場合に、ＦＵ１ドメインまたはＦＵ２ドメインの各々において１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を超えないアミノ酸置換を有する、組換えバリアント。
【0209】
Ｅ５． 請求項Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、Ｒｓｐｏ１の２１～３３の領域内、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４における同等領域内の、最初の１０～１４個のＮ末端アミノ酸の欠失、典型的にはＲｓｐｏ１の残基２１～３１の欠失を含む、組換えバリアント。
【0210】
Ｅ６． Ｅ５に記載の組換えバリアントであって、配列番号２４のタンパク質を含むか、または配列番号２４のタンパク質からなる、組換えバリアント。
【0211】
Ｅ７． Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、配列番号５のヒトＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインにおけるＲ６６のアミノ酸置換、または、ヒトＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４のＦＵ１ドメイン配列における同等のアルギニン残基のアミノ酸置換を少なくとも含み、前記アミノ酸置換はＺＮＲＦ３結合を減少または消失させる、組換えバリアント。
【0212】
Ｅ８． 請求項Ｅ７に記載の組換えバリアントであって、ＺＮＲＦ３結合を減少または消失させる残基Ｒ６６の単一アミノ酸置換、典型的にはＲ６６Ａを有する、配列番号５のＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメインを含む、組換えバリアント。
【0213】
Ｅ９． Ｅ７またはＥ８に記載の組換えバリアントであって、前記ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲドメインが、Ｒｓｐｏ１と９５％、好ましくは１００％同一であり、例えば、前記組換えバリアントは、配列番号２３を含むか、または本質的に配列番号２３からなる、組換えバリアント。
【0214】
Ｅ１０． 請求項Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、Ｒ－スポンジンの前記バリアントは、Ｒｓｐｏ１／ＬＧＲ４結合親和性インビトロアッセイにて測定し、配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１よりも高い親和性でＬＧＲ４に結合する、組換えバリアント。
【0215】
Ｅ１１． Ｅ１０に記載の組換えバリアントであって、配列番号４１のキメラＲｓｐｏ１と比較してＬＧＲ４への結合親和性を増強させるために、Ｒｓｐｏ１の位置Ｈ１０８、Ｎ１０９、Ｅ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２７、Ａ１２８、Ｓ１３３、Ａ１３６、Ｇ１３８、もしくはＳ１４３、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４の対応する残基において１つ以上のアミノ酸置換を含み、より具体的には、Ｈ１０８Ｋ、Ｎ１０９Ｄ、Ｅ１１６Ｖ、Ｌ１１８Ｆ、Ｐ１２７Ｄ、Ａ１２８Ｆ、Ｓ１３３Ｆ、Ａ１３６Ｌ、Ｇ１３８Ｅ、またはＳ１４３Ｖのうちの１つ以上のアミノ酸置換を含む、組換えバリアント。
【0216】
Ｅ１２． Ｅ１０に記載の組換えバリアントであって、Ｒｓｐｏ１の位置Ｅ４５、Ｌ４６、Ｅ４９、Ｖ５０、Ｎ５１、Ｋ５５、Ｓ５７、Ｉ６２、Ｌ６３、Ｄ６８、Ｐ７７、Ｆ８４、Ｄ８５、Ｎ８８、またはＩ９５、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはＲｓｐｏ４の対応する残基において１つ以上のアミノ酸置換を含み、配列番号４１のＲｓｐｏ１と比較して、ＺＮＲＦ３への結合親和性を増強させる、組換えバリアント。
【0217】
Ｅ１３． Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、当該バリアントは、ＦＵ２ドメインとＴＳＰドメインとの間にＮ－グリコシル化部位を含んでいない、組換えバリアント。
【0218】
Ｅ１４． Ｅ１３に記載の組換えバリアントであって、Ｒｓｐｏ１の残基Ｎ１３７、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、もしくはＲｓｐｏ４の相当する残基に変異を含み、この部位でのＮ－グリコシル化を抑制する、組換えバリアント。
【0219】
Ｅ１５． Ｅ１４に記載の組換えバリアントであって、配列番号２２を含むか、または本質的に配列番号２２からなる、組換えバリアント。
【0220】
Ｅ１６． Ｅ１～Ｅ１５のいずれかに記載の１つの組換えバリアントであって、前記ＦＵ１ドメインは、配列番号９のＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメインと１００％同一であり、前記ＦＵ２は、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３、Ｒｓｐｏ４、またはこれらの機能的バリアントであって、ＬＧＲ４に対する結合親和性を少なくとも同じに維持するアミノ酸置換を有するバリアントのＦＵ２ドメインの中から選択される、組換えバリアント。
【0221】
Ｅ１７． Ｅ１６に記載の組換えバリアントであって、配列番号９のＲｓｐｏ２のＦＵ１ドメインおよび配列番号６のＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメイン、ならびに任意選択で配列番号７のＲｓｐｏ１のＴＳＰドメインおよび配列番号８のＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含む、組換えバリアント。
【0222】
Ｅ１８． Ｅ１６に記載の組換えバリアントであって、配列番号２５または配列番号２６を含むか、または本質的に配列番号２５または配列番号２６からなる、組換えバリアント。
【0223】
Ｅ１９． Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、位置Ｅ４９、Ｖ５０、Ｄ６８、およびＤ８５に１つ以上のアミノ酸置換を含むことを除いて、配列番号９と同じ配列を有し、配列番号２５のタンパク質と比較して、ＺＮＲＦ３への結合親和性を増強させる、組換えバリアント。
【0224】
Ｅ２０． Ｅ１９に記載の組換えバリアントであって、位置Ｅ４９、Ｖ５０、Ｄ６８、およびＤ８５に１つ以上のアミノ酸置換を含むことを除いて、配列番号５のＲｓｐｏ１ ＦＵ１ドメインを含み、配列番号２５のタンパク質と比較してＺＮＲＦ３への結合親和性を増強させ、好ましくはアミノ酸置換Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｄ６８Ｇ、およびＤ８５Ｇを含み、さらに、前記ＦＵ２ドメインは、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ３、Ｒｓｐｏ４のＦＵ２ドメイン、またはこれらの機能的バリアントであって、ＺＮＲＦ３に対する結合親和性を少なくとも同じに維持するアミノ酸置換を有するバリアントのＦＵ２ドメインの中から選択される、組換えバリアント。
【0225】
Ｅ２１． Ｅ１９またはＥ２０に記載の組換えバリアントであって、前記ＦＵ２ドメインが、配列番号６のＲｓｐｏ１ ＦＵ２ドメインと１００％同一である、組換えバリアント。
【0226】
Ｅ２２． Ｅ１９またはＥ２０に記載の組換えバリアントであって、Ｅ４５Ｌ、Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｋ５５Ｒ、Ｄ６８Ｇ、Ｄ８５Ｇ、Ｎ８８Ａ、およびＨ１０８Ｋ、Ｎ１０９Ｄの中から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有するＲｓｐｏ１のＦＵ１およびＲｓｐｏ１のＦＵ２ドメインを含む、組換えバリアント。
【0227】
Ｅ２３． Ｅ１９～Ｅ２２のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、配列番号２７を含むか、または本質的に配列番号２７からなる、組換えバリアント。
【0228】
Ｅ２４． Ｅ１９～Ｅ２２のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、配列番号２８を含むか、または本質的に配列番号２８からなる、組換えバリアント。
【0229】
Ｅ２５． Ｅ１９～Ｅ２２のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、配列番号１０、１４、または１８の、ヒトＲｓｐｏ３またはＲｓｐｏ４の対応するＦＵ２ドメインを、Ｒｓｐｏ２のＦＵ１ドメインまたはハイブリッドＲｓｐｏ１のＦＵ１ドメイン（例えば、位置Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｄ６８Ｇ、Ｄ８５Ｇにて１つ以上のアミノ酸置換を含む）と組み合わせて含み、Ｅ４９Ｋ、Ｖ５０Ｄ、Ｄ６８Ｇ、Ｄ８５ＧなどのＺＮＲＦ３への結合を増強させる、組換えバリアント。
【0230】
Ｅ２６． Ｅ１に記載の組換えバリアントであって、配列番号２２～２８のいずか１つと比較して、１０個を超えないアミノ酸置換を有する、配列番号２２～２８のいずれか１つのバリアントである、組換えバリアント。
【0231】
Ｅ２７． Ｅ２６に記載の組換えバリアントであって、配列番号２２～２８のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の同一性を有し、前記ＦＵ１ドメインおよびＦＵ２ドメインが、配列番号２２～２８のうちの少なくとも１つのＦＵ１ドメインおよびＦＵ２ドメインに対して１００％同一である、組換えバリアント。
【0232】
Ｅ２８． Ｅ２６に記載の組換えバリアントであって、配列番号２２～２８の１つと同一のアミノ酸配列を含むが、１、２または３個のアミノ酸残基が、別の天然アミノ酸によって置換され、好ましくは保存的アミノ酸置換で置換されている、組換えバリアント。
【0233】
Ｅ２９． Ｅ１～Ｅ２８のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、前記ＦＵ２ドメインは、配列番号１のヒトＲｓｐｏ１におけるアミノ酸残基Ｆ１０６、Ｈ１０８、Ｆ１１０、Ｎ１０９、Ｅ１１６、Ｌ１１８、Ｐ１２７、Ａ１２８、Ｓ１３３、Ａ１３６、Ｇ１３８、Ｓ１４３、または配列番号２のヒトＲｓｐｏ２、配列番号３のヒトＲｓｐｏ３もしくは配列番号４のヒトＲｓｐｏ４における対応する残基を含む、組換えバリアント。
【0234】
Ｅ３０． Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、前記ＢＲドメインは、アミノ酸残基Ｔ２５３、Ｌ２５７、Ｔ２５８、Ｓ２５９、Ａ２６０またはＡ２６３のうちの少なくとも１つ以上のアミノを含み、典型的には、前記ＢＲドメインは、配列番号８、１２、１６、２０と１００％同一である、組換えバリアント。
【0235】
Ｅ３１． Ｅ１～Ｅ３０のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、ＢＲドメインにおいてアミノ酸置換を含むことによりＯ－グリコシル化を改善し、例えば、前記バリアントは、Ｒｓｐｏ１の位置Ｇ２５２、Ｔ２５３、Ｌ２５７、Ｔ２５８、Ｓ２５９、Ａ２６０、Ａ２６３、またはＲｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３もしくはＲｓｐｏ４における対応する残基において、１つ以上のアミノ酸置換を含み、例えば、前記バリアントは、アミノ酸置換Ｇ２５２Ｔ、Ｌ２５７Ｓ、Ａ２６０ＴもしくはＡ２６３Ｔの１つ以上を有するＲｓｐｏ１のＢＲドメインを含む、組換えバリアント。
【0236】
Ｅ３２． Ｅ１～Ｅ３１のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、配列番号４１のＲｓｐｏ１タンパク質と少なくとも同程度のレベルで以下の特性を１つ以上示す、組換えバリアント：
（ｉ） Ｒｓｐｏ１／ＬＧＲ４結合親和性インビトロアッセイにて測定し、例えばＳＰＲアッセイにより決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同一の親和性でＬＧＲ４レセプターに結合する；
（ｉｉ） Ｒｓｐｏ１／ＺＮＲＦ３結合親和性インビトロアッセイで測定し、例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同じ親和性でＺＮＲＦ３レセプターに結合する；
（ｉｉｉ） 例えば以下の実施例に記載されるようにトップフラッシュアッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまでｗｎｔ／βカテニン経路を活性化させる、
（ｉｖ） 例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する；および／または
（ｖ） 例えばインビボのβ細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する。
（ｉ） Ｒｓｐｏ１／ＬＧＲ４結合親和性インビトロアッセイにて測定し、例えばＳＰＲアッセイにより決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同一の親和性でＬＧＲ４レセプターに結合する；
