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▶ ユニバーシティー オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーションの特許一覧
特表2024-526851モノカルボン酸トランスポーター１１の阻害によるがんの細胞治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】モノカルボン酸トランスポーター１１の阻害によるがんの細胞治療
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240711BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240711BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240711BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240711BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240711BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240711BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240711BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240711BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240711BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K35/17
A61P35/00
A61K38/20
A61K45/00
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61K39/395 F
A61P35/02
C12N15/11 Z
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503402
(86)(22)【出願日】2022-07-19
(85)【翻訳文提出日】2024-03-14
(86)【国際出願番号】 US2022037633
(87)【国際公開番号】W WO2023003907
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】63/223,453
(32)【優先日】2021-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504279968
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ピッツバーグ － オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】デルゴフ， グレッグ エム．
(72)【発明者】
【氏名】ペラルタ， ロナル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA91Y
4B065AA92X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA23
4B065CA31
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA44
4C084DA12
4C084DA14
4C084MA17
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB27
4C084ZC75
4C085AA13
4C085AA14
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE03
4C085GG02
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087DA31
4C087MA17
4C087MA65
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZC75
(57)【要約】
本開示は、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減されたおよび／またはＭＣＴ１１の活性が低減された改変末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む組成物を提供する。同様に、Ｓｌｃ１６ａ１１を標的とするｓｉＲＮＡおよびｇＲＮＡも提供する。がんの処置における本開示の組成物を使用する方法もまた提供する。本発明は、例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である改変末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であって、１）Ｓｌｃ１６ａ１１発現を低減させる作用剤；または２）機能的ＭＣＴ１１の量を低減させる天然に存在しない遺伝子改変を含む改変末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である改変末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であって、１）Ｓｌｃ１６ａ１１発現を低減させる作用剤；または
２）機能的ＭＣＴ１１の量を低減させる天然に存在しない遺伝子改変
を含む改変末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）。
【請求項2】
Ｓｌｃ１６ａ１１発現を低減させる前記作用剤を含み、前記作用剤が、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）またはＳｌｃ１６ａ１１に対して特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項3】
前記ＲＮＡｉが、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、またはアンチセンスＲＮＡ分子である、請求項２に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項4】
前記作用剤が、ａ）Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子もしくは転写物に対して特異的な前記ＲＮＡｉであって、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な前記ＲＮＡｉが、前記Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子もしくは転写物の一部との少なくとも９０％の相補性を含むＲＮＡｉ、
ｂ）Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子もしくは転写物に対して特異的な前記ｇＲＮＡであって、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な前記ｇＲＮＡが、前記Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子もしくは転写物の一部と少なくとも９０％の配列同一性を含むｇＲＮＡ、または
ｃ）Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子もしくは転写物に対して特異的な前記ｇＲＮＡであって、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な前記ｇＲＮＡが、前記Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子もしくは転写物の一部と少なくとも９０％の配列同一性を含むｇＲＮＡ、およびＣａｓヌクレアーゼ
をコードする異種核酸分子を含む、請求項２または３に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項5】
前記異種核酸をコードする発現ベクターを含む、請求項４に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項6】
ｃ）前記Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的な前記ｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓヌクレアーゼを含み、前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ１３ｄ、またはｄＣａｓ１３ｄヌクレアーゼである、請求項４または５に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項7】
前記遺伝子改変が、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減させる、および／またはＭＣＴ１１の活性を低減させる、Ｓｌｃ１６ａ１１の点変異、部分的欠失、完全な欠失、または挿入である、請求項１に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項8】
Ｔ細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項9】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＤ３＋ Ｔ細胞である、請求項８に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項10】
前記Ｔ細胞が、治療的Ｔ細胞である、請求項８または請求項９に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項11】
前記Ｔ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項12】
前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項13】
前記Ｔ細胞が、腫瘍特異的抗原に対して反応性である、請求項８～１２のいずれか一項に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項14】
前記腫瘍特異的抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、メソテリン１（ＭＳＬＮ）、またはＥＧＦＲの１つまたは複数である、請求項１３に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項15】
前記Ｔ細胞が疲弊Ｔ細胞である、請求項８～１４のいずれか一項に記載の改変ＰＢＭＣ。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変ＰＢＭＣを生成する方法であって、前記作用剤、または天然に存在しない遺伝子改変をＰＢＭＣに導入し、それによって、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である前記改変ＰＢＭＣを生成することを含む、方法。
【請求項17】
前記ＰＢＭＣがＴ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記改変ＰＢＭＣを、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、またはその組合せと共にインキュベートすることをさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記改変ＰＢＭＣが、腫瘍特異的抗原に対して反応性である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記腫瘍特異的抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、メソテリン１（ＭＳＬＮ）、およびＥＧＦＲの１つまたは複数である、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
Ｓｌｃ１６ａ１１の発現の低減、ＭＣＴ１１の活性の低減、または両方が、前記Ｔ細胞のエフェクター機能を増加させる、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
Ｓｌｃ１６ａ１１の発現の低減、ＭＣＴ１１の活性の低減、または両方が、前記Ｔ細胞の疲弊を低減させる、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である前記改変ＰＢＭＣを選択すること、および必要に応じて、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である前記選択された改変ＰＢＭＣを対象に導入すること
をさらに含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記選択するステップが、フローサイトメトリー、パニング、または磁気分離の使用を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記対象ががんを有する、請求項２３～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変ＰＢＭＣ、または請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法によって生成された改変ＰＢＭＣ；および薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項27】
静脈内製剤である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項28】
対象におけるがんまたは腫瘍を処置するための方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変ＰＢＭＣの治療有効量、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法によって生成された改変ＰＢＭＣの治療有効量、または請求項２６もしくは２７に記載の医薬組成物の治療有効量を、がんまたは前記腫瘍を有する前記対象に投与し、それによって前記がんまたは前記腫瘍を処置することを含む方法。
【請求項29】
前記改変ＰＢＭＣが、前記対象に対して自家である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記改変ＰＢＭＣが、前記対象に対して同種異系である、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の治療有効量を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２３～２５、または２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
手術、放射線照射、化学療法、生物療法、または免疫療法の１つまたは複数によって前記対象を処置することをさらに含む、請求項２３～２５、または２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞アゴニスト抗体、腫瘍溶解ウイルス、または養子細胞移入（ＡＣＴ）免疫療法の１つまたは複数の治療有効量を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２３～２５または２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
非改変リンパ球が、前記改変ＰＢＭＣの投与前に前記対象において枯渇される、請求項２３～２５または２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記がんまたは腫瘍が、白血病、結腸直腸がん、黒色腫、子宮頸がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、腎細胞癌、前立腺がん、または頭頸部がんである、請求項２５または２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年７月１９日に出願された米国仮出願第６３／２２３，４５３号の利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年７月１９日に出願された米国仮出願第６３／２２３，４５３号の利益を主張する。
【0002】
分野
本開示は、免疫療法、特にＴ細胞疲弊を防止または低減する組成物および方法、ならびにがんを処置するまたは免疫療法を改善するためのその使用に関する。
本開示は、免疫療法、特にＴ細胞疲弊を防止または低減する組成物および方法、ならびにがんを処置するまたは免疫療法を改善するためのその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
プログラム細胞死１（ＰＤ－１）受容体は、成熟細胞傷害性Ｔリンパ球上で主に発現されるチェックポイント受容体である。がん細胞はしばしば、ＰＤ－１リガンド、例えばＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を発現し、がん様細胞の免疫寛容をもたらす。ある特定のがん治療は、ＰＤ－１またはそのリガンドを標的として免疫寛容を低減させ、それによってがん様細胞のＴ細胞媒介除去を増加させる。しかし、このいわゆるＰＤ－１遮断に応答するのは患者のわずかなサブセットに過ぎない。有効性を制限する潜在的因子は、Ｔ細胞疲弊の発生であり、これはＴ細胞が機能障害状態へと分化した代替の結末である。疲弊は、Ｔ細胞が腫瘍細胞を標的とする能力、または免疫療法に応答する能力を制限する。このように、Ｔ細胞のエフェクター機能を増加させることまたは疲弊に対する抵抗性を増加させることは、様々ながん免疫療法、例えばＰＤ－１遮断に対する患者の応答を改善するために有用であり得る。
プログラム細胞死１（ＰＤ－１）受容体は、成熟細胞傷害性Ｔリンパ球上で主に発現されるチェックポイント受容体である。がん細胞はしばしば、ＰＤ－１リガンド、例えばＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を発現し、がん様細胞の免疫寛容をもたらす。ある特定のがん治療は、ＰＤ－１またはそのリガンドを標的として免疫寛容を低減させ、それによってがん様細胞のＴ細胞媒介除去を増加させる。しかし、このいわゆるＰＤ－１遮断に応答するのは患者のわずかなサブセットに過ぎない。有効性を制限する潜在的因子は、Ｔ細胞疲弊の発生であり、これはＴ細胞が機能障害状態へと分化した代替の結末である。疲弊は、Ｔ細胞が腫瘍細胞を標的とする能力、または免疫療法に応答する能力を制限する。このように、Ｔ細胞のエフェクター機能を増加させることまたは疲弊に対する抵抗性を増加させることは、様々ながん免疫療法、例えばＰＤ－１遮断に対する患者の応答を改善するために有用であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
概要
ＭＣＴ１１は、輸送タンパク質である。ＭＣＴ１１は、ここでは終末疲弊Ｔ細胞、特に腫瘍に浸潤する終末疲弊Ｔ細胞の表面上に存在することが示される。ＭＣＴ１１の発現を減少させると、Ｔ細胞疲弊の発生を遅らせることが示され（in shown）、これは抗腫瘍機能性を保持するために役立つ。このように、ＭＣＴ１１活性は、Ｔ細胞疲弊に寄与し得る。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、ＭＣＴ１１は、モノカルボキシレート、例えば乳酸を輸送し得る。このように、乳酸（または別のＭＣＴ１１基質）のＭＣＴ１１媒介取り込みは、Ｔ細胞の抗腫瘍機能を低減し得る。これらの知見に基づいて、がんの処置、例えば免疫療法に使用されるＰＢＭＣまたはＴ細胞におけるＴ細胞疲弊を低減または防止するために、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方であるＰＢＭＣ、例えばＴ細胞を生成する方法を提供する。
ＭＣＴ１１は、輸送タンパク質である。ＭＣＴ１１は、ここでは終末疲弊Ｔ細胞、特に腫瘍に浸潤する終末疲弊Ｔ細胞の表面上に存在することが示される。ＭＣＴ１１の発現を減少させると、Ｔ細胞疲弊の発生を遅らせることが示され（in shown）、これは抗腫瘍機能性を保持するために役立つ。このように、ＭＣＴ１１活性は、Ｔ細胞疲弊に寄与し得る。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、ＭＣＴ１１は、モノカルボキシレート、例えば乳酸を輸送し得る。このように、乳酸（または別のＭＣＴ１１基質）のＭＣＴ１１媒介取り込みは、Ｔ細胞の抗腫瘍機能を低減し得る。これらの知見に基づいて、がんの処置、例えば免疫療法に使用されるＰＢＭＣまたはＴ細胞におけるＴ細胞疲弊を低減または防止するために、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方であるＰＢＭＣ、例えばＴ細胞を生成する方法を提供する。
【0005】
本明細書において、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である改変末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を提供する。一部の実施形態では、改変ＰＢＭＣは、Ｓｌｃ１６ａ１１発現を低減させる作用剤、例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的な阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の例では、ＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡである。一部の実施形態では、改変ＰＢＭＣは、機能的なＭＣＴ１１の量を低減させるＳｌｃ１６ａ１１の天然に存在しない遺伝子改変を含む。一部の例では、遺伝子改変は、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減させるおよび／またはＭＣＴ１１の活性を低減させる、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子における点変異、部分的欠失、完全な欠失、または挿入である。
【0006】
一部の実施形態では、改変ＰＢＭＣは、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＤ３＋ Ｔ細胞である。一部の例では、Ｔ細胞は、腫瘍特異的抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、メソテリン１（ＭＳＬＮ）、またはＥＧＦＲに対して反応性である。さらなる例では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり、および／またはＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくは操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。一部の例では、Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む）である。
【0007】
本開示の改変ＰＢＭＣは、例えばがん免疫療法を改善するために、またはｉｎ ｖｉｖｏでがんもしくは腫瘍を処置するために有用である。
【0008】
同様に本明細書において、例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１発現を低減させる作用剤、または機能的ＭＣＴ１１を低減させる天然に存在しない遺伝子改変をＰＢＭＣに導入し、それによって、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減されたおよび／またはＭＣＴ１１の活性が低減された改変ＰＢＭＣを生成することによって、本明細書に開示される改変ＰＢＭＣを生成する方法も提供される。一部の例では、そのような方法は、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、またはその両方である改変ＰＢＭＣを選択すること（例えば、そのような細胞を、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減されていない、ＭＣＴ１１の活性が低減されていない、またはその両方である細胞から精製または単離すること）をさらに含む。一部の例では、そのような方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで実施される。一部の例では、そのような選択方法は、フローサイトメトリー、パニング、または磁気分離を使用して実施される。本開示の方法は、一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、またはその両方である選択された改変ＰＢＭＣを、対象、例えばＳｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、またはその両方である選択された改変ＰＢＭＣによって処置されるがんを有する対象に導入することをさらに含む。
【0009】
