特表 2024-526820 ＡＣＴＲＩＩタンパク質およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】ＡＣＴＲＩＩタンパク質およびその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20240711BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240711BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20240711BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 14/71 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240711BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17

A61P9/00

A61P9/12

A61K47/68

A61K47/65

A61K45/00

C07K14/71 ZNA

C07K16/00

C07K19/00

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024502611

(86)(22)【出願日】2022-07-18

(85)【翻訳文提出日】2024-03-04

(86)【国際出願番号】 US2022037479

(87)【国際公開番号】W WO2023003815

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/223,265

(32)【優先日】2021-07-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509125475

【氏名又は名称】アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】デ・オリヴェイラ・ペーナ，ジャネーテ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076CC11

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA21

4C084BA23

4C084CA18

4C084NA14

4C084ZA36

4C084ZA42

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

幾つかの態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減するための組成物および方法、特に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する投与レジメンに関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドで患者を治療する際の毛細血管拡張症のリスクを低減する方法であって、該方法が、
（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の第１用量を、０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、２４週間、患者に投与すること、および
（ｉｉ）患者が毛細血管拡張症の、１以上の症状または発生リスク因子を示す場合には、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の第２用量を、第１用量の量の少なくとも半分低減した量で、患者に投与すること
を含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与することを含む、前記方法。

【請求項2】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドで患者を治療する際の毛細血管拡張症のリスクを低減する方法であって、該方法が、
（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の用量を、０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、２４週間、患者に投与すること、
（ｉｉ）患者が毛細血管拡張症の、１以上の症状または発生リスク因子を示す場合には、投与を省略（ｓｋｉｐ）し、この場合、工程（ｉ）の後の６週間にわたって患者を治療しないこと、
（ｉｉｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の用量を、０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、２４週間、患者に投与することを再開すること
を含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与することを含む、前記方法。

【請求項3】

肺動脈性肺高血圧症の治療方法であって、該方法が、
（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、および
（ｉｉ）患者が治療を要する限り、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、患者に投与すること
を含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを、それを要する患者に投与することを含み、
ここで、該ポリペプチドが、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記方法。

【請求項4】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドで患者を治療する際の毛細血管拡張症のリスクを低減する方法であって、該方法が、
（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の第１用量を、０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、２４週間、患者に投与すること、
（ｉｉ）患者が治療を要する限り、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の第２用量を、０．７ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、患者に投与すること、および
（ｉｉｉ）患者が毛細血管拡張症の、１以上の症状または発生リスク因子を示す場合には、症状が改善するまで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の第３用量を、０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、投与すること
を含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与し、
該ポリペプチドが、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減することを含む、前記方法。

【請求項5】

工程（ｉｉｉ）が、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の用量を、０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、少なくとも２４週間、患者に投与することを含む、請求項４記載の方法。

【請求項6】

工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）との間の少なくとも２～６週間、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドで患者を治療しない、請求項４記載の方法。

【請求項7】

工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）との間の少なくとも３週間、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドで患者を治療しない、請求項４または６記載の方法。

【請求項8】

工程（ｉ）が、第１用量を少なくとも３週間、患者に投与することを含む、請求項４～７のいずれか１項記載の方法。

【請求項9】

工程（ｉｉ）が、第２用量を少なくとも２１週間、患者に投与することを含む、請求項４～８のいずれか１項記載の方法。

【請求項10】

工程（ｉｉ）が、第２用量を少なくとも４５週間、患者に投与することを含む、請求項４～８のいずれか１項記載の方法。

【請求項11】

毛細血管拡張症の前記の１以上の症状が、疼痛、掻痒、皮膚上の糸状の赤い跡、皮膚粘膜毛細血管拡張症、胃腸出血、皮膚上の病変、鼻出血、歯肉出血、動静脈奇形、内部毛細血管拡張症および皮膚上の赤色斑点からなる群から選択される、請求項１～２および４～１０のいずれか１項記載の方法。

【請求項12】

毛細血管拡張症の、１以上の症状が、皮膚上の病変を含む、請求項１～２および４～１１のいずれか１項記載の方法。

【請求項13】

毛細血管拡張症の、１以上の症状が、歯肉出血を含む、請求項１～２および４～１１のいずれか１項記載の方法。

【請求項14】

毛細血管拡張症の、１以上の症状が、鼻出血を含む、請求項１～２および４～１１のいずれか１項記載の方法。

【請求項15】

毛細血管拡張症の、１以上の症状が、動静脈奇形を含む、請求項１～２および４～１１のいずれか１項記載の方法。

【請求項16】

毛細血管拡張症の、１以上の症状が、内部毛細血管拡張症を含む、請求項１～２および４～１１のいずれか１項記載の方法。

【請求項17】

動静脈奇形または内部毛細血管拡張症が内臓において生じる、請求項１１、１５または１６のいずれか１項記載の方法。

【請求項18】

毛細血管拡張症を発生するリスク因子が、
ｉ．低いＢＭＰ９レベル、
ｉｉ．低いＢＭＰ１０レベル、
ｉｉｉ．低いＶＥＧＦレベル、
ｉｖ．遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）、および
ｖ．結合組織病（膠原病）（ＣＴＤ）
からなる群から選択される、請求項１～２および４～１４のいずれか１項記載の方法。

【請求項19】

該方法が患者における毛細血管拡張症の重症度を緩和または改善する、請求項１～２および４～１８のいずれか１項記載の方法。

【請求項20】

該方法が患者における毛細血管拡張症の進行を予防する、請求項１～２および４～１８のいずれか１項記載の方法。

【請求項21】

工程（ｉｉｉ）が、毛細血管拡張症がグレード１以下に改善するまで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を保留することを含む、請求項２または請求項４記載の方法。

【請求項22】

該方法が毛細血管拡張症の重症度をグレード２からグレード１に改善する、請求項１９記載の方法。

【請求項23】

該方法が毛細血管拡張症の重症度をグレード３からグレード２に改善する、請求項１９記載の方法。

【請求項24】

該方法が毛細血管拡張症の重症度をグレード３からグレード１に改善する、請求項１９記載の方法。

【請求項25】

該方法がグレード１からグレード２への毛細血管拡張症の進行を予防する、請求項２０記載の方法。

【請求項26】

該方法がグレード２からグレード３への毛細血管拡張症の進行を予防する、請求項２０記載の方法。

【請求項27】

患者が肺高血圧症の治療のためにＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与を受けている、請求項１～２および４～２６のいずれか１項記載の方法。

【請求項28】

患者が肺動脈性肺高血圧症の治療のためにＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与を受けている、請求項１～２および４～２７のいずれか１項記載の方法。

【請求項29】

該ポリペプチドが、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項記載の方法。

【請求項30】

該ポリペプチドが、配列番号１の残基２１～１３５に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項記載の方法。

【請求項31】

該ポリペプチドが、配列番号１の残基２１～１３５に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項記載の方法。

【請求項32】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３１のいずれか１項記載の方法。

【請求項33】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３１のいずれか１項記載の方法。

【請求項34】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃドメインを更に含む融合タンパク質である、請求項１～３３のいずれか１項記載の方法。

【請求項35】

免疫グロブリンのＦｃドメインがＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項３４記載の方法。

【請求項36】

Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインと免疫グロブリンのＦｃドメインとの間に位置するリンカードメインを更に含む、請求項３４または請求項３５記載の方法。

【請求項37】

リンカードメインが、ＴＧＧＧ（配列番号２０）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１８）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧ（配列番号１７）およびＳＧＧＧ（配列番号２１）からなる群から選択される、請求項３６記載の方法。

【請求項38】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３７のいずれか１項記載の方法。

【請求項39】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３７のいずれか１項記載の方法。

【請求項40】

該ポリペプチドが凍結乾燥後に再構成（reconstituted）される、請求項１～３９のいずれか１項記載の方法。

【請求項41】

該ポリペプチドが可溶性である、請求項１～４０のいずれか１項記載の方法。

【請求項42】

該ポリペプチドが、皮下注射を用いて患者に投与される、請求項１～４１のいずれか１項記載の方法。

【請求項43】

該ポリペプチドが、毎週、２週間ごと、３週間ごとおよび４週間ごとからなる群から選択されるスケジュールで患者に投与される、請求項１～４２のいずれか１項記載の方法。

【請求項44】

該ポリペプチドが３週間ごとに患者に投与される、請求項１～４２のいずれか１項記載の方法。

【請求項45】

該ポリペプチドが４週間ごとに患者に投与される、請求項１～４２のいずれか１項記載の方法。

【請求項46】

該ポリペプチドがホモ二量体タンパク質複合体の一部である、請求項１～４５のいずれか１項記載の方法。

【請求項47】

該ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１～４６のいずれか１項記載の方法。

【請求項48】

該ポリペプチドが、チャイニーズハムスター卵巣細胞における発現によって得られるグリコシル化パターンを有する、請求項１～４７のいずれか１項記載の方法。

【請求項49】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１からなる群から選択される１以上のリガンドに結合する、請求項１～４８のいずれか１項記載の方法。

【請求項50】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドがアクチビンおよび／またはＧＤＦ１１に結合する、請求項１～４８のいずれか１項記載の方法。

【請求項51】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８およびＢＭＰ６からなる群から選択される１以上のリガンドに更に結合する、請求項４９または請求項５０記載の方法。

【請求項52】

追加的な活性物質および／または支持療法を患者に更に投与することを含む、請求項１～５１のいずれか１項記載の方法。

【請求項53】

追加的な活性物質および／または支持療法が、ベータブロッカー、アンジオテンシン変換酵素インヒビター（ＡＣＥインヒビター）、アンジオテンシン受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、利尿剤、脂質低下薬、エンドセリンブロッカー、ＰＤＥ５インヒビター、プロスタサイクリンおよび左心室補助装置（ＬＶＡＤ）からなる群から選択される、請求項５２記載の方法。

【請求項54】

追加的な活性物質および／または支持療法が、プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニルおよびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、テリン、アンブリセンタン、マシテンタンおよびボセンタン）；カルシウムチャネルブロッカー（例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン）；抗凝固薬（例えば、ワルファリン）；利尿薬；酸素療法；心房中隔欠損作成術；肺血栓内膜切除術；ホスホジエステラーゼ５型インヒビター（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼのアクチベーター（例えば、シナシグアトおよびリオシグアト）；ＡＳＫ－１インヒビター（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ－４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ－ナフト［１，２，３－デ］キニリン－２，７－ジオン、ＮＱＤＩ－１；２－チオキソ－チアゾリジン、５－ブロモ－３－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデン）－１，３－ジヒドロ－インドール－２－オン）；ＮＦ－κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ－エポキシド；２．２－ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）；２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアン－１，９－ジエン－２８－酸（ＣＤＤＯ）；３－アセチルオレアノール酸；３－トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８－メチル－３－アセチルオレアナン；２８－メチル－３－トリフルオロアセチルオレアナン；２８－メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のＰＥＧ化誘導体；３－Ｏ－（ベータ－Ｄ－グルコピラノシル）オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［αＬ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［アルファ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－オレアノール酸；３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸 ３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ２）；メチル ３，１１－ジオキソオレアン－１２－エン－２８－オラート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ_４－２；ベンジル ３－デヒドロオキシ－１，２，５－オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノラート）；左心室補助装置（ＬＶＡＤ）、ならびに肺および／もしくは心臓移植からなる群から選択される、請求項５２記載の方法。

【請求項55】

患者が、ホスホジエステラーゼ５型インヒビター、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、プロスタサイクリン受容体アゴニストおよびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１以上の物質で治療されている、請求項１～５４のいずれか１項記載の方法。

【請求項56】

前記の１以上の物質が、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタンおよびタダラフィルからなる群から選択される、請求項５５記載の方法。

【請求項57】

該方法が、ホスホジエステラーゼ５型インヒビター、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、プロスタサイクリン受容体アゴニストおよびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１以上の物質の投与を更に含む、請求項１～５６のいずれか１項記載の方法。

【請求項58】

前記の１以上の物質が、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタンおよびタダラフィルからなる群から選択される、請求項５７記載の方法。

【請求項59】

患者が該ポリペプチドの投与の前に１以上の血管拡張薬で治療されている、請求項１～５８のいずれか１項記載の方法。

【請求項60】

該方法が１以上の血管拡張薬の投与を更に含む、請求項１～５９のいずれか１項記載の方法。

【請求項61】

前記の１以上の血管拡張薬が、プロスタサイクリン、エポプロステノールおよびシルデナフィルからなる群から選択される、請求項５９または請求項６０記載の方法。

【請求項62】

血管拡張薬がプロスタサイクリンである、請求項６１記載の方法。

【請求項63】

患者がＰＡＨに対する１以上の療法を受けている、請求項１～６２のいずれか１項記載の方法。

【請求項64】

ＰＡＨに対する１以上の療法が、プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニルおよびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、テリン、アンブリセンタン、マシテンタンおよびボセンタン）；カルシウムチャネルブロッカー（例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン）；抗凝固薬（例えば、ワルファリン）；利尿薬；酸素療法；心房中隔欠損作成術；肺血栓内膜切除術；ホスホジエステラーゼ５型インヒビター（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼのアクチベーター（例えば、シナシグアトおよびリオシグアト）；ＡＳＫ－１インヒビター（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ－４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ－ナフト［１，２，３－デ］キニリン－２，７－ジオン、ＮＱＤＩ－１；２－チオキソ－チアゾリジン、５－ブロモ－３－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデン）－１，３－ジヒドロ－インドール－２－オン）；ＮＦ－κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ－エポキシド；２．２－ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）；２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアン－１，９－ジエン－２８－酸（ＣＤＤＯ）；３－アセチルオレアノール酸；３－トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８－メチル－３－アセチルオレアナン；２８－メチル－３－トリフルオロアセチルオレアナン；２８－メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のＰＥＧ化誘導体；３－Ｏ－（ベータ－Ｄ－グルコピラノシル）オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ａ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［アルファ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－オレアノール酸；３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸 ３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ２）；メチル ３，１１－ジオキソオレアン－１２－エン－２８－オラート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ_４－２；ベンジル ３－デヒドロオキシ－１，２，５－オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノラート）；左心室補助装置（ＬＶＡＤ）、ならびに肺および／もしくは心臓移植からなる群から選択される、請求項６３記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本出願は２０２１年７月１９日付出願の米国仮特許出願第６３／２２３，２６５号（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。

【0002】

分野
本出願は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法を記載する。本出願はまた、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法であって、該ポリペプチドが、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記方法に関する。

