知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 森瑞斯生物科技（深▲せん▼）有限公司の特許一覧 ▶ 中国科学院深▲チェン▼先進技術研究院の特許一覧
特表2024-526496グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体、及びそのγ－アミノ酪酸の生産における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体、及びそのγ－アミノ酪酸の生産における使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/60 20060101AFI20240711BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20240711BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240711BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240711BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20240711BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20240711BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20240711BHJP
C12N 9/04 20060101ALI20240711BHJP
C12Q 1/527 20060101ALI20240711BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
C12N15/60
C12N9/88 ZNA
C12N1/21
C12N15/63 Z
C12N15/52 Z
C12N15/53
C12N9/00
C12N9/04 Z
C12Q1/527
C12P13/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023540831
(86)(22)【出願日】2022-10-24
(85)【翻訳文提出日】2023-08-25
(86)【国際出願番号】 CN2022126883
(87)【国際公開番号】W WO2023240871
(87)【国際公開日】2023-12-21
(31)【優先権主張番号】202210677091.7
(32)【優先日】2022-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202210677092.1
(32)【優先日】2022-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523250784
【氏名又は名称】森瑞斯生物科技（深▲せん▼）有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】519002014
【氏名又は名称】中国科学院深▲チェン▼先進技術研究院
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ ＯＦ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】１０６８， Ｘｕｅｙｕａｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｏｗｎ， Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０５５， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】朱凌峰
(72)【発明者】
【氏名】陳兪妃
(72)【発明者】
【氏名】趙長楽
(72)【発明者】
【氏名】羅小舟
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ80
4B063QR06
4B064AD06
4B065AA24X
4B065AA24Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA17
(57)【要約】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体及びそのγ－アミノ酪酸の生産における使用を提供し、また、改良された組換えコリネバクテリウム・グルタミカム、及びγ－アミノ酪酸に応答し得るバイオセンサーを提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に基づき、下記の変異のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする、グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体：（１）３８番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（２）８９番目のイソロイシンのバリンへの変異
（３）９２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（４）９３番目のグルタミン酸のグルタミンへの変異
（５）１１８番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（６）１５３番目のセリンのスレオニン又はアラニンへの変異
（７）２０２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（８）２６８番目のプロリンのスレオニンへの変異
（９）２９４番目のグルタミン酸のアルギニンへの変異
（１０）３０１番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１１）３５５番目のフェニルアラニンのチロシンへの変異
（１２）３７１番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１３）４３２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１４）４３５番目のヒスチジンのグルタミンへの変異
（１５）４５１番目のロイシンの終止コドンへの変異
（１６）４５７番目のリジンの終止コドンへの変異
（１７）４６１番目のチロシンの終止コドンへの変異。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に基づき、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
１２０番目のスレオニンをアスパラギンに変異させ、４３６番目のロイシンをバリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
１２０番目のスレオニンをバリンに変異させ、４３６番目のロイシンをアスパラギンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
１２０番目のスレオニンをアラニンに変異させ、４３６番目のロイシンをセリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
１２０番目のスレオニンをロイシンに変異させ、４３６番目のロイシンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミン酸に変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをセリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをセリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をヒスチジンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをロイシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをバリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをプロリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをプロリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、１５３番目のセリンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをアラニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをロイシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをプロリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをメチオニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをメチオニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをチロシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをロイシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをバリンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをセリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをプロリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをチロシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをバリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、１５３番目のセリンをセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをバリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをプロリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをアラニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をセリンに変異させ、１５３番目のセリンをチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをセリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアラニンに変異させ、１５３番目のセリンをメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをメチオニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をロイシンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをロイシンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをメチオニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをチロシンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
第８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアラニンに変異させ、１５３番目のセリンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをプロリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をセリンに変異させ、１５３番目のバリンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをアラニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
３８番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をセリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
３８番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
３８番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをセリンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をチロシンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
３８番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をバリンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をアラニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
３８番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をプロリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
３８番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をアルギニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、又は
３８番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をバリンに変異させ、１５３番目のセリンをメチオニンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をロイシンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをバリンに変異させ、４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたことを特徴とする、グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードする、遺伝子。
【請求項4】
請求項３に記載の遺伝子を持つ、発現ベクター。
【請求項5】
請求項１又は２に記載のグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体を発現させる、組換え微生物細胞。
【請求項6】
請求項１又は２に記載のグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体を発現させることを特徴とする、組換えコリネバクテリウム・グルタミカム。
【請求項7】
さらに下記の改良の少なくとも１つが行われたことを特徴とする、請求項６に記載の組換えコリネバクテリウム・グルタミカム：（１）セリン／スレオニンキナーゼ遺伝子ｐｋｎＧをノックアウト又は欠失させること
