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特表2024-526735免疫沈降及びネイティブＳＣＸ－ＭＳ検出を使用する、治療用抗体及び関連生成物のバイオアナリシス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】免疫沈降及びネイティブＳＣＸ－ＭＳ検出を使用する、治療用抗体及び関連生成物のバイオアナリシス
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240711BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240711BHJP
G01N 33/544 20060101ALI20240711BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240711BHJP
C07K 16/42 20060101ALN20240711BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
G01N33/543 541A
G01N33/544 Z
G01N27/62 G
G01N27/62 X
C07K16/42
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024501677
(86)(22)【出願日】2022-07-12
(85)【翻訳文提出日】2024-02-20
(86)【国際出願番号】 US2022036873
(87)【国際公開番号】W WO2023287826
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】63/221,439
(32)【優先日】2021-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507302748
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ユエティエン
(72)【発明者】
【氏名】ワン シュンハイ
【テーマコード（参考）】
2G041
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041DA05
2G041EA04
2G041FA10
2G041FA12
2G041GA01
2G041GA10
2G041HA01
4H045AA50
4H045BA60
4H045BA61
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA50
4H045FA71
(57)【要約】
本発明は、概して、抗体及び関連生成物を特徴付ける方法に関する。特に、本発明は、試料中の抗体及び関連生成物を特異的かつ高感度で検出及び定量化するための、免疫沈降及びネイティブ強陽イオン交換クロマトグラフィー－質量分析法の使用に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体を特徴付けるための方法であって、（ａ）前記抗体を固相基体上に固定化することと、
（ｂ）前記抗体の非結合断片を産生するために、前記固定化された抗体を消化酵素に接触させることと、
（ｃ）前記抗体断片を溶出することと、
（ｄ）前記抗体を特徴付けるために、前記溶出液をネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析に供することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記抗体が、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記固定化するステップが、前記抗体を含む試料を、前記抗体に結合することができる固相基体に接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記固相基体が、ビーズを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ビーズが、アガロースビーズ又は磁気ビーズである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記結合することが、前記固相基体に接着した抗体によって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記抗体が、抗Ｆｃ抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記抗体を固定化した後、前記固相基体を洗浄するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記消化酵素が、ＩｄｅＳ又はそのバリアントである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記抗体断片が、Ｆａｂ２断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記溶出することが、前記固相基体及び前記抗体断片を遠心分離するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ＳＣＸシステムが、質量分析計に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
抗体の前記特徴付けが、抗体の定量化を含み、任意選択的に、前記定量化が、内部標準に対して正規化される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記試料が、血清試料である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２２１，４３９号の優先権及び利益を主張し、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２２１，４３９号の優先権及び利益を主張し、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
分野
本発明は、概して、抗体及び関連生成物を特徴付けるための方法に関する。
本発明は、概して、抗体及び関連生成物を特徴付けるための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
治療用ペプチド又はタンパク質は、産生のために細胞培養懸濁液中で発現される。続いて、ペプチド又はタンパク質を精製して、プロセス関連不純物を除去する。精製された治療用ペプチド又はタンパク質の製品品質特性は、薬物動態に関連性のある、それらの関連する安全性、有効性、及び保存期間プロファイルの維持を確実にするように、広範囲に特徴付けられる。
治療用ペプチド又はタンパク質は、産生のために細胞培養懸濁液中で発現される。続いて、ペプチド又はタンパク質を精製して、プロセス関連不純物を除去する。精製された治療用ペプチド又はタンパク質の製品品質特性は、薬物動態に関連性のある、それらの関連する安全性、有効性、及び保存期間プロファイルの維持を確実にするように、広範囲に特徴付けられる。
【0004】
治療用ペプチド又はタンパク質の変化は、産生プロセス及び／又は精製プロセス中及び後の任意の時点で生じ得る。治療用ペプチド又はタンパク質は、様々な翻訳後修飾、タンパク質分解、酵素修飾、及び化学修飾により、不均一になる可能性がある。バイオ医薬品の生物物理学的特徴へのこれらの変化は、関連する安全性、有効性、及び保存期間に影響を及ぼす可能性がある。
【0005】
治療用ペプチド又はタンパク質の他の重要な特徴には、インビボでの存在量及び療法のタイミングを決定する薬物動態及び薬力学などの特性が含まれる。インビボでの治療薬の処理を理解することは、その治療薬がどのように最良に産生され、送達されるかを決定するために、例えば、投与経路、投薬、並びに治療効果及び有害作用を決定するために不可欠であり得る。
【0006】
多くの場合、検出を複雑にする血清などの複雑なマトリックスの文脈において、治療用ペプチド又はタンパク質のこれらの特徴を正確かつ効率的に評価するには、高スループット、高感度、及び高特異性の技術が必要である。治療用ペプチド及びタンパク質並びにそれらの主要な特徴の正確な特徴付け及び定量化を達成するための方法及びシステムに対する必要性が存在することが、理解されるであろう。
【発明の概要】
【0007】
概要
抗体及び関連生成物の検出及び定量化のためのネイティブＳＣＸ－ＭＳ法が開発されている。抗ヒトＦｃ抗体でコーティングされたアガロースビーズを用いた免疫沈降を使用して、試料中のヒト抗体をプルダウンすることができる。消化酵素ＩｄｅＳ又はそのバリアントを使用して、固定化された抗体を切断し、溶出及び回収され得るＦａｂ２断片を産生することができる。次いで、この断片を、感度が高く堅牢な定量化のために、ネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析に供することができる。実施例で実証されるように、本発明の方法は、低濃度であっても、純粋な溶液又は血清中であっても、抗体を効率的かつ正確に定量化することが示された。
抗体及び関連生成物の検出及び定量化のためのネイティブＳＣＸ－ＭＳ法が開発されている。抗ヒトＦｃ抗体でコーティングされたアガロースビーズを用いた免疫沈降を使用して、試料中のヒト抗体をプルダウンすることができる。消化酵素ＩｄｅＳ又はそのバリアントを使用して、固定化された抗体を切断し、溶出及び回収され得るＦａｂ２断片を産生することができる。次いで、この断片を、感度が高く堅牢な定量化のために、ネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析に供することができる。実施例で実証されるように、本発明の方法は、低濃度であっても、純粋な溶液又は血清中であっても、抗体を効率的かつ正確に定量化することが示された。
【0008】
本開示は、抗体の特徴付けのための方法を提供する。一部の例示的な実施形態では、本方法は、（ａ）当該抗体を固相基体上に固定化することと、（ｂ）当該抗体の非結合断片を産生するために、当該固定化された抗体を消化酵素に接触させることと、（ｃ）当該抗体断片を溶出することと、（ｄ）当該抗体を特徴付けるために、当該溶出液をネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析に供することとを含む。
