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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】標的ゲノムを検出するための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6825 20180101AFI20240711BHJP
G01N 21/76 20060101ALI20240711BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240711BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20240711BHJP
C12Q 1/6834 20180101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6825 Z
G01N21/76
C12Q1/6888 Z ZNA
C12Q1/70
C12Q1/6834 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502479
(86)(22)【出願日】2022-07-04
(85)【翻訳文提出日】2024-03-15
(86)【国際出願番号】 IT2022050195
(87)【国際公開番号】W WO2023286095
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】102021000018422
(32)【優先日】2021-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524019988
【氏名又は名称】ウニべルシタ デッリ ストゥーディ デ メッシーナ
(71)【出願人】
【識別番号】510023160
【氏名又は名称】アルマ マーテル ステューディオラム － ウニヴェルスィタ ディ ボローニャ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】コノチ、サブリナ
(72)【発明者】
【氏名】ラムパッゾ、エンリコ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァレンティ、ジョヴァンニ
(72)【発明者】
【氏名】パオルッキ、フランチェスコ
(72)【発明者】
【氏名】ザヌト、アレッサンドラ
(72)【発明者】
【氏名】プロディ、ルカ
(72)【発明者】
【氏名】ペトラリア、サルヴァトーレ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR39
4B063QR55
4B063QR66
4B063QR84
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、ゲノム分子の核酸の検出によって、迅速かつ高感度なゲノム分子検出を可能にする方法に関する。具体的には、この方法は、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの超高感度検出で誘導体化された電極表面上の高分子遺伝的標的の協調ハイブリダイゼーションプロセスを組み合わせる。この方法は、いかなる増幅も伴わずに標的ゲノムを直接検出することを可能にする。したがって、本発明の方法は、増幅なしのアプローチ、特にＰＣＲなしのアプローチと考えることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の分析物を検出するためのＥＣＬに基づく方法であって、前記分析物が生物の標的全ゲノムであり、ａ）前記全ゲノムを含有する前記試料を、電極の表面に固定された少なくとも２つの一本鎖核酸プローブと接触させる工程であって、前記少なくとも２つの一本鎖核酸プローブの各々が、前記標的全ゲノムの対応する部分に相補的である、接触させる工程、
ｂ）ＥＣＬ活性ルミノフォアを添加する工程であって、前記ＥＣＬ活性ルミノフォアがＥＣＬインターカレート性ルミノフォアである、添加する工程、
ｃ）前記ＥＣＬ活性ルミノフォアによって生成された発光シグナルを決定する工程、
を含み、前記標的全ゲノムが、ＤＮＡゲノム又はＲＮＡゲノムから選択される、方法。
【請求項2】
前記標的全ゲノムが、一本鎖（ｓｓ－）又は二本鎖（ｄｓ－）であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記一本鎖核酸プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記一本鎖核酸プローブが、表面リンカーによって固定化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記表面リンカーが、ＨＳ－（ＣＨ２）ｎ－（式中、ｎは６～１８である）である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＥＣＬ活性ルミノフォアが、Ｒｕ（ＩＩ）、Ｉｒ（ＩＩＩ）、Ｒｅ（Ｉ）又はＯｓ（ＩＩ）配位錯体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記標的全ゲノムが二本鎖ゲノムである場合、前記少なくとも２つの一本鎖核酸プローブのうちの少なくとも１つが、前記二本鎖標的全ゲノムの平行鎖の一部に相補的であり、前記少なくとも２つの一本鎖核酸プローブのうちの少なくとも１つは、前記二本鎖標的全ゲノムの逆平行鎖の一部に相補的である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記標的全ゲノムが、ウイルス若しくは細菌の核酸、又は寄生生物、真核細胞全ゲノムである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ウイルス核酸が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のものである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記標的全ゲノムがＨＢＶのものである場合、前記少なくとも２つの一本鎖核酸プローブにおいて、少なくとも１つの配列が配列番号１（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴ）の配列であり、少なくとも１つの配列が配列番号２（ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧ）の配列である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