同様に本明細書において、本明細書に開示される改変ＰＢＭＣを、がん（または腫瘍）を有するおよび／または免疫療法を受けている対象に投与し、それによってがん（または腫瘍）を処置するまたは免疫療法を増強することによって、がん（または腫瘍）を処置するまたはがん免疫療法を増強する方法も提供される。一部の例では、対象は、がん免疫療法、例えばチェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体療法を受けている、または受ける予定である。一部の例では、対象は、改変ＰＢＭＣの前、後、または実質的に同時にＭＣＴ（例えば、ＭＣＴ１１）の低分子阻害剤を投与される。
【0010】
本開示の前述および他の目的および特色は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図2A-B】図２Ａ～２Ｃは、ＭＣＴ１１が、マウスおよびヒトの疲弊Ｔ細胞において上方調節されていることを示す。図２Ａは、ＲＮＡ－ｓｅｑのためのＬＮ ＣＤ８＋およびＴＩＬ ＣＤ８＋細胞のＦＡＣＳ選別（左）を示し、ＭＣＴ１１が疲弊Ｔ細胞（ＰＤ１ｈｉＴｉｍ３＋）において上方調節されていること（右）を示す。図２Ｂは、黒色腫（ＭＥＬ）または頭頸部がん（ＨＮＳＣＣ）患者からのヒトＰＢＭＣ、ＰＤ１／ＴＩＭ３－およびＰＤ１／ＴＩＭ３＋細胞のＭＣＴ１１染色を示す。ヒト腫瘍生検試料を、ＣＤ８、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３、およびＭＣＴ１１に対する抗体によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図２Ｂは、疲弊（ＰＤ－１＋Ｔｉｍ３＋）への進行の関数としてのＭＣＴ１１の染色を示す。図２Ｃは、Ｃ５６／ＢＬ６ＪマウスのＭＣ３８（腺癌）またはＭＥＥＲ（頭頸部がん）モデルからの疲弊または非疲弊腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＭＣＴ１１表面発現を示す。
【図2C】同上。
【図3】図３Ａ～３Ｂは、表記の細胞タイプのＲＮＡ－ｓｅｑからのＳｌｃ１６ａ１１の塩基１００万個あたりの転写物（ＴＰＭ）を示す。ＭＣＴ１１は、疲弊Ｔ細胞、特に腫瘍に浸潤する疲弊Ｔ細胞（ＴＩＬ）の表面上に発現（上方調節）される（図３Ａ）。図３Ｂは、公開されているデータから生成され、Ｓｌｃ１６ａ１１が、腫瘍浸潤性疲弊Ｔ細胞に対して特異的であることを確認する。
【図5】図５は、ＭＣＴ１１阻害Ｔ細胞（Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｓｈＲＮＡによる処置による）が、抗腫瘍機能を保持しているが（上）、ＭＣＴ１１過剰発現（Ｓｌｃ１６ａ１１を発現するベクターによる処置による）は、マウスモデルにおいてＴ細胞疲弊を促進する（下）ことを示す。
【図6A-B】図６Ａ～Ｄは、ＭＣＴ１１（Ｓｌｃ１６ａ１１）の条件的欠失を有するマウスが、より小さい腫瘍体積、ならびにＴ細胞浸潤の増加、およびＴ細胞機能の増加を有することを示す。図６Ａは、実験の設定を示す。図６Ｂは、腫瘍体積を示す。図６Ｃは、疲弊Ｔ細胞区画内でのＴ細胞浸潤（パーセント生存ＣＤ８＋細胞）の増加およびＴ細胞機能の増加（再刺激後のサイトカイン産生によって測定）を示す。図６Ｄは、ＭＣＴ１１ ｍＡｂがＭＣＴ１１の条件的欠失を有するマウスにおいて疲弊Ｔ細胞（Ｔｅｘｈ）細胞を染色しないことを示す。
【図6C】同上。
【図6D】同上。
【発明を実施するための形態】
【0012】
配列表
核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基に関する標準的な文字略記、およびアミノ酸に関する３文字表記で示される。各核酸配列の１つの鎖のみを示すが、表示された鎖に対する何らかの参照によって、相補鎖が含まれると理解される。ＲＮＡが、ＤＮＡとしてコードされる場合、「Ｕ」は「Ｔ」に置き換えられ、逆にＤＮＡがＲＮＡとして発現される場合、「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられることが理解される。
核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基に関する標準的な文字略記、およびアミノ酸に関する３文字表記で示される。各核酸配列の１つの鎖のみを示すが、表示された鎖に対する何らかの参照によって、相補鎖が含まれると理解される。ＲＮＡが、ＤＮＡとしてコードされる場合、「Ｕ」は「Ｔ」に置き換えられ、逆にＤＮＡがＲＮＡとして発現される場合、「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられることが理解される。
【0013】
配列表は、２０２２年７月１８日に作成された１６，３８４バイトのＸＭＬファイル、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｘｍｌ」として提出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において：
配列番号１：ヒトＭＣＴ１１の例示的なアミノ酸配列
配列番号２：ヒトＳＬＣ１６Ａ１１ ｍＲＮＡをコードする例示的な核酸配列
配列番号３：ヒトＳＬＣ１６Ａ１１についての例示的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的化配列
ＣＧＧＧＧＧＵＣＣＧＧＣＧＧＧＣＵＧＧＧ
配列番号４：ヒトＳＬＣ１６Ａ１１を標的とする例示的なｓｈＲＮＡ
配列番号５：マウスＭＣＴ１１の例示的なアミノ酸配列
配列番号６：マウスＳｌｃ１６ａ１１ ｍＲＮＡをコードする例示的な核酸配列
配列番号７：マウスＳｌｃ１６ａ１１についての例示的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的化配列
ＣＧＣＣＣＣＣＵＵＣＵＡＧＧＣＣＣＡＧＵ
配列番号８：マウスＳｌｃ１６ａ１１を標的とする例示的なｓｈＲＮＡ
ＵＧＧＣＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＧＧＣＵＵＵ
配列番号１：ヒトＭＣＴ１１の例示的なアミノ酸配列
【化1】
【化2-1】
【化2-2】
ＣＧＧＧＧＧＵＣＣＧＧＣＧＧＧＣＵＧＧＧ
配列番号４：ヒトＳＬＣ１６Ａ１１を標的とする例示的なｓｈＲＮＡ
【化3】
【化4】
【化5-1】
【化5-2】
ＣＧＣＣＣＣＣＵＵＣＵＡＧＧＣＣＣＡＧＵ
配列番号８：マウスＳｌｃ１６ａ１１を標的とする例示的なｓｈＲＮＡ
ＵＧＧＣＵＵＧＧＵＣＵＵＣＵＣＧＧＣＵＵＵ
【0014】
詳細な説明
特に注記していない限り、技術用語は、通常の使用に従って使用される。分子生物学における多くの一般的な用語の定義は、Krebs et al. (eds.), Lewin's genes XII, published by Jones & Bartlett Learning, 2017；The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995；ならびに他の類似の参考文献に見出され得る。
特に注記していない限り、技術用語は、通常の使用に従って使用される。分子生物学における多くの一般的な用語の定義は、Krebs et al. (eds.), Lewin's genes XII, published by Jones & Bartlett Learning, 2017；The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995；ならびに他の類似の参考文献に見出され得る。
【0015】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、本文が明らかにそれ以外であることを示していない限り、単数形ならびに複数形の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。このように、「核酸分子を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他のエレメントを除外することなく「核酸分子を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。核酸に関して与えられたあらゆる全ての塩基サイズは、近似値であり、特に示していない限り説明目的のために提供されることがさらに理解される。本明細書の記載と類似または同等の多くの方法および材料を使用することができるが、特定の好適な方法および材料を以下に説明する。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および例は、単なる例証であり、限定的であることを意図しない。
【0016】
本開示の様々な実施形態の精査を容易にするために、以下に特定の用語の説明を提供する。
【0017】
約：本文がそれ以外であることを示していない限り、「約」は、参照値のプラスまたはマイナス５％を指す。例えば、「約」１００は、９５～１０５を指す。
【0018】
投与：対象に作用剤、例えば改変ＰＢＭＣを、任意の有効な経路によって提供または与えること。投与は局所または全身であり得る。例示的な投与経路としては、これらに限定されないが、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、前立腺内、髄腔内、骨内、および静脈内）、経口、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣、および吸入経路が挙げられる。一部の例では、本明細書に提供される改変ＰＢＭＣ（例えば、Ｔ細胞）は、静脈内注射によって投与される。
【0019】
養子細胞移入（ＡＣＴ）療法：改変（例えば、腫瘍抗原を認識するように改変）されている、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（またはｅｘ ｖｉｖｏ）で増大させているＴ細胞が、投与することを必要とする患者に投与される、あるタイプの免疫療法。ＡＣＴ療法のためのＴ細胞は、患者自身のＴ細胞またはドナーからのＴ細胞であり得る。ＡＣＴ療法は、例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法を含む。ＡＣＴ療法はまた、時に養子細胞療法、細胞養子免疫療法、またはＴ細胞移入療法とも呼ばれる。
【0020】
がん：異常なまたは制御されない細胞成長によって特徴付けられる悪性腫瘍。がんにしばしば関連する他の特色は、転移、隣接する細胞の正常な機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、および炎症応答または免疫応答の抑制または悪化、周囲または遠位の組織または臓器、例えばリンパ節への侵入等を含む。「転移疾患」は、元の腫瘍部位を離れて、例えば、血流またはリンパ系を介して体の他の部分へと遊走するがん細胞を指す。
【0021】
Ｃａｓ９：原核細胞ウイルスに対するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫防御に関与する（that that participates in）ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素。Ｃａｓ９は、二重らせんの各鎖に対して１つずつの、２つの活性切断部位（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を有する。このように、Ｃａｓ９タンパク質を使用して、適切なガイドＲＮＡと組み合わせてＤＮＡを編集することができる。Ｃａｓ９配列は公開されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＣＰ０１２０４５．１のヌクレオチド７９６６９３．．８００７９９、およびＣＰ０１４１３９．１のヌクレオチド１１０００４６．．１１０４１５２は、例示的なＣａｓ９核酸を開示し、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿２６９２１５．１、ＡＭＡ７０６８５．１、およびＡＫＰ８１６０６．１は、例示的なＣａｓ９タンパク質を開示している。
【0022】
エンドヌクレアーゼ活性が低減されているかまたは消失したがなおもｄｓＤＮＡに結合する触媒的に不活性な（非活性化または不活性型）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質もまた、本開示に包含される。一部の例では、ｄＣａｓ９は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインに１つまたは複数の変異、例えば以下の点変異：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、およびＤ９８６Ａの１つまたは複数を含む。例示的なｄＣａｓ９配列は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ置換の両方を含む。一例では、ｄＣａｓ９タンパク質は、変異Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ、およびＮ８６３Ａを有する（例えば、Esvelt et al., Nat. Meth. 10:1116-21, 2013を参照されたい）。例示的なｄＣａｓ９配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＫＡ６０２４２．１およびＫＲ０１１７４８．１に提供される。
【0023】
Ｃａｓ１３ｄ：ＲＮＡを切断するかまたはＲＮＡに結合することができるＲＮＡガイドＲＮＡエンドヌクレアーゼ酵素。Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、特定の二次構造を有するｓｇＲＮＡに存在するダイレクトリピート（ＤＲ）配列を特異的に認識する。Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、１つまたは２つのＨＥＰＮドメインを含む。天然のＨＥＰＮドメインは、配列ＲＸＸＸＸＨを含み、Ｘは任意のアミノ酸である。触媒的に不活性な、または「不活性型」Ｃａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ）は、変異したＨＥＰＮドメイン（複数可）を含み、このようにＲＮＡを切断することができないが、ｓｇＲＮＡをプロセシングすることができ、これもまた、本開示に包含される。ｄＣａｓ１３ｄは、選択的スプライシングを操作するためにプレｍＲＮＡのシスエレメントへと標的化され得る。例示的な天然およびバリアントＣａｓ１３ｄタンパク質配列は、ＷＯ２０１９／０４０６６４、ＵＳ１０，８７６，１０１、およびＵＳ１０，３９２，６１６に提供される。
【0024】
一例では、全長の（非トランケート型）Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、８７０～１０８０アミノ酸長の間である。一例では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ目の細菌のゲノム配列またはメタゲノム配列に由来する。一例では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質の対応するＤＲ配列は、Ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡを含む分子におけるスペーサー配列の５’末端に位置する。一例では、Ｃａｓ１３ｄ ｓｇＲＮＡにおけるＤＲ配列は、非プロセシングＣａｓ１３ｄガイドアレイ転写物におけるＤＲ配列と比較して５’末端でトランケートされる（例えば、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、例えば１～３ヌクレオチド、３～６ヌクレオチド、５～７ヌクレオチド、または５～１０ヌクレオチドトランケートされる）。一例では、Ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡにおけるＤＲ配列は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質によって５’末端で５～７ヌクレオチドトランケートされる。一例では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、スペーサー－標的二重鎖の３’末端でＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣリボヌクレオチドのいずれかに挟まれ、５’末端でＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣリボヌクレオチドのいずれかに挟まれる標的ＲＮＡを切断することができる。
【0025】
チェックポイント阻害剤（またはチェックポイント遮断）：チェックポイントタンパク質を標的とする治療剤。チェックポイントタンパク質は、過活動免疫応答または自己免疫を防止するために役立ち、時にＴ細胞ががん様細胞を除去する能力を制限し得る。チェックポイントが遮断されると（例えば、ＰＤ－１遮断）、Ｔ細胞は、がん様細胞をより良好に標的とし殺滅することができる。Ｔ細胞またはがん様細胞において見出されるチェックポイントタンパク質の例は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、およびＣＴＬＡ－４／Ｂ７－１／Ｂ７－２を含む。
【0026】
例示的なチェックポイント阻害剤としては、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｎｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、パルボシクリブ（Ｉｂｒａｎｃｅ（登録商標））、リボシクリブ（Ｋｉｓｑｕａｌｉ（登録商標））、ピディリズマブ、アベルマブ、およびアベマシクリブ（Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（登録商標））が挙げられる。さらなる例は、Qiu et al., Journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology, 126(3):450-464, 2018；Visconti et al., J Exp Clin Cancer Res. 35(1): 153, 2016；およびMills et al. Cancer Res. 77(23): 6489-6498, 2017に提供される。
【0027】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植する人工の操作されたＴ細胞受容体。典型的に、これらの受容体は、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を移植するために使用され、それらのコード配列の移入はベクターによって促進される。このように、抗原に「特異的に結合する」または「特異的」であるＣＡＲは、高い親和性で抗原に結合し、他の無関係な抗原に有意に結合しないＣＡＲである。養子細胞移入を使用して、ＣＡＲは、がんを処置するために有用であり得る。例えば、Ｔ細胞（患者またはドナーから得られた）は、それらが患者の特定のがんに対して特異的な受容体を発現するように改変されている。次に、がん細胞を認識して殺滅することができる改変Ｔ細胞を、患者に導入する。一部の例では、本明細書に開示される改変ＰＢＭＣは、ＣＡＲを発現する。
【0028】
第１世代ＣＡＲは、典型的に、内因性ＴＣＲからのシグナルの一次伝達物質であるＣＤ３ζ鎖からの細胞内ドメインを含んだ。第２世代ＣＡＲは、様々な共刺激性タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）からの細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質テールに付加し、Ｔ細胞に追加のシグナルを提供した。第３世代ＣＡＲは、効力を増加させるために、複数のシグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０を組み合わせる。多重特異性ＣＡＲは、各々が異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに結合する少なくとも２つの抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖおよび／または単一ドメイン抗体）で構成される単一のＣＡＲ分子である（例えば、ＵＳ２０１８／０２３０２２５を参照されたい）。例えば、二重特異性ＣＡＲは、各々が異なる抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを有する単一のＣＡＲ分子を指す。バイシストロン性のＣＡＲは、各々が、異なる抗原に結合する抗原結合部分を含有する２つの完全なＣＡＲ分子を指す。一部の例では、バイシストロン性ＣＡＲ構築物は、切断リンカーによって連結される２つの完全なＣＡＲ分子を発現する。二重特異性またはバイシストロン性ＣＡＲを発現するＴ細胞は、結合部分が向けられる抗原の両方を発現する細胞に結合することができる（例えば、Qin et al., Blood 130:810, 2017；およびＷＯ／２０１８／２１３３３７を参照されたい）。これらのＣＡＲのいずれも、本明細書に記載される方法によって使用することができる。
【0029】
相補性：核酸が、従来のワトソンクリック塩基対形成または他の非従来タイプのいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソンクリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージ（例えば、１０個中５、６、７、８、９、および１０個はそれぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）を示す。
【0030】
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、本開示のｇＲＮＡまたはＲＮＡｉ）は、標的核酸とハイブリダイズし、このように核酸分子は、標的配列と相補的である。例えば、一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なＲＮＡｉまたはｇＲＮＡは、標的遺伝子、例えばＳｌｃ１６ａ１１の固有の部分と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である。一部の例では、標的配列は、少なくとも１０連続ヌクレオチド、例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０連続ヌクレオチドである。さらなる例では、標的配列は、１０～５０連続ヌクレオチド、例えば、１２～４０、１２～３０、１２～２０、１２～１５、１５～３０、１５～２０、２０～３０、または２０～４０連続ヌクレオチドである。一部の例では、標的化配列は、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物における約２０ヌクレオチド長の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である。
【0031】
対照：参照標準。一部の実施形態では、対照は、陰性対照である。他の実施形態では、対照は陽性対照である。一部の例では、好適な対照は、歴史的対照または標準的な参照値もしくは値の範囲（例えば、以前に試験した対照試料、例えば既知の予後もしくは転帰を有する疾患もしくは状態、例えばがんと診断された患者の群、またはベースラインもしくは正常値を表す試料の群）である。一部の例では、対照は、作用剤（例えば、本開示の改変ＰＢＭＣ）による処置を受けていないもしくは代替処置を受けている対象、または作用剤による処置の前の対象のベースライン読み取り値であり得る。
【0032】
試験試料と対照の間の差は、増加であり得るか、または逆に減少であり得る。差は、定性的な差または定量的な差、例えば統計学的に有意な差であり得る。一部の例では、差は、対照と比較した増加、例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％の増加である。他の例では、差は、対照と比較した減少、例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の減少である。
【0033】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系：外来遺伝子エレメント、例えばプラスミドおよびファージに対する抵抗性を付与し、ある形態の獲得免疫を提供する原核細胞免疫系。内因性の系では、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）として公知の別のＲＮＡ分子のリピート配列とハイブリダイズして、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに結合する固有の二重ＲＮＡハイブリッド構造を形成し、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を標的へとガイドする、標的遺伝子と相補的な標的化配列を含有する。次に、Ｃａｓ９は、標的遺伝子において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、例えばＳｌｃ１６ａ１１などの標的遺伝子を標的にして該標的遺伝子における二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することによって、遺伝子発現を減少させることができる。同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３系を使用してＲＮＡを切断することができる。
【0034】
