特表 2024-526615 抗体高次構造コンパラビリティのためのＮＭＲ方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】抗体高次構造コンパラビリティのためのＮＭＲ方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 24/08 20060101AFI20240711BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20240711BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240711BHJP

   G01N 24/12 20060101ALI20240711BHJP

   G01R 33/465 20060101ALI20240711BHJP

【ＦＩ】

G01N24/08 510Q

G01N33/483 E

G01N33/68

G01N24/12 510C

G01R33/465

G01N24/12 510L

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580706

(86)(22)【出願日】2022-06-28

(85)【翻訳文提出日】2024-01-22

(86)【国際出願番号】 US2022035312

(87)【国際公開番号】W WO2023278443

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/216,501

(32)【優先日】2021-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】ディッキ― イゴール

(72)【発明者】

【氏名】マトウゼク ウィリアム

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA37

2G045FA36

(57)【要約】

本発明は、概して、抗体高次構造を特徴付ける方法に関する。特に、本発明は、抗体高次構造における製造プロセス変動性を比較するための新規なＮＭＲ方法の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのタンパク質の製造プロセスを比較するための方法であって、
ａ．少なくとも２つの製造プロセスからの複数の試料を取得することと、
ｂ．ＮＭＲ分光法のために前記試料を調製することと、
ｃ．調製した試料をＮＭＲ実験に供することと、
ｄ．前記ＮＭＲ実験から前記試料についてのＮＭＲスペクトルを取得することと、
ｅ．前記少なくとも２つの製造プロセスの各々の前記スペクトルを平均化することと、
ｆ．タンパク質高次構造の差異を検出するために、前記少なくとも２つの製造プロセスからの前記平均化されたＮＭＲスペクトルを比較することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記タンパク質が、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、抗体薬物複合体、抗体／標的化薬物複合体、複合モノクローナル抗体、複合モノクローナル抗体断片、又はＦｃ融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ＮＭＲ分光法のために前記試料を調製することが、前記試料を少なくとも１つの加水分解剤に接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記加水分解剤が、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）又はそのバリアントである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＮＭＲスペクトルが、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記２Ｄ－ＮＭＲスペクトルが、相関分光法（ＣＯＳＹ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、又は核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）を通じた同種核ＮＭＲ実験を使用して取得される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記２Ｄ－ＮＭＲスペクトルが、^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣ又は^１Ｈ－^１３Ｃ ＨＳＱＣを通じた異種核ＮＭＲ実験を使用して取得される、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

比較が、前記少なくとも２つの製造プロセスからの前記平均化されたＮＭＲスペクトルに対してＥＣＨＯＳ－ＮＭＲを適用することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

タンパク質の２つの製造プロセスを比較することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

少なくとも１つのタンパク質の製造プロセスを比較するための方法であって、
（ａ）少なくとも２つの製造プロセスからの複数のタンパク質試料を取得することと、
（ｂ）ＮＭＲ分光法のために前記試料を調製することと、
（ｃ）前記試料をＮＭＲ実験に供することと、
（ｄ）タンパク質高次構造の差異を検出するために製造プロセスを比較するため、取得されたＮＭＲスペクトルを主成分分析に供することと
を含む、方法。

【請求項12】

前記主成分分析における前記ＮＭＲスペクトルが、製造プロセスによってクラスター化される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

製造プロセスを比較するために、前記主成分分析クラスターを統計分析に供することを更に含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

主成分分析を使用して測定された少なくとも１つの差異に寄与する前記ＮＭＲスペクトルの少なくとも１つの領域を決定することを更に含み、前記領域が、前記ＮＭＲスペクトル上に等高線プロットとして少なくとも１つの負荷量をプロットすることによって決定される、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記タンパク質が、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、又はＦｃ融合タンパク質である、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

前記タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

ＮＭＲ分光法のために前記試料を調製することが、前記試料を少なくとも１つの加水分解剤に接触させるステップを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項18】

前記加水分解剤が、化膿連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）又はそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ＮＭＲスペクトルが、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルである、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記２Ｄ－ＮＭＲスペクトルが、相関分光法（ＣＯＳＹ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、又は核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）を通じた同種核ＮＭＲ実験を使用して取得される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記２Ｄ－ＮＭＲスペクトルが、^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣ又は^１Ｈ－^１３Ｃ ＨＳＱＣを通じた異種核ＮＭＲ実験を使用して取得される、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

比較が、前記少なくとも２つの製造プロセスからの前記平均化されたＮＭＲスペクトルに対してＥＣＨＯＳ－ＮＭＲを適用することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項23】

タンパク質の２つの製造プロセスを比較することができる、請求項１１に記載の方法。

【請求項24】

タンパク質を特徴付けるための方法であって、
ａ．タンパク質試料を取得することと、
ｂ．ＮＭＲ分光法のために前記試料を調製することと、
ｃ．前記試料をＮＭＲ実験に供することと、
ｄ．取得されたＮＭＲスペクトルの空の領域からノイズを排除することと、
ｅ．前記ＮＭＲスペクトルを分析して、前記タンパク質を特徴付けることと
を含む、方法。

【請求項25】

ステップ（ｄ）が、
（ｉ）前記ＮＭＲスペクトルをビンに分割することと、
（ｉｉ）前記ＮＭＲスペクトルの空の領域を選択することと、
（ｉｉｉ）前記選択された領域におけるシグナル強度の標準偏差を決定して、ノイズ閾値を設定することと、
（ｉｖ）前記ノイズ閾値の２倍を下回るシグナルを有する全てのビンがゼロに設定されるように、前記ＮＭＲスペクトルシグナルを調整することと
を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

ゼロの強度を有するビンを分析から除外することを更に含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記タンパク質が、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、又はＦｃ融合タンパク質である、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

前記タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

ＮＭＲ分光法のために前記試料を調製することが、前記試料を少なくとも１つの加水分解剤に接触させるステップを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項30】

前記加水分解剤が、化膿連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）又はそのバリアントである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＮＭＲスペクトルが、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルである、請求項２４に記載の方法。

