特表 2024-526860 初代ＮＫ細胞内での発現のためのキメラ抗原受容体ｍＲＮＡ分子の生成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】初代ＮＫ細胞内での発現のためのキメラ抗原受容体ｍＲＮＡ分子の生成

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240711BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240711BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240711BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240711BHJP

   C07K 16/10 20060101ALN20240711BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N5/0783

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/02

A61K48/00

A61K35/17

C07K16/28

C07K16/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503426

(86)(22)【出願日】2022-07-14

(85)【翻訳文提出日】2024-01-18

(86)【国際出願番号】 US2022073727

(87)【国際公開番号】W WO2023004255

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/224,100

(32)【優先日】2021-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523333870

【氏名又は名称】イミュニティバイオ，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パルヴィーズ，フェレシュテ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AA92Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、新規なキメラ抗原（ＣＡＲ）ｍＲＮＡ分子、この分子を生成する方法及びこの分子で癌を治療する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔ７プロモーター、スペーサー配列、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記シグナルペプチドは、分化抗原群６４（ＣＤ６４）及び／又はＩｇＧ重鎖可変遺伝子（ＩｇＧＨｖ）シグナルペプチドを含み；
前記抗原結合ドメインは、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７ホモログ４（Ｂ７Ｈ４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及び分化抗原群３０α（ＣＤ３０α）からなる群から選択される抗原に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項2】

前記シグナルペプチドは、配列番号１又は配列番号２を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項3】

ＣＤ１９に結合する前記抗原結合ドメインは、配列番号４に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項4】

ＢＣＭＡに結合する前記抗原結合ドメインは、配列番号５又は配列番号６に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項5】

Ｂ７Ｈ４に結合する前記抗原結合ドメインは、配列番号７に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項6】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに結合する前記抗原結合ドメインは、配列番号８に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項7】

ＣＤ３０αに結合する前記抗原結合ドメインは、配列番号５７に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項8】

前記ヒンジ領域は、配列番号９を有する分化抗原群２８（ＣＤ２８）ヒンジ領域である、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項9】

前記ＴＭドメインは、配列番号１０を有するＣＤ２８ ＴＭドメインである、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項10】

前記細胞内ドメインは、共刺激ドメインを含み、配列番号１１を有するＣＤ２８細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項11】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１２を有する分化抗原群３ζ（ＣＤ３ζ）細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項12】

配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。

【請求項13】

請求項１に記載のＣＡＲをコードする核酸構築物。

【請求項14】

配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号５９からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１３に記載の核酸構築物。

【請求項15】

請求項１に記載のＣＡＲをコードする発現ベクター。

【請求項16】

配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択される核酸配列を有する、請求項１５に記載の発現ベクター。

【請求項17】

Ｔ７プロモーター、スペーサー配列、シグナルペプチド配列部分、抗原結合ドメイン配列部分、ヒンジ領域配列部分、膜貫通（ＴＭ）ドメイン配列部分及び細胞内ドメイン配列部分の１つ以上の核酸を含むＲＮＡ分子で修飾された修飾初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、
前記シグナルペプチド配列は、分化抗原群６４（ＣＤ６４）及び／又はＩｇＧ重鎖可変遺伝子（ＩｇＧＨｖ）をコードする配列を含み；
前記抗原結合ドメインは、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７ホモログ４（Ｂ７Ｈ４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及び分化抗原群３０α（ＣＤ３０α）からなる群から選択される抗原に結合する抗原結合部分をコードする配列を含み；
前記核酸配列は、単一のポリヌクレオチドとして互いに作動可能に連結される、修飾初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。

【請求項18】

前記細胞内ドメイン配列部分は、配列番号１１を有するＣＤ２８細胞質ドメイン及び／又は配列番号１２を有する分化抗原群３ζ（ＣＤ３ζ）細胞質ドメインを含む、請求項１７に記載の修飾初代ＮＫ細胞。

【請求項19】

３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をさらに含む、請求項１７に記載の修飾初代ＮＫ細胞。

【請求項20】

ポリ－Ａ配列部分をさらに含む、請求項１７に記載の修飾初代ＮＫ細胞。

【請求項21】

修飾初代ＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成する方法であって、初代ＮＫ細胞を、請求項１３に記載の組み換え核酸構築物でトランスフェクトすることを含む方法。

【請求項22】

癌の治療を、それを必要としている対象において行うための免疫治療の方法であって、治療有効量の、請求項１７に記載の遺伝子組み換えＮＫ細胞を含む医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項23】

前記癌は、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、限定されないが、肉腫及び癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む固形腫瘍からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

癌の治療に使用するための、請求項１７に記載の修飾ＮＫ細胞。

【請求項25】

前記癌は、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、限定されないが、肉腫及び癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む固形腫瘍からなる群から選択される、請求項２４に記載の修飾ＮＫ細胞。

【請求項26】

薬剤として使用するための、請求項１７に記載の修飾ＮＫ細胞。

【請求項27】

請求項１７に記載の修飾ＮＫ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０２１年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２２４，１００号明細書に対する優先権の利益を主張するものである。米国仮特許出願第６３／２２４，１００号明細書の開示全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂによってテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含む。「８７７４－１９－ＰＣＴ」いう名称のＸＭＬファイルは、１５４０００バイトのバイトサイズを有し、２０２１年７月１１日に記録された。ＸＭＬファイルに含まれる情報は、米国特許法施行規則（３７ ＣＦＲ）第１．５２条（ｅ）（５）に従い、その全体が参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0003】

ナチュラルキラー（ＮＫと略記される）細胞は、自然免疫系の主要なメディエーターである。ＮＫ細胞は、事前の感作又はＨＬＡ適合を必要とすることなく、異常細胞（癌細胞又はウイルス感染細胞など）を迅速に発見し、破壊することができる。癌を治療するために免疫細胞（ＮＫ細胞を含む）を使用することは、最近の新しい傾向である。この新しい治療法は、従来の手術、化学療法及び放射線療法に不応性の腫瘍の治療に有望であると予想される。

【0004】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞内シグナル伝達領域に融合された細胞外受容体領域から構成された操作タンパク質である。通常、これらの領域は、異なるタンパク質に由来するが、それらは、デノボで設計することもできる。ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインに融合された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）、通常、ＣＤ３のζ鎖（ＣＤ３ζ）を用いている。さらなる開発は、Ｔ細胞活性化を促進するために、ＣＤ２８及びＣＤ１３７などの二次共刺激シグナルを含んでいる。ＣＡＲ構築物は、特にＴ細胞ＣＤ１９－ＣＡＲでも治療されているＣＤ１９＋ Ｂ細胞腫瘍の治療のためのＮＫ－９２ ＣＤ１９－ＣＡＲ発現の使用でもＮＫ細胞に適用されている。

【0005】

本発明者らは、多くのＣＡＲ分子がＮＫ細胞株内で発現され得る一方、それらが初代ＮＫ細胞内のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれとしても発現され得ないことを見出した。ほとんどのＣＡＲ技術は、細胞内へのＤＮＡ分子の送達のためにウイルスベクターを使用する。ウイルスＤＮＡは、核に侵入し、転写的に活性な部位を優先して宿主ゲノムに統合し得る。本明細書に開示されるように、本発明者らは、ＮＫ細胞内のＣＡＲ ＲＮＡ分子の高い発現のための特定のドメイン及び安定化要素の新規な組合せを特定した。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