リンカーが、前記配列番号１（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴ）及び配列番号２（ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧ）と共に使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記リンカーが、ＨＳ－（ＣＨ２）６－である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＥＣＬ活性ルミノフォアが、ｄｐｐｚ配位子、１，１０－フェナントロリン、キノキサリノ［２，３－ｆ］［１，１０］フェナントロリンを有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＥＣＬ活性ルミノフォアが、Ｒｕ（ｂｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋又は［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋ｐｈｅｎ＝１，１０－フェナントロリン、ｂｐｙ＝２，２’－ビピリジン、ｄｐｐｚ＝ジピリド［３，２－ａ：２’，３’－ｃ］フェナジンである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記発光が、犠牲共反応物を用いて電気化学的に生成される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記共反応物が、Ｋ２Ｓ２Ｏ８である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記共反応物が、第三級アミンであるか、又はトリ－ｎ－プロピルアミン若しくは２－（ジブチルアミノ）エタノール）オキサラート及び過酸化水素である、請求項１６に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲノム分子の核酸の検出によって、迅速かつ高感度なゲノム分子検出を可能にする方法に関する。具体的には、この方法は、特定のプローブで誘導体化され、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの超高感度検出と組み合わされた電極表面上の高分子遺伝的標的の協調ハイブリダイゼーションプロセスを組み合わせる。この方法は、いかなる分析物増幅もなく標的ゲノムを直接検出することを可能にする。したがって、本発明の方法は、増幅なしのアプローチ、特にＰＣＲなしのアプローチと考えることができる。
【背景技術】
【0002】
核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の分子分析は、今日、早期かつ正確な診断、個別化治療、及び予防スクリーニングのために多くの医療分野で重要である。これは、世界中で２２００万人を超える人々に８０万人を超える死者をもたらしたＣＯＶＩＤ－１９のパンデミック感染後に明らかになったように、感染症の分野において特に重要である。この緊急性は、一般に、これらの疾患が人口の健康に壊滅的に影響を与える状態、特に感染症が全乳児死亡の半数以上の死亡及び罹患の原因である発展途上国で特に明白である。
【0003】
これに関連して、分子分析は、伝統的な実験室の方法（細菌培養物又は抗体検出）に関して関連する臨床上の利点を提供し、はるかに速く（細菌培養物の場合は数日であるのに対して数時間である）、特異的であり（遺伝子型の検出を可能にする）、高感度であり（試料中の病原体の数コピーの検出を達成する）、正確である（微生物（ＤＮＡ）の「存在」だけでなくその活力度（ｍＲＮＡ）も検出することができる）。しかしながら、分子的方法は、本質的に非常に面倒であり（いくつかの分析実験室工程を含む）、高価であり（試料あたり約２０～８０ドル）、結果として、現在は専門の集中型検査室でのみ行われている周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を必要とする。したがって、現在の分子ＰＣＲに基づく方法は、確立され統合された方法論であるが、競争力のあるコスト（試験当たり数ドル）で患者の近くの熟練していない人員が使用するのには適していない。これは、ヒトの健康のための分子分析の可能性を事実上制限するその大規模な使用のための強い制限を表す。この証拠として、迅速な感染管理及び予防のためのＣＯＶＩＤの大規模でリアルタイムの診断の現在の困難がある（分子分析には少なくとも１日かかる）。したがって、迅速かつ高感度の病原体検出を可能にする新しい分子的方法の開発は、分子診断分野における大きな進歩である。
【0004】
したがって、ＬｏＤ（１０コピーの標的／反応）の感度の高い要件を満たすことができ、標識の試料前処理を必要としない、増幅なしのアプローチ、特にＰＣＲなしのアプローチが必要とされているが、これは、特に標的濃度が細菌又はウイルスのコピー数が少ないほど低い可能性がある感染性疾患の場合には非常に困難である。
【発明の概要】
【0005】
本発明によって対処される技術的課題は、直接的、迅速かつ高感度の病原体分子検出を可能にする、増幅なしのアプローチ、特にＰＣＲなしのアプローチに基づく検出方法を提供することである。
【0006】
このような課題は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の方法によって解決され、添付の特許請求の範囲の規定は本明細書の不可欠な部分である。
【0007】
