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特表2024-526805ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－Ｇ－ＰＮＩＰＡＭ）の調製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－Ｇ－ＰＮＩＰＡＭ）の調製方法
(51)【国際特許分類】
C08G 81/02 20060101AFI20240711BHJP
C08B 37/08 20060101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
C08G81/02
C08B37/08 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502431
(86)(22)【出願日】2021-07-14
(85)【翻訳文提出日】2024-03-13
(86)【国際出願番号】 TH2021000040
(87)【国際公開番号】W WO2023287366
(87)【国際公開日】2023-01-19
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524018431
【氏名又は名称】ナブソルート カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】ルッカナガル、ジッティマ エイミー
(72)【発明者】
【氏名】ブラナスジャ、ヴィサル
【テーマコード（参考）】
4C090
4J031
【Ｆターム（参考）】
4C090AA02
4C090AA05
4C090BA67
4C090BB02
4C090BB33
4C090BB35
4C090BB36
4C090BB55
4C090BB69
4C090BB98
4C090CA35
4C090DA11
4C090DA22
4J031AA02
4J031AA22
4J031AB01
4J031AB06
4J031AC09
4J031AD01
4J031AE05
4J031AF03
(57)【要約】
【要約】
【解決手段】 本発明は、ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の調製方法であって、
ａ）水混和性溶媒中で、ヒアルロン酸化合物、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤を含む混合物を調製する工程と、
ｂ）ｐＨを７．２～７．８の範囲に調整し、２０～４０℃で１～３日間撹拌して前記混合物を反応させる工程と、
ｃ）工程ｂ）の前記混合物を乾燥させる工程と、を含み、
ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤のモル比は、０．１：０．００２５：１～０．２：０．０１２５：１の範囲である、方法に関する。
【選択図】 図２
【解決手段】 本発明は、ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の調製方法であって、
ａ）水混和性溶媒中で、ヒアルロン酸化合物、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤を含む混合物を調製する工程と、
ｂ）ｐＨを７．２～７．８の範囲に調整し、２０～４０℃で１～３日間撹拌して前記混合物を反応させる工程と、
ｃ）工程ｂ）の前記混合物を乾燥させる工程と、を含み、
ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤のモル比は、０．１：０．００２５：１～０．２：０．０１２５：１の範囲である、方法に関する。
【選択図】 図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の調製方法であって、ａ）水混和性溶媒中で、ヒアルロン酸化合物、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤を含む混合物を調製する工程と、
ｂ）ｐＨを７．２～７．８の範囲に調整し、２０～４０℃で１～３日間撹拌して前記混合物を反応させる工程と、
ｃ）工程ｂ）の前記混合物を乾燥させる工程と、を含み、
ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤のモル比は、０．１：０．００２５：１～０．２：０．０１２５：１の範囲である、方法。
【請求項2】
請求項１記載の方法において、前記カルボジイミド架橋剤が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、またはそれらの混合物から選択される、方法。
【請求項3】
請求項２記載の方法において、前記カルボジイミド架橋剤が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを１：０．５～１：１．５のモル比で混合したものである、方法。
【請求項4】
請求項１記載の方法において、ヒアルロン酸化合物の重量平均分子量が３０，０００～６０，０００ダルトンの範囲である、方法。
【請求項5】
請求項１記載の方法において、前記ヒアルロン酸化合物が、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、またはそれらの混合物から選択される、方法。
【請求項6】
請求項５記載の方法において、前記ヒアルロン酸塩が、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、またはそれらの混合物から選択される、方法。
【請求項7】
請求項６記載の方法において、前記ヒアルロン酸塩がヒアルロン酸ナトリウムである、方法。
【請求項8】
請求項１記載の方法において、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の重量平均分子量が４，０００～６，０００ダルトンの範囲である、方法。
【請求項9】
請求項１記載の方法において、工程ａ）において使用される前記水混和性溶媒が、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、ヒドロアルコール溶液、またはそれらの混合物から選択される、方法。
【請求項10】
請求項９記載の方法において、工程ａ）で使用される前記水混和性溶媒が水である、方法。
【請求項11】
請求項１記載の方法において、前記方法は、工程ｂ）を実施する前に、工程ａ）から得られた前記混合物のｐＨを４．８～５．８の範囲に調整する工程と、前記混合物を０．５～２時間撹拌する工程と、をさらに含む、方法。
【請求項12】
請求項１記載の方法において、前記ｐＨが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、またはそれらの混合物から選択されるｐＨ調整剤によって調整される、方法。
【請求項13】
請求項１１記載の方法において、前記ｐＨが、塩酸、硫酸、またはそれらの混合物から選択されるｐＨ調整剤によって調整される、方法。
【請求項14】
請求項１記載の方法において、前記工程ｃ）が、凍結乾燥、真空乾燥、空気乾燥、またはそれらの組み合わせから選択される過程によって実施される、方法。
【請求項15】
請求項１記載の方法において、前記方法が、工程ｃ）を実施する前に、工程ｂ）から得られた生成物を精製する工程をさらに含む、方法。
【請求項16】
請求項１５記載の方法において、前記精製する工程が、工程ｃ）を実施する前に、透析、クロスフロー濾過、液体－液体抽出、またはそれらの組み合わせによって実施される、方法。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか１つに記載の方法から得られるヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）。
【請求項18】
請求項１７記載のヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）であって、前記ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）が、４～８％の範囲のグラフト化度を有する、ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）。
【請求項19】
０．０００１～２質量体積％の濃度で、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、またはそれらの混合物から選択される水混和性溶媒中に存在する、請求項１７～１９のいずれか１つに記載のヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）のコロイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は化学分野に関し、特にヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－Ｇ－ＰＮＩＰＡＭ）の調製方法に関する。