（ｉｉ） Ｒｓｐｏ１／ＺＮＲＦ３結合親和性インビトロアッセイで測定し、例えばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡアッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同じ親和性でＺＮＲＦ３レセプターに結合する；
（ｉｉｉ） 例えば以下の実施例に記載されるようにトップフラッシュアッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまでｗｎｔ／βカテニン経路を活性化させる、
（ｉｖ） 例えばインビトロのＭｉｎ６β細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する；および／または
（ｖ） 例えばインビボのβ細胞増殖アッセイにて決定すると、参照の配列番号４１のヒトＲｓｐｏ１と少なくとも同程度のレベルまで機能的β細胞の増殖を誘導する。
【0237】
Ｅ３３． Ｅ１～Ｅ３２のいずれか１つに記載の組換えバリアントと、前記組換えバリアントに対して、直接、またはペプチドリンカーを介して間接的に融合したＦｃ断片と、を含む、Ｆｃ融合タンパク質。
【0238】
Ｅ３４． Ｅ３３に記載のＦｃ融合タンパク質であって、Ｒ－スポンジンタンパク質のＮ末端に直接、または間接的に融合したＦｃ断片をさらに含む、Ｆｃ融合タンパク質。
【0239】
Ｅ３５． Ｅ３３に記載のＦｃ融合タンパク質であって、Ｒ－スポンジンタンパク質のＣ末端に直接、または間接的に融合したＦｃ断片をさらに含む、Ｆｃ融合タンパク質。
【0240】
Ｅ３６． Ｅ３３～３５のいずれか１つに記載のＦｃ融合タンパク質であって、前記ペプチドリンカーは、例えば、（ＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ）（配列番号４４）または（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧ）（配列番号４５）のリンカーを含む、Ｆｃ融合タンパク質。
【0241】
Ｅ３７． Ｅ３３～Ｅ３６のいずれか１つに記載のＦｃ融合タンパク質であって、前記Ｆｃ断片は、配列番号２９を含むか、または本質的に配列番号２９からなる、Ｆｃ融合タンパク質。
【0242】
Ｅ３８． Ｅ３３～Ｅ３７のいずれか１つに記載のＦｃ融合タンパク質であって、配列番号４２、４３、または配列番号９２、９３、もしくは９５からなる群から選択される配列を含むか、または本質的に配列番号４２、４３、または配列番号９２、９３、もしくは９５からなる群から選択される配列からなる、Ｆｃ融合タンパク質。
【0243】
Ｅ３９． Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載の組換えバリアントであって、それらを必要とする患者において、薬剤として、特に糖尿病、より好ましくはＩ型またはＩＩ型糖尿病を処置するための薬剤として使用するための、組換えバリアント。
【0244】
Ｅ４０． Ｅ３３～Ｅ３９のいずれか１つに記載の融合タンパク質であって、それらを必要とする患者において、薬剤として、特に糖尿病、より好ましくはＩ型またはＩＩ型糖尿病を処置するための薬剤として使用するための、融合タンパク質。
【0245】
Ｅ４１． 請求項Ｅ３９に記載の使用のための組換えバリアントまたはＥ４０に記載の使用のための融合タンパク質であって、前記組換えバリアントまたは融合タンパク質は、β細胞、好ましくは幹細胞由来のβ細胞と組み合わせて前記患者に投与される、組換えバリアントまたは融合タンパク質。
【0246】
Ｅ４２． Ｅ１～Ｅ３２のいずれか１つに記載の組換えバリアントをコードする核酸。
【0247】
Ｅ４３． Ｅ４２の核酸を含むベクター。
【0248】
Ｅ４４． Ｅ４２の核酸を含む、宿主細胞。
【0249】
Ｅ４５． Ｅ１～Ｅ３２のいずれかに記載の組換えバリアントの製造方法であって、（ｉ）前記組換えバリアントの発現条件下でＥ４４に記載の宿主細胞を培養する工程、（ｉｉ）前記組換えバリアントを回収する工程、（ｉｉｉ）任意選択で、前記組換えバリアントを精製する工程を含む、方法。
【0250】
Ｅ４６． Ｅ３３～Ｅ３８のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【0251】
Ｅ４７． Ｅ４６に記載の核酸を含むベクター。
【0252】
Ｅ４８． Ｅ４６に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【0253】
Ｅ４９． Ｅ３３～Ｅ３８のいずれかに記載の融合タンパク質の製造方法であって、（ｉ）前記融合タンパク質の発現条件下でＥ４４に記載の宿主細胞を培養する工程、（ｉｉ）前記組換えバリアントを回収する工程、（ｉｉｉ）任意選択で、前記組換えバリアントを精製する工程を含む、方法。
【0254】
〔図面の説明〕
〔図１〕異なるドメインＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲの概略図とともに、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３およびＲｓｐｏ４アミノ酸配列のアラインメントを提供する。
〔図１〕異なるドメインＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲの概略図とともに、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３およびＲｓｐｏ４アミノ酸配列のアラインメントを提供する。
【0255】
〔図２〕ＰＢＳ（対照は黒色）、または異なる用量の組換えｈＲｓｐｏ１と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。
【0256】
〔図３〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃００９（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0257】
〔図４〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃００８（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0258】
〔図５〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃００５（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0259】
〔図６〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０３４（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0260】
〔図７〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０４７（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0261】
〔図８〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０５１（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0262】
〔図９〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０６３（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0263】
〔図１０〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０６４（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0264】
〔図１１〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、またはヒスチジンのタグを含む、異なる用量のバリアント＃０４９（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0265】
〔図１２〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０５４（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0266】
〔図１３〕ＰＢＳ（対照）、または２００ｎＭおよび４００ｎＭのタグ付けされていないバリアント＃０４９と共に、２４時間インキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。
【0267】
〔図１４〕ＰＢＳ（対照）、または２００ｎＭおよび４００ｎＭのタグ付けされていないバリアント＃０４９と共に、４８時間インキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。最初の２４時間のインキュベーション後、新鮮なタンパク質を添加した。
【0268】
〔図１５〕ＰＢＳ（対照）、または２００ｎＭおよび４００ｎＭのタグ付けされていないバリアント＃０４９と共に、７２時間インキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。最初の２４時間のインキュベーション後に新鮮なタンパク質を添加し、４８時間後にも再度、新鮮なタンパク質を添加した。
【0269】
〔図１６〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０５６（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0270】
〔図１７〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０８２（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0271】
〔図１８〕ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０１１６（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける左のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１（＃０１４）を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【0272】
〔図１９〕バリアント＃０１４（Ａ）、＃４９（Ｂ）、＃００８（Ｃ）、＃０６４（Ｄ）、＃０５１（Ｅ）、＃１２１（Ｆ）およびＧＬＰ１（１ｎＭ）を用いた、４日間の培養および７２時間の処理後の１２９／Ｓｖマウスのランゲルハンス島におけるＢｒｄＵ陽性β細胞の割合。
【0273】
〔図２０〕バリアント＃０１４（Ａ、Ｂ）およびバリアント＃０６４（Ｃ、Ｄ）の腹腔内注射によって、１６週間毎日処置した雌のＮＯＤマウスの血糖追跡および糖尿病発生率。
【0274】
〔図２１〕雌のＮＯＤマウスを、０．２ｍｇ／Ｋｇ、０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０４９で毎日処置した場合の糖尿病発症率。
【0275】
〔図２２〕０．２ｍｇ／Ｋｇ、０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０４９で毎日処置されたＮＯＤマウスの血糖追跡。
【0276】
〔図２３〕バリアント＃０１４を５日間連続して腹腔内注射されたマウスの膵臓切片における、膵島面積（μｍ２）で正規化したＫｉ６７／インスリン二重陽性細胞の定量化。
【0277】
〔図２４〕バリアント＃０１４を５日間連続して腹腔内注射されたマウスの膵臓切片における、膵島面積（μｍ２）で正規化したＢｒｄＵ／インスリン二重陽性細胞の定量化。
【0278】
〔図２５〕ＳＴＺ処置の１５日前から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスの血糖追跡。
【0279】
〔図２６〕ＳＴＺ処置の１５日前から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスの水分摂取量。
【0280】
〔図２７〕ＳＴＺ処置の１５日前から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置されたＳＴＺ誘導高血糖マウスに対して実施された、腹腔内グルコース負荷試験。この試験は、バリアント＃０１４の連日投与開始から７４日後に実施した。
【0281】
〔図２８〕ＳＴＺ処置の７日後から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスの血糖追跡。
【0282】
〔図２９〕ＳＴＺ処置の７日後から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスの水分摂取量。
【0283】
〔図３０〕ＳＴＺ処置の７日後から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスに対して実施された、腹腔内グルコース負荷試験。この試験は、バリアント＃０１４の連日投与開始から６３日後に実施した。
【0284】
