特表 2024-526835 ＣＤ８結合ポリペプチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】ＣＤ８結合ポリペプチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240711BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 14/56 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 14/565 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 14/57 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240711BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240711BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20240711BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K14/55

C07K14/56

C07K14/565

C07K14/57

C07K19/00

C07K16/46

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12Q1/02

A61K39/395 N

A61K38/20

A61P37/04

A61P35/00

C12N7/01

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503351

(86)(22)【出願日】2022-07-19

(85)【翻訳文提出日】2024-03-05

(86)【国際出願番号】 US2022073877

(87)【国際公開番号】W WO2023004304

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/223,786

(32)【優先日】2021-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/288,111

(32)【優先日】2021-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514199744

【氏名又は名称】インヒブルクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ティマー ジョン シー．

(72)【発明者】

【氏名】クラゴ ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】スルツマイアー フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】ラスコン ルーカス

(72)【発明者】

【氏名】エッケルマン ブレンダン ピー．

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ08

4B063QR48

4B063QR77

4B063QS33

4B063QS40

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE11

4B064CE12

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC01

4B065BD14

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084CA53

4C084DA14

4C084NA14

4C084ZB021

4C084ZB022

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085CC05

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA04

4H045DA16

4H045DA17

4H045DA18

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA23

4H045GA25

4H045GA26

(57)【要約】

本明細書では、ＣＤ８に結合するＶＨＨ含有ポリペプチドが提供される。ＶＨＨ含有ポリペプチドの使用も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ８に結合し、配列番号３、配列番号７３、又は配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、又は配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５、配列番号１６、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチド。

【請求項2】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１２、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１４、及び配列番号５；配列番号３、配列番号４、及び配列番号１６；配列番号３、配列番号４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号２２、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号２７、及び配列番号５；配列番号３、配列番号２９、及び配列番号５；配列番号３、配列番号３１、及び配列番号５；配列番号７３、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号７４、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７５、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７６、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７７、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７８、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７９、及び配列番号１８；又は配列番号３、配列番号８０及び配列番号１８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

少なくとも１つのＶＨＨドメイン又は各ＶＨＨドメインは、ヒト化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、又は配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、又は配列番号１００のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号９２又は配列番号１００のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項8】

２つのＶＨＨドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項9】

３つのＶＨＨドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項10】

免疫細胞活性化サイトカインを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインのＮ末端又はＣ末端に融合している、請求項１０に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、若しくはＩＦＮγ、又はそれらの弱毒化型若しくは改変型である、請求項１０又は１１に記載のポリペプチド。

【請求項13】

Ｆｃ領域を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

前記Ｆｃ領域は、配列番号３２～配列番号７０、及び配列番号１０１～配列番号１１１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。

【請求項15】

免疫細胞活性化サイトカインを含む、請求項１３又は１４に記載のポリペプチド。

【請求項16】

前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、若しくはＩＦＮγ、又はそれらの弱毒化型若しくは改変型である、請求項１５に記載のポリペプチド。

【請求項17】

前記免疫細胞活性化サイトカインは、前記Ｆｃ領域のＣ末端に融合している、請求項１６に記載のポリペプチド。

【請求項18】

ＣＤ８以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項19】

Ｌａｇ３、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤＬ１、又はＴＩＭ３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。

【請求項20】

ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ２、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、α４インテグリン、αＶインテグリン、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、補体Ｃ５、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、クローディン３、クローディン４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体α（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＲＰ７８、ＨＡＶＣＡＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｎｏｔｃｈ ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦβ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ＴＲＯＰ－２、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、又はＷＩＳＰ－３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項１８又は１９に記載のポリペプチド。

【請求項21】

ＣＤ８以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項22】

ＣＤ８以外の抗原に結合する各抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである、請求項２１に記載のポリペプチド。

【請求項23】

ＣＤ８以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項24】

ＣＤ８以外の抗原に結合する各抗原結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項２３に記載のポリペプチド。

【請求項25】

第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む複合体であって、前記第１のポリペプチドは、請求項１３～２４のいずれか一項に記載のポリペプチドであり、前記第１のポリペプチドは、第１のＦｃ領域を含み、前記第２のポリペプチドは、第２のＦｃ領域を含み、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域は、同じか又は異なる、複合体。

【請求項26】

前記第２のポリペプチドは、ＣＤ８に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメイン、少なくとも１つの免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＣＤ８以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項２５に記載の複合体。

【請求項27】

ＣＤ８以外の抗原に結合する前記抗原結合ドメインが重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む場合、前記重鎖可変領域は、前記第２のＦｃ領域を含む重鎖定常領域に融合する、請求項２６に記載の複合体。

【請求項28】

前記第１のＦｃ領域は、ノブ突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、ホール突然変異を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項29】

前記第１のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含む、請求項２８に記載の複合体。

【請求項30】

前記第２のＦｃ領域は、Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋ突然変異を含む、請求項２９に記載の複合体。

【請求項31】

前記ポリペプチドは、生理学的条件下で二量体であるか、又は前記複合体は、生理学的条件下で形成される、請求項１３～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体。

【請求項32】

前記ＣＤ８は、ヒトＣＤ８である、請求項１～３１のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体。

【請求項33】

前記ヒトＣＤ８は、配列番号１の配列を含む、請求項３２に記載のポリペプチド又は複合体。

【請求項34】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体と、細胞傷害性物質とを含む免疫複合体。

【請求項35】

前記細胞傷害性物質は、カリケアマイシン、アウリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、メイタンシノイド、クリプトフィシン、ズオカルマイシン、エスペラミシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びエンジイン抗生物質から選択される、請求項３４に記載の免疫複合体。

【請求項36】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくは複合体、又は請求項３４若しくは３５に記載の免疫複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項37】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体をコードする単離された核酸。

【請求項38】

請求項３７に記載の核酸を含むベクター。

【請求項39】

請求項３７に記載の核酸又は請求項３８に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項40】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体を発現する宿主細胞。

【請求項41】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体を生産する方法であって、前記ポリペプチド又は複合体の発現に適した条件下で請求項３９又は４０に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、方法。

【請求項42】

前記ポリペプチド又は複合体を単離することを更に含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる方法であって、Ｔ細胞を請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体と接触させることを含む、方法。

【請求項44】

前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

癌を治療する方法であって、癌を伴う被験体に請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくは複合体、又は請求項３６に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【請求項47】

前記癌は、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病から選択される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

追加の療法剤を投与することを更に含む、請求項４６又は４７に記載の方法。

【請求項49】

前記追加の療法剤は、抗癌剤である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記抗癌剤は、化学療法剤、抗癌生物製剤、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、及び腫瘍溶解性ウイルスから選択される、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記追加の療法剤は、抗癌生物製剤である、請求項４８に記載の方法。

【請求項52】

前記抗癌生物製剤は、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１を阻害する作用物質である、請求項４９に記載の方法。

【請求項53】

前記抗癌生物製剤は、ＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＴＬＡ４、又はＴＩＧＩＴを阻害する作用物質である、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記抗癌剤は、抗体である、請求項４９に記載の方法。

【請求項55】

前記抗癌生物製剤は、サイトカインである、請求項５１に記載の方法。

【請求項56】

前記抗癌剤は、ＣＡＲ－Ｔ療法薬である、請求項４９に記載の方法。

【請求項57】

前記抗癌剤は、腫瘍溶解性ウイルスである、請求項４９に記載の方法。

【請求項58】

腫瘍切除及び／又は放射線療法を更に含む、請求項４６～５７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年７月２０日付で出願された米国仮出願第６３／２２３，７８６号及び２０２１年１２月１０日付で出願された米国仮出願第６３／２８８，１１１号の優先権の利益を主張し、その全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす。

【0002】

本発明は、ＣＤ８結合ポリペプチド、及びＣＤ８結合ポリペプチドを使用してＣＤ８の生物学的活性を調節する方法に関する。そのような方法には、限定されるものではないが、癌を治療する方法が含まれる。幾つかの実施の形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８結合ポリペプチドと、ＣＤ８以外の抗原に結合するポリペプチドとを含む融合ポリペプチドである。

【背景技術】

【0003】

ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）、更にはナチュラルキラー細胞、γδＴ細胞、皮質胸腺細胞、及び樹状細胞のサブセットを含むリンパ系の他の細胞の表面上に発現される膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ８は、典型的には、ＣＤ８α鎖及びＣＤ８β鎖から構成されるヘテロ二量体であるが、状況によってはＣＤ８αホモ二量体として存在することがある。細胞傷害性Ｔ細胞では、ＣＤ８は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の補助受容体として作用し、抗原認識及びＴ細胞活性化を増強する。細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲと、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質に結合したペプチド抗原との相互作用によって支配される。ＣＤ８は、クラスＩ ＭＨＣタンパク質の不変領域に結合することによって、ＴＣＲ／ペプチド－ＭＨＣ相互作用の安定化を助長する。ＣＤ８はまた、ＣＤ８αの細胞質ドメインにＬｃｋを動員することによってＴＣＲシグナル伝達を増強し、Ｔ細胞活性化シグナルを増幅するカスケードをもたらす。

【0004】

Ｔ細胞の活性化は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、及びＩＦＮγ等の他の分子によっても制御される。活性化Ｔ細胞自体によって合成及び分泌されるサイトカインインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、ヘルパーＴ細胞の分化を調節し、ナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性を増強し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を制御する多面的サイトカインである。ＩＬ－２は、Ｔ細胞表面上の３つのサブユニット（ＩＬ－２α、ＩＬ－２β、及びγｃ）から構成される高親和性受容体に結合する。ＩＬ－２受容体複合体を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の細胞分裂を進行させ、活性化Ｔ細胞のクローン性増殖を推進する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

活性化分子をＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に標的化し、細胞傷害性Ｔ細胞応答の効力及び選択性を増大させることができるＣＤ８結合ポリペプチドが必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

ＣＤ８結合ポリペプチド、及びＣＤ８結合ポリペプチドを使用して、例えば癌を治療する方法が本明細書で提供される。幾つかの実施の形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、１つ以上の付加的な結合ドメイン及び／又はサイトカイン配列を含む。或る特定の番号付けされた実施の形態を以下に提示する。

【0007】

実施の形態１ ＣＤ８に結合し、配列番号３、配列番号７３、又は配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、又は配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号５、配列番号１６、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチド。

【0008】

実施の形態２ 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１２、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１４、及び配列番号５；配列番号３、配列番号４、及び配列番号１６；配列番号３、配列番号４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号２２、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号２７、及び配列番号５；配列番号３、配列番号２９、及び配列番号５；配列番号３、配列番号３１、及び配列番号５；配列番号７３、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号７４、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７５、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７６、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７７、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７８、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７９、及び配列番号１８；又は配列番号３、配列番号８０及び配列番号１８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0009】

実施の形態３ 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１又は２に記載のポリペプチド。

【0010】

実施の形態４ 少なくとも１つのＶＨＨドメイン又は各ＶＨＨドメインは、ヒト化されている、実施の形態１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0011】

実施の形態５ 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、又は配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、実施の形態１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0012】

実施の形態６ 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、又は配列番号９９、又は配列番号１００のアミノ酸配列を含む、実施の形態１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0013】

実施の形態７ 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号９２又は配列番号１００のアミノ酸配列を含む、実施の形態１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0014】

実施の形態８ ２つのＶＨＨドメインを含む、実施の形態１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0015】

実施の形態９ ３つのＶＨＨドメインを含む、実施の形態１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0016】

実施の形態１０ 免疫細胞活性化サイトカインを含む、実施の形態１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0017】

実施の形態１１ 前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインのＮ末端又はＣ末端に融合している、実施の形態１０に記載のポリペプチド。

【0018】

実施の形態１２ 前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、若しくはＩＦＮγ、又はそれらの弱毒化型若しくは改変型である、実施の形態１０又は１１に記載のポリペプチド。

【0019】

実施の形態１３ Ｆｃ領域を含む、実施の形態１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0020】

実施の形態１４ 前記Ｆｃ領域は、配列番号３２～配列番号７０、又は配列番号１０１～配列番号１１１から選択されるアミノ酸配列を含む、実施の形態１３に記載のポリペプチド。

【0021】

実施の形態１５ 免疫細胞活性化サイトカインを含む、実施の形態１３又は１４に記載のポリペプチド。

【0022】

実施の形態１６ 前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、若しくはＩＦＮγ、又はそれらの弱毒化型若しくは改変型である、実施の形態１５に記載のポリペプチド。

【0023】

実施の形態１７ 前記免疫細胞活性化サイトカインは、前記Ｆｃ領域のＣ末端に融合している、実施の形態１６に記載のポリペプチド。

【0024】

実施の形態１８ ＣＤ８以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施の形態１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0025】

実施の形態１９ Ｌａｇ３、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤＬ１、又はＴＩＭ３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施の形態１８に記載のポリペプチド。

【0026】

実施の形態２０ ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ２、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、α４インテグリン、αＶインテグリン、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、補体Ｃ５、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、クローディン３、クローディン４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体α（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＲＰ７８、ＨＡＶＣＡＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｎｏｔｃｈ ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦβ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ＴＲＯＰ－２、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、又はＷＩＳＰ－３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施の形態１８又は１９に記載のポリペプチド。

【0027】

実施の形態２１ ＣＤ８以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである、実施の形態１８～２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0028】

実施の形態２２ ＣＤ８以外の抗原に結合する各抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである、実施の形態２１に記載のポリペプチド。

【0029】

実施の形態２３ ＣＤ８以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、実施の形態１８～２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【0030】

実施の形態２４ ＣＤ８以外の抗原に結合する各抗原結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、実施の形態２３に記載のポリペプチド。

【0031】

実施の形態２５ 第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む複合体であって、前記第１のポリペプチドは、実施の形態１３～２４のいずれか一項に記載のポリペプチドであり、前記第１のポリペプチドは、第１のＦｃ領域を含み、前記第２のポリペプチドは、第２のＦｃ領域を含み、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域は、同じか又は異なる、複合体。

【0032】

実施の形態２６ 前記第２のポリペプチドは、ＣＤ８に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメイン、少なくとも１つの免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＣＤ８以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施の形態２５に記載の複合体。

【0033】

実施の形態２７ ＣＤ８以外の抗原に結合する前記抗原結合ドメインが重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む場合、前記重鎖可変領域は、前記第２のＦｃ領域を含む重鎖定常領域に融合する、実施の形態２６に記載の複合体。

【0034】

実施の形態２８ 前記第１のＦｃ領域は、ノブ突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、ホール突然変異を含む、実施の形態２５～２７のいずれか一項に記載の複合体。

【0035】

実施の形態２９ 前記第１のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含む、実施の形態２８に記載の複合体。

【0036】

実施の形態３０ 前記第２のＦｃ領域は、Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋ突然変異を含む、実施の形態２９に記載の複合体。

【0037】

実施の形態３１ 前記ポリペプチドは、生理学的条件下で二量体であるか、又は前記複合体は、生理学的条件下で形成される、実施の形態１３～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体。

【0038】

実施の形態３２ 前記ＣＤ８は、ヒトＣＤ８である、実施の形態１～３１のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体。

【0039】

実施の形態３３ 前記ヒトＣＤ８は、配列番号１の配列を含む、実施の形態３２に記載のポリペプチド又は複合体。

【0040】

実施の形態３４ 実施の形態１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体と、細胞傷害性物質とを含む免疫複合体。

【0041】

実施の形態３５ 前記細胞傷害性物質は、カリケアマイシン、アウリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、メイタンシノイド、クリプトフィシン、ズオカルマイシン、エスペラミシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びエンジイン抗生物質から選択される、実施の形態３４に記載の免疫複合体。

【0042】

実施の形態３６ 実施の形態１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくは複合体、又は実施の形態３４若しくは３５に記載の免疫複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【0043】

