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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】核酸を検出するための導電率センサ及びその検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/04 20060101AFI20240711BHJP
C12Q 1/6825 20180101ALI20240711BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20240711BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240711BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
G01N27/04 Z ZNA
C12Q1/6825 Z
C12Q1/6827 Z
C12M1/00 A
C12M1/34 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579370
(86)(22)【出願日】2022-06-23
(85)【翻訳文提出日】2024-02-22
(86)【国際出願番号】 AU2022050637
(87)【国際公開番号】W WO2022266714
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】2021901896
(32)【優先日】2021-06-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517333347
【氏名又は名称】ロイヤル メルボルン インスティチュート オブ テクノロジー
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＹＡＬ ＭＥＬＢＯＵＲＮＥ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
【住所又は居所原語表記】１２４ Ｌａ Ｔｒｏｂｅ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ ３０００，Ａｕｓｔｒａｌｉａ
(71)【出願人】
【識別番号】521197450
【氏名又は名称】ピーター・マッカラム・キャンサー・インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アハメド，タイムール
(72)【発明者】
【氏名】ペレラ，ガンガナート
(72)【発明者】
【氏名】ワリア，スミート
(72)【発明者】
【氏名】バースカラン，マドゥー
(72)【発明者】
【氏名】スリラム，シャラート
(72)【発明者】
【氏名】フォックス，ステファン
(72)【発明者】
【氏名】フェローズ，アンドリュー
【テーマコード（参考）】
2G060
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G060AA07
2G060AA19
2G060AD06
2G060AE17
2G060AF08
2G060AG10
2G060AG15
2G060KA10
4B029BB20
4B029CC07
4B029FA01
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ41
4B063QR82
4B063QS34
4B063QX04
(57)【要約】
本発明は、核酸を検出するためのセンサであって、基板と、互いに離間して対向する関係で基板上に配置された一対の端子電極と、一対の端子電極の間にあり、一対の端子電極と電気的に接触しているセンサ素子とを備え、センサ素子が、（ｉ）基板の半導体部分であって、端子電極間の導電路が半導体部分を貫通する、半導体部分と、（ｉｉ）半導体部分の表面上のオリゴヌクレオチドであって、検出される核酸に相補的である、オリゴヌクレオチドとを含み、核酸とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションがセンサの抵抗の変化をもたらす、センサを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸を検出するためのセンサであって、基板と、
互いに離間して対向する関係で前記基板上に配置された一対の端子電極と、
前記一対の端子電極の間にあり、前記一対の端子電極と電気的に接触しているセンサ素子とを備え、前記センサ素子が、
（ｉ）前記基板の半導体部分であって、前記端子電極間の導電路が前記半導体部分を貫通する、半導体部分と、
（ｉｉ）前記半導体部分の表面上のオリゴヌクレオチドであって、検出される前記核酸に相補的である、オリゴヌクレオチドと
を含み、
前記核酸と前記オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが前記センサの抵抗の変化をもたらす、センサ。
【請求項2】
前記半導体部分が、１００オーム・ｃｍよりも大きい抵抗率を有する、請求項１に記載のセンサ。
【請求項3】
前記半導体部分が、約５００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する、請求項１又は２に記載のセンサ。
【請求項4】
前記半導体部分が、約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項5】
前記半導体部分が、高抵抗率非酸化物半導体を含む、請求項１に記載のセンサ。
【請求項6】
前記非酸化物半導体が、１００オーム・ｃｍよりも大きい抵抗率を有する、請求項５に記載のセンサ。
【請求項7】
前記非酸化物半導体が、約５００オーム・ｃｍから約５０，０００オーム・ｃｍの範囲、好ましくは約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する、請求項５又は請求項６に記載のセンサ。
【請求項8】
約１０キロオームから約１００００キロオームの範囲の電気抵抗を有する、請求項５から７のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項9】
前記非酸化物半導体が、元素半導体及び化合物半導体からなる群から選択され、好ましくは元素半導体である、請求項５から８のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項10】
前記非酸化物半導体が、シリコン半導体である、請求項５から９のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項11】
前記シリコン半導体が、真性シリコン半導体である、請求項１０に記載のセンサ。
【請求項12】
前記シリコン半導体が、フロートゾーンシリコン半導体である、請求項１０又は請求項１１に記載のセンサ。
【請求項13】
前記基板が、その一体部分として前記半導体部分を含む、請求項５から１１のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項14】
前記基板が、前記非酸化物半導体のウェハである、請求項１３に記載のセンサ。
【請求項15】
前記半導体部分が、酸素欠損金属酸化物を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項16】
前記酸素欠損金属酸化物が、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化ストロンチウムチタン（ＳＴＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、及び二酸化チタン（ＴｉＯ２）からなる群から選択される、請求項１５に記載のセンサ。
【請求項17】
前記酸素欠損金属酸化物の層が、酸素欠損酸化亜鉛である、請求項１５又は１６に記載のセンサ。
【請求項18】
前記オリゴヌクレオチドが、前記半導体部分に化学的に結合している、請求項１から１７のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項19】
前記オリゴヌクレオチドが、（ｉ）エポキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基及びヒドロキシ基からなる群から選択される末端官能基を有するシラン化剤で前記半導体部分をシラン化すること、及び（ｉｉ）オリゴヌクレオチドを前記末端官能基と反応させることを含むプロセスによって、前記半導体部分に化学的に結合される、請求項１８に記載のセンサ。
【請求項20】
前記シラン化剤が、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＴＳ）、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、及びＮ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＳ）からなる群から選択される、請求項１９に記載のセンサ。
【請求項21】
前記オリゴヌクレオチドが、天然のＤＮＡ配列に対する単一点突然変異を有する核酸に相補的である、請求項１から２０のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項22】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端を介して前記半導体部分の表面に付着している、請求項１から２１のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項23】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端を介して前記半導体部分の表面に付着している、請求項１から２１のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項24】
前記オリゴヌクレオチドがＢＲＡＦオリゴヌクレオチドである、請求項１から２３のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項25】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１又は配列番号２である、請求項１から２３のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項26】
核酸を検出するための方法であって、（ａ）請求項１から２５のいずれか一項に記載のセンサのセンサ素子を核酸を含み得る物質と接触させる工程と、
（ｂ）前記センサの抵抗に対応する前記センサの電気化学パラメータを測定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で測定された電気化学パラメータに基づいて前記センサ素子上の核酸の有無を検出する工程と
を含む方法。
【請求項27】
前記センサの電気化学パラメータを測定することが、（ｉ）前記センサの両端間に電圧を印加すること、及び（ｉｉ）前記センサを通る電流フローを測定することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記核酸配列の有無を検出することが、前記電気化学パラメータを前記センサのそのパラメータの基準値と比較することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記センサを試料溶液と１分から６０分の時間接触させる、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記センサを前記試料溶液と１分から１０分の時間接触させる、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記オリゴヌクレオチドが、天然のＤＮＡ配列に対する単一点突然変異を有する核酸に相補的である、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端を介して前記センサ素子の表面に付着している、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端を介して前記センサ素子の表面に付着している、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記オリゴヌクレオチドが、ＢＲＡＦオリゴヌクレオチドである、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１又は配列番号２である、請求項２６から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
核酸を検出するためのセンサを製造する方法であって、ａ．半導体部分を含む基板を用意する工程と、
ｂ．互いに離間して対向する関係にある一対の端子電極を前記基板上に作製する工程であって、前記基板の前記半導体部分が前記端子電極間に配置されて前記端子電極と電気的に接触し、前記端子電極間の導電路が前記半導体部分を貫通する、工程と、