【背景技術】

【0003】

毛細血管拡張症は、拡張した細静脈（小さな血管）が皮膚に糸のような赤い線または模様を生じさせる状態を意味する。これらの模様、すなわち毛細血管拡張は多数の条件下で血管作動性物質の放出または活性化によって引き起こされると考えられている。毛細血管拡張症はしばしば良性であるが、それは遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）のような重篤な疾患によっても引き起こされうる。ＨＨＴ患者では、肝臓のような重要な器官に毛細血管拡張が生じうる。これらの毛細血管拡張の破裂は、生命を脅かす出血を引き起こしうる。

【0004】

毛細血管拡張症は、ＡＬＫ－１受容体融合タンパク質（ダランテルセプト）、エンドグリン中和抗体（ＴＲＣ１０５）および特定のＡｃｔＲＩＩポリペプチドのような特定の薬物の投与の際に副作用として生じうる（Ｇａｒｂｅｒ Ｋ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４（５）：４５８－４６１）。

【0005】

基礎疾患の治療のために１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減するための有効な療法に対する、満たされていない高い需要が存在する。したがって、本開示の目的は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクに対する方法を提供することである。

【発明の概要】

【0006】

概括
特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法を提供し、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、および（ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含み、ここで、患者が毛細血管拡張症の症状を示し、または毛細血管拡張症を発生するリスク因子を含む場合には、第３用量の投与を開始し、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減する。特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法を提供し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、および（ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与することを含み、ここで、患者が毛細血管拡張症の症状を示し、または毛細血管拡張症を発生するリスク因子を含む場合には、第３用量の投与を開始し、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、第３用量の投与は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、第３用量の投与は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を、少なくとも２～６週間、保留する（ｗｉｔｈｈｏｌｄ；見合わせる）ことを含む。幾つかの実施形態においては、第３用量の投与は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を、少なくとも３週間、保留することを含む。幾つかの実施形態においては、第１用量を患者に少なくとも３週間投与する。幾つかの実施形態においては、第２用量を少なくとも２１週間投与する。幾つかの実施形態においては、第２用量を少なくとも４５週間投与する。

【0007】

特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドで患者を治療する際の毛細血管拡張症のリスクを低減する方法を提供し、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の第１用量を、０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、２４週間、患者に投与することを含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与することを含み、ここで、患者が毛細血管拡張症の１以上の症状または発生リスク因子を示す場合には、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの、１以上の第２用量を、第１用量の量の少なくとも半分低減した量で、患者に投与する。

【0008】

特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法を提供し、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間ごとに患者に投与することを含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与することを含み、ここで、患者が毛細血管拡張症の症状を示し、または毛細血管拡張症を発生するリスク因子を含む場合には、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを０．３ｍｇ／ｋｇの量で６週間ごとに患者に投与し、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減する。特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法を提供し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを０．３ｍｇ／ｋｇの量で３週間ごとに患者に投与することを含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与することを含み、ここで、患者が毛細血管拡張症の症状を示し、または毛細血管拡張症を発生するリスク因子を含む場合には、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを０．３ｍｇ／ｋｇの量で６週間ごとに患者に投与し、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量は３週間ごとの０．７ｍｇ／ｋｇである。

【0009】

特定の態様においては、本開示は、肺動脈性肺高血圧症の治療方法を提供し、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、および（ｉｉ）患者が治療を要する限り、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で３週間に１回、患者に投与することを含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを、それを要する患者に投与することを含み、ここで、該ポリペプチドは、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0010】

幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は、疼痛、掻痒、皮膚上の糸状の赤い跡、皮膚粘膜毛細血管拡張症、胃腸出血、皮膚上の病変、鼻出血、歯肉出血、動静脈奇形、内部毛細血管拡張症および皮膚上の赤色斑点からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は皮膚上の病変を含む。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は歯肉出血を含む。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は鼻出血を含む。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は動静脈奇形を含む。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は内部毛細血管拡張症を含む。幾つかの実施形態においては、動静脈奇形または内部毛細血管拡張症は内臓（例えば、脳、肝臓、肺、脾臓、尿路および脊椎）において生じる。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症を発生するリスク因子は、低いＢＭＰ９レベル、低いＢＭＰ１０レベル、低いＶＥＧＦレベル、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）および結合組織病（膠原病）（ＣＴＤ）からなる群から選択される。

【0011】

幾つかの実施形態においては、リスクの低減は重篤な毛細血管拡張症の軽減または改善を含む。幾つかの実施形態においては、リスクの低減は、毛細血管拡張症の進行を予防することを含む。幾つかの実施形態においては、第３用量は、毛細血管拡張症がグレード１以下に改善するまで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を保留することを含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、毛細血管拡張症の重症度をグレード２からグレード１に改善する。幾つかの実施形態においては、該方法は毛細血管拡張症の重症度をグレード３からグレード２に改善する。幾つかの実施形態においては、該方法は毛細血管拡張症の重症度をグレード３からグレード１に改善する。幾つかの実施形態においては、該方法はグレード１からグレード２への毛細血管拡張症の進行を予防する。幾つかの実施形態においては、該方法は、グレード２からグレード３への毛細血管拡張症の進行を予防する。幾つかの実施形態においては、患者はＰＨの治療のためにＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与を受けている。幾つかの実施形態においては、患者はＰＡＨの治療のためにＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与を受けている。

【0012】

幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号１の残基２１～１３５に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号１の残基２１～１３５に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを更に含む融合タンパク質である。幾つかの実施形態においては、免疫グロブリンのＦｃドメインはＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインである。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインと免疫グロブリンのＦｃドメインとの間に位置するリンカードメインを更に含む。幾つかの実施形態においては、リンカードメインは、ＴＧＧＧ（配列番号２０）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１８）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧ（配列番号１７）およびＳＧＧＧ（配列番号２１）からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0013】

幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは凍結乾燥される。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは可溶性である。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、皮下注射を用いて患者に投与される。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、毎週、２週間ごと、３週間ごとおよび４週間ごとからなる群から選択されるスケジュールで患者に投与される。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは３週間ごとに患者に投与される。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは４週間ごとに患者に投与される。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドはホモ二量体タンパク質複合体の一部である。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドはグリコシル化されている。幾つかの実施形態においては、該ポリペプチドは、チャイニーズハムスター卵巣細胞における発現によって得られうるグリコシル化パターンを有する。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１からなる群から選択される１以上のリガンドに結合する。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドはアクチビンおよび／またはＧＤＦ１１に結合する。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８およびＢＭＰ６からなる群から選択される１以上のリガンドに更に結合する。

【0014】

幾つかの実施形態においては、該方法は、追加的な活性物質および／または支持療法を患者に投与することを更に含む。幾つかの実施形態においては、追加的な活性物質および／または支持療法は、ベータブロッカー、アンジオテンシン変換酵素インヒビター（ＡＣＥインヒビター）、アンジオテンシン受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、利尿剤、脂質低下薬、エンドセリンブロッカー、ＰＤＥ５インヒビター、プロスタサイクリンまたは左心室補助装置（ＬＶＡＤ）からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、追加的な活性物質および／または支持療法は、以下のものからなる群から選択される：プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニルおよびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、テリン、アンブリセンタン、マシテンタンおよびボセンタン）；カルシウムチャネルブロッカー（例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン）；抗凝固薬（例えば、ワルファリン）；利尿薬；酸素療法；心房中隔欠損作成術；肺血栓内膜切除術；ホスホジエステラーゼ５型インヒビター（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼのアクチベーター（例えば、シナシグアトおよびリオシグアト）；ＡＳＫ－１インヒビター（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ－４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ－ナフト［１，２，３－デ］キニリン－２，７－ジオン、ＮＱＤＩ－１；２－チオキソ－チアゾリジン、５－ブロモ－３－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデン）－１，３－ジヒドロ－インドール－２－オン）；ＮＦ－κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ－エポキシド；２．２－ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）；２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアン－１，９－ジエン－２８－酸（ＣＤＤＯ）；３－アセチルオレアノール酸；３－トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８－メチル－３－アセチルオレアナン；２８－メチル－３－トリフルオロアセチルオレアナン；２８－メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のＰＥＧ化誘導体；３－Ｏ－（ベータ－Ｄ－グルコピラノシル）オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［αＬ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［アルファ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－オレアノール酸；３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸 ３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ２）；メチル ３，１１－ジオキソオレアン－１２－エン－２８－オラート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ_４－２；ベンジル ３－デヒドロオキシ－１，２，５－オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノラート）；左心室補助装置（ＬＶＡＤ）、または肺および／もしくは心臓移植。幾つかの実施形態においては、患者は、ホスホジエステラーゼ５型インヒビター、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、プロスタサイクリン受容体アゴニストおよびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１以上の物質で治療されている。幾つかの実施形態においては、前記の１以上の物質は、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタンおよびタダラフィルからなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、該方法は、ホスホジエステラーゼ５型インヒビター、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、プロスタサイクリン受容体アゴニストおよびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１以上の物質の投与を更に含む。幾つかの実施形態においては、前記の１以上の物質は、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタンおよびタダラフィルからなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、患者は、該ポリペプチドの投与の前に１以上の血管拡張薬で治療されている。幾つかの実施形態においては、該方法は、１以上の血管拡張薬の投与を更に含む。幾つかの実施形態においては、前記の１以上の血管拡張薬は、プロスタサイクリン、エポプロステノールおよびシルデナフィルからなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、血管拡張薬はプロスタサイクリンである。幾つかの実施形態においては、患者はＰＡＨに対する１以上の療法を受けている。幾つかの実施形態においては、ＰＡＨに対する１以上の療法は、以下のものからなる群から選択される：プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニルおよびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、テリン、アンブリセンタン、マシテンタンおよびボセンタン）；カルシウムチャネルブロッカー（例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン）；抗凝固薬（例えば、ワルファリン）；利尿薬；酸素療法；心房中隔欠損作成術；肺血栓内膜切除術；ホスホジエステラーゼ５型インヒビター（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼのアクチベーター（例えば、シナシグアトおよびリオシグアト）；ＡＳＫ－１インヒビター（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ－４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ－ナフト［１，２，３－デ］キニリン－２，７－ジオン、ＮＱＤＩ－１；２－チオキソ－チアゾリジン、５－ブロモ－３－（４－オキソ－２－チオキソ－チアゾリジン－５－イリデン）－１，３－ジヒドロ－インドール－２－オン）；ＮＦ－κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ－エポキシド；２．２－ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ－Ｉｍ）；２－シアノ－３，１２－ジオキソオレアン－１，９－ジエン－２８－酸（ＣＤＤＯ）；３－アセチルオレアノール酸；３－トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８－メチル－３－アセチルオレアナン；２８－メチル－３－トリフルオロアセチルオレアナン；２８－メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のＰＥＧ化誘導体；３－Ｏ－（ベータ－Ｄ－グルコピラノシル）オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→２）－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；３－Ｏ－［ａ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３－Ｏ－［アルファ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシル］オレアノール酸 ２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルエステル；２８－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－オレアノール酸；３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸 ３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル（１→３）－β－Ｄ－グルコピラノシズロン酸（ＣＳ２）；メチル ３，１１－ジオキソオレアン－１２－エン－２８－オラート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ_４－２；ベンジル ３－デヒドロオキシ－１，２，５－オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノラート）；左心室補助装置（ＬＶＡＤ）、または肺および／もしくは心臓移植。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１はヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（配列番号３１）とヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン（配列番号２）とのアライメントを示し、ここで、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造の複合解析に基づいてリガンドに直接接触すると本明細書において推定される残基がボックスで示されている。

【図2】図２は種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号６～１０および３６～３８）の多重配列アライメントを示す。

【図3】図３は、Ｃｌｕｓｔａｌ２．１を使用した場合の、ヒトＩｇＧアイソタイプからのＦｃドメインの多重配列アライメントを示す。ヒンジ領域は点線の下線で示されている。二重下線は、非対称鎖対合を促進するためにＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号３２）において操作された位置の例、ならびに他のアイソタイプＩｇＧ２（配列番号３３）、ＩｇＧ３（配列番号３４）およびＩｇＧ４（配列番号３５）に関する対応位置を示す。

【図4A】図４Ａおよび４Ｂは、ＣＨＯ細胞において発現されたＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃの精製を示す。該タンパク質は、サイジングカラム（図４Ａ）およびクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図４Ｂ）によって可視化されるとおり、単一の明確なピークとして精製される（左レーン：分子量標準；右レーン：ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃ）。

【図4B】図４Ａおよび４Ｂは、ＣＨＯ細胞において発現されたＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃの精製を示す。該タンパク質は、サイジングカラム（図４Ａ）およびクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図４Ｂ）によって可視化されるとおり、単一の明確なピークとして精製される（左レーン：分子量標準；右レーン：ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃ）。

【図5A】図５Ａおよび５Ｂは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイによって測定された場合の、アクチビン（図５Ａ）およびＧＤＦ－１１（図５Ｂ）へのＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃの結合を示す。

【図5B】図５Ａおよび５Ｂは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイによって測定された場合の、アクチビン（図５Ａ）およびＧＤＦ－１１（図５Ｂ）へのＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃの結合を示す。

【0016】

詳細な説明
１．概観
本開示は、本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減するための組成物および方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、および（ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含み、ここで、患者が毛細血管拡張症の症状を示し、または毛細血管拡張症を発生するリスク因子を含む場合には、第３用量の投与を開始し、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減する。

【0017】

特定の実施形態においては、本開示は、肺動脈性肺高血圧症（例えば、機能的クラスＩＩまたは機能的クラスＩＩＩ）の治療のためにＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減するための方法を提供し、ここで、肺動脈性肺高血圧症は、本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドの有効量を、それを要する患者に投与することによって治療される。

【0018】

肺動脈性肺高血圧症［世界保健機関（ＷＨＯ）グループ１ ＰＨ］は、肺動脈の壁における平滑筋細胞の異常増殖および深刻な血管収縮によって特徴付けられる、重篤で進行性の生命を脅かす肺血管系疾患である。肺における血管の激しい収縮は非常に高い肺動脈圧を招く。これらの高圧は、心臓が肺に血液を送り出してそれが酸素化されることを困難にする。ＰＡＨを有する患者は極度の息切れに悩まされる。なぜなら、心臓はこれらの高圧に抗して拍出しようとするからである。ＰＡＨを有する患者は、典型的には、ＰＶＲの有意な増加およびｍＰＡＰの持続的上昇を引き起こし、これらは最終的には右心室不全および死を招く。ＰＡＨと診断された患者は不良予後および同様に損なわれた生活の質を示し、治療されなかった場合の平均余命は診断時から２～５年である。