【背景】
【0002】
ヒアルロン酸またはＨＡは天然のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンが化学結合して二糖サブユニットを形成したものである。このような二糖サブユニットは、２，４－グリコシド結合を介して結合し、長鎖で大きな構造を形成する。自然に、７０ｋｇの人体中、約１５ｇのＨＡが皮膚、関節、眼球およびその他の組織の中に存在することが分かっている。今日、ＨＡは例えば雄鶏のとさかや、分子量５，０００～１，８００，０００ｋＤａの黄色ブドウ球菌の発酵物から自然に生産することができる。
【0003】
ヒアルロン酸には優れた特性、特に保水性があり、１グラムのＨＡで６リットルの水を保持できることが分かっている。さらに、ＨＡは吸湿性があり、ゲルを形成するのに適切な粘性を持ち、生分解性で、生体適合性を持っている。現在、ＨＡは生体材料ならびに化粧品、例えば抗炎症、創傷治癒、および組織再生のためのゲル、クリーム、フォーム、注射、またはハイドロゲルに広く使われている。
【0004】
ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）またはｐＮＩＰＡＭは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドモノマーの重合反応から得られる熱応答性ポリマーである。ｐＮＩＰＡＭの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）、またはポリマーが柔軟な溶媒和状態からより剛直な非溶媒和状態へ相転移する温度は３２℃である。温度が３２℃未満の場合、ｐＮＩＰＡＭは親水性で可溶性である。一方、温度が３２℃以上（体温など）の場合、ｐＮＩＰＡＭは疎水性で不溶性であり、組織接着性を有するハイドロゲルを形成することができる。
【0005】
ナノゲルはコロイドの一種であり、ナノスケールの範囲で三次元的かつナノサイズ化されたハイドロゲルのような物質である。ナノゲルの主な利点は、保水性、到達が困難な臓器、組織、細胞への全身投与が可能な乳剤を形成する能力、迅速な薬物動態が可能であることである。そのため、最近では薬物送達、診断、画像診断、グルコース感知、および組織工学の分野でナノゲルが注目されている。
【0006】
文献調査から、ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は以下の文献に開示されている：
【0007】
米国特許文献２０１３０１７１１９７Ａ１は、特定のハチの巣構造を有するヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）ハイドロゲルを開示している。このハイドロゲルは熱応答性で形成することができ、組織工学の効率を高めるために使用することができる。
【0008】
Ｃｈｅｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１１，１００（２），６５５－６６６．）は、ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）ハイドロゲルをがん治療薬シスプラチンの薬物送達のために開発した。このハイドロゲルは４０％以上のグラフト化度を持ち、ネットワーク状のハイドロゲルを形成している。
【0009】
Ａｍｅｎｄａ（Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．２０１９）は、カルボジイミド架橋剤として１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いたヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）ナノゲルを開示した。このナノゲルは約２５％のグラフト化度を有し、さらに疎水性薬物送達システムに使用される。
【0010】
しかしながら、これまでの開示によるヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は、グラフト化度が高いため粘度が高く、ネットワーク状のハイドロゲルを形成する。したがって、本発明の目的は、高い安定性と生体適合性を維持しながら、低粘度を提供する低グラフト化度のヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）を合成することである。本発明におけるＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭは、送達システム、創傷治癒、細胞増殖、抗炎症、抗酸化、および光保護など多くの用途に用いることができる。
【発明の概要】
【0011】
一実施形態では、本発明はヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の調製方法に関し、前記方法は、
ａ）水混和性溶媒中で、ヒアルロン酸化合物、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤を含む混合物を調製する工程と、
ｂ）ｐＨを７．２～７．８の範囲に調整し、２０～４０℃で１～３日間撹拌して前記混合物を反応させる工程と、
ｃ）工程ｂ）の前記混合物を乾燥させる工程と、を含み、０．００２：１：０．０１～０．００４：１：０．０８、
ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤のモル比は、０．１：０．００２５：１～０．２：０．０１２５：１の範囲である、方法である。
ａ）水混和性溶媒中で、ヒアルロン酸化合物、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤を含む混合物を調製する工程と、
ｂ）ｐＨを７．２～７．８の範囲に調整し、２０～４０℃で１～３日間撹拌して前記混合物を反応させる工程と、
ｃ）工程ｂ）の前記混合物を乾燥させる工程と、を含み、０．００２：１：０．０１～０．００４：１：０．０８、
ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤のモル比は、０．１：０．００２５：１～０．２：０．０１２５：１の範囲である、方法である。
【0012】
さらに、上記の方法で調製されたヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】（ａ）試料１、（ｂ）試料２、（ｃ）試料３、（ｄ）試料４、（ｅ）試料５の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。
【図2】ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の化学構造を示す。
【図3】試料２の赤外（ＩＲ）スペクトルを示す。ＨＡとｐＮＩＰＡＭとのグラフト化が１６０６．４、１４０６．３、および１３７３．２ｃｍ－１の波数に特徴的なピークとして示されている。
【図4】試料３の熱重量分析（ＴＧＡ）スペクトルを示す。
【図5】試料３の熱応答性を示す。
【図6】（ａ）０．２５質量体積％の試料１、（ｂ）０．２５質量体積％の試料２、（ｃ）０．２５質量体積％の試料４、および（ｄ）０．２５質量体積％の試料５の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。
【図7】（ａ）ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）および（ｂ）線維芽細胞（ＢＪ細胞）における試料２の細胞増殖効率を示す。
【図8】（ａ）ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）および（ｂ）線維芽細胞（ＢＪ細胞）における試料２の創傷治癒効率を示す。
【図9】ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）における試料２の抗炎症効率を示す。
【図10】ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）における試料２の酸化防止効率を示しており、（ａ）は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の有無、（ｂ）は用量依存的効率を示す。
【図11】ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）における試料２の光保護効率を示しており、（ａ）はＵＶＡ５Ｊ／ｃｍ３で処理し、（ｂ）はＵＶＡ７．５Ｊ／ｃｍ３で処理したものである。
【図12】ケラチノサイト（ＨａＣａＴ）における試料２のコラゲナーゼ分解効率を示す。