Ｔ７プロモーター、スペーサー配列、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、シグナルペプチドは、分化抗原群６４（ＣＤ６４）及び／又はＩｇＧ重鎖可変遺伝子（ＩｇＧＨｖ）シグナルペプチドを含み；抗原結合ドメインは、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７ホモログ４（Ｂ７Ｈ４）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク及び分化抗原群３０α（ＣＤ３０α）からなる群から選択される抗原に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書に開示される。

【0007】

一態様では、シグナルペプチドは、配列番号１又は配列番号２を含む。

【0008】

一態様では、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、配列番号４に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0009】

さらに別の態様では、ＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインは、配列番号５又は配列番号６に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0010】

さらに別の態様では、Ｂ７Ｈ４に結合する抗原結合ドメインは、配列番号７に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0011】

一態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに結合する抗原結合ドメインは、配列番号８に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0012】

一態様では、ＣＤ３０αスパイクに結合する抗原結合ドメインは、配列番号５７に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0013】

一態様では、ヒンジ領域は、配列番号９を有する分化抗原群２８（ＣＤ２８）ヒンジ領域である。

【0014】

一態様では、ＴＭドメインは、配列番号１０を有するＣＤ２８ ＴＭドメインである。

【0015】

一態様では、共刺激ドメインは、配列番号１１を有するＣＤ２８細胞質ドメインを含む。

【0016】

一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１２を有する分化抗原群３ζ（ＣＤ３ζ）細胞質ドメインを含む。

【0017】

さらに別の態様では、ＣＡＲは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0018】

本明細書に開示されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸構築物であって、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７ホモログ４（Ｂ７Ｈ４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びＣＤ３０αからなる群から選択される抗原に結合する、核酸構築物も本明細書に開示される。一態様では、核酸構築物は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号５９からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0019】

本明細書に開示されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターであって、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７ホモログ４（Ｂ７Ｈ４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びＣＤ３０αからなる群から選択される抗原に結合する、発現ベクターも本明細書に開示される。一態様では、発現ベクターは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２からなる群から選択される核酸配列を有する。

【0020】

Ｔ７プロモーター、スペーサー配列、シグナルペプチド配列部分、抗原結合ドメイン配列部分、ヒンジ領域配列部分、膜貫通（ＴＭ）ドメイン配列部分及び細胞内ドメイン配列部分の１つ以上の核酸を含むＲＮＡ分子で修飾された初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、シグナルペプチド配列は、分化抗原群６４（ＣＤ６４）及び／又はＩｇＧ重鎖可変遺伝子（ＩｇＧＨｖ）をコードする配列を含み；抗原結合ドメインは、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７ホモログ４（Ｂ７Ｈ４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及び分化抗原群３０α（ＣＤ３０α）からなる群から選択される抗原に結合する抗原結合部分をコードする配列を含み；核酸配列は、単一のポリヌクレオチドとして互いに作動可能に連結される、初代ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が本明細書にさらに開示される。

【0021】

修飾初代ＮＫ細胞の一態様では、細胞内ドメイン配列部分は、配列番号１１を有するＣＤ２８細胞質ドメイン及び／又は配列番号１２を有する分化抗原群３ζ（ＣＤ３ζ）細胞質ドメインを含む。一態様では、修飾初代ＮＫ細胞は、３’－ＵＴＲをさらに含む。さらに別の態様では、修飾初代ＮＫ細胞は、ポリ－Ａ配列部分をさらに含む。

【0022】

修飾初代ＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成する方法であって、初代ＮＫ細胞を、本明細書に開示される組み換え核酸構築物でトランスフェクトすることを含む方法も本明細書に開示される。

【0023】

癌の治療を、それを必要としている対象において行うための免疫治療の方法であって、治療有効量の、本明細書に開示される遺伝子組み換えＮＫ細胞を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法も本明細書に開示される。一態様では、癌は、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、限定されないが、肉腫及び癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む固形腫瘍からなる群から選択される。

【0024】

癌の治療に使用するための、本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞も本明細書に開示される。一態様では、癌は、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒性）白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、限定されないが、肉腫及び癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む固形腫瘍からなる群から選択される。

【0025】

薬剤として使用するための、本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞も本明細書に開示される。

【0026】

本明細書に開示される遺伝子組み換えＮＫ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書にさらに開示される。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】ＡＣＥ２ ＣＡＲ分子（ｐＮＫＷ９７）を生成するための構築物の概略図である。ＡＣＥ２タンパク質の細胞外ドメインを用いて、ＣＤ６４シグナルペプチド及び１５０－ｂｐの長さのポリＡテイルを有するＣＡＲ分子を生成した。配列番号３を有するスペーサー配列をこの構築物において使用した。

【図2A】サイトカイン富化ナチュラルキラー（ＣＥＮＫ）細胞内のＮＫＷ９７－１５０Ａ（ＸＬ５３－ＡＣＥ２－細胞外ドメイン）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＮＫＷ９７ ＲＮＡでトランスフェクトした。一晩の回復後、ＡＣＥ２発現を、フローサイトメトリー及びコンジュゲートされたＡＣＥ２抗体を用いて検出した。アイソタイプ対照を用いて、ＡＣＥ２抗体の特異性を確認した。示されるように、発現及び細胞生存の両方がこの構築物について非常に良好である。

【図2B】サイトカイン富化ナチュラルキラー（ＣＥＮＫ）細胞内のＮＫＷ９７－１５０Ａ（ＸＬ５３－ＡＣＥ２－細胞外ドメイン）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＮＫＷ９７ ＲＮＡでトランスフェクトした。一晩の回復後、ＡＣＥ２発現を、フローサイトメトリー及びコンジュゲートされたＡＣＥ２抗体を用いて検出した。アイソタイプ対照を用いて、ＡＣＥ２抗体の特異性を確認した。示されるように、発現及び細胞生存の両方がこの構築物について非常に良好である。

【図2C】サイトカイン富化ナチュラルキラー（ＣＥＮＫ）細胞内のＮＫＷ９７－１５０Ａ（ＸＬ５３－ＡＣＥ２－細胞外ドメイン）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＮＫＷ９７ ＲＮＡでトランスフェクトした。一晩の回復後、ＡＣＥ２発現を、フローサイトメトリー及びコンジュゲートされたＡＣＥ２抗体を用いて検出した。アイソタイプ対照を用いて、ＡＣＥ２抗体の特異性を確認した。示されるように、発現及び細胞生存の両方がこの構築物について非常に良好である。

【図2D】サイトカイン富化ナチュラルキラー（ＣＥＮＫ）細胞内のＮＫＷ９７－１５０Ａ（ＸＬ５３－ＡＣＥ２－細胞外ドメイン）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＮＫＷ９７ ＲＮＡでトランスフェクトした。一晩の回復後、ＡＣＥ２発現を、フローサイトメトリー及びコンジュゲートされたＡＣＥ２抗体を用いて検出した。アイソタイプ対照を用いて、ＡＣＥ２抗体の特異性を確認した。示されるように、発現及び細胞生存の両方がこの構築物について非常に良好である。

【図3】ｐＮＫＷ９７のプラスミドマップを示す。

【図4】Ｂ７Ｈ４抗原（ｐＮＫＷ９２－９３）を標的としたＣＡＲ分子を生成するための２つの構築物の概略図である。シグナルペプチド（ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ）が異なる２つの形態のモノペプチドＢ７Ｈ４ ＣＡＲを設計した。配列番号３を有するスペーサー配列をｐＮＫＷ９２構築物において使用し；配列番号６０を有するスペーサー配列をｐＮＫＷ９３構築物において使用した。