本出願人は、ここで、その核酸の検出によって、迅速かつ高感度な全ゲノム分子検出を可能にする新しい分子的方法を見出した。具体的には、この方法は、特定のプローブで誘導体化され、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの超高感度検出と組み合わされた電極表面上の高分子遺伝的標的全体の協調ハイブリダイゼーションプロセスを組み合わせる。この方法は、分析物増幅することなく、生物の標的全ゲノム、特に病原体ゲノムを直接検出することを可能にする。したがって、本発明の方法は、増幅なしのアプローチ、特にＰＣＲなしのアプローチと考えることができる。具体的には、これは、ＥＣＬ電極表面に固定された相補的なｓｓ－オリゴプローブ、特にＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡによる標的全ゲノムの表面協調ハイブリダイゼーション（ＳＣＨ）の組み合わせに基づいていた。実際、これらのプローブは、標的全ゲノムの特定の配列部分を認識するように設計されている。このようにして、それらは標的ゲノムとの同時ハイブリダイゼーションを保証することができる（２つのプローブ間の配列ギャップを維持することができる）。ハイブリダイゼーション時に、標的の全ゲノムは、ゲノムの２つの相補的フィラメントに独立してハイブリダイズし、それを電極表面に固定して超分子複合体を形成する表面プローブによって認識される。
【0008】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、請求項１に記載の方法に関する。
【0009】
有利には、本発明の方法は、非常に高感度であり、ＬｏＤ（１０コピーの標的／反応物）の要件を満たすことができる。本発明の方法はまた、携帯可能で低コストのデバイスに容易に一体化させることができ、したがって診断スクリーニングのための大量使用を可能にする。したがって、安価な診療現場での検査（ＰｏＣＴ）の作成が可能になる。さらに、本発明の方法は、前処理及び標識化を必要としない。
【0010】
本発明による方法のさらなる特徴及び利点は、本発明の実施形態の説明から明らかであり、これは例示的であるが限定的ではない目的として意図される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】超分子錯体形成に基づく分子認識の作成のための実験手順。（ａ）特異的プローブ及びチオールの金電極表面への固定化（ｂ）ｄｓ－ＤＮＡ ＨＢＶの認識及び超分子錯体形成（ｃ）［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋のインターカレーション及びＨＢＶ定量（ｄ）協調ハイブリダイゼーションのためのＰ１及びＰ２プローブ設計。
【0012】
【図2】ＥＣＬ強度対異なる濃度の合成ゲノムＨＢＶの可能性；（ａ）０～１００００ｃｐｓ／ｍｌ（ｂ）ＰＢＳ ０．１Ｍ及び５０ｍＭ Ｋ２Ｓ２Ｏ８中のＥＣＬ強度対Ｌｏｇ ＨＢＶ濃度。走査速度０．３Ｖ／ｓでのＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対するＰ１及びＰ２形成を伴う作動Ａｕ電極。７５０ＶのＰＭＴバイアス。
【0013】
【図3】較正プロット分析及びＨＢＶゲノムの濃度に対する電極の応答の依存性（標準偏差は±０．０７５～０．３２１）。ＰＢＳ ０．１Ｍ中、１４μＭのインターカレートした［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋及び５０ｍＭのＫ２Ｓ２Ｏ８。走査速度０．３Ｖ／ｓでのＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対するＰ１及びＰ２形成を伴う作動Ａｕ電極。７５０ＶのＰＭＴバイアス。
【0014】
【図4】抽出されたＨＢＶゲノムの異なる濃度に対するＥＣＬ強度対電位。（ａ）０～１００００ｃｐｓ／ｍｌ（ｂ）ＰＢＳ ０．１Ｍ、１４μＭインターカレートした［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋及び５０ｍＭ Ｋ２Ｓ２Ｏ８中のＬｏｇ（ｃｐｓ／ｍｌで表されるＨＢＶ濃度）の較正曲線。走査速度０．３Ｖ／ｓでのＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対するＰ１及びＰ２形成を伴う作動Ａｕ電極。７５０ＶのＰＭＴバイアス。
【0015】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の範囲に関して、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される以下の定義が提供される。
【0018】
本発明の方法は、電気化学的刺激によって誘発される発光現象に基づく分析技術である電気化学発光（ＥＣＬ）に基づく。特に、ＥＣＬ共反応体機構では、ルミノフォアの励起状態は、ルミノフォアのラジカルと電気化学的酸化又は還元によって生成された共反応物の反応性中間体との間の反応を通して生成される。特に、本発明の方法は、電極表面に固定された特異的プローブを用いた形成及びＥＣＬルミノフォアを介した検出によるゲノム分子の分子認識に基づく。インターカレーションがその存在によって促進される場合、ＥＣＬシグナルは標的の存在下で増加する。
【0019】
本発明の目的は、試料中の分析物を検出するためのＥＣＬに基づく方法であって、分析物が生物の標的全ゲノムであり、
【0020】
ａ）全ゲノムを含有する試料を少なくとも２つの一本鎖核酸プローブと接触させる工程であって、少なくとも２つの一本鎖核酸プローブの各々が当該標的全ゲノムの対応する部分に相補的である、接触させる工程、
【0021】
ｂ）ＥＣＬ活性ルミノフォアを添加する工程であって、当該ＥＣＬ活性ルミノフォアがＥＣＬインターカレート性ルミノフォアである、添加する工程、
【0022】
ｃ）当該ＥＣＬ活性ルミノフォアによって生成された発光シグナルを決定する工程、を含み、
【0023】
当該標的全ゲノムが、ＤＮＡ又はＲＮＡゲノムから選択される、方法である。
【0024】
好ましい態様によれば、標的全ゲノムは、一本鎖（ｓｓ－）又は二本鎖（ｄｓ－）であり得る。
【0025】
好ましい態様によれば、一本鎖核酸プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡである。
【0026】
好ましい態様によれば、一本鎖核酸プローブは６～１８残基プローブである。