【図13】（ａ）０．２５質量体積％の試料１、（ｂ）０．２５質量体積％の試料４、および（ｃ）０．２５質量体積％の試料５にカプセル化したクルクミンの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。
【図14】（ａ）０．１質量体積％、（ｂ）０．１５質量体積％、（ｃ）０．２５質量体積％の試料２にカプセル化したアジア酸の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。
【図15】（ａ）０．１質量体積％、（ｂ）０．２５質量体積％、（ｃ）０．５質量体積％の試料２にカプセル化したポリ（Ｉ：Ｃ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。
【図16】（ａ）０．１質量体積％、（ｂ）０．２５質量体積％、（ｃ）０．５質量体積％の試料２にカプセル化したポリ（Ｉ：Ｃ）のゼータ電位とサイズを示す。
【図17】試料１、４および５のＮＩＨ－３Ｔ３細胞へのクルクミン細胞取り込み効率試験の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図18】試料３の歯根膜幹細胞へのクルクミン細胞取り込み効率試験の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図19】試料２の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）安定性を示す。
【図20】（ａ）０．１質量体積％の試料２、および（ｂ）０．２５質量体積％の試料１、４、５のクルクミン溶解効率を示す。
【図21】試料２の（ａ）担持量（ｍＭ）、（ｂ）担持効率（％）、（ｃ）担持容量（％）及び（ｅ）封入効率（％）を示す。
【図22】（ａ）エタノール溶液なし、（ｂ）エタノール溶液ありにおける試料２のレスベラトロール溶解効率を示す。
【図23】試料２の濃度０、０．０６、０．１２、０．２５、０．５、１、および２質量体積％における角膜上皮細胞の細胞毒性を示す。
【図24】７．５Ｊ／ｃｍ２の紫外線Ａ（ＵＶＡ）を照射した試料２の濃度０、０．０５、０．５質量体積％のケラチノサイト（ＨａＣａＴ）の細胞生存率を示す。
【図25】ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）アッセイによる試料２の０、０．１、０．１５、０．２５質量体積％での細胞生存率を示す。
【発明の詳細な説明】
【0014】
本発明は、高い安定性と生体適合性を維持しながら、低粘度を提供する低グラフト化度のヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の調製方法に関する。本発明におけるＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭは、送達システム、創傷治癒、細胞増殖、抗炎症、抗酸化、光保護など多くの用途に用いることができる。
【0015】
ここに記載された態様は、特に断りのない限り、本発明の他の態様への適用を含むことを意味する。
【0016】
定義
ここで使用される専門用語や科学用語は、特に断りのない限り、当業者が理解する定義を有する。
ここで使用される専門用語や科学用語は、特に断りのない限り、当業者が理解する定義を有する。
【0017】
ここに挙げた道具、装置、方法、または化学薬品は、本発明のみに特有な道具、装置、方法、または化学薬品であることが明記されていない限り、当業者によって一般的に使用されている道具、装置、方法、または化学薬品を意味する。
【0018】
特許請求の範囲または明細書における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と単数名詞または単数代名詞の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し、「１つまたはそれ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」、「１つまたはそれ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」も含む。
【0019】
本出願において開示されるすべての組成物および／または方法、ならびに特許請求の範囲は、特許請求の範囲に具体的に記載されていないものの、当業者によれば、本実施形態と同等の有用性および結果を有する対象物を得るために、本発明と大きく異なる実験を行うことなく、任意の作用、性能、修正、または調整から実施形態をカバーすることを目的とする。従って、本実施形態と代替可能又は類似の対象は、当業者であれば明らかに分かるような軽微な修正又は調整を含めて、添付の特許請求の範囲に記載された発明の精神、範囲及び概念に留まるものと解釈されるべきである。
【0020】
本出願を通じて、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、機器、方法、または前記機器もしくは方法を使用する個人のいかなる誤差からも変化または逸脱する可能性のある、ここに表示または示されるあらゆる数値を意味する。
【0021】
以下、本発明の実施形態は、本発明の範囲を限定する目的で示されるものではない。
【0022】
例示的な実施形態では、本発明はヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の調製方法であって、
ａ）水混和性溶媒中で、ヒアルロン酸化合物、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤を含む混合物を調製する工程と、
ｂ）ｐＨを７．２～７．８の範囲に調整し、２０～４０℃で１～３日間撹拌して前記混合物を反応させる工程と、
ｃ）工程ｂ）の前記混合物を乾燥させる工程と、を含み、
ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤のモル比は、０．１：０．００２５：１～０．２：０．０１２５：１の範囲である、方法である。
ａ）水混和性溶媒中で、ヒアルロン酸化合物、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤を含む混合物を調製する工程と、
ｂ）ｐＨを７．２～７．８の範囲に調整し、２０～４０℃で１～３日間撹拌して前記混合物を反応させる工程と、
ｃ）工程ｂ）の前記混合物を乾燥させる工程と、を含み、
ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびカルボジイミド架橋剤のモル比は、０．１：０．００２５：１～０．２：０．０１２５：１の範囲である、方法である。
【0023】
好ましい例示的な実施形態では、前記カルボジイミド架橋剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、またはそれらの混合物から選択される。
【0024】
好ましい例示的な実施形態では、前記カルボジイミド架橋剤は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを１：０．５～１：１．５のモル比で混合したものである。
【0025】
好ましい例示的な実施形態では、ヒアルロン酸化合物の重量平均分子量は３０，０００～６０，０００ダルトンの範囲である。
【0026】
好ましい例示的な実施形態では、前記ヒアルロン酸化合物は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、またはそれらの混合物から選択される。
【0027】
好ましい例示的な実施形態では、前記ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、またはそれらの混合物から選択される。
【0028】
好ましい例示的な実施形態では、前記ヒアルロン酸塩はヒアルロン酸ナトリウムである。
【0029】
好ましい例示的な実施形態では、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の重量平均分子量が４，０００～６，０００ダルトンの範囲である。
【0030】
好ましい例示的な実施形態では、工程ａ）において使用される前記水混和性溶媒が、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、ヒドロアルコール溶液、またはそれらの混合物から選択される。
【0031】
好ましい例示的な実施形態では、工程ａ）で使用される前記水混和性溶媒が水である。
【0032】
好ましい例示的な実施形態では、前記方法は、工程ｂ）を実施する前に、工程ａ）から得られた前記混合物のｐＨを４．８～５．８の範囲に調整する工程と、前記混合物を０．５～２時間撹拌する工程と、をさらに含む。
【0033】