【図5A】ＣＥＮＫ細胞におけるＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ Ｂ７Ｈ４ ＶＨ－ＶＬ １０５Ａ（ＮＫＷ９２、ＮＫＷ９３）ＣＡＲ分子の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ９２又はｐＮＫＷ９３ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。２４時間後、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲ発現を、フロー及びビオチン化Ｂ７Ｈ４、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。両方の構築物がＢ７Ｈ４ ＣＡＲの良好な発現を示す。

【図5B】ＣＥＮＫ細胞におけるＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ Ｂ７Ｈ４ ＶＨ－ＶＬ １０５Ａ（ＮＫＷ９２、ＮＫＷ９３）ＣＡＲ分子の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ９２又はｐＮＫＷ９３ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。２４時間後、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲ発現を、フロー及びビオチン化Ｂ７Ｈ４、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。両方の構築物がＢ７Ｈ４ ＣＡＲの良好な発現を示す。

【図5C】ＣＥＮＫ細胞におけるＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ Ｂ７Ｈ４ ＶＨ－ＶＬ １０５Ａ（ＮＫＷ９２、ＮＫＷ９３）ＣＡＲ分子の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ９２又はｐＮＫＷ９３ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。２４時間後、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲ発現を、フロー及びビオチン化Ｂ７Ｈ４、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。両方の構築物がＢ７Ｈ４ ＣＡＲの良好な発現を示す。

【図5D】ＣＥＮＫ細胞におけるＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ Ｂ７Ｈ４ ＶＨ－ＶＬ １０５Ａ（ＮＫＷ９２、ＮＫＷ９３）ＣＡＲ分子の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ９２又はｐＮＫＷ９３ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。２４時間後、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲ発現を、フロー及びビオチン化Ｂ７Ｈ４、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。両方の構築物がＢ７Ｈ４ ＣＡＲの良好な発現を示す。

【図5E】ＣＥＮＫ細胞におけるＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ Ｂ７Ｈ４ ＶＨ－ＶＬ １０５Ａ（ＮＫＷ９２、ＮＫＷ９３）ＣＡＲ分子の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ９２又はｐＮＫＷ９３ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。２４時間後、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲ発現を、フロー及びビオチン化Ｂ７Ｈ４、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。両方の構築物がＢ７Ｈ４ ＣＡＲの良好な発現を示す。

【図5F】ＣＥＮＫ細胞におけるＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ Ｂ７Ｈ４ ＶＨ－ＶＬ １０５Ａ（ＮＫＷ９２、ＮＫＷ９３）ＣＡＲ分子の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ９２又はｐＮＫＷ９３ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。２４時間後、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲ発現を、フロー及びビオチン化Ｂ７Ｈ４、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。両方の構築物がＢ７Ｈ４ ＣＡＲの良好な発現を示す。

【図6】ｐＮＫＷ９２のプラスミドマップを示す。

【図7】ｐＮＫＷ９３のプラスミドマップを示す。

【図8A】ＢＣＭＡ抗原（ｐＮＫＷ８８－９１）を標的としたＣＡＲ分子を生成するための４つの構築物の概略図である。シグナルペプチド（ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ）並びに可変重鎖及び軽鎖の順序が異なる４つの形態のモノペプチドＢＣＭＡ ＣＡＲを設計した。配列番号３を有するスペーサー配列をｐＮＫＷ８９及びｐＮＫＷ９１構築物において使用し；配列番号６０を有するスペーサー配列をｐＮＫＷ８８及びｐＮＫＷ９０構築物において使用した。

【図8B】ＢＣＭＡ抗原（ｐＮＫＷ８８－９１）を標的としたＣＡＲ分子を生成するための４つの構築物の概略図である。シグナルペプチド（ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ）並びに可変重鎖及び軽鎖の順序が異なる４つの形態のモノペプチドＢＣＭＡ ＣＡＲを設計した。配列番号３を有するスペーサー配列をｐＮＫＷ８９及びｐＮＫＷ９１構築物において使用し；配列番号６０を有するスペーサー配列をｐＮＫＷ８８及びｐＮＫＷ９０構築物において使用した。

【図9A】ＣＥＮＫ細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡの発現を示す。シグナルペプチド（ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ）並びに可変重鎖及び軽鎖の順序が異なる４つの形態のモノシストロン性ＢＣＭＡ ＣＡＲを設計した。ＣＥＮＫ細胞を、各構築物からのｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。ＣＡＲ ＢＣＭＡ発現を、ビオチン化ＢＣＭＡ、続いてＡＰＣがコンジュゲートされたストレプトアビジン分子を用いて、エレクトロポレーションの２４時間後に検出した。示されるように、４つ全ての構築物が高いレベルのＢＣＭＡ ＣＡＲを示す。

【図9B】ＣＥＮＫ細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡの発現を示す。シグナルペプチド（ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ）並びに可変重鎖及び軽鎖の順序が異なる４つの形態のモノシストロン性ＢＣＭＡ ＣＡＲを設計した。ＣＥＮＫ細胞を、各構築物からのｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。ＣＡＲ ＢＣＭＡ発現を、ビオチン化ＢＣＭＡ、続いてＡＰＣがコンジュゲートされたストレプトアビジン分子を用いて、エレクトロポレーションの２４時間後に検出した。示されるように、４つ全ての構築物が高いレベルのＢＣＭＡ ＣＡＲを示す。

【図9C】ＣＥＮＫ細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡの発現を示す。シグナルペプチド（ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ）並びに可変重鎖及び軽鎖の順序が異なる４つの形態のモノシストロン性ＢＣＭＡ ＣＡＲを設計した。ＣＥＮＫ細胞を、各構築物からのｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。ＣＡＲ ＢＣＭＡ発現を、ビオチン化ＢＣＭＡ、続いてＡＰＣがコンジュゲートされたストレプトアビジン分子を用いて、エレクトロポレーションの２４時間後に検出した。示されるように、４つ全ての構築物が高いレベルのＢＣＭＡ ＣＡＲを示す。

【図9D】ＣＥＮＫ細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡの発現を示す。シグナルペプチド（ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ）並びに可変重鎖及び軽鎖の順序が異なる４つの形態のモノシストロン性ＢＣＭＡ ＣＡＲを設計した。ＣＥＮＫ細胞を、各構築物からのｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。ＣＡＲ ＢＣＭＡ発現を、ビオチン化ＢＣＭＡ、続いてＡＰＣがコンジュゲートされたストレプトアビジン分子を用いて、エレクトロポレーションの２４時間後に検出した。示されるように、４つ全ての構築物が高いレベルのＢＣＭＡ ＣＡＲを示す。

【図9E】ＣＥＮＫ細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ ｍＲＮＡの発現を示す。シグナルペプチド（ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖ）並びに可変重鎖及び軽鎖の順序が異なる４つの形態のモノシストロン性ＢＣＭＡ ＣＡＲを設計した。ＣＥＮＫ細胞を、各構築物からのｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。ＣＡＲ ＢＣＭＡ発現を、ビオチン化ＢＣＭＡ、続いてＡＰＣがコンジュゲートされたストレプトアビジン分子を用いて、エレクトロポレーションの２４時間後に検出した。示されるように、４つ全ての構築物が高いレベルのＢＣＭＡ ＣＡＲを示す。