実施の形態３７ 実施の形態１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体をコードする単離された核酸。

【0044】

実施の形態３８ 実施の形態３７に記載の核酸を含むベクター。

【0045】

実施の形態３９ 実施の形態３７に記載の核酸又は実施の形態３８に記載のベクターを含む宿主細胞。

【0046】

実施の形態４０ 実施の形態１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体を発現する宿主細胞。

【0047】

実施の形態４１ 実施の形態１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体を生産する方法であって、前記ポリペプチド又は複合体の発現に適した条件下で実施の形態３８又は３９に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、方法。

【0048】

実施の形態４２ 前記ポリペプチド又は複合体を単離することを更に含む、実施の形態４１に記載の方法。

【0049】

実施の形態４３ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を増加させる方法であって、Ｔ細胞を実施の形態１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は複合体と接触させることを含む、方法。

【0050】

実施の形態４４ 前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する、実施の形態４３に記載の方法。

【0051】

実施の形態４５ 前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する、実施の形態４３に記載の方法。

【0052】

実施の形態４６ 癌を治療する方法であって、癌を伴う被験体に実施の形態１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくは複合体、又は実施の形態３６に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【0053】

実施の形態４７ 前記癌は、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病から選択される、実施の形態４６に記載の方法。

【0054】

実施の形態４８ 追加の療法剤を投与することを更に含む、実施の形態４６又は４７に記載の方法。

【0055】

実施の形態４９ 前記追加の療法剤は、抗癌剤である、実施の形態４８に記載の方法。

【0056】

実施の形態５０ 前記抗癌剤は、化学療法剤、抗癌生物製剤、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、及び腫瘍溶解性ウイルスから選択される、実施の形態４９に記載の方法。

【0057】

実施の形態５１ 前記追加の療法剤は、抗癌生物製剤である、実施の形態４８に記載の方法。

【0058】

実施の形態５２ 前記抗癌生物製剤は、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１を阻害する作用物質である、実施の形態５１に記載の方法。

【0059】

実施の形態５３ 前記抗癌生物製剤は、ＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＴＬＡ４、又はＴＩＧＩＴを阻害する作用物質である、実施の形態５１に記載の方法。

【0060】

実施の形態５４ 前記抗癌剤は、抗体である、実施の形態４９のいずれか一項に記載の方法。

【0061】

実施の形態５５ 前記抗癌生物製剤は、サイトカインである、実施の形態５１に記載の方法。

【0062】

実施の形態５６ 前記抗癌剤は、ＣＡＲ－Ｔ療法薬である、実施の形態４９に記載の方法。

【0063】

実施の形態５７ 前記抗癌剤は、腫瘍溶解性ウイルスである、実施の形態４９に記載の方法。

【0064】

実施の形態５８ 腫瘍切除及び／又は放射線療法を更に含む、実施の形態４６～５７のいずれか一項に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質としてフォーマットされたＣＤ８ａ標的化ｓｄＡｂの結合を示す図である。図１Ａは、単離ヒトＴ細胞への結合を示す。図１Ｂは、ＣＤ８ａネガティブコントロールとしてのＨＥＫ２９３ＦＳ細胞への結合を示す。

【図2】図２Ａ及び図２Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質としてフォーマットされたＣＤ８ａ標的化ｓｄＡｂの結合を示す図である。図２Ａは、単離ヒトＴ細胞への結合を示す。図２Ｂは、ＣＤ８ａネガティブコントロールとしてのＨＥＫ２９３ＦＳ細胞への結合を示す。

【図3】図３Ａ及び図３Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質としてフォーマットされたＣＤ８ａ標的化ｓｄＡｂの結合を示す図である。図３Ａは、ヒトＣＤ８ａ－ＦＬ細胞（完全長ＣＤ８ａを発現する）への結合を示す。図３Ｂは、カニクイザルＣＤ８ａ－ＦＬ細胞に対する結合を示す。

【図4】図４Ａ及び図４Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質としてフォーマットされたＣＤ８ａ標的化ｓｄＡｂの結合を示す図である。図４Ａは、単離ヒトＣＤ３＋ＣＤ４－Ｔ細胞への結合を示す。図４Ｂは、単離カニクイザルＣＤ３＋ＣＤ４－末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への結合を示す。

【図5】図５Ａ及び図５Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、融合タンパク質ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ１５ ｘＥＬＬ－Ｆｃの結合を示す図である。図５Ａは、ヒトＣＤ３＋ＣＤ４－Ｌｅｕｋｏ ２９ Ｔ細胞への結合を示す。図５Ｂは、カニクイザルＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ１６－Ｔ細胞への結合を示す。

【図6】図６Ａ～図６Ｃは、ＩＬ－２レポーター細胞上での野生型ＩＬ－２、及びＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ１５と弱毒化ＩＬ－２とを含むＣＤ８ａ標的化ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１融合タンパク質のＩＬ－２活性を示す図である。図６Ａは、ＣＤ８を発現しないレポーター細胞上でのＩＬ－２活性を示す。図６Ｂは、ＣＤ８を発現するＩＬ－２レポーター細胞上でのＩＬ－２活性を示す。図６Ｃは、ＣＤ８を発現するＩＬ－２レポーター細胞上での野生型ＩＬ－２、ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１と弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含む融合タンパク質、及び同じ突然変異を含む標的化されていない弱毒化ＩＬ－２突然変異体の活性を示す。

【図7】ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ１５と弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質の単回投与後のカニクイザルの末梢血における細胞増加を示す図である。

【図8】図８Ａ及び図８Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、ＶＨＨ－ホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質、又は弱毒化ＩＬ－２突然変異体を含むＶＨＨ－ノブインホールＦｃ融合タンパク質としてフォーマットされたＣＤ８ａ標的化ｓｄＡｂの結合を示す図である。図８Ａは、完全長ヒトＣＤ８ａ（ＣＤ８ａ－ＦＬ）でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合を示す。図８Ｂは、完全長ヒトＣＤ８ｂ（ＣＤ８ｂ－ＦＬ）でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合を示す。

【図9】図９Ａ及び図９Ｂは、フローサイトメトリーによって評価した、ＶＨＨ－ホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質、又は弱毒化ＩＬ－２突然変異体を含むＶＨＨ－ノブインホールＦｃ融合タンパク質としてフォーマットされたＣＤ８ａ標的化ｓｄＡｂの結合を示す図である。図９Ａは、ヒト全血から富化した汎Ｔ細胞内のＣＤ８ Ｔ細胞への結合を示す。図９Ｂは、ヒト全血から富化した汎Ｔ細胞内のＣＤ４ Ｔ細胞への結合の欠如を示す。

【図10】図１０Ａ～図１０Ｈは、フローサイトメトリーによって評価した、ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質としてフォーマットされたＣＤ８ａ標的化ｓｄＡｂの結合を示す図である。図１０Ａ及び図１０Ｂ並びに図１０Ｅ及び図１０Ｆは、ヒト全血から富化した汎Ｔ細胞（図１０Ａ及び図１０Ｂ）、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（図１０Ｅ及び図１０Ｆ）内のＣＤ８ Ｔ細胞（図１０Ａ及び図１０Ｄ）又はＣＤ４ Ｔ細胞（図１０Ｂ及び図１０Ｆ）への結合を示す。図１０Ｃ及び図１０Ｄ並びに図１０Ｆ～図１０Ｈは、カニクイザル全血から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内のＣＤ８ Ｔ細胞（図１０Ｃ及び図１０Ｇ）又はＣＤ４ Ｔ細胞（図１０Ｄ及び図１０Ｈ）への結合を示す。

【図11】図１１Ａ及び図１１Ｂは、ヒトドナーの末梢血内のＳＴＡＴ５シグナル伝達細胞集団を示す図である。ヒト全血から富化した汎Ｔ細胞内のＣＤ８ Ｔ細胞（図１１Ａ、図１１Ｃ）又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、図１１Ｂ）又はＣＤ４ Ｔ細胞（図１１Ｄ）におけるリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）のレベル（図１１Ａ及び図１１Ｂ）又はｐＳＴＡＴ５を発現する細胞の割合（図１１Ｃ及び図１１Ｄ）を示す。ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１又はＣＤ８ａＢ７ｖ４１と、Ｆｃ領域と、突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質；ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１とＦｃ領域とを含む融合タンパク質（ＩＬ－２なし）；標的化されていないＶＨＨと、Ｆｃ領域と、弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質；又は野生型ＩＬ－２で細胞を処理した。

【図12】図１２Ａ～図１２Ｃは、ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１と、Ｆｃ領域と、突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質；ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１とＦｃ領域とを含む融合タンパク質（ＩＬ－２なし）；標的化されていないＶＨＨと、Ｆｃ領域と、弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質；又は野生型ＩＬ－２でｅｘ ｖｉｖｏ処理した、ヒト腫瘍試料からの解離腫瘍細胞調製物（２つの頭頸部又は腎癌の症例及び１つの結腸癌の症例、図１２Ａ及び図１２Ｂ）又は健常血液ドナーからのＰＢＭＣ（図１２Ｃ）内のＣＤ８ Ｔ細胞（図１２Ａ及び図１２Ｃ）又はＣＤ４ Ｔ細胞（図１２Ｂ）の増加を示す図である。

【図13】図１３Ａ及び図１３Ｂは、カニクイザルにおけるＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ１５と、Ｆｃ領域と、突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質の単回投与（１ｍｇ／ｋｇ）の活性を示す図である。図１３Ａは、投与７日後の細胞数のベースラインに対する倍率変化として或る特定のＰＢＭＣ亜集団の増加を示す。図１３Ｂは、投与前（ベースライン）及び投与７日後のこれらの亜集団におけるＫｉ６７＋細胞のパーセンテージを示す。

【図14】図１４Ａ及び図１４Ｂは、Ａ４３１類表皮癌細胞に対する富化し、予め刺激したＣＤ８ Ｔ細胞（図１４Ａ）の細胞傷害活性又はＰＢＭＣの抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）（図１４Ｂ）を示す図である。細胞を指定のようにＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１と、Ｆｃ領域と、弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含む融合タンパク質；標的化されていないＶＨＨと、Ｆｃ領域と、弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含む融合タンパク質；又は野生型ＩＬ－２で処理した。ＣＤ８ Ｔ細胞又はＰＢＭＣは、指定の異なるエフェクター対標的細胞比（２０：１、１０：１又は５：１）で添加した。ＥＧＦＲ特異的治療用抗体セツキシマブを図１４Ｂの細胞培養に添加した。

【発明を実施するための形態】

【0066】

本明細書に示される実施形態は、ＣＤ８結合ポリペプチド、及び、例えば、癌を治療する様々な方法におけるそれらの使用に関する。

【0067】

定義及び様々な実施形態
本明細書に使用されるセクションの見出しは編成のみを目的とし、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。

【0068】

特許出願、特許公報、及びＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、各個別の参考文献が、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすと具体的かつ個別に示されているかのように、引用することにより本明細書の一部をなす。

【0069】

本明細書に記載又は参照される技術及び手順は、一般に十分に理解されており、通常、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)、PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))、Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)、Methods in Molecular Biology, Humana Press、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press、Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press、Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell eds., 1993-8) J. Wiley and Sons、Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.）、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994）、Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al. eds., 1991)、Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)、Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)、Antibodies (P. Finch, 1997)、Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)、Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)、Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)、The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)、及びCancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)並びにそれらの最新版に記載される広く利用されている方法論等の当業者による慣例的な方法論を用いて使用される。

【0070】

別段の規定がない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別段の要求がない限り、又は明白に特段の指示がない限り、単数名辞は複数を含み、複数名辞は単数を含むものとする。様々な出典又は参考文献の間での定義の矛盾については、本明細書に示される定義が優先される。

【0071】

一般に、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)でのようなＥＵインデックスの番号付けである。「ＫａｂａｔでのようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。

【0072】

本明細書に記載される本発明の実施形態は、「からなる（consisting）」実施形態及び／又は「から本質的になる（consisting essentially of）」実施形態を含むと理解される。本明細書で使用される場合に、単数形（"a", "an", and "the"）は、特段の指示がない限り複数の参照を含む。本明細書での「又は」という用語の使用は、選択肢が互いに排他的であることを意味すると解釈されない。

【0073】

本出願では、「又は」の使用は、明白に特段の指定がない限り又は当業者によって理解されない限り、「及び／又は」を意味する。多項従属請求項の文脈では、「又は」の使用は、２項以上の先行する独立請求項又は従属請求項を引用する。

【0074】

「参照試料」、「参照細胞」、又は「参照組織」という語句は、少なくとも１つの未知の特徴を有する試料との比較として使用され得る少なくとも１つの既知の特徴を有する試料を示す。幾つかの実施形態においては、参照試料は、陽性又は陰性の指標として使用され得る。参照試料を使用することで、未知の特徴を有する試料中に存在するタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルに対して、例えば、健康な組織中に存在するタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルを確立することができる。幾つかの実施形態においては、参照試料は、同じ被験体に由来するが、試験される部分とは異なる被験体の部分に由来する試料である。幾つかの実施形態においては、参照試料は、癌を取り囲む又は癌に隣接する組織領域に由来する試料である。幾つかの実施形態においては、参照試料は、試験される被験体に由来するものではなく、対象の障害（例えば、特定の癌又はＣＤ８関連障害）を有する又は有しないことが既知の被験体に由来する試料である。幾つかの実施形態においては、参照試料は、同じ被験体に由来するものであるが、被験体が癌を発症する前の時点での試料である。幾つかの実施形態においては、参照試料は、同じ被験体又は異なる被験体からの良性癌試料に由来する試料である。比較のために陰性参照試料が使用される場合に、陰性参照試料における対象の分子の発現レベル又は量は、当業者が本開示を考慮して、該分子が存在しない及び／又は低いレベルの該分子が存在することを認識するレベルを示す。比較のために陽性参照試料が使用される場合に、陽性参照試料における対象の分子の発現レベル又は量は、当業者が本開示を考慮して、或るレベルの該分子が存在することを認識するレベルを示す。

【0075】

療法剤の投与から恩恵を受ける又は療法剤の投与に応答するという文脈において本明細書で使用される「便益」、「臨床的便益」、「応答性」、及び「治療的応答性」という用語は、様々なエンドポイント、例えば、減速及び完全な停止を含む疾患進行の或る程度の抑止、疾患エピソード及び／又は症状の数の減少、病変サイズの縮小、隣接する末梢器官及び／又は末梢組織内への疾患細胞浸潤の抑止（すなわち、減少、減速、又は完全な停止）、病気蔓延の抑止（すなわち、減少、減速、又は完全な停止）、障害に関連する１つ以上の症状の或る程度の軽減、治療後の無病提示、例えば無増悪生存期間の長さの増加、全生存期間の延長、より高い奏効率、及び／又は治療後の所与の時点での死亡率の低下を評価することによって推し量ることができる。「非応答性」又は「応答しない」被験体又は癌は、「応答する」という上記の条件を満たさないものである。

【0076】

「核酸分子」、「核酸」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、区別なく使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し得る。そのようなヌクレオチドのポリマーは、天然及び／又は非天然のヌクレオチドを含み、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡを含み得る。「核酸配列」は、核酸分子又はポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの線状配列を指す。

【0077】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために区別なく使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然のアミノ酸残基を含み、限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、及び多量体を含み得る。この定義には、完全長タンパク質及びその断片の両方が含まれる。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化等を含む。さらに、本開示の目的で、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加、及び置換等の修飾（一般に性質について保存的）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであり得る、又はタンパク質を産生する宿主の突然変異若しくはＰＣＲ増幅によるエラーによるような偶発的なものであり得る。幾つかの実施形態においては、ポリペプチドは、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの「複合体」である。