【0009】
一態様では、当該抗体は、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である。
【0010】
一態様では、当該固定化するステップは、当該抗体を含む試料を、当該抗体に結合することができる固相基体に接触させることを含む。特定の態様では、当該試料は、血清試料である。
【0011】
一態様では、当該固相基体は、ビーズを含む。特定の態様では、当該ビーズは、アガロースビーズ又は磁気ビーズである。
【0012】
特定の態様では、当該固相基体の当該結合は、当該固相基体に接着した抗体によって行われる。更なる特定の態様では、当該抗体は、抗Ｆｃ抗体である。
【0013】
一態様では、本方法は、当該抗体を固定化した後、当該固相基体を洗浄するステップを更に含む。
【0014】
一態様では、当該消化酵素は、ＩｄｅＳ又はそのバリアントである。別の態様では、当該抗体断片は、Ｆａｂ２断片である。
【0015】
一態様では、当該溶出することは、当該固相基体及び抗体断片を遠心分離するステップを含む。
【0016】
一態様では、当該ＳＣＸシステムは、当該質量分析計に結合されている。別の態様では、当該質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計である。
【0017】
一態様では、抗体の当該特徴付けは、抗体の定量化を含み、任意選択的に、当該定量化は、内部標準に対して正規化される。
【0018】
本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮すると、よりよく評価され、理解されるであろう。以下の説明は、様々な実施形態及びその多数の具体的詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。本発明の範囲内で、多くの置換、修正、追加、又は再配置を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】例示的な実施形態による本発明の方法のワークフローを例示する。
【図2】例示的な実施形態による、抗体の分離のためのＳＣＸ－ＭＳ全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）における異なるＳＣＸカラムの性能の比較を示す。
【図3A】例示的な実施形態による、一連の異なる抗体のＳＣＸ－ＭＳ ＴＩＣを示す。
【図3B】例示的な実施形態による、様々な濃度でのｍＡｂ１の質量スペクトルを示す。
【図3C】例示的な実施形態による、様々な濃度でのｍＡｂ２の質量スペクトルを示す。
【図4A】例示的な実施形態による、ｍＡｂ１ Ｆａｂ２及び内部標準ｍＡｂ２ Ｆａｂ２のＳＣＸ－ＭＳ ＴＩＣを示す。
【図4B】例示的な実施形態による、内部標準と比較して、純粋な溶液中で２０ｐｇ～２０ｎｇの測定されたｍＡｂ１濃度の線形性を示す。
【図4C】例示的な実施形態による、内部標準と比較して、純粋な溶液中で２０ｎｇ～２μｇの測定されたｍＡｂ１濃度の線形性を示す。
【図4D】例示的な実施形態による、純粋な溶液中で２０ｐｇ～２μｇの濃度でのｍＡｂ１の質量スペクトルを示す。
【図5A】例示的な実施形態による、内部標準に対して正規化した場合の、血清中の測定されたｍＡｂ１濃度の線形性を示す。
【図6A】例示的な実施形態による、内部標準に対して正規化しない場合の、血清中の測定されたｍＡｂ１濃度の線形性を示す。
【図7A】例示的な実施形態による、質量スペクトルにおける、血清中のｍＡｂ１の検出限界（ＬＯＤ）を示す。
【図7B】例示的な実施形態による、質量スペクトルにおける、血清中のｍＡｂ１の定量限界（ＬＯＱ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
治療用ペプチド又はタンパク質は、様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）、タンパク質分解、酵素修飾、及び化学的修飾により不均一になり得、これは、ペプチド又はタンパク質の産生及び精製中及びその後の任意の時点で導入され得る。異種バリアントの特定及び特徴付けは、バイオ医薬品の生物物理学的特徴の品質特性を制御するために重要である。モノクローナル抗体又は抗体－薬物コンジュゲートの産生などの治療用ペプチド又はタンパク質の産生及び精製を制御及びモニタリングするための高速高感度ハイスループットの分析方法が、バイオ医薬品産業において必要とされている。
治療用ペプチド又はタンパク質は、様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）、タンパク質分解、酵素修飾、及び化学的修飾により不均一になり得、これは、ペプチド又はタンパク質の産生及び精製中及びその後の任意の時点で導入され得る。異種バリアントの特定及び特徴付けは、バイオ医薬品の生物物理学的特徴の品質特性を制御するために重要である。モノクローナル抗体又は抗体－薬物コンジュゲートの産生などの治療用ペプチド又はタンパク質の産生及び精製を制御及びモニタリングするための高速高感度ハイスループットの分析方法が、バイオ医薬品産業において必要とされている。
【0021】
投与後のインビボでの治療用ペプチド又はタンパク質のプロセシングは、治療薬の有効性及び安全性などの特徴を更に決定する。ペプチド又はタンパク質の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）などの特性は、投与後にのみ明らかになる可能性がある。加えて、治療用ペプチド又はタンパク質への修飾は、インビボで行われ続けてもよく、その結果、製造中に予測不可能であり得る生体内変換生成物がもたらされる。したがって、治療薬の重要な特性を完全に理解するために、生体試料を分析することができ、これは、目的のタンパク質又はペプチドの高感度かつ特異的な特徴付け及び定量化に対する複雑性及び課題の増加を提示する。
【0022】
エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ ＭＳ）ベースのインタクトなタンパク質分析は、開発中の治療用タンパク質の特徴付けに不可欠なツールとなっている。最も一般的には、ＭＳは、変性条件下で逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）と結合されている。しかしながら、本方法の感度、及び結果として得られる広範囲の分析物の電荷状態を有する複雑な試料によって生成されるシグナル対ノイズ比には限界があり、低存在量の抗体の正確な定量化には信頼性が低くなる可能性がある。
【0023】
最近、ＥＳＩ ＭＳにオンラインで結合されたネイティブイオン交換クロマトグラフィーを含むＬＣ－ＭＳシステムが記載されている（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，３１：２１７１－２１７９）。ネイティブ強陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＣＸ）－ＭＳの使用は、従来の変性ＲＰＬＣ－ＭＳと比較して、治療用抗体の分析に多くの利点を提供する。ネイティブＳＣＸ－ＭＳは、ＲＰＬＣと比較して、高い感度及び広いダイナミックレンジ、及び、例えば、血清試料中の血清タンパク質などのマトリックスから標的分析物を分離する優れた能力を実証し得る。ネイティブＳＣＸ－ＭＳプロファイルはまた、優れたＭＳ空間分解能を特徴とし得、タンパク質バリアント又は生体内変換生成物の検出が容易になる。
【0024】
上記のように、試料中の治療用タンパク質及びペプチド、例えば、治療用抗体を特徴付け及び定量化するための高感度の方法に対する必要性が存在する。本開示は、治療用抗体の開発に好適な、抗体を特徴付けるための新規のネイティブＳＣＸ－ＭＳ方法を説明する。
【0025】
別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似又は等価な任意の方法及び材料が、実施又は試験において使用され得るが、特定の方法及び材料がここで記載される。
【0026】
「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、端点が含まれる。本明細書で使用される場合、それぞれ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。
【0027】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「目的のタンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含み得る。タンパク質は、当技術分野で概して「ポリペプチド」として知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して連結された、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、及びその合成の天然に存在しない類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、天然に存在しないペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が当業者に知られている。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために１つ又は複数のポリペプチドを含み得る。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含むことができる。目的のタンパク質は、生物学的治療用タンパク質、研究又は治療において使用される組換えタンパク質、捕捉タンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、並びに二重特異性抗体のいずれかを含むことができる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）の種）、及び哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）のような、組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。生物学的治療用タンパク質及びそれらの産生を考察する最近の総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ”（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ １４７－１７６（２０１２）、その教示全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一部の例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、及び他の共有結合部分を含む。これらの修飾、付加物及び部分としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識及び他の色素などが挙げられる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類することができ、したがって、球状タンパク質及び繊維状タンパク質などの単純タンパク質と、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などのコンジュゲートされたタンパク質と、一次由来タンパク質及び二次由来タンパク質などの由来タンパク質とを含むことができる。
