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特表2024-526483免疫増強活性を有する新規ＣＲＳ断片ペプチド及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】免疫増強活性を有する新規ＣＲＳ断片ペプチド及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240711BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240711BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240711BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240711BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240711BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240711BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240711BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240711BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240711BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240711BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240711BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240711BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240711BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20240711BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20240711BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20240711BHJP
A61K 38/16 20060101ALN20240711BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C12N15/11
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/00 Z
A61K39/39
A61K35/76
A61K35/12
A61P35/00
A61P37/04
A61K48/00
C12N9/00
C12N15/52 Z
A61K31/7088
A61K38/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535652
(86)(22)【出願日】2021-12-10
(85)【翻訳文提出日】2023-07-19
(86)【国際出願番号】 KR2021018751
(87)【国際公開番号】W WO2022124849
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】10-2020-0172565
(32)【優先日】2020-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．トライトン
(71)【出願人】
【識別番号】521486170
【氏名又は名称】ザイメディ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｚｙｍｅｄｉ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002354
【氏名又は名称】弁理士法人平和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム，スン フン
(72)【発明者】
【氏名】キム，サン ブム
(72)【発明者】
【氏名】チョ，ソンミン
(72)【発明者】
【氏名】ソン，イ チャン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BC01
4B065BD01
4B065BD14
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084DC50
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4C085AA03
4C085AA38
4C085BB01
4C085CC32
4C085EE01
4C085FF01
4C085FF11
4C085FF19
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、免疫増強活性を有する新規CRS断片ペプチド及びその使用に関し、より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列からなる新規ペプチド及びそのワクチンアジュバント、及びがん治療剤への使用に関する。本発明で開示されるペプチドは、本明細書で最初に開示されたCRS断片として抗がん活性及び免疫機能増強活性を示す。
【選択図】 図8
【選択図】 図8
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２のアミノ酸配列又はそれと９５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項2】
前記ペプチドが、先天性免疫及び獲得免疫を活性化する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
前記ペプチドが、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項4】
請求項１に記載のペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４の塩基配列からなることを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項7】
請求項６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項8】
下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含むワクチンアジュバント：（ｉ）請求項１に記載のペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【請求項9】
請求項８に記載のワクチンアジュバント及び抗原を含むワクチン組成物。
【請求項10】
前記抗原が、アルファ胎児タンパク質、発がん胚性抗原、cdk4、β－カテニン、CA125、カスパーゼ-8、上皮腫瘍抗原、HPV抗原、HPV16抗原、HPV16 E7抗原由来のCTLエピトープ、黒色腫関連抗原（MAGE：melanoma associated antigen）-1、MAGE-3、チロシナーゼ、表面Igイディオタイプ、Her-2/neu、MUC-1、前立腺特異抗原（PSA：prostate specific antigen）、シアリルTn（STn）、熱ショックタンパク質、gp96、ガングリオシド分子GM2、GD2、GD3、発がん胚性抗原（CEA：carcinoembryonic antigen）、PRAME、WT1、サバイビン、サイクリンD、サイクリンE、HER2、MAGE、NY-ESO、EGF、GP100、カテプシンG、ヒトパピローマウイルス（HPV）-16-E6、HPV-16-E7、HPV-18-E6、HPV-18-E7、Her/2-neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原（PSA）、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体（AR）、PAK6、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、NY-ESO-1、Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme（SCCE）抗原、Wilms腫瘍抗原1（WT）-1、HIV-1 gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2）、高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、滑液肉腫、X（SSX）-2、雌胚抗原（CEA）、黒色腫関連抗原E（MAGE-A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4）、インターロイキン-13受容体α（IL13-Rα）、炭酸デヒドラターゼIX（CAIX）、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97メラノーマ抗原、KLH抗原、がん胚抗原（CEA）、gp100、MART1抗原、TRP-2、HSP-70、β-HCG、テスチシン、1A01_HLA-A/m；1A02；5T4；ACRBP；AFP；AKAP4；α-アクチニン-_4/m；α-メチルアシル-コエンザイム_A_ラセマーゼ；ANDR；ART-4；ARTC1/m；AURKB；B2MG；B3GN5；B4GN1；B7H4；BAGE-1；BASI；BCL-2；bcr/abl；β-カテニン/m；BING-4；BIRC7；BRCA1/m；BY55；カレチクリン（calreticulin）；CAMEL；CASPA；カスパーゼ_8；カデプシン_B（cathepsin_B）；カデプシン_L；CD1A；CD1B；CD1C；CD1D；CD1E；CD20；CD22；CD276；CD33；CD3E；CD3Z；CD4；CD44_ホモログ_1；CD44_ホモログ_6；CD52；CD55；CD56；CD80；CD86；CD8A；CDC27/m；CDE30；CDK4/m；CDKN2A/m；CEA；CEAM6；CH3L2；CLCA2；CML28；CML66；COA-1/m；コアクトシン-類似_タンパク質（coactosin-like_protein）；コラーゲン_XXIII；COX-2；CP1B1；CSAG2；CT-_9/BRD6；CT45A1；CT55；CTAG2_ホモログ_LAGE-1A；CTAG2_ホモロジー_LAGE-1B；CTCFL；Cten；サイクリン_B1；サイクリン_D1；cyp-B；DAM-10；DEP1A；E7；EF1A2；EFTUD2/m；EGFR；EGLN3；ELF2/m；EMMPRIN；EpCam；EphA2；EphA3；ErbB3；ERBB4；ERG；ETV6；EWS；EZH2；FABP7；FCGR3A_バージョン_1；FCGR3A_バージョン_2；FGF5；FGFR2；フィブロネクチンFOS；FOXP3；FUT1；G250；GAGE-1；GAGE-2；GAGE-3；GAGE-4；GAGE-5；GAGE-6；GAGE7b；GAGE-8_（GAGE-2D）；GASR；GnT-V；GPC3；GPNMB/m；GRM3；HAGE；hepsin；Her2/neu；HLA-A2/m；ホメオボックス_NKX3.1；HOM-TES-85；HPG1；HS71A；HS71B；HST-2；hTERT；iCE；IF2B3；IL-10；IL-13Ra2；IL2-RA；IL2-RB；IL2-RG；IL-5；IMP3；ITA5；ITB1；ITB6；カリクレイン-2（kallikrein-2）；カリクレイン-4；KI20A；KIAA0205；KIF2C；KK-LC-1；LDLR；LGMN；LIRB2；LY6K；MAGA5；MAGA8；MAGAB；MAGE-_B1；MAGE-_E1；MAGE-A1；MAGE-A10；MAGE-A12；MAGE-A2；MAGE-A3；MAGE-A4；MAGE-A6；MAGE-A9；MAGE-B10；MAGE-B16；MAGE-B17；MAGE-B2；MAGE-B3；MAGE-B4；MAGE-B5；MAGE-B6；MAGE-C1；MAGE-C2；MAGE-C3；MAGE-D1；MAGE-D2；MAGE-D4；MAGE-E1_（MAGE1）；MAGE-E2；MAGE-F1；MAGE-H1；MAGEL2；Mammaglobin_A（mammaglobin_A）；MART-1/メラン（melan）-A；MART-2；MC1_R；M-CSF；メソテリン（mesothelin）；MITF；MMP1_1；MMP7；MUC-1；MUM-1/m；MUM-2/m；MYO1A；MYO1B；MYO1C；MYO1D；MYO1E；MYO1F；MYO1G；MYO1H；NA17；NA88-A；Neo-PAP；NFYC/m；NGEP；N-myc；NPM；NRCAM；NSE；NUF2；NY-ESO-1；OA1；OGT；OS-9；オステオカルシン；オステオポンチンp53；PAGE-4；PAI-1；PAI-2；PAP；PATE；PAX3；PAX5；PD1L1；PDCD1；PDEF；PECA1；PGCB；PGFRB；Pim-1_-キナーゼ；Pin-1；PLAC1；PMEL；PML；POTE；POTEF；PRAME；PRDX5/m；PRM2；プロステイン；プロテナーゼ-3（プロテイナーゼ-3）；PSA；PSB9；PSCA；PSGR；PSM；PTPRC；RAB8A；RAGE-1；RARA；RASH；RASK；RASN；RGS5；RHAMM/CD168；RHOCRSSA；RU1；RU2；RUNX1；S-100；SAGE；SART-1；SART-2；SART-3；SEPR；SERPINB5；SIA7F；SIA8A；SIAT9；SIRT2/m；SOX10；SP17；SPNXA；SPXN3；SSX-1；SSX-2；SSX3；SSX-4；ST1A1；STAG2；STAMP-1；STEAP-1；サバイビン；サバイビン-2B；SYCP1；SYT-SSX-1；SYT-SSX-2；TARP；TCRg；TF2AA；TGFbeta1；TGFR2；TGM-4；TIE2；TKTL1；TPI/m；TRGV11；TRGV9；TRPC1；TRP-p8；TSG10；TSPY1；TVC_（TRGV3）；TX101；チロシナーゼ；TYRP1；TYRP2；UPA；VEGFR1；WT1；XAGE1；α-アクチニン-4；ARTC1；BCR-ABL融合タンパク質（b3a2）；B-RAF；CASP-5；CASP-8；β-カテニン；Cdc27；CDK4；CDKN2A；COA-1；dek-can融合タンパク質；EFTUD2；伸長因子2（Elongation factor 2）；ETV6-AML1融合タンパク質；FN1；GPNMB；LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質；HLA-A2d；HLA-A11d；hsp70-2；KIAAO205；MART2；ME1；MUM-If；MUM-2；MUM-3；neo-PAP；ミオシンクラスI；NFYC；OGT；OS-9；pml-RARアルファ融合タンパク質；PRDX5；PTPRK；K-ras；N-ras；RBAF600；SIRT2；SNRPD1；SYT-SSX1又はSSX2融合タンパク質；トリオースホスフェートイソメラーゼ（Triosephosphate Isomerase）；BAGE-1；GAGE-1,2,8；GAGE-3,4,5,6,7；GnTVf；HERV-K-MEL；KK-LC-1；KM-HN-1；LAGE-1；MAGE-A1；MAGE-A2；MAGE-A3；MAGE-A4；MAGE-A6；MAGE-A9；MAGE-A10；MAGE-A12；MAGE-C2；mucin k；NA-88；NY-ESO-1/LAGE-2；SAGE；Sp17；SSX-2；SSX-4；TRAG-3；TRP2-INT2g；CEA；gp100/Pmel17；カリクレイン4（Kallikrein 4）；ママグロビン-A（mammaglobin-A）；メラン-A（Melan-A）/MART-1；NY-BR-1；OA1；PSA；RAB38/NY-MEL-1；TRP-1/gp75；TRP-2；チロシナーゼ；アディポフィリン（adipophilin）；AIM-2；BING-4；CPSF；サイクリンD1；Ep-CAM；EphA3；FGF5；G250/MN/CAIX；HER-2/neu；IL13Rアルファ2；腸カルボキシルエステラーゼ（Intestinal carboxyl esterase）；α-フェトプロテイン（alpha-foetoprotein）；M-CSF；mdm-2；MMP-2；MUC1；p53；PBF；PRAME；PSMA；RAGE-1；RNF43；RU2AS；セセルニン1（secernin 1）；SOX10；STEAP1；サバイビン；テロメラーゼ（Telomerase）；WT1；FLT3-ITD；BCLX（L）；DKK1；ENAH（hMena）；MCSP；RGS5；ガストリン-17；ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（Human Chorionic Gonadotropin）、EGFRvIII、HER2、HER2/neu、P501、グアニリルシクラーゼC（Guanylyl Cyclase C）、PAP、OVA（ovalbumin）、及びMART-1からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項11】
前記ワクチンが抗がんワクチンである、請求項９又は１０に記載のワクチン組成物。
【請求項12】
前記抗がんワクチンが、がん予防用ワクチン又はがん治療用ワクチンである、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項13】
前記がんが、乳がん、大腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、胃がん、皮膚がん、頭頸部がん、肺がん、膠芽腫、口腔がん、下垂体腺腫、神経膠腫、脳腫瘍、上咽頭がん、喉頭がん、胸腺腫、中皮腫、食道がん、直腸がん、肝がん、膵臓がん、膵内分泌腫瘍、胆嚢がん、陰茎がん、尿管がん、腎細胞がん、膀胱がん、非ホジキン性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、白血病、小児がん、気管支がん、結腸がん、及び卵巣がんからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項14】
ワクチンアジュバント、免疫チェックポイント阻害剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項15】