【0078】

「ＣＤ８ａ」又は「ＣＤ８」という用語は、本明細書において区別なく使用され、細胞内でのＣＤ８前駆体のプロセシングから生ずるあらゆる天然の成熟ＣＤ８を指す。この用語は、特段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル又はアカゲザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源からのＣＤ８を含む。この用語はまた、スプライス変異体又はアレル変異体等のＣＤ８の天然に存在する変異体を含む。非限定的な例示的な成熟ヒトＣＤ８アミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１３６９６２７．１に示されている。配列番号１を参照されたい。

【0079】

抗原又はエピトープに「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法も当該技術分野で十分に知られている。別の細胞又は物質と反応又は会合するよりも特定の細胞又は物質とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間及び／又はより高い親和性で反応又は会合する場合に、分子は「特異的な結合」又は「優先的な結合」を示すと言及される。シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合に、標的に「特異的に結合」又は「優先的に結合」する。例えば、ＣＤ８エピトープに特異的に又は優先的に結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、他のＣＤ８エピトープ又は非ＣＤ８エピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこのエピトープに結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドである。また、この定義を解釈することにより、例えば、第１の標的に特異的又は優先的に結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドが、第２の標的に特異的又は優先的に結合し得る又は結合し得ないことも理解される。したがって、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、排他的な結合を（含み得るものの）必ずしも必要としない。一般に、必ずしもそうとは限らないが、結合への言及は優先的な結合を意味する。「特異性」は、結合性タンパク質が抗原に選択的に結合する能力を指す。

【0080】

「抑止」又は「抑止する」という用語は、任意の表現型特徴の減少若しくは停止、又はその特徴の発生率、程度、若しくは可能性の減少若しくは停止を指す。「低減する」又は「抑止する」とは、参照と比較して、活性、機能、及び／又は量を減少させる、低減する、又は停止することである。幾つかの実施形態においては、「低減する」又は「抑止する」とは、１０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態においては、「低減する」又は「抑止する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態においては、「低減する」又は「抑止する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態においては、上記の量は、或る期間にわたって、同じ期間にわたるコントロールに対して抑止又は減少される。

【0081】

本明細書で使用される場合に、「直接抑止」という用語及び類似の用語は、抗体濃度の増加が抑止の増大をもたらす抑止プロファイルを指す。幾つかの実施形態においては、或る特定の濃度の後に、最大抑止に達し、抑止プロファイルがプラトーになる。最大抑止は１００％の抑止である必要はなく、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％であってもよい。

【0082】

本明細書で使用される場合に、「エピトープ」という用語は、抗原結合分子（例えば、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチド）が結合する標的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、又は脂質等の抗原）上の部位を指す。エピトープは、しばしば、アミノ酸、ポリペプチド、又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面編成物を含み、特定の三次元構造的特徴及び特定の電荷特徴を有する。エピトープは、標的分子の連続残基及び／又は並置された非連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）の両方から形成され得る。連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）から形成されるエピトープは、通常、変性溶剤への曝露で保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、通常、変性溶剤による処理で失われる。エピトープは、限定されるものではないが、少なくとも３個、少なくとも５個、又は８個～１０個の残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）を含み得る。幾つかの実施形態においては、エピトープは、２０残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）未満、１５残基未満、又は１２残基未満の長さである。２つの抗体は、それらが抗原に対して競合的結合を示す場合に、抗原内の同じエピトープに結合し得る。幾つかの実施形態においては、エピトープは、抗原結合分子上のＣＤＲ残基との或る特定の最小距離によって特定され得る。幾つかの実施形態においては、エピトープは、上記距離によって特定され得て、抗原結合分子の残基と抗原残基との間の結合（例えば、水素結合）に関与するそれらの残基に更に限定され得る。エピトープは、様々なスキャンによっても同様に特定され得る。例えば、アラニンスキャン又はアルギニンスキャンは、抗原結合分子が相互作用し得る１つ以上の残基を示すことができる。明示的に示されない限り、エピトープとしての残基のセットは、特定の抗原結合分子に対するエピトープの一部であることから他の残基を除外するものではない。むしろ、そのようなセットの存在は、最小のエピトープの列（又は種類のセット）を示す。したがって、幾つかの実施形態においては、エピトープとして特定された残基のセットは、抗原上のエピトープについての残基の排他的リストではなく、抗原に関連する最小のエピトープを示す。

【0083】

「非線状エピトープ」又は「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子が結合する抗原性タンパク質内の非連続的なポリペプチド、アミノ酸及び／又は糖を含む。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの残基がエピトープの他の示された残基と非連続的であるが、１つ以上の残基が他の残基と連続的である場合もある。

【0084】

「線状エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子が結合する抗原性タンパク質内の連続的なポリペプチド、アミノ酸及び／又は糖を含む。幾つかの実施形態においては、線状エピトープ内の残基の全てが、抗原結合分子によって直接的に結合される（又は結合に関与する）必要があるわけではないことに留意されたい。幾つかの実施形態においては、線状エピトープは、事実上線状エピトープの配列からなるペプチドによる免疫化に由来し得る、又はタンパク質の残部から相対的に分離されたタンパク質の構造区間に由来し得る（こうして、抗原結合分子は、少なくとも主として、まさにその配列区間と相互作用し得る）。

【0085】

「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、慣例的な抗体（典型的には、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含む）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、少なくとも１つのＶＨＨドメイン及びＦｃ領域を含む）、ＶＨＨ含有ポリペプチド（少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチド）、及び所望の抗原結合活性を示す限り上述のいずれかのフラグメントを含む抗体様抗原結合ドメインを含む様々なポリペプチドを包含する。幾つかの実施形態においては、抗体は二量体化ドメインを含む。そのような二量体化ドメインとしては、限定されるものではないが、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ＣＨ１は典型的には、軽鎖定常ドメインＣＬと対をなす一方で、ヒンジは二量体化を介在する）及びＦｃ領域（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ヒンジは二量体化を介在する）が挙げられる。

【0086】

抗体という用語には、限定されるものではないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びラクダ（ラマを含む）、サメ、マウス、ヒト、カニクイザル等の様々な種の抗体も含まれる。

【0087】

本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原に結合するのに十分な抗体の部分を指す。幾つかの実施形態においては、慣例的な抗体の抗原結合ドメインは、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む。したがって、幾つかの実施形態においては、抗原結合ドメインは、ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３と、抗原への結合を維持するのに必要とされるＦＲ１及び／又はＦＲ４の任意の部分とを含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３と、抗原への結合を維持するのに必要とされるＦＲ１及び／又はＦＲ４の任意の部分とを含む軽鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態においては、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインの３つのＣＤＲを含む。したがって、幾つかの実施形態においては、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの抗原結合ドメインは、ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３と、抗原への結合を維持するのに必要とされるＦＲ１及び／又はＦＲ４の任意の部分とを含むＶＨＨドメインを含む。

【0088】

本明細書で使用される「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨドメイン」又は「ＶＨＨ抗原結合ドメイン」という用語は、ラクダ抗体又はサメ抗体等のシングルドメイン抗体の抗原結合部分を指す。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４と表される３つのＣＤＲと４つのフレームワーク領域とを含む。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨは、ＶＨＨが実質的に抗原結合及び特異性を維持する限り、部分的なＦＲ１及び／又はＦＲ４のみを含むように又はそれらのフレームワーク領域の一方若しくは両方を欠くように、Ｎ末端又はＣ末端で切断されていてもよい。

【0089】

「シングルドメイン抗体」及び「ｓｄＡｂ」という用語は、軽鎖及びＦｃ領域を有しないＶＨＨドメイン等の少なくとも１つの単量体ドメインを含む抗体を指すために、本明細書において区別なく使用される。幾つかの実施形態においては、ｓｄＡｂは、それぞれのポリペプチドが少なくとも１つのＶＨＨドメイン及びＦｃ領域を含む２つのポリペプチドの二量体である。本明細書で使用される場合に、「シングルドメイン抗体」及び「ｓｄＡｂ」という用語は、多重ＶＨＨドメインを含むポリペプチド、例えば、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃ又はＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃを有し、ここで、ＶＨＨ_１、ＶＨＨ_２、及びＶＨＨ_３が同じか又は異なる場合があるポリペプチドを包含する。

【0090】

「ＶＨＨ含有ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドを指す。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨポリペプチドは、２つ、３つ、又は４つ以上のＶＨＨドメインを含み、ここで、各ＶＨＨドメインは、同じ又は異なっていてもよい。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。幾つかのそのような実施形態においては、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、ｓｄＡｂと称され得る。さらに、幾つかのそのような実施形態においては、ＶＨＨポリペプチドは、二量体を形成し得る。ｓｄＡｂとも称されるＶＨＨ含有ポリペプチドの非限定的な構造としては、ＶＨＨ_１－Ｆｃ、ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃ、及びＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃが挙げられ、ここで、ＶＨＨ_１、ＶＨＨ_２、及びＶＨＨ_３は、同じ又は異なっていてもよい。そのような構造の幾つかの実施形態においては、或るＶＨＨは、リンカーによって別のＶＨＨに連結され得る、又は或るＶＨＨは、リンカーによってＦｃに連結され得る。幾つかのそのような実施形態においては、リンカーは、１個～２０個のアミノ酸、好ましくは、主にグリシン及び任意にセリンから構成される１個～２０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態においては、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号１１２）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１１３）、及び／又はＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１１４）を含む。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨ含有ポリペプチドがＦｃを含む場合に、それは二量体を形成する。したがって、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃは、それが二量体を形成する場合に、四価であるとみなされる（すなわち、二量体は４つのＶＨＨドメインを有する）。同様に、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃは、それが二量体を形成する場合に、六価であるとみなされる（すなわち、二量体は６つのＶＨＨドメインを有する）。

【0091】

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団の抗体（ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドを含む）を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。したがって、モノクローナル抗体の試料は、抗原上の同じエピトープに結合することができる。「モノクローナル」という修飾成句は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の性質を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る、又は米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554に記載される技術を使用して作製されたファージライブラリーから単離され得る。

【0092】

「ＣＤＲ」という用語は、少なくとも１つの当業者に対する特定様式によって定義される相補性決定領域を示す。幾つかの実施形態においては、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの組合せ、ＡｂＭ定義、及び／又は接触定義（contact definition）のいずれかに従って定義され得る。ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表される３つのＣＤＲを含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤＲは、ＡｂＭ定義に従って定義される。

【0093】

本明細書で使用される「重鎖定常領域」という用語は、少なくとも３つの重鎖定常ドメイン、すなわち、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む領域を指す。当然ながら、ドメイン内の機能を変えない欠失及び改変は、特段の指定がない限り、「重鎖定常領域」という用語の範囲内に含まれる。非限定的な例示的な重鎖定常領域としては、γ、δ、及びαが挙げられる。非限定的な例示的な重鎖定常領域としては、ε及びμも挙げられる。それぞれの重鎖定常領域は、１つの抗体アイソタイプに対応する。例えば、γ定常領域を含む抗体はＩｇＧ抗体であり、δ定常領域を含む抗体はＩｇＤ抗体であり、α定常領域を含む抗体はＩｇＡ抗体である。さらに、μ定常領域を含む抗体はＩｇＭ抗体であり、ε定常領域を含む抗体はＩｇＥ抗体である。或る特定のアイソタイプは、更にサブクラスに細分化され得る。例えば、ＩｇＧ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＧ１（γ_１定常領域を含む）抗体、ＩｇＧ２（γ_２定常領域を含む）抗体、ＩｇＧ３（γ_３定常領域を含む）抗体、及びＩｇＧ４（γ_４定常領域を含む）抗体が挙げられ、ＩｇＡ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＡ１（α_１定常領域を含む）抗体及びＩｇＡ２（α_２定常領域を含む）抗体が挙げられ、ＩｇＭ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられる。

【0094】

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖定常領域の一部を指す。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。様々な実施形態において、Ｆｃ領域がヒンジを含む場合に、ヒンジは、２つのＦｃ含有ポリペプチド間の二量体化を介在する。Ｆｃ領域は、本明細書で論じられる任意の抗体重鎖定常領域アイソタイプのものであり得る。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域がヒンジを含む場合に、ヒンジは、Ｆｃ領域と同じアイソタイプである。幾つかの実施形態においては、ＩｇＧ４ヒンジは、Ｓ２２８Ｐ安定化突然変異を含む。

【0095】

本明細書で使用される「アクセプターヒトフレームワーク」は、本明細書で論じられるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来するアクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことができる、又はアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施形態においては、アミノ酸の変化の数は、ＶＨＨ等の単一の抗原結合ドメイン内の全てのヒトフレームワークにわたって１０個未満、又は９個未満、又は８個未満、又は７個未満、又は６個未満、又は５個未満、又は４個未満、又は３個未満である。

【0096】

「親和性」は、分子（例えば、ｓｄＡｂ等の抗体又はＶＨＨ含有ポリペプチド）の単一の結合部位及びその結合相手（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の合計の強さを指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性又は見かけの親和性は、一般に、それぞれ解離定数（Ｋ_Ｄ）又はＫ_{Ｄ（見かけ）}によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されている方法を含む、当該技術分野で既知の通常の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ Ｋ_Ｄ、ＫｉｎＥｘＡ、フローサイトメトリー、及び／又は表面プラズモン共鳴デバイス等）によって測定され得る。このような方法としては、限定されるものではないが、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、Ｏｃｔｅｔ（商標）、又はフローサイトメトリーを要する方法が挙げられる。

【0097】

本明細書で使用される「Ｋ_Ｄ」という用語は、抗原結合分子／抗原相互作用の平衡解離定数を指す。本明細書で「Ｋ_Ｄ」という用語が使用される場合に、それには、Ｋ_Ｄ及びＫ_{Ｄ（見かけ）}が含まれる。

【0098】

幾つかの実施形態においては、抗原結合分子のＫ_Ｄは、フローサイトメトリーによって、抗原発現細胞系統を使用し、各抗体濃度で測定された平均蛍光を非線形１サイト結合方程式（graphpad社のＰｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にフィッティングして測定される。幾つかのそのような実施形態においては、Ｋ_ＤはＫ_{Ｄ（見かけ）}である。

【0099】

「生物学的活性」という用語は、分子の任意の１つ以上の生物学的特性（ｉｎ ｖｉｖｏで見られるように天然に存在するか、又は組換え手段によって提供される若しくは可能となるかどうか）を指す。生物学的特性としては、限定されるものではないが、リガンドの結合、細胞増殖（Ｔ細胞増殖等）の誘導又は増加、及びサイトカインの発現の誘導又は増加が挙げられる。

【0100】

「アゴニスト」抗体又は「活性化」抗体は、標的抗原の生物学的活性を増加及び／又は活性化する抗体である。幾つかの実施形態においては、アゴニスト抗体は、抗原に結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上増加させる。

【0101】

「アンタゴニスト」抗体、「ブロッキング」抗体、又は「中和」抗体は、標的抗原の生物学的活性を抑止、低下及び／又は不活性化する抗体である。幾つかの実施形態においては、中和抗体は、抗原に結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上低下させる。

【0102】

「親和性成熟」ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの抗原に対する親和性に改善をもたらす改変を有しない親ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドと比較して１つ以上のＣＤＲに１つ以上のそのような改変を有するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドを指す。

【0103】

本明細書で使用される「ヒト化ＶＨＨ」は、１つ以上のフレームワーク領域が実質的にヒトフレームワーク領域で置き換えられたＶＨＨを指す。幾つかの場合には、ヒト免疫グロブリンの或る特定のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化ＶＨＨは、当初のＶＨＨにもヒトフレームワーク配列にも見られないが、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの性能を更に改良及び最適化するために含まれる残基を含み得る。幾つかの実施形態においては、ヒト化ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、ヒトＦｃ領域を含む。理解されるように、ヒト化配列は、その一次配列によって特定され得て、必ずしも抗体が作製された過程を示すわけではない。