〔図３１〕ヒト膵島を移植され、ＰＢＳ、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４のいずれかを毎日注射された動物の血液にて測定された空腹時ヒトｃ－ペプチド。
【0285】
〔図３２〕ＰＢＳ（対照）、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４のいずれかで２８日間処置された後に、ヒト膵島を移植されたマウスに対して実施した腹腔内グルコース負荷試験。
【0286】
〔図３３〕ＰＢＳ（対照）、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４のいずれかで２８日間処置された後に、ヒト膵島を移植されたマウスの基礎血中ヒトｃ－ペプチド濃度およびグルコース刺激された血中ヒトｃ－ペプチド濃度。
【0287】
〔図３４〕ＰＢＳ（対照）、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４のいずれかで６０日間処置された後に、ヒト膵島を移植された場合の総インスリン容量の定量化。
【0288】
〔図３５〕雄の１２９／Ｓｖマウス（ｎ＝３／タイムポイント）において、＃６３－１、＃６３－２、および＃６４のＦｃ融合タンパク質を０．８ｍｇ／ｋｇでＳＣ投与した後の１６８時間動態の比較は、参照の非Ｆｃタンパク質＃１４との関連において半減期の延長を示している。比較のために、タンパク質＃１４の単回投与ＰＫプロファイルが示されている（破線）。
【0289】
〔実施例〕
１．Ｒ－スポンジンタンパク質の特性解析のための機能試験
（ＺＮＲＦ３結合アッセイ：ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）プロトコル）
ＥＬＩＳＡは、リガンド結合分子（抗体、融合分子など）および検出抗体を使用して、液体試料中の可溶性タンパク質（リガンド）を検出および定量するためのプレートベースのアッセイ法である。
１．Ｒ－スポンジンタンパク質の特性解析のための機能試験
（ＺＮＲＦ３結合アッセイ：ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）プロトコル）
ＥＬＩＳＡは、リガンド結合分子（抗体、融合分子など）および検出抗体を使用して、液体試料中の可溶性タンパク質（リガンド）を検出および定量するためのプレートベースのアッセイ法である。
【0290】
手順：
ＥＬＩＳＡモジュール（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗原（１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ（ｐＨ７．４のＰＢＳ）、４℃で一晩）で処理する。抗原を捕捉した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳでプレートを４回洗浄し、２％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ）を含むＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで６０分間ブロックする。次に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで、４０００ｎｇ／ｍｌから始まるサンプルの連続２倍希釈（第２の層については使用された分子を参照）を行い、プレートに塗布（１００μｌ／ウェル）し、室温にてシェーカー（３００ｒｐｍ）上で６０分間インキュベートする。
ＥＬＩＳＡモジュール（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗原（１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ（ｐＨ７．４のＰＢＳ）、４℃で一晩）で処理する。抗原を捕捉した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳでプレートを４回洗浄し、２％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ）を含むＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで６０分間ブロックする。次に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで、４０００ｎｇ／ｍｌから始まるサンプルの連続２倍希釈（第２の層については使用された分子を参照）を行い、プレートに塗布（１００μｌ／ウェル）し、室温にてシェーカー（３００ｒｐｍ）上で６０分間インキュベートする。
【0291】
第３の層が必要な場合（ＬＧＲ４－Ｈｉｓ結合）：プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで希釈した抗体（第３の層に使用する抗体を参照）１００μｌを添加する。プレートを室温にてシェーカー（３００ｒｐｍ）上で３０分間インキュベートする。
【0292】
次に、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ－ＨＲＰ、１：１００００、０．１μｇ／ｍＬ、ＬａｂＡｓ Ｅｓｔｏｎｉａ）１００μｌを添加する。プレートを室温にてシェーカー（３００ｒｐｍ）上で３０分間インキュベートする。
【0293】
プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質溶液ＶＩＩ（Ｂｉｏｐａｎｄａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を加える。室温にてシェーカー（３００ｒｐｍ）上で１０分間反応させ、０．５Ｍの硫酸５０μｌを加えて終了させる。
【0294】
吸光度は、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、４５０ｎｍで測定する。
【0295】
使用抗原：
・ＲＳＰＯ－１（＃１２０－３８、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・ＲＳＰＯ－２（＃３２６６－ＲＳ、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＲＳＰＯ－３（＃１２０－４４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・タンパク質＃００７、＃００８、＃０１４、＃０５９（Ｉｃｏｓａｇｅｎ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙで製造された）
・第２の層に使用した分子：
・ＬＧＲ４－Ｈｉｓ（＃ＬＧ４－Ｈ５２Ｈ３、Ａｃｒｏ）
・ＬＧＲ４－Ｆｃ（＃７７５０－ＧＰ、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＺＮＲＦ３－Ｆｃ（＃７９９４－ＲＦ、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・第３の層（ＬＧＲ４－Ｈｉｓ結合用）に使用した抗体：
・マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体（１：２５００、０．２μｇ／ｍＬ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８６）
（Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路活性の測定のためのＴＯＰ－ＦＬＡＳＨ－ＡＳＳＳＡＹ）
Ｓｕｐｅｒ－ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈルシフェラーゼレポーターアッセイは、コンディショニング培地中のＷｎｔタンパク質およびＲ－スポンジンタンパク質の両方の濃度および活性をモニターするために用いることができる。まず、Ｓｕｐｅｒ－ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター発現ＨＥＫ ２９３ ＳＴＦ細胞を調製し、無血清ＤＭＥＭで９６ウェルプレートにプレーティングする（１～２×１０４細胞／ウェル）。２４時間後、血清無添加のレポーター細胞を、Ｗｎｔタンパク質またはＲ－スポンジンタンパク質のいずれかを含む異なる量の培養液に暴露する。誘導の１８～２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定し、調整培地中に存在する成長因子の量を既知のタンパク質源（組換え標準ｈＲＳＰＯ１）と比較する。この細胞ベースのレポーターアッセイは、ＷｎｔリガンドとＲ－スポンジンリガンドの両方の活性を試験することができる。
・ＲＳＰＯ－１（＃１２０－３８、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・ＲＳＰＯ－２（＃３２６６－ＲＳ、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＲＳＰＯ－３（＃１２０－４４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・タンパク質＃００７、＃００８、＃０１４、＃０５９（Ｉｃｏｓａｇｅｎ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙで製造された）
・第２の層に使用した分子：
・ＬＧＲ４－Ｈｉｓ（＃ＬＧ４－Ｈ５２Ｈ３、Ａｃｒｏ）
・ＬＧＲ４－Ｆｃ（＃７７５０－ＧＰ、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＺＮＲＦ３－Ｆｃ（＃７９９４－ＲＦ、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・第３の層（ＬＧＲ４－Ｈｉｓ結合用）に使用した抗体：
・マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ抗体（１：２５００、０．２μｇ／ｍＬ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ００１８６）
（Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路活性の測定のためのＴＯＰ－ＦＬＡＳＨ－ＡＳＳＳＡＹ）
Ｓｕｐｅｒ－ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈルシフェラーゼレポーターアッセイは、コンディショニング培地中のＷｎｔタンパク質およびＲ－スポンジンタンパク質の両方の濃度および活性をモニターするために用いることができる。まず、Ｓｕｐｅｒ－ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター発現ＨＥＫ ２９３ ＳＴＦ細胞を調製し、無血清ＤＭＥＭで９６ウェルプレートにプレーティングする（１～２×１０４細胞／ウェル）。２４時間後、血清無添加のレポーター細胞を、Ｗｎｔタンパク質またはＲ－スポンジンタンパク質のいずれかを含む異なる量の培養液に暴露する。誘導の１８～２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定し、調整培地中に存在する成長因子の量を既知のタンパク質源（組換え標準ｈＲＳＰＯ１）と比較する。この細胞ベースのレポーターアッセイは、ＷｎｔリガンドとＲ－スポンジンリガンドの両方の活性を試験することができる。
【0296】
必要な試薬および細胞株：
ａ． ＨＥＫ－２９３ ＳＴＦ細胞（ＡＴＣＣ）。
ｂ． Ｉｃｏｓａｇｅｎ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙで生産されたＲ－スポンジンタンパク質、およびＲＳＰＯ－１（＃１２０－３８、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＲＳＰＯ－２（＃３２６６－ＲＳ、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＲＳＰＯ－３（＃１２０－４４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ｄ． Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃Ｅ２５１０）
ｅ．完全な増殖培地：１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）細胞培養培地＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
ｆ．無血清増殖培地：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培養培地＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
ｇ．ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェルプレート：平底白色ポリスチレンウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
Ｓｕｐｅｒ－Ｔｏｐ－Ｆｌａｓｈルシフェラーゼレポーターアッセイ用のＨＥＫ－２９３ ＳＴＦ細胞の調製：