好ましい例示的な実施形態では、前記ｐＨが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、またはそれらの混合物から選択されるｐＨ調整剤によって調整される。
【0034】
好ましい例示的な実施形態では、前記ｐＨが、塩酸、硫酸、またはそれらの混合物から選択されるｐＨ調整剤によって調整される。
【0035】
好ましい例示的な実施形態では、前記工程ｃ）が、凍結乾燥、真空乾燥、空気乾燥、またはそれらの組み合わせから選択される過程によって実施される。
【0036】
好ましい例示的な実施形態では、前記方法が、工程ｃ）を実施する前に、工程ｂ）から得られた生成物を精製する工程をさらに含む。
【0037】
好ましい例示的な実施形態では、前記精製する工程が、工程ｃ）を実施する前に、透析、クロスフロー濾過、液体－液体抽出、またはそれらの組み合わせによって実施される。
【0038】
別の実施形態では、本発明は本発明に係るヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）に関する。
【0039】
好ましい例示的な実施形態では、前記ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）が、４～８％の範囲のグラフト化度を有する。
【0040】
別の実施形態では、本発明に係るヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）のコロイドは、０．０００１～２質量体積％の濃度で、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、またはそれらの混合物から選択される水混和性溶媒中に存在する。
【0041】
本発明をよりよく理解するために、本発明によるヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の実施例を示すが、以下の実施例は本発明の実施形態を示すためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【0042】
本出願を通して、水混和性溶媒は、これに限定されるものではないが、脱イオン水、蒸留水、水道水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、細胞培養培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、トリス緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、ヒドロアルコール溶液、もしくは生体適合性有機溶媒、またはそれらの混合物から選択される。生体適合性有機溶媒は、希釈メタノール、希釈エタノール、もしくは希釈酢酸、またはそれらの混合物の群から選択される。
【0043】
ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の調製（試料１～５）
ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の試料１～５は以下の手順で調製した。
ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の試料１～５は以下の手順で調製した。
【0044】
（１）重量平均分子量約４７，０００ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）を水に溶解した。
【0045】
（２）工程（１）のヒアルロン酸ナトリウム溶液に、重量平均分子量約５，５００ダルトンのポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ｐＮＩＰＡＭ）を添加し、続いて１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をそれぞれ添加した。
【0046】
（３）工程（２）の溶液のｐＨを水酸化ナトリウムで約５．５に調整し、室温で攪拌しながら約１時間反応させた。
【0047】
（４）工程（３）の溶液のｐＨを塩酸で約７．５に一旦調整し、さらに室温で約３日間撹拌しながら反応させた。
【0048】
（５）工程（４）で得られたＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭをそれぞれ透析で精製し、凍結乾燥法で乾燥した。
【0049】
試料１～５に用いたヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ｐＮＩＰＡＭ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の量を表１に示す。
【0050】
本発明のＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭの特性評価
（１）核磁気共鳴（ＮＭＲ）
試料１～５の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを図１に示す。その結果、試料１～５にはヒアルロン酸とポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）に特有のピークがあり、１．１０～１．６５ｐｐｍにはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の脂肪族プロトンが、１．６５～２．０１ｐｐｍにはヒアルロン酸のＤ－グルコサミン環上のＮ－アセチル基とポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）のプロトンの重なりが確認された。さらに、試料１～５のグラフト化度はＮＭＲスペクトルの２つの顕著なピークから計算した。ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の化学構造を図２に示す。ｐＮＩＰＡＭとＨＡのグラフト化度、平均分子量、質量比を表２に示す。
（１）核磁気共鳴（ＮＭＲ）
試料１～５の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを図１に示す。その結果、試料１～５にはヒアルロン酸とポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）に特有のピークがあり、１．１０～１．６５ｐｐｍにはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の脂肪族プロトンが、１．６５～２．０１ｐｐｍにはヒアルロン酸のＤ－グルコサミン環上のＮ－アセチル基とポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）のプロトンの重なりが確認された。さらに、試料１～５のグラフト化度はＮＭＲスペクトルの２つの顕著なピークから計算した。ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の化学構造を図２に示す。ｐＮＩＰＡＭとＨＡのグラフト化度、平均分子量、質量比を表２に示す。
【0051】
（２）赤外分光法（ＩＲ）スペクトル
図３に示すように、試料２の赤外（ＩＲ）スペクトルはＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭの特徴的なピークを示した。１，６０６ｃｍ－１のピークはアミドバンド（Ｃ＝Ｏの伸縮振動）であった。１，４０６．３および１，３７３ｃｍ－１のピークは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドのメチル基におけるＣ－Ｈ結合の特徴的な変形振動ピークであった。ＩＲの結果から、ｐＮＩＰＡＭコア構造上にＨＡがグラフ化していることが確認された。
図３に示すように、試料２の赤外（ＩＲ）スペクトルはＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭの特徴的なピークを示した。１，６０６ｃｍ－１のピークはアミドバンド（Ｃ＝Ｏの伸縮振動）であった。１，４０６．３および１，３７３ｃｍ－１のピークは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドのメチル基におけるＣ－Ｈ結合の特徴的な変形振動ピークであった。ＩＲの結果から、ｐＮＩＰＡＭコア構造上にＨＡがグラフ化していることが確認された。
【0052】
（３）熱重量分析（ＴＧＡ）
試料３の熱分解を熱重量分析（ＴＧＡ）で調べた結果を図４に示す。その結果、この試料３の分解は約２００℃と約４００℃の２つに分かれた。ヒアルロン酸化合物の分解温度と比較すると、試料２の分解は約２００℃で起こった。
試料３の熱分解を熱重量分析（ＴＧＡ）で調べた結果を図４に示す。その結果、この試料３の分解は約２００℃と約４００℃の２つに分かれた。ヒアルロン酸化合物の分解温度と比較すると、試料２の分解は約２００℃で起こった。