（２）アミノトランスフェラーゼ遺伝子ｂｉｏＡをノックアウト又は欠失させ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させること
（３）輸送タンパク質遺伝子ｇａｂＰをノックアウト又は欠失させ、ピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現させること
（４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子ｐｃｋをノックアウト又は欠失させ、ピリドキサールキナーゼを過剰発現させること
（５）クエン酸シンターゼ遺伝子ｇｌｔＡの発現をプロモーターＰｇｌｔＡで増強すること
（６）オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｏｄｘをノックアウト又は欠失させること
（７）ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｏｄｈＡを弱いＲＢＳで発現させること
（８）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈをノックアウト又は欠失させ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させること
（９）乳酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子ｌｌｄＤをノックアウト又は欠失させ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｄｈの発現をプロモーターＰｔｕｆで増強すること。
【請求項8】
γ－アミノ酪酸の生産における、請求項１若しくは２に記載の変異体、又は請求項５に記載の組換え微生物細胞、又は請求項６若しくは７に記載の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの使用。
【請求項9】
γ－アミノ酪酸を１段階法で生産する方法であって、請求項６又は７に記載の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを培地中で少なくとも４０ｈ発酵させることを特徴とする、方法。
【請求項10】
前記培地は、コリネバクテリウム・グルタミカムにより利用可能な糖を炭素源とすることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
発酵過程において、ｐＨを７．０±０．２、発酵温度を２８～３０℃に制御することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
γ－アミノ酪酸バイオセンサーであって、プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子を含有し、前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子は、同一ベクター上又は同一ゲノムＤＮＡ上に位置し、前記バイオセンサーを構成し、前記ＰｇａｂＴＤＰはレポーター遺伝子の発現を調節し、前記ＰｇａｂＲ及びＰｇａｂＴＤＰは、ＧＡＢＡ－ＧａｂＲコンジュゲート結合部位の配列を有し、レポーター遺伝子の発現を調節し、前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰとプロモーターＰｇａｂＲの転写方向が反対であることを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項13】
γ－アミノ酪酸生産菌株の選択育成における、請求項１２に記載のバイオセンサーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体、及びそのγ－アミノ酪酸の生産における使用に関し、遺伝子工学及び酵素工学の技術分野に属する。
【背景技術】
【0002】
γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は４炭素の非タンパク構成アミノ酸の一種であり、微生物から植物や動物まで自然界に広く存在し、不眠症の予防及び治療、血圧降下、抗不安、鎮静、鎮痛、利尿などの機能を持ち、さまざまな神経機能障害の治療に用いることができる。ＧＡＢＡは、２－ピロリドンや生分解性素材であるポリアミドナイロン４を合成するための前駆体としても注目されており、さらに産業分野へと応用分野を広げている。
【0003】
ＧＡＢＡの合成方法には、化学合成、酵素触媒又は全細胞生体触媒、及び微生物発酵を含む多くの方法がある。化学合成と比較して、ＧＡＢＡの生合成には、簡単な後処理工程、温和な反応条件、高い生成物収率、高い生成物選択性、低環境汚染性など、多くの利点がある。ＧＡＢＡ生合成の主要な経路は、Ｌ－グルタミン酸をグルタミン酸デカルボキシラーゼＧＡＤにより触媒する不可逆的な脱炭酸反応である。グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）は、リン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）を補因子としてグルタミン酸（Ｇｌｕ）を触媒してＧＡＢＡを生成可能であり、ＧＡＢＡ生産のための重要な酵素である。いくつかの国内外の文献には、コリネバクテリウム・グルタミカムによるＧＡＢＡの生産についてすでに報告されており、２０１１年に研究者は初めて、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてラクトバチルス・ブレビスＬｂ８５由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼの発現により、低濃度だが検出可能なＧＡＢＡを生産することができることを報告した。また、大腸菌Ｗ３１１０のＧａｄＢを外因性で発現させることにより、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムが最適化された発酵過程によって１２．３７ｇ／ＬのＧＡＢＡを産生可能なことが報告されている。Ｚｈａｎｇらは組換えコリネバクテリウム・グルタミカムに基づいて、グルコースを用いて有効な直接生合成経路を開発し、高価なＰＬＰ補因子を添加する必要がなく、２段階ｐＨ制御スキームにより７０時間発酵させた結果、ＧＡＢＡの生産量は７０．６ｇ／Ｌに達した。
【0004】
グルタミン酸デカルボキシラーゼは、グルタミン酸からのＧＡＢＡ生成を触媒し、この反応はプロトンを消費するため、環境のｐＨを上昇させ得る。多くのグルタミン酸デカルボキシラーゼは、ｐＨ４～５の範囲で最適な活性を示し、ｐＨ６を超えるとその活性が急激に低下し、ｐＨ７ではほとんど不活性化する。いくつかの研究では、中性ｐＨでの活性を高める変異体が報告されているが、現在の研究では、グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体の最適ｐＨは変化しておらず、ほとんどはｐＨが６より高い場合に酵素活性を高めることができず、ｐＨ７．０の条件では、まだほとんど不活性化される。
【0005】
現在、市販ＧＡＢＡの生産は、すべてグルタミン酸を前駆体とし、全細胞触媒又は酵素触媒によって行われるが、グルコースを直接発酵してＧＡＢＡを生産することは、更にコスト面で優位性がある。グルタミン酸の生合成にはｐＨ７．０の中性条件が必要であるが、ＧＡＤの最適ｐＨは４～５であり、ｐＨ７．０ではほとんど不活性化される。そのため、ＧＡＢＡの直接発酵の研究でも、一般的に２段階発酵法が使用されている。第１段階では、中性ｐＨ（ｐＨ７前後）の条件下でグルタミン酸を産生する。第２段階では、酸性ｐＨ（ｐＨ５程度）でＧＡＢＡを産生する。１段階法によりＧＡＢＡを生産する直接発酵に比べ、２段階法は、発酵時間が長くなり、生産量が少なく、コストが増加する。一般的な工業シャーシ菌株の中で、大腸菌などと比べて、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は安全な生産菌株（ＧＲＡＳ：Ｇｅｎｅｒａｌ Ｒｅｇａｒｄｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）であり、これにより生産したＧＡＢＡは、食品に適用できる。コリネバクテリウム・グルタミカムは優れたグルタミン酸生産菌でもあり、グルタミン酸はＧＡＢＡの直接の前駆体であるため、コリネバクテリウム・グルタミカムは、ＧＡＢＡの大量生産に有望な菌株である。要するに、現在市場にあるグルタミン酸を基質とする全細胞触媒及び酵素触媒、あるいは２段階発酵は、１段階の直接発酵に比べてコストが高くなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、従来のグルタミン酸デカルボキシラーゼのｐＨがＧＡＢＡの１段階生産には適用できないことや、全細胞触媒、酵素触媒、２段階法でＧＡＢＡを生産する場合のコストが高く、生産量が少なく、プロセスが複雑であることなどの欠点を解決するために、ＧＡＢＡバイオセンサー、該バイオセンサーによる指向性進化により得られるＧＡＤ酵素変異体、及びｐＨ７．０の条件でグルコースから１段階でγ－アミノ酪酸を生産できるコリネバクテリウム・グルタミカムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、ＧＡＢＡバイオセンサーであって、
プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子を含有し；前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子は同一ベクター上又は同一ゲノムＤＮＡ上に位置し、前記バイオセンサーを構成し；前記ＰｇａｂＴＤＰはレポーター遺伝子の発現を調節し；前記ＰｇａｂＲ及びＰｇａｂＴＤＰは、ＧＡＢＡ－ＧａｂＲコンジュゲート結合部位の配列を有し、レポーター遺伝子の発現を調節し；前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰとプロモーターＰｇａｂＲの転写方向が反対である、ＧＡＢＡバイオセンサーを提供する。
プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子を含有し；前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子は同一ベクター上又は同一ゲノムＤＮＡ上に位置し、前記バイオセンサーを構成し；前記ＰｇａｂＴＤＰはレポーター遺伝子の発現を調節し；前記ＰｇａｂＲ及びＰｇａｂＴＤＰは、ＧＡＢＡ－ＧａｂＲコンジュゲート結合部位の配列を有し、レポーター遺伝子の発現を調節し；前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰとプロモーターＰｇａｂＲの転写方向が反対である、ＧＡＢＡバイオセンサーを提供する。
【0008】
一実施形態では、前記レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）を含むが、これらに限定されない蛍光タンパク質遺伝子である。
【0009】
一実施形態では、前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示され、前記プロモーターＰｇａｂＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示され、前記ｇａｂＲ遺伝子をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示され、前記ＧＡＢＡ－ｇａｂＲコンジュゲート結合部位の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される。
【0010】
本発明はまた、γ－アミノ酪酸生産菌株の選択育成における前記バイオセンサーの使用を提供する。
【0011】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるグルタミン酸デカルボキシラーゼに基づき、下記の少なくとも１つの部位の変異が発生したグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体を提供する：
（１）３８番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（２）８９番目のイソロイシンのバリンへの変異
（３）９２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（４）９３番目のグルタミン酸のグルタミンへの変異
（５）１１８番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（６）１５３番目のセリンのスレオニン又はアラニンへの変異
（７）２０２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（８）２６８番目のプロリンのスレオニンへの変異
（９）２９４番目のグルタミン酸のアルギニンへの変異
（１０）３０１番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１１）３５５番目のフェニルアラニンのチロシンへの変異
（１２）３７１番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１３）４３２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１４）４３５番目のヒスチジンのグルタミンへの変異
（１５）４５１番目のロイシンの終止コドンへの変異
（１６）４５７番目のリジンの終止コドンへの変異
（１７）４６１番目のチロシンの終止コドンへの変異
（１）３８番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（２）８９番目のイソロイシンのバリンへの変異
（３）９２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（４）９３番目のグルタミン酸のグルタミンへの変異
（５）１１８番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（６）１５３番目のセリンのスレオニン又はアラニンへの変異
（７）２０２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（８）２６８番目のプロリンのスレオニンへの変異
（９）２９４番目のグルタミン酸のアルギニンへの変異
（１０）３０１番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１１）３５５番目のフェニルアラニンのチロシンへの変異
（１２）３７１番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１３）４３２番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異
（１４）４３５番目のヒスチジンのグルタミンへの変異
（１５）４５１番目のロイシンの終止コドンへの変異
（１６）４５７番目のリジンの終止コドンへの変異
（１７）４６１番目のチロシンの終止コドンへの変異
【0012】
一実施形態では、前記変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に基づき、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0013】
