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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】ゲル組成物、システム、及び方法
(51)【国際特許分類】
A61L 31/06 20060101AFI20240711BHJP
A61L 31/14 20060101ALI20240711BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
A61L31/06
A61L31/14 300
A61P1/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503421
(86)(22)【出願日】2022-07-19
(85)【翻訳文提出日】2024-03-11
(86)【国際出願番号】 US2022073894
(87)【国際公開番号】W WO2023004318
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】63/223,808
(32)【優先日】2021-07-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/260,113
(32)【優先日】2021-08-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506192652
【氏名又は名称】ボストン サイエンティフィック サイムド，インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＳＴＯＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＳＣＩＭＥＤ，ＩＮＣ．
(71)【出願人】
【識別番号】301069856
【氏名又は名称】トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(72)【発明者】
【氏名】ライデッカー、ローレン エス．
(72)【発明者】
【氏名】フレドリクソン、ジェラルド
(72)【発明者】
【氏名】ベリー、サマンサ
(72)【発明者】
【氏名】クック、キャサリン エイ．
(72)【発明者】
【氏名】グリンスタッフ、マーク
【テーマコード（参考）】
4C081
【Ｆターム（参考）】
4C081AC16
4C081BA12
4C081BB04
4C081CA151
4C081CA181
4C081CA20
4C081CE11
4C081CF21
4C081DA12
4C081EA13
(57)【要約】
ゲルを形成する方法、及びそのようなゲルで対象を処置する関連する方法が記載される。本方法は、第１のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマー、ポリ（エチレンイミン）系ポリマー、又はポリ（１，２－グリセロール）カルボナート系ポリマーを含むマクロマーであって、少なくとも１つの第１の官能部分を含むマクロマーと、少なくとも１つの第２の官能部分を含む第２のＰＥＧ系ポリマーを含む架橋剤と、光開始剤とを組み合わせることによって組成物を調製すること、及び光源を介して光開始剤を活性化することでゲルを形成することを含み得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲルを形成する方法であって、前記方法は、第１のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマー、ポリ（エチレンイミン）系ポリマー、又はポリ（１，２－グリセロール）カルボナート系ポリマーを含むマクロマーであって、少なくとも１つの第１の官能部分を含む前記マクロマー、
少なくとも１つの第２の官能部分を含む第２のＰＥＧ系ポリマーを含む架橋剤、及び
光開始剤
を組み合わせることによって組成物を調製すること、及び
光源を介して前記光開始剤を活性化することで、生体適合性のゲルを形成すること
を含む方法。
【請求項2】
前記少なくとも１つの第１の官能部分は、チオール基、ビニル基、アリル基、アクリラート基、又はノルボルネン基を含み、前記少なくとも１つの第２の官能部分は、チオール基、ビニル基、アリル基、アクリラート基、又はノルボルネン基を含み、前記少なくとも１つの第１の官能部分は前記少なくとも１つの第２の官能部分とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも１つの第１の官能部分又は前記少なくとも１つの第２の官能部分の一方は、ビニル基、アリル基、アクリラート基、又はノルボルネン基を含み、前記少なくとも１つの第１の官能部分又は前記少なくとも１つの第２の官能部分の他方は、チオール基を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記マクロマー、前記架橋剤、及び前記光開始剤は、前記組成物の総重量に対して、合計で前記組成物の約１０～２５重量％を占める、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つの第１の官能部分と前記少なくとも１つの第２の官能部分とのモル比は、１：１～２：１の範囲である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記マクロマーは、前記組成物の総重量に対して、合計で前記組成物の約５～１５重量％を占め、かつ／又は、前記架橋剤は、前記組成物の総重量に対して、合計で前記組成物の５～１０重量％を占める、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記架橋剤はＮ－ヒドロキシスクシンイミド基及び／又はマレイミド基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記組成物中の前記光開始剤の濃度は、約０．１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記組成物は生理学的緩衝液をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記光源はＵＶ光又は可視光を発する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ＵＶ光で照らされると、前記ゲルは５秒以内に形成され、又は、前記光開始剤が可視光で活性化されると、前記ゲルは１０秒以内に形成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記マクロマーは超分岐ポリマーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記組成物は、前記組成物のゲル化時間を促進するために、チロシン誘導体を含む添加剤をさらに含み、任意選択で、前記チロシン誘導体は、チロシンメチルエステル又はチロシンエチルエステルを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記組成物は、１０ｍＭまで、例えば約０．１ｍＭ～約５ｍＭの前記添加剤を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ヒトの胃腸管の組織を処置するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法に従って形成されたゲルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、主に、内視鏡手術を含む医療処置に有用な治療用ゲルに関する。例えば、本開示は、ゲル、ならびにゲルを形成するように配合された組成物及びシステム（例えば、胃腸管などの身体組織への適用のための）を含む。
【背景技術】
【0002】
内視鏡手術、例えば、内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ）、及び吻合、ならびに、意図的な又は疾患に起因する瘻孔の形成、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及びＩＢＤに付随する疾患などの健康状態は、胃腸（ＧＩ）管の組織への損傷をもたらし得、及び／又はそれに寄与し得る。結腸直腸がんは、先進国におけるがんによる死亡の主な原因の一つである。５０歳以上の患者のための標準的な予防的ケアは、結腸直腸がんを評価するための結腸内視鏡検査によるポリープの生検（ポリペクトミーとして知られている）を含む。実際には、医師は、麻酔下で患者の結腸に内視鏡を挿入し、結腸を検査した後、ポリープを除去する。除去後、創傷は結腸内部環境に対して開いたままにするか、電気凝固を使用して熱的に閉じられる。ＧＩ管におけるポペクトミー後又は他の内視鏡手術後の傷口は、出血及び敗血症をもたらし得る。電気凝固は、灌流又はポリープ切除後凝固症候群などの他の合併症をもたらし得る。
【0003】
これらの種類の医療処置及び健康状態により、ＧＩ管壁の比較的薄い組織層が残ることがある。現在、医師は、ＧＩ管壁の治癒を可能にするために、クリッピング又は内視鏡的縫合を含む時間又は外科的処置に頼ることが多い。しかしながら、これらの実践は、大きな欠損及び／又は脆弱なもしくは線維性の組織などの特定の場合には不適切であり得る。生じ得る合併症としては、穿孔、感染、及び敗血症が挙げられる。
【発明の概要】
【0004】
医療処置において有用なゲルを形成する方法が開示される。本開示は、例えば、ゲルを形成する方法であって、第１のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマー、ポリ（エチレンイミン）系ポリマー、又はポリ（１，２－グリセロール）カルボナート系ポリマーを含むマクロマーであって、少なくとも１つの第１の官能部分を含むマクロマーと、少なくとも１つの第２の官能部分を含む第２のＰＥＧ系ポリマーを含む架橋剤と、光開始剤とを組み合わせることによって組成物を調製すること、及び光源を介して光開始剤を活性化することでゲルを形成することを含む方法を含む。ゲルは、生体適合性及び／又は生分解性であり得る。前記少なくとも１つの第１の官能部分は、例えば、チオール基、ビニル基、アリル基、アクリラート基、又はノルボルネン基を含み得、かつ／又は前記少なくとも１つの第２の官能部分は、チオール基、ビニル基、アリル基、アクリラート基、又はノルボルネン基を含み得、前記少なくとも１つの第１の官能部分は前記少なくとも１つの第２の官能部分とは異なる。少なくとも１つの例では、前記少なくとも１つの第１の官能部分又は前記少なくとも１つの第２の官能部分は、ビニル基、アリル基、アクリラート基、又はノルボルネン基を含み得、前記少なくとも１つの第１の官能部分又は前記少なくとも１つの第２の官能部分の他方はチオール基を含み得る。本明細書のいくつかの例によれば、マクロマー、架橋剤、及び光開始剤は、組成物の総重量に対して、合計で組成物の１０～２５重量％を占め得る。任意選択で、前記少なくとも１つの第１の官能部分と前記少なくとも１つの第２の官能部分とのモル比は、１：１～２：１の範囲であり得る。これに加えて又はこれに代えて、マクロマーは、組成物の総重量に対して、合計で組成物の５～１５重量％を占め得る。架橋剤は、組成物の総重量に対して、合計で組成物の５～１０重量％を占め得る。組成物中の光開始剤の濃度は、約０．１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲であり得る。いくつかの例では、架橋剤はＮ－ヒドロキシスクシンイミド基及び／又はマレイミド基を含む。これに加えて又はこれに代えて、マクロマーは超分岐ポリマーを含み得る。
【0005】
本明細書のいくつかの態様によれば、組成物はさらに生理学的緩衝液を含み得る。光源は、ＵＶ光又は可視光を発し得る。例えば、ＵＶ光で照らされると、ゲルは５秒以内に形成され得る。いくつかの例では、光開始剤が可視光で活性化されると、ゲルは１０秒以内に形成され得る。任意選択で、組成物は、組成物のゲル化時間を促進するために、チロシン誘導体を含む添加剤をさらに含み得る。いくつかの態様では、組成物は最大１０ｍＭの添加剤を含み得る。チロシン誘導体は、例えば、チロシンメチルエステル又はチロシンエチルエステルを含み得る。
【0006】
上記及び本明細書の他の場所に記載されたゲルは、対象、例えばヒト対象の組織を治療するために使用され得る。例えば、ゲルは、対象の胃腸管の組織を治療するために使用され得る。
【0007】
本開示はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマー、ポリ（エチレンイミン）系ポリマー、又はポリ（１，２－グリセロール）カルボナート系ポリマーを含むマクロマーであって、少なくとも１つの第１の官能基を含むマクロマーと、第１の緩衝液とを組み合わせることによって第１の溶液を調製すること；複数の第２の官能基を含む第２の（ＰＥＧ）系ポリマーを含む架橋剤と、第１の緩衝液よりも低いｐＨを有する第２の緩衝液とを組み合わせることによって第２の溶液を調製すること；及び第１の溶液と第２の溶液を混合することでゲルを形成することを含む、ゲルを形成する方法を含む。ゲルは、生体適合性及び／又は生分解性であり得る。前記少なくとも１つの第１の官能基は、例えばチオール基又はアミン基を含み得、かつ／又は複数の第２の官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基又はマレイミド基を含み得る。いくつかの例では、マクロマーの分子量は約２，０００Ｄａであり得る。これに加えて又はこれに代えて、架橋剤の分子量は約３，４００Ｄａであり得る。いくつかの例では、架橋剤対マクロマーのモル比は、３：２から７：３の範囲であり得る。
【0008】
上述のように、本明細書に開示されるゲルは、対象の組織を治療するために使用され得る。例えば、ゲルを形成する方法は、対象の胃腸管の組織上にゲルを形成することによって対象を治療することを含み得る。少なくとも１つの例では、方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマー、ポリ（エチレンイミン）系ポリマー、又はポリ（１，２－グリセロール）カルボナート系ポリマーを含むマクロマーであって、少なくとも１つの第１の官能基を含むマクロマーと第１の緩衝液とを含む第１の溶液を組織に適用すること；及び複数の第２の官能基を含む第２の（ＰＥＧ）系ポリマーを含む架橋剤と、第１の緩衝液よりも低いｐＨを有する第２の緩衝液とを含む第２の溶液を組織に適用することを含み、第１の溶液が第２の溶液と接触することで組織上にゲルを形成する。第１の溶液は、第２の溶液の前に、後に、又は第２の溶液と同時に組織に適用され得る。
【0009】
本開示はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマー、ポリ（エチレンイミン）系ポリマー、又はポリ（１，２－グリセロール）カルボナート系ポリマーを含むマクロマーを含む組成物を含み、マクロマーは、少なくとも１つのチオール基又はアミン基を含み；架橋剤は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド官能基、マレイミド官能基、又はその両方を含むＰＥＧ系ポリマーを含み、組成物はヒドロゲルとして製剤化される。ヒドロゲルは、体管腔に接着した場合、少なくとも２，０００Ｐａのゲル強度及び／又は０．０３～０．９０Ｎ／ｃｍ２のせん断力を有し得る。これに加えて又はこれに代えて、ヒドロゲルが結腸組織に接着されて約１ｍｍ×約５ｍｍの組織の開口を満たすとき、ヒドロゲルは約１５，０００Ｐａ（約１５０ｍｂａｒ）までの破裂圧力に耐えるように製剤化され得る。
【図面の簡単な説明】
【0010】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、様々な例示的な実施形態を示し、明細書とともに、開示された実施形態の原理を説明する役割を果たす。
【図1B】同上。
【図2B】同上。
【図2C】同上。
【図2D】同上。
【図2E】同上。
【図2F】同上。
【図2G】同上。
【図3B】同上。
【図4B】同上。
【図4C】同上。
【図4D】同上。
【図5】本開示のいくつかの態様によるゲルの形成の概略図である。
【図6】本開示のいくつかの態様によるゲルの溶解の概略図である。
【図7】システインの存在下でのゲルの溶解メカニズムを示す。
【図8】水の存在下でのゲルの溶解メカニズムを示す。
【図9】本開示のいくつかの態様による、例示的な架橋剤との可能な反応を示す。
【図10】実施例１で述べるゲル強度のチャートである。
【図11B】同上。
【図12B】同上。
【図12C】同上。
【図12D】同上。
【図12E】同上。
【図13】実施例４で述べる例示的な架橋剤の合成を示す。
【図14】実施例６で述べるゲルの形成に使用される架橋剤及びマクロマーを示す。
【図15】実施例６で述べるゲル化測定結果を示す。
【図17】同上。
【図18】実施例６で述べるＮＨＳエステル及び内部エステル結合におけるアミド化反応速度を報告する。
【図19】実施例６で述べる加水分解をモニタリングするための１Ｈ ＮＭＲデータを示す。
【図20】実施例６で述べる異なる温度におけるヒドロゲルの貯蔵弾性率データを示す。
【図21】実施例６で述べるヒドロゲルの膨潤を報告する。
【図22】実施例６で述べるヒドロゲルの接着測定結果を示す。
【図23】実施例６で述べるヒドロゲルの細胞毒性の結果を報告する。
【図25】同上。
【図26】実施例６で述べるヒドロゲルのＳＥＭ画像である。
【図28】同上。
【図29】実施例７で述べるいくつかの例示的な架橋剤の合成を示す。
【図30】実施例８で述べる様々なヒドロゲルについて測定された特性を示す。
【図31】実施例８で述べる様々なヒドロゲルのＳＥＭ画像を示す。
【図32】実施例８で述べるマクロマーとの反応前後の架橋剤の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図33】実施例８で述べる架橋剤のＮＨＳ加水分解を調査する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図34】実施例８で述べる様々なヒドロゲルの動態研究を報告する。
【図35】実施例８で述べるヒドロゲルのひずみスイープ及び周波数スイープを報告する。
【図37】同上。
【図38】実施例８で述べるヒドロゲルの膨潤を報告する。
【図39】実施例８で述べるヒドロゲルの溶解を報告する。
【図41】同上。
【図42】実施例８で述べるヒドロゲルの溶解結果を報告する。
【図43】実施例８で述べるヒドロゲルの細胞生存率を報告する。
【図44-2】同上。
【図46】同上。
【図47】同上。
【図48】同上。
【図49】同上。
【図50】実施例８で述べる創傷被覆材として使用されるヒドロゲルの溶解の概略図である。
【図51】実施例９で述べるいくつかの例示的な架橋剤の合成を示す。
【図52】実施例１０で述べる例示的なマクロマーの合成を示す。
【図53】実施例１０で述べるＰＥＩ及びＰＥＩ－ＳＨ分子の第一級アミンを検出するＴＮＢＳアッセイの結果を示す。
【図54】実施例１１で述べるヒドロゲルのレオロジー測定結果を示す。
【図55】実施例１１で述べる架橋剤の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図56】実施例１１で述べる破裂圧力を測定するために使用されるシステムを示す。
【図57】実施例１１で述べるヒドロゲルの破裂圧力データを報告する。
【発明を実施するための形態】
【0011】
詳細な説明
前述の全般的な説明及び以下の詳細な説明は両方とも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲に記載されている特徴を限定するものではない。本明細書で使用される場合、「含む」、「有する」、「包含する」という用語又はそれらの他の変形は、要素のリストを含むプロセス、方法、物品、又は装置がそれらの要素のみを含むのではなく、明示的に列挙されていない、又はそのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の要素を含み得るように、非排他的な包含をカバーすることを意図している。本開示では、例えば「約」、「実質的に」、「概して」、及び「およそ」などの相対的な用語は、記載された値又は特性における±１０％の変動の可能性を示すために使用される。全ての範囲は上限・下限を含むものと理解され、例えば、５重量％～１０重量％のマクロマー含量には、５重量％、１０重量％、及びそれらの間にあるすべての値が含まれる。
前述の全般的な説明及び以下の詳細な説明は両方とも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲に記載されている特徴を限定するものではない。本明細書で使用される場合、「含む」、「有する」、「包含する」という用語又はそれらの他の変形は、要素のリストを含むプロセス、方法、物品、又は装置がそれらの要素のみを含むのではなく、明示的に列挙されていない、又はそのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の要素を含み得るように、非排他的な包含をカバーすることを意図している。本開示では、例えば「約」、「実質的に」、「概して」、及び「およそ」などの相対的な用語は、記載された値又は特性における±１０％の変動の可能性を示すために使用される。全ての範囲は上限・下限を含むものと理解され、例えば、５重量％～１０重量％のマクロマー含量には、５重量％、１０重量％、及びそれらの間にあるすべての値が含まれる。
【0012】
本開示の実施形態は、当技術分野における１つ以上の制限に対処することができる。しかしながら、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されるものであり、特定の問題を解決する能力によって定義されるものではない。本開示には、ゲル、例えばヒドロゲルを形成するように配合された組成物及びシステム、ならびに例えば胃腸管の組織への適用に有用なゲル／ヒドロゲル形態の組成物が含まれる。本明細書のヒドロゲルは、ポリペクトミーなどの医療処置の直後に適用される、一時的で低侵襲性のｉｎ ｓｉｔｕヒドロゲル被覆材として機能し得る。ヒドロゲルは、創傷を覆って保護することにより、合併症の可能性を予防又は軽減することができる。生体材料設計の観点から見ると、被覆材は次の１つ以上を達成できる：１）ｉｎ ｓｉｔｕで迅速に形成される；２）結腸組織に接着する；３）非細胞毒性である；４）３～５日で自然に溶解する；５）創傷滲出液を吸収するために最大２００％まで膨潤する；６）細菌の拡散又は移動を防止する；及び／又は７）結腸内腔の展性のある形状に適合する。本明細書のゲルは、ヒドロゲル組成に応じて、ゲル化速度、接着強度、膨潤、細胞毒性、及び／又は分解などの所望の特性を備えるように配合することができる。本明細書の組成物は、内視鏡を通して挿入されるカテーテルなどの適切な医療装置によって対象に送達され得る。例えば、デュアルルーメンカテーテルが使用されてもよい。ヒドロゲルのバリア特性は、細菌の移動を防ぐのに役立ち得る。