有効量：有益なまたは所望の結果を引き起こすために十分である作用剤（例えば、改変ＰＢＭＣ、ＲＮＡｉ、ｇＲＮＡ、または本明細書に開示される他の組成物）の量。有効量（治療有効量とも呼ばれる）は、処置される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などの１つまたは複数に応じて変化し得るが、これらは当業者によって容易に決定することができる。有益な治療効果は、診断の決定を可能にすること；疾患、症状、障害、または病態の回復；疾患、症状、障害、または状態の発症を低減または防止すること；および一般的に疾患、症状、障害、または病態に対抗することを含み得る。
【0035】
一実施形態では、治療剤（例えば、本明細書に開示される改変ＰＢＭＣ）の「有効量」は、腫瘍の体積／サイズ、腫瘍の重量、転移の数、転移の体積／サイズ、転移の重量、またはその組合せを、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（好適な対照、例えば治療剤を投与していない対照と比較して）低減させるために十分な量である。一実施形態では、治療剤（例えば、本明細書に開示されるｇＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）の「有効量」は、標的（例えば、ＭＣＴ１１）の活性または発現を、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには１００％低減させるために十分な量である（好適な対照、例えば治療剤を投与する前の発現または活性と比較して）。一部の例では、これらの効果の組合せが達成される。
【0036】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）：標的核酸配列、例えば標的ＤＮＡ（例えば、ゲノム配列）または標的ＲＮＡ配列にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を向かわせるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＲＮＡ構成要素。ｇＲＮＡ分子は、（１）標的核酸との配列相補性を有する部分（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の配列相補性）、および（２）Ｃａｓヌクレアーゼに結合する二次構造を有する部分を含む。そのような部分は、同じ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて単一のＲＮＡ転写物にする合成キメラ）の一部であってもよく、または２つもしくはそれより多くの個別の分子（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが個別のＲＮＡ転写物である２部のｇＲＮＡ）に分割してもよい。単純にするために、両方のタイプの分子を、本明細書においてｇＲＮＡと呼ぶ。
【0037】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するゲノム編集のための多くの技術が記載されている。簡単に説明すると、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＤＮＡヌクレアーゼ（そのようなＣａｓ９）を標的遺伝子（ＤＮＡ）に向ける。次に、Ｃａｓ９は、標的部位で二本鎖切断を導入する。破壊変異を、切断ＤＮＡの非相同末端結合を通して導入することができる。Ｃａｓ９をまた使用して、例えば個別の部位を標的とする２つのｇＲＮＡを使用して、このように、２つの切断部位の間の介在配列の欠失を引き起こすことによってより大きいＤＮＡ断片を欠失させることができる。標的部位に対して相同性を有するＤＮＡ鋳型をまた付加して、相同組換えＤＮＡ修復機構を使用して挿入を導入することができる。
【0038】
ＲＮＡ編集では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＡヌクレアーゼ（そのようなＣａｓ１３ｄ）を標的ＲＮＡに向ける。１つのそのような例では、ｇＲＮＡは、例えばＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｃ、およびＣａｓ １３ｄヌクレアーゼの場合、５’から３’に（１）ダイレクトリピート（ＤＲ）領域を含有するｃｒＲＮＡ、および（２）スペーサーを含む。一例では、ＤＲの約３６ヌクレオチドの後に約２８～３２ヌクレオチドのスペーサー配列を含む。別のそのような例では、ｇＲＮＡは、例えばＣａｓ１３ｂヌクレアーゼの場合、５’から３’に、（１）スペーサー、および（２）ＤＲ領域を含有するｃｒＲＮＡを含む。一部の例では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＡヌクレアーゼまたは他のＲＮａｓｅにより、より短い「成熟」型へとプロセシング（トランケート／改変）される。ＤＲは、Ｃａｓ ＲＮＡヌクレアーゼタンパク質とｇＲＮＡの間の相互作用を容易にする二次構造を含有するｓｇＲＮＡの定常部分である。スペーサー部分は、ｇＲＮＡの可変部分であり、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズする（および一部の例では標的ＲＮＡ配列を編集する）ように設計された配列を含む。一部の例では、全長のスペーサーは、約２８～３２ヌクレオチド（例えば、３０～３２ヌクレオチド）長であるが、成熟（プロセシングされた）スペーサーは、約１４～３０ヌクレオチドである。
【0039】
ｇＲＮＡの標的化部分を改変して、目的の任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の標的化を容易にすることができる。（CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Fuguo Jiang and Jennifer A. Doudna, Annual Review of Biophysics, 46:1, 505-529 (2017)を参照されたい）。標的に対して「特異的」であるｇＲＮＡは、標的に結合し、他の無関係な配列と有意にハイブリダイズしないように標的配列との十分な相補性を有する。ｇＲＮＡの標的化配列は、典型的に約２０ヌクレオチド、例えば、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、または約２５ヌクレオチドである。標的化配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適に整列させた場合、約５０％もしくはそれより高い、約６０％もしくはそれより高い、約７５％もしくはそれより高い、約８０％もしくはそれより高い、約８５％もしくはそれより高い、約９０％もしくはそれより高い、約９５％もしくはそれより高い、約９７．５％もしくはそれより高い、約９８％もしくはそれより高い、約９９％もしくはそれより高い、またはそれより高い。一部の実施形態では、相補性の程度は１００％である。最適なアライメントは、配列を整列させるための任意の好適なアルゴリズムの使用によって決定され得、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（soap.genomics.org.cnで入手可能）、およびＭａｑ（maq.sourceforge.netで入手可能）が挙げられる。一部の例では、標的化配列は、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物における約２０ヌクレオチド長の連続するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である。
【0040】
免疫療法：疾患、例えばがんを処置するために免疫系を刺激または抑制する作用剤を使用する療法。がん免疫療法の一部の例としては、免疫チェックポイント阻害剤、養子細胞移入（ＡＣＴ）免疫療法、抗体、ワクチン、および免疫系モジュレーターが挙げられる。特定の非限定的な例としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、およびイピリムマブが挙げられる。
【0041】
増加または減少：対照値（例えば、治療剤なしを表す値）からの量のそれぞれ、正または負の変化。増加は、対照値と比較して正の変化、例えば少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％の増加である。減少は、対照値と比較して負の変化、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の減少である。一部の例では、増加または減少は、好適な対照と比較して統計学的に有意である。
【0042】
遺伝子（例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１）または遺伝子産物（例えば、ＭＣＴ１１）の発現または活性を減少させる作用剤（例えば、本明細書に開示されるＳｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉまたはｇＲＮＡ）は、細胞もしくは組織（例えば、ＰＢＭＣ）における遺伝子によってコードされるｍＲＮＡもしくは機能的産物のレベルを低減させる、または遺伝子産物の１つもしくは複数の活性を低減させる（除去するまたは阻害することを含む）化合物である。一部の実施形態では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現は、対照、例えば無処置対象または細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、またはさらには１００％低減される。逆に、遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を増加させる作用剤は、細胞もしくは組織における遺伝子によってコードされるｍＲＮＡもしくはタンパク質産物のレベルを増加させる、または遺伝子産物の１つもしくは複数の活性を増加させる化合物である。
【0043】
一部の実施形態では、作用剤（例えば、本明細書に開示されるＳｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉまたはｇＲＮＡ）、または天然に存在しない遺伝子改変は、それがＰＢＭＣに存在する場合、ＰＢＭＣ（例えば、Ｔ細胞）の活性を増加または減少させることができる。例えば、一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、Ｔ細胞であり、作用剤（例えば、本明細書に開示されるＳｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉまたはｇＲＮＡ）または遺伝子改変（本明細書に開示されるように、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減させる点変異、部分的欠失、完全な欠失、または挿入）は、好適な対照（例えば、処置前の測定値または無処置対照群との比較）と比較してＴ細胞疲弊を、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低減させる。Ｔ細胞疲弊の減少は、例えば、好適な対照と比較した、乳酸取り込みの減少、ＰＤ－１もしくはＴｉｍ３の発現の減少、サイトカイン産生（例えば、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦα、またはＩＬ－２）の増加、細胞傷害活性の増加（例えば、腫瘍特異的標的化または殺滅の増加）、またはＴ細胞エフェクター活性の別の指標を測定することによって測定することができる。一部の例では、これらの効果の組合せが達成される。
【0044】
一部の実施形態では、作用剤（例えば、本明細書に開示されるＳｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉまたはｇＲＮＡ）または遺伝子改変（本明細書に開示されるように、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減させる点変異、部分的欠失、完全な欠失、または挿入）は、ＰＢＭＣの活性または機能を増加させる。例えば、一部の例では、ＰＢＭＣはＴ細胞であり、作用剤は、好適な対照（例えば、処置前の測定値または無処置対照群との比較）と比較して、Ｔ細胞の活性またはエフェクター機能を少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させることができる。Ｔ細胞のエフェクター機能の増加は、例えば、好適な対照と比較した、乳酸取り込みの減少、ＰＤ－１もしくはＴｉｍ３の発現の減少、サイトカイン産生（例えば、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦα、またはＩＬ－２）の増加、細胞増殖の増加（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの増大）、または細胞傷害活性の増加（例えば、腫瘍特異的標的化または殺滅の増加）によって、あるいはエフェクター機能の別の指標によって測定することができる。一部の例では、これらの効果の組合せが達成される。
【0045】
単離された：「単離された」生物学的構成要素（例えば、細胞、ＰＢＭＣ、核酸、タンパク質）は、構成要素が存在する生物の細胞または組織、例えば他の細胞（例えば、ＲＢＣ）、染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質中の他の生物学的構成要素から実質的に分離されている、それとは別に産生されている、または精製されている。「単離」されている核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学合成された核酸およびタンパク質も包含する。例えば、患者の血液、腫瘍、または他の試料から単離されたＰＢＭＣまたはＴＩＬは、少なくとも５０％純粋、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれより高く純粋である。
【0046】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている（例えば、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする異種核酸配列の発現を駆動するプロモーター）。一般的に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合は、同じ読み取り枠に存在する。
【0047】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）：免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、Ｔ細胞およびプロＢ細胞において発現される細胞表面受容体。ＰＤ－１は、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合する。ヒト型は、２６８アミノ酸の１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１は、Ｔ細胞活性を抑制し、Ｔ細胞疲弊を媒介する阻害性受容体である。ＰＤ－１配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースで公開されている（例えば、受託番号ＮＰ＿００５００９．２（成熟ペプチドは、アミノ酸２１～２８８である）、ＣＡＡ４８１１３．１、ＮＰ＿００１３０１０２６．１（成熟ペプチドは、アミノ酸２５～２８８である）、およびＣＡＡ４８１１３．１（成熟ペプチドは、アミノ酸２１～２８８である）は、例示的なＰＤ－１タンパク質配列を提供し、受託番号Ｌ２７４４０．１、ＮＭ＿００５０１８．２、Ｘ６７９１４．１、ＡＢ８９８６７７．１、およびＥＵ２９５５２８．２は、例示的なＰＤ－１核酸配列を提供する）。
【0048】
薬学的に許容される担体：本発明において有用な薬学的に許容される担体は通常通りである。Remington's Pharmaceutical Sciences, 23rd Edition, Academic Press, Elsevier, (2020)は、治療剤、例えば本明細書に開示される改変ＰＢＭＣの薬学的送達にとって好適な組成物および製剤を記載している。
【0049】
一般的に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例として、非経口製剤は通常、薬学的および生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、５％ヒト血清アルブミン、グリセロールなどを媒体として含む注射可能流体を含む。生理的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の、非毒性の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、またはモノラウリン酸ソルビタンを含有し得る。補助活性化合物もまた、組成物に組み入れることができる。
【0050】
プロモーター：核酸の転写を指示する一群の核酸制御配列。プロモーターは、転写の開始部位付近に必要な核酸配列、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターはまた、必要に応じて転写開始部位から数千塩基対もの位置に存在し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。
【0051】
プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶエンハンサー－プロモーター、ＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、またはＰＧＫプロモーターが挙げられる。一例では、ｇＲＮＡの発現は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６またはＨ１、例えばヒトまたはマウスＵ６またはＨ１プロモーターによって駆動される。構成的および誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987を参照されたい）。同様に、プロモーター依存的遺伝子発現を、細胞タイプ特異的、組織特異的に制御可能にするため、または外部シグナルもしくは作用剤によって誘導可能にするために十分であるそれらのプロモーターエレメントも含まれる；そのようなエレメントは、遺伝子の５’または３’領域に位置し得る。組換えＤＮＡまたは合成技術によって産生されたプロモーターもまた使用して、核酸配列の転写を用意することができる。
【0052】
防止する：状態を防止することは、状態の完全な発生を低減する、遅らせる、または阻害すること、例えばＴ細胞の疲弊Ｔ細胞への進行を防止する、低減する、または遅らせることを指す。一例では、Ｓｌｃ１６ａ１１発現を低減させる作用剤、または機能的ＭＣＴ１１の量を低減させる天然に存在しない遺伝子改変は、ＰＢＭＣ、そのようなＴ細胞、例えばＣＡＲまたはＴＣＲに存在する場合、細胞が疲弊する可能性を防止もしくは低減する（例えば、Ｔ細胞がプログラム細胞死１を過剰発現する（ＰＤ１ｈｉ）および／もしくはＴ細胞免疫グロブリン－ムチンドメイン含有タンパク質３陽性となる（ＴＩＭ３＋）可能性を防止もしくは低減する、または細胞の疲弊状態への進行を遅らせ得る。一部の例では、本開示の改変ＰＢＭＣ、例えば改変Ｔ細胞は疲弊しない。一部の例では、本開示の改変ＰＢＭＣ、例えば改変Ｔ細胞は、非改変ＰＢＭＣまたはＴ細胞と比較して疲弊の低減、例えば少なくとも１０％（least 10%）、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の低減を示す。一部の例では、本開示の改変ＰＢＭＣ、例えば改変Ｔ細胞は、非改変ＰＢＭＣまたはＴ細胞と比較して、疲弊へのより遅い進行、例えば疲弊までの日数の少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の増加を示す。
【0053】
ＲＮＡ干渉または干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）：細胞およびウイルス遺伝子を含む遺伝子の発現を阻害する細胞プロセス。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ転写物の配列特異的低減をもたらす、二本鎖ＲＮＡ様オリゴヌクレオチドの導入を伴うアンチセンス媒介遺伝子サイレンシングの形態である。ＲＮＡｉ経路を通して遺伝子発現を阻害するＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡを含み得る。一例では、ＲＮＡｉは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的であり、Ｓｌｃ１６ａ１１核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる。
【0054】
配列同一性：アミノ酸またはヌクレオチド配列間の類似性は、配列間の類似性に関して表記されるか、そうでなければ配列同一性と呼ばれる。配列同一性はしばしば、パーセンテージ同一性（または類似性または相同性）に関して測定される。パーセンテージが高ければ、２つの配列はより類似である。ポリペプチド（またはヌクレオチド配列）のホモログは、標準的な方法を使用して整列させた場合に、比較的高い程度の配列同一性を有する。
【0055】
比較のための配列のアライメントの方法は記載されている。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988；Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989；Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988；およびPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988に記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994は、配列アライメント方法および相同性計算の詳細な検討事項を提示している。
【0056】
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネットを含むいくつかの起源から入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。
【0057】
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）：堅固なヘアピンターンを作製し、ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子発現を沈黙させるために使用することができるＲＮＡの配列。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によってｓｉＲＮＡへと切断される。標的配列（例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１）に対して「特異的」であるｓｈＲＮＡは、それが標的に結合し、他の無関係な配列と有意にハイブリダイズしないように標的配列との十分な相補性を有する。
【0058】
溶質担体ファミリー１６メンバー１１（Ｓｌｃ１６ａ１１）およびモノカルボン酸トランスポーター１１（ＭＣＴ１１）：Ｓｌｃ１６ａ１１は、ＭＣＴ１１タンパク質をコードする遺伝子である。ＭＣＴ１１は、モノカルボキシレート、例えば乳酸を輸送し得る最近特徴付けられた輸送タンパク質である。配列番号１は、ＭＣＴ１１の例示的なアミノ酸配列を開示する。配列番号２は、Ｓｌｃ１６ａ１１の例示的な核酸配列を開示する。ＭＣＴ１１／Ｓｌｃ１６ａ１１の配列は公開されており、例えばＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＮＣＫ７を参照されたく、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＪ９００３４８．１、ＮＭ＿１５３０８１．３、ＮＭ＿１５３３５７．３、およびＮＭ＿００１３７０５４９．１は、例示的なＳｌｃ１６ａ１１核酸配列を提供し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１３５７４７８．１、ＮＰ＿６９４７２１．２およびＮＰ＿００１０９９２６７．２は、例示的なＭＣＴ１１タンパク質配列を提供する。一例では、ＭＣＴ１１タンパク質は、配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１３５７４７８．１、ＮＰ＿６９４７２１．２、もしくはＮＰ＿００１０９９２６７．２、またはＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＮＣＫ７の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一例では、Ｓｌｃ１６ａ１１核酸分子は、配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＪ９００３４８．１、ＮＭ＿１５３０８１．３、ＮＭ＿１５３３５７．３、もしくはＮＭ＿００１３７０５４９．１、またはＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＮＣＫ７の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【0059】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：ＲＮＡｉ経路を通して遺伝子発現をモジュレートする二本鎖核酸分子。ｓｉＲＮＡ分子は、一般的に１５～４０ヌクレオチド長、例えば２０～３０または２０～２５ヌクレオチド長であり、０～５（例えば、２）ヌクレオチドのオーバーハングが各３’末端に存在する。しかし、ｓｉＲＮＡはまた、平滑末端でもあり得る。一般的にｓｉＲＮＡ分子の１つの鎖は、標的核酸、例えば標的ｍＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である。ｓｉＲＮＡはまた、「低分子阻害性ＲＮＡ」とも呼ばれる。標的配列（例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１）に対して「特異的」であるｓｉＲＮＡは、それが標的に結合し、他の無関係な配列と有意にハイブリダイズしないように標的配列との十分な相補性を有する。
