特表 2024-526850 ベクター製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】ベクター製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20240711BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20240711BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z

C12N7/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503401

(86)(22)【出願日】2022-07-19

(85)【翻訳文提出日】2024-02-15

(86)【国際出願番号】 US2022037544

(87)【国際公開番号】W WO2023003844

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/223,249

(32)【優先日】2021-07-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521438515

【氏名又は名称】２セブンティ バイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】クラル， ケリー マリー

(72)【発明者】

【氏名】クチェウスキ， マイケル クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】バッタチャリヤ， モウミタ

(72)【発明者】

【氏名】ケリー， クリステン

(72)【発明者】

【氏名】カパディア， アドナン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA97X

4B065BA02

4B065BC01

4B065BD14

4B065CA44

(57)【要約】

本開示は、ウイルスベクターの製造および精製方法を提供する。特に、本開示は、懸濁液中で成長させた宿主細胞からレンチウイルスベクターを製造するための改善された方法を提供する。より具体的には、本開示は、細胞を適当な数に成長させること、レンチウイルスパッケージングプラスミド、トランスファープラスミド、およびトランスフェクション剤でトランスフェクトすること；エンドヌクレアーゼで処理すること；懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；アフィニティークロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーを使用してレンチウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；濃縮されたレンチウイルスベクターを濾過すること；レンチウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；レンチウイルスベクターを製剤化すること；ならびに製剤化バルクレンチウイルスベクターを滅菌濾過することを含む、改善された大規模レンチウイルス製造方法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

レンチウイルスベクター（ｓＬＶＶ）を生成するための懸濁方法であって、
（ａ）大規模懸濁培養物に生宿主細胞を接種すること；
（ｂ）レンチウイルスパッケージングプラスミド、トランスファープラスミド、およびトランスフェクション剤を含む混合物を用いて、前記大規模懸濁培養物中の前記宿主細胞を一過性にトランスフェクトすること；
（ｃ）トランスフェクションの約３６時間～約４８時間後（トランスフェクションの開始後）にエンドヌクレアーゼを前記懸濁培養物上清に添加すること；
（ｄ）タンデムデプスフィルターおよび二重層フィルターを使用して、前記懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；
（ｅ）クロマトグラフィーを使用して、前記採取され、清澄化された懸濁培養物上清から前記レンチウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；
（ｆ）前記濃縮されたレンチウイルスベクターを濾過すること；
（ｇ）接線流濾過（ＴＦＦ）を使用し、前記レンチウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；ならびに
（ｈ）前記レンチウイルスベクターを製剤化して、製剤化バルクレンチウイルスベクターを生成すること、および前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを滅菌濾過することを含む、懸濁方法。

【請求項2】

前記方法が、２００Ｌ～２０００Ｌの懸濁培養物を接種することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記方法が、２００Ｌ～１０００Ｌの懸濁培養物を接種することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記方法が、２００Ｌ～５００Ｌの懸濁培養物を接種することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記方法が、２００Ｌの懸濁培養物を接種することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記大規模懸濁培養物に、約４０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞が接種される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、懸濁培養に適合させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞、およびＨＥＫ２９３Ｅ細胞からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記大規模細胞懸濁培養物が、培養培地で培養された宿主細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記大規模細胞懸濁培養物が、培養培地で約３日間培養された宿主細胞を含み、前記３日後、前記培養培地が、新鮮な培養培地と交換される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記大規模細胞懸濁培養物が、培養培地で約３日間培養された宿主細胞を含み、前記３日後、前記培養培地が、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用して新鮮な培養培地と交換される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記培養培地が、無血清の化学的に規定された細胞培養培地である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記宿主細胞が、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、およびカチオン性ポリマーからなる群から選択されるトランスフェクション剤を含む前記混合物で一過性にトランスフェクトされる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記宿主細胞が、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、デンドリマー、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）からなる群から選択されるカチオン性ポリマーであるトランスフェクション剤を含む前記混合物で一過性にトランスフェクトされる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記宿主細胞が、ＰＥＩを含むトランスフェクション剤を含む前記混合物で一過性にトランスフェクトされる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記トランスフェクション剤が、ＰＥＩを含み、前記混合物が、約５、約５．５、約６、約６．４、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０のＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比を有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記トランスフェクション剤が、約１４～約１８時間、前記懸濁培養物に添加され、任意選択的に、前記懸濁培養物が、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用した新鮮な培養培地との培養培地交換に供される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記レンチウイルスパッケージングプラスミドが、レンチウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖならびに異種エンベロープタンパク質をコードする、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記レンチウイルスパッケージングプラスミドが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、マラバウイルス（ＭＡＲＡＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ピリウイルス（ＰＩＲＹＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ニパウイルス（ＮｉＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、センダイウイルス（ＳｅＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、モルビリウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、イヌジステンパー（ＣＤＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、麻疹ウイルス（ＭＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、および狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアントからなる群から選択される異種エンベロープタンパク質をコードする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記トランスファープラスミドが、パッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記トランスファープラスミドが、左のキメラ（５’）レンチウイルスＬＴＲを含むパッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを含み、前記５’ＬＴＲの前記プロモーターが、異種プロモーター；Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル；中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント（ＲＲＥ）；対象のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；および右（３’）の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスＬＴＲで置換されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記エンドヌクレアーゼが、セラチア・マルセセンスから誘導され、任意選択的に、前記エンドヌクレアーゼが、組換えＮｕｃＡエンドヌクレアーゼである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡとＲＮＡ切断活性の両方を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記エンドヌクレアーゼが、ＢｅｎｚｏｎａｓｅまたはＤｅｎａｒａｓｅである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記エンドヌクレアーゼが、約６０Ｕ／ｍｌまたは約３０Ｕ／ｍｌの濃度で添加される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記エンドヌクレアーゼが、トランスフェクションの約３６時間～約７２時間後に前記懸濁培養物上清に添加される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記エンドヌクレアーゼが、トランスフェクションの約３６時間～約４８時間後に前記懸濁培養物上清に添加される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記エンドヌクレアーゼが、トランスフェクションの約４８時間後に前記懸濁培養物上清に添加される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記エンドヌクレアーゼが、トランスフェクションの約４４時間後に前記懸濁培養物上清に添加される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記エンドヌクレアーゼが、トランスフェクションの約４０時間後に前記懸濁培養物上清に添加される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記エンドヌクレアーゼが、トランスフェクションの約３６時間後に前記懸濁培養物上清に添加される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記エンドヌクレアーゼが、約１～約２時間、前記培養物に添加される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記採取および清澄化工程が、少なくとも約４０μｍまたは少なくとも約６０μｍの混入物を保持する前記タンデムデプスフィルターならびに約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備える二重層フィルターを通して、前記懸濁培養物上清を濾過することを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記清澄化された懸濁培養物が、任意選択的に、１Ｍ ＨＥＰＥＳを用いて、約ｐＨ７．０または約ｐＨ７．２に調整される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記レンチウイルスベクターが、アフィニティークロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記採取され、清澄化された懸濁培養物上清から捕捉され、濃縮される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記上清が、アフィニティークロマトグラフィーカラムまたは陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを通過する、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記アフィニティークロマトグラフィーが、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーである、請求項３５または３６に記載の方法。

【請求項38】

前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項３５または３６に記載の方法。

【請求項39】

前記硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーが、約４５μｍのビーズサイズおよび／または約１００ｎｍの平均孔サイズを有するカラムを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７を含む洗浄緩衝液が、前記クロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８を含む溶出緩衝液が、前記クロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む洗浄緩衝液が、前記クロマトグラフィーカラムを通過する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む溶出緩衝液が、前記クロマトグラフィーカラムを通過する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記濾過工程（ｆ）は、約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して、前記濃縮されたレンチウイルスベクターを濾過することを含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記レンチウイルスベクターが、約１００ｋＤａ～約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備えた中空繊維接線流濾過（ＴＦＦ）フィルターを使用して、限外濾過され、透析濾過される、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記中空繊維ＴＦＦフィルターが、約１００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記中空繊維ＴＦＦフィルターが、約３００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記中空繊維ＴＦＦフィルターが、約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える、請求項４５に記載の方法。

【請求項49】

前記レンチウイルスベクターが、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、前記透析濾過緩衝液が、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０である、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記レンチウイルスベクターが、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、前記透析濾過緩衝液が、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０である、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記レンチウイルスベクターが、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、前記透析濾過緩衝液が、約５０ｍＭ Ｌ－Ｈｉｓ、ｐＨ７．０である、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記レンチウイルスベクターを、２×幹細胞成長培地（ＳＣＧＭ）中で１：１で製剤化して、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを生成する、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記レンチウイルスベクターが、ＨＥＰＥＳおよびスクロースを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、前記緩衝液が、Ｌ－プロリン、ポロクサマー１８８、またはＮａＣｌをさらに含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約０．２～約２．０ポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記レンチウイルスベクターが、Ｌ－ヒスチジン、スクロース、およびＬ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、前記製剤が、約０．２～約２．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８をさらに含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記製剤化バルクレンチウイルスベクターが、任意選択的に、０．４５μｍのプレフィルターを備えた０．２２μｍのフィルターを通して滅菌濾過される、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記方法が、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終レンチウイルスベクターを生成すること、および前記最終レンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記方法が、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記方法が、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを解凍すること、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを滅菌濾過すること、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終レンチウイルスベクターを生成すること、および前記最終レンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記最終レンチウイルスベクターが、≦－６５℃で凍結される、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

懸濁レンチウイルスベクターを生成する方法であって、
（ａ）約５０ｍＬの培養培地を含むＰ０懸濁培養物に、約１０．０×１０^６～約１５．０×１０^６個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；
（ｂ）約１００ｍＬの培養培地を含むＰ１懸濁培養物に、前記Ｐ０懸濁培養物から得られた約３０．０×１０^６～約７０．０×１０^６個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；
（ｃ）それぞれが、約２００ｍＬの培養培地を含む三つのＰ２懸濁培養物に、前記Ｐ１懸濁培養物から得られた約１１．０×１０^７～約１９．０×１０^７個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；
（ｄ）それぞれが、約１．０Ｌの培養培地を含む三つのＰ３懸濁培養物に、前記プールされたＰ２懸濁培養物から得られた約５５．０×１０^７～約９５．０×１０^７個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；
（ｅ）約２０．０Ｌの培養培地を含むＰ４懸濁培養物に、前記プールされたＰ３懸濁培養物から得られた約４０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；
（ｆ）約２００．０Ｌの培養培地を含むＰ５懸濁培養物に、前記Ｐ４懸濁培養物から得られた約４０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；
（ｇ）前記Ｐ５懸濁培養物を約３日間培養し、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用して、前記Ｐ５懸濁培養物の前記培養培地を約１９０．０Ｌの新鮮な培養培地と交換すること；
（ｈ）前記培養培地交換後、前記Ｐ５懸濁培養物をトランスフェクトして、レンチウイルスベクターを生成することであって、前記トランスフェクト工程が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体化された、トランスファープラスミドならびにｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、ＶＳＶ－ｇをコードするプラスミドＤＮＡを含む約１０．０Ｌの培養培地を添加することを含む、生成すること；
（ｉ）トランスフェクション後、ＡＴＦを使用して、前記Ｐ５懸濁培養物の前記培養培地を約２００．０Ｌの新鮮な培養培地と交換すること；
（ｊ）トランスフェクションの約３６時間～約４８時間後、前記Ｐ５懸濁培養物をエンドヌクレアーゼで約１時間～約２時間処理すること；
（ｋ）６０μｍ以上の粒子を保持するタンデムデプスフィルター、および０．８μｍおよび０．４５μｍの孔サイズを備えた二重層フィルターを使用して、前記Ｐ５懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；
（ｌ）ヘパリンクロマトグラフィーまたは硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、前記採取され、清澄化されたＰ５懸濁培養物上清から前記レンチウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；
（ｍ）０．８μｍおよび０．４５μｍの孔サイズを備えた二重層フィルターを使用して、前記濃縮されたレンチウイルスベクターを濾過すること；
（ｎ）接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して前記レンチウイルスベクターを限外濾過して、前記レンチウイルスベクターをさらに濃縮し、前記レンチウイルスベクターを透析濾過緩衝液に透析濾過し、これにより、バルクレンチウイルスベクターを生成すること；ならびに
（ｏ）前記レンチウイルスベクターを製剤化して、製剤化バルクレンチウイルスベクターを生成することを含む、方法。

【請求項67】

前記培養培地が、無血清の化学的に規定された細胞培養培地である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比が、約５、約５．５、約６、約６．４、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０である、請求項６６または請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記ＰＥＩが、約１４～約１８時間、前記懸濁培養物に添加され、任意選択的に、前記懸濁培養物が、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用した新鮮な培養培地との培養培地交換に供される、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記トランスファープラスミドが、パッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記トランスファープラスミドが、左のキメラ（５’）レンチウイルスＬＴＲを含むパッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを含み、前記５’ＬＴＲの前記プロモーターが、異種プロモーター；Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル；中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント（ＲＲＥ）；対象のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；および右（３’）の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスＬＴＲで置換されている、請求項６６～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記エンドヌクレアーゼが、セラチア・マルセセンスから誘導される、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記エンドヌクレアーゼが、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅ活性の両方を有する、請求項６６～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記エンドヌクレアーゼが、ＢｅｎｚｏｎａｓｅまたはＤｅｎａｒａｓｅである、請求項６６～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記エンドヌクレアーゼが、約６０Ｕ／ｍｌまたは約３０Ｕ／ｍｌの濃度で添加される、請求項６６～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記清澄化された懸濁培養物が、任意選択的に、１Ｍ ＨＥＰＥＳを用いて、約ｐＨ７．０または約ｐＨ７．２に調整される、請求項６６～７５に記載の方法。

【請求項77】

前記硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーが、約４５μｍのビーズサイズおよび／または約１００ｎｍの平均孔サイズを有するカラムを含む、請求項６６～７６に記載の方法。

【請求項78】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７を含む洗浄緩衝液が、前記ヘパリンクロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる、請求項６６～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８を含む溶出緩衝液が、前記ヘパリンクロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる、請求項６６～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む洗浄緩衝液が、前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる、請求項６６～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む溶出緩衝液が、前記陽イオン交換クロマトグラフィー上にポンプで吸い上げられる、請求項６６～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記レンチウイルスベクターが、約１００ｋＤａ、約３００ｋＤａもしくは約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備えた中空繊維ＴＦＦフィルターを使用して、限外濾過され、透析濾過緩衝液に透析濾過される、請求項６６～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記透析濾過緩衝液が、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０である、請求項６６～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記透析濾過緩衝液が、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０である、請求項６６～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記レンチウイルスベクターが、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、前記透析濾過緩衝液が、約５０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ７．０である、請求項６６～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記レンチウイルスベクターを、２×幹細胞成長培地（ＳＣＧＭ）中で１：１で製剤化して、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを生成する、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記レンチウイルスベクターが、ＨＥＰＥＳおよびスクロースを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、前記緩衝液が、Ｌ－プロリン、ポロクサマー１８８、またはＮａＣｌをさらに含む、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記レンチウイルスベクターが、Ｌ－ヒスチジン、スクロース、およびＬ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記レンチウイルスベクターが、約５ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、前記製剤が、約０．２～約２．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８をさらに含む、請求項６６～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記方法が、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終レンチウイルスベクターを生成すること、および前記最終レンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項６６～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記方法が、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項６６～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記方法が、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを解凍すること、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターを滅菌濾過すること、前記製剤化バルクレンチウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終レンチウイルスベクターを生成すること、および前記最終レンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記最終レンチウイルスベクターが、≦－６５℃で凍結される、請求項９５～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