【図10】ＳＵＰ－Ｂ１５ ＢＣＭＡ標的及びＳＵＰ－Ｂ１５親細胞におけるＣＤ６４－ＢＣＭＡ ＶＬ－ＶＨ １５０Ａ（ＮＫＷ８９）ＣＡＲでトランスフェクトされたＣＥＮＫ細胞の細胞毒性を示す。ＣＥＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ８９からのｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。２４時間後、カルセインＡＭアッセイを用いて、ＳＵＰ－Ｂ１５ ＢＣＭＡ標的及び対照ＳＵＰ－Ｂ１５親細胞に対する、ＣＥＮＫでトランスフェクトされた細胞の細胞毒性を試験した。示されるように、ＮＫＷ８９でトランスフェクトされた細胞は、ＳＵＰ－Ｂ１５親細胞に対する活性を有さずに、ＳＵＰ－Ｂ１５ ＢＣＭＡに対する特異的な細胞傷害活性を示す。対照の非トランスフェクトＣＥＮＫ細胞は、ＳＵＰ－Ｂ１５ ＢＣＭＡ又は親細胞にいずれに対しても細胞傷害活性を示さない。

【図11】ｐＮＫＷ８８のプラスミドマップを示す。

【図12】ｐＮＫＷ８９のプラスミドマップを示す。

【図13】ｐＮＫＷ９０のプラスミドマップを示す。

【図14】ｐＮＫＷ９１のプラスミドマップを示す。

【図15A】トリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡによるＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションの結果を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲを安定的に発現する安定した細胞株をＣＤ１９ ＣＡＲ検出のための陽性対照として使用した。ＧＦＰ及びＰＤＬ１ ＣＡＲ ｍＲＮＡの両方をエレクトロポレーションのための陽性対照として使用した。示されるように、トリペプチドＣＡＲは、ＰＢ－ＮＫ細胞内のＲＮＡ分子としてエレクトロポレーション後に発現されることができない。

【図15B】トリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡによるＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションの結果を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲを安定的に発現する安定した細胞株をＣＤ１９ ＣＡＲ検出のための陽性対照として使用した。ＧＦＰ及びＰＤＬ１ ＣＡＲ ｍＲＮＡの両方をエレクトロポレーションのための陽性対照として使用した。示されるように、トリペプチドＣＡＲは、ＰＢ－ＮＫ細胞内のＲＮＡ分子としてエレクトロポレーション後に発現されることができない。

【図15C】トリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡによるＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションの結果を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲを安定的に発現する安定した細胞株をＣＤ１９ ＣＡＲ検出のための陽性対照として使用した。ＧＦＰ及びＰＤＬ１ ＣＡＲ ｍＲＮＡの両方をエレクトロポレーションのための陽性対照として使用した。示されるように、トリペプチドＣＡＲは、ＰＢ－ＮＫ細胞内のＲＮＡ分子としてエレクトロポレーション後に発現されることができない。

【図16A】トリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートされた幹メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ細胞）の結果を示す。Ｔｓｃｍ細胞は、３つの異なるエレクトロポレーションプロトコル（増加する電気パルスを用いたＥ１～Ｅ３）を用いてトリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートされた。示されるように、トリペプチドＣＡＲは、メモリーＴ細胞中のＲＮＡ分子としてエレクトロポレーション後に発現されることができない。

【図16B】トリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートされた幹メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ細胞）の結果を示す。Ｔｓｃｍ細胞は、３つの異なるエレクトロポレーションプロトコル（増加する電気パルスを用いたＥ１～Ｅ３）を用いてトリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートされた。示されるように、トリペプチドＣＡＲは、メモリーＴ細胞中のＲＮＡ分子としてエレクトロポレーション後に発現されることができない。

【図16C】トリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートされた幹メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ細胞）の結果を示す。Ｔｓｃｍ細胞は、３つの異なるエレクトロポレーションプロトコル（増加する電気パルスを用いたＥ１～Ｅ３）を用いてトリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートされた。示されるように、トリペプチドＣＡＲは、メモリーＴ細胞中のＲＮＡ分子としてエレクトロポレーション後に発現されることができない。

【図16D】トリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートされた幹メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ細胞）の結果を示す。Ｔｓｃｍ細胞は、３つの異なるエレクトロポレーションプロトコル（増加する電気パルスを用いたＥ１～Ｅ３）を用いてトリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートされた。示されるように、トリペプチドＣＡＲは、メモリーＴ細胞中のＲＮＡ分子としてエレクトロポレーション後に発現されることができない。

【図17】ＣＤ１９抗原（ｐＮＫＷ８７－５９）を標的としたＣＡＲ分子を生成するための２つの構築物の概略図である。初代ＮＫ細胞（本明細書においてＰＢ－ＮＫ細胞とも呼ばれる）及び幹メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ細胞）中のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖシグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。１５０ヌクレオチド長のポリＡテイルを各分子の末端に付加して、ｍＲＮＡ安定性を改善した。配列番号３を有するスペーサー配列をこれらの構築物において使用した。

【図18A】ＰＢ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ分子の発現を示す。初代ＮＫ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションのために使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子を生成した。示されるように、両方の構築物がエレクトロポレーションの２４時間後に９４％超のＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図18B】ＰＢ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ分子の発現を示す。初代ＮＫ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションのために使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子を生成した。示されるように、両方の構築物がエレクトロポレーションの２４時間後に９４％超のＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図18C】ＰＢ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ分子の発現を示す。初代ＮＫ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションのために使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子を生成した。示されるように、両方の構築物がエレクトロポレーションの２４時間後に９４％超のＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図18D】ＰＢ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ分子の発現を示す。初代ＮＫ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションのために使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子を生成した。示されるように、両方の構築物がエレクトロポレーションの２４時間後に９４％超のＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図18E】ＰＢ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ分子の発現を示す。初代ＮＫ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションのために使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子を生成した。示されるように、両方の構築物がエレクトロポレーションの２４時間後に９４％超のＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図18F】ＰＢ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ分子の発現を示す。初代ＮＫ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡを用いて、ＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションのために使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子を生成した。示されるように、両方の構築物がエレクトロポレーションの２４時間後に９４％超のＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図19A-B】ｍＲＮＡエレクトロポレーション後にＣＤ－１９陽性、ＳＵＰ－Ｂ１５親標的細胞株におけるＣＤ１９ ＣＡＲでトランスフェクトされたＰＢ－ＮＫ細胞の細胞傷害活性を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲでトランスフェクトされたＰＢ－ＮＫ細胞の細胞傷害活性を、ＣＤ１９陽性（ＳＵＰ－Ｂ１５親）及びＣＤ１９陰性（ＳＵＰ－Ｂ１５変異体）細胞株を用いて、エレクトロポレーションの２４時間後に決定した。示されるように、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９）シグナルペプチドのいずれかを有する構築物の両方は、ＣＤ１９陽性細胞株に対する特異的な細胞毒性を示す。

【図20A-B】ｍＲＮＡトランスフェクション後のメモリー（ＰＢ－ＮＫ ＣＩＭＬ）及び対照（ＰＢ－ＮＫ）細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ分子の細胞傷害活性を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲでトランスフェクトされたメモリー（ＰＢ－ＮＫ ＣＩＭＬ）又は対照（ＰＢ－ＮＫ）細胞の細胞傷害活性を、ＣＤ１９陽性（ＳＵＰ－Ｂ１５親）及びＣＤ１９陰性（ＳＵＰ－Ｂ１５変異体）細胞株を用いて、エレクトロポレーションの２４時間後に決定した。示されるように、ＣＤ１９－ＣＡＲでトランスフェクトされたＰＢ－ＮＫ ＣＩＭＬ細胞は、ＣＤ１９－ＣＡＲでトランスフェクトされた対照ＰＢ－ＮＫ細胞と同等の細胞傷害活性を示す。これは、ＣＩＭＬ細胞をＣＤ１９陽性腫瘍細胞の特異的な標的化に向けることをさらに促進する。