０日目：２ｍｌのトリプシン溶液を用いて、１０ｃｍ培養プレートの底からＨＥＫ－２９３－ＳＴＦ細胞を剥離し、５分後に２ｍｌの完全増殖培地を加える。２００ｇで５分間スピンダウンし、細胞ペレットを無血清ＤＭＥＭに懸濁する。細胞を数え、総容積が１００ｕｌの無血清培地のＨＥＫ－２９３－ＳＴＦレポーター細胞（２＊１０５細胞／ｍｌ）をＣＥＬＬＳＴＡＲ ９６ウェルプレートに播種する。加湿した細胞培養インキュベーターにて、細胞を３７℃で２２～２６時間培養する。
１日目：Ｒ－スポンジンタンパク質をＤＭＥＭ培地に希釈し、段階稀釈になるように、培養したＨＥＫ－２９３ ＳＴＦ細胞に適用する（今回は、３倍希釈を用いた）。３７℃で１８～２４時間、細胞を誘導物質と共に培養する。
２日目：５０μｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質を培養ウェルに直接に添加し、少なくとも５分間待機した後、Ｇｌｏｍａｘ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生物発光シグナル強度を測定することにより、ＳＴＦホタル活性を測定する。結果をＰＣにエクスポートして解析する。
ａ． ＨＥＫ－２９３ ＳＴＦ細胞（ＡＴＣＣ）。
ｂ． Ｉｃｏｓａｇｅｎ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙで生産されたＲ－スポンジンタンパク質、およびＲＳＰＯ－１（＃１２０－３８、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＲＳＰＯ－２（＃３２６６－ＲＳ、Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＲＳＰＯ－３（＃１２０－４４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
ｄ． Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃Ｅ２５１０）
ｅ．完全な増殖培地：１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）細胞培養培地＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
ｆ．無血清増殖培地：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培養培地＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
ｇ．ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェルプレート：平底白色ポリスチレンウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
Ｓｕｐｅｒ－Ｔｏｐ－Ｆｌａｓｈルシフェラーゼレポーターアッセイ用のＨＥＫ－２９３ ＳＴＦ細胞の調製：
０日目：２ｍｌのトリプシン溶液を用いて、１０ｃｍ培養プレートの底からＨＥＫ－２９３－ＳＴＦ細胞を剥離し、５分後に２ｍｌの完全増殖培地を加える。２００ｇで５分間スピンダウンし、細胞ペレットを無血清ＤＭＥＭに懸濁する。細胞を数え、総容積が１００ｕｌの無血清培地のＨＥＫ－２９３－ＳＴＦレポーター細胞（２＊１０５細胞／ｍｌ）をＣＥＬＬＳＴＡＲ ９６ウェルプレートに播種する。加湿した細胞培養インキュベーターにて、細胞を３７℃で２２～２６時間培養する。
１日目：Ｒ－スポンジンタンパク質をＤＭＥＭ培地に希釈し、段階稀釈になるように、培養したＨＥＫ－２９３ ＳＴＦ細胞に適用する（今回は、３倍希釈を用いた）。３７℃で１８～２４時間、細胞を誘導物質と共に培養する。
２日目：５０μｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質を培養ウェルに直接に添加し、少なくとも５分間待機した後、Ｇｌｏｍａｘ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生物発光シグナル強度を測定することにより、ＳＴＦホタル活性を測定する。結果をＰＣにエクスポートして解析する。
【0297】
（Ｍｉｎ６細胞増殖アッセイ）
マウスインスリノーマ（Ｍｉｎ６）細胞を、４．５ｇ／ｌのグルコース、１２．５％のＦＣＳ（子牛胎児血清）、０．００５％の炭酸水素ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭで培養し、加湿雰囲気（３７℃；９５％空気／５％ＣＯ２）にて維持する。低過剰（最大Ｐ３０）Ｍｉｎ６細胞を、８００００細胞／ｍｌの播種密度で１２ウェルプレートにプレーティングする。接着細胞を、低ＦＣＳ培地（５％）に異なる濃度で希釈した標的分子とともに２４時間インキュベートする。より長時間のインキュベーションには、２４時間ごとに新鮮なタンパク質を培地に加えた。細胞は最終的に剥離され、Ｔｈｏｍａ Ｃｈａｍｂｅｒを用いて手動で定量される。
マウスインスリノーマ（Ｍｉｎ６）細胞を、４．５ｇ／ｌのグルコース、１２．５％のＦＣＳ（子牛胎児血清）、０．００５％の炭酸水素ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭで培養し、加湿雰囲気（３７℃；９５％空気／５％ＣＯ２）にて維持する。低過剰（最大Ｐ３０）Ｍｉｎ６細胞を、８００００細胞／ｍｌの播種密度で１２ウェルプレートにプレーティングする。接着細胞を、低ＦＣＳ培地（５％）に異なる濃度で希釈した標的分子とともに２４時間インキュベートする。より長時間のインキュベーションには、２４時間ごとに新鮮なタンパク質を培地に加えた。細胞は最終的に剥離され、Ｔｈｏｍａ Ｃｈａｍｂｅｒを用いて手動で定量される。
【0298】
４００ｎＭでＲｓｐｏ１と比較して全体的に強い増殖誘導能を示す場合、または同程度の濃度のｈＲｓｐｏ１と比較して有意な増殖増加を可能にする濃度が低い場合、バリアントは天然ｈＲｓｐｏ１よりも有効であると考えられる。
【0299】
（Ｗｎｔ／βカテニンアッセイ）
Ｍｉｎ６細胞は、これより前の段落で述べたように培養する。低継代細胞を６ウェルプレートに２５００００細胞／ｍｌの播種密度でプレーティングする。接着した細胞を、低ＦＣＳ培地（５％）中で、異なる用量のｈＲｓｐｏ１アナログを用いて、複数のタイムポイントで処理する。その後、細胞を剥離し、ＰＢＳに再懸濁する。全タンパク質含量を超音波処理で単離し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡアッセイによってβ－カテニン濃度を評価する。ＢＣＡ含量は、各タンパク質サンプルの正規化に使用される。
Ｍｉｎ６細胞は、これより前の段落で述べたように培養する。低継代細胞を６ウェルプレートに２５００００細胞／ｍｌの播種密度でプレーティングする。接着した細胞を、低ＦＣＳ培地（５％）中で、異なる用量のｈＲｓｐｏ１アナログを用いて、複数のタイムポイントで処理する。その後、細胞を剥離し、ＰＢＳに再懸濁する。全タンパク質含量を超音波処理で単離し、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡアッセイによってβ－カテニン濃度を評価する。ＢＣＡ含量は、各タンパク質サンプルの正規化に使用される。
【0300】
（インビボ増殖アッセイ）
インビボ増殖試験は、２ヶ月齢の野生型１２９ＳＶマウスを用いて行う。最低３日間の馴化期間の後、数日間連続して、異なる濃度の目的のバリアントを毎日、動物の腹腔内または皮下に注射する。１５０μｌの滅菌ＰＢＳを毎日注射したマウスを対照とした。最後に、マウスは最後の注射の３０分後に頸椎脱臼により犠牲にされる。膵臓を採取し、Ａｎｔｉｇｅｎｆｉｘ（ｐＨ７．２～７．４のパラホルムアルデヒド溶液；Ｍｉｃｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ Ｆｒａｎｃｅ）で固定し、冷えたＰＢＳで洗浄し、０．８６％生理食塩水で１時間インキュベートする。エタノール希釈度を一連に大きくすることにより（５０％、７０％、８０％、９０％、および１００％）脱水した後、膵臓をイソプロパノールおよびトルエンで処理し、パラフィンに包埋する。パラフィンブロックを６μｍスライドに切り出し、インスリン、ＰＣ１／３、Ｋｉ６７、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて免疫蛍光によって分析する。
インビボ増殖試験は、２ヶ月齢の野生型１２９ＳＶマウスを用いて行う。最低３日間の馴化期間の後、数日間連続して、異なる濃度の目的のバリアントを毎日、動物の腹腔内または皮下に注射する。１５０μｌの滅菌ＰＢＳを毎日注射したマウスを対照とした。最後に、マウスは最後の注射の３０分後に頸椎脱臼により犠牲にされる。膵臓を採取し、Ａｎｔｉｇｅｎｆｉｘ（ｐＨ７．２～７．４のパラホルムアルデヒド溶液；Ｍｉｃｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ Ｆｒａｎｃｅ）で固定し、冷えたＰＢＳで洗浄し、０．８６％生理食塩水で１時間インキュベートする。エタノール希釈度を一連に大きくすることにより（５０％、７０％、８０％、９０％、および１００％）脱水した後、膵臓をイソプロパノールおよびトルエンで処理し、パラフィンに包埋する。パラフィンブロックを６μｍスライドに切り出し、インスリン、ＰＣ１／３、Ｋｉ６７、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて免疫蛍光によって分析する。
【0301】
バリアントは、より多くの増殖性β細胞、β細胞量のより大きな増加、より優れたグルコースハンドリングを誘導する場合、または作用の開始／必要とされる濃度が天然ｈＲｓｐｏ１よりも低い場合、オリジナルのｈＲｓｐｏ１よりも活性が高いとみなされる。
【0302】
明らかに、このようなアプローチは、特にストレプトゾトシン処置マウス、ＮＯＤ動物またはＲｉｐ－Ｂ７動物を含む、異なる糖尿病マウスモデルにおいても使用することができる（King, Br J Pharmacol. 2012 Jun; 166(3): 877-894およびKarges et al., Diabetes 2002 Nov; 51(11): 3237-3244）。
【0303】
〔結果〕
Ａ．組換えバリアントの生産
以下の表２に、以下のプロトコルに従って生産された組換えＲｓｐｏタンパク質のリストを示す。
Ａ．組換えバリアントの生産
以下の表２に、以下のプロトコルに従って生産された組換えＲｓｐｏタンパク質のリストを示す。
【0304】
【表2】
【0305】
上記の組換えタンパク質はすべて、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３ベースのＱＭＣＦ細胞株を含む、Ｉｃｏｓａｇｅｎが開発したＱＭＣＦ技術（ＵＳ７，７９０，４４６、ＵＳ８，３７７，６５３も参照されたい）を用いて発現させた。
【0306】
表２に記載されたタンパク質の大部分は、それらのＣ末端、ＢＲドメインの後ろに、精製を容易にするための短いリンカーおよびＣ－Ｈｉｓタグを含むが、以下は例外である：
・＃０１４（天然ｈＲｓｐｏ１）、
・＃４６、Ｃ末端が短いリンカーで官能化されており、アルブミンと高い親和性を持つ配列となっている、
・Ｆｃ共役タンパク質。
・＃０１４（天然ｈＲｓｐｏ１）、
・＃４６、Ｃ末端が短いリンカーで官能化されており、アルブミンと高い親和性を持つ配列となっている、
・Ｆｃ共役タンパク質。
【0307】
当業者であれば、精製のために代わりのリンカーおよび／またはタグを用いるか、あるいはそのようなリンカーおよびタグを用いずに、同様の組換えタンパク質を生産することができるであろう。
【0308】
Ｂ．ＴＯＰ Ｆｌａｓｈアッセイにおけるβ－カテニン経路刺激の決定
産生されたバリアントはすべて、β－カテニン経路を刺激する能力について試験され、天然ｈＲｓｐｏ１と比較された。
産生されたバリアントはすべて、β－カテニン経路を刺激する能力について試験され、天然ｈＲｓｐｏ１と比較された。
【0309】
以下の表３は、生産されたバリアントのいくつかの結果を示す：
【0310】
【表3】
【0311】
Ｃ．インビトロＭｉｎ６増殖アッセイを用いたＭｉｎ増殖活性の測定
各バリアントの増殖活性は、マウスインスリノーマ（Ｍｉｎ６）細胞株を用いてインビトロで評価した。組換えｈＲｓｐｏ１は、４００ｎＭをピークとする釣鐘型の用量反応曲線を示し、Ｍｉｎ６の増殖を刺激した（図２）。
各バリアントの増殖活性は、マウスインスリノーマ（Ｍｉｎ６）細胞株を用いてインビトロで評価した。組換えｈＲｓｐｏ１は、４００ｎＭをピークとする釣鐘型の用量反応曲線を示し、Ｍｉｎ６の増殖を刺激した（図２）。
【0312】
天然ｈＲｓｐｏ１と同様に、バリアント＃００９はＭｉｎ６細胞に対して釣鐘型の用量反応性分裂促進効果を示し、４００ｎＭでピークを示した（図３）。しかしながら、この用量では、Ｍｉｎ６の増殖率はオリジナルのｈＲｓｐｏ１と比較して有意に高かった（図３）。
【0313】
Ｍｉｎ６細胞の数は、試験したすべての濃度でバリアント＃００８とのインキュベーションにより有意に増加した（図４）。興味深いことに、この数は、ｈＲｓｐｏ１で処理したＭｉｎ６細胞と比較した場合、２００ｎＭおよび１μＭの用量でも有意に高かった（図４）。
【0314】
バリアント＃００５は、標準ｈＲｓｐｏ１と同じ釣鐘型の用量反応曲線を示し、４００ｎＭで増殖反応のピークを示した（図５）。それにもかかわらず、バリアント＃００５と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞は、天然ｈＲｓｐｏ１でインキュベートした細胞よりも数が有意に少なかった（図５）。
【0315】