【0053】
（４）粒子径
試料２を水に分散させ、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、０．１５、０．２５質量体積％の濃度範囲でコロイドを得た。得られた試料２のコロイドを動的光散乱（ＤＬＳ）で調べた。コロイド状試料２の各濃度の粒子径および平均粒子径を表３に示す。その結果、コロイドの濃度を上げると平均粒子径が大きくなることがわかった。
試料２を水に分散させ、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、０．１５、０．２５質量体積％の濃度範囲でコロイドを得た。得られた試料２のコロイドを動的光散乱（ＤＬＳ）で調べた。コロイド状試料２の各濃度の粒子径および平均粒子径を表３に示す。その結果、コロイドの濃度を上げると平均粒子径が大きくなることがわかった。
【0054】
（５）熱応答性
試料３コロイドの熱応答性を動的光散乱（ＤＬＳ）法で調べた。試料３の熱応答性を図５に示す。その結果、０．５質量体積％の試料３コロイドの球状粒子は、約２５～３２℃の温度で約３０～８０ｎｍの範囲の粒子径を有し、温度が３２℃以上になると、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の低臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）特性により、粒子径が増大した。
試料３コロイドの熱応答性を動的光散乱（ＤＬＳ）法で調べた。試料３の熱応答性を図５に示す。その結果、０．５質量体積％の試料３コロイドの球状粒子は、約２５～３２℃の温度で約３０～８０ｎｍの範囲の粒子径を有し、温度が３２℃以上になると、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）の低臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）特性により、粒子径が増大した。
【0055】
（６）粒子形態
試料１、２、４および５を水に分散させ、０．２５質量体積％のコロイドを得た。得られたコロイドを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。
試料１、２、４および５を水に分散させ、０．２５質量体積％のコロイドを得た。得られたコロイドを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。
【0056】
粒子の形態を図６に示す。その結果、０．２５質量体積％の試料１（図６ａ）、０．２５質量体積％の試料２（図６ｂ）、０．２５質量体積％の試料４（図６ｃ）、および０．２５質量体積％の試料５（図６ｄ）に記載されているように、コロイドは明確に定義された球状を有することが示された。
【0057】
ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭの効率試験
以下、０．０００１～２質量体積％の範囲の濃度を有するコロイド状試料１、２、４および５を用いて、ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭの効率を調べた。
以下、０．０００１～２質量体積％の範囲の濃度を有するコロイド状試料１、２、４および５を用いて、ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭの効率を調べた。
【0058】
（１）細胞増殖
３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを用いて、コロイド状試料２の細胞増殖試験を行った。ＭＴＴアッセイは、細胞の生存率と増殖を測定するための至適基準法である。実験は以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトおよびＢＪ線維芽細胞を、０、０．０６、０．１２、０．２５、０．５、１および２質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。処理後、細胞増殖をＭＴＴアッセイで評価した。
３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを用いて、コロイド状試料２の細胞増殖試験を行った。ＭＴＴアッセイは、細胞の生存率と増殖を測定するための至適基準法である。実験は以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトおよびＢＪ線維芽細胞を、０、０．０６、０．１２、０．２５、０．５、１および２質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。処理後、細胞増殖をＭＴＴアッセイで評価した。
【0059】
細胞増殖効率試験を図７に示す。その結果、試料２は、非処理細胞と比較して、ＨａＣａＴケラチノサイト（図７ａ）およびＢＪ線維芽細胞（図７ｂ）の細胞生存率の増加によって決定されるように、皮膚細胞の増殖を促進できることが示された。
【0060】
（２）創傷治癒
コロイド状試料２の創傷治癒試験を以下の手順で行った。ＢＪ線維芽細胞を剃刀でひっかき、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。化合物の治癒活性を顕微鏡で観察した。
コロイド状試料２の創傷治癒試験を以下の手順で行った。ＢＪ線維芽細胞を剃刀でひっかき、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。化合物の治癒活性を顕微鏡で観察した。
【0061】
創傷治癒効率試験を図８に示す。その結果、試料２を処理した線維芽細胞は、ヒアルロン酸処理細胞や非処理細胞よりも早く傷を治すことができた（図８ａ）。試料２の創傷治癒活性は用量依存的であった（図８ｂ）。これらの結果から、試料２は有望な創傷治癒活性を有することが示唆された。
【0062】
（３）抗炎症作用
０．１質量体積％濃度のコロイド状試料２の抗炎症試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトを、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）およびインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の存在下、試料２で２４時間処理した。処理後、放出されたＴＡＲＣのレベルを酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。ＴＮＦ－αとＩＦＮ－γは炎症誘導物質であり、胸腺および活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）は炎症マーカーである。
０．１質量体積％濃度のコロイド状試料２の抗炎症試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトを、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）およびインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の存在下、試料２で２４時間処理した。処理後、放出されたＴＡＲＣのレベルを酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。ＴＮＦ－αとＩＦＮ－γは炎症誘導物質であり、胸腺および活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）は炎症マーカーである。
【0063】
抗炎症効率試験を図９に示す。その結果、試料２の曝露により、胸腺および活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）レベルを低下させることができ、試料２が抗炎症活性を有することが示唆された。
【0064】
（４）抗酸化作用
コロイド状試料２の抗酸化試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトを０、０．０００５、０．０００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。処理後、細胞を過酸化水素とともに１時間インキュベートし、酸化ストレス状態を２’－７’－ジクロロフルオレジンジアセテート（ＤＣＦＨ－ＤＡ）アッセイで評価した。過酸化水素は酸化ストレス誘導剤として用いた。
コロイド状試料２の抗酸化試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトを０、０．０００５、０．０００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。処理後、細胞を過酸化水素とともに１時間インキュベートし、酸化ストレス状態を２’－７’－ジクロロフルオレジンジアセテート（ＤＣＦＨ－ＤＡ）アッセイで評価した。過酸化水素は酸化ストレス誘導剤として用いた。