ウイルスベクターを生成するための懸濁方法から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を低減する方法であって、
（ａ）ウイルスベクター（例えば、請求項１～９８のいずれか一項に従い製造されたウイルスベクター）を含む、採取され、清澄化された懸濁培養物上清を用意すること；
（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記採取され、清澄化された懸濁培養物上清から前記ウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；
（ｃ）前記濃縮されたウイルスベクターを濾過すること；
（ｄ）接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して、前記ウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；ならびに
（ｅ）前記ウイルスベクターを製剤化して、製剤化バルクウイルスベクターを生成すること、および前記製剤化バルクウイルスベクターを滅菌濾過することを含む、方法。

【請求項100】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記ウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、マラバウイルス（ＭＡＲＡＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ピリウイルス（ＰＩＲＹＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ニパウイルス（ＮｉＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、センダイウイルス（ＳｅＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、モルビリウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、イヌジステンパー（ＣＤＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、麻疹ウイルス（ＭＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、および狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアントからなる群から選択される異種エンベロープタンパク質でシュードタイプ化される、請求項９９または請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記ウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）からなる異種エンベロープタンパク質でシュードタイプ化される、請求項９９～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記採取および清澄化工程が、少なくとも約４０μｍまたは少なくとも約６０μｍの混入物を保持する前記タンデムデプスフィルターならびに約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備える二重層フィルターを通して前記懸濁培養物上清を濾過することを含む、請求項９９～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記清澄化された懸濁培養物が、任意選択的に、１Ｍ ＨＥＰＥＳを用いて、約ｐＨ７．０または約ｐＨ７．２に調整される、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

前記上清が、前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを通過する、請求項９９～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーが、約４５μｍのビーズサイズおよび／または約１００ｎｍの平均孔サイズを有するカラムを含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む洗浄緩衝液が、前記クロマトグラフィーカラムを通過する、請求項９９～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む溶出緩衝液が、前記クロマトグラフィーカラムを通過する、請求項９９～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

前記濾過工程（ｃ）は、約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して、前記濃縮されたウイルスベクターを濾過することを含む、請求項９９～１０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

前記ウイルスベクターが、約１００ｋＤａ～約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備えた中空繊維接線流濾過（ＴＦＦ）フィルターを使用して、限外濾過され、透析濾過される、請求項９９～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記中空繊維ＴＦＦフィルターが、約１００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記中空繊維ＴＦＦフィルターが、約３００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える、請求項１１１に記載の方法。

【請求項114】

前記中空繊維ＴＦＦフィルターが、約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える、請求項１１１に記載の方法。

【請求項115】

前記ウイルスベクターが、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、前記透析濾過緩衝液が、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０である、請求項１１１～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記ウイルスベクターが、ＨＥＰＥＳおよびスクロースを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、前記緩衝液が、Ｌ－プロリン、ポロクサマー１８８、またはＮａＣｌをさらに含む、請求項９９～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記ウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項９９～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記ウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約０．２～約２．０ポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項９９～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記ウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリンおよび約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項９９～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記ウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項９９～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記ウイルスベクターが、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１で製剤化される、請求項９９～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記製剤化バルクウイルスベクターが、任意選択的に、０．４５μｍのプレフィルターを備えた０．２２μｍのフィルターを通して滅菌濾過される、請求項９９～１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

前記方法が、前記製剤化バルクウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終ウイルスベクターを生成すること、および前記最終ウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項９９～１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

前記方法が、前記製剤化バルクウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記方法が、前記製剤化バルクウイルスベクターを解凍すること、前記製剤化バルクウイルスベクターを滅菌濾過すること、前記製剤化バルクウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終ウイルスベクターを生成すること、および前記最終ウイルスベクターを凍結することをさらに含む、請求項１２２～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記最終ウイルスベクターが、≦－６５℃で凍結される、請求項１２３～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる、２０２１年７月１９日に出願された米国仮出願第６３／２２３，２４９号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張する。

【0002】

本発明は、ウイルスベクター生成および精製の改善された方法に関する。本発明はまた、ウイルスベクターを製造する改善された方法に関する。

【背景技術】

【0003】

関連分野に関する記載
オンコレトロウイルス起源とレンチウイルス起源の両方のレトロウイルスベクターは、まだ遺伝子送達ビヒクルとして満たされていない可能性を豊富に有している。臨床グレードのウイルス遺伝子療法ベクターの大規模製造は、ベクターの安定性、力価、および効力を維持しながら混入物を除去する、ベクター生成および精製のための拡張可能な単位操作を含む多くの障害に直面する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示は、概して、部分的には、レンチウイルスベクターを製造するための改善された方法に関する。特に、本開示は、懸濁液中で成長させた宿主細胞からレンチウイルスベクターを製造するための改善された方法を提供する。

【0005】

本開示の一態様では、大規模懸濁培養物に生宿主細胞を接種すること；レンチウイルスパッケージングプラスミド、トランスファープラスミド、およびトランスフェクション剤を含む混合物を用いて、大規模懸濁培養物中の宿主細胞を一過性にトランスフェクトすること；トランスフェクションの約３６時間～約４８時間後（トランスフェクションの開始後）にエンドヌクレアーゼを懸濁培養物上清に添加すること；タンデムデプスフィルターおよび二重層フィルターを使用して、懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；クロマトグラフィーを使用して、採取され、清澄化された懸濁培養物上清からレンチウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；濃縮されたレンチウイルスベクターを濾過すること；接線流濾過（ＴＦＦ）を使用し、レンチウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；ならびにレンチウイルスベクターを製剤化して、製剤化バルクレンチウイルスベクターを生成すること、および製剤化バルクレンチウイルスベクターを滅菌濾過することを含む、レンチウイルスベクター（ｓＬＶＶ）を生成するための懸濁方法が提供さる。

【0006】

様々な実施形態では、方法は、２００Ｌ～２０００Ｌの懸濁培養物に接種することを含む。一部の実施形態では、方法は、２００Ｌ～１０００Ｌの懸濁培養物に接種することを含む。一部の実施形態では、方法は、２００Ｌ～５００Ｌの懸濁培養物に接種することを含む。一部の実施形態では、方法は、２００Ｌの懸濁培養物に接種することを含む。

【0007】

様々な実施形態では、大規模懸濁培養物は、約４０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に接種される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、懸濁培養に適合させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞、およびＨＥＫ２９３Ｅ細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。

【0008】

様々な実施形態では、大規模細胞懸濁培養物は、培養培地中で培養された宿主細胞を含む。一部の実施形態では、大規模細胞懸濁培養物は、培養培地中で約３日間培養された宿主細胞を含み、３日後、培養培地は、新鮮な培養培地と交換される。一部の実施形態では、大規模細胞懸濁培養物は、培養培地中で約３日間培養された宿主細胞を含み、３日後、培養培地は、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用し、新鮮な培養培地と交換される。一部の実施形態では、培養培地は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地である。

【0009】

様々な実施形態では、宿主細胞は、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、およびカチオン性ポリマーからなる群から選択されるトランスフェクション剤を含む混合物で一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、デンドリマー、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）からなる群から選択されるカチオン性ポリマーであるトランスフェクション剤を含む混合物で一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＰＥＩを含むトランスフェクション剤を含む混合物で一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクション剤は、ＰＥＩを含み、混合物は、約５、約５．５、約６、約６．４、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０のＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比を有する。

【0010】

様々な実施形態では、トランスフェクション剤は、約１４～約１８時間、懸濁培養物に添加され、任意選択的に、懸濁培養物は、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用した新鮮な培養培地との培養培地交換に供される。

【0011】

様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、レンチウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖならびに異種エンベロープタンパク質をコードする。

【0012】

様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、ベジクロウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、パラミクソウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、アルファウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、ガンマレトロウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、オルトヘパドナウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、ヘパシウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、およびリッサウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアントからなる群から選択される異種エンベロープタンパク質をコードする。

【0013】

特定の実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、ニパウイルスエンベロープタンパク質、センダイウイルス（ＳｅＶ）エンベロープタンパク質、モルビリウイルスエンベロープタンパク質、イヌジステンパー（ＣＤＶ）エンベロープタンパク質、および麻疹ウイルスエンベロープタンパク質からなる群から選択される異種エンベロープタンパク質をコードする。

【0014】

様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）エンベロープタンパク質をコードする。

【0015】

様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、およびヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープタンパク質からなる群から選択される異種エンベロープタンパク質をコードする。

【0016】

様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）エンベロープタンパク質をコードする。

【0017】

様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質をコードする。

【0018】

様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）をコードする。

【0019】

様々な実施形態では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、マラバウイルス（ＭＡＲＡＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ピリウイルス（ＰＩＲＹＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ニパウイルス（ＮｉＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、センダイウイルス（ＳｅＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、モルビリウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、イヌジステンパー（ＣＤＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、麻疹ウイルス（ＭＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、および狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアントをコードする。

【0020】

好ましい実施形態では、ＶＳＶエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇまたはそのバリアントである。

【0021】

様々な実施形態では、トランスファープラスミドは、パッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、トランスファープラスミドが、左のキメラ（５’）レンチウイルスＬＴＲを含むパッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを含み、５’ＬＴＲのプロモーターが、異種プロモーター；Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル；中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント（ＲＲＥ）；対象のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；および右（３’）の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスＬＴＲで置換されている。

【0022】

様々な実施形態では、エンドヌクレアーゼは、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から誘導され、任意選択的に、エンドヌクレアーゼは、組換えＮｕｃＡエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断活性とＲＮＡ切断活性の両方を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＢｅｎｚｏｎａｓｅまたはＤｅｎａｒａｓｅである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、約６０Ｕ／ｍｌまたは約３０Ｕ／ｍｌの濃度で添加される。

【0023】

様々な実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約３６時間～約７２時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約３６時間～約４８時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約４８時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約４４時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約４０時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約３６時間後に懸濁培養物上清に添加される。

【0024】

様々な実施形態では、エンドヌクレアーゼは、約１～約２時間、培養物に添加される。

【0025】

様々な実施形態では、採取および清澄化工程は、少なくとも約４０μｍまたは少なくとも約６０μｍの混入物を保持するタンデムデプスフィルターならびに約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備える二重層フィルターを通して懸濁培養物上清を濾過することを含む。

【0026】

様々な実施形態では、清澄化された懸濁培養物は、任意選択的に、１Ｍ ＨＥＰＥＳを用いて約ｐＨ７．０または約ｐＨ７．２に調整される。

【0027】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、アフィニティークロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、採取され、清澄化された懸濁培養物上清から捕捉され、濃縮される。一部の実施形態では、上清は、アフィニティークロマトグラフィーカラムまたは陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを通過する。一部の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーである。一部の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーは、約４５μｍのビーズサイズおよび／または約１００ｎｍの平均孔サイズを有するカラムを含む。

【0028】

様々な実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７を含む洗浄緩衝液は、クロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる。

【0029】

様々な実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８を含む溶出緩衝液は、クロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる。

【0030】

様々な実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む洗浄緩衝液は、クロマトグラフィーカラムを通過する。様々な実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む溶出緩衝液は、クロマトグラフィーカラムを通過する。

【0031】

様々な実施形態では、濃縮されたベクターの濾過は、約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して濃縮されたレンチウイルスベクターを濾過することを含む。

【0032】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１００ｋＤａ～約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備えた中空繊維接線流濾過（ＴＦＦ）フィルターを使用して、限外濾過され、透析濾過される。一部の実施形態では、中空繊維ＴＦＦフィルターは、約１００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える。一部の実施形態では、中空繊維ＴＦＦフィルターは、約３００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える。一部の実施形態では、中空繊維ＴＦＦフィルターは、約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える。

【0033】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、透析濾過緩衝液は、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０である。

【0034】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、透析濾過緩衝液は、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０である。

【0035】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、透析濾過緩衝液は、約５０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ７．０である。

【0036】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターを、２×幹細胞成長培地（ＳＣＧＭ）中で１：１で製剤化して、製剤化バルクレンチウイルスベクターを生成する。

【0037】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＥＰＥＳおよびスクロースを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、緩衝液は、Ｌ－プロリン、ポロクサマー１８８、またはＮａＣｌをさらに含む。

【0038】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される。

【0039】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。

【0040】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１で製剤化される。

【0041】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。

【0042】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。

【0043】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｌ－ヒスチジン、スクロース、およびＬ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される。

【0044】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、製剤は、約０．２～約２．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８をさらに含む。

【0045】

様々な実施形態では、製剤化バルクレンチウイルスベクターは、任意選択的に、０．４５μｍのプレフィルターを備えた０．２２μｍのフィルターを通して滅菌濾過される。

【0046】

様々な実施形態では、方法は、製剤化バルクレンチウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終レンチウイルスベクターを生成すること、および最終レンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む。

【0047】

様々な実施形態では、方法は、製剤化バルクレンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む。

【0048】

様々な実施形態では、方法は、製剤化バルクレンチウイルスベクターを解凍すること、製剤化バルクレンチウイルスベクターを滅菌濾過すること、製剤化バルクレンチウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終レンチウイルスベクターを生成すること、および最終レンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む。一部の実施形態では、最終レンチウイルスベクターは、≦－６５℃で凍結される。

【0049】

別の態様では、約５０ｍＬの培養培地を含むＰ０懸濁培養物に約１０．０×１０^６～約１５．０×１０^６個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；約１００ｍＬの培養培地を含むＰ１懸濁培養物に、Ｐ０懸濁培養物から得られた約３０．０×１０^６～約７０．０×１０^６個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；それぞれが、約２００ｍＬの培養培地を含む三つのＰ２懸濁培養物に、Ｐ１懸濁培養物から得られた約１１．０×１０^７～約１９．０×１０^７個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；それぞれが、約１．０Ｌの培養培地を含む三つのＰ３懸濁培養物に、プールされたＰ２懸濁培養物から得られた約５５．０×１０^７～約９５．０×１０^７個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；約２０．０Ｌの培養培地を含むＰ４懸濁培養物に、プールされたＰ３懸濁培養物から得られた約４０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；約２００．０Ｌの培養培地を含むＰ５懸濁培養物に、Ｐ４懸濁培養物から得られた約４０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を接種すること；Ｐ５懸濁培養物を約３日間培養し、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用して、Ｐ５懸濁培養物の培養培地を約１９０．０Ｌの新鮮な培養培地と交換すること；培養培地交換後、Ｐ５懸濁培養物をトランスフェクトして、レンチウイルスベクターを生成すること、当該トランスフェクト工程は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体化された、トランスファープラスミドならびにｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、ＶＳＶ－ｇをコードするプラスミドＤＮＡを含む約１０．０Ｌの培養培地を添加することを含む；トランスフェクション後、ＡＴＦを使用して、Ｐ５懸濁培養物の培養培地を約２００．０Ｌの新鮮な培養培地と交換すること；トランスフェクションの約３６時間～約４８時間後、Ｐ５懸濁培養物をエンドヌクレアーゼで約１時間～約２時間処理すること；６０μｍ以上の粒子を保持するタンデムデプスフィルター、および０．８μｍおよび０．４５μｍの孔サイズを備えた二重層フィルターを使用して、Ｐ５懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；ヘパリンクロマトグラフィーまたは硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、採取され、清澄化されたＰ５懸濁培養物上清からレンチウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；０．８μｍおよび０．４５μｍの孔サイズを備えた二重層フィルターを使用して、濃縮されたレンチウイルスベクターを濾過すること；接線流濾過（ＴＦＦ）を使用してレンチウイルスベクターを限外濾過して、レンチウイルスベクターをさらに濃縮し、レンチウイルスベクターを透析濾過緩衝液に透析濾過し、これにより、バルクレンチウイルスベクターを生成すること；およびレンチウイルスベクターを製剤化して、製剤化バルクレンチウイルスベクターを生成することを含む、懸濁レンチウイルスベクターを生成する方法が提供される。