一実施形態では、前記変異体は、１２０番目のスレオニンをアスパラギンに変異させ、４３６番目のロイシンをバリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0014】
一実施形態では、前記変異体は、１２０番目のスレオニンをバリンに変異させ、４３６番目のロイシンをアスパラギンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0015】
一実施形態では、前記変異体は、１２０番目のスレオニンをアラニンに変異させ、４３６番目のロイシンをセリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0016】
一実施形態では、前記変異体は、１２０番目のスレオニンをロイシンに変異させ、４３６番目のロイシンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0017】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0018】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0019】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0020】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0021】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0022】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0023】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0024】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0025】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0026】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミン酸に変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをセリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0027】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをセリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をヒスチジンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0028】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0029】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをロイシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをバリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0030】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをプロリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0031】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0032】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0033】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0034】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0035】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0036】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをプロリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0037】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0038】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、１５３番目のセリンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0039】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをアラニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0040】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0041】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをロイシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0042】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0043】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0044】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0045】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0046】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0047】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをプロリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0048】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをメチオニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0049】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0050】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをメチオニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0051】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをチロシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0052】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをロイシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0053】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをチロシンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0054】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをバリンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをセリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0055】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0056】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをプロリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0057】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをチロシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをバリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0058】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、１５３番目のセリンをセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをバリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0059】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをプロリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0060】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0061】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをアラニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0062】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をセリンに変異させ、１５３番目のセリンをチロシンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをセリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0063】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアラニンに変異させ、１５３番目のセリンをメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをメチオニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0064】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0065】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0066】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアスパラギンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0067】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをグルタミンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0068】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをプロリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をロイシンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをロイシンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをメチオニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0069】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をチロシンに変異させ、１５３番目のセリンをアラニンに変異させ、２６８番目のプロリンをチロシンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0070】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアスパラギンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0071】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアラニンに変異させ、１５３番目のセリンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをメチオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをプロリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをプロリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0072】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をセリンに変異させ、１５３番目のバリンをプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをアラニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0073】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２６８番目のプロリンをアラニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをメチオニンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0074】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをロイシンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0075】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをロイシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0076】
一実施形態では、前記変異体は、８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0077】
一実施形態では、前記変異体は、３８番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をセリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをバリンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0078】