【0019】

ＰＡＨは、安静時における２５ｍｍＨｇを超える（あるいは、更新されたガイドラインでは２０ｍｍＨｇを超える）平均肺動脈圧および正常な肺動脈毛細血管楔入圧に基づいて診断されうる。ＰＡＨは息切れ、めまい、失神および他の症状を引き起こす可能性があり、これらの全ては労作によって悪化する。ＰＡＨは、運動耐性の顕著な低下および心不全を伴う重篤な疾患でありうる。ＰＡＨの２つの主要タイプには、特発性ＰＡＨ（例えば、素因が特定されていないＰＡＨ）および遺伝性ＰＡＨ（例えば、ＢＭＰＲ２、ＡＬＫ１、ＥＮＧ、ＳＭＡＤ９、ＣＡＶ１、ＫＣＮＫ３またはＥＩＦ２ＡＫ４における突然変異に関連するＰＡＨ）が含まれる。家族性ＰＡＨの症例の７０％においては、ＢＭＰＲ２遺伝子に突然変異が存在する。ＰＡＨの発生のリスク因子には、ＰＡＨの家族歴、薬物および毒素の使用（例えば、メタンフェタミンまたはコカインの使用）、感染症（例えば、ＨＩＶ感染または住血吸虫症）、肝硬変、先天性心臓異常、門脈圧亢進症、肺静脈閉塞性疾患、肺毛細血管腫症または結合組織／自己免疫障害（例えば、強皮症またはループス）が含まれる。ＰＡＨはカルシウムチャネルブロッカーに対する長期応答者、静脈／毛細血管（ＰＶＯＤ／ＰＣＨ）関与の明白な特徴および新生児症候群の持続性ＰＨに関連づけられうる。

【0020】

本明細書中で用いられている用語は、一般に、本開示の文脈内および各用語が用いられている具体的な文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本開示の組成物および方法ならびにそれらの製造および使用方法を説明する際に実施者に追加的な指針を提供するために、後記または本明細書中のどこかで特定の用語を説明する。用語の任意の使用の範囲または意味は、それが用いられている具体的な文脈から明らかとなろう。

【0021】

「配列類似性」なる語は全てのその文法的形態において、共通の進化的起源を共有していてもしていなくてもよい核酸またはアミノ酸配列間の同一性または一致の度合を意味する。

【0022】

参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に対する「配列同一性（％）」は、配列をアライメント（整列）させ、配列同一性の一部としていずれの保存的置換をも考慮することなく、最大の配列同一性（％）が得られるように必要に応じてギャップを導入した後、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列におけるアミノ酸残基（または核酸）と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基（または核酸）の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性（％）を決定するためのアライメントは、当業者の技術の範囲内である種々の方法、例えば、公に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａまたはＭｅｇａａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成されうる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要ないずれかのアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメーターを決定することが可能である。幾つかの実施形態においては、アミノ酸（核酸）配列同一性（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して得られる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著され、ソースコードはユーザードキュメントと共に米国著作権局（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ）（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、それは米国著作権登録番号（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．）ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）から公に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされうる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変動しない。配列の同一性または相同性を決定するための他のアルゴリズムには、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＬＡＬＩＧＮ、ＦＡＳＴＡ、ＳＩＭおよびＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅが含まれる。好ましい実施形態においては、配列同一性を決定するために使用されるアルゴリズムはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａである。

【0023】

「刺激する」（「アゴナイズする」）は全てのその文法的形態において、タンパク質および／もしくは遺伝子を（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによって、または不活性タンパク質を、活性状態となるように誘導することによって）活性化するプロセス、またはタンパク質および／もしくは遺伝子の活性を増強するプロセスを意味する。

【0024】

「拮抗する」（「アンタゴナイズ」する）は全てのその文法的形態において、タンパク質および／もしくは遺伝子を（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは低減することによって、または活性タンパク質を、不活性状態となるように誘導することによって）阻害するプロセス、またはタンパク質および／もしくは遺伝子の活性を低減するプロセスを意味する。

【0025】

本明細書および特許請求の範囲の全体を通じて数値に関して用いる「約」および「およそ」なる語は、当業者に周知であり許容可能な精度の範囲を示す。一般に、そのような精度の範囲は±１０％である。あるいは、特に生体系においては、「約」および「およそ」なる語は、所定の値の一桁の倍数以下の値、好ましくは、所定の値の５倍以下、より好ましくは２倍以下の値を意味しうる。

【0026】

本明細書に開示されている数値範囲は、その範囲を定める数値を含む。

【0027】

単数形の用語は、その用語が用いられている文脈が明確に別段の定めをしていない限り、複数の指示対象を含む。単数形の用語ならびに「１以上」および「少なくとも１つ」なる語は本明細書においては互換的に用いられうる。更に、本明細書中で用いる「および／または」は、２以上の特定されている特徴または成分のそれぞれの、その他のものの存在下または非存在下の具体的開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」のような句で用いる「および／または」なる語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むと意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」のような句で用いる「および／または」なる語は以下の態様のそれぞれを含むと意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ、ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。

【0028】

本明細書の全体にわたり、「含む」なる語または「含み」もしくは「含んで」のような変形は、示されている整数または整数群の包含を意味し、任意の他の整数または整数群の除外を意味しないと理解される。

【0029】

２．ＡｃｔＲＩＩポリペプチド
特定の態様においては、本開示はＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその用途（使用）（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する）に関する。本明細書中で用いる「ＡｃｔＲＩＩ」なる語はＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを意味する。このファミリーはアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）およびアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）を含む。

【0030】

特定の実施形態においては、本開示は、配列番号１、２、３、２３、２７、３０および４０のいずれかに記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関する。他の実施形態においては、本開示は、配列番号３１に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関する。本明細書中で用いる「ＡｃｔＲＩＩ」なる語は、アクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリー、アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリー、またはそれらの組合せおよび／もしくは変異体を意味する。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは任意の種に由来することが可能であり、突然変異誘発または他の修飾によってそのようなＡｃｔＲＩＩタンパク質から誘導された変異体を含む。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩに対する言及は、現在特定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡｃｔＲＩＩファミリーのメンバーは、一般に、システインに富む領域を含むリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび推定されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。

【0031】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドなる語は、ＡｃｔＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然ポリペプチドを含むポリペプチド、および有用な活性を保持するその任意の変異体（突然変異体、断片、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含む。そのような変異体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの例は本開示の全体にわたって、ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ ２００６／０１２６２７、ＷＯ ２００７／０６２１８８、ＷＯ ２００８／０９７５４１、ＷＯ ２０１０／１５１４２６およびＷＯ ２０１１／０２００４５（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。本明細書に記載されている全てのＡｃｔＲＩＩ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、特に示されていない限り、以下に示すヒトＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づく。

【0032】

標準的なヒトＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質配列は以下のとおりである。

【数1】

【0033】

シグナルペプチドは一本の下線で示されており、細胞外ドメインは太字で示されており、潜在的な内因性Ｎ結合グリコシル化部位は二重下線で示されている。

【0034】

プロセシングされた（成熟した）細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩポリペプチド配列は以下のとおりである。

【数2】

【0035】

細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は一本の下線で示されている。「尾部」が欠失している配列（Δ１５配列）は以下のとおりである。

【数3】

【0036】

ヒトＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９～１７００に従い、以下に示す（配列番号４）。シグナル配列は下線で示されている。

【数4】

【0037】

プロセシングされた可溶性（細胞外）ヒトＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は以下のとおりである。

【数5】

【0038】

ＡｃｔＲＩＩは脊椎動物間でよく保存されており、細胞外ドメインの大きな伸長が完全に保存されている。例えば、図２は、種々のＡｃｔＲＩＩＡオーソログと比較した場合のヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの多重配列アライメントを示す。ＡｃｔＲＩＩＡに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、これらのアライメントから、正常なＡｃｔＲＩＩ－リガンド結合活性に重要であるリガンド結合性ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測することが可能であり、また、正常なＡｃｔＲＩＩ－リガンド結合活性を有意に変化させることなく置換に許容性である可能性が高いアミノ酸位置を予測することも可能である。したがって、本明細書に開示されている方法で有用である活性なヒトＡｃｔＲＩＩ変異体ポリペプチドは別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩの配列からの対応位置における１以上のアミノ酸を含むことが可能であり、あるいはヒトまたは他の脊椎動物の配列におけるものに類似した残基を含むことが可能である。

【0039】

ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインとヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインとのアミノ酸配列のアライメントを図１に示す。このアライメントは、ＡｃｔＲＩＩリガンドに直接接触すると考えられる両方の受容体内のアミノ酸残基を示す。例えば、該複合ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＡ－リガンド結合ポケットが残基Ｆ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｋ３８～Ｔ４１、Ｅ４７、Ｙ５０、Ｋ５３～Ｋ５５、Ｒ５７、Ｈ５８、Ｆ６０、Ｔ６２、Ｋ７４、Ｗ７８～Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ｅ９２、およびＫ９４～Ｆ１０１によって部分的に定められることを示した。これらの位置では、保存的突然変異が許容されると予想される。

【0040】

限定的なものではないが、以下の例は、活性なＡｃｔＲＩＩ変異体を定めるためのこのアプローチを例示する。図２に示されているとおり、ヒト細胞外ドメインにおけるＦ１３はオビス・アリエス（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）（ヒツジ）（配列番号７）、ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）（ニワトリ）（配列番号１０）、ボス・タウルス（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）（ウシ）（配列番号３６）、タイト・アルバ（Ｔｙｔｏ ａｌｂａ）（フクロウ）（配列番号３７）およびミオティス・ダビディ（Ｍｙｏｔｉｓ ｄａｖｉｄｉｉ）（コウモリ）のＡｃｔＲＩＩＡにおいてはＹであり、このことは、Ｆ、ＷおよびＹを含む芳香族残基がこの位置で許容されることを示している。ヒト細胞外ドメインにおけるＱ２４はボス・タウルス（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）（ウシ）ＡｃｔＲＩＩＡにおいてはＲであり、このことは、Ｄ、Ｒ、Ｋ、ＨおよびＥを含む荷電残基がこの位置で許容されることを示している。ヒト細胞外ドメインにおけるＳ９５はガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）（ニワトリ）およびタイト・アルバ（Ｔｙｔｏ ａｌｂａ）（フクロウ）のＡｃｔＲＩＩＡにおいてはＦであり、このことは、この部位が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙのような極性残基、そしておそらくはＬ、ＩまたはＦのような疎水性残基を含む多種多様な変化に許容性でありうることを示している。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ５２はオビス・アリエス（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）（ヒツジ）ＡｃｔＲＩＩＡにおいてはＤであり、このことは、ＤおよびＥを含む酸性残基がこの位置において許容されることを示している。ヒト細胞外ドメインにおけるＰ２９は比較的低度に保存されており、オビス・アリエス（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）（ヒツジ）ＡｃｔＲＩＩＡにおいてはＳとして現れ、ミオティス・ダビディ（Ｍｙｏｔｉｓ ｄａｖｉｄｉｉ）（コウモリ）ＡｃｔＲＩＩＡにおいてはＬとして現れ、したがって、実質的に全てのアミノ酸がこの位置で許容されるはずである。

【0041】

更に、前記のとおり、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造的／機能的特徴の観点から、特にリガンド結合に関して、当技術分野で特徴付けられている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８（１）：９７－１０８；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６（１）：１８－２２；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６）ＰＮＡＳ １０３（２０：７６４３－７６４８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２２（７）：１５５５－１５６６；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、第７，６１２，０４１号および第７，８４２，６６３号］。例えば、スリーフィンガー毒素フォールドとして公知である定義性（ｄｅｆｉｎｉｎｇ）構造モチーフはＩ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の種々の位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：１８－２２；およびＨｉｎｃｋ（２０１２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８６：１８６０－１８７０］。本明細書における教示に加えて、これらの参考文献は、１以上の所望の活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩ変異体の製造方法に関する詳細な指針を提供する。

【0042】

例えば、スリーフィンガー毒素フォールドとして公知である定義性（ｄｅｆｉｎｉｎｇ）構造モチーフはＩ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の種々の位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：１８－２２；およびＨｉｎｃｋ（２０１２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８６：１８６０－１８７０］。したがって、これらの保存されたシステインの最外部によって境界が定められるヒトＡｃｔＲＩＩのコアリガンド結合ドメインは配列番号１（ＡｃｔＲＩＩ前駆体）の位置３０～１１０に対応する。したがって、これらのシステインによって境界が定められるコア配列に隣接する構造的にそれほど秩序だっていないアミノ酸は、リガンド結合を必ずしも変化させることなく、Ｎ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９残基、およびＣ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基だけ、トランケート（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されうる。例示的なＡｃｔＲＩＩ細胞外ドメインのトランケート体には、配列番号２および３が含まれる。

【0043】

したがって、ＡｃｔＲＩＩの活性部分（例えば、リガンド結合）の一般式は、配列番号１のアミノ酸３０～１１０を含む、または本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドである。したがって、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２１～３０のいずれか１つに対応する残基で始まる（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、かつ、配列番号１のアミノ酸１１０～１３５のいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、ＡｃｔＲＩＩの部分に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むこと、または本質的にそれからなること、またはそれからなることが可能である。他の例には、配列番号１の２１～３０から選択される位置で始まる（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、または２２～３０から選択される位置で始まる（例えば、アミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、または２３～３０から選択される位置で始まる（例えば、アミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、または２４～３０から選択される位置で始まる（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、かつ、配列番号１の１１１～１３５から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、または１１２～１３５から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、または１１３～１３５から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、または１２０～１３５から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、または１３０～１３５から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、または１１１～１３４から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つで終わる）、または１１１～１３３から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２または１３３のいずれか１つで終わる）、または１１１～１３２から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１または１３２のいずれか１つで終わる）、または１１１～１３１から選択される位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０または１３１のいずれか１つで終わる）構築物が含まれる。これらの範囲内の変異体も想定され、特に、配列番号１の対応部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなる、またはそれからなるものも想定される。したがって、幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３０～１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含むこと、または本質的にそれからなること、またはそれからなることが可能である。所望により、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３０～１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドであって、リガンド結合ポケット内に１、２、５、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化を含むポリペプチドを含みうる。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドはホモ二量体タンパク質複合体の一部である。