【0027】
好ましい態様によれば、一本鎖核酸プローブは、表面リンカーによって固定化される。
【0028】
好ましい態様によれば、標的全ゲノムが二本鎖ゲノムである場合、少なくとも２つの一本鎖核酸プローブのうちの少なくとも１つは、二本鎖標的全ゲノムの平行鎖の一部に相補的であり、少なくとも２つの一本鎖核酸プローブのうちの少なくとも１つは、二本鎖標的全ゲノムの逆平行鎖の一部に相補的である。好ましくは、二本鎖標的全ゲノムは、ｄｓ－ＤＮＡである。
【0029】
好ましい態様によれば、ｓｓ－核酸プローブとしても示され得る一本鎖核酸プローブに関して、それらは好ましくは一本鎖核酸オリゴプローブ（ｓｓ－核酸オリゴプローブ）である。
【0030】
上記のように、本発明の方法は、生物の標的全ゲノムを検出することを可能にする。好ましくは、当該生物は微生物、更により好ましくはウイルス又は細菌である。
【0031】
好ましい態様によれば、標的全ゲノムは、ウイルス又は細菌ゲノムである。好ましくは、標的全ゲノムは、ウイルス又は細菌、寄生生物、真核細胞全ゲノムである。
【0032】
一般に、一本鎖核酸プローブの数は、標的全ゲノムの種類に基づいて適宜調整することができる。
【0033】
さらに、本発明の方法の選択性は、標的ゲノム全体に応じて選択的に選択することができる一本鎖核酸プローブに依存する。
【0034】
本明細書で意図されるように、生物の標的全ゲノム（本明細書では単に標的全ゲノムとしても示される）という用語は、生物の標的全ゲノム、標的完全ゲノム、又は標的全ゲノムと同じ意味を有する。
【0035】
好ましい態様では、標的二本鎖核酸はウイルス核酸であり、より好ましくはウイルス核酸はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のものである。標的全ゲノムがＨＢＶのものである場合、少なくとも２つの一本鎖核酸プローブは、少なくとも１つの配列が配列番号１（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴ）の配列であり、少なくとも１つの配列が配列番号２（ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧ）の配列である。好ましくはリンカーを使用することができ、より好ましくはリンカーはＨＳ－（ＣＨ２）６－である。好ましい態様によれば、リンカーは、当該配列番号１（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴ）及び配列番号２（ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧ）の配列と共に使用され、好ましくは当該リンカーはＨＳ－（ＣＨ２）６－である。
【0036】
好ましい態様によれば、工程ａ）の一本鎖核酸プローブは２つである。好ましくは、当該２つの一本鎖核酸プローブは、配列番号１（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴ）及び配列番号２（ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧ）の配列を有する。
【0037】
好ましい態様によれば、電極は、金電極である。このような電極は、小型化されていることが好ましい。
【0038】
本発明のＥＣＬに基づく方法は、表面の全標的ゲノム固定化と、ＤＮＡの溝にインターカレートするＥＣＬ－インターカレート性ルミノフォアによるＥＣＬ伝達との組み合わせに基づく診断及び定量化を可能にする。
【0039】
したがって、ＥＣＬインターカレート性ルミノフォアはインターカレート剤であり、その発光寿命及び量子収率の並外れた環境感度を示す。ＥＣＬ活性分子（あるいは、ＥＣＬ活性ルミノフォア又はＥＣＬ活性物質として示される）は、好ましくはＲｕ（ＩＩ）、Ｉｒ（ＩＩＩ）、Ｒｅ（Ｉ）又はＯｓ（ＩＩ）錯体、より好ましくはＲｕ（ＩＩ）錯体である。好ましくは、ＥＣＬ活性ルミノフォアは、Ｒｕ（ＩＩ）、Ｉｒ（ＩＩＩ）、Ｒｅ（Ｉ）又はＯｓ（ＩＩ）配位錯体である。
【0040】
好ましい態様によれば、ＥＣＬ活性ルミノフォアはｄｐｐｚ配位子を有する。好ましくは、ＥＣＬ活性ルミノフォアは、ｄｐｐｚ配位子（ｄｐｐｚ＝ジピリド［３，２－ａ：２’、３’－ｃ］フェナジン）、好ましくはＲｕ（ｂｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋又は［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋（ｐｈｅｎ＝１，１０－フェナントロリン、ｂｐｙ＝２，２’－ビピリジン）を有するＲｕ（ＩＩ）錯体である。他の好ましい配位子は、１，１０フェナントロリン；キノキサリノ［２，３－ｆ］［１，１０］フェナントロリンである。好ましくは、ＥＣＬ活性ルミノフォアは、Ｒｕ（ＩＩ）－又はＯｓ（ＩＩ）－錯体である。
【0041】
好ましい態様によれば、ＥＣＬ共反応物は、酸化又は還元後にＥＣＬシグナルを生成するための反応性ラジカルを生成することができる犠牲試薬である。ＥＣＬ共反応物は、好ましくはＫ２Ｓ２Ｏ８である。他の好ましい共反応物は、第三級アミン、オキサラート（例えば、２－（ジブチルアミノ）エタノール））及び過酸化水素である。
【0042】
例
【0043】
化学物質及び材料
【0044】