【請求項32】

前記２Ｄ－ＮＭＲスペクトルが、相関分光法（ＣＯＳＹ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、又は核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）を通じた同種核ＮＭＲ実験を使用して取得される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記２Ｄ－ＮＭＲスペクトルが、^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣ又は^１Ｈ－^１３Ｃ ＨＳＱＣを通じた異種核ＮＭＲ実験を使用して取得される、請求項３１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月２９日に出願された、米国仮特許出願第６３／２１６，５０１号の優先権及び利益を主張するものであり、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本出願は、核磁気共鳴分光法を比較するための方法、及びバイオテクノロジー生成物の製造におけるその適用に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
タンパク質治療薬は、その安全性及び有効性が、高次構造（ＨＯＳ）を含む、種々の重要品質特性に依存している複雑な原薬である。ＨＯＳを特徴付けることは、バイオ医薬品製造における一貫性を確立し、製造変化からのプロセス関連変動を検出し、バイオ治療薬生成物間のコンパラビリティを確立するために不可欠である。

【0004】

近年、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光方法が、治療用抗体などの、治療用タンパク質におけるＨＯＳの特徴付けのために開発されている。特に、２Ｄ異種核相関方法は、原子レベルまでのタンパク質構造の詳細かつ包括的な報告を可能にする。薬物開発プロセスにおける治療用タンパク質の分析は特別な課題を提示する。なぜなら、薬物製造ワークフローは、そうでなければＮＭＲシグナルを増強し、ＮＭＲピーク帰属を容易にするために使用され得る、同位体標識又は濃縮と不適合性であり得るからである。代わりに、高度な分析方法が、帰属を容易にするために、又はピーク帰属を必要としない場合があるより広範な統計的メトリックを使用してスペクトルを比較するために適用され得る。

【0005】

試料調製、ＮＭＲ技法、データ処理、データ後処理、及びデータ分析は全て、ＮＭＲによる治療用タンパク質の特徴付けを改善するために現在開発中の領域である。これまでに、治療用タンパク質の個々のロット間比較のための方法が開発されている。２つの試料又はプロセスの間で比較することは、バイオ治療薬製造プロセスの１つの重要な構成要素であるが、１つの代表的なロットのみが分析されるときに不明瞭にされ得る所与のプロセス内の変動もまた存在し得る。この変動を理解すること、及び異なるプロセスの変動を互いに比較することは、バイオ治療薬開発のための製造プロセスを選択及び最適化するために重要である。

【0006】

したがって、治療用タンパク質の製造におけるプロセス変動性の特徴付け及び比較をするためのＮＭＲ方法に対する必要性が存在することが理解されるであろう。

【発明の概要】

【0007】

概要
複数の製造プロセスの変動性を比較するための方法が開発された。プロセス平均化された（ｐｒｏｃｅｓｓ－ａｖｅｒａｇｅｄ）、ＥＣＨＯＳ（ｅａｓｙ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｏｒｄｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（高次構造の容易なコンパラビリティ））－ＮＭＲの方法は、いずれかのプロセスのロット間変動性による歪みなしでの製造プロセスの比較を可能にする。プロセスクラスター化された（ｐｒｏｃｅｓｓ－ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ）主成分分析（ＰＣＡ）は、各製造プロセス内並びにそれらの間の変動性の検出及び比較を可能にする。プロセスによるＰＣＡクラスター化は更に、各主成分に対して相対的な当該プロセス変動の統計分析を可能にする。

【0008】

ＮＭＲ方法に対する追加の改善が本明細書に開示される。ＮＭＲ試料調製のための消化酵素としてのＩｄｅＳの使用は、他の酵素と比較して、抗体断片化における一貫性、及び特有のサイズ範囲にある断片の生成を可能にする。加えて、ＩｄｅＳの使用は、ＩｄｅＳなしで又はインタクトなタンパク質を用いて取得されたスペクトル分解能と比べて、スペクトル分解能の改善を提供する。ＮＭＲスペクトルを単純化し、分析物シグナルのより精確な統計分析を可能にするノイズ排除方法もまた開示される。

【0009】

本開示は、タンパク質の製造プロセスを比較するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、方法は、（ａ）少なくとも２つの製造プロセスからの複数のタンパク質試料を取得することと、（ｂ）ＮＭＲ分光法のために当該試料を調製することと、（ｃ）調製した試料をＮＭＲ実験に供することと、（ｄ）当該ＮＭＲ実験から当該試料についてのＮＭＲスペクトルを取得することと、（ｅ）当該少なくとも２つの製造プロセスの各々の当該スペクトルを平均化することと、（ｆ）タンパク質高次構造の差異を検出するために、当該少なくとも２つの製造プロセスからの当該平均化されたＮＭＲスペクトルを比較することとを含む。

【0010】

いくつかの態様では、当該タンパク質試料は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、抗体薬物複合体、抗体／標的化薬物複合体、複合モノクローナル抗体、複合モノクローナル抗体断片、又はＦｃ融合タンパク質を含む。

【0011】

いくつかの態様では、ＮＭＲ分光法のために当該試料を調製することは、当該試料を少なくとも１つの加水分解剤に接触させるステップを含み得る。特定の態様では、当該加水分解剤は、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）又はそのバリアントである。

【0012】

いくつかの態様では、当該ＮＭＲスペクトルは、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルである。特定の態様では、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルは、相関分光法（ＣＯＳＹ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、又は核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）を通じた同種核ＮＭＲ実験を使用して取得される。別の特定の態様では、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルは、^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣ又は^１Ｈ－^１３Ｃ ＨＳＱＣを通じた異種核ＮＭＲ実験を使用して取得される。好ましい態様では、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルは、ＨＳＱＣである。

【0013】

いくつかの他の態様では、当該ＮＭＲスペクトルは、３Ｄ－ＮＭＲスペクトルである。別の態様では、当該ＮＭＲスペクトルは、４Ｄ－ＮＭＲスペクトルである。

【0014】

いくつかの態様では、当該比較は、当該少なくとも２つの製造プロセスからの当該平均化されたＮＭＲスペクトルに対してＥＣＨＯＳ－ＮＭＲを適用することを含む。

【0015】

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質の製造プロセスを比較するための方法は、（ａ）少なくとも２つの製造プロセスからの複数のタンパク質試料を取得することと、（ｂ）ＮＭＲ分光法のために当該試料を調製することと、（ｃ）当該試料をＮＭＲ実験に供することと、（ｄ）一次、二次、及び三次構造並びにより高次構造の差異を検出するために製造プロセスを比較するため、取得されたＮＭＲスペクトルを主成分分析に供することとを含む。タンパク質の製造プロセスを比較するための方法はまた、製造プロセスを比較して、タンパク質試料中の当該タンパク質の翻訳後修飾の差異を検出するために使用され得る。