【図21A】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物による活性化Ｔ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９ ＣＡＲ発現のモニタリングの結果を示す。初代リンパ球内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－－－図２１Ｂ及び２１Ｃ）又はＩｇＧＨ（ｐＮＫＷ５９－－図２１Ｄ及び２１Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、初代細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。

【図21B】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物による活性化Ｔ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９ ＣＡＲ発現のモニタリングの結果を示す。初代リンパ球内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－－－図２１Ｂ及び２１Ｃ）又はＩｇＧＨ（ｐＮＫＷ５９－－図２１Ｄ及び２１Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、初代細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。

【図21C】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物による活性化Ｔ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９ ＣＡＲ発現のモニタリングの結果を示す。初代リンパ球内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－－－図２１Ｂ及び２１Ｃ）又はＩｇＧＨ（ｐＮＫＷ５９－－図２１Ｄ及び２１Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、初代細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。

【図21D】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物による活性化Ｔ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９ ＣＡＲ発現のモニタリングの結果を示す。初代リンパ球内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－－－図２１Ｂ及び２１Ｃ）又はＩｇＧＨ（ｐＮＫＷ５９－－図２１Ｄ及び２１Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、初代細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。

【図21E】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物による活性化Ｔ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９ ＣＡＲ発現のモニタリングの結果を示す。初代リンパ球内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－－－図２１Ｂ及び２１Ｃ）又はＩｇＧＨ（ｐＮＫＷ５９－－図２１Ｄ及び２１Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノペプチドＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、初代細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。

【図22A】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物によるＴｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９発現のモニタリングの結果を示す。メモリーＴ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－図２２Ｂ及び２２Ｃ）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９－－－図２２Ｄ及び２２Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノシストロン性ＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、Ｔｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。示されるように、両方の構築物は、エレクトロポレーションの７２時間後でも高いレベルのＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図22B】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物によるＴｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９発現のモニタリングの結果を示す。メモリーＴ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－図２２Ｂ及び２２Ｃ）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９－－－図２２Ｄ及び２２Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノシストロン性ＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、Ｔｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。示されるように、両方の構築物は、エレクトロポレーションの７２時間後でも高いレベルのＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図22C】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物によるＴｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９発現のモニタリングの結果を示す。メモリーＴ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－図２２Ｂ及び２２Ｃ）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９－－－図２２Ｄ及び２２Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノシストロン性ＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、Ｔｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。示されるように、両方の構築物は、エレクトロポレーションの７２時間後でも高いレベルのＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図22D】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物によるＴｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９発現のモニタリングの結果を示す。メモリーＴ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－図２２Ｂ及び２２Ｃ）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９－－－図２２Ｄ及び２２Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノシストロン性ＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、Ｔｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。示されるように、両方の構築物は、エレクトロポレーションの７２時間後でも高いレベルのＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図22E】ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物によるＴｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションの２４～７２時間後のＣＤ１９発現のモニタリングの結果を示す。メモリーＴ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の発現を改善するために、ＣＤ６４（ｐＮＫＷ８７－図２２Ｂ及び２２Ｃ）又はＩｇＧＨｖ（ｐＮＫＷ５９－－－図２２Ｄ及び２２Ｅ）シグナルペプチドのいずれかを有するモノシストロン性ＣＤ１９構築物を設計した。鋳型ＤＮＡは、Ｔｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションのためにさらに使用されるインビトロで転写されたｍＲＮＡ分子のための鋳型として用いられた。示されるように、両方の構築物は、エレクトロポレーションの７２時間後でも高いレベルのＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

【図23】ｐＮＫＷ５９のプラスミドマップを示す。

【図24】ｐＮＫＷ８７のプラスミドマップを示す。

【図25】ＣＤ３０アルファ（ＣＤ３０α）抗原（ｐＮＫＷ９５）を標的としたＣＡＲ分子を生成するための構築物の概略図である。ＣＤ６４シグナルペプチド及び１５０－ｂｐの長さのポリＡテイルを含有するモノシストロン性ＣＤ３０α ＣＡＲを設計した。配列番号３を有するスペーサー配列を構築物において使用した。

【図26A】ＣＥＮＫ細胞内のα－ＣＤ３０ ＣＤ６４－ＶＬ－ＶＨ ＣＡＲ（ＮＫＷ９５－１５０Ａ）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＸＬ４６（短鎖ポリＡ）又はｐＮＫＷ９５ ＲＮＡ（１５０Ａ）でトランスフェクトした。一晩の回復後、ＣＤ３０α ＣＡＲ発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化ＣＤ３０、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。ｐＮＫＷ９５構築物は、親ｐＸＬ４６と比較してより多い発現を示す。

【図26B】ＣＥＮＫ細胞内のα－ＣＤ３０ ＣＤ６４－ＶＬ－ＶＨ ＣＡＲ（ＮＫＷ９５－１５０Ａ）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＸＬ４６（短鎖ポリＡ）又はｐＮＫＷ９５ ＲＮＡ（１５０Ａ）でトランスフェクトした。一晩の回復後、ＣＤ３０α ＣＡＲ発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化ＣＤ３０、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。ｐＮＫＷ９５構築物は、親ｐＸＬ４６と比較してより多い発現を示す。

【図26C】ＣＥＮＫ細胞内のα－ＣＤ３０ ＣＤ６４－ＶＬ－ＶＨ ＣＡＲ（ＮＫＷ９５－１５０Ａ）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＸＬ４６（短鎖ポリＡ）又はｐＮＫＷ９５ ＲＮＡ（１５０Ａ）でトランスフェクトした。一晩の回復後、ＣＤ３０α ＣＡＲ発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化ＣＤ３０、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。ｐＮＫＷ９５構築物は、親ｐＸＬ４６と比較してより多い発現を示す。

【図26D】ＣＥＮＫ細胞内のα－ＣＤ３０ ＣＤ６４－ＶＬ－ＶＨ ＣＡＲ（ＮＫＷ９５－１５０Ａ）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＸＬ４６（短鎖ポリＡ）又はｐＮＫＷ９５ ＲＮＡ（１５０Ａ）でトランスフェクトした。一晩の回復後、ＣＤ３０α ＣＡＲ発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化ＣＤ３０、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。ｐＮＫＷ９５構築物は、親ｐＸＬ４６と比較してより多い発現を示す。

【図26E】ＣＥＮＫ細胞内のα－ＣＤ３０ ＣＤ６４－ＶＬ－ＶＨ ＣＡＲ（ＮＫＷ９５－１５０Ａ）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＸＬ４６（短鎖ポリＡ）又はｐＮＫＷ９５ ＲＮＡ（１５０Ａ）でトランスフェクトした。一晩の回復後、ＣＤ３０α ＣＡＲ発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化ＣＤ３０、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。ｐＮＫＷ９５構築物は、親ｐＸＬ４６と比較してより多い発現を示す。

【図26F】ＣＥＮＫ細胞内のα－ＣＤ３０ ＣＤ６４－ＶＬ－ＶＨ ＣＡＲ（ＮＫＷ９５－１５０Ａ）の発現を示す。ＣＥＮＫ細胞を、エレクトロポレーションを用いてｐＸＬ４６（短鎖ポリＡ）又はｐＮＫＷ９５ ＲＮＡ（１５０Ａ）でトランスフェクトした。一晩の回復後、ＣＤ３０α ＣＡＲ発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化ＣＤ３０、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。ｐＮＫＷ９５構築物は、親ｐＸＬ４６と比較してより多い発現を示す。