【0028】
一部の例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ及びそれらの組み合わせであり得る。
【0029】
本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、好適な宿主細胞に導入されている組換え発現ベクターに担持される遺伝子の転写及び翻訳の結果として産生されたタンパク質を指す。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプの抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、抗体分子は、全長抗体（例えば、ＩｇＧ１）であるか、又は代替的に、抗体は、断片（例えば、Ｆｃ断片又はＦａｂ断片）であり得る。
【0030】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。本発明の異なる実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得、又は天然若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解消化又は抗体可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準技術を使用して、完全抗体分子から得ることができる。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ－抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であり、又は合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的に又は分子生物学技術を使用することによって操作して、例えば、１つ以上の可変及び／若しくは定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、又はコドンを導入する、システイン残基を作製する、アミノ酸を修飾する、付加する、若しくは欠失させることなどができる。
【0031】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などの、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２（又は「Ｆａｂ２」）断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続される組換え一本鎖ポリペプチド分子である。一部の例示的な実施形態では、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、一部の例示的な実施形態では、断片は、親抗体の親和性に匹敵する親和性で抗原に結合し、かつ／又は抗原への結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的若しくは化学的に産生されてもよく、かつ／又は部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換えによって産生されてもよい。一部の例示的な実施形態では、抗体断片は、消化酵素ＩｄｅＳ又はそのバリアントによる消化によって産生され得る。代替的に、又は追加的に、抗体断片は、全体又は部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、単鎖抗体断片を含み得る。代替的に、又は追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結される複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的に、多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。
【0032】
「二重特異性抗体」という用語は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上又は同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかの異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は、概して、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１～２桁又は３桁又は４桁低く、逆もまた同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ又は異なる標的上（例えば、同じ又は異なるタンパク質上）に存在し得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、かかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞において発現され得る。
【0033】
典型的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲ、次いでＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを持つ２つの重鎖と、抗原結合特異性を与えないが各重鎖と会合することができる、又は各重鎖と会合することができ、重鎖抗原結合領域によって結合される１つ以上のエピトープと結合することができる、又は各重鎖に会合することができ、１つ若しくは両方の重鎖を１つ若しくは両方のエピトープに結合させることができる、免疫グロブリン軽鎖とを有する。ｂｓＡｂは、Ｆｃ領域を有するもの（ＩｇＧ様）及びＦｃ領域を欠くものの２つの主要なクラスに分けることができ、後者は通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、トリオマブ、ノブイントゥホールＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツーインワン若しくはデュアルアクションＦａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－一本鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλボディなどであるがこれらに限定されない、異なる形式を有し得る。非ＩｇＧ様の異なるフォーマットは、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディフォーマット、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重アフィニティーリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法によって産生される抗体を含む（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ ＆ Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ＆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０；Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６５－３１０（２０１４）、その教示全体が本明細書に組み込まれる）。ｂｓＡｂを産生する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、化学的架橋剤を含む化学的結合、及び組換えＤＮＡ技術を利用する遺伝学的アプローチに限定されない。ｂｓＡｂの例としては、参照により本明細書に組み込まれる、以下の特許出願、すなわち２０１０年６月２５日に出願された米国特許出願第１２／８２３８３８号、２０１２年６月５日に出願された米国特許出願第１３／４８８６２８号、２０１３年９月１９日に出願された米国特許出願第１４／０３１０７５号、２０１５年７月２４日に出願された米国特許出願第１４／８０８１７１号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５７４号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５６９号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４５３号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４４３号、２０１６年７月２９日に出願された米国特許出願第１５／２２３４３号、及び２０１７年１１月１５日に出願された米国特許出願第１５８１４０９５号に開示されているものが挙げられる。
【0034】