【0050】

様々な実施形態では、培養培地は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地である。

【0051】

様々な実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約５、約５．５、約６、約６．４、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０である。

【0052】

様々な実施形態では、ＰＥＩは、約１４～約１８時間、懸濁培養物に添加され、任意選択的に、懸濁培養物は、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用した新鮮な培養培地との培養培地交換に供される。

【0053】

様々な実施形態では、トランスファープラスミドは、パッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、トランスファープラスミドが、左のキメラ（５’）レンチウイルスＬＴＲを含むパッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを含み、５’ＬＴＲのプロモーターが、異種プロモーター；Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル；中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント（ＲＲＥ）；対象のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；および右（３’）の自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスＬＴＲで置換されている。

【0054】

様々な実施形態では、エンドヌクレアーゼは、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から誘導され、任意選択的に、エンドヌクレアーゼは、組換えＮｕｃＡエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断活性とＲＮＡ切断活性の両方を有する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＢｅｎｚｏｎａｓｅまたはＤｅｎａｒａｓｅである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、約６０Ｕ／ｍｌまたは約３０Ｕ／ｍｌの濃度で添加される。

【0055】

様々な実施形態では、清澄化された懸濁培養物は、任意選択的に、１Ｍ ＨＥＰＥＳを用いて約ｐＨ７．０または約ｐＨ７．２に調整される。

【0056】

様々な実施形態では、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーは、約４５μｍのビーズサイズおよび／または約１００ｎｍの平均孔サイズを有するカラムを含む。

【0057】

様々な実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む洗浄緩衝液は、アフィニティークロマトグラフィーカラムまたは陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる。

【0058】

様々な実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む溶出緩衝液は、アフィニティークロマトグラフィーカラムまたは陽イオン交換クロマトグラフィー上にポンプで吸い上げられる。

【0059】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約１００ｋＤａ、約３００ｋＤａもしくは約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備えた中空繊維ＴＦＦフィルターを使用して、限外濾過され、透析濾過緩衝液に透析濾過される。

【0060】

様々な実施形態では、透析濾過緩衝液は、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０である。

【0061】

様々な実施形態では、透析濾過緩衝液は、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０である。

【0062】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターを、２×幹細胞成長培地（ＳＣＧＭ）中で１：１で製剤化して、製剤化バルクレンチウイルスベクターを生成する。

【0063】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＥＰＥＳおよびスクロースを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、緩衝液は、Ｌ－プロリン、ポロクサマー１８８、またはＮａＣｌをさらに含む。

【0064】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される。

【0065】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約０．２ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。

【0066】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１で製剤化される。

【0067】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。

【0068】

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。

【0069】

様々な実施形態では、方法は、製剤化バルクレンチウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終レンチウイルスベクターを生成すること、および最終レンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む。

【0070】

様々な実施形態では、方法は、製剤化バルクレンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む。

【0071】

様々な実施形態では、方法は、製剤化バルクレンチウイルスベクターを解凍すること、製剤化バルクレンチウイルスベクターを滅菌濾過すること、製剤化バルクレンチウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終レンチウイルスベクターを生成すること、および最終レンチウイルスベクターを凍結することをさらに含む。一部の実施形態では、最終レンチウイルスベクターは、≦－６５℃で凍結される。

【0072】

別の態様では、ウイルスベクターを生成するための懸濁方法から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を低減する方法が提供される。様々な実施形態では、ＨＣＰを低減する方法は、（ａ）ウイルスベクター（例えば、本明細書で企図される製造されたウイルスベクター）を含む採取され、清澄化された懸濁培養物上清を用意すること；（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、採取され、清澄化された懸濁培養物上清からウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；（ｃ）濃縮されたウイルスベクターを濾過すること；（ｄ）接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して、ウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；ならびに（ｅ）ウイルスベクターを製剤化して、製剤化バルクウイルスベクターを生成すること、および製剤化バルクウイルスベクターを滅菌濾過することを含む。

【0073】

様々な実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

【0074】

様々な実施形態では、ウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、マラバウイルス（ＭＡＲＡＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ピリウイルス（ＰＩＲＹＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ニパウイルス（ＮｉＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、センダイウイルス（ＳｅＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、モルビリウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、イヌジステンパー（ＣＤＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、麻疹ウイルス（ＭＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、および狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアントからなる群から選択される異種エンベロープタンパク質でシュードタイプ化される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）からなる異種エンベロープタンパク質でシュードタイプ化される。

【0075】

様々な実施形態では、採取および清澄化工程は、少なくとも約４０μｍまたは少なくとも約６０μｍの混入物を保持するタンデムデプスフィルターならびに約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備える二重層フィルターを通して懸濁培養物上清を濾過することを含む。

【0076】

様々な実施形態では、清澄化された懸濁培養物は、任意選択的に、１Ｍ ＨＥＰＥＳを用いて約ｐＨ７．０または約ｐＨ７．２に調整される。

【0077】

様々な実施形態では、上清は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを通過する。

【0078】

様々な実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーは、約４５μｍのビーズサイズおよび／または約１００ｎｍの平均孔サイズを有するカラムを含む。

【0079】

様々な実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む洗浄緩衝液は、クロマトグラフィーカラムを通過する。

【0080】

様々な実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む溶出緩衝液は、クロマトグラフィーカラムを通過する。

【0081】

様々な実施形態では、濾過工程（ｃ）は、約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して濃縮されたウイルスベクターを濾過することを含む。

【0082】

様々な実施形態では、ウイルスベクターは、約１００ｋＤａ～約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備えた中空繊維接線流濾過（ＴＦＦ）フィルターを使用して、限外濾過され、透析濾過される。一部の実施形態では、中空繊維ＴＦＦフィルターは、約１００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える。一部の実施形態では、中空繊維ＴＦＦフィルターは、約３００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える。一部の実施形態では、中空繊維ＴＦＦフィルターは、約５００ｋＤａの孔サイズまたは分子量カットオフを備える。

【0083】

様々な実施形態では、ウイルスベクターは、透析濾過緩衝液に透析濾過され、任意選択的に、透析濾過緩衝液は、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０である。

【0084】

様々な実施形態では、ウイルスベクターは、ＨＥＰＥＳおよびスクロースを含む緩衝液中で１：１で製剤化され、任意選択的に、緩衝液は、Ｌ－プロリン、ポロクサマー１８８、またはＮａＣｌをさらに含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１で製剤化される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約０．２～約２．０のポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１で製剤化される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む緩衝液で１：１で製剤化される。

【0085】

様々な実施形態では、製剤化バルクウイルスベクターは、任意選択的に、０．４５μｍのプレフィルターを備えた０．２２μｍのフィルターを通して滅菌濾過される。

【0086】

様々な実施形態では、方法は、製剤化バルクウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終ウイルスベクターを生成すること、および最終ウイルスベクターを凍結することをさらに含む。

【0087】

様々な実施形態では、方法は、製剤化バルクウイルスベクターを凍結することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、製剤化バルクウイルスベクターを解凍すること、製剤化バルクウイルスベクターを滅菌濾過すること、製剤化バルクウイルスベクターの充填仕上げを行い、最終ウイルスベクターを生成すること、および最終ウイルスベクターを凍結することをさらに含む。

【0088】

様々な実施形態では、最終ウイルスベクターは、≦－６５℃で凍結される。

【図面の簡単な説明】

【0089】

【図1】図１は、懸濁培養物からのレンチウイルスベクターの生成のための上流のプロセスフロー、下流のプロセスフローおよび充填完了の例を示す。

【図2】図２は、懸濁培養物からのレンチウイルスベクターの生成のための上流のプロセスフロー、下流のプロセスフローおよび充填完了の例を示す。

【図3A】図３Ａ～３Ｃは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、およびｖｓｖ－ｇのパッケージングプラスミドのプラスミドマップを示す。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図4】図４は、懸濁培養物からのレンチウイルスベクターの生成のための上流プロセスフロー、下流プロセスフローおよび充填完了の例を示す。

【図5】図５は、異なるＬＶＶ製造方法間の総感染力価収量の比較を示す。

【図6】図６は、異なるＬＶＶ製造方法間の感染力価の比較を示す。

【図7】図７は、異なるＬＶＶ製造方法間の粒子の感染力に対する比の比較を示す。

【図8】図８は、異なるＬＶＶ製造方法間の正規化宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の比較を示す。

【図9】図９は、異なるＬＶＶ製造方法間の累積宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）対数減少の比較を示す。

【図10】図１０は、異なるＬＶＶ製造方法間の工程宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）対数減少の比較を示す。

【発明を実施するための形態】

【0090】

Ａ．概要
本開示は、概して、部分的には、臨床使用のためのレトロウイルスベクターを製造するための改善された大規模プロセスに関する。いかなる特定の理論によって結び付けられることを望むものではないが、本開示は、臨床グレードのレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを生成するための製造プロセスを提供する最初のものである。本明細書で企図される製造プロセスを使用して生成されるベクターは、当該技術分野に存在する方法によって合致されない感染性および純度を有する臨床規模で生成される。さらに、本開示は、製造されたウイルスベクター上清からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を低減するための方法を提供する。

【0091】

当該技術分野に存在する製造プロセスは、通常、ベクター品質を犠牲にしてウイルスベクター量を増加させるという側面で誤っている。本明細書で企図される製造プロセスは、品質のための取引量の技術分野における問題を解決し、商業規模で高品質の臨床グレードベクターの生成を可能にする。実際に、本明細書で企図されるプロセスは、より高い感染力価（ＴＵ／ｍｌ）、および一部の実施形態では、同等またはより低い宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを示す。

【0092】

企図される製造プロセスは、ウイルスベクターを生成する上流のプロセス、およびウイルスベクターを精製する下流プロセスを含む。企図される製造プロセスは、バイオリアクター内に大規模宿主細胞培養物を確立すること；ウイルスアクセサリー遺伝子をコードするパッケージングプラスミドおよびトランスファープラスミドを含む混合物で宿主細胞を一過性にトランスフェクトすること；トランスフェクトされた宿主細胞を培養して、ウイルスを生成すること；および粗レンチウイルスベクターを含有する培養上清を収集し、処理して、不純物を除去し、濃縮し、臨床使用のためにウイルスベクターを製剤化することを含む。

【0093】

特定の実施形態では、本明細書で企図される製造プロセスは、大規模、例えば、少なくとも２００Ｌの作業量であるバイオリアクターに播種するのに十分な量の宿主細胞まで、宿主細胞を徐々により大量の量で解凍し、培養し、拡大することを含む上流プロセスを含む。播種された宿主細胞は、所望の密度まで培養され、培地は交換され、細胞は、トランスフェクション剤、ウイルスアクセサリー遺伝子をコードするパッケージングプラスミド、および治療用導入遺伝子を含むパッケージング可能なウイルスベクターゲノムをコードするトランスファープラスミドを含む混合物でトランスフェクトされる。トランスフェクションに十分な時間の後、別の培地交換が行われ、トランスフェクトされた宿主細胞を培養して、ウイルスベクターを約一～約三日間生成する。好ましい実施形態では、宿主細胞は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で培養される。

【0094】

特定の実施形態では、本明細書で企図される製造プロセスは、バイオリアクターの内容物をＤＮＡエンドヌクレアーゼで処理すること；濾過によって懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；アフィニティークロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、得られた濾液中のウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；ウイルスベクターを含む溶出物を濾過すること；接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して、ウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；培養培地中でウイルスベクターを製剤化して、製剤化バルクウイルスベクターを生成することを含む下流プロセスを含む。一実施形態では、製剤化バルクレンチウイルスベクターは、滅菌濾過され、充填され、凍結され；その後、解凍され、滅菌濾過され、最終充填仕上げに供される。別の実施形態では、バルクレンチウイルスベクターは、滅菌濾過され、最終充填仕上げに供され、凍結される。

【0095】

好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであり、さらにより好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

【0096】

組み換え（すなわち、操作された）ＤＮＡ、ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成、免疫アッセイ、組織培養、形質変換（例、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製ならびに関連する技術及び手法は、本明細書を通じて引用され、考察される、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学及び免疫学における様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように一般的に行われてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００８年７月に更新）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ，１９８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、並びにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの専門誌の研究論文を参照されたい。

【0097】

Ｂ．定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ちうる。

【0098】

他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと類似した、又は均等の方法及び材料を、特定の実施形態の実施又は検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法及び材料の実施形態を開示している。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。

【0099】

冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、当該冠詞の文法上の対象の一つ又は複数（すなわち少なくとも一つ、又は一つもしくは複数）を指すために使用される。例示として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、一つの要素、又は一つもしくは複数の要素を意味する。

【0100】

選択肢（例、「又は」）の使用は、いずれか一つ、両方、又はその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。

【0101】

「および／または」という用語は、いずれか一つ、またはその選択肢の両方を意味すると理解されたい。

【0102】

本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％までも変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。一つの実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに関し、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さの範囲を指す。

【0103】

一実施形態では、例えば、１～５、約１～５、又は約１～約５といった範囲は、当該範囲に包含される各数値を指す。例えば、一つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、範囲「１～５」は、表現１、２、３、４、５、又は１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、若しくは５．０、又は１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０と同等である。

【0104】

本明細書中で使用するように、用語「実質的に」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さとほぼ同じである効果、例えば、生理学的効果を生じる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。

【0105】

本明細書全体を通じて、文脈が別段要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと」は、規定される工程もしくは要素又は工程もしくは要素のグループを含むことを暗示するが、任意の他の工程もしくは要素又は工程もしくは要素のグループを除外することを暗示しないことは理解されるだろう。「～からなる」とは、語句「からなる」に先行するもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。このように、文言「～からなる」は、列記される要素が必要又は義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に～からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、及び列記される要素に関して本開示中に特定される活性若しくは作用に干渉しない、又は寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。このように、文言「本質的に～からなる」は、列記される要素が必須又は義務であり、しかし列記される要素の活性又は作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。

【0106】

本明細書全体を通じて「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、又はそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造又は特徴が、少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。このように、本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。更に、特定の性質、構造、又は特徴は、一つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされ得る。また、一実施形態でのある性質の肯定的な列挙は、特定の実施形態では当該性質の除外の根拠として機能することを理解されたい。

【0107】

用語「ベクター」は、別の核酸分子を細胞またはゲノムに移送または輸送する能力がある核酸分子、微生物、またはウイルスを指すために本明細書で使用される。ベクターの例示的な例としては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、細菌、およびウイルスベクターが挙げられる。

【0108】

「ウイルスベクター」という用語は、核酸分子の移行または細胞および／もしくはゲノムへの統合を典型的には促進するウイルス由来核酸エレメントを含む核酸分子を指すために特定の実施形態で使用される。「ウイルスベクター」という用語はまた、特に好ましい実施形態では、核酸を細胞および／またはゲノムに輸送する能力がある改変ウイルスまたはウイルス粒子のいずれかを指す。ウイルスベクターは、主に、ウイルスから誘導される構造的および／または機能的遺伝エレメントを含有してもよい。好ましい実施形態での使用に適したウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0109】

レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５－４６０）。本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有的に組み込むウイルスベクターを指す。特定の実施形態での使用に好適な例示的なレトロウイルスベクターには、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、並びにレンチウイルスから誘導されるものが含まれる。

【0110】

本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（又は種）を指す。本明細書で企図される特定の実施形態での使用に適したレンチウイルスベクターの例としては、限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）；ビスナマエディウイルス（ＶＭＶ）；カプリン関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から誘導されるものが挙げられる。

【0111】

「プロベクター」または「プロウイルス」という用語は、宿主ゲノムに統合されたウイルスベクターを指す。プロベクターは、ウイルスベクターに類似しているが、逆転写中に生成された３’ＬＴＲの二つのコピーを含み、例えば、Ｐｌｕｔａ ａｎｄ Ｋａｃｐｒｚａｋ，２００９を参照されたい。

【0112】

特定の実施形態では、ウイルスベクターは、５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰエレメント、ＲＮＡ輸送エレメント、導入遺伝子、および３’ＬＴＲを含む。ウイルスベクターは、任意選択的に、転写後制御エレメントおよびポリアデニル化シグナル／配列を含み得る。

【0113】

「長末端反復（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」という用語は、レトロウイルスゲノムの末端に位置する塩基対のドメインを指し、本来の配列ではＬＴＲはダイレクトリピートであり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含有する。ＬＴＲは、概して、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始、およびポリアデニル化）ならびにウイルス複製に基本的な機能をもたらす。ＬＴＲは、転写調節エレメント、ポリアデニル化シグナルおよびウイルスゲノムの複製および統合に必要な配列を含む多数の制御シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる三つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（繰り返し）領域は、Ｕ３領域およびＵ５領域が隣接している。ＬＴＲは、Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域から構成され、ウイルスゲノムの５’末端と３’末端の両方に存在する。５’ＬＴＲに隣接するものは、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージング（Ｐｓｉ部位）に必要な配列である。

【0114】

本明細書で使用される場合、「改変されたＬＴＲ」という用語は、天然ウイルス５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲにおける一つまたは複数のヌクレオチド付加、欠失または置換を指す。当業者であれば、ＬＴＲが参照ＬＴＲと比較して改変されているかどうかを決定することができるであろう。ＬＴＲの一方または両方は、一つまたは複数の改変を含んでもよい。３’ＬＴＲの改変は、ウイルスベクターを複製欠損させることを含むがこれに限定されない、ウイルスベクターシステムの安全性を改善するためにしばしば行われる。

【0115】

本明細書で使用される場合、「複製欠損」という用語は、感染性ウイルス粒子が生成されないように（例えば、複製欠損ウイルス子孫）、完全で有効に複製する能力がないウイルスベクターを指す。

【0116】

「自己不活化」（ＳＩＮ：ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ウイルスベクターとは、複製能力を欠いたベクターを指し、例えば右（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域はＵ３領域として知られているが、この領域が（例えば欠失または置換により）改変されて、ウイルス複製の最初のラウンドを超えたウイルス転写が阻害される、レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクターなどがある。これは、右（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域がウイルス複製中に左（５’）ＬＴＲ Ｕ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルス転写物は、Ｕ３エンハンサープロモーターなしでは作製できないためである。自己不活化は、ベクターＤＮＡ、すなわちベクターＲＮＡを生成するために使用されるＤＮＡの３’ＬＴＲのＵ３領域に欠失を導入することで実現されることが好ましい。そうすることで、逆転写の間にこの欠失がプロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲに移送される。レンチウイルスベクターの場合、そうしたベクターは、ＬＴＲ ＴＡＴＡ ｂｏｘの除去（例えば－４１８～－１８の欠失）を含む大幅なＵ３欠失に耐用性があり、ベクター力価の大きな低下は伴わないことが判明している。

【0117】

追加の安全性の強化は、５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルスベクター生成中にウイルスベクターゲノムの転写をもたらすための異種プロモーター（すなわち、キメラ５´ＬＴＲ）で置き換えることによってもたらされる。キメラ５’ＬＴＲプロモーターは、Ｔａｔ非依存的な様式で高レベルの転写をもたらすことができる。本明細書で企図される特定の実施形態での使用に適した異種プロモーターの例としては、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0118】

「Ｒ領域」は、キャッピング基の開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡトラクトの開始直前に終わるＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域はまた、Ｕ３領域およびＵ５領域に隣接しているとして定義される。Ｒ領域は、逆転写中に、ゲノムの一方の端から他方の端への新生ＤＮＡの移行を可能にするのに役割を果たす。

【0119】

特定の実施形態で企図されるウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝エレメントを指す。このエレメントは、トランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝エレメントと相互作用して、ウイルス複製を強化する。しかしながら、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置換されるウイルスベクターにおいては必要とされない。

【0120】

本明細書において使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージ配列」という用語は、ウイルスゲノム内に位置する配列を指し、ウイルスカプシドまたはウイルス粒子内にウイルスＲＮＡを挿入するために必要とされる。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９、Ｎｏ．４、ｐｐ．２１０１－２１０９を参照されたい。いくつかのウイルスベクターは、ウイルスゲノムのキャプシド形成に必要な最小パッケージングシグナル（ｐｓｉ［Ψ〕または〔Ψ＋］配列としても言及される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「ｐｓｉ」および記号「Ψ」という用語は、ウイルス粒子形成中のウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要な非コード配列を参照して使用される。

【0121】

本明細書において使用される場合、「ＦＬＡＰ因子」、または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、その配列が、ウイルスベクターの中心ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）と中心末端配列（ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰ因子は、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ウイルス逆転写中、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）でのプラス鎖ＤＮＡの中心開始および中心終結配列（ＣＴＳ）での中心終結は、中心ＤＮＡ ＦＬＡＰという三本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらす。いかなる理論によって結びつけられることを望むものではないが、ＤＮＡ ＦＬＡＰは、ウイルスベクターゲノム核輸入のシス活性決定因子として作用してもよく、および／またはウイルスの力価を増加させてもよい。

【0122】

「輸出因子」という用語は、シス作用性の転写後制御因子を指し、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を制御する。ＲＮＡ排出エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照）が挙げられるが、これに限定されない。

【0123】

本明細書で使用される場合、「転写後制御エレメント」または「ＰＲＥ」という用語は、例えば、キャッピング、スプライシング、ポリ（Ａ）テール付加、およびｍＲＮＡ安定性を制御することによって、ｍＲＮＡレベルでの発現を制御するシス作用エレメントを指す。ＰＴＥの例示的な例としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）に存在する転写後制御エレメント（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｙｅｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）；および同様のもの（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0124】

本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）部位」又は「ポリ（Ａ）配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止及びポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリ（Ａ）テールをコード配列の３’末端に付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進することができ、したがって、翻訳効率の向上に寄与する。切断及びポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列によって指向される。哺乳類プレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断ポリアデニル化部位に隣接する二つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、Ｕ残基又はＧＵ残基が豊富な、より可変性であるエレメントの上流２０～５０ヌクレオチドに存在する。初期転写物の切断はこれら二つのエレメントの間で発生し、５’切断産物に最大で２５０個のアデノシンが付加される。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、ポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。

【0125】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよく、かつ組換え、合成、又は単離のいずれかであってもよい。ポリヌクレオチドとして、限定されるものではないが、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組み換えＤＮＡが挙げられる。特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドの例示的な例としては、トランスファープラスミド、ウイルス構造タンパク質および／またはアクセサリータンパク質、例えば、ｇａｇ、ポリ、ｔａｔ、ｒｅｖ、および／またはｅｎｖをコードするプラスミド、ならびに対象のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0126】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などという用語は、本明細書に記載される参照配列のいずれかと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを指し、典型的には、バリアントは、参照配列の少なくとも一つの生物学的活性を維持する。ポリヌクレオチドバリアントは、一つ以上のヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドに比べて、付加若しくは欠失若しくは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関して、当該技術分野において、参照ポリヌクレオチドに対し、変異、付加、欠失、及び置換を含むある特定の改変がなされ、改変されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は生物学的活性を保持し得ると十分に理解されている。

【0127】

本明細書で使用される場合、「対象のポリヌクレオチド」という用語は、発現されることが望まれるベクターに挿入される治療用ポリペプチドを含む、一つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチド（すなわち、対象のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、ベクターおよび／またはプラスミドは、一つまたは複数の治療用ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｈｍｉＲ、および／または治療用ポリペプチドをコードする一つまたは複数の対象のポリヌクレオチドを含む。

【0128】

ポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所に開示されるか当該技術分野で知られている、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。ゆえに、ほとんどすべての長さのポリヌクレオチド断片が採用され得ること、好ましくは全体の長さは調製の容易さ、および意図される組み換えＤＮＡプロトコールでの用途により制限されることが企図される。

【0129】

用語「作動可能に連結した」は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。

【0130】

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーならびにそのバリアントおよび合成類似体を指すために、本明細書で互換的に使用される。したがって、これらの用語は、一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の化学類似体などの合成非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドの例示的な例としては、特定の実施形態の組成物および方法における使用に適したグロビンポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。また、例えば、米国特許第６，０５１，４０２号、第７，９０１，６７１号、第９，０６８，１９９号を参照されたく、その開示および特許請求の範囲全体は、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。

【0131】

本明細書で企図される特定の実施形態はまた、ポリペプチド「バリアント」を含む。列挙ポリペプチド「バリアント」は、少なくとも一つのアミノ酸残基の付加、欠失、切断、修飾、および／または置換によって参照ポリペプチドと区別され、生物学的活性を保持するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、当該技術分野で公知の保存的または非保存的であり得る一つまたは複数の置換によって参照ポリペプチドと区別される。ある特定の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの対応する配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸の付加または欠失は、参照ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端で生じる。

【0132】

追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。

【0133】

Ｃ．上流ウイルスベクター製造プロセス
本明細書で企図される上流製造プロセスは、大量のバイオリアクター内で宿主細胞の集団を培養することと、宿主細胞を、トランスファープラスミド、パッケージングプラスミドおよびトランスフェクション剤を含む混合物でトランスフェクトすること；およびトランスフェクトされた宿主細胞を培養して、ウイルスベクターを生成することを含む。特定の実施形態では、本明細書で企図される上流製造プロセスは、様々な下流製造プロセスと組み合わせて使用することができる。

【0134】

本明細書の特定の実施形態で企図される上流製造プロセスは、宿主細胞のワーキングセルバンクを解凍すること；大量のバイオリアクターに播種するのに十分な量の宿主細胞まで、徐々により大量の量で宿主細胞を培養し、拡大すること；大量のバイオリアクターに宿主細胞を播種し、トランスフェクションに十分な密度に達するまで宿主細胞を培養すること；バイオリアクター内の培養培地を交換すること；宿主細胞を、トランスフェクション剤、ウイルスアクセサリー遺伝子をコードするパッケージングプラスミドおよび治療用導入遺伝子を含むパッケージング可能なウイルスベクターゲノムをコードするトランスファープラスミドを含む混合物でトランスフェクトすること；トランスフェクションされた細胞を、完全トランスフェクションに十分な期間培養すること；バイオリアクター内の培養培地を交換すること；および細胞を約一～約三日間培養して、ウイルスベクターを生成することを含む。

【0135】

本明細書の特定の実施形態で企図される上流製造プロセスは、宿主細胞のワーキングセルバンクを解凍すること；大量のバイオリアクターに播種するのに十分な量の宿主細胞まで、徐々により大量の量で宿主細胞を培養し、拡大すること；大量のバイオリアクターに宿主細胞を播種し、トランスフェクションに十分な密度に達するまで宿主細胞を培養すること；バイオリアクター内の培養培地を交換すること；宿主細胞を、トランスフェクション剤、ウイルスアクセサリー遺伝子をコードするパッケージングプラスミドおよび治療用導入遺伝子を含むパッケージング可能なウイルスベクターゲノムをコードするトランスファープラスミドを含む混合物でトランスフェクトすること；トランスフェクションされた細胞を、完全トランスフェクションに十分な期間培養すること；バイオリアクター内の培養培地を交換すること；および細胞を約一～約三日間培養して、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを生成することを含む。

【0136】

様々な実施形態では、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターの上流製造プロセスは、宿主細胞のワーキングセルバンクを解凍すること、約１８日間にわたって無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で徐々により大量の量で宿主細胞を拡大すること；例えば、少なくとも２００リットルの作業量の、大量のバイオリアクターに、ある量の生宿主細胞を接種すること、および無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で宿主細胞を約三日間培養すること；バイオリアクター内の細胞培養培地を、新鮮な無血清の化学的に規定された細胞培養培地と交換すること；細胞を、トランスフェクション剤、ウイルスアクセサリー遺伝子をコードするパッケージングプラスミドおよび治療用導入遺伝子を含むパッケージング可能なウイルスベクターゲノムをコードするトランスファープラスミドを含む混合物でトランスフェクトすること；バイオリアクター内の培養培地を、約１２時間～約２０時間のトランスフェクションまたは約１４時間～約１８時間のトランスフェクションで、新鮮な無血清の化学的に規定された細胞培養培地と交換すること；およびトランスフェクトされた宿主細胞を約一日間または約三日間培養して、レトロウイルスベクターを生成することを含む。好ましい実施形態では、培養上清は、約一日間または約三日間のレトロウイルス生成中に一回収集される。特定の実施形態では、培養上清は、約一日間～約三日間のレトロウイルスベクター生成中に一回、二回、または三回収集される。

【0137】

１．宿主細胞
本明細書で企図される大規模ウイルスベクター生成プロセスは、ウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、および／またはｎｅｆ遺伝子をコードするトランスファーベクターおよびプラスミドを、宿主細胞の集団に導入することを含む。

【0138】

「宿主細胞」は、ウイルスベクターを生成するように改変される細胞を指す。特定の実施形態では、宿主細胞は、パッケージング細胞およびプロデューサー細胞を含む。「パッケージング細胞」は、ウイルスベクターゲノムのウイルスベクターへのパッケージングを可能にするウイルス構造および／またはアクセサリー遺伝子を発現するように改変された宿主細胞である。パッケージング細胞は、ウイルスベクターゲノムをウイルスベクターにパッケージングするためのパッケージングシグナルを含有しない。「プロデューサー細胞」は、ウイルスベクターゲノムをウイルスベクターにパッケージングするためのパッケージングシグナルを含むウイルスベクターゲノムを含有するパッケージング細胞である。

【0139】

好ましい実施形態では、宿主細胞は、懸濁培養で培養され得るか、または懸濁培養に適合される能力がある哺乳類細胞である。

【0140】

特定の実施形態では、特定の実施形態での使用に適した宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、Ａ５４９細胞、およびＨＥＫ２９３細胞ならびにその誘導体が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、懸濁培養に適合させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ３９２Ｔ）、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴＭ細胞、およびＨＥＫ２９３Ｅ細胞からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。

【0141】

２．拡大培養
宿主細胞は、多くの場合、ワーキングセルバンクの一部としてアリコートで保存される。ワーキングセルバンクは、宿主細胞拡大培養における再現性を最大化するために、宿主細胞の実質的に類似したアリコートを保存する便利な方法である。特定の実施形態で企図される上流製造プロセスは、宿主細胞を解凍し、宿主細胞を徐々により大量の量で培養して、大規模バイオリアクターに播種するのに十分な数の生宿主細胞を生成することを企図した。特定の実施形態での使用に適した大規模バイオリアクターとしては、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、または少なくとも２０００Ｌの作業量を有するバイオリアクターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0142】