【0016】

いくつかの態様では、当該タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、抗体薬物複合体、抗体／標的化薬物複合体、複合モノクローナル抗体、複合モノクローナル抗体断片、又はＦｃ融合タンパク質であり得る。

【0017】

いくつかの態様では、ＮＭＲ分光法のために当該試料を調製することは、当該試料を少なくとも１つの加水分解剤に接触させるステップを含み得る。特定の態様では、当該加水分解剤は、化膿連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）又はそのバリアントである。更なる態様では、ＮＭＲ分光法のために当該試料を調製することは、当該加水分解された試料をリン酸塩緩衝液中に交換するステップを含み得る。

【0018】

いくつかの態様では、当該ＮＭＲスペクトルは、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルである。特定の態様では、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルは、相関分光法（ＣＯＳＹ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、又は核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）を通じた同種核ＮＭＲ実験を使用して取得される。別の特定の態様では、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルは、^１Ｈ－^１５Ｎ ＨＳＱＣ又は^１Ｈ－^１３Ｃ ＨＳＱＣを通じた異種核ＮＭＲ実験を使用して取得される。好ましい態様では、２Ｄ－ＮＭＲスペクトルは、ＨＳＱＣである。

【0019】

いくつかの態様では、当該主成分分析における当該ＮＭＲスペクトルは、製造プロセスによってクラスター化される。特定の態様では、方法は、製造プロセスを比較するために、当該主成分分析クラスターを統計分析に供することを更に含む。

【0020】

いくつかの態様では、方法は、主成分分析を使用して測定された少なくとも１つの差異に寄与する当該ＮＭＲスペクトルの少なくとも１つの領域を決定することを更に含み、当該領域は、当該ＮＭＲスペクトル上に等高線プロットとして少なくとも１つの負荷量をプロットすることによって決定される。

【0021】

いくつかの態様では、当該複数のタンパク質試料は、３つ、４つ、５つ、又は５つより多くであり得る。

【0022】

本開示は、タンパク質を特徴付けるための追加の方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、方法は、（ａ）タンパク質試料を取得することと、（ｂ）ＮＭＲ分光法のために当該試料を調製することと、（ｃ）当該試料をＮＭＲ実験に供することと、（ｄ）取得されたＮＭＲスペクトルの空の領域からノイズを排除することと、（ｅ）当該ＮＭＲスペクトルを分析して、タンパク質を特徴付けることとを含む。

【0023】

いくつかの態様では、ステップ（ｄ）は、（ｉ）ＮＭＲスペクトルをビンに分割することと、（ｉｉ）ＮＭＲスペクトルの空の領域を選択することと、（ｉｉｉ）選択された領域におけるシグナル強度の標準偏差を決定して、ノイズ閾値を設定することと、（ｉｖ）ノイズ閾値の４倍を下回るシグナルを有する全てのビンがゼロに設定されるように、ＮＭＲスペクトルシグナルを調整することとを含む。特定の態様では、当該方法は、ゼロの強度を有するビンを分析から除外することを更に含む。

【0024】

本発明のこれらの、及び他の、態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮されたときによりよく認識及び理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態及び多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修正、追加、又は再配置が、本発明の範囲内で行われ得る。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】図１Ａは、例示的な実施形態による、生^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図1B】図１Ｂは、例示的な実施形態による、ビニングされた^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図1C】図１Ｃは、例示的な実施形態による、^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおけるノイズ領域の選択を示す。

【図1D】図１Ｄは、例示的な実施形態による、^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおけるノイズ領域の統計分析を示す。

【図1E】図１Ｅは、例示的な実施形態による、ノイズを除去するために強度が調整された^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図1F】図１Ｆは、例示的な実施形態による、^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおける目的の領域の選択を示す。

【図1G】図１Ｇは、例示的な実施形態による、^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおける目的の単離領域を示す。

【図1H】図１Ｈは、例示的な実施形態による、強度が正規化された^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図1I】図１Ｉは、例示的な実施形態による、シグナル及びノイズ領域を分離するために閾値が適用された^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図1J】図１Ｊは、例示的な実施形態による、シグナル及びノイズ領域を示すために閾値が適用された^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図2】図２は、例示的な実施形態による、条件ごとに平均化された３つの試料を用いた、２つの抗体及び２つの製造プロセスについての平均化され、重ね合わされた^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図3】図３は、例示的な実施形態による、条件ごとに平均化された３つの試料を用いた、２つの抗体及び２つの製造プロセスについてのＥＣＨＯＳ－ＮＭＲ分析を示す。

【図4A】図４Ａは、例示的な実施形態による、２つの抗体及び２つの製造プロセスについてのＮＭＲスペクトルのセンタリングＰＣＡを示す。

【図4B】図４Ｂは、例示的な実施形態による、ｍＡｂ１及び２つの製造プロセスについてのＮＭＲスペクトルの非センタリングＰＣＡを示す。

【図4C】図４Ｂは、例示的な実施形態による、ｍＡｂ２及び２つの製造プロセスについてのＮＭＲスペクトルの非センタリングＰＣＡを示す。

【図4D】図４Ｄは、例示的な実施形態による、２つの抗体及び２つの製造プロセスについてのＮＭＲスペクトルのＰＣＡの統計分析を示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