興味深いことに、バリアント＃０３４は、試験したすべての濃度でＭｉｎ６細胞の増殖を有意に刺激したが、４００ｎＭの野生型ｈＲｓｐｏ１と比較して有意差はなかった（図６）。
【0316】
バリアント＃０４７の増殖用量反応曲線は、２００ｎＭで作用が見られ始め、１μＭでピークを示す釣鐘型であった（図７）。この後者の濃度において、Ｍｉｎ６細胞の有糸分裂率は、４００ｎＭでオリジナルのｈＲｓｐｏ１とインキュベートした細胞と比較して有意に増大することが見出された（図７）。
【0317】
重要なことに、バリアント＃０５１を用いてＭｉｎ６細胞を刺激すると、バリアント＃０４７で処理したときに観察されたものと同様の形状の用量反応曲線が生じた（図８）。しかしながら、バリアント＃０５１は、４００ｎＭの天然ｈＲｓｐｏ１と比較して、より早く（１００ｎＭ）において作用が見られ始め、４００ｎＭおよび１μＭの両方で有意に強い増殖を誘導した（図８）。
【0318】
興味深いことに、Ｆｃ結合ｈＲｓｐｏ１バリアント（＃０６３）は、４００ｎＭの濃度でインキュベートした場合、オリジナルタンパク質と同程度の効率を示すことがわかった（図９）。しかしながら、この増殖効果は釣鐘型の用量反応曲線には従わず、むしろ高用量において安定を保持した（図９）。
【0319】
逆に、Ｎ末端Ｆｃ結合バリアント＃０６４は、４００ｎＭではＭｉｎ６細胞に対して有意な増殖効果を示さず、このタンパク質は１μＭ以上で希釈した場合にのみ有効になった（図１０）。
【0320】
タグＨｉｓを含むバリアント＃０４９およびバリアント＃０５６の有糸分裂効果は、同じ釣鐘型の用量反応曲線を生じさせ、天然組換えｈＲｓｐｏ１と同じ有効性を示した（図１１～１２）。
【0321】
タグ付けされていないバリアント＃０４９の有効性は、Ｍｉｎ６細胞でも試験された。Ｍｉｎ６細胞数は、４００ｎＭのバリアント＃０４９と２４時間インキュベートした後に有意に増加した（図１３）。重要なことに、この増加は、同じタンパク質を４８時間または７２時間インキュベートした場合により強く、より顕著であることが示された（図１４および１５）。
【0322】
同様に、バリアント＃０５４は、４００ｎＭの用量まで次第に有効的になることが観察され、この効率は濃度が高くなるにつれて徐々に低下した（図１６）。しかしながら、このアナログは、その用量反応曲線のピークにおいて、Ｍｉｎ６の増殖を刺激することにおいて、オリジナルのｈＲｓｐｏ１よりも有意に強力であることが見出された（図１６）。
【0323】
意外なことに、バリアント＃０８２は、試験したすべての濃度でＭｉｎ６細胞の増殖を強く刺激し、低用量でもｈＲｓｐｏ１より有意に強力な有糸分裂活性を示した（図１７）。
【0324】
バリアント＃１１６は、４００ｎＭに活性のピークを持つ釣鐘型になるようにＭｉｎ６細胞数を増加させる（図１８）。
【0325】
天然ヒトＲｓｐｏ３は、インビボでβ細胞増殖を誘導する能力についても試験された。そして、野生型マウスをヒトＲｓｐｏ３に短期間（５～３０分）曝露すると、インビボでβ細胞増殖も誘導されることが追加分析で示された。
【0326】
Ｄ．ＺＮＲＦ３結合の決定
我々は、バリアント＃００９、バリアント＃０４７およびバリアント＃０５１を作製し、上述のＺＮＲＦ３－Ｆｃレセプター結合アッセイを用いて、オリジナルの天然Ｒｓｐｏ１と比較してＺＮＲＦ３への結合を改善する能力について試験した。
我々は、バリアント＃００９、バリアント＃０４７およびバリアント＃０５１を作製し、上述のＺＮＲＦ３－Ｆｃレセプター結合アッセイを用いて、オリジナルの天然Ｒｓｐｏ１と比較してＺＮＲＦ３への結合を改善する能力について試験した。
【0327】
バリアント＃００９は対照のＲｓｐｏ１（変異なし）と同様の挙動を示すが、バリアント＃０４７およびバリアント＃０５１は対照のＲｓｐｏ１と比較してＺＮＲＦ３に対して優れた結合親和性を示す。
【0328】
２．単離膵島におけるβ細胞増殖
２．１ 方法
２．１．１ 動物
雄の１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（６９２１０ Ｓａｉｎｔ－Ｇｅｒｍａｉｎ Ｎｕｅｌｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手し：１０～１２週齢のマウスを６０匹使用した。すべての動物実験は、欧州動物飼育ガイドライン（２０１０／６３／ＵＥ）に従い、公認プロジェクトＮ２７９６の一環として実施された。動物は実験開始の１週間前から環境に順応させ、温度管理（２２±２℃）された場所で、１２時間の明暗サイクル（午前７時に点灯）で飼育した。すべてのマウスに、ＳＡＦＥ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－Ｒｏｕｔｅ ｄｅ Ｓａｉｎｔ Ｂｒｉｓ－８９２９０ＡＵＧＹ－Ｆｒａｎｃｅ）の通常の成長食Ａ０４を食べさせ、自由に飲ませた。敷料（滅菌おがくず）は１日おきに交換した。マウスは１ケージ６匹の群に分けた。ケージの大きさは４２．５×２６．６×１５．５ｃｍであった。全身徴候を観察し、異常徴候のない動物のみを研究に組み入れた。
２．１ 方法
２．１．１ 動物
雄の１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（６９２１０ Ｓａｉｎｔ－Ｇｅｒｍａｉｎ Ｎｕｅｌｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手し：１０～１２週齢のマウスを６０匹使用した。すべての動物実験は、欧州動物飼育ガイドライン（２０１０／６３／ＵＥ）に従い、公認プロジェクトＮ２７９６の一環として実施された。動物は実験開始の１週間前から環境に順応させ、温度管理（２２±２℃）された場所で、１２時間の明暗サイクル（午前７時に点灯）で飼育した。すべてのマウスに、ＳＡＦＥ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－Ｒｏｕｔｅ ｄｅ Ｓａｉｎｔ Ｂｒｉｓ－８９２９０ＡＵＧＹ－Ｆｒａｎｃｅ）の通常の成長食Ａ０４を食べさせ、自由に飲ませた。敷料（滅菌おがくず）は１日おきに交換した。マウスは１ケージ６匹の群に分けた。ケージの大きさは４２．５×２６．６×１５．５ｃｍであった。全身徴候を観察し、異常徴候のない動物のみを研究に組み入れた。
【0329】
マウスをペントバルビタールの腹腔内注射で麻酔し、膵島をさらに単離するために膵臓をコラゲナーゼで灌流した。ＲＰＭＩ１６４０にて一晩安定化させた後、膵島を分離し、化合物および参考物質で７２時間処理し、さらに細胞増殖評価に進めた。
【0330】
２．１．２ 膵島の分離と処理
１２９／Ｓｖマウスの膵島は、膵臓のコラゲナーゼ消化によって単離し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７およびＨＢＳＳを用いて密度勾配で精製した。膵島を３０個の密度でペトリ皿にハンドピックして分注し、１０ｍＭのへぺス、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、およびＳＶＦ １０％を添加したＲＰＭＩ１６４０に入れ、３７℃で９０％空気／５％ＣＯ２の加湿雰囲気で培養した。一晩安定化させた後、培地を除去し、試験化合物または参考物質のいずれも含まない新鮮な培地（対照）、または試験化合物または参考物質を含む新鮮な培地を添加した。２４時間後および４８時間後に培地および処理を更新した。処理の最後２４時間では、ＢｒｄＵ（１０μＭ）を培地に添加した。
１２９／Ｓｖマウスの膵島は、膵臓のコラゲナーゼ消化によって単離し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７およびＨＢＳＳを用いて密度勾配で精製した。膵島を３０個の密度でペトリ皿にハンドピックして分注し、１０ｍＭのへぺス、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、およびＳＶＦ １０％を添加したＲＰＭＩ１６４０に入れ、３７℃で９０％空気／５％ＣＯ２の加湿雰囲気で培養した。一晩安定化させた後、培地を除去し、試験化合物または参考物質のいずれも含まない新鮮な培地（対照）、または試験化合物または参考物質を含む新鮮な培地を添加した。２４時間後および４８時間後に培地および処理を更新した。処理の最後２４時間では、ＢｒｄＵ（１０μＭ）を培地に添加した。
【0331】
以下の表４に記載するように、膵島を８群に分け、各群につきペトリ皿の数を６とした：
【0332】
【表4】
【0333】
２．１．３ 増殖測定のための分離された膵島の調製
処理の７２時間後、各条件で３０個の膵島をペトリ皿から集め、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。次いで、膵島をＤＰＢＳで３回遠心洗浄した（１０００ｒｐｍ、３０秒、４℃）後、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ ０．２５％で消化させた。ＲＰＭＩ１６４０を加えて反応を停止させ、消化された膵島をサイトスライド上で細胞分注した。
処理の７２時間後、各条件で３０個の膵島をペトリ皿から集め、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。次いで、膵島をＤＰＢＳで３回遠心洗浄した（１０００ｒｐｍ、３０秒、４℃）後、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ ０．２５％で消化させた。ＲＰＭＩ１６４０を加えて反応を停止させ、消化された膵島をサイトスライド上で細胞分注した。
【0334】
その後、膵島をパラホルムアルデヒド３．７％で３０分間固定し、ＢＳＡ５％中０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００で透過処理し、ｐＨ６のクエン酸緩衝液を用いて１００℃で２０分間抗原検索を行った。抗体の非特異的結合を防ぐため、免疫染色の前にＰＢＳ－５％ＢＳＡでブロッキング工程を実施した。
【0335】
２．１．４ β細胞増殖の決定
細胞増殖は、ヤギ抗ラットＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、整理番号：Ａ－２１２４７）とカップリングされたラット抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｒｅｆ．ａｂ６３２６）、およびヤギ抗マウスＩｇＧ ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８抗体（Ｄｉａｇｏｍｉｘ－整理番号：ＧｔｘＭｕ－００３－Ｄ４８８ＮＨＳＸ）とカップリングされたマウス抗インスリン抗体（Ｓｉｇｍａ、整理番号：Ｉ２０１８）を用いた二重免疫染色の後のセクションにおける、ＢｒｄＵ陽性細胞の測定によって推定された。細胞核は、ＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－整理番号：Ｐ３６９３５）を用いて染色した。ＢｒｄＵ免疫染色で染色された細胞の数は、スライドをスキャンし、ＮＤＰ ｖｉｅｗまたはｃａｓｅ ｖｉｅｗｅｒイメージングソフトウェアを用いてスライドスキャンおよび解析した後に決定した。解析は１バッチあたり５～６サンプルについて行った。
細胞増殖は、ヤギ抗ラットＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、整理番号：Ａ－２１２４７）とカップリングされたラット抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｒｅｆ．ａｂ６３２６）、およびヤギ抗マウスＩｇＧ ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８抗体（Ｄｉａｇｏｍｉｘ－整理番号：ＧｔｘＭｕ－００３－Ｄ４８８ＮＨＳＸ）とカップリングされたマウス抗インスリン抗体（Ｓｉｇｍａ、整理番号：Ｉ２０１８）を用いた二重免疫染色の後のセクションにおける、ＢｒｄＵ陽性細胞の測定によって推定された。細胞核は、ＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－整理番号：Ｐ３６９３５）を用いて染色した。ＢｒｄＵ免疫染色で染色された細胞の数は、スライドをスキャンし、ＮＤＰ ｖｉｅｗまたはｃａｓｅ ｖｉｅｗｅｒイメージングソフトウェアを用いてスライドスキャンおよび解析した後に決定した。解析は１バッチあたり５～６サンプルについて行った。
【0336】
２．２ 結果
この研究は、６つのバリアント（＃００８、＃０１４、＃０４９、＃０５１、＃０６４および＃１２１）への７２時間暴露が、１２９／Ｓｖマウスのランゲルハンス島におけるβ細胞増殖に及ぼす影響を評価することを目的としている。＃００８、＃０１４、＃０５１、＃０６４タンパク質は、３種類の濃度（０．２μＭ、１μＭおよび３μＭ）で試験し、＃０４９および＃１２１は５種類の濃度（０．１μＭ、０．２μＭ、０．４μＭ、１μＭ、ならびに２μＭ（＃０４９）もしくは３μＭ（＃１２１））で試験した。細胞増殖は、ＢｒｄＵ陽性細胞数を細胞総数で割って算出し、％で表した（図１９）。結果は平均値±ＳＥＭで表した。観察数は各処理につき５～６であった。複合効果を解析するために、分散が有意に異なる場合は、Ａｎｏｖａに続いてＤｕｎｎｅｔｔの検定、またはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓに続いてＤｕｎｎの検定を用いて統計解析を行った（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（登録商標）８）。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