使用した試薬は全て分析グレードのものであった。異なる濃度（０．１Ｍ及び０．０１Ｍ）及び異なるｐＨ（５．５、６．５、７．４、８．５）のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、過硫酸カリウム（Ｋ２Ｓ２Ｏ８）＞９９％、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）９８％、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）カリウム（Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］－３／－４）及びエタノール（Ｃ２Ｈ６Ｏ）１００％をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）によって製造されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）１００％をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋を前述のように合成し、６－メルカプト－１－ヘキサノール（Ｃ６Ｈ１４ＯＳ）＞９７％はＦｌｕｋａから購入した。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）クローン完全ゲノム（ＨＢＶクローン分析試料）を、Ｃｌｏｎｉｔ（参照番号０５９６０４６７）から購入し、これはプラスミドＰＢＲ３２２ベクター（３．８ｋｂｐｓ）に挿入されたＨＢＶゲノム（３．２ｋｂｐｓ）である。これは、ＴＥ（Ｔｒｉｓ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ＝８）溶液中で提供される。結核菌（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴＢ）クローン完全ゲノムをＣｌｏｎｉｔ（ｒｅｆ ０５９６０５６４）から入手し、これは系の選択性を試験するためにａＴＥ（Ｔｒｉｓ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ＝８）溶液中に提供された。相補的Ｐ１プローブ（ＨＳ－（ＣＨ２）６－ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴ）及びＰ２プローブ（ＨＳ－（ＣＨ２）６－ＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＧＧ）を、ＭＷＧ（ドイツ）から購入した。ヒト血液からのＨＢＶゲノム抽出（抽出された実際のＨＢＶゲノム試料）を、使用説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（参照５１３０６）を使用して行った。
【0045】
装置及び測定
【0046】
全てのＥＣＬ及び電気化学測定は、作用電極（ＷＥ）としてＡｕ電極（ＣＨ機器１０１）、対極（ＣＥ）としてＰｔワイヤ、及び基準電極（ＲＥ）としてＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）電極を有する単一区画３電極テフロン（登録商標）セルを使用して、ポテンショスタット（ＰＧＳＴＡＴ３０２Ｎ、Ｍｅｔｒｏｈｍ）を用いて行った。ＥＣＬシグナルを、暗箱の内部で、電気化学セルから一定の高さに配置された光電子増倍管（ＰＭＴ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｒ９２８）を用いて測定した。ポテンショスタットＤＡＣモジュールへの外部トリガー接続を使用して、トランスインピーダンスアンプ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ６２７１）を有する高電圧電源ソケットアセンブリを使用してＰＭＴに７５０Ｖを供給した。ポテンショスタットのＡＤＣモジュールを用いて増幅ＰＭＴ出力シグナルを収集することによって、光／電流／電圧曲線を記録した。ＥＣＬスペクトルは、ＳＥＣ２０００ Ｓｐｅｃｔｒａ ｓｙｓｔｅｍ ＵＶ－可視分光光度計（ＡＬＳ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、日本）によって収集した。ただし、電気化学技術として、走査速度０．３Ｖ／ｓで、本発明者らのシステムにおいて負電位を印加するサイクリックボルタンメトリーを使用した。電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）には、５．０ｍＭ（Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］－３／－４）を含有するＰＢＳ ０．１Ｍ、ｐＨ ５．５の緩衝溶液を使用した。全てのＥＩＳ測定は周波数０．１ＭＨｚ～１Ｈｚの範囲で行われており、したがって電流範囲は１ｍＡで同等に保たれている。最後に、開回路電位（Ｅｏｃｐ）の値は、測定全体を通して同じ０．２２８Ｖであった。
【0047】
ＨＢＶ ＤＮＡセンサの製作
【0048】
金電極を、鏡面を得るために０．３μｍ及び０．０５μｍのアルミナスラリーで研磨し、次いで５０：５０エタノール及び脱イオン水で５分間超音波処理することによって洗浄した。さらに、金電極を電気化学的に洗浄し、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液中で－１～１Ｖの間で１０サイクルの周期的電位走査を行った。最後に金電極をＡｒガスで乾燥した。次に、ｐＨ７．４のＰＢＳ ０．０１Ｍの緩衝液を調製し、Ｐ１及びＰ２チオール５’末端プローブを１０μＭの濃度で溶解し、Ａｕ－Ｓ化学に従って表面に固定化した。この溶液に金電極を浸漬し、室温（ＲＴ）条件で４時間保持した。ただし、金電極の表面を数滴のＰＢＳ ０．０１Ｍ、ｐＨ７．４で洗浄した。続いて、Ｐ１特異的プローブとＰ２特異的プローブとの間のギャップを充填する等のために、１０μＭのＣ６Ｈ１４ＯＳを含むｐＨ７．４のＰＢＳ ０．０１Ｍの溶液を使用して一晩のブロッキング手順を行った（図１ａ）。このようにして、ＨＢＶのｄｓ－ＤＮＡを付加する超分子錯体形成を行うＡｕ電極／Ｐ１Ｐ２表面を改質することがより容易になった。ブロッキング修飾後、異なる濃度のｄｓ－ＤＮＡ ＨＢＶ（１～１００００ｃｐｓ／ｍｌ）をｐＨ５．５のＰＢＳ ０．０１Ｍで調製し、このようにして、全ての電極をチャンバ内で５０℃にてこれらの溶液に浸漬する。超分子錯体形成の達成は、この工程の３時間後に達成された（図１ｂ）。しかしながら、ｄｓ－ＤＮＡの溝内に［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋をインターカレーションするために、１４μＭ ［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋のストック溶液をｐＨ５．５のＰＢＳ ０．０１Ｍで調製した。インターカレーションが完了するまで、電極を［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋に２時間浸漬したままにした。記載された手順の後、ＨＢＶ ＤＮＡセンサをすぐに使用することができた（図１ｃ）。