一実施形態では、前記変異体は、３８番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、８９番目のイソロイシンをセリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をチロシンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をプロリンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をアスパラギンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアラニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0079】
一実施形態では、前記変異体は、３８番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をプロリンに変異させ、１５３番目のセリンをセリンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をチロシンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをセリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0080】
一実施形態では、前記変異体は、３８番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、８９番目のイソロイシンをグルタミンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をバリンに変異させ、１５３番目のセリンをアスパラギンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、２６８番目のプロリンをアスパラギンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をアラニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをグルタミンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをロイシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0081】
一実施形態では、前記変異体は、３８番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、８９番目のイソロイシンをメチオニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をロイシンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をメチオニンに変異させ、１５３番目のセリンをロイシンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、２６８番目のプロリンをセリンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をプロリンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアスパラギンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをチロシンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0082】
一実施形態では、前記変異体は、３８番目のアスパラギン酸をメチオニンに変異させ、８９番目のイソロイシンをアラニンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をグルタミンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をバリンに変異させ、１５３番目のセリンをメチオニンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をセリンに変異させ、２６８番目のプロリンをバリンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をロイシンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをアラニンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をバリンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをバリンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させたものである。
【0083】
一実施形態では、前記変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に基づき、３８番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、８９番目のイソロイシンをバリンに変異させ、９２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、９３番目のグルタミン酸をグルタミンに変異させ、１５３番目のセリンをスレオニンに変異させ、２０２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、２６８番目のプロリンをスレオニンに変異させ、２９４番目のグルタミン酸をアルギニンに変異させ、３０１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、３５５番目のフェニルアラニンをチロシンに変異させ、４３２番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させ、４３５番目のヒスチジンをグルタミンに変異させ、かつ４５１番目のロイシンを終止コドンに変異させ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される変異体Ｄ３８Ｎ／Ｉ８９Ｖ／Ｄ９２Ｎ／／Ｅ９３Ｑ／Ｓ１５３Ｔ／Ｄ２０２Ｎ／Ｐ２６８Ｔ／Ｅ２９４Ｒ／Ｄ３０１Ｎ／Ｆ３５５Ｙ／Ｄ４３２Ｎ／Ｈ４３５Ｑ／Ｌ４５１＊として得られる。
【0084】
本発明はまた、前記変異体をコードする遺伝子を提供する。
【0085】
一実施形態では、前記変異体Ｄ３８Ｎ／Ｉ８９Ｖ／Ｄ９２Ｎ／／Ｅ９３Ｑ／Ｓ１５３Ｔ／Ｄ２０２Ｎ／Ｐ２６８Ｔ／Ｅ２９４Ｒ／Ｄ３０１Ｎ／Ｆ３５５Ｙ／Ｄ４３２Ｎ／Ｈ４３５Ｑ／Ｌ４５１＊をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される。
【0086】
本発明はまた、前記遺伝子を持つ発現ベクターを提供する。
【0087】
一実施形態では、前記発現ベクターは、ｐＣＥＳ、ｐＪＣ１、ｐＡＮ６プラスミドを含むが、これらに限定されず、前記プラスミドｐＣＥＳは、論文『Development of a high-copy-number plasmid via adaptive laboratory evolution of Corynebacterium glutamicum』、前記プラスミドｐＪＣ１、ｐＡＮ６は、論文『Regulation of γ-aminobutyrate (GABA) utilization in Corynebacterium glutamicum by the PucR-type transcriptional regulator GabR and by alternative nitrogen and carbon sources』に開示されている。
【0088】
本発明はまた、前記グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体を発現させる組換え微生物細胞を提供する。
【0089】
一実施形態では、前記組換え微生物細胞は、細菌又は真菌細胞を宿主細胞とする。
【0090】
一実施形態では、前記組換え微生物は、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムであり、宿主であるコリネバクテリウム・グルタミカムは、ＡＴＣＣ １３０３２、ＡＴＣＣ １３８６９を含むが、これらに限定されない。
【0091】
本発明はまた、ｐＨ７．０の条件下で高活性を有するＧＡＤ酵素変異体、及びグルコースを利用してγ－アミノ酪酸を１段階法で生産することができるコリネバクテリウム・グルタミカムを提供する。
【0092】
本発明は、ＧＡＢＡを１段階法で生産するための組換えコリネバクテリウム・グルタミカムであって、前記グルタミン酸デカルボキシラーゼを発現させており、下記の少なくとも１つの改良が行われた組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを提供する：
（１）セリン／スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子ｐｋｎＧをノックアウト又は欠失させること
（２）アミノトランスフェラーゼ遺伝子ｂｉｏＡをノックアウト又は欠失させ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させること
（３）輸送タンパク質遺伝子ｇａｂＰをノックアウト又は欠失させ、ピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現させること
（４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子ｐｃｋをノックアウト又は欠失させ、ピリドキサールキナーゼを過剰発現させること
（５）クエン酸シンターゼ遺伝子ｇｌｔＡの発現をプロモーターＰｇｌｔＡで増強すること
（６）オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｏｄｘをノックアウト又は欠失させること
（７）ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｏｄｈＡを弱いＲＢＳで発現させること
（８）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈをノックアウト又は欠失させ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させること
（９）乳酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子ｌｌｄＤをノックアウト又は欠失させ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｄｈの発現をプロモーターＰｔｕｆで増強すること。
（１）セリン／スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子ｐｋｎＧをノックアウト又は欠失させること
（２）アミノトランスフェラーゼ遺伝子ｂｉｏＡをノックアウト又は欠失させ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させること
（３）輸送タンパク質遺伝子ｇａｂＰをノックアウト又は欠失させ、ピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現させること
（４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子ｐｃｋをノックアウト又は欠失させ、ピリドキサールキナーゼを過剰発現させること
（５）クエン酸シンターゼ遺伝子ｇｌｔＡの発現をプロモーターＰｇｌｔＡで増強すること
（６）オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｏｄｘをノックアウト又は欠失させること
（７）ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｏｄｈＡを弱いＲＢＳで発現させること
（８）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈをノックアウト又は欠失させ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させること
（９）乳酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子ｌｌｄＤをノックアウト又は欠失させ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｄｈの発現をプロモーターＰｔｕｆで増強すること。
【0093】
一実施形態では、前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、（１）～（９）に示される改良を行った：
（１）セリン／スレオニンキナーゼ遺伝子ｐｋｎＧをノックアウト又は欠失させ、前記セリン／スレオニンキナーゼ遺伝子ｐｋｎＧによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００１４５．１に示される。
（２）アミノトランスフェラーゼ遺伝子ｂｉｏＡをノックアウト又は欠失させ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させ、前記アミノトランスフェラーゼ遺伝子ｂｉｏＡによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ：ＢＡＢ９９９９７．１に示され、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８８９２．１に示され、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９９４７２．１に示される。
（３）輸送タンパク質遺伝子ｇａｂＰをノックアウト又は欠失させ、ピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現させ、前記輸送タンパク質遺伝子ｇａｂＰによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ：ＢＡＢ９７８７４．１に示され、前記ピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８０８２．１に示される。
（４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子ｐｃｋをノックアウト又は欠失させ、ピリドキサールキナーゼを過剰発現させ、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子ｐｃｋによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００２５７．１に示され、前記ピリドキサールキナーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＷＰ＿００３６４１１１２．１に示される。
（５）クエン酸シンターゼ遺伝子ｇｌｔＡの発現をプロモーターＰｇｌｔＡで増強し、前記プロモーターＰｇｌｔＡのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示され、前記クエン酸シンターゼ遺伝子ｇｌｔＡによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８２２２．１に示される。