この研究は、６つのバリアント（＃００８、＃０１４、＃０４９、＃０５１、＃０６４および＃１２１）への７２時間暴露が、１２９／Ｓｖマウスのランゲルハンス島におけるβ細胞増殖に及ぼす影響を評価することを目的としている。＃００８、＃０１４、＃０５１、＃０６４タンパク質は、３種類の濃度（０．２μＭ、１μＭおよび３μＭ）で試験し、＃０４９および＃１２１は５種類の濃度（０．１μＭ、０．２μＭ、０．４μＭ、１μＭ、ならびに２μＭ（＃０４９）もしくは３μＭ（＃１２１））で試験した。細胞増殖は、ＢｒｄＵ陽性細胞数を細胞総数で割って算出し、％で表した（図１９）。結果は平均値±ＳＥＭで表した。観察数は各処理につき５～６であった。複合効果を解析するために、分散が有意に異なる場合は、Ａｎｏｖａに続いてＤｕｎｎｅｔｔの検定、またはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓに続いてＤｕｎｎの検定を用いて統計解析を行った（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（登録商標）８）。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【0337】
３． 雌のＮＯＤマウスにおける血糖値の推移とβ細胞量
３．１ 方法
３．１．１ 動物
雌のＮＯＤ／Ｍｒｋ Ｔａｃマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（４６２３ Ｅｊｂｙ、Ｌｉｌｌｅ Ｓｋｅｎｓｖｅｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から提供され：５５匹のマウスは、ＣＮＲＳ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｐａｒｉｓ－ＵＭＲ ７５９２動物施設に移送された時点で６～８週齢であった。動物実験はすべて、欧州動物管理ガイドライン（２０１０／６３／ＵＥ）に従い、公認プロジェクト＃２０１７３および＃３１８７６の一部として実施された。動物は、実験の１週間前から環境に順応させ、温度管理（２２±２℃）された場所で、１２時間の明暗サイクル（午前７時に点灯）で飼育した。すべてのマウスに、ＡＬＴＲＯＭＩＮ（Aｌｔｒｏｍｉｎ Ｓｐｅｚｉａｌｆｕｔｔｅｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ－ Ｉｍ Ｓｅｅｌｅｎｋａｍｐ ２０－ Ｄ－３２７９１ Ｌａｇｅ － Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮＩＨ－３１Ｍ飼料を食べさせ、飲み物は自由に飲ませた。敷料（滅菌おがくず）は１日おきに交換した。マウスは１ケージにつき５匹の群に分けた。ケージの大きさは３７．３×２３．４×１４．０ｃｍであった。全身徴候を観察し、異常徴候のない動物のみを研究に組み入れた。
３．１ 方法
３．１．１ 動物
雌のＮＯＤ／Ｍｒｋ Ｔａｃマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（４６２３ Ｅｊｂｙ、Ｌｉｌｌｅ Ｓｋｅｎｓｖｅｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から提供され：５５匹のマウスは、ＣＮＲＳ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｐａｒｉｓ－ＵＭＲ ７５９２動物施設に移送された時点で６～８週齢であった。動物実験はすべて、欧州動物管理ガイドライン（２０１０／６３／ＵＥ）に従い、公認プロジェクト＃２０１７３および＃３１８７６の一部として実施された。動物は、実験の１週間前から環境に順応させ、温度管理（２２±２℃）された場所で、１２時間の明暗サイクル（午前７時に点灯）で飼育した。すべてのマウスに、ＡＬＴＲＯＭＩＮ（Aｌｔｒｏｍｉｎ Ｓｐｅｚｉａｌｆｕｔｔｅｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ－ Ｉｍ Ｓｅｅｌｅｎｋａｍｐ ２０－ Ｄ－３２７９１ Ｌａｇｅ － Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮＩＨ－３１Ｍ飼料を食べさせ、飲み物は自由に飲ませた。敷料（滅菌おがくず）は１日おきに交換した。マウスは１ケージにつき５匹の群に分けた。ケージの大きさは３７．３×２３．４×１４．０ｃｍであった。全身徴候を観察し、異常徴候のない動物のみを研究に組み入れた。
【0338】
３．１．２ 研究デザイン
試験の１６週間の間、タンパク質は、以下の表５に記載されているように、バリアント＃０１４では１日１回、バリアント＃０６４では週１回、朝に、スポンサーから提供された用量、１０ｍｌ／ｋｇの投与量で、腹腔内経路によりマウスに投与された：
試験の１６週間の間、タンパク質は、以下の表５に記載されているように、バリアント＃０１４では１日１回、バリアント＃０６４では週１回、朝に、スポンサーから提供された用量、１０ｍｌ／ｋｇの投与量で、腹腔内経路によりマウスに投与された：
【0339】
【表5】
【0340】
薬液は、以下のように調製した：
－ ＃０６４：ｐＨ７．４のＰＢＳ１Ｘ中１ｍｇ／ｍｌのタンパク質の適切な量を、ｐＨ７．４のＰＢＳ１Ｘで希釈し、２４０μｇ／ｍｌ溶液（２４００μｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）を得た。
－ ＃０６４：ｐＨ７．４のＰＢＳ１Ｘ中１ｍｇ／ｍｌのタンパク質の適切な量を、ｐＨ７．４のＰＢＳ１Ｘで希釈し、２４０μｇ／ｍｌ溶液（２４００μｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）を得た。
【0341】
－ ＃０１４：ｐＨ７．４のＰＢＳ１Ｘ中１ｍｇ／ｍｌのタンパク質の適切な量を、ｐＨ７．４のＰＢＳ１Ｘで希釈し、８０μｇ／ｍｌ溶液（８００μｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）を得た。
【0342】
この溶液をさらに、ｐＨ７．４のＰＢＳ１Ｘで１：２に希釈し、４０μｇ／ｍｌ溶液（４００μｇ／ｋｇ／１０ｍｌ）を得た。調製する量は、注射する動物の数に合わせて調整した。
【0343】
１週目から１８週目までの間、すべての動物にビヒクルまたは化合物を腹腔内経路で１日１回朝に投与した（＃６４は週１回）。血糖値は、尾静脈で採血後、アキュチェックリーダー（Accu-Check reader）を用いて第１６週まで週１回モニターした。
【0344】
１０週齢の雌のＮＯＤマウスに、０．２ｍｇ／Ｋｇ、０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇの濃度のタグ付けされていないバリアント＃０４９を、１３週間毎日腹腔内注射した。マウスの血糖値および体重を毎週モニターした。血中グルコースレベルが２５０ｍｇ／ｄｌを超えたマウスを糖尿病とみなした。
【0345】
分析手法
グルコース濃度は、Ｈｏｒｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌの市販キット（整理番号：Ａ１１Ａ０１６６７）を用いて決定する。手順は二相酵素反応に基づいている：
グルコース濃度は、Ｈｏｒｉｂａ Ｍｅｄｉｃａｌの市販キット（整理番号：Ａ１１Ａ０１６６７）を用いて決定する。手順は二相酵素反応に基づいている：
【0346】
【数1】
【0347】
反応は、第二相で生成されるＮＡＤＨによって生じる吸収を測定することにより、速度論的にモニターされる。測定された吸光度の変化からサンプルのグルコース含量を算出することができる。
【0348】
インスリン濃度は、Ａｌｐｃｏから市販されているキット（整理番号：８０－ＩＮＳＭＳＵ－Ｅ０１／Ｅ１０）を用いて決定する。ＡＬＰＣＯ Ｍｏｕｓｅ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡは、サンドイッチタイプの免疫アッセイである。９６ウェルマイクロプレートは、インスリンに特異的なモノクローナル抗体でコートされている。標準品、対照、および試料は、結合体と共にマイクロプレートウェルに添加される。マイクロプレートは、７００～９００ｒｐｍにてマイクロプレートシェーカーでインキュベートされる。最初のインキュベーションが完了した後に、ウェルを洗浄バッファーで洗浄し、ブロットして乾燥させる。ＴＭＢ基質を添加し、７００～９００ｒｐｍにてマイクロプレートシェーカーで２回目のインキュベーションを行う。２回目のインキュベーションが完了した後に、停止溶液（Stop Solution）を加え、分光光度計で４５０ｎｍにて光学密度（ＯＤ）を測定する。発色した色の濃さは、試料中のインスリン量に直接、正比例する。測定範囲は、０．０２５～６．９ｎｇ／ｍＬである。
【0349】
３．２ 結果
本研究は、＃０１４タンパク質を２種類の用量（４００および８００μｇ／ｋｇ）、および＃６４タンパク質を１種類の用量（２４００μｇ／ｋｇ）の腹腔内経路での１８週間の処置が、雌のＮＯＤマウス（４群：ビヒクル（ｎ＝１５）、２種類の濃度での＃０１４タンパク質（ｎ＝１３）、１種類の濃度での＃６４タンパク質（ｎ＝１４）で、１０週齢から１８週間、化合物を投与されている）の血糖値の推移、糖尿病表現型およびβ細胞量に及ぼす影響を評価することを目的としている。
本研究は、＃０１４タンパク質を２種類の用量（４００および８００μｇ／ｋｇ）、および＃６４タンパク質を１種類の用量（２４００μｇ／ｋｇ）の腹腔内経路での１８週間の処置が、雌のＮＯＤマウス（４群：ビヒクル（ｎ＝１５）、２種類の濃度での＃０１４タンパク質（ｎ＝１３）、１種類の濃度での＃６４タンパク質（ｎ＝１４）で、１０週齢から１８週間、化合物を投与されている）の血糖値の推移、糖尿病表現型およびβ細胞量に及ぼす影響を評価することを目的としている。
【0350】
図２０の結果は、個々の観察数（ｎ）とともに平均±ＳＥＭで表した。統計解析は、処置群をＳＴＺ対照群と比較するために、Ａｎｏｖａに続いてＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定を用いて行った。Ｂａｒｔｌｅｔｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（登録商標８）により算出された群間の分散が有意に異なる場合は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定に続いてＤｕｎｎ検定を使用した。ｐ値０．０５を有意とみなした。
【0351】
糖尿病の状態において、β細胞喪失に対抗するバリアント＃０４９の能力を評価するために、本発明者らは１型糖尿病モデルとしてＮＯＤマウスを使用した。興味深いことに、バリアント＃０４９の毎日の腹腔内投与は、糖尿病発症を用量依存的に減少させた（図２１）。重要なことに、０．８ｍｇ／Ｋｇの濃度でバリアント＃０４９で処置されたげっ歯類は、対照と比較して基礎血糖について無視できる増加を示したことである（図２２）。
【0352】
４．インビボ試験
４．１ 方法
４．１．１ インビボ中期増殖アッセイ
インビボ増殖試験は、２ヶ月齢の野生型の雄の１２９ＳＶマウスを用いて行う。最低３日間の馴化期間の後、動物に０．４ｍｇ／Ｋｇの＃０１４および０．８ｍｇ／ｋｇの＃０１４を５日間連続で毎日腹腔内注射する。１５０ｕｌの滅菌ＰＢＳを毎日注射したマウスを対照として用いた。さらに、チミジンアナログであるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で飲料水に希釈し、すべてのマウスに犠牲になる７２時間前から与えた。最後に、マウスは最後の注射の３０分後に頸椎脱臼により犠牲にされる。膵臓を採取し、Ａｎｔｉｇｅｎｆｉｘ（ｐＨ７．２～７．４のパラホルムアルデヒド溶液；Ｍｉｃｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ Ｆｒａｎｃｅ）で固定し、冷えたＰＢＳで洗浄し、０．８６％生理食塩水で１時間インキュベートする。エタノール希釈度を一連に大きくすることにより（５０％、７０％、８０％、９０％、および１００％）脱水させた後、膵臓をイソプロパノールおよびトルエンで処理して、パラフィンに包埋する。パラフィンブロックを６μｍのスライドに切り出し、インスリン、Ｋｉ６７、およびＢｒｄＵに対する抗体を用いて免疫蛍光法で分析する。
４．１ 方法
４．１．１ インビボ中期増殖アッセイ
インビボ増殖試験は、２ヶ月齢の野生型の雄の１２９ＳＶマウスを用いて行う。最低３日間の馴化期間の後、動物に０．４ｍｇ／Ｋｇの＃０１４および０．８ｍｇ／ｋｇの＃０１４を５日間連続で毎日腹腔内注射する。１５０ｕｌの滅菌ＰＢＳを毎日注射したマウスを対照として用いた。さらに、チミジンアナログであるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で飲料水に希釈し、すべてのマウスに犠牲になる７２時間前から与えた。最後に、マウスは最後の注射の３０分後に頸椎脱臼により犠牲にされる。膵臓を採取し、Ａｎｔｉｇｅｎｆｉｘ（ｐＨ７．２～７．４のパラホルムアルデヒド溶液；Ｍｉｃｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ Ｆｒａｎｃｅ）で固定し、冷えたＰＢＳで洗浄し、０．８６％生理食塩水で１時間インキュベートする。エタノール希釈度を一連に大きくすることにより（５０％、７０％、８０％、９０％、および１００％）脱水させた後、膵臓をイソプロパノールおよびトルエンで処理して、パラフィンに包埋する。パラフィンブロックを６μｍのスライドに切り出し、インスリン、Ｋｉ６７、およびＢｒｄＵに対する抗体を用いて免疫蛍光法で分析する。