【0044】

特定の実施形態においては、本開示はＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）（その断片、機能的変異体および修飾形態を含む）およびその使用（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクの低減）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩの細胞外ドメイン）。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１以上のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５］を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１以上のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５］に結合する。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２１～３０に対応する残基で始まる（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、かつ、アミノ酸１１０～１３５のいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、ＡｃｔＲＩＩの部分に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなる、またはそれからなる。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３０～１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、または本質的にそれからなる。特定の実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２１～１３５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、または本質的にそれからなる。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号１、２、３、２７、３０および４０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、または本質的にそれからなる。

【0045】

幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、または本質的にそれからなる。幾つかの代替実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号２３）はＣ末端リジンを欠いていてもよい。幾つかの実施形態においては、Ｃ末端リシンを欠くＡｃｔＲＩＩポリペプチドは配列番号４０である。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、または本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態においては、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、または本質的にそれらからなるＡｃｔＲＩＩポリペプチドを患者に投与する。幾つかの実施形態においては、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、または本質的にそれらからなるＡｃｔＲＩＩポリペプチドを患者に投与する。幾つかの実施形態においては、配列番号２３と配列番号４０との組合せを患者に投与する。

【0046】

特定の態様においては、本開示はＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）に関する。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩトラップ（ｔｒａｐ）は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、「野生型」または未修飾ＡｃｔＲＩＩポリペプチド）の細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインとも称される）における１以上の突然変異（例えば、アミノ酸の付加、欠失、置換およびそれらの組合せ）を含む変異体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）であり、該変異体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、対応野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して改変された１以上のリガンド結合活性を有する。好ましい実施形態においては、本開示の変異体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、対応野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに類似した少なくとも１つの活性を保持する。例えば、好ましいＡｃｔＲＩＩポリペプチドはＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、それらの機能を阻害する（例えば、拮抗する）。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは更に、ＧＤＦ／ＢＭＰ［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５］のリガンドの１以上に結合し、それらを阻害する。したがって、本開示は、１以上のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する改変した結合特異性を有するＡｃｔＲＩＩポリペプチドを提供する。

【0047】

例示すると、アクチビン（アクチビンＡまたはアクチビンＢ）、特にアクチビンＡのような１以上のＡｃｔＲＩＩ結合リガンドと比較して、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に対する改変リガンド結合ドメインの選択性を増加させる１以上の突然変異が選択されうる。所望により、改変リガンド結合ドメインは、野生型リガンド結合ドメインの比と比較して少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００または更には１０００倍大きい、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合に関するＫ_ｄに対する、アクチビン結合に関するＫ_ｄの比を有する。所望により、改変リガンド結合ドメインは、野生型リガンド結合ドメインと比較して少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００または更には１０００倍大きい、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の阻害に関するＩＣ_５０に対する、アクチビンの阻害に関するＩＣ_５０の比を有する。所望により、改変リガンド結合ドメインは、アクチビンの阻害に関するＩＣ_５０より少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００または更には１０００倍低いＩＣ_５０で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する。

【0048】

特定の実施形態においては、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を改変するための、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）の特定の突然変異を想定している。そのような突然変異は、Ｏ結合またはＮ結合グリコシル化部位のような１以上のグリコシル化部位を導入または除去するように選択されうる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－スレオニンまたはアスパラギン－Ｘ－セリン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。改変はポリペプチドの配列への１以上のセリンまたはスレオニン残基の付加、または該残基による置換によっても行われうる（Ｏ－結合グリコシル化部位の場合）。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は該修飾トリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は該ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。用いられるカップリング法に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの；（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの；（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの；あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に結合しうる。ポリペプチド上に存在する１以上の炭水化物部分の除去は化学的および／または酵素的に達成されうる。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等化合物へのポリペプチドの曝露を含みうる。この処理は、アミノ酸配列を無傷のまま維持する一方で、結合糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖の切断をもたらす。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１３８：３５０］によって記載されているとおり、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって達成されうる。ポリペプチドの配列は、使用される発現系のタイプに応じて、必要に応じて調整されうる。なぜなら、哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響を受けうる異なるグリコシル化パターンを導入しうるからである。一般に、ヒトにおける使用のための本開示のポリペプチドは、適切なグリコシル化をもたらす哺乳類細胞株、例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞株において発現されうるが、他の哺乳類発現細胞株も同様に有用であると予想される。

【0049】

本開示は更に、突然変異体、特にＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）のコンビナトリアル（組合せ）突然変異体のセットおよびトランケート突然変異体を製造方法を想定している。コンビナトリアル突然変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドに結合する）ＡｃｔＲＩＩ配列を特定するのに特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、改変した特性、例えば、改変した薬物動態または改変したリガンド結合を有するポリペプチド変異体を製造することでありうる。種々のスクリーニングアッセイを以下に示し、そのようなアッセイは、変異体を評価するために使用されうる。例えば、ＡｃｔＲＩＩ変異体は、１以上のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５］に結合する能力、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびそのヘテロ多量体へのＧＤＦ／ＢＭＰリガンドの結合を妨げる能力、ならびに／またはＧＤＦ／ＢＭＰリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を妨げる能力に関してスクリーニングされうる。

【0050】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）またはその変異体の活性は、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイにおいても試験されうる。例えば、肺動脈高血圧症の発病に関与する遺伝子の発現に対するＡｃｔＲＩＩポリペプチドの効果が評価されうる。これは、必要に応じて、１以上の組換えリガンドタンパク質［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５］の存在下で実施可能であり、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよび所望によりＧＤＦ／ＢＭＰリガンドが製造されるように細胞がトランスフェクトされうる。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドがマウスまたは他の動物に投与可能であり、肺動脈高血圧症の発病に対する効果が、当技術分野で認められた方法を用いて評価されうる。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはその変異体の活性が、血液細胞前駆細胞において、これらの細胞の増殖に対する何らかの効果に関して試験可能であり、これは、例えば、本明細書に記載されているアッセイおよび当技術分野において一般的に公知のアッセイによって行われうる。下流シグナル伝達に対する効果をモニターするために、そのような細胞株において、ＳＭＡＤ応答性レポーター遺伝子が使用されうる。

【0051】

参照ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）と比較して増加した選択性または一般に増加した効力を有する、コンビナトリアル由来の変異体が製造されうる。そのような変異体は、組換えＤＮＡ構築物から発現される場合、遺伝子治療プロトコールにおいて使用されうる。同様に、突然変異誘発は、対応する未修飾ＡｃｔＲＩＩポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生成しうる。例えば、改変タンパク質は、未修飾ポリペプチドの破壊または不活性化をもたらすタンパク質分解または他の細胞プロセスに対して、より安定またはより不安定にされうる。そのような変異体およびそれらをコードする遺伝子は、ポリペプチドの半減期を調節することによってポリペプチド複合体レベルを変化させるために使用されうる。例えば、短い半減期はより一過性の生物学的効果をもたらすことが可能であり、誘導可能な発現系の一部である場合、細胞内の組換えポリペプチド複合体レベルの、より厳密な制御を可能にしうる。Ｆｃ融合タンパク質においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの半減期を改変するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において突然変異が施されうる。

【0052】

コンビナトリアルライブラリーは、潜在的なＡｃｔＲＩＩポリペプチド配列の少なくとも一部をそれぞれが含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成されうる。例えば、潜在的なＡｃｔＲＩＩをコードするヌクレオチド配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、あるいはより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ用）として発現可能となるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物が、酵素を使用して遺伝子配列に連結されうる。

【0053】

縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的ホモログのライブラリーが作製されうる多数の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成が自動ＤＮＡ合成装置において実施可能であり、次いで合成遺伝子は発現用の適切なベクター内に連結されうる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で周知である［Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３－２８９；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；およびＩｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７］。そのような技術は他のタンパク質の定方向進化において使用されている［Ｓｃｏｔｔら，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６－３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：２４２９－２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４－４０６；Ｃｗｉｒｌａら，（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８－６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号および第５，０９６，８１５号］。

【0054】

あるいは、コンビナトリアルライブラリーを作製するために、他の形態の突然変異誘発が利用されうる。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発［Ｒｕｆら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５－１５７２；Ｗａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５－３０９９；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９－１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７－６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８－２８９２；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２－１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５］、リンカースキャニング突然変異誘発［Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３－６６０；およびＢｒｏｗｎら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２６４４－２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６］、飽和突然変異誘発［Ｍｅｙｅｒｓら，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３］、ＰＣＲ突然変異誘発［Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１－１９］、またはランダム突然変異誘発、例えば化学突然変異誘発［Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２－３４］を用いて作製され、それらを用いるスクリーニングによってライブラリーから単離されうる。特にコンビナトリアル設定においては、リンカースキャニング突然変異誘発が、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのトランケート（生物活性）形態を特定するための魅力的な方法である。

【0055】

点突然変異およびトランケートによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ならびに更に言えば、特定の特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための多種多様な技術が当技術分野で公知である。そのような技術は、一般に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）のコンビナトリアル突然変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く用いられている技術は、典型的には、複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリーをクローニングすること、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出が、検出産物の遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下、コンビナトリアル（組合せ）遺伝子を発現させることを含む。好ましいアッセイには、リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５］結合アッセイおよび／またはリガンド媒介性細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。

【0056】

当業者によって認識されるとおり、本明細書に記載されている突然変異、変異体または修飾のほとんどは、核酸レベルで、または幾つかの場合には翻訳後修飾もしくは化学合成によって作製されうる。そのような技術は当技術分野で周知であり、その一部が本明細書に記載されている。部分的に、本開示は、本明細書に記載されている開示の範囲内で他の変異体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを作製し使用するための指針として使用されうる、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）の機能的に活性な部分（断片）および変異体を特定する。

【0057】

特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的に活性な断片は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする核酸の対応断片から組換え製造されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得られうる。また、断片は、当技術分野で公知の技術、例えば通常のメリフィールド固相ｆ－Ｍｏｃまたはｔ－Ｂｏｃ化学を用いて化学合成されうる。断片は（組換えまたは化学合成によって）製造され、ＡｃｔＲＩＩ受容体および／または１以上のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５］のアンタゴニスト（インヒビター）として機能しうるペプチジル断片を特定するために試験されうる。

【0058】

特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）は、翻訳後修飾を、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに天然に存在するいずれかのものに加えて更に含みうる。そのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。結果として、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えばポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖およびホスファートを含有しうる。リガンドトラップポリペプチドの機能に対するそのような非アミノ酸要素の効果は、他のＡｃｔＲＩＩ変異体に関して本明細書に記載されているとおり試験されうる。本開示のポリペプチドが、ポリペプチドの新生形態を切断することによって細胞内で産生される場合、翻訳後プロセシングはタンパク質の適切なフォールディングおよび／または機能にも重要でありうる。種々の細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ－３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）はそのような翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの適切な修飾およびプロセシングが保証されるように選択されうる。

【0059】

特定の態様においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）には、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの少なくとも一部（ドメイン）と１以上の異種部分（ドメイン）とを有する融合タンパク質が含まれる。そのような融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されるものではない。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択されうる。例えば、幾つかの融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製の目的には、グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルト結合樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィー用の関連マトリックスが使用される。そのようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ_６）（配列番号３９）融合パートナーの存在下で有用なＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製系およびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）系（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」形態で入手可能である。もう１つの例として、融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの検出を促進するように選択されうる。そのような検出ドメインの例には、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）および「エピトープタグ」（これは、通常、対応する特異的抗体が利用可能である短いペプチド配列である）が含まれる。対応する特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能である周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）およびｃ－ｍｙｃタグが含まれる。幾つかの場合には、融合ドメインは、例えば第Ｘａ因子またはトロンビンに関するプロテアーゼ切断部位を有し、これは、関連プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによってそこから組換えタンパク質を遊離することを可能にする。次いで、遊離したタンパク質は後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離されうる。選択されうる他のタイプの融合ドメインには、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメイン、および例えば免疫グロブリン由来の定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を含む機能的ドメイン（これは追加的な生物学的機能を付与する）が含まれる。

【0060】

特定の態様においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）は、ポリペプチドを「安定化」しうる１以上の修飾を含む。「安定化する」は、インビトロ半減期、血清半減期を増加させるあらゆることを意味し、これは該物質の破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少または他の薬物動態効果によるものであるかどうかには無関係である。例えば、そのような修飾はポリペプチドの貯蔵寿命を延長させ、ポリペプチドの循環半減期を延長させ、および／またはポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。そのような安定化修飾には、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインと安定化ドメインとを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）、および炭水化物部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書中で用いる「安定化ドメイン」なる語は、融合タンパク質の場合のような融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を意味するだけでなく、例えば炭水化物部分のような非タンパク質性修飾、または例えばポリエチレングリコールのような非タンパク質性部分をも含む。特定の好ましい実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ポリペプチドを安定化させる異種ドメイン（「安定化」ドメイン）、好ましくは、インビボでのポリペプチドの安定性を増強する異種ドメインと融合される。免疫グロブリンの定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）との融合は、望ましい薬物動態学的特性を広範なタンパク質に付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンとの融合も、望ましい特性を付与しうる。

【0061】

ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用されうる天然アミノ酸配列の一例を以下に示す（配列番号１１）。点線の下線はヒンジ領域を示し、実線の下線は、天然に存在する変異の位置を示す。部分的に、本開示は、配列番号１１に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在する変異には、配列番号１１において用いられている番号付け系によれば、Ｅ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌが含まれるであろう。（ＵｎｉｐｒｏｔＰ０１８５７を参照されたい）。

【数6】

【0062】

所望により、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ａｓｐ－２６５、リジン３２２およびＡｓｎ－４３４のような残基に１以上の突然変異を有する。特定の場合においては、これらの突然変異の１以上（例えば、Ａｓｐ－２６５突然変異）を有する突然変異体ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して低減した、Ｆｃγ受容体への結合能力を有する。他の場合には、これらの突然変異の１以上（例えば、Ａｓｎ－４３４突然変異）を有する突然変異Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して増強した、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能力を有する。

【0063】

ヒトＩｇＧ２（Ｇ２Ｆｃ）のＦｃ部分に使用されうる天然アミノ酸配列の一例を以下に示す（配列番号１２）。点線の下線はヒンジ領域を示し、二重下線は、配列内でデータベースの矛盾が存在する位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９に準拠）。部分的に、本開示は、配列番号１２に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。

【数7】

【0064】

ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用されうるアミノ酸配列の２つの例を以下に示す。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は他のＦｃ鎖の最大４倍の長さを有する可能性があり、３つの同一の１５残基セグメントおよびそれに先行する類似した１７残基のセグメントを含有する。以下に示す第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号１３）は、単一の１５残基のセグメントからなる短いヒンジ領域を含有し、一方、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号１４）は完全長のヒンジ領域を含有する。いずれの場合においても、点線の下線はヒンジ領域を示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９に基づく天然に存在する変異の位置を示す。部分的に、本開示は、配列番号１３および１４に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または本質的それからなる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。