【0104】

「エフェクター陽性Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｆｃ受容体結合、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、並びにＢ細胞活性化等が挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせることを要し、様々なアッセイを使用して評価することができる。

【0105】

「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域としては、天然配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａアロタイプ及びＡアロタイプ）、天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域、及び天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、並びにそれらの天然に存在する変異体が挙げられる。

【0106】

「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるが、天然配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、約１個～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは、約１個～約５個のアミノ酸置換を有する。幾つかの実施形態においては、本明細書の変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、それらと少なくとも約９０％の配列同一性、それらと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。

【0107】

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載している。幾つかの実施形態においては、ＦｃγＲは、天然のヒトＦｃＲである。幾つかの実施形態においては、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体であって、これらの受容体のアレル変異体及び選択的スプライシングされた形態を含む受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは同様のアミノ酸配列を有するが、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照されたい）。ＦｃＲは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)、Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)、及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)でレビューされている。将来特定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書では「ＦｃＲ」という用語によって包含される。例えば、「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語はまた、胎児性受容体ＦｃＲｎを含み、これは、母体のＩｇＧの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）及び免疫グロブリンの恒常性の調節の役割を担う。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は既知である（例えば、Ghetie and Ward, Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)、Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)、国際公開第２００４／９２２１９号（Hintonら）を参照されたい）。

【0108】

本明細書で使用される「実質的に同様」又は「実質的に同じ」という用語は、当業者が２つ以上の値の間の差を、上記値によって測定される生物学的特徴の文脈内で生物学的意義及び／又は統計学的有意性が殆どない又は全くないとみなすような、２つ以上の数値の間の十分に高度な類似性を示す。幾つかの実施形態においては、２つ以上の実質的に同様の値は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％のいずれか１つの概数以下だけ異なる。

【0109】

ポリペプチド「変異体」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮せずに、天然配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体としては、例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で１つ以上のアミノ酸残基が付加又は欠失されているポリペプチドが挙げられる。幾つかの実施形態においては、変異体は、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態においては、変異体は、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態においては、変異体は、天然配列のポリペプチドと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0110】

本明細書で使用される場合に、ペプチド配列、ポリペプチド配列、又は抗体配列に関する「パーセント（％）のアミノ酸配列同一性」及び「ホモロジー」は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮せずに、特定のペプチド配列又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントのアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（DNASTAR社）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技能の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0111】

アミノ酸置換には、限定されるものではないが、ポリペプチド中の或るアミノ酸を別のアミノ酸により置き換えることが含まれ得る。例示的な置換を表１に示す。アミノ酸置換を対象の抗体に導入し、産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。

【0112】

【表1】

【0113】

共通の側鎖特性に従ってアミノ酸をグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0114】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。

【0115】

「ベクター」という用語は、宿主細胞内で増殖され得る、クローニングされたポリヌクレオチド（単数又は複数）を含むように操作することができるポリヌクレオチドを記載するために使用される。ベクターは、以下のエレメントのうちの１つ以上を含み得る：複製起点、対象のポリペプチドの発現を調節する１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー等）、及び／又は１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子及び比色アッセイで使用することができる遺伝子、例えば、β－ガラクトシダーゼ等）。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞において対象のポリペプチドを発現するために使用されるベクターを指す。

【0116】

「宿主細胞」は、ベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得る又はレシピエントであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。例示的な真核細胞としては、霊長類動物細胞又は非霊長類動物細胞等の哺乳動物細胞、酵母等の真菌細胞、植物細胞、及び昆虫細胞が挙げられる。非限定的な例示的な哺乳動物細胞としては、限定されるものではないが、ＮＳＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Crucell社）、並びに２９３細胞及びＣＨＯ細胞、並びにそれらの派生物、例えば２９３－６Ｅ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、及びＣＨＯ－ＤＳ細胞が挙げられる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれるが、自然突然変異、偶発突然変異、又は意図的突然変異のため、子孫は必ずしも当初の親細胞と完全に同一（形態又はゲノムＤＮＡ相補において）であるとは限らない。宿主細胞には、本明細書で提供されるポリヌクレオチド（複数の場合もある）と共にｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションされた細胞も含まれる。

【0117】

本明細書で使用される「単離された」という用語は、典型的に天然に一緒に見出される又は一緒に産生される成分の少なくとも幾つかから分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合に、「単離された」と称される。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合に、ポリペプチドを含む上清を、それを産生した細胞から物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが典型的に天然に見られるより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合に、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡ等）の一部ではない場合に、又は例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合に、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合に、「単離された」と称される。したがって、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称され得る。

【0118】

「個体」及び「被験体」という用語は、動物、例えば哺乳動物を指すために本明細書では区別なく使用される。幾つかの実施形態においては、限定されるものではないが、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物実験動物、哺乳動物家畜、哺乳動物競技用動物（sport animals）、及び哺乳動物ペットを含む哺乳動物を治療する方法が提供される。幾つかの例では、「個体」又は「被験体」は、疾患又は障害の治療を必要とする個体又は被験体を指す。幾つかの実施形態においては、治療を受ける被験体は、被験体が治療に関連する障害を有する又は障害を患う十分なリスクがあると特定されたことを表す患者であり得る。

【0119】

本明細書で使用される「疾患」又は「障害」は、治療が必要とされる及び／又は所望される状態を指す。

【0120】

「腫瘍細胞」、「癌細胞」、「癌」、「腫瘍」、及び／又は「新生物」という用語は、特段の指定がない限り、本明細書では区別なく使用され、身体器官及び系の正常な機能を妨げる制御不能な増殖及び／又は異常な細胞生存の増加及び／又はアポトーシスの阻害を示す細胞（又は複数の細胞）を指す。この定義には、良性及び悪性の癌、ポリープ、過形成、並びに潜伏腫瘍又は微小転移が含まれる。

【0121】

「癌」及び「腫瘍」という用語は、固形癌及び血液癌／リンパ腺癌を包含するとともに、異形成等の悪性腫瘍、前悪性腫瘍、及び良性腫瘍も包含する。例示的な癌としては、限定されるものではないが、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、並びにその他の癌腫及び肉腫、並びに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫等）及びメイグス症候群に関連する異常血管増殖が挙げられる。

【0122】

本明細書で使用される「非腫瘍細胞」という用語は、正常な細胞又は組織を指す。例示的な非腫瘍細胞としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、間質性腎臓細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、骨芽細胞、及び乳房、骨格筋、膵臓、胃、卵巣、小腸、胎盤、子宮、精巣、腎臓、肺、心臓、脳、肝臓、前立腺、結腸、リンパ器官、骨に位置する細胞、及び骨由来の間葉系幹細胞が挙げられる。本明細書で使用される「末梢に位置する細胞又は組織」という用語は、腫瘍細胞の近く及び／又は腫瘍微小環境内に位置しない非腫瘍細胞を指す。

【0123】

本明細書で使用される「腫瘍微小環境内の細胞又は組織」という用語は、腫瘍細胞を取り囲む及び／又は腫瘍細胞に栄養を与える細胞、分子、細胞外マトリックス及び／又は血管を指す。例示的な腫瘍微小環境内の細胞又は組織としては、限定されるものではないが、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、マクロファージ、好中球、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞が挙げられる。腫瘍細胞及び／又は腫瘍微小環境内に位置する細胞／組織を特定する方法は、本明細書で以下に記載されるように当該技術分野で十分に知られている。

【0124】

幾つかの実施形態においては、「増加」又は「減少」は、それぞれ、統計学的に有意な増加又は減少を指す。当業者に明らかであるように、「調節」はまた、試験作用物質が存在することを除き同じ条件と比較した、標的又は抗原のそのリガンド、結合相手、ホモ多量体形若しくはヘテロ多量体形へと会合する相手又は基質の１つ以上に対する親和性、アビディティー、特異性及び／又は選択性の変化（増加又は減少のいずれかであり得る）を引き起こすこと、標的又は抗原が存在する培地又は環境における１つ以上の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対する標的又は抗原の感受性の変化（増加又は減少のいずれかであり得る）を引き起こすこと、及び／又は細胞増殖若しくはサイトカイン産生を含み得る。これは、関与する標的に応じて、それ自体が既知の又は本明細書に記載される任意の適切な方法で及び／又は任意の適切なアッセイを使用して決定され得る。

【0125】

本明細書で使用される場合に、「免疫応答」は、疾患（例えば、癌又は癌転移）の発症を抑止若しくは未然防止する又はその症状を改善するのに十分である細胞性免疫応答及び／又は体液性免疫応答を包含することが意図される。「免疫応答」は、自然免疫系及び適応免疫系の両方の側面を包含し得る。

【0126】

本明細書で使用される場合に、「治療」は、有益な又は所望の臨床結果を得るための手法である。本明細書で使用される「治療」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患用の療法薬の任意の投与又は適用を対象とする。本開示の目的では、有益な又は所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の進展（例えば、転移、例えば肺又はリンパ節への転移）の未然防止又は遅延、疾患の再発の未然防止又は遅延、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善、疾患又は疾患の進行の抑止、疾患又はその進行の抑止又は減速、その発達の阻止、及び寛解（部分的でも全体的でも）のいずれか１つ以上が挙げられる。「治療」には、増殖性疾患の病理学的結果の軽減も含まれる。本明細書で提供される方法は、治療のこれらの側面のいずれか１つ以上を企図している。上記に従って、治療という用語は、障害の全ての側面を１００パーセント除去する必要はない。

【0127】

「改善」とは、療法剤を投与しない場合と比べて、１つ以上の症状が軽減又は向上することを意味する。「改善」には、症状の持続期間が短縮又は減少することも含まれる。

【0128】

「抗癌剤」という用語は、本明細書では、その最も広い意味で、１つ以上の癌の治療に使用される作用物質を指すために使用される。そのような作用物質の例示的なクラスとしては、限定されるものではないが、化学療法剤、抗癌生物製剤（サイトカイン、受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合物、及び抗体等）、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、治療用オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ等）、及び腫瘍溶解性ウイルスが挙げられる。

【0129】

「生体試料」という用語は、生きている生き物又はかつて生きていた生き物からの或る量の物質を意味する。そのような物質としては、限定されるものではないが、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節、及び脾臓が挙げられる。

【0130】

「コントロール」又は「参照」という用語は、分析物を含まないことが既知の組成物（「ネガティブコントロール」）又は分析物を含むことが既知の組成物（「ポジティブコントロール」）を指す。ポジティブコントロールは、既知の濃度の分析物を含み得る。

【0131】

本明細書で使用される場合に、「疾患の発症を遅延させる」とは、疾患（癌等）の発症を遅らせる、妨げる、減速させる、遅滞させる、安定化させる、抑制する、及び／又は引き延ばすことを意味する。この遅延は、疾患の病歴及び／又は治療される個体に応じて、様々な長さの時間となり得る。当業者に明らかであるように、十分な又は大幅な遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で未然防止を包含し得る。例えば、転移の発生等の末期癌を遅延させることができる。

【0132】

本明細書で使用される「未然防止」は、疾患の素因を有し得るが、まだ疾患と診断されていない被験体における疾患の発生又は再発に対する予防をもたらすことを含む。特段の指示がない限り、「低減する」、「抑止する」、又は「未然防止する」という用語は、全期間にわたる完全な未然防止を示すのではなく又は必要とするのではなく、測定される期間だけにわたる未然防止を示す又は必要とする。

【0133】

物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストが個体において所望の応答を誘発する能力等の要因によって変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な作用が物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の有毒作用又は有害作用を上回る量である。治療有効量は、１回以上の投与で送達され得る。治療有効量は、必要な投与量で必要な時間にわたって、所望の治療的結果及び／又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。

【0134】

「医薬製剤」及び「医薬組成物」という用語は、区別なく使用され、有効成分（複数の場合もある）の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、製剤を投与する被験体に対して許容不可能なほど有毒な追加の成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は滅菌され得る。

【0135】

「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に投与するための「医薬組成物」を一緒に含む療法剤とともに使用される当該技術分野において慣用の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、又は担体を指す。薬学的に許容可能な担体は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容可能な担体は、使用される製剤にとって適切である。

【0136】

１つ以上の更なる療法剤と「組み合わせて」の投与には、同時（併用）投与及び任意の順序での連続投与が含まれる。

【0137】

「併用して」という用語は、本明細書では、２つ以上の療法剤の投与であって、投与の少なくとも一部が時間的に重複する、又は１つの療法剤の投与が他の療法剤の投与に対して短い期間に含まれる、又は両方の療法剤の治療効果が少なくとも或る期間にわたり重複する、投与を指すために使用される。

【0138】

「連続的に」という用語は、本明細書では、２つ以上の療法剤の投与であって、時間的に重複しない、又は療法剤の治療効果が重複しない、投与を指すために使用される。

【0139】

本明細書で使用される場合に、「～と組み合わせて」は、或る治療法の施与に別の治療法を加えることを指す。したがって、「～と組み合わせて」は、或る治療法を、個体に他の治療法を施す前、その間、又はその後に施すことを指す。

【0140】

「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれる使用説明書であって、そのような治療製品の使用に関する指示、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む、使用説明書を指すために使用される。

【0141】

「製造品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患若しくは障害（例えば、癌）の治療用の医薬、又は本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するプローブを含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）又はキットである。幾つかの実施形態においては、製造物又はキットは、本明細書に記載される方法を実施するユニットとして宣伝、配送、又は販売される。

【0142】

「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、例えば、抗体又は抗原に結合されて、特異的結合ペアのメンバー間の反応（例えば、結合）を検出可能にする部分を意味する。特異的結合ペアの標識されたメンバーは、「検出可能に標識された」と称される。したがって、「標識された結合性タンパク質」という用語は、結合性タンパク質の特定をもたらす標識が組み込まれたタンパク質を指す。幾つかの実施形態においては、標識は、視覚的に又は機器的手段により検出可能なシグナルを生成し得る検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み又はマーキングされたアビジン（例えば、蛍光マーカー又は光学的方法若しくは比色法により検出され得る酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部のポリペプチドへの結合である。ポリペプチドの標識の例としては、限定されるものではないが、放射性同位体又は放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ、又は^１５３Ｓｍ）、色素原、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される予め決められたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、及びガドリニウムキレート等の磁性剤が挙げられる。イムノアッセイに通常使用される標識の代表的な例としては、光を発する部分、例えば、アクリジニウム化合物、及び蛍光を発する部分、例えば、フルオレセインが挙げられる。この点について、その部分自体は検出可能に標識されていない場合もあるが、更に別の部分と反応すると検出可能になり得る。

【0143】

例示的なＣＤ８結合ポリペプチド
アンタゴニストＣＤ８結合ポリペプチドが本明細書で提供される。様々な実施形態において、ＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８に結合する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインを含む。そのようなＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８以外の１つ以上の標的タンパク質に結合する１つ以上の付加的な抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨＨドメイン）を含んでいてもよく、及び／又はサイトカイン配列等の１つ以上の付加的なポリペプチド配列を含んでいてもよい。

【0144】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインとＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインとＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域は、生理学的条件でＣＤ８結合ポリペプチドの二量体化を介在し、こうして二量体が形成されることにより、ＣＤ８結合部位の数が２倍となる。例えば、ＣＤ８に結合する３つのＶＨＨドメインとＦｃ領域とを含むＣＤ８結合ポリペプチドは、単量体としては三価であるが、生理学的条件では、Ｆｃ領域が二量体化を介在することができ、こうしてＣＤ８結合ポリペプチドは、そのような条件下で六価の二量体として存在する。

【0145】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、少なくとも２つのＶＨＨドメインを含み、ここで、第１のＶＨＨドメインは、ＣＤ８の第１のエピトープに結合し、第２のＶＨＨドメインは、ＣＤ８の第２のエピトープに結合する。ＣＤ８結合ポリペプチドが、ＣＤ８の第１のエピトープに結合するＶＨＨドメインと、ＣＤ８の第２のエピトープに結合するＶＨＨドメインとを含む場合に、ＣＤ８結合ポリペプチドは、「二重エピトープ性」又は「二重特異性」と称され得る。