【0065】
抗酸化効率試験を図１０に示す。その結果、試料２は過酸化水素処理後の酸化ストレスを低減することができ、試料２が抗酸化活性を有することが示された。
【0066】
（５）光保護
コロイド状試料２の光保護試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトを０、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．０１および０．０５質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。処理後、細胞に紫外線Ａ（ＵＶＡ）を５Ｊ／ｃｍ２（図１１ａ）および７．５Ｊ／ｃｍ２（図１１ｂ）で照射し、ＭＴＴアッセイで細胞生存率を測定した。
コロイド状試料２の光保護試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトを０、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．０１および０．０５質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。処理後、細胞に紫外線Ａ（ＵＶＡ）を５Ｊ／ｃｍ２（図１１ａ）および７．５Ｊ／ｃｍ２（図１１ｂ）で照射し、ＭＴＴアッセイで細胞生存率を測定した。
【0067】
光保護効率試験を図１１に示す。その結果、試料２はＵＶＡ照射による毒性からケラチノサイトを防ぐことができ、試料２には光保護活性があることが示唆された。
【0068】
（６）コラゲナーゼ分解
コロイド状試料２のコラゲナーゼ分解試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴ細胞を試料２で２４時間処理した。処理後、細胞に７．５Ｊ／ｃｍ２ の紫外線Ａ（ＵＶＡ）を照射した。マトリックスメタロプロテアーゼ－１（ＭＭＰ－１）とマトリックスメタロプロテアーゼ－９（ＭＭＰ－９）のレベルは、照射２４時間後にウェスタンブロット分析で測定した。
コロイド状試料２のコラゲナーゼ分解試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴ細胞を試料２で２４時間処理した。処理後、細胞に７．５Ｊ／ｃｍ２ の紫外線Ａ（ＵＶＡ）を照射した。マトリックスメタロプロテアーゼ－１（ＭＭＰ－１）とマトリックスメタロプロテアーゼ－９（ＭＭＰ－９）のレベルは、照射２４時間後にウェスタンブロット分析で測定した。
【0069】
コラゲナーゼ分解効率試験を図１２に示す。その結果、試料２は、ＵＶＡ照射に対するＭＭＰ－１およびＭＭＰ－９の発現を抑制できることが示された。この結果から、試料２はコラゲナーゼの分解を促進できることが示唆された。
【0070】
（７）送達システム
クルクミン、アジア酸、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））を含む化合物のカプセル化は、以下の手順で試験された。化合物は、簡単なインキュベーション法を用いてナノ粒子にカプセル化された。
クルクミン、アジア酸、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））を含む化合物のカプセル化は、以下の手順で試験された。化合物は、簡単なインキュベーション法を用いてナノ粒子にカプセル化された。
【0071】
クルクミンについては、クルクミンのエタノール原液をコロイド状試料１、４および５に約１：１０の体積比で滴下添加し、４℃で２４時間撹拌しながらインキュベートした後、遠心分離して未溶解の化合物を除去した。
【0072】
アジア酸については、アジア酸のエタノール原液をコロイド状試料２に約１：１０の体積比で滴下添加し、２５℃で６時間撹拌しながらインキュベートした後、遠心分離して未溶解の化合物を除去した。
【0073】
ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））については、ポリ（Ｉ：Ｃ）の水性原液をコロイド状試料２に約１：１０の体積比で室温で３０分間撹拌しながら滴下添加した。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いてカプセル化された化合物ナノ粒子の形態学的形状と外観を観察し、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いてポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））カプセル化ナノ粒子のサイズとゼータ電位の測定を行った。
【0074】
クルクミンカプセル化ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を図１３に示す。その結果、ナノ粒子のサイズ、形状、および外観の変化から判断して、クルクミンがコロイド状で０．２５質量体積％の試料１、試料４、および試料５にうまくカプセル化されたことが示された。
【0075】
図１４に、カプセル化されたアジア酸ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。その結果、ナノ粒子のサイズ、形状、および外観の変化から判断して、試料２の０．１質量体積％、０．１５質量体積％、および０．２５質量体積％のコロイド形態に、アジア酸がうまくカプセル化されていることが示された。
【0076】
ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））カプセル化ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を図１５に示す。その結果、ナノ粒子のサイズ、形状、および外観の変化から判断して、クルクミンがコロイド状で試料２の０．１質量体積％、０．２５質量体積％、および０．５質量体積％にうまくカプセル化されたことが示された。
【0077】
ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））のカプセル化を図１６に示す。その結果、０．１質量体積％（図１６ａ）および０．５質量体積％（図１６ｂ）の試料２の粒径減少により、有効成分をカプセル化した試料と比較して、異なる濃度（０．２および１μｇ／ｍｌ）のポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））がコロイド状試料２にカプセル化されていることが示された。
【0078】
（８）細胞への取り込み
コロイド状のクルクミンカプセル化試料１、４および５の細胞取り込み試験を以下の手順で行った。ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を試料１、４および５で２４時間処理した。処理後、細胞を４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（核染色）およびローダミンファロイジン（アクチン染色）で１５～３０分間染色した。２４時間処理後、蛍光顕微鏡で細胞の取り込みレベルを測定した。
コロイド状のクルクミンカプセル化試料１、４および５の細胞取り込み試験を以下の手順で行った。ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を試料１、４および５で２４時間処理した。処理後、細胞を４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（核染色）およびローダミンファロイジン（アクチン染色）で１５～３０分間染色した。２４時間処理後、蛍光顕微鏡で細胞の取り込みレベルを測定した。
【0079】
ＮＩＨ－３Ｔ３細胞へのクルクミン細胞取り込み効率試験の共焦点顕微鏡画像を図１７に示す。その結果、クルクミンコロイドの細胞内取り込みは緑色の蛍光強度で示され、クルクミンコロイドはＮＩＨ－３Ｔ３細胞に取り込まれたことが示された。
【0080】
試料３のカプセル化クルクミンの細胞取り込み試験は、以下の手順で行った。歯根膜幹細胞を試料３で２４時間処理した。処理後、細胞を４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（核染色）およびローダミンファロイジン（アクチン染色）で１５～３０分間染色した。２４時間処理後、蛍光顕微鏡で細胞の取り込みレベルを測定した。
【0081】
歯根膜幹細胞へのクルクミン細胞取り込み効率試験の共焦点顕微鏡画像を図１８に示す。その結果、緑色の蛍光強度で示されるクルクミンコロイドの細胞内への取り込みは、水中のクルクミンよりも高いことが示された。
【0082】
（９）透過性