【数8】

【0065】

Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在する変異（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０を参照されたい）には、配列番号１３において用いられている番号付け系に変換された場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙが含まれ、本開示は、これらの変異の１以上を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。また、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長によって特徴付けられる構造多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９を参照されたい］。特に、変異体ＷＩＳはＶ領域の大部分およびＣＨ１領域の全てを欠いている。それは、ヒンジ領域に通常存在する１１位に加えて、７位に追加的な鎖間ジスルフィド結合を有する。変異体ＺＵＣはＶ領域の大部分、ＣＨ１領域の全て、およびヒンジの一部を欠いている。変異体ＯＭＭは対立遺伝子形態または別のガンマ鎖サブクラスに相当しうる。本開示は、これらの変異体の１以上を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加的な融合タンパク質を提供する。

【0066】

ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用されうる天然アミノ酸配列の一例を以下に示す（配列番号１５）。点線の下線はヒンジ領域を示す。部分的に、本開示は、配列番号１５に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または本質的それからなる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。

【数9】

【0067】

Ｆｃドメインにおける種々の操作された突然変異がＧ１Ｆｃ配列（配列番号１１）に関して本明細書に示されており、図３におけるＧ１Ｆｃとのそれらのアライメントから、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似突然変異が誘導されうる。ヒンジの長さが等しくないため、アイソタイプアライメントに基づく類似したＦｃ位置（図３）は、配列番号１１、１２、１３、１４および１５においては異なるアミノ酸番号を有する。また、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号１１、１２、１３、１４および１５）における与えられたアミノ酸位置は、番号付けがＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体（Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域からなる）を含む場合、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおけるのと同じ位置とは異なる番号によって特定されると理解されうる。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号１１）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７）およびヒトＩｇＧ１重鎖における選択されたＣ_Ｈ３位置の間の対応は以下のとおりである。

【0068】

【表1】

【0069】

単一細胞株においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させて、許容可能な収率で好ましい非対称融合タンパク質を生成する種々の方法が当技術分野で公知である［Ｋｌｅｉｎら（２０１２）ｍＡｂｓ ４：６５３－６６３；およびＳｐｉｅｓｓら（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２Ａ）：９５－１０６］。Ｆｃ含有鎖の所望のペア形成を得るための方法には、電荷に基づくペア形成（静電ステアリング）、「ノブ・イントゥ・ホール」立体ペア形成、ＳＥＥＤｂｏｄｙペア形成、およびロイシンジッパーに基づくペア形成が含まれるが、これらに限定されるものではない［Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９：６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７－６８１；Ｄａｖｉｓら（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３：１９５－２０２；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（２０１０）；２８５：１９６３７－１９６４６；Ｗｒａｎｉｋら（２０１２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７：４３３３１－４３３３９；ＵＳ５９３２４４８；ＷＯ １９９３／０１１１６２；ＷＯ ２００９／０８９００４およびＷＯ ２０１１／０３４６０５］。

【0070】

融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なる要素は、所望の機能と合致するいずれかの様態で配置されうると理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインは異種ドメインのＣ末端に配置されることが可能であり、あるいは、異種ドメインはＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインのＣ末端に配置されることが可能である。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインと異種ドメインとは融合タンパク質において隣接している必要はなく、いずれかのドメインのＣ末端もしくはＮ末端またはドメイン間に追加的なドメインまたはアミノ酸配列が含まれてもよい。

【0071】

例えば、ＡｃｔＲＩＩ受容体融合タンパク質は、式：Ａ－Ｂ－Ｃで示されるアミノ酸配列を含みうる。Ｂ部分はＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメイン（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）に対応する。Ａ部分およびＣ部分は、独立して、０個、１個または２個以上のアミノ酸であることが可能であり、Ａ部分およびＣ部分の両方は、存在する場合には、Ｂに対して異種である。Ａ部分および／またはＣ部分はリンカーを介してＢ部分に結合していてもよい。リンカーは、グリシン残基（例えば、２～１０、２～５、２～４、２～３個のグリシン残基）、またはグリシンおよびプロリン残基に富んでいてもよく、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一配列、あるいはスレオニン／セリンおよび／またはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号１６）、ＧＧＧＧ（配列番号１７）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１８）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１９）、ＴＧＧＧ（配列番号２０）、ＳＧＧＧ（配列番号２１）またはＧＧＧＧＳ（配列番号２２）の単体または反復を含有しうる。特定の実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、式：Ａ－Ｂ－Ｃで示されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ａはリーダー（シグナル）配列であり、ＢはＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインからなり、Ｃは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうちの１以上を増強するポリペプチド部分である。特定の実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質は、式：Ａ－Ｂ－Ｃで示されるアミノ酸配列を含み、ここで、ＡはＴＰＡリーダー配列であり、ＢはＡｃｔＲＩＩ受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは免疫グロブリンＦｃドメインである。好ましい融合タンパク質は、配列番号２３、２７、３０および４０のいずれか１つに記載されているアミノ酸配列を含む。

【0072】

好ましい実施形態においては、本明細書に記載されている方法に従い使用されるＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。本明細書中で用いる単離されたタンパク質またはポリペプチドは、その天然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施形態においては、本開示のポリペプチドは、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）による測定で９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える純度まで精製されている。純度の評価方法は当技術分野で周知である［例えば、Ｆｌａｔｍａｎら（２００７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７を参照されたい］。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている方法に従い使用されるＡｃｔＲＩＩポリペプチドは組換えポリペプチドである。

【0073】

本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、当技術分野で公知である種々の技術によって製造されうる。例えば、本開示のポリペプチドは、標準的なタンパク質化学技術、例えば、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔ Ｇ．Ａ．（編），Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されている技術を用いて合成されうる。また、自動ペプチド合成装置が商業的に入手可能である（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００）。あるいは、本開示のポリペプチド（その断片または変異体を含む）は、当技術分野で周知のとおり、種々の発現系［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して組換え製造されうる。もう１つの実施形態においては、本開示の修飾または未修飾のポリペプチドは、例えばプロテアーゼ、例えばトリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシンまたはペアード（ｐａｉｒｅｄ）塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用することによる、組換え製造された完全長ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの消化によって製造されうる。コンピュータ分析（例えば、商業的に入手可能なソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用するもの）を用いて、タンパク質分解切断部位を特定することが可能である。あるいは、そのようなポリペプチドは、化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミンなど）を用いて、組換え製造された完全長ＡｃｔＲＩＩポリペプチドから製造されうる。

【0074】

３．ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする核酸
特定の実施形態においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）（その断片、機能的変異体および融合タンパク質を含む）をコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。

【0075】

本明細書中で用いる単離された核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸には、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0076】

特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４、５または２８のいずれか１つの変異体である核酸を含むと理解される。変異体ヌクレオチド配列には、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失（対立遺伝子変異体を含む）の点で異なる配列が含まれ、したがって、配列番号４、５または２８のいずれか１つに示されているヌクレオチド配列とは異なるコード配列が含まれる。

【0077】

特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、配列番号４、５または２８のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離されたおよび／または組換え核酸配列によってコードされる。当業者は、配列番号４、５または２８に相補的である配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列およびそれらの変異体も本開示の範囲内であると理解するであろう。他の実施形態においては、本開示の核酸配列は単離されていること、および／または組換え体であること、および／または異種ヌクレオチド配列と融合していることが可能であり、あるいはＤＮＡライブラリーにおけるものであることが可能である。

【0078】

他の実施形態においては、本開示の核酸は、配列番号４、５もしくは２８に示されているヌクレオチド配列、配列番号４、５もしくは２８の相補的配列またはそれらの断片に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列をも含む。前記のとおり、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更可能であると容易に理解するであろう。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更可能であると容易に理解するであろう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションを行い、次いで５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことが可能であろう。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまで選択されうる。また、洗浄工程における温度は室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加されうる。温度および塩の両方を変化させることも、温度または塩濃度を一定に保ち、もう一方の変数を変化させることも可能である。１つの実施形態においては、本開示は、室温で６×ＳＳＣおよびそれに続く室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。

【0079】

配列番号４、５または２８に記載されている核酸とは遺伝暗号の縮重ゆえに異なる単離された核酸も本開示の範囲内である。例えば、幾つかのアミノ酸は複数のトリプレットによって示される。同一アミノ酸を指定する複数のコドン、すなわち同義語（例えば、ＣＡＵとＣＡＣとはヒスチジンに関する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異を引き起こしうる。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列における変化を招くＤＮＡ配列多型が哺乳類細胞において存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の、１以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大約３～５％）におけるこれらの変異は、天然対立遺伝子突然変異により、所与の種の個体間に存在しうる、と当業者は理解するであろう。あらゆるそのようなヌクレオチド変異および結果として生じるアミノ酸多型は本開示の範囲内である。

【0080】

特定の実施形態においては、本開示の組換え核酸は発現構築物における１以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結されうる。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適したものである。多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が当技術分野で公知であり、種々の宿主細胞において使用されうる。典型的には、１以上の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および転写終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれうるが、これらに限定されるものではない。当技術分野で公知である構成的または誘導性プロモーターが本開示によって想定される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または複数のプロモーターの要素を組合せたハイブリッドプロモーターのいずれかでありうる。発現構築物は、プラスミドのように、エピソーム上で細胞内に存在していてもよく、あるいは発現構築物は染色体内に挿入されていてもよい。幾つかの実施形態においては、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なりうる。

【0081】

特定の態様においては、本明細書に開示されている主題の核酸は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの組合せ）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節配列は当技術分野で認識されており、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を導くように選択される。したがって、調節配列なる語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素を含む。例示的な調節配列はＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列の発現を制御し、それに作動可能に連結された多種多様な発現調節配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用されうる。そのような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって発現が導かれるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、ならびに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにそれらの種々の組合せが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質のタイプのような要因に左右されうると理解されるべきである。更に、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされるいずれかの他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮されるべきである。

【0082】

本開示の組換え核酸は、クローン化遺伝子またはその一部を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）またはその両方における発現に適したベクター内に連結することによって製造されうる。組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドの製造のための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、以下のタイプのプラスミドが含まれる：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。

【0083】

幾つかの哺乳類発現ベクターは、細菌におけるベクターの増殖を促進させる原核生物配列と、真核細胞において発現される１以上の真核生物転写単位との両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏおよびｐＨｙｇに由来するベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターの幾つかは、原核細胞と真核細胞との両方おける複製および薬物耐性選択を促進させるために、ｐＢＲ３２２のような細菌プラスミド由来の配列で修飾されている。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタイン－バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用されうる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は後記の遺伝子治療送達系の説明において見出されうる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に使用される種々の方法が当技術分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適切な発現系および一般的な組換え法に関しては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照されたい。幾つかの場合には、バキュロウイルス発現系を使用して組換えポリペプチドを発現させることが望ましいかもしれない。そのようなバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β－ｇａｌを含有するｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が含まれる。

【0084】

好ましい実施形態においては、ベクターは、例えばＰｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）のように、ＣＨＯ細胞において対象ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを製造するために設計される。明らかになるとおり、対象遺伝子構築物は、例えば精製用の融合タンパク質または変異体タンパク質を含むタンパク質を製造するために、培養内で増殖させた細胞において対象ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を引き起こさせるために使用されうる。

【0085】

本開示はまた、１以上の対象ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞でありうる。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母または哺乳類細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］において発現されうる。他の適切な宿主細胞は当業者に公知である。

【0086】

したがって、本開示は更に、対象ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの製造方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞が、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現が生じることを可能にする適切な条件下で培養されうる。該ポリペプチドは分泌され、該ポリペプチドを含有する細胞と培地との混合物から単離されうる。あるいは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが細胞質または膜画分に保持され、細胞が回収され、細胞溶解され、タンパク質が単離されうる。細胞培養は宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養のための適切な培地は当技術分野で周知である。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を使用する免疫アフィニティ精製、ならびにＡｃｔＲＩＩポリペプチドに融合したドメインに結合する物質を使用するアフィニティ精製（例えば、ＡｃｔＲＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質を精製するためにプロテインＡカラムが使用されうる）を含む、タンパク質を精製するための当技術分野で公知の技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から対象ポリペプチドが単離されうる。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、その精製を促進させるドメインを含有する融合タンパク質である。

【0087】

幾つかの実施形態においては、精製は、例えば以下のものの３つ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成される：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー。精製はウイルス濾過およびバッファー交換で完了されうる。ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された場合には９０％超（すなわち、９０％を超える）、９５％超、９６％超、９８％超または９９％超の純度まで、そしてＳＤＳ ＰＡＧＥによって測定された場合には９０％超、９５％超、９６％超、９８％超または９９％超の純度まで精製されうる。純度の目標レベルは、哺乳類系、特に非ヒト霊長類、齧歯類（マウス）およびヒトにおいて望ましい結果を達成するのに十分なものであるべきである。

【0088】

もう１つの実施形態においては、組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドの所望部分のＮ末端におけるポリ－（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列のような精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ^２＋金属樹脂を使用するアフィニティクロマトグラフィーによる発現融合タンパク質の精製を可能にしうる。次いで精製リーダー配列はエンテロキナーゼでの処理によって除去されて、精製されたＡｃｔＲＩＩポリペプチドが得られうる。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら（１９９１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８９７２を参照されたい。

【0089】

融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の結合は、連結のための平滑末端またはスタッガー（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、適宜行われる付着末端のフィリングイン（埋め合わせ）、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素を使用する連結を用いる通常の技術に従い行われる。もう１つの実施形態においては、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む通常の技術によって合成されうる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実施可能であり、次いでそれらはアニーリングに付されて、キメラ遺伝子配列が生成されうる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい。

【0090】

４．使用方法
部分的に、本開示は、本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、および（ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含む投与レジメンでＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与することを含み、ここで、患者が毛細血管拡張症の症状を示し、または毛細血管拡張症を発生するリスク因子を含む場合には、第３用量の投与を開始し、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、患者は、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）の治療のために、本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている。

【0091】

これらの方法は、特に、動物、より詳細にはヒトの治療的処置および予防的処置を目的としている。「対象」、「個体」または「患者」なる語は本明細書の全体を通じて交換可能であり、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味する。これらの用語は哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、実験動物、家畜（ウシ、ブタ、ラクダなどを含む）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、他の家畜など）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の実施形態においては、患者、対象または個体はヒトである。