ｃ．前記半導体部分の表面に、検出される前記核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを固定化し、それにより、（ｉ）前記半導体部分及び（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドを含むセンサ素子を作製する工程と
を含む、方法。
【請求項37】
前記半導体部分が、１００オーム・ｃｍよりも大きい抵抗率を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記半導体部分が、約５００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する、請求項３６又は３７に記載のセンサ。
【請求項39】
前記半導体部分が、約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する、請求項３６から３８のいずれか一項に記載のセンサ。
【請求項40】
前記半導体部分が、高抵抗率非酸化物半導体を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項41】
前記非酸化物半導体が、１００オーム・ｃｍよりも大きい抵抗率を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記非酸化物半導体が、約５００オーム・ｃｍから約５０，０００オーム・ｃｍの範囲、好ましくは約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記センサが、約１０キロオームから約１００００キロオームの範囲の電気抵抗を有する、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記非酸化物半導体が、元素半導体及び化合物半導体からなる群から選択され、好ましくは元素半導体である、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記非酸化物半導体が、シリコン半導体である、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記シリコン半導体が、真性シリコン半導体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記シリコン半導体が、フロートゾーンシリコン半導体である、請求項４５又は請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記基板が、その一体部分として前記半導体部分を含む、請求項３６から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記基板が、前記非酸化物半導体のウェハである、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記半導体部分が、酸素欠損金属酸化物を含む、請求項３６から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記酸素欠損金属酸化物が、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化ストロンチウムチタン（ＳＴＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、及び二酸化チタン（ＴｉＯ２）からなる群から選択される、請求項５０に記載のセンサ。
【請求項52】
前記酸素欠損金属酸化物の層が、酸素欠損酸化亜鉛である、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項53】
前記オリゴヌクレオチドが、前記半導体部分に化学的に結合している、請求項３６から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記オリゴヌクレオチドが、（ｉ）エポキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基及びヒドロキシ基からなる群から選択される末端官能基を有するシラン化剤で前記半導体部分をシラン化すること、及び（ｉｉ）オリゴヌクレオチドを前記末端官能基と反応させることを含むプロセスによって、前記半導体部分に化学的に結合される、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記シラン化剤が、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＴＳ）、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、及びＮ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＳ）からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記オリゴヌクレオチドが、天然のＤＮＡ配列に対する単一点突然変異を有する核酸配列に相補的である、請求項３６から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端を介して前記半導体部分の表面に付着している、請求項３６から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端を介して前記半導体部分の表面に付着している、請求項３６から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記オリゴヌクレオチドが、ＢＲＡＦオリゴヌクレオチドである、請求項３６から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１又は配列番号２である、請求項３６から５９のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、センサに関し、特に、流体中の核酸配列を検出するための導電率センサ及びそのようなセンサを用いて核酸を検出するための方法に関する。本発明は、主に、体液又は組織などの試料の中の核酸の検出、及び試料に由来する核酸の検出に使用するために開発されており、この例示的な用途を参照して以下に説明される。
【0002】
本発明の背景の以下の議論は、本発明の理解を容易にすることを意図している。ただし、当然のことながら、その議論は、言及された内容のいずれかが、本明細書の特許請求の範囲のいずれか１つの優先日に、オーストラリア又は他の国において公開された、又は公知の、又は共通の一般知識の一部であったことを肯定又は承認するものではない。
【背景技術】
【0003】
目的の異なる核酸を正確に検出する能力は、広範囲の技術分野で応用されているが、医療診断及び治療に使用されるセンサにおいて特に重要である。例えば、これは、個体から得られた試料中の特定の核酸配列の存在が、癌などの疾患に罹患している個体につながる個体における遺伝子突然変異を示す用途を見出す。これは、天然の核酸（例えば、ＲＮＡ及びサブタイプ、ＤＮＡ、メチル化タイプ）と疾患に罹患している個体の核酸との間の差が核酸中の単一点突然変異である場合及び／又は個体中の核酸の変化に基づいて適切な治療が決定される場合に特に重要である。
【0004】
このタイプの疾患の例は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ単一塩基変異体を有する黒色腫である。黒色腫は一般的な皮膚癌であり、末期に特定された場合に死亡率が高い（オーストラリアでは年間約１７００人が死亡）世界的な健康上の憂慮事項である。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅは、黒色腫における一般的な発癌点変異（約４０％）であり、抗ＢＲＡＦ標的療法には同定が必要である。特定の治療は突然変異を標的とするが、他の方法では効果がない場合に、核酸のこのような微かな変化を同定する能力は不可欠である。これらの内科的疾患を有する患者の予後不良を考えると、正しい治療にアクセスすることは、死亡率を改善するために不可欠である。診断、予後及び治療上重要な核酸の変化／突然変異の他の例は複数ある。
【0005】
突然変異を検出する能力などの特定の核酸を検出することの利益を前提として、これらの分野では重要な研究が行われてきた。したがって、黒色腫におけるＢＲＡＦ Ｖ６００ＥなどのＤＮＡ中の突然変異を検出するために、広範囲の従来のＰＣＲベースの技術、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、高分解能融解ＰＣＲ、並びにサンガー及び次世代シークエンシングなどのＰＣＲクランピング及びシークエンシングが広く使用されている。残念なことに、従来の突然変異ＤＮＡ検出方法は、癌同定技術として使用される場合、試料の調製や、試料の取り扱い、操作及びデータ分析の複雑さに大いに悩まされる。更に、試験は非常に時間がかかり、面倒であり、高価である。
【0006】
例えば、従来のＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型ＤＮＡ検出技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術、及び従来のサンガー及びより最近の次世代シーケンシングなどのシーケンスベースアプローチが含まれる。
【0007】
これらの従来の方法は、少なくとも以下の一般的な欠点、（ｉ）特定の技術的技能及び知識の必要性、（ｉｉ）高価でかさばる装置及び試験コスト、（ｉｉｉ）偽陽性／陰性結果をもたらす試料汚染に対する過度の負担、（ｉｖ）複雑で時間のかかる試料調製方法（数時間から数日までさまざま）、及び（ｖ）試料の取り扱い、機器の準備及び操作における実験条件の慎重な制御の必要性、を伴う。
【0008】
別法として、核酸中の点突然変異などの突然変異を検出するための光学センサが提案されており、蛍光分光法、表面増強ラマン分光法、発光分光法、及び表面プラズモン共鳴分光法などの検出方法が利用されている。核酸配列における点突然変異検出のためのこれらの光学センサは、以下の制約、すなわち、（ｉ）かさばる測定用機器の必要性、（ｉｉ）目的のバイオマーカーを検出するための適切な光学活性タグ／標識の必要性（例えば、蛍光分光法）、（ｉｉｉ）感受性の欠如につながる標的バイオマーカーとバックグラウンド成分の光学バンドの密接な重複、（ｉｖ）検出（例えば、表面増強ラマン分光法及び表面プラズモン分光法）のためにナノ粒子の細胞傷害性をもたらし得るナノ粒子の必要性、（ｖ）光安定性の限界及び認識能力の喪失、（ｖｉ）ｐＨ、温度、及び酸素レベルなどの要因による干渉に対する感受性、という制約を受ける。
【0009】
核酸配列中の点突然変異などの突然変異の検出のための電気化学センサもこれまでに提案されており、アンペロメトリ、ボルタンメトリ（サイクリック、方形波、差動パルス）、電界効果トランジスタ、及び電気化学インピーダンス分光法などの検出方法を利用してきた。
【0010】
核酸配列における点突然変異検出などの突然変異の検出のためのこれらの電気化学センサは、以下の欠点を有する。（ｉ）従来の電気化学的方法は、複雑な検出技術（例えば、電気化学インピーダンス分光法及び電界効果トランジスタ）を必要とするが、本発明では、単純な導電率測定検出方法を使用する。（ｉｉ）電界効果トランジスタ及びサイクリックボルタンメトリーなどの電気化学的方法は、高い電力消費につながる複数の電極を必要とするが、本発明では、２つの端子電極を使用して電力消費が少ない。（ｉｉｉ）いくつかの電気化学的方法は、特定の材料及び複雑なセンサ製造方法（例えば、ナノ材料関連センサプラットフォーム）を利用する。（ｉｖ）いくつかの電気化学技術は、シグナル増幅のために特定の酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を必要とし、シグナル生成のために特定のレドックス対（例えば、アンペロメトリ）を必要とするが、本発明では、検出のためにこれらの材料を必要としない。
【0011】
したがって、突然変異を含むＤＮＡ配列などの核酸の検出を可能にする方法を開発することが望ましいにもかかわらず、この結果を達成するためのさらなる方法が依然として必要である。
【0012】
本発明は、試料中の核酸のレベルを検出及び／又は定量するのに使用するためのセンサ、並びに変化した核酸のレベルを検出及び／又は定量するための方法を提供しようとするものであり、これは先行技術の欠点の少なくともいくつかを克服するか、又は実質的に改善するか、又は少なくとも有用な代替物を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明の第１の態様によれば、核酸を検出するためのセンサであって、基板と、互いに離間して対向する関係で基板上に配置された一対の端子電極と、一対の端子電極の間にあり、一対の端子電極と電気的に接触しているセンサ素子とを備え、センサ素子が、（ｉ）基板の半導体部分であって、端子電極間の導電路が半導体部分を貫通する、半導体部分と、（ｉｉ）半導体部分の表面上のオリゴヌクレオチドであって、検出される核酸に相補的である、オリゴヌクレオチドとを含み、核酸とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションがセンサの抵抗の変化をもたらす、センサが提供される。
【0014】