本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。かかる分子は、通常、２つの抗原のみに結合する（すなわち、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）が、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性などの更なる特異性を有する抗体もまた、本明細書に開示されるシステム及び方法によって対処することができる。
【0035】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能な又は既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一のクローンから得ることができる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で既知の多種多様な技術を使用して調製することができる。
【0036】
一部の例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、哺乳動物細胞から産生され得る。哺乳動物細胞は、ヒト起源又は非ヒト起源であり得、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞及び網膜上皮細胞）、樹立細胞株及びそれらの株（例えば、２９３胎児腎細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞及びＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－ｌ細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ－細胞、ＰＫ－１５細胞又はその誘導体）、任意の組織又は器官（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓を含むが、これらに限定されない）由来の線維芽細胞、並びに線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、ミディ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、ホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、及びジェンセン細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞又はその誘導体）を含み得る。
【0037】
本明細書で使用される場合、「試料」は、細胞培養流体（ＣＣＦ）、採取された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）、下流処理における任意のステップ、原薬（ＤＳ）、又は最終製剤化製品を含む医薬品（ＤＰ）などのバイオプロセスの任意のステップから得ることができる。一部の他の特定の例示的な実施形態では、試料は、清澄化、クロマトグラフィー生成、ウイルス不活性化、又は濾過の下流プロセスの任意のステップから選択され得る。一部の特定の例示的な実施形態では、医薬品は、診療所、出荷、保管、又は取り扱い時に、既製の医薬品から選択することができる。
【0038】
試料はまた、治療用ペプチド又はタンパク質の投与の前及び／又は後に対象から採取され得、その場合、それは、「生体試料」又は「ＰＫ試料」であり得る。生体試料は、例えば、組織試料、血液試料、血清試料、唾液試料、又は尿試料であってもよい。例示的な実施形態では、投与後の目的のタンパク質を特徴付け及び／又は定量化するために、対象から血清試料が採取される。一部の例示的な実施形態では、生体試料は、マウスから採取される。
【0039】
本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、タンパク質バイオ医薬品に存在するあらゆる望ましくないタンパク質を挙げることができる。不純物には、プロセス及び生成物関連不純物が含まれ得る。不純物は更に、既知の構造を有するか、部分的に特徴付けられるか、又は未特定であり得る。プロセス関連不純物は、製造プロセスから誘導することができ、３つの主要なカテゴリー：細胞基材由来、細胞培養由来、及び下流由来を含むことができる。細胞基材由来の不純物は、宿主生物由来のタンパク質、及び核酸（宿主細胞のゲノム、ベクター、又は全ＤＮＡ）を含むが、これらに限定されない。細胞培養由来の不純物は、誘導物質、抗生物質、血清、及び他の培地成分を含むが、これらに限定されない。下流由来不純物としては、酵素、化学的及び生化学的処理試薬（例えば、臭化シアン、グアニジン、酸化剤及び還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、並びに他の浸出性物が挙げられるが、これらに限定されない。生成物関連不純物（例えば、前駆体、特定の分解生成物）は、活性、有効性、及び安全性に関して所望の生成物のものと同等の特性を有しない、製造及び／又は保存中に生じる分子バリアントであり得る。そのようなバリアントは、修飾のタイプを特定するために、単離及び特徴付けにおけるかなりの努力を必要とし得る。生成物関連不純物には、切断形態、修飾形態、及び凝集体が含まれ得る。切断形態は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素又は化学物質によって形成される。修飾形態としては、脱アミド化、異性化、ミスマッチＳ－Ｓ連結、酸化、又は改変共役形態（例えば、グリコシル化、リン酸化）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾形態はまた、任意の翻訳後修飾形態を含み得る。凝集体には、所望の生成物の二量体及びより高い倍数体が含まれる。（Ｑ６Ｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。
【0040】
本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」又は「ＰＴＭ」という一般的な用語は、ポリペプチドがリボソーム合成中（翻訳時修飾）又はその後（翻訳後修飾）のいずれかで受ける共有結合修飾を指す。ＰＴＭは概して、特定の酵素又は酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（シグネチャー配列）の部位で起こる。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は、タンパク質の構造又は機能の何らかの側面に常に影響を及ぼす（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾としては、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（ビオチンによるリジン残基のアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（通常、タンパク質のＮ末端でのアセチル基の付加）、アルキル化（通常、リジン又はアルギニン残基でのアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内又はポリペプチド鎖間の共有結合架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリン及びリジンのヒドロキシル化並びにカルボキシ末端のアミド化）、ビタミンＫ依存性修飾（ビタミンＫは、γ－カルボキシグルタメート（グルタミン酸残基）の形成をもたらすグルタミン酸残基のカルボキシル化における補因子である）、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（共有結合グリシン残基）、グリコシル化（アスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン、又はスレオニンのいずれかにグリコシル基を付加し、糖タンパク質をもたらす）、イソプレニル化（ファルネソール及びゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポ酸官能基の付加）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、及びロイシンの生合成などにおけるコエンザイムＡからの４’－ホスホパンテテイニル部分の付加）、リン酸化（通常はセリン、チロシン、スレオニン、又はヒスチジンへのリン酸基の付加）、及び硫酸化（通常はチロシン残基への硫酸基の付加）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾としては、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、及び脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸への又はアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が挙げられるが、これらに限定されない。構造変化を伴う翻訳後修飾としては、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）及びタンパク質切断（ペプチド結合でのタンパク質の切断）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の翻訳後修飾は、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン活性化遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質（低分子ユビキチン関連修飾因子）への共有結合）、及びユビキチン化（タンパク質へのユビキチンの共有結合）などの他のタンパク質又はペプチドの付加を伴う。ＵｎｉＰｒｏｔによって精選されたＰＴＭのより詳細な統制語彙については、欧州バイオインフォマティクス研究所タンパク質情報リソース、ＳＩＢスイスバイオインフォマティクス研究所、欧州バイオインフォマティクス研究所Ｄｒｓ－ドロソマイシン前駆体－Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）－Ｄｒｓ遺伝子及びタンパク質、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔ（最終訪問日：２０１９年１月１５日）を参照されたい。