【図27】ｐＮＫＷ９５のプラスミドマップを示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本明細書において特に定義されない限り、本出願において使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般に、化学、分子生物学、細胞及び癌生物学、免疫学、微生物学、薬理学及びタンパク質及び核酸化学に関連して使用される命名法並びにそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。

【0029】

本出願において示される全ての刊行物、特許及び公開特許出願は、参照により本明細書に具体的に援用される。矛盾する場合、その具体的な定義を含む本明細書が優先される。

【0030】

本明細書に開示されるように、本発明者らは、初代ＮＫ細胞内のキメラ抗原ｍＲＮＡ分子の高い発現のための特定のドメイン及び安定化要素の新規な組合せを決定した。特に、本明細書に開示されるように、新規な組合せは、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通（ＴＭ）を含む細胞外ドメインを含み、且つ少なくとも１つの共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含む。さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞内のインビトロで転写されたＲＮＡの最適な発現のための３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における修飾を有する。本発明者らによる初期の結果は、ＮＫ細胞株内で容易に発現された多くのＣＡＲ分子が、初代ＮＫ細胞内のインビトロ転写及びエレクトロポレーション後、最小限の発現を示すか又は発現を示さないことを示した。ほとんどのＣＡＲ技術は、細胞内へのＤＮＡ分子の送達のためにウイルスベクターを使用する。ウイルスＤＮＡは、核に侵入し、転写的に活性な部位を優先して宿主ゲノムに統合し得る。本明細書に開示されるように、本発明者らは、ゲノムに統合しないｍＲＮＡ分子を使用し、それによりウイルス遺伝子送達の発癌の可能性に関連するリスクを回避する別の手法を用いた。安全性に加えて、（ＤＮＡと比較した際の）本明細書に開示されるＣＡＲ ｍＲＮＡ分子を使用する別の利点は、ｍＲＮＡが細胞質中への侵入時に迅速に翻訳されるために得られるより速い応答である。ｍＲＮＡの１つの欠点は、それが容易に分解することであるが、本発明者らは、安定化要素を各ＣＡＲ分子の５’末端に導入することにより、本明細書に開示されるｍＲＮＡ構築物の半減期を長くすることによってこの欠点に対処した。本明細書に提供される図及び実施例においてさらに実証されるように、本発明者らは、メモリーＮＫ及びＴ細胞内でＣＡＲ ｍＲＮＡの成功した発現も示した。

【0031】

本明細書に記載されるＣＡＲ分子は、限定されないが、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ及びＣＤ３０を含む癌表面マーカー並びにチェックポイント阻害剤又は限定されないが、Ｂ７Ｈ４を含むそれらのリガンドを標的とする。ＤＮＡ鋳型ベクターは、癌患者における免疫治療のために本明細書に開示される初代ＮＫ細胞に送達されるｍＲＮＡ分子のインビトロ合成のための鋳型として用いられる。インビトロ転写は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターにおいて開始され得る。Ｔ７プロモーターは、翻訳開始に必要とされるコザック配列（配列番号４５）を含むスペーサー配列（配列番号３又は配列番号６０）の上流にある。ＣＤ６４又はＩｇＧＨｖタンパク質からの短鎖シグナルペプチド（１５－アミノ酸）は、ＣＡＲタンパク質のＮ末端を示す。シグナルペプチドは、新生ポリペプチド鎖を細胞質ゾルから小胞体に送達する、細胞質ゾル中のシグナル認識ペプチド（ＳＲＰ）によって認識される。ＣＡＲ結合部位は、可変軽鎖及び重鎖ドメインのヘテロ二量体である。２つのドメインは、２０アミノ酸（ａａ）リンカーを介して互いに接続される。分子のヒンジ及びＴＭドメインは、ＣＤ２８タンパク質に由来する。ヒンジ領域は、結合ドメインのための移動範囲及び柔軟性を提供する一方、ＴＭ領域／ドメインは、正確な膜内挿入を可能にする。細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。共刺激ドメインは、ＣＤ２８の細胞質ドメインを含む一方、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質ドメインを含む。共刺激及び細胞内シグナル伝達ドメインは、トランスフェクトされた細胞の細胞傷害活性を促進する細胞内シグナル伝達経路に関与する。本明細書に開示される構築物の３’ＵＴＲは、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ヘモグロビンα遺伝子の３’ＵＴＲからの９４－ｂｐ配列であり、その後、１５０－ｂｐポリＡ伸長が続き、ＲＮＡ分子に安定性を与える。３’ＵＴＲ領域の代替物がＣＡＲ構築物において使用され得る。これらとしては、限定されないが、ヒトβグロビンに由来する３’ＵＴＲ又はＮＫ細胞内で高度に発現される遺伝子に由来する３’ＵＴＲが挙げられる。ＮＫ細胞内で高度に発現される遺伝子の例としては、限定されないが、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４などの天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）；又はＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４などの活性化免疫受容体のようなｃ－レクチンが挙げられる。３’ＵＴＲ（並びにそれらの代替物）がＣＡＲ構築物中に導入され得、ｍＲＮＡ ＣＡＲ分子の安定性を改善することができる。

【0032】

本明細書に開示される構築物は、特定の癌表面マーカー、チェックポイント阻害剤及び／又はそれらのリガンドに対する高い結合親和性を有する点で新規である。さらに、構築物は、標的細胞に対して促進された細胞傷害活性をもたらすＣＤ２８及びＣＤ３ζの細胞質ドメインを含む。構築物は、ｍＲＮＡベースでもあり、したがって宿主ゲノムへの構築物の統合に関する懸念がない。

【0033】

シグナルペプチドは、ＣＤ６４及び／又はＩｇＧＨｖシグナルペプチドを含む。一態様では、シグナルペプチドは、配列番号１又は配列番号２を含む。

【0034】

抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ４、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びＣＤ３０αからなる群から選択される抗原に結合する。

【0035】

一態様では、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、配列番号４に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0036】

さらに別の態様では、ＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインは、配列番号５又は配列番号６に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0037】

さらに別の態様では、Ｂ７Ｈ４に結合する抗原結合ドメインは、配列番号７に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0038】

一態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに結合する抗原結合ドメインは、配列番号８に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0039】

一態様では、ＣＤ３０αに結合する抗原結合ドメインは、配列番号５７に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を含む。

【0040】

一態様では、ヒンジ領域は、配列番号９を有するＣＤ２８ヒンジ領域である。

【0041】

一態様では、ＴＭドメインは、配列番号１０を有するＣＤ２８ ＴＭドメインである。

【0042】

一態様では、共刺激ドメインは、配列番号１１を有するＣＤ２８細胞質ドメインを含む。さらに別の態様では、共刺激ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７又はＴＮＦＲＳ９とも呼ばれる）及び／又はＯＸ４０を含む。さらにまた、さらなる共刺激ドメインが構築物に付加され得る。構築物内の共刺激ドメインの順序／位置を入れ替える／変化させることも考えられる。

【0043】

一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１２を有するＣＤ３ζ細胞質ドメインを含む。

【0044】

本明細書に開示されるように、ＣＡＲは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は最大で１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0045】