【0049】
分析試験手順
【0050】
Ｐ１及びＰ２プローブで誘導体化した金電極をｐＨ７．４のＰＢＳ ０．０１Ｍを用いて洗浄し、既知濃度のＨＢＶクローンの溶液に５０℃のチャンバ内で４時間浸漬した。次いで、超分子錯体形成が達成され、金電極をｐＨ５．５のＰＢＳ ０．０１Ｍで洗浄した。ｐＨの酸価は、ｄｓ－ＤＮＡの－Ｇ及び－Ｃ基をプロトン化し（超分子複合体三重鎖ＤＮＡ形成を促進する）、Ｐ１プローブ及びＰ２プローブとＨＢＶのｄｓ－ＤＮＡとの間の結合をより強くする。最後に、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋１４μＭを含むｐＨ５．５のＰＢＳ ０．０１Ｍの溶液を調製し、金電極を２時間浸漬した。ハイブリダイズしたＤＮＡの溝に［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋をインターカレーションした後、Ａｕ電極はＥＣＬ手順の準備ができていた。分析的に、出発クローン溶液（１０６コピー）を脱イオン水で希釈することによって、ＨＢＶゲノム試料（１、５、１０、１００、１０００、１００００コピー／反応）を調製した。ただし、実試料分析には、出発クローン溶液（２０００コピー）を脱イオン水で希釈することによって調製したヒト血液（５０－１００－２５０－５００－７５０－１０００コピー／反応）から抽出したＨＢＶゲノム合成クローンを使用した。最後に、ＦＢＳ等の生物学的流体を使用し、実試料を使用するＥＣＬ実験については、上記と同じ実験手順に従う。異なる部分は、生体液及び抽出されたＨＢＶゲノムの異なる濃度における分析のためのＰＢＳの代わりのＦＢＳの使用である。
【0051】
実験結果に関するコメント
【0052】
本発明の方法は、増幅することなく、標的ゲノム、特に病原体ゲノム、より具体的にはＨＢＶゲノムを直接検出することを可能にする。ＨＢＶ検出を特に参照すると、具体的には、この方法は、ＥＣＬ電極表面に固定された２つの相補的なｓ－オリゴプローブによる二本鎖ＨＢＶゲノム（ｄｓ－ＤＮＡゲノム）の表面協調ハイブリダイゼーション（ＳＣＨ）の組み合わせに基づいていた。２つのオリゴプローブ（Ｐ１及びＰ２）は、ｄｓ標的ゲノムの単一フィラメントの一部と相補的であるように設計された。これらのプローブは、同じ標的二本鎖ゲノムの平行鎖及び逆平行鎖の両方の特異的配列を認識するように設計されている。このようにして、それらはゲノム標的の２本の鎖との同時ハイブリダイゼーションを保証することができ、２つのプローブ間の１３８ｂｐｓの配列ギャップが図１ｄに示されるように維持された。この配列ギャップは、プローブとゲノムとの間の分子認識プロセス中の立体障害を最小限に抑えるために重要である。ハイブリダイゼーション時に、標的の全ゲノムは、ゲノムの２つの相補的フィラメントに独立してハイブリダイズし、それを電極表面に固定して超分子複合体－ＤＮＡ標的－プローブ構造を形成する表面プローブによって認識される。分析試料及びヒト血液から抽出された実試料の両方からのＨＢＶゲノムの検出。また、ＥＣＬ活性複合体（ルミノフォア）として、ｄｐｐｚ配位子を有するルテニウム（ＩＩ）錯体等の特定のＥＣＬインターカレート性分子であるルテニウム化合物（［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋）を用い、その発光寿命及び量子収率の並外れた環境感度を示す。
【0053】
改質電極の特性評価
【0054】
この研究の第１の部分は、Ｐ１及びＰ２プローブの効果的な固定のための金電極の表面の化学処理の最適化に焦点を当てた。ＥＣＬバイオセンシングに使用した電極の表面を、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）によって特性評価した。図Ｓ１は、５ｍＭ（Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］－３／－４）の固有の電極で収集したＥＩＳのナイキストプロットを示す。等価回路系（図Ｓ１の挿入図）を使用して、実験的ＥＩＳ結果を適合させた。この回路は、電解質のオーミック抵抗（Ｒ１）、ワールブルグインピーダンス（Ｗｄ２）、電荷移動抵抗（Ｒ２）、及び二重層容量（Ｑ２）を含む。フィッティングは、選択された回路で実証されるように、シミュレートされた線（ドット）が実験インピーダンスデータ（実線）と良好に一致することを示している。図Ｓ１には、４．７ｋΩ・ｃｍ－２（線ａ）の値を有する低い電荷電子移動抵抗を示す裸金電極が示されている。プローブの固定化後、それは、プローブの良好な安定性を与えると同時に、二重層の抵抗を増加させるためのブロッキング工程を作り出す。［４］この工程の後、改質金電極をＥＩＳ技術を用いて新たに分析した。しかしながら、Ｐ１及びＰ２ ＤＮＡプローブの金電極への固定化による電極表面の抵抗は、新たな値Ｒ２を有する。図Ｓ１に示されているように、負に帯電したＤＮＡとレドックスメディエータとの間の静電反発力の結果である可能性がある８．８ｋΩｃｍ－２（線ｂ）に増加した。さらに、ブロッキング手順及び電極の表面へのチオールの堆積の後、Ｒ２（１２．６ｋΩｃｍ２）の値はこの場合も増加する。これは、電子移動を妨げるチオールによって作り出されたという二重層効果の結果である（線ｃ）。さらに、いずれの場合も、表１に示すように、より多くの分子が金電極の表面に堆積する限り、二重層容量Ｑ２の値は増加する。最後に、ＨＢＶのゲノムが電極表面のプローブによって認識されると、超分子複合体ＤＮＡ標的－プローブ形成が作り出される。［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋錯体の付加は、分子のπ－πストーキング性のためにｄｓ－ＤＮＡ溝へのインターカレーションを可能にする。実際、Ｒｕ（ＩＩ）及びＯｓ（ＩＩ）とのｄｐｐｚ錯体は、水中でわずかに発光するだけであるが、ｄｓ－ＤＮＡをインターカレートすると高度に発光する。
【表1】
【0055】
分析性能
【0056】