詳細な説明
タンパク質治療薬は、その安全性及び有効性が種々の重要品質特性（ＣＱＡ）に依存している複雑な原薬である。１つのそのような特性は高次構造（ＨＯＳ）であり、これは、薬物の二次、三次及び四次構造で構成される。ＨＯＳを特徴付けることは、バイオ医薬品製造における一貫性を確立し、製造変化からのプロセス関連変動を検出し、バイオ治療薬生成物間のコンパラビリティを確立するために重要である。しかしながら、タンパク質のＨＯＳを測定することは、実質的な技術的及び分析的課題を表す。化学的に誘導され、それについて構造が絶対に決定され得る小分子薬物とは異なり、タンパク質治療薬のＨＯＳは、それらの大きな分子量、タンパク質動力学、及び製造プロセスの微妙な差異から生じる生成物の不均一性に起因して、絶対的な特徴付けを妨げる（Ｂｒｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９，ＭＡｂｓ，１１（１）：９４－１０５）。

【0027】

ｍＡｂ薬物生成物のＨＯＳを特徴付けるために典型的に使用される方法には、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）及び円二色性（ＣＤ）が含まれる。これらの方法のうちのいくつかはｍＡｂに関する構造情報を提供するのに好適であり得るが、それらはタンパク質治療薬のＨＯＳ特徴付けについてのいくつかの欠点を有する。ＣＤの実用的なハードウェア制限は、典型的なｍＡｂ製剤と比較して希薄なタンパク質濃度を必要とする。ＣＤの別の問題は、特に、変化を観察するにもかかわらず、構造摂動を局在化させることが常には可能でない、ＩｇＧのような構造的に均一なタンパク質を評価するときの、低感度である。このより低い濃度で取得された結果が、より高い製剤濃度での挙動の予測となる程度は、未解決の問題のままである。ＦＴ－ＩＲは広いタンパク質濃度範囲にわたって動作し得るが、それは、二次構造のみを特徴付ける、限定的な単一特性方法であり、したがって、タンパク質構造の完全な尺度を提供しない。ＣＤと同様に、ＦＴ－ＩＲは、いかなる構造的欠陥をも局所化させることができず、このことは、それを比較的低い情報量の方法にしている。ＦＴ－ＩＲを使用すると、ＮＭＲスペクトルは通常十分に分散され、これは、タンパク質配列に局在化させられ得る数百個の独立した読み出しを提供する。両方の技法の低い分光学的及び構造的分解能はまた、スペクトル分散を構造分散に相関させることを困難にする。加えて、最近の研究は、両方の方法が臨床的に関連するＨＯＳ分散について報告する感度を疑問視している（Ａｒｂｏｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，１００（１）：ｅ１０５）。

【0028】

ＮＭＲ分光法は、タンパク質高次構造の研究における重要なツールであったが、その使用は、妥当な感度を達成するための^１３Ｃ及び^１５Ｎでの同位体標識及び／又は濃縮に伝統的に依存しており、これは、バイオ治療薬製造プロセスと適合性でない場合がある。ＮＭＲはまた、一般的に、抗体などのより大きな分子とは対照的な、より小さな分子量の分析物のために使用されている。したがって、ＮＭＲは、治療用抗体の構造的特徴付けにおいて限定的な役割を果たしている。しかしながら、ＮＭＲ方法論における最近の進歩は、より大きな分析物について、及び天然の同位体存在量（１．１％の^１３Ｃ、０．３％の^１５Ｎ）のタンパク質についての感度の改善を可能にした。１Ｄ ^１Ｈ方法、２Ｄ ^１Ｈ－^１Ｈ方法、及び２Ｄ ^１Ｈ－Ｘ異種核相関方法を含む、本出願に有用なＮＭＲ技法が記載されている。後者の方法の例としては、２Ｄ ^１３Ｃ－^１Ｈ及び２Ｄ ^１５Ｎ－^１Ｈ方法が挙げられる。加えて、化学シフト自己相関、主成分分析（ＰＣＡ）及びＥＣＨＯＳなどの、ＮＭＲデータ処理及び後処理技法、又は計量化学方法が、抗体の特徴付けのために開発されている（Ａｒｂｏｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．，上記、Ａｍｅｚｃｕａ ａｎｄ Ｓｚａｂｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１３，１０２（６），１７２４－１７３３）。

【0029】

タンパク質治療薬の特徴付けのためのＮＭＲ方法の使用が望ましい。なぜなら、単一の２Ｄ－ＮＭＲ実験が、タンパク質治療薬の一次、二次、三次及び四次構造の包括的な原子レベルのフィンガープリントを差し出すスペクトルマップをもたらし得るからである。正しく折り畳まれたタンパク質分子は、典型的には、２Ｄスペクトルフィンガープリントと言われる、個々の^１５Ｎ－^１Ｈアミド又は^１３Ｃ－^１Ｈメチル共鳴相関から生じるクロスピークの規定されたパターンを与える。これらのシグナルは、温度、ｐＨ、及びイオン強度などの実験試料条件が適正に管理されていると仮定すると、三次元タンパク質構造におけるそれらの個々の原子の独特の化学的及び構造的環境に関連する特定の周波数位置で観察される。２つの生成物からのタンパク質の２つの２Ｄ－ＮＭＲスペクトルフィンガープリントの精密な一致は、タンパク質の優勢な構造が、それらの２つの生成物試料の間で高度に類似していることの高レベルの保証を提供する。そのような高い類似性の決定は、他の関連するＣＱＡとの組み合わせで、２つの生成物の間の分析的類似性を指定するために使用され得る（Ｂｒｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）。

【0030】

ＮＭＲを使用するバイオ治療用タンパク質のロット間比較のための方法が確立されているが、適用は、２つの試料又はプロセスの間のＨＯＳ差異を分析することに限定されている。２つの試料又はプロセスの間で比較することはバイオ治療薬製造プロセスの１つの重要な構成要素であるが、所与のプロセス内の変動もまた存在し得る。２つ以上の異なるプロセスの変動性を比較することができることは、生成物の全範囲を封入する場合があるか又はしない場合がある各プロセスからの１つの個々のロットを比較することとは対照的に、そのために方法がまだ確立されていない重要な実用的考慮事項である。したがって、抗体高次構造における製造プロセス変動性を比較するための方法に対する差し迫った必要性が存在する。

【0031】

本開示は、抗体製造プロセスの分析のための新規な方法を記載する。消化酵素としてのＩｄｅＳの使用、スペクトルノイズ低減のための方法、平均化されたＥＣＨＯＳ－ＮＭＲのための方法、及びＮＭＲスペクトルのプロセスグループ化された（ｐｒｏｃｅｓｓ－ｇｒｏｕｐｅｄ）ＰＣＡのための方法を含む、従来のＮＭＲ方法に対する種々の進歩が本明細書に開示される。