特定の実施形態では、ワーキングセルバンクは解凍され、宿主細胞は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４日の総時間にわたって徐々により大量の量で、１、２、３、４、５、６回またはそれ以上の培養ラウンド（例えば、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）を通して拡大される（または継代される）。

【0143】

宿主細胞は、化学的に規定された細胞培養培地中での拡大のため培養される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で培養される。特定の実施形態での使用に適した無血清の化学的に規定された細胞培養培地の例示的な例としては、限定されないが、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地、Ｅｘ－Ｃｅｌｌ ２９３無血清培地、Ｅｘｐｉ２９３発現培地、およびＯｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地が挙げられる。宿主細胞は、約３７℃および約ｐＨ７で培養される。

【0144】

特定の実施形態では、ワーキングセルバンクは解凍され、宿主細胞培養物が、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の生細胞が少なくとも約．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約２×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも約２．５×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度に達するまで、宿主細胞は、約５０ｍＬの培地の体積（例えば、少なくとも２５０ｍＬの培養容器）で培養される。特定の実施形態では、５０ｍＬの培養物は、Ｐ０（第一継代）培養物と呼ばれる。

【0145】

特定の実施形態では、Ｐ０培養物からの生宿主細胞が、十分な密度に達した後、宿主細胞培養物が、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の生細胞が、少なくとも約２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬ、８．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１１×１０^６細胞ｓ／ｍＬ、少なくとも約１１５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１４．５×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも約１５×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度に達するまで、細胞は、約１００ｍＬの培地の培養体積（例えば、少なくとも５００ｍＬの培養容器）まで拡大される。特定の実施形態では、１００ｍＬの培養物は、Ｐ１（第二継代）培養物と呼ばれる。

【0146】

特定の実施形態では、Ｐ１培養物からの生宿主細胞が、十分な密度に達した後、宿主細胞培養物が、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の生細胞が、少なくとも約２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬ、８．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１１×１０^６細胞ｓ／ｍＬ、少なくとも約１１５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１４．５×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも約１５×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度に達するまで、細胞は、それぞれが約２００ｍＬの培地の培養体積（例えば、少なくとも１Ｌの培養容器）を有する一回、二回または三回培養物まで拡大される。特定の実施形態では、２００ｍＬの培養物は、Ｐ２（第三継代）培養物と呼ばれる。

【0147】

特定の実施形態では、Ｐ２培養物からの生宿主細胞が、十分な密度に達した後、宿主細胞培養物が、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の生細胞が、少なくとも約２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬ、８．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１１×１０^６細胞ｓ／ｍＬ、少なくとも約１１５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１４．５×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも約１５×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度に達するまで、細胞は、それぞれが約１Ｌの培地の培養体積（例えば、少なくとも３Ｌの培養容器）を有する一回、二回または三回培養物まで拡大される。特定の実施形態では、１Ｌの培養物は、Ｐ３（第四継代）培養物と呼ばれる。

【0148】

特定の実施形態では、Ｐ３培養物からの生宿主細胞が、十分な密度に達した後、宿主細胞培養物が、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の生細胞が、少なくとも約２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０^６細胞／ｍＬ、８．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約９．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１１×１０^６細胞ｓ／ｍＬ、少なくとも約１１５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１４．５×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも約１５×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度に達するまで、細胞は、約２０Ｌの培地の体積のバイオリアクター（例えば、少なくとも５０Ｌの体積を有するバイオリアクター）での培養物まで拡大される。特定の実施形態では、２０ｍＬの培養物は、Ｐ４（第五継代）培養物と呼ばれる。

【0149】

特定の実施形態では、Ｐ４培養物からの生宿主細胞が、十分な密度に達した後、少なくとも約２００Ｌの作業量を有する大規模バイオリアクター（Ｐ５、第六継代培養物）は、少なくとも約０．１×１０^６生細胞／ｍＬ、少なくとも約０．１５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約０．２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約０．３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約０．３５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約０．４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約０．４５×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも約０．５×１０^６細胞／ｍＬで播種される。

【0150】

様々な実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約５０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約６０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約７０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約８０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約９０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約１００．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約１１０．０×１０^８～約１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８～約１１０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８～約１００．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８～約９０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８～約８０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８～約７０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８～約６０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８～約５０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約５０．０×１０^８～約１１０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約６０．０×１０^８～約１００．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約７０．０×１０^８～約９０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約４０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約５０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約６０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約７０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約８０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、約９０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、１００．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、１１０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。一部の実施形態では、大規模懸濁バイオリアクターは、１２０．０×１０^８個の生宿主細胞に播種／接種される。

【0151】

細胞は、トランスフェクション前の生細胞密度が、少なくとも約２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約４．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約５．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約６．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約７×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも約７．５×１０^６細胞／ｍＬになるまで、約二、約三、または約四日間培養される。

【0152】

特定の実施形態では、大規模バイオリアクター中で培養された宿主細胞は、所望の形質導入前生細胞密度に到達し、バイオリアクター中の細胞培養培地は、新鮮な化学的に規定された細胞培養培地と交換される。特定の実施形態では、交互接線流濾過（ＡＴＦ）フィルター単位、ＴＦＦフィルター単位、または音響フィルター単位を使用して、培地交換を行う。一実施形態では、ＡＴＦフィルター単位を使用して、培地交換を行う。一実施形態では、ＴＦＦフィルター単位を使用して、培地交換を行う。一実施形態では、音響フィルター単位を使用して、培地交換を行う。好ましい実施形態では、バイオリアクター培地が交換された後、宿主細胞は、トランスフェクションの準備ができている。

【0153】

３．トランスフェクション
トランスフェクションは、物理的または化学的方法（非ウイルス性）によって宿主細胞に一つまたは複数のポリヌクレオチドを導入するプロセスである。「トランスフェクション」は、非ウイルス法によってネイキッドＤＮＡを細胞に導入するプロセスを指す。トランスフェクションは、安定または一過性であり得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、ウイルスベクターゲノムをパッケージングするための一つまたは複数のウイルス構造および／またはアクセサリー遺伝子をコードする一つまたは複数のプラスミド、パッケージングシグナルを含むトランスファープラスミドならびに導入遺伝子（例えば、治療用遺伝子、対象の遺伝子、もしくは対象のポリヌクレオチド）を含むウイルスベクターゲノム、ならびにトランスフェクション剤を含む混合物で一過性にトランスフェクトされる。

【0154】

「トランスフェクション剤」は、宿主細胞へのＤＮＡのトランスフェクションを増加させる分子である。本明細書で企図される特定の実施形態での使用に適したトランスフェクション剤の例示的な例としては、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、およびカチオン性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0155】

本明細書で企図される特定の実施形態での使用に適したカチオン性脂質の例示的な例としては、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロペル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－スペルミンカルボキサミド〕エチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ、リポフェクタミン）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジミリストイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ），３－β－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル〕コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）；ジオクタデシルアミドグリセリルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）；および臭化イメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、リポフェクタミンである。

【0156】

本明細書で企図される特定の実施形態での使用に適したカチオン性ポリマーの例示的な例としては、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、デンドリマー、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0157】

特定の実施形態では、大規模バイオリアクター中の宿主細胞は、トランスフェクション剤、ウイルス構造および／またはアクセサリー遺伝子をコードする一つまたは複数のプラスミド、ならびにヒト治療用導入遺伝子をコードするパッケージング可能なウイルスベクターゲノムを含むトランスファープラスミドを含む混合物で一過性にトランスフェクトされる。好ましい実施形態では、トランスフェクション剤は、カチオン性ポリマーを含み、より好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーは、ＰＥＩを含み、さらにより好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーは、直鎖状ＰＥＩを含む。

【0158】

特定の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約５～約１０、または約５、約５．５、約６、約６．４、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、もしくは約１０である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約５～約１０である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約５である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約５．５である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約６である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約６．４である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約６．５である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約７である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約７．５である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約８である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約９．５である。一部の実施形態では、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物についてのＮ（ＰＥＩ中のＮＨ２アミン）：Ｐ（ＤＮＡ骨格中のリン酸基）の比は、約１０である。

【0159】

好ましい実施形態では、一つまたは複数のプラスミドは、レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、異種エンベロープタンパク質、および任意選択的に、ｔａｔをコードするポリヌクレオチドを含み、より好ましくは、一つまたは複数のプラスミドは、レンチウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、および異種エンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0160】

特に好ましい実施形態では、一つまたは複数のプラスミドは、レンチウイルスｇａｇおよびｐｏｌをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド、レンチウイルスｒｅｖをコードするプラスミド、ならびにベジクロウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、パラミクソウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、アルファウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、ガンマレトロウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、オルトヘパドナウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、ヘパシウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、およびリッサウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント由来のエンベロープ糖タンパク質を含むが、これらに限定されない異種エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドを含む。

【0161】

特に好ましい実施形態では、一つまたは複数のプラスミドは、レンチウイルスｇａｇおよびｐｏｌをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド、レンチウイルスｒｅｖをコードするプラスミド、ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、マラバウイルス（ＭＡＲＡＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ピリウイルス（ＰＩＲＹＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ニパウイルス（ＮｉＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、センダイウイルス（ＳｅＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、モルビリウイルスエンベロープタンパク質またはそのバリアント、イヌジステンパー（ＣＤＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、麻疹ウイルス（ＭＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント、および狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）エンベロープタンパク質またはそのバリアント由来のエンベロープ糖タンパク質を含むが、これらに限定されない異種エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドを含む。

【0162】

好ましい実施形態では、トランスファーベクターは、パッケージング配列を含み、ヒト治療用導入遺伝子をコードするＨＩＶレンチウイルスベクター骨格を含み、好ましくは、トランスファーベクターは、パッケージング配列を含み、重篤な遺伝子疾患または癌の処置のためのヒト治療用導入遺伝子をコードするＨＩＶ－１レンチウイルスベクター骨格を含む。特定の実施形態では、トランスファーベクターは、パッケージング配列を含み、ヘモグロビン異常症の処置のためのヒト治療用グロビン、ＣＡＬＤの処置のためのＡＢＣＤ１遺伝子、または癌の処置のためのキメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、もしくはＤＡＲＩＣをコードするパッケージング配列を含むＨＩＶ－１レンチウイルスベクター骨格を含む。

【0163】

特定の実施形態では、大規模バイオリアクター中の宿主細胞は、直鎖状ＰＥＩ、レンチウイルスｇａｇおよびｐｏｌをコードするプラスミド、ｒｅｖをコードするプラスミド、ＶＳＶ－Ｇをコードするプラスミドならびにヒト治療用導入遺伝子をコードするパッケージ可能なＨＩＶ－１ベースのレンチウイルスベクターゲノムを含むトランスファープラスミドを含む混合物で一過性にトランスフェクトされる。特定の実施形態では、レンチウイルスｇａｇおよびｐｏｌ、ｒｅｖ、ならびに／またはＶＳＶ－Ｇは、ヒト細胞における発現および／または安定性に最適化されたコドンである。特定の実施形態では、トランスファープラスミドおよびパッケージングプラスミドは、選択カセットまたは遺伝子を含む。好ましい実施形態では、トランスファープラスミドおよびパッケージングプラスミドは、ＲＮＡｏｕｔ選択カセット（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、または約２０時間トランスフェクトされる。特定の実施形態では、宿主細胞は、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、または約１８時間トランスフェクトされる。より特定の実施形態では、宿主細胞は、約１４時間～約１８時間トランスフェクトされる。

【0164】

宿主細胞トランスフェクションが完了した後、例えば、トランスフェクションの約１４時間～約１８時間後に、交互接線流濾過（ＡＴＦ）フィルター単位、ＴＦＦフィルター単位、または音響フィルター単位を使用して、培地交換を行う。一実施形態では、ＡＴＦフィルター単位を使用して、培地交換を行う。一実施形態では、ＴＦＦフィルター単位を使用して、培地交換を行う。一実施形態では、音響フィルター単位を使用して、培地交換を行う。特定の実施形態では、バイオリアクター培地が交換された後、宿主細胞は、ウイルスベクター生成のため培養される。

【0165】

特定の実施形態では、ウイルスベクター生成は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で、トランスフェクションの約３６時間から約４８時間後、トランスフェクションの約３６時間から約４８時間後、トランスフェクションの約３６時間から約４６時間後、トランスフェクションの約３６時間から約４４時間後、トランスフェクションの約３８時間から約４８時間後、トランスフェクションの約３８時間から約４６時間後、トランスフェクションの約３８時間から約４４時間後、またはトランスフェクションの約３８時間から約４２時間後（例えば、トランスフェクションの３６時間後は、トランスフェクション混合物の宿主細胞への添加の３６時間後である）に生じる。特定の実施形態では、ウイルスベクター生成は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で、トランスフェクションの約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間または約４８時間後まで生じる。特定の実施形態では、ウイルスベクター生成は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、トランスフェクションの約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、または約４２時間後まで生じる。

【0166】

特定の実施形態では、ウイルスベクター生成は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、約１２時間～約４８時間、約１８時間～約４８時間、約１８時間～約３６時間、約１８時間～約３０時間、約２０時間～約２８時間、または約２２時間～約２６時間生じる。特定の実施形態では、ウイルスベクター生成は、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間または約４８時間生じる。

【0167】

特定の実施形態では、懸濁培養物上清は、十分なウイルスベクター生成を確実にするために、一回または複数回試料採取され、分析される。

【0168】

様々な実施形態では、懸濁培養物上清は、ウイルスベクター生成の期間中に一回、二回、三回またはそれ以上収集される。特定の実施形態では、懸濁培養物上清は、ウイルスベクター生成中に一回収集される。好ましい実施形態では、十分なウイルスベクター生成後、懸濁培養物上清は、下流製造プロセスの開始前に収集されない。

【0169】

Ｄ．下流ウイルスベクター製造プロセス
ウイルスベクター生成は、上流製造プロセスの終わりを印付る。下流製造プロセスは、ウイルスベクター生成期間の終わりに開始する。本明細書で企図される下流製造プロセスは、ウイルスベクター生成期間の終わりに、懸濁培養物上清にヌクレアーゼを添加すること；濾過を使用して、懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；クロマトグラフィーを使用して、採取され、清澄化された懸濁培養物上清からウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；ウイルスベクターを濾過すること；ウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；およびウイルスベクターを製剤化することを含む。特定の実施形態では、バルク製剤化ウイルスベクターは、滅菌濾過され、凍結され；その後、解凍され、滅菌濾過され；最終充填仕上げに供され；次いで、凍結される。他の特定の実施形態では、バルク製剤化ウイルスベクターは、滅菌濾過され、最終充填仕上げに供され；次いで、凍結される。

【0170】

本明細書の特定の実施形態で企図される下流製造プロセスは、ウイルスベクター生成期間の終わりに懸濁培養物上清にエンドヌクレアーゼを添加すること；タンデムデプス濾過を使用して、懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；アフィニティークロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、採取され、清澄化された懸濁培養物上清からウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；ウイルスベクターを濾過すること；接線流濾過を使用して、ウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；および細胞培養培地中でウイルスベクターを製剤化することを含む。特定の実施形態では、バルク製剤化ウイルスベクターは、滅菌濾過され、≦－６５℃で凍結され；その後、解凍され、滅菌濾過され；最終充填仕上げに供され；次いで、≦－６５℃で凍結される。他の特定の実施形態では、バルク製剤化ウイルスベクターは、滅菌濾過され、最終充填仕上げに供され；次いで、≦－６５℃で凍結される。