センサ素子の一部を形成する基板の半導体部分は、多くの形態をとることができる。一実施形態では、半導体部分は、高抵抗率非酸化物半導体を含む。一実施形態では、半導体部分は、酸素欠損金属酸化物を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、半導体部分は、１００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、２００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、５００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、１０００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、２０００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、５０００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。
【0016】
いくつかの実施形態では、半導体部分は、約５００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、約１０００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、約５０００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。
【0017】
いくつかの実施形態では、半導体部分は、高抵抗率非酸化物半導体を含む。いくつかの実施形態では、非酸化物半導体は、１００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、非酸化物半導体は、約５００オーム・ｃｍから約５０，０００オーム・ｃｍの範囲、又は約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。
【0018】
いくつかの実施形態では、センサは、約１０キロオームから約１００００キロオームの範囲の電気抵抗を有する。
【0019】
いくつかの実施形態では、非酸化物半導体は、元素半導体及び化合物半導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非酸化物半導体は元素半導体である。
【0020】
いくつかの実施形態では、非酸化物半導体はシリコン半導体である。シリコン半導体は、真性シリコン半導体であってもよい。シリコン半導体は、フロートゾーン型のシリコン半導体であってもよい。
【0021】
いくつかの実施形態では、基板は、その一体部分として半導体部分を含む。基板は、非酸化物半導体のウェハであってもよい。
【0022】
別の実施形態では、半導体部分は、酸素欠損金属酸化物を含む。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、約５００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、約１０００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、約５０００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。
【0023】
いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化ストロンチウムチタン（ＳＴＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、及び二酸化チタン（ＴｉＯ２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物層は、酸素欠損酸化亜鉛である。
【0024】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、シラン化剤の残基であり得る有機リンカーによって、半導体部分に化学的に結合している。オリゴヌクレオチドは、（ｉ）非酸化物半導体を、エポキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基及びヒドロキシ基からなる群から選択される末端官能基を有するシラン化剤でシラン化すること、及び（ｉｉ）オリゴヌクレオチドを含む前駆体を末端官能基と反応させることを含むプロセスによって、半導体層に化学的に結合され得る。シラン化剤は、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＴＳ）、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、及びＮ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＳ）からなる群から選択される。
【0025】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のＤＮＡ配列に対する単一点突然変異を有する核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のＤＮＡ配列に対して挿入又は欠失突然変異を有する核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端を介して半導体部分の表面に付着している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端を介して半導体部分の表面に付着している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－β－Ｄ－リボフラノシルヌクレオチド単量体単位、すなわち、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ，Ｂ．，Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．，ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）：ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１３２３３－１３２４１（２００４）。
【0026】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の配列に相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ配列に相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、薬理遺伝学的遺伝子の変異体に相補的である。
【0027】
センサは、好適には導電率センサである。したがって、センサは、端子電極間に電圧を印加し、センサの導電路を通る電流フローを測定するための装置を備えることができる。この装置は、好適にはポテンショスタットであってもよい。したがって、実施形態では、センサは電界効果トランジスタではない。
【0028】
本発明の第２の態様によれば、核酸を検出するための方法であって、（ａ）本発明のセンサのセンサ素子を核酸を含み得る物質と接触させる工程と、（ｂ）センサの抵抗に対応するセンサの電気化学パラメータを測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で測定された電気化学パラメータに基づいてセンサ素子上の核酸の有無を検出する工程とを含む方法が提供される。
【0029】
本出願人らは、核酸とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションがセンサの抵抗の変化をもたらすことを見出した。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、標的核酸のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって引き起こされる電気的環境の変化に起因すると考えられる。測定され得るいくつかの異なるパラメータがある。一実施形態では、センサの電気化学パラメータを測定することは、（ｉ）センサの両端間に電圧を印加すること、及び（ｉｉ）センサを通る電流フローを測定することを含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、センサの電気化学パラメータを測定することは、（ｉ）センサの両端間に電圧を印加すること、及び（ｉｉ）センサを通る電流フローを測定することを含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、核酸の有無を検出することは、工程ｂ）で測定された電気化学パラメータをセンサのそのパラメータの基準値と比較することを含む。いくつかの実施形態では、センサの基準抵抗に対するセンサの抵抗の増加は、センサ上の核酸、したがって試料中の核酸の存在を示す。
【0032】
いくつかの実施形態では、物質は、組織及び／又は体液から抽出された核酸からの試料溶液である。
【0033】
本発明の第３の態様によれば、核酸を検出するためのセンサを製造する方法であって、半導体部分を含む基板を用意する工程と、互いに離間して対向する関係にある一対の端子電極を基板上に作製する工程であって、基板の半導体部分が端子電極間に配置されて端子電極と電気的に接触し、端子電極間の導電路が半導体部分を貫通する、工程と、半導体部分の表面に、検出される核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを固定化し、それにより、（ｉ）半導体部分及び（ｉｉ）オリゴヌクレオチドを含むセンサ素子を作製する工程とを含む方法が提供される。
【0034】
本発明の他の態様も開示される。
【0035】
本発明の範囲内にあり得る他の形態にもかかわらず、本発明の好ましい実施形態は、ここでは添付の図面を参照して単なる例として説明される。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】図１は、本発明の特定の実施形態による核酸を検出するための導電率センサの一実施形態の概略図を示し、センサは、半導体部分の表面に固定化されたオリゴヌクレオチドを有するセンサ基板の半導体部分を含むセンサ素子を有し、オリゴヌクレオチドは、検出される核酸配列に相補的である。
【発明を実施するための形態】
【0037】
配列識別子の概要
【表1】
【0038】
ＢＲＡＦ ３’－アミンＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１）
（５’－ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴ／３ＡｍＭＯ／－３’）
（５’－ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴ／３ＡｍＭＯ／－３’）
【0039】
ＢＲＡＦ ５’－アミンＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号２）
（５’－／ＡｍＭＣ６／ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴ－３’）
（５’－／ＡｍＭＣ６／ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴ－３’）
【0040】
本発明は、核酸を検出するための導電率センサに関する。センサは、基板と、基板上に相互に離間して対向する関係で配置された一対の端子電極と、一対の端子電極の間に配置され、一対の端子電極と電気的に接触するセンサ素子とを備える。センサ素子は、（ｉ）基板の半導体部分と、（ｉｉ）半導体部分の表面上の１つ又は複数のオリゴヌクレオチドであって、検出される核酸に相補的なオリゴヌクレオチドとを含む。端子電極間の電気的な導電路は、半導体部分を貫通している。使用時に、オリゴヌクレオチドへの核酸配列の結合は、センサの電気抵抗の変化を引き起こす。理論に拘束されることを望むものではないが、オリゴヌクレオチドへの核酸配列の結合は、センサ上の電子密度の変化をもたらし、ひいてはセンサの抵抗の変化をもたらすと考えられる。したがって、抵抗の増加は、センサの抵抗に対応するセンサの電気化学パラメータを測定することによって調べることができる。例えば、抵抗は、センサの両端間に電圧が印加されたときの電流応答を測定することができ、したがって、核酸の有無及び／又は濃度を検出することができる。一実施形態では、試料中の目的の核酸の存在は、センサを試料とインキュベーションした後のセンサの抵抗の増加によって示される。更に別の実施形態では、試料中の目的の核酸の存在は、センサを試料とインキュベーションした後のセンサの抵抗の増加によって示されるが、天然配列とのインキュベーションは抵抗の減少をもたらした。
【0041】