（６）オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｏｄｘをノックアウト又は欠失させ、前記オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｏｄｘによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８６８３．１に示される。
（７）ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｏｄｈＡを弱いＲＢＳで発現させ、前記弱いＲＢＳの配列はＣＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＧであり、前記ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｏｄｈＡによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８５２２．１に示される。
（８）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈをノックアウト又は欠失させ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させ、前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００３０５．１に示され、前記イソクエン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８０５７．１に示される。
（９）乳酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子ｌｌｄＤをノックアウト又は欠失させ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｄｈの発現をプロモーターＰｔｕｆで増強し、前記プロモーターＰｔｕｆで増強されたヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示され、前記乳酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子ｌｌｄＤによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００３１２．１に示され、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９９４７２．１に示される。
（１）セリン／スレオニンキナーゼ遺伝子ｐｋｎＧをノックアウト又は欠失させ、前記セリン／スレオニンキナーゼ遺伝子ｐｋｎＧによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００１４５．１に示される。
（２）アミノトランスフェラーゼ遺伝子ｂｉｏＡをノックアウト又は欠失させ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させ、前記アミノトランスフェラーゼ遺伝子ｂｉｏＡによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ：ＢＡＢ９９９９７．１に示され、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８８９２．１に示され、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９９４７２．１に示される。
（３）輸送タンパク質遺伝子ｇａｂＰをノックアウト又は欠失させ、ピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現させ、前記輸送タンパク質遺伝子ｇａｂＰによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ：ＢＡＢ９７８７４．１に示され、前記ピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８０８２．１に示される。
（４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子ｐｃｋをノックアウト又は欠失させ、ピリドキサールキナーゼを過剰発現させ、前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子ｐｃｋによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００２５７．１に示され、前記ピリドキサールキナーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＷＰ＿００３６４１１１２．１に示される。
（５）クエン酸シンターゼ遺伝子ｇｌｔＡの発現をプロモーターＰｇｌｔＡで増強し、前記プロモーターＰｇｌｔＡのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示され、前記クエン酸シンターゼ遺伝子ｇｌｔＡによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８２２２．１に示される。
（６）オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｏｄｘをノックアウト又は欠失させ、前記オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｏｄｘによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８６８３．１に示される。
（７）ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｏｄｈＡを弱いＲＢＳで発現させ、前記弱いＲＢＳの配列はＣＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＧであり、前記ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｏｄｈＡによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８５２２．１に示される。
（８）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈをノックアウト又は欠失させ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させ、前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００３０５．１に示され、前記イソクエン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８０５７．１に示される。
（９）乳酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子ｌｌｄＤをノックアウト又は欠失させ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｄｈの発現をプロモーターＰｔｕｆで増強し、前記プロモーターＰｔｕｆで増強されたヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示され、前記乳酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子ｌｌｄＤによりコードされるアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００３１２．１に示され、前記グルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９９４７２．１に示される。
【0094】
本発明はまた、前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを用いてγ－アミノ酪酸を１段階法で生産する方法であって、前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを発酵培地に接種して、少なくとも４０ｈ発酵させる方法を提供する。
【0095】
一実施形態では、前記発酵培地は、コリネバクテリウム・グルタミカムにより利用可能な単糖、多糖又はこれらの混合物を炭素源とし、これらの糖は、グルコース、フルクトース、スクロース、糖蜜などを含むが、これらに限定されない。
【0096】
一実施形態では、前記方法においては、グルタミン酸又はグルタミン酸塩を生産前駆体として添加しないため、生育後に菌体を収集して形質転換することなく、そのままグルコースを含む炭素源から１段階で発酵させてγ－アミノ酪酸を生産することができ、発酵過程においてｐＨを７．０±０．５に制御し、前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムで発酵させて、発酵温度を２８～３０℃に制御して、少なくとも４０ｈ発酵させる。
【0097】
一実施形態では、前記発酵培地は、グルコース１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．８７ｇ／Ｌ、コーンシロップ３ｍｌ／Ｌ、リン酸０．４ｍｌ／Ｌ、塩化カリウム０．５３ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１２０ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４２ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム６．３ｍｇ／Ｌ、微生物Ｂ１６．３ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．０５ｍｇ／Ｌを含有する。
【0098】
一実施形態では、発酵過程においてまた、ｐＨを７．０±０．２に制御する。
【0099】
一実施形態ではまた、発酵温度を３０℃、溶存酸素を３０％に制御する。
【0100】
本発明はまた、γ－アミノ酪酸含有製品の生産における、前記グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体、前記コリネバクテリウム・グルタミカム又は前記方法の使用を提供する。
【発明の効果】
【0101】
有利な効果は以下のとおりである：
（１）本発明で構築されたＧＡＢＡバイオセンサーは、原核生物において初めて構築されたＧＡＢＡバイオセンサーであり、ＧＡＢＡ濃度が向上するに伴い、その蛍光シグナルが強くなり、ＧＡＢＡ生産菌株の効率的な選択育成に有利である。
（２）本発明で提供されるグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体は、ｐＨ６．０～７．５条件での活性を大幅に向上させ、ｐＨ７．０では比酵素活性が１０．２９ Ｕ／ｍｇと高い。
（３）本発明は、γ－アミノ酪酸の生産に有用なコリネバクテリウム・グルタミカムシャーシ細胞を構築しており、グルタミン酸デカルボキシラーゼＧＡＤ酵素変異体を過剰発現させることにより、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムがｐＨ７．０の条件下でグルコースから１段階法で発酵してＧＡＢＡを生産する場合の生産量を向上させ、ＧＡＢＡ生産量を今まで報告された最高値である１１４ｇ／Ｌにし、しかも、コストを大幅に削減し、ＧＡＢＡの生産コストをグルタミン酸の生産コストよりも低くする。
（１）本発明で構築されたＧＡＢＡバイオセンサーは、原核生物において初めて構築されたＧＡＢＡバイオセンサーであり、ＧＡＢＡ濃度が向上するに伴い、その蛍光シグナルが強くなり、ＧＡＢＡ生産菌株の効率的な選択育成に有利である。
（２）本発明で提供されるグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体は、ｐＨ６．０～７．５条件での活性を大幅に向上させ、ｐＨ７．０では比酵素活性が１０．２９ Ｕ／ｍｇと高い。
（３）本発明は、γ－アミノ酪酸の生産に有用なコリネバクテリウム・グルタミカムシャーシ細胞を構築しており、グルタミン酸デカルボキシラーゼＧＡＤ酵素変異体を過剰発現させることにより、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムがｐＨ７．０の条件下でグルコースから１段階法で発酵してＧＡＢＡを生産する場合の生産量を向上させ、ＧＡＢＡ生産量を今まで報告された最高値である１１４ｇ／Ｌにし、しかも、コストを大幅に削減し、ＧＡＢＡの生産コストをグルタミン酸の生産コストよりも低くする。
【図面の簡単な説明】
【0102】
【図1】バイオセンサーの構築である。
【図2】ＧＡＢＡの代謝と合成経路、及び関与している遺伝子である。ＧＡＤ：グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ＧａｂＴ：γ－アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ＧａｂＤ：コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＧａｂＰ：ＧＡＢＡ特異的輸送タンパク質、ＯＤＨＣ：α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰｋｎＧ：セリン／スレオニンキナーゼ、ＰＥＰＣ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ＰＣ：ピルビン酸カルボキシラーゼ、ＧＤＨ：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ。
【図3】各世代の菌を改変してＧＡＢＡを振盪フラスコで生産する場合の生産量である。
【図4】グルタミン酸デカルボキシラーゼの指向性進化方法である。
【図5】ＧＡＤ変異ライブラリーの構築、及びフローサイトメーターＦＡＣＳによる選別試験結果である。
【図6】野生型グルタミン酸デカルボキシラーゼ及び変異体ＧＡＤ ＭＵＴ１２の比酵素活性のアッセイである。
【図7】ＦＦ１０発現グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体（ａ）又はＦＦ１０発現野生型グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｂ）のエンジニアリング細菌を用いて１段階法で発酵させてＧＡＢＡを生産する。
【発明を実施するための形態】
【0103】
培地：
ＣＧＸＩＩ培地：グルコース ５０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ／Ｌ、尿素 ５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １３．３ｍｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ ４２ｇ／Ｌ、ビオチン ０．２ｍｇ／Ｌ、微量元素溶液 １ｍｌ／Ｌを含み、ＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、ここで、微量元素溶液は、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・１Ｈ２Ｏ １０ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ３１３ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌを含む。