【0171】

本明細書の特定の実施形態で企図される下流製造プロセスは、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター生成期間の終わりに懸濁培養物上清にエンドヌクレアーゼを添加すること；タンデムデプス濾過および第二のフィルターを使用して、懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること；ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、採取され、清澄化された懸濁培養物上清からレトロウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；濃縮されたレトロウイルスベクターを濾過すること；中空繊維接線流濾過を使用して、レトロウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること；およびレトロウイルスベクターを製剤化することを含む。特定の実施形態では、バルク製剤化レトロウイルスベクターは、滅菌濾過され、≦－６５℃で凍結され；その後、解凍され、滅菌濾過され；最終充填仕上げに供され；次いで、≦－６５℃で凍結される。他の特定の実施形態では、バルク製剤化レトロウイルスベクターは、滅菌濾過され、最終充填仕上げに供され；次いで、≦－６５℃で凍結される。

【0172】

様々な実施形態では、レトロウイルスベクター生成および精製のための下流製造プロセスは、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター産生期間の終わりに懸濁培養物上清に、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、ＢｅｎｚｏｎａｓｅまたはＤｅｎａｒａｓｅを添加すること；タンデムデプス濾過および第二のフィルターを使用して、懸濁培養物上清を採取し、清澄化すること、第二のフィルターは、プレフィルター膜および濾過膜を備える；ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、採取され、清澄化された懸濁培養物上清からレトロウイルスベクターを捕捉し、濃縮すること；プレフィルター膜および濾過膜を備えたフィルターを用いて、濃縮されたレトロウイルスベクターを濾過すること；中空繊維接線流濾過を使用して、レトロウイルスベクターを限外濾過し、透析濾過すること、ＴＦＦは、約１００ｋＤａ～約５００ｋＤａの分子量カットオフを有する；および製剤緩衝液（例えば、２×幹細胞成長培地（ＳＣＧＭ））中レトロウイルスベクターを、任意選択的に、一部の実施形態では、好ましくは、１：１の比で含有する溶出物を製剤化することを含む。特定の実施形態では、バルク製剤化レトロウイルスベクターは、滅菌濾過され、≦－６５℃で凍結され；その後、解凍され、滅菌濾過され；最終充填仕上げに供され；次いで、≦－６５℃で凍結される。他の特定の実施形態では、バルク製剤化レトロウイルスベクターは、滅菌濾過され、最終充填仕上げに供され；次いで、≦－６５℃で凍結される。

【0173】

特定の実施形態では、本明細書で企図される下流製造プロセスは、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍もしくはそれ以上のウイルスベクター濃度をもたらす。

【0174】

１．ヌクレアーゼ消化
上流ウイルスベクター製造プロセスは、十分なウイルスベクターが生成された後、終了する。ウイルスベクター上清は、ＲＮＡ、宿主細胞トランスフェクション由来のプラスミドＤＮおよびウイルスベクター生成中の宿主細胞の溶解物由来のゲノムＤＮＡを含むが、これらに限定されない残留核酸を含んでもよい。かかる残留核酸は、潜在的に毒性であり、本明細書で企図される製造プロセスから生成される任意のウイルスベクターの有効性を減少させる。ヌクレアーゼ消化工程の目的は、ウイルスベクター生成上清中のこれらの残留核酸の量を低減することである。

【0175】

様々な実施形態では、ヌクレアーゼは、ウイルスベクター生成プロセスの終了時にウイルスベクター産生上清に添加される。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼであり、好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ／ＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡとＲＮＡの両方を切断するエンドヌクレアーゼ）である。本明細書で企図される下流製造プロセスの特定の実施形態での使用に適したエンドヌクレアーゼの例示的な例としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｄｅｎａｒａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（ｃ－ＬＥｃｔａ ＧｍｂＨ）、デコンタミナーゼ（商標）エンドヌクレアーゼ（ＡＧ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびセラチア・マルセセンス由来の組換えＮｕｃＡタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0176】

好ましい実施形態では、セラチア・マルセセンス由来のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼまたは組換えＮｕｃＡタンパク質は、ウイルスベクター生成プロセスの終了時にウイルスベクター産生上清に添加される。

【0177】

特定の実施形態では、ＭｇＣｌ_２を、エンドヌクレアーゼと共にウイルスベクター生成上清に添加して、エンドヌクレアーゼが触媒的に活性であることを確実にする。様々な実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約３６時間～約７２時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約３６時間～約４８時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約４８時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約４４時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約４０時間後に懸濁培養物上清に添加される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、トランスフェクションの約３６時間後に懸濁培養物上清に添加される。

【0178】

特定の実施形態では、下流ウイルスベクター製造プロセスのヌクレアーゼ消化工程は、適当な温度およびウイルスベクター生成上清に存在する混入核酸を消化するのに十分な時間行われる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ消化は、約２℃～約８℃で一晩行われる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ消化は、約３６℃～約３８℃で、約一、約二、または約三時間行われる。好ましい実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約３６℃、約３７℃、または約３８℃で、約一、約二、または約三時間行われる。より好ましい実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ消化は、約３７℃で約１～２時間行われる。

【0179】

様々な実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約２０Ｕ／ｍｌ～約７０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約５０Ｕ／ｍｌ～約７０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約５５Ｕ／ｍｌ～約６５Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約２０Ｕ／ｍｌ～約４０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約２５Ｕ／ｍｌ～約３５Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約５０Ｕ／ｍｌ～約７０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約２０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約２５Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約３０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約３５Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約４０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約４５Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約５０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約５５Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約６０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約６５Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ消化は、約７０Ｕ／ｍｌの濃度で行われる。

【0180】

ヌクレアーゼが、ウイルスベクター生成上清に存在する細胞外核酸を十分に消化した後、上清は、清澄化され、濾過される。

【0181】

２．清澄化
特定の実施形態で企図される下流ウイルスベクター製造プロセスは、清澄化工程をさらに含む。清澄化の最終的な目的は、下流クロマトグラフィーおよびウイルスベクターの精製のためのウイルスベクター生成上清の調製である。清澄化工程は、ウイルスベクター捕捉、クロマトグラフィー、および精製の前に、混入物、例えば、宿主細胞および細胞破片を除去する。

【0182】

特定の実施形態では、清澄化工程は、一次清澄化工程および二次清澄化工程を含む。特定の実施形態では、一次浄化工程は、デプス濾過を含み、二次清澄化工程は、膜濾過を含む。

【0183】

デプスフィルターは、規定された孔サイズまたは構造を有さない。デプスフィルターは、規定されたサイズの粒子を保持するように特別に設計された勾配密度構造を備える。粒子は、フィルター媒体の深さ全体に保持される。デプスフィルター媒体は、セルロース、珪藻土、または特定のサイズの混入物を保持するのに適した他の材料を含み得る。対照的に、膜フィルターは、膜表面で膜の孔サイズによって除外される特定のサイズの粒子を保持する。特定の実施形態では、膜フィルターは、プレ濾過前および濾過膜を有する。好ましい実施形態では、プレ濾過膜は、濾過膜よりも大きな孔サイズを有し、濾過膜の目詰まりまたは汚れを低減するように機能する。複数の形式のデプスフィルターおよび膜フィルターが市販されている。

【0184】

様々な実施形態では、懸濁培養物上清を採取し、清澄化することは、タンデムデプス濾過（一次清澄化）および膜濾過工程（二次清澄化）の工程を含む。

【0185】

特定の実施形態では、タンデムデプスフィルターは、少なくとも約４０μｍ～約６０μｍの混入物を保持する。特定の実施形態では、タンデムデプスフィルターは、少なくとも約４０μｍ、約５０μｍ、または約６０μｍの混入物を保持する。好ましい実施形態では、タンデムデプスフィルターは、少なくとも約６０μｍの混入物を保持する。好ましい実施形態では、タンデムデプスフィルターは、約６０μｍ以上の混入物を保持する。

【0186】

特定の実施形態では、タンデムデプスフィルターは、約４０μｍ～約６０μｍより大きなサイズを有する混入物を保持する。特定の実施形態では、タンデムデプスフィルターは、約４０μｍ、約５０μｍ、または約６０μｍより大きなサイズを有する混入物を保持する。好ましい実施形態では、タンデムデプスフィルターは、約６０μｍより大きなサイズを有する混入物を保持する。

【0187】

特定の実施形態では、膜濾過は、二重層濾過である。特定の実施形態では、二重層フィルターは、プレフィルター膜および濾過膜を備える。特定の実施形態では、二重層フィルターは、約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズを備えたプレフィルター膜および約０．２２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備えた最終濾過膜を含む。特定の実施形態では、二重層フィルターは、約０．４５μｍ～約のプレフィルター孔サイズを備えたプレフィルター膜および約０．２２μｍの最終フィルター孔サイズを備えた最終濾過膜を含む。特定の実施形態では、二重層フィルターは、約０．８のプレフィルター孔サイズを備えたプレフィルター膜および約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備えた最終濾過膜を含む。

【0188】

様々な実施形態では、懸濁培養物上清を採取し、清澄化することは、約４０μｍ、約５０μｍ、または約６０μｍより大きなサイズを有する混入物を保持するタンデムデプスフィルターを使用したタンデムデプス濾過（一次清澄化）の工程ならびに約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズを有するプレフィルター膜および約０．２２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを有する最終濾過膜を備えた二重層フィルターを使用した膜濾過工程（二次清澄化）を含む。

【0189】

特定の実施形態では、懸濁培養物上清を採取し、清澄化することは、約６０μｍ以上のサイズを有する混入物を保持するタンデムデプスフィルターを使用したタンデムデプス濾過（一次清澄化）の工程または約０．４５μｍのプレフィルター孔サイズを有するプレフィルター膜および約０．２２μｍの最終フィルター孔サイズを有する最終濾過膜を備えた二重層フィルターを使用した膜濾過工程（二次清澄化）を含む。

【0190】

特定の実施形態では、懸濁培養物上清を採取し、清澄化することは、約６０μｍ以上のサイズを有する混入物を保持するタンデムデプスフィルターを使用したタンデムデプス濾過（一次清澄化）の工程または約０．８μｍのプレフィルター孔サイズを有するプレフィルター膜および約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを有する最終濾過膜を備えた二重層フィルターを使用した膜濾過工程（二次清澄化）を含む。様々な実施形態では、清澄化された懸濁培養物は、１Ｍ ＨＥＰＥＳを用いて約ｐＨ７．０またはｐＨ７．２に調整される。一部の実施形態では、清澄化された懸濁培養物は、約ｐＨ７．０に調整される。一部の実施形態では、清澄化された懸濁培養物は、約ｐＨ７．２に調整される。

【0191】

ウイルスベクター生成上清が採取され、清澄化された後、それは、任意選択的に、適当な温度、例えば、約４℃、約２０℃、約３０℃、または約３７℃で、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、または約２４時間保存されてもよい。採取および清澄化、ならびに任意選択的に保存後、ウイルスベクターは、クロマトグラフィーを使用して捕捉され、濃縮される。

【0192】

３．クロマトグラフィー
特定の実施形態で企図される下流ウイルスベクター製造プロセスは、クロマトグラフィー工程をさらに含む。クロマトグラフィーは、通常、採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清からウイルスベクターを捕捉し、採取され、清澄化されたウイルスベクター産生上清中の望ましくない不純物がカラムを通過することを可能にするように設計された樹脂またはビーズを充填したカラムで行われる。次いで、捕捉されたウイルスベクターは、脱離剤を使用してカラムから移動または溶出される。

【0193】

特定の実施形態では、クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはマルチモードクロマトグラフィーである。

【0194】

イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、それらの総電荷に基づいてイオン化可能な分子を分離することを伴う。ＩＥＸは、陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーの両方を含む。陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）は、精製目的のためにウイルスベクター粒子の負に荷電した表面を利用する。ＡＥＸは、不活化ＨＩＶ－１ワクチンを調製するため、およびレトロウイルス、例えば、レンチウイルスベクターの精製のため使用されてきた。特定の実施形態では、採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清由来のウイルスベクターは、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して捕捉され、濃縮される。陽イオン交換クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）の別の形態である。陽イオン交換クロマトグラフィーは、正味の正の表面電荷を有する分子に対する親和性を有する負に荷電したイオン交換樹脂を使用する。ここで、レンチウイルス上清のｐＨをＬＶＶ等電点より下に調整して、ＬＶＶに全体として正の正味の表面電荷を与え、負に荷電した樹脂ビーズに結合させることができる。

【0195】

したがって、様々な実施形態では、ＬＶＶ上清は、イオン交換クロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる。一部の実施形態では、ＬＶＶ上清は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げられる。特定の実施形態では、ＬＶＶ上清は、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）Ｓｕｌｆａｔｅ－６５０Ｆ）上にポンプで吸い上げられる。一部の実施形態では、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーは、約４５μｍのビーズサイズおよび／または約１００ｎｍの平均孔サイズを有するカラムを含む。

【0196】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、規定された孔サイズのビーズを含む樹脂を使用して、それらのサイズに基づいて分子を分ける。分子は、サイズ順にＳＥＣ樹脂から溶出する：ビーズ孔に閉じ込められていない大きな分子は、より短い距離を移動し、ビーズ孔によって溶出される第一かつ小さい分子は、最後に溶出する。異なる孔サイズのビーズを購入して、所望の解像度を得ることができる。ＳＥＣは、野生型レトロウイルスおよびレトロウイルスベクターを精製するために使用されてきた。レトロウイルスベクターは、そのサイズが大きいためビーズ孔から排除され、カラムの空隙容積で溶出する一方で、より小さい分子量の混入物は、カラムによって遅らせられ、より後の画分に溶出する。特定の実施形態では、採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清由来のウイルスベクターは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して捕捉され、濃縮される。

【0197】

アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）は、特定のクロマトグラフィー吸着体に対するそれらの高度に選択的な親和性に基づいて分子を分ける。残念ながら、適当な吸着体の選択を複雑にするウイルス膜の組成についてはほとんど知られていない。ウイルスベクターは、精製を促進するためにその表面上に親和性タグを発現するように操作されており、例えば、ＭｏＭＬＶは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製されたヘキサヒスチジン親和性タグを発現するように改変されている。ＭｏＭＬＶウイルスベクターはまた、ストレプトアビジンとビオチンとの間の相互作用を利用することによって精製されている。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーは、偽型レトロウイルスベクター、例えば、ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスベクターを含む、細胞表面受容体としてヘパラン硫酸を使用するウイルスベクターを精製するために使用されている。特定の実施形態では、採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清由来のウイルスベクターは、アフィニティークロマトグラフィーを使用して捕捉され、濃縮される。

【0198】

マルチモードまたは混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）は、単一の樹脂に複数のクロマトグラフィーモードを組み込む。分子は、単一の特徴ではなく、いくつかのそれらの特徴に基づいて分けられ得るため、ＭＭＣは、樹脂の選択性を強化する。

【0199】

好ましい実施形態では、採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清由来のウイルスベクターは、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを使用して捕捉され、濃縮される。特定の実施形態では、採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清は、必要に応じて、約７．０のｐＨに調整される。採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清は、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラムを通過し、カラムは、洗浄緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用いて一回または複数回洗浄され、溶出される（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）。

【0200】

好ましい実施形態では、採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清由来のウイルスベクターは、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して捕捉され、濃縮される。様々な実施形態では、クロマトグラフィーは、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーである。特定の実施形態では、採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清は、必要に応じて、約７．２のｐＨに調整される。採取され、清澄化されたウイルスベクター生成上清は、硫酸陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを通過／上にポンプで吸い上げられ、カラムは、洗浄緩衝液（例えば、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を用いて一回または複数回洗浄され、溶出される（例えば、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）。