【0013】
本明細書の組成物、システム、及び方法は、とりわけ固有の凝集力及び組織への接着を含む、一連の特性を提供し得る。このような特性により、本明細書のゲルは、体管腔、例えばＧＩ管の薄い、損傷した、及び／又はその他の損傷を受けた組織のための保護バリアとして機能し得る。例えば、例示的な組成物、例えば、ゲルを形成するための製剤又はシステムは、ＧＩ管に沿った標的部位に適用することができ、組成物は架橋してゲルを形成することができ、これにより、標的部位にバリア保護／治療を提供することができる。本明細書の組成物及びゲルシステムの成分は、例えば医療処置の前、最中、及び／又は後の組織保護に有利な所望の特性を提供し得る。本明細書の組成物及びシステムは、適切な方法又は技術によって標的部位に送達され得る。例えば粘度などの組成物の特性は、医療処置に有用なデバイスの中でも特に、例えば内視鏡を含むシングル／マルチルーメンカテーテル、及びシリンジなどの適切な医療デバイスを介したゲル形成製剤の標的部位への送達可能性を促進し得る。例えば、ゲル形態の本明細書の組成物は、室温（約２２～２５℃）で約０．０１０Ｐａ・ｓから、例えば約０．０１５Ｐａ・ｓまでの範囲、例えば約０．０１３Ｐａ・ｓの粘度を有し得る。組成物又はゲルシステムの成分は架橋してゲルを形成してもよく、これには１つ以上の成分をｐＨ値や光などの刺激で、又はそのような刺激の存在下で活性化することが含まれ得る。本明細書のヒドロゲルは、マクロマー及び架橋剤から形成される親水性の三次元ポリマーネットワークであってもよい。本明細書のゲル、例えばヒドロゲルは、架橋を開始するための適切なｐＨ条件下又は露光下でマクロマーと架橋剤とを組み合わせることによって形成され得る。
【0014】
本開示に有用な例示的なマクロマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマー、ポリ（１，２－グリセロール）カルボナート（ＰＧＣ）系ポリマー、及びポリ（エチレンイミン）系ポリマーが含まれる。マクロマーは、架橋剤との反応に利用できる、アミン、アルケン、及び／又はチオール官能基などの複数の官能基を有し得る。図１Ａ及び１Ｂは、アミン官能基を有する分岐ポリ（エチレンイミン）（図１Ａ）及びチオール官能基を有する分岐ポリ（エチレンイミン）（図１Ｂ）を表す例示的なマクロマー構造を示す。本明細書で使用できるマクロマーのさらなる例を図２Ａ（ポリ（エチレンイミン））、図２Ｂ（４アームＰＥＧ－ＮＨ２）、図２Ｃ（アルケン官能基を有するＰＥＧ系マクロマー）、図２Ｄ（アルケン官能基を有するポリ（１，２－グリセロール）カルボナート系マクロマー。式中、ｍ及びｎは合計１００％までの各単位の量を表す整数であり、「ｒａｎ」はランダムコポリマーを指す）、図２Ｅ（アルケン官能基を有するノルボルネン部分を含むＰＥＧ系マクロマー）、図２Ｆ（（アルケン官能基を有するノルボルネン部分を含むポリ（１，２－グリセロールカルボナート系マクロマー。式中、ｌ、ｍ、及びｎは１以上の整数である）、及び図２Ｇ（超分岐ポリ（エチレンイミン）－チオール）（実施例７も参照）に示す。少なくとも１つの例において、マクロマーは、少なくとも１つのノルボレン（ｎｏｒｂｏｒｅｎｅ）基を有するポリ（１，２－グリセロール）カルボナート系ポリマーを含み、ノルボレン基はマクロマーの１％～９０％を構成する。
【0015】
本開示に有用な架橋剤の例としては、１つ以上のＮ－ヒドロキシスクシンイミド又はマレイミド官能基を含むＰＥＧ系ポリマーが挙げられる。図３Ａ及び３Ｂは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ＰＥＧポリマー（図３Ａ）及びマレイミド－ＰＥＧポリマー（図３Ｂ）を表す例示的な架橋剤構造を示す。本明細書で使用することができる架橋剤のさらなる例を図４Ａ～４Ｄに示す。図４Ａ及び４Ｂは、２つの異なるタイプのＮ－ヒドロキシスクシンイミド官能化ＰＥＧ架橋剤である。構造は、図４Ａに示されるものには加水分解可能な内部エステル結合が含まれていることを除いて同じである。図４Ｃは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド官能化ＰＥＧ架橋剤の別の例示的な構造を示し、ｍは１以上の整数、例えば、ｍ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である（実施例５も参照）。図４Ｄは、マレイミド官能化ＰＥＧ架橋剤の例示的な構造を示し、ｎは１以上の整数、例えば、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である（実施例６も参照）。
【0016】
上述したように、本明細書のゲルは、創傷又は体内の他の関心部位、例えば結腸又はＧＩ管の別の部分の上にバリアを形成できる三次元ポリマーネットワークを形成し得る。図５は、マクロマーと架橋剤との間の架橋の簡略図であり、マクロマーの官能基が架橋剤の官能基と反応する。マクロマーと架橋剤との間の結合の強さに応じて、ゲルのポリマーネットワークが破壊され、例えばゲルが溶解することがある。図６は、ゲルの溶解を簡略化して示す図である。溶解は、例えば加水分解によって生じ得る。図７は、チオール基を有するヒドロゲルの加水分解を示す。溶解はまた、以下のいくつかの実施例で述べるように、システインメチルエステルとの反応などによるチオール－チオエステル交換を介して生じ得る（図８）。後者の場合、システインメチルエステルの第一級アミンが再配列されて不可逆的なアミド結合を形成し、ポリマーネットワークが崩壊した後のゲルの再形成を妨げると考えられる。
【0017】
架橋剤の構造は、溶解速度の制御に役立ち得る。図９は、例示的なＮ－ヒドロキシスクシンイミド官能化ＰＥＧ架橋剤の異なる部位で起こり得る反応を示す：（Ａ）ＮＨＳエステルとの反応、（Ｂ）内部チオエステルとの反応、及び（Ｃ）内部エステルとの反応。これらの部位とマクロマーポリ（エチレンイミン）、システインメチルエステル、及び水との反応が示されており、濃い陰影の領域はより高い反応性を有する部分に相当する。したがって、ＮＨＳエステル（Ａ）はマクロマーポリ（エチレンイミン）と最も反応性が高く、内部チオエステル（Ｂ）はシステインメチルエステルと最も反応性が高い。内部エステルは、マクロマー、システインメチルエステル、及び水に対して同等の反応性を有する。理論に束縛されるものではないが、ゲルの安定性は、隣接するチオエステルを加水分解又はチオール－チオエステル交換から保護する疎水性メチレン鎖の長さに少なくとも部分的に由来すると考えられる。
【0018】
本明細書のゲルは、ＧＩ管の組織など（例えば、腸組織、結腸組織など）の対象の標的組織上に形成され得る。例えば、架橋剤及びマクロマーは、これら２つの成分が標的組織部位に到達するまで互いに接触しないように、標的組織部位に別々に送達され得る。いくつかの例では、デュアルルーメンカテーテルが使用され得、例えば、架橋剤及びマクロマーが別個の管腔で標的組織部位に送達される。これら２つの成分は、標的組織部位で互いに接触することができ、適切なｐＨ（例えば、ＧＩ管の生理的ｐＨで架橋するように配合された成分）により、又はＵＶもしくは可視光によって活性化された光開始剤の存在下、標的組織部位でゲル化が起こる。例えば、光開始剤は、架橋剤及び／又はマクロマーの前、後、又は同時に標的組織部位に適用され、その後、光開始剤を活性化するために光が適用され、架橋を開始してゲルを形成することができる。ゲル化は、０秒超かつ３０秒未満、２５秒未満、２０秒未満、１５秒未満、１０秒未満、又は５秒未満の時間、例えば、１秒超かつ１５秒未満の時間で開始され得る。架橋剤及びマクロマー（及び存在する場合には光開始剤）は、ＧＩ管などの曲がりくねった環境で重力の引力にさらされたときにゲルを形成する比較的速いゲル化速度を提供するように選択され得る。
【0019】
ゲルは、組織上にｉｎ ｓｉｔｕで形成されると、所望の期間にわたって無傷のままであるのに十分な強度を備えたバリアを形成し得る。例えば、ゲルは、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも２１日又は少なくとも３０日、組織上に留まり得る。本開示のいくつかの態様によれば、ゲルは、組織上に約１時間～約６０日、約１時間～約３０日、約１時間～約１４日、約１時間～約２４時間、約１２時間～約４８時間、又は約２日～約２１日、約５日～約１４日の範囲の期間持続するバリアを形成することができる。
【0020】
架橋剤及びマクロマーは、ゲルが組織上にバリアを形成するのに望ましい期間に適合するのに十分な強度を提供するように選択され得る。以下の実施例で考察するように、より高い架橋密度（架橋剤及びマクロマーの官能基の数及び種類に少なくとも部分的に依存する）及び／又は相対的な疎水性は、組織に適用した場合、より長い滞留時間を有するより強力なゲルを提供すると予想される。本明細書のゲルは、生体適合性及び／又は生分解性であり得る。例えば、ゲルは、ゲルの架橋密度及び強度に応じて、時間の経過とともに（例えば、加水分解によって、及び／又は以下の実施例で述べるようにチオール－チオエステル交換などの外因性チオエステルの存在下で）溶解し得る。
【0021】
以下に、内視鏡処置を含む医療処置に有用な例示的な組成物及びシステム、例えば、ゲルを含む、又はゲルを形成するように配合された組成物又はシステムについてさらに説明する。組成物は、治療目的で対象に適用することができ、組成物は、（例えば、その場でゲルを形成するように）様々な機構を介して活性化することができる。
【0022】
ｐＨ活性化ゲルシステム
本開示のいくつかの態様では、組成物又はシステムは、生理学的ｐＨ、例えば約７～約７．５、例えば約７．３５～７．４５のｐＨ下で架橋し、粘着性の凝集性ゲルを形成するように配合され得る。したがって、そのような組成物及びシステムは、ゲル、例えばヒドロゲルが中性から塩基性ｐＨでは選択的に架橋し（例えば、酸性ｐＨでは架橋がほとんど又は全くない）、ｐＨが上昇するにつれて反応速度が増加するように、ｐＨで活性化され得る。本開示のいくつかの態様によれば、組成物又はシステムは、ゲル、例えばヒドロゲルを形成するためにｐＨで活性化され得る。例えば、組成物は、生理的ｐＨ、例えば、約７から約７．５の範囲内のｐＨで架橋する少なくとも２つの成分、例えば、第１の成分（例えば、第１の部分溶液）及び第２の成分（例えば、第２の部分溶液）を含み得る。したがって、例えば、第１及び第２の部分溶液は異なるｐＨ値を有することができ、生理学的ｐＨを提供するために一緒に混合することでゲルを形成することができる。
本開示のいくつかの態様では、組成物又はシステムは、生理学的ｐＨ、例えば約７～約７．５、例えば約７．３５～７．４５のｐＨ下で架橋し、粘着性の凝集性ゲルを形成するように配合され得る。したがって、そのような組成物及びシステムは、ゲル、例えばヒドロゲルが中性から塩基性ｐＨでは選択的に架橋し（例えば、酸性ｐＨでは架橋がほとんど又は全くない）、ｐＨが上昇するにつれて反応速度が増加するように、ｐＨで活性化され得る。本開示のいくつかの態様によれば、組成物又はシステムは、ゲル、例えばヒドロゲルを形成するためにｐＨで活性化され得る。例えば、組成物は、生理的ｐＨ、例えば、約７から約７．５の範囲内のｐＨで架橋する少なくとも２つの成分、例えば、第１の成分（例えば、第１の部分溶液）及び第２の成分（例えば、第２の部分溶液）を含み得る。したがって、例えば、第１及び第２の部分溶液は異なるｐＨ値を有することができ、生理学的ｐＨを提供するために一緒に混合することでゲルを形成することができる。
【0023】
例示的なシステムの第１の成分は、マクロマーを含み得る。マクロマーは、多官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系又はポリ（エチレンイミン）系ポリマーであり得る。例えば、ＰＥＧ系ポリマー又はポリ（エチレンイミン）系ポリマーは、少なくとも１５００Ｄａ（ｇ／モル）、例えば約１８００Ｄａ～約２２００Ｄａ、例えば約２０００Ｄａの分子量を有し得る。例えば、マクロマーは、約１５００Ｄａ～約２５００Ｄａ、約１５００Ｄａ～約２０００Ｄａ、又は約１８００Ｄａ～約２２００Ｄａの範囲の分子量を有し得る。ポリ（エチレンイミン）は直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい。いくつかの例では、マクロマーは、複数の官能基を有する多官能性ＰＥＧ系又はポリ（エチレンイミン）系ポリマーであり得る。複数の官能基は、システムの架橋剤と反応し得る（架橋剤の例は以下でさらに詳細に論じられる）。そのような官能基は、例えば、アミン又はチオール官能基であり得る。いくつかの態様によれば、多官能性ＰＥＧ系又はポリ（エチレンイミン）系ポリマーは、複数の２～２０個の官能基、例えば、４、６、８、又は１５個の官能基を含み得る。アミン官能基を有する分岐ポリ（エチレンイミン）（図１Ａ）及びチオール官能基を有する分岐ポリ（エチレンイミン）（図１Ｂ）を表す例示的な構造を本開示で使用することができる。いくつかの態様では、マクロマーは緩衝液に溶解される。マクロマーを溶解できる例示的な緩衝液には、ホウ酸緩衝液が含まれるが、これに限定されない。例えば、ホウ酸緩衝液は、約８．５～９．０のｐＨを有し得る。
【0024】
このシステムの第２の成分は、架橋剤を含み得る。架橋剤の例には、ＰＥＧ系ポリマーが含まれるが、これに限定されない。例えば、架橋剤として使用されるＰＥＧ系ポリマーは、３０００Ｄａを超える分子量、例えば約３２００Ｄａ～約３５００Ｄａ、例えば約３４００Ｄａを有し得る。本開示のいくつかの態様によれば、架橋剤は、約３０００Ｄａ～約３８００Ｄａ、約３２００Ｄａ～約３５００Ｄａ、又は約３４００Ｄａ～約３８００Ｄａの範囲の分子量を有する。いくつかの例では、架橋剤は、１つ以上のＮ－ヒドロキシスクシンイミド又はマレイミド官能基を含むＰＥＧ系ポリマーであり得る。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はマレイミド基は、以下でさらに詳細に述べるように、マクロマーと反応し得る。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ＰＥＧポリマー及びマレイミド－ＰＥＧポリマーを表す例示的な構造を、それぞれ図３Ａ及び３Ｂに示す。しかしながら、適切な架橋剤、例えばＰＥＧ系ポリマーは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はマレイミド官能基に限定されないことに留意されたい。本開示に適したＰＥＧ系ポリマーは、ゲルを形成するためのシステムの第１の成分のマクロマーと反応し得る他の官能基を含み得る。
【0025】
いくつかの態様では、架橋剤は、緩衝剤を含む溶液中で提供されてもよく、例えば、架橋剤は緩衝液に溶解されている。例えば、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などのリン酸緩衝液であってもよい。架橋剤が提供される、例えば溶解される緩衝液は、マクロマーが溶解される緩衝液よりも低いｐＨを有し得る。例えば、架橋剤は、約６．０～６．５のｐＨを有するＰＢＳ溶液に提供、例えば溶解することができる。したがって、本開示によるゲルを形成するためのシステムは、ｐＨで活性化され得、一方が他方よりも高いｐＨを有する少なくとも２つの緩衝液を含み得る。
【0026】
架橋剤及びマクロマーは、約３：２～７：３のモル比、例えばそれぞれ２：１のモル比の官能基比（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド：アミン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド：チオール、マレイミド：アミン、マレイミド：チオールなど）で存在し得る。ゲルは、架橋剤及びマクロマーの合計含有量が組成物の総重量に対して少なくとも１５重量％である水性組成物であってもよい。例えば、架橋剤の含有量は、組成物の総重量に対して約１０～２０重量％であってもよく、例えば、約１０重量％～約１５重量％、約１２重量％～約１８重量％、又は約１５重量％～約２０重量％の範囲であってもよい。これに加えて又はこれに代えて、マクロマーの含有量は、組成物の総重量に対して約５～１０重量％、例えば、約５重量％～約８重量％、又は約７重量％～約９重量％の範囲であってもよい。上述したように、第１及び第２の部分溶液は、少なくとも２つの異なる緩衝液、例えば、架橋剤に適した第１の緩衝液及びマクロマーに適した第２の緩衝液を含んでもよい。いくつかの態様によれば、第１の緩衝液はリン酸緩衝液を含み、第２の緩衝液はホウ酸緩衝液を含む。水性組成物は、緩衝剤として任意の適切な塩を含み得る。本明細書の組成物によって形成されるゲル、例えばヒドロゲルの機械的特性は、マクロマー及び／又は架橋剤の量によって少なくとも部分的に決定され得ることに留意されたい。例えば、ゲル強度は、水性組成物中のマクロマー及び架橋剤の含有量が増加するにつれて増加し得る。したがって、例えば、水性ゲルシステムの総重量に対して約２０重量％又は約２５重量％のマクロマー及び架橋剤の組み合わせを含む組成物は、約１５重量％のマクロマー及び架橋剤の組み合わせを含む組成物から形成されるゲルよりも高いゲル強度を有するゲルを形成し得る。
【0027】
組成物又はシステムの成分（例えば、マクロマー、架橋剤、及びそれぞれの緩衝液）は一緒に混合することができる。
生理的ｐＨの下では、架橋剤の官能基とマクロマーの官能基が化学的結合を介して相互に反応し、それによって即時のゲル化が可能になる。例えば、組成物が約７～約７．５のｐＨにある場合、マクロマーと架橋剤が反応してゲルを形成し得る。いくつかの態様では、ゲルは、第１の緩衝液とともにマクロマーを含む第１の成分と、第２の緩衝液とともに架橋剤を含む第２の成分とを混合すると、２０秒以内、１５秒以内、１０秒以内、又は約５秒以内に形成され得る。例えば、ゲルは、約１秒～約１５秒、約３秒～約８秒、約５秒～約１０秒、又は約２秒～約５秒の範囲の時間で形成され得る。得られるゲル、例えばヒドロゲルは、例えば生理学的環境内で時間の経過とともに受動的に、又はヒドロゲルネットワークを破壊できる薬剤の適用などの要求に応じて溶解可能であり得る。例えば、ゲルは約１０～３０分間以内に溶解し得る。溶解度は、例えばゲルを水溶液に浸したときのレオロジーを測定することによって、実験室環境内で測定することができる。
生理的ｐＨの下では、架橋剤の官能基とマクロマーの官能基が化学的結合を介して相互に反応し、それによって即時のゲル化が可能になる。例えば、組成物が約７～約７．５のｐＨにある場合、マクロマーと架橋剤が反応してゲルを形成し得る。いくつかの態様では、ゲルは、第１の緩衝液とともにマクロマーを含む第１の成分と、第２の緩衝液とともに架橋剤を含む第２の成分とを混合すると、２０秒以内、１５秒以内、１０秒以内、又は約５秒以内に形成され得る。例えば、ゲルは、約１秒～約１５秒、約３秒～約８秒、約５秒～約１０秒、又は約２秒～約５秒の範囲の時間で形成され得る。得られるゲル、例えばヒドロゲルは、例えば生理学的環境内で時間の経過とともに受動的に、又はヒドロゲルネットワークを破壊できる薬剤の適用などの要求に応じて溶解可能であり得る。例えば、ゲルは約１０～３０分間以内に溶解し得る。溶解度は、例えばゲルを水溶液に浸したときのレオロジーを測定することによって、実験室環境内で測定することができる。
【0028】
マクロマー及び架橋剤から形成されたゲルは、望ましい特性を示し得る。例えば、得られるゲル、例えばヒドロゲルの貯蔵弾性率（ゲル強度の尺度として）は、約２．０～１０．５ｋＰａ、例えば約２．５ｋＰａ～約１０ｋＰａ、約５ｋＰａ～約８ｋＰａ、又は約３．５ｋＰａ～約７．５ｋＰａの範囲であり得る。これに加えて又はこれに代えて、ゲルは、ほぼ室温設定で、例えば最長３０日以上などの所望の期間、約２０００～１０，０００Ｐａの範囲のゲル強度（本明細書では貯蔵弾性率Ｇ’とも呼ばれる）を保持し得る。さらに、例えば、ゲル、例えばヒドロゲルは、組織、例えば体管腔の組織、例えばＧＩ管の結腸組織に接着した場合、約０．０３～０．９０Ｎ／ｃｍ２、例えば約０．１～０．６Ｎ／ｃｍ２、例えば約０．０５Ｎ／ｃｍ２～約０．４Ｎ／ｃｍ２、約０．５Ｎ／ｃｍ２～約０．９Ｎ／ｃｍ２、又は約０．７５Ｎ／ｃｍ２～約０．９Ｎ／ｃｍ２範囲のせん断力を有し得る。
【0029】
これに加えて又はこれに代えて、ゲルは、約２００ｍｂａｒまでの圧力、例えば１５０ｍｂａｒまでの圧力、例えば１ｍｂａｒを超え、２００ｍｂａｒ以下（１ｍｂａｒ＝１００Ｐａ）の破裂圧力（ゲルが組織に接着したときに裂けるか破損する圧力に相当する）に耐えるように配合され得る。ゲルの破裂圧力は、カテーテル及び圧力トランスデューサー（例えば、圧力センサを備えたミラー（Ｍｉｌｌａｒ）カテーテルを含む）によって測定することができ、これはベースライン圧力及び破裂直前の圧力を測定するために利用され得ることに留意されたい。破裂圧力を測定するために、ゲルを組織サンプルの開口部にｉｎ ｓｉｔｕで形成し、ゲルの凝集及び／又は組織へのゲルの接着が破壊されて流体が組織の開口部を通過するまで圧力が増加する流体にさらすことができる。ゲルが破壊する直前の流体の最大圧力に対応する圧力が破裂圧力である。
【0030】
結腸組織などのＧＩ管の組織に適用されるゲルの破裂圧力は、以下のように測定され得る。まず、およそ１ｍｍ×５ｍｍの幅及び長さの寸法を有する開口を組織内に切り込む（開口の深さは組織の厚さに相当し、結腸組織の場合は約５ｍｍ）。組織サンプルは、直径約５１ｍｍ（約２インチ）の領域が容器上の邪魔にならない窓として配置されるように、容器の開口端上に固定される。生理食塩水を容器に導入し、開口を通って流れるようにして、圧力センサをベースライン圧力に校正する。次いで、ゲルをｉｎ ｓｉｔｕで形成させて開口を閉じる。次いで、生理食塩水を容器に導入し、ゲルの開口を溶液が通過して容器から排出されることができなくなるまで、増加する流体圧力を測定する。生理食塩水がゲルを突き破って開口から出る直前の最大圧力が破裂圧力である。本明細書のいくつかの例では、ゲルは、結腸組織に接着した場合、少なくとも５０ｍｂａｒ、少なくとも１００ｍｂａｒ、又は少なくとも１２０ｍｂａｒ（１ｍｂａｒ＝１００Ｐａ）の破裂圧力に耐えるように配合され得る。例えば、本明細書のゲルは、結腸組織に接着した場合に最大約１５０ｍｂａｒの破裂圧力、例えば、約５０ｍｂａｒ～約１５０ｍｂａｒ、約１００ｍｂａｒ～約１５０ｍｂａｒ、又は約１２５ｍｂａｒ～約１５０ｍｂａｒの範囲の破裂圧力に耐えるように配合され得る。破裂圧力は、上述のように、１ｍｍ×５ｍｍの開口サイズを使用して、結腸組織に対して測定され得る。