【0060】
低分子阻害剤：典型的に、約１０００ダルトン未満、または一部の実施形態では、約５００ダルトン未満の分子量を有する分子であって、標的分子（例えば、ＭＣＴ１１）の活性を何らかの測定可能な程度にモジュレートすることが可能である分子。一部の例では、低分子阻害剤は、ＭＣＴ阻害剤（例えば、７ＡＣＣ１、ＡＲ－Ｃ１５５８５８、ＵＫ５０９９、ＳＲ１３８００、ＣＨＣ、ＡＲ－Ｃ１４１９９０塩酸塩、ＡＺＤ３９６５、またはＢＡＹ８００２）である。
【0061】
対象：脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト。哺乳動物は、これらに限定されないが、ネズミ、サル、ヒト、農場動物、競技用動物、およびペットを含む。一実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物対象、例えば猿または他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。一部の例では、対象は、本明細書に開示される改変ＰＢＭＣを使用して処置することができるがん（または腫瘍）を有する。一部の例では、対象は、実験動物／生物、例えばマウス、ウサギ、またはラットである。
【0062】
Ｔ細胞アゴニスト：Ｔ細胞を活性化して抗腫瘍機能を促進する免疫療法。非限定的な例としては、ウレルマブおよびウトミルマブが挙げられる。
【0063】
Ｔ細胞：免疫応答の重要なメディエーターである白血球（リンパ球）。Ｔ細胞は、これらに限定されないが、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、「表面抗原分類４」（ＣＤ４）としても公知であるその表面上のマーカーを有する免疫細胞である。これらの細胞は、ヘルパーＴ細胞としても公知であり、抗体応答ならびにキラーＴ細胞応答を含む免疫応答を調整するために役立つ。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、「表面抗原分類８」（ＣＤ８）マーカーを有する。一部の例では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。ＣＤ３＋ Ｔ細胞は、「表面抗原分類３」（ＣＤ３）マーカー、すなわちＴ３複合体としても歴史的に公知である多量体タンパク質複合体を有する。
【0064】
活性化Ｔ細胞は、細胞増殖の増加、および／または１つもしくは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、またはＴＮＦα）の発現または分泌の増加によって検出することができる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化はまた、抗原に応答する細胞溶解活性の増加によっても検出することができる。「疲弊Ｔ細胞」は、がんの環境で一般的に見出される機能障害Ｔ細胞（低応答性）である。Ｔ細胞疲弊は、エフェクター機能の進行性の喪失（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γ産生の喪失）ならびに阻害性受容体、例えばＰＤ－１、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン－ムチンドメイン含有タンパク質３（Ｔｉｍ－３）、ＣＴＬＡ－４、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、およびＣＤ１６０の持続的発現によって特徴付けられる。一部の例では、疲弊Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。一部の例では、疲弊Ｔ細胞は、終末疲弊Ｔ細胞（疲弊した最終分化Ｔ細胞）である。終末疲弊Ｔ細胞は、Ｔｉｍ３を発現し、他のＴ細胞（Ｔｉｍ３＋ ＰＤ－１ｈｉ Ｔ細胞）と比較してＰＤ－１の高い永続的発現を有する。Ｔｉｍ３＋および／またはＰＤ－１ｈｉであるＴ細胞は、ＦＡＣｓ解析、例えばＴ細胞集団のＦＡＣｓ解析によって決定され得る。一部の例では、終末疲弊Ｔ細胞はＭＣＴ１１を発現する。Ｔ細胞疲弊の可能性がある原因は、慢性的な活性化または持続的な抗原刺激である。一部の例では、改変ＰＢＭＣは、疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む）である。
【0065】
「治療的Ｔ細胞」は、治療、例えば免疫療法（例えば、がん免疫療法）に使用されるＴ細胞である。治療的Ｔ細胞は、特定の疾患、例えばがんまたは免疫疾患の処置のために対象に投与される。一部の例では、治療的Ｔ細胞は、標的細胞、例えばがん様細胞を認識および殺滅し、それによって疾患、例えばがんを処置する。治療的Ｔ細胞は、対象に対して自家または同種異系であり得る。一部の例では、治療的Ｔ細胞は、養子細胞移入（ＡＣＴ）免疫療法に使用されるＴ細胞である。さらなる例では、治療的Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくは操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
【0066】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）：主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして抗原の断片の認識に関与するＴリンパ球（またはＴ細胞）の表面上に見出される受容体。ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖で構成される。ヒトでは、Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）およびベータ（β）鎖からなるが、Ｔ細胞の５％では、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。この比率は、個体発生の間および疾患状況、ならびに異なる種において変化する。ＴＣＲが、抗原ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）に係合すると、Ｔリンパ球は、シグナル伝達、すなわち関連する酵素、共受容体、専門のアダプター分子、および活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学事象を通して活性化される。一例では、ＴＣＲは、組換えＴＣＲ、例えばＡＣＴ療法のためのＴＣＲ操作Ｔ細胞において使用されるＴＣＲである。
【0067】
治療剤：対象に投与すると何らかの有益な効果を付与する１つまたは複数の分子または化合物を指す。有益な治療効果は、診断の決定を可能にすること；疾患、症状、障害、または病態の回復；疾患、症状、障害、または状態の発症を低減または防止すること；および一般的に疾患、症状、障害、または病態に対抗することを含み得る。
【0068】
形質転換された：形質転換細胞は、その中に核酸分子が分子生物学技術によって導入されている細胞（例えば、ＰＢＭＣ、例えば、Ｔ細胞）である。本明細書で使用される場合、形質転換されたという用語など（例えば、形質転換、トランスフェクション、形質導入等）は、ウイルスベクター、プラスミドベクター、核酸－タンパク質複合体（例えば、リボヌクレオタンパク質）、またはネイキッド核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む、核酸分子がそのような細胞に導入され得る全ての技術を包含する。
【0069】
例示的な形質転換方法としては、化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、粒子衝突）、融合（例えば、リポソーム）、リポフェクション、ヌクレオフェクション、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ－タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド－ＤＮＡ複合体）、粒子銃加速器（遺伝子銃）、およびウイルス、例えば組換えウイルスによる生物学的感染（Wolff, J. A., ed, Gene Therapeutics, Birkhauser, Boston, USA (1994)）が挙げられる。レトロウイルスによる感染の場合、感染するレトロウイルス粒子は、標的細胞によって吸収され、レトロウイルスＲＮＡゲノムの逆転写および得られたプロウイルスの細胞ＤＮＡへの組み込みをもたらす。
【0070】
処置すること、処置、および治療：任意の客観的または主観的パラメーター、例えば症状の軽減、寛解、減少、または状態を患者により認容性にすること、悪化もしくは低下速度を遅らせること、悪化の最終ポイントの衰弱性を弱めること、対象の身体もしくは精神の幸福を改善すること、または生存期間を延長することを含む、傷害、病理、または状態の減弱または回復における任意の成功または成功の指標。処置は、身体検査、血液、および他の臨床検査の結果などを含む、客観的または主観的パラメーターによって評価され得る。一部の例では、本開示の方法による処置は、腫瘍および／または転移の数、体積、および／または重量の減少をもたらす。
【0071】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）：腫瘍組織に侵入するリンパ球。例えば、腫瘍試料内に見出されるＴ細胞。ＡＣＴ療法において、ＴＩＬ療法は一般的に、患者の腫瘍からＴＩＬを単離すること、培養中でＴＩＬを活性化および増大させること、ならびに次に患者に再灌流することを伴う。一部の例では、本明細書に開示される改変ＰＢＭＣはＴＩＬである。
【0072】
腫瘍、新形成、または悪性疾患：新生物は、過度の細胞分裂に起因する組織または細胞の異常な成長である。新生物の成長は、腫瘍を生じ得る。個体における腫瘍の量は、「腫瘍量」であり、これは、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる。「非がん様組織」は、悪性新生物が形成されたが、新生物の特徴的な病理を有しない同じ臓器に由来する組織である。一般的に、非がん様組織は組織学的に正常に見える。「正常組織」は、がんにもその臓器の別の疾患または障害にも罹患していない臓器からの組織である。「がんを有しない」対象は、その臓器のがんと診断されておらず、検出可能ながんを有しない。
【0073】
本開示の改変ＰＢＭＣを使用して処置することができる例示的な腫瘍、例えばがんとしては、固形腫瘍、例えば乳癌（例えば、小葉癌および乳管癌、例えばトリプルネガティブ乳がん）、肉腫、肺の癌（例えば、非小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌、および腺癌）、肺の中皮腫、結腸直腸腺癌、胃癌、前立腺腺癌、卵巣癌（例えば、漿液性嚢胞腺癌および粘液性嚢胞腺癌）、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌および胚細胞腫瘍、膵腺癌、胆管腺癌、肝細胞癌、膀胱癌（例として、移行上皮癌、腺癌、および扁平上皮癌を含む）、腎細胞腺癌、子宮内膜癌（例えば、腺癌およびミュラー管混合腫瘍（癌肉腫）を含む）、子宮頸内膜、子宮頸外膜、および膣の癌（例えば、それらの各々の腺癌および扁平上皮癌）、皮膚の腫瘍（例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、皮膚付属器腫瘍、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器の腫瘍ならびに様々なタイプの肉腫およびメルケル細胞癌）、食道癌、鼻咽頭および中咽頭の癌（それらの扁平上皮癌および腺癌を含む）、唾液腺癌、脳および中枢神経系の腫瘍（例えば、グリア起源、ニューロン起源、および髄膜起源の腫瘍を含む）、末梢神経の腫瘍、軟部組織肉腫、ならびに骨および軟骨の肉腫、頭頸部扁平上皮癌、ならびにリンパ腫瘍（Ｂ細胞およびＴ細胞悪性リンパ腫を含む）が挙げられる。一例では、腫瘍は黒色腫である。一例では、腫瘍は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、例えば、ＨＰＶ陽性ＨＮＳＣＣである。
【0074】
本開示の改変ＰＢＭＣはまた、液性腫瘍、例えばリンパ、白血球の腫瘍、または白血病の他のタイプを処置するためにも使用することができる。特定の例では、処置される腫瘍は、血液の腫瘍、例えば白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、および成人Ｔ細胞白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、または骨髄腫である。
【0075】
ベクター：宿主細胞に導入され（例えば、トランスフェクションまたは形質転換によって）、それによって形質転換宿主細胞（例えば、形質転換ＰＢＭＣ）を産生することができる核酸分子。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、宿主細胞においてそれが複製することを許容する核酸配列、例えば複製開始点を含み得る。ベクターはまた、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントも含み得る。ウイルスベクター（例えば、ＡＶＶ）は、１つまたは複数のウイルスに由来する少なくとも一部の核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。複製欠損ウイルスベクターは、少なくとも１つの複製に不可欠な遺伝子機能の欠如により、複製にとって必要なウイルスゲノムの１つまたは複数の領域の相補を必要とするベクターである。
【0076】
概説
免疫療法、中でも注目すべきはチェックポイント受容体の遮断ならびに操作された腫瘍特異的Ｔ細胞の治療のための使用により、がんの処置の模範は変化している。しかし、これらのモダリティの有効性を制限する潜在的要因は、Ｔ細胞疲弊の発生、すなわちＴ細胞のより機能障害状態への代替的分化である。疲弊は、Ｔ細胞が免疫療法に応答する能力を制限する。疲弊したＴ細胞はまた、それらの機能を制限する別個の代謝プロファイルも有する。例えば、それらは、グルコースに関する競合が不良であり、新規ミトコンドリアの生成を抑制する。しかし、これらの細胞は、腫瘍微小環境において存続し、このためにこれらの細胞を支持するある特定の代謝経路または代謝物が、抗腫瘍機能を妨害し得る。
免疫療法、中でも注目すべきはチェックポイント受容体の遮断ならびに操作された腫瘍特異的Ｔ細胞の治療のための使用により、がんの処置の模範は変化している。しかし、これらのモダリティの有効性を制限する潜在的要因は、Ｔ細胞疲弊の発生、すなわちＴ細胞のより機能障害状態への代替的分化である。疲弊は、Ｔ細胞が免疫療法に応答する能力を制限する。疲弊したＴ細胞はまた、それらの機能を制限する別個の代謝プロファイルも有する。例えば、それらは、グルコースに関する競合が不良であり、新規ミトコンドリアの生成を抑制する。しかし、これらの細胞は、腫瘍微小環境において存続し、このためにこれらの細胞を支持するある特定の代謝経路または代謝物が、抗腫瘍機能を妨害し得る。
【0077】
本明細書において、終末疲弊Ｔ細胞は、ＭＣＴ１１発現を特異的に上方調節することが示される。終末疲弊Ｔ細胞はまた、モノカルボキシレート、例えば乳酸を特異的に取り込むことができる。このことは、ＭＣＴ１１トランスポーターが、終末疲弊Ｔ細胞に対する栄養の流れの提供において役割を有することを示している。腫瘍を有するマウスに移入された腫瘍特異的Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１活性の欠如は、Ｔ細胞機能の増加および疲弊の減少をもたらした。さらに、腫瘍特異的Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の過剰発現は、疲弊した機能障害表現型の発生を加速させた。このように、いかなる特定の理論にも拘束されないが、ＭＣＴ１１は、おそらく、疲弊Ｔ細胞のエフェクター機能を制限し得る乳酸の取り込みを支持する。このように、Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１機能または発現を低減または除去することを使用して、エフェクター活性を増加させるおよび／またはＴ細胞疲弊を減少させる、例えばがん治療において使用されるＴ細胞の疲弊を防止することができる。このように、一部の例では、ＭＣＴ１１発現および／または活性が低減または除去された本開示の改変Ｔ細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで生成し、Ｔ細胞が疲弊する能力を防止または遅らせ、改変細胞は、免疫療法のためにがんを有する対象に投与され得る。そのような治療におけるＰＢＭＣ、例えば治療的Ｔ細胞の使用は、より強力な免疫応答およびより良好ながんの処置を提供することができる。
【0078】
Ｉ． ＲＮＡｉおよびｇＲＮＡ
本明細書において、Ｓｌｃ１６ａ１１（ＳＬＣ１６Ａ１１）に対して特異的な干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）またはガイド核酸（ｇＲＮＡ）を開示する。ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡは、Ｓｌｃ１６ａ１１核酸分子、例えば遺伝子または転写物を標的として、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減させる。一部の例では、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡは、細胞、例えばＰＢＭＣ、Ｔ細胞、または疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む）に導入される。一部の例では、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡ分子は、例えばオリゴヌクレオチドとして細胞に直接導入される。一部の例では、ＲＮＡｉまたは（of）ｇＲＮＡ分子は、細胞に導入されたベクターから発現される。ガイドＲＮＡが発現される（例えば、発現カセットまたはベクターから）例では、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡとしてコードされ得る。
本明細書において、Ｓｌｃ１６ａ１１（ＳＬＣ１６Ａ１１）に対して特異的な干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）またはガイド核酸（ｇＲＮＡ）を開示する。ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡは、Ｓｌｃ１６ａ１１核酸分子、例えば遺伝子または転写物を標的として、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減させる。一部の例では、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡは、細胞、例えばＰＢＭＣ、Ｔ細胞、または疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む）に導入される。一部の例では、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡ分子は、例えばオリゴヌクレオチドとして細胞に直接導入される。一部の例では、ＲＮＡｉまたは（of）ｇＲＮＡ分子は、細胞に導入されたベクターから発現される。ガイドＲＮＡが発現される（例えば、発現カセットまたはベクターから）例では、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡとしてコードされ得る。
【0079】
一部の実施形態では、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なＲＮＡｉを使用して、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減または阻害する。Ｓｌｃ１６ａ１１に対するＲＮＡｉの特異性により、Ｓｌｃ１６ａ１１ ＤＮＡまたはＲＮＡとのＲＮＡｉ分子のハイブリダイゼーションが可能となり、それによってＳｌｃ１６ａ１１発現を低減または阻害する。ＲＮＡｉは、総称的に、転写および／または翻訳を阻害することによって遺伝子の発現を阻害する細胞プロセスを指す。ＲＮＡｉ経路を通して遺伝子発現を阻害する分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡを含む。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉは、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物の固有の（例えば、ＲＮＡｉが導入される細胞または生物のゲノムにはどこにも見出されない）連続部分（例えば、配列番号２の一部分）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％相補的である配列を含む。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉは、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物の固有の連続部分（例えば、配列番号２の一部分）と少なくとも９０％相補的（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的）である配列からなる。
【0080】
特定の非限定的な例では、ＲＮＡｉは、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡを設計する方法が記載されており、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Moore et al. (2010) Short Hairpin RNA (shRNA): Design, Delivery, and Assessment of Gene Knockdown, Methods Mol. Biol., 629:141-158を参照されたい。一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列の固有の連続部分に対して特異的である。一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の固有の連続部分に対して特異的である。
【0081】
一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号４のヌクレオチド５～２５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する標的化配列を含む。一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号４のヌクレオチド５～２５と少なくとも９５％の配列同一性を有する標的化配列を含む。一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。例えば、ｓｈＲＮＡは、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号４を含むかまたはからなる。
【0082】
他の例では、ＲＮＡｉは、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｓｉＲＮＡであり、例えばｓｉＲＮＡは、配列番号２の固有の連続部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列に対して特異的である。例えば、ｓｉＲＮＡは、配列番号２の固有の連続部分と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列に対して特異的であり得る。
【0083】
一部の実施形態では、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｇＲＮＡを使用して、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減または阻害する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ方法を、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｇＲＮＡと共に使用して、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現を低減または阻害することができる。Ｓｌｃ１６ａ１１に対するｇＲＮＡの特異性を、Ｃａｓヌクレアーゼまたは不活性型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ１３ｄ、またはＣａｓ１３ｄ）と組み合わせると、Ｓｌｃ１６ａ１１ ＤＮＡまたはＲＮＡとのｇＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションを可能にし、それによってＳｌｃ１６ａ１１を編集し（例えば、それを変異させ、例えばそれをノックダウンまたはノックアウトして）、その発現を低減または阻害する。一部の例では、Ｃａｓヌクレアーゼ（または不活性型Ｃａｓヌクレアーゼ）配列は、宿主細胞における発現に関してコドン最適化されている。一部の例では、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓヌクレアーゼは、宿主細胞（例えば、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞、または疲弊Ｔ細胞）に導入されたベクターから発現される。一部の例では、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓヌクレアーゼを含有するＲＮＰ複合体は、細胞（例えば、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞、または疲弊Ｔ細胞）に導入される。一部の例では、ｇＲＮＡは、例えばオリゴヌクレオチドとして細胞に導入される。