【0032】

別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料が実施又は試験において使用され得るが、特定の方法及び材料がここに記載される。

【0033】

「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を許容すると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることが意図され、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

【0034】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「医薬タンパク質生成物」という用語は、共有結合されたアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含み得る。タンパク質は、当技術分野において「ポリペプチド」として一般的に知られている、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基、関連する天然起源の構造バリアント、及びそれらの合成の非天然起源のアナログで構成されたポリマー、関連する天然起源の構造バリアント、並びにそれらの合成の非天然起源のアナログを指す。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、非天然起源のペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成され得る。様々な固相ペプチド合成方法が当業者に知られている。タンパク質は、単一の機能生体分子を形成するように、１つ又は複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。目的のタンパク質には、バイオ治療用タンパク質、研究又は療法において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、並びに二重特異性抗体のうちのいずれかが含まれ得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルスシステム、酵母システム（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、哺乳動物システム（例えば、ＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの、組換え細胞ベースの産生システムを使用して産生され得る。バイオ治療用タンパク質及びその産生を考察する最近の総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ”（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ １４７－１７６（２０１２）（その教示全体が本明細書に組み込まれる））を参照されたい。タンパク質は、組成及び溶解性に基づいて分類され得、したがって、球状タンパク質及び線維状タンパク質などの単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などの複合タンパク質、並びに一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質を含み得る。

【0035】

いくつかの例示的な実施形態では、治療用タンパク質は、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約２７５ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ、約３２５ｍｇ／ｍＬ、約３５０ｍｇ／ｍＬ、約３７５ｍｇ／ｍＬ、又は約４００ｍｇ／ｍＬで存在し得る。

【0036】

いくつかの例示的な実施形態では、治療用タンパク質は、組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ及びそれらの組み合わせであり得る。

【0037】

本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、好適な宿主細胞中に導入された組換え発現ベクター上に担持された遺伝子の転写及び翻訳の結果として産生されたタンパク質を指す。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、抗体、例えば、キメラ、ヒト化、又は完全ヒト抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、以下からなる群から選択されるアイソタイプの抗体であり得る：ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥ。特定の例示的な実施形態では、抗体分子は、完全長抗体（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４免疫グロブリン）であるか、又は代替的には、抗体は、断片（例えば、Ｆｃ断片又はＦａｂ断片）であり得る。

【0038】

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。本発明の異なる実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか又は天然に若しくは人工的に改変され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて規定され得る。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、完全な抗体分子の抗原結合断片もまた含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して、複合体を形成する任意の天然起源の、酵素的に取得され得る、合成の、又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、完全な抗体分子から、任意の好適な標準的な技法、例えば、タンパク質分解消化、又は抗体の可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技法を使用して誘導され得る。そのようなＤＮＡは、知られており、かつ／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成され得る。ＤＮＡを、配列決定し、化学的に又は分子生物学技法を使用することによって操作して、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを好適な構成に配置し得るか、又はコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を改変、付加、若しくは欠失などさせ得る。

【0039】

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合又は可変領域などの、インタクトな抗体の部分を含む。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、その中で免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子である。いくつかの例示的な実施形態では、抗体断片は、それが、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合する断片である、いくつかの例示的な実施形態では、断片が、親抗体のものと比較可能な親和性で抗原に結合し、かつ／又は抗原への結合について親抗体と競合する、親抗体の十分なアミノ酸配列を含む。抗体断片は、任意の手段によって生成され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的又は化学的に生成され得、かつ／又はそれは部分抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に生成され得る。代替的には、又は加えて、抗体断片は、全体的に又は部分的に合成的に生成され得る。抗体断片は、任意選択的に、単鎖抗体断片を含み得る。代替的には、又は加えて、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって、一緒に連結されている複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的に、多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。

【0040】

「二重特異性抗体」という用語は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、一般的に、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上又は同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかの、異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１の重鎖の第１のエピトープに対する親和性は、一般的に、第１の重鎖の第２のエピトープに対する親和性よりも少なくとも１桁～２桁又は３桁又は４桁低く、逆もまた同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ又は異なる標的上（例えば、同じ又は異なるタンパク質上）にあり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、そのような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞において発現させられ得る。

【0041】

典型的な二重特異性抗体は、各々が３つの重鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖、続いて、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、並びに免疫グロブリン軽鎖を有し、この免疫グロブリン軽鎖は、抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合し得るか、又は各重鎖と会合し得、かつ重鎖抗原結合領域によって結合されるエピトープのうちの１つ以上と結合し得るか、又は各重鎖と会合し得、かつ一方若しくは両方のエピトープへの重鎖のうちの一方若しくは両方の結合を可能にし得る。ＢｓＡｂは、２つの主要なクラス、Ｆｃ領域を有するもの（ＩｇＧ様）及びＦｃ領域を欠くものに分けられ得、後者は、通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、異なる形式、例えば、限定されないが、トリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）、ノブズイントゥホールズＩｇＧ（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ ＩｇＧ）（ｋｉｈ ＩｇＧ）、クロスＭａｂ（ｃｒｏｓｓＭａｂ）、オルト－Ｆａｂ ＩｇＧ（ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ）、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツーインワン（ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ）若しくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－単鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλボディを有し得る。非ＩｇＧ様の異なる形式には、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドックアンドロック（ｄｏｃｋ－ａｎｄ－ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）方法によって生成された抗体が含まれる（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ ＆ Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ＆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０、Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６５－３１０（２０１４）（その教示全体が本明細書に組み込まれる））。

【0042】

本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。そのような分子は、通常、２つの抗原に結合するのみであるが（例えば、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性などの追加の特異性を有する抗体もまた本明細書に開示される方法によって対処され得る。

【0043】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技法を通して産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能であるか又は知られている任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む、単一クローンに由来し得る。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技法、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において知られている多種多様の技法を使用して調製され得る。