発酵培地：グルコース１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．８７ｇ／Ｌ、コーンシロップ３ｍｌ／Ｌ、リン酸０．４ｍｌ／Ｌ、塩化カリウム０．５３ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１２０ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４２ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム６．３ｍｇ／Ｌ、微生物Ｂ１６．３ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５ｍｇ／Ｌ。
ＣＧＸＩＩ培地：グルコース ５０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ／Ｌ、尿素 ５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １３．３ｍｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ ４２ｇ／Ｌ、ビオチン ０．２ｍｇ／Ｌ、微量元素溶液 １ｍｌ／Ｌを含み、ＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、ここで、微量元素溶液は、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・１Ｈ２Ｏ １０ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ３１３ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌを含む。
発酵培地：グルコース１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．８７ｇ／Ｌ、コーンシロップ３ｍｌ／Ｌ、リン酸０．４ｍｌ／Ｌ、塩化カリウム０．５３ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１２０ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４２ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム６．３ｍｇ／Ｌ、微生物Ｂ１６．３ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５ｍｇ／Ｌ。
【0104】
検出方法：
グルタミン酸デカルボキシラーゼの測定：高速液体クロマトグラフィーによりＧＡＢＡ含有量を検出し（方法は２０２０年に開示された論文『Regulation of γ-aminobutyrate (GABA) utilization in Corynebacterium glutamicum by the PucR-type transcriptional regulator GabR and by alternative nitrogen and carbon sources』を参照）、ＧＡＢＡ含有量からグルタミン酸デカルボキシラーゼの酵素活性を算出する。１分あたり１μMのＧＡＢＡを生成するのに必要な酵素量を１酵素活性単位（Ｕ）として定義する。比酵素活性は、タンパク質１ｍｇあたりのグルタミン酸デカルボキシラーゼのＵ量を表す。
グルタミン酸デカルボキシラーゼの測定：高速液体クロマトグラフィーによりＧＡＢＡ含有量を検出し（方法は２０２０年に開示された論文『Regulation of γ-aminobutyrate (GABA) utilization in Corynebacterium glutamicum by the PucR-type transcriptional regulator GabR and by alternative nitrogen and carbon sources』を参照）、ＧＡＢＡ含有量からグルタミン酸デカルボキシラーゼの酵素活性を算出する。１分あたり１μMのＧＡＢＡを生成するのに必要な酵素量を１酵素活性単位（Ｕ）として定義する。比酵素活性は、タンパク質１ｍｇあたりのグルタミン酸デカルボキシラーゼのＵ量を表す。
【0105】
実施例１ ＧＡＢＡバイオセンサーの構築
ＧＡＢＡバイオセンサーの設計：図１に示すように、プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子を含有する。前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子は同一ベクター上又はゲノム上に位置し、前記バイオセンサーを構成し、前記ＰｇａｂＴＤＰは、レポーター遺伝子の発現を調節し、前記ＰｇａｂＲ及びＰｇａｂＴＤＰはＧＡＢＡ－ＧａｂＲコンジュゲート結合部位の配列を有し、レポーター遺伝子の発現を調節し、前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰとプロモーターＰｇａｂＲの転写方向が反対である。前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示され、前記プロモーターＰｇａｂＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示され、前記ｇａｂＲ遺伝子（ｃｇ０５６５）をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示され、前記ＧＡＢＡ－ｇａｂＲコンジュゲート結合部位の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される。
ＧＡＢＡバイオセンサーの作動原理：ＧＡＢＡが調節タンパク質ＧａｂＲに結合され、形成されたコンジュゲートがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される部位に結合され、これにより、プロモーターＰｇａｂＴＤＰは転写を開始させ、レポーター遺伝子の発現を調節する。スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆｇｆｐ）を例にすると、菌株の生育環境でＧＡＢＡが生成されると、ｇａｂＴＤＰプロモーターは転写を開始させ、緑色蛍光タンパク質が生成され、プロモーターＰｇａｂＴＤＰはさまざまな濃度のＧＡＢＡに応答して、さまざまな強度の緑色蛍光タンパク質の発現を調節することができ、蛍光を検出することによりＧＡＢＡ生産量が多い菌株がスクリーニングされる。
ＧＡＢＡバイオセンサーのゲノムでの構築：プロモーターＰｇａｂＲ及びｇａｂＲ遺伝子（ｃｇ０５６５）はコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム上に位置する。Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを骨格、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムをテンプレートとして、ｇａｂＴＤ遺伝子の上下流１０００ ｂｐの相同アームをそれぞれクローニングして、ｓｆｇｆｐ遺伝子とともにΔｇａｂＴＤノックアウトフレームを構築し、ノックアウトフレームとＰｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ骨格をＧｉｂｓｏｎ方法で連結し、Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｇａｂＴＤ：：ｓｆｇｆｐ プラスミドを構築した。次に、Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｇａｂＴＤ：：ｓｆｇｆｐを大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質導入し、検証の結果、正しいプラスミドをＰｋ１８ｍｏｂｓａｃｂ－ΔｇａｂＴＤ：：ｓｆｇｆｐとして命名した。Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｇａｂＴＤ：：ｓｆｇｆｐプラスミドをコンピテントコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２に形質転換した。まず、カナマイシン耐性により選択し、次に、スクロース耐性により選択することにより、２回目の組換えを行った。コロニーＰＣＲによりｓｆｇｆｐがｇａｂＴＤを置き換え、ＧＡＢＡバイオセンサーを含む組換えコリネバクテリウム・グルタミカムが構築されたことを確認し、これをＦＦ１と命名した。
ＧＡＢＡバイオセンサーの設計：図１に示すように、プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子を含有する。前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰ、ＰｇａｂＲ、レポーター遺伝子、ｇａｂＲ遺伝子は同一ベクター上又はゲノム上に位置し、前記バイオセンサーを構成し、前記ＰｇａｂＴＤＰは、レポーター遺伝子の発現を調節し、前記ＰｇａｂＲ及びＰｇａｂＴＤＰはＧＡＢＡ－ＧａｂＲコンジュゲート結合部位の配列を有し、レポーター遺伝子の発現を調節し、前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰとプロモーターＰｇａｂＲの転写方向が反対である。前記プロモーターＰｇａｂＴＤＰをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示され、前記プロモーターＰｇａｂＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示され、前記ｇａｂＲ遺伝子（ｃｇ０５６５）をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示され、前記ＧＡＢＡ－ｇａｂＲコンジュゲート結合部位の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される。
ＧＡＢＡバイオセンサーの作動原理：ＧＡＢＡが調節タンパク質ＧａｂＲに結合され、形成されたコンジュゲートがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される部位に結合され、これにより、プロモーターＰｇａｂＴＤＰは転写を開始させ、レポーター遺伝子の発現を調節する。スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆｇｆｐ）を例にすると、菌株の生育環境でＧＡＢＡが生成されると、ｇａｂＴＤＰプロモーターは転写を開始させ、緑色蛍光タンパク質が生成され、プロモーターＰｇａｂＴＤＰはさまざまな濃度のＧＡＢＡに応答して、さまざまな強度の緑色蛍光タンパク質の発現を調節することができ、蛍光を検出することによりＧＡＢＡ生産量が多い菌株がスクリーニングされる。
ＧＡＢＡバイオセンサーのゲノムでの構築：プロモーターＰｇａｂＲ及びｇａｂＲ遺伝子（ｃｇ０５６５）はコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム上に位置する。Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを骨格、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムをテンプレートとして、ｇａｂＴＤ遺伝子の上下流１０００ ｂｐの相同アームをそれぞれクローニングして、ｓｆｇｆｐ遺伝子とともにΔｇａｂＴＤノックアウトフレームを構築し、ノックアウトフレームとＰｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ骨格をＧｉｂｓｏｎ方法で連結し、Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｇａｂＴＤ：：ｓｆｇｆｐ プラスミドを構築した。次に、Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｇａｂＴＤ：：ｓｆｇｆｐを大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質導入し、検証の結果、正しいプラスミドをＰｋ１８ｍｏｂｓａｃｂ－ΔｇａｂＴＤ：：ｓｆｇｆｐとして命名した。Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｇａｂＴＤ：：ｓｆｇｆｐプラスミドをコンピテントコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２に形質転換した。まず、カナマイシン耐性により選択し、次に、スクロース耐性により選択することにより、２回目の組換えを行った。コロニーＰＣＲによりｓｆｇｆｐがｇａｂＴＤを置き換え、ＧＡＢＡバイオセンサーを含む組換えコリネバクテリウム・グルタミカムが構築されたことを確認し、これをＦＦ１と命名した。
【0106】
実施例２ γ－アミノ酪酸を生産するコリネバクテリウム・グルタミカムのエンジニアリング菌株のシャーシ細胞の構築
図２は、ＧＡＢＡの合成経路及び代謝経路である。その代謝経路及びいくつかの分岐経路をノックアウトして、合成経路におけるいくつかの重要な遺伝子の発現を増強し、γ－アミノ酪酸を合成し得るコリネバクテリウム・グルタミカムを構築した。具体的には、次のとおりである。
（１）組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｐｋｎＧを構築し、セリン／スレオニンキナーゼ ＰｋｎＧをノックアウトし、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＤＨＣ）の活性をさらに低下させ、次に、コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムをテンプレートとし、ｐｋｎＧ遺伝子の上下流１０００ ｂｐの相同アームをそれぞれクローニングし、Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ骨格とＧｉｂｓｏｎ方法で連結し、得た組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｐｋｎＧを実施例１で構築されたＦＦ１に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ１／ΔｐｋｎＧを得て、ＦＦ２と命名した。
（２）アミノトランスフェラーゼＢｉｏＡをノックアウトし、また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の発現を増強し、すなわち、コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムをテンプレートとして、ｂｉｏＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９９９９７．１）の上下流１０００ ｂｐの相同アームをそれぞれクローニングし、プロモーターを含むホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８８９２．１）のコード遺伝子ｐｅｐｃとプロモーターを含むグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋｄ登録番号：ＢＡＢ９９４７２．１）遺伝子ｇｄｈをクローニングし、ｂｉｏＡ遺伝子の上下流の相同アームの間に構築し、Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ骨格とＧｉｂｓｏｎ方法で連結し、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｂｉｏＡ：：ｐｅｐｃ＋ｇｄｈを構築し、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｂｉｏＡ：：ｐｅｐｃ＋ｇｄｈを菌株ＦＦ２コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ２／ΔｂｉｏＡ：：ｐｅｐｃ＋ｇｄｈを得て、ＦＦ３と命名した。