前記ワクチンアジュバントが、1018 ISS、アルミニウム塩、アンプリバックス、AS15、BCG、CP-870,893、CpG ODN、CpG7909、サイアエイ、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド、イムファクトIMP321、ISパッチ、イスコマトリックス、ジュブイミュン、リポバック、MF59、モノホスホリルリピドA、モンタナイドIMS 1312、モンタナイドISA 206、モンタナイドISA 50V、モンタナイド、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、オンタック、ペプテルベクターシステム、PLGマイクロ粒子、レシキモード、SRL172、バイロソーム及び他のウイルス型粒子、YF-17DBCG、アキュラスQS21スチムロン、リビスデトックスキル、スーパーフォース、プロインドス、GM-CSF、コレラトキシン、免疫学的アジュバント、MF59、及びサイトカインからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項16】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1（programmed cell death-1）アンタゴニスト、PD-L1（programmed cell death-ligand 1）アンタゴニスト、PD-L2（programmed cell death-ligand 2）アンタゴニスト、CD27（cluster of differentiation 27）アンタゴニスト、CD28（cluster of differentiation 28）アンタゴニスト、CD70（cluster of differentiation 70）アンタゴニスト、CD80（cluster of differentiation 80, also known as B7-1）アンタゴニスト、CD86（cluster of differentiation 86, also known as B7-2）アンタゴニスト、CD137（cluster of differentiation 137）アンタゴニスト、CD276（cluster of differentiation 276）アンタゴニスト、KIRs（killer-cell immunoglobulin-like receptors）アンタゴニスト、LAG3（lymphocyte-activation gene 3）アンタゴニスト、TNFRSF4（tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4, also known as CD134）アンタゴニスト、GITR（glucocorticoid-induced TNFR-related protein）アンタゴニスト、GITRL（glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand）アンタゴニスト、4-1BBL（4-1BB ligand）アンタゴニスト、CTLA-4（cytolytic T lymphocyte associated antign-4）アンタゴニスト、A2AR（Adenosine A2A receptor）アンタゴニスト、VTCN1（V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1）アンタゴニスト、BTLA（B- and T-lymphocy））アンタゴニスト、IDO（Indoleamine 2,3-dioxygenase）アンタゴニスト、TIM-3（T-cell Immunoglobulin domain and Mucindomain 3）アンタゴニスト、VISTA（V-domain Ig suppressor of T cell activation）アンタゴニスト、及びKLRA（killer cell lectin-like receptor subfamily A）アンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項17】
下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含む、がん予防用又は治療用医薬組成物：（ｉ）請求項１に記載のペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【請求項18】
がん治療用製剤を製造するための下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される１種以上の使用：（ｉ）請求項１に記載のペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【請求項19】
下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含むがん治療方法：（ｉ）請求項１に記載のペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、2020年12月10日に出願された韓国特許出願第2020-0172565号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書全体は、参照により本出願に援用する。
【0002】
本発明は、免疫増強活性を有する新規CRS断片ペプチド及びその使用に関し、より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列からなる新規ペプチド及びそのワクチンアジュバント、及びがん治療剤への使用に関する。
【背景技術】
【0003】
tRNA分子のアミノアシル化を触媒するアミノアシルtRNA合成酵素（Aminoacyl-tRNA synthetase、ARS、又はAARS）は、翻訳プロセス中に遺伝子情報を解読するために不可欠である。真核生物のtRNA合成酵素のそれぞれは、コア酵素（tRNA合成酵素の原核生物における対応物に密接に関連する）と、追加のドメイン（上記コア酵素のアミノ末端又はカルボキシ末端に付加されている）とからなる。したがって、真核生物と原核生物との間には、酵素の構成に大きな違いがある。例えば、ヒトチロシルtRNA合成酵素（TyrRS）は、原核生物及び下等真核生物のTyrRS分子にはないカルボキシ末端ドメインを有する。
【0004】
近年、いくつかのアミノアシルtRNA合成酵素は、翻訳過程への関与とは別の非標準的な（non-canonical）機能を有することが証明されている。すなわち、ARSタンパク質の一部の断片では、タンパク質の翻訳を超えて、異なる種類の経路を調節する細胞外シグナル伝達（シグナリング）活性を示し、アミノアシル化に関連しない予想外の活性を保持することが解明されている。このような予期しない活性は、特定の疾患等に対して治療的に利用可能な活性であることもあるが、むしろ人間の疾患状態を誘発する機能をする恐れが大きい活性である場合もある。一例として、ライシル－tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase、KRS）が、がん転移を促進する活性があることが明らかになったことがある（特許文献１）。また、多形核細胞エラスターゼ（polymorphonuclear cell elastase）及びプラスミン（plasmin）により切断される、TRSのＮ末端ドメインであるミニチロシルtRNAシンターゼ（ミニTRS、アミノ酸残基１～３６４に相当）は、全長タンパク質には見られない非標準的な生物学的活性を示す。インビトロにおいて、ミニTRSは、内皮細胞の増殖及び移動を刺激することを示し、マウスマトリゲルアッセイにおいて血管形成を促進する（pro-angiogenic）活性を有する。新生血管形成を促進する機能は、一般にがんの転移とも密接に関連している。
【0005】
このように、上記のような予期しない活性は、天然の全長タンパク質配列では観察されず（又は天然の全長タンパク質レベルでは有意な効果を示さない）が、一部の領域が単離されたときに特定の活性が顕著に示される場合もあり、また、その効果が治療的に使用されるのに不適切な特性を保有している場合もある。このような予測不可能性に伴う困難性を克服し、このARSファミリータンパク質に対する治療的潜在性を活用するためには、他の様々なアミノアシルtRNA合成酵素タンパク質の生物学的に関連した形態を究明する様々な努力が必要である。
【0006】
一方、製薬産業は、過去の天然物医薬品や化学合成医薬品から、タンパク質又はペプチド医薬品の開発へと変化する傾向があり、世界の医薬品市場のうち、タンパク質又はペプチド医薬品の市場は、２００６年の４３７億ドルから２０１１年には８８５億に拡大し、韓国国内のタンパク質医薬品市場が世界市場で占める割合は、２００６年の３％から２０２１年には７％に拡大する見通しである。タンパク質又はペプチド医薬品は、合成医薬品に比べて副作用が少なく、薬効が速く、医薬品の革新分野として評価されている。
【0007】
現在、主要な製薬会社のパイプラインにおいてバイオ医薬品の重要性が徐々に増加しているが、ペプチド（Peptides）などの特定のバイオ医薬品が発売されるまでには、主要な技術的問題が存在する。一例として、標的部位までのペプチド医薬品の低い送達率、長鎖ペプチド合成などが商業化の障害として作用している。ペプチド医薬品で成功するためには、短い配列でありながら活性を示すことを発掘すること、すなわち全長（full length）タンパク質から優れた生理活性を有する最小単位（モチーフ）を選別することが鍵であることが知られている。ペプチド長が長いと合成コストが高く、製造が容易ではなく、人体吸収上の問題があることが知られている。
【0008】
これに関して、特許文献２には、CRSタンパク質の断片（106-228 aa）及びその使用が開示されているが、上記文献に開示されたCRS断片ペプチドは、マルチマーを形成するだけでなく、Ｎ末端及びＣ末端に付加された親和性タグを除去すると、ペプチドが分解され、医薬品として開発されるには限界がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】韓国登録特許公報１０－１４５３１４１号
【特許文献2】韓国特許出願第１０－２０１９－００２６４９０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明者らは、以前の研究において、システニルtRNA合成酵素（cysteinyl-tRNA synthetase、以下「CRS」という）の断片ペプチドが、抗がん活性及び免疫増強活性を有することを見出したが、上述の限界により、医薬品としての開発が難しいことを確認した。そこで、本発明者らは、上述の限界を克服できる新規なCRS断片ペプチドを開発するために鋭意研究を重ねた結果、配列番号２のアミノ酸配列からなる新規CRS断片ペプチドが、上述の従来のCRS断片ペプチドと比較して、同等の程度の抗がん活性及び免疫機能増強活性を示しながらも、モノマーで形態を維持するだけでなく、親和性タグがなくとも分解されないことを見出し、本発明を完成するに至った。
【0011】
したがって、本発明の目的は、配列番号２のアミノ酸配列又はそれと９５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなるペプチドを提供することである。
【0012】
本発明の他の目的は、前記ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供することである。
【0013】
本発明の他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。
【0014】
本発明の他の目的は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することである。
【0015】
本発明の他の目的は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含むワクチンアジュバントを提供することである。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0016】
本発明の他の目的は、前記ワクチンアジュバント及び抗原を含むワクチン組成物を提供することである。
【0017】
本発明の他の目的は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含むがん予防用又は治療用医薬組成物を提供することである。
【0018】
さらに、本発明の他の目的は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種からなるがん予防用又は治療用医薬組成物を提供することである。
【0019】
さらに、本発明の他の目的は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種から本質的になるがん予防用又は治療用医薬組成物を提供することである。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0020】
本発明の他の目的は、がん治療用製剤を製造するための以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される１種以上の使用を提供することである。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0021】
本発明の他の目的は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含むがん治療方法を提供することである。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【課題を解決するための手段】
【0022】
上記の本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又はそれと９５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【0023】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0024】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0025】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【0026】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含むワクチンアジュバントを提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0027】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ワクチンアジュバント及び抗原を含むワクチン組成物を提供する。
【0028】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含むがん予防用又は治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種からなるがん予防用又は治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種から本質的になるがん予防用又は治療用医薬組成物を提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
さらに、本発明は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種からなるがん予防用又は治療用医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種から本質的になるがん予防用又は治療用医薬組成物を提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0029】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、がん治療用製剤を製造するための、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１つの使用を提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0030】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、下記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含むがん治療方法を提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0031】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0032】
本発明の実施例は、特に逆に示さない限り、本発明が属する技術分野内の分子生物学及び組換えDNA技術の従来方法を用い、説明のための大部分が以下（文献）に記載されている。そのような技術は文献中に詳細に説明されている：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I&II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984).
【0033】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0034】
本明細書に開示されている内容全体にわたって、本発明に関連する様々な態様又は条件を範囲形式で提案することができる。本明細書における範囲値の記載は、特に断りのない限り、対応する境界値を含むものであり、すなわち、下限値以上～上限値以下の値を全て含む意味である。範囲形式の記述は単に便宜性及び簡略性のためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値と同様にすべての可能な下位範囲を具体的に開示したものと見なすべきである。例えば、７～１７０などの範囲の記述は、上記範囲内の個々の数値、例えば、９、２７、３５、１０１、及び１５５、ならびに１０～１２７、２３～３５、８０～１００、５０～１６９などのような下位範囲を具体的に開示したものと見なすべきである。これは範囲の幅に関係なく適用される。
【0035】
本発明の用語「～を含む」とは、「含有する」又は「特徴とする」と同様に使用され、組成物又は方法において、言及されていない追加の成分要素又は方法ステップなどを排除しない。また、用語「～からなる」とは、別途記載されていない追加の要素、工程、又は成分などを除外することを意味する。用語「～から本質的になる」とは、組成物又は方法の範囲において、記載された材料又は工程に加えてその基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程などを含み得ることを意味する。
【0036】
本明細書で使用される「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、通常（従来）の意味に従って使用され、すなわちアミノ酸の配置を意味する。ペプチドは、特定の長さに限定されないが、本発明の文脈では、一般に全長タンパク質の断片を表し、翻訳後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、及び当該分野で公知の他の修飾（天然に発生する修飾及び非天然発生の修飾）を含めることができ、「ポリペプチド」として表すことができる。本発明のペプチド及びタンパク質は、様々な既知の組換え及び／又は合成の技術のいずれかを使用して調製することができ、その例示的な実施形態は以下でさらに説明される。
【0037】
本発明は、CRS及びCRS由来のペプチドが、治療的に関連する非標準的な生物学的活性を保持するという発見に由来する。
【0038】
本明細書において「非標準的活性」とは、tRNA分子にシステインを付加することに加えて、本発明のCRSペプチドが保持する活性を一般に指す。本明細書に詳細に記載されるように、特定の実施形態では、本発明のCRS断片によって示される非標準的の生物学的活性は、これらに限定されないが、抗がん活性、先天性免疫の活性化、及び獲得免疫（adaptive immune）の活性化からなる群から選択することができる。
【0039】
本発明は、少なくとも１つの非標準的な生物学的活性を有するCRS断片ペプチドだけでなく、前記非標準的的活性を実質的に維持する変異体なども本発明の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【0040】
具体的には、本発明者らは、新規CRS断片ペプチドが、先天性免疫及び獲得免疫を活性化して、腫瘍成長を抑制する活性を示し、構造的にも非常に安定であることを明らかにした。上記CRS断片ペプチドの領域は、本発明において最初に公開されるものである。
【0041】
したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又はそれと９５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【0042】
本発明において、前記配列番号２のペプチドは、CRSタンパク質の切断型であり、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるCRS全長タンパク質の配列のうち９９番目から２００番目のアミノ酸からなり、１８２番目のシステインがセリンに置換されたことを特徴とする。
【0043】