【0084】
一部の例では、ｇＲＮＡは、Ｓｌｃ１６ａ１１（ＳＬＣ１６Ａ１１）遺伝子または転写物に対して特異的である。例えば、ｇＲＮＡは、配列番号２の固有の連続部分と７０％（at 70%）、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列に対して特異的である。一部の例では、ｇＲＮＡは、配列番号２の固有の連続部分と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に対して特異的である。一部の例では、ｇＲＮＡは、例えば、配列番号２の固有の連続部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である標的化配列を有することによって、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的な標的化配列（時にスペーサーと呼ばれる）を含む。ｇＲＮＡの標的化配列は、典型的に約２０ヌクレオチド、例えば、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、または約２５ヌクレオチドである。特定の非限定的な例では、標的化配列は約２０ヌクレオチドである。標的化配列とその対応する標的配列の間の相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適に整列させた場合、約５０％もしくはそれより高い、約６０％もしくはそれより高い、約７５％もしくはそれより高い、約８０％もしくはそれより高い、約８５％もしくはそれより高い、約９０％もしくはそれより高い、約９５％もしくはそれより高い、約９７．５％もしくはそれより高い、約９８％もしくはそれより高い、約９９％もしくはそれより高い、またはそれより高い。一部の実施形態では、相補性の程度は、約１００％である。最適なアライメントは、配列を整列させるための任意の好適なアルゴリズムの使用によって決定され得、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（soap.genomics.org.cnで入手可能）、およびＭａｑ（maq.sourceforge.netで入手可能）が挙げられる。一部の例では、標的化配列は、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物における約２０ヌクレオチド長の固有の連続するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である。
【0085】
一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｇＲＮＡは、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する連続配列を含む。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｇＲＮＡは、配列番号３を含む。一部の例では、ｇＲＮＡの標的化配列部分は、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の例では、ｇＲＮＡの標的化配列部分は、配列番号３を含むかまたはからなる。
【0086】
一部の例では、ｇＲＮＡは、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｓｇＲＮＡである。一部の例では、ｓｇＲＮＡは、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する連続配列を含む。一部の例では、ｓｇＲＮＡは配列番号３を含む。一部の例では、ｓｇＲＮＡの標的化配列部分は、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の例では、ｓｇＲＮＡの標的化配列部分は、配列番号３を含むかまたはからなる。
【0087】
ｇＲＮＡを設計して適切な標的化配列を決定する方法は記載されている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hanna and Doench (2020) Design and analysis of CRISPR-Cas experiments, Nature Biotechnology, 38:813-823(2020)を参照されたい）。様々な操作様式に関して最適なｇＲＮＡを設計するための、およびそのような実験の結果を解析するためのリソースを含む多数のソフトウェアツールを使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ実験を設計および分析することができる。検証されたｇＲＮＡのオンラインデータベースもまた容易に入手可能である（addgene.org/crispr/reference/grna-sequence/およびgenscript.com/gRNA-database.htmlを参照されたい）。
【0088】
ＩＩ． 核酸および発現ベクター
ＲＮＡｉ、ｇＲＮＡ、および／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸（例えば、異種核酸または単離された核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））もまた、本明細書において提供される。核酸は、本明細書に提供される本開示の配列、当技術分野で利用可能な配列、および遺伝子コードを使用して容易に産生することができる。
ＲＮＡｉ、ｇＲＮＡ、および／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸（例えば、異種核酸または単離された核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））もまた、本明細書において提供される。核酸は、本明細書に提供される本開示の配列、当技術分野で利用可能な配列、および遺伝子コードを使用して容易に産生することができる。
【0089】
本開示の核酸配列の縮重バリアントもまた、開示される。コード配列におけるサイレント変異は、遺伝子コードの縮重（すなわち、冗長性）に起因し、それによって１つより多くのコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る。このように、例えばロイシンは、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコードされ得る；セリンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコードされ得る；アスパラギンは、ＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされ得る；アスパラギン酸は、ＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされ得る；システインは、ＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされ得る；アラニンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコードされ得る；グルタミンは、ＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされ得る；チロシンは、ＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされ得る；およびイソロイシンは、ＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡによってコードされ得る。
【0090】
特定の種に関するコドン優先性およびコドン使用表を使用して、その特定の種のコドン使用優先性を利用するタンパク質産物、例えばＣａｓ９をコードする単離された核酸分子を操作することができる。例えば、核酸を、目的の特定の生物（例えば、改変されるＰＢＭＣの起源生物、または核酸を投与される生物）が優先的に使用するコドンを有するように設計することができる。一部の例では、核酸は、ヒトでの発現に関してコドン最適化される。このように、一部の例では、Ｃａｓヌクレアーゼ（または不活性型ヌクレアーゼ）配列は、ヒトＰＢＭＣ（例えば、Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞）における発現に関してコドン最適化される。
【0091】
本開示の核酸は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の好適な方法によって、または標準的な方法による直接化学合成によって調製することができる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これを、相補配列とのハイブリダイゼーション、または鋳型として一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼによる重合によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。
【0092】
核酸配列は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の好適な方法を使用して、またはNarang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979のホスホトリエステル方法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979のホスホジエステル方法；Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981のジエチルホスホラミダイト方法；Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862, 1981によって記載され、例えば、Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984に記載される自動シンセサイザーを使用する固相ホスホラミダイトトリエステル方法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持法などの方法による直接化学合成によって調製することができる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これを、相補配列とのハイブリダイゼーション、または鋳型として一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼによる重合によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。当業者は、ＤＮＡの化学合成が一般的に約１００塩基の配列に限定されるが、より短い配列のライゲーションによってより長い配列が得られ得ることを認識するであろう。
【0093】
本開示の核酸は、クローニング技術によって調製することができる。適切なクローニングおよびシーケンシング技術の例は、例えばGreen and Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)およびAusubel et al. (Eds.)(Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons、補遺を含む）に見出され得る。核酸はまた、増幅法によっても調製することができる。増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製系（３ＳＲ）、およびＱβレプリカーゼ増幅系（ＱＢ）を含む。広く多様なクローニングおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法論が当業者に公知である。
【0094】
一部の実施形態では、本開示の核酸は、宿主、または特に標的細胞（例えば、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞、または疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む））における発現のために発現ベクター（例えば、ウイルスベクター、プラスミド、または他の媒体）に含まれる。一部の例では、発現ベクターは、本開示の核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。例えば、プロモーターを、ＲＮＡｉ、ｇＲＮＡ、またはＣａｓヌクレアーゼ（または不活性型ヌクレアーゼ）に作動可能に連結して、その発現を駆動することができる。一部の例では、ベクターは、Ｃａｓヌクレアーゼ（または不活性型ヌクレアーゼ）およびｇＲＮＡの両方をコードする。追加の発現制御配列、例えば１つまたは複数のエンハンサー、転写および／または翻訳ターミネーター、ならびに開始配列もまた、発現ベクターに含めることができる。一部の実施形態では、本開示の核酸は、ウイルスベクターに含まれる。使用することができる例示的なウイルスベクターとしては、これらに限定されないが、ポリオーマ、ＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、アルファウイルス、ならびに鳥類、ネズミ、およびヒト起源のレトロウイルスが挙げられる。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体病ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターもまた、使用することができる。他の好適なベクターは、オルソポックスベクター、アビポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、スイポックスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、およびポリオウイルスベクターを含む。特定の例示的なベクターは、ポックスウイルスベクター、例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、および高度弱毒化ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、アデノウイルス、バキュロウイルスなどである。使用されるポックスウイルスは、オルソポックス、スイポックス、アビポックス、およびカプリポックスウイルスを含む。オルソポックスは、ワクシニア、エクトロメリア、およびラクーンポックスを含む。使用されるオルソポックスの一例は、ワクシニアである。アビポックスは、鶏痘、カナリア痘、および鳩痘を含む。カプリポックスは、ヤギ痘およびヒツジ痘を含む。一例では、スイポックスは、豚痘である。使用することができる他のウイルスベクターは、他のＤＮＡウイルス、例えばヘルペスウイルスおよびアデノウイルス、ならびにＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスおよびポリオを含む。細胞（例えば、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞、または疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む））における発現および複製が可能な生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、公知であり、当業者は、好適なベクターを同定することができる。一部の例では、ベクターは、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン）またはレポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を含む。他の例では、選択可能マーカーおよび／またはレポーターは、ベクターに含まれない。
【0095】
本開示の核酸を、ＤＮＡ移入によって宿主細胞に導入することができ（例えば、オリゴヌクレオチド）、または好適な宿主細胞に導入および発現させることができる（例えば、発現カセットまたはベクター）。一部の例では、発現産物は、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｇＲＮＡ）であり、他の例では、発現産物は、タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）である。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞はＰＢＭＣ（例えば、Ｔ細胞または疲弊Ｔ細胞）である。一過性または安定な移入方法を使用することができる。一過性の移入は、外来核酸がごく一過性に存在することを示す（例えば、一定期間後に分解する、宿主細胞によって除去される、またはそうでなければ安定に複製されない）。安定な移入は、外来核酸が、宿主において持続的に維持されることを示す。
【0096】
本開示の核酸の最適な発現を得るために、発現カセットは、例えば転写を指示するための強いプロモーターを含有することができ、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（例えば、配列内リボソーム結合配列）、および転写／翻訳ターミネーターを使用することができる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために、プロモーター、例えば、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃ、またはラムダプロモーター、リボソーム結合部位、および好ましくは転写終結シグナルを使用することができる。真核細胞、例えばＰＢＭＣの場合、制御配列は、例えば免疫グロブリン遺伝子、ＨＴＬＶ、ＳＶ４０、またはサイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含み得、スプライスドナーおよび／またはアクセプター配列（例えば、ＣＭＶおよび／またはＨＴＬＶスプライスアクセプターおよびドナー配列）をさらに含み得る。追加の機能性エレメントは、これらに限定されないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに核酸配列の適切な転写およびその後の翻訳にとって必要な他の任意の配列を含む。
【0097】
本開示の核酸またはベクターは、任意の好適な方法（例えば、形質転換）によって宿主細胞に導入することができる。多数の形質転換法：例えば、化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、粒子衝突）、融合（例えば、リポソーム）、リポフェクション、ヌクレオフェクション、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ－タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド－ＤＮＡ複合体）、粒子銃加速器（遺伝子銃）、およびウイルス、例えば組換えウイルスによる生物学的感染（Wolff, J. A., ed, Gene Therapeutics, Birkhauser, Boston, USA (1994)）が公知である。レトロウイルスによる感染の場合、感染するレトロウイルス粒子は、標的細胞によって吸収され、それによってレトロウイルスＲＮＡゲノムの逆転写および得られたプロウイルスの細胞ＤＮＡへの組み込みをもたらす。形質転換に成功した細胞を、ベクターが含有する遺伝子、例えばａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、およびｈｙｇ遺伝子によって付与される抗生物質に対する耐性によって選択することができる。一部の例では、本開示の核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体（例えば、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ複合体）に組み込まれる。ＲＮＰは、形質転換、例えばヌクレオフェクションによって宿主細胞に導入することができる。
【0098】
コードされる産物の生物活性を減損させることなく、本開示の核酸に改変を行うことができる。例えば、標的化分子のクローニング、発現、または融合タンパク質への組み込みを容易にするための改変を行うことができる。そのような改変は、例えば終止コドン、慣習的に位置決めした制限部位を作り出すための配列、および開始部位を提供するためにアミノ末端でのメチオニン、または精製ステップを助けるために追加のアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を付加するための配列を含む。
【0099】
ＩＩＩ． 改変ＰＢＭＣ
本明細書において、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である改変末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を提供する。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現は、好適な対照（例えば、改変前のＰＢＭＣ）と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％低減される。一部の例では、ＭＣＴ１１の活性は、好適な対照（例えば、改変前のＰＢＭＣ）と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％低減される。活性を低減させることは、例えばモノカルボキシレート（例えば、乳酸）の改変ＰＢＭＣへの輸送を低減させることによって、ＭＣＴ１１の任意の測定可能な生物機能を低減させることを含む。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である改変ＰＢＭＣは、好適な対照（例えば、非改変ＰＢＭＣ）と比較してエフェクター活性（例えば、抗腫瘍）が増加している。一部の例では、改変ＰＢＭＣはＴ細胞であり、Ｔ細胞は、好適な対照（例えば、非改変ＰＢＭＣ）と比較してＴ細胞疲弊に対する抵抗性が増加している。
本明細書において、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である改変末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を提供する。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現は、好適な対照（例えば、改変前のＰＢＭＣ）と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％低減される。一部の例では、ＭＣＴ１１の活性は、好適な対照（例えば、改変前のＰＢＭＣ）と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％低減される。活性を低減させることは、例えばモノカルボキシレート（例えば、乳酸）の改変ＰＢＭＣへの輸送を低減させることによって、ＭＣＴ１１の任意の測定可能な生物機能を低減させることを含む。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である改変ＰＢＭＣは、好適な対照（例えば、非改変ＰＢＭＣ）と比較してエフェクター活性（例えば、抗腫瘍）が増加している。一部の例では、改変ＰＢＭＣはＴ細胞であり、Ｔ細胞は、好適な対照（例えば、非改変ＰＢＭＣ）と比較してＴ細胞疲弊に対する抵抗性が増加している。
【0100】
改変ＰＢＭＣは、追加の改変をさらに含み得、例えば、ＰＢＭＣは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するかまたはそうでなければ含有し得る。
【0101】