ＨＢＶの合成ｄｓ－ゲノムの実試料を用いてさらなる試験を行った。反応あたり１０６ｃｐｓの開始濃度を有するこの試料を希釈して、それぞれ反応あたり０－１－５－１０－１００－１０００－１００００ｃｐｓの最終ＤＮＡ量の試験溶液濃度を得た。提案された方法の感度を評価するために、ＥＣＬ強度をＨＢＶ濃度の関数として検出する。電気化学実験は、反応あたり標準濃度１０００ｃｐｓを使用して、３電極セル（詳細は実験部を参照）で行った。この分析性能では、Ｋ２Ｓ２Ｏ８の使用が重要であり、例えばラジカルの生成にとって重要な因子である。この場合、本発明者らは、ＥＣＬ強度４．９３±０．３２ ａ．ｕ．の本発明者らの系の正の応答を得る（図２）。ペルオキシジサルフェート（式１）及び［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋（式２）の還元が起こり得、したがって、式３～５によって概説される一連のプロセスが可能になる。ペルオキシジサルフェートは、電極で直接（式１）又は［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋（式４）の媒介のいずれかによって還元され、硫酸アニオンラジカルを生成する。以下の仮説に沿って、強いＥＣＬシグナルは、ＨＢＶの合成ゲノムの異なる濃度ごとにＥＣＬ強度の最大値を得る第１のスキャンにおいて陰性電位が掃引されたときにのみ観察された。式１～５は、Ｋ２Ｓ２Ｏ８が負電位－０．８０Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極で共反応物として使用される場合の生成の可能な経路［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＊を要約している。［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２／Ｓ２Ｏ８
２－系のＥＣＬ強度は Ｓ２Ｏ８
２－濃度（５０ｍＭ）及び１４μＭの［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋の関数であることが分かったため、この組み合わせを使用して、ＨＢＶの合成ゲノムを認定することを達成した。この結果は、過硫酸イオンが［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋の有効な共反応物であり、励起された［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＊の優れたクエンチャーであるという事実に起因する。
Ｓ２Ｏ８ ２－＋ｅ－－＞ＳＯ４ ・－＋ＳＯ４２－
（１）
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＋ｅ－－＞［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］＋
（２）
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］＋＋ＳＯ４ ２－－＞［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＋ＳＯ４ ・－＋ＳＯ４ ２－
（３）
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］＋＋ＳＯ４ ・－－＞［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＊＋ＳＯ４ ２－
（４）
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＊－＞［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＋ｈν
（５）
Ｓ２Ｏ８ ２－＋ｅ－－＞ＳＯ４ ・－＋ＳＯ４２－
（１）
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＋ｅ－－＞［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］＋
（２）
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］＋＋ＳＯ４ ２－－＞［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＋ＳＯ４ ・－＋ＳＯ４ ２－
（３）
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］＋＋ＳＯ４ ・－－＞［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＊＋ＳＯ４ ２－
（４）
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＊－＞［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋＋ｈν
（５）
【0057】
本発明の系に影響を及ぼし得る二次因子のさらなる調査のために、超分子錯体形成のハイブリダイゼーションに２つの異なるｐＨを使用してｐＨ効果を調査した。ｐＨは、あらゆる種類の共試薬におけるＥＣＬシグナルの増強に影響を及ぼし得る。４つの異なるｐＨ値を使用したこの場合も、同じ濃度のＨＢＶ合成ゲノム（反応あたり１００ｃｐｓ）に対するＥＣＬシグナルが変化した（図Ｓ３）。ｐＨ＜７．４では、より多くのＨ＋の存在が、ＳＯ４
・－種の生成等の本発明者らの系における化学バランスをそれほど効果的にすることはできない。一方、ｐＨ＞７．４の場合、特異的なＰ１プローブ及びＰ２プローブによるＨＢＶ合成ゲノムの認識は金電極の表面で行うことができないため、この効果はＥＣＬシグナル値の劇的な減少をもたらす。最後に、全てのＥＣＬ実験についてｐＨ７．４を使用した（例えば、ＥＣＬ強度のより高い値が観察される）。図２で観察されるように、本発明者らはこの実験プロセスを繰り返し、反応当たり１０００ｃｐｓよりも高い／低い濃度も使用して電気化学的応答を測定する。いずれの場合も、本発明者らは、ｄｓ－ＤＮＡ濃度に比例する異なるＥＣＬ強度を観察する。ＰＭＴによって検出されるＥＣＬ強度は、Ｋ２Ｓ２Ｏ８（共試薬）と［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋（ルミノフォア）との間の還元反応に由来する。式１～５には、発光を生成するための可能な経路が記載されている。ＣＶ－ＥＣＬ技術で保持された濃度の範囲は、反応あたり０～１０００ｃｐｓであった。図２に示される反応あたり１０００ｃｐｓの最大ＥＣＬ値（濃い青色線）は、図２に示される最小値（反応あたり５ｃｐｓ）（赤色線）０．４１±０．０８ ａ．ｕの代わりである。これらの結果のいずれの場合も、実験は３回を超えて繰り返されており、各測定の再現性が試験されている。