本発明の前記ペプチドは、当技術分野で公知の利用可能な技術を用いて調製することができる。一例として、様々なタンパク質分解酵素のいずれかを使用して調製することができる。例示的なプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）としては、例えば、アクロモペプチダーゼ（achromopeptidase）、アミノペプチダーゼ（aminopeptidase）、アンクロッド（ancrod）、アンジオテンシン変換酵素（angiotensin converting enzyme）、ブロメライン（bromelain）、カルパイン（calpain）、カルパインI（calpain I）、カルパインII（calpain II）、カルボキシペプチダーゼA（carboxypeptidase A）、カルボキシペプチダーゼB（carboxypeptidase B）、カルボキシペプチダーゼG（carboxypeptidase G）、カルボキシペプチダーゼP（carboxypeptidase P）、カルボキシペプチダーゼW（carboxypeptidase W）、カルボキシペプチダーゼY（carboxypeptidase Y）、カスパーゼ1（caspase 1）、カスパーゼ2（caspase 2）、カスパーゼ3（caspase 3）、カスパーゼ4（caspase 4）、カスパーゼ5（caspase 5）、カスパーゼ6（caspase 6）、カスパーゼ7（caspase 7）、カスパーゼ8（caspase 8）、カスパーゼ9（caspase 9）、カスパーゼ10（caspase 10）、カスパーゼ11（caspase 11）、カスパーゼ12（caspase 12）、カスパーゼ13（caspase 13）、カテプシンB（cathepsin B）、カテプシンC（cathepsin C））、カテプシンD（cathepsin D）、カテプシンE（cathepsin E）、カテプシンG（cathepsin G）、カテプシンH（cathepsin H）、カテプシンL（cathepsin L）、キモパパイン（chymopapain）、キマーゼ（chymase）、キモトリプシン（chymotrypsin）、クロストリパイン（clostripain）、コラゲナーゼ（collagenase）、補体C1r（complement C1r）、補体C1s（complement C1s）、補体D因子（complement Factor D）、補体I因子（complement factor I）、ククミシン（cucumisin）、ジペプチジルペプチダーゼIV（dipeptidyl peptidase IV）、白血球エラスターゼ（elastase, leukocyte）、膵臓エラスターゼ（elastase, pancreatic）、エンドプロテイナーゼArg-C（endoproteinase Arg-C）、エンドプロテイナーゼAsp-N（endoproteinase Asp-N）、エンドプロテイナーゼGlu-C（endoproteinase Glu-C）、エンドプロテイナーゼ Lys-C（endoproteinase Lys-C）、エンテロキナーゼ（enterokinase）、Xa因子（factor Xa）、フィシン（ficin）、フーリン（furin）、グランザイムA（granzyme A）、グランザイムB（granzyme B）、HIVプロテアーゼ（HIV Protease）、Igase、カリクレイン組織（kallikrein tissue）、一般ロイシンアミノペプチダーゼ（leucine aminopeptidase, general）、細胞基質ロイシンアミノペプチダーゼ（leucine aminopeptidase, cytosol）、ミクロソームロイシンアミノペプチダーゼ（leucine ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloprotease）、メチオニンアミノペプチダーゼ（methionine aminopeptidase）、ニュートラーゼ（neutrase）、パパイン（papain）、ペプシン（pepsin）、プラスミン（plasmin）、プロリダーゼ（prolidase）、プロナーゼE（pronase E）、前立腺特異的抗原（prostate specific antigen）、Streptomyces griseus由来の好アルカリ性プロテアーゼ（protease alkalophilic from Streptomyces griseus）、Aspergillus由来のプロテアーゼ（protease from Aspergillusa）、Aspergillute saitoi由来のプロテアーゼ（protease from Aspergillus saitoi）, Aspergillus sojae由来のプロテアーゼ（protease from Aspergillus sojae）, B. licheniformisプロテアーゼ（protease B. licheniformis, alkaline or alcalase）, Bacillus polymyxa由来のプロテアーゼ（protease from Bacillus polymyxa）, Bacillus sp由来のプロテアーゼ（protease from Bacillus sp）、Rhizopus sp.由来のプロテアーゼ（protease from Rhizopus sp.）、プロテアーゼS（protease S）、プロテアソーム（proteasomes）、Aspergillus oryzae由来のプロテイナーゼ（proteinase from Aspergillus oryza）、プロテイナーゼ3（proteinase 3）、プロテイナーゼA（proteinase A）、プロテイナーゼK（proteinase K）、プロテインC（protein C）、ピログルタメートアミノペプチダーゼ（pyroglutamate aminopeptidase）、レンニン（rennin）、ストレプトキナーゼ（streptokinase）、サブチリシン（subtilisin）、サーモリシン（thermolysin）、トロンビン（thrombin）、組織プラスミノーゲン活性化因子（tissue plasminogen activator）、トリプシン（trypsin）、トリプターゼ（tryptase）、及びウロキナーゼ（urokinase）などが挙げられる。当業者であれば、作製したい断片の化学的特異性を考慮して、どのタンパク質分解酵素が適切であるかを容易に決定することができる。
【0044】
本明細書に記載のポリペプチドは、当技術分野の当業者に知られている任意の適切な手順、例えば組換え技術によって調製することができる。組換え製造方法に加えて、本発明のポリペプチドは、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって製造することができる。
【0045】
固相ペプチド合成（SPPS）法は、小さな多孔性ビーズにリンカーと呼ばれる機能性ユニットを結合して、ペプチド鎖を繋げるように誘導することによって合成を開始することができる。液相法とは異なり、ペプチドはビーズと共有結合して、トリフルオロアセチド酸（TFA）などの特定の反応物によって切断されるまで、濾過プロセスによって脱落するのを防止する。固相に付着したペプチドのＮ末端アミンとＮ保護アミノ酸ユニット（N-protected amino acid unit）が結合する保護（protection）工程、脱保護（deprotection）工程、再曝露されたアミン基（amine group）と新しいアミノ酸が結合するカップリング（coupling）工程のサイクル（cycle、deprotection-wash-coupling-wash）が繰り返されながら合成が行われるようになる。SPPS法は、マイクロ波技術を併用して行うことができ、マイクロ波技術は、ペプチド合成工程で熱を加えることによって、各サイクルのカップリングと脱保護に要する時間を短縮することができる。熱エネルギーは、伸長するペプチド鎖の折り畳み又は凝集体の形成を防ぎ、化学結合を促進することができる。
【0046】
また、液相ペプチド合成法によって本発明のペプチドを作製することができ、その具体的な方法は、以下の文献を参照する：米国特許第5,516,891号。また、本発明のペプチドは、上記固相合成法と液相合成法とを組み合わせる方法などの様々な方法で合成可能であり、本明細書に記載の手段にその製造方法が限定されない。
【0047】
タンパク質合成は、手動技術を使用して又は自動化によって行うことができる。自動化合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて達成することができる。あるいは、様々な断片を別々に化学的に合成し、化学的方法を用いて組み合わせて目的分子を製造することができる。
【0048】
本発明で提供するペプチドには、前記配列番号２のペプチドと配列相同性が９５％以上である変異体を含む。変異体は、ペプチドの活性変異体を意味し、そのような活性変異体は、それが由来するペプチドから少なくとも１つ又は複数の所望の非標準的活性（例えば抗がん活性及び免疫増強活性）を維持することを意味する。前記変異体の一例として、天然に発生するか、又は天然に発生（生成）しないかに関わらず、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つの非標準的活性を保持するスプライス変異体であってよい。別の例として、前記変異体は、天然に発生するか、又は天然に発生生（生成）しないかに関わらず、前記ペプチド配列に対する１つ以上の点突然変異を含み、前記変異体ペプチドは、例えば、ここで記載された少なくとも１つの非標準的活性を保持する。すなわち、本願発明における上記変異体（又は用語「活性変異体」）は、配列番号２のペプチドの機能的同等物として理解される。
【0049】
より具体的には、前記変異体は、前記ペプチド配列に対してその長さ方向に沿って少なくとも、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列相同性を有する機能的同等物であることを特徴とする。
【0050】
本発明の一実施形態では、ペプチドは、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列からなることを特徴とすることができる。
【0051】
変異体は、「ペプチド」のアミノ酸配列に何らかの変化が生じたものであり、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／又は挿入を含み得る。そのような変異体は、天然に存在するものであってもよく、又は本技術分野において周知の任意の多数の技術を用いて、例えば、本発明の上記ペプチド配列のうちの１つ又は複数を、修飾又は変更し、本明細書に記載のそれらの生物学的活性を評価することによって、合成的に生成することができる。
【0052】
本発明の一実施形態では、変異体は、保存的置換を含む。「保存的置換」とは、あるアミノ酸が類似の特性を有する他のアミノ酸で置換されて、当業者であれば、そのペプチドの二次構造及び感受性質（hydropathic nature、疎水性又は親水性性質）が実質的に不変であると予測できる置換である。一般に、以下のアミノ酸群は保存性の変化を示す：（１）ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；（２）cys、ser、tyr、thr；（３）val、ile、leu、met、ala、phe；（４）lys、arg、his；（５）phe、tyr、trp、his。
【0053】
修飾（modification）は、本発明のペプチドの構造内で実施することができ、所望の（好ましい）特徴を有するペプチド変異体又は誘導体（derivatives）をコードする機能的分子を得ることができる。本発明の前記ペプチドと同等（equivalent）又は改良された変異体を作製するために、ペプチドのアミノ酸配列を変更することを望む場合、当業者は、当技術分野で知られているタンパク質コドン情報に基づいて、１つ又は複数のコドンを変化させることができる。
【0054】
例えば、受容体、抗体の抗原結合部位、又は基質分子上の結合部位などの構造を有する相互作用的な結合能力の有意な損失なしに、特定のアミノ酸はタンパク質又はペプチド構造内の他のアミノ酸で置換され得る。なぜなら、これは一般に定義されたタンパク質の生物学的機能的活性としてタンパク質の相互作用的な能力及び性質のためであり、特定のアミノ酸配列置換はタンパク質又はペプチド配列のうちで行われてもよく、もちろん根底にあるDNAコード配列のうちで行われてもよく、それにもかかわらず同じ又は類似の特性を有するタンパク質を得ることができる。
【0055】
したがって、所望の有用性又は活性の有意な損失なしに、上記に開示されたペプチド配列又はそのペプチドをコードするDNA配列に様々な変更が行われることが企図される。そのような修飾には、アミノ酸のヒドロパシー（hydropathic、疎水性又は親水性）指標も考慮することができる。タンパク質に相互作用する生物学的機能を付与する疎水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている（Kyte and Doolittle, 1982.、参照により本明細書に援用される）。例えば、アミノ酸の相対的な疎水性は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、これが最終的に他の分子、例えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などと、タンパク質との相互作用を規定することが分かった。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて減数指数（hydropathic index）が指定される（Kyte and Doolittle, 1982）。これらの値は以下の通りである：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン／シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1.8）；グリシン（-0.4）；トレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）；トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタミン酸（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパラギン酸（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リジン（-3.9）；アルギニン（-4.5）。
【0056】
特定のアミノ酸は、同様の疎水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換され、同様の生物学的活性を有するタンパク質を得ることができる（すなわち、依然として生物学機能的に同等のタンパク質を得る）ことは当業界に公知である。このような変更において、疎水性指標が±２以内のアミノ酸が置換に好ましく、疎水性指標が±１以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、疎水性指標が±０．５以内のアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
【0057】
同じアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効果的に実施され得ることもまた当技術分野において理解されている。米国特許第4,554,101号に記載されているように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に指定されている：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパラギン酸（+3.0±1）；グルタミン酸（+3.0±1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5±1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。アミノ酸が類似の親水性値を有する他のアミノ酸で置換されることができ、生物学的に同等のタンパク質を得ることができることが理解される。このような変更において、その親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内のアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
【0058】
上記で概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいていてもよく、例えば、それら（側鎖置換基の相対的類似性）の疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくことができる。上記の様々な特徴を考慮する例示的な置換は当業者に周知であり、以下を含む：アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；バリン、ロイシン、イソロイシン。
【0059】
アミノ酸置換はまた、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性特性の類似性に基づいて行われることができる。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。正に荷電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれる。同様の親水性値を有する非荷電性極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
【0060】
さらに、変異体は、非保存的変更を含み得る。好ましい実施形態では、変異体ペプチドは、５つのアミノ酸又はそれより少ないアミノ酸の置換、欠失、又は付加によって天然配列とは異なる場合がある。変異体はまた、例えば、ペプチドの二次構造及び親水性に及ぼす影響が最小であるアミノ酸の欠失又は付加によって変更され得る。
【0061】
ペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（又はリーダー）配列を含み得、その配列は、翻訳と同時に又は翻訳後に、そのタンパク質の輸送を指示する。ペプチドはまた、ペプチドの合成、精製、又は同定を容易にするために（例えばポリHis）、又はペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列又は他の配列と結合する（コンジュゲート）することができる。例えば、ペプチドは、免疫グロブリンFc領域に結合（コンジュゲート）することができる。
【0062】
ペプチド配列が比較される場合、後述するように、２つの配列が最大の一致に整列したときに、２つの配列においてアミノ酸の配列が同一である場合、前記２つの配列は「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウ上で配列を比較することによって、配列類似性の局所領域を同定及び比較することによって行われる。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０の連続位置、通常は３０～７５、４０～５０の連続位置の部分を意味し、その部分における配列は、２つの配列である。この最適な整列後、同じ数の連続した位置の参照配列と比較することができる。
【0063】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、バイオインフォマティクスソフトウェア（DNASTAR、Inc., Madison、Wis.）のLasergene suiteのMegalignプログラムを使用して、基本パラメータを使用して行うことができる。このプログラムには、以下の参考文献に記載されているいくつかのアライメントスキームが含まれている。Dayhoff, MO (1978) In Dayhoff, MO (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, DG and Sharp, PM (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, EW and Muller W. (1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson, ED (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406-425. Sneath, PHA and Sokal, RR (1973) Numerical Taxonomy-The Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, WJ and Lipman, DJ (1983) Proc. Nat'l Acad., Sci. USA 80: 726-730.