一部の例では、改変ＰＢＭＣは、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋またはＣＤ３＋Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、腫瘍特異的抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、メソテリン１（ＭＳＬＮ）、またはＥＧＦＲに対して反応性であり得る。一部の例では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。一部の例では、Ｔ細胞は、治療的Ｔ細胞であるか、または治療的Ｔ細胞として、例えばＡＣＴ療法として使用される。一部の例では、Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む）である。疲弊Ｔ細胞は、エフェクター機能の進行的喪失（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γ産生の喪失）、ならびに阻害性受容体、例えばＰＤ－１、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン－ムチンドメイン含有タンパク質３（Ｔｉｍ－３）、ＣＴＬＡ－４、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、およびＣＤ１６０の持続的発現によって特徴付けられる機能障害Ｔ細胞である。一部の例では、疲弊Ｔ細胞は、プログラム細胞死１の高い永続的発現（ＰＤ１ｈｉ）を有し、Ｔ細胞免疫グロブリン－ムチンドメイン含有タンパク質３に関して陽性である（ＴＩＭ３＋）終末疲弊Ｔ細胞である。
【0102】
一部の実施形態では、改変ＰＢＭＣは、Ｓｌｃ１６ａ１１発現を低減させる作用剤、例えばＳｌｃ１６ａ１１遺伝子もしくは転写物に対して特異的な本開示の阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、またはＳｌｃ１６ａ１１遺伝子もしくは転写物に対して特異的な１つもしくは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたは不活性型Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、ＲＮＰと組み合わせて）の１つまたは複数を含む。
【0103】
一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１発現を低減させる作用剤は、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な本開示の阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、例えば、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスＲＮＡの１つまたは複数である。特定の非限定的な例では、ＲＮＡｉは、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｓｈＲＮＡであり、例えば、ｓｉＲＮＡは、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む配列に対して特異的である。一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号２の固有の連続部分に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に対して特異的である。一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。例えば、ｓｈＲＮＡは、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。一部の例では、ｓｈＲＮＡは、配列番号４からなるかまたは含む。
【0104】
一部の例では、作用剤は、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的な本開示のｇＲＮＡであり、例えばｇＲＮＡは、配列番号２と７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列に対して特異的である。例えば、ｇＲＮＡは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に対して特異的であり得る。一部の例では、ｇＲＮＡは、例えば配列番号２の固有の連続部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である標的化配列を有することによって、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的な標的化配列を含む。
【0105】
一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｇＲＮＡは、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する連続配列を含む。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物に対して特異的なｇＲＮＡは、配列番号３を含む。一部の例では、ｇＲＮＡの標的化配列部分は、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の例では、標的化配列は、配列番号３を含むかまたはからなる。一部の例では、改変ＰＢＭＣは、本開示のｇＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ１３ｄ、またはＣａｓ１３ｄを含むＲＮＰ複合体を含む。
【0106】
一部の例では、改変ＰＢＭＣは、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）またはｇＲＮＡをコードする本開示の核酸の１つまたは複数をコードする異種核酸分子を含む。ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡは、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡベクターにコードされる）としてコードされ得るが、ＲＮＡとして発現され得る。一部の例では、異種核酸分子は、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な本開示のｇＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼ（または不活性型Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードする。特定の例では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。他の例では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ１３ｄヌクレアーゼである。
【0107】
一部の実施形態では、改変ＰＢＭＣは、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡをコードする本開示のベクターを含む。このように、一部の例では、改変ＰＢＭＣは、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡを発現する。ｇＲＮＡを使用する場合、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ１３ｄ、またはＣａｓ１３ｄ）をまた、同じまたは異なるベクターにコードして、例えば改変ＰＢＭＣにおいて、Ｃａｓヌクレアーゼ（または不活性型Ｃａｓヌクレアーゼ）およびＳｌｃ１６ａ１１に対して特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡを共発現させることができる。一部の例では、ｇＲＮＡは、スペーサー配列およびＤＲ配列（例えば、ＤＲ－スペーサー－ＤＲ－スペーサー）を含み、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ１３ｄであり、Ｓｌｃ１６ａ１１ ＲＮＡは編集されている。一部の例では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（２つの個別の分子、または１つの融合分子、例えば、ｓｇＲＮＡのいずれかとして発現される）を含み、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の例では、ベクターは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な２つまたはそれより多くのｇＲＮＡを含むカセットを含み、２つまたはそれより多くのｇＲＮＡは、同じまたは異なる標的化配列を有する（例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１の２つの異なる領域を標的とし得る）。
【0108】
核酸またはベクターは、ＰＢＭＣ（例えば、Ｔ細胞）に一過性または安定に導入され得る。特定の非限定的な例では、ベクターは、改変ＰＢＭＣに安定に導入され、それによって改変ＰＢＭＣにおいてＲＮＡｉまたはｇＲＮＡの安定な発現をもたらす。一部の例では、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡをコードする核酸は、ベクターにおいて細胞特異的プロモーター（例えば、Ｔ細胞特異的プロモーター）に作動可能に連結される。ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡの発現は構成的または誘導性であり得る。例示的なプロモーターとしては、ＮＦＡＴ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、Ｕ６、またはＨ１が挙げられる。一例では、ｇＲＮＡは、Ｕ６またはＨ１プロモーターから発現される。一例では、Ｃａｓヌクレアーゼ（または不活性型Ｃａｓヌクレアーゼ）は、ＣＭＶプロモーターから発現される。
【0109】
一部の実施形態では、改変ＰＢＭＣは、機能的ＭＣＴ１１の量を低減させる天然に存在しない遺伝子改変を含む。機能的ＭＣＴ１１を低減させることは、改変ＰＢＭＣにおいてＳｌｃ１６ａ１１発現を減少させる（例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子または転写物の転写または翻訳を減少させる）遺伝子改変を含む。一部の例では、遺伝子改変は、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子の天然に存在しない遺伝子改変である。他の例では、遺伝子改変は、Ｓｌｃ１６ａ１１の調節エレメント（例えば、プロモーター、応答エレメント、エンハンサー、転写因子、またはＳｌｃ１６ａ１１の発現に影響を及ぼす他の調節因子）の天然に存在しない遺伝子改変である。調節エレメントは、シス作用またはトランス作用であり得る。
【0110】
一部の例では、天然に存在しない遺伝子改変は、改変ＰＢＭＣにおいて機能的なＭＣＴ１１の量を低減させる改変である。例えば、遺伝子改変は、機能障害ＭＣＴ１１の産生をもたらし得る。一部の例では、遺伝子改変は、不安定なＭＣＴ１１の産生をもたらし、それによって機能的ＭＣＴ１１の蓄積が低減される。遺伝子改変は、ＭＣＴ１１の量の減少をもたらす任意の天然に存在しない改変であり得る。遺伝子改変の非限定的な例としては、点変異、部分的欠失、完全な欠失、または挿入が挙げられる。
【0111】
一部の実施形態では、改変ＰＭＢＣは、ＭＣＴの阻害剤、例えば低分子阻害剤を含む。一部の例では、ＭＣＴの低分子阻害剤は、７ＡＣＣ１、ＡＲ－Ｃ１５５８５８、ＵＫ５０９９、ＳＲ１３８００、ＣＨＣ、ＡＲ－Ｃ１４１９９０塩酸塩、ＡＺＤ３９６５、またはＢＡＹ８００２の１つまたは複数である。特定の非限定的な例では、改変ＰＢＭＣは、ＭＣＴ１１の低分子阻害剤を含む。
【0112】
改変ＰＢＭＣを生成する方法
本明細書において、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤をＰＢＭＣに導入し、それによってＳｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、および／またはＭＣＴ１１の活性が低減された改変ＰＢＭＣを生成することによって、本開示の改変ＰＢＭＣを生成する方法もまた提供される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤を導入する前の対象から得られる。ＰＢＭＣは、例えば、対象の血液試料、例えば静脈血試料から採取または単離することができる。ＰＢＭＣを単離するためのいくつかの技術、例えば密度遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌアプローチ）、細胞調製チューブ（ＣＰＴ）による単離、またはＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブによる単離が公知である。一部の例では、アフェレーシス（aphersis）または白血球アフェレーシスを使用してＰＢＭＣを採取する。赤血球の混入を、例えば試料の顕微鏡解析によって評価することができる。フローサイトメトリー技術（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して単離されたＰＢＭＣ集団の組成を評価し、例えば単球（例えば、ＣＤ１４）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４）、Ｂ細胞（例えば、ＣＤ２０）、またはＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６）を同定することができる。ＦＡＣＳ技術をまた使用して、ＰＢＭＣから特定の細胞タイプを富化または枯渇する（例えば、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ２０、ＣＤ５６、またはその組合せを富化または枯渇する）こともできる。
本明細書において、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤をＰＢＭＣに導入し、それによってＳｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、および／またはＭＣＴ１１の活性が低減された改変ＰＢＭＣを生成することによって、本開示の改変ＰＢＭＣを生成する方法もまた提供される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤を導入する前の対象から得られる。ＰＢＭＣは、例えば、対象の血液試料、例えば静脈血試料から採取または単離することができる。ＰＢＭＣを単離するためのいくつかの技術、例えば密度遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌアプローチ）、細胞調製チューブ（ＣＰＴ）による単離、またはＳｅｐＭａｔｅ（商標）チューブによる単離が公知である。一部の例では、アフェレーシス（aphersis）または白血球アフェレーシスを使用してＰＢＭＣを採取する。赤血球の混入を、例えば試料の顕微鏡解析によって評価することができる。フローサイトメトリー技術（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して単離されたＰＢＭＣ集団の組成を評価し、例えば単球（例えば、ＣＤ１４）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４）、Ｂ細胞（例えば、ＣＤ２０）、またはＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６）を同定することができる。ＦＡＣＳ技術をまた使用して、ＰＢＭＣから特定の細胞タイプを富化または枯渇する（例えば、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ２０、ＣＤ５６、またはその組合せを富化または枯渇する）こともできる。
【0113】
一部の例では、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ試料から単離されるか、またはＰＢＭＣ試料は、Ｔ細胞に関して富化され、例えばＣＤ３＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞に関して単離または富化される。一部の例では、試料は、負の選択によって、例えば試料から望まない細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞以外の細胞タイプ、および／またはナイーブもしくはメモリーＴ細胞）を選択および除去することによって富化される。一部の例では、ＦＡＣＳを使用して特定のＰＢＭＣを富化する、例えばＴ細胞（例えば、ＣＤ３またはＣＤ８陽性Ｔ細胞）を富化する。ＦＡＣＳをまた使用して、疲弊Ｔ細胞、もしくは特に終末疲弊Ｔ細胞（ＰＤ－１ｈｉ、ＴＩＭ３＋）が、ＰＢＭＣ試料に存在するかどうかを評価する、またはＰＢＭＣ試料を選別して疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む）を富化する、もしくは逆に疲弊Ｔ細胞を除去することもできる。ＰＢＭＣの抗原応答性は、サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＴＮＦαの放出を測定することによって評価することができる。
【0114】
一部の例では、ＰＢＭＣは、処置される対象、例えばがんを有する対象から得られる。他の例では、ＰＢＭＣは、ドナー対象、例えばがんを有しない対象から得られる。一部の例では、疲弊Ｔ細胞は、腫瘍生検または試料（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）から得られる。
【0115】
一部の例では、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤は、ｅｘ ｖｉｖｏでＰＢＭＣに導入される。そのような例では、そのような方法は、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である改変ＰＢＭＣを選択すること（例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減されていない、ＭＣＴ１１の活性が低減されていない、または両方である細胞からそのような細胞を精製または単離すること）をさらに含み得る。そのような方法はまた、Ｔ細胞、例えばＣＤ３＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞である改変ＰＢＭＣを選択することをさらに含み得る。例示的な選択方法は、フローサイトメトリー、パニング、または磁気分離を使用することを含む。本開示の方法は、一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である選択された改変ＰＢＭＣを対象、例えばＳｌｃ１６ａ１１の発現が低減された、ＭＣＴ１１の活性が低減された、または両方である選択された改変ＰＢＭＣによって処置されるべきがんを有する対象に導入することをさらに含む。
【0116】
一部の例では、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤は、対象に投与され、および作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤は、ＰＢＭＣ（例えば、Ｔ細胞または疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む））にｉｎ ｖｉｖｏで導入される。
【0117】
一部の実施形態では、改変ＰＢＭＣを生成する方法は、阻害剤、作用剤、または天然に存在しない遺伝子改変を導入する前に、ＰＢＭＣまたは細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む））を、例えば試料（例えば、腫瘍生検、血液、Ｔ細胞集団）から選択することをさらに含む。一部の例では、選択されたＰＢＭＣは、腫瘍特異的抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、メソテリン１（ＭＳＬＮ）、またはＥＧＦＲの１つまたは複数に対して反応性である。一部の例では、選択されたＰＢＭＣはＴ細胞である。一部の例では、Ｔ細胞はＣＤ８＋またはＣＤ３＋である。一部の例では、Ｔ細胞は、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法のＴ細胞であり、例えば選択された疲弊Ｔ細胞は、腫瘍抗原に対して特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み得る。さらなる例では、選択されたＰＢＭＣは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。一部の例では、Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞、例えばプログラム細胞死１を高度に発現し（ＰＤ１ｈｉ）、Ｔ細胞免疫グロブリン－ムチンドメイン含有タンパク質３に関して陽性である（ＴＩＭ３＋）終末疲弊Ｔ細胞である。
【0118】
一部の例では、作用剤（ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡ）または阻害剤（例えば、低分子阻害剤）は、例えばＰＢＭＣを、作用剤または阻害剤と接触させることによって導入され、それによって改変ＰＢＭＣを生成する。他の例では、阻害剤または作用剤は、ＰＢＭＣに、阻害剤もしくは作用剤をコードする本開示の核酸分子、または本開示の核酸分子をコードするベクターをトランスフェクトするか、またはＰＢＭＣをそれらによって形質転換することによって導入され、それによって改変ＰＢＭＣを生成する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法は、本明細書に記載され、化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、粒子衝突）、融合（例えば、リポソーム）、ヌクレオフェクション、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ－タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド－ＤＮＡ複合体）、およびウイルス、例えば組換えウイルスによる生物学的感染を含み得る。レトロウイルスによる感染の場合、感染性のレトロウイルス粒子は、標的細胞によって吸収され、レトロウイルスＲＮＡゲノムの逆転写および得られたプロウイルスの細胞ＤＮＡへの組み込みをもたらす。一部の例では、ｇＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼまたは不活性型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１３ｄ）を含むリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を、ＰＢＭＣに直接導入する。ＲＮＰ複合体を宿主細胞に導入する方法は記載されている。例えば、ＰＢＭＣに、ＲＮＰをヌクレオフェクトすることができる。一部の例では、ＰＢＭＣに、ＲＮＰを電気穿孔によってトランスフェクトする（例えば、Seki and Rutz, (2018) J Exp Med. 215(3): 985-997を参照されたい）。一部の例では、脂質含有オリゴアミノアミド（ｌｉｐｏ－ＯＡＡ）を、ＲＮＰ複合体の細胞内送達の担体として使用する（例えば、Kuhn et al. (2020) Bioconjugate Chem. 31(3):729-742を参照されたい）。
【0119】
特定の非限定的な例では、導入される作用剤は、ｓｈＲＮＡであり、ｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡをコードするウイルスベクターによる感染を通してＰＢＭＣに導入される。ウイルスベクターによる導入は、ｓｈＲＮＡの安定な組み込みおよび標的化遺伝子の長期ノックダウンを可能にする。別の特定の非限定的な例では、導入される作用剤は、ｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡは、トランスフェクションが可能な宿主細胞の細胞質に導入される。
【0120】
一部の実施形態では、天然に存在しない遺伝子改変がＰＢＭＣに導入される。遺伝子改変は、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現の減少またはＭＣＴ１１の活性の低減をもたらす任意の天然に存在しない改変であり得る。遺伝子改変の非限定的な例としては、点変異、部分的欠失、完全な欠失、または挿入が挙げられる。一部の例では、遺伝子改変は、Ｓｌｃ１６ａ１１遺伝子の標的化ゲノム編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ改変によって誘導される。ゲノム編集方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Nemudryi et al. (2014) Acta Naturae; 6(3): 19-40において以前に記載されている。一部の例では、遺伝子改変は、Ｓｌｃ１６ａ１１発現を、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％低減させる。一部の例では、遺伝子改変は、ＭＣＴ１１活性を、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％低減させる。一部の例では、遺伝子改変は、ＭＣＴ１１の乳酸輸送活性を、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％低減させる。
【0121】
一部の実施形態では、改変ＰＢＭＣは、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、およびインターロイキン１５（ＩＬ－１５）からなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと共にインキュベートされる。