【0146】

ＣＤ８結合ポリペプチド
様々な実施形態において、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号３、配列番号７３、及び配列番号７４から選択されるＣＤＲ１配列と、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０から選択されるＣＤＲ２配列と、配列番号５、配列番号１６、及び配列番号１８から選択されるＣＤＲ３とを含む。様々な実施形態において、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１２、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１４、及び配列番号５；配列番号３、配列番号４、及び配列番号１６；配列番号３、配列番号４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号２２、及び配列番号５；配列番号３、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号２７、及び配列番号５；配列番号３、配列番号２９、及び配列番号５；配列番号３、配列番号３１、及び配列番号５；配列番号７３、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号７４、配列番号１４、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７５、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７６、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７７、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７８、及び配列番号１８；配列番号３、配列番号７９、及び配列番号１８；並びに配列番号３、配列番号８０、及び配列番号１８から選択されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む。様々な実施形態において、ＶＨＨドメインは、ヒト化されている。

【0147】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１００から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１００から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８及び配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、残基ＸＸは存在しない。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、残基ＸＸはＧｌｙ－Ｇｌｙである。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、及び配列番号９９から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、ＶＨＨドメインは、突然変異Ｋ１１７Ｄ、Ｋ１１７Ｅ、又はＫ１１７Ｒを含む。

【0148】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号３のＣＤＲ１配列と、配列番号１４のＣＤＲ２配列と、配列番号１８のＣＤＲ３とを含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号３のＣＤＲ１配列と、配列番号７８のＣＤＲ２配列と、配列番号１８のＣＤＲ３とを含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号９２又は配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。

【0149】

様々な実施形態において、ＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインを含む。

【0150】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８に結合するＶＨＨドメインはヒト化され得る。ヒト化抗体（ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチド等）は、治療分子として有用である。それというのも、ヒト化抗体は、抗体療法薬に対する免疫応答をもたらして療法薬の有効性を低下させ得る非ヒト抗体に対するヒト免疫応答を低減又は排除するからである。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態においては、ヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基の元となる抗体）からの対応する残基で置換される。

【0151】

ヒト化抗体及びその作製方法は、例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633においてレビューされており、例えば、Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329、Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033、米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、及び米国特許第７，０８７，４０９号、Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34、Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498（「リサーフェイシング（resurfacing）」を記載している）、Dall'Acqua et al., (2005) Methods 36:43-60（「ＦＲシャッフリング（FR shuffling）」を記載している）、並びにOsbourn et al., (2005) Methods 36:61-68及びKlimka et al., (2000) Br. J. Cancer, 83:252-260（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択（guided selection）」アプローチを記載している）で更に記載されている。

【0152】

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されるものではないが、「ベストフィット（best-fit）」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 :2296を参照されたい）、重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285、及びPresta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633を参照されたい）、及びＦＲライブラリーのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684、及びRosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271 :22611-22618を参照されたい）が挙げられる。典型的には、ＶＨＨのＦＲ領域をヒトＦＲ領域と置き換えることで、ヒト化ＶＨＨが作製される。幾つかの実施形態においては、ヒトＦＲの或る特定のＦＲ残基を置き換えることで、ヒト化ＶＨＨの１つ以上の特性が改善される。そのような置き換えられた残基を有するＶＨＨドメインも、本明細書では更に「ヒト化」と称される。

【0153】

様々な実施形態において、ＣＤ８結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域であるか、又はヒトＦｃ領域に由来する。

【0154】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、ＩｇＧ１ Ｅ２３３、Ｌ２３４、及びＬ２３５に対応する３つのアミノ酸欠失を下部ヒンジに含み、本明細書で「Ｆｃ ｘＥＬＬ」と称される。Ｆｃ ｘＥＬＬポリペプチドはＦｃγＲと結合しないため、「エフェクターサイレント」又は「エフェクターヌル」と称されるが、幾つかの実施形態においては、ｘＥＬＬ Ｆｃ領域はＦｃＲｎに結合するため、半減期の延長及びＦｃＲｎ媒介性リサイクリング（FcRn mediated recycling）と関連したトランスサイトーシスを伴う。

【0155】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、突然変異Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｖを含み、本明細書で「Ｆｃ－ＹＶ」と称される。幾つかの実施形態においては、そのような突然変異は、エンドソームの酸性ｐＨ（６．５近く）でＦｃＲｎへの結合を増強するのに対し、中性ｐＨ（約７．２）では検出可能な結合が失われることから、ＦｃＲｎ媒介性リサイクリングの増強及び半減期の延長が可能となる。

【0156】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、ヘテロ二量体化のために設計された突然変異を含み、本明細書において「ノブ」及び「ホール」と称される。幾つかの実施形態においては、「ノブ」Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３６６Ｗを含む。幾つかの実施形態においては、「ホール」Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。幾つかの実施形態においては、ヘテロ二量体化に使用されるＦｃ領域は、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第１のメンバー上の突然変異Ｓ３５４Ｃ等の追加の突然変異を含み、この突然変異は、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第２のメンバー上の対応する突然変異Ｙ３４９Ｃと非対称ジスルフィドを形成する。幾つかの実施形態においては、ヘテロ二量体Ｆｃペアの一方のメンバーは、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むことで、ＦｃＲｎ結合を維持しつつプロテインＡの結合を妨げる。幾つかの実施形態においては、ヘテロ二量体Ｆｃペアの一方のメンバーは、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むのに対して、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第２のメンバーは、Ｈ４３５で修飾されていない。様々な実施形態において、ホールＦｃ領域は、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むが（修飾がＨ４３５Ｒである場合に、場合によっては「ホール－Ｒ」と称される）、ノブＦｃ領域はそれを含まない。幾つかの場合には、ホール－Ｒ突然変異は、存在し得るホモ二量体ホールＦｃ領域に対するヘテロ二量体の精製を改善する。

【0157】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、Ｃ末端リジン残基を欠く（ΔＫ４４７）。

【0158】

ＣＤ８結合ポリペプチドで使用され得る非限定的な例示的なＦｃ領域としては、配列番号３２～配列番号７０、及び配列番号１０１～配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＦｃ領域が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、配列番号３３、配列番号３６～配列番号５２、配列番号６８～配列番号７０、及び配列番号１０１～配列番号１１１から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。

【0159】

ＣＤ８結合ポリペプチドの例示的な活性
様々な実施形態において、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８＋細胞を刺激する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ８＋細胞の刺激又は活性は、幾つかの実施形態においては、本明細書の実施例に示される方法を使用して決定され得る。

【0160】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、免疫細胞活性化サイトカイン、又はＣＤ８以外の抗原に結合し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する抗原結合ドメインを含む。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカイン、又はＣＤ８以外の抗原に結合する抗原結合ドメインのＣＤ８＋刺激活性は、単独で使用する場合よりも増加し、及び／又はＣＤ８結合ＶＨＨに融合した場合に、より特異的に細胞傷害性Ｔ細胞に標的化される。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカイン、又はＣＤ８以外の抗原に結合する抗原結合ドメインの毒性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的に標的化することによって減少する。

【0161】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供される免疫細胞活性化サイトカイン、又はＣＤ８以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含むＣＤ８結合ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖を増加させる。

【0162】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、本明細書で提供されるＣＤ８結合ＶＨＨと免疫細胞活性化サイトカインとを含む。幾つかのそのような実施形態において、免疫細胞活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、又はＩＦＮγである。幾つかのそのような実施形態において、免疫細胞活性化サイトカインは、野生型免疫細胞活性化サイトカインである。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカインは、野生型サイトカインの活性と比べて免疫細胞活性化サイトカインの活性を弱める突然変異を含む。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカインを含むＣＤ８結合ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び増殖を刺激する。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカインを含むＣＤ８結合ポリペプチドは、癌を治療する方法に使用される。

【0163】

活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の増加は、例えば、本明細書の実施例に示される方法等の当該技術分野における任意の方法によって決定され得る。非限定的な例示的なアッセイは以下の通りである。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を１人以上の健康なヒトドナーから分離することができる。Ｔ細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色し、抗ＣＤ３抗体で活性化し、本明細書で提供されるポリペプチドと接触させた後に、ＦＡＣＳで分析する。ＣＴＶ染色の喪失は増殖を示す。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の増加は、例えば、異なる健康なヒトドナーから分離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を測定することによって、一連の実験又はプールされたＴ細胞からの平均として決定される。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の増加は、少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なる健康なドナーからのＴ細胞を使用して実施される実験からの、又は少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なる健康なドナーからのＴ細胞のプールからの平均として決定される。

【0164】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８結合ＶＨＨと、ＣＤ８以外の抗原に結合する抗原結合ドメインとを含む。幾つかのそのような実施形態において、抗原は、Ｌａｇ３、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤＬ１、又はＴＩＭ３である。幾つかの実施形態において、抗原は、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、α４インテグリン、αＶインテグリン、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、補体Ｃ５、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、クローディン３、クローディン４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体α（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＲＰ７８、ＨＡＶＣＡＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｎｏｔｃｈ ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦβ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ＴＲＯＰ－２、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、又はＷＩＳＰ－３である。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８結合ＶＨＨと、腫瘍細胞抗原に結合する抗原結合ドメインとを含む。

【0165】

ポリペプチドの発現及び産生
ＣＤ８結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子が提供される。幾つかの実施形態において、核酸分子はまた、ＣＤ８結合ポリペプチドの分泌を指示するリーダー配列もコードすることができ、そのリーダー配列は、典型的には、これが分泌されたポリペプチド中に存在しないように切断される。リーダー配列は、天然の重鎖（又はＶＨＨ）リーダー配列であり得る、又は別の異種リーダー配列であり得る。

【0166】

核酸分子は、当該技術分野で慣用の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。幾つかの実施形態においては、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクターである。

【0167】

本明細書に記載されるＣＤ８結合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターが提供される。そのようなベクターとしては、限定されるものではないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ＣＨＯ細胞若しくはＣＨＯ由来細胞等の所望の細胞型、又はＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現のために最適化されたベクターが選択される。例示的なそのようなベクターは、例えば、Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004)に記載されている。

【0168】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、細菌細胞等の原核細胞において、又は真菌細胞（酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞等の真核細胞において発現され得る。そのような発現は、例えば、当該技術分野で既知の手順に従って実施され得る。ポリペプチドの発現に使用され得る例示的な真核細胞としては、限定されるものではないが、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞、２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞及びＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Crucell社）、並びにＮＳＯ細胞が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、酵母において発現され得る。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２７００４５号を参照されたい。幾つかの実施形態においては、特定の真核宿主細胞は、ポリペプチドに対して所望の翻訳後修飾を行うその能力に基づいて選択される。例えば、幾つかの実施形態においては、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞で産生される同じポリペプチドよりも高レベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。

【0169】

所望の宿主細胞への１つ以上の核酸（ベクター等）の導入は、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等を含むあらゆる方法によって達成され得る。非限定的な例示的な方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一過的又は安定的にトランスフェクションされ得る。

【0170】

本明細書に記載される核酸又はベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供される。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されるＣＤ８結合ポリペプチドを発現する宿主細胞が提供される。宿主細胞で発現されたＣＤ８結合ポリペプチドは、任意の適切な方法によって精製され得る。そのような方法としては、限定されるものではないが、親和性マトリックス又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が挙げられる。適切なアフィニティーリガンドとしては、ＲＯＲ１ ＥＣＤ及びＦｃ領域に結合する作用物質が挙げられる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又は抗体アフィニティーカラムを使用して、Ｆｃ領域に結合することで、Ｆｃ領域を含むＣＤ８結合ポリペプチドを精製することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルカラム又はフェニルカラムもまた、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー）もまた、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。混合モードクロマトグラフィー（例えば、逆相／陰イオン交換、逆相／陽イオン交換、親水性相互作用／陰イオン交換、親水性相互作用／陽イオン交換等）も、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当該技術分野で知られている。

【0171】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、無細胞系において産生される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009)、Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004)、Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)に記載されている。

【0172】

幾つかの実施形態においては、上記の方法によって作製されたＣＤ８結合ポリペプチドが提供される。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、宿主細胞において作製される。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、無細胞系において作製される。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは精製される。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドを含む細胞培養培地が提供される。

【0173】

幾つかの実施形態においては、上記の方法によって作製された抗体を含む組成物が提供される。幾つかの実施形態においては、該組成物は、宿主細胞において作製されたＣＤ８結合ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態においては、該組成物は、無細胞系において作製されたＣＤ８結合ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態においては、該組成物は、精製されたＣＤ８結合ポリペプチドを含む。

【0174】

ＣＤ８結合ポリペプチドを使用して疾患を治療する例示的な方法
幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドを投与することを含む、個体における疾患を治療する方法が提供される。このような疾患としては、Ｔ細胞、例えばＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖及び活性化の増加から恩恵を受けるあらゆる疾患が挙げられる。幾つかの実施形態においては、個体における癌を治療する方法が提供される。幾つかの実施形態においては、癌を治療する方法は、ＣＤ８結合ＶＨＨと、免疫細胞活性化サイトカイン、又はＣＤ８以外の腫瘍細胞抗原に結合する抗原結合ドメインとを含むＣＤ８結合ポリペプチドを投与することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化を増加させることを含む。

【0175】

上記方法は、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドを有効量、個体に投与することを含む。そのような治療方法は、ヒト又は動物における治療方法であり得る。幾つかの実施形態においては、ヒトを治療する方法が提供される。本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドを使用して治療することができる非限定的な例示的な癌としては、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、並びに外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病が挙げられる。

【0176】

ＣＤ８結合ポリペプチドは、必要に応じて被験体に投与され得る。投与の頻度の決定は、治療される病態、治療される被験体の年齢、治療される病態の重症度、治療される被験体の全般的健康状態等の考慮に基づいて、主治医等の当業者によって行われ得る。幾つかの実施形態においては、有効用量のＣＤ８結合ポリペプチドが被験体に１回以上投与される。幾つかの実施形態においては、有効用量のＣＤ８結合ポリペプチドが、被験体に毎日、週に２回、毎週、２週間ごとに、月に１回等で投与される。有効用量のＣＤ８結合ポリペプチドが被験体に少なくとも１回投与される。幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドの有効用量は、少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年間にわたる複数回を含む複数回で投与され得る。

【0177】

幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、癌を治療する（癌の予防を含む）及び／又はＴ細胞増殖を増加させるのに有効な量で投与される。治療有効量は、典型的には、治療される被験体の体重、その被験体の身体的状態若しくは健康状態、治療される病態の広範さ、又は治療される被験体の年齢に依存する。一般に、抗体は、用量当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。

【0178】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドは、限定されるものではないが、静脈内、動脈内、非経口、腹腔内、又は皮下を含む様々な経路によってｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。意図される用途に応じて、適切な製剤及び投与経路を選択することができる。

【0179】

幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドを使用する治療的処置は、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化を増加させることによって、及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を癌細胞に接触させることによって達成される。幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化の増加は、癌の成長を抑止する。

【0180】

医薬組成物
幾つかの実施形態においては、ＣＤ８結合ポリペプチドを含む組成物は、多種多様な薬学的に許容可能な担体を含む製剤で提供される（例えば、Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003)、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004)、Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed., Pharmaceutical Press (2000)を参照されたい）。賦形剤、アジュバント、及び希釈剤を含む様々な薬学的に許容可能な担体が利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤等の様々な薬学的に許容可能な補助物質も利用可能である。非限定的な例示的な担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せが挙げられる。