したがって、本発明のセンサは、試料中、例えば、流体中の潜在的な核酸の範囲を検出するための導電率検出技術を使用する。例示的な流体の例としては、ヒトの唾液、血液、血漿、間質液、脳脊髄液、涙及び／又は汗などの体液、あるいは、個々の人の内科的疾患又は他の特徴の予後診断／治療のために、また薬理ゲノミクスのために組織から抽出された核酸が挙げられる。センサを使用して、呼吸エアロゾル液滴又は換気システムなどの気体試料中の核酸を検出することもできる。以下でより詳細に説明するように、導電率センサは、単純で比較的容易に製造することができるデバイス構造を有し、これは、特殊な基板を必要とするか、又はその精度を制限する検出技術を採用するかのいずれかである従来の非侵襲的センサに対して費用効果の高い代替手段を提供する。
【0042】
以下は、試料中、例えば、流体中のある範囲の核酸のレベルを検出するための非侵襲的導電率センサ及びその適用方法の詳細な説明である。以下の説明では、異なる実施形態における同様の又は同じ参照番号は、同じ又は同様の特徴を示すことに留意されたい。
【0043】
センサ
一形態では、図１の概略図に示すように、センサ１００は、基板１０２と、基板上に互いに離間して対向する関係で配置された一対の端子電極１０４、１０６と、端子電極１０４、１０６の間にあり、端子電極と電気的に接触するセンサ素子１０８とを備える。センサ素子１０８は、半導体材料１１２を含む半導体部分１１０と、半導体部分１１０の表面１１６上のオリゴヌクレオチド１１４とを含む。端子電極１０４と端子電極１０６との間の導電路１２０は、半導体部分１１０を貫通し、ひいては半導体材料１１２を貫通している。
一形態では、図１の概略図に示すように、センサ１００は、基板１０２と、基板上に互いに離間して対向する関係で配置された一対の端子電極１０４、１０６と、端子電極１０４、１０６の間にあり、端子電極と電気的に接触するセンサ素子１０８とを備える。センサ素子１０８は、半導体材料１１２を含む半導体部分１１０と、半導体部分１１０の表面１１６上のオリゴヌクレオチド１１４とを含む。端子電極１０４と端子電極１０６との間の導電路１２０は、半導体部分１１０を貫通し、ひいては半導体材料１１２を貫通している。
【0044】
図１に示す実施形態では、基板１０２は、基板の一体部分として半導体部分１１０を含み、したがって、基板の残りの部分は、同じ半導体材料１１２から構成される。端子１０４と１０６との間の導電経路１２０は、使用時にセンサの両端間に電圧が印加されたときに確立される電界線によって基板の表面層（半導体部分１１０に対応する表面層）に実質的に限定される。したがって、有利には、センサ基板上に個別の薄膜半導体層を製造する必要がない。したがって、基板１０２は、例えば、半導体材料１１２のウェハを使用するときに与えられるような任意の好都合な厚さであってもよい。
【0045】
あるいは、センサ素子１０８は、基板１０２上の、少なくとも端子電極１０４と１０６との間の個別の表面層として、ただし任意選択で基板表面全体にわたって延在する個別の表面層として形成された半導体部分１１０を含むことができる。そのような実施形態では、基板１０２は、半導体層１１０を受け入れて支持することができる任意の適切な材料から構成されてもよい。
【0046】
使用時に、センサ１００は、核酸１２４を含有する（又は含有し得る）試料溶液１２２などの物質と接触する。核酸は、それが存在する場合、オリゴヌクレオチド１１４とハイブリダイズし、それによってセンサの電気抵抗の変化を引き起こす。電気抵抗の変化は、入ってくる相補的ＤＮＡ鎖がオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするときに、半導体への電子の供与又は半導体からの電子の受容による電荷移動によって起こる。センサの両端間に、すなわち端子電極１０４と１０６との間に電圧が印加されると、その結果として導電経路１２０に沿って端子電極間を流れる電流を測定することができ、したがってセンサの電気抵抗を求めることができる。この抵抗をセンサの予め定義された基準抵抗と比較することにより、試料溶液１２２中の核酸の有無を検出することができる。
【0047】
当業者には当然のことながら、センサ素子１０８は、典型的には複数のオリゴヌクレオチド１１４を含み、１２４とハイブリダイズするそれらのオリゴヌクレオチドの割合は、試料溶液１２２中の核酸濃度に依存し得る。導電経路１２０の抵抗は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド部位１１４の割合に比例するので、流体１２２中の核酸１２４の濃度は、例えば、較正曲線で決定された抵抗を比較することによって求めることができる。
【0048】
別の形態では、図３の概略図に示すように、センサ１００は、基板１０２と、基板上に互いに離間して対向する関係で配置された一対の端子電極１０４、１０６と、端子電極１０４、１０６の間にあり、端子電極と電気的に接触するセンサ素子１０８とを備える。センサ素子１０８は、下地となる基板上の半導体層１１２を含む半導体部分１１０と、半導体部分１１０の表面１１６上のオリゴヌクレオチド１１４とを含む。端子電極１０４と端子電極１０６との間の導電路１２０は、半導体部分１１０を貫通し、ひいては半導体材料１１２を貫通している。
【0049】
図３に示される実施形態では、基板１０２は、基板の層部分として半導体部分１１０を含み、したがって、基板の残りの部分は、支持材料から構成される。端子１０４と端子１０６との間の導電経路１２０は、半導体部分１１０に対応する層に実質的に限定される。
【0050】
したがって、この実施形態では、センサ素子１０８は、基板１０２上の、少なくとも端子電極１０４と１０６との間の個別の表面層として、ただし任意選択で基板表面全体にわたって延在する個別の表面層として形成された半導体部分１１０を含む。そのような実施形態では、基板１０２は、半導体層１１０を受け入れて支持することができる任意の適切な材料から構成されてもよい。
【0051】
使用時に、センサ１００は、核酸１２４を含有する（又は含有し得る）試料溶液１２２などの物質と接触する。核酸は、それが存在する場合、オリゴヌクレオチド１１４に結合し、それによってセンサの電気抵抗の変化を引き起こす。電気抵抗の変化は、入ってくる相補的ＤＮＡ鎖がオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするときに、半導体への電子の供与又は半導体からの電子の受容による電荷移動によって起こる。センサの両端間に、すなわち端子電極１０４と１０６との間に電圧が印加されると、その結果として導電経路１２０に沿って端子電極間を流れる電流を測定することができ、したがってセンサの電気抵抗を求めることができる。この抵抗をセンサの予め定義された基準抵抗と比較することにより、試料溶液１２２中のオリゴヌクレオチドの有無を検出することができる。
【0052】
前述のように、当業者は、センサ素子１０８が典型的には複数のオリゴヌクレオチド部位１１４を含み、核酸１２４とハイブリダイズするそれらの結合部位の割合が試料溶液１２２中の核酸濃度に依存し得ることを理解するであろう。導電経路１２０の抵抗は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド１１４の割合に比例するので、流体１２２中の核酸１２４の濃度は、例えば、較正曲線で決定された抵抗を比較することによって求めることができる。
【0053】
以下、導電率センサの各構成要素について説明する。
【0054】
基板
本発明の最も広い形態では、基板は総じて特に限定されず、例えば、半導体、ポリマー、ガラス又はセラミックからなる群から選択される材料から製造されてもよい。
本発明の最も広い形態では、基板は総じて特に限定されず、例えば、半導体、ポリマー、ガラス又はセラミックからなる群から選択される材料から製造されてもよい。
【0055】
例えば、基板として使用するのに適したポリマーは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリイミド（ＰＩ）及びポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）からなる群から選択することができる。適切なセラミックは、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、サファイア及び窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）からなる群から選択することができる。
【0056】
前述のように、基板の少なくとも一部は、センサ素子の一部を形成する半導体部分を含む。特定の実施形態では、半導体部分は基板全体に相当する。特定の実施形態では、半導体部分は、全体として基板の一部のみに相当する。そのような実施形態では、センサ素子の半導体部分は、基板の支持層上に支持されてもよく、任意選択でセンサ素子によって覆われた基板領域内でのみ、基板の支持層上に支持されてもよい。特定の実施形態では、センサ素子を形成する基板の半導体部分は、基板の支持層の片側の層の形態である。特定の実施形態では、センサ素子を形成する基板の半導体部分は、電極間の基板の支持層上の、又は支持層内に窪んだストリップの形態である。ただし、いくつかの好ましい実施形態では、基板は半導体部分を含むか、又はそれからなる。この実施形態では、基板の半導体部分は基板全体に相当する。したがって、図１に見られるように、センサ素子の半導体部分は、基板の一体部分として、デバイス構造を単純化してもよい。いくつかの実施形態では、基板は半導体材料のウェハである。
【0057】
電極
センサは、互いに離間して対向する関係で基板上に配置された一対の端子電極を備える。したがって、センサのセンサ素子は、離間した端子電極間の検出領域に配置される。当業者には明らかなように、端子電極は導電性であり、センサの両端間に電圧を印加するための装置、例えば、ポテンショスタットに電気的に接続するように構成される。
センサは、互いに離間して対向する関係で基板上に配置された一対の端子電極を備える。したがって、センサのセンサ素子は、離間した端子電極間の検出領域に配置される。当業者には明らかなように、端子電極は導電性であり、センサの両端間に電圧を印加するための装置、例えば、ポテンショスタットに電気的に接続するように構成される。
【0058】
図１に示すように、端子電極は、基板表面の上に個別の構造として形成され、その下の基板の半導体部分と電気的に接触している。ただし、他の構成も想定される。例えば、端子電極は基板内に陥凹していてもよく、センサ素子の半導体部分は基板表面に沿って端子電極間に水平に横たわっていてもよい。
【0059】
端子電極は、導電性金属又は合金、好ましくは化学的に不活性な金属又は合金を含んでいてもよい。金は、好適な金属の一例である。
【0060】
いくつかの実施形態では、微細加工技術によって基板上に端子電極が形成される。電子ビームリソグラフィを使用して、半導体層上に金薄膜（１００ｎｍのクロム接着層を有する２５０ｎｍ）を蒸着させることによって、金端子電極を形成することができる。次いで、堆積した状態の金薄膜は、一対の端子電極を画定するために標準的なフォトリソグラフィ及びウェットエッチング技術を使用してパターニングされる。
【0061】
端子電極は、一般に、導電率センサに適した任意の構成で互いに対して寸法決め及び配置されてもよい。いくつかの実施形態では、端子電極は、１マイクロメートルから１００マイクロメートルの範囲の距離だけ離間している。いくつかの実施形態では、端子電極は、２００から４０００マイクロメートルの範囲の長さ（すなわち、電極間ギャップ距離に直交する方向の長さ）を有する。本発明者らは、４０マイクロメートル離間した、長さ４０００マイクロメートルの２つの平行電極を使用して良好な結果を得て、１６×１０－８ｍ２の面積を有する検出領域を実現した。
【0062】
原則として、センサは、電極に関して多種多様なセンサの幾何学的形状及び寸法で機能する。それにもかかわらず、電極は、典型的には、１μｍから２００μｍ離間している。一実施形態では、電極は１μｍから１００μｍ離間している。一実施形態では、電極は１０μｍから８０μｍ離間している。一実施形態では、電極は２０μｍから６０μｍ離間している。一実施形態では、電極は３０μｍから５０μｍ離間している。一実施形態では、電極は３５μｍから４５μｍ離間している。一実施形態では、電極は約４０μｍ離間している。
【0063】
検出電極はまた、幅が様々であってもよく、幅は、典型的には２００から４０００μｍの幅である。一実施形態では、検出電極の幅は４００から３０００μｍである。一実施形態では、検出電極の幅は８００から２０００μｍである。一実施形態では、検出電極の幅は１０００から１５００μｍである。
【0064】
センサ素子
センサは、（ｉ）基板の半導体部分と、（ｉｉ）半導体部分の表面上のオリゴヌクレオチドであって、検出される核酸に相補的なオリゴヌクレオチドとを含むセンサ素子を備える。当業者には理解されるように、センサは、表面上に一種類のオリゴヌクレオチドを用いて製造されてもよく、又は最終用途に応じて複数の異なるオリゴヌクレオチドを用いて製造されてもよい。一実施形態では、センサは、単一オリゴヌクレオチドを用いて製造される。一実施形態では、センサは、複数の異なるオリゴヌクレオチドを用いて製造される。更に理解されるように、センサは、表面上に一種類のオリゴヌクレオチドのみが存在する場合、異なるオリゴヌクレオチド間の干渉の可能性が低減されるので、より感度が高い。それにもかかわらず、原則として、センサは、一回の試験で複数の異なる核酸が検出され得るように、いくつかの異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。核酸は、任意のクラス及びタイプのものであり得る。