【0122】
一部の実施形態では、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤を導入することは、改変ＰＢＭＣにおけるＭＣＴ１１の活性を、好適な対照（例えば、非改変ＰＢＭＣ）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％低減させる。一部の例では、遺伝子改変は、ＭＣＴ１１の乳酸輸送活性を、好適な対照と比較して例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％低減させる。一部の例では、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤を導入することは、ＭＣＴ１１のタンパク質レベルを、好適な対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれより大きく低減させる。一部の例では、作用剤、天然に存在しない遺伝子改変、または阻害剤を導入することは、ＭＣＴ１１の活性を、好適な対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれより大きく低減させる。活性を低減させることは、例えば、モノカルボキシレート（例えば、乳酸）の改変ＰＢＭＣへの輸送を低減させることによって、ＭＣＴ１１の任意の測定可能な生物機能を低減させることを含む。
【0123】
一部の実施形態では、ＰＢＭＣにおけるＳｌｃ１６ａ１１の発現またはＭＣＴ１１の活性の減少は、エフェクター機能を増加させる、疲弊を低減させる、疲弊に対する抵抗性を増加させる、またはその組合せである。一部の例では、ＰＢＭＣはＴ細胞であり、ＰＢＭＣにおけるＳｌｃ１６ａ１１の発現またはＭＣＴ１１の活性の減少は、Ｔ細胞のエフェクター機能を増加させる、Ｔ細胞の疲弊を低減させる、または両方である。さらなる例では、ＰＢＭＣはＴ細胞であり、ＰＢＭＣにおけるＳｌｃ１６ａ１１の発現またはＭＣＴ１１の活性の減少は、Ｔ細胞疲弊に対する抵抗性を増加させる。一部の例では、本開示の改変ＰＢＭＣ、例えば改変Ｔ細胞は疲弊しない（例えば、ＰＤ１ｈｉおよびＴＩＭ３＋にはならない）。一部の例では、本開示の改変ＰＢＭＣ、例えば改変Ｔ細胞は、より遅い速度で疲弊するようになり、例えば疲弊細胞（例えば、ＰＤ１ｈｉおよびＴＩＭ３＋）へと進行する日数は、例えば、天然のＭＣＴ１１発現／活性を有するＰＢＭＣ／Ｔ細胞と比較して少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％増加する。一部の例では、本開示の改変ＰＢＭＣ、例えば、改変Ｔ細胞は、例えば、天然のＭＣＴ１１発現／活性を有するＰＢＭＣ／Ｔ細胞と比較してより少ない疲弊細胞（例えば、ＰＤ１ｈｉおよびＴＩＭ３＋）、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減された疲弊細胞を有する改変ＰＢＭＣの集団、例えば改変Ｔ細胞集団をもたらす。
【0124】
ＩＶ． 医薬組成物
本明細書において、がんを処置するため、または免疫療法に対する応答を増加させるために有用な医薬組成物も開示する。一部の例では、医薬組成物は、（１）Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な本開示のＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な１つもしくは複数のｇＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｇＲＮＡをコードする核酸もしくはベクター、阻害剤（例えば、ＭＣＴ１１阻害剤）、または改変ＰＢＭＣの１つまたは複数；および（２）薬学的に許容される担体を含む。特定の非限定的な例では、医薬組成物は、改変ＰＢＭＣおよび薬学的に許容される担体を含む。
本明細書において、がんを処置するため、または免疫療法に対する応答を増加させるために有用な医薬組成物も開示する。一部の例では、医薬組成物は、（１）Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な本開示のＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な１つもしくは複数のｇＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｇＲＮＡをコードする核酸もしくはベクター、阻害剤（例えば、ＭＣＴ１１阻害剤）、または改変ＰＢＭＣの１つまたは複数；および（２）薬学的に許容される担体を含む。特定の非限定的な例では、医薬組成物は、改変ＰＢＭＣおよび薬学的に許容される担体を含む。
【0125】
一部の例では、医薬組成物は、（１）Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｇＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｇＲＮＡをコードする核酸もしくはベクター、ＭＣＴ１１阻害剤、または改変ＰＢＭＣの１つまたは複数；（２）がん免疫療法；および（３）薬学的に許容される担体を含む。一部の例では、がん免疫療法は、ＡＣＴ療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ、ＴＩＬ）、モノクローナル抗体（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＴＬＡ４）、Ｔ細胞アゴニスト抗体、または腫瘍溶解ウイルスである。特定の非限定的な例では、医薬組成物は、改変ＰＢＭＣ、抗体がん免疫療法、および薬学的に許容される担体を含む。別の非限定的な例では、医薬組成物は、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｇＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｇＲＮＡをコードする核酸もしくはベクターの１つまたは複数；ＡＣＴ免疫療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ、ＴＩＬ）；および薬学的に許容される担体を含む。
【0126】
「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 23rd Edition, Academic Press, Elsevier, (2020)を参照されたい）。そのような担体または希釈剤の例としては、これらに限定されないが、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、平衡塩類溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび非水性媒体、例えば固定油もまた、使用してもよい。補助活性化合物もまた、組成物に組み入れることができる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 23rd Edition, Academic Press, Elsevier, (2020)に提供される方法を含む。一部の例では、医薬組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【0127】
Ｖ． がんを処置する方法
本明細書において、本開示の組成物（Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｇＲＮＡ、およびＣａｓヌクレアーゼもしくは不活性型Ｃａｓヌクレアーゼ（ＲＮＰ複合体として投与され得る）、ＲＮＡｉもしくはｇＲＮＡをコードする核酸もしくはベクター（一部の例では、ベクターはまた、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ不活性型ヌクレアーゼも発現する）、ＭＣＴ１１阻害剤、改変ＰＢＭＣ、または本明細書に開示される医薬組成物（以降、集合的に「組成物」と呼ぶ））の有効量を対象に投与することによって、がんまたは腫瘍を処置する、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法もまた開示される。特定の非限定的な例では、投与される組成物は、本明細書に開示される改変ＰＢＭＣの有効量である。一部の例では、ＰＢＭＣは、対象から採取され、本明細書に開示されるようにｅｘ ｖｉｖｏで改変された後、改変細胞を対象に導入する。一部の例では、ＰＢＭＣは、例えば本明細書に提供される治療分子（例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｇＲＮＡ）を対象に導入することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで改変される。
本明細書において、本開示の組成物（Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｇＲＮＡ、およびＣａｓヌクレアーゼもしくは不活性型Ｃａｓヌクレアーゼ（ＲＮＰ複合体として投与され得る）、ＲＮＡｉもしくはｇＲＮＡをコードする核酸もしくはベクター（一部の例では、ベクターはまた、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ不活性型ヌクレアーゼも発現する）、ＭＣＴ１１阻害剤、改変ＰＢＭＣ、または本明細書に開示される医薬組成物（以降、集合的に「組成物」と呼ぶ））の有効量を対象に投与することによって、がんまたは腫瘍を処置する、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法もまた開示される。特定の非限定的な例では、投与される組成物は、本明細書に開示される改変ＰＢＭＣの有効量である。一部の例では、ＰＢＭＣは、対象から採取され、本明細書に開示されるようにｅｘ ｖｉｖｏで改変された後、改変細胞を対象に導入する。一部の例では、ＰＢＭＣは、例えば本明細書に提供される治療分子（例えば、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｇＲＮＡ）を対象に導入することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで改変される。
【0128】
同様に本明細書において、本開示の組成物の有効量を投与し、それによって免疫療法に対する応答を増加させることによって、対象における免疫療法に対する応答を増加させる方法も開示される。特定の非限定的な例では、方法は、対象における免疫療法に対する応答を増加させる方法であり、組成物は、ＲＮＡｉもしくはｇＲＮＡをコードする本開示のベクター、またはＭＣＴ１１阻害剤である。
【0129】
一部の例では、対象は腫瘍またはがんを有する。一部の例では、対象は、固形腫瘍またはがん、例えば乳癌（例えば、小葉癌および乳管癌、例えばトリプルネガティブ乳がん）、肉腫、肺の癌（例えば、非小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌、および腺癌）、肺の中皮腫、結腸直腸腺癌、胃癌、前立腺腺癌、卵巣癌（例えば、漿液性嚢胞腺癌および粘液性嚢胞腺癌）、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌および胚細胞腫瘍、膵腺癌、胆管腺癌、肝細胞癌、膀胱癌（例として、移行上皮癌、腺癌、および扁平上皮癌を含む）、腎細胞腺癌、子宮内膜癌（例えば、腺癌およびミュラー管混合腫瘍（癌肉腫）を含む）、子宮頸内膜、子宮頸外膜、および膣の癌（例えば、それらの各々の腺癌および扁平上皮癌）、皮膚の腫瘍（例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、皮膚付属器腫瘍、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器の腫瘍ならびに様々なタイプの肉腫およびメルケル細胞癌）、食道癌、鼻咽頭および中咽頭の癌（それらの扁平上皮癌および腺癌を含む）、唾液腺癌、脳および中枢神経系の腫瘍（例えば、グリア起源、ニューロン起源、および髄膜起源の腫瘍を含む）、末梢神経の腫瘍、軟部組織肉腫ならびに骨および軟骨の肉腫、頭頸部扁平上皮癌（例えば、ＨＰＶ陽性ＨＮＳＣＣ）、ならびにリンパ腫瘍（Ｂ細胞およびＴ細胞悪性リンパ腫を含む）を有する。
【0130】
一部の例では、対象は、血液の腫瘍またはがん、例えばリンパ、白血球、または他のタイプの白血病を有する。特定の例では、処置される腫瘍は、血液の腫瘍、例えば白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、および成人Ｔ細胞白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）、または骨髄腫である。
【0131】
非限定的な例では、対象は、白血病、結腸直腸がん、子宮頸がん、肺がん、膀胱がん、頭頸部がん、膵臓がん、膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、乳がん、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌、肉腫、または副腎癌を有する。別の非限定的な例では、対象は黒色腫を有する。
【0132】
一部の実施形態では、対象は、免疫療法、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤＫ４、および／またはＣＤＫ６を標的とするチェックポイント阻害剤を受けている、受けた、または受ける予定である。例示的なチェックポイント阻害剤としては、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、およびアベマシクリブが挙げられる。一部の例では、組成物の有効量は、免疫療法（例えば、チェックポイント阻害剤またはＡＣＴ）に対する対象の応答を増加させる量、例えば免疫療法と共に投与した場合に、免疫療法（または組成物）単独の投与と比較してがんまたは腫瘍の処置においてより有効である量である。一部の例では、有効量は、免疫療法と共に投与した場合に相乗的である量、例えばがんの１つまたは複数の徴候または症状を相乗的に防止する、処置する、低減する、および／または回復させる量である。
【0133】
一部の例では、組成物の有効量は、対象におけるがんの１つまたは複数の徴候または症状を防止する、処置する、低減させる、および／または回復させるために十分な量である。例えば、同じ対象についてのベースライン測定値または好適な対照と比較して、対象における腫瘍サイズまたは腫瘍量を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低減させるために十分な量。一部の例では、有効量は、対象における転移を阻害または遅らせるのに十分な量である。例えば、同じ対象についてのベースライン測定値または好適な対照と比較して、対象における腫瘍の拡散を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％減少させることによる。一部の例では、有効量は、対象の余命を、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも４００％、またはそれより大きく増加させる量である。他の例では、有効量は、同じ対象についてのベースライン測定値または他の好適な対照と比較して、対象における腫瘍密度を、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％低減させるために十分な量である。好適な対照の非限定的な例は、無処置対象または組成物を受けていない対象（例えば、他の作用剤または代替治療を受けている対象）を含む。さらなる例では、有効量は、好適な対照と比較して、腫瘍細胞を標的として除去する、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには１００％除去するために十分な量である。
【0134】
一部の例では、方法は、対象における標的組織または細胞、例えばＰＢＭＣ、Ｔ細胞、または疲弊Ｔ細胞（終末疲弊Ｔ細胞を含む））において、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現またはＭＣＴ１１の活性を低減させる。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現またはＭＣＴ１１の活性は、好適な対照（例えば、無処置対象または処置前の同じ対象のベースライン読み取り値）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％減少する。一部の例では、方法は、ＭＣＴ１１（または機能的ＭＣＴ１１）のタンパク質レベルを、好適な対照（例えば、無処置対象または処置前の同じ対象のベースライン読み取り値）と比較して、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低減させる。一部の例では、方法は、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現またはｍＲＮＡ転写物の蓄積を、好適な対照（例えば、無処置対象または処置前の同じ対象のベースライン読み取り値）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低減させる。
【0135】
一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現またはＭＣＴ１１の活性を減少させることは、Ｔ細胞エフェクター機能を増加させるかまたはＴ細胞疲弊を減少させる。一部の例では、Ｓｌｃ１６ａ１１の発現またはＭＣＴ１１の活性を減少させることは、Ｔ細胞疲弊を低減させる（防止または阻害することを含む）またはＴ細胞疲弊に対する抵抗性を増加させる（Ｔ細胞疲弊を防止または阻害することを含む）。一部の例では、対象においてＴ細胞応答を増加させるまたはＴ細胞疲弊を低減させることは、対象における免疫療法に対する応答を増加させる。
【0136】
特定の非限定的な例では、方法は、改変ＰＢＭＣおよび薬学的に許容される担体を対象に投与することを含む。本開示のＰＢＭＣが投与される場合、組成物は、改変ＰＢＭＣ約１０４～１０１２個（例えば、細胞約１０４～１０８個、細胞約１０６～１０８個、細胞約１０６～１０１２個、細胞約１０８～１０１２個、または細胞約１０９～１０１０個）を含む。例えば、組成物は、改変ＰＢＭＣ約１０４～１０１０個（例えば、細胞約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０個／ｋｇ）が対象に投与されるように調製され得る。一部の例では、細胞約１０１０個／ｋｇが対象に投与される。特定の例では、組成物は、改変ＰＢＭＣ少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０個を含む。特定の非限定的な例では、改変ＰＢＭＣ約１０８～１０１０個が対象に投与される。適切な用量は、対象、処置されるがん、処置の履歴、腫瘍量およびタイプ、疾患の臨床ステージおよびグレード、対象の全身健康、ならびに他の要因などの要因に基づいて熟練した臨床医によって決定され得る。一部の例では、対象は、改変ＰＢＭＣの前、後、または実質的に同時にＭＣＴ（例えば、ＭＣＴ１１）の低分子阻害剤を投与される。
【0137】
一部の例では、非改変リンパ球を、本開示の組成物を投与する前に対象において枯渇させる。一部の例では、対象はまた、例えば、本開示の改変ＰＢＭＣの生存および／もしくは成長を支持するために、１つもしくは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、および／またはＩＬ－１２）、ならびに／または組み合わせて対象に投与される追加のＡＣＴ療法も投与される。特定の非限定的な例では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、およびＩＬ－１５の少なくとも１つもまた、対象に投与される。サイトカイン（複数可）は、組成物の前、後、または実質的に同時に投与される。特定の例では、少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５）は、例えば組成物と同時に投与される。一部の例では、改変ＰＢＭＣは、がんを有する対象における腫瘍特異的抗原に対して反応性である。一部の例では、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＴＲＰ－２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰＣ３、メソテリン１（ＭＳＬＮ）、またはＥＧＦＲの１つまたは複数である。
【0138】
本開示の組成物のいずれかの投与は、局所または全身であり得る。例示的な投与経路としては、これらに限定されないが、経口、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば、外用）、鼻腔内、膣、および吸入経路が挙げられる。一部の例では、作用剤は、腫瘍にもしくは腫瘍の近傍に注射もしくは注入される（局所投与）、または腹腔に投与される。適切な投与経路は、対象、処置される状態、および他の要因などの要因に基づいて熟練した臨床医によって決定され得る。
【0139】
組成物の複数用量を対象に投与することができる。例えば、組成物は、毎日、２日毎、週に２回、毎週、隔週、３週間毎、毎月、またはそれより少ない頻度で投与することができる。熟練した臨床医は、対象、処置される状態、以前の処置の履歴、および他の要因に基づいて投与スケジュールを選択することができる。
【0140】
一部の例では、対象は、組成物に加えて処置、例えば手術、放射線療法、化学療法、生物療法、免疫療法、または他の治療剤の１つまたは複数を受ける。例示的な化学療法剤としては、（これらに限定されないが）アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシル）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えばカルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジン）；代謝拮抗剤、例えば葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、５－ＦＵまたはシタラビン）、およびプリンアナログ、例えばメルカプトプリンもしくはチオグアニン；または天然物、例えばビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシン（mitocycin）Ｃ）、および酵素（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ）が挙げられる。追加の作用剤は、白金配座錯体（例えば、シス－ジアミン－ジクロロ白金ＩＩ、シスプラチンとしても公知である）、置換ウレア（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質（adrenocrotical）抑制剤（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）；ホルモンおよびアンタゴニスト、例えば、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、およびメゲストロール（magestrol）酢酸エステル）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、およびアンドロゲン（例えば、テストステロンプロピオン酸エステル（proprionate）およびフルオキシメステロン）を含む。最も一般的に使用される化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））Ａｒａ－Ｃ（シタラビン）、カルムスチン、ブスルファン、ロムスチン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ダウノルビシン、ダカルバジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル（または他のタキサン、例えばドセタキセル）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ－１６が挙げられるが、新規薬物としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））イマチニブ（ＳＴＩ－５７１）、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標））、カペシタビン、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、およびカルシトリオールが挙げられる。熟練した臨床医は、対象、処置されるがん、処置の履歴、および他の要因などの要因に応じて、対象に関して適切な追加の治療を選択することができる（本明細書に記載の治療または他の現行の治療から）。
【0141】
一部の例では、対象は、追加の治療剤、例えば、モノクローナル抗体がん免疫療法（例えば、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ１、または抗ＰＤＬ１）、Ｔ細胞アゴニスト抗体、腫瘍溶解ウイルス、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法、またはその２つもしくはそれより多くの任意の組合せを投与される。追加の治療剤の投与は、本開示の組成物の投与の前、後、または実質的に同時であり得る。一部の例では、追加の治療剤は、細胞周期阻害剤またはチェックポイント阻害剤である。一部の例では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤＫ４、および／またはＣＤＫ６を標的とする。例示的な阻害剤としては、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、およびアベマシクリブが挙げられる。