【0092】

「治療」、「治療する」、「軽減する」などの語は、本明細書において一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するものとして用いられ、治療されている状態の、１以上の臨床合併症の重症度を改善、軽減および／または低減すること（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクの減少）を意味するものとしても用いられうる。該効果は、疾患、病態もしくはその合併症の発症もしくは再発を完全もしくは部分的に遅らせるという点で予防的あることが可能であり、ならびに／または疾患、病態および／もしくは該疾患もしくは病態に起因する副作用の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であることが可能である。本明細書中で用いる「治療」は、哺乳動物、特にヒトの疾患または病態の任意の治療を含む。本明細書中で用いる、障害または病態を「予防する」治療用物質は、統計サンプルにおいて、未処置の対照サンプルと比較して、処置されたサンプルにおける障害または病態の発生を減少させる、あるいは、未処置の対照サンプルと比較して、疾患または病態の発症を遅らせる化合物を意味する。

【0093】

一般に、本開示に記載されている疾患または病態の治療または予防（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクの低減）は、本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを「有効量」で投与することによって達成される。作用物質の有効量は、所望の治療または予防結果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を意味する。本開示の作用物質の「治療的有効量」は、個体の病態、年齢、性別および体重ならびに個体において所望の応答を誘発する作用物質の能力のような要因に応じて変動しうる。「予防的有効量」は、所望の予防結果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を意味する。

【0094】

特定の態様においては、本開示は、疾患または病態を治療または予防する（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する）ための、１以上の追加的な活性物質または他の支持療法と組合された、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの使用を想定している。量）。本明細書中で用いる、投与「と組合せて」、投与の「組合せ」、投与「と組合された」または「組合せ」投与は、追加的な活性物質または支持療法（例えば、第２、第３、第４など）が体内で尚も有効である（例えば、複数の化合物が或る期間にわたって患者において同時に有効であり、これはそれらの化合物の相乗効果を含みうる）任意の投与形態を意味する。有効性は、血液、血清または血漿中の作用物質の測定可能な濃度と相関しない可能性がある。例えば、異なる治療用化合物が、同じ製剤において、または別個の製剤において、同時または逐次的に、異なるスケジュールで投与されうる。したがって、そのような治療を受ける対象は、異なる活性物質または療法の組合せ効果から利益を受けうる。本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１以上の他の追加的な物質または支持療法（例えば、本明細書に開示されているもの）と同時に、その前にまたはその後に投与されうる。一般に、各活性物質または療法は、その特定の物質に関して決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。レジメンにおいて用いる特定の組合せは、追加的な活性物質もしくは療法との本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの適合性および／または所望の効果を考慮したものとなろう。

【0095】

ＷＨＯ分類の概要
本明細書に記載されている方法によって治療される肺動脈性肺高血圧症の病態は、世界保健機関（ＷＨＯ）に従い認識されている病態のいずれか１以上を含みうる。例えば、Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ（２０１９）Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ：５３：１８０１９１３を参照されたい。

【0096】

【表2】

【0097】

ＰＡＨの分類の臨床上の目的は、ＰＡＨに関連する臨床状態を、それらの病態生理学的メカニズム、臨床症状、血行力学的特性および治療戦略に従って特定のサブグループに分類することである。この臨床分類は、前記の特徴に関する新たなデータが入手可能となった場合または追加的な臨床要素が考慮された場合に更新されうる。

【0098】

本明細書中で用いる「肺血流力学的パラメータ」なる語は、心臓および肺血管系を通る血流を説明または評価するために使用される任意のパラメータを意味する。肺血流力学的パラメータの例には、平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）、拡張期肺動脈圧（ｄＰＡＰ）［肺動脈拡張期圧（ＰＡＤＰ）としても公知である］、収縮期肺動脈圧（ｓＰＡＰ）［肺動脈収縮期圧（ＰＡＳＰ）としても公知である］、平均右房圧（ｍＲＡＰ）、肺毛細管楔入圧（ＰＣＷＰ）［肺動脈楔入圧（ＰＡＷＰ）としても公知である］、肺血管抵抗（ＰＶＲ）および心拍出量（ＣＯ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0099】

前記の肺血流力学的パラメータの多くは相互に関連している。例えば、ＰＶＲは、以下の方程式に従い、ｍＰＡＰ、ＰＣＷＰおよびＣＯに関連付けられる。
ＰＶＲ＝（ｍＰＡＰ－ＰＣＷＰ）／ＣＯ［ウッド単位］

【0100】

ＰＶＲは、左側充満圧の影響の非存在下で肺血管系によって課される流動に対する抵抗を評価するものである。ＰＶＲは以下の式によっても評価されうる。
ＰＶＲ＝ＴＰＧ×８０／ＣＯ［単位：ダイン－秒－ｃｍ^－５］またはＰＶＲ＝（ｍＰＡＰ－ＰＣＷＰ）×８０／ＣＯ［単位：ダイン－秒－ｃｍ^－５］

【0101】

幾つかの実施形態においては、総周辺抵抗（ＴＰＲ）は、以下の式を用いて評価されうる。
ＴＰＲ＝ｍＰＡＰ／ＣＯ

【0102】

幾つかの実施形態によれば、ＰＨに対する前毛細管肺動脈の寄与はＰＶＲの上昇によって反映されうる。幾つかの実施形態においては、正常ＰＶＲは２０～１３０ダイン－秒－ｃｍ^－５または０．５～１．１ウッド単位である。幾つかの実施形態によれば、上昇したＰＶＲは、２ウッド単位を超える、２．５ウッド単位を超える、３ウッド単位を超える、または３．５ウッド単位を超えるＰＶＲを意味しうる。

【0103】

更にもう１つの例として、ｍＰＡＰは、以下の方程式に従い、ｄＰＡＰおよびｓＰＡＰに関連付けられる：ｍＰＡＰ＝（２／３）ｄＰＡＰ＋（１／３）ｓＰＡＰ

【0104】

更に、ｄＰＡＰおよびｓＰＡＰを用い、以下の式を用いて、脈圧（ｍｍＨｇ）が計算されうる：脈圧＝ｓＰＡＰ－ｄＰＡＰ

【0105】

脈圧は、以下の方程式を用いて肺動脈コンプライアンスを計算するために用いられうる：肺動脈コンプライアンス（ｍＩ．ｍｍＨｇ^－１）＝一回拍出量／脈圧

【0106】

幾つかの実施形態においては、肺血流力学的パラメータは、例えば右心カテーテル挿入中に、直接測定される。他の実施形態においては、肺血流力学的パラメータは、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または心エコー検査のような他の技術によって推定および／または評価される。

【0107】

例示的な肺血流力学的パラメータには、ｍＰＡＰ、ＰＡＷＰおよびＰＶＲが含まれる。前記の１以上の肺血流力学的パラメータは、例えば右心カテーテル法または心エコー検査の利用のような任意の適切な方法によって測定されうる。ＰＨおよびＰＡＨの種々の血流力学的特性を表２に示す。

【0108】

【表3】

【0109】

本明細書に記載されているＰＡＨの臨床分類または血流力学的特性および関連診断パラメータは、新たな若しくは既存のデータソースの入手可能性に基づいて、または追加的な臨床要素が考慮された場合に、更新または変更されうる。

【0110】

ＰＡＨの特徴
肺動脈性肺高血圧症（ＷＨＯグループ１ ＰＨ）は、肺動脈の壁における平滑筋細胞の異常増殖および深刻な血管収縮によって特徴付けられる、重篤で進行性の生命を脅かす肺血管系疾患である。肺における血管の激しい収縮は非常に高い肺動脈圧を招く。これらの高圧は、心臓が肺に血液を送り出してそれが酸素化されることを困難にする。ＰＡＨを有する患者は極度の息切れに悩まされる。なぜなら、心臓はこれらの高圧に抗して拍出しようとするからである。ＰＡＨを有する患者は、典型的には、ＰＶＲの有意な増加およびｍＰＡＰの持続的上昇を引き起こし、これらは最終的には右心室不全および死を招く。ＰＡＨと診断された患者は不良予後および同様に損なわれた生活の質を示し、治療されなかった場合の平均余命は診断時から２～５年である。

【0111】

肺高血圧症の病因には種々の要因が関与しており、それらには、血管リモデリング（すなわち、過形成）に寄与しうる肺細胞の増殖が含まれる。例えば、肺血管リモデリングは、主に、肺高血圧症を有する患者の動脈内皮細胞および平滑筋細胞の増殖によって生じる。種々のサイトカインの過剰発現は肺高血圧症を促進させると考えられている。更に、肺高血圧症は肺動脈平滑細胞および肺内皮細胞の過剰増殖から生じうることが判明している。更に、進行性ＰＡＨは、遠位肺細動脈の筋肉化、同心円状内膜肥厚、および増殖内皮細胞による血管内腔の閉塞によって特徴付けられうる。Ｐｉｅｔｒａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，４３：２５５－３２５（２００４）。

【0112】

ＰＡＨは、安静時における２５ｍｍＨｇを超える（あるいは、更新されたガイドラインでは２０ｍｍＨｇを超える）平均肺動脈圧および正常な肺動脈毛細血管楔入圧に基づいて診断されうる。ＰＡＨは息切れ、めまい、失神および他の症状を引き起こす可能性があり、これらの全ては労作によって悪化する。ＰＡＨは、運動耐性の顕著な低下および心不全を伴う重篤な疾患でありうる。ＰＡＨの２つの主要タイプには、特発性ＰＡＨ（例えば、素因が特定されていないＰＡＨ）および遺伝性ＰＡＨ（例えば、ＢＭＰＲ２、ＡＬＫ１、ＥＮＧ、ＳＭＡＤ９、ＣＡＶ１、ＫＣＮＫ３またはＥＩＦ２ＡＫ４における突然変異に関連するＰＡＨ）が含まれる。家族性ＰＡＨの症例の７０％においては、ＢＭＰＲ２遺伝子に突然変異が存在する。ＰＡＨの発生のリスク因子には、ＰＡＨの家族歴、薬物および毒素の使用（例えば、メタンフェタミンまたはコカインの使用）、感染症（例えば、ＨＩＶ感染または住血吸虫症）、肝硬変、先天性心臓異常、門脈圧亢進症、肺静脈閉塞性疾患、肺毛細血管腫症または結合組織／自己免疫障害（例えば、強皮症またはループス）が含まれる。ＰＡＨはカルシウムチャネルブロッカーに対する長期応答者、静脈／毛細血管（ＰＶＯＤ／ＰＣＨ）関与の明白な特徴および新生児症候群の持続性ＰＨに関連づけられうる。

【0113】

ＰＡＨの診断
機能群を含むＰＡＨの診断は、血流力学的基準および他の基準が満たされているかどうかを判断するための包括的なパラメーターセットのレビューを用いて、症状および身体検査に基づいて決定されうる。考慮されうる基準の幾つかには、患者の臨床症状（例えば、息切れ、疲労感、脱力感、狭心症、失神、乾性咳、運動誘発性の吐き気および嘔吐）、心電図（ＥＣＧ）の結果、胸部Ｘ線写真の結果、肺機能検査、動脈血ガス、心エコー検査の結果、換気／灌流肺スキャンの結果、高解像度コンピュータ断層撮影の結果、造影コンピュータ断層撮影の結果、肺血管造影の結果、心臓磁気共鳴画像法、血液検査（例えば、ＢＮＰまたはＮＴ－ｐｒｏＢＮＰのようなバイオマーカー）、免疫学、腹部超音波スキャン、右心カテーテル法（ＲＨＣ）、血管反応性および遺伝子検査が含まれる。例えば、Ｇａｌｉｅ Ｎ．ら，Ｅｕｒｏ Ｈｅａｒｔ Ｊ．（２０１６）３７，６７－１１９を参照されたい。

【0114】

幾つかの実施形態においては、ＰＡＨの診断を助けるためにバイオマーカーが使用されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、バイオマーカーは血管機能不全のマーカー（例えば、不斉ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、エンドセリン－１、アンジオポエチンまたはフォンヴィレブランド因子）である。幾つかの実施形態においては、バイオマーカーは炎症のマーカー（Ｃ反応性タンパク質、インターロイキン６、ケモカイン）である。幾つかの実施形態においては、バイオマーカーは心筋ストレスのマーカー（例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）／ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰまたはトロポニン）である。幾つかの実施形態においては、バイオマーカーは、低ＣＯおよび／または組織低酸素症のマーカー（例えば、ｐＣＯ２、尿酸、増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）またはオステオポンチン）である。幾つかの実施形態においては、バイオマーカーは二次臓器損傷のマーカー（例えば、クレアチニンまたはビリルビン）である。例えば、Ｇａｌｉｅ Ｎ．ら，Ｅｕｒｏ Ｈｅａｒｔ Ｊ．（２０１６）３７，６７－１１９を参照されたい。

【0115】

ＰＨの測定
特定の態様においては、本開示は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）の治療および／または進行のために治療的ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列）の治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、特発性ＰＡＨを有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、遺伝性ＰＡＨ（例えば、ＢＭＰＲ２、ＡＬＫ－１、ＥＮＧ、ＳＭＡＤ９、ＣＡＶ１およびＫＣＮＫ３内の１以上の突然変異によるＰＡＨ）を有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、未知の突然変異による遺伝性ＰＡＨを有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、薬物または毒素によって誘発されたＰＡＨを有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、結合組織病（膠原病）に関連するＰＡＨを有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、ＨＩＶ感染に関連するＰＡＨを有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、門脈圧亢進症に関連するＰＡＨを有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、住血吸虫症に関連するＰＡＨを有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、カルシウムチャネルブロッカーに対する長期応答者として分類されるＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、静脈／毛細血管（ＰＶＯＤ／ＰＣＨ）関与の明白な特徴を有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、新生児症候群の持続性肺高血圧症（ＰＨ）を有するＰＡＨ患者の治療に関する。幾つかの実施形態においては、該方法は、シャント修復の少なくとも１年後に、単純先天性体肺シャントに関連するＰＡＨを有するＰＡＨ患者を治療することに関する。