センサは、（ｉ）基板の半導体部分と、（ｉｉ）半導体部分の表面上のオリゴヌクレオチドであって、検出される核酸に相補的なオリゴヌクレオチドとを含むセンサ素子を備える。当業者には理解されるように、センサは、表面上に一種類のオリゴヌクレオチドを用いて製造されてもよく、又は最終用途に応じて複数の異なるオリゴヌクレオチドを用いて製造されてもよい。一実施形態では、センサは、単一オリゴヌクレオチドを用いて製造される。一実施形態では、センサは、複数の異なるオリゴヌクレオチドを用いて製造される。更に理解されるように、センサは、表面上に一種類のオリゴヌクレオチドのみが存在する場合、異なるオリゴヌクレオチド間の干渉の可能性が低減されるので、より感度が高い。それにもかかわらず、原則として、センサは、一回の試験で複数の異なる核酸が検出され得るように、いくつかの異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。核酸は、任意のクラス及びタイプのものであり得る。
【0065】
センサ素子は、端子電極間に位置し、両端子電極と電気的に接触している。したがって、デバイスは、端子電極間の電気導電路が半導体部分を貫通し、ひいては半導体部分を貫通するように構成される。
【0066】
半導体部分
いくつかの実施形態では、半導体部分は、基板の一体部分、具体的には、端子電極間の検出領域を横切って延在する基板の領域又は表面部分である。
いくつかの実施形態では、半導体部分は、基板の一体部分、具体的には、端子電極間の検出領域を横切って延在する基板の領域又は表面部分である。
【0067】
他の実施形態では、半導体部分は、下地となる基板の支持層上に支持された基板の別個の表面層である。半導体層は、少なくとも端子電極間の検出領域内に位置するが、任意選択で基板表面全体にわたって延在していてもよい。そのような実施形態では、端子電極は、基板の別個の半導体層の表面上に、例えば、金属堆積によって形成されてもよい。あるいは、端子電極は支持層上に形成されてもよく、基板の半導体部分は、続いて、少なくとも端子電極間の検出領域において基板の支持層上に形成される。
【0068】
基板の半導体部分は、いくつかの異なる形態をとることができる。一実施形態では、半導体部分は、高抵抗率非酸化物半導体を含み、典型的には高抵抗率非酸化物半導体からなる。本明細書で使用される場合、非酸化物半導体は、元素半導体材料及び化合物半導体材料の両方を含むが、金属酸化物半導体は含まない。別の実施形態では、半導体部分は、酸素欠損金属酸化物を含む。
【0069】
ドープされたシリコンなどの多くの非酸化物半導体を含む電気化学デバイスに使用される一般的な半導体は、導電率センサ素子で使用するには導電性が高すぎる。オリゴヌクレオチドが表面に結合することによって引き起こされるそのような半導体の電子特性へのいかなる影響も、十分な感度を得るには小さすぎる。このため、従来の導電率センサは、典型的には、高抵抗率ポリマー又は金属酸化物材料の個別の導電率検出層で構成されている。
【0070】
本出願人らは、驚くべきことに、センサの表面に結合したペンダントオリゴヌクレオチドへの核酸配列のハイブリダイゼーションによって引き起こされる電気的環境の時として非常に小さな変化を検出することができる好適に感受性のセンサを実現できるようにするためには、使用される半導体材料は、非常に高い抵抗率を有さなければならないことを見出した。いくつかの実施形態では、半導体材料は、１００オーム・ｃｍ超、又は２００オーム・ｃｍ超の抵抗率を有する。このタイプ以上の抵抗率は、結合オリゴヌクレオチドを検出する際にセンサに適切な感度をもたらすことが見出された。
【0071】
いくつかの実施形態では、半導体部分は、１００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、２００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、５００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、１０００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、２０００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、５０００オーム・ｃｍを超える抵抗率を有する。
【0072】
いくつかの実施形態では、半導体部分は、約５００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、約１０００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、約５０００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、半導体部分は、約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。
【0073】
したがって、驚くべきことに、次に、導電率センサ素子に高抵抗率非酸化物半導体を使用すると、良好な導電率センサ性能が得られ得ることが分かった。高抵抗率を有する非酸化物半導体を選択することにより、センサは、センサ素子表面に結合したペンダントオリゴヌクレオチドへの核酸配列のハイブリダイゼーションによって引き起こされる電気的環境の変化の検出に適した範囲に収まる全体的な抵抗を有する。
【0074】
いくつかの実施形態では、高抵抗率非酸化物半導体は、１００オーム・ｃｍ超、又は２００オーム・ｃｍ超の抵抗率を有する。対照的に、電気化学的検出デバイスに一般的に使用されるドープされたシリコン半導体は、一般に、約１から１０オーム・ｃｍの抵抗率を有する。
【0075】
いくつかの実施形態では、高抵抗率非酸化物半導体は、５００オーム・ｃｍから約５０，０００オーム・ｃｍの範囲、例えば、約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。本発明者らは、１０００オーム・ｃｍ及び５０００～１００００オーム・ｃｍの抵抗率を有する非酸化物半導体で良好な結果を得た。
【0076】
高抵抗率非酸化物半導体は、端子電極間で（且つ導電路に沿って）測定されるときに、センサが適切な電気抵抗を有するように選択されてもよい。いくつかの実施形態では、センサは、例えば、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしている核酸配列が存在しない場合、約１０キロオームから約１００００キロオームの範囲の電気抵抗を有する。本発明者らは、低抵抗センサを使用すると、バイオアナライトに対する非常に低い感度が得られることを見出した。
【0077】
いくつかの実施形態では、非酸化物半導体は、元素半導体及び化合物半導体からなる群から選択される。
【0078】
好適な元素半導体としては、シリコン及びゲルマニウム半導体、好ましくはシリコン半導体が挙げられる。高純度の真性（ドープされていない）シリコン半導体は、それらの抵抗特性のために特に適していることが分かっている。真性シリコン半導体は、フロートゾーン精製技術によって調製された高純度シリコンであるフロートゾーンシリコンであってもよい。この技術では、溶融領域はシリコンのロッドに沿ってゆっくりと通過し、不純物は再結晶シリコンに再び組み込まれずに溶融領域に優先的に残る。対照的に、ほとんどのシリコン半導体はチョクラルスキー法によって製造され、それ故により高度の不純物を組み込む。適切なフロートゾーンシリコンは、＜１００＞配向を有する３”及び４”ウェハである。
【0079】
真性シリコン半導体が特に適していることが分かっているが、ドーピングレベルが十分に低く、半導体が高抵抗に維持されているのであるならば、非酸化物半導体がドープ元素半導体であってもよく、これを排除するものではない。
【0080】
適切な化合物半導体としては、ガリウムヒ素（ＧａＡｓ）、インジウムリン（ＩｎＰ）及びインジウムアンチモン（ＩｎＳｂ）などの二元半導体、ガリウムアルミニウムヒ素（ＧａＡｌＡｓ）などの三元半導体などが挙げられる。
【0081】
既に述べたように、特定の実施形態では、高抵抗率非酸化物半導体を含む半導体部分は、基板の一体部分であってもよく、すなわち、基板は、非酸化物半導体を含むか、又は非酸化物半導体からなってもよい。例えば、基板は、高抵抗率真性シリコン半導体のウェハなどの非酸化物半導体のウェハであってもよい。
【0082】
なおさらなる実施形態では、半導体部分は酸素欠損金属酸化物を含む。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、約５００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、約１０００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、約５０００オーム・ｃｍから約５０００，０００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。いくつかの実施形態では、酸素欠損金属酸化物は、約１０００オーム・ｃｍから約１００００オーム・ｃｍの範囲の抵抗率を有する。
【0083】
いくつかの適切な酸素欠損金属酸化物を半導体部分に使用することができる。一実施形態では、酸素欠損金属酸化物半導体部分は、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化ストロンチウムチタン（ＳＴＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、及び二酸化チタン（ＴｉＯ２）からなる群から選択される任意の適切な金属酸化物を使用して形成され得る。
【0084】
好ましい形態では、半導体部分は、酸化亜鉛（ＺｎＯ）又は酸化ストロンチウムチタン（ＳＴＯ）を用いて形成された酸素欠損金属酸化物層である。後述するように、本発明者らは、金属酸化物層が薄膜酸素欠損酸化亜鉛（ＺｎＯ）層である場合に、良好な結果が得られることを見出した。
【0085】
酸素欠損金属酸化物半導体部分は、反応性スパッタリング、物理蒸着（ＰＶＤ）、化学蒸着（ＣＶＤ）、有機金属化学蒸着（ＭＯＣＶＤ）、パルスレーザー蒸着（ＰＬＤ）及び分子線エピタキシ（ＭＢＥ）からなる群から選択される技術によって基板表面に付着させてもよい。
【0086】
一実施形態では、酸素欠損金属酸化物層を反応性スパッタリングによって剛性（ＳｉＯ２／Ｓｉ）ウェハ又は可撓性ポリイミド箔の表面に付着させて、約５０ｎｍから約２００μｍの範囲の厚さを有する薄い金属酸化物膜を得る。
【0087】
特定の実施形態では、半導体部分は、硬質（ＳｉＯ２／Ｓｉ）ウェハの表面にスパッタリングされた酸化亜鉛によって形成され、表面に複数のヒドロキシ（ＯＨ）基を提示する酸素欠損酸化亜鉛層（ＺｎＯ１－ｘ）を得る。堆積した状態の酸素欠損ＺｎＯ層は、所望の用途に適合する任意の適切な厚さであってもよい。本出願人らは、酸素欠損ＺｎＯ層が約１０ｎｍから約１μｍの範囲に収まる厚さを有する場合に良好な結果が得られることを見出した。
【0088】
酸化亜鉛（ＺｎＯ）
酸素含有量の比が異なる２つの異なるタイプのＺｎＯ薄膜が、マグネトロンスパッタリングによって調製される。これは、スパッタリングされた薄膜の異なる化学量論をもたらす。スパッタパラメータ及び関連する導電率を表１に列挙する。
酸素含有量の比が異なる２つの異なるタイプのＺｎＯ薄膜が、マグネトロンスパッタリングによって調製される。これは、スパッタリングされた薄膜の異なる化学量論をもたらす。スパッタパラメータ及び関連する導電率を表１に列挙する。
【0089】
【表2】
【0090】
スパッタリングパラメータは、０．０８～０．６Ｓ／ｍの範囲の導電率を有する薄膜を設計するように選択される。この範囲の導電率は、センサの良好な感度を与える。
【0091】
酸化チタンストロンチウム（ＳＴＯ）
２つの異なるタイプの酸化ストロンチウムチタン（ＳｒＴｉＯ３：ＳＴＯ）薄膜は、異なる酸素含有率を用いたマグネトロンスパッタリングによって調製される。スパッタリングパラメータを表３にまとめる。
２つの異なるタイプの酸化ストロンチウムチタン（ＳｒＴｉＯ３：ＳＴＯ）薄膜は、異なる酸素含有率を用いたマグネトロンスパッタリングによって調製される。スパッタリングパラメータを表３にまとめる。
【0092】
【表3】
【0093】
オリゴヌクレオチド
センサのセンサ素子は、半導体部分の表面上に少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、典型的には複数のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、検出される１つ又は複数の核酸配列に相補的であるように選択される。本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、検出される１つ又は複数の核酸配列が、核酸配列の実質的に全長にわたって塩基対合する結果としてオリゴヌクレオチドと結合することを意味する。いくつかの実施形態では、センサ素子は、半導体部分の表面上に複数のオリゴヌクレオチドを含む。