アスコルビルリン酸ナトリウム（ＳＡＰ）と０．１質量体積％の試料２をコロイド状にカプセル化したＳＡＰの浸透性を、フランツ拡散セルを用いてブタの皮膚で試験した。その結果、ＳＡＰは６μｇ／ｃｍ２、０．１質量体積％の試料２をコロイド状にカプセル化したＳＡＰは６８．７８μｇ／ｃｍ２、それぞれブタの皮膚に浸透した。したがって、ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭは表皮への透過性を高めることができることが確認された。
アスコルビルリン酸ナトリウム（ＳＡＰ）と０．１質量体積％の試料２をコロイド状にカプセル化したＳＡＰの浸透性を、フランツ拡散セルを用いてブタの皮膚で試験した。その結果、ＳＡＰは６μｇ／ｃｍ２、０．１質量体積％の試料２をコロイド状にカプセル化したＳＡＰは６８．７８μｇ／ｃｍ２、それぞれブタの皮膚に浸透した。したがって、ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭは表皮への透過性を高めることができることが確認された。
【0083】
（１０）有効医薬品成分の安定性
コロイド状試料２の物理的安定性因子（色、沈殿物など）、化学的安定性因子（ｐＨ、Ｌ－９２９細胞における細胞増殖誘導など）を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の安定性を、ＦＧＦと試料２にカプセル化したＦＧＦを比較することにより検討した。実験は、コロイド状試料２にＦＧＦを組み込んでから０、２、４、８、１８週後に行った。
コロイド状試料２の物理的安定性因子（色、沈殿物など）、化学的安定性因子（ｐＨ、Ｌ－９２９細胞における細胞増殖誘導など）を含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の安定性を、ＦＧＦと試料２にカプセル化したＦＧＦを比較することにより検討した。実験は、コロイド状試料２にＦＧＦを組み込んでから０、２、４、８、１８週後に行った。
【0084】
Ｌ－９２９細胞における細胞増殖誘導は、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）アッセイを用いたＬ－９２９細胞の代謝率分析である。Ｌ－９２９細胞を、５体積％のウシ胎児血清と１５０μＬの２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合Ｆ－１２（ＤＭＥＭ－Ｆ－１２）（以下、「培地」と言う）で２４時間培養し、９６ウェルプレートへの細胞の接着を促進した。その後、各ウェルで培地を除去し、試験材料であるＦＧＦ（対照）、およびＦＧＦを５０μＬの試料２にカプセル化したもので交換した。さらに、細胞を５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターで２４時間培養した。その後、試験材料も除去し、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１０％のＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）含有培地に交換し、さらに５％ＣＯ２、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、蛍光強度をマイクロプレートリーダーで５６０／５９０ｎｍ（励起／発光）で測定した。
【0085】
細胞生存率試験を図１９に示す。その結果、コロイド－ＦＧＦ製剤では、ＦＧＦの生物学的活性が低下する一方で、ＦＧＦ誘導性細胞増殖が１８週間の保存期間にわたって維持されたことが示された。
【0086】
（１１）溶解度
クルクミン、アジア酸、レスベラトロールを添加したコロイド状試料２、およびクルクミンを添加したコロイド状試料１、４、５の溶解度は、以下の手順で試験した。レスベラトロールとクルクミンについては紫外可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光光度分析、アジア酸については高速液体クロマトグラフィー分析を用いた。
クルクミン、アジア酸、レスベラトロールを添加したコロイド状試料２、およびクルクミンを添加したコロイド状試料１、４、５の溶解度は、以下の手順で試験した。レスベラトロールとクルクミンについては紫外可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光光度分析、アジア酸については高速液体クロマトグラフィー分析を用いた。
【0087】
濃度０．１質量体積％のクルクミン担持コロイド状試料２、および濃度０．２５質量体積％のクルクミン担持コロイド状試料１、４、５の溶解度を図２０に示す。その結果、濃度０．１％の試料２（図２０ａ）では、コロイドはクルクミンの溶解度を２６倍高めることができた。試料１、４および５は、対照としての水と比較して、それぞれ約２倍、約３倍、および約２倍クルクミンの溶解度を増加させることができた。
【0088】
０、０．１、０．１５、および０．２５質量体積％の濃度のコロイド状で、アジア酸を担持した試料２の溶解性を、担持量（図２１ａ）、担持効率（図２１ｂ）、担持容量（図２１ｃ）、および封入効率（図２１ｄ）の観点から図２１に示す。その結果、試料２を０．１％、０．１５％、０．２５％の濃度で水に添加した場合、コロイドは対照としての水と比較して、それぞれ約４００倍、約３７０倍、約２５０倍のアジア酸の担持量を増加させることができた。
【0089】
レスベラトロールを担持したコロイド状試料２の溶解度を０、０．１、０．２質量体積％の濃度で測定した結果を図２２に示す。その結果、濃度０．２％の試料２を水またはヒドロアルコール水溶液に溶解させた場合、コロイドは水を対照とした場合に比べ、レスベラトロールの溶解度を４．５～５倍高めることができた。
【0090】
（１２）保湿試験
０．１および２質量体積％濃度のコロイド状試料２の保湿試験を、５人の健康なボランティアを用いて以下の手順で行った。治療の前に、参加者は１週間、試験部位への化粧品の使用を控える必要があった。温度２５±２℃、湿度５０±５％の環境下で、１日２回、１４日間、前腕部に試料を均一に塗布した。試料２とその対照品を塗布する前後で、一定の圧力で皮膚に押し当てた測定用コンデンサを用いて皮膚水分含量をチェックし、その測定値をコルネオメーターで評価した。あるいは、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）試験は、試料２の適用前後を比較するＴＥＷＬ測定プローブを用いて実施した。
０．１および２質量体積％濃度のコロイド状試料２の保湿試験を、５人の健康なボランティアを用いて以下の手順で行った。治療の前に、参加者は１週間、試験部位への化粧品の使用を控える必要があった。温度２５±２℃、湿度５０±５％の環境下で、１日２回、１４日間、前腕部に試料を均一に塗布した。試料２とその対照品を塗布する前後で、一定の圧力で皮膚に押し当てた測定用コンデンサを用いて皮膚水分含量をチェックし、その測定値をコルネオメーターで評価した。あるいは、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）試験は、試料２の適用前後を比較するＴＥＷＬ測定プローブを用いて実施した。
【0091】
０．１および２質量体積％濃度のコロイド状試料２の保湿試験を表４に示す。その結果、試料２は、２％および０．１％濃度の試料２を水中に適用した後、それぞれ１２４％および１１．９１％の皮膚水分含量を増加させることができたが、未修飾のＨＡは０．１％濃度の対照ポリマーでは皮膚水分含量を変化させることができなかった。さらに、０．１％の試料２を上腕の皮膚に塗布すると、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）が１２．１％減少した。
【0092】
（１３）ヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）の毒性
ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）、線維芽細胞（ＢＪ細胞）および角膜上皮細胞におけるコロイド状試料２のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験を以下の手順で実施した。細胞を０、０．０６、０．１２、０．２５、０．５、１、２質量体積％の濃度で２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイで毒性を評価した。
ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）、線維芽細胞（ＢＪ細胞）および角膜上皮細胞におけるコロイド状試料２のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験を以下の手順で実施した。細胞を０、０．０６、０．１２、０．２５、０．５、１、２質量体積％の濃度で２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイで毒性を評価した。