【0116】

機能的クラス
ベースラインにおけるＰＡＨは、例えば肺高血圧症患者における疾患重症度の尺度である世界保健機関（ＷＨＯ）の機能的クラスによる評価では、軽度、中等度または重度でありうる。ＷＨＯ機能的クラスは、ニューヨーク心臓協会（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＮＹＨＡ）系を適応させたものであり、例えば疾患進行および治療応答のモニターにおいて、活動耐性を定性的に評価するために常套的に用いられている（Ｒｕｂｉｎ（２００４）Ｃｈｅｓｔ １２６：７－１０）。ＷＨＯ系においては、以下の４つの機能的クラスが認められている：機能的クラスＩ：結果的に生じる身体活動制限を伴わない肺高血圧症；通常の身体活動は、過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛または失神寸前状態を引き起こさない；機能的クラスＩＩ：身体活動のわずかな制限を引き起こす肺高血圧症；患者は安静時には快適；通常の身体活動が、過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛または失神寸前状態を引き起こす；機能的クラスＩＩＩ：身体活動の顕著な制限を引き起こす肺高血圧症；患者は安静時には快適；通常より低い活動が、過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛または失神寸前状態を引き起こす；機能的クラスＩＶ：症状を伴わずにはいかなる身体活動をも行い得ない状態をもたらす肺高血圧症；患者は右心不全の徴候を示す；安静時であっても呼吸困難および／または疲労が生じうる；あらゆる身体活動によって不快感が増大する。

【0117】

ＰＡＨに対する公知の治療
ＰＡＨに対する公知の治療方法は存在しない。現在の治療方法は、患者の寿命を延長させること、および患者の生活の質を向上させることに重点を置いている。これは、通常、良好な運動能力、良好な右心室機能および低い死亡リスクに関連している（例えば、患者をＷＨＯ機能的クラスＩまたは機能的クラスＩＩに導き、および／または維持する）。ＰＡＨの現在の治療方法には、血管拡張薬、例えばプロスタサイクリン、エポプロステノールおよびシルデナフィル；エンドセリン受容体アンタゴニスト、例えばボセンタン；カルシウムチャネルブロッカー、例えばアムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン；抗凝固薬、例えばワルファリン；利尿薬の投与が含まれうる。また、ＰＡＨの治療は、酸素療法、心房中隔欠損作成術、肺血栓内膜切除術ならびに肺および／または心臓移植を用いて行われている。しかし、これらの方法のそれぞれは、有効性の欠如、重篤な副作用、低い患者コンプライアンスおよび高いコストを含みうる１以上の欠点を有する。特定の態様においては、該方法は、ＰＡＨを治療するための１以上の追加的な活性物質および／または支持療法（例えば、血管拡張薬、例えばプロスタサイクリン、エポプロステノールおよびシルデナフィル；エンドセリン受容体アンタゴニスト、例えばボセンタン；カルシウムチャネルブロッカー、例えばアムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン；抗凝固薬、例えばワルファリン；利尿薬；酸素療法；心房中隔欠損作成術；肺血栓内膜切除術；ならびに肺および／または心臓移植）；バルドキソロンメチルまたはその誘導体；オレアノール酸またはその誘導体と組合されたＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列）の治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減することに関する。

【0118】

毛細血管拡張症のリスクを低減するための投与レジメン
患者が毛細血管拡張症を患う確率は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの初期治療中に、より高くなりうる。特定の実施形態においては、毛細血管拡張症の症状を予防、改善または低減するための投与レジメンが用いられうる。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、投与レジメンを用いて投与される。幾つかの実施形態においては、該方法は、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与レジメンを患者に投与することを含み、投与レジメンは第１期間の該ポリペプチドの０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの第１用量、および次いで第２期間に投与される該ポリペプチドの０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの第２用量を含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与レジメンを患者に投与することを含み、投与レジメンは第１期間の該ポリペプチドの０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの第１用量、第２期間に投与される該ポリペプチドの０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの第２用量、および次いで第３期間に投与される該ポリペプチドの０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの第３用量を含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療的有効量の投与レジメンを患者に投与することを含み、投与レジメンは第１期間の該ポリペプチドの０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの第１用量、第２期間に投与される該ポリペプチドの０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの第２用量、およびＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療が保留される第３期間の第３用量を含む。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量は約０．２ｍｇ／ｋｇ～約０．４ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量は０．３ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量は約０．５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量は０．７ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第３用量は約０．２ｍｇ／ｋｇ～約０．４ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第３用量は０．３ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。幾つかの実施形態においては、第３用量は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を或る期間にわたって保留することを含む。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療は少なくとも２～６週間保留される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療は少なくとも３週間保留される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療は少なくとも６週間保留される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療は少なくとも９週間保留される。幾つかの実施形態においては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療が保留された期間の後で再開される。

【0119】

幾つかの実施形態においては、投与レジメンは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、および次いでＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、投与レジメンは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、およびＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第３用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、投与レジメンは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、およびＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を少なくとも３週間保留することを含むＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第３用量を患者に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、投与レジメンは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、およびＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を少なくとも３週間保留することを含むＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を患者に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、投与レジメンは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を少なくとも３週間保留することを含むＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第３用量を患者に投与すること、およびＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第４用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、第２用量は第１用量を上回る。幾つかの実施形態においては、第１用量は第２用量を上回る。幾つかの実施形態においては、第３用量は第２用量を上回る。幾つかの実施形態においては、第２用量は第３用量を上回る。幾つかの実施形態においては、第３用量は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、第３用量は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を少なくとも２～６週間保留することを含む。幾つかの実施形態においては、第２用量は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を少なくとも２～６週間保留することを含む。幾つかの実施形態においては、第３用量は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を少なくとも３週間保留することを含む。幾つかの実施形態においては、第２用量は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を少なくとも３週間保留することを含む。幾つかの実施形態においては、第１期間は少なくとも３週間である。幾つかの実施形態においては、第２期間は少なくとも３週間である。幾つかの実施形態においては、第３期間は少なくとも３週間である。幾つかの実施形態においては、第２期間は少なくとも２１週間である。幾つかの実施形態においては、第２期間は少なくとも４５週間である。幾つかの実施形態においては、第２期間は第１期間を上回る。幾つかの実施形態においては、第３期間は第１期間を上回る。幾つかの実施形態においては、第３期間は第２期間を上回る。幾つかの実施形態においては、第１用量は患者に少なくとも３週間投与される。幾つかの実施形態においては、第２用量は少なくとも２１週間投与される。幾つかの実施形態においては、第２用量は少なくとも４５週間投与される。

【0120】

幾つかの実施形態においては、第１用量と第２用量との間の用量変更は、種々の要因（例えば、毛細血管拡張症の症状および／またはリスク因子）を考慮して、主治医によって決定される。幾つかの実施形態においては、第２用量と第３用量との間の用量変更は、種々の要因（例えば、毛細血管拡張症の症状および／またはリスク因子）を考慮して、主治医によって決定される。幾つかの実施形態においては、第３用量と第４用量との間の用量変更は、種々の要因（例えば、毛細血管拡張症の症状および／またはリスク因子）を考慮して、主治医によって決定される。

【0121】

幾つかの実施形態においては、前記の種々の要因には、毛細血管拡張症を発生する、患者のリスク因子が含まれるが、これに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症を発生するリスク因子は、低いＢＭＰ９レベル、低いＢＭＰ１０レベル、低いＶＥＧＦレベル、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）および結合組織病（ＣＴＤ）からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、患者は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療の前に、これらのリスク因子のうちの１以上を含む。幾つかの実施形態においては、患者は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療中に、これらのリスク因子のうちの１以上を含む。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症を発生するリスク因子は、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）および／または結合組織病（ＣＴＤ）に関連する１以上の突然変異を含む患者である。幾つかの実施形態においては、ＨＨＴに関連する１以上の突然変異は、ＥＮＧ、ＡＣＶＲＬ１、ＥＰＨＢ４、ＳＭＡＤ４、ＧＤＦ２、ＢＭＰＲ９およびＲＡＳＡ１からなる群から選択される遺伝子における突然変異である。幾つかの実施形態においては、ＣＴＤに関連する１以上の突然変異は、ＡＢＣＣ６、ＡＣＴＡ２、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＡＴＰ７Ａ、Ｂ３ＧＡＬＴ６、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＢＧＮ、Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｓ、ＣＢＳ、ＣＨＳＴ１４、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ９Ａ３、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＤＳＥ、ＥＦＥＭＰ２（ＦＢＬＮ４）、ＥＬＮ、ＦＢＬＮ５、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＦＫＢＰ１４、ＦＬＣＮ、ＦＬＮＡ、ＦＯＸＥ３、ＧＯＲＡＢ、ＬＯＸ、ＬＴＢＰ４、ＭＥＤ１２、ＭＦＡＰ５、ＭＹＨ１１、ＭＹＬＫ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＬＯＤ１、ＰＲＤＭ５、ＰＲＫＧ１、ＰＴＤＳＳ１、ＰＹＣＲ１、ＲＩＮ２、ＳＫＩ、ＳＬＣ２Ａ１０、ＳＬＣ３９Ａ１３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ６、ＴＡＢ２、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＸＢおよびＺＮＦ４６９からなる群から選択される遺伝子における突然変異である。幾つかの実施形態においては、治療前または治療中の患者の症状またはリスク因子の１以上が異常である場合、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドの患者の用量は維持される（例えば、０．３ｍｇ／ｋｇまたは０．７ｍｇ／ｋｇに維持される）。

【0122】

幾つかの実施形態においては、投与レジメンはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの副作用を予防、改善または軽減する。幾つかの実施形態においては、本明細書において提供される投与レジメンによるＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与は毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、本明細書において提供される投与レジメンによるＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与は第２期間中の毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、本明細書において提供される投与レジメンによるＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与は第３期間中の毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、本明細書において提供される投与レジメンによるＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与は第４期間中の毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、本明細書において提供される投与レジメンによるＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与は最初の２１週間の治療の後の毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、本明細書において提供される投与レジメンによるＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与は最初の４５週間の治療の後の毛細血管拡張症のリスクを低減する。

【0123】

毛細血管拡張症の症状およびリスク因子
毛細血管拡張症は、くも状静脈、ハイフンウェブ、糸状静脈、サンバースト静脈、星状静脈および静脈フレアとしても公知である。毛細血管拡張症は、皮膚に糸のような赤い線または模様を生じさせる拡張した細静脈（小さな血管）を含む。これらの模様、すなわち毛細血管拡張は多数の条件下で血管作動性物質の放出または活性化によって引き起こされると考えられている。毛細血管拡張症の症状には、疼痛、掻痒、皮膚上の糸状の赤い跡、皮膚粘膜毛細血管拡張症、胃腸出血、皮膚上の病変、鼻出血、歯肉出血、動静脈奇形、内部毛細血管拡張症および皮膚上の赤色斑点が含まれる。

【0124】

毛細血管拡張症はしばしば良性であるが、それは遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）のような重篤な疾患によっても引き起こされうる。ＨＨＴ患者では、肝臓のような重要な器官に毛細血管拡張が生じうる。これらの毛細血管拡張の破裂は、生命を脅かす出血を引き起こしうる。

【0125】

特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列）の治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法に関するものであり、該方法は、患者が毛細血管拡張症の症状を示し、または毛細血管拡張症を発生するリスク因子を含む場合には、投与レジメンに基づいてＡｃｔＲＩＩポリペプチドを投与し、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減することを含む。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は、疼痛、掻痒、皮膚上の糸状の赤い跡、皮膚粘膜毛細血管拡張症、胃腸出血、皮膚上の病変、鼻出血、歯肉出血、動静脈奇形、内部毛細血管拡張症および皮膚上の赤色斑点からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は皮膚上の病変である。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は歯肉出血である。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は鼻出血である。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は動静脈奇形である。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の症状は内部毛細血管拡張症である。幾つかの実施形態においては、動静脈奇形または内部毛細血管拡張症は内臓（例えば、脳、肝臓、肺、脾臓、尿路および脊椎）において生じる。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症を発生するリスク因子は、低いＢＭＰ９レベル、低いＢＭＰ１０レベル、低いＶＥＧＦレベル、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）および結合組織病（膠原病）（ＣＴＤ）からなる群から選択される。

【0126】

特定の実施形態においては、本開示は、本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列）で治療されている患者または該ポリペプチドで治療される候補である患者を管理するための方法であって、患者における毛細血管拡張症の、１以上の症状またはリスク因子を測定することによる方法を提供する。毛細血管拡張症の前記の１以上の症状および／またはリスク因子は、本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドで治療される候補である患者に対する適切な投与を評価するために、ならびに／または治療中の毛細血管拡張症の症状および／もしくはリスク因子をモニターするために、ならびに／または本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドでの治療中に投与量を調整するかどうかを評価するために、ならびに／または本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの適切な維持用量を評価するために用いられうる。毛細血管拡張症の症状および／またはリスク因子の１以上が異常である場合、１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与が低減され、延期され、または中止されうる。

【0127】

１つの実施形態においては、１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドで治療される候補である患者において、毛細血管拡張症の、１以上の症状および／またはリスク因子が異常である場合、本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与の開始は、毛細血管拡張症の症状および／またはリスク因子が自然にまたは治療的介入によって正常または許容レベルに戻るまで、延期される。

【0128】

特定の実施形態においては、１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドで治療される候補である患者において、毛細血管拡張症の、１以上の症状および／またはリスク因子が異常である場合、投与の開始は延期されなくてもよい。しかし、本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与量または投与頻度は、本開示の１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの投与に際して生じる毛細血管拡張症のリスクを低減する量に設定されうる。あるいは、毛細血管拡張症のリスクに対処する治療用物質と１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドとが組合された治療レジメンが患者のために開発されうる。

【0129】

患者における毛細血管拡張症の重症度
毛細血管拡張症およびその重症度レベルは、種々の分類を用いて説明され、評価されうる。例えば、慢性静脈障害の臨床病因学解剖病態生理学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ－Ｅｔｉｏｌｏｇｙ－Ａｎａｔｏｍｙ－Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）（ＣＥＡＰ）分類は、重症度が高くなる順に静脈の状態を等級分けしている。ＣＥＡＰは毛細血管拡張症を最も軽度のカテゴリー（Ｃ１）に分類しており、これは、毛細血管拡張症を、内径１ｍｍ未満の拡張した皮内細静脈の集合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）として記載している。例えば、以下の表３を参照されたい。

【0130】

【表4】

【0131】

毛細血管拡張症は重症度の特定のグレード（等級）へと更に分類定義されうる。例えば、毛細血管拡張症は静脈の蛇行および隆起の程度および範囲に従い３つのグレードに分類されうる。例えば、Ｒｕｃｋｌｅｙ ＣＶら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ．２００８；３６（６）：７１９－７２４を参照されたい。