【0064】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482の部分的同一性アルゴリズムによって行われ、又はNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の同一性ソートアルゴリズムによって実行されるか、又はPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性検索方法によって実行されるか、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA）、及びTFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group（GCG）, 575 Science Dr., Madison、Wis.によって行われてもよく、又は検査によって行われてもよい。
【0065】
配列同一性及び配列類似性百分率を決定するための適切なアルゴリズムの例は、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズムであってよく、それらはそれぞれAltschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402、及びAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されている。BLAST及びBLAST2.0は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドに対する配列相同性のパーセンテージを決定するために使用することができ、例えば、本明細書に記載のパラメータと共に使用することができる。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Infomationを通じて公開されている。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算することができる。
【0066】
各方向における文字マッチング（word hit）の伸びは、以下の場合に停止する：残基の整列累積により０（zero）以下になった場合、又はある配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、位置合わせの感度及び速度を決定する。
【0067】
１つの例示的なアプローチでは、「配列相同性パーセンテージ」は、少なくとも２０箇所の比較ウィンドウ上で２つの最適なアラインメント配列を比較することによって決定され、ここで比較ウィンドウ中のポリペプチド配列部分は、参照配列（これは追加又は欠失を含まない）と比較して、２０％以下、典型的には５～１５％、又は１０～１２％の追加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、正の配列で同じアミノ酸残基が存在する位置の数を決定し、一致する位置の数を取得し、一致する位置の数を参照配列の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割る。そして、この結果に１００を乗じて配列相同性パーセントが算出される。
【0068】
本発明で提供されるペプチドは、直鎖状又は環状であり得、これは本発明の実施形態を参照することによって理解され得る。
【0069】
本発明において、上記変異体としての環状ペプチドの作製は、当技術分野で知られている公知のペプチド環化方法によるものであれば、具体的な環化方法及びそれによる環化形態は特に限定されない。好ましくは、本発明の環状ペプチドの作製は、直鎖状のペプチドに対してそれらの両末端（Ｎ末端及びＣ末端）にシステインが位置するように切断又は置換等を行って準備し、両末端中に存在するシステイン残基の間にモノスルフィド結合が起こるようにすることによって行われるものであってよい。
【0070】
本明細書に提供されるペプチドは、一態様として改変されたポリペプチドの使用を考慮し、そのような改変されたポリペプチドは、本明細書に記載のように単離されたポリペプチドの所望の特性を改善する改変を含む。本発明のポリペプチドの例示的な変更としては、これらに限定されないが、１つ以上の構成アミノ酸における化学的誘導体化及び／又は酵素的誘導体化を含むことができ、誘導体化はアセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び炭水化物又は脂質成分、補因子などの付加を含む側鎖変更、骨格変更、並びにＮ末端及びＣ末端の変更を含む。例示的な変更としては、ポリペプチドのPEG化が挙げられる。
【0071】
特定の実施形態では、本発明のペプチドを改変するために化学選択的ライゲーション技術を使用することができ、例えば部位特異的及び制御された方法でポリマーを接着することによって可能である。そのような技術は、典型的には、化学的手段又は組換え手段のうちの１つによるタンパク質骨格への化学選択的アンカーの結合と、相補的なリンカーを担持するポリマーへのその後の変更に依存する。その結果、組み立てプロセス及び得られたタンパク質－ポリマー結合体の共有結合構造が制御され、それによって有効性及び医薬品動態学的特性などの医薬品特性の合理的な最適化が可能になる。例えば、PEGの選択的な付着を可能にすることによって、それらの医薬品動態学的特性を改善する。
【0072】
本発明の前記ペプチドは、薬学的に許容される塩の形態を含むことができる。薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、錫酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、又はパラトルエンスルホン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0073】
本発明はまた、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0074】
本明細書で使用される「DNA」、「ポリヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、特定の種の全ゲノムDNAから単離されたDNA分子を指す。したがって、ポリペプチドをコードするDNA断片（部分、セグメント）とは、そのDNA断片を得ることができる種の全ゲノムDNAから実質的に単離又は精製された１つ又は複数のコード配列である。作られたDNA断片を指す。「DNA断片」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、DNA断片及びその断片のより小さな断片を含み、また組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、殺菌ウイルス、ウイルスなどを含む）を意味する。
【0075】
当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチド配列は、タンパク質、ペプチドなどを発現するか、又は発現できるように改変されたものであり、ゲノム配列、ゲノム外配列、プラスミドにコードされた配列、及びより小さな操作された遺伝子断片などが含まれる。そのような断片は天然から単離することができ、又は人間の手によって合成的に修飾することができる。
【0076】
当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード配列又はアンチセンス配列）であるか、又は二本鎖であってよく、そしてDNA分子（ゲノム、cDNA、又は合成）又はRNA分子であってよい。さらなるコード配列又は非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド中に存在してもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、他の分子及び／又は支持材料に連結することができる。
【0077】
ポリヌクレオチドは、天然配列を含んでよく、又は変異体、もしくはその配列の生物学的機能的等価物を含んでもよい。ポリペプチド変異体は、以下にさらに記載されるような１つ又は複数の置換、付加、欠失、及び／又は挿入を含むことができ、好ましくは、そのような修飾は、コードされたポリペプチドの所望の活性が、非修飾ポリペプチドと比較して実質的に減少しないラインで行われるものである。コードされたポリペプチドの活性に対する効果は、一般に、本明細書に記載のように評価することができる。
【0078】
本発明で提供されるポリヌクレオチドは、本発明の前記ペプチド又はその変異体ペプチドをコードする限り、その具体的な配列は特に制限されず、いかなる組み合わせの塩基配列（核酸配列）構成も許容される。一例では、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドによって発現され得るが、これらに限定されない。
【0079】
本発明のポリヌクレオチドは、そのコード配列自体の長さに関係なく、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコーディングフラグメント（部分、セグメント）などのような他のDNA配列と組み合わせる。その結果、自分の全長は大きく変わることがある。したがって、ほぼすべての長さのポリヌクレオチド断片を適用することができると考えられ、好ましくは、意図する組換えDNAプロトコルにおける調製及び使用の容易さによってその全長を制限することができる。
【0080】
さらに、遺伝的コードの縮重の結果として、本明細書に記載のペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当技術分野の当業者には明らかに理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用法の違いのために、他のポリヌクレオチド（例えばヒト及び／又は霊長類のコドン選択に対して最適化されたポリヌクレオチド）が本発明によって具体的に企図される。
【0081】
さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１つ以上の変異、例えばヌクレオチドの欠失、付加、及び／又は置換の結果として修飾される内因性遺伝子である。得られたmRNA及びタンパク質は、変化した構造又は機能を有することができる（必ずしも必要ではないかもしれないが）。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、及び／又はデータベース配列比較）を使用して同定することができる。
【0082】
ポリヌクレオチド及びその融合物は、当技術分野で知られており、利用可能であるよく確立された技術のいずれかを使用して製造、操作、及び／又は発現され得る。例えば、本発明のペプチド又はその機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞内で前記ポリペプチドの発現を指向する組換えDNA分子内で利用することができる。遺伝暗号の固有の縮重のために、実質的に同一又は機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を生成することができ、これらの配列はクローニング及び所与のポリペプチドを有する発現に使用することができる。
【0083】
当業者によって理解されるように、場合によっては、天然に存在しないコドンを保持するヌクレオチド配列（ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を産生することが有利である場合がある。例えば、特定の原核生物宿主又は真核生物宿主において好ましいコドンが、タンパク質発現比の増加又は所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期より長い半減期）を有する組換えRNA転写物を生産するように選択することができる。
【0084】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、様々な理由（遺伝子産物のクローニング、処理、発現、及び／又は活性を変更する改変を含むが、これらに限定されない）でペプチドコード配列を改変するために、当技術分野で一般に知られている方法を使用して操作できる。
【0085】
さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクター及び前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【0086】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチド又は機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な要素（エレメント）を含むベクター）に挿入することができる。当業者によく知られた方法により、目的とするポリペプチドをコードする配列、及び適切な転写制御要素（エレメント）及び翻訳制御要素（エレメント）を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ（in vitro）組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換えが含まれる。これらの方法は、以下の文献に記載されている：Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)、及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1989).
【0087】
様々な発現ベクター／宿主系が知られており、ポリヌクレオチド配列を含有及び発現させるために使用することができる。発現ベクター／宿主系は、これらに限定されないが、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）又は細菌発現ベクター（例えば、Ti又はpBR322プラスミド）で形質転換された植物細胞系、又は動物細胞系などの微生物を含む。
【0088】
発現ベクター内に存在する「制御要素（エレメント）」又は「制御配列」は、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、5'及び3'非翻訳領域）である。そのような要素（エレメント）は、その強度及び特異性を変えることができる。使用されるベクター系及び宿主に応じて、任意の適切な転写要素及び翻訳要素（常時プロモーター及び誘導性プロモーターを含む）を使用することができる。
【0089】
例えば、細菌系にクローニングする場合、PBLUESCRIPTファージミド（Stratagene, La Jolla, Calif.）又はPSPORT1プラスミド（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）のハイブリッドlacZプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用することができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが一般に好ましい。ポリペプチドのコード化は、配列の複数の複製を含む細胞株を生成することが必要な場合、SV40又はEBVベースのベクターを適切な選択マーカーと共に有用に利用することができる。
【0090】
細菌系では、複数の発現ベクターを、ペプチド発現のために意図された用途に応じて選択することができる。例えば、大量に必要な場合、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現することを指向するベクターを利用することができる。そのようなベクターとしては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：薬剤のアミノ末端Ｍｅｔ及びそれに続く７残基の配列とインフレームでベクター内に連結され、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生されるpINベクター（Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989））等。pGEXベクター（Promega, Madison, Wis.）もまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用することができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン－アガロースビーズに吸着し、次いで遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、溶解細胞から容易に精製することができる。そのようなシステムで作製されたタンパク質は、複製されたポリペプチドがGST部分（GST moiety）から放出されるように、ヘパリン、トロンビン、又はファクターXa（Factor Xa）プロテアーゼ切断部位を含むように設計することができる。
【0091】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）では、抗原的プロモーター又は誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼ及びPGH）を含む多数のベクターを使用することができる。これはAusubel et al.（supra）及びGrant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987)などを参照して理解することができる。
【0092】
植物発現ベクターを使用する場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターによって駆動することができる。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、CaMVの35Sプロモーター及び19Sプロモーター）は、単独で使用することができ、又はTMV由来のω（オメガ）リーダー配列と組み合わせて使用することができる（Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987））。あるいは、植物プロモーター（例えば、RUBISCOの小サブユニット又は熱ショックプロモーター（heat shock promoter））を利用することができる。これらの構築物は、直接DNA形質転換又は病原体媒介トランスフェクションによって植物細胞に導入され、これらの技術は当技術分野で知られている。
【0093】
昆虫系も、所望のポリペプチドを発現させるために使用することができる。例えば、あるシステムでは、AcNPV（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）が、Spodoptera frugiperda細胞又はTrichoplusia larvaeにおいて外来遺伝子を発現させるためのベクターとして利用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内にクローニングすることができ、例えばポリヘドリン遺伝子などのポリヘドリンプロモーターの制御下に配置することができる。ポリペプチドをコードする配列の成功した挿入は、ポリヘドリン遺伝子が不活性化し、コートタンパク質が欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、組換えウイルスを使用して、例えばS. frugiperda細胞又はTrichoplusia larvaeなどに感染させることができ、所望のポリペプチドを発現させることができる。
【0094】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が一般に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、所望のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーター（late promoter）及び三者間リーダー（tripartite leader）配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須E1又はE3領域への挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現することができる生存ウイルスを得ることができる。さらに、哺乳動物宿主細胞の発現を増大させるために転写エンハンサー（例えば、Rous Sarcoma Virus（RSV）エンハンサー）を使用することができる。