【0181】

幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＣＤ８結合ポリペプチドを含む。

【0182】

併用療法
ＣＤ８結合ポリペプチドは、単独で又は他の抗癌剤等の他の治療方式と組み合わせて投与され得る。ＣＤ８結合ポリペプチドは、他の治療方式の前、実質的にそれと同時に、又はその後に供給され得る（すなわち、同時に又は連続的に）。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される治療方法は、放射線療法、化学療法、ワクチン接種、標的腫瘍療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、癌免疫療法、サイトカイン療法、外科的切除、クロマチン修飾、切除、冷却療法、腫瘍標的に対するアンチセンス剤、腫瘍標的に対するｓｉＲＮＡ剤、腫瘍標的に対するマイクロＲＮＡ剤若しくは抗癌剤／抗腫瘍剤、又は抗体、サイトカイン若しくは受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合物等の生物製剤を施すことを更に含み得る。

【0183】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、第２の療法剤、例えば、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１療法薬と同時に与えられる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法薬の例としては、ニボルマブ（BMS）、ピディリズマブ（CureTech、ＣＴ－０１１）、ペンブロリズマブ（Merck）、デュルバルマブ（Medimmune/AstraZeneca）、アテゾリズマブ（Genentech/Roche）、アベルマブ（Pfizer）、ＡＭＰ－２２４（Amplimmune）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＡＭＰ－５１４（Amplimmune）、ＭＤＸ－１１０５（Merck）、ＴＳＲ－０４２（Tesaro/AnaptysBio、ＡＮＢ－０１１）、ＳＴＩ－Ａ１０１０（Sorrento Therapeutics）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Sorrento Therapeutics）、及びプログラム死－１（ＰＤ－１）又はプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に対する他の作用物質が挙げられる。

【0184】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、免疫刺激剤、例えば腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバー又はＢ７ファミリーのメンバーのアゴニストと同時に与えられる。免疫刺激性ＴＮＦＲＳＦメンバーの非限定的な例としては、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＣＤ２７、及びＨＶＥＭが挙げられる。Ｂ７ファミリーメンバーの非限定的な例としては、ＣＤ２８及びＩＣＯＳが挙げられる。したがって、幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＣＤ２８、及び／又はＩＣＯＳのアゴニスト、例えばアゴニスト抗体と同時に与えられる。

【0185】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＡＲ－Ｔ（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）療法薬、腫瘍溶解性ウイルス療法薬、サイトカイン療法薬、及び／又はＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ等の他のチェックポイント分子を標的とする作用物質と同時に与えられる。

【0186】

診断及び治療の非限定的な例示的な方法
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、被験体及び／又は被験体（例えば、癌患者）からの検体を評価するのに有用である。幾つかの実施形態においては、評価は、診断、予後診断、及び／又は治療への奏効のうちの１つ以上である。

【0187】

幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、タンパク質の存在、非存在、又はレベルを評価することを含む。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、核酸の存在、非存在、又は発現のレベルを評価することを含む。これらの測定に本明細書に記載される組成物を使用することができる。例えば、幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、腫瘍の検体又は腫瘍から培養された細胞を、本明細書に記載される療法剤と接触させることを含む。

【0188】

幾つかの実施形態においては、評価により、治療（本明細書に記載される抗体による治療を含む）が指示され得る。幾つかの実施形態においては、評価により、切除後の補助療法を使用する又は差し控えることが指示され得る。補助治療とも呼ばれる補助療法は、一次治療、主治療、又は初回治療に加えてなされる治療である。非限定的な例として、補助療法は、全ての検出可能な疾患が取り除かれたが、潜在疾患のため再燃の統計的リスクが残っている場合に、通常は手術後になされる追加の治療であり得る。幾つかの実施形態においては、上記抗体は、癌の治療における補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態においては、上記抗体は、癌の治療における単独補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される抗体は、癌の治療における補助療法薬としては差し控えられる。例えば、患者が本明細書に記載される抗体に応答する可能性が低い又は最小限の応答しか有しない場合に、生活の質のために、及び無効な化学療法による不必要な毒性を避けるために、治療を施さなくてもよい。このような場合に、緩和ケアが使用される場合がある。

【0189】

幾つかの実施形態においては、切除前に術前補助療法薬として上記分子が投与される。幾つかの実施形態においては、術前補助療法薬は、任意の手術の前に腫瘍を縮小及び／又はダウングレードする療法薬を指す。幾つかの実施形態においては、術前補助療法薬は、手術前に癌患者に投与される化学療法薬を意味する。幾つかの実施形態においては、術前補助療法薬は、手術前に癌患者に投与される抗体を意味する。術前補助化学療法薬が通常考慮される癌型としては、例えば、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、及び肺癌が挙げられる。幾つかの実施形態においては、上記抗体は、癌の治療における術前補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態においては、その使用は切除前である。

【0190】

幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法で企図される腫瘍微小環境は、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、好中球、及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞の１つ以上である。

【0191】

キット
本明細書に記載されるＣＤ８結合ポリペプチドのいずれか及び適切な包装を含む製造品及びキットも提供される。幾つかの実施形態においては、本発明は、（ｉ）ＣＤ８結合ポリペプチドと、（ｉｉ）該キットを使用してＣＤ８結合ポリペプチドを個体に投与するための使用説明書とを備えるキットを含む。

【0192】

本明細書に記載される組成物に適切な包装は、当該技術分野で知られており、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、広口瓶、フレキシブルな包装（例えば、密封マイラー又はプラスチックバッグ）等が含まれる。これらの製造品は、更に滅菌及び／又は密封され得る。本明細書に記載される組成物を含む単位剤形も提供される。これらの単位剤形は、単回又は多回単位剤形で適切な包装内で保存され得て、更に滅菌及び密封もされ得る。本発明のキットに提供される使用説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた指示であるが、機械可読の指示（例えば、磁気記憶ディスク又は光学記憶ディスクに保持された指示）も許容可能である。抗体の使用に関する使用説明書は一般に、意図された治療又は工業的使用のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。キットは、個々の適切な治療を選択することの説明を更に含み得る。

【0193】

容器は、単位用量、バルク包装（例えば、多回用量包装）又はサブユニット用量であり得る。例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月以上のいずれかの概数の期間等の長期間にわたって個体に効果的な治療をもたらすのに十分な用量の本明細書に開示される分子を含むキットも提供され得る。キットはまた、多回単位用量の分子及び使用説明書を含むことができ、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局での保存及び使用に十分な量で包装され得る。幾つかの実施形態においては、キットは、再構成、再懸濁、又は再水和することで、一般的に抗体の安定な水性懸濁液を形成することができる乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を含む。

【実施例】

【0194】

以下で論じられる実施例は、本発明を純粋に例示することが意図され、決して本発明を限定するとみなされるべきではない。これらの実施例は、以下の実験が、実施された全て又は唯一の実験であることを表すとは意図されない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、幾らかの実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。特段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか又は近大気圧である。

【0195】

実施例１：ＣＤ８ａ結合ＶＨＨドメインの開発
ヒトＣＤ８ａを標的とするシングルドメイン抗体を、ラマＦｃに融合したヒトＣＤ８ａの細胞外ドメイン（配列番号７２）でラマを免疫化することによって生成した。特異的な抗ＣＤ８ａ抗体価の発現後に、ラマ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を免疫化動物の血液５００ｍＬから単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いて全ｍＲＮＡを単離し、続いてＴｈｅｒｍｏ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びオリゴｄＴプライミングを用いてファーストストランドｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲによってＶＨＨ配列を特異的に増幅し、ＶＨＨ－Ｆｃ－ＡＧＡ２融合タンパク質として酵母表面提示ベクターにクローニングした。ＦｃはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号３２）、又は場合によっては、エフェクター機能が低下した変異体ＩｇＧ１ Ｆｃであった（例えば、Ｆｃ ｘＥＬＬ；配列番号３３）。

【0196】

ＶＨＨ－Ｆｃ－ＡＧＡ２融合タンパク質を提示する酵母ライブラリーを、磁気ビーズ単離に続く蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、ＣＤ８ａ ＥＣＤの組換え型を用いて富化した。選別された酵母をプレートアウトし、単離したコロニーを９６ウェルブロックに採取し、表面提示されたＶＨＨ－Ｆｃからの発現を培地への分泌に切り替える培地中で成長させた。９６ウェルの酵母分泌培養物からの上清を、ＣＤ８ａで一過的にトランスフェクションした２９３Ｆ細胞（ＣＤ８ａ陽性）又はトランスフェクションしていない２９３Ｆ細胞（ＣＤ８ａ陰性）に適用し、洗浄し、フルオロフォア標識抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ二次抗体で処理し、９６ウェルフローサイトメトリーによって分析した。

【0197】

ＣＤ８ａ陽性細胞に結合し、ＣＤ８ａ陰性細胞に結合しないＶＨＨをコードする核酸配列を、ヒトＦｃ ｘＥＬＬコード領域とインフレームで哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ポリエチレンイミンを用いたＨＥＫ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（２９３Ｆ細胞）又はＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクションにより発現させた。３日～７日後に上清を回収し、分泌された組換えタンパク質をプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、２８０ｎｍでの吸光度及び吸光係数から濃度を算出した。

【0198】

ＣＤ８ａに結合する１つのＶＨＨドメイン（クローンＢ７）をヒト化した。簡潔に述べると、ヒト重鎖フレームワークをベースとしてＢ７の様々なヒト化型を作製した。或る特定のアミノ酸をドナーアミノ酸へと復帰突然変異させ、或る特定の突然変異を、例えばその結合特性についてＣＤＲにおいて試験した。Ｂ７のアミノ酸配列及び様々なヒト化された形態は、以下に提示される或る特定の配列の表に示される。Ｂ７ ＶＨＨ（配列番号２）及びヒト化型ｈｚＢ７ｖ１～ｈｚＢ７ｖ１８（配列番号６～配列番号３０）の配列が、Ｃ末端に任意のＧｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧ）リンカー（或る特定の配列の表においてＸＸで表される）を含み得ることに留意されたい。加えて、開示されるＶＨＨドメインのいずれかの残基１１７（Ｋ１１７）のリジンがアスパラギン酸（Ｋ１１７Ｄ）、グルタミン酸（Ｋ１１７Ｅ）、又はアルギニン（Ｋ１１７Ｒ）で置換されていてもよいことが示される。ｈｚＢ７ｖ４１と命名されたヒト化ＶＨＨ（配列番号１００）は、Ｋ１１７Ｒ置換を含む（或る特定の配列の表において太字及び下線で示す）。

【0199】

ＣＤ８ａ ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－ＦｃとしてフォーマットされたＣＤ８ａ結合ポリペプチドの結合を、単離ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞でフローサイトメトリーによって評価した。単離Ｔ細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）中、１ウェル当たり３００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。トランスフェクションしていないＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＣＤ８ａネガティブコントロールとして使用し、別のプレートに１ウェル当たり３００００個の細胞でプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度１０００ｎＭの２倍に希釈し、３倍、４倍、及び５倍の段階希釈を行った。ポリペプチドを含まないＦＡＣＳバッファーを二次抗体のみのコントロールとして使用した。ポリペプチド希釈物を等容量の細胞に添加し、アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、結合を検出するために２０００倍希釈した蛍光標識抗ヒトＦｃ抗体と、対比染色として１００倍希釈した蛍光標識抗ＣＤ４抗体（クローンＯＫＴ４）とを含むＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁した。アッセイプレートを４℃で２０分間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで更に１回洗浄した後、結合したポリペプチドをＣＤ４－細胞でフローサイトメトリーによって検出した。ＣＤ８ａ結合は、この集団において６４７ｎｍでの蛍光中央値として測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。フローサイトメトリー検出は、IntellicytのｉＱｕｅ Ｐｌｕｓで行った。得られた最大結合（Ｂｍａｘ）値及び結合親和性（Ｋ_ｄ）を表２及び表３に示し、結合曲線を図１Ａ及び図１Ｂ並びに図２Ａ及び図２Ｂに示す。より高いＢｍａｘ値は、一般により遅いオフレートを示し、同様に、より低いＢｍａｘ値は、より速いオフレートを示す。

【0200】

【表2】

【0201】

【表3】

【0202】

図１Ａ及び図２Ａ、並びに上記の表に示されるように、試験したＣＤ８結合ポリペプチドは０．２ｎＭ未満、殆どの場合は０．１ｎＭ未満の親和性でヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に結合した。図１Ｂ及び図２Ｂに示されるように、親Ｂ７－ｘＥＬＬ－Ｆｃを除く全ての試験したポリペプチドが、２９３コントロール細胞に対して有意な結合を示さず、Ｂ７－ｘＥＬＬ－Ｆｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合と比較して２０００倍超低い親和性でコントロール細胞に結合した。これらの結果から、ＣＤ８ａ結合ポリペプチドがＣＤ８に特異的に結合することが実証された。

【0203】

実施例２：ヒト及びカニクイザルＣＤ８へのＣＤ８結合ポリペプチドの結合
上記の親ポリペプチド及び２つのヒト化ＣＤ８ａ結合ポリペプチドの結合を、トランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞でフローサイトメトリーによって評価した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、完全長ヒト又はカニクイザルＣＤ８ａに続いてＩＲＥＳ及びＧＦＰをコードするプラスミドで一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）中、１ウェル当たり３００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度５００ｎＭの２倍に希釈し、３倍、４倍、及び５倍の段階希釈を行った。ポリペプチドを含まないＦＡＣＳバッファーを二次抗体のみのコントロールとして使用した。試験ポリペプチドを等容量の細胞に添加し、アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、２０００倍希釈した蛍光標識抗ヒトＦｃ抗体を含むＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁した。アッセイプレートを４℃で２０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで更に１回洗浄した後、結合したポリペプチドをフローサイトメトリーによって検出した。フローサイトメトリー検出は、IntellicytのｉＱｕｅ Ｐｌｕｓで行った。ＣＤ８ａ発現トランスフェクション細胞をＧＦＰ陽性としてゲーティングし、ポリペプチド結合を６４７ｎｍでの蛍光中央値として測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。結果を表４及び表５、並びに図３Ａ及び図３Ｂに示す。

【0204】

【表4】

【0205】

【表5】

【0206】

図３Ａ及び表４に示されるように、試験したＣＤ８結合ポリペプチドは、ヒトＣＤ８ａを発現するトランスフェクションＨＥＫ２９３Ｆ細胞に０．６ｎＭ未満の親和性で結合した。図３Ｂ及び表５に示されるように、試験したＣＤ８結合ポリペプチドは、カニクイザルＣＤ８ａを発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞に０．１ｎＭ未満の親和性で結合した。

【0207】

実施例３：ＣＤ８結合ポリペプチドは、ヒト及びカニクイザル免疫細胞に結合する
上記の親ポリペプチド及び２つのヒト化ＣＤ８ａ結合ポリペプチドの結合を、単離ヒトＴ細胞及び単離カニクイザルＰＢＭＣでフローサイトメトリーによって評価した。単離細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）中、カニクイザルＰＢＭＣについては１ウェル当たり２０００００個の細胞、ヒトＴ細胞については１ウェル当たり５００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度２５０ｎＭの２倍に希釈し、４倍の段階希釈を行った。ＦＡＣＳバッファー単独を二次抗体のみのコントロールとして使用した。ポリペプチド希釈物を等容量の細胞に添加し、アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＣＤ８ａ結合を検出するために１０００倍希釈した蛍光標識抗ヒト抗体、及び４０倍希釈した蛍光標識抗ＣＤ３抗体（クローンＳＰ３４．２）、及び１００倍希釈した抗ＣＤ４抗体（クローンＯＫＴ４）を含むＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁した。アッセイプレートを４℃で２０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで更に１回洗浄した後、ＣＤ８ａ結合をＣＤ３＋ＣＤ４－細胞でフローサイトメトリーによって検出した。結合は、これらの細胞集団において６４７ｎｍでの平均蛍光として測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。フローサイトメトリー検出は、ACEA BiosciencesのＮｏｖｏｃｙｔｅ－Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターで行った。結果を表６及び表７、並びに図４Ａ及び図４Ｂに示す。