別の実施形態は、本明細書に開示されるＣＡＲをコードする核酸構築物であり、ＣＡＲは、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域及びＴＭドメインを含む細胞外ドメインを含み；且つ少なくとも１つの共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み；シグナルペプチドは、ＣＤ６４及び／又はＩｇＧＨｖシグナルペプチドを含み；抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ４、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びＣＤ３０α並びにそれらの変異体からなる群から選択される抗原に結合する。一態様では、核酸構築物は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号５９からなる群から選択される核酸配列を含む。別の態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質及びその変異体を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原として又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を生成するために使用され得る好適なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の例としては、限定されないが、メインプロテアーゼ（鎖Ａ ３Ｃ様プロテイナーゼ又は３Ｃ様プロテイナーゼとしても知られているＭ^ＰＲＯ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜タンパク質（Ｍタンパク質）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）が挙げられる。

【0046】

本明細書に開示される別の実施形態は、本明細書に開示されるＣＡＲをコードする発現ベクターであり、ＣＡＲは、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域及びＴＭドメインを含む細胞外ドメイン；並びに少なくとも１つの共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み；シグナルペプチドは、ＣＤ６４及び／又はＩｇＧＨｖシグナルペプチドを含み；抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ４、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びＣＤ３０αからなる群から選択される抗原に結合する。一態様では、発現ベクターは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２からなる群から選択される核酸配列を有する。

【0047】

本明細書に開示されるさらなる実施形態は、本明細書に開示されるＣＡＲを発現する修飾初代ＮＫ細胞であり、ＣＡＲは、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域及びＴＭドメインを含む細胞外ドメイン；並びに少なくとも１つの共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み；シグナルペプチドは、ＣＤ６４及び／又はＩｇＧＨｖシグナルペプチドを含み；抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ４、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びＣＤ３０αからなる群から選択される抗原に結合する。

【0048】

本明細書に開示される別の実施形態は、遺伝子組み換えＮＫ細胞を作製する方法であって、本明細書に開示される発現ベクターから転写されるＣＡＲ ｍＲＮＡ分子を導入する工程を含む方法である。

【0049】

ＲＮＡ ＣＡＲ分子の活性を向上させ得る同じ構築物（ビペプチド又はトリペプチドとして）に他のサイトカイン遺伝子を付加することも可能である。このようなサイトカイン遺伝子としては、ＩＬ－１５が挙げられる。

【0050】

活性を向上させるための、本明細書に開示されるＣＡＲ分子への、ＮＫＧ２Ｄなどの活性化ＮＫ受容体からのドメインの導入も考えられる。ＮＫＧ２Ｄは、Ｃ型レクチン様受容体のＮＫＧ２ファミリーに属する膜貫通タンパクである。

【0051】

本明細書に開示されるさらなる実施形態は、癌の治療を、それを必要としている対象において行うための免疫治療の方法である。本方法は、本明細書に開示される遺伝子組み換えＮＫ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態は、癌を治療するための、本明細書に開示される遺伝子組み換えＮＫ細胞及び薬学的に許容される担体の使用である。

【0052】

別の実施形態は、本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。

【0053】

本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる」などの変化形は、記載される整数（若しくは成分）又は整数（若しくは成分）の群の包含を示唆するが、任意の他の整数（若しくは成分）又は整数（若しくは成分）の群の除外を示唆していない。

【0054】

単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈上特に明記されない限り、複数を含む。

【0055】

「含む」は、「限定されないが、含む」を意味する。「含む」及び「限定されないが、含む」は、同義的に使用される。

【0056】

「薬学的に許容される担体」は、（本明細書に記載される組成物と一緒に）患者に投与され得、組成物内の活性薬剤の薬理学的活性を損なわない非毒性担体を指す。「賦形剤」は、薬学的に有効な成分ではない、製剤又は組成物中の添加剤を指す。

【0057】

「薬学的に有効な量」は、例えば、疾患（限定されないが、癌を含む）に罹患した患者の全体的な健康の有益な及び／又は望ましい変化をもたらす、患者を治療するのに有効な量を指す。治療することは、限定されないが、細胞を殺滅すること、新しい細胞の増殖を防止すること、患者の生活機能を改善すること、患者の健康を改善すること、疼痛を軽減すること、食欲を改善すること、患者の体重を改善すること及びそれらの任意の組合せを含む。「薬学的に有効な量」は、患者の臨床症状を改善するために必要な量も指す。

【0058】

「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、アミノ酸残基から構築されたポリマーを指すために、本明細書において同義語として使用される。本明細書において使用される際の「アミノ酸残基」は、任意の天然アミノ酸（Ｌ若しくはＤ型）、非天然アミノ酸又はアミノ酸模倣体（ペプチドモノマーなど）を指す。

【0059】

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、「同一の」又はパーセント「同一性」は、比較ウインドウ上の最大の一致に対して比較及び整列された場合、同じであるか、又は特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。本開示の趣旨でのアミノ酸又は核酸配列同一性の程度は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定される。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか又はそれを満たす、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することによって高スコアリング配列対（ＨＳＰＳ）を同定する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０）。初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。次に、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿った両方の方向に伸長される。累積スコアは、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて、ヌクレオチド配列について計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少する場合に停止され；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積のため、累積スコアは、ゼロ以下になるか；又はいずれかの配列の末端に到達する。アミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、ＢＬＡＳＴＰ設定は、ワード長（Ｗ）、３；期待値（Ｅ）、１０；及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスである。核酸配列の分析については、ＢＬＡＳＴＮプログラム設定は、ワード長（Ｗ）、１１；期待値（Ｅ）、１０；Ｍ＝５；Ｎ＝－４；及び両方の鎖の比較である。ＴＢＬＡＳＴＮプログラム（タンパク質配列を使用して、ヌクレオチド配列データベースにクエリーを行う）は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）。

【0060】

パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－８７を参照されたい）。最小合計確率（Ｐ（Ｎ））は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の表示を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．０１未満である場合、核酸は、参照配列と類似すると考えられる。

【0061】

ポリペプチドの「長さ」は、非ペプチドリンカー及び／又はポリペプチドが含み得る修飾を除く、ポリペプチドを構成する端から端までの連結されたアミノ酸残基の数である。

【0062】

疎水性アミノ酸残基は、主に非極性の化学的特性を有する官能基（「側鎖」）によって特徴付けられる。このような疎水性アミノ酸残基は、天然（Ｌ若しくはＤ型）又は非天然であり得る。代わりに、疎水性アミノ酸残基は、主に非極性の化学的特性を有する側鎖によって特徴付けられるアミノ酸模倣体であり得る。逆に、親水性アミノ酸残基は、主に極性（荷電又は非荷電）の化学的特性を有する側鎖によって特徴付けられる。このような親水性アミノ酸残基は、天然（Ｌ若しくはＤ型）又は非天然であり得る。代わりに、親水性アミノ酸残基は、主に極性（荷電又は非荷電）の化学的特性を有する側鎖によって特徴付けられるアミノ酸模倣体であり得る。好適な非天然アミノ酸残基及びアミノ酸模倣体は、当技術分野で公知である。例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（７）：ｅ６７８４４を参照されたい。

【0063】

ほとんどのアミノ酸残基は、疎水性又は親水性のいずれかであると考えられ得るが、いくつかは、その文脈に応じて疎水性又は親水性のいずれかとして挙動し得る。例えば、グリシン、プロリン及びシステインは、その比較的弱い非極性特性により、それぞれ場合により親水性アミノ酸残基として機能することが可能である。逆に、ヒスチジン及びアルギニンは、嵩高のわずかに疎水性の側鎖により、それぞれ場合により疎水性アミノ酸残基として機能することが可能である。

【0064】

特に規定されない限り、本明細書に開示される各実施形態は、単独で又は本明細書におけるいずれか１つ以上の他の実施形態と組み合わせて使用され得る。

【0065】

「トランスフェクション」は、真核細胞内への外来核酸の導入を指す。トランスフェクションは、エレクトロポレーション、ポリマー（ナノ粒子）、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、原形質融合及びバイオリステック法を含む、当技術分野で公知の様々な手段によって達成され得る。