【0353】
４．４．２ ストレプトゾトシン誘発マウスの高血糖モデルに対するインビトロ有効性試験
これらの試験は、成体２ヶ月齢の野生型の雄の１２９ＳＶマウスに対して実施される。高血糖を誘導するために、１２９ＳＶ雄マウスに、ＤＮＡおよび染色体損傷による細胞毒性作用を示すグルコサミン－ニトロソウレア化合物であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を腹腔内注射する。簡単に説明すると、ＳＴＺを０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、５時間の飢餓状態の後、５０ｍｇ／Ｋｇの用量で３日間連続投与した。高血糖の発現は、ＯＮＥＴＯＵＣＨグルコメーター（Ｌｉｆｅ Ｓｃａｎ， Ｉｎｃ．ＣＡ）を用いて血中グルコースレベルをモニタリングすることによって評価した。飲水量は週１回手動で測定した。耐糖能の評価のためには、腹腔内グルコース負荷試験（ｉｐ－ＧＴＴ）を行った。これらの試験では、マウスを５時間絶食させ、Ｄ－（＋）－グルコースを２ｇ／ｋｇ体重で腹腔内注射した。血中グルコースレベルは、ＯＮＥＴＯＵＣＨグルコメーターを用いて注射後の指示されたタイムポイントで測定した。ＰＢＳまたはバリアント＃０１４（配列番号４１）を、ＳＴＺ処置の１５日前またはＳＴＺ処置の７日後のいずれかから、０．８ｍｇ／Ｋｇの用量で腹腔内注射により毎日投与した。
これらの試験は、成体２ヶ月齢の野生型の雄の１２９ＳＶマウスに対して実施される。高血糖を誘導するために、１２９ＳＶ雄マウスに、ＤＮＡおよび染色体損傷による細胞毒性作用を示すグルコサミン－ニトロソウレア化合物であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を腹腔内注射する。簡単に説明すると、ＳＴＺを０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、５時間の飢餓状態の後、５０ｍｇ／Ｋｇの用量で３日間連続投与した。高血糖の発現は、ＯＮＥＴＯＵＣＨグルコメーター（Ｌｉｆｅ Ｓｃａｎ， Ｉｎｃ．ＣＡ）を用いて血中グルコースレベルをモニタリングすることによって評価した。飲水量は週１回手動で測定した。耐糖能の評価のためには、腹腔内グルコース負荷試験（ｉｐ－ＧＴＴ）を行った。これらの試験では、マウスを５時間絶食させ、Ｄ－（＋）－グルコースを２ｇ／ｋｇ体重で腹腔内注射した。血中グルコースレベルは、ＯＮＥＴＯＵＣＨグルコメーターを用いて注射後の指示されたタイムポイントで測定した。ＰＢＳまたはバリアント＃０１４（配列番号４１）を、ＳＴＺ処置の１５日前またはＳＴＺ処置の７日後のいずれかから、０．８ｍｇ／Ｋｇの用量で腹腔内注射により毎日投与した。
【0354】
４．４．３ 移植ヒト膵島に対するインビボ有効性試験
この実験のために、１２匹のＲａｇ２Ｎ１２免疫不全マウスにヒト膵島を移植した（５００膵島相当／マウス）。ガス麻酔（イソフルラン）後、腰椎開腹手術を行い、左腎臓にアクセスした。膵島ペレット（５００膵島相当）をカテーテルを通して各動物の腎臓の被膜下腔に注入した。移植後、出血および細胞漏出を避けるために被膜を焼灼した。筋層および皮膚層の両方を縫合した。周術期の痛みを和らげるためにモルヒネ（ブプレノルフィン－０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。各マウスはＳＯＰＦ動物施設の無菌ケージで飼育した。２週間の回復後、マウスを、ＰＢＳ、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇの用量のバリアント＃１４で６０日間毎日処置した。２週間ごとに、６時間の飢餓後の血中ｃ－ペプチド濃度を測定した。２８日間のバリアント＃０１４投与後、グルコースハンドリングをｉｐ－ＧＴＴで評価した。最後に、ＢｒｄＵを１ｍｇ／ｍｌの濃度で飲料水に希釈し、動物に犠牲になる１週間前から与えた。実験終了時に、マウスを犠牲にし、膵島移植片を単離し、固定し、インスリンおよびＢｒｄＵに対する抗体を用いて免疫蛍光法で分析した。
この実験のために、１２匹のＲａｇ２Ｎ１２免疫不全マウスにヒト膵島を移植した（５００膵島相当／マウス）。ガス麻酔（イソフルラン）後、腰椎開腹手術を行い、左腎臓にアクセスした。膵島ペレット（５００膵島相当）をカテーテルを通して各動物の腎臓の被膜下腔に注入した。移植後、出血および細胞漏出を避けるために被膜を焼灼した。筋層および皮膚層の両方を縫合した。周術期の痛みを和らげるためにモルヒネ（ブプレノルフィン－０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。各マウスはＳＯＰＦ動物施設の無菌ケージで飼育した。２週間の回復後、マウスを、ＰＢＳ、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇの用量のバリアント＃１４で６０日間毎日処置した。２週間ごとに、６時間の飢餓後の血中ｃ－ペプチド濃度を測定した。２８日間のバリアント＃０１４投与後、グルコースハンドリングをｉｐ－ＧＴＴで評価した。最後に、ＢｒｄＵを１ｍｇ／ｍｌの濃度で飲料水に希釈し、動物に犠牲になる１週間前から与えた。実験終了時に、マウスを犠牲にし、膵島移植片を単離し、固定し、インスリンおよびＢｒｄＵに対する抗体を用いて免疫蛍光法で分析した。
【0355】
４．２ 結果
４．２．１ インビボｈＲｓｐｏ１増殖活性の評価
成体マウスβ細胞新生を誘導するｈＲｓｐｏ１の能力を評価するために、本発明者らはバリアント＃０１４を５日間連続して腹腔内投与した。重要なことに、インスリンと内因性の核増殖マーカーＫｉ６７とを共発現する細胞の増加が、試験したすべての用量でバリアント＃０１４で処置したマウスの膵臓サンプルで観察された（図２３）。特に、０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４で処置した動物から単離した組織では、６倍の有意な増加が評価された。従って、バリアント＃０１４の投与は、膵臓β細胞内のＢｒｄＵ蓄積を増強することが示された（図２４）。さらにまた、ＢｒｄＵ／インスリン共発現細胞は、０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４を注射したマウスの膵臓切片において有意に豊富であった。
４．２．１ インビボｈＲｓｐｏ１増殖活性の評価
成体マウスβ細胞新生を誘導するｈＲｓｐｏ１の能力を評価するために、本発明者らはバリアント＃０１４を５日間連続して腹腔内投与した。重要なことに、インスリンと内因性の核増殖マーカーＫｉ６７とを共発現する細胞の増加が、試験したすべての用量でバリアント＃０１４で処置したマウスの膵臓サンプルで観察された（図２３）。特に、０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４で処置した動物から単離した組織では、６倍の有意な増加が評価された。従って、バリアント＃０１４の投与は、膵臓β細胞内のＢｒｄＵ蓄積を増強することが示された（図２４）。さらにまた、ＢｒｄＵ／インスリン共発現細胞は、０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４を注射したマウスの膵臓切片において有意に豊富であった。
【0356】
４．２．２ ＳＴＺ誘導高血糖マウスモデルにおける血糖コントロールに対するバリアント＃０１４の影響
本研究は、複数の低用量ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により誘導された高血糖マウスモデルにおいて、＃０１４タンパク質（０．８ｍｇ／ｋｇ）を用いた慢性処置が血糖コントロールに及ぼす影響を評価することを目的とした。高血糖は、ＳＴＺ（５０ｍｇ／Ｋｇ）を３日間連続にわたって３回投与して誘導した。ＳＴＺ処置の１５日前またはＳＴＺ処置の７日後のいずれかより、バリアント＃０１４またはビヒクルを腹腔内注射によって毎日投与した。
本研究は、複数の低用量ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により誘導された高血糖マウスモデルにおいて、＃０１４タンパク質（０．８ｍｇ／ｋｇ）を用いた慢性処置が血糖コントロールに及ぼす影響を評価することを目的とした。高血糖は、ＳＴＺ（５０ｍｇ／Ｋｇ）を３日間連続にわたって３回投与して誘導した。ＳＴＺ処置の１５日前またはＳＴＺ処置の７日後のいずれかより、バリアント＃０１４またはビヒクルを腹腔内注射によって毎日投与した。
【0357】
両方の実験環境において、ＳＴＺはすべての動物において高血糖を有効的に誘導した。しかしながら、バリアント＃０１４を注射したマウスの血中グルコースレベルは、２ヶ月の実験期間全体を通して、ビヒクルを注射した対照と比較して、着実に低いままであった（図２５および２８）。重要なことに、この差は、ＳＴＺを介した高血糖の発症前に、バリアント＃０１４を接種した場合に、より顕著かつ有意であった。従って、２４時間の水摂取量は、バリアント＃０１４で処置したマウスで一貫して減少し、ｈＲｓｐｏ１の慢性投与が高血糖に伴う多飲症を緩和することが示された（図２６および２９）。
【0358】
２ヶ月間の血糖モニタリングの後、ｉｐ－ＧＴＴにより、＃１４タンパク質でＩＰ処置したマウスでは、両方の実験において、対照と比較して耐糖能が有意に改善されたことが明らかになった（図２７および３０）。これらのデータは、バリアント＃０１４が慢性高血糖マウスモデルにおいて血糖コントロールを改善できることを示している。
【0359】
４．２．３ 移植されたヒト膵島に対するバリアント＃０１４の影響
ヒトβ細胞に対するバリアント＃０１４の増殖活性を試験するために、腎臓被膜下にヒト膵島を移植した免疫不全マウスに、この分子を毎日注射した。興味深いことに、０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４をマウスに投与すると、ＰＢＳを注射した対照と比較して、空腹時の血中ヒトペプチドレベルが徐々に上昇した（図３１）。注目すべきことに、この上昇は、バリアント＃０１４の両方の用量で処置したマウスで４５日目に有意になり、０．４ｍｇ／Ｋｇを注射した実験動物群では６０日目でも有意なままであった（図３１）。さらに、ｉｐ－ＧＴＴで評価した２８日目の耐糖能は、対照と比較してバリアント＃０１４処置動物で改善されることが示された（図３２）。従って、血漿ヒトｃ－ペプチドは飢餓時だけでなく、グルコースボーラスによる刺激の１５分後にも有意に増大することがわかった（図３３）。
ヒトβ細胞に対するバリアント＃０１４の増殖活性を試験するために、腎臓被膜下にヒト膵島を移植した免疫不全マウスに、この分子を毎日注射した。興味深いことに、０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４をマウスに投与すると、ＰＢＳを注射した対照と比較して、空腹時の血中ヒトペプチドレベルが徐々に上昇した（図３１）。注目すべきことに、この上昇は、バリアント＃０１４の両方の用量で処置したマウスで４５日目に有意になり、０．４ｍｇ／Ｋｇを注射した実験動物群では６０日目でも有意なままであった（図３１）。さらに、ｉｐ－ＧＴＴで評価した２８日目の耐糖能は、対照と比較してバリアント＃０１４処置動物で改善されることが示された（図３２）。従って、血漿ヒトｃ－ペプチドは飢餓時だけでなく、グルコースボーラスによる刺激の１５分後にも有意に増大することがわかった（図３３）。
【0360】
最後に、膵臓組織分析のために、マウスに飲料水中のＢｒｄＵを１週間与え、６０日目に犠牲にした。これらの研究により、バリアント＃０１４を注射したネズミの膵臓切片では、対照と比較して、ＢｒｄＵ免疫標識β細胞およびβ細胞量が強く有意に増加したことが明らかになった（図３４）。まとめると、これらのデータは、バリアント＃０１４の慢性投与がヒトβ細胞の増殖および過形成を有効的に刺激することを示唆する。
【0361】
５． 薬物動態学
５．１ 方法
Ｆｃ融合バリアント＃６３－１、＃６３－２および＃６４の薬物動態プロファイルを、１２９／Ｓｖマウスに０．８ｍｇ／ｋｇで単回皮下注射して調べた。
５．１ 方法
Ｆｃ融合バリアント＃６３－１、＃６３－２および＃６４の薬物動態プロファイルを、１２９／Ｓｖマウスに０．８ｍｇ／ｋｇで単回皮下注射して調べた。
【0362】
以下の表６に示すように、タンパク質を１０ｍｌ／ｋｇの投与量で、皮下経路（ＳＣ、背中に沿った皮膚）によりマウスに投与した：
【0363】
【表6】
【0364】
投与から１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１６８時間後に、上表に詳述されるように、血液サンプル（１動物につき、３つのタイムポイントでの採血＋終末採血１回）を採取し、生物分析試験用に血漿を分離した。
【0365】
血漿中のタンパク質＃６３－１、＃６３－２および＃６４の濃度を、市販のＨｕｍａｎ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ １ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に基づき、最適化された生物分析法を用いて定量した。
【0366】