【0044】

いくつかの例示的な実施形態では、治療用タンパク質は、哺乳動物細胞から産生され得る。哺乳動物細胞は、ヒト起源又は非ヒト起源のものであり得、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞及び網膜上皮細胞）、樹立細胞株及びそれらの株（例えば、２９３胚性腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞及びＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞、ＨｅＬａ ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、Ｃｌｏｎｅ Ｍ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－ｌ細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ－細胞、ＰＫ－１５細胞又はそれらの誘導体）、任意の組織又は器官からの線維芽細胞（限定されないが、以下を含む：心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道，胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓、並びに線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５７３細胞、ＨＥＬ ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、Ｓｔｒａｉｎ ２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、並びにＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞又はそれらの誘導体）を含み得る。

【0045】

本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。消化は、ＮＭＲのための試料の調製において使用され得る。消化を使用することの利点は、分析物のサイズを低減させることであり、これは、その分析物についてのＮＭＲシグナルを比例的に増加させる。特に、抗体に関して、抗体のサブドメインは互いに独立して折り畳み得、したがって、サブドメインを互いから切断することは、タンパク質構造における重大な変化なしにシグナルの増強の利益を提供する。同位体標識も濃縮もなしに特定の断片化されたサブドメインへのＮＭＲシグナルの帰属を容易にすることにおける、断片化に対する追加の利益が存在し得る。

【0046】

適切な加水分解剤を使用して試料中のタンパク質の消化を実施することへのいくつかのアプローチ、例えば、酵素消化又は非酵素消化が存在する。本明細書で使用される場合、「消化酵素」という用語は、タンパク質の消化を行い得る多数の異なる薬剤のうちのいずれかを指す。酵素消化を実施し得る加水分解剤の非限定的な例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉからのプロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）又は外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）、化膿連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ又はそれらの生物学的に活性な断片若しくはホモログ又はそれらの組み合わせが挙げられる。タンパク質消化のために利用可能な技法を考察する最近の総説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ ＆ Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １０６７－１０７７（２０１３））を参照されたい。例示的な実施形態では、消化酵素は、ＩｄｅＳ、又はＩｄｅＳのバリアントである。

【0047】

治療用製剤は、ＮＭＲ分析における使用に好適でない成分を含み得る。例えば、水素原子を含む賦形剤又は緩衝剤は、タンパク質分析物の検出に干渉する望ましくないＮＭＲシグナルを生成し得る。そのような場合、タンパク質分析物を好適な緩衝液に移すために、緩衝液交換又は透析ステップが使用され得る。例示的な実施形態では、分析物は、ｐＨ６．０の１０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液中に透析される。

【0048】

本明細書で使用される場合、「核磁気共鳴」（「ＮＭＲ」）という用語は、原子核の周囲の局所磁場を観察するために使用される技法である、核磁気共鳴分光法を指す。ＮＭＲシグナルは、ラジオ波での分析物試料の核の核磁気共鳴への励起によって生成され、これは、次いで、ラジオレシーバーを用いて検出される。取得されたＮＭＲスペクトルは、分析物分子の構造、動力学、反応状態、及び化学的環境に関する情報を提供する。分析物及び所望のデータに応じて選択され得る種々の異なるＮＭＲ技法が存在する。タンパク質分析に関連するＮＭＲ技法には、例えば、１Ｄ ^１Ｈ方法、２Ｄ ^１Ｈ－^１Ｈ方法、並びに２Ｄ ^１Ｈ－Ｘ異種核相関方法（２Ｄ ^１３Ｃ－^１Ｈ及び２Ｄ ^１５Ｎ－^１Ｈ方法を含む）が含まれる。例示的な実施形態では、製造プロセスを比較するために使用されるＮＭＲ方法は、２Ｄ ^１３Ｃ－^１Ｈ方法である。

【0049】

２Ｄ異種核ＮＭＲの分野内には、異種核単一量子相関（ＨＳＱＣ）、異種核多量子相関分光法（ＨＭＱＣ）、及び異種核多重結合相関分光法（ＨＭＢＣ）を含む、代替の方法のサブセットが存在する。別段示さない限り、本明細書に開示される実験は、ＨＳＱＣを用いる。しかしながら、開示される方法はまた、ＨＭＱＣ又はＨＭＢＣを使用することを含む任意のタイプの多次元ＮＭＲ実験に適用され得る。

【0050】

ＮＭＲスペクトルは、各スペクトルに固有の豊富なデータセットを更に解釈するために、追加の分析に供され得る。本明細書で使用される場合、「データ処理」、「データ後処理」、又は「計量化学」という用語は、獲得後のＮＭＲデータの分析のための方法を記載するために使用される。データ処理を容易にするために使用され得るいくつかのソフトウェアプログラム、例えば、ＪＭＰ １５（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）又はＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）が存在する。大規模データセットを操作することができる任意の好適なソフトウェアが選択され得る。

【0051】

ＮＭＲデータは、例えば、ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲ（ｅａｓｙ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｏｒｄｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ ＮＭＲ（ＮＭＲによる高次構造の容易なコンパラビリティ））を使用して更に分析され得る（Ａｍｅｚｃｕａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，１０２（６）：１７２４－１７３３）。ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲは、ビニングされたＮＭＲスペクトル強度の線形回帰分析から導かれる相関係数を測定することによって、２つの実験試料の間の類似性を比較することを含む。この方法は、同位体標識も濃縮も必要とせずに、２つの分析物の間の全体的類似性の直接的な相対比較を行うことを可能にする。例示的な実施形態では、ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲの方法は更に、２つの製造プロセスからの平均化されたスペクトルに適用され、したがって、２つの試料の代わりに２つのプロセスを比較するために使用される。

【0052】

大規模データセットの分析のための一般的な統計的方法は、主成分分析（ＰＣＡ）である。ＰＣＡは、可能な限り多くのデータの変動を保ちながらより低次元のデータを得るために、最も高い分散を有するデータセットの次元を表す最初のいくつかの主成分のみに各データポイントを投影することによる、次元削減のために一般に使用される。主成分は、データ共分散行列の固有値分解によって計算され得る。例示的な実施形態では、ＰＣＡプロット上の各データポイントは、ＮＭＲスペクトルを表す。例示的な実施形態では、ＰＣＡプロット上のデータポイントは、分析物抗体の製造プロセスに従ってクラスター化され得る。例示的な実施形態では、これらのクラスターは、各製造プロセスの分散を他と比較するために、追加の統計分析に供され得る。