【0095】
さらに、所望のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルを使用することができる。そのようなシグナルとしては、ATG開始コドン及び隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合、さらなる転写制御シグナル又は翻訳制御シグナルは必要ない可能性がある。しかしながら、コード配列のみ、又はその一部のみが挿入される場合、ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供しなければならない。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、正しいリーディングフレーム内になければならない。外因性翻訳要素（エレメント）及び開始コドンは、様々な起源（天然及び合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、利用される特定の細胞系に適切なエンハンサーを入れることによって増強することができる。
【0096】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望の方法で発現されたタンパク質を処理（プロセシング）するその能力に応じて選択することができる。ポリペプチドのそのような変更は、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化を含む。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後処理は、正確な挿入、折り畳み及び／又は機能を促進するために使用することができる。他の宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、及びW138であり、これらはそのような翻訳後活性に対する特定の細胞機構及び特徴的な機構を有する）は外来タンパク質の正確な改変及び加工を確実にするために選択することができる。
【0097】
長期的に、組換えタンパク質の高収率の産生のためには、安定な発現が一般に好ましい。例えば、所望のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株は、ウイルス複製起点及び／又は内因性発現要素（エレメント）を含めることができる発現ベクターと、同じベクター又は別個のベクター上の選択マーカー遺伝子とを用いて形質転換することができる。
【0098】
ベクターの導入後、細胞は増殖培地で１～２日間増殖され、その後、選択培地に変換される。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、導入された配列が首尾よく発現されている細胞の成長及び回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【0099】
多数の選択系を用いて形質転換された細胞株を回収することができる。このような選択システムとしては、これに限定されないが、それぞれ、tk細胞又はaprt細胞に用いることができる、ヘルペスsimplexウイルスチミジンキナーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【0100】
また、代謝拮抗物質耐性、抗生物質耐性、又は除草剤耐性を選択の基礎として使用することができる。例えば、メトトレキサートに対する耐性を与えるdhfr；アミノグリコシド、ネオマイシン、及びG-418に対する耐性を付与するnpt；それぞれ、クロルスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するためのals又はpat（前述のMurry、文献参照）；追加の選択遺伝子が知られており、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB、又は細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisDなどがある。アントシアニン、β－グルクロニダーゼとその基質であるGUS、及びルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンなどの目に見えるマーカーは人気を得ており、形質転換体を同定するためだけでなく、特定のベクターシステムに起因する一時的なタンパク質発現又は安定したタンパク質発現の量を定量するためにも広く利用されている。
【0101】
ポリヌクレオチドがコードする産物に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドがコードする産物の発現を検出及び測定するための様々なプロトコルが当技術分野で知られている。例としては、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）、RIA（radioimmunoassay）、FACS（fluorescence activated cell sorting）などが挙げられる。アッセイ方法及びさらなる他のアッセイ方法は、当技術分野で公知の方法を参照することができる。様々な標識技術及びコンジュゲーション技術が当業者に知られており、これは様々な核酸アッセイ及びアミノ酸アッセイに使用することができる。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するために標識されたハイブリダイゼーションプローブ又は標識されたPCRプローブを作製するための手段は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識又は標識されたヌクレオチドを用いたPCR増幅が挙げられる。あるいは、mRNAプローブの産生のために、配列又はその任意の部分をベクターにクローニングすることができる。そのようなベクターは、当技術分野で、公知で、市販されており、適切なRNAポリメラーゼ（例えば、T7、T3、又はSP6）及び標識ヌクレオチドを添加することによってインビボ（in vito）上でRNAプローブを合成するために使用することができる。これらの手順は、市販されているさまざまなキットを使用して実行できる。適切なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光、又は発色剤、基質、キャリア、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。
【0102】
所望のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現及び細胞培養物からの回収に適した条件下で培養することができる。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、その配列及び／又はベクターに従って分泌されてもよく、又は細胞内に含まれてもよい。
【0103】
当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜又は真核細胞膜を介してポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計することができる。所望のポリペプチドをコードする配列を、水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードする配列と連結するために、他の組換え構築物を使用することができる。
【0104】
組換え生産方法に加えて、本発明のポリペプチド及びその断片は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって製造することができる。タンパク質合成は、手動技術を用いて行ってもよいし、自動化によって行ってもよい。自動化合成は、例えばApplied Biosystems 431 A Peptide Syntthesizer (Perkin Elmer)を用いて達成することができる。あるいは、様々な断片を別々に化学的に合成し、その後全長分子を生成するために化学的方法を用いて組み合わせることができる。
【0105】
本発明の他の態様によれば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば遺伝子治療技術を用いてインビボ（in vivo）で被験体に送達することができる。遺伝子治療とは、一般に、これらの治療が必要とされる障害又は症状を有する哺乳動物、特にヒトの特定の細胞、標的細胞に対する異種の核酸の移入を指す。核酸が選択された標的細胞に導入され、異種のDNAが発現され、それに応じてコードされた治療産物が産生される。
【0106】
本明細書に開示されるような遺伝子治療に利用可能な様々なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア（vaccinia）、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus（AAV））、又は好ましくはレトロウイルスなどのRNAウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、げっ歯類又は藻類のレトロウイルス誘導体又はレンチウイルスベクターであってよい。好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってよい。単一の外因性遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Moloney murine leukemia virus（MoMuLV）、Harvey murine sarcoma virus（HaMuSV）、murine mammary tumor virus（MuMTV）、SIV、BIV、HIVとRous Sarcoma Virus（RSV）。複数の追加のレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を含むことができる。これらのベクターのすべては、形質導入細胞が同定及び産生されるように選択マーカー遺伝子を含んでよい。例えば、所望のジンクフィンガー由来DNA結合ポリペプチド配列を、特定の標的細胞上の受容体のためのリガンドをコードする他の遺伝子と共にウイルスベクターに挿入することによって、ベクターが標的特異的になってよい。
【0107】
レトロウイルスベクターは、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異的であってよい。例示的に、標的化は、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を利用することによって達成することができる。当業者は、ジンクフィンガー－ヌクレオチド結合タンパク質ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを標的特異的に伝達できるようにするために、レトロウイルスゲノム中に挿入され得る特異的ポリヌクレオチド配列について精通している。過度の実験をしなくても容易に確認できる。
【0108】
組換えレトロウイルスは欠損を有するため、感染性ベクター粒子を産生するための補助が必要である。この補助は、例えば、LTR内の調節配列の制御下でレトロウイルスの全ての構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を利用することによって提供することができる。これらのプラスミドは、カプセル化のためのRNA転写物を認識するパッケージングメカニズムを可能にするヌクレオチド配列を失っている。パッケージングシグナルが欠損しているヘルパー細胞株としては、これに限定されないが、例えば、PSI.2、PA317、及びPA12などを含む。これらの細胞株は、ゲノムがパッケージされていないため、空のビリオンを産生する。パッケージングシグナルが無傷であり、構造遺伝子が所望の他の遺伝子で置き換えられた細胞にレトロウイルスベクターが導入される場合、ベクターはパッケージされてベクタービリオンを産生することができる。次に、この方法によって産生されたベクタービリオンを、組織細胞株（例えば、NIH3T3細胞）に感染させるために使用することができ、それによって大量のキメラレトロウイルスビリオンが産生される。
【0109】
また、遺伝子治療のための「非ウイルス性」伝達技術、例えばDNA－リガンド複合体、アデノウイルス－リガンド－DNA複合体、DNAの直接注入、CaPO4沈殿、遺伝子銃技術、電気穿孔法、リポソーム法、及びリポフェクションなどを使用することができる。これらの方法のいずれも当業者に広く利用可能であり、本発明における使用に適している。他の適切な方法も当業者に利用可能であり、本発明が任意の利用可能な形質導入方法を使用して達成され得ることは明らかに理解される。リポフェクションは、リポソーム粒子内に単離されたDNA分子をカプセル化し、リポソーム粒子を標的細胞の細胞膜と接触させることによって達成することができる。リポソームは自己組織化コロイド状分子であり、ホスファチジルセリン又はホスファチジルコリンなどの両親媒性分子からなる脂質二重層が周囲媒体の一部をカプセル化し、その結果、脂質二重層が親水性内部を取り囲む。単層又は多層リポソームを構築することができ、その結果、所望の化学物質、医薬品、又は本発明のように単離されたDNA分子が含まれる。
【0110】
本発明はまた、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含むワクチンアジュバントを提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0111】
本発明において、ワクチンアジュバントは、抗原がワクチンアジュバントと共に投与される場合に、抗原に対する免疫応答、又は免疫応答の増加が誘導されるように免疫系に抗原を提示することができる物質として定義することができる。すなわち、ワクチンアジュバントは、免疫増強剤であり、抗原に対する免疫応答を促進する物質であり、宿主に対して免疫原ではないが、免疫系の細胞の活性を増大させることにより免疫を強化する物質を意味する。
【0112】
ワクチンアジュバントによる抗原特異的誘導免疫応答を分析するために、免疫応答は、ワクチンアジュバントなしで抗原の存在下で誘導された免疫応答と比較することができる。その誘導は、対象者又は対象の細胞で評価することができる。
【0113】
本発明において、免疫応答は、マクロファージ、樹状細胞、単核球、B細胞、及びT細胞応答からなる群から選択される１種以上であってよい。特に、免疫応答は、B細胞応答であってよく、すなわち抗原に対して特異的に抗体を生成することができることを意味する。抗体は、好ましくはIgG抗体、より好ましくはIgG2a及び／又はIgG1抗体である。免疫応答は、T細胞応答、好ましくはTh1反応、Th2反応、又はバランスのとれたTh2/Th1反応であり得る。当業者は、疾患に依存するB細胞及び／又はT細胞応答が、それを調節するために誘導される必要がありうることを認識する。変形例では、免疫応答は、例えば、IFNgamma、IL-6、TNFalpha、又はIL-10などのサイトカインの産生を測定することによって検出することができる。そのようなサイトカインの産生は、ELISAによって、好ましくは実施例で行ったように評価することができる。
【0114】
本発明の一実施形態によれば、前記配列番号２のペプチドは、先天性免疫及び獲得免疫を活性化する効果が非常に優れていることが確認され、抗原と共に処理時の対象の免疫応答の増加を著しく向上させることができることが確認された。
【0115】
したがって、配列番号２のペプチド、あるいはこのペプチドと９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターで形質転換された宿主細胞も、同種の生理学的活性を示すであろうことは、通常の技術者は自明に理解することができる。
【0116】
本発明の一実施形態として、ワクチンアジュバントは、抗原自体で得られるものと比較して、抗原とワクチンアジュバントを一緒に投与した場合、改善された先天性免疫応答及び獲得免疫反応の活性化を誘導することができ、より具体的には、改善された細胞性免疫応答及び体液性免疫反応の活性化が誘導され得る。
【0117】
本発明の一実施形態として、抗原特異的誘導免疫応答の検出は、検出が少なくとも本発明のワクチンアジュバントを投与してから、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間後又はそれ以上の時間後に起こる、又は少なくとも１日後、又は少なくとも２日後、又は少なくとも３日後、又は少なくとも４日後、又はそれ以上の時間後に起こることを意味する。検出は、対象者又は対象の細胞において、好ましくは実施例で行ったように評価することができる。
【0118】
本発明の一実施形態では、抗原特異的誘導免疫応答は、好ましくは抗原に対する検出可能な免疫応答を意味する。検出可能な増加は、ワクチンアジュバント及び抗原を対象に投与してから、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間後、又はそれ以上の時間後、又は少なくとも１日後、又は少なくとも２日後、又は少なくとも３日後、又は少なくとも４日後、又はそれ以上の時間後、免疫細胞、抗体及び／又はサイトカインの量の少なくとも５％、又は１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％又はそれ以上が増加することを意味することができる。検出は、対象者又は対象の細胞において、好ましくは実施例で行ったように評価することができる。
【0119】
本発明はまた、上記ワクチンアジュバント及び抗原を含むワクチン組成物を提供する。
【0120】
本発明において、上記ワクチンは、全疾患誘発生物（以下、構造化又は弱化された）又はこれらの生物の成分、例えばタンパク質、ペプチド、又は多糖類からなる抗原を含有し、生物が誘発する疾患に対する免疫性を付与するために、使用される製剤を指す。上記のように、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、又はこのペプチドと９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むペプチドは、先天性免疫及び獲得免疫系を活性化して抗原と一緒に投与されたとき、対象の免疫反応を著しく増強させる効果を発揮し、ワクチン組成物として活用することができる。
【0121】
本発明において上記ワクチン組成物に含まれる抗原は、その種類が特に限定されるものではなく、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、脂質、炭水化物、核酸、多糖類、及びこれらを含むウイルス、菌体、アレルギー原因物質、組織、細胞等である場合もある。その非限定的な例として、花粉由来抗原、A型肝炎ウイルス由来抗原、B型肝炎ウイルス由来抗原、C型肝炎ウイルス由来抗原、D型肝炎ウイルス由来抗原、E型肝炎ウイルス由来抗原、F型肝炎ウイルス由来抗原、HIVウイルス由来抗原、インフルエンザウイルス由来抗原、ヘルペスウイルス（HSV-1、HSV-2）由来抗原、炭疽菌由来抗原、クラジミア由来抗原、肺炎球菌由来抗原、日本脳炎ウイルス由来抗原、麻疹ウイルス由来抗原、風疹ウイルス由来抗原、破傷風菌由来抗原、水痘ウイルス由来抗原、SARSウイルス由来抗原、EBウイルス由来抗原、パピロマウイルス由来抗原、ヘリコバクターピロリ菌（Helicobacterpylori）菌由来抗原、狂犬病ウイルス由来抗原、ウエストナイルウイルス由来抗原、ハンタウイルス由来抗原、連鎖球菌由来抗原、ブドウ球菌由来抗原、百日咳菌（Bordetella pertussis）由来抗原、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来抗原、マラリア原虫（Plasmodium）由来抗原、ポリオウイルス由来抗原、共通感染症由来抗原、がん抗原、各種食品アレルギー由来抗原などが挙げられる。
【0122】
本発明のワクチン組成物に含まれる抗原は、単一である必要はない。これは、本発明の応用を考慮した場合に、単独のタンパク質やペプチドでないがん細胞や、細菌、ウイルスなど複数の構成物からなるものに対する免疫応答を起こす場合があり、この場合は、免疫応答を起こし得る複数種類のタンパク質などや、種類が特定できない混合物でも構わない。また、積極的に複数種類の抗原に対する免疫応答を起こすことを目的とし、複数種類の抗原を含有させることも本発明のワクチン組成物の利用形態の一つであり得る。