【0031】
動脈又は他の血管閉塞デバイスとして使用されるゲルの破裂圧力は、直径４～６ｍｍの血管を閉じるためにｉｎ ｓｉｔｕでゲルを形成することによって測定され得る。シリンジポンプ及び圧力トランスデューサーを使用することができ（図５６及び実施例１１を参照）、ゲルサンプル中の漏れが観察されるまで、Ｄ２Ｏを１ｍＬ／分の速度でシリンジポンプを通してポンプ輸送することができる。圧力トランスデューサーから検出されるピーク圧力が破裂圧力として記録される（圧力の単位、１ｍｍＨｇ＝１３３．３２２Ｐａ）。
【0032】
光活性化ゲルシステム
本開示はまた、刺激としての光によって活性化されるとゲルを形成するように配合された組成物及びシステムを含む。いくつかの例では、組成物は、光（例えば、ＵＶ光又は可視光）に曝露されたときに架橋して凝集性ゲルを形成するように配合され得る。したがって、そのような組成物及びシステムは、光活性化されるものとして説明され得る。このような組成物及びシステムは、例えば、マクロマー、架橋剤、光開始剤、及び緩衝液を含み得る。緩衝液は、使用する緩衝液に応じて、生理学的ｐＨ付近又はそれをわずかに超える任意の適切な緩衝液であり得る。例えば、リン酸緩衝液は、７．０～８．０のｐＨ範囲にあり得る。
本開示はまた、刺激としての光によって活性化されるとゲルを形成するように配合された組成物及びシステムを含む。いくつかの例では、組成物は、光（例えば、ＵＶ光又は可視光）に曝露されたときに架橋して凝集性ゲルを形成するように配合され得る。したがって、そのような組成物及びシステムは、光活性化されるものとして説明され得る。このような組成物及びシステムは、例えば、マクロマー、架橋剤、光開始剤、及び緩衝液を含み得る。緩衝液は、使用する緩衝液に応じて、生理学的ｐＨ付近又はそれをわずかに超える任意の適切な緩衝液であり得る。例えば、リン酸緩衝液は、７．０～８．０のｐＨ範囲にあり得る。
【0033】
マクロマーは、少なくとも１つの官能基を含む多官能性ＰＥＧ系ポリマーであり得る。ＰＥＧ系ポリマーは直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい。マクロマーの少なくとも１つの官能基は、例えば、チオール基、又はアルケン基の中でも特に、ビニル基、アリル基、アクリラート基、もしくはノルボルネン基などのアルケン基を含み得る。マクロマーの官能基は、例えばゲル化時間を含む、ゲルの所望の特性に基づいて選択され得る。マクロマーの官能基の数は、４～１００の間、例えば、１０～５０の間、２５～６５の間、又は４５～８５の間であり得る。
【0034】
いくつかの例では、架橋剤は、少なくとも１つの官能基を含むＰＥＧ系ポリマーであり得る。架橋剤の官能基は、マクロマーと架橋剤とを架橋するために、マクロマーの官能基と相補的であってもよい。例えば、架橋剤の少なくとも１つの官能基は、チオール基、又はビニル基、アリル基、アクリラート基、ノルボルネン基、又は他の種類のアルケン基などのアルケン基を含み得る。架橋剤の官能基は、ゲルの所望の分解特性に基づいて選択され得る。本明細書のいくつかの例では、架橋剤の官能基の数は、２～４の間、例えば、２、３、又は４つの異なる官能基であり得る。
【0035】
いくつかの例では、マクロマーはチオール基を含み、架橋剤はアルケン基を含み、又はその逆でもあり得る。例えば、架橋剤は、チオール基を含むＰＥＧ系ポリマーを含むことができ、マクロマーは、アルケン基、例えば、アクリラート基を含む。別の例では、マクロマーは、チオール基を含むＰＥＧ系ポリマーを含むことができ、架橋剤は、アリルエーテル基などのアルケン基を含むＰＥＧ系ポリマーを含み得る。
【0036】
上述したように、組成物は、例えばゲル化を開始するために光開始剤を含み得る。したがって、例えば、光開始剤は、光の所与の波長の光を吸収する化合物であり得る。本開示の態様によれば、光開始剤は、ＵＶ光（例えば、約１００～３９０ｎｍの間の波長）又は可視光（例えば、約３９０～８００ｎｍの間の波長）を吸収し得る。ＵＶ光によって活性化される、本明細書の組成物に適した光開始剤の例には、限定するものではないが、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９）及びリチウムフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸（ＬＡＰ）が挙げられる。ＵＶ光によって活性化されるゲル化は、例えばＵＶ光曝露の約５秒以内に直ちに起こり得る。可視光によって活性化される、本明細書の組成物に適した光開始剤の例としては、限定するものではないが、エオシンＹが挙げられる。可視光によって活性化されるゲル化は、可視光暴露後短時間で又は直後に、例えば、可視光暴露の約１０秒以内に起こり得る。いくつかの例では、光開始剤は白色光、例えば約３９０ｎｍ～約７００ｎｍの波長を吸収する。したがって、組成物にＵＶ光又は可視光（例えば、白色光）を照射すると、使用される光開始剤に応じて、組成物は架橋してゲルを形成し得る。ＵＶ光又は可視光の強度は、約１ｍＷ／ｃｍ２から約１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲であり得る。例えば、ＵＶ光（３６５ｎｍ）強度は、約４ｍＷ／ｃｍ２から約１２０ｍＷ／ｃｍ２の範囲であってもよく、白色光強度は、約１０ｍＷ／ｃｍ２（例えば、光開始剤の最大吸収時）から約４５ｍＷ／ｃｍ２までの範囲、例えば４２．９Ｗ／ｃｍ２であってもよい。
【0037】
いくつかの例では、組成物は、光重合ゲル化反応速度を促進し又は高めるための添加剤を含み得る。例示的な添加剤には、例えば、チロシン誘導体、例えば、チロシンメチルエステル又はチロシンエチルエステルなどの小分子添加剤が含まれる。このような組成物は、可視光、例えば白色光を吸収する光開始剤を含み得る。
【0038】
マクロマー、架橋剤、及び光開始剤の前述の成分は、組成物の総重量に対して約１０～２５重量％の合計濃度で存在し得る。より高い量（例えば、約２０～２５重量％）では、組成物は比較的短いゲル化時間を有し、比較的高い弾性を有するゲルをもたらし得る。架橋剤の含有量は、組成物の総重量に対して５～１０重量％であり得る。これに加えて又はこれに代えて、マクロマーの含有量は、組成物の総重量に対して５～１５重量％であり得る。マクロマーの官能基と架橋剤の官能基との間のモル比は、組成物中で１：１から２：１の範囲であり得る。いくつかの例では、上記モル比は約１：１である。前述の部分の１：１の比は、前述の２：１のモル比と比較して、弾性、すなわちゲル弾性率の増加をもたらし得ることに留意されたい。いくつかの例では、組成物又はシステムは、組成物又はシステムの架橋剤ごとに２つ以上の官能基を含むマクロマーを含み得る（例えば、マクロマーと架橋剤が１：１の比であり、マクロマーは少なくとも２つの官能基を含むか、又はマクロマーと架橋剤が１：２の比であり、マクロマーは少なくとも４つの官能基を含む）。さらに、官能部分の異なる化学量論量、例えばマクロマーあたりの官能基又は反応性基の数が、得られるゲル、例えばヒドロゲルの機械的特性と膨潤率の両方に影響を与え得ることに留意されたい。例えば、光活性化ゲルシステムのマクロマーの官能基の数が増加すると、より膨潤率の低い、より硬い（例えば、より粘稠な）ゲルが得られ得る。
【0039】
組成物は、約０．１ｍＭ～約１００ｍＭの光開始剤を含み得る。より高い光開始剤濃度、例えば、約９０～１００ｍＭは、より低い濃度、例えば、約０．１～１ｍＭと比較して、比較的速いゲル化速度を提供し得る。組成物が添加剤を含む場合、組成物は、最大１０ｍＭの添加剤、例えば、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、又は約０．５ｍＭ～約１ｍＭを含み得る。
【0040】
得られる光活性化ゲル、例えばヒドロゲルは、医療処置の前、最中、及び／又は後に組織に適用するのに有益な多くの所望の特性を示し得る。例えば、ゲル、例えばヒドロゲルは、５００～２５００Ｐａ、例えば約５００Ｐａから約１５００Ｐａ、約１０００Ｐａから約２０００Ｐａ、約７５０Ｐａから約１２５０Ｐａ、約１７５０Ｐａから約２５００Ｐａの範囲のゲル強度（貯蔵弾性率Ｇ’とも呼ばれる）を示し得る。ゲル強度Ｇ’は、組成物中の濃度、マクロマー及び架橋剤、及び／又は成分相互の比率に依存し得る。ゲル、例えばヒドロゲルは、初期質量の約１．８から約１．９倍、又は初期質量の約２．３から約２．４倍の範囲の膨潤比ｍｆ／ｍｉ（吸水によるゲルの重量の変化倍数、すなわち、ｍｆはゲルを緩衝液に浸した後の特定の時点におけるゲルの重量であり、ｍｉは緩衝液に浸す前のゲルの初期重量）を示し得る。得られたゲルは、比較的低レベルの細胞毒性を示し得る。例えば、ゲルは、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞などの細胞株に２４時間曝露した後、少なくとも９７％を超える生存率を示し得る。
【0041】
以下の実施例は本開示を説明することを意図しているが、本質的に限定するものではない。本開示は、前述の説明及び以下の実施例に沿った追加の実施形態を包含することが理解される。本開示は、以下にさらに説明する実施例に限定されるものではなく、本開示の範囲から逸脱することなく追加の条件を包含する。
【0042】
実施例
実施例１
例示的なｐＨ活性化組成物（ゲルシステム）を、湿潤環境において表１に従って室温でｅｘ ｖｉｖｏで調製した。第１の部分溶液を、アミン末端ＰＥＧ系マクロマー又はポリ（エチレンイミン）マクロマーとｐＨ８．５のホウ酸緩衝液とを混合することによって調製した。これとは別に、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液に溶解したＮ－ヒドロキシスクシンイミド架橋剤を含む第２の部分溶液を調製した。
実施例１
例示的なｐＨ活性化組成物（ゲルシステム）を、湿潤環境において表１に従って室温でｅｘ ｖｉｖｏで調製した。第１の部分溶液を、アミン末端ＰＥＧ系マクロマー又はポリ（エチレンイミン）マクロマーとｐＨ８．５のホウ酸緩衝液とを混合することによって調製した。これとは別に、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液に溶解したＮ－ヒドロキシスクシンイミド架橋剤を含む第２の部分溶液を調製した。
【0043】
【表1】
【0044】
第１の部分溶液と第２の部分溶液を一緒に混合することで水溶液を形成し、この水溶液はその後ゲルを形成した。組成物を１時間放置して完全にゲル化させてから、もたらされた特性を評価した。
【0045】
ゲルのゲル強度（貯蔵弾性率Ｇ’）をＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ－２レオメーターを使用して室温（約２２～２５℃）で測定し、１Ｈｚの周波数で１～１００％のひずみスイープを使用して評価した。線形粘弾性領域を、曲線のゲル強度の傾きが１０％低下するまで、ひずみの割合が増加するに従い決定した。次に、３％ひずみの線形粘弾性領域内で１～１０Ｈｚの周波数スイープを行った。ゲルが溶解するまでゲルを５０ｍＭ ＰＢＳに浸漬した後、ｔ＝０、４時間、２４時間、４８時間、７日、及び３０日の時点で周波数スイープを行った。
【0046】
図１０は、上記の時間中のゲルのゲル強度を示す。示されているように、ゲルは少なくとも３０日間、少なくとも１，０００Ｐａのゲル強度を示した。ゲルは、ｔ＝０で約４，０００Ｐａの初期ゲル強度を示し、ｔ＝２４時間で約８，０００Ｐａのピークゲル強度を示した。これらの特性は、ｐＨで活性化されたゲルが少なくとも３０日間、組織のための持続的な保護バリアとして機能し得ることを示す。
【0047】
ゲル化時間を、逆さチューブ試験を使用して決定した。ゲル化は、第１及び第２の部分溶液を混合した直後に、逆さにしたときにゲルがバイアルの側面を流れ落ちなくなった時として決定された。ゲル化時間は１秒未満で測定された。
【0048】
膨潤率を、５０ｍＭ ＰＢＳに浸漬した後のヒドロゲルの重量パーセントとして、以下の式：
【0049】
【数1】
【0050】
に従って決定した。ただし、ｍｆは、ゲルを緩衝液に浸した後の特定の時点でのゲルの重量であり、ｍｉは、緩衝液に浸す前のゲルの初期重量である。
【0051】
【表2】
【0052】
接着測定値は、生体外ブタ結腸組織を使用し、Ｉｎｓｔｒｏｎ（登録商標）マシンによるラップせん断試験によって決定した。この組織を約５１ｍｍ×２５ｍｍ（約２インチ×１インチ）の断片に切り分けた。ゲルを結腸組織の２片の間に置き、湿潤チャンバー内に１時間放置して完全にゲル化させた。この例では、ゲル化を、体外組織／接着測定をより適切に処理できる約５～１０分まで遅らせたことに注意されたい。したがって、完全なゲル化を確実にするために、組織サンプルをチャンバー内に１時間放置した。次に、ゲル組織構造体をＩｎｓｔｒｏｎ（登録商標）に取り付け、結腸組織の２つの細片を１０ｍｍ／分の速度で互いに反対方向に引っ張り、ヒドロゲルの凝集破壊が観察されるまで、力を継続的に測定した。接着力の測定値は０．０３～０．８５Ｎ／ｃｍ２の範囲であった。
【0053】
実施例２
２つのＵＶ活性化組成物（ゲル組成物１及び２）を、表３に従って、アルケン含有ＰＥＧ系マクロマー、チオール含有ＰＥＧ系架橋剤、及び光開始剤ＬＡＰをｐＨ７．４のＰＢＳ中で混合することによって、室温でｅｘ ｖｉｖｏで調製した。ゲル組成物１を、図２Ｄに示されるＰＧＣ系マクロマーを使用して調製し、ゲル組成物２を、図２Ｃに示されるＰＥＧ系マクロマーを使用して調製した。架橋剤は、ＰＥＧジチオール架橋剤又は４アーム－ＰＥＧ－チオール架橋剤であった。
２つのＵＶ活性化組成物（ゲル組成物１及び２）を、表３に従って、アルケン含有ＰＥＧ系マクロマー、チオール含有ＰＥＧ系架橋剤、及び光開始剤ＬＡＰをｐＨ７．４のＰＢＳ中で混合することによって、室温でｅｘ ｖｉｖｏで調製した。ゲル組成物１を、図２Ｄに示されるＰＧＣ系マクロマーを使用して調製し、ゲル組成物２を、図２Ｃに示されるＰＥＧ系マクロマーを使用して調製した。架橋剤は、ＰＥＧジチオール架橋剤又は４アーム－ＰＥＧ－チオール架橋剤であった。
【0054】
【表3】
【0055】
３６５ｎｍのＵＶ光の手持ち式４Ｗランプを使用して、組成物をゲル化した。
緩衝液中でゲルを膨潤させる前後のゲル強度を、室温（約２２～２５℃）で８ｍｍ平行プレートを使用するＴＡ機器ＤＨＲ－２レオメーターで測定した。周波数スイープを１％のひずみで行い、ゲル強度Ｇ’をスイープの線形粘弾性部分から特定した。
緩衝液中でゲルを膨潤させる前後のゲル強度を、室温（約２２～２５℃）で８ｍｍ平行プレートを使用するＴＡ機器ＤＨＲ－２レオメーターで測定した。周波数スイープを１％のひずみで行い、ゲル強度Ｇ’をスイープの線形粘弾性部分から特定した。
【0056】
図１１Ａは、膨潤前後のゲルのゲル強度を示す。組成物１から得られたゲルは、膨潤前では約１，８００Ｐａのゲル強度を示し、膨潤後では約１，５００Ｐａのゲル強度を示した。組成物２から得られたゲルは、膨潤前では約７００Ｐａのゲル強度を示し、膨潤後では約１０００Ｐａのゲル強度を示した。組成物１は、１分子あたり４つの反応性部分を有するマクロマーを有する組成物２と比較して、１分子あたりより多くの反応性部分を有するマクロマーを含んでいることに留意されたい。したがって、組成物１は組成物２よりも高い架橋密度を示し、その結果、より強いゲル強度が得られた。
【0057】
膨潤率を、上記の数式１に従い、初期のゲルの質量（ｍｉ）を取得し、次に緩衝液中で２４時間膨潤させ、過剰な緩衝液を拭き取った後のゲルの質量（ｍｆ）を取得することによって決定した。
【0058】
図１１Ｂは、両方のゲルのゲル膨潤率（図１１Ｂにはパーセントではなく、ｍｆをｍｉで割った比率として表される）を示す。組成物１から得られたゲルは約１．９の比を示し、一方、組成物２から得られたゲルは約２．４の比を示した。２つの組成物間の膨潤率の違いは、使用したマクロマーの違いの結果であるとも考えられ、その結果、架橋密度が異なる。架橋密度が高くなると膨潤率が低くなることが分かる。
【0059】
実施例３
例示的な可視光活性化ゲルシステム（組成物３）を、表４に従って、アルケン含有ＰＥＧ系マクロマーと、チオール含有ＰＥＧ系架橋剤、光開始剤エオシンＹ、添加剤チロシンエチルエステル、及びｐＨ７．０のリン酸緩衝液を混合することにより、室温でｅｘ ｖｉｖｏで調製した。
例示的な可視光活性化ゲルシステム（組成物３）を、表４に従って、アルケン含有ＰＥＧ系マクロマーと、チオール含有ＰＥＧ系架橋剤、光開始剤エオシンＹ、添加剤チロシンエチルエステル、及びｐＨ７．０のリン酸緩衝液を混合することにより、室温でｅｘ ｖｉｖｏで調製した。
【0060】
【表4】
【0061】
このシステムを、広スペクトルの白色光（４００～７００ｎｍ）のデュアルグースネック光ファイバー照明装置を備えたＡｍＳｃｏｐｅ１５０Ｗハロゲンランプを使用してゲル化した。
【0062】
ゲル強度を、図１２Ａに示すように、実施例２と同様にｔ＝０、４時間、２４時間、４８時間、及び７日の時点で室温（約２２～２５℃）で測定した。
ゲルは、ｔ＝０で約６００Ｐａの初期ゲル強度を示し、その後７日間にわたってゲル強度が増加し、ピークゲル強度はｔ＝２４時間の約２，１００Ｐａであった。ゲルは、少なくとも７日間、少なくとも６００Ｐａのゲル強度を示した。したがって、これらの結果は、ゲルが少なくとも７日間、組織のための持続的な保護バリアとして機能し得ることを示す。
ゲルは、ｔ＝０で約６００Ｐａの初期ゲル強度を示し、その後７日間にわたってゲル強度が増加し、ピークゲル強度はｔ＝２４時間の約２，１００Ｐａであった。ゲルは、少なくとも７日間、少なくとも６００Ｐａのゲル強度を示した。したがって、これらの結果は、ゲルが少なくとも７日間、組織のための持続的な保護バリアとして機能し得ることを示す。
【0063】
ゲル化時間を、２０ｍｍ平行板を用いて、ハロゲンランプの２つのグースネックを溶液に向けてから２枚の平行板間に露光し、室温（約２２～２５℃）でＤＨＲ－２レオメーターで測定した。１Ｈｚの周波数で時間スイープを行った。３０秒でランプを点灯し、その後ゲル化が起こった時間を記録した。ゲル化時間を図１２Ｂに示す。示されているように、チロシンエチルエステルの濃度が増加するにつれて（０から１０ｍＭまで）、ゲル化速度が増加する。
【0064】
ゲル前駆体の粘度を、５０ｍｍ１．００８°のコーンプレートを使用し、３７℃でＤＨＲ－２レオメーターでのフロースイープから測定した。図１２Ｃに示される結果は、光開始前に、ゲル前駆体溶液が、長いカテーテルを通して溶液を適用できるようなニュートン特性、及び、１／ｓを超えるせん断速度範囲での十分に低い粘度を示したことを示す。さらに、溶液は顕著なせん断減粘又は増粘を示さなかった。
【0065】
光開始剤及びゲルのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を使用して試験した。細胞を、９６ウェルプレート又は１２ウェルプレートのいずれかに、それぞれ２，５００細胞／ウェル又は２５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。光開始剤溶液及びゲル溶液を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する前に、０．２２μｍフィルターを使用して滅菌濾過した。次いで、ゲル溶液を、１５０Ｗハロゲンランプを使用してバイオセーフティキャビネット内でゲル化し、孔径３μｍのトランズウェルインサートを使用して細胞と共培養した。細胞を２４時間、処理とともにインキュベートした後、ＭＴＳ（３－（４，５－ジメチルトリアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－トラトラゾリウム、分子内塩）アッセイを使用して生存率を測定した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞生存率を、対照の未処理細胞に対して正規化した。
【0066】
図１２Ｄ～１２Ｅは、上述の細胞毒性試験の結果を示す。光開始剤のＩＣ５０は約０．２２３ｍＭであり、これはゲル製剤で使用した濃度を上回る。３重量パーセントのゲル製剤すべてについて９７％を超える細胞生存率を実証している図１２Ｅに見られるように、ＩＣ５０未満の光開始剤を使用することにより、ゲルでは細胞毒性の問題は予想されなかった。さらに、３つのゲル製剤の生存率の間に差は見られず、ゲルの他の成分についても、溶液中の濃度が増加してもそれらに関連する重大な毒性がないことが示された。
【0067】
【0068】
まず、ＳＡ－ＰＥＧ－ＳＡを次のように合成した。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ；平均Ｍｎ３０００ｇ／ｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（５ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、三口丸底フラスコ中で１２０℃で撹拌しながら溶解させた。溶解したら、フラスコを真空下に置き、温度を８０℃に下げて３０分間撹拌した。フラスコを窒素で３回パージした。無水コハク酸（ＳＡ）（９９％；Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．７５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）をフラスコに加えた。反応物を窒素下で１８時間撹拌した。次いで、内容物を最少量の無水塩化メチレン（ＤＣＭ；９９％；無水；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解させ、ジエチルエーテル中で沈殿させた。最後に、生成物を濾過し、真空下で１日間乾燥させた（白色固体、収率９９％）。プロトン及び炭素の核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ）スペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ５００ＭＨｚ分光計でＣＤＣｌ３中で取得した。ＳＡ－ＰＥＧ－ＳＡ生成物のＮＭＲスペクトルは以下の通りであった：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ２．６２（ｍ，８Ｈ），３．６４（オーバーラップ，２８８Ｈ），４．２４（ｍ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ１７４．０，１７２．１，７０．５，６３．８，２９．３，２８．３ｐｐｍ。ＳＡ－ＰＥＧ－ＳＡ中間体は９９％の反応収率で得られた。