（３）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｇａｂＰ：：ｐｙｃを構築し、ＧＡＢＡの細胞内輸送タンパク質ＧａｂＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９７８７４．１）をノックアウトし、ピルビン酸カルボキシラーゼＰＹＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８０８２．１）の発現を増強し、構築した組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｇａｂＰ：：ｐｙｃをＦＦ３コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ３／ΔｇａｂＰ：：ｐｙｃを得て、ＦＦ４と命名した。
（４）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｐｃｋ：：ｐｌｋを構築し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼＰＣＫ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００２５７．１）をノックアウトし、ピリドキサールキナーゼｐｌｋ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＷＰ＿００３６４１１１２．１）を過剰発現させて、補酵素ＰＬＰの合成を増強し、構築した組換えプラスミドｐＫ１８－Δｐｃｋ：：ｐｌｋをＦＦ４コンピテント細胞に形質転換し、組換え菌株ＦＦ４／Δｐｃｋ：：ｐｌｋを得て、ＦＦ５と命名した。
（５）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－ＰｇｌｔＡｇｌｔＡを構築し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示されるプロモーターＰｇｌｔＡでクエン酸シンターゼＧｌｔＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８２２２．１）の発現を増強し、構築した組換えプラスミドｐＫ１８－ＰｇｌｔＡｇｌｔＡをＦＦ５コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ５ ＰｇｌｔＡｇｌｔＡを得て、ＦＦ６と命名した。
（６）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｏｄｘ：：ｗＲＢＳｏｄｈＡ、ノックアウトオキサロ酢酸デカルボキシラーゼＯＤＸ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８６８３．１）を構築し、弱いＲＢＳを持つケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＯｄｈＡをＯＤＸの位置に置き換え、弱いＲＢＳの配列はＣＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＧであった。組換えプラスミドｐＫ１８－Δｏｄｘ：：ｗＲＢＳｏｄｈＡをＦＦ６コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ６ Δｏｄｘ：：ｗＲＢＳｏｄｈＡを得て、ＦＦ７と命名した。
（７）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｏｄｈＡを構築し、コリネバクテリウム・グルタミカムに固有のケトグルタル酸デヒドロゲナーゼＯｄｈＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８５２２．１）をノックアウトし、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｏｄｈＡをＦＦ７コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ７ ΔｏｄｈＡを得て、ＦＦ８と命名した。
（８）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｌｄｈ：：ｉｃｄを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００３０５．１）をノックアウトし、イソクエン酸デヒドロゲナーゼＩＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８０５７．１）の発現を増強し、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｌｄｈ：：ｉｃｄをＦＦ８コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ８ Δｌｄｈ：：ｉｃｄを得て、ＦＦ９と命名した。
（９）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｌｌｄｄ：：Ｐｔｕｆｇｄｈを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼ２ ＬｌｄＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００３１２．１）をノックアウトし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示されるプロモーターＰｔｕｆでグルタミン酸デヒドロゲナーゼＧＤＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９９４７２．１）の発現を増強し、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｌｌｄｄ：：ＰｔｕｆｇｄｈをＦＦ９コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ９ Δｌｌｄｄ：：Ｐｔｕｆｇｄｈを得て、ＦＦ１０と命名した。
ＣＧＸＩＩ培地を用いて、振盪フラスコ中でＦＦ１～ＦＦ１０をそれぞれ発酵し、接種後の菌株の初期ＯＤを０．２、発酵温度を３０℃、ｐＨを７．０に制御して、７２時間発酵させた。図３に示すように、世代ずつ改良するに伴い、ＧＡＢＡの生産量が増加していき、最終的には、ＦＦ１０の生産量は、初期ＦＦ１の１７倍である９．１８ ｇ／Ｌになった。
図２は、ＧＡＢＡの合成経路及び代謝経路である。その代謝経路及びいくつかの分岐経路をノックアウトして、合成経路におけるいくつかの重要な遺伝子の発現を増強し、γ－アミノ酪酸を合成し得るコリネバクテリウム・グルタミカムを構築した。具体的には、次のとおりである。
（１）組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｐｋｎＧを構築し、セリン／スレオニンキナーゼ ＰｋｎＧをノックアウトし、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＤＨＣ）の活性をさらに低下させ、次に、コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムをテンプレートとし、ｐｋｎＧ遺伝子の上下流１０００ ｂｐの相同アームをそれぞれクローニングし、Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ骨格とＧｉｂｓｏｎ方法で連結し、得た組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｐｋｎＧを実施例１で構築されたＦＦ１に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ１／ΔｐｋｎＧを得て、ＦＦ２と命名した。
（２）アミノトランスフェラーゼＢｉｏＡをノックアウトし、また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の発現を増強し、すなわち、コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムをテンプレートとして、ｂｉｏＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９９９９７．１）の上下流１０００ ｂｐの相同アームをそれぞれクローニングし、プロモーターを含むホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８８９２．１）のコード遺伝子ｐｅｐｃとプロモーターを含むグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋｄ登録番号：ＢＡＢ９９４７２．１）遺伝子ｇｄｈをクローニングし、ｂｉｏＡ遺伝子の上下流の相同アームの間に構築し、Ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ骨格とＧｉｂｓｏｎ方法で連結し、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｂｉｏＡ：：ｐｅｐｃ＋ｇｄｈを構築し、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｂｉｏＡ：：ｐｅｐｃ＋ｇｄｈを菌株ＦＦ２コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ２／ΔｂｉｏＡ：：ｐｅｐｃ＋ｇｄｈを得て、ＦＦ３と命名した。
（３）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｇａｂＰ：：ｐｙｃを構築し、ＧＡＢＡの細胞内輸送タンパク質ＧａｂＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９７８７４．１）をノックアウトし、ピルビン酸カルボキシラーゼＰＹＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８０８２．１）の発現を増強し、構築した組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｇａｂＰ：：ｐｙｃをＦＦ３コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ３／ΔｇａｂＰ：：ｐｙｃを得て、ＦＦ４と命名した。
（４）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｐｃｋ：：ｐｌｋを構築し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼＰＣＫ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００２５７．１）をノックアウトし、ピリドキサールキナーゼｐｌｋ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＷＰ＿００３６４１１１２．１）を過剰発現させて、補酵素ＰＬＰの合成を増強し、構築した組換えプラスミドｐＫ１８－Δｐｃｋ：：ｐｌｋをＦＦ４コンピテント細胞に形質転換し、組換え菌株ＦＦ４／Δｐｃｋ：：ｐｌｋを得て、ＦＦ５と命名した。
（５）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－ＰｇｌｔＡｇｌｔＡを構築し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示されるプロモーターＰｇｌｔＡでクエン酸シンターゼＧｌｔＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８２２２．１）の発現を増強し、構築した組換えプラスミドｐＫ１８－ＰｇｌｔＡｇｌｔＡをＦＦ５コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ５ ＰｇｌｔＡｇｌｔＡを得て、ＦＦ６と命名した。
（６）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｏｄｘ：：ｗＲＢＳｏｄｈＡ、ノックアウトオキサロ酢酸デカルボキシラーゼＯＤＸ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８６８３．１）を構築し、弱いＲＢＳを持つケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＯｄｈＡをＯＤＸの位置に置き換え、弱いＲＢＳの配列はＣＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＧであった。組換えプラスミドｐＫ１８－Δｏｄｘ：：ｗＲＢＳｏｄｈＡをＦＦ６コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ６ Δｏｄｘ：：ｗＲＢＳｏｄｈＡを得て、ＦＦ７と命名した。
（７）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｏｄｈＡを構築し、コリネバクテリウム・グルタミカムに固有のケトグルタル酸デヒドロゲナーゼＯｄｈＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８５２２．１）をノックアウトし、組換えプラスミドｐＫ１８－ΔｏｄｈＡをＦＦ７コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ７ ΔｏｄｈＡを得て、ＦＦ８と命名した。
（８）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｌｄｈ：：ｉｃｄを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００３０５．１）をノックアウトし、イソクエン酸デヒドロゲナーゼＩＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９８０５７．１）の発現を増強し、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｌｄｈ：：ｉｃｄをＦＦ８コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ８ Δｌｄｈ：：ｉｃｄを得て、ＦＦ９と命名した。
（９）上記と同じスキームに従って、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｌｌｄｄ：：Ｐｔｕｆｇｄｈを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼ２ ＬｌｄＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＣ００３１２．１）をノックアウトし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示されるプロモーターＰｔｕｆでグルタミン酸デヒドロゲナーゼＧＤＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＢ９９４７２．１）の発現を増強し、組換えプラスミドｐＫ１８－Δｌｌｄｄ：：ＰｔｕｆｇｄｈをＦＦ９コンピテント細胞に形質転換し、組換えて、菌株ＦＦ９ Δｌｌｄｄ：：Ｐｔｕｆｇｄｈを得て、ＦＦ１０と命名した。