【0058】
選択性
【0059】
提案されたシステムの選択性を評価するために、３つの異なる濃度（１０－１００－１０００ｃｐｓ／反応）で非特異的標的である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＭＴＢ）合成クローンを用いてバイオセンサを試験した。結果は、本発明者らの化学的戦略がプローブとＨＢＶ合成ゲノムとの間の超分子錯体形成にのみ独特であることを証明している。したがって、ＭＴＢの場合、ＥＣＬシグナル応答はない（図Ｓ２ａ～ｃ）。一方、ｄｓ－ＨＢＶゲノムの場合のＥＣＬシグナル応答は完全に観察され、例えば、それは２つの平行及び逆平行の相補的Ｐ１プローブ及びＰ２プローブによって捕捉される。最後の場合、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋をインターカレートし、金電極の改質表面におけるＨＢＶの存在を定量することができる（図Ｓ２ｄ）。
【0060】
実験変数の最適化
【0061】
提案された系の分析ＥＣＬ応答を評価した。本発明者らの方法の感度を評価するために、ＥＣＬ強度を対数ｄｓ－ＨＢＶ濃度の関数として調べた。
【0062】
検知能力の評価について、上記最適条件で検出限界（ＬｏＤ）を測定した。検量線を、ＥＣＬ強度及び対数ｄｓ－ＨＢＶ濃度の変化をプロットすることによって確立した。反応あたり５ｃｐｓ～反応あたり１００００ｃｐｓの良好な線形範囲が得られ、相関係数は０．９８７である。ＬｏＤ（Ｓ／Ｎ＝３．３）は、値が反応あたり２．７ｃｐｓである較正プロット（図３）を使用して計算されており、ＰＣＲ法よりも３７倍効率的かつ高感度であるため、本発明者らの方法の感度を確認するものである。
【0063】
生物学的流体への適用
【0064】
ＨＢＶの測定のための改質金電極の適用性のためにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使用した。この分析については、実験セクションで説明したのと同じ実験手順に従ったが、主な違いは、三重鎖形成がＰＢＳ緩衝液の代わりにＦＢＳ溶液中で行われたことである。しかしながら、ＨＢＶ濃度の３つの異なる合成ゲノム（反応あたり１００－１０００－１００００ｃｐｓ）が、ＥＣＬ技術を使用して試験されている。ＦＢＳでの本発明者らの測定は全て、大きなＥＣＬ応答を有し、ＰＢＳ溶液中のｄｓ－ＨＢＶゲノムの定量に関する本発明者らの理論に従う（図Ｓ４）。結果は、８２．７～１０４．１％の範囲の実際の標準偏差（ＲＳＤ）でＨＢＶの満足のいく回収を示し（表２）、したがって、生物学的流体における提案された電気化学的ＤＮＡセンサの効率的な適用性が確認される。
【表2】
【0065】
実試料分析
【0066】
この実験手順を、ＨＢＶゲノムの検証及び定量化のため行った。Ｐ１プローブとＰ２プローブの組み合わせは、同じ標的ゲノムの平行鎖と逆平行鎖の両方で特定の遺伝子配列を認識するように適切に設計された。提案された改質金電極の適用性及び有効性を、抽出されたＨＢＶ試料の決定に評価した。実試料分析をＣＶ技術を用いて行い、ＥＣＬ応答を得て、ここで、記載の設定及び前処理プロトコルを用いて測定を行った。
【0067】
実試料対照は、図２等の同じ濃度範囲で完了している。抽出されたＨＢＶゲノムの場合、分析試料のＥＣＬ強度値は常に合成のものよりも低い。抽出された試料は、３３００ｂｐｓに相当するＨＢＶゲノムのサイズを有するいかなるベクターも含まない。しかしながら、分析試料ＨＢＶクローンは、７１４４ｂｐｓの最終環状構造に相当するプラスミドＰＢＲ３２２ベクター（３．８ｋｂｐｓ）にクローニングされたゲノム（３．３ｋｂｐｓ）からなる。この差は、合成ＨＢＶゲノムの溝内の［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋の最も高いインターカレーションに対応する。ＥＣＬ強度は、ＨＢＶの抽出されたクローンの場合には１１倍低く、これはより低いレドックスシグナルのために起こる。図４ａによれば、様々な濃度（０～１０００ｃｐｓ／ｍｌ）で所有される非常に高いＥＣＬ強度のために、ＨＢＶのｄｓ－ＤＮＡの存在を検証することができる。本発明者らのシステムの電気化学反応（還元）は、図２でも観察される同じ負電位（－０．８０Ｖ）で起こる。ＥＣＬ曲線は、式（１－５）に記載されているように、Ｋ２Ｓ２Ｏ８及び［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋の還元の結果である。抽出されたＨＢＶゲノムは、検知能力について研究及び評価されており、検出限界（ＬｏＤ）は、上述の最適条件下で測定された。検量線を、ＥＣＬ強度の変化と対数ｄｓ－ＨＢＶ濃度との間のプロットによって確立した。反応あたり５０ｃｐｓ～反応あたり１００００ｃｐｓの良好な線形範囲が得られ、相関係数０．９７３である。ＬｏＤ（Ｓ／Ｎ＝３．３）は、値が反応あたり６０ｃｐｓである較正プロット（図４ｂ）を使用して計算されており、ＰＣＲ法の代わりに１．７倍効率的かつ高感度であるため、本発明者らの方法の感度を確認するものである。一般に、ＨＢＶのこれら２つの異なるゲノムのＥＣＬ応答は、２つの異なるＬｏＤ間の比較によって達成されている。合成ＨＢＶゲノムの場合、本発明者らは、上記のように約２．７ｃｐｓ／ｍｌのＬｏＤを得た。一方、抽出されたＨＢＶゲノムを決定するためのＬｏＤは、同じ経路を使用して、約６０ｃｐｓ／ｍｌである。これらの２つのＬｏＤ値間のこの大きな差は、ＨＢＶ ｄｓ－ＤＮＡの溝内にインターカレートされた異なる量の［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２ｄｐｐｚ］２＋を示す。ＨＢＶ ＤＮＡの長さは、ＥＣＬ強度の重要な中断を有する。
【0068】
上記の例は、本発明の表示として提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】