【0142】
一部の例では、対象は、ＡＣＴ療法、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞、操作されたＴＣＲ Ｔ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与される。一部の例では、対象は、組成物の有効量およびＡＣＴ療法を投与され、組成物の有効量は、ＡＣＴの有効性を増加させる（例えば、ＡＣＴ療法単独と比較してがん様細胞の除去を増加させる）量である。
【0143】
追加の治療剤は、本開示の組成物と実質的に同時に投与され得る。一部の例では、追加の治療剤は、組成物の投与の前に、例えば、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１２日、少なくとも１４日、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、またはそれよりも前に投与される。追加の治療剤の複数用量を、対象に、例えば毎日２回、毎日１回、２日毎、週に２回、毎週、隔週、３週間毎、毎月、またはそれより少ない頻度で投与してもよい。熟練した臨床医は、対象、処置される状態、以前の処置の履歴、腫瘍量およびタイプ、疾患の臨床ステージおよびグレード、ならびに対象の全身健康、ならびに他の要因に基づいて投与スケジュールを選択することができる。
【0144】
ＶＩ． キット
同様に、本開示の方法と共に使用することができる組成物およびキットも提供する。一部の例では、組成物またはキットは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｇＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡをコードする核酸またはベクター、ＭＣＴ１１阻害剤、および改変ＰＢＭＣの１つまたは複数を、例えば薬学的に許容される担体と共に含む。一部の例では、キットは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ不活性型ヌクレアーゼ（ＲＮＰ複合体であり得る）を含む。特定の非限定的な例では、キットは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡをコードするベクターを含み、ベクターは、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ不活性型ヌクレアーゼをさらにコードし得る。一部の例では、キットは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な本開示のＲＮＡｉの１つまたは複数を含む。さらなる例では、キットは、本開示の改変ＰＢＭＣを含む。
同様に、本開示の方法と共に使用することができる組成物およびキットも提供する。一部の例では、組成物またはキットは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なＲＮＡｉ、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的なｇＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｇＲＮＡをコードする核酸またはベクター、ＭＣＴ１１阻害剤、および改変ＰＢＭＣの１つまたは複数を、例えば薬学的に許容される担体と共に含む。一部の例では、キットは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡおよびＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ不活性型ヌクレアーゼ（ＲＮＰ複合体であり得る）を含む。特定の非限定的な例では、キットは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な１つまたは複数のｇＲＮＡをコードするベクターを含み、ベクターは、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ不活性型ヌクレアーゼをさらにコードし得る。一部の例では、キットは、Ｓｌｃ１６ａ１１に対して特異的な本開示のＲＮＡｉの１つまたは複数を含む。さらなる例では、キットは、本開示の改変ＰＢＭＣを含む。
【0145】
キットは、追加の試薬、例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＩＬ－２、およびＩＬ－１５の１つまたは複数を含み得る。一部の例では、試薬は、個別の容器に存在する。一例では、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８は、同じ容器に存在し、例えばビーズ上に存在してもよい。一部の例では、キットは、トランスフェクション試薬、培養培地、抗生物質、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－７）の１つまたは複数をさらに含み、必要に応じてそのような試薬は、個別の容器に存在する。一部の例では、キットまたは組成物は、ＰＢＭＣをｅｘ ｖｉｖｏで培養または増大させることができる培地、例えばＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地を含む。
【実施例】
【0146】
（実施例１）
材料および方法
本実施例は、以下の実施例において考察されるデータを生成するために使用した材料および方法を提供する。
材料および方法
本実施例は、以下の実施例において考察されるデータを生成するために使用した材料および方法を提供する。
【0147】
ＲＮＡ－ｓｅｑ
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、Ｂ１６黒色腫を移植した。腫瘍がいずれかの方向に７ｍｍに達すると、リンパ節および腫瘍を採取して処理し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、リンパ節（ＬＮ）および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からのＣＤ４４、ＰＤ－１、およびＴｉｍ－３発現に基づいて選別した。ＲＮＡ－ｓｅｑを、以下の区画から単離した細胞１，０００個について実施した：ＬＮ ＣＤ４４ｈｉ、ＴＩＬ ＰＤ－１ｌｏ、ＴＩＬ ＰＤ－１ｍｉｄ、ＴＩＬ ＰＤ－１ｈｉ、およびＴＩＬ ＰＤ－１ｈｉＴｉｍ３＋。ＬＮおよびＴＩＬからのＣＤ４＋ Ｔ細胞を、個別の実験から配列決定した。ＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）キットを使用して細胞１０００個の細胞溶解物から調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳＥＱ（登録商標）において配列決定した。マウスゲノム（ｍｍ９アセンブリ）と整列させた後、ＴＰＭを計算した。Ｓｌｃ１６ａ１１（ＭＣＴ１１をコードする）のプロット１００万個あたりの転写物（ＴＰＭ）を示す（図３Ａ）。
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、Ｂ１６黒色腫を移植した。腫瘍がいずれかの方向に７ｍｍに達すると、リンパ節および腫瘍を採取して処理し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、リンパ節（ＬＮ）および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からのＣＤ４４、ＰＤ－１、およびＴｉｍ－３発現に基づいて選別した。ＲＮＡ－ｓｅｑを、以下の区画から単離した細胞１，０００個について実施した：ＬＮ ＣＤ４４ｈｉ、ＴＩＬ ＰＤ－１ｌｏ、ＴＩＬ ＰＤ－１ｍｉｄ、ＴＩＬ ＰＤ－１ｈｉ、およびＴＩＬ ＰＤ－１ｈｉＴｉｍ３＋。ＬＮおよびＴＩＬからのＣＤ４＋ Ｔ細胞を、個別の実験から配列決定した。ＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）キットを使用して細胞１０００個の細胞溶解物から調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳＥＱ（登録商標）において配列決定した。マウスゲノム（ｍｍ９アセンブリ）と整列させた後、ＴＰＭを計算した。Ｓｌｃ１６ａ１１（ＭＣＴ１１をコードする）のプロット１００万個あたりの転写物（ＴＰＭ）を示す（図３Ａ）。
【0148】
乳酸の取り込み
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、上記のようにＢ１６黒色腫を移植し、ＴＩＬ調製物を作製した。ＴＩＬに、ｐＨ感受性色素であるｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄをロードし、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中でインキュベートした。乳酸を３０分間パルスし、ｐＨの変化を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Watson et al. (2021) Nature, 591: 645-651に記載されるように、フローサイトメトリーによって測定した。
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、上記のようにＢ１６黒色腫を移植し、ＴＩＬ調製物を作製した。ＴＩＬに、ｐＨ感受性色素であるｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄをロードし、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中でインキュベートした。乳酸を３０分間パルスし、ｐＨの変化を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Watson et al. (2021) Nature, 591: 645-651に記載されるように、フローサイトメトリーによって測定した。
【0149】
機能獲得および機能喪失変異体
ＯＴ－Ｉ（ＯＶＡ特異的）Ｔｈｙ１．１＋コンジェニックＴ細胞を、同起源のペプチドおよび脾細胞によって一晩活性化した後、Ｔ細胞に、Ｓｌｃ１６ａ１１を標的とするｓｈＲＮＡ構築物をレトロウイルスによって形質導入し、次に、これをＢ１６－ＯＶＡ腫瘍を有するコンジェニックに不一致の（Ｔｈｙ１．２＋）宿主に移入した。８日後、ＴＩＬを採取して、最終分化の読み取りとしてＰＤ－１およびＴｉｍ－３に関して染色した。個別のＴＩＬ調製物はまた、ブレフェルディンＡの存在下、ＯＶＡペプチドによって一晩再刺激した後、サイトカイン産生を測定するためにＩＦＮ－γおよびＴＮＦαに関して細胞内染色した。
ＯＴ－Ｉ（ＯＶＡ特異的）Ｔｈｙ１．１＋コンジェニックＴ細胞を、同起源のペプチドおよび脾細胞によって一晩活性化した後、Ｔ細胞に、Ｓｌｃ１６ａ１１を標的とするｓｈＲＮＡ構築物をレトロウイルスによって形質導入し、次に、これをＢ１６－ＯＶＡ腫瘍を有するコンジェニックに不一致の（Ｔｈｙ１．２＋）宿主に移入した。８日後、ＴＩＬを採取して、最終分化の読み取りとしてＰＤ－１およびＴｉｍ－３に関して染色した。個別のＴＩＬ調製物はまた、ブレフェルディンＡの存在下、ＯＶＡペプチドによって一晩再刺激した後、サイトカイン産生を測定するためにＩＦＮ－γおよびＴＮＦαに関して細胞内染色した。
【0150】
ＭＣＴ１１（Ｓｌｃ１６ａ１１）の条件的ノックアウト
Ｓｌｃ１６ａ１１（ＭＣＴ１１）の条件的ノックアウトマウスを生成した（ＭＣＴ１１ＣＯＩＮ×ＣＤ４ｃｒｅ）。野生型マウスまたはＭＣＴ１１条件的ノックアウト（ＭＣＴ１１ＣＯＩＮ×ＣＤ４ｃｒｅ）マウスにＢ１６腫瘍細胞を接種した。腫瘍の成長を追跡した。Ｔ細胞浸潤（腫瘍面積あたりのパーセント生存ＣＤ８＋細胞）および再刺激後のサイトカイン産生もまた、記録した。
Ｓｌｃ１６ａ１１（ＭＣＴ１１）の条件的ノックアウトマウスを生成した（ＭＣＴ１１ＣＯＩＮ×ＣＤ４ｃｒｅ）。野生型マウスまたはＭＣＴ１１条件的ノックアウト（ＭＣＴ１１ＣＯＩＮ×ＣＤ４ｃｒｅ）マウスにＢ１６腫瘍細胞を接種した。腫瘍の成長を追跡した。Ｔ細胞浸潤（腫瘍面積あたりのパーセント生存ＣＤ８＋細胞）および再刺激後のサイトカイン産生もまた、記録した。
【0151】
Ｃａｓ９－ｇＲＮＡヌクレオフェクション
ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を、ＴＣＲ－Ｔｇマウスから単離し、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を使用して、Ｓｌｃ１６ａ１１を標的とするＣａｓ９：ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体（配列番号７のｇＲＮＡ）をヌクレオフェクトした。次に、細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化し、組換えＩＬ－２を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで治療量まで増大させた。これと並行して、宿主マウスにＢ１６－ＯＶＡ細胞を接種した。腫瘍が直径３ｍｍに達すると、それらを増大させたＴ細胞（細胞１０７個／マウス）によって処置した。腫瘍サイズを、腫瘍がいずれかの方向に１５ｍｍに達するまで、または実験３０日後まで毎週３回測定した。
ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を、ＴＣＲ－Ｔｇマウスから単離し、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を使用して、Ｓｌｃ１６ａ１１を標的とするＣａｓ９：ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体（配列番号７のｇＲＮＡ）をヌクレオフェクトした。次に、細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化し、組換えＩＬ－２を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで治療量まで増大させた。これと並行して、宿主マウスにＢ１６－ＯＶＡ細胞を接種した。腫瘍が直径３ｍｍに達すると、それらを増大させたＴ細胞（細胞１０７個／マウス）によって処置した。腫瘍サイズを、腫瘍がいずれかの方向に１５ｍｍに達するまで、または実験３０日後まで毎週３回測定した。
【0152】
（実施例２）
疲弊Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の発見
ＲＮＡ－ｓｅｑおよび代謝プロファイリングを使用して、終末疲弊Ｔ細胞（がんの環境で一般的な機能障害Ｔ細胞）が、ＭＣＴ１１（Ｓｌｃ１６ａ１１によってコードされる）と呼ばれる新規栄養トランスポーターを高度に発現することが見出された（図３Ａおよび３Ｂ）。ＭＣＴ１１は、おそらくモノカルボキシレート、短鎖炭素源、例えば、乳酸、ピルベートおよび短鎖脂肪酸を輸送する。ヒトおよびマウスの疲弊Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の上方調節を、フローサイトメトリーおよびＲＮＡ－Ｓｅｑによって確認した（図２Ａ～２Ｃおよび図３Ａ～３Ｂを参照されたい）。さらに、終末疲弊Ｔ細胞は、モノカルボキシレート、例えば乳酸を特異的に取り込むことが確認された（図４）。しかし、ＭＣＴ１１は、慢性ウイルス感染によって誘導された疲弊Ｔ細胞の表面には発現されない。これらの知見は、ＭＣＴ１１が、終末疲弊Ｔ細胞に栄養の流入を提供するうえで重要であり得ることを示唆している。
疲弊Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の発見
ＲＮＡ－ｓｅｑおよび代謝プロファイリングを使用して、終末疲弊Ｔ細胞（がんの環境で一般的な機能障害Ｔ細胞）が、ＭＣＴ１１（Ｓｌｃ１６ａ１１によってコードされる）と呼ばれる新規栄養トランスポーターを高度に発現することが見出された（図３Ａおよび３Ｂ）。ＭＣＴ１１は、おそらくモノカルボキシレート、短鎖炭素源、例えば、乳酸、ピルベートおよび短鎖脂肪酸を輸送する。ヒトおよびマウスの疲弊Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の上方調節を、フローサイトメトリーおよびＲＮＡ－Ｓｅｑによって確認した（図２Ａ～２Ｃおよび図３Ａ～３Ｂを参照されたい）。さらに、終末疲弊Ｔ細胞は、モノカルボキシレート、例えば乳酸を特異的に取り込むことが確認された（図４）。しかし、ＭＣＴ１１は、慢性ウイルス感染によって誘導された疲弊Ｔ細胞の表面には発現されない。これらの知見は、ＭＣＴ１１が、終末疲弊Ｔ細胞に栄養の流入を提供するうえで重要であり得ることを示唆している。
【0153】
（実施例３）
ＭＣＴ１１機能獲得および機能喪失
ＭＣＴ１１がノックダウンされているＴ細胞は、完全に疲弊へと進行せず（ＰＤ１ｈｉであるが、Ｔｉｍ－３＋ではない）、ペプチド刺激に応答してより多くのＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生した（図５）。コンパニオン実験において、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞に、Ｓｌｃ１６ａ１１をコードするレトロウイルス過剰発現ベクターを形質導入した。それらのＴ細胞は、疲弊（ＰＤ１ｈｉＴｉｍ３＋）へと急速に進行し、不良なサイトカイン産生を実証した（図５）。このように、腫瘍を有するマウスに移入した腫瘍特異的Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の欠失は、Ｔ細胞機能の増加および疲弊の減少をもたらしたのに対し、腫瘍特異的Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の過剰発現は、疲弊した機能障害表現型の発生を加速させた。
ＭＣＴ１１機能獲得および機能喪失
ＭＣＴ１１がノックダウンされているＴ細胞は、完全に疲弊へと進行せず（ＰＤ１ｈｉであるが、Ｔｉｍ－３＋ではない）、ペプチド刺激に応答してより多くのＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生した（図５）。コンパニオン実験において、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞に、Ｓｌｃ１６ａ１１をコードするレトロウイルス過剰発現ベクターを形質導入した。それらのＴ細胞は、疲弊（ＰＤ１ｈｉＴｉｍ３＋）へと急速に進行し、不良なサイトカイン産生を実証した（図５）。このように、腫瘍を有するマウスに移入した腫瘍特異的Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の欠失は、Ｔ細胞機能の増加および疲弊の減少をもたらしたのに対し、腫瘍特異的Ｔ細胞におけるＭＣＴ１１の過剰発現は、疲弊した機能障害表現型の発生を加速させた。
【0154】
腫瘍の成長およびＴ細胞機能を、Ｔ細胞（ＭＣＴ１１ＣＯＩＮ×ＣＤ４ｃｒｅ）にＭＣＴ１１（Ｓｌｃ１６ａ１１）の条件的欠失を有するマウスにおいて調べた。野生型（ＷＴ）マウスおよびＭＣＴ１１ＣＯＩＮ×ＣＤ４ｃｒｅマウスに、Ｂ１６黒色腫を接種した（図６Ａ）。ＭＣＴ１１ＣＯＩＮ×ＣＤ４ｃｒｅマウスは、ＷＴと比較してより小さい腫瘍体積（図６Ｂ）、Ｔ細胞浸潤の増加、およびＴ細胞機能の増加（再刺激後のサイトカイン産生によって測定したときに）（図６Ｃ）を有した。ＭＣＴ１１ノックアウトを、抗体染色によって確認した；ＭＣＴ１１ ｍＡｂは、ＭＣＴ１１の条件的欠失を有するマウスにおいて疲弊Ｔ細胞を染色しなかった（図６Ｄ）。
【0155】
（実施例４）
Ｓｌｃ１６ａ１１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介欠失
ＯＴ－Ｉ ＯＶＡ特異的Ｔ細胞に、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体をヌクレオフェクトして、Ｓｌｃ１６ａ１１を欠失させた。ＭＣＴ１１ノックアウトＴ細胞（ＭＣＴ１１ ＫＯ ＯＴ－Ｉ）を移入したマウスは、いずれかの対照（Ｔ細胞なしの対照、または対照ＯＴ－Ｉ細胞によって処置した）より小さい腫瘍面積を有した（図７）。このように、ＭＣＴ１１ ＫＯ Ｔ細胞は、わずか１回の投与後で優れた治療的細胞であり、リンパ枯渇または補助的ＩＬ－２を示した。
Ｓｌｃ１６ａ１１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介欠失
ＯＴ－Ｉ ＯＶＡ特異的Ｔ細胞に、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体をヌクレオフェクトして、Ｓｌｃ１６ａ１１を欠失させた。ＭＣＴ１１ノックアウトＴ細胞（ＭＣＴ１１ ＫＯ ＯＴ－Ｉ）を移入したマウスは、いずれかの対照（Ｔ細胞なしの対照、または対照ＯＴ－Ｉ細胞によって処置した）より小さい腫瘍面積を有した（図７）。このように、ＭＣＴ１１ ＫＯ Ｔ細胞は、わずか１回の投与後で優れた治療的細胞であり、リンパ枯渇または補助的ＩＬ－２を示した。
【0156】
（実施例５）
細胞治療の改善
本実施例では、Ｓｌｃ１６ａ１１を、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法で使用されるＴ細胞から機能的に欠失させる。機能的欠失は、例えばＴ細胞におけるＳｌｃ１６ａ１１発現を低減させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｓｈＲＮＡベクター）を使用することによって達成することができる。一例では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９を使用して、Ｔ細胞におけるＳｌｃ１６ａ１１遺伝子を標的とする／編集する。別の例では、Ｃａｓ１３ｄ、ｄＣａｓ１３ｄ、またはＲＮＡｉを使用して、Ｔ細胞におけるＳｌｃ１６ａ１１ ＲＮＡを標的とする／低減する。
細胞治療の改善
本実施例では、Ｓｌｃ１６ａ１１を、養子細胞移入（ＡＣＴ）療法で使用されるＴ細胞から機能的に欠失させる。機能的欠失は、例えばＴ細胞におけるＳｌｃ１６ａ１１発現を低減させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｓｈＲＮＡベクター）を使用することによって達成することができる。一例では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９を使用して、Ｔ細胞におけるＳｌｃ１６ａ１１遺伝子を標的とする／編集する。別の例では、Ｃａｓ１３ｄ、ｄＣａｓ１３ｄ、またはＲＮＡｉを使用して、Ｔ細胞におけるＳｌｃ１６ａ１１ ＲＮＡを標的とする／低減する。
【0157】
一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ１３ｄ、またはＣａｓ１３）またはＲＮＡｉを使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来Ｔ細胞においてＳｌｃ１６ａ１１を機能的に欠失させる（例えば、遺伝子を標的化／編集する、またはｍＲＮＡを標的化／低減する）。得られたＳｌｃ１６ａ１１ ＫＯ Ｔ細胞を活性化し、腫瘍関連抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターを形質導入する。例示的な腫瘍標的としては、これらに限定されないが、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、メソテリン、およびＭＵＣ１が挙げられる。腫瘍関連抗原を発現する腫瘍を有する対象に、がんまたは腫瘍を処置するためにＳｌｃ１６ａ１１ ＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療有効量を投与する。
【0158】
別の例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはＲＮＡｉを使用して、がんを有する患者から単離されている、例えば患者の腫瘍生検から単離されている腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）Ｔ細胞においてＳｌｃ１６ａ１１を機能的に欠失させる。Ｓｌｃ１６ａ１１ ＫＯ ＴＩＬ Ｔ細胞を、ＩＬ－２によって増大させた後、がんまたは腫瘍を処置するために治療有効量を患者に投与する。なお別の例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはＲＮＡｉを使用してＴ細胞受容体（ＴＣＲ）操作Ｔ細胞（例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１）においてＳｌｃ１６ａ１１を機能的に欠失させる。Ｓｌｃ１６ａ１１ ＫＯ ＴＣＲ Ｔ細胞の治療有効量を、がんまたは腫瘍の処置を必要とする患者に投与する。
【0159】
本開示の原理が適用され得る多くの起こり得る実施形態を考慮して、例証される実施形態は、本開示の単なる例に過ぎず、本発明の範囲を制限すると解釈してはならないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神内に入る全てを本発明者らの発明として特許請求する。
【図1】
【図2A-B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A-B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】