【0041】
治療用ペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾、電荷バリアント、又はサイズバリアントは、治療用ペプチド又はタンパク質の産生、製造、保管、送達、又は投与中の任意の時点で生じ得る。ペプチド又はタンパク質に対する追加の修飾は、「生体内変換」と称されるプロセスにおいて、対象に投与された後にインビボで生じ得る。生体内変換生成物は、投与前治療薬と比較して、修飾された特性を有し得る。生体内変換は、しばしば治療薬のサイズの縮小をもたらすため、より小さい分析物に対してより高い感度を有する検出方法が好まれる場合がある。一部の例示的な実施形態では、本発明の方法は、目的のタンパク質の生体内変換生成物に対する感度の高さを特徴とする。
【0042】
一部の例示的な実施形態では、目的のタンパク質を特徴付け及び／又は定量化するための方法は、任意選択的に、免疫沈降（ＩＰ）を使用して試料マトリックス中の目的のタンパク質を富化することを含み得る。本明細書で使用される場合、「免疫沈殿」という用語は、その特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して、タンパク質抗原を溶液から沈殿させるプロセスを含み得る。免疫沈降は、標的タンパク質の抗体が固相基体上に固定化される直接的なものであってもよく、又は遊離抗体がタンパク質混合物に添加され、その後、例えば、タンパク質Ａ／Ｇビーズで捕捉される間接的なものであってもよい。
【0043】
一部の例示的な実施形態では、固相基体は、ビーズ、例えば、アガロースビーズ又は磁気ビーズであってもよい。抗体への接着を容易にするために、ビーズをストレプトアビジンでコーティングしてもよい。次いで、ビオチン化「捕捉」抗体をストレプトアビジンでコーティングされたビーズに接触させ、ビーズに接着させ、接着した抗体の抗原に結合することができる「免疫沈降ビーズ」を形成させてもよい。一部の例示的な実施形態では、接着した捕捉抗体は、抗Ｆｃ抗体であってもよく、具体的には、抗ヒトＦｃ抗体であり得る。
【0044】
抗ヒトＦｃ抗体は、例えば、治療用抗体などの任意のヒト抗体のＦｃドメインに優先的に結合し、したがって、試料から治療用抗体を免疫沈降又は「プルダウン」するために使用することができ、分析のために濃縮することを可能にする。治療用抗体の免疫沈降後、消化酵素を免疫沈降混合物に接触させて、治療用抗体を切断し、抗体断片を放出させ、これは次いで、更なる分析のために溶出され得る。例示的な実施形態では、ＩｄｅＳ又はそのバリアントは、消化酵素として使用される。ＩｄｅＳ切断は、Ｆｃ断片及びＦａｂ２断片の２つの抗体断片を産生する。治療用抗体のＦｃドメインが抗ヒトＦｃ捕捉抗体に結合する場合、ＩｄｅＳによる切断は、非結合Ｆａｂ２断片の放出をもたらし、次いで、更なる分析のために溶出することができる。例示的な実施形態では、溶出されたＦａｂ２断片は、液体クロマトグラフィー－質量分析法分析、特にネイティブＳＣＸ－ＭＳに供される。
【0045】
本明細書で使用される場合、「消化」という用語とは、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用して試料中のタンパク質の消化を行うための複数のアプローチ（例えば、酵素的消化又は非酵素的消化）が存在する。
【0046】
本明細書で使用される場合、「消化酵素」という用語は、タンパク質の消化を行うことができる多数の異なる薬剤のいずれかを指す。酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）由来のプロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）若しくは外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）、ストレプトコッカスピオゲネスの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ又はそれらの生物学的に活性な断片若しくはホモログ又はそれらの組み合わせが挙げられる。タンパク消化のための利用可能な技術を考察する最近の総説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ＆Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １０６７－１０７７（２０１３））を参照されたい。
【0047】
一部の例示的な実施形態では、ＩｄｅＳ又はそのバリアントは、ヒンジ領域の下で抗体を切断し、Ｆｃ断片及びＦａｂ２断片を産生するために使用される。サイズの減少は、ＬＣ－ＭＳを使用する分析物の特徴付け及び検出の感度及び特異性を向上させる可能性があるため、分析物の消化は有利である可能性がある。この目的のために使用される場合、Ｆｃ断片を分離し、分析のためにＦａｂ２断片を保持する消化が好ましい場合がある。これは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）などの目的の可変領域がＦａｂ２断片に含まれているが、Ｆｃ断片は抗体間で比較的均一であり得るため、関連性の低い情報が提供される可能性があるためである。加えて、ＩｄｅＳ消化は効率が高く、分析物の高い回収率を可能にする。消化プロセス及び溶出プロセスは、ネイティブＬＣ－ＭＳシステムへの単純な結合を可能にするネイティブ条件下で行われ得る。
【0048】
ＩｄｅＳ又はそのバリアントは、市販されており、例えば、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）又はＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ Ｚ（登録商標）として市販され得る。
【0049】
本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」という用語は、液体によって運ばれる生物学的／化学的混合物が、静止した液相又は固相を通って流れる（又は流れ込む）際の成分の分布の差の結果として、成分に分離することができるプロセスを指す。液体クロマトグラフィーの非限定的例は、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、又は混合モードクロマトグラフィーを含む。
【0050】
一部の例示的な実施形態では、目的のタンパク質を特徴付け及び／又は定量化するための方法は、強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーの使用を含むことができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、正に荷電した分析物を捕捉するために、負に荷電した官能基を提示する固定相を使用するイオン交換クロマトグラフィーのサブセットである。分析物をｐＩの順で放出及び溶出するために、クロマトグラフィー緩衝液のｐＨを徐々に調整することができる。
【0051】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、「陽イオン交換クロマトグラフィー材料」を使用する。陽イオン交換クロマトグラフィーは、使用される陽イオン交換クロマトグラフィー材料に応じて、例えば、強陽イオン交換（ＳＣＸ）又は弱陽イオン交換に更に細分することができる。スルホン酸基（Ｓ）を有する陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、強陽イオン交換体に使用されてもよく、一方、カルボキシメチル基（ＣＭ）を有する陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、弱陽イオン交換体に使用されてもよい。強陽イオン交換体としては、例えば、硫酸メチルの官能基を使用するＳＯＵＲＣＥ Ｓ、及びスルホプロピルの官能基を使用するＳＰセファロースが挙げられる。弱陽イオン交換体としては、例えば、カルボキシメチルの官能基を使用するＣＭセルロースが挙げられる。ＳＣＸは、強陽イオン交換体の電荷を失うことなく、より広範囲のｐＨ緩衝液が使用することができ、広いｐＩ範囲を有する分析物の効果的な分離を可能になるため、好ましい場合がある。
【0052】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｂｉｏ－Ｒｅｘ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＣＭ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから入手可能）、弱陽イオン交換体ＷＣＸ２（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから入手可能）、Ｄｏｗｅｘ ＭＡＣ－３（Ｄｏｗ化学企業、Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈ．，ＵＳＡから入手可能）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｃ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡから入手可能）、セルロースＣＭ－２３、ＣＭ－３２、ＣＭ－５２、ｈｙｐｅｒ－Ｄ、及びｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ（Ｗｈａｔｍａｎ ｐｌｃ、Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ７６、ＩＲＣ７４７、ＩＲＣ７４８、ＧＴ７３（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）、ＣＭ１５００、ＣＭ３０００（ＢｉｏＣｈｒｏｍ Ｌａｂｓ、Ｔｅｒｒｅ Ｈａｕｔｅ，Ｉｎｄ．、ＵＳＡから入手可能）、並びにＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）などの異なる名前で、多くの会社から入手可能である。加えて、市販の陽イオン交換樹脂としては、カルボキシメチルセルロース、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ、アガロースに固定化されたスルホプロピル（ＳＰ）（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ又はＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、）及びアガロース上に固定化されたスルホニル（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なＳ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）が更に挙げられる。