センサのセンサ素子は、半導体部分の表面上に少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、典型的には複数のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、検出される１つ又は複数の核酸配列に相補的であるように選択される。本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、検出される１つ又は複数の核酸配列が、核酸配列の実質的に全長にわたって塩基対合する結果としてオリゴヌクレオチドと結合することを意味する。いくつかの実施形態では、センサ素子は、半導体部分の表面上に複数のオリゴヌクレオチドを含む。
【0094】
オリゴヌクレオチドは、物理吸収又は化学結合のいずれかによって基板の半導体部分に固定化されてもよい。好ましい形態では、オリゴヌクレオチドは半導体部分の表面に化学的に結合している。
【0095】
シリコン半導体を含む、酸素欠損金属酸化物又は非酸化物半導体などの半導体は、典型的には、シラン化剤（アルコキシシランなどのシラン化基を含む表面改質剤）などの表面改質剤との共有結合形成反応の影響を受けやすいヒドロキシ基などの表面官能基を含む。したがって、オリゴヌクレオチドは、（ｉ）非酸化物半導体を、エポキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基及びヒドロキシ基からなる群から選択される末端官能基を有するシラン化剤でシラン化すること、並びに（ｉｉ）適切に官能化されたオリゴヌクレオチドを末端官能基と反応させることを含むプロセスによって、半導体部分に化学的に結合され得る。このプロセスの結果として、結合部位は、シラン化剤の残基である有機リンカーによって半導体部分の表面に固定される。
【0096】
適切なシラン化剤としては、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＴＳ）、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、及びＮ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＳ）などが挙げられる。例えば、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）などのエポキシ官能化シラン化剤が使用される場合、非酸化物半導体のシラン化は、ペンダントエポキシ基でその表面を官能化する。したがって、アミノ官能化オリゴヌクレオチドなどの適切に官能化されたオリゴヌクレオチドは、エポキシ反応性官能基とアミンとの抱合反応によってこの表面に固定化され得る。
【0097】
別の一連の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、シラン化基などの表面反応性官能基で予め官能化された分子上に最初に存在する。したがって、オリゴヌクレオチドは、共有結合形成を可能にするのに適した条件、ひいては表面固定化を可能にするのに適した条件下で、予め官能化された生体分子（又は他の実体）を半導体部分と接触させることによって、半導体部分に化学的に結合され得る。
【0098】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端を介して半導体部分の表面に付着している。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端を介して半導体部分の表面に付着している。
【0099】
本発明のセンサは、多種多様な核酸を検出するために使用することができ、唯一の実際の制約は、核酸を検出するために、検出される核酸に相補的な（上述のような）オリゴヌクレオチドを半導体部分に付着させることが必要であることである。一般に、核酸配列決定及びオリゴヌクレオチド合成の進歩により、検出される標的核酸は、診断される内科的疾患に関連するため、通常は十分にキャラクタライズされているので、このことは、重大な困難を引き起こさない。
【0100】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のＤＮＡ配列と比較して単一点突然変異を有する核酸配列に相補的である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはヒトＢＲＡＦ由来である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはヒトＫＲＡＳ遺伝子由来である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子に由来する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のＤＮＡ配列に対して挿入又は欠失突然変異を有する核酸に相補的である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはヒトＥＧＦＲ遺伝子由来である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはヒトマイクロＲＮＡ核酸に相補的である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはヒトマイクロＲＮＡ ｍｉＲ－３７１ａに由来する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒト天然ＤＮＡ配列に共通の変異を有する核酸に相補的である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはヒトＤＰＹＤ遺伝子由来である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号２である。
【0101】
基板の半導体部分は、半導体部分上に酸化物表面層を含んでいてもよく、酸化物層は、表面改質剤との共有結合形成反応を受けやすい表面官能基を含んでいてもよい。そのような不動態化層は一般に非常に薄く、その結果、オリゴヌクレオチドの結合は、使用中に、その下の高抵抗率半導体の抵抗に変化を引き起こす。したがって、半導体部分の表面における任意の酸化物表面層は、厚さが１０ｎｍ未満であってもよい。
【0102】
検出方法
本発明はまた、核酸を検出する方法に関する。本方法は、（ａ）本明細書に記載のセンサのセンサ素子を核酸を含み得る物質と接触させる工程と、（ｂ）センサの抵抗に対応するセンサの電気化学パラメータを測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で測定された電気化学パラメータに基づいてセンサ素子上の核酸の有無を検出する工程とを含む。
本発明はまた、核酸を検出する方法に関する。本方法は、（ａ）本明細書に記載のセンサのセンサ素子を核酸を含み得る物質と接触させる工程と、（ｂ）センサの抵抗に対応するセンサの電気化学パラメータを測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で測定された電気化学パラメータに基づいてセンサ素子上の核酸の有無を検出する工程とを含む。
【0103】
検出される核酸は、典型的には、目的の核酸配列を含有するか、又は含有し得る任意の物質であり得る物質の中に位置する。いくつかの実施形態では、物質は、試料溶液であり、例えば、唾液、汗、血液若しくは尿などの体液、又は組織若しくは腫瘍から抽出された核酸であるか、それらを含む液体試料である。
【0104】
上記のように、本方法は、検出される核酸が、センサ上に位置し、検出される核酸に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることに依存する。したがって、本発明のセンサ素子は、ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な期間、物質と接触させる必要がある。例えば、物質が流体である場合、核酸には、液体を通ってオリゴヌクレオチドに拡散し、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするのに十分な時間が与えられる必要がある。
【0105】
原則として、センサ素子と物質試料との接触時間は、検出される核酸がオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするのに十分な時間にわたって物質と接触している限りにおいて、任意の長さの時間であり得る。特定の実施形態では、センサ素子は、１分から６０分の期間、物質と接触する。特定の実施形態では、センサ素子は、１分から３０分の期間、物質と接触する。特定の実施形態では、センサ素子は、１分から２０分の期間、物質と接触する。特定の実施形態では、センサ素子は、１分から１０分の期間、物質と接触する。特定の実施形態では、センサ素子は、５分から１０分の期間、物質と接触する。
【0106】
センサ素子と試料の接触後、センサ素子は、典型的には、センサの表面からあらゆる物質を除去するためにリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄される。
【0107】
前述のように、オリゴヌクレオチドへの核酸のハイブリダイゼーションは、センサの抵抗の変化をもたらす。したがって、センサ素子を物質と接触させた後、センサの抵抗に対応するセンサの電気化学パラメータが測定される。
【0108】
当業者には理解されるように、センサの抵抗に対応する測定され得るセンサのいくつかの異なる電気化学パラメータが存在する。例えば、センサの両端間に固定電流を印加して、センサの両端間の電圧を測定することができる。あるいは、センサの両端間に固定電圧を印加して、電流フローを測定することができる。
【0109】
導電率センサの典型的な動作では、直接測定されるパラメータは、既知の電圧（又は電圧プロファイル）がセンサの両端間に印加されたときの電流応答である。したがって、いくつかの実施形態では、センサの電気化学パラメータを測定する方法は、（ｉ）センサの両端間に電圧を印加すること、及びセンサを通る電流フローを測定することを含む。ポテンショスタットなどの導電率センサ用の従来の装置を使用して、電圧を印加し、電流フローを測定することができる。
【0110】
ただし、センサ抵抗に対応する異なる電気化学パラメータを測定してもよく、これを排除するものではない。例えば、原則として、センサに所定の電流を流し、この電流を達成するために必要な電圧を測定することが可能である。その場合、測定された電圧は、センサ抵抗に対応する。一実施形態では、基準抵抗と比較したセンサの抵抗の増加は、試料中の核酸の存在を示す。
【0111】
センサ素子上の核酸の有無は、測定された電気化学パラメータをセンサのそのパラメータの基準値と比較することによって検出することができる。測定されたパラメータが電流応答である場合、電流フロー又は電流フローから求められるセンサの電気抵抗は、センサ素子上の核酸の有無に対応するセンサの予め定義された基準電流フロー又は抵抗に対する。例えば、物質と接触した後のセンサの電流フロー（又は抵抗）を、核酸を含まない参照溶液と接触した後のセンサの電流フロー（又は抵抗）と比較することができる。その最も単純な形態では、そのような比較を使用して、物質中の核酸の有無を判定することができる。あるいは、核酸を含有する試料溶液との接触後のセンサの電流フロー（又は抵抗）を、既知濃度の核酸を有する一連の参照溶液との接触後のセンサの電流フロー（又は抵抗）をプロットする較正曲線と比較することができる。このようにして、試料溶液中の核酸の濃度を算出することができる。
【0112】
本方法は、任意選択で、センサ素子を物質と接触させる工程と電圧を印加する工程との間に、１つ以上の調製工程を含むことができる。例えば、物質が試料溶液である場合、核酸（試料溶液中にそれが存在する場合）のオリゴヌクレオチド部位への結合を可能にするために、規定の条件（例えば、温度）で規定の時間、センサ素子をインキュベートすることができる。次いで、試料溶液をセンサから除去し、導電率測定を実行する前にセンサ素子を洗浄及び／又は乾燥させることができる。
【0113】
あるいは、センサは、例えば、マイクロニードルに組み込めば、核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために人体に挿入される侵襲性センサとして使用することができる。別の実施形態では、センサは、ヒトの汗中の核酸をモニタリングするためのウェアラブルデバイスに組み込まれる。
【0114】
原則として、本発明のセンサは、目的の任意の核酸の存在を検出するために使用することができる。実際、センサは、ＢＲＡＦ及び癌関連配列に関して例示されているが、原理上、センサは、任意の核酸を検出するために使用することができる。核酸配列を検出するセンサの能力に対する唯一の制限。
【0115】
センサの製造方法
本発明はまた、核酸を検出するためのセンサを製造する方法に関する。本方法は、半導体部分を含む基板を用意する工程を含む。基板の半導体部分が端子電極間に配置され、端子電極と電気的に接触し、端子電極間の導電路が半導体部分を貫通するように、一対の端子電極が基板上に互いに離間して対向する関係で作製される。次いで、オリゴヌクレオチドを半導体部分の表面に固定化し、それにより、（ｉ）半導体部分と、（ｉｉ）半導体部分の表面上のオリゴヌクレオチドとを含むセンサ素子を作製する。