【0053】

ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲ又はＰＣＡは、ＮＭＲ分析物の的確な化学構造から抽出されるが、これらの、又は他の、統計的方法を使用して検出されたＮＭＲスペクトルの間の統計的差異又は分散は、各々の差異又は変動の特定の化学的な根源を決定するために、代替の分析方法を用いて相関させられ得る。

【0054】

本発明は、前述のタンパク質、抗体、ＮＭＲ技法、消化酵素、データ処理方法、又はデータ後処理方法のうちのいずれかに限定されず、任意のタンパク質、抗体、ＮＭＲ技法、消化酵素、データ処理方法、又はデータ後処理方法が、任意の好適な手段によって選択され得ることが理解される。

【0055】

本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。しかしながら、それは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0056】

試料調製。ＮＭＲ実験を、２つの異なる製造プロセス、プロセス１及びプロセス２を使用して製造したｍＡｂ１及びｍＡｂ２ロット試料を用いて行った。ｍＡｂ１及びｍＡｂ２ロット試料を、固定化ＩｄｅＳ（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＦｒａｇＩＴカラム）を用いてインサイチュで消化し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中に透析し、ＮＭＲ実験のために４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0057】

ＮＭＲデータ収集。一次元^１Ｈ及び二次元^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、４５℃の低温冷却したプローブを使用して、８００ＭＨｚ（１Ｈ周波数）で動作するＢｒｕｋｅｒ分光計上で、標準的なＢｒｕｋｅｒパルスシーケンス（ｚｇｅｓｇｐ、又は勾配を用いた励起スカルプティングを使用する水抑制を伴う１Ｄシーケンス、及びｈｓｑｃｅｔｇｐｓｐ、又はＥｃｈｏ／Ａｎｔｉｅｃｈｏ－ＴＰＰＩ勾配選択を使用する二重ｉｎｅｐｔ移動、位相感応型を介する２Ｄ Ｈ－１／Ｘ相関）を使用して取得した。二次元スペクトルを、５０％不均一サンプリングを用いて収集した。

【0058】

ＮＭＲデータ処理及び後処理。一次元^１Ｈ及び二次元^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、ＮＭＲＦｘ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｏｎｅ Ｍｏｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ）を使用して処理し、生スペクトル強度をエクスポートし、次いで、ＪＭＰ １５（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ）中にインポートした。プロセス間比較のために、各プロセスからの代表的なロット／試料について収集したスペクトルを、ＮＭＲＦｘ処理後に平均化して、各プロセスを表す平均スペクトルを生成した。次いで、これらの平均スペクトルを、直接的に収集したデータと同じく処理し得る。

【0059】

一次元スペクトルを、スペクトル全体として、又はアミド（６．０～１１．５ｐｐｍ ^１Ｈ）及び脂肪族（－１．０～３．５ｐｐｍ ^１Ｈ）領域に分解してのいずれかで分析した。一次元スペクトルに対してノイズ除去又は正規化を行わなかった。

【0060】

二次元スペクトルを、ビニング、ノイズ除去、及び正規化に供した。二次元スペクトルを、^１Ｈ次元における幅０．０５４ｐｐｍ及び^１３Ｃ次元における高さ０．４０６ｐｐｍのビンに分割し（なぜなら、これが、各メチルピークのおおよそのサイズであるからである）、各ビン内のシグナルを平均化した。ノイズを除去するために、経験的に決定された「ノイズ領域」（－１．５～－１．０ｐｐｍ ^１Ｈ）におけるシグナル強度の標準偏差を計算し、次いで、そのノイズ閾値の２倍を下回るシグナルを有する全てのビンをゼロに設定した。これはまた、この実験において予想されていない、全ての負のシグナルをゼロに設定する目的にかなった。最後に、濃度のささいな変動を説明するために、メチル領域（－１．０～２．５ｐｐｍ ^１Ｈ、１０．８～２８ｐｐｍ ^１３Ｃ）内のビンを、その領域における最も高い強度のビンに対して正規化した。

【0061】

ＮＭＲデータ分析。後処理後の、一次元^１Ｈ及び二次元^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを表すベクトルを、ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲ又はＰＣＡ分析のいずれかを使用して比較した。

【0062】

ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲのために、２つのスペクトルを表すベクトルを、ＪＭＰ １５において直接的に相関させた。Ｒ^２値（高は類似性を示す）、ＲＭＳＥ（低は差異の欠如を示す）、及び％ＣＶ（変動係数、これは、平均シグナルによってスケーリングされたＲＭＳＥであり、低は差異の欠如を示す）を、各ペアワイズ比較について報告した。二次元データセットのために、それにおいて比較される両方のデータセットについて強度がゼロであったポイントを、ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲ分析から除外した。

【0063】

ＰＣＡのために、いくつかのスペクトル（例えば、２つのプロセスからのいくつかの代表的なスペクトル）を表すベクトルを、ＪＭＰ １５中に実装された主成分プラットフォームを使用し、ペアワイズ推定方法を使用し、共分散に基づいて作成された主成分について分析した。ＰＣＡの間に、データセット間で変動のないビンを分析から外した。

【0064】

いくつかのグループ（例えば、異なる製造プロセス）の比較のために、上位２つの主成分のスコアを互いに対してプロットし、比較されるカテゴリによってグループ化された９５％信頼密度の楕円をプロットした。楕円の平均及び標準偏差を、グループの統計的比較（ｔ検定）のために使用し得るか、又は視覚的検査のためにプロットし得、これは、コンパラビリティ又はコンパラビリティの欠如の発見をもたらす。

【0065】

それにおいてグループ間で関連する差異が観察される主成分を、差異の根源について更に分析し得る。目的の主成分についての負荷量（スペクトルビンを主成分に変換する係数）を、元のスペクトル化学シフト軸上に等高線プロットとしてプロットし得、これは、この主成分に沿って差異に強く寄与する領域を示す「仮想スペクトル」をもたらす。１つの主成分に沿って分離されている２つのクラスター／プロセスの場合、この負荷量プロットは、２つのグループの差異スペクトルを本質的に再現し、分析物に対して高分解能で差異が正確に示されることを可能にする。