【0123】
本発明のワクチン組成物に含まれる抗原は、好ましくは腫瘍抗原であってよい。腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（TSA：tumor specific antigen）又は腫瘍関連抗原（TAA：tumor associated antigen）である。いくつかの腫瘍抗原及びそれらの発現態様は当技術分野で知られており、治療される腫瘍の種類に応じて選択することができる。腫瘍抗原の非限定的な例には、アルファ胎児タンパク質、発がん胚性抗原、cdk4、β－カテニン、CA125、カスパーゼ-8、上皮腫瘍抗原、HPV抗原、HPV16抗原、HPV16 E7抗原由来のCTLエピトープ、黒色腫関連抗原（MAGE：melanoma associated antigen）-1、MAGE-3、チロシナーゼ、表面Igイディオタイプ、Her-2/neu、MUC-1、前立腺特異抗原（PSA：prostate specific antigen）、シアリルTn（STn）、熱ショックタンパク質、gp96、ガングリオシド分子GM2、GD2、GD3、発がん胚性抗原（CEA：carcinoembryonic antigen）、PRAME、WT1、サバイビン、サイクリンD、サイクリンE、HER2、MAGE、NY-ESO、EGF、GP100、カテプシンG、ヒトパピローマウイルス（HPV）-16-E6、HPV-16-E7、HPV-18-E6、HPV-18-E7、Her/2-neu抗原、キメラHer2抗原、前立腺特異的抗原（PSA）、二価PSA、ERG、アンドロゲン受容体（AR）、PAK6、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、NY-ESO-1、Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme（SCCE）抗原、Wilms腫瘍抗原1（WT）-1、HIV-1 gag、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2）、高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、滑液肉腫、X（SSX）-2、雌胚抗原（CEA）、黒色腫関連抗原E（MAGE-A、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4）、インターロイキン-13受容体α（IL13-Rα）、炭酸デヒドラターゼIX（CAIX）、サバイビン、GP100、血管新生抗原、rasタンパク質、p53タンパク質、p97メラノーマ抗原、KLH抗原、がん胚抗原（CEA）、gp100、MART1抗原、TRP-2、HSP-70、β-HCG、テスチシン、1A01_HLA-A/m；1A02；5T4；ACRBP；AFP；AKAP4；α-アクチニン-_4/m；α-メチルアシル-コエンザイム_A_ラセマーゼ；ANDR；ART-4；ARTC1/m；AURKB；B2MG；B3GN5；B4GN1；B7H4；BAGE-1；BASI；BCL-2；bcr/abl；β-カテニン/m；BING-4；BIRC7；BRCA1/m；BY55；カレチクリン（calreticulin）；CAMEL；CASPA；カスパーゼ_8；カデプシン_B（cathepsin_B）；カデプシン_L；CD1A；CD1B；CD1C；CD1D；CD1E；CD20；CD22；CD276；CD33；CD3E；CD3Z；CD4；CD44_ホモログ_1；CD44_ホモログ_6；CD52；CD55；CD56；CD80；CD86；CD8A；CDC27/m；CDE30；CDK4/m；CDKN2A/m；CEA；CEAM6；CH3L2；CLCA2；CML28；CML66；COA-1/m；コアクトシン-類似_タンパク質（coactosin-like_protein）；コラーゲン_XXIII；COX-2；CP1B1；CSAG2；CT-_9/BRD6；CT45A1；CT55；CTAG2_ホモログ_LAGE-1A；CTAG2_ホモロジー_LAGE-1B；CTCFL；Cten；サイクリン_B1；サイクリン_D1；cyp-B；DAM-10；DEP1A；E7；EF1A2；EFTUD2/m；EGFR；EGLN3；ELF2/m；EMMPRIN；EpCam；EphA2；EphA3；ErbB3；ERBB4；ERG；ETV6；EWS；EZH2；FABP7；FCGR3A_バージョン_1；FCGR3A_バージョン_2；FGF5；FGFR2；フィブロネクチンFOS；FOXP3；FUT1；G250；GAGE-1；GAGE-2；GAGE-3；GAGE-4；GAGE-5；GAGE-6；GAGE7b；GAGE-8_（GAGE-2D）；GASR；GnT-V；GPC3；GPNMB/m；GRM3；HAGE；hepsin；Her2/neu；HLA-A2/m；ホメオボックス_NKX3.1；HOM-TES-85；HPG1；HS71A；HS71B；HST-2；hTERT；iCE；IF2B3；IL-10；IL-13Ra2；IL2-RA；IL2-RB；IL2-RG；IL-5；IMP3；ITA5；ITB1；ITB6；カリクレイン-2（kallikrein-2）；カリクレイン-4；KI20A；KIAA0205；KIF2C；KK-LC-1；LDLR；LGMN；LIRB2；LY6K；MAGA5；MAGA8；MAGAB；MAGE-_B1；MAGE-_E1；MAGE-A1；MAGE-A10；MAGE-A12；MAGE-A2；MAGE-A3；MAGE-A4；MAGE-A6；MAGE-A9；MAGE-B10；MAGE-B16；MAGE-B17；MAGE-B2；MAGE-B3；MAGE-B4；MAGE-B5；MAGE-B6；MAGE-C1；MAGE-C2；MAGE-C3；MAGE-D1；MAGE-D2；MAGE-D4；MAGE-E1_（MAGE1）；MAGE-E2；MAGE-F1；MAGE-H1；MAGEL2；Mammaglobin_A（mammaglobin_A）；MART-1/メラン（melan）-A；MART-2；MC1_R；M-CSF；メソテリン（mesothelin）；MITF；MMP1_1；MMP7；MUC-1；MUM-1/m；MUM-2/m；MYO1A；MYO1B；MYO1C；MYO1D；MYO1E；MYO1F；MYO1G；MYO1H；NA17；NA88-A；Neo-PAP；NFYC/m；NGEP；N-myc；NPM；NRCAM；NSE；NUF2；NY-ESO-1；OA1；OGT；OS-9；オステオカルシン；オステオポンチンp53；PAGE-4；PAI-1；PAI-2；PAP；PATE；PAX3；PAX5；PD1L1；PDCD1；PDEF；PECA1；PGCB；PGFRB；Pim-1_-キナーゼ；Pin-1；PLAC1；PMEL；PML；POTE；POTEF；PRAME；PRDX5/m；PRM2；プロステイン；プロテナーゼ-3（プロテイナーゼ-3）；PSA；PSB9；PSCA；PSGR；PSM；PTPRC；RAB8A；RAGE-1；RARA；RASH；RASK；RASN；RGS5；RHAMM/CD168；RHOCRSSA；RU1；RU2；RUNX1；S-100；SAGE；SART-1；SART-2；SART-3；SEPR；SERPINB5；SIA7F；SIA8A；SIAT9；SIRT2/m；SOX10；SP17；SPNXA；SPXN3；SSX-1；SSX-2；SSX3；SSX-4；ST1A1；STAG2；STAMP-1；STEAP-1；サバイビン；サバイビン-2B；SYCP1；SYT-SSX-1；SYT-SSX-2；TARP；TCRg；TF2AA；TGFbeta1；TGFR2；TGM-4；TIE2；TKTL1；TPI/m；TRGV11；TRGV9；TRPC1；TRP-p8；TSG10；TSPY1；TVC_（TRGV3）；TX101；チロシナーゼ；TYRP1；TYRP2；UPA；VEGFR1；WT1；XAGE1；α-アクチニン-4；ARTC1；BCR-ABL融合タンパク質（b3a2）；B-RAF；CASP-5；CASP-8；β-カテニン；Cdc27；CDK4；CDKN2A；COA-1；dek-can融合タンパク質；EFTUD2；伸長因子2（Elongation factor 2）；ETV6-AML1融合タンパク質；FN1；GPNMB；LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質；HLA-A2d；HLA-A11d；hsp70-2；KIAAO205；MART2；ME1；MUM-If；MUM-2；MUM-3；neo-PAP；ミオシンクラスI；NFYC；OGT；OS-9；pml-RARアルファ融合タンパク質；PRDX5；PTPRK；K-ras；N-ras；RBAF600；SIRT2；SNRPD1；SYT-SSX1又はSSX2融合タンパク質；トリオースホスフェートイソメラーゼ（Triosephosphate Isomerase）；BAGE-1；GAGE-1,2,8；GAGE-3,4,5,6,7；GnTVf；HERV-K-MEL；KK-LC-1；KM-HN-1；LAGE-1；MAGE-A1；MAGE-A2；MAGE-A3；MAGE-A4；MAGE-A6；MAGE-A9；MAGE-A10；MAGE-A12；MAGE-C2；mucin k；NA-88；NY-ESO-1/LAGE-2；SAGE；Sp17；SSX-2；SSX-4；TRAG-3；TRP2-INT2g；CEA；gp100/Pmel17；カリクレイン4（Kallikrein 4）；ママグロビン-A（mammaglobin-A）；メラン-A（Melan-A）/MART-1；NY-BR-1；OA1；PSA；RAB38/NY-MEL-1；TRP-1/gp75；TRP-2；チロシナーゼ；アディポフィリン（adipophilin）；AIM-2；BING-4；CPSF；サイクリンD1；Ep-CAM；EphA3；FGF5；G250/MN/CAIX；HER-2/neu；IL13Rアルファ2；腸カルボキシルエステラーゼ（Intestinal carboxyl esterase）；α-フェトプロテイン（alpha-foetoprotein）；M-CSF；mdm-2；MMP-2；MUC1；p53；PBF；PRAME；PSMA；RAGE-1；RNF43；RU2AS；セセルニン1（secernin 1）；SOX10；STEAP1；サバイビン；テロメラーゼ（Telomerase）；WT1；FLT3-ITD；BCLX（L）；DKK1；ENAH（hMena）；MCSP；RGS5；ガストリン-17；ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（Human Chorionic Gonadotropin）、EGFRvIII、HER2、HER2/neu、P501、グアニリルシクラーゼC（Guanylyl Cyclase C）、PAP、OVA（ovalbumin）、及びMART-1が含まれる。
【0124】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは抗がんワクチンであってよい。さらに、抗がんワクチンは、がん予防用ワクチン又はがん治療用ワクチンであってよい。
【0125】
本発明の態様によれば、本発明の配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド（又はそれと９５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなるペプチド）及び特定腫瘍抗原を含むワクチン組成物は、がん形成前に予め投与して被験体の免疫反応を活性化することにより、がんの成長を阻害する予防効果を示すことができる。また、本発明のワクチン組成物は、がん形成後に対象に投与され、がんの成長を阻害したり、がんを死滅させたりする効果を示し、治療用ワクチンとしての効力が確認された。
【0126】
本発明において、がんは、その種類が特に限定されず、好ましくは乳がん、大腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、胃がん、皮膚がん、口がん、肺がん、膠芽腫、口腔がん、下垂体腺腫、神経膠腫、脳腫瘍、咽頭頭がん、喉頭がん、胸腺腫、中皮腫、食道がん、直腸がん、肝がん、膵臓がん、膵内分泌腫瘍、胆嚢がん、陰茎がん、尿管がん、腎細胞がん、膀胱がん、非ホジキン性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、白血病、小児がん、気管支がん、結腸がん及び卵巣がんからなる群から選択することができる。
【0127】
本発明のワクチン組成物は、任意のワクチンアジュバント及び免疫チェックポイント阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種をさらに含むことができる。
【0128】
本発明の一実施形態によれば、本発明のペプチドは、任意の追加のワクチンアジュバント及び／又は免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて処理されたときに、対象の免疫機能を活性化する効果がより顕著であることが確認された。特に、この効果は、高用量の物質を投与することによって起こり得る副作用などを最小限に抑え、最小限の投与で最大限の効果を達成することができるという点で特に望ましい場合がある。
【0129】
本発明のワクチン組成物にさらに含まれ得るワクチンアジュバントは、その種類が特に限定されず、当業界で現在広く使用されているワクチンアジュバント又は今後新たに開発されるワクチンアジュバントもこれに含まれることが理解されるべきである。上記のいずれかのワクチンアジュバントの非限定的な例として、1018 ISS、アルミニウム塩、アンプリバックス、AS15、BCG、CP-870,893、CpG ODN、CpG7909、サイアエイ、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド、イムファクトIMP321、ISパッチ、イスコマトリックス、ジュブイミュン、リポバック、MF59、モノホスホリルリピドA、モンタナイドIMS 1312、モンタナイドISA 206、モンタナイドISA 50V、モンタナイド、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、オンタック、ペプテルベクターシステム、PLGマイクロ粒子、レシキモード、SRL172、バイロソーム及び他のウイルス型粒子、YF-17DBCG、アキュラスQS21スチムロン、リビスデトックスキル、スーパーフォース、プロインドス、GM-CSF、コレラトキシン、免疫学的アジュバント、MF59、及びサイトカインが含まれ、最も好ましくはCpG ODNであってよい。
【0130】
本発明において、前記チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントを遮断する物質である。免疫チェックポイントは刺激性又は抑制性であり得る。抑制性免疫チェックポイントの遮断は免疫系機能を活性化し、がん免疫療法に使用することができる［参照：Pardoll, Nature Reviews. Cancer 12:252-64 (2012)］。腫瘍細胞は、それらが特異的T細胞受容体に付着すると、活性化T細胞を消失させる。免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞がT細胞に付着するのを防ぎ、これによりT細胞が活性化された状態になる。実際、細胞及び可溶性成分による協働作用は、病原体及びがんによる損傷に対抗する。免疫系経路の調節は、経路の少なくとも１つの成分の発現又は機能的活性を変化させ、免疫系による応答を調節することを伴う。免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1（programmed cell death-1）アンタゴニスト、PD-L1（programmed cell death-ligand 1）アンタゴニスト、PD-L2（programmed cell death-ligand 2）アンタゴニスト、CD27（cluster of differentiation 27）アンタゴニスト、CD28（cluster of differentiation 28）アンタゴニスト、CD70（cluster of differentiation 70）アンタゴニスト、CD80（cluster of differentiation 80, also known as B7-1）アンタゴニスト、CD86（cluster of differentiation 86, also known as B7-2）アンタゴニスト、CD137（cluster of differentiation 137）アンタゴニスト、CD276（cluster of differentiation 276）アンタゴニスト、KIRs（killer-cell immunoglobulin-like receptors）アンタゴニスト、LAG3（lymphocyte-activation gene 3）アンタゴニスト、TNFRSF4（tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4, also known as CD134）アンタゴニスト、GITR（glucocorticoid-induced TNFR-related protein）アンタゴニスト、GITRL（glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand）アンタゴニスト、4-1BBL（4-1BB ligand）アンタゴニスト、CTLA-4（cytolytic T lymphocyte associated antign-4）アンタゴニスト、A2AR（Adenosine A2A receptor）アンタゴニスト、VTCN1（V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1）アンタゴニスト、BTLA（B- and T-lymphocy））アンタゴニスト、IDO（Indoleamine 2,3-dioxygenase）アンタゴニスト、TIM-3（T-cell Immunoglobulin domain and Mucindomain 3）アンタゴニスト、VISTA（V-domain Ig suppressor of T cell activation）アンタゴニスト、及びKLRA（killer cell lectin-like receptor subfamily A）アンタゴニストであり得る。
【0131】
本発明の一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はPD-1アンタゴニストであり得る。PD-1は、宿主の免疫系を回避する腫瘍細胞の能力において中心的な役割を担うT細胞共抑制受容体である。PD-1及びPD-L1、PD-1アンタゴニストのリガンド間の相互作用の遮断は、免疫機能を増強し、抗腫瘍活性を媒介する。PD-1アンタゴニストの例には、PD-1に特異的に結合する抗体が含まれる。特定の抗PD-1抗体には、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、STI-1014、及びピジリズマブが含まれるが、これらに限定されない。
【0132】
本発明の別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はPDーL1アンタゴニストであってよい。PD-L1アンタゴニストの例には、PD-L1に特異的に結合する抗体が含まれる。特定の抗PD-L1抗体には、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びBMS-936559が含まれるが、これらに限定されない。
【0133】
別の一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、LAG3アンタゴニストであってよい。LAG3（リンパ球活性化遺伝子3）は、T細胞ホメオスタシス、増殖及び活性化を調節するネガティブ共刺激受容体である。さらに、LAG3は、調節T細胞（Treg）阻害機能に関与することが報告されている。LAG3分子の大部分は微小管組織化中心に近い細胞に保持され、抗原特異的T細胞の活性化後にのみ誘導される（参照：US 2014/0286935）。LAG3アンタゴニストの例には、LAG3に特異的に結合する抗体が含まれる。特定の抗LAG3抗体にはGSK2831781が含まれるが、これらに限定されない。