本発明はまた、核酸を検出するためのセンサを製造する方法に関する。本方法は、半導体部分を含む基板を用意する工程を含む。基板の半導体部分が端子電極間に配置され、端子電極と電気的に接触し、端子電極間の導電路が半導体部分を貫通するように、一対の端子電極が基板上に互いに離間して対向する関係で作製される。次いで、オリゴヌクレオチドを半導体部分の表面に固定化し、それにより、（ｉ）半導体部分と、（ｉｉ）半導体部分の表面上のオリゴヌクレオチドとを含むセンサ素子を作製する。
【0116】
本発明の一形態では、図２の概略図に示すように、基板１０２は工程Ａで用意される。基板１０２は、本明細書に記載の半導体材料１１２を含む半導体部分１１０を含む。図２に示す実施形態では、基板１０２は、基板の一体部分として半導体部分１１０を含み、したがって、基板の残りの部分は、同じ半導体材料１１２から構成される。あるいは、基板１０２は、半導体層１１０を受け入れ且つ支持することができる任意の適切な材料から構成され得る、下地となる支持層上の個別の薄い表面層として形成された半導体部分１１０を含み得る。
【0117】
工程Ｂでは、基板１０２上に、互いに離間して対向する関係にある一対の端子電極１０４、１０６を作製する。電極は、基板の半導体部分１１０が端子電極１０４、１０６の間に配置され、端子電極と電気的に接触するように製造される。したがって、端子電極１０４と１０６との間の導電路１２０は、半導体部分１１０を貫通し、ひいては半導体材料１１２も貫通している。
【0118】
工程Ｃでは、オリゴヌクレオチド１１４が半導体部分の表面１１６に固定化され、それによってセンサ素子１０８が作製される。図１は単一の結合部位を示しているが、当然のことながら、複数のオリゴヌクレオチド１１４を表面１１６に固定化することができる。センサ素子１０８は、半導体部分１１０及びオリゴヌクレオチド１１４を含む。したがって、図１を参照して本明細書で前述したように、センサ１００は、工程Ａ、Ｂ、及びＣを実行した後に製造される。
【0119】
本発明の製造方法の別の形態では、図４の概略図に示すように、基板１０２が工程Ａで用意される。基板１０２は、本明細書に記載の半導体材料の層１１２として存在する半導体部分１１０を含む。図４に示す実施形態では、基板１０２は、半導体層１１０を受け入れ且つ支持することができる任意の適切な材料から構成され得る、下地となる支持層上の個別の薄い表面層１１２として形成された半導体部分１１０を含む。
【0120】
工程Ｂでは、基板１０２上に、互いに離間して対向する関係にある一対の端子電極１０４、１０６を作製する。電極は、基板の半導体部分１１０が端子電極１０４、１０６の間に配置され、端子電極と電気的に接触するように製造される。したがって、端子電極１０４と１０６との間の導電路１２０は、半導体部分１１０を貫通し、ひいては半導体材料１１２も貫通している。
【0121】
工程Ｃでは、オリゴヌクレオチド１１４が半導体部分の表面１１６に固定化され、それによってセンサ素子１０８が作製される。図４は単一のオリゴヌクレオチドを示しているが、当然のことながら、複数のオリゴヌクレオチド部位１１４を表面１１６に固定化することができる。センサ素子１０８は、半導体部分１１０及びオリゴヌクレオチド１１４を含む。したがって、図３を参照して本明細書で前述したように、センサ１００は、工程Ａ、Ｂ、及びＣを実行した後に製造される。
【0122】
半導体部分を含む基板は、本発明のセンサに関連して本明細書に記載される実施形態のいずれかによるものであり得る。
【0123】
端子電極は、任意の適切な方法によって基板上に作製することができる。いくつかの実施形態では、端子電極は微細加工技術によって形成される。電子ビームリソグラフィを使用して、半導体層上に金薄膜（１００ｎｍのクロム接着層を有する２５０ｎｍ）を蒸着させることによって、金端子電極を形成することができる。次いで、堆積した状態の金薄膜は、一対の端子電極を画定するために標準的なフォトリソグラフィ及びウェットエッチング技術を使用してパターニングされる。
【0124】
オリゴヌクレオチド結合部位は、物理吸収又は化学結合のいずれかによって半導体部分の表面に固定化され得る。好ましい形態では、オリゴヌクレオチドは、半導体部分の表面に化学的に結合している。
【0125】
シリコン半導体又は酸素欠損金属酸化物を含む非酸化物半導体などの本発明の基板の半導体部分に使用される材料は、典型的には、シラン化剤（アルコキシシランなどのシラン化基を含む表面改質剤）などの表面改質剤との共有結合形成反応の影響を受けやすいヒドロキシ基などの表面官能基を含む。したがって、オリゴヌクレオチドは、（ｉ）半導体部分を、エポキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基及びヒドロキシ基からなる群から選択される末端官能基を有するシラン化剤でシラン化すること、及び（ｉｉ）オリゴヌクレオチドを含む前駆体を末端官能基と反応させることを含むプロセスによって、半導体部分に化学的に結合され得る。このプロセスの結果として、オリゴヌクレオチドは、シラン化剤の残基である有機リンカーによって半導体部分の表面に固定される。
【0126】
適切なシラン化剤としては、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＴＳ）、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、及びＮ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＳ）などが挙げられる。
【0127】
図５（１）の概略図に示すように、金（Ａｕ）端子電極の下及びその間の基板の半導体部分は、半導体材料、この場合は高抵抗率真性シリコンウェハを含む。工程（２）において、半導体部分の表面を、任意選択で（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）などのエポキシ官能化シラン化剤であってもよい、シラン化剤と接触させる。シラン化剤は、半導体部分の表面ヒドロキシ（－ＯＨ）官能基と反応し、その結果、共有結合を介してシラン化剤を表面に固定し、ペンダント共役基、この場合はエポキシ基で表面を官能化する。次いで、工程（３）において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中に存在するエポキシ反応性官能基、この場合はアミン（－ＮＨ２）の抱合反応によって表面に固定化される。すなわち、オリゴヌクレオチドは、シラン化剤の残基である有機連結基によって半導体部分の表面に固定される。使用中、工程４に示すように、核酸はオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成して、固定化核酸分子をセンサ上に形成する。
【0128】
別の実施形態のための同じプロセス工程が、図６の概略図に示されている。図６（１）では、基板の支持部上、金（Ａｕ）端子電極の下及びその間に、基板の半導体部分が層として設けられたセンサが設けられている。図示の層は、酸素欠損酸化亜鉛層である。工程（２）において、半導体部分の表面を、任意選択で（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）などのエポキシ官能化シラン化剤であってもよい、シラン化剤と接触させる。シラン化剤は、半導体部分の表面ヒドロキシ（－ＯＨ）官能基と反応し、その結果、共有結合を介してシラン化剤を表面に固定し、ペンダント共役基、この場合はエポキシ基で表面を官能化する。次いで、工程（３）において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中に存在するエポキシ反応性官能基、この場合はアミン（－ＮＨ２）の抱合反応によって表面に固定化される。すなわち、オリゴヌクレオチドは、シラン化剤の残基である有機連結基によって半導体部分の表面に固定される。使用中、工程４に示すように、核酸はオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成して、固定化核酸分子をセンサ上に形成する。
【実施例】
【0129】
材料及び方法
抵抗率１０００～２０００オーム・ｃｍの高抵抗率シリコンウェハ（直径１００ｍｍ）を日本のＤ＆Ｘ社から購入し、それは片面研磨シリコンウェハであった。１０００～２０００オーム・ｃｍウェハの配向は＜１００＞であり、厚さは５００±１０μｍであった。
抵抗率１０００～２０００オーム・ｃｍの高抵抗率シリコンウェハ（直径１００ｍｍ）を日本のＤ＆Ｘ社から購入し、それは片面研磨シリコンウェハであった。１０００～２０００オーム・ｃｍウェハの配向は＜１００＞であり、厚さは５００±１０μｍであった。
【0130】
シリコンウェハセンサは、標準的なフォトリソグラフィプロセスを使用して高抵抗率シリコンウェハ上に２つの端子面内電極をパターニングすることによって作製した。電極ギャップは、１～２μｍから１００μｍの範囲内とすることができる。ただし、この電極ギャップは、最良のセンサ性能のために４０μｍになるように最適化した。電極の長さは、２００μｍから４０００μｍの範囲とした。最適電極長は４０００μｍとした。センサ素子面積（電極間のシリコン基板面積）は１６×１０－８ｍ２であった。金属酸化物層についても同様の仕様であることを確認した。
【0131】
センサのコンダクタンスは、市販の電流源計（Ｋｅｙｓｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＢ２９０１Ａ精密源／測定ユニット）を使用して測定した。センサは、すべての測定において、センサホルダとしてのＬＴＳ１２０ Ｌｉｎｋａｍステージ上に配置した。Ｋｅｙｓｉｇｈｔ Ｑｕｉｃｋ Ｉ－Ｖ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔソフトウェアをデータ取得に使用した。電極間のバイアスは１．８Ｖに維持した。オリゴヌクレオチドを固定し、且つ相補的ＤＮＡをハイブリダイゼーションした後に、センサの抵抗測定値を取得した。所与のセンサのデータ取得時間を１分とした。
【0132】
ＰＢＳ中の野生型ＤＮＡ（ＮＡ １２８７８）及びＰＢＳ中の点変異体Ｖ６００Ｅを有する黒色腫Ａ３７５ ＤＮＡは、Ｐｅｔｅｒ ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅによって提供され、受け取った状態で使用した。
【0133】
実施例１．ＧＰＳシラン化シリコンウェハセンサの調製：
シリコンウェハセンサは、標準的なフォトリソグラフィプロセスを使用して高抵抗率シリコンウェハ上に２つの端子面内電極をパターニングすることによって作製した。電極ギャップは、１～２μｍから１００μｍの範囲内とすることができる。ただし、この電極ギャップは、最良のセンサ性能のために４０μｍになるように最適化した。電極の長さは、２００μｍから４０００μｍの範囲とした。最適電極長は４０００μｍとした。センサ素子面積（電極間のシリコン基板面積）は１６×１０－６８ｍ２であった。
シリコンウェハセンサは、標準的なフォトリソグラフィプロセスを使用して高抵抗率シリコンウェハ上に２つの端子面内電極をパターニングすることによって作製した。電極ギャップは、１～２μｍから１００μｍの範囲内とすることができる。ただし、この電極ギャップは、最良のセンサ性能のために４０μｍになるように最適化した。電極の長さは、２００μｍから４０００μｍの範囲とした。最適電極長は４０００μｍとした。センサ素子面積（電極間のシリコン基板面積）は１６×１０－６８ｍ２であった。
【0134】
（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＰＳ）を用いたシリコンウェハセンサ表面のシラン化は、新たに調製したセンサデバイスをＯ２プラズマ（プラズマクリーナーＰＤＣ－００２、Ｈａｒｒｉｃｋプラズマ）に１０分間曝露してシリコン表面のヒドロキシル基を活性化した後に行った。次いで、新たに調製したＧＰＳ溶液２０μＬをＡｌ箔上にドロップキャストし、これを真空デシケータ内に配置し、デシケータ内にＧＰＳ蒸気を生じさせた。次いで、Ｏ２プラズマ洗浄シリコンセンサを、ＬＣ２００グローブボックスシステム内でこのＧＰＳ蒸気に３０～４５分間曝露した。その後、シラン化シリコンウェハセンサをＭｉｌｌｉ－Ｑ水で２分間十分にすすいで、表面から未結合シラン基を除去した。次いで、洗浄したセンサを１５０℃で１０分間加熱して、シリコンウェハ表面へのシラン基の結合を強化した。次いで、基板表面に化学的に結合した表面エポキシド官能基で官能化されたこれらのＧＰＳシラン化シリコンウェハセンサを使用して、オリゴヌクレオチドを固定化した。
【0135】
実施例２．ＧＰＳシラン化酸化亜鉛ウェハセンサの調製：
センサは、標準的なマイクロナノ製造技術に従って、剛性基板（５０～３００ｎｍのＳｉＯ２／５００μｍのＳｉ）及び可撓性プラスチック基板（ポリイミド箔、厚さ７５～１２５μｍ）上に、バイオセンサ内の検出層として作用する酸素欠損酸化亜鉛（ＺｎＯ）などの金属酸化物の厚さ８０～１００ｎｍの薄膜を堆積させることによって作製した。検出層の組成物を反応性スパッタリングによって作製し、１～２シーメンス／ｍの範囲のコンダクタンスを有する酸素欠損金属酸化物膜を得た。コンダクタンス測定のために、１６×１０－８ｍ２の検出面積を有する２つの端子面内電極がパターニングされて作製される。