【0053】
陽イオン交換クロマトグラフィー材料には、イオン交換及び疎水性相互作用技術の組み合わせを行う混合モードクロマトグラフィー材料（例えば、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌｌ、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＨＣＸなど）、陰イオン交換及び陽イオン交換技術の組み合わせを行う混合モードクロマトグラフィー材料（例えば、ヒドロキシアパタイト、セラミックヒドロキシアパタイトなど）などが含まれる。本発明における陽イオン交換クロマトグラフィーに使用され得る陽イオン交換クロマトグラフィー材料としては、上に記載される全ての市販の陽イオン交換クロマトグラフィー材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【0054】
変性ＲＰＬＣ－ＭＳは、治療用タンパク質の特徴付けにおける従来の技術であるが、ネイティブＳＣＸ－ＭＳは、本明細書に記載されるような分析上の利点を提供することができる。例えば、ネイティブＳＣＸ－ＭＳは、検出の改善された感度及び特異性を提供することができる。ＲＰＬＣ及びＳＣＸの検出限界が同等である場合、ＳＣＸは、優れたデータ品質及びより高いシグナル対ノイズ比を提供することができる。ＳＣＸは、標的分析物をマトリックスタンパク質（例えば、血清試料中の血清タンパク質）から分離する改善された能力を有し得、加えて、目的のタンパク質の生体内変換生成物を分離する改善された能力を有し得る。したがって、本発明の方法の好ましいクロマトグラフィーは、ネイティブＳＣＸであり、本明細書において、ネイティブＳＣＸを使用して目的のタンパク質を特徴付け及び／又は定量化する新規の方法が開示される。
【0055】
本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を認識し、その正確な質量を測定することができるデバイスを含む。この用語は、ポリペプチド又はペプチドが特徴付けられ得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、３つの主要部分、すなわち、イオン源、質量分析器、及び検出器を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。分析物原子、分子、又はクラスタは、気相に移行され、同時に（エレクトロスプレーイオン化におけるように）、又は別個のプロセスを通してイオン化されることができる。イオン源の選択は用途に依存する。一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析法」という用語は、試料分子についての構造情報が、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによって得られる技術を含む。必要条件は、第１の質量選択ステップの後に断片が予測可能かつ制御可能な方式で形成されるように、試料分子が気相に変換され、イオン化されることである。多段階ＭＳ／ＭＳ、又はＭＳｎは、意味のある情報を得ることができるか、又は断片イオンシグナルが検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ２）を選択及び単離すること、それを断片化すること、一次断片イオン（ＭＳ３）を単離すること、それを断片化すること、二次断片（ＭＳ４）を単離することなどによって行われ得る。タンデムＭＳは、広範な分析器の組み合わせを用いて正常に行われている。特定の用途のためにどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、及び速度だけでなく、サイズ、コスト、及び利用可能性などの多くの異なる要因によって決定することができる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペース及びタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器がスペース内で又はタンデムインスペース分析器と連結されるハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源と、前駆体イオン活性化デバイスと、少なくとも２つの非捕捉質量分析器とを備える。特定のｍ／ｚ分離関数は、機器の１つのセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで、産生イオンがｍ／ｚ分離及びデータ取得のために別の分析器に送られるように設計され得る。時間的に相前後して、イオン源で産生された質量分析計イオンは、同じ物理的デバイスで捕捉、単離、断片化、及びｍ／ｚ分離することができる。質量分析計によって特定されたペプチドは、インタクトなタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理代表として使用され得る。それらは、実験的及び理論的ＭＳ／ＭＳデータを相関させることによって、タンパク質特徴付けのために使用することができ、後者は、タンパク質配列データベース内の可能なペプチドから生成される。特徴付けとしては、限定されるものではないが、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質配列決定の決定、タンパク質デノボ配列決定の決定、翻訳後修飾の位置決定、又は翻訳後修飾の特定、又は比較可能性分析、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【0056】
一部の例示的な態様では、質量分析計は、ナノエレクトロスプレー又はナノスプレーを使用して動作することができる。
【0057】
本明細書で使用される「ナノエレクトロスプレー」又は「ナノスプレー」という用語は、多くの場合、外部溶媒送達を使用しない、非常に低い溶媒流量、典型的には、数百ナノリットル／分以下の試料溶液におけるエレクトロスプレーイオン化を指す。ナノエレクトロスプレーを形成するエレクトロスプレー注入セットアップは、静的ナノエレクトロスプレーエミッタ又は動的ナノエレクトロスプレーエミッタを使用することができる。静的ナノエレクトロスプレーエミッタは、長期間にわたって少量の試料（分析物）溶液の連続分析を行う。動的ナノエレクトロスプレーエミッタは、キャピラリーカラム及び溶媒送達システムを使用して、質量分析計による分析の前に混合物に対してクロマトグラフィー分離を行う。
【0058】
一部の例示的な実施形態では、ＳＣＸ－ＭＳは、ネイティブ条件下で行われ得る。
【0059】
本明細書で使用される場合、「ネイティブ条件」という用語は、分析物中の非共有結合性相互作用を保存する条件下で質量分析法を行うことを含み得る。ネイティブ質量分析法は、ネイティブ又はほぼネイティブの状態のインタクトな生体分子の構造を研究するためのアプローチである。「ネイティブ」という用語は、イオン化を受ける前の溶液中の分析物の生物学的状態を指す。生物学的分析物を含む溶液のｐＨ及びイオン強度などのいくつかのパラメータは、溶液中の生物学的分析物のネイティブのフォールディング状態を維持するように制御することができる。一般に、ネイティブ質量分析法は、エレクトロスプレーイオン化に基づいており、生物学的分析物は、非変性溶媒からスプレーされる。非共有、ネイティブスプレー、エレクトロスプレーイオン化、非変性、巨大分子、又は超分子質量分析などの他の用語は、ネイティブ質量分析法を記述することによっても使用することができる。例示的な実施形態では、ネイティブＭＳは、非ネイティブＭＳと比較してより良い空間分解能を可能にし、治療用タンパク質の生体内変換生成物の検出を改善する。ネイティブＭＳについての詳細な総説については、総説Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｂｏｅｒｉ Ｅｒｂａ＆Ｃａｒｌｏ Ｐｅ－ｔｏｓａ，Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，２４ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ１１７６－１１９２（２０１５）を参照されたい。
【0060】
一部の例示的な実施形態では、ＳＣＸ－ＭＳは、ネイティブ条件下で行われ得る。目的のペプチド又はタンパク質は、例えば、アルキル化、還元、変性、及び／又は消化によって調製され得る。
【0061】
本明細書で使用される場合、「タンパク質アルキル化剤」という用語とは、タンパク質中の特定の遊離アミノ酸残基をアルキル化するために使用される薬剤を指す。タンパク質アルキル化剤の非限定的な例は、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ）、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）、及び４－ビニルピリジン、又はそれらの組み合わせである。
【0062】
本明細書で使用される場合、「タンパク質変性」は、分子の三次元形状がその天然状態から変化するプロセスを指し得る。タンパク質の変性は、タンパク質変性剤を使用して行うことができる。タンパク質変性剤の非限定的な例としては、熱、高ｐＨ若しくは低ｐＨ、ＤＴＴのような還元剤（以下を参照のこと）、又はカオトロピック剤への曝露が挙げられる。複数のカオトロピック剤をタンパク質変性剤として使用することができる。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性効果などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨害することによって、系のエントロピーを増加させる。カオトロピック剤の非限定的な例としては、ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、Ｎ－ラウロイルサルコシン、尿素、及びそれらの塩が挙げられる。