【0069】
次に、ＳＡ－ＰＥＧ－ＳＡ（４ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を乾燥した丸底フラスコに加え、１５ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶解させた。Ｎ－ヒドロキシスルホンイミド（ＮＨＳ；９９％、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．４ｇ、３．８ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；９９％、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．８ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を加え、フラスコをアルゴンでパージした。混合物を室温で１８時間撹拌した。ジシクロヘキシル尿素を濾過し、溶液を濃縮し、ジエチルエーテル中で沈殿させた。得られた生成物であるＳＡ架橋剤（白色の水溶性粉末）を濾過により収集し、真空下で一晩乾燥させた（白色固体、収率９８％）。構造を、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＤＳＣ、及びＧＰＣによって確認した。上記のように測定されたＳＡ架橋剤のＮＭＲスペクトルは以下の通りであった：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣ１３：δ２．７０（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，４Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，８Ｈ），２．８９（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ、４Ｈ），３．５７（オーバーラップ，２９６Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，４Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣ１３：δ１７０．９，１６８．９，１６７．６，７０．７，６４．１，２８．６，２６．２，２５．５ｐｐｍ。
【0070】
分子量及びポリマー分布を、移動相としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で流速１．０ｍＬ／分でゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して測定した。ＳＡ架橋剤の場合、Ｍｗ：２９４９ｇ／ｍｏｌ；ＰＤＩ：１．０２。２つの同一のＪｏｒｄｉ Ｇｅｌ ＤＶＢカラム（Ｊｏｒｄｉ Ｌａｂｓ、２５０ｍｍ×１０ｍｍ、孔径１０５Å）を取り付けたＯｐｔｉＬａｂ ＤＳＰ干渉屈折計（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、ＧＰＣ分析を行った。ＳＡ架橋剤の場合、ＧＰＣ：Ｍｎ：２８９３ｇ／ｍｏｌ。ＳＭＡＲＴ－ｂｅａｍ ＩＩとフラッシュ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ分光計でマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）を行った。ＳＡ架橋剤の場合、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｐｏｓ）：Ｍｗ：３６００ｍ／ｚ。示差走査熱量計（ＤＳＣ）スペクトルをＱ１００ＴＡ機器熱量計で取得し、融点（ｍｐ）を決定するために使用した。ＳＡ架橋剤の場合、Ｍｐ（ＤＳＣ）：４３．５℃。
【0071】
実施例５
図４Ｂに示す架橋剤（「ＳＶＡ架橋剤」）（平均Ｍｎ３４００）を、Ｌａｙ ｓａｎ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．から入手し、グローブボックス内に保管した。上記のように測定したＮＭＲスペクトルは以下の通りであった：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣ１３：δ１．６９（ｔｔ，Ｊ＝７．３，７．４ ４Ｈ），１．８３（ｔｔ，Ｊ＝６．１，７．３，４Ｈ），２．６４（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．８３（ｂ，８Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝６．１，４Ｈ），３．６３（ｍ，３００Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ１６９．１，１６８．６，７０．４，３０．６，２８．４，２５．５，２１．４ｐｐｍ。ＳＶＡ架橋剤について以下を測定し、実施例４に記載したように測定した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｐｏｓ）：Ｍｗ：３７００ｍ／ｚ；ＧＰＣ：Ｍｎ：４６３５ｇ／ｍｏｌ；Ｍｗ：４８１２ｇ／ｍｏｌ；多分散指数ＰＤＩ：１．０３；Ｍｐ（ＤＳＣ）：４７．６℃。
図４Ｂに示す架橋剤（「ＳＶＡ架橋剤」）（平均Ｍｎ３４００）を、Ｌａｙ ｓａｎ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．から入手し、グローブボックス内に保管した。上記のように測定したＮＭＲスペクトルは以下の通りであった：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣ１３：δ１．６９（ｔｔ，Ｊ＝７．３，７．４ ４Ｈ），１．８３（ｔｔ，Ｊ＝６．１，７．３，４Ｈ），２．６４（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．８３（ｂ，８Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝６．１，４Ｈ），３．６３（ｍ，３００Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ１６９．１，１６８．６，７０．４，３０．６，２８．４，２５．５，２１．４ｐｐｍ。ＳＶＡ架橋剤について以下を測定し、実施例４に記載したように測定した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｐｏｓ）：Ｍｗ：３７００ｍ／ｚ；ＧＰＣ：Ｍｎ：４６３５ｇ／ｍｏｌ；Ｍｗ：４８１２ｇ／ｍｏｌ；多分散指数ＰＤＩ：１．０３；Ｍｐ（ＤＳＣ）：４７．６℃。
【0072】
実施例６
図４Ａに示される架橋剤（「ＳＡ架橋剤」）及び図４Ｂに示される架橋剤（「ＳＶＡ架橋剤」）と超分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（平均Ｍｎ２０００ｇ／ｍｏｌ、製造元Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は４アームＰＥＧ－ＮＨ２ＨＣｌ塩（４アームＰＥＧ－ＮＨ２）（スターポリマー、Ｍｎ５０００ｇ／ｍｏｌ、製造元ＪｅｎＫｅｍ）とを混合することによって、図１４に示すようにヒドロゲルを調製した。簡潔に述べると、各ＰＥＧ架橋剤を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５に溶解させた。ＰＥＩ及び４アームＰＥＧ－ＮＨ２のそれぞれを、０．３Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．６に溶解させた。架橋剤とマクロマー溶液を混合した後に得られるｐＨをｐＨ８．５に調整した。アミン：ＮＨＳのモル比は１：１５であり、ヒドロゲルは１０、１５、又は２０重量パーセント（重量％）で調製された。架橋におけるマクロマーのアミン基対ＮＨＳ基の比率は一定に保たれ、溶液中の量を増やすために重量％を増加させた。ヒドロゲルの特性を、次のセクションで説明するように測定及び分析した。
図４Ａに示される架橋剤（「ＳＡ架橋剤」）及び図４Ｂに示される架橋剤（「ＳＶＡ架橋剤」）と超分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（平均Ｍｎ２０００ｇ／ｍｏｌ、製造元Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は４アームＰＥＧ－ＮＨ２ＨＣｌ塩（４アームＰＥＧ－ＮＨ２）（スターポリマー、Ｍｎ５０００ｇ／ｍｏｌ、製造元ＪｅｎＫｅｍ）とを混合することによって、図１４に示すようにヒドロゲルを調製した。簡潔に述べると、各ＰＥＧ架橋剤を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５に溶解させた。ＰＥＩ及び４アームＰＥＧ－ＮＨ２のそれぞれを、０．３Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．６に溶解させた。架橋剤とマクロマー溶液を混合した後に得られるｐＨをｐＨ８．５に調整した。アミン：ＮＨＳのモル比は１：１５であり、ヒドロゲルは１０、１５、又は２０重量パーセント（重量％）で調製された。架橋におけるマクロマーのアミン基対ＮＨＳ基の比率は一定に保たれ、溶液中の量を増やすために重量％を増加させた。ヒドロゲルの特性を、次のセクションで説明するように測定及び分析した。
【0073】
データをＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ８で分析した。ヒドロゲルの特性評価研究の場合、エラーバーは３回以上の反復から得た結果の標準偏差を表す。細菌移動研究の場合、エラーバーは、それぞれ３つ以上の技術的反復で実施された３つの生物学的反復からの結果の標準偏差を表す。スチューデントのＴ検定を使用して結果を比較し、有意性を評価した。＊ｐ＜０．０５は有意である。
【0074】
ゲル化測定
比較的速いゲル化時間（例えば、３秒未満）は、例えば、ポリペクトミー処置又は他の内部創傷被覆の際に、ｉｎ ｓｉｔｕでゲルを形成するのに有用であり得る。ゲル化測定では、架橋剤とアミン末端マクロマー溶液を混合し、２ｍＬガラスバイアルに入れた。ゲル化は、逆さチューブ試験の仕組みを使用して試験した。１０秒ごとにチューブを反転させた。ゲル化は、バイアルを逆さにしたときに溶液が底に残る時間によって定義した。すべてのゲル化研究を室温２５℃で実施した。
比較的速いゲル化時間（例えば、３秒未満）は、例えば、ポリペクトミー処置又は他の内部創傷被覆の際に、ｉｎ ｓｉｔｕでゲルを形成するのに有用であり得る。ゲル化測定では、架橋剤とアミン末端マクロマー溶液を混合し、２ｍＬガラスバイアルに入れた。ゲル化は、逆さチューブ試験の仕組みを使用して試験した。１０秒ごとにチューブを反転させた。ゲル化は、バイアルを逆さにしたときに溶液が底に残る時間によって定義した。すべてのゲル化研究を室温２５℃で実施した。
【0075】
図１５はゲル化測定を示す。パネルＡ）様々な重量パーセント及び様々な配合でのヒドロゲルのゲル化時間、及びパネルＢ）上昇していくｐＨでのＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲル、１５重量％のゲル化時間。＊ｐ＜０．０５。ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは、図１５のパネルＡ）に示されるように、重量パーセントが１０重量％から２０重量％に増加するにつれてより速くゲル化した（パネルＡ）のすべてのヒドロゲルはｐＨ８．５で形成された）。ゲル化時間の増加は、反応性基の濃度が高く、したがってより迅速なゲル化が促進されることに起因すると考えられる。次に、ＳＡ架橋剤とＰＥＩ又は４アームＰＥＧ－ＮＨ２マクロマーのいずれかとの間のゲル化時間を１５重量％で比較した。ゲル化時間は約９０秒（１．５分）で同様であり、これは、ゲル化がアミンマクロマーとは無関係であることを示唆している。
【0076】
ＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは、ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２及びＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルと同様の速度でゲル化することが判明した。しかしながら、ＳＶＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２よりも速くゲル化することが観察された。このゲル化時間の増加は２つの要因によるものと考えられる。４アームＰＥＧ－ＮＨ２マクロマーは４つの長いアミン末端アームを含み、分子量は５ｋＤａである。ＰＥＩは、分子量２．０ｋＤａのより凝縮された分岐マクロマーである。４アームＰＥＧ－ＮＨ２の長いＰＥＧアームは、末端アミンを含む短いアームとより小さい分子量を有する分岐ポリマーであるＰＥＩと比較して立体自由度が増すため、ＳＶＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルのより速いゲル化時間に有利であると考えられる。この、より小さい分岐ＰＥＩ構造で観察される立体障害は、より高分子量でアームの長い星形４アームＰＥＧ－ＮＨ２構造と比較して、ヒドロゲルネットワーク内のＮＨＳ反応性基と容易に反応する能力を低下させると考えられる。
【0077】
ヒドロゲルネットワークの欠陥に関しては、末端アミンはＮＨＳエステルでの結合を促進するが、ＳＡ架橋剤にはマクロマーアミド化及び加水分解にも影響されやすい内部エステルが含まれている。ＳＡ架橋剤におけるアミド化に好ましい部位はＮＨＳエステルにあり、これはモデル系の１Ｈ ＮＭＲ分析、ｔ１／２＝０．６０ｍｉｎ－１によって確認される。図１９は反応のＮＭＲスペクトルの変化を示し、図１８は、ＮＨＳエステル及び内部エステルのＮＭＲにおけるシグナルのモニタリング変化、時間の関数としての変化を示す。可能性は低いと考えられるが、内部エステルでアミド化が起こり、ヒドロゲルネットワークに欠陥が生じる可能性がある（ｔ１／２＝１．８ｍｉｎ－１）（図１８を参照）。さらに、エステル結合における加水分解の半減期は、ｐＨ８．０でｔ１／２＝＜５分であり、さらにヒドロゲルネットワークに欠陥が生じる。内部エステルの加水分解とアミド化は競合反応であるため、ＳＶＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルと比較してゲル化時間が遅くなる可能性がある。
【0078】
ゲル化時間に対するｐＨの影響も、図１５のパネルＢ）にまとめたように、１５重量％のＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルについて、ｐＨ８．５、ｐＨ９．５、及びｐＨ１０．５で評価した。ゲル化速度は、ＰＥＩ緩衝溶液のｐＨが高くなるほど増加した：ｐＨ８．６で１００秒、ｐＨ９．５で６０秒、ｐＨ１０．５で５秒。比較のために、図１５のパネルＡ）を参照すると、ｐＨ８．５では、ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは８０秒でゲル化し、ＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは９０秒でゲル化し、ＳＶＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは４５秒でゲル化した。ＰＥＩ溶液のｐＨを上げると、ゲル化が速くなった。
【0079】
レオロジー測定
レオロジー測定値を、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ－２レオメーターを使用して得た。レオロジー８ｍｍ平行プレートを使用して、２２℃でレオロジー測定を行った。振動ひずみスイープを、０．１Ｈｚの周波数で０．１～１０％のひずみまで実施した。ひずみスイープから、ひずみパーセント（それ以下ではＧ’が水平から１０°逸脱する）として線形粘弾性領域を決定した。その後、周波数スイープを３０日にわたりすべての時点で実施した。ひずみは３％の線形粘弾性領域内に収まるように設定され、周波数を以前に公開されたプロトコルに従って０．１Ｈｚから１０Ｈｚの範囲で実施した。データは平均±標準偏差（ｎ≧３）として表される。
レオロジー測定値を、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ－２レオメーターを使用して得た。レオロジー８ｍｍ平行プレートを使用して、２２℃でレオロジー測定を行った。振動ひずみスイープを、０．１Ｈｚの周波数で０．１～１０％のひずみまで実施した。ひずみスイープから、ひずみパーセント（それ以下ではＧ’が水平から１０°逸脱する）として線形粘弾性領域を決定した。その後、周波数スイープを３０日にわたりすべての時点で実施した。ひずみは３％の線形粘弾性領域内に収まるように設定され、周波数を以前に公開されたプロトコルに従って０．１Ｈｚから１０Ｈｚの範囲で実施した。データは平均±標準偏差（ｎ≧３）として表される。
【0080】
ヒドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）を、１００ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で膨潤させた後、０時間、４時間、２４時間、４８時間、７日、及び３０日で測定した（３％のひずみを加えた）。各ヒドロゲルの膨潤率及び貯蔵弾性率（Ｇ’）を、強度の指標及びヒドロゲルの膨潤の指標として、３０日にわたり、又はヒドロゲルが１００μＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解するまで測定した。図１６は、以下のヒドロゲルについて測定された強度（Ｇ’）を示す：パネルＡ）様々な重量パーセントのＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ；パネルＢ）１５重量％のＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ又はＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２；パネルＣ）１５重量％のＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２及びＳＶＡ＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２；パネルＤ）１５重量％のＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ及びＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩ。すべてのレオメトリーは膨潤後に経時的に記録された。＊ｐ＜０．０５。
【0081】
１０重量％、１５重量％、及び２０重量％のＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは、ゲル化時にそれぞれ６３８Ｐａ、９９２Ｐａ、及び２９３０Ｐａの平均Ｇ’を示した。１５重量％及び２０重量％のヒドロゲルは４８時間まで機械的完全性（Ｇ’＞３００Ｐａ）を維持したが、１０重量％ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは４時間後に溶解した（Ｇ’＜３００Ｐａ）。機械的強度に対する架橋剤中の分解性エステル結合の影響を評価するために、ＳＡ又はＳＶＡ架橋剤と４アームＰＥＧ－ＮＨ２（パネルＢ）及びＤ））を使用してヒドロゲルを調製した。比較すると、１５重量％ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、時間ｔ＝０で３８１４ＰａのＧ’を示し、７日間の膨潤にわたって完全性を維持し、２４時間にわたるＧ’の変化は最小限であり、４８時間と７日の機械的強度は低下した。１５重量％のＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩ及びＳＶＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、それぞれ１６８３Ｐａ及び７７３９ＰａのＧ’を示した。全てのヒドロゲルのＧ’は、膨潤時に最初は増加した（図１６）。ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、４８時間にわたってＧ’が変化せず（３５９１Ｐａ）完全性を維持し、７日間の膨潤の間ヒドロゲルの形態を維持することがわかった。一方、ＳＶＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、３０日間の膨潤にわたって機械的強度を維持した（１３７６６Ｐａ）。ＰＥＩを使用して調製したヒドロゲルでも同様の傾向が観察されたが、ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルでは４８時間にわたってＧ’は同様のままであった（１３８０Ｐａ）。
【0082】
ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルで示されているように、ヒドロゲル重量パーセントの増加により、Ｇ’が大きくなり、機械的強度がより長く持続するようになった（パネルＡ）を参照）。さらに、各ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ）では時間の経過とともにＧ’が減少し、これは内部エステル結合での加水分解によるものと考えられる。一方、ＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルでは３０日間の膨潤の間Ｇ’は変化せず、これはＳＶＡ架橋剤構造内に分解性結合が欠如していることによるものと考えられる（パネルＣ）を参照）。
【0083】
ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルと比較したＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルの分解速度の増加は、ＰＥＩの結果としてのヒドロゲルネットワーク内の局所的な塩基性ｐＨに起因すると考えられる。ｐＨの影響を、ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルをｄＨ２Ｏ、ｐＨ５．０中で膨潤させ、ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２をｐＨ８．０のＴＥＡ水溶液（第三級アミン、ＰＥＩ系ヒドロゲル中に存在するものと同等の［Ｍ］）中で膨潤させることによって評価した。図１７は、パネルＡ）において、ｐＨ７．４及びｐＨ５．０で膨潤したＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルの貯蔵弾性率を示し、パネルＢ）において、ｐＨ７．４及びｐＨ８．０で膨潤したＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルの貯蔵弾性率を示す。＊ｐ＜０．０５。ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは、ｐＨ７．４のＰＢＳ中での膨潤と同様に、ｐＨ５．０で膨潤し、４８時間で加水分解した（パネルＡを参照））。同様の分解速度は、ＰＥＩの強力な塩基性の性質と、局所的なｐＨを緩衝できないことに起因すると考えられる。ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルをＴＥＡを含む溶液中で膨潤させることにより、ヒドロゲルの加水分解が加速され、ヒドロゲルはｐＨ７．４のＰＢＳ中では７日であったのに対し、２４時間で分解した。ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルのこの加水分解の増加は、ＰＥＩの局所的な塩基性ｐＨが、ヒドロゲルネットワーク内の内部エステルの加水分解を促進することと一致する（パネルＢ）を参照）。
【0084】
ｄＨ２Ｏ、ｐＨ５．０中のＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルについて、及びｐＨ８．０のＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２についてレオロジー測定を行った。ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは、ｔ＝０の時点で１３６２ＰａのＧ’を示し、顕著な加水分解が起こるまで４８時間にわたって同様の機械的完全性を維持した（３００Ｐａ未満の貯蔵弾性率を示す場合、ジオロジー測定の間ヒドロゲルはその機械的構造を保持できないため、ヒドロゲルの完全性の損失はＧ’＜３００Ｐａとして定義される）。これはゲルを膨潤させる水のｐＨに関係なかった（図１７を参照）。ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲル製剤のＧ’は、時間ｔ＝０で２２３９Ｐａであり、４８時間までにｐＨ８．０の水溶液に溶解した（Ｇ’＜３００Ｐａ）。一方、ｐＨ７．４で膨潤させたＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルのＧ’は、時間の経過とともに減少したが、７日間を通してその機械的完全性を維持した（Ｇ’＞３００Ｐａ）（図１７を参照）。
【0085】
内部エステル結合における加水分解を、モデル系における１Ｈ ＮＭＲでエステルに隣接するメチレンピークの４．１９ｐｐｍから４．１５ｐｐｍへのシフトを追跡することによって確認した。ＳＡ架橋剤を、ｐＨ８．０のＤ２Ｏ中の０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝溶液に溶解させた。図１９は、ＮＭＲシグナルの変化に基づいた、緩衝されていないＤ２Ｏ中のＳＡ架橋剤の加水分解されていない内部エステル（下）と比較して、ｐＨ８．０のＤ２Ｏ中で上方にシフトしたＳＡ架橋剤の内部エステル（上）の加水分解を示す。半減期（ｔ１／２）は、ＴＥＡが存在する（やはり、ＰＥＩ系ヒドロゲルに存在する場合と同等の［Ｍ］）Ｄ２Ｏ中、ｐＨ８．０でのエステル結合で１９．８分であったが、ＴＥＡが存在しない場合（ｐＨ５又は６）には、２４時間にわたる１Ｈ ＮＭＲではエステル結合の加水分解は発生しなかった。
【0086】
ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルの加水分解を、結腸環境を模倣するために３７℃で評価した。図２０は、パネルＡ）ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲル、及びパネルＢ）ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルについて、３７℃と比較した室温での貯蔵弾性率Ｇ’値を示す。ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは３７℃で２４時間以内に分解したが、ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは温度（室温（ＲＴ）又は３７℃）に関係なく同じ速度で分解し、７時間存在した。温度の上昇により、ＰＥＩが触媒するヒドロゲルの加水分解がさらに加速されたと考えられる。ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは３７℃で、室温に維持したヒドロゲルと比較してより大きいＧ’値（３５７９Ｐａ）を示したが、ＳＡ＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、温度に関係なく７日間の膨潤の間安定であった。
【0087】
ヒドロゲルの組成に関係なく、ヒドロゲルを１００ｍＭ ＰＢＳに浸漬すると、最初の４時間後に貯蔵弾性率と膨潤の初期増加が発生した。図２１は、２４時間にわたるヒドロゲルの膨張を報告する。１０重量％ヒドロゲルのＳＡ架橋剤＋ＰＥＩは２４時間で加水分解したため、膨潤データは入手できなかった。ヒドロゲルの膨潤率は、膨潤の２４時間後に報告された。ヒドロゲルは、２４時間で平衡に達するか分解するまで膨潤した。すべてのヒドロゲルは、緩衝液中で初期重量の少なくとも２００％まで膨潤した。ヒドロゲルの重量パーセントを増加させると（ＳＡ架橋剤＋１０、１５、及び２０重量％のＰＥＩ）、それぞれ１５３％、２５９％、及び４１１％膨潤した。ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは３９６％膨潤した。ＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩ及びＳＶＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、それぞれ２７４％及び３７６％膨潤した。この吸収特性は、ポリペクトミー処置や他の医療処置における創傷被覆材としての使用など、組織を覆うのに役立つと考えられる。
【0088】
接着
生体外ブタ結腸組織へのヒドロゲルの接着を、Ｉｎｓｔｒｏｎ ５９４４ Ｍｉｃｒｏ－ｔｅｓｔｅｒで実施した。ヒドロゲルを混合し、２つの結腸組織片の間に配置した。結腸組織を２５ｍｍ×２５ｍｍ（１インチ×１インチ）片に分割し、ヒドロゲルを組織上で直接ゲル化させた。ヒドロゲルを結腸組織に適用する際、追加の組織片を「サンドイッチ式」で一番上に置いた（組織－ヒドロゲル－組織）。各サンプルにおいて、ヒドロゲルに接着している組織（結腸組織をメスで削り取ることで得た）は、結腸組織の粘膜層、又は粘膜下層のいずれかであった。湿潤チャンバー内で１時間ゲル化させた後、結腸組織上のヒドロゲルの接着についてＡＳＴＭ Ｄ３１６５プロトコルに従ってラップせん断試験を実施した。接着の失敗が検出されるまで、室温で５ｍｍ／分の速度で組織片を引き剥がした。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）として表される。
生体外ブタ結腸組織へのヒドロゲルの接着を、Ｉｎｓｔｒｏｎ ５９４４ Ｍｉｃｒｏ－ｔｅｓｔｅｒで実施した。ヒドロゲルを混合し、２つの結腸組織片の間に配置した。結腸組織を２５ｍｍ×２５ｍｍ（１インチ×１インチ）片に分割し、ヒドロゲルを組織上で直接ゲル化させた。ヒドロゲルを結腸組織に適用する際、追加の組織片を「サンドイッチ式」で一番上に置いた（組織－ヒドロゲル－組織）。各サンプルにおいて、ヒドロゲルに接着している組織（結腸組織をメスで削り取ることで得た）は、結腸組織の粘膜層、又は粘膜下層のいずれかであった。湿潤チャンバー内で１時間ゲル化させた後、結腸組織上のヒドロゲルの接着についてＡＳＴＭ Ｄ３１６５プロトコルに従ってラップせん断試験を実施した。接着の失敗が検出されるまで、室温で５ｍｍ／分の速度で組織片を引き剥がした。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）として表される。
【0089】
１５重量％のＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ、ＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩ、及びＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルの接着強度を、粘膜層が存在する場合と存在しない場合の結腸組織上で２５℃で測定した。これらのヒドロゲルは、ヒドロゲルにおけるＰＥＩ又は４アームＰＥＧ－ＮＨ２の存在により接着力が変化するかどうか、また、加水分解性ＳＡ架橋剤又は非加水分解性ＳＶＡ架橋剤が接着力に影響を与えるかどうかを決定するために選択された。いくつかのサンプルでは、ポリペクトミー後に結腸組織上の粘膜層をメスで除去し、粘膜下層をより適切なモデル組織に露出させた。図２２に示されるように、ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ、ＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩ、及びＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、無傷の粘膜層がある場合は、それぞれ０．１８Ｎ／ｃｍ２、０．３６Ｎ／ｃｍ２、及び０．０３Ｎ／ｃｍ２の平均接着強度を示し、無傷の粘膜層がない場合は、それぞれ０．３１Ｎ／ｃｍ２、０．２９Ｎ／ｃｍ２、及び０．６４Ｎ／ｃｍ２の平均接着強度を示した。図２２では、無傷の粘膜層を有する（黒色で示された左側のデータ）及び粘膜層を有しない（濃い灰色で示された右側のデータ）結腸組織上の厚さ１ｍｍのヒドロゲルの接着が示されている。＊ｐ＜０．０５。
【0090】
ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ及びＳＶＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは、無傷の粘膜層を有する組織に最もよく接着し、それぞれ０．１８Ｎ／ｃｍ２及び０．３６Ｎ／ｃｍ２の接着力値を示した。ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、粘膜層のない組織に最も強く接着した（０．６４Ｎ／ｃｍ２）（図２２）。この接着力の違いは、中性ＰＥＧと比較したカチオン性ＰＥＩと粘膜層との間の水素結合及び電荷－電荷相互作用に起因すると考えられる。粘液は、ＰＥＩなどの分子との水素結合や静電相互作用に利用できる糖タンパク質を含むアニオン性、疎水性、かつ粘弾性のネットワークである。一方、ＰＥＧは帯電しておらず、親水性であり、非接着性である。すべての特性は粘液への接着を遅らせると理解されている。ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは粘膜層のない結腸組織に最も強力に接着した。これは、おそらく組織基質との静電相互作用がないためである。結腸組織への接着を維持するには、少なくとも０．３Ｎ／ｃｍ２の力で十分であると考えられる。
【0091】
細胞毒性研究
１５重量％のヒドロゲルの細胞毒性を、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞に対して評価した。架橋剤及びＰＥＩ溶液を０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターに通した後、無菌条件下で混合及びゲル化した。ヒドロゲルの５０ｍｇ、２５ｍｇ、及び１０ｍｇ（±２．５ｍｇ）の部分を、透過性細胞培養インサート（ＰＥＳ、３μｍ孔）（Ｃｅｌｌ Ｔｒｅａｔ、２３０６３７）中に配置した。ヒドロゲルサンプルを含む透過性細胞培養インサートを滅菌脱イオン水中で４℃で１６時間インキュベートして膨潤させた。ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）をＤＭＥＭ＋１０％ＢＣＳ＋１％ＰＳ中、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％加湿空気中で培養した。実験では、すべての細胞は４～８継代であった。細胞を２４ウェルプレートに１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、１６時間接着させた。培地を交換し、膨潤したヒドロゲルを含む細胞培養インサートを、接着した細胞を含むウェルに移した。ヒドロゲルサンプルを、移す前に簡単に３７℃に平衡化した。ヒドロゲルを細胞の存在下で２４時間インキュベートした。細胞培養インサートを除去し、培地で１：９に希釈したＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ５４２１）を各ウェルに加えた。４時間後に吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。相対的な細胞生存率を、ヒドロゲルに曝露された細胞対曝露されていない対照で吸光度を正規化することによって決定した。すべての実験は３回繰り返して完了し、エラーバーは平均からの１標準偏差を表す。全てのヒドロゲルは、細胞毒性が最小限であることが判明した（＞８８％の細胞生存率）（図２３）。
１５重量％のヒドロゲルの細胞毒性を、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞に対して評価した。架橋剤及びＰＥＩ溶液を０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターに通した後、無菌条件下で混合及びゲル化した。ヒドロゲルの５０ｍｇ、２５ｍｇ、及び１０ｍｇ（±２．５ｍｇ）の部分を、透過性細胞培養インサート（ＰＥＳ、３μｍ孔）（Ｃｅｌｌ Ｔｒｅａｔ、２３０６３７）中に配置した。ヒドロゲルサンプルを含む透過性細胞培養インサートを滅菌脱イオン水中で４℃で１６時間インキュベートして膨潤させた。ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５８）をＤＭＥＭ＋１０％ＢＣＳ＋１％ＰＳ中、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％加湿空気中で培養した。実験では、すべての細胞は４～８継代であった。細胞を２４ウェルプレートに１．２５×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、１６時間接着させた。培地を交換し、膨潤したヒドロゲルを含む細胞培養インサートを、接着した細胞を含むウェルに移した。ヒドロゲルサンプルを、移す前に簡単に３７℃に平衡化した。ヒドロゲルを細胞の存在下で２４時間インキュベートした。細胞培養インサートを除去し、培地で１：９に希釈したＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ５４２１）を各ウェルに加えた。４時間後に吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。相対的な細胞生存率を、ヒドロゲルに曝露された細胞対曝露されていない対照で吸光度を正規化することによって決定した。すべての実験は３回繰り返して完了し、エラーバーは平均からの１標準偏差を表す。全てのヒドロゲルは、細胞毒性が最小限であることが判明した（＞８８％の細胞生存率）（図２３）。
【0092】
細菌の移動
大腸菌及びバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）はどちらも腸内によく見られ、感染症を引き起こすことが知られているため、これらの細菌の分離株を用いて細菌移動研究を行った。大腸菌は移動性が高く、ヒドロゲルを通過する可能性があると考えられる。Ｂ．フラジリス分離株は、多剤耐性を示し、敗血症を引き起こすことが知られている。病原性の可能性を持つこれら２つの一般的な腸内細菌を、ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ及びＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルを通過する能力について評価した。
大腸菌及びバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）はどちらも腸内によく見られ、感染症を引き起こすことが知られているため、これらの細菌の分離株を用いて細菌移動研究を行った。大腸菌は移動性が高く、ヒドロゲルを通過する可能性があると考えられる。Ｂ．フラジリス分離株は、多剤耐性を示し、敗血症を引き起こすことが知られている。病原性の可能性を持つこれら２つの一般的な腸内細菌を、ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩ及びＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルを通過する能力について評価した。
【0093】
寒天プレート上でのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験及び顕微鏡研究を実施した。寒天ベースのアッセイの利点は、個々の細菌が目に見えるコロニーになるまで約２４時間増殖することができるため、細菌細胞が少数でもヒドロゲルに侵入したかどうかを検出できることである。臨床分離株大腸菌（ＡＤＲ１２９Ｑ－ＳＭＣ９０９６）及びＢ．フラジリス（ＣＦＰＬＴＡ００４＿１Ｂ－ＳＭＣ９１０７）は、嚢胞性線維症の小児から得られた。ヒドロゲルの接種前に、大腸菌分離株をＬＢ（溶原性ブロス）中で好気的に一晩培養し、Ｂ．フラジリス分離株をＧａｓＰａｋシステムを使用して血液寒天（ＴＳＡ＋５％ヒツジ血液）上で嫌気的に４８時間培養した。ヒドロゲルディスク（直径８ｍｍ×高さ２．５ｍｍ）をＬＢ寒天（大腸菌の場合）又はＴＳＡ＋５％ヒツジ血液寒天（Ｂ．フラジリスの場合）上に置き、５μＬの細菌又はＰＢＳを各ヒドロゲルの最上部に加えた。次いで、プレートを好気的に（大腸菌）又は嫌気的に（Ｂ．フラジリス）で３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、ヒドロゲルを除去し、寒天プレートを各微生物にとって適切な条件下でさらに２４時間インキュベートすることで、微生物がヒドロゲルを通過できたかどうかの尺度としてヒドロゲルの下での細菌の増殖を試験した。増殖後、Ｂ．フラジリス分離株をこすり落として１ｍＬのＰＢＳに入れ、均質化した。Ｂ．フラジリスと大腸菌のそれぞれ１ｍＬを１６，０００×ｇで３０秒間遠心分離し、ＰＢＳに再懸濁した。次いで、各分離株を、寒天プレート実験についてはＰＢＳ中で１．０のＯＤ６００に、顕微鏡実験については、報告されているように（バイオプロジェクト登録番号ＰＲＪＮＡ５５７６９２）最少培地中で１．０のＯＤ６００に正規化した。培地のみで処理したウェルはバックグラウンド蛍光を決定するために使用し、分析前に各サンプルから差し引かれた。
【0094】
顕微鏡検査を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲで動作するＨａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ ４．０カメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立顕微鏡で行った。高速スキャンモードと２Ｘ２ビニングを使用し、Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ ４０ｘ ＤＩＣ Ｍ Ｎ２対物レンズを通して画像を取得した。画像をＩｍａｇｅＪで処理し、バックグラウンドを差し引いて、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｙ（ＩｎｔＤｅｎ）関数を通じてピクセルあたりの平均信号強度を測定することで信号強度を定量化した。顕微鏡研究のために、３００μＬのＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２を８ウェルプレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ、カタログ番号Ｃ８－１．５Ｈ－Ｎ）の各ウェルに接種した。細菌を視覚化するために、ヒドロゲル接種前に各培養物にＳｙｔｏ９を添加した。細菌培養物を、ヒドロゲルの最上部、又は最初にピペットチップで穴を開けたヒドロゲルの下のいずれかに接種した。インキュベーションの前後の両方でプレートを画像化し、最上部に接種した細菌がヒドロゲルを通過できるかどうかを判定した。結果は、これらの微生物がＳＡ＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルを横断しないことを示し、これはｉｎ ｖｉｖｏでの敗血症予防の可能性を示す。図２４は、ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルによる細菌の軽減を示す。大腸菌（左）とＢ．フラジリス（右）の存在を、細菌がウェルの底に接種された有孔ヒドロゲル（上の２つのパネル）と、細菌が表面に配置された無孔ヒドロゲル（下の２つのパネル）で評価した。３回の独立した実験が行われ、それぞれについて３回の技術的反復が行われた。明視野染色とＳｙｔｏ９染色を組み合わせた代表的な画像が示されている。ヒドロゲルの厚さは約１ｍｍであった。有孔ヒドロゲルの底部に添加された大腸菌及びＢ．フラジリスは顕微鏡で観察されたが（図２４、それぞれ左上及び右上）、無孔ヒドロゲルの最上部に添加された場合には存在しなかった（図２４、下のパネル）。
【0095】