【0201】

濃縮されたウイルスベクターを含む得られた溶出物を濾過して、不純物をさらに除去する。

【0202】

４．クロマトグラフィー後濾過
特定の実施形態で企図される下流ウイルスベクター製造プロセスは、ウイルスベクターのクロマトグラフィー精製後の濾過工程を含む。クロマトグラフィー後濾過は、ウイルスベクターの精製を妨げる可能性のある不純物をさらに除去することによって、クロマトグラフィー工程の下流の単位操作を保護する。

【0203】

特定の実施形態では、濾過工程は、約０．４５μｍ～約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２２μｍ～約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して濃縮されたウイルスベクターを濾過することを含む。

【0204】

特定の実施形態では、濾過工程は、約０．４５μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２２μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して濃縮されたウイルスベクターを濾過することを含む。

【0205】

特定の実施形態では、濾過工程は、約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．４５μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して濃縮されたウイルスベクターを濾過することを含む。

【0206】

特定の実施形態では、濃縮されたウイルスベクターがフィルターを通過した後、フィルターを透析濾過緩衝液で追跡して、ウイルスベクターの回収を最大化する。

【0207】

次いで、濾過されたウイルスベクター溶液は、限外濾過を使用してさらに精製され、濃縮され、次いで、透析濾過される。

【0208】

５．限外濾過／透析濾過
特定の実施形態で企図される下流ウイルスベクター製造プロセスは、製剤化のための調製において、ウイルスベクターをさらに精製し、濃縮するための限外濾過工程および濃縮され、濾過されたウイルスベクター緩衝液の緩衝液を透析濾過緩衝液（例えば、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；または約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；または約５０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ７．０）に交換するための透析濾過工程をさらに含む。

【0209】

特定の実施形態では、ウイルスベクターは、不純物をさらに除去し、ウイルスベクターを濃縮するために限外濾過され、次いでその後、バルクウイルスベクター製剤化に適当な緩衝液に透析濾過される。

【0210】

特定の実施形態では、ウイルスベクターは、濾過され、濃縮され、その後、接線流濾過を使用して透析濾過される。好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、濾過され、濃縮され、その後、接線流濾過を使用して透析濾過される。中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターを使用して、不純物を同時に濃縮し、除去し、高度に活性なレトロウイルスベクターを得る。中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターはまた、ウイルスベクターをバルクウイルスベクター製剤化に適した緩衝液に透析濾過するための便利なツールとして使用されてきた。

【0211】

特定の実施形態では、ＴＦＦシステムは、ウイルスベクターを含有する供給液を中空繊維ＴＦＦモジュールにポンプ注入することを含む。ＴＦＦモジュールの孔サイズは、ウイルスベクターが孔を通過せず、ＴＦＦモジュールに保持された溶液である回収液に濃縮されるように選択され、一方で、不純物を含有する透過物は、孔を通過する。

【0212】

特定の実施形態では、ＴＦＦシステムを使用して、ウイルスベクター含有溶液の透析濾過または緩衝液交換を行う。ＴＦＦシステムは、変化イオン濃度、ｐＨ、塩、糖、非水性溶媒、分離非結合分子を除去し、改変し、および／または交換し、低分子量の混入物を除去するための有効な方法である。

【0213】

特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターを使用して、透析濾過および／または限外濾過を行い、さらに精製し、濃縮し、緩衝液交換を行う。本明細書で企図される特定の実施形態で使用するための適当なＴＦＦシステムは、例えば、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｉｇｍａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、およびＲｅｐｌｉｇｅｎから市販されている。

【0214】

特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約１００ｋＤａ～約５００ｋＤａの孔サイズおよび約０．５ｍ^２、約１．０ｍ^２、約２．５ｍ^２、約５．０ｍ^２、約１０ｍ^２、または約２０ｍ^２の表面積を備える。特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約１００ｋＤａ～約５００ｋＤａの孔サイズおよび約１．００ｍ^２、約１．０５ｍ^２、約１．１０ｍ^２、約１．１５ｍ^２、約１．２０ｍ^２、約１．２５ｍ^２、約１．３０ｍ^２、約１．３５ｍ^２、約１．４０ｍ^２、約１．４５ｍ^２、約１．５０ｍ^２、約１．５５ｍ^２、約１．６０ｍ^２、約１．６５ｍ^２、約１．７０ｍ^２、約１．７５ｍ^２、約１．８０ｍ^２、約１．８５ｍ^２、約１．９０ｍ^２、約１．９５ｍ^２、約２．００ｍ^２、２．００ｍ^２、約２．０５ｍ^２、約２．１０ｍ^２、約２．１５ｍ^２、約２．２０ｍ^２、約２．２５ｍ^２、約２．３０ｍ^２、約２．３５ｍ^２、約２．４０ｍ^２、約２．４５ｍ^２、または約２．５０ｍ^２の表面積を備える。

【0215】

特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約１００ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａまたは約５００ｋＤａの孔サイズおよび約１．００ｍ^２、約１．０５ｍ^２、約１．１０ｍ^２、約１．１５ｍ^２、約１．２０ｍ^２、約１．２５ｍ^２、約１．３０ｍ^２、約１．３５ｍ^２、約１．４０ｍ^２、約１．４５ｍ^２、約１．５０ｍ^２、約１．５５ｍ^２、約１．６０ｍ^２、約１．６５ｍ^２、約１．７０ｍ^２、約１．７５ｍ^２、約１．８０ｍ^２、約１．８５ｍ^２、約１．９０ｍ^２、約１．９５ｍ^２、約２．００ｍ^２、２．００ｍ^２、約２．０５ｍ^２、約２．１０ｍ^２、約２．１５ｍ^２、約２．２０ｍ^２、約２．２５ｍ^２、約２．３０ｍ^２、約２．３５ｍ^２、約２．４０ｍ^２、約２．４５ｍ^２、または約２．５０ｍ^２の表面積を備える。

【0216】

特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約１００ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａまたは約５００ｋＤａの孔サイズおよび約１．００ｍ^２、約１．０５ｍ^２、約１．１０ｍ^２、約１．１５ｍ^２、約１．２０ｍ^２、約１．２５ｍ^２、約１．３０ｍ^２、約１．３５ｍ^２、約１．４０ｍ^２、約１．４５ｍ^２、約１．５０ｍ^２、約１．５５ｍ^２、約１．６０ｍ^２、約１．６５ｍ^２、約１．７０ｍ^２、約１．７５ｍ^２、約１．８０ｍ^２、約１．８５ｍ^２、約１．９０ｍ^２、約１．９５ｍ^２、約２．００ｍ^２、２．００ｍ^２、約２．０５ｍ^２、約２．１０ｍ^２、約２．１５ｍ^２、約２．２０ｍ^２、約２．２５ｍ^２、約２．３０ｍ^２、約２．３５ｍ^２、約２．４０ｍ^２、約２．４５ｍ^２、または約２．５０ｍ^２の表面積を備える。

【0217】

特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約１００ｋＤａの孔サイズおよび約１．２５ｍ^２、約１．３０ｍ^２、約１．３５ｍ^２、約１．４０ｍ^２、約１．４５ｍ^２、または約１．５０ｍ^２の表面積を備える。特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約２００ｋＤａの孔サイズおよび約１．２５ｍ^２、約１．３０ｍ^２、約１．３５ｍ^２、約１．４０ｍ^２、約１．４５ｍ^２、または約１．５０ｍ^２の表面積を備える。特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約３００ｋＤａの孔サイズおよび約１．２５ｍ^２、約１．３０ｍ^２、約１．３５ｍ^２、約１．４０ｍ^２、約１．４５ｍ^２、または約１．５０ｍ^２の表面積を備える。特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約４００ｋＤａの孔サイズおよび約１．２５ｍ^２、約１．３０ｍ^２、約１．３５ｍ^２、約１．４０ｍ^２、約１．４５ｍ^２、または約１．５０ｍ^２の表面積を備える。特定の実施形態では、中空繊維ＴＦＦモジュールまたはフィルターは、約５００ｋＤａの孔サイズおよび約１．２５ｍ^２、約１．３０ｍ^２、約１．３５ｍ^２、約１．４０ｍ^２、約１．４５ｍ^２、または約１．５０ｍ^２の表面積を備える。

【0218】

特定の実施形態では、下流ウイルスベクター製造プロセスは、約１００ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、または約５００ｋＤａの孔サイズを有する中空繊維ＴＦＦモジュールを使用して行われる限外濾過工程を含み、製剤化の調製においてウイルスベクターを含有する緩衝液を透析濾過緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；または５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）に交換するための中空繊維ＴＦＦモジュールを使用して行われる透析濾過工程をさらに含む。

【0219】

６．製剤化
特定の実施形態で企図される下流ウイルスベクター製造プロセスは、適当な緩衝液および／または薬学的に許容し得る培地中でウイルスベクターを製剤化することをさらに含む。ウイルスベクターは、ベクターを安定化させ、凍結／解凍サイクルを通してベクター活性を保持するように製剤化される。

【0220】

特定の実施形態で企図される限外濾過および透析濾過工程は、精製、濃縮およびウイルスベクターの透析濾過緩衝液（例えば、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；または約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；または約５０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ７．０）への透析濾過をもたらす。

【0221】

特定の実施形態では、ウイルスベクターを製剤化するために、透析濾過されたウイルスベクターの体積は、適当な製剤緩衝液または薬学的細胞培養培地を等体積の２×濃縮して希釈される。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、等体積の透析濾過されたウイルスベクターを２×濃縮された無血清の化学的に規定された細胞培養培地に希釈することによって製剤化される。適当な製剤培地の例示的な例としては、２×Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地、２×Ｅｘ－Ｃｅｌｌ ２９３無血清培地、２×Ｅｘｐｉ２９３発現培地、２×Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地、および２×幹細胞成長培地（ＳＣＧＭ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0222】

ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、等体積の透析濾過されたウイルスベクターを２×濃縮されたＳＣＧＭに希釈することによって製剤化される。一部の実施形態では、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５０に透析濾過されたウイルスベクターは、２×ＳＣＧＭ中で１：１に希釈することによって製剤化される。一部の実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中に透析濾過されたウイルスベクターは、ＨＥＰＥＳおよびスクロースを含む緩衝液中で１：１に希釈することによって製剤化され、任意選択的に、緩衝液は、Ｌ－プロリン、ポロクサマー１８８、またはＮａＣｌをさらに含む。一部の実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中に透析濾過されたウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１に希釈することによって製剤化される。一部の実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中に透析濾過されたウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１に希釈することによって製剤化される。一部の実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中に透析濾過されたウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、および約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１に希釈することによって製剤化される。一部の実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中に透析濾過されたウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１００ｍＭ Ｌ－プロリン、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１に希釈することによって製剤化される。一部の実施形態では、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中に透析濾過されたウイルスベクターは、約５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約１４６ｍＭスクロース、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．２～約２．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む緩衝液中で１：１に希釈することによって製剤化される。

【0223】

様々な実施形態では、約５０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ７．０中に透析濾過されたウイルスベクターは、Ｌ－ヒスチジン、スクロース、およびＬ－プロリンを含む緩衝液中で１：１に希釈することによって製剤化される。様々な実施形態では、約５０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ７．０中に透析濾過されたウイルスベクターは、約５ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、約１４６ｍＭスクロース、および約１００ｍＭ Ｌ－プロリンを含む緩衝液中で１：１に希釈することによって製剤化され、任意選択的に、製剤は、約０．２～約２．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８をさらに含む。

【0224】

様々な実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約０．２ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約０．３ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約０．４ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤化緩衝液は、約０．５ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約０．６ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約０．７ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約０．８ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約０．９ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．１ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．２ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．３ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．４ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．５ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．６ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．７ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．８ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約１．９ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、１：１希釈のための製剤緩衝液は、約２．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。

【0225】

ウイルスベクターはバルクで製剤化され、多くの場合、特定の実施形態では、好ましくは、製剤化バルクウイルスベクターと呼ばれる。

【0226】

７．製剤後の濾過
特定の実施形態で企図される下流ウイルスベクター製造プロセスは、ウイルスベクターの製剤後の濾過工程をさらに含む。製剤後の濾過は、製剤化バルクウイルスベクター中の粒子および不純物をさらに除去する。

【0227】

特定の実施形態では、濾過工程は、約０．５μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して製剤化バルクウイルスベクターを濾過することを含む。

【0228】

特定の実施形態では、製剤化バルクウイルスベクターがフィルターを通過し、回収された後、濾過された製剤化バルクウイルスベクターは、最終充填仕上げが行われ得るまで、凍結保存されるか、または保持工程（凍結保存なし）に供される。

【0229】

特定の実施形態では、製剤化バルクウイルスベクターがフィルターを通過し、回収された後、最終充填仕上げは、濾過され製剤化バルクウイルスベクターで行われ、その後、凍結保存される。

【0230】

８．凍結保存
特定の実施形態で企図される下流ウイルスベクター製造プロセスは、最終充填仕上げのような時間がバルクウイルスベクター上で行われ得るまで、濾過された製剤化バルクウイルスベクターを凍結保存することをさらに含む。製剤化バルクウイルスベクターの凍結保存は、ベクターの安定性および生物学的活性が、実質的に維持されるように、ならびに／またはウイルスベクターの安定性および生物学的活性の喪失が最小化されるように行われる。

【0231】

本明細書で使用される場合、「凍結保存すること」または「凍結保存」は、ゼロ以下の温度に冷却することによってウイルスベクターを保存することを指す。特定の実施形態では、濾過された製剤化バルクウイルスベクターは、凍結保護剤をさらに含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、凍結保護をもたらすように製剤化される。

【0232】

様々な実施形態では、濾過された製剤化バルクウイルスベクターは、約－２０℃未満、約－２１℃未満、約－２２℃未満、約－２３℃未満、約－２４℃未満、約－２５℃未満、約－２６℃未満、約－２７℃未満、約－２８℃未満、約－２９℃未満、約－３０℃未満、約－３１℃未満、約－３２℃未満、約－３３℃未満、約－３４℃未満、約－３５℃未満、約－３６℃未満、約－３７℃未満、約－３８℃未満、約－３９℃未満、約－４０℃未満、約－４１℃未満、約－４２℃未満、約－４３℃未満、約－４４℃未満、約－４５℃未満、約－４６℃未満、約－４７℃未満、約－４８℃未満、約－４９℃未満、約－５０℃未満、約－５１℃未満、約－５２℃未満、約－５３℃未満、約－５４℃未満、約－５５℃未満、約－５６℃未満、約－５７℃未満、約－５８℃未満、約－５９℃未満、約－６０℃未満、約－６１℃未満、約－６２℃未満、約－６３℃未満、約－６４℃未満、約－６５℃未満、約－６６℃未満、約－６７℃未満、約－６８℃未満、約－６９℃未満、約－７０℃未満、約－７１℃未満、約－７２℃未満、約－７３℃未満、約－７４℃未満、約－７５℃未満、約－７６℃未満、約－７７℃未満、約－７８℃未満、約－７９℃未満、または約－８０℃未満で凍結保存されるか、または凍結される。当業者は、－８０℃の温度が、－２０℃の温度未満であることを理解する。

【0233】

様々な実施形態では、濾過された製剤化バルクウイルスベクターは、約－６５℃未満、約－７０℃未満、約－７５℃未満、または約－８０℃未満で凍結保存されるか、または凍結される。

【0234】

特定の実施形態では、冷却速度は、１℃～３℃／分である。

【0235】

９．充填仕上げ
本明細書で企図される下流製造プロセスは、充填仕上げ工程をさらに含む。ウイルスベクターは、典型的には、単回使用体積に分注され、ベクターの安定性および生物学的活性を保護し、ウイルスベクターの熱不活化を最小化するために凍結保存される。