【0063】
本明細書で使用される場合、「タンパク質還元剤」という用語とは、タンパク質中のジスルフィド架橋の還元のために使用される薬剤を指す。タンパク質を還元するために使用されるタンパク質還元剤の非限定的な例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、又はそれらの組み合わせである。
【0064】
一部の例示的な態様では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。
【0065】
本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析法」という用語は、試料分子についての構造情報が複数段階の質量選択及び質量分離を使用することによって得られる技術を含む。必要条件は、試料分子が気相に移行され得、インタクトなままイオン化され得ること、及びこれらの分子が、第１の質量選択ステップ後に、いくらかの予測可能かつ制御可能な方式でばらばらになるように誘導され得ることである。多段階ＭＳ／ＭＳ、又はＭＳｎは、意味のある情報を得ることができるか、又は断片イオンシグナルが検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ２）を選択及び単離すること、それを断片化すること、一次断片イオン（ＭＳ３）を単離すること、それを断片化すること、二次断片（ＭＳ４）を単離することなどによって行われ得る。タンデムＭＳは、広範な分析器の組み合わせを用いて正常に行われている。特定の用途のためにどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、及び速度だけでなく、サイズ、コスト、及び利用可能性などの多くの異なる要因によって決定することができる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペース及びタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器がスペース内で又はタンデムインスペース分析器と連結されるハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源と、前駆体イオン活性化デバイスと、少なくとも２つの非捕捉質量分析器とを備える。特定のｍ／ｚ分離関数は、機器の１つのセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで、産生イオンがｍ／ｚ分離及びデータ取得のために別の分析器に送られるように設計され得る。時間的に相前後して、イオン源で産生された質量分析計イオンは、同じ物理的デバイスで捕捉、単離、断片化、及びｍ／ｚ分離することができる。
【0066】
質量分析計によって特定されたペプチドは、インタクトなタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理代表として使用され得る。それらは、実験的及び理論的ＭＳ／ＭＳデータを相関させることによって、タンパク質特徴付けのために使用することができ、後者は、タンパク質配列データベース内の可能なペプチドから生成される。特徴付けとしては、限定されるものではないが、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質配列決定の決定、タンパク質デノボ配列決定の決定、翻訳後修飾の位置決定、又は翻訳後修飾の特定、又は比較可能性分析、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【0067】
本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、例えば、ＦＡＳＴＡ形式のファイルの形態で、試料中に存在する可能性があるタンパク質配列の編集されたコレクションを指す。関連するタンパク質配列は、研究される種のｃＤＮＡ配列に由来し得る。関連するタンパク質配列を検索するために使用され得る公的データベースは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ又はＳｗｉｓｓ－ｐｒｏｔによってホストされるデータベースを含んでいた。データベースは、本明細書で「バイオインフォマティクスツール」と称されるものを使用して検索することができる。バイオインフォマティクスツールは、データベース中の全ての可能な配列に対して解釈されていないＭＳ／ＭＳスペクトルを検索する能力を提供し、出力として解釈された（アノテーションされた）ＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。かかるツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）又はＳｅｑｕｅｓｔ（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。
【0068】
一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、クロマトグラフィーシステム、例えば、ＳＣＸに結合されている。
【0069】
一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、液体クロマトグラフィー多重反応モニタリングシステムに結合され得る。より一般的には、質量分析計は、連続反応モニタリング（ＣＲＭ）及び並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）によって分析することが可能であり得る。
【0070】
本明細書で使用される場合、「多重反応モニタリング」又は「ＭＲＭ」は、高感度、高特異性、及び広いダイナミックレンジを有する複雑なマトリックス内の小分子、ペプチド、及びタンパク質を正確に定量化することができる質量分析法ベースの技術を指す（Ｐａｏｌａ Ｐｉｃｏｔｔｉ ＆ Ｒｕｅｄｉ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｗｏｒｋｆｌｏｗｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｐｉｔｆａｌｌｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，９ ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ ５５５－５６６（２０１２））。ＭＲＭは、典型的には、三連四重極質量分析計を用いて行われ得、ここで、選択された小分子／ペプチドに対応する前駆体イオンが第１の四重極で選択され、かつ前駆体イオンの断片イオンが第３の四重極で監視するために選択された（Ｙｏｎｇ Ｓｅｏｋ Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，９３０ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ Ｂ １２９－１３５（２０１３））。
【0071】
いくつかの態様では、本出願の方法又はシステムにおける質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又はトリプル四重極質量分析計であり得、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに接続され得、質量分析計は、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析法）又はＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析法）分析を行うことができる。
【0072】
本明細書で使用される場合、「質量分析器」という用語は、質量に応じて種、つまり原子、分子、又はクラスタを分離することができるデバイスを含む。用いられ得る質量分析計の非限定的例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁場／電場セクタ、四重極質量フィルタ（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）及びまた加速器質量分析法（ＡＭＳ）の技術である。
【0073】
本発明は、前述の目的のタンパク質（複数可）、抗体（複数可）、抗体断片（複数可）、試料（複数可）、不純物（複数可）、ＰＴＭ（複数可）、免疫沈降法（複数可）、液体クロマトグラフィー法（複数可）又はシステム（複数可）、質量分析計（複数可）、アルキル化剤（複数可）、還元剤（複数可）、消化酵素（複数可）、データベース（複数可）、又はバイオインフォマティクスツール（複数可）のいずれにも限定されず、目的のタンパク質（複数可）、抗体（複数可）、抗体断片（複数可）、試料（複数可）、不純物（複数可）、ＰＴＭ（複数可）、免疫沈降法（複数可）、液体クロマトグラフィー法（複数可）又はシステム（複数可）、質量分析計（複数可）、アルキル化剤（複数可）、還元剤（複数可）、消化酵素（複数可）、データベース（複数可）、又はバイオインフォマティクスツール（複数可）は、任意の好適な手段によって選択され得ることが理解される。
【0074】
本発明は、以下の実施例を参照することにより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0075】
本発明の方法の例示的な実施形態を、図１に例示する。示される第１の成分は、ストレプトアビジン部分とコンジュゲートされたアガロースビーズを含有するカートリッジである。次いで、ビオチン化抗ヒトＦｃ抗体をカートリッジに添加し、ストレプトアビジンビーズに結合させて、免疫沈降ビーズを産生する。ビオチン化抗ヒトＦｃは、産生又は市販され得る。例示的なビオチン－ストレプトアビジン反応は、ほぼ室温で約１５分間インキュベートすることを含む。次いで、分析物を含む試料をカートリッジに添加し、インキュベートして、分析物を免疫沈降又は「プルダウン」する。例示的な免疫沈降プロセスは、ほぼ室温で約１時間インキュベートすることを含む。例示される実施例は、目的のタンパク質及び分析物としての三重特異性抗体を含む薬物動態研究からの試料であるが、本発明の方法は、この実施例に限定されず、任意の抗体又は抗体関連タンパク質を含む任意の適切な試料に適用され得る。