【0093】
ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）および線維芽細胞（ＢＪ細胞）における細胞毒性試験を図７に示す。これらの結果から、試料２は両皮膚細胞の細胞生存率を低下させなかったことから、試料２は両細胞株に対して毒性を引き起こさないことが示唆された。
【0094】
また、角膜上皮細胞を用いた細胞毒性試験を図２３に示す。これらの結果から、試料２を処理した細胞に毒性は観察されなかった。これらの結果は、試料２の安全性プロファイルを支持するものである。
【0095】
（１４）ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭの光毒性
コロイド状試料２のｉｎ ｖｉｔｒｏ光毒性試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトを０、０．０５、０．５質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。処理後、細胞に７．５Ｊ／ｃｍ２の紫外線Ａ（ＵＶＡ）を照射し、ＭＴＴアッセイで細胞生存率を測定した。
コロイド状試料２のｉｎ ｖｉｔｒｏ光毒性試験を以下の手順で行った。ＨａＣａＴケラチノサイトを０、０．０５、０．５質量体積％の濃度の試料２で２４時間処理した。処理後、細胞に７．５Ｊ／ｃｍ２の紫外線Ａ（ＵＶＡ）を照射し、ＭＴＴアッセイで細胞生存率を測定した。
【0096】
光毒性試験を図２４に示す。その結果、試料２はＵＶＡ照射による毒性を防止できることがわかった。
【0097】
（１５）副作用試験
０、０．１、０．１５、および０．２５質量体積％濃度のコロイド状試料２の副作用試験は、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）アッセイにより繊維芽細胞Ｌ９２９細胞におけるアジア酸の毒性減少を考慮することで検討した。
０、０．１、０．１５、および０．２５質量体積％濃度のコロイド状試料２の副作用試験は、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）アッセイにより繊維芽細胞Ｌ９２９細胞におけるアジア酸の毒性減少を考慮することで検討した。
【0098】
０、０．１、０．１５、０．２５質量体積％濃度のコロイド状試料２の副作用試験を図２５に示す。その結果、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した１２．５μＭのアジア酸を細胞培養培地に使用した場合、細胞生存率は５％に低下した。しかし、１２．５μＭのアジア酸をコロイドにし、試料の０．１、０．１５、および０．２５質量体積％の濃度でコロイドを作ると、細胞生存率は１００％に増加した。したがって、本発明のヒアルロン酸グラフトポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＨＡ－ｇ－ｐＮＩＰＡＭ）は、アジア酸の毒性を軽減できることが確認された。
【0099】
（１６）皮膚刺激性試験
濃度２．０質量体積％のコロイド状試料２の刺激性試験を、２４時間閉塞性ヒトパッチテストにより調べた。インフォームド・コンセントを取得し、対象／除外基準、すなわち、すべての被験者は２０～５９歳の健康な成人であり、いかなる除外基準も有していないことを確認した後、検査技師がそれぞれの被験者の背中（脊椎傍）を調べた。さらに、検査技師は、選択された各被験者の背中上部（傍脊椎領域）の検査部位を観察し、写真に収めた。その後、被験者にパッチテストユニットを用いて試験試料を適切な用量で塗布した。貼付２４時間後、被験者自身によりパッチが剥がされた。パッチ除去から１時間後（合計２４時間後）と２４時間後（合計４８時間後）に、技術者が試験部位を撮影した。さらに、皮膚反応性判定や皮膚刺激性スコアの判定などは、皮膚科医が評価した。
濃度２．０質量体積％のコロイド状試料２の刺激性試験を、２４時間閉塞性ヒトパッチテストにより調べた。インフォームド・コンセントを取得し、対象／除外基準、すなわち、すべての被験者は２０～５９歳の健康な成人であり、いかなる除外基準も有していないことを確認した後、検査技師がそれぞれの被験者の背中（脊椎傍）を調べた。さらに、検査技師は、選択された各被験者の背中上部（傍脊椎領域）の検査部位を観察し、写真に収めた。その後、被験者にパッチテストユニットを用いて試験試料を適切な用量で塗布した。貼付２４時間後、被験者自身によりパッチが剥がされた。パッチ除去から１時間後（合計２４時間後）と２４時間後（合計４８時間後）に、技術者が試験部位を撮影した。さらに、皮膚反応性判定や皮膚刺激性スコアの判定などは、皮膚科医が評価した。
【0100】
その結果、成人被験者２４名全員が試料に対して反応を示さなかった。その結果、スガイの分類（ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９５， １９： ４９－５６．）によると、皮膚刺激性スコアは０となり、５未満となった。従って、試料２は安全で刺激のない製品であることが確認された。
【0101】
（１７）感作性試験
２．０質量体積％濃度のコロイド状試料２の感作性試験を、ヒト反復負荷パッチテスト（ＨＲＩＰＴ）により検討した。ＨＲＩＰＴは、（１）スクリーニング期、（２）誘導期、（３）休息期、（４）チャレンジ期の４段階に大別される。スクリーニング期では、インフォームド・コンセントと、２０～５９歳の健康な成人であること、除外基準を持たないこと、といった被験者の組み入れ基準を入手し、確認した。次に、検査技師が、選択された各被験者の背中上部（傍脊椎領域）の検査部位を観察し、写真撮影を行った。誘導期では、被験者にパッチテストユニットを用いて適切な用量の被験試料を塗布した。貼付２４時間後、被験者自身がパッチを剥がした。２４時間後または４８時間後に次のパッチテストユニットを貼付する前に、訓練を受けた検査技師が皮膚反応を評価し、写真撮影を行った。その後、同じ試料を検査技師が各被験者の背中の同じ場所に貼付した。この手順を週３回、３週間連続で繰り返した（合計９セットの貼付と剥離）。誘導期の後、すべての被験者に１０～１４日間の休息期間が与えられた。最後に、チャレンジ期では、誘導期で塗布した部位の近くの正常皮膚に、パッチテストユニットを用いて同じ被験試料を塗布した。各パッチテストユニットは、貼付２４時間後に各被験者から取り外された。各被験者の試験部位は検査技師によって写真に撮られ、皮膚反応はパッチテストユニットの除去から１時間後と２４時間後に皮膚科医によって判定された（それぞれ「２４時間後」と「４８時間後」）。
２．０質量体積％濃度のコロイド状試料２の感作性試験を、ヒト反復負荷パッチテスト（ＨＲＩＰＴ）により検討した。ＨＲＩＰＴは、（１）スクリーニング期、（２）誘導期、（３）休息期、（４）チャレンジ期の４段階に大別される。スクリーニング期では、インフォームド・コンセントと、２０～５９歳の健康な成人であること、除外基準を持たないこと、といった被験者の組み入れ基準を入手し、確認した。次に、検査技師が、選択された各被験者の背中上部（傍脊椎領域）の検査部位を観察し、写真撮影を行った。誘導期では、被験者にパッチテストユニットを用いて適切な用量の被験試料を塗布した。貼付２４時間後、被験者自身がパッチを剥がした。２４時間後または４８時間後に次のパッチテストユニットを貼付する前に、訓練を受けた検査技師が皮膚反応を評価し、写真撮影を行った。その後、同じ試料を検査技師が各被験者の背中の同じ場所に貼付した。この手順を週３回、３週間連続で繰り返した（合計９セットの貼付と剥離）。誘導期の後、すべての被験者に１０～１４日間の休息期間が与えられた。最後に、チャレンジ期では、誘導期で塗布した部位の近くの正常皮膚に、パッチテストユニットを用いて同じ被験試料を塗布した。各パッチテストユニットは、貼付２４時間後に各被験者から取り外された。各被験者の試験部位は検査技師によって写真に撮られ、皮膚反応はパッチテストユニットの除去から１時間後と２４時間後に皮膚科医によって判定された（それぞれ「２４時間後」と「４８時間後」）。
【0102】
その結果、表６に示すように、５６名の被験者のほとんどに反応は認められず、わずか１～２名の被験者に試験部位にわずかな紅斑が認められたのみであった。このことから、試料２は感作の原因とはならず、試験条件下では低アレルギー性製品とみなすことができると解釈された。
【0103】
発明を実施するための最良の形態
本発明の最良のまたは好ましい実施形態は、本発明の説明に記載した通りである。
本発明の最良のまたは好ましい実施形態は、本発明の説明に記載した通りである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】