ＣＧＸＩＩ培地を用いて、振盪フラスコ中でＦＦ１～ＦＦ１０をそれぞれ発酵し、接種後の菌株の初期ＯＤを０．２、発酵温度を３０℃、ｐＨを７．０に制御して、７２時間発酵させた。図３に示すように、世代ずつ改良するに伴い、ＧＡＢＡの生産量が増加していき、最終的には、ＦＦ１０の生産量は、初期ＦＦ１の１７倍である９．１８ ｇ／Ｌになった。
【0107】
実施例３ グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体、組換えプラスミド、及び組換え菌の構築
Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法により、ＧＡＤに指向性進化を行い、実施例１で構築したＧＡＢＡバイオセンサーにより、中性ｐＨで活性を有するＧＡＤをスクリーニングした。ＧＡＢＡの細胞内輸送タンパク質ＧａｂＰをノックアウトし、細胞外のＧＡＢＡ濃度が蛍光に与える影響を解消し、生成させた蛍光強度が生産されたＧＡＢＡの濃度を表すようにした。指向性進化方法を図４に示す。
グルタミン酸デカルボキシラーゼの最も好適な遺伝子配列をスクリーニングするために、増幅プライマーを設計した。
GADF: CTTGGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCCATGCCTCAATGGCATCCGCATCGTGA、
GADR: CTACTGCCGCCAGGCAGCGGCCGCTTAATGATGAAATCCATTGTCCTATTTC
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ）ＣＩＣＣ １００５５ゲノムをテンプレートとして、Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法により約２５回の増幅を行い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される野生型グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のランダム変異ライブラリーを得て、増幅産物をＤＮＡ精製キットで精製した後、ＧｉｂｓｏｎによりＥｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法増幅産物及びプラスミドｐＣＥＳ（プラスミドは、論文『Development of a high-copy-number plasmid via adaptive laboratory evolution of Corynebacterium glutamicum』に開示されている）のバックボーン断片を連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、変異プラスミドを構築した。その後、変異プラスミドを、実施例２で構築したＧＡＢＡバイオセンサーを含むコリネバクテリウム・グルタミカムＦＦ５に形質導入し、ＧＡＤ変異ライブラリーを含む菌株ＦＦ５を、ＧＡＢＡ産生に適したＣＧＸＩＩ培地中で、３０℃で３０時間培養した後、緑色蛍光タンパク質シグナルに基づいて、フローサイトメーターＦＡＣＳにより、緑色蛍光効果が最も高い変異菌株をスクリーニングし、高速液体ＨＰＬＣによりＧＡＢＡ生産量を検出し、さらに再スクリーニングして、酵素活性が向上した変異株を特定した。変異株の遺伝子配列について配列解析を行い、ＧＡＢＡの生産量及び変異部位との相関情報を得た。ＧＡＤ変異ライブラリーの構築及びＦＡＣＳ選別試験は図５に示される。ＧＡＤの変異ライブラリーは培養後の蛍光がより強く、しかも、選別によりこれらの強い蛍光の変異体が得られ、このことから、変異ライブラリーを構築し、蛍光が向上したこれらの変異菌株を選別できることが明らかになった。
Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法により、ＧＡＤに指向性進化を行い、実施例１で構築したＧＡＢＡバイオセンサーにより、中性ｐＨで活性を有するＧＡＤをスクリーニングした。ＧＡＢＡの細胞内輸送タンパク質ＧａｂＰをノックアウトし、細胞外のＧＡＢＡ濃度が蛍光に与える影響を解消し、生成させた蛍光強度が生産されたＧＡＢＡの濃度を表すようにした。指向性進化方法を図４に示す。
グルタミン酸デカルボキシラーゼの最も好適な遺伝子配列をスクリーニングするために、増幅プライマーを設計した。
GADF: CTTGGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCCATGCCTCAATGGCATCCGCATCGTGA、
GADR: CTACTGCCGCCAGGCAGCGGCCGCTTAATGATGAAATCCATTGTCCTATTTC
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ）ＣＩＣＣ １００５５ゲノムをテンプレートとして、Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法により約２５回の増幅を行い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される野生型グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のランダム変異ライブラリーを得て、増幅産物をＤＮＡ精製キットで精製した後、ＧｉｂｓｏｎによりＥｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法増幅産物及びプラスミドｐＣＥＳ（プラスミドは、論文『Development of a high-copy-number plasmid via adaptive laboratory evolution of Corynebacterium glutamicum』に開示されている）のバックボーン断片を連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、変異プラスミドを構築した。その後、変異プラスミドを、実施例２で構築したＧＡＢＡバイオセンサーを含むコリネバクテリウム・グルタミカムＦＦ５に形質導入し、ＧＡＤ変異ライブラリーを含む菌株ＦＦ５を、ＧＡＢＡ産生に適したＣＧＸＩＩ培地中で、３０℃で３０時間培養した後、緑色蛍光タンパク質シグナルに基づいて、フローサイトメーターＦＡＣＳにより、緑色蛍光効果が最も高い変異菌株をスクリーニングし、高速液体ＨＰＬＣによりＧＡＢＡ生産量を検出し、さらに再スクリーニングして、酵素活性が向上した変異株を特定した。変異株の遺伝子配列について配列解析を行い、ＧＡＢＡの生産量及び変異部位との相関情報を得た。ＧＡＤ変異ライブラリーの構築及びＦＡＣＳ選別試験は図５に示される。ＧＡＤの変異ライブラリーは培養後の蛍光がより強く、しかも、選別によりこれらの強い蛍光の変異体が得られ、このことから、変異ライブラリーを構築し、蛍光が向上したこれらの変異菌株を選別できることが明らかになった。
【0108】
実施例４ グルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体の試験
実施例３で構築したＧＡＤ変異体を含む組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを、１０ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムが添加されたＣＧＸＩＩ培地を含む振盪フラスコにおいて、ｐＨ７．０、３０℃で４０時間振盪培養した後、ＧＡＢＡの生産量を検出した。ＦＦ１において野生型ＧＡＤ（ＧＡＤ ＷＴ）を発現させた菌株を対照とし、その結果、表１に示すように、野生型グルタミン酸デカルボキシラーゼを発現させた組換え菌は、ＧＡＢＡ生産量が極めて低く、一方、変異体は、このような条件で、すべてより多くのＧＡＢＡを産生することができ、その中でも、第３８位、５１位、６８位、８９位、９２位、９３位、９６位、１１８位、１２０位、１２１位、１５３位、１８６位、２０２位、２０６位、２６８位、２９４位、３０１位、３５５位、３７１位、４３２位、４３６位、４５１位、４５７位、４５９位、４６１位又は４６７位のうちの１つ又は複数の変異を持つ変異体は、いずれもＧＡＢＡ含有量が野生型ＧＡＤよりも上昇し、複数の部位変異を持つ変異体ＧＡＤ ＭＵＴ １２８（アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される）は、生産量が高く、野生型の３６倍である５．１２ｇ／Ｌになった。
ＧＡＤ変異体ＧＡＤ ＭＵＴ１２８をｐＥＴプラスミドに再度構築し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、ＬＢ培地にて３７℃で振盪培養した。ＯＤ６００が０．６～０．８に達すると、最終濃度０．２ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて遺伝子発現を誘導した。２５℃で８時間誘導後、遠心分離により細胞を収集した。収集した細胞を結合バッファ（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ［ｐＨ ７．８］、５００ ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ ｍＭイミダゾール）に再懸濁させ、次に、超音波で破砕した。破砕した上清を収集し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによりＧＡＤを精製した。精製後のタンパク質を ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５－ｍｌ脱塩カラムで脱塩した。ラウリル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によりタンパク質の精製品質を検出した。ウシ血清アルブミンを基準にして、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質の濃度を測定した。精製後、グルタミン酸を基質、ＰＬＰを補酵素として、ｐＨ７．０の条件下でＧＡＤの活性を測定した。酵素を添加することで反応を開始させ、水素化ナトリウムを添加することで反応を終了し、対応するＧＡＢＡの生産量を検出した。その結果、表１及び図６に示すように、グルタミン酸デカルボキシラーゼ野生型（ＧＡＤ ＷＴ）は、ｐＨ７．０の条件下で比酵素活性が０．８４ Ｕ／ｍｇであり、一方、本発明で構築されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体Ｄ３８Ｎ／Ｉ８９Ｖ／Ｄ９２Ｎ／Ｅ９３Ｑ／Ｓ１５３Ｔ／Ｄ２０２Ｎ／Ｐ２６８Ｔ／Ｅ２９４Ｒ／Ｄ３０１Ｎ／Ｆ３５５Ｙ／Ｄ４３２Ｎ／Ｈ４３５Ｑ／Ｌ４５１＊（ＧＡＤ ＭＵＴ１２８）は、比酵素活性が１０．２９ Ｕ／ｍｇで、野生型と比べて１２．２５倍向上した。
実施例３で構築したＧＡＤ変異体を含む組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを、１０ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムが添加されたＣＧＸＩＩ培地を含む振盪フラスコにおいて、ｐＨ７．０、３０℃で４０時間振盪培養した後、ＧＡＢＡの生産量を検出した。ＦＦ１において野生型ＧＡＤ（ＧＡＤ ＷＴ）を発現させた菌株を対照とし、その結果、表１に示すように、野生型グルタミン酸デカルボキシラーゼを発現させた組換え菌は、ＧＡＢＡ生産量が極めて低く、一方、変異体は、このような条件で、すべてより多くのＧＡＢＡを産生することができ、その中でも、第３８位、５１位、６８位、８９位、９２位、９３位、９６位、１１８位、１２０位、１２１位、１５３位、１８６位、２０２位、２０６位、２６８位、２９４位、３０１位、３５５位、３７１位、４３２位、４３６位、４５１位、４５７位、４５９位、４６１位又は４６７位のうちの１つ又は複数の変異を持つ変異体は、いずれもＧＡＢＡ含有量が野生型ＧＡＤよりも上昇し、複数の部位変異を持つ変異体ＧＡＤ ＭＵＴ １２８（アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される）は、生産量が高く、野生型の３６倍である５．１２ｇ／Ｌになった。
【0109】
実施例５ コリネバクテリウム・グルタミカムのエンジニアリング菌株を用いた発酵によるγ－アミノ酪酸生産
実施例３のスキームに従って得られた、変異体ＭＵＴ１２８コード配列を持つ発現ベクターｐＣＥＳ－ＧＡＤ ＭＵＴ１２を、実施例２で構築されたコリネバクテリウム・グルタミカムのエンジニアリング菌株ＦＦ１０に形質転換し、グルコースを１段階法で発酵させてγ－アミノ酪酸を生産した。菌株ＦＦ１０においてグルタミン酸デカルボキシラーゼ野生型（ＧＡＤ ＷＴ）を発現させた菌株を対照とした。
菌株ＦＦ１０ ｐＣＥＳ－ＧＡＤ ＭＵＴ１２をＢＨＩＳ培地、３０℃で２４時間培養して、シード液を得た。発酵培地５００ｍＬを１Ｌ発酵槽に加え、１０％の播種率で発酵タンクに播種し、発酵温度を３０℃、溶存酸素を３０％にして、アンモニア水を用いてｐＨを７．０±０．２に調整した。
グルタミン酸デカルボキシラーゼ野生型（ＧＡＤ ＷＴ）を対照として、２段階法で発酵させ、まず、発酵培地にて初期ｐＨ７．０で発酵させて、グルタミン酸を生産し、発酵が７６時間進んだ後、ｐＨが５．５に下がり、１６８ｈまでは、発酵により２７ｇ／ＬのＧＡＢＡが生産された。図７に示すように、ＦＦ１０を宿主としてグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体（ＧＡＤ ＭＵＴ１２）を発現させた菌株で１６８時間発酵させた場合、ＧＡＢＡの生産量は対照菌株の４．２倍を超える１１４ｇ／Ｌに達し、現在までに報告された最大値でもある。
実施例３のスキームに従って得られた、変異体ＭＵＴ１２８コード配列を持つ発現ベクターｐＣＥＳ－ＧＡＤ ＭＵＴ１２を、実施例２で構築されたコリネバクテリウム・グルタミカムのエンジニアリング菌株ＦＦ１０に形質転換し、グルコースを１段階法で発酵させてγ－アミノ酪酸を生産した。菌株ＦＦ１０においてグルタミン酸デカルボキシラーゼ野生型（ＧＡＤ ＷＴ）を発現させた菌株を対照とした。
菌株ＦＦ１０ ｐＣＥＳ－ＧＡＤ ＭＵＴ１２をＢＨＩＳ培地、３０℃で２４時間培養して、シード液を得た。発酵培地５００ｍＬを１Ｌ発酵槽に加え、１０％の播種率で発酵タンクに播種し、発酵温度を３０℃、溶存酸素を３０％にして、アンモニア水を用いてｐＨを７．０±０．２に調整した。
グルタミン酸デカルボキシラーゼ野生型（ＧＡＤ ＷＴ）を対照として、２段階法で発酵させ、まず、発酵培地にて初期ｐＨ７．０で発酵させて、グルタミン酸を生産し、発酵が７６時間進んだ後、ｐＨが５．５に下がり、１６８ｈまでは、発酵により２７ｇ／ＬのＧＡＢＡが生産された。図７に示すように、ＦＦ１０を宿主としてグルタミン酸デカルボキシラーゼ変異体（ＧＡＤ ＭＵＴ１２）を発現させた菌株で１６８時間発酵させた場合、ＧＡＢＡの生産量は対照菌株の４．２倍を超える１１４ｇ／Ｌに達し、現在までに報告された最大値でもある。
【0110】
本発明は好適な実施例を以上のように開示したが、これらは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、さまざまな変更や修正を行うことができ、よって、本発明の特許範囲は特許請求の範囲により定められる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】