ヒドロゲルによる細菌の軽減に対する影響を定量化するために、培地のみの対照からバックグラウンド蛍光を差し引いた後、ヒドロゲルの底部でＳｙｔｏ９シグナル強度を評価した。図２５は、ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲル上に大腸菌（上のグラフＡ）及びＢ．フラジリス（下のグラフＢ）を接種してから２４時間後のＳｙｔｏ９染色された細菌の測定された表面積を報告する。細菌の存在は３回の独立した実験で測定された。細菌が占める表面積を、細菌をウェルの底に接種した有孔ヒドロゲルと、細菌を表面に接種した無孔ヒドロゲルとの間で比較した。エラーバーは標準偏差を表し、＊、＊＊、及び＊＊＊＊は、それぞれ０．０５、０．０１、及び０．０００１未満のＰ値で有意な細菌表面積の差を示す。図２４の画像と一致して、有孔ヒドロゲルの底部に接種された細菌は、最上部に接種された対照と比較して、Ｓｙｔｏ９染色の上昇を示す（図２５）。ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルは、大腸菌及びＢ．フラジリスに対して少なくとも２４時間有効なバリアであることが判明した。対照的に、ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは３７℃の実験室条件下で加水分解したため、研究できなかった。
【0096】
ヒドロゲルを通した細菌の移動がないのは、細菌のサイズに対するヒドロゲルの孔径の結果である可能性がある。ヒドロゲルの孔径は、１μｍ未満から２０μｍまでの範囲であり、ＳＡ架橋剤＋４アーム－ＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルについて走査型電子顕微鏡で示されるように、孔同士は連結しておらず、メッシュ状ネットワークとなっていた（図２６）。大腸菌及びＢ．フラジリスの長さは約１．０～４．５μｍである。したがって、孔径と多孔度が細菌の動く曲がりくねった経路を生み出し、細菌の移動を阻害した。ＳＡ架橋剤＋ＰＥＩヒドロゲルは３７℃の実験室条件下で加水分解するため、この研究には適していなかった。
【0097】
寒天プレートアッセイの結果を図２７～２８に示す。図２７は、Ｂ．フラジリスがＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルを通過できるかどうかを、ヒドロゲルをＴＳＡ＋５％ヒツジ血液寒天上に置き、細菌をヒドロゲルの表面に適用し、その後２４時間及び４８時間の合計インキュベーション時間後の寒天上でのＢ．フラジリスの増殖を評価することにより、試験する。１回の実験につきｎ＝３の対照とｎ＝４～５個のバクテロイデス接種ヒドロゲルディスクを使用して、３回の独立した実験を行った。各プレートについて、細菌を陽性対照としてプレート上に直接スポットした（大きい矢印、左上）。独立したレプリケートごとに１つの代表的なプレートが表示される。各ヒドロゲルの頂端側に、１０μＬの滅菌ＰＢＳ又は１ＯＤ６００／ｍＬのＰＢＳ中の１０μＬのＢ．フラジリス培養物のいずれかを接種した。プレートを嫌気的に３７℃で２４時間インキュベートした（上段）。２４時間後、ヒドロゲルを除去し（中段）、プレートを同じ条件下でさらに２４時間インキュベートした（下段）。２４時間後、Ｂ．フラジリスの増殖はヒドロゲルの頂端側では明らかであったが、寒天上では見られなかった。これは、Ｂ．フラジリスが大量にヒドロゲルを通過しなかったことを示す。４８時間後、合計１４の技術的反復のうち１１で汚染が確認された。これらのうち、１０／１１は、ヒドロゲルをプレートから除去するときに発生したエッジ汚染である可能性が最も高い（黒い矢印）。実験１では、２４時間後にヒドロゲルをプレート上で裏返し、ヒドロゲルの頂端側でのＢ．フラジリの生存率を確認した。４８時間時点でのヒドロゲルの頂端側に由来する増殖は、Ｂ．フラジリスがまだ生存していたことを示す（小さい白い矢印、左下）。
【0098】
図２８は、ＬＢ寒天プレート上にヒドロゲルを配置し、ヒドロゲルの表面に大腸菌を適用し、その後の２４時間及び４８時間の合計インキュベーション時間後の寒天プレート上での大腸菌増殖を評価することによる、ＳＡ架橋剤＋４アームＰＥＧ－ＮＨ２ヒドロゲルについての大腸菌の結果を示す。３回の独立した実験を、１回の実験につきｎ＝３の対照及びｎ＝４～５の大腸菌接種ヒドロゲルディスクを用いて行った。独立したレプリケートごとに１つの代表的なプレートが表示される。各プレートについて、細菌を陽性対照としてプレート上に直接スポットした（大きい白い矢印、左上）。各ヒドロゲルの頂端側に、１０μＬの滅菌ＰＢＳ又は１ＯＤ６００／ｍＬのＰＢＳ中の１０μＬの大腸菌培養物のいずれかを接種した。プレートを３７℃で２４時間好気的にインキュベートした（上段）。２４時間後、ヒドロゲルを除去し（中段）、プレートを同じ条件下でさらに２４時間インキュベートした（下段）。２４時間後、大腸菌の増殖はヒドロゲルの頂端側で明らかであったが、無傷のまま残った大腸菌接種ヒドロゲルの寒天上では見られなかった（ｎ＝１１／１５）。これは、大腸菌が大量に寒天を通過しなかったことを示す。４８時間の時点で、ｎ＝８／１５のディスクでプレートの汚染が見られた（黒い矢印）。２４時間のすべて及び４８時間の大部分の汚染は、実験２中に発生した。これらのヒドロゲルは他の実験に比べてわずかに薄く、一部は２４時間で溶けていた。これが汚染の最も可能性の高い原因である。実験１では、２４時間後にヒドロゲルをプレート上で裏返し、ヒドロゲルの頂端側での大腸菌の生存率を確認した。４８時間の頂端側からの増殖は、大腸菌がまだ生存していたことを示す（小さい白い矢印、左下）。
【0099】
結腸組織サンプル上の標的部位での出口でのその後のヒドロゲル形成のために、デュアルルーメンカテーテルを通して架橋剤及びマクロマー成分を投与することにより、ヒドロゲルの適用及び取扱い性を調査した。デュアルルーメンカテーテルを使用した。このカテーテルは、生体内で内視鏡を通して結腸に挿入できるため、別個の装置は必要ない。デュアルルーメンカテーテルを通して空気圧を適用し、ヒドロゲル前駆体成分を創傷にスプレーしてその場でゲル化することができる。２つの部分からなるヒドロゲルシステムを、生体外の結腸組織に送達した。１２種類のヒドロゲル製剤すべてがデュアルルーメンカテーテルを通して注入され、その後重力に従う場合と重力に逆らう場合の両方でゲル化して結腸組織に接着した。
【0100】
実施例７
追加の架橋剤（架橋剤５、６、及び７）を、図２９に示すようにＰＥＧ（Ｍｗ３０００）から出発して合成した。簡潔に述べると、ＰＥＧ（Ｍｗ３０００）を適切な無水物と反応させてＰＥＧ二酸を形成し、その後ＮＨＳエステルで活性化して架橋剤１を得た。架橋剤１を１，８－ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）、及び１、５、及び１０メチレンのそれぞれのチオール末端カルボン酸と反応させて、それぞれ中間体２、３、及び４を得た。次に、ＮＨＳとのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップリング化学によってＮＨＳ活性化架橋剤を調製し、生成物をジエチルエーテル中での沈殿によって精製した。収率はすべての反応で８５～９８％であった。架橋剤の構造を、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＧＰＣ、ＭＡＬＤＩ、及びＤＳＣによって確認した。特性評価測定を、実施例６で述べたように実施した。データは次のとおりであった。
追加の架橋剤（架橋剤５、６、及び７）を、図２９に示すようにＰＥＧ（Ｍｗ３０００）から出発して合成した。簡潔に述べると、ＰＥＧ（Ｍｗ３０００）を適切な無水物と反応させてＰＥＧ二酸を形成し、その後ＮＨＳエステルで活性化して架橋剤１を得た。架橋剤１を１，８－ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）、及び１、５、及び１０メチレンのそれぞれのチオール末端カルボン酸と反応させて、それぞれ中間体２、３、及び４を得た。次に、ＮＨＳとのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップリング化学によってＮＨＳ活性化架橋剤を調製し、生成物をジエチルエーテル中での沈殿によって精製した。収率はすべての反応で８５～９８％であった。架橋剤の構造を、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＧＰＣ、ＭＡＬＤＩ、及びＤＳＣによって確認した。特性評価測定を、実施例６で述べたように実施した。データは次のとおりであった。
【0101】
ＰＥＧ二酸：ＰＥＧ二酸化合物の合成は、以前に報告されたプロトコルに基づいていた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ１．９３（ｑ，Ｊ＝７．２１Ｈｚ，４Ｈ），２．４（ｔｔ，Ｊ＝７．２１，８Ｈ），３．６２（ｍ，２９２Ｈ），４．２２（ｔｔ，Ｊ＝４．７３Ｈｚ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：１７５．３，１７２．８，７０．６，６８．９，６３．４，３３．１，３２．６，１９．９ｐｐｍ。
【0102】
架橋剤１．出発物質の合成は、以前に報告されたプロトコルに基づいていた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ４．１５（ｔｔ，Ｊ＝３．３，１．５，４Ｈ），３．５４（ｍ，２９６Ｈ），２．８（ｂ，８Ｈ），２．６（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．４（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．０（ｑ，Ｊ＝７．３，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：１７２．３，１６９．０，１６８．０，７０．５，６９．０，６３．６，３２．４，２９．９，２５．５，１９．７ｐｐｍ。
【0103】
中間体２．合成は、以前に報告されたプロトコルに基づいていた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ４．２１（ｍ，Ｊ＝４．６，４．９，４Ｈ），３．６２（ｍ，２９６Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝７．２，４Ｈ），１．９８（ｔ，Ｊ＝７．２，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：１９６．８，１７２．６，１６９．８，７０．６，６９．０，６３．６，４２．３，３２．８，３１．０，２０．５ｐｐｍ。
【0104】
中間体３．火炎乾燥させたフラスコ中で、１，８－ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ－７－エン（２６５μＬ）及び６－メルカプトヘキサン酸（１２２μＬ）を、架橋剤１（１ｇ）の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に加えた。溶液を室温で１６時間撹拌した。有機相を１Ｍ ＨＣｌ溶液、水、及びブラインで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、ジエチルエーテル中で沈殿させた。沈殿物を濾過し、真空下で乾燥させて、中間体３を白色固体として得た（収率９６％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ４．２２（ｔ，Ｊ＝４．８，４Ｈ），３．６３（ｍ，３０８Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝７．２，４Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．４，４Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．４，４Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），１．６０（ｍ，８Ｈ），１．３９（ｍ，４Ｈ），ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：１９８．６，１７６．１，１７２．７，７０．７，６９．０，４２．８，３３．５，３２．９，２９．２，２８．５，２８．１，２４．２，２０．６ｐｐｍ。
【0105】
中間体４．合成は、チオール源として１１－メルカプトウンデカン酸（０．１９０ｇ）を使用して上記の手順に従って行った（収率９２％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ４．２２（ｔ，Ｊ＝４．９，４Ｈ），２．８５（ｔ，Ｊ＝７．４，７．３，４Ｈ），２．６０（ｔ＝７．３，４Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．５，４Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），１．６０（ｍ，８Ｈ），１．３９（ｍ，２４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：１９８．７，１７６．５，１７２．７，７０．５，６９．０，６３．５，３３．８，３２．９，２９．４，２９．３，２９．２，２９．１，２９．０，２８．９５，２８．８，２８．７，２４．７，２０．６ｐｐｍ。
【0106】
架橋剤５、６及び７．架橋剤５、６、及び７の合成は、以前に報告されたプロトコルに基づいていた（収率９６～９８％）。
架橋剤５．１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ４．１６（ｔ，Ｊ＝４．３，４Ｈ），３．９２（ｓ，４Ｈ），３．５７（ｍ，２５７Ｈ），２．７８（ｂ，８Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），１．９５（ｑ，Ｊ＝７．３，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ ｐｐｍ；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｐｏｓ）：Ｍｗ：３７６３ｍ／ｚ；ＧＰＣ：Ｍｎ：５０７７；Ｍｗ：５３１２；ＰＤＩ：１．０５；Ｍｐ（ＤＳＣ）：４６．０６℃。
架橋剤５．１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ４．１６（ｔ，Ｊ＝４．３，４Ｈ），３．９２（ｓ，４Ｈ），３．５７（ｍ，２５７Ｈ），２．７８（ｂ，８Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），１．９５（ｑ，Ｊ＝７．３，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ ｐｐｍ；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｐｏｓ）：Ｍｗ：３７６３ｍ／ｚ；ＧＰＣ：Ｍｎ：５０７７；Ｍｗ：５３１２；ＰＤＩ：１．０５；Ｍｐ（ＤＳＣ）：４６．０６℃。
【0107】
架橋剤６．１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ４．２１（ｔｔ，Ｊ＝１．５，３．４，４Ｈ），３．６３（ｍ，２９０Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），２．８１（ｂ，８Ｈ），２．６０（ｔｔ，Ｊ＝２．５，４．９，８Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ），１．９６（ｑ，Ｊ＝７．３，７．４，４Ｈ），１．７４（ｑ，Ｊ＝７．４，７．７，４Ｈ），１．５９（ｍ，４Ｈ），１．４６（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ１９８．６，１７２．７，１６９．１，１６８．４，７０．５，６９．１，６３．６，４２．９，３３．０，２９．１，２８．４，２７．８，２５．６，２４．１，２０．６ｐｐｍ；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｐｏｓ）：Ｍｗ：３８０７ｍ／ｚ；ＧＰＣ：Ｍｎ：４９９９；Ｍｗ：５１９６；ＰＤＩ：１．０４；Ｍｐ（ＤＳＣ）：４５．８０℃。
【0108】
架橋剤７．１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ４．２２（ｍ，４Ｈ），３．６２（ｍ，２７８Ｈ），２．８５（ｍ，８Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝７．２，７．３，２Ｈ），２．６０（ｔｔ，Ｊ＝７．３，４Ｈ）），２．４５（ｔ，Ｊ＝７．２，７．４，４Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝７．２，７．３，４Ｈ），２．０４（ｑ，Ｊ＝７．２，７．４，４Ｈ），１．９５（ｍ，４Ｈ），１．７１（ｍ，２Ｈ），１．５２（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｍ，１０Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ），ＣＤＣｌ３：δ１９８．８，１７２．７，１６９．２，１６８．６，７０．５，６９．０，６３．５，４２．８，３２．９，３０．９，２９．５，２９．３，２９．２，２９．０，２８．８，２８．７，２５．６，２４．５，２０．６ｐｐｍ；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｐｏｓ）：Ｍｗ：４２１０ｍ／ｚ；ＧＰＣ：Ｍｎ：６０３８；Ｍｗ：６３１３；ＰＤＩ：１．０５；Ｍｐ（ＤＳＣ）：４７．４２℃。
【0109】
実施例８
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した実施例７の架橋剤（すなわち、架橋剤５、６、及び７）を０．３Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｍｗ１８００）と混合することによって、１０重量％、１５重量％、及び２０重量％のヒドロゲルを調製した。緩衝液中での架橋剤７の溶解度は最小限であることが観察され、これはその構造内のメチレン鎖の疎水性によるものと考えられる。溶解度の低さを克服するために、ＰＥＩ溶液と混合する前に、架橋剤７を５０％エタノールを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させた。ＰＥＩ及びそれぞれの架橋剤のアミド化を確実にするために、ＮＨＳ：ＮＨ２の比は２：１であった。２：１又は１：１のＮＨＳ：ＮＨ２比では、ヒドロゲルの機械的特性に大きな違いは観察されなかった。逆さチューブゲル化試験により測定したところ、すべての組成物（各ヒドロゲル５、６、及び７）について５分以内に透明な固体ヒドロゲルが形成された（実施例６の考察を参照）。ヒドロゲルのゲル化時間は、疎水性鎖の長さの増加と正の相関があることが判明した。図３０に示すように、架橋剤５、６、及び７を用いて調製されたヒドロゲルは、それぞれ５秒未満、９０秒未満、及び３～５分未満でゲル化した。図３０は、以下のことを報告している：パネルＡ）１０重量％、１５重量％、及び２０重量％のヒドロゲルのゲル化時間；パネルＢ）１０重量％、１５重量％、及び２０重量％のヒドロゲル７の貯蔵弾性率；パネルＣ）１５重量％のヒドロゲル５、６、及び７の貯蔵弾性率；パネルＤ）１５重量％ヒドロゲルの経時的な膨潤。ゲル化時間は重量パーセントと正の相関があることも判明した。つまり、重量パーセントが高いほどゲル化時間が長くなる。
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した実施例７の架橋剤（すなわち、架橋剤５、６、及び７）を０．３Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｍｗ１８００）と混合することによって、１０重量％、１５重量％、及び２０重量％のヒドロゲルを調製した。緩衝液中での架橋剤７の溶解度は最小限であることが観察され、これはその構造内のメチレン鎖の疎水性によるものと考えられる。溶解度の低さを克服するために、ＰＥＩ溶液と混合する前に、架橋剤７を５０％エタノールを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させた。ＰＥＩ及びそれぞれの架橋剤のアミド化を確実にするために、ＮＨＳ：ＮＨ２の比は２：１であった。２：１又は１：１のＮＨＳ：ＮＨ２比では、ヒドロゲルの機械的特性に大きな違いは観察されなかった。逆さチューブゲル化試験により測定したところ、すべての組成物（各ヒドロゲル５、６、及び７）について５分以内に透明な固体ヒドロゲルが形成された（実施例６の考察を参照）。ヒドロゲルのゲル化時間は、疎水性鎖の長さの増加と正の相関があることが判明した。図３０に示すように、架橋剤５、６、及び７を用いて調製されたヒドロゲルは、それぞれ５秒未満、９０秒未満、及び３～５分未満でゲル化した。図３０は、以下のことを報告している：パネルＡ）１０重量％、１５重量％、及び２０重量％のヒドロゲルのゲル化時間；パネルＢ）１０重量％、１５重量％、及び２０重量％のヒドロゲル７の貯蔵弾性率；パネルＣ）１５重量％のヒドロゲル５、６、及び７の貯蔵弾性率；パネルＤ）１５重量％ヒドロゲルの経時的な膨潤。ゲル化時間は重量パーセントと正の相関があることも判明した。つまり、重量パーセントが高いほどゲル化時間が長くなる。
【0110】
次に、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用してヒドロゲルの形態を特性評価した。全てのヒドロゲルは、５μｍから１００μｍまでの様々な孔径を有し、ハニカム状構造を有していた。ヒドロゲル７は、他のヒドロゲルとは異なり、より層状の構造を示した。図３１は、ヒドロゲル５（上）、６（中央）、及び７（下）のＳＥＭ画像を示す。この観察された二次構造のため、ピレンアッセイを使用して架橋剤７の臨界凝集濃度（ＣＡＣ）を評価した。０．０５０ｍＭのＣＡＣが観察され、これはヒドロゲル架橋剤濃度（０．０５３ｍＭ）よりも低い濃度であった。これは、ヒドロゲル自体の中に自己組織化構造が形成され、ＳＥＭで見られる層状構造が生じていることを示している。化学反応性の観点から見ると、ＰＥＩの末端アミンは末端ＮＨＳエステル又は内部チオエステルと反応してアミド結合を形成し得る。アミンの優先攻撃部位を、１Ｈ ＮＭＲによって決定した。具体的には、Ｎ－ブチルアミンをＰＥＩの第一級末端アミンのモデルとして使用し、架橋剤６を含む水溶液に添加した。アミド化反応を、１Ｈ ＮＭＲによって追跡した。選択的反応性は、ＰＥＩと架橋剤のＮＨＳエステルとの間で観察され、内部チオールエステルでは観察されなかった（２０分間でＮＨＳ部位で＞９９％）。ＮＨＳエステルのアミド化は架橋剤６上の２．８２ｐｐｍの結合ＮＨＳエステルから２．４９ｐｐｍの遊離ＮＨＳへの高磁場シフトによって確認されたが、チオエステルの２．６ｐｐｍのメチレンピークはシフトしない。図３２は、ＰＥＩ模倣物である４－ブチルアミンとの反応前（太線）及び反応後（細線）の架橋剤６の代表的な１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。４－ブチルアミンと反応したとき、ＮＨＳエステルが架橋剤６から切断された後、架橋剤６に結合したＮＨＳピークのシフトが２．７８ｐｐｍ（太線）から２．４９ｐｐｍ（細線）で観察された。図３３は、無傷の架橋剤６（下）（２．７８ｐｐｍのＮＨＳ）、及び０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０中のＮＨＳ加水分解（２．５４ｐｐｍ）架橋剤６（上）の代表的な１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【0111】