【0208】

【表6】

【0209】

【表7】

【0210】

図４Ａ及び表６に示されるように、試験したＣＤ８結合ポリペプチドは、ヒトＣＤ３＋ＣＤ４－Ｔ細胞に０．１ｎＭ未満の親和性で結合した。図４Ｂ及び表７に示されるように、試験したＣＤ８結合ポリペプチドは、カニクイザルＣＤ３＋ＣＤ４－細胞に０．０８ｎＭ未満の親和性で結合した。

【0211】

ＣＤ８ａ結合ポリペプチドｈｚＢ７ｖ１５－ｘＥＬＬ－Ｆｃの結合を、ヒトｌｅｕｋｏｐａｋ Ｔ細胞及びカニクイザルＰＢＭＣでフローサイトメトリーによって評価した。ｌｅｕｋｏｐａｋ Ｔ細胞をＣＴＬ ａｎｔｉ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｗａｓｈ解凍液で解凍し、９６ウェルＵ型底アッセイプレートにプレーティングした。細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。ｈｚＢ７ｖ１５－ｘＥＬＬ－Ｆｃを２００ｎＭの初期濃度から１０ウェルにわたって３倍段階希釈した。ＦＡＣＳバッファーを非結合コントロールとして使用し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。アッセイプレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を１回洗浄し、染色パネル（抗ＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３－ＢＶ６０５（１：２００）、抗ＣＤ４抗体クローンＯＫＴ４－ＢＶ７８５（１：２００）、及び蛍光標識抗ヒトＦｃ抗体（１：５００））に４℃で３０分間再懸濁した。アッセイプレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、７０μＬのＦＡＣＳバッファーで再懸濁して、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターで読み取った。結果を下記表８及び図５Ａに示す。

【0212】

カニクイザルＰＢＭＣをＣＴＬ ａｎｔｉ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｗａｓｈ解凍液で解凍し、９６ウェルＵ型底アッセイプレートに１ウェル当たり５０００００個の細胞でプレーティングした。細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７化学標識ｈｚＢ７ｖ１５－ｘＥＬＬ－Ｆｃ（ＡＦ６４７－ｈｚＢ７ｖ１５－ｘＥＬＬ－Ｆｃ）を３０ｎＭの初期アッセイ濃度から１０ウェルにわたって３倍段階希釈した。ＦＡＣＳバッファーを非結合コントロールとして使用し、プレートを４℃で２０分間インキュベートした。アッセイプレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を１５０μＬのＰＢＳバッファーで洗浄し、４０μＬのＦＡＣＳバッファーで再懸濁し、ＦＡＣＳバッファー中の１０μＬのＢＶ染色バッファー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｐｌｕｓ；BD Biosciences）、及び５０μＬの抗体混合物（抗ＣＤ３抗体クローンＳＰ３４－ＢＶ４２１（１：２５）、抗ＣＤ４抗体クローンＯＫＴ４－ＢＶ７８５（１：１００）、及び抗ＣＤ１６抗体クローン３Ｇ８－ＰＥ（１：１００））を細胞に添加した。細胞を４℃で２０分間染色した。アッセイプレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、７０μＬのＦＡＣＳバッファーで再懸濁して、Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターで読み取った。結果を下記表９及び図５Ｂに示す。

【0213】

【表8】

【0214】

【表9】

【0215】

図５Ａ及び表８に示されるように、ｈｚＢ７ｖ１５－ｘＥＬＬ－Ｆｃは、ヒトＣＤ３＋ＣＤ４－Ｔ細胞に０．１ｎＭ未満の親和性で結合した。図５Ｂ及び表９に示されるように、ｈｚＢ７ｖ１５－ｘＥＬＬ－Ｆｃは、カニクイザルＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ１６－細胞に０．０６ｎＭ未満の親和性で結合した。

【0216】

実施例４：弱毒化ＩＬ－２のＣＤ８ａ標的化は、活性を回復させる
ＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ１５又はＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１ドメインと、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドのＣＤ８ａ標的化ＩＬ－２活性をＩＬ－２レポーター細胞において評価した。融合タンパク質は二量体であり、ノブＦｃ領域に融合したＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ１５ドメイン又はＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１ドメインと、弱毒化ＩＬ－２と、ホールＦｃ領域に融合したＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ１５ドメイン又はＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１ドメインとを含んでいた。したがって、二量体融合タンパク質は、２つのＣＤ８ａ結合ＶＨＨドメイン、２つのＦｃ領域、及び１つの弱毒化ＩＬ－２を含んでいた。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ２レポーター細胞又はＣＤ８ａ発現ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ２レポーター細胞を分離し、５０ｍＬコニカルチューブに移し、４００×ｇで５分間ペレット化し、新鮮な予め温めたアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋４．５ｇ／Ｌグルコース、２ｍＭ Ｌ－グルタミン＋１０％熱不活性化ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００μｇ／ｍＬ ｎｏｒｍｏｃｉｎ）に０．５×１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ポリペプチド希釈系列をアッセイ培地中で最終濃度の２倍に調製し、１ウェル当たり１００μＬ添加した。１００μＬ中５００００個の細胞を平底９６ウェル組織培養処理プレートの各ウェルに添加した。プレートをＣＯ_２インキュベーターにて３７℃で２０時間インキュベートした。Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液を製造業者の指示に従って調製した（水に再懸濁し、水浴内で３０分間かけて３７℃に温める）。アッセイプレートを４００×ｇで５分間遠沈した。１００μＬの上清を新たな平底９６ウェル組織培養プレートに移し、１００μＬ／ウェルのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液を添加し、５％ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃で１時間～２時間インキュベートした。吸光度をＥＭａｘプレートリーダーにて６５０ｎｍで読み取った。

【0217】

図６Ａに示されるように、弱毒化ＩＬ－２を含むＣＤ８ａ標的化ポリペプチドは、ＣＤ８ａを発現しない細胞で、標的化されていないＶＨＨドメインと野生型ＩＬ－２とを含むポリペプチドよりも有意に低い活性を示した。図６Ｂ及び図６Ｃに示されるように、ＣＤ８ａを発現する細胞においては、ＣＤ８ａ結合ＶＨＨと弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドは、標的化されていないＶＨＨドメインと野生型ＩＬ－２とを含むポリペプチドと同様に、強いＩＬ－２活性を示した。標的化されていないＶＨＨドメインと弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドは、ＣＤ８ａ発現レポーター細胞で有意に低い活性を示した。これらの結果から、このレポーターアッセイにおいては、およそ０．０１ｎＭ～１ｎＭの広い濃度範囲でＩＬ－２活性をＣＤ８ａ発現細胞に特異的に標的化し得ることが示される。

【0218】

実施例５：ＣＤ８ａ結合ＶＨＨと弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドによって誘導されるＴ細胞増殖
ＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ１５のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２を含む融合タンパク質のＣＤ８＋Ｔ細胞増加に対する影響を非ヒト霊長類において試験した。カニクイザルに０．３ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質を静脈内ボーラス注射した。融合タンパク質投与の前及び７日後に研究動物から全血試料を採取した。各時点の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）にて密度遠心分離を用いて単離し、細胞を蛍光標識細胞型特異的抗体の組合せで染色した。Ｔ細胞は、ＣＤ４又はＣＤ８ａを発現し、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０を発現しないＣＤ３＋細胞として分類された。制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）は、ＣＤ２５も発現し、ＣＤ１２７のレベルが低下したＣＤ４＋Ｔ細胞として定義された。ＣＤ４＋通常Ｔ細胞（「ＣＤ４＋Ｔｃｏｎ」）は、ＣＤ２５を発現せず、正常レベルのＣＤ１２７を有するＣＤ４＋Ｔ細胞として定義された。ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａを発現する非Ｔ及び非Ｂ細胞として定義された。ＣＤ２０陽性染色集団は、Ｂ細胞として分類された。各ＰＢＭＣ亜集団の絶対細胞数を、フローサイトメトリーを用いて決定し、投与７日後の絶対細胞数を投与前のベースライン数で除算することによって倍率増加を算出した。

【0219】

図７に示されるように、０．３ｍｇ／ｋｇのＣＤ８標的化弱毒化ＩＬ－２の単回投与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の５．６倍の増加及びＮＫ細胞の２．８倍の増加をもたらしたが、Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋通常Ｔ細胞、及びＢ細胞を含むＣＤ８－細胞集団には有意な影響を及ぼさなかった。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加は、Ｔ細胞全体の３．２倍の増加をもたらし、全ＰＢＭＣ数は、投与前の細胞数より２．７倍増加した。これらのデータから、ＣＤ８ａ標的化弱毒化ＩＬ－２がｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８＋細胞集団の細胞増殖を特異的に誘導することが示される。

【0220】

実施例６：２９３Ｆ細胞上に発現されたヒトＣＤ８鎖へのＣＤ８ａ結合ポリペプチドの結合
ヒト化ＣＤ８ａ結合ＶＨＨドメインと、Ｆｃ領域と、或る特定のポリペプチドにおいては、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した突然変異型弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドの結合を、ヒトＣＤ８ａ鎖又はＣＤ８ｂ鎖をコードするプラスミドで一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞においてフローサイトメトリーによって評価した。「ＫｉＨ」と表示される複合体又はポリペプチドは、指定のＣＤ８ａ結合ＶＨＨドメインが各Ｆｃ領域のＮ末端に融合し、突然変異体ＩＬ－２が「ノブ」Ｆｃ領域のみのＣ末端に融合したノブインホールヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む。「ＫｉＨ」と表示されていない複合体又はポリペプチドは、生理学的条件下でホモ二量体を形成する。トランスフェクションした細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）中、１ウェル当たり５００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度５００ｎＭの２倍に希釈し、６倍の段階希釈を行った。ポリペプチドを含まないＦＡＣＳバッファーを二次抗体のみのコントロールとして使用した。試験ポリペプチドを等容量の細胞に添加し、アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＣＤ８結合を検出するために１０００倍希釈した蛍光標識抗ヒトＦｃ抗体を含むＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁した。アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで更に１回洗浄した後、ＣＤ８に結合したポリペプチドを、トランスフェクションマーカーであるシトリンに陽性の細胞でフローサイトメトリーによって検出した。結合は、これらの細胞集団において６４７ｎｍでの平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。フローサイトメトリー検出は、IntelliCytのｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓで行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。結果を表１０、並びに図８Ａ及び図８Ｂに示す。

【0221】

【表10】

【0222】

図８Ａ及び表１０に示されるように、試験したＣＤ８ａ結合ポリペプチドは、低ナノモル範囲の親和性でヒトＣＤ８ａに結合した。図８Ｂから、ポリペプチドが低いないし無視し得る親和性でヒトＣＤ８ｂに結合したことが示される。

【0223】

実施例７：Ｔ細胞へのＣＤ８ａ結合ポリペプチドの結合
ヒト化ＣＤ８ａ結合ＶＨＨドメインと、Ｆｃ領域と、或る特定のポリペプチドにおいては、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した突然変異型弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドの結合を、単離ヒトＴ細胞においてフローサイトメトリーによって評価した。「ＫｉＨ」と表示される複合体又はポリペプチドは、指定のＣＤ８ａ結合ＶＨＨドメインが各Ｆｃ領域のＮ末端に融合し、突然変異体ＩＬ－２が「ノブ」Ｆｃ領域のみのＣ末端に融合したノブインホールヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む。「ＫｉＨ」と表示されていない複合体又はポリペプチドは、生理学的条件下でホモ二量体を形成する。単離細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）中、１ウェル当たり５００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度２００ｎＭの２倍に希釈し、５倍の段階希釈を行った。ポリペプチドを含まないＦＡＣＳバッファーを二次抗体のみのコントロールとして使用した。試験ポリペプチドを等容量の細胞に添加し、アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＣＤ８ａ結合を検出するために１０００倍希釈した蛍光標識抗ヒトＩｇＧ抗体と、蛍光標識抗ＣＤ４抗体（クローンＯＫＴ４、１：２００）とを含むＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁した。生細胞と死細胞とを区別するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を１：２０００で添加した。アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで更に１回洗浄した後、ＣＤ８ａに結合したポリペプチドをＰＩ－ＣＤ４－細胞及びＰＩ－ＣＤ４＋細胞でフローサイトメトリーによって検出した。結合は、これらの細胞集団において６４７ｎｍでの平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。フローサイトメトリー検出は、ACEA BiosciencesのＮｏｖｏｃｙｔｅ－Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターで行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。結果を表１１、並びに図９Ａ及び図９Ｂに示す。

【0224】

【表11】

【0225】

図９Ａ及び表１１に示されるように、試験したＣＤ８ａ結合ポリペプチドは、低ナノモルないしサブナノモルの範囲の親和性でヒトＣＤ８ Ｔ細胞に結合した。図９Ｂから、ポリペプチドがヒトＣＤ４ Ｔ細胞に結合しなかったことが示される。

【0226】

実施例８：ヒト及びカニクイザルＣＤ８ａへのＣＤ８ａ結合ポリペプチドの結合
ｘＥＬＬ ｆｃ領域に融合したヒト化ＣＤ８ａ結合ＶＨＨドメインを含む４つのポリペプチドの結合を、単離ヒトＴ細胞及び単離ヒト又はカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でフローサイトメトリーによって評価した。単離細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）中、カニクイザルＰＢＭＣについては１ウェル当たり２０００００個の細胞、ヒトＴ細胞については１ウェル当たり１０００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度２５ｎＭ又は５０ｎＭの２倍に希釈し、３倍又は５倍の段階希釈物を調製した。ＦＡＣＳバッファー単独を二次抗体のみのコントロールとして使用した。ポリペプチド希釈物を等容量の細胞に添加し、アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＣＤ８ａ結合を検出するために１０００倍希釈した蛍光標識抗ヒトＩｇＧ抗体と、蛍光標識抗ＣＤ３抗体（クローンＳＰ３４．２、１：５０、ＰＢＭＣ調製のためのみ）と、蛍光標識抗ＣＤ４抗体（クローンＯＫＴ４、１：１００）とを含むＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁した。生細胞と死細胞とを区別するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を１：２０００で添加した。アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで更に１回洗浄した後、ＣＤ８ａ結合をＰＩ－（ＣＤ３＋）ＣＤ４－細胞でフローサイトメトリーによって検出した。結合は、これらの細胞集団において６４７ｎｍでの平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。フローサイトメトリー検出は、ACEA BiosciencesのＮｏｖｏｃｙｔｅ－Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターで行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。結果を表１２及び表１３、並びに図１０Ａ～図１０Ｄに示す。

【0227】

【表12】

【0228】

【表13】

【0229】

図１０Ａ及び図１０Ｅ、並びに表１２に示されるように、試験したＣＤ８ａ結合ポリペプチドは、０．１ｎＭ以下の親和性でヒトＣＤ８ Ｔ細胞に結合した。図１０Ｂ及び図１０Ｆから、これらのポリペプチドがヒトＣＤ４ Ｔ細胞に結合しなかったことが示される。図１０Ｃ及び表１３に示されるように、試験したＣＤ８ａ結合ポリペプチドは、０．０４ｎＭ未満の親和性でカニクイザルＣＤ８ Ｔ細胞に結合した。図１０Ｄ及び図１０Ｈから、ポリペプチドがカニクイザルＣＤ４ Ｔ細胞に結合しなかったことが示される。