【0066】

実施例１．ＮＭＲ方法の改善
従来のＮＭＲ方法を、抗体高次構造（ＨＯＳ）の定量分析のために改良した。

【0067】

ＮＭＲ分析のための抗体の調製において、より高いＮＭＲシグナル及びより高い分解能の分析のためのより小さな断片を生成するために、抗体を消化酵素によって消化し得る。ＮＭＲ分析のための抗体の従来の消化は、消化酵素として、例えば、パパインを使用し得、これは、抗体を非特異的部位で消化し、おおよそ５０、５０及び５０ｋＤａの抗体断片を生成する。本分析のために、酵素ＩｄｅＳを使用した。ＩｄｅＳ、及び関連酵素は、ヒンジ領域の下の特異的で予測可能な抗体部位を切断し、従来の方法と比べて、実験間のより高いコンパラビリティを可能にする。加えて、ＩｄｅＳは、おおよそ１００、２５及び２５ｋＤａの抗体断片を生成し、これは、分析物サイズにつれて変動する、ＮＭＲシグナルの質及び強度の点で特有の結果を提供する。消化がｍＡｂのスペクトル分散に重大な影響を及ぼさないように留意した。

【0068】

ＮＭＲデータの後処理分析のために、新規なノイズ低減方法を試験し、用いた。例えば、二次元^１３Ｃ／^１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおける、大きな領域が、タンパク質分析物からのシグナルを含まず、もっぱらノイズを含み得る。後続の分析にこのノイズを含めることは、例えば、ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲ又はＰＣＡを使用する相関を歪め得る。

【0069】

ノイズ排除及びシグナル正規化を含む、ＮＭＲデータ分析の例示的な方法を、図１に示す。生データを、図１Ａに示すように集め、図１Ｂに示すようにビニングした。分析物からのシグナルを含まない「空の」領域を図１Ｃに示すように選択し、ノイズ閾値を、図１Ｄに示すように、この領域からの値の標準偏差に基づいて設定した。次いで、図１Ｅに示すように、調整された強度を計算し、適用して、このノイズを除外し、ＮＭＲスペクトルを単純化した。この新規なノイズ除去プロセスは、ＮＭＲデータのより精確な定量分析を可能にし、これを下記の実験のために使用した。

【0070】

実験間の技術的変動について管理するために、シグナル強度の正規化を行った。図１Ｆ及び図１Ｇに示すように、目的の領域を特定し、単離した。図１Ｈに示すように、スペクトル間の定量的比較を容易にするために、目的の領域内のビンの強度を、目的の領域の、最も高い強度のビンに対して正規化した。

【0071】

図１Ｉ及び図１Ｊに示すように、前のステップからの、調整され、正規化された強度を使用して、スペクトルのシグナル領域を、スペクトルのノイズ領域から分離し得た。

【0072】

実施例２．ｍＡｂ製造におけるプロセス変動性の評価
２つのモノクローナル抗体、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２を、２つの異なるプロセス、プロセス１及びプロセス２を使用して各々製造した。抗体高次構造（ＨＯＳ）の点で両方のプロセスのプロセス変動性を分析するために、新規なＮＭＲ技法を開発した。

【0073】

プロセス１及びプロセス２に従って製造した３ロットのｍＡｂ１及びｍＡｂ２を、上記のように、ＮＭＲを使用して分析した。各プロセスについての各抗体についての^１３Ｃ／^１Ｈスペクトルを、図２に示すように、平均化し、重ね合わせた。プロセス１からのスペクトルを黒で示し、プロセス２からのスペクトルを赤で示す。重ね合わされた平均化されたスペクトルは、プロセス間でほとんど変動が存在しないことを示す。スペクトルの平均化及び重ね合わせのこの方法は、抗体ＨＯＳにおけるプロセス変動性の容易な視覚的分析を可能にする。各プロセスについての各抗体についてのＮＭＲスペクトルを平均化することは、ロット間変動の小さな効果を除去し、各プロセスについての部位間の有意差の分析を可能にする。

【0074】

製造プロセス間の更なる比較を、ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲを使用して実施した。各プロセスについての各抗体についての平均化されたスペクトルを、図３に示すように相関させた。両方の抗体について、２つの製造プロセスは、決定係数（Ｒ^２）及び二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）の両方によって測定したところ、高度に比較可能であった。ｍＡｂ２のためのプロセスは、おそらくより比較可能であった。ＥＣＨＯＳ－ＮＭＲ分析のための平均化されたスペクトルの使用は、製造プロセス間の堅牢な比較を可能にし、これは、いかなるロット間変動性をも補償する。

【0075】

プロセス変動性の追加の分析を、ＰＣＡを使用して行った。図４Ａに示すように、各プロセスについての各抗体についての代表的なスペクトルを、上位２つの主成分のスコアに基づいて互いに対してプロットした。製造プロセスによってグループ化された９５％信頼密度の楕円（「クラスター」）をプロットした。この分析は、プロセス間及びプロセス内の両方の可視的な変動を与え、単一のロット間比較と比べて、潜在的な品質管理関連性を有する抗体ＨＯＳ変動のより詳細な理解を可能にする。図４Ａ及び４Ｂに示す例において、このＰＣＡ分析は、ｍＡｂ１について、各成分における相関が、各プロセスの間で一貫性があるようであることを明らかにする。対照的に、ｍＡｂ２について、プロセス１についてのコンポーネント１は、プロセス２についてよりも変動性であるようであり、一方、プロセス２についてのコンポーネント２は、プロセス１についてよりも変動性であるようである。図４Ｂ及び４Ｃはまた、スペクトル類似性数に加えて分散ブレークダウンを示す。

【0076】

このＰＣＡ分析からのデータを、図４Ｄに示すように、上記で確立された各製造プロセスからのＮＭＲスペクトルのクラスターの統計分析を使用して更に調べ得る。プロセス変動性を、様々な方法で、例えば、ＰＣＡプロット上のスペクトル値の平均又は標準的な変動をとることによって、定量化及び比較し得る。この分析は、タンパク質製造プロセス間の変動性を比較するための単純な定量的方法を提供する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【国際調査報告】