ＮＨＳエステルに対する末端アミンの攻撃は１０秒未満と迅速に起こったが、ヒドロゲルではこの反応はおそらく遅くなる。その理由は、アミンの１つがＮＨＳエステルを攻撃すると、絡み合いと固化が起こると考えられ、その結果、立体障害が増加すると考えられるからである。したがって、ゲル化時間が長くなる。さらに、ＮＨＳエステルでは競合的な加水分解反応が生じた。図３４は、パネルＡ）０．３Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０中の架橋剤５におけるチオエステル加水分解の速度順序；パネルＢ）０．３Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０中の架橋剤６におけるチオエステル加水分解の速度順序；及びパネルＣ）０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中でのＮＨＳエステルの安定性を示す。しかし、ＮＨＳエステルの加水分解は、ｐＨ６．５では２０分間にわたって無視でき、これはヒドロゲルを調製するのに十分な時間を超えている（パネルＣ）を参照）。ＮＨＳエステルにおけるアミド化のこの選択性により、内部チオエステル結合が確実に保持され、システインメチルエステル（ＣＭＥ）による溶解が可能になる。
【0112】
機械的特性に関しては、５０ｍＭ ＰＢＳでの膨潤の前後の様々な時点でひずみと周波数のスイープを実行した。まず、ひずみスイープを使用して線形粘弾性領域を決定した（図３５（左））。周波数スイープを、１から１０Ｈｚまで、３％ひずみですべてのヒドロゲルに対して実行した（図３５（右））。これらのヒドロゲルは、貯蔵弾性率（Ｇ’）＞損失弾性率（Ｇ”）という粘弾性の固体のような挙動を示した。
【0113】
図３６は、１０重量％（左）及び２０重量％（右）の架橋剤５、６、及び７をそれぞれ用いて調製されたヒドロゲル５、６、及び７の貯蔵弾性率を報告する。また、図３７は、１０重量％、１５重量％、及び２０重量％の架橋剤５（左）、６（中央）、及び７（右）を用いて調製されたヒドロゲルの、３０日間の膨潤又は溶解までの貯蔵弾性率を報告する。３０日間の膨潤にわたって、ヒドロゲル５で最も低い貯蔵弾性率が観察され、膨潤後の一定期間１０ｋＰａ未満のＧ’が維持された。架橋剤６及び７を用いて調製されたヒドロゲルの貯蔵弾性率はどちらもより大きく、１５重量％でのピーク貯蔵弾性率はそれぞれ約１２ｋＰａ及び２０ｋＰａであった。各ヒドロゲルの貯蔵弾性率のこの増加は、メチレンの疎水性に起因すると考えられ、メチレン鎖長が長くなるほど疎水性相互作用が大きくなり、ヒドロゲルがより強力になる。この観察は重量パーセント依存性にも当てはまり、重量パーセントが高くなるほど、貯蔵弾性率は大きくなる。
【0114】
図３８は、２０重量％のヒドロゲルの膨潤を報告する。図３９は、０．３Ｍ ＣＭＥ溶液、ｐＨ８．６に浸漬した際の、１０重量％（左）及び２０重量％（右）の架橋剤５、６、及び７をそれぞれ用いて調製されたヒドロゲル５、６、及び７の溶解を報告する。図４０は、架橋剤６から２：１（黒色）又は１：１（灰色）のＮＨＳ：ＮＨ２モル比で調製されたヒドロゲルのレオロジー測定を報告する。図４１は、ＥｔＯＨを使用した場合と使用しない場合の、架橋剤６から作製されたヒドロゲルのレオロジー測定を報告する。
【0115】
架橋剤７を用いて調製されたヒドロゲルの貯蔵弾性率がエタノールの存在によって増加しないことを確認するために、架橋剤７について使用したヒドロゲルと同じ条件下で、架橋剤６を用いて調製されたヒドロゲルのレオロジー測定を行った。ＥｔＯＨの有無にかかわらず調製されたヒドロゲルの間で貯蔵弾性率の有意差は観察されず、緩衝条件がヒドロゲルの機械的特性を変えなかったことを示している（図４１）。
【0116】
３０日間の膨潤中に、ヒドロゲルは、ヒドロゲル製剤の重量パーセント及び疎水性に応じて、１５０～３５０％膨潤した（図３８）。すべてのヒドロゲルの膨潤は４８時間後に平衡に達した。架橋剤７を使用して調製されたヒドロゲルは、おそらく長いメチレン鎖長内の疎水性の結果として膨潤が最も少なく、一方、架橋剤５を使用して調製されたヒドロゲルは最も膨潤した。
【0117】
全体構造の損失と経時的な貯蔵弾性率の低下によって示されるように、すべてのヒドロゲルは３０日間の膨潤にわたって加水分解を受けた。ヒドロゲル５は貯蔵弾性率と全体構造の即時損失を示したが、ヒドロゲル６及び７は膨潤するにつれて強度が増加した。しかしながら、ヒドロゲル６及び７では、膨潤後３０日までに貯蔵弾性率の低下が観察された。この構造と機械的特性の損失は、架橋剤の加水分解に起因すると考えられる。加水分解をさらに特性評価するために、架橋剤の加水分解速度を、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０中で、１Ｈ ＮＭＲによって測定した。加水分解は、架橋剤５及び６についてそれぞれｋ＝０．０５５ｍｉｎ－１及びｋ＝０．００３ｍｉｎ－１の速度で、チオエステル結合で優先的に起こることが観察された（図３４）。これは、架橋剤のグルタル酸とＰＥＧとの間のエステル結合とは対照的である。ヒドロゲル７は７日間以上安定であった。架橋剤７におけるチオエステル結合の安定性は、隣接するチオエステルを加水分解から保護する疎水性メチレン鎖の長さに起因すると考えられた（図９を参照）。加水分解とは別に、チオエステルはシステインメチルエステル（ＣＭＥ）の存在下でのチオール－チオエステル交換を通じてヒドロゲルの溶解を促進した。ヒドロゲルをｐＨ８．６の０．３Ｍ ＣＭＥ溶液に曝露すると、システインメチルエステルのチオールが架橋剤の内部チオエステルを攻撃して置換すると考えられる。内部システインメチルエステルのアミンは、その後再配列されて、チオエステルを置換することによってアミド結合を形成すると考えられる（図２９を参照）。このアミド結合は、元の内部チオールの再攻撃を防ぐと考えられる。この溶解プロセスによりヒドロゲルのネットワークが断片化され、時間の経過とともにヒドロゲルが分解されると考えられる。ＣＭＥ溶液中のヒドロゲルの貯蔵弾性率を、ｐＨ８．６における時間の関数として評価した。Ｇ’＜３００Ｐａで定義される完全な溶解は、ヒドロゲルの配合と重量パーセントに応じて１０分未満から９０分以上で起こることが判明し、重量パーセントが高くなるほどメチレン鎖長が長くなり、完全に溶解するまでの時間が長くなる。図４２は、パネルＡ）０．３Ｍ ＣＭＥ溶液中の１５重量％のヒドロゲルの溶解；パネルＢ）ラップせん断試験を使用したヒト乳房組織へのヒドロゲルの接着；及びパネルＣ）熱傷させた及び未熱傷のヒト腹部組織への１５重量％ヒドロゲル６の接着を示す。図３９も参照されたい。具体的には、１５重量％では、ヒドロゲル５は１０分以内に溶解し、ヒドロゲル６は３０分以内に溶解し、ヒドロゲル７は８０分以内に溶解した。この傾向は、重量パーセントに関係なく、すべてのヒドロゲルにわたって継続した。ヒドロゲル７のこの遅い溶解は、ヒドロゲル５及び６と比較して、チオエステル近くの追加の疎水性メチレンが局所的な親水性を低下させることに起因すると考えられる。水の加水分解とチオール－チオエステル交換の間のチオエステルにおける競合反応のため、重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０中のＣＭＥを使用した溶解速度を、架橋剤６を用いて１Ｈ ＮＭＲにより研究した。チオエステルに隣接するメチレンプロトンの減少をモニタリングしたところ、チオール－チオエステル交換速度はｋ＝０．０８４ｍｉｎ－１であると決定された。この速度は加水分解の速度よりも速かったため、チオール－チオエステル交換が０．３Ｍ ＣＭＥ溶液条件下での好ましい溶解様式であることを示していると解釈された。
【0118】
ヒドロゲルの接着特性をヒトの皮膚に対して研究した。生体外のヒトの乳房組織及び腹部組織における接着強度を測定するために、ラップせん断試験を実施した。全てのヒドロゲルは、約０．５Ｎ／ｃｍ２の値で同様に組織に接着し、ヒドロゲルと皮膚の界面で凝集破壊を示した（図４２）。さらに、ヒドロゲルは健康な皮膚だけでなく熱傷させた皮膚にも同様に接着した。この接着強度は、ヒドロゲルとヒトの皮膚の間の物理的な絡み合いに起因すると考えられる。
【0119】
ｉｎ ｖｉｖｏ研究の前に、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を使用して細胞毒性を評価した。図４３は、架橋剤５、６、７及びＰＥＩを用いて調製されたヒドロゲルの、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞に対する細胞生存率を報告する。ヒドロゲル６及び７は＞８５％の生存率を示したが、ヒドロゲル５は非常に低い生存率を示した。これは、グルタル酸の急速な放出と溶解による局所的な酸性度の増加によるものと考えられる。
【0120】
これらの結果のまとめに基づいて、１５重量％のヒドロゲル６をｉｎ ｖｉｖｏ試験用に選択した。ヒドロゲル６は、非毒性の、ヒトの皮膚と同程度の貯蔵弾性率を示し、７日間にわたって機械的強度と構造を維持し、皮膚に付着し、膨潤し、３０分で溶解した。ｉｎ ｖｉｖｏモデルでは、真鍮シリンダーを８０℃に加熱し、ブタの背中に２０秒間置くことにより、４頭のブタにＩＩ度熱傷を誘発させた。図４４に示すように、被覆材を１回又は２回交換して、治療群を７日目及び１４日目に群間の治癒の違いを観察することで評価した。ヒドロゲル６を、ガーゼスポンジ被覆材、Ｍｅｐｉｌｅｘ（登録商標）、及びｘｅｒｏｆｏｒｍと比較した。トリプル抗生物質軟膏（ｔｒｉｐｌｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｏｉｎｔｍｅｎｔ）を各熱傷に塗布してから被覆材をした。剖検後、組織を解剖し、ヘマトキサリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。図４４は、パネルＡ）実験の概略図；パネルＢ）熱傷部位の代表的な写真と組織学；パネルＣ）壊死と血管新生の組織学的スコアを示す。
【0121】
図４５～４９及び表５～９は、サンプルから得られたデータを報告する。図４５は、ガーゼ（左）、被覆材なし（中央）、及びヒドロゲル被覆材（右）についての群１のＨ＆Ｅを示す（表５を参照）。図４６は、ガーゼ（左）、被覆材なし（中央）、及びヒドロゲル被覆材（右）についての群１のＨ＆Ｅを示す（表６を参照）。図４７は、ガーゼ（左）、被覆材なし（中央）、及びヒドロゲル被覆材（右）についての群２のＨ＆Ｅを示す（表７を参照）。図４８は、ガーゼ（左）、被覆材なし（中央）、及びヒドロゲル被覆材（右）についての群４のＨ＆Ｅを示す（表８を参照）。図４９は、ガーゼ（左）、被覆材なし（中央）、及びヒドロゲル被覆材（右）についての群５のＨ＆Ｅを示す（表９を参照）。表５～９は、炎症及び炎症性細胞種の平均±ＳＤ、中央値及び発生率を示す。
【0122】
【表5】
【0123】
【表6】
【0124】
【表7】
【0125】
【表8】
【0126】
【表9】
【0127】
総じて、すべての治療群で軽度／中度の壊死、表皮潰瘍形成、炎症、及び血管新生が見られた。しかしながら、ヒドロゲル６は、他の治療群よりも少ない壊死、表皮潰瘍形成、及び炎症を示し、１４日目までにすべての治療群と同様の血管新生、熱傷深さ（ｍｍ）及び表皮真皮厚さ（ｍｍ）を示した（図４４、パネルＣ））。さらに、すべてのヒドロゲルは１４日目までにある程度の再上皮化を示し、ヒドロゲル６は２回の被覆材交換後に２つの熱傷で完全な再上皮化、及び１つの熱傷で部分的な再上皮化を示した（Ｎ＝３）。これは複数の熱傷で完全な再上皮化を示した唯一の被覆材である。熱傷で完全な再上皮形成を示した治療群には、１４日目のヒドロゲル６（被覆材交換１回）と、１４日目の滅菌ガーゼ被覆材（被覆材交換２回）のみが含まれる。群間の差は統計的に有意ではないが（Ｐ＞０．０５）、ヒドロゲル６は従来のガーゼ、Ｍｅｐｉｌｅｘ（登録商標）、及びｘｅｒｏｆｏｒｍ被覆材よりも優れた性能を示す傾向があった。我々のヒドロゲルのスプレー塗布及び除去プロセスにより、被覆中の塗布及びデブリードマンが容易になり、機械的なデブリードマンや新たに形成された組織の破壊が不要になる。図５０は、熱傷被覆材として使用されるヒドロゲル６の溶解の概略図を示す。ガーゼを０．３Ｍ ＣＭＥ溶液に浸し、ヒドロゲル６熱傷被覆材の上に１０分間置き、被覆剤の溶解を誘導した。続いて、Ｈ２Ｏに浸したガーゼで熱傷の部分を拭き、創傷の上に新しいヒドロゲル被覆材を準備した。
【0128】
実施例９
本開示による追加のヒドロゲルを調製する。マクロマーは、アルケン官能部分を特徴とする、ＰＥＧ系マクロマー又はポリ（１，２－グリセロールカルボナート）（ＰＧＣ）系マクロマーのいずれかである。架橋剤は、チオール部分を特徴とするＰＥＧ系架橋剤である（実施例９を参照）。これらの成分を、ｐＨ７～８の範囲のリン酸緩衝液に、１０重量％～２５重量％の範囲の総ポリマー濃度で溶解させる。ゲル溶液の重量パーセントが増加すると、ゲル化時間が短くなり、ゲルの弾性率が増加する。アルケン部分とチオール部分との間のモル比は、ゲル製剤中で１：１から２：１の間の範囲であり得る。１：１の比率は、２：１の比率と比較して、ゲルの弾性率のわずかな増加をもたらす。アルケン官能部分は、図２Ｃ及び２Ｄに示されるアルキルエーテル、又は図２Ｅ及び２Ｆに示されるノルボルネンなどであるがこれらに限定されない多くの異なる構造を包含する。上記部分の選択はゲル化時間に影響し、ノルボルネンではアルキルエーテルよりも反応速度が速くなる。マクロマーは、１分子あたり４～１００個のアルケン部分を特徴とし得る。より多量のアルケン部分を特徴とするマクロマーは、より硬いゲルとより低い膨潤率をもたらす。架橋剤は、１分子当たり２～４個のチオールを含有し得る。ゲル前駆体溶液は、使用する光開始剤に応じて、３６５ｎｍＵＶ光又は白色光を照射されるまで固化しない。光開始剤は、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）又はエオシンＹである。光開始剤の濃度は、光開始剤とゲル化速度に応じて０．１ｍＭ～１００ｍＭの範囲であり、光開始剤の濃度が高いほど速度は速くなる。非常に高濃度では、ゲルのマクロ構造が破壊される可能性があり、細胞毒性の危険性があると考えられる。可視光システムの場合、ゲル化速度を高めるためにチロシンエチルエステルが最大１０ｍＭ含まれる。これらのゲルは、４～１２０ｍＷ／ｃｍ２の広範囲のＵＶ（３６５ｎｍ）強度及び１０ｍＷ／ｃｍ２（光開始剤の最大吸収時）から４２．９Ｗ／ｃｍ２フルスペクトル白色光の白色光下で形成される。
本開示による追加のヒドロゲルを調製する。マクロマーは、アルケン官能部分を特徴とする、ＰＥＧ系マクロマー又はポリ（１，２－グリセロールカルボナート）（ＰＧＣ）系マクロマーのいずれかである。架橋剤は、チオール部分を特徴とするＰＥＧ系架橋剤である（実施例９を参照）。これらの成分を、ｐＨ７～８の範囲のリン酸緩衝液に、１０重量％～２５重量％の範囲の総ポリマー濃度で溶解させる。ゲル溶液の重量パーセントが増加すると、ゲル化時間が短くなり、ゲルの弾性率が増加する。アルケン部分とチオール部分との間のモル比は、ゲル製剤中で１：１から２：１の間の範囲であり得る。１：１の比率は、２：１の比率と比較して、ゲルの弾性率のわずかな増加をもたらす。アルケン官能部分は、図２Ｃ及び２Ｄに示されるアルキルエーテル、又は図２Ｅ及び２Ｆに示されるノルボルネンなどであるがこれらに限定されない多くの異なる構造を包含する。上記部分の選択はゲル化時間に影響し、ノルボルネンではアルキルエーテルよりも反応速度が速くなる。マクロマーは、１分子あたり４～１００個のアルケン部分を特徴とし得る。より多量のアルケン部分を特徴とするマクロマーは、より硬いゲルとより低い膨潤率をもたらす。架橋剤は、１分子当たり２～４個のチオールを含有し得る。ゲル前駆体溶液は、使用する光開始剤に応じて、３６５ｎｍＵＶ光又は白色光を照射されるまで固化しない。光開始剤は、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）又はエオシンＹである。光開始剤の濃度は、光開始剤とゲル化速度に応じて０．１ｍＭ～１００ｍＭの範囲であり、光開始剤の濃度が高いほど速度は速くなる。非常に高濃度では、ゲルのマクロ構造が破壊される可能性があり、細胞毒性の危険性があると考えられる。可視光システムの場合、ゲル化速度を高めるためにチロシンエチルエステルが最大１０ｍＭ含まれる。これらのゲルは、４～１２０ｍＷ／ｃｍ２の広範囲のＵＶ（３６５ｎｍ）強度及び１０ｍＷ／ｃｍ２（光開始剤の最大吸収時）から４２．９Ｗ／ｃｍ２フルスペクトル白色光の白色光下で形成される。
【0129】
ＵＶ活性化ヒドロゲルの場合、マクロマーと架橋剤の濃度と比率を変更することで、貯蔵弾性率を５００Ｐａ～２，０００Ｐａの間で調整できる。これらの配合物は単一溶液であり、内視鏡の長さ方向に沿ってシングルルーメンカテーテルを介して適用するのに適した粘度を示す。これらの配合物は、長波ＵＶ光に反応して速い反応速度で刺激応答性のゲル化を利用し、照射後５秒以内にゲルを形成する。このゲルはブタの結腸組織に接着し、小さい欠損を封止するために使用すると強い破裂圧力を示す。ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、内視鏡カテーテルを使用してコンポーネントを適用するために行われる。得られるゲルは適用後２．５時間でもまだ存在する。得られるゲルは細胞毒性が低く、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞において２４時間にわたって９７％以上の生存率を示す。この光開始剤は、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞においてＩＣ５０未満の濃度で使用されるが、１０ｍＭまでのチロシンエチルエステルと組み合わせると、自転車ライト、ランプ、内視鏡などの広範囲の白色光源に応答して高速（１０秒未満）のゲル化反応速度を示す。
【0130】
実施例９
図５１に示すように、チオール部分を有する追加の架橋剤をＰＥＧ（Ｍｗ３０００）から出発して合成した。これらの架橋剤は、実施例１０及び１１でさらに説明する、分枝状ＰＥＩ－チオールと二官能性マレイミド活性化ＰＥＧ架橋剤との間のマイケル付加反応を介してｉｎ ｓｉｔｕで形成されるヒドロゲルの形成に関する研究用に調製された。この架橋剤内には内部チオエステル結合があり、システインメチルエステル（ＣＭＥ）溶液とのチオール－チオエステル交換によって溶解しやすくなる。チオール－チオエステル交換後、ＣＭＥの第一級アミンが再配列されて不可逆的なアミド結合を形成し、ポリマーネットワークが崩壊した後のヒドロゲルの再形成を防止すると考えられる（図８参照）。ＰＥＧ架橋剤を、メチレン鎖長が２、３、又は４になるように調製した。メチレン鎖の長さを変化させることで、ヒドロゲルの機械的特性、膨潤、溶解時間、及び破裂圧力への依存性を決定した。ヒドロゲルは、チオール－チオエステル交換による溶解のための内部チオエステルと、超分岐ポリ（エチレンイミン）－チオール（「ＰＥＩ－ＳＨ」）との結合のためのマレイミド末端基を含んでいた。
図５１に示すように、チオール部分を有する追加の架橋剤をＰＥＧ（Ｍｗ３０００）から出発して合成した。これらの架橋剤は、実施例１０及び１１でさらに説明する、分枝状ＰＥＩ－チオールと二官能性マレイミド活性化ＰＥＧ架橋剤との間のマイケル付加反応を介してｉｎ ｓｉｔｕで形成されるヒドロゲルの形成に関する研究用に調製された。この架橋剤内には内部チオエステル結合があり、システインメチルエステル（ＣＭＥ）溶液とのチオール－チオエステル交換によって溶解しやすくなる。チオール－チオエステル交換後、ＣＭＥの第一級アミンが再配列されて不可逆的なアミド結合を形成し、ポリマーネットワークが崩壊した後のヒドロゲルの再形成を防止すると考えられる（図８参照）。ＰＥＧ架橋剤を、メチレン鎖長が２、３、又は４になるように調製した。メチレン鎖の長さを変化させることで、ヒドロゲルの機械的特性、膨潤、溶解時間、及び破裂圧力への依存性を決定した。ヒドロゲルは、チオール－チオエステル交換による溶解のための内部チオエステルと、超分岐ポリ（エチレンイミン）－チオール（「ＰＥＩ－ＳＨ」）との結合のためのマレイミド末端基を含んでいた。
【0131】
図５１に要約されるように、ＰＥＧ－ジオールをそれぞれの無水物（無水コハク酸、無水グルタル酸、又は無水アジピン酸）と反応させて、対応するＰＥＧ二酸を得た。次に、ＤＣＣカップリングを介してＰＥＧ二酸をＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）末端基で官能化して、架橋剤１、２、及び３を生成した。磁気撹拌子を備えた火炎乾燥させた丸底フラスコ内で、架橋剤１、２、又は３（１ｇ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。チオグリコール酸（６８．８μＬ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２７９μＬ）をこの順序で加えた。チオグリコール酸は、チオエステルに隣接して親水性があり、溶解時間が速いため選択された。反応物を室温で一晩撹拌した。有機相を１Ｎ ＨＣｌ溶液、水、次いでブラインで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾紙で濾過し、ジエチルエーテル中で沈殿させて白色粉末を得た（収率９８％）。
【0132】