【0132】

特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列）の治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法に関するものであり、ここで、患者は、臨床病因学解剖病態生理学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ－Ｅｔｉｏｌｏｇｙ－Ａｎａｔｏｍｙ－Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）（ＣＥＡＰ）によって分類されるＣ１毛細血管拡張症を有する。幾つかの実施形態においては、該方法は、毛細血管拡張症を、ＣＥＡＰによって分類されるＣ１からＣ０まで改善する。

【0133】

特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列）の治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法に関するものであり、ここで、患者はグレード１、グレード２またはグレード３の毛細血管拡張症を有する。幾つかの実施形態においては、患者はグレード１の毛細血管拡張症を有する。幾つかの実施形態においては、患者はグレード２の毛細血管拡張症を有する。幾つかの実施形態においては、患者はグレード３の毛細血管拡張症を有する。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症のリスクは、毛細血管拡張症の重症度を低減または改善することによって低減する。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症のグレードを改善することによって、毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、該方法は毛細血管拡張症をグレード２からグレード１に改善する。幾つかの実施形態においては、該方法は毛細血管拡張症をグレード３からグレード２に改善する。幾つかの実施形態においては、該方法は毛細血管拡張症をグレード３からグレード１に改善する。幾つかの実施形態においては、毛細血管拡張症の進行を予防することによって、毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、該方法はグレード１からグレード２への毛細血管拡張症の進行を予防する。幾つかの実施形態においては、該方法はグレード２からグレード３への毛細血管拡張症の進行を予防する。

【0134】

特定の態様においては、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号１の残基３０～１１０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列）の治療的有効量の投与を受けている患者における毛細血管拡張症のリスクを低減する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第１用量を０．３ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与すること、および（ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの第２用量を０．７ｍｇ／ｋｇの量で患者に投与することを含み、ここで、患者が毛細血管拡張症の症状を示し、または毛細血管拡張症を発生するリスク因子を含む場合には、第３用量の投与を開始し、それによって毛細血管拡張症のリスクを低減する。幾つかの実施形態においては、第３用量は、毛細血管拡張症がグレード１以下に改善するまで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を保留することを含む。幾つかの実施形態においては、第３用量は、毛細血管拡張症がグレード２以下に改善するまで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を保留することを含む。第３用量は、毛細血管拡張症がグレード３以下に改善するまで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの治療を保留することを含む。

【0135】

５．医薬組成物および投与方法
特定の実施形態においては、本開示の治療方法は、組成物を全身的に、またはインプラントもしくはデバイスとして局所的に投与することを含む。本開示における使用のための治療用組成物は、投与される際には、実質的に発熱物質を含有しないまたは発熱物質を含有しない生理的に許容される形態である。前記組成物中に所望により含まれていてもよい、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド以外の治療上有用な物質は、本明細書に開示されている方法において、対象化合物と同時または逐次的に投与されうる。

【0136】

典型的には、本明細書に開示されているタンパク質治療用物質は非経口的に、特に静脈内または皮下に投与される。非経口投与に適した医薬組成物は、１以上のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを、１以上の薬学的に許容される無菌等張性の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション（乳濁液）、または使用直前に無菌注射用溶液もしくは分散液へと再構成（reconstituted）されうる無菌粉末と共に含むことが可能であり、それは抗酸化剤、バッファー、静菌剤、意図される被投与者の血液に対して製剤を等張にする溶質、または懸濁化もしくは増粘剤を含有しうる。本開示の医薬組成物において使用されうる適切な水性担体および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。例えば、レシチンのようなコーティング材の使用、分散液の場合には必要粒径の維持、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持されうる。製剤は、単位用量または複数用量の密封容器、例えばアンプルおよびバイアルにおいて提供可能であり、注射用の無菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを使用直前に要するフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵されうる。即時の注射溶液および懸濁液は、本明細書に記載されている種類の無菌性の散剤、顆粒剤および錠剤から調製されうる。

【0137】

組成物および製剤は、所望により、有効成分を含有する１以上の単位剤形を含有しうるパックまたはディスペンサー装置において提供されうる。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含みうる。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が付属しうる。

【0138】

更に、組成物は標的組織部位への送達のための形態で注射され、またはカプセル化されうる。特定の実施形態においては、本発明の組成物は、発生中の組織に構造を提供するように１以上の治療用化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド）を標的組織部位に送達しうる、そして最適には体内に再吸収されうるマトリックスを含みうる。例えば、マトリックスはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの徐放をもたらしうる。そのようなマトリックスは、他の移植医療用途に現在使用されている材料から構成されうる。

【0139】

マトリックス材の選択は生体適合性、生分解性、機械的特性、美的外観および界面特性に基づく。対象組成物の個々の用途が、適切な製剤を定めるであろう。組成物用の潜在的マトリックスは生分解性であり、化学的に定められる硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物でありうる。他の潜在的材料は生分解性であり、生物学的に明確に定められるものであり、例えば骨または真皮のコラーゲンである。他のマトリックスは純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分から構成される。他の潜在的マトリックスは非生分解性であり、化学的に定められるものであり、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミナートまたは他のセラミックである。マトリックスは、例えばポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおおよびリン酸三カルシウムのような前記タイプの材料のいずれかの組合せから構成されうる。バイオセラミックスは、例えばカルシウム－アルミナート－ホスファートにおけるように、組成の改変が可能であり、細孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状および生分解性を改変するために処理されうる。

【0140】

特定の実施形態においては、本発明の方法は、例えば、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（香味基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用するもの）、散剤、顆粒剤の形態で、または水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型の液体エマルションとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤（不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアを使用するもの）、および／または洗口剤などとして経口投与可能であり、それぞれは所定量の作用物質を有効成分として含有する。作用物質はボーラス、舐剤またはペースト剤としても投与されうる。

【0141】

経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）においては、本発明の１以上の治療用化合物が、１以上の薬学的に許容される担体、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のもののいずれかと混合されうる：（１）増量剤またはエクステンダー、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア；（３）保湿剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリカートおよび炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は緩衝化剤をも含みうる。類似タイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセル剤における充填剤としても使用されうる。

【0142】

経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁剤（懸濁液）、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、有効成分に加えて、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有しうる。経口組成物は、不活性希釈剤に加えて、補助剤、例えば湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、賦香剤および保存剤をも含みうる。

【0143】

懸濁剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントならびにそれらの混合物を含有しうる。

【0144】

本発明の組成物は、補助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤をも含有しうる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含有させることによって保証されうる。また、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に含有させることも望ましいかもしれない。また、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることによって、注射可能な医薬形態の持続的吸収がもたらされうる。

【0145】

投与レジメンは、本開示の対象化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド）の作用を改変する種々の要因を考慮して、主治医によって決定されると理解される。種々の要因には、患者の年齢、性別および食事、疾患の重症度、投与時間および他の臨床要因が含まれるが、これらに限定されるものではない。所望により、投与量は、再構成に使用されるマトリックスのタイプおよび組成物中の化合物のタイプに応じて変動しうる。幾つかの実施形態においては、患者の血液学的パラメータは、患者が正常より高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベル（例えば、１６．０ｇ／ｄＬを超えるヘモグロビンレベルまたは１８．０ｇ／ｄＬを超えるヘモグロビンレベル）を有するかどうかを決定するために、定期的な評価によってモニターされうる。幾つかの実施形態においては、正常より高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを有する患者は、それらのレベルが正常または許容レベルに戻るまで、延期または低減された投与を受けうる。

【0146】

幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．１ｍｇ／ｋｇ～２．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．１ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．２ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．３ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．４ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．５ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．６ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．７ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．８ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは０．９ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．０ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．１ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．２ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．３ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．４ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．５ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．６ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．７ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．８ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１．９ｍｇ／ｋｇで投与される。幾つかの実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは２．０ｍｇ／ｋｇで投与される。

【0147】

特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１日１回投与される。特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは１日２回投与される。特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは週１回投与される。特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは週２回投与される。特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは週３回投与される。特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは２週間ごとに投与される。特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは３週間ごとに投与される。特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは４週間ごとに投与される。特定の実施形態においては、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドは毎月投与される。

【0148】

特定の実施形態においては、本発明はまた、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。そのような治療は、前記の障害を有する細胞または組織内にＡｃｔＲＩＩポリペプチドのポリヌクレオチド配列を導入することによって、その治療効果を達成するであろう。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのポリヌクレオチド配列の送達は、組換え発現ベクター、例えばキメラウイルスまたはコロイド分散系を使用して達成されうる。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのポリヌクレオチド配列の治療用送達には、標的化リポソームの使用が好ましい。

【0149】

本明細書で教示されている遺伝子治療に利用されうる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または好ましくはＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターはマウスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入されうるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。多数の追加的なレトロウイルスベクターに複数の遺伝子が組み込まれうる。形質導入細胞が特定され作製されうるように、これらのベクターの全ては選択マーカーの遺伝子を導入し、組み込みうる。レトロウイルスベクターは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質に結合することによって、標的特異的にされうる。好ましい標的化は、抗体を使用することによって達成される。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達が可能となるよう、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム内に挿入され、またはウイルスエンベロープに結合されうる、と当業者は認識するであろう。好ましい実施形態においては、ベクターは骨または軟骨に標的化される。

【0150】

あるいは、通常のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドで組織培養細胞が直接的にトランスフェクトされうる。次いでこれらの細胞は、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞はレトロウイルスベクターを培地内に放出する。

【0151】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのポリヌクレオチドの別の標的化送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質に基づく系、例えば水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームが含まれる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷ビリオンは水性の内部領域内に封入され、生物学的に活性な形態で細胞に送達されうる（例えば、Ｆｒａｌｅｙら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７，１９８１を参照されたい）。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子導入のための方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８を参照されたい。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組合せであり、通常はステロイド、特にコレステロールと組合されたものである。他のリン脂質または他の脂質も使用されうる。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に左右される。

【0152】

リポソームの製造に有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが含まれる。例示的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的化は、例えば器官特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性に基づくことによっても可能であり、当技術分野で公知である。

【0153】

本開示は、ｐＨを調整するために酸および塩基ならびにｐＨを狭い範囲内に維持するためのバッファーを含むように変更されうる製剤を提供する。

【0154】

６．実施例
前記開示は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。それらの実施例は本発明の特定の実施形態の単なる例示目的で記載されているに過ぎず、限定的であるとは意図されない。

【0155】

実施例１：ＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ融合タンパク質
ヒトまたはマウスＦｃドメインに融合したヒトＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメイン（それらの間に最小リンカーが介在する）を有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質を構築した。これらの構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃと称される。

【0156】

ＣＨＯ細胞株から精製されたＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃを以下に示す（配列番号２３）。

【数10】

【0157】

ＣＨＯ細胞株から精製された、Ｃ末端リジンを欠く追加的なＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃを以下に示す（配列番号４０）。

【数11】

【0158】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃタンパク質をＣＨＯ細胞株において発現させた。３つの異なるリーダー配列が考慮された。
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２４）；
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２５）；
（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号：２６）。

【0159】

選択された形態はＴＰＡリーダーを使用し、プロセシングされていない以下のアミノ酸配列を有する。

【数12】

【0160】

このポリペプチドは以下の核酸配列によってコードされる。

【数13】

【0161】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃは共に、組換え発現に非常に適していた。図４Ａおよび４Ｂに示されているとおり、タンパク質は単一の明確なタンパク質ピークとして精製された。Ｎ末端配列決定は、－ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号２９）の単一配列を示した。精製は、例えば以下のものの３つ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成できた：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー。精製はウイルス濾過およびバッファー交換で完了できた。ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された場合には９８％超（すなわち、９８％を超える）の純度まで、そしてＳＤＳ ＰＡＧＥによって測定された場合には９５％超の純度まで精製された。

【0162】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃはリガンドに対して高いアフィニティを示した。標準的なアミンカップリング法を用いて、ＧＤＦ１１またはアクチビンＡをＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に固定化した。ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃタンパク質を系にローディングし、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃは５×１０^－１２の解離定数（Ｋ_Ｄ）でアクチビンに結合し、９．９６×１０^－９のＫ_ＤでＧＤＦ１１に結合した。図５Ａおよび図５Ｂを参照されたい。同様の結合アッセイを用いて、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃは、例えばアクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０を含む他のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドに対して高度ないし中等度のアフィニティを有することが決定された。ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃも同様の性質を示した。

【0163】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃは薬物動態研究において非常に安定であった。１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃタンパク質をラットに投与し、該タンパク質の血漿レベルを２４、４８、７２、１４４および１６８時間の時点で測定した。別の研究において、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇをラットに投与した。ラットにおいては、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃは１１～１４日の血清半減期を有し、該薬物の循環レベルは２週間後に非常に高かった（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの初回投与の場合に、それぞれ、１１μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌまたは３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルにおいては、血漿半減期は１４日より実質的に長く、該薬物の循環レベルは１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの初回投与の場合に、それぞれ、２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ／ｍｌまたは１４４０μｇ／ｍｌであった。

【0164】

実施例２：ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃタンパク質の特徴付け
配列番号２５の組織プラスミノーゲンリーダー配列を使用して、ｐＡＩＤ４ベクター（ＳＶ４０ ｏｒｉ／エンハンサー、ＣＭＶプロモーター）から、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃ融合タンパク質を、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ－ＤＵＫＸ Ｂ１１細胞において発現させた。前記実施例１に記載されているとおりに精製されたタンパク質は配列番号２３の配列を有していた。Ｆｃ部分は、配列番号２３に示されているヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列である。タンパク質分析は、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃ融合タンパク質が、ジスルフィド結合を有するホモ二量体として形成されることを示した。

【0165】

ＣＨＯ細胞において発現された物質は、ヒト２９３細胞において発現されたＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃ融合タンパク質に関して報告されているものより高い、アクチビンＢリガンドに対するアフィニティを有する［ｄｅｌ Ｒｅら（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（５１）：５３１２６－５３１３５を参照されたい］。また、ＴＰＡリーダー配列の使用は他のリーダー配列の場合より大量の産生をもたらし、天然リーダーで発現されたＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃとは異なり、高純度のＮ末端配列を与えた。天然リーダー配列の使用は、ＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃの、２つの主要種（それぞれは、異なるＮ末端配列を有する）を生成した。

【0166】

実施例３：代替的なＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃタンパク質
本明細書に記載されている方法に従い使用されうる種々のＡｃｔＲＩＩＡ変異体が、ＷＯ２００６／０１２６２７（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）（例えば、５５～５８ページを参照されたい）として公開された国際特許出願に記載されている。別の構築物はＣ末端尾部（ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインの最後の１５アミノ酸）の欠失を有しうる。そのような構築物の配列を以下に示す（Ｆｃ部分が下線で示されている）（配列番号３０）。

【数14】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

2024526820000001.xml

【国際調査報告】