センサは、標準的なマイクロナノ製造技術に従って、剛性基板（５０～３００ｎｍのＳｉＯ２／５００μｍのＳｉ）及び可撓性プラスチック基板（ポリイミド箔、厚さ７５～１２５μｍ）上に、バイオセンサ内の検出層として作用する酸素欠損酸化亜鉛（ＺｎＯ）などの金属酸化物の厚さ８０～１００ｎｍの薄膜を堆積させることによって作製した。検出層の組成物を反応性スパッタリングによって作製し、１～２シーメンス／ｍの範囲のコンダクタンスを有する酸素欠損金属酸化物膜を得た。コンダクタンス測定のために、１６×１０－８ｍ２の検出面積を有する２つの端子面内電極がパターニングされて作製される。
【0136】
新たに調製したＺｎＯデバイスをＯ２プラズマ（市販のＰｌａｓｍａ Ｃｌｅａｎｅｒ ＰＤＣ－００２、Ｈａｒｒｉｃｋプラズマ）に１０分間曝露して、デバイス表面から有機汚染物質を取り除き、ＺｎＯ表面のヒドロキシル基を活性化した。次いで、２０μＬの新たに調製したＧＰＳ溶液を、真空デシケータ内に配置された市販のＡｌ箔上にドロップキャストし、デシケータ内にＧＰＳ蒸気を生じさせた。次いで、Ｏ２プラズマで洗浄したＺｎＯセンサをこのＧＰＳ蒸気に１～２時間曝露した。ＺｎＯセンサのＧＰＳ蒸気への曝露は、ＬＣ２００グローブボックスシステム内で行った。ＧＰＳ蒸気への曝露が完了したら、ＺｎＯセンサをＭｉｌｉ－Ｑ水で２分間十分にすすぎ、ＺｎＯデバイスから結合していないシラン基を除去した。次いで、洗浄したＺｎＯセンサを１５０℃で１０分間加熱して、ＺｎＯ表面へのシラン基の結合を強化した。これらのＧＰＳシラン化センサをオリゴヌクレオチドの固定化に使用した。
【0137】
実施例３．オリゴヌクレオチドの固定化
この実施例は、実施例２のＺｎＯセンサへのオリゴヌクレオチドの固定化を例示する。同様の方法が、オリゴヌクレオチドを他のセンサに固定化するために使用される。
この実施例は、実施例２のＺｎＯセンサへのオリゴヌクレオチドの固定化を例示する。同様の方法が、オリゴヌクレオチドを他のセンサに固定化するために使用される。
【0138】
ＢＲＡＦ ３’－アミンＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’－ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴ／３ＡｍＭＯ／－３’）及びＢＲＡＦ ５’－アミンＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’－／ＡｍＭＣ６／ＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴ－３’）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡから購入し、受け取った状態で使用した。新たに調製した１５μＬ体積の３５ｐＭオリゴヌクレオチド溶液（ｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製）を、新たにＧＰＳシラン化した各ＺｎＯセンサ上にドロップキャストし、１時間インキュベートしてオリゴヌクレオチドをＺｎＯセンサ上に固定させた。次いで、センサをｐＨ７．４のＰＢＳ溶液で広範囲にすすぎ、結合していないオリゴヌクレオチドを除去した。次に、導電率測定の前に、ＰＢＳで洗浄したＺｎＯセンサをＮ２ガス下で２分間乾燥させた。
【0139】
実施例４．ＤＮＡ－ＺｎＯセンサの導電率測定
ＰＢＳ中の野生型ＤＮＡ（ＮＡ １２８７８）及びＰＢＳ中の点変異体Ｖ６００Ｅを有する黒色腫Ａ３７５ ＤＮＡは、Ｐｅｔｅｒ ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅによって提供され、受け取った状態で使用した。ＤＮＡ試料の添加前に、オリゴヌクレオチド固定化ＺｎＯセンサのベースラインコンダクタンスを測定した。１５μＬの量のＤＮＡ溶液（野生型ＤＮＡ又は点突然変異体ＤＮＡ）をオリゴヌクレオチド固定化ＺｎＯセンサ上にドロップキャストし、１０分間インキュベートした。１０分後、センサ上の残りのＤＮＡ溶液を除去し、Ｎ２ガス下で表面を乾燥させた後、コンダクタンス測定を行った。交差選択測定のために、２種類のＤＮＡ試料を１：２００、１：１００、１：１、１００：１、及び２００：１の体積比（点変異体ＤＮＡ：野生型ＤＮＡ）で予備混合することによって一連のＤＮＡ混合物を調製した。ストックＤＮＡ試料のモル濃度が同じであるため、２つのＤＮＡタイプの体積比は、２つのＤＮＡタイプのモル比と同じである。
ＰＢＳ中の野生型ＤＮＡ（ＮＡ １２８７８）及びＰＢＳ中の点変異体Ｖ６００Ｅを有する黒色腫Ａ３７５ ＤＮＡは、Ｐｅｔｅｒ ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅによって提供され、受け取った状態で使用した。ＤＮＡ試料の添加前に、オリゴヌクレオチド固定化ＺｎＯセンサのベースラインコンダクタンスを測定した。１５μＬの量のＤＮＡ溶液（野生型ＤＮＡ又は点突然変異体ＤＮＡ）をオリゴヌクレオチド固定化ＺｎＯセンサ上にドロップキャストし、１０分間インキュベートした。１０分後、センサ上の残りのＤＮＡ溶液を除去し、Ｎ２ガス下で表面を乾燥させた後、コンダクタンス測定を行った。交差選択測定のために、２種類のＤＮＡ試料を１：２００、１：１００、１：１、１００：１、及び２００：１の体積比（点変異体ＤＮＡ：野生型ＤＮＡ）で予備混合することによって一連のＤＮＡ混合物を調製した。ストックＤＮＡ試料のモル濃度が同じであるため、２つのＤＮＡタイプの体積比は、２つのＤＮＡタイプのモル比と同じである。
【0140】
３’－アミンオリゴヌクレオチドと５’－アミンオリゴヌクレオチドはいずれも、野生型ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションについて得られた抵抗変化と比較して、点突然変異体ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションの際に抵抗変化における極性の逆転を示した（図７）。抵抗の変化は、ベースライン抵抗に対するＤＮＡハイブリダイゼーション後のデバイスの抵抗の変化率である。ベースライン抵抗は、ＤＮＡ添加前のオリゴヌクレオチド固定化デバイスの抵抗である。デバイスの抵抗は、点突然変異体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に増加したが、デバイスの抵抗は、野生型ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後に減少した。この結果は、点突然変異体ＤＮＡが電子受容体として作用し、野生型ＤＮＡが両方のタイプのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション時に電子供与体として作用することを示唆している。点突然変異体ＤＮＡの抵抗の変化の逆極性は、健康なＤＮＡと比較して単一塩基対の違い（Ｖ６００Ｅ変異体）を有する黒色腫などの癌ＤＮＡを検出するためのこれらの導電率測定デバイスの高い感度を強調している。試験したすべての試料について得られた抵抗値の絶対変化は、５’－アミンオリゴヌクレオチド固定化デバイスよりも３’－アミンオリゴヌクレオチド固定化デバイスにおいて高い。これは、電荷移動プロセスが５’－アミンオリゴヌクレオチドよりも３’－アミンオリゴヌクレオチドではるかに起こり得ることを示している。ＰＢＳ溶媒の抵抗変化は、野生型ＤＮＡと同じ極性であり、点突然変異体ＤＮＡとは同じ極性ではない。したがって、抵抗の変化に対する点突然変異体ＤＮＡ溶液のマトリックスからの寄与は無視できる。
【0141】
実施例５．交差選択性実験
他のＤＮＡの存在下でＶ６００Ｅ点変異体ＤＮＡを検出するための導電率測定デバイスの実現可能性を調べるために、交差選択性測定も行った。両方のタイプのオリゴヌクレオチド固定化デバイスは、野生型ＤＮＡの存在下でＶ６００Ｅ点変異体ＤＮＡを選択的に検出した（図８）。抵抗変化は、Ｖ６００Ｅ点変異体ＤＮＡ画分の増加と共に増加し、点変異体ＤＮＡ：野生型ＤＮＡのモル分率が１００：１を超えると飽和値に達した。この傾向は、両方のタイプのオリゴヌクレオチドで見られる。両方のオリゴヌクレオチドは、臨床的に重要な対立遺伝子分率比（すなわち０．５％）に相当する１：２００の点突然変異体ＤＮＡ：野生型ＤＮＡモル比でＶ６００Ｅ点突然変異体ＤＮＡを検出することに成功した。この結果は、Ｖ６００Ｅ点変異体ＤＮＡ検出におけるこれらの導電率センサの高い感度及び高い選択性を強調している。
他のＤＮＡの存在下でＶ６００Ｅ点変異体ＤＮＡを検出するための導電率測定デバイスの実現可能性を調べるために、交差選択性測定も行った。両方のタイプのオリゴヌクレオチド固定化デバイスは、野生型ＤＮＡの存在下でＶ６００Ｅ点変異体ＤＮＡを選択的に検出した（図８）。抵抗変化は、Ｖ６００Ｅ点変異体ＤＮＡ画分の増加と共に増加し、点変異体ＤＮＡ：野生型ＤＮＡのモル分率が１００：１を超えると飽和値に達した。この傾向は、両方のタイプのオリゴヌクレオチドで見られる。両方のオリゴヌクレオチドは、臨床的に重要な対立遺伝子分率比（すなわち０．５％）に相当する１：２００の点突然変異体ＤＮＡ：野生型ＤＮＡモル比でＶ６００Ｅ点突然変異体ＤＮＡを検出することに成功した。この結果は、Ｖ６００Ｅ点変異体ＤＮＡ検出におけるこれらの導電率センサの高い感度及び高い選択性を強調している。
【0142】
実施例６．Ｓｉセンサ上のＤＮＡの導電率測定
実施例４の方法を使用し、ただし、５’－アミンオリゴヌクレオチドが固定化された実施例１のシリコンセンサを使用して実験を行った。導電率測定実験の結果を図９に示す。
実施例４の方法を使用し、ただし、５’－アミンオリゴヌクレオチドが固定化された実施例１のシリコンセンサを使用して実験を行った。導電率測定実験の結果を図９に示す。
【0143】
定義
本明細書で範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、又は濃度範囲が与えられるときはいつでも、すべての中間範囲及び部分範囲、並びに与えられた範囲に含まれるすべての個々の値が本開示に含まれることが意図される。当然のことながら、本明細書の説明に含まれるあらゆる部分範囲、又は範囲若しくは部分範囲内の任意の個々の値は、本明細書の特許請求の範囲から除外することができる。
本明細書で範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、又は濃度範囲が与えられるときはいつでも、すべての中間範囲及び部分範囲、並びに与えられた範囲に含まれるすべての個々の値が本開示に含まれることが意図される。当然のことながら、本明細書の説明に含まれるあらゆる部分範囲、又は範囲若しくは部分範囲内の任意の個々の値は、本明細書の特許請求の範囲から除外することができる。
【0144】
本明細書で定義及び使用されるすべての定義は、当然のことながら、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、及び／又は定義された用語の通常の意味に優先すると理解されるべきである。
【0145】
本明細書で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0146】
本明細書で使用される「及び／又は」という語句は、そのように結合された要素、すなわち、場合によっては結合的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」を用いて列挙された複数の要素は、同じように、すなわちそのように結合された要素の「１つ又は複数」と解釈されるべきである。「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、具体的に特定される要素に関連するか否かにかかわらず、任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンドの表現と共に使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意選択で含む）を指す場合があり、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）を指す場合があり、更に別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意選択で他の要素を含む）を指す場合がある、といった具合である。
【0147】
本発明を限られた数の実施形態と共に説明してきたが、当業者には当然のことながら、前述の説明に照らして多くの代替、変更、及び変形が可能である。したがって、本発明は、開示される本発明の趣旨及び範囲内に含まれ得るようなすべてのそのような代替、変更及び変形を包含することが意図される。
【0148】
「含む／備える（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）」という用語が本明細書（特許請求の範囲を含む）で使用される場合、それらは、記載された特徴、整数、工程又は構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程又は構成要素、又はそれらの群の存在を排除しないと解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】