【0230】

実施例９：ＣＤ８ａ結合ＶＨＨと弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドによって誘導される特異的ＩＬ－２シグナル伝達
ＣＤ８結合ＶＨＨドメイン（ｈｚＢ７ｖ３１、配列番号９２、又はｈｚＢ７ｖ４１、配列番号１００）と、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドのＣＤ８ａ標的化ＩＬ－２活性をｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて評価した。コントロールタンパク質には、ＣＤ８ａ結合ＶＨＨドメイン及びＦｃ領域を含むが、ＩＬ－２を含まないポリペプチド、非標的化ＶＨＨと、Ｆｃ領域と、突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質、並びに野生型ＩＬ－２が含まれていた。リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）のレベル又はｐＳＴＡＴ５を発現する細胞の割合の増加は、ＩＬ－２受容体連結及びシグナル伝達の近接読み出し値として細胞内フローサイトメトリーによって測定した。富化ヒトＴ細胞を完全増殖培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、１％ａｎｔｉ－ａｎｔｉ）中、１ウェル当たり５０００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度２００ｎＭ又は５０ｎＭの２倍に希釈し、４倍の段階希釈を行った。段階希釈物を細胞に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ固定バッファー（BD）中にて４℃で３０分間固定した。次いで、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファー中で１回洗浄し、Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ）中にて４℃で３０分間透過処理した。透過処理した細胞を１倍Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（eBioscience）中で合計３回洗浄した後、ＣＤ４（ＯＫＴ４、１：１００）、ＣＤ３（ＳＰ３４－２、１：５０）、ＦｏｘＰ３（２３６Ａ／Ｅ７、１：４０）、ｐＳＴＡＴ５（ＳＲＢＣＺＸ、１：７０）、ＣＤ２５（Ｍ－Ａ２５１、１：５００）及びＣＤ８（ＲＰＡ－Ｔ８、１：４０００）に対する蛍光標識抗体を含有する１倍Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中にて４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ACEA BiosciencesのＮｏｖｏｃｙｔｅ－Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターを用いて分析した。ＩＬ－２シグナル伝達は、中央蛍光強度、又はＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）若しくは制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）上のｐＳＴＡＴ５を検出する蛍光標識抗体で染色された陽性細胞の割合の増加によって定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。

【0231】

図１１Ａ及び図１１Ｃに示されるように、ＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１又はＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ４１ドメインと、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む試験したポリペプチドは、０．０３ｎＭ未満のＥＣ_５０で濃度依存的にｐＳＴＡＴ５のレベルの増加又はｐＳＴＡＴ５陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の割合の増加を誘導した。野生型ＩＬ－２（非標的化）は、およそ１．６ｎＭのＥＣ_５０で約５０倍低い活性を示した。また、野生型ＩＬ２は、およそ２．５ｐＭのＥＣ_５０でＴｒｅｇにおいてＩＬ－２受容体シグナル伝達を誘導したが、Ｔｒｅｇ ｐＳＴＡＴ５又はｐＳＴＡＴ５陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の割合の検出可能な増加は、ＣＤ８ａ標的化弱毒化ＩＬ－２によって誘導されなかった（図１１Ａ～図１１Ｄ）。ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１を含み、ＩＬ－２を含まないポリペプチドも、標的化されていないＶＨＨと、Ｆｃ領域と、突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドも、試験した細胞型のいずれにおいてもｐＳＴＡＴ５レベルの検出可能な増加を誘導せず、弱毒化ＩＬ－２がＩＬ－２受容体シグナル伝達活性を誘導するために細胞への標的化を必要とすることが示された（図１１Ａ～図１１Ｄ）。

【0232】

実施例１０：ＣＤ８ａ結合ＶＨＨと弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドによって誘導されるヒト腫瘍浸潤Ｔ細胞及び健常ドナーＴ細胞のＴ細胞増殖
ＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１ドメインと、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドの活性を、ヒト癌患者からの解離腫瘍細胞（ＤＴＣ）試料又は健常ヒトドナー血液からのＰＢＭＣを用いた増殖アッセイにおいて更に評価した。ＤＴＣ単細胞懸濁液を頭頸部、腎臓又は結腸の腫瘍の生検からヒト腫瘍解離キット（Miltenyi Biotec）を用いて生成した。次いで、ＤＴＣ又はＰＢＭＣを製造業者の推奨プロトコルに従って増殖色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Thermo）で標識した。１０ｎＭの試験ポリペプチド又は２００ｎＭの濃度から開始した試験ポリペプチドの５倍希釈物を添加した完全増殖培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、１％ａｎｔｉ－ａｎｔｉ）中で細胞をインキュベートした。コントロールタンパク質には、ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－ｘＥＬＬ ＦｃとしてフォーマットされたＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１を含むポリペプチド、非標的化ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－ｘＥＬＬ Ｆｃと、突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質、及び野生型ＩＬ－２が含まれていた。培養６日後又は７日後に、細胞亜集団をＣＤ３（Ｈｉｔ３、１：１００）、ＣＤ４（ＯＫＴ４、１：２００）、ＣＤ８（ＲＰＡ－Ｔ８、１：２００）、及びＣＤ４５（ＨＩ３０、１：１００）に対する蛍光タグ付き抗体、並びに生細胞と死細胞とを区別するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ、１：２０００）で標識した。Ｔ細胞は、ＣＤ４又はＣＤ８ａのいずれかを発現するＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＰＩ－細胞として分類された。これらのＴ細胞亜集団の細胞数を６日目又は７日目にフローサイトメトリーを用いて定量した。フローサイトメトリー検出は、ACEA BiosciencesのＮｏｖｏｃｙｔｅ－Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターで行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１－Ｆｃ－ｘＥＬＬで処理した試料に対して細胞数を正規化し、ＩＬ－２を含まず、細胞増殖を引き起こさないコントロールポリペプチドに対する細胞数の倍率増加を決定した。パーセント増殖は、親非分裂細胞ピークよりも低いＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ蛍光強度を有する細胞のパーセントを定量化することによって決定した。

【0233】

図１２Ａ及び図１２Ｃに示されるように、ＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１ドメインと、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む試験したポリペプチドは、解離腫瘍試料及び健常ＰＢＭＣにおいてＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を誘導した。また、野生型ＩＬ２は、ＣＤ８（図１２Ａ及び図１２Ｃ）及びＣＤ４（図１２Ｂ）の両方のＴ細胞の増殖を誘導したが、ＣＤ８ａ標的化突然変異体弱毒化ＩＬ－２は、ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を誘導しなかった。ＣＤ８ａ－ｈｚＢ７ｖ３１を含み、ＩＬ－２を含まないポリペプチドも、標的化されていないＶＨＨと、Ｆｃ領域と、突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドも、ＣＤ８又はＣＤ４ Ｔ細胞の増殖の検出可能な増加を誘導せず、弱毒化ＩＬ－２が増殖等のＩＬ－２受容体シグナル伝達活性を誘導するために細胞への標的化を必要とすることが示された。

【0234】

実施例１１：ＣＤ８ａ結合ＶＨＨと弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドによって誘導されるカニクイザルＰＢＭＣ亜集団の細胞増加
ＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ１５と、ｘＥＬＬ Ｐ３２９Ｇと、ノブインホールヘテロ二量体Ｆｃ領域と、「ノブ」ＦｃのＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ細胞増加に対する影響を非ヒト霊長類において試験した。カニクイザルに１．０ｍｇ／ｋｇの融合タンパク質を静脈内ボーラス注射した。融合タンパク質投与の前及び７日後に研究動物から全血試料を採取した。各時点のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）にて密度遠心分離を用いて単離し、細胞を蛍光標識細胞型特異的抗体の組合せで染色した。Ｔ細胞は、ＣＤ４又はＣＤ８ａを発現し、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０を発現しないＣＤ３＋細胞として分類された。制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）は、ＣＤ２５も発現し、ＣＤ１２７のレベルが低下したＣＤ４＋Ｔ細胞として定義された。ＣＤ４＋通常Ｔ細胞（「ＣＤ４＋Ｔｃｏｎ」）は、ＣＤ２５を発現せず、正常レベルのＣＤ１２７を有するＣＤ４＋Ｔ細胞として定義された。ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａを発現する非Ｔ及び非Ｂ細胞として定義され、ＣＤ１６には陽性又は陰性のいずれかであった。ＣＤ２０陽性染色集団は、Ｂ細胞として分類された。各ＰＢＭＣ亜集団の絶対細胞数を、フローサイトメトリーを用いて決定し、投与７日後の絶対細胞数を投与前のベースライン数で除算することによって倍率増加を算出した。Ｋｉ６７発現を、上記のＰＢＭＣ亜集団において付加的な固定、透過処理及び染色工程を用いて測定した。簡潔に述べると、細胞を細胞表面マーカーについて蛍光標識細胞型特異的抗体の組合せで染色した後、ＦｏｘＰ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（eBioscience）を用いて固定し、透過処理した。次いで、ＦｏｘＰ３及びＫｉ６７を特異的蛍光標識抗体で検出した。Ｔ細胞は、ＣＤ４又はＣＤ８ａを発現し、ＮＫ細胞マーカーＮＫＧ２Ａを発現しないＣＤ３＋細胞として分類された。制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）は、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３も発現するＣＤ４＋Ｔ細胞として定義された。ＣＤ４＋通常Ｔ細胞（「ＣＤ４＋Ｔｃｏｎ」）は、ＣＤ２５又はＦｏｘＰ３を発現しないＣＤ４＋Ｔ細胞として定義された。ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａを発現する非Ｔとして定義され、ＣＤ１６には陽性又は陰性のいずれかであった。フローサイトメトリー検出は、ACEA BiosciencesのＮｏｖｏｃｙｔｅ－Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターで行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。７日目の全血１ｍＬ当たりの細胞数をベースライン（投与前）の全血１ｍＬ当たりの細胞数で除算することによって倍率変化を算出した。

【0235】

図１３Ａに示されるように、１ｍｇ／ｋｇのＣＤ８ａ標的化弱毒化ＩＬ－２の単回投与は、ＣＤ８ Ｔ細胞の５倍の増加、並びにＣＤ８ａ発現ＣＤ１６＋又はＣＤ１６－ＮＫ細胞のそれぞれ３．９倍及び４．７倍の増加をもたらした。Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋通常Ｔ細胞及びＢ細胞を含むＣＤ８ａ陰性細胞集団の数は、投与前の採血と７日目との間に有意に増加しなかった。図１３Ｂから、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ８ａ発現細胞集団の特異的な増加が増殖マーカーＫｉ６７の特異的な増加を伴っていたことが示される。Ｋｉ６７＋増殖ＣＤ８ Ｔ細胞の割合は、ベースラインの６％から７日目の５８％まで増加し、ＣＤ１６＋及びＣＤ１６－ＮＫ細胞集団は、同じ時間枠で４０％～５３％のＫｉ６７＋細胞の平均増加を示した。Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋通常Ｔ細胞を含むＣＤ８ａ陰性細胞集団内のＫｉ６７＋集団の割合は変化しなかった。これらのデータから、ＣＤ８ａ標的化弱毒化ＩＬ－２がＣＤ８ａ陽性細胞集団の細胞増殖をｉｎ ｖｉｖｏで特異的に誘導したことが示される。

【0236】

実施例１２：ＣＤ８ａ結合ＶＨＨと弱毒化ＩＬ－２とを含むポリペプチドによって誘導されるＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性及びヒト癌細胞に対する抗体依存性細胞傷害作用の増強
ＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１ドメインと、ｘＥＬＬノブインホールヘテロ二量体Ｆｃ領域と、「ノブ」Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２とを含む融合体の活性を、富化ＣＤ８ Ｔ細胞を用いた腫瘍細胞死滅アッセイ及びセツキシマブと組み合わせた抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて更に評価した。コントロールタンパク質には、非標的化ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－ｘＥＬＬ Ｆｃと突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質、及び野生型ＩＬ－２が含まれていた。ＣＤ８ Ｔ細胞死滅アッセイについては、健常ヒトドナー血液からのＰＢＭＣをＣＤ８ Ｔ細胞の単離に使用し、野生型ＩＬ－２からの付加的なサイトカイン支持、又はＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１－ｈＩｇＧ１－ｘＥＬＬ Ｆｃと、突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質（それぞれ１ｎＭ）の存在下又は非存在下において、培養プレート上に１μｇ／ｍＬでコーティングしたＣＤ３に対する抗体（クローン：ＯＫＴ３）で富化細胞を３日間刺激した。標的細胞死滅アッセイの当日に、Ａ４３１細胞をＣＹＴＯ－ＩＤ ｒｅｄ長期細胞トレーサー（Enzo）で標識した後、１００μＬ中１ウェル当たり４０００個の細胞で９６ウェル平底プレートにプレーティングし、４時間接着させた。予め刺激したＣＤ８ Ｔ細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、標識Ａ４３１標的細胞に指定の異なるエフェクター対標的細胞比（２０：１、１０：１及び５：１）で添加した。Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ（Sartorius）を各ウェルに添加して細胞死を検出した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅイメージャーを用いてＣａｓｐａｓｅ－３／７及びＣＹＴＯ－ＩＤ ｒｅｄの重なりを定量化することにより、２０時間後にＡ４３１の死滅を決定した。

【0237】

ＡＤＣＣアッセイについては、Ａ４３１細胞をＣＹＴＯ－ＩＤ ｒｅｄ長期細胞トレーサー（Enzo）で標識した後、１００μＬ中１ウェル当たり１００００個の細胞で９６ウェル平底プレートにプレーティングし、４時間接着させた。ヒトＰＢＭＣを解凍し、フローサイトメトリーによってＮＫ細胞頻度について試験した。各ウェルに対し、２５μＬの培地について最終希釈率２０００倍のＩｎｃｕｃｙｔｅ（商標） Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Sartorius）２５μＬ、又は２５μＬの培地について最終濃度２０ｎＭのＡＤＣＣ抗体セツキシマブ、最終濃度１ｎＭの野生型組換えＩＬ－２、又は最終濃度１ｎＭのＩＬ－２変異体融合ポリペプチド、及びＡ４３１細胞１個当たり１０個又は５個のＮＫ細胞の濃度に調整したヒトＰＢＭＣ ２５μＬとした。細胞を室温で１０分間沈降させた後、プレートをイメージングのために３７℃のＩｎｃｕｃｙｔｅイメージャーに入れた。Ｃａｓｐａｓｅ－３／７及びＣＹＴＯ－ＩＤ ｒｅｄの重なりを定量化することにより、１５時間後にＡ４３１の死滅を決定し、最大死滅を２０ｎＭセツキシマブによって規定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いて全てのデータをプロットし、分析した。

【0238】

図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるように、ＣＤ８ａ結合ＶＨＨ ｈｚＢ７ｖ３１ドメインと、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む試験したポリペプチドは、異なるエフェクター対標的細胞比でＣＤ８ Ｔ細胞の相対細胞毒性を増強し（図１４Ａ）、最適以下のエフェクター対標的細胞比では、ＥＧＦＲ陽性Ａ４３１標的細胞に対するＰＢＭＣのセツキシマブ駆動ＡＤＣＣ活性の改善を助長した（図１４Ｂ）。ＣＤ８ Ｔ細胞による活性の程度は、野生型ＩＬ－２で観察された活性よりも３倍～４倍高かったが、ＡＤＣＣアッセイにおいては同等であった。非標的化ＶＨＨ－ｈＩｇＧ１－ｘＥＬＬ Ｆｃと突然変異体弱毒化ＩＬ－２とを含む融合タンパク質は、より低いエフェクター対標的細胞比のＡＤＣＣ活性を改善することができず、弱毒化ＩＬ－２がＩＬ－２受容体シグナル伝達活性及び増強された細胞毒性を誘導するためにエフェクター細胞への標的化を必要とすることが示された。

【0239】

本開示は、本発明の趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、全ての点で例示としてみなされるべきであって、本開示を限定するものとはみなされない。したがって、本開示の範囲は、上述の詳細な説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示されるため、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内にある全ての変更は、本明細書に含まれることが意図される。

【0240】

【表14】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【配列表】

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【国際調査報告】