【0134】
本発明において、抗体は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体及び抗体断片を含むことを意味する。別の実施形態では、抗体は、抗体のＦｃ部分を保持しない可溶性受容体を含むことを意味する。一実施形態では、抗体は、組換え遺伝子操作によって調製されたヒト化モノクローナル抗体及びその断片であってよい。
【0135】
免疫チェックポイント阻害剤の別のクラスは、阻害剤シグナル形質導入を引き起こすことなくT細胞上のPD-1受容体に結合し、それを遮断するポリペプチドを含む。そのようなペプチドは、米国特許第8,114,845号に開示されているように、B7-DCポリペプチド、B7-H1ポリペプチド、B7-1ポリペプチド、及びB7-2ポリペプチド、並びにそれらの可溶性断片を含む。
【0136】
免疫チェックポイント阻害剤の別のクラスには、PD-1シグナリングを阻害するペプチド部分を有する化合物が含まれる。そのような化合物の例は、米国特許第8,907,053号に開示されている。
【0137】
免疫チェックポイント阻害剤の別のクラスは、骨髄細胞及び腫瘍細胞を浸潤させることによって発現されるインドールアミン-2,3-デオキシゲナーゼ（IDO）などの特定の代謝酵素の阻害剤を含む。IDO酵素は、T細胞における同化に必要なアミノ酸を枯渇させることによって、又はリンパ球機能を変化させることができる細胞質受容体のための特定の天然リガンドの合成を通じて免疫応答を阻害する。
【0138】
本発明の組成物（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなど）は、細胞、組織、又は動物に投与されるために、単独で、又は１つもしくは複数の他の治療方法と組み合わせて、薬学的に許容される溶液又は生理学的に許容される溶液中で一般に配合（製剤化）することができる。希望する場合（必要に応じて）、本発明の組成物は、他の薬剤（例えば、他のタンパク質、ポリペプチド、又は様々な薬学的に活性な薬剤など）と組み合わせて投与することができる。追加の薬剤が本発明の上記ペプチドなどの特性に悪影響を及ぼさない限り、事実上本発明の組成物に含まれ得る他の成分に制限はない。
【0139】
本発明の組成物において、薬学的に許容される賦形剤及び担体の配合は当業者に周知である。さらに、本明細書に記載の特定の組成物の使用における適切な投与量及び治療方法は、当業者に周知の方法を使用することができ、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、脳内、及び筋肉内などの投与とそのための製剤（組み合わせ）を含むことができる。
【0140】
特定の用途では、本明細書に開示される医薬組成物は、対象への経口投与によって送達され得る。そのようなものとして、組成物は、不活性希釈剤と共に、又は吸収可能な食用担体と共に、製剤化（配合）することができ、又は組成物は、硬質シェル又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、又は組成物は、錠剤に圧縮されてもよく、又は組成物は、食品中に直接含まれてもよい。
【0141】
特定の状況では、本明細書に開示される医薬組成物は、非経口的、静脈内、筋肉内、又は腹腔内に送達されることが好ましい場合があり、そのような投与経路は、例えば米国特許第5,543,158号、米国特許第5,641,515号、米国特許第5,399,363号等に記載されたものを参照とすることができる。活性化合物（遊離塩基として又は薬学的に許容される塩として）の溶液は、水中でヒドロキシプロピルセルロース（Hydroxypropylcellulose）などの界面活性剤と適切に混合して調製することができる。さらに、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、又はそれらの混合物中で調製することができ、又は油中で調製することができる。貯蔵及び使用の一般的な条件下で微生物の増殖を防ぐために、調製物は防腐剤を含み得る。
【0142】
注射的利用に適した薬学的形態としては、滅菌水溶液又は分散液と、滅菌注射溶液又は分散液の即時調製を可能にする滅菌粉末などが挙げられる（米国特許第5,466,468号を参照とすることができる）。すべての場合において、薬学的形態は滅菌されなければならず、容易に注射できるほど流動的でなければならない。それは生産及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存的でなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び／又は植物油などを含む溶媒又は分散媒体であってよい。例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散の場合に必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって可能であってよい。多くの場合、等張剤（アイソトニック剤、例えば糖又は塩化ナトリウムなど）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノスチル酸アルミニウム及びゼラチンなど）を組成物に利用することによって達成することができる。
【0143】
水溶液の非経口投与のために、例えば、溶液は必要に応じて適切に緩衝化され、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張化されるべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与に適している。これに関して使用することができる滅菌水性媒体は、当業者に知られている。例えば、１回用量を１ｍｌの等張性NaCl溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注射液に添加するか、又は提案された注入部位に注射することができる。医薬組成物が処理される対象の症状に応じて、用量においてある程度の変化が本質的に起こる。当業者であれば、当業界の従来の知識により、個々の被験者に適した用量を決定することができる。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、FDA Office of Biologics standardsによって必要とされる無菌性、発熱性、及び一般的な安全性と純度基準を満たさなければならない。
【0144】
滅菌注射溶液は、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を含み、次いで濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、滅菌された様々な活性成分を基礎分散媒体及び上に列挙された他の必要な構成要素を含む滅菌ビヒクルに含めることによって調製することができる。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であってよく、この滅菌粉末は、予め滅菌濾過された溶液から得られる。活性成分に加えて、任意の追加の所望の成分の粉末を製造する。
【0145】
本明細書に開示される組成物は、中性又は塩の形態で製剤化（配合）することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられ、酸付加塩は無機酸（例えば塩酸又はリン酸など）又は有機酸（酢酸、シュウ酸、錫酸、マンデル酸など）と形成される。遊離カルボキシル基及び形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄など）及び有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することができる。製剤に応じて、溶液は、投与製剤に適切な方法で、及び治療的に有効な量で投与される。製剤は、例えば注射溶液、医薬品放出カプセルなどのような様々な製剤形態で容易に投与することができる。
【0146】
本明細書で使用される「担体」という用語は、任意の溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質のための媒体及び薬剤の使用は当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、それらは治療用組成物に使用される。補助的な活性成分も本発明の組成物に含まれ得る。
【0147】
「薬学的に許容される」という表現は、ヒトに投与された場合にアレルギー又は同様の不適切な反応を引き起こさない分子材料及び組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の製造方法は、当技術分野で周知である。代表的には、そのような組成物は、注射可能な液体溶液又は懸濁液として調製される。注射前に液体に溶解又は懸濁するのに適した固体形態も製造することができる。さらに、製造物はエマルジョン（emulsified）であってよい。
【0148】
特定の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内スプレー、吸入及び／又は他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達することができる。遺伝子、ポリヌクレオチド、及びペプチド組成物を、鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第5,756,353号及び米国特許第5,804,212号に記載されているものを参照することができる。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Takenaga et al, 1998）及びリゾホスファチジル－グリセロール化合物（米国特許第5,725,871号）を用いた医薬品の送達も薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックス（polytetrafluoroetheylene support matrix）の形態での粘膜経由薬剤送達は、米国特許第5,780,045号に記載されているものを参照することができる。
【0149】
特定の実施形態では、送達は、本発明の組成物を適切な細胞に導入するためのリポソーム、ナノカプセル、微粒子、微小球、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの使用によって行うことができる。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、又はナノ粒子などに封入され、送達のために製剤化することができる。製剤及びそのような送達ビヒクルの使用は、公知の従来技術を使用して実施することができる。
【0150】
さらに、本発明の医薬組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速な、持続又は遅延放出を提供することができるように、当技術分野で公知の方法を使用して製剤化することができる。上記のように製剤化された医薬組成物は、上記のように経口、経皮、皮下、静脈、又は筋肉を含むいくつかの経路を通じて有効量で投与することができる。上記において「有効量」とは、患者に投与した場合、診断又は治療効果の追跡を可能にする物質量を意味する。本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えることができるが、通常、成人を基準とした１回投与で０．１μｇ～１０，０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～５，０００ｍｇの有効用量で１日に数回繰り返し投与することができる。しかしながら、本発明による医薬組成物の投与量は、投与経路、投与対象、対象疾患及びその重症度、年齢、性別体重、個人差及び疾患状態に応じて適宜選択することができ、そのような技術は当業者に知られている。
【0151】
別の態様（側面）において、本発明は、所望の細胞効果及び／又は治療効果を達成するために、細胞、組織、又は被験体に、本発明の組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）を使用する方法を提供する本発明によって制御することができる細胞又は組織は、好ましくは哺乳動物細胞又は組織であってよく、より好ましくはヒト細胞又は組織であってよい。そのような細胞又は組織は、健康な状態のものでもよく、又は病状のものでもよい。
【0152】
本発明はまた、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１種を含むがん予防用又は治療用医薬組成物を提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0153】
本発明の一態様によれば、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは、そのペプチドと９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むペプチドは、いずれも、それ自体として腫瘍成長を抑制し、死滅させる効果を発揮し、がん予防又は治療効果を示すことができる。
【0154】
本発明はまた、がん治療用製剤を製造するための、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１つの使用を提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0155】
本発明はまた、以下の（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される少なくとも１つを含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、がん治療方法を提供する。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
（ｉ）前記ペプチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）を含むベクター、及び
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）で形質転換された宿主細胞。
【0156】
本発明の「有効量」とは、個体に投与した場合、がんの改善、治療、予防、検出、診断、又はがんの抑制もしくは減少効果を示す量をいい、前記「個体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物であってもよく、動物由来の細胞、組織、器官などであってもよい。個体は効果を必要とする患者であってよい。
【0157】
本発明の「治療」は、がん又はがんの症状を改善することを包括的に指し、それはがんを治癒、実質的に予防する、又は状態を改善することを含み得る。症状又は症状のほとんどを軽減、治癒、又は予防することを含むが、これに限定されない。
【発明の効果】
【0158】
本発明で開示されるペプチドは、本明細書で最初に開示されたCRS断片として、抗がん活性及び免疫機能増強活性を示す。
【0159】
また、上記ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、又はCRS全長タンパク質は、抗がん活性及び免疫機能増強活性に非常に優れており、ワクチンアジュバント、ワクチン組成物、及びがん治療用組成物の開発に非常に有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0160】
【図2】図２は、C-VAX開発過程で導出された中間体を精製した後、アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを進行した後、クマシーブルー染色薬を通してタンパク質を染色して、タンパク質の安定性を確認した結果である。
【図4】図４は、開発されたC-VAXを、his-UNE-C1-hisと共に、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で４８時間処理し、分化したＴＨＰ－１セルに培地中でTNF-αを４時間処理し、ELISAを通じてレベルを確認した結果である。
【図5】図５及び図６は、ＢＭＤＣに、his-UNE-C1-his、C-VAXを、濃度別にそれぞれ２４時間処理した後、培地に存在するIL-6（ｅ）、IL-12p70（ｆ）を、ELISAを通じて確認した結果である。
【図6】図５及び図６は、ＢＭＤＣに、his-UNE-C1-his、C-VAXを、濃度別にそれぞれ２４時間処理した後、培地に存在するIL-6（ｅ）、IL-12p70（ｆ）を、ELISAを通じて確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0161】
［発明を実施するための具体的な内容］
以下、本発明を詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
以下、本発明を詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【0162】
実験方法
１．マウス
DooYeol BiotechからC57BL/6及びBALB/cマウスを得た。そして、OVA特異的T細胞受容体遺伝子改変OT-1マウスは、ソウル大学のカン・チャンユル教授の好意により提供された。全てのマウス実験は、ソウル国立大学の承認を得たガイドラインに従って行った。すべてのマウスは、制度的に承認されたプロトコルを使用して、フレンドシップbscで維持されました。
１．マウス
DooYeol BiotechからC57BL/6及びBALB/cマウスを得た。そして、OVA特異的T細胞受容体遺伝子改変OT-1マウスは、ソウル大学のカン・チャンユル教授の好意により提供された。全てのマウス実験は、ソウル国立大学の承認を得たガイドラインに従って行った。すべてのマウスは、制度的に承認されたプロトコルを使用して、フレンドシップbscで維持されました。
【0163】
２．細胞株
CT26及びB16f10 CRS過剰発現細胞を、G418セレクション法で作製した。簡単に説明すると、各細胞について、pEXPR-IBA105 EV及びCRSを形質転換するために、lipofectamine 2000を使用した。過剰発現した細胞を選択するために、１ｍｇ／ｍｌのG418を増殖培地で使用し、耐性モノクローナルを選択した。各クローンの発現レベルをイムノブロッティングによって試験し、類似のインビトロ内成長を有するクローンを選択して実験に使用した。
CT26及びB16f10 CRS過剰発現細胞を、G418セレクション法で作製した。簡単に説明すると、各細胞について、pEXPR-IBA105 EV及びCRSを形質転換するために、lipofectamine 2000を使用した。過剰発現した細胞を選択するために、１ｍｇ／ｍｌのG418を増殖培地で使用し、耐性モノクローナルを選択した。各クローンの発現レベルをイムノブロッティングによって試験し、類似のインビトロ内成長を有するクローンを選択して実験に使用した。
【0164】
３．同種マウス腫瘍モデルと腫瘍測定
CT26及びB16F10を、10% FBS及び1%ストレプトマイシンを含むDMEM中に維持した。CT26及びB16F10の合計5×105個の細胞を、それぞれ６～８週齢程度のBALB/c及びC57BL/6マウスの右側に皮下注射した。７、８、９日目に、２００μｇの各タンパク質を腹腔内注射した。腫瘍をデジタルキャリパーで測定し、以下の式（０．５２×長さ×幅２）に従って計算した。腫瘍が１５００ｍｍ３以上になった時点で、マウスを安楽死させた。
CT26及びB16F10を、10% FBS及び1%ストレプトマイシンを含むDMEM中に維持した。CT26及びB16F10の合計5×105個の細胞を、それぞれ６～８週齢程度のBALB/c及びC57BL/6マウスの右側に皮下注射した。７、８、９日目に、２００μｇの各タンパク質を腹腔内注射した。腫瘍をデジタルキャリパーで測定し、以下の式（０．５２×長さ×幅２）に従って計算した。腫瘍が１５００ｍｍ３以上になった時点で、マウスを安楽死させた。
【0165】
４．細胞結合アッセイ（Cell binding Assay）