前のステップに続いて、乾燥ＤＣＭ中でマレイミドトリフルオロ酢酸、ＰｙＢＯＰ、ＤＩＰＥＡを使用するペプチドカップリング法により、中間体１、２、及び３をマレイミド反応性末端基で官能化して、最終的な架橋剤である架橋剤４、５、及び６を得た。メチレン鎖の長さはそれぞれ２、３、４である。磁気撹拌子を備えた火炎乾燥させた丸底フラスコ中で、中間体１、２、又は３を乾燥塩化メチレンに溶解させた。マレイミド－エチルアミントリフルオロ酢酸、ＤＩＰＥＡ、ＨＯＢｔ、及びＥＤＣを反応物に加えた。溶液を室温で一晩撹拌した。有機相を飽和クエン酸溶液、水、及びブラインを使用して抽出した。次いで、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾紙で濾過し、ジエチルエーテル中で沈殿させて、オフホワイトの固体を得た。固体を真空下で一晩乾燥させた。次いで、固体を水に溶解させ、０．２２μｍのシリンジフィルターを通して濾過し、凍結乾燥させて、オフホワイトの固体（収率８０～９０％）を得た。上記の反応の収率はすべて８０％以上であった。
【0133】
１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＧＰＣ、及びＤＳＣによる特性データは次のとおりである。
ＰＥＧ二酸。このポリマーは、以前に公開されたプロトコルに従って調製された（実施例７も参照）。
ＰＥＧ二酸。このポリマーは、以前に公開されたプロトコルに従って調製された（実施例７も参照）。
【0134】
架橋剤１、２、３。架橋剤１、２、及び３の合成は、以前に公開されたプロトコルに基づいていた（実施例７も参照）。
中間体１、２、３。合成は上記のように行った。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、ＣＤＣｌ３による特性評価：中間体１－δ４．２２（ｔｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），３．６２（ｍ，３１０Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ）ｐｐｍ；中間体２－δ４．２２（ｔｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，４Ｈ），３．６３（ｍ，３０８Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），１．６０（ｍ，８Ｈ），１．３９（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；中間体３－δ４．２１（ｔｔ，Ｊ＝４．４，４．９Ｈｚ，４Ｈ），３．６３（ｍ，２７７Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝６．７，７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝６．７，７．２Ｈｚ，４Ｈ），１．６９（ｍ，８Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、ＣＤＣｌ３による特性評価：中間体１－１９５．９，１７１．５，７０．５，６４．１，３０．９，２９．１ｐｐｍ；中間体２－１９８．６，１７２．７，７０．７，６９．０，３３．５，３２．９，２０．６ｐｐｍ；中間体３－１９７．０，１７３．０，７０．５，６３．５，３３．７，３１．０，２４．７，２４．０ｐｐｍ。
中間体１、２、３。合成は上記のように行った。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、ＣＤＣｌ３による特性評価：中間体１－δ４．２２（ｔｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），３．６２（ｍ，３１０Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ）ｐｐｍ；中間体２－δ４．２２（ｔｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，４Ｈ），３．６３（ｍ，３０８Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），１．６０（ｍ，８Ｈ），１．３９（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；中間体３－δ４．２１（ｔｔ，Ｊ＝４．４，４．９Ｈｚ，４Ｈ），３．６３（ｍ，２７７Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝６．７，７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝６．７，７．２Ｈｚ，４Ｈ），１．６９（ｍ，８Ｈ）ｐｐｍ。１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）、ＣＤＣｌ３による特性評価：中間体１－１９５．９，１７１．５，７０．５，６４．１，３０．９，２９．１ｐｐｍ；中間体２－１９８．６，１７２．７，７０．７，６９．０，３３．５，３２．９，２０．６ｐｐｍ；中間体３－１９７．０，１７３．０，７０．５，６３．５，３３．７，３１．０，２４．７，２４．０ｐｐｍ。
【0135】
架橋剤４、５、６。合成を上記のように行った。
架橋剤４。１Ｈ ＮＭＲ：δ６．７１（ｓ，２Ｈ），６．５５（ｂ，１Ｈ），４．２３（ｔｔ，Ｊ＝４．２，４．９Ｈｚ，４Ｈ），３．６２（ｍ，３２２Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ：１９７．５，１７１．９，１３４．２，７０．５，６４．０，３２．３，２９．１ｐｐｍ；Ｍｗ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：２８６８Ｄａ；Ｍｎ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：２８０１Ｄａ；ＰＤＩ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：１．０２；融点（ＤＳＣ）：４１．７８℃；結晶化点（ＤＳＣ）：３９．９℃。
架橋剤４。１Ｈ ＮＭＲ：δ６．７１（ｓ，２Ｈ），６．５５（ｂ，１Ｈ），４．２３（ｔｔ，Ｊ＝４．２，４．９Ｈｚ，４Ｈ），３．６２（ｍ，３２２Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ：１９７．５，１７１．９，１３４．２，７０．５，６４．０，３２．３，２９．１ｐｐｍ；Ｍｗ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：２８６８Ｄａ；Ｍｎ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：２８０１Ｄａ；ＰＤＩ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：１．０２；融点（ＤＳＣ）：４１．７８℃；結晶化点（ＤＳＣ）：３９．９℃。
【0136】
架橋剤５。１Ｈ ＮＭＲ：δ６．７２（ｓ，２Ｈ），６．５１（ｂ，１Ｈ），４．２３（ｔｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，４Ｈ），３．６３（ｍ，２９７Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．０１（ｍ，Ｊ＝７．２，７．３Ｈｚ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ：１９８．２，１７２．６，１３４．２，７０．４，６３．６，３２．８，３２．３，２０．２ｐｐｍ；Ｍｗ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：３０２８Ｄａ；Ｍｎ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：２９５５Ｄａ；ＰＤＩ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：１．０２；融点（ＤＳＣ）：４０．２２℃；結晶化点（ＤＳＣ）：２１．３℃。
【0137】
架橋剤６。１Ｈ ＮＭＲ：δ６．７１（ｓ，２Ｈ），６．５０（ｂ，１Ｈ），４．２１（ｔｔ，Ｊ＝，４Ｈ），２．６７（ｔ，３Ｈ），２．３６（ｔ，Ｊ＝，４Ｈ），１．６７（ｍ，８Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ：１９８．６，１７３．１，１３４．２，７０．５，６３．５，３３．５，３２．４，２４．６，２４．０ｐｐｍ；Ｍｗ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：３３５１Ｄａ；Ｍｎ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：３１６２Ｄａ；ＰＤＩ（ＧＰＣ，ＴＨＦ）：１．０６；融点（ＤＳＣ）：４５．０４℃；結晶化点（ＤＳＣ）：３３．５℃。
【0138】
実施例１０
チオール末端ポリエチレンイミン（ＰＥＩ－ＳＨ）超分岐マクロマー（図２Ｇ）を、図５１に要約したように実施例９のマレイミド末端ＰＥＧ架橋剤と反応させて合成した。ＰＥＩ－ＳＨの合成には、ペンタフルオロフェニル官能化３－（トリチルチオ）プロピオン酸をＰＥＩと一晩反応させて、トリチル保護されたＰＥＩ－チオール超分岐ポリマー（以下「ＰＥＩ－ＳＴｒ」）を得ることが含まれた（収率＝６８％）。次に、ＴＦＡとＥｔ３Ｓｉを使用してトリチル基を脱保護し、最終的なＰＥＩ－ＳＨ超分岐ポリマーを得た（収率＝９６％）。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＧＰＣ、及びＤＳＣを含む特性データは以下のとおりである。
チオール末端ポリエチレンイミン（ＰＥＩ－ＳＨ）超分岐マクロマー（図２Ｇ）を、図５１に要約したように実施例９のマレイミド末端ＰＥＧ架橋剤と反応させて合成した。ＰＥＩ－ＳＨの合成には、ペンタフルオロフェニル官能化３－（トリチルチオ）プロピオン酸をＰＥＩと一晩反応させて、トリチル保護されたＰＥＩ－チオール超分岐ポリマー（以下「ＰＥＩ－ＳＴｒ」）を得ることが含まれた（収率＝６８％）。次に、ＴＦＡとＥｔ３Ｓｉを使用してトリチル基を脱保護し、最終的なＰＥＩ－ＳＨ超分岐ポリマーを得た（収率＝９６％）。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＧＰＣ、及びＤＳＣを含む特性データは以下のとおりである。
【0139】
最初のＰＥＩ－ＳＨ合成では、ＰＥＩ分子あたり１５当量のチオールを反応させてＰＥＩを完全にチオール化した。しかし、ポリマーあたりのチオール濃度が高いため、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．６）中のＰＥＩ－ＳＨのピンク色の溶液を介して視覚的に観察されるように、分子内及び分子間のジスルフィド結合が形成された。これにより、実施例９のマレイミド官能化架橋剤とのマイケル付加反応に利用可能な遊離チオールの数が最小限に抑えられた。したがって、ＰＥＩと反応するチオールの当量を減らして、分子間及び分子内のジスルフィド結合の数を最小限に抑えた。遊離アミンの数を、図５３に示すように比色ＴＮＢＳアッセイによって測定した。このアッセイを、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中の２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の０．０１％（ｗ／ｖ）溶液をＰＥＩ－ＳＨと反応させることによって実施した。溶液を３７℃で２時間インキュベートした後、得られた黄色の溶液を１０％ＳＤＳ及び１Ｎ ＨＣｌで希釈して、反応を止めた。溶液に存在する第一級アミンの数と相関する吸光度を３３５ｎｍで読み取った。ＰＥＩ及び完全にチオール化されたＰＥＩ－ＳＨの様々な濃度に基づいて標準曲線を作成した。ＲＦＵ対濃度（μｇ／ｍＬ）グラフの傾きは、特定の分子上の遊離アミンの数と相関する。ＰＥＩ（ＭＷ１８００）には平均１５個の遊離アミンがあり、ＴＮＢＳアッセイの傾きは０．００７である。完全にチオール化されたＰＥＩ－ＳＨは、予想どおり０．０００の傾きを示し、分子上に第一級アミンが存在しないことを示す。４当量のトリチルチオプロピオン酸を用いて調製されたＰＥＩ－ＳＨを表す線の傾きを評価した。その線の傾きは０．００２で、官能化されていないＰＥＩの傾きの３分の１である。これらのデータから、ＰＥＩポリマーの約２／３がチオール化されていることが確認され、これは５～６個の第一級アミンが残っていることを意味する。ＰＥＩのこの部分官能化により、分子内及び分子間のジスルフィド結合が最小限に抑えられ、マレイミド官能化架橋剤によるヒドロゲルの形成が促進されることが期待される。
【0140】
ＰＥＩ－ＳＴｒ。ＰＥＩ（３ｇ）をＤＭＦに溶解させた。３－（トリチルチオ）プロピオン酸ペントフルオロフェノール（３．４ｇ）、ＨＯＢｔ（３．２ｇ）、及びＤＩＰＥＡ（４．７ｍＬ）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を塩化メチレンに溶解させ、有機相を重炭酸ナトリウム、水、及びブラインから抽出した。有機溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾紙で濾過し、濃縮した。有機溶液をジエチルエーテル中で沈殿させ、真空下で乾燥させて、淡黄色の固体を得た（収率６８％）。１Ｈ ＮＭＲ：δ８．００（ｓ，１Ｈ），７．４９－７．１０（ｍ，４８Ｈ），３．６５－２．０１（ｍ，６０Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ：１６２．５，１４４．６，１２９．５，１２７．９，１２６．７，３６．５，３５．１，２７．７ｐｐｍ。
【0141】
ＰＥＩ－ＳＨ。磁気撹拌子を備えた丸底フラスコ内で、ＰＥＩ－ＳＴｒ（２ｇ）を最小量の塩化メチレンに溶解させた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１２．３ｍＬ）及びトリエチルシラン（２．７ｍＬ）を、撹拌溶液に同時に滴下した。反応物を室温で３時間撹拌した。塩化メチレン及びＴＦＡを真空下で除去し、最小量の塩化メチレンに再溶解させた。溶液をジエチルエーテル中で沈殿させ、生成物を真空下で一晩乾燥させた。生成物を１Ｎ ＨＣｌに溶解させ、０．２２μｍシリンジフィルターを通して濾過し、凍結乾燥して、淡黄色固体（収率９６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ：７．９（ｓ，１Ｈ），３．６１－２．４９（ｍ，２１７．１３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ：１６３．１，１６２．８，１１７．６，１１５．３，３９．５，２２．７ｐｐｍ；Ｍｗ（ＧＰＣ，水性）：５６６０Ｄａ；Ｍｎ（ＧＰＣ，水性）：６９９４Ｄａ；ＰＤＩ（ＧＰＣ，水性）：１．１２；Ｍｐ（ＤＳＣ）：１５．６℃。
【0142】
実施例１１
実施例９の架橋剤と実施例１０のマクロマーを組み合わせることによりヒドロゲルを調製した。ヒドロゲルを、２：１の架橋剤：ＰＥＩ（ＳＨ）４の比で調製した。架橋剤及びＰＥＩ－ＳＨを、それぞれ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５及び０．３Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．６に溶解させた。各溶液を混合チップを備えたデュアルルーメンシリンジに充填し、円筒型に注入して固体ヒドロゲルを形成した。
実施例９の架橋剤と実施例１０のマクロマーを組み合わせることによりヒドロゲルを調製した。ヒドロゲルを、２：１の架橋剤：ＰＥＩ（ＳＨ）４の比で調製した。架橋剤及びＰＥＩ－ＳＨを、それぞれ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５及び０．３Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．６に溶解させた。各溶液を混合チップを備えたデュアルルーメンシリンジに充填し、円筒型に注入して固体ヒドロゲルを形成した。
【0143】
ゲル化反応速度を、マレイミド架橋剤をＰＥＩ－ＳＨ模倣物であるメルカプトプロピオン酸と混合したときの１Ｈ ＮＭＲにおける６．７０ｐｐｍでのマレイミドアルケンピークの消失を追跡することによって評価した。ｉｎ ｓｉｔｕでＰＥＩ－ＳＨ模倣物として使用される２当量のメルカプトプロピオン酸を注入した後、ＮＭＲスペクトルを０．４秒ごとに約２０秒間記録した。ＰＥＩ－ＳＨ模倣物の注入直後には６．７０ｐｐｍではアルケンのピークは観察されず、０．４秒より速いゲル化速度を示した。
【0144】
ゲル化後、ヒドロゲルの貯蔵弾性率を機械的強度の評価として、ひずみ及び周波数スイープによって測定し、線形粘弾性領域（ＬＶＥＲ）を決定した。ＬＶＥＲは１０ひずみ％まで存在し、これは塑性変形が発生する前にこれらのヒドロゲルに適用できる最大ひずみである。周波数スイープは、ＬＶＥＲ内で３％ひずみ、０．１～１０Ｈｚで行った。我々のヒドロゲルの初期貯蔵弾性率は２０００～５０００Ｐａであった。５０ｍＭ ＰＢＳ中でヒドロゲルが膨潤すると、架橋剤４、５、及び６は貯蔵弾性率の低下を示した。図５４は、パネルＡ）ヒドロゲルのレオロジー測定；パネルＢ）５０ｍＭ ＰＢＳ中での膨潤；及びパネルＣ）０．３Ｍ ＣＭＥ溶液中のヒドロゲルの溶解を示す。Ｇ’の時間経過に伴う減少は、加水分解による架橋剤の劣化に起因すると考えられる。
【0145】
分解速度を推定し、エステルではなく内部チオエステルでの加水分解の位置を確認するために、１Ｈ ＮＭＲ架橋剤スペクトルを０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０中で２０分間モニタリングした。内部チオールに隣接するメチレンは３．４１ｐｐｍから３．１７ｐｐｍにシフトしたが、架橋剤中の二酸結合（コハク酸、グルタル酸、アジピン酸）のもう一方の末端メチレンに対応する、エステル結合に隣接する４．１５ｐｐｍのメチレンピークは、塩基触媒による加水分解中にシフトしなかった。この１Ｈ ＮＭＲシフトにより、チオエステルの選択的加水分解が確認された。図５５は、チオールに隣接するメチレンの３．４１ｐｐｍ（結合）から３．１７ｐｐｍ（加水分解）へのシフトによって観察される、チオエステルの加水分解を示す１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【0146】
架橋剤４、５、及び６を使用して調製されたヒドロゲルの分解速度は４時間超、２４時間超、及び７日超と様々で、架橋の内部チオエステルを加水分解から保護する内部二酸結合の疎水性メチレン鎖長に対応して増加した。架橋剤４は２つのメチレンとの内部コハク酸結合を含み、一方、架橋剤５と６はそれぞれ３つと４つのメチレンのグルタル酸とアジピン酸結合を含む。架橋剤中のメチレン鎖長が長く疎水性が高いほど、チオエステルは加水分解開裂に対してより安定すると考えられ、その結果、分解速度が遅くなる。架橋剤４、５、及び６内のメチレン鎖長に対する分解速度の変化により、機械的完全性を維持するために架橋剤の構造を通じてヒドロゲルの機械的特性を調整することができる。
【0147】
２００～４００％の間で膨潤が観察された（図５４、パネルＢ））。膨張は、５０ｍＭ ＰＢＳに浸漬してから２４時間後に最大に達した。ヒドロゲルには周囲環境から水性液体を吸収するとサイズが拡大する能力があるため、水溶液中での膨潤はヒドロゲルにとって有利であると考えられる。
【0148】
０．３Ｍシステインメチルエステル（ＣＭＥ）溶液に浸漬したときの、チオール－チオエステル交換によるヒドロゲルのオンデマンド溶解時間を評価した（図８）。周波数スイープを、ヒドロゲルネットワークが完全に崩壊又は分解するまで（Ｇ’＜３００Ｐａ）、十分なＣＭＥ曝露を可能にするために１０分間隔で実施した。チオール－チオエステル交換により、ヒドロゲルのネットワークが崩壊し、ＣＭＥのアミンが再配列されて不可逆的なアミド結合が形成され、ヒドロゲルの再形成が妨げられた。溶解は、３つのヒドロゲル製剤すべてについて１０分以内に起こった（図５４、パネルＣ））。酸結合（コハク酸、グルタル酸、アジピン酸）は中性条件下では加水分解を遅らせるが、ＣＭＥ溶液の塩基性条件はチオール－チオエステル交換反応を触媒する。チオール－チオエステル交換によるヒドロゲルネットワークの迅速な溶解は、患者の麻酔時間を最小限に抑えるなど、医療現場で役立つ可能性がある。
【0149】
ｅｘ ｖｉｖｏ研究の前に、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞に対するヒドロゲルの細胞毒性を２４時間の曝露にわたって評価した。ヒドロゲル４及び５は６０％の平均細胞生存率を示し、一方、ヒドロゲル６は９８％の平均細胞生存率を示した。ヒドロゲル４及び５の細胞生存率が低いのは、ヒドロゲルネットワークの崩壊によるコハク酸及びグルタル酸の急速な放出と、トランスウェルプレートの閉鎖環境での局所的な酸性度の増加によるものと考えられる。
【0150】
ヒドロゲル破裂圧力を、生体外の２ｃｍブタ頸動脈の一端にマクロマーを総体積１ｍＬで注入してヒドロゲルを形成することによって測定した。ヒドロゲルは血管を満たし、所定の位置に留まった。この塞いだ動脈を湿気の多い環境で３０分間保管した後（例えば、例示的な外科手術中の時間を模倣する）、この血管を、コンピュータに接続された圧力トランスデューサーとシリンジポンプを備えた自社独自の破裂圧力システムに取り付けた（図５６）。漏れが観察されるまで、脱イオンＨ２Ｏを１ｍＬ／分で血管にポンプで送り込み、破損するまで圧力を記録した。架橋剤４、５、６を用いて調製されたヒドロゲル４、５、６の破裂圧力はそれぞれ３８２ｍｍＨｇ、４４０ｍｍＨｇ、及び２３１ｍｍＨｇであり、動脈圧（１２０／６０）よりも最大４倍大きかった（図５７）。２００～６００ｍｍＨｇの破裂圧力はヒドロゲル閉塞デバイスには十分であると考えられる。
【0151】
本開示の範囲から逸脱することなく、本開示に対して様々な修正及び変形を行うことができることは、当業者には明らかであろう。他の実施形態は、本明細書及び本明細書に開示される本発明の実施を考慮することにより当業者には明らかとなるであろう。本明細書及び実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲及び趣旨は特許請求の範囲によって示されることが意図されている。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44-1】
【図44-2】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【国際調査報告】