【0236】

「充填仕上げ」または「充填および仕上げ」は、容器、例えば、バイアル、アンプルなどを、製剤化ウイルスベクターで充填すること、およびウイルスベクターを流通用にパッケージングするプロセスを終えることを含む、下流製造プロセスの一部を指す。

【0237】

特定の実施形態では、充填仕上げは、介在する凍結保存工程なしで、濾過された製剤化ウイルスベクター上で行われる。充填仕上げ後、ウイルスベクターは、本明細書で企図される方法に従って凍結保存される。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、約－６５℃未満、約－７０℃未満、約－７５℃未満、または約－８０℃未満で凍結保存されるか、または凍結される。

【0238】

特定の実施形態では、充填仕上げは、介在する保持工程ありだが、介在する凍結保存工程なしで、濾過された製剤化ウイルスベクター上で行われる。充填仕上げ後、ウイルスベクターは、本明細書で企図される方法に従って凍結保存される。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、約－６５℃未満、約－７０℃未満、約－７５℃未満、または約－８０℃未満で凍結保存されるか、または凍結される。

【0239】

特定の実施形態では、凍結保存された濾過された製剤化バルクウイルスベクターは、充填仕上げ前に解凍され、滅菌濾過される。特定の実施形態では、濾過工程は、約０．５μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．２μｍの最終フィルター孔サイズを備えた二重層フィルターを通して解凍された製剤化バルクウイルスベクターを濾過することを含む。濾過後、充填仕上げは、製剤化ウイルスベクターを用いて行われる。充填仕上げ後、ウイルスベクターは、本明細書で企図される方法に従って凍結保存される。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、約－６５℃未満、約－７０℃未満、約－７５℃未満、または約－８０℃未満で凍結保存されるか、または凍結される。

【0240】

Ｅ．組成物
本明細書で企図される組成物は、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを含み得る。組成物には、薬学的組成物が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的組成物」とは、細胞又は動物への投与に対し、薬学的に許容される溶液又は生理学的に許容される溶液中で、単独で、又は一つ以上の他の治療モダリティと併用されて製剤化される組成物を指す。事実上、組成物に含有され得る他の構成要素に制限はないが、追加される剤は、意図される療法を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。

【0241】

本明細書において、語句「薬学的に許容される」は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合った、それら化合物、物質、組成物及び／又は剤型を指すために採用される。

【0242】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、限定されないが、ヒトまたは家畜での使用に許容されるものとして米国食品医薬品局によって承認されている、アジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、香味剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、並びにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカンス；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物及び植物性脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウレートエチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、リン酸緩衝液、および医薬製剤で採用される任意の他の適合性のある物質が挙げられる。

【0243】

特定の実施形態では、組成物は、ウイルスベクターおよび生理的に許容可能な緩衝液または培地を含む。

【0244】

特定の実施形態では、組成物は、ウイルスベクターおよび透析濾過緩衝液（例えば、約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、約１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５；または約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；または約５０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ７．０）を含む。

【0245】

特定の実施形態では、組成物は、ウイルスベクターおよび薬学的細胞培養培地を含む。適当な培地の例示的な例としては、２×Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地、２×Ｅｘ－Ｃｅｌｌ ２９３無血清培地、２×Ｅｘｐｉ２９３発現培地、２×Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地、および２×幹細胞成長培地（ＳＣＧＭ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0246】

特定の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、透析濾過緩衝液、及び１×ＳＣＧＭを含む。

【0247】

ある特定の実施形態では、組成物は、ＨＥＰＥＳベースの製剤中にウイルスベクターを含む。

【0248】

ある特定の実施形態では、組成物は、Ｌ－ヒスチジンベースの製剤中にウイルスベクターを含む。

【0249】

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、ＨＥＰＥＳ、およびスクロースを含み、任意選択的に、緩衝液は、Ｌ－プロリン、ポロクサマー１８８、またはＮａＣｌをさらに含む。

【0250】

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、約２７．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約７３ｍＭスクロース、および約５０ｍＭ Ｌ－プロリンを含む。

【0251】

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、約２７．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約７３ｍＭスクロース、約５０ｍＭ Ｌ－プロリン、および約０．１～約１．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む。

【0252】

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、約２７．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約７３ｍＭスクロース、約５０ｍＭ Ｌ－プロリン、および約７５ｍＭ ＮａＣｌを含む。

【0253】

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、約２７．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約７３ｍＭスクロース、約５０ｍＭ Ｌ－プロリン、約７５ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．１～約１．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む。

【0254】

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、約２７．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、約７３ｍＭスクロース、約７５ｍＭ ＮａＣｌ、および約０．１～約１．０ｍｇ／ｍｌポロクサマー１８８を含む。

【0255】

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、Ｌ－ヒスチジン、スクロース、およびＬ－プロリンを含む。

【0256】

一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、約２７．５ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、約７３ｍＭスクロース、および約５０ｍＭ Ｌ－プロリンを含み、任意選択的に、製剤は、約０．１～約１．０ｍｇ／ｍＬ ポロクサマー１８８をさらに含む。

【0257】

一部の実施形態では、組成物は、約０．１ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．２ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．３ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．４ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．５ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．６ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．７ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．８ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．９ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。一部の実施形態では、組成物は、約１．０ｍｇ／ｍＬポロクサマー１８８を含む。

【0258】

当業者であれば、本明細書で企図される組成物の特定の実施形態は、薬学分野で周知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ Ｉ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ．２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載される構成成分などの他の構成成分を含み得ることを理解するであろう。

【0259】

本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、および登録された特許は、あたかも個々の刊行物、特許出願、または登録された特許が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0260】

前述の実施形態は、明確性及び理解を目的として、図及び実施例により詳細に記載されているが、本明細書において企図される教示に照らし、特定の変化及び改変が、添付の請求の範囲の主旨又は範囲から逸脱することなく実施されうることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、説明の目的のみで提供され、限定の目的で提供されるものではない。当業者であれば、本質的に類似した結果をもたらすために変更又は修正されうる様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。

【実施例】

【0261】

実施例１
レンチウイルスベクター懸濁製造プロセス２．０
ＨＥＫ２９３Ｔワーキングセルバンクを、２５０ｍＬ培養容器中で培養し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ０培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を５００ｍＬ培養容器に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ１培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を１Ｌ培養容器に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ２培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を３Ｌ培養容器に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ３培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を５０Ｌ培養容器に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ４培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を２００Ｌバイオリアクター（Ｐ５培養物）に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃およびｐＨ７．０で培養した。このＰ５培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養培地を、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用して、１９０Ｌの新鮮な無血清の化学的に規定された細胞培養培地に交換した。

【0262】

トランスフェクションの前に、パッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムおよびｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖ、ならびにＶＳＶ－ＧパッケージングプラスミドおよびＰＥＩ構成成分を含むトランスファープラスミドを、１０Ｌの体積で無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で一緒に混合した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、Ｐ５懸濁培養物に約１４～約１８時間添加し、その後、ＡＴＦを使用した新鮮な無血清の化学的に規定された細胞培養培地との培養培地交換に供した。

【0263】

トランスフェクションから（トランスフェクション開始後）約３６～４８時間後、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で希釈したＢｅｎｚｏｎａｓｅエンドヌクレアーゼ（５０～７５Ｕ／ｍＬの最終濃度）およびＭｇＣｌ_２を、２００Ｌのバイオリアクター培養物に添加し、３７℃で約１～２時間インキュベートした。

【0264】

Ｂｅｎｏｎｚａｓｅ処理した培養物を、約６０μｍを超える混入物を保持するタンデムデプスフィルターを通して、次いで約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．４５μｍの最終フィルターを有する二重層フィルターを通してポンプ注入した。

【0265】

清澄化したベクター生成上清を、偽親和性ヘパリンクロマトグラフィーを使用して、捕捉し、濃縮した。上清をクロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げ、洗浄し、溶出緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中に溶出した。濃縮ベクター溶液を、約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．４５μｍの最終フィルターを有する二重層フィルターを通してポンプ注入した。

【0266】

濾過した濃縮ベクターを、約３００ｋＤａ～約５００ｋＤａの分子量カットオフまたは孔サイズを有する中空繊維ＴＦＦカラムを通してポンプ注入した。次いで、保持液を透析濾過緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に対して透析濾過し、２ｘ／１×ＳＣＧＭ製剤ストック溶液の１：１希釈液で製剤化して、製剤化バルクレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を形成した。製剤化したバルクＬＶＶを滅菌グレードフィルターで濾過し、バルク保存容器に充填し、充填／仕上げを行うまで、≦－６５℃で保存した。

【0267】

凍結製剤化バルクＬＶＶを解凍し、アリコートを一緒にプールし、最終濾過を行う前に混合し、その後、Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製のすぐに使用できる容器／クロージャーおよび自動充填ラインを使用して充填／仕上げを行った。

【0268】

実施例２
レンチウイルスベクター懸濁製造プロセス２．５
ＨＥＫ２９３Ｔワーキングセルバンクを、２５０ｍＬ培養容器中で培養し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ０培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を５００ｍＬ培養容器に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ１培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を１Ｌ培養容器に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ２培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を３Ｌ培養容器に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ３培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を５０Ｌ培養容器に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃および８．０％ＣＯ２で培養した。このＰ４培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養物を２００Ｌバイオリアクター（Ｐ５培養物）に継代し、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中、３７．０℃およびｐＨ７．０で培養した。このＰ５培養物の適当な生細胞密度を確認した後、培養培地を、交互接線流濾過（ＡＴＦ）を使用して、１９０Ｌの新鮮な無血清の化学的に規定された細胞培養培地に交換した。

【0269】

トランスフェクションの前に、パッケージング可能なレンチウイルスベクターゲノムおよびｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖ、ならびにＶＳＶ－ＧパッケージングプラスミドおよびＰＥＩ構成成分を含むトランスファープラスミドを、１０Ｌの体積で無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で一緒に混合した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を、Ｐ５懸濁培養物に約１４～約１８時間添加し、その後、ＡＴＦを使用した新鮮な無血清の化学的に規定された細胞培養培地との培養培地交換に供した。

【0270】

トランスフェクションから（トランスフェクション開始後）約３６～４８時間後、無血清の化学的に規定された細胞培養培地中で希釈したＤｅｎａｒａｓｅエンドヌクレアーゼ（～３０Ｕ／ｍＬ）およびＭｇＣｌ_２を、２００Ｌのバイオリアクター培養物に、３７℃で約１～２時間添加した。

【0271】

Ｄｅｎａｒａｓｅ処理した培養物を、約６０μｍを超える混入物を保持するタンデムデプスフィルターを通して、次いで約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．４５μｍの最終フィルターを有する二重層フィルターを通してポンプ注入した。

【0272】

清澄化したベクター生成上清を、カチオン交換硫酸塩クロマトグラフィーを使用して、捕捉し、濃縮した。上清をクロマトグラフィーカラム上にポンプで吸い上げ、洗浄緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で洗浄し、溶出緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中に溶出した。濃縮ベクター溶液を、約０．８μｍのプレフィルター孔サイズおよび約０．４５μｍの最終フィルターを有する二重層フィルターを通してポンプ注入した。

【0273】

濾過した濃縮ベクターを、約３００ｋＤａ～約５００ｋＤａの分子量カットオフまたは孔サイズを有する中空繊維ＴＦＦカラムを通してポンプ注入した。次いで、保持液を透析濾過緩衝液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）に対して透析濾過し、濃縮製剤培地（例えば、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４６ｍＭスクロース、１００ｍＭ Ｌ－プロリン、ｐＨ７．０）の１：１希釈液で製剤化して、製剤化バルクレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を形成した。製剤化したバルクＬＶＶを滅菌グレードフィルターで濾過し、充填／仕上げを行うまで、２～８℃で保存した。

【0274】

冷却中間バルクを滅菌濾過し、すぐに使用できる容器／クロージャー（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）および自動充填ラインを使用して充填／仕上げを行った。

【0275】

実施例３
レンチウイルスベクター製造プロセスの比較
実施例１および２に記載の懸濁液製造プロセス（すなわち、プロセスｓＬＶＶ ２．０及びｓＬＶＶ ２．５）を接着製造プロセス（ａＬＶＶ）と比較した。ａＬＶＶを、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２３，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １，Ｍａｙ ２０１５に記載される通り生成した。ｓＬＶＶ ２．０を、実施例１に記載される通り生成し（図１も参照）、一方、ｓＬＶＶ ２．５を、２Ｌの最終培養スケール（適宜スケールした体積）で生成し、実施例２に記載した中間バルク単位操作まで精製した（図４も参照）。中間バルク工程は、残留不純物の観点から最終ＬＶＶ産物を表しており、したがって、２．０ｓＬＶＶプロセス（図１）およびａＬＶＶプロセスによって生成した最終ＬＶＶ産物と比較する。プロセス収率を、感染力価収率によって決定し、これを、ＨＯＳ細胞のウイルス形質導入によって測定する。ＬＶＶ産物の純度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定する、残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度に基づいて比較する。さらに、相対残留ｐ２４カプシドタンパク質濃度対感染力価（粒子対感染率比）を、ＬＶＶ純度の尺度としてプラットフォーム間で比較する。残留ｐ２４もＥＬＩＳＡにより測定する。

【0276】

図５に示すように、懸濁液２．０ ｓＬＶＶプロセスは、図６に示すように、産生細胞培養スケールの増加（２．０ ｓＬＶＶについては２００Ｌに対してａＬＶＶについては４０Ｌ）、ならびに感染力価濃度の増加に部分的に起因する、ａＬＶＶ生成プロセスと比較して、総感染力価（ＴＵ）が約１０倍の増加を示す。２．５ｓＬＶＶプロセスは、２．０ｓＬＶＶと同様の中間バルク力価濃度を生じ（図６）、元のａＬＶＶプロセスよりも高い感染力価を維持する。さらに、２．０および２．５ｓＬＶＶプロセスは、ａＬＶＶプロセスと比較して、粒子対感染率（ＶＰ／ＴＵ）比の一貫性がより高いことを示す（図７を参照）。

【0277】

さらに、ｓＬＶＶ ２．５プロセスは、ｓＬＶＶ２．０プロセスと比較して、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物減少の大幅な改善をもたらす。ｓＬＶＶ２．０プロセスは、ａＬＶＶプロセスと比較して感染力価が１０倍増加したが、感染力価に対して正規化した場合、プロセス全体を通してＨＣＰレベルも１０倍を超えて増加した。しかしながら、ｓＬＶＶ ２．５プロセスは、中間バルクＬＶＶから実質的に高い宿主細胞タンパク質の減少を達成することができ、一方で、ＬＶＶ生成プロセスと同等の正規化したＨＣＰレベルをもたらした（図８）。ＨＣＰ対数減少値は、ａＬＶＶとｓＬＶＶ ２．５プロセスとの間で類似しており、これは、類似の不純物除去性能を示す（図９）。いかなる特定の理論によって結び付けられることを望むものではないが、２．５ｓＬＶＶプロセス中の改善したＨＣＰ除去の一つの潜在的な理由は、硫酸カチオン捕捉クロマトグラフィーカラムの導入に起因する。図１０に示すように、ヘパリン親和性結合カラムは、クロマトグラフィー単位操作工程にわたって＜１．０ｌｏｇの平均ＨＣＰ対数減少を達成するが、硫酸カラムは、クロマトグラフィー中に約１．５ｌｏｇ減少を示し、これは、１．０ｌｏｇのＨＣＰのｓＬＶＶ ２．５プロセスに対するＨＣＰ減少の全体的な増加に寄与する（中間バルクでのＨＣＰ濃度の＞１０倍減少）。

【0278】

概して、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲とともに全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、請求の範囲は、本開示により限定されない。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】