ＰＫ Ｓｏｌｖｅｒ ａｄｄ－ｉｎ ｆｏｒ Ｅｘｃｅｌを用いてＰＫデータを評価したＥｘｃｅｌにおいて、濃度対時間のプロットが作成された（Zhang Y, t al. Comput Methods Programs Biomed. 2010 Sep;99(3):306-14）。
【0367】
５．２ 結果
Ｆｃ融合バリアント＃６４、＃６３－１および＃６３－２の薬物動態プロファイルを図３５および表７に示す。プロファイルは、比較のために以前の試験（試験番号：ＤＸ００１－ＰＨＡ－２１－０１７）で作製された参照タンパク質＃１４の単回投与プロファイルと重ね合わせた。
Ｆｃ融合バリアント＃６４、＃６３－１および＃６３－２の薬物動態プロファイルを図３５および表７に示す。プロファイルは、比較のために以前の試験（試験番号：ＤＸ００１－ＰＨＡ－２１－０１７）で作製された参照タンパク質＃１４の単回投与プロファイルと重ね合わせた。
【0368】
【表7】
【0369】
１２９／Ｓｖマウスに８００μｇ／ｋｇで皮下投与した後、３種類のタンパク質の１６８ｈ－動態を比較したところ、Ｃ最大は投与後１時間から３時間の間（Ｔ最大）に到達した。この時点以降、３種類のタンパク質の血漿中濃度は、研究の最後のタイムポイント（１６８時間）まで徐々に低下した。タンパク質＃１４はＳＣ注射から２４時間後まで定量可能であったが、３種類のＦｃ融合タンパク質はすべて投与から１６８時間後も血漿中で検出可能であり、Ｆｃ部分によって半減期が約６．５時間（＃１４の推定値）から３０時間以上まで延長されたことが実証された（図３５）。
【0370】
６． ２種類のＲｓｐｏ１－Ｆｃ融合タンパク質の生産
＃０６３（ｈＲｓｐｏ１ ２１～２６３－リンカー－Ｆｃ）バリアントおよび＃０６４（Ｆｃ－リンカー－ｈＲｓｐｏ１－２１～２６３）バリアントをＣＨＯＥＢＮＡＬＴ－８５－Ｅ９細胞で一過性に発現させた。生産した２種類のタンパク質の量を決定した。バリアント＃０６４の生産収量は、バリアント＃０６３よりも高い（１１．２５ｍｇ対４．５ｍｇ）。したがって、本開示のバリアントのＮ末端でのＦｃポリペプチドの融合は、Ｆｃ融合タンパク質の生産収量を増加させることを可能にする。
＃０６３（ｈＲｓｐｏ１ ２１～２６３－リンカー－Ｆｃ）バリアントおよび＃０６４（Ｆｃ－リンカー－ｈＲｓｐｏ１－２１～２６３）バリアントをＣＨＯＥＢＮＡＬＴ－８５－Ｅ９細胞で一過性に発現させた。生産した２種類のタンパク質の量を決定した。バリアント＃０６４の生産収量は、バリアント＃０６３よりも高い（１１．２５ｍｇ対４．５ｍｇ）。したがって、本開示のバリアントのＮ末端でのＦｃポリペプチドの融合は、Ｆｃ融合タンパク質の生産収量を増加させることを可能にする。
【0371】
７． Ｆｃ融合タンパク質のリンカーの最適化
本発明者らは、活性型Ｆｃ融合タンパク質を生成するにはリンカーの最適化が必要であることを示した。実際、リンカーを含まない市販のＦｃ融合タンパク質（Ｆｃ－ｈＲｓｐｏ１；Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ ０５３Ｈ）は、ＴｏｐＦｌａｓｈアッセイにおいて活性を示さなかった。以前に試験したバリアント＃０６４または＃０６３とは異なり、Ｆｃ－ｈＲｓｐｏ１タンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ ０５３Ｈ）は膵臓β細胞増殖を刺激しないようである。
本発明者らは、活性型Ｆｃ融合タンパク質を生成するにはリンカーの最適化が必要であることを示した。実際、リンカーを含まない市販のＦｃ融合タンパク質（Ｆｃ－ｈＲｓｐｏ１；Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ ０５３Ｈ）は、ＴｏｐＦｌａｓｈアッセイにおいて活性を示さなかった。以前に試験したバリアント＃０６４または＃０６３とは異なり、Ｆｃ－ｈＲｓｐｏ１タンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ ０５３Ｈ）は膵臓β細胞増殖を刺激しないようである。
【0372】
〔本発明の実施に有用な配列〕
【0373】
【表8】
【0374】
【表9】
【0375】
【表10】
【0376】
【表11】
【図面の簡単な説明】
【0377】
【図1】異なるドメインＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰおよびＢＲの概略図とともに、Ｒｓｐｏ１、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３およびＲｓｐｏ４アミノ酸配列のアラインメントを提供する。
【図2】ＰＢＳ（対照は黒色）、または異なる用量の組換えｈＲｓｐｏ１と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。
【図3】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃００９（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図4】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃００８（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図5】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃００５（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図6】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０３４（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図7】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０４７（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図8】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０５１（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図9】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０６３（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図10】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０６４（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図11】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、またはヒスチジンのタグを含む、異なる用量のバリアント＃０４９（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図12】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０５４（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図13】ＰＢＳ（対照）、または２００ｎＭおよび４００ｎＭのタグ付けされていないバリアント＃０４９と共に、２４時間インキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。
【図14】ＰＢＳ（対照）、または２００ｎＭおよび４００ｎＭのタグ付けされていないバリアント＃０４９と共に、４８時間インキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。最初の２４時間のインキュベーション後、新鮮なタンパク質を添加した。
【図15】ＰＢＳ（対照）、または２００ｎＭおよび４００ｎＭのタグ付けされていないバリアント＃０４９と共に、７２時間インキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。最初の２４時間のインキュベーション後に新鮮なタンパク質を添加し、４８時間後にも再度、新鮮なタンパク質を添加した。
【図16】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０５６（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図17】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０８２（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける右のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図18】ＰＢＳ（対照は左の黒いバー）、または異なる用量のバリアント＃０１１６（灰色）と共にインキュベートしたＭｉｎ６細胞の定量。４００ｎＭにおける左のバーは、野生型ｈＲｓｐｏ１（＃０１４）を用いたＭｉｎ６の定量結果に対応する。
【図19】バリアント＃０１４（Ａ）、＃４９（Ｂ）、＃００８（Ｃ）、＃０６４（Ｄ）、＃０５１（Ｅ）、＃１２１（Ｆ）およびＧＬＰ１（１ｎＭ）を用いた、４日間の培養および７２時間の処理後の１２９／Ｓｖマウスのランゲルハンス島におけるＢｒｄＵ陽性β細胞の割合。
【図20】バリアント＃０１４（Ａ、Ｂ）およびバリアント＃０６４（Ｃ、Ｄ）の腹腔内注射によって、１６週間毎日処置した雌のＮＯＤマウスの血糖追跡および糖尿病発生率。
【図21】雌のＮＯＤマウスを、０．２ｍｇ／Ｋｇ、０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０４９で毎日処置した場合の糖尿病発症率。
【図22】０．２ｍｇ／Ｋｇ、０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０４９で毎日処置されたＮＯＤマウスの血糖追跡。
【図23】バリアント＃０１４を５日間連続して腹腔内注射されたマウスの膵臓切片における、膵島面積（μｍ２）で正規化したＫｉ６７／インスリン二重陽性細胞の定量化。
【図24】バリアント＃０１４を５日間連続して腹腔内注射されたマウスの膵臓切片における、膵島面積（μｍ２）で正規化したＢｒｄＵ／インスリン二重陽性細胞の定量化。
【図25】ＳＴＺ処置の１５日前から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスの血糖追跡。
【図26】ＳＴＺ処置の１５日前から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスの水分摂取量。
【図27】ＳＴＺ処置の１５日前から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置されたＳＴＺ誘導高血糖マウスに対して実施された、腹腔内グルコース負荷試験。この試験は、バリアント＃０１４の連日投与開始から７４日後に実施した。
【図28】ＳＴＺ処置の７日後から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスの血糖追跡。
【図29】ＳＴＺ処置の７日後から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスの水分摂取量。
【図30】ＳＴＺ処置の７日後から毎日、バリアント＃０１４の腹腔内注射で処置された、ＳＴＺ誘導高血糖マウスに対して実施された、腹腔内グルコース負荷試験。この試験は、バリアント＃０１４の連日投与開始から６３日後に実施した。
【図31】ヒト膵島を移植され、ＰＢＳ、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４のいずれかを毎日注射された動物の血液にて測定された空腹時ヒトｃ－ペプチド。
【図32】ＰＢＳ（対照）、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４のいずれかで２８日間処置された後に、ヒト膵島を移植されたマウスに対して実施した腹腔内グルコース負荷試験。
【図33】ＰＢＳ（対照）、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４のいずれかで２８日間処置された後に、ヒト膵島を移植されたマウスの基礎血中ヒトｃ－ペプチド濃度およびグルコース刺激された血中ヒトｃ－ペプチド濃度。
【図34】ＰＢＳ（対照）、または０．４ｍｇ／Ｋｇおよび０．８ｍｇ／Ｋｇのバリアント＃０１４のいずれかで６０日間処置された後に、ヒト膵島を移植された場合の総インスリン容量の定量化。
【図35】雄の１２９／Ｓｖマウス（ｎ＝３／タイムポイント）において、＃６３－１、＃６３－２、および＃６４のＦｃ融合タンパク質を０．８ｍｇ／ｋｇでＳＣ投与した後の１６８時間動態の比較は、参照の非Ｆｃタンパク質＃１４との関連において半減期の延長を示している。比較のために、タンパク質＃１４の単回投与ＰＫプロファイルが示されている（破線）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19(1-4)】
【図19(2-4)】
【図19(3-4)】
【図19(4-4)】
【図20(1-2)】
【図20(2-2)】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【配列表】
【国際調査報告】