C57Bl/6マウスの脾臓を分離した後、物理的な力を加えて単一細胞レベルに分離、分注させた。Alexa647 dyeを用いて染色されたBSA、CRSタンパク質を用いて分注した脾細胞と一緒に、４℃で１時間培養した。培養細胞を用いてCD11b、CD11c、CD3、CD19、Ly6C、Ly6G、F4/80 FACS antibodyで染色した後、FACS分析により分析した。CD3: T cell, CD11b+, F4/80+: macrophage, CD11b, Ly6C: monocyte, CD11b+, Ly6G: neutrophil, CD19: B cell, CD11b+, CD11c+: Dendritic cell
C57Bl/6マウスの脾臓を分離した後、物理的な力を加えて単一細胞レベルに分離、分注させた。Alexa647 dyeを用いて染色されたBSA、CRSタンパク質を用いて分注した脾細胞と一緒に、４℃で１時間培養した。培養細胞を用いてCD11b、CD11c、CD3、CD19、Ly6C、Ly6G、F4/80 FACS antibodyで染色した後、FACS分析により分析した。CD3: T cell, CD11b+, F4/80+: macrophage, CD11b, Ly6C: monocyte, CD11b+, Ly6G: neutrophil, CD19: B cell, CD11b+, CD11c+: Dendritic cell
【0166】
５．腫瘍浸潤免疫細胞及び脾臓免疫細胞の分析
CT26腫瘍保持マウスを、１０日目及び１２日目に屠殺した。腫瘍細胞を、調製プロトコルに従って、腫瘍解離キット、Tumor dissociation kit, mouse（130-096-730、Miltenyi Biotec）を用いて解離した。脾臓細胞を、2% FBS及び1%ストレプトマイシンを含有するRPMI培地を含む培地で解離した。赤血球を溶解（Lysing Buffer（555899, BD biosciences））した後、腫瘍及び脾臓細胞を、CD8、CD4、CD3、CD45、Foxp3、及びCD69抗体で染色した。モノクローナル抗体を4℃で30分間染色した。細胞内染色には、固定／透過性溶液キット（Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug （商標）（555028、BD biosciences））を使用した。
CT26腫瘍保持マウスを、１０日目及び１２日目に屠殺した。腫瘍細胞を、調製プロトコルに従って、腫瘍解離キット、Tumor dissociation kit, mouse（130-096-730、Miltenyi Biotec）を用いて解離した。脾臓細胞を、2% FBS及び1%ストレプトマイシンを含有するRPMI培地を含む培地で解離した。赤血球を溶解（Lysing Buffer（555899, BD biosciences））した後、腫瘍及び脾臓細胞を、CD8、CD4、CD3、CD45、Foxp3、及びCD69抗体で染色した。モノクローナル抗体を4℃で30分間染色した。細胞内染色には、固定／透過性溶液キット（Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug （商標）（555028、BD biosciences））を使用した。
【0167】
６．タンパク質精製
CRS及びCRS（106-228）タンパク質は、N、C末端6×hisタグを含むpET28aプラスミドベクターを用いて精製した。His-UNE-C1-4H及びC-VAXの場合、Ｎ末端6×hisタグ及びrTEVで切断可能な部分を含むpHIS. Parallellプラスミドベクターを用いて精製した。BL21-コドンプラス細胞で形質転換し、コロニーを培地に接種して育成した。OD 600が0.5に達するまで、大規模細胞をLB中で増殖させ、0.5 mMのIPTGを4℃で16時間使用してタンパク質発現を誘導した。遠心分離から細胞ペレットを得て、300mM NaClを含む50mM Tris buffer pH7.5で超音波処理して破砕した。その後、20,000gで30分間遠心分離して上澄み液を得た。これをNi-NTA樹脂を含むカラムの上に注いだ。300mM NaCl、5%グリセロール及び15mMイミダゾールを含有する50mM Tris、pH7.5で洗浄工程を行った。溶出緩衝液（50mM Tris pH7.5、300mM NaCl、グリセロール5％、300mMイミダゾール）10 mlでタンパク質をカラムから分離した。His-UNE-C1-4HとC-VAXの場合、rTEVプロテアーゼを標的タンパク質総量の1:20（g）に混合した後、ダイアリシスを行い、TX-114を用いてエンドトキシンを除去した（REF: Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-114）。SM-2ビーズをポリプレップカラムに充填した後、製造業者の推奨プロトコルに従ってタンパク質を通過させ、残りのトライトンx-114を除去した。LAL分析から、0.04 EU/mg以下の滴定タンパク質を全実験に使用した。
CRS及びCRS（106-228）タンパク質は、N、C末端6×hisタグを含むpET28aプラスミドベクターを用いて精製した。His-UNE-C1-4H及びC-VAXの場合、Ｎ末端6×hisタグ及びrTEVで切断可能な部分を含むpHIS. Parallellプラスミドベクターを用いて精製した。BL21-コドンプラス細胞で形質転換し、コロニーを培地に接種して育成した。OD 600が0.5に達するまで、大規模細胞をLB中で増殖させ、0.5 mMのIPTGを4℃で16時間使用してタンパク質発現を誘導した。遠心分離から細胞ペレットを得て、300mM NaClを含む50mM Tris buffer pH7.5で超音波処理して破砕した。その後、20,000gで30分間遠心分離して上澄み液を得た。これをNi-NTA樹脂を含むカラムの上に注いだ。300mM NaCl、5%グリセロール及び15mMイミダゾールを含有する50mM Tris、pH7.5で洗浄工程を行った。溶出緩衝液（50mM Tris pH7.5、300mM NaCl、グリセロール5％、300mMイミダゾール）10 mlでタンパク質をカラムから分離した。His-UNE-C1-4HとC-VAXの場合、rTEVプロテアーゼを標的タンパク質総量の1:20（g）に混合した後、ダイアリシスを行い、TX-114を用いてエンドトキシンを除去した（REF: Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-114）。SM-2ビーズをポリプレップカラムに充填した後、製造業者の推奨プロトコルに従ってタンパク質を通過させ、残りのトライトンx-114を除去した。LAL分析から、0.04 EU/mg以下の滴定タンパク質を全実験に使用した。
【0168】
７．ELISA
THP1-PMA及びBMDC（bone marrow derived DC）細胞のサイトカイン分泌を確認するために試験した。２４ウェルプレートに5×105 cell/mlで処理し、各ウェルを試薬処理前に２時間セラムフリー培地に変更した。THP1-PMAの場合、100 nMのタンパク質を4時間処理した。 BMDC細胞の場合、100 nM濃度のタンパク質を24時間処理した。上清を500gで10分間遠心分離し、IL-6、TNF-α、及びIL-12 ELISAセット（BD）を用いてELISAを行った。
THP1-PMA及びBMDC（bone marrow derived DC）細胞のサイトカイン分泌を確認するために試験した。２４ウェルプレートに5×105 cell/mlで処理し、各ウェルを試薬処理前に２時間セラムフリー培地に変更した。THP1-PMAの場合、100 nMのタンパク質を4時間処理した。 BMDC細胞の場合、100 nM濃度のタンパク質を24時間処理した。上清を500gで10分間遠心分離し、IL-6、TNF-α、及びIL-12 ELISAセット（BD）を用いてELISAを行った。
【0169】
８．BMDC、BMMの有効化
BMDC（bone marrow derivated dendritic cell）は、標準的な方法を用いて調製した。簡単に言えば、メスC57BL/6マウスから骨髄細胞を得て、10% FBS、1%ストレプトマイシン及び10 ng/ml GM-CSF（R&D、BMDC）又は10 ng/ml M-CSF（R&D、BMM）を含むRPMI培地で培養した。３日目に、GM-CSF又はM-CSFと新鮮なRPMI培地を添加し、６日目に非付着性及び緩く付着した細胞からBMDCを、付着した細胞からBMMを、回収した。各タンパク質100 nM及びLPS 1 μg/mlを18時間処理し、FACS CD11c、CD40、CD80、及びCD86に対する抗体を用いたFACS分析を行った。
BMDC（bone marrow derivated dendritic cell）は、標準的な方法を用いて調製した。簡単に言えば、メスC57BL/6マウスから骨髄細胞を得て、10% FBS、1%ストレプトマイシン及び10 ng/ml GM-CSF（R&D、BMDC）又は10 ng/ml M-CSF（R&D、BMM）を含むRPMI培地で培養した。３日目に、GM-CSF又はM-CSFと新鮮なRPMI培地を添加し、６日目に非付着性及び緩く付着した細胞からBMDCを、付着した細胞からBMMを、回収した。各タンパク質100 nM及びLPS 1 μg/mlを18時間処理し、FACS CD11c、CD40、CD80、及びCD86に対する抗体を用いたFACS分析を行った。
【0170】
９．治療用抗がんワクチンマウスモデル
C-VAXを用いた治療用がんワクチンモデルでは、E.G7-OVA細胞は、背側の右側にs.cで注射した。３日目と１０日目に左背面にOVA（10 ug/mouse）、OVA（10 ug/mouse）＋his-UNE-C1-his（100 ug/mouse）、OVA（10 ug/mouse）＋C-VAX（100 ug/mouse）をぞれぞれ注射し、腫瘍体積を上記のように測定した。
C-VAXを用いた治療用がんワクチンモデルでは、E.G7-OVA細胞は、背側の右側にs.cで注射した。３日目と１０日目に左背面にOVA（10 ug/mouse）、OVA（10 ug/mouse）＋his-UNE-C1-his（100 ug/mouse）、OVA（10 ug/mouse）＋C-VAX（100 ug/mouse）をぞれぞれ注射し、腫瘍体積を上記のように測定した。
【0171】
１０．サイズ排除クロマトグラフィー（Size Exclusion Chromatography）（FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography）
タンパク質サンプルは、50 mM Tris、pH 7.5、300 mM NaClからなる緩衝液及びアミコンUltra-15遠心式フィルターユニットを用いて必要な濃度に合わせて濃縮した。カラム（GE healthcare、Chicgo、Illinois、USA）をAKTA pure（GE Healthcare）と連結した後、カラム容積の３倍の緩衝液で洗浄し、タンパク質緩衝液と平衡を保った。平衡化後、タンパク質サンプルをAKTA pureに注入し、製造業者の説明に従った実施条件によってプロトコルに従って実験を行った。
タンパク質サンプルは、50 mM Tris、pH 7.5、300 mM NaClからなる緩衝液及びアミコンUltra-15遠心式フィルターユニットを用いて必要な濃度に合わせて濃縮した。カラム（GE healthcare、Chicgo、Illinois、USA）をAKTA pure（GE Healthcare）と連結した後、カラム容積の３倍の緩衝液で洗浄し、タンパク質緩衝液と平衡を保った。平衡化後、タンパク質サンプルをAKTA pureに注入し、製造業者の説明に従った実施条件によってプロトコルに従って実験を行った。
【0172】
１１．HEK-blue SEAPアッセイ
HEK細胞は、5% CO2、37℃インキュベーター中、1%抗生物質と10% FBS、100 μg/mlのNormocin（Invivogen, San Diego, CA, USA）を含むDMEM中で培養した。処理したいタンパク質を２４ウェルプレートに処理した後、hTLR2、hTLR1/TLR2、TLR2KO-hTLR1/TLR2-HEK-Blue cellを、5×105 cellずつ各wellに添加した。Plateは２４時間インキュベーションで培養し、上清を回収した。回収した上清をQUANTI-Blue溶液（InvivoGen）と混合した後、37℃で15分から6時間インキュベートし、OD 620 nmで測定して結果を得た。
HEK細胞は、5% CO2、37℃インキュベーター中、1%抗生物質と10% FBS、100 μg/mlのNormocin（Invivogen, San Diego, CA, USA）を含むDMEM中で培養した。処理したいタンパク質を２４ウェルプレートに処理した後、hTLR2、hTLR1/TLR2、TLR2KO-hTLR1/TLR2-HEK-Blue cellを、5×105 cellずつ各wellに添加した。Plateは２４時間インキュベーションで培養し、上清を回収した。回収した上清をQUANTI-Blue溶液（InvivoGen）と混合した後、37℃で15分から6時間インキュベートし、OD 620 nmで測定して結果を得た。
【0173】
実験結果
１．医薬品開発形態であるC-VAXの開発と免疫活性と抗がん効能の検証
本発明者らは、既存の研究においてCRS（106-228）の効力を確認した後、CRS（106-228）を医薬品開発可能な形態にするために研究を進めた。医薬品開発が可能な形態は、（１）タグなし、（２）タンパク質分解なしで安定、（３）初期形態と同等又はより高い効力を示すという３つの条件を満たさなければならない。
１．医薬品開発形態であるC-VAXの開発と免疫活性と抗がん効能の検証
本発明者らは、既存の研究においてCRS（106-228）の効力を確認した後、CRS（106-228）を医薬品開発可能な形態にするために研究を進めた。医薬品開発が可能な形態は、（１）タグなし、（２）タンパク質分解なしで安定、（３）初期形態と同等又はより高い効力を示すという３つの条件を満たさなければならない。
【0174】
以前までの研究で使用したCRS（106-228）は、タンパク質の両末端にhis-tagが結合している形態であり、本発明ではこのCRS（106-228）断片をhis-UNE-C1-hisと命名した。
【0175】
本発明では、上記his-UNE-C1-his両末端のhis-tagを除去し、システインによるマルチフォーム形態から単一フォーム形態にするための研究を進めた（図１）。
【0176】
（１）His-tagの除去とタンパク質配列の調節（UNE-C1-4H産生）
His-UNE-C1-hisタンパク質から、まずC末端のhis-tagを除去（his-UNE-C1）した後、タンパク質の分解が確認された。これを安定化するために、タンパク質配列をCRS（配列番号1）の106-228 aaから99-200 aaに調整し、配列決定されたCRS（99-200 aa）ペプチド（以下、「UNE-C1-4H」という）は、タンパク質分解が起きない安定した形態であることを確認した（図２）。
His-UNE-C1-hisタンパク質から、まずC末端のhis-tagを除去（his-UNE-C1）した後、タンパク質の分解が確認された。これを安定化するために、タンパク質配列をCRS（配列番号1）の106-228 aaから99-200 aaに調整し、配列決定されたCRS（99-200 aa）ペプチド（以下、「UNE-C1-4H」という）は、タンパク質分解が起きない安定した形態であることを確認した（図２）。
【0177】
（２）多量体（マルチマー）形態のない単一形態のペプチドの製造
先に作製したUNE-C1-4Hは、FPLC（Fast protein liquid chromatography）を介して三量体（Trimer）と単量体（monomer）の２つの形態で存在することを確認した。これを解決するために、UNE-C1-4Hに存在するシステイン残基をセリン残基に改変し、FPLCを通じて確認した際に、モノマーのみが存在することを確認した（図３）。システイン残基をセリン残基に修飾したUNE-C1-4Hを、C-VAXと命名した。
先に作製したUNE-C1-4Hは、FPLC（Fast protein liquid chromatography）を介して三量体（Trimer）と単量体（monomer）の２つの形態で存在することを確認した。これを解決するために、UNE-C1-4Hに存在するシステイン残基をセリン残基に改変し、FPLCを通じて確認した際に、モノマーのみが存在することを確認した（図３）。システイン残基をセリン残基に修飾したUNE-C1-4Hを、C-VAXと命名した。
【0178】
（3）C-VAXの免疫活性
PMA-differentiated THP-1 cell lineを用いて、his-UNE-C1-hisとC-VAXのマクロファージ免疫活性の効力を確認した。実験の結果、C-VAXとhis-UNE-C1-hisの両方で十分な免疫活性効力が現れたことを確認した（図４）。
PMA-differentiated THP-1 cell lineを用いて、his-UNE-C1-hisとC-VAXのマクロファージ免疫活性の効力を確認した。実験の結果、C-VAXとhis-UNE-C1-hisの両方で十分な免疫活性効力が現れたことを確認した（図４）。
【0179】
さらに、BMDC（bone marrow-derived dendrictic cell）を用いて、his-UNE-C1-hisとC-VAXの免疫活性効力を確認した。実験の結果、BMDCでも、C-VAXとhis-UNE-C1-hisの両方が、IL-6、IL-12p70サイトカイン分泌（cytokine secretion）を増加させることが確認された（図５及び図６）。
【0180】
（４）TLR2/6によるC-VAX免疫活性機構
以前の研究では、His-UNE-C1-hisがTLR2/6を介して免疫活性を引き起こすことが確認されたので、本発明では、his-UNE-C1-hisに基づいて作製されたC-VAXについても、TLR2/6を介して免疫活性を持つかどうかを確認した。
以前の研究では、His-UNE-C1-hisがTLR2/6を介して免疫活性を引き起こすことが確認されたので、本発明では、his-UNE-C1-hisに基づいて作製されたC-VAXについても、TLR2/6を介して免疫活性を持つかどうかを確認した。
【0181】
hTLR2-HEK-blue cell line、hTLR2 KO-TLR1/6-HEK-Blue cell line、hTLR1/2-HEK-blue cell lineを用いた実験の結果、his-UNE-C1-hisとC-VAXは同じパターンで免疫活性を示し、TLR2が非常に重要であり、TLR1/6ではいずれも効力を示さないことが確認された。したがって、C-VAXもTLR2/6を受容体として利用し、C-VAXがhis-UNE-C1-hisと同じ機序で免疫活性を示すことがわかった（図７）。
【0182】
（５）C-VAXの抗がん効能
以前の研究では、his-UNE-C1-hisの抗がんワクチンとしての効力を確認したので、C-VAXについても抗がんワクチンの効力を確認することを試みた。
以前の研究では、his-UNE-C1-hisの抗がんワクチンとしての効力を確認したので、C-VAXについても抗がんワクチンの効力を確認することを試みた。
【0183】
E.G7-OVA cell lineを5x105 cellで右側に皮下注射（right subcutaneous injection）し、his-UNE-C1-his、C-VAX 5mpkとOVAタンパク質を、３日目（day-3）、７日目（day-7）に左側に皮下注射（left subcutaneous injection）してがんのサイズとマウスの体重を測定した。
【0184】
OVAと共にC-VAXを処理した際に、OVAと共にhis-UNE-C1-hisを処理したときのように強力な抗がん効果を示すことが確認できた（図８）。
【産業上の利用可能性】
【0185】
本発明で開示されるペプチドは、本明細書で最初に開示されたCRS断片として抗がん活性及び免疫機能増強活性を示す。
【0186】
また、前記ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、又はCRS全長タンパク質は、抗がん活性及び免疫機能増強活性に非常に優れており、ワクチンアジュバント、ワクチン組成物、及びがん治療用組成物の開発に非常に有用に活用することができ、産業上の利用可能性が非常に優れている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】