【0076】
次いで、試料を洗浄して、非特異的に結合した成分を除去する。例示的な洗浄するステップは、カートリッジを、６カートリッジ体積のＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（Ｃｙｔｉｖａ）で洗浄し、続いて、６カートリッジ体積のＴｒｉｓ－ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄することを含む。次いで、消化酵素、例えば、ＩｄｅＳ又はそのバリアントをカートリッジに添加し、インキュベートし、これにより、結合した分析物の切断、例えば、抗体のＦａｂ２断片からのＦｃ断片の分離がもたらされる。例示的な消化ステップは、分析物１μｇ当たり４０単位のＩｄｅＳタンパク質ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）（Ｇｅｎｏｖｉｓ）、又は１単位の消化酵素を添加し、約３７℃で約３０分間～約１時間インキュベートすることを含む。カートリッジを遠心分離（「スピンダウン」）し、遊離Ｆａｂ２断片を溶出し、溶出液を回収して、その後のネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析を行う。
【0077】
ネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析のための例示的な方法は、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，３１：２１７１－２１７９（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例示的な実施形態では、ＳＣＸ－ＭＳの条件は、以下のとおりである。ＳＣＸカラムは、ＹＭＣ ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳＦ ４．６×５０ｍｍ、５μｍである。カラム温度は４５℃である。移動相Ａ（ＭＰＡ）は、１０ｍＭの酢酸アンモニウムを含み、移動相Ｂ（ＭＰＢ）は、３００ｍＭの酢酸アンモニウムを含む。流量は０．４ｍＬ／分である。勾配は、以下のとおりである。０～１分間：１００％ＭＰＡ；１～９分間：１００％ＭＰＡ～１００％ＭＰＢ；９～１０．５分間：１００％ＭＰＢ；１０．５～１０．６分間：１００％ＭＰＢ～１００％ＭＰＡ；及び１０．６～１５分間：１００％ＭＰＡ。
【0078】
ＭＳ分解能を、１２，５００（ＵＨＭＲ）に設定する。キャピラリースプレー電圧を、３．０ｋＶに設定する。キャピラリー温度を、３５０℃に設定する。ＳレンズＲＦレベルを、２００に設定する。インソース断片化エネルギーを、１００に設定する。ＨＣＤトラッピングガス圧力を、３に設定する。質量スペクトルを、２０００～１５，０００のｍ／ｚ範囲ウィンドウで取得する。
【0079】
実施例１．ＳＣＸカラムの選択
複数のＳＣＸカラムの性能を比較して、本発明の方法を最適化した。上記のようにＦａｂ２断片を調製し、ネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析に供した。Ｂｉｏｒｅｓｏｌｖｅ ＳＣＸ ２．１×５０ｍｍを、ＹＭＣ ＳＣＸ ４．６×５０ｍｍと比較した。図２に、各カラムのＳＣＸ－ＭＳ全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示し、各実験の対応する流量及び温度を示す。この方法の実証された感度に基づいて、ＹＭＣ ＳＣＸ ４．６×５０ｍｍを、１０～３００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液の８分間の勾配を使用して、更なる実験に使用した。
複数のＳＣＸカラムの性能を比較して、本発明の方法を最適化した。上記のようにＦａｂ２断片を調製し、ネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析に供した。Ｂｉｏｒｅｓｏｌｖｅ ＳＣＸ ２．１×５０ｍｍを、ＹＭＣ ＳＣＸ ４．６×５０ｍｍと比較した。図２に、各カラムのＳＣＸ－ＭＳ全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示し、各実験の対応する流量及び温度を示す。この方法の実証された感度に基づいて、ＹＭＣ ＳＣＸ ４．６×５０ｍｍを、１０～３００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液の８分間の勾配を使用して、更なる実験に使用した。
【0080】
実施例２．純粋な溶液中の検出限界及び定量限界の確立
本発明のネイティブＳＣＸ－ＭＳ法を、純粋な溶液中のＦａｂ２断片に対して試験して、検出限界（ＬＯＤ）を確立した。純粋な溶液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に抗体分析物及び内部標準抗体（３００ｐｇ／μＬ、又はカラム上６００ｐｇ）を含んだ。図３Ａに示されるように、高ｐＩから低ｐＩの範囲の一連の抗体を分析物として試験した。試験した抗体のｐＩ範囲は、６．２８～８．１５であった。試験した試料量は、カラム上で２０ｐｇ～２μｇの範囲であり、濃度は１０ｐｇ／μＬ～１μｇ／μＬの範囲であった。
本発明のネイティブＳＣＸ－ＭＳ法を、純粋な溶液中のＦａｂ２断片に対して試験して、検出限界（ＬＯＤ）を確立した。純粋な溶液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に抗体分析物及び内部標準抗体（３００ｐｇ／μＬ、又はカラム上６００ｐｇ）を含んだ。図３Ａに示されるように、高ｐＩから低ｐＩの範囲の一連の抗体を分析物として試験した。試験した抗体のｐＩ範囲は、６．２８～８．１５であった。試験した試料量は、カラム上で２０ｐｇ～２μｇの範囲であり、濃度は１０ｐｇ／μＬ～１μｇ／μＬの範囲であった。
【0081】
Ａｂ９を除き、各々０．２ｍＬ／分の流速で、各試料について１５分間のＳＣＸ実行を行った。試験した抗体には、様々な治療用抗体を表すＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ４抗体、並びにｍＡｂ及びｂｓＡｂが含まれた。本発明の方法は、各抗体を高感度で、効果的に分離及び分析することができた。図３Ｂ及び３Ｃに、２０ｐｇ～２０ｎｇの範囲の濃度の２つの例示的な抗体からの質量スペクトルを示す。これらの条件下では、本発明の方法を使用してＦａｂ２断片の絶対ＬＯＤが、２０ｐｇであると決定された。
【0082】
図４に示されるように、純粋な溶液中のＬＯＤ及び定量限界（ＬＯＱ）を更に評価した。図４ＡのＴＩＣに示されるように、ｍＡｂ２のＦａｂ２断片を内部標準として使用して、ｍＡｂ１のＦａｂ２断片をネイティブＳＣＸ－ＭＳを使用して分析した。図４Ｂは、２０ｐｇ～２０ｎｇの範囲の濃度で、本発明の方法によって測定された、内部標準に対して正規化された強度と比較した実際の濃度のｍＡｂ１の比較を示す。実際の濃度に対する測定された濃度は、０．９９５４の加重Ｒ２との線形関係を示し、低濃度の分析物を正確かつ高感度で定量化する本発明の方法の能力を実証する。図４Ｃは、２０ｎｇ～２μｇの範囲の濃度で行われた同じ比較を示しており、このより高い濃度範囲でも強い線形関係が実証される。図４Ｄに、２０ｐｇ～２μｇの例示的な質量スペクトルを示し、本発明の方法の感度及び特異性を更に例示する。
【0083】
実施例３．血清中の検出限界及び定量化限界の確立
本発明の方法の堅牢性は、マウス血清試料からの分析物を使用して更に実証された。血清中の目的のタンパク質の分析には、生体内変換による目的のタンパク質の不均一性、及び高濃度の血清タンパク質などの複雑なマトリックスによる干渉を含む、多くの追加の課題が存在する。
本発明の方法の堅牢性は、マウス血清試料からの分析物を使用して更に実証された。血清中の目的のタンパク質の分析には、生体内変換による目的のタンパク質の不均一性、及び高濃度の血清タンパク質などの複雑なマトリックスによる干渉を含む、多くの追加の課題が存在する。
【0084】
ｍＡｂ１のＦａｂ２断片を前述のように調製し、ネイティブＳＣＸ－ＭＳ分析に供した。図５Ａに、実際の濃度の抗体に対する応答比（内部標準に対して正規化された、測定された分析物の強度）の線形性を示す。図５Ｂ及び図５Ｃは更なる挿入図を示し、低濃度でも応答の線形性を実証する。これらの結果は、血清中で低濃度であっても、抗体の定量化における本発明の方法の感度及び有効性を実証する。
【0085】
図６Ａに示されるように、本発明の方法の安定性は、内部標準に対して正規化しなくても、抗体濃度と比較して測定された強度の線形性をプロットすることによって更に実証された。図６Ｂ及び図６Ｃは更なる挿入図を示し、内部標準に対して正規化しなくても、血清中の低濃度で測定された強度の線形性を実証する。
【0086】
図７に、血清中及び純粋な溶液中のｍＡｂ１ Ｆａｂ２のＬＯＤ及びＬＯＱを示す質量スペクトルを例示する。図７Ａに示されるように、血清中で０．０２５μｇ／ｍＬもの低いＬＯＤが決定され、これは、ＳＣＸカラム上で５０ｐｇに相当する。図７Ｂに示されるように、血清中で０．０５μｇ／ｍＬもの低いＬＯＱが決定され、これは、ＳＣＸカラム上で１００ｐｇに相当する。シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が５であることは、ＬＯＱを確立するための妥当な基準として示される。血清試料から検出されたｍＡｂ１ Ｆａｂ２の絶対強度は、純粋な溶液で検出されたものよりも高く、血清試料の感度の限界が、共ＩＰされた血清タンパク質からのノイズによるものであることを示唆している。
【0087】
本明細書に開示される実施例に加えて、当業者に知られているであろうより好ましい条件下で本発明の方法を使用すると、例えば、より遅い溶出時間を有する抗体を使用すると、又はＩＰ中により多くの洗浄量を使用すると、更に低いＬＯＤ及びＬＯＱが可能である。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【国際調査報告】