【0066】

「安定したトランスフェクション」又は「安定的にトランスフェクトされた」は、トランスフェクトされた細胞のゲノム中への外来核酸、ＤＮＡの導入及び組み込みを指す。

【0067】

変異体という用語は、参照配列（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質配列）と類似しているが同一でないアミノ酸配列を有する、タンパク質又はそのフラグメントを指し、変異体タンパク質の活性は、実質的に変化されない。配列のこれらの変化は、自然に発生する変化であり得るか、又はそれらは、当業者に公知の技術の使用によって操作され得る。好適な変化の例としては、限定されないが、アミノ酸の欠失、挿入、置換及びそれらの組合せが挙げられる。

【0068】

アミノ酸は、それらの物理的特性に基づいていくつかのグループに分類され得る。このようなグループの例としては、限定されないが、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性の非荷電アミノ酸及び疎水性アミノ酸が挙げられる。好ましい変異体は、アミノ酸が同じグループからのアミノ酸で置換されるものである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。

【0069】

天然残基は、一般的な側鎖特性に基づいていくつかの種類に分けられ得る：
１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0070】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含み得る。

【0071】

方法及び使用は、癌の症状を治療若しくは改善し、且つ／又は個体における癌若しくは腫瘍を治療するためにも提供される。方法及び／又は使用は、対象に、治療有効量の、本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞又は本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞を含む組成物を、それを必要としている患者に投与することを含む。投与は、癌を治療するか、対象における腫瘍のサイズを減少させるか、又は対象における癌転移を減少させることが想定される。一実施形態は、癌の治療に使用するための、本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞である。さらに別の実施形態は、薬剤として使用するための、本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞である。

【0072】

「癌」という用語は、白血病、癌腫及び肉腫を含む、哺乳動物において見られるあらゆるタイプの癌、新生物又は悪性腫瘍を指す。例示的な癌としては、脳、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、肝臓、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮の癌及び髄芽腫が挙げられる。追加的な例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、内分泌性及び外分泌性膵臓の新生物並びに前立腺癌が挙げられる。

【0073】

「転移」、「転移性」及び「転移性癌」という用語は、同義的に使用可能であり、１つの器官又は別の非隣接器官又は身体部分からの増殖性疾患又は障害、例えば癌の伝播を指す。癌は、発生部位、例えば乳房において発生し、この部位は、原発腫瘍、例えば原発性乳癌と呼ばれる。原発腫瘍又は発生部位中の一部の癌細胞は、局所において周囲の正常な組織に浸透及び浸潤する能力及び／又はリンパ系又は血管系の壁を貫通して、系を通して身体における他の部位及び組織に循環する能力を獲得する。原発腫瘍の癌細胞から形成される第２の臨床的に検出可能な腫瘍は、転移性又は二次性腫瘍と呼ばれる。癌細胞が転移すると、転移性腫瘍及びその細胞は、原発腫瘍のものと同様であると推定される。したがって、肺癌が乳房に転移する場合、乳房の部位における二次性腫瘍は、異常な乳房細胞ではなく、異常な肺細胞からなる。乳房における二次性腫瘍は、転移性肺癌と呼ばれる。したがって、転移性癌という語句は、対象が原発腫瘍を有するか又は有していた、且つ１つ以上の二次性腫瘍を有する疾患を指す。非転移性癌又は非転移性の癌を有する対象という語句は、対象が原発腫瘍を有するが、１つ以上の二次性腫瘍を有さない疾患を指す。例えば、転移性肺癌は、原発性肺腫瘍を有するか又は原発性肺腫瘍の病歴を有し、且つ第２の場所又は複数の場所、例えば乳房に１つ以上の二次性腫瘍を有する対象の疾患を指す。

【0074】

対象、患者、個体などの用語は、限定であることを意図されず、一般に置き換え可能である。すなわち、患者として記載される個体は、必ずしも所与の疾患を有するわけではなく、単に医師の診察を受けているに過ぎない場合もある。全体を通して使用される際、対象は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット及びモルモット）、鳥類、は虫類、両生類、魚類及び任意の他の動物であり得る。この用語は、特定の年齢又は性別を示さない。したがって、雄であるか又は雌であるかにかかわらず、成熟及び新生対象が含まれることが意図される。本明細書において使用される際、患者、個体及び対象は、同義的に使用され得、これらの用語は、限定であることを意図されない。すなわち、患者として記載される個体は、必ずしも所与の疾患を有するわけではなく、単に医師の診察を受けているに過ぎない場合もある。患者又は対象という用語は、ヒト及び動物対象を含む。

【0075】

本明細書における「治療」及び「予防」への言及は、それらの最も広い文脈で考えられるべきである。「治療」は、哺乳動物が完全な回復まで治療されることを必ずしも示唆するわけではない。同様に、「予防」は、対象が病状を最終的に縮小しないことを必ずしも意味するわけではない。「予防」という用語は、特定の病態の発症の重症度を低下させることと考えられ得る。治療法も、既存の病態の重症度又は急性の発作の頻度を低下させ得る。本明細書において使用される際、「治療する」、「治療すること」及び同様の用語は、疾患若しくは病態の症状を安定させること及び／又は軽減することを意味する。ある態様では、本明細書に開示される組成物は、疾患若しくは病態の発生を防止するか、又は治療とは別に病状若しくは疾患を治癒し得る。

【0076】

本明細書に記載される治療用組成物の経路及び投与の頻度並びに投与量は、個体により且つ疾患により変化し、標準的な技術を用いて容易に確立され得る。一般に、医薬組成物は、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内又は皮下）により、鼻腔内に（例えば、吸入により）丸薬形態（例えば、嚥下、膣内又は直腸内送達用の坐薬）で投与され得る。

【0077】

本明細書に記載されるように、本発明の組成物は、非経口投与に好適である。これらの組成物は、例えば、腹腔内に、静脈内に又は髄腔内に、頭蓋内に、皮内に、筋肉内に、眼内に、髄腔内に、脳内に、鼻腔内に、経粘膜的に、注入により、経口で、直腸内に、静脈内点滴、パッチ及びインプラントを介して、非経口的に、同所的に、皮下に、局所的に、経鼻的に、経口で、舌下に、眼内に、埋め込み可能なデポーにより、ナノ粒子ベースの送達システム、極微針パッチ、ミクロスフェア、ビーズ、浸透圧若しくは機械式ポンプ及び／又は他の機械的な手段を用いて投与され得る。任意選択的に、ＮＫ細胞は、非経口的に投与される。任意選択的に、ＮＫ細胞は、静脈内に投与される。任意選択的に、ＮＫ細胞は、腫瘍周辺に投与される。当業者は、本発明の組成物を投与する方法が、治療される患者の年齢、体重及び身体状態並びに治療される疾患又は病態などの因子に依存し得ることを理解するであろう。したがって、当業者は、患者に最適な投与方法を個別に選択することができるであろう。

【0078】

本明細書に開示される修飾ＮＫ細胞は、細胞の絶対数によって対象に投与され得、例えば前記対象に約１０００個の細胞／注入～最大で約１００億個の細胞／注入、例えば１注入当たり、約、少なくとも約又は多くとも約１×１０^１０、１×１０^９、１×１０^８、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^３、５×１０^３個（など）のＮＫ細胞又は数値のいずれか２つの間の任意の範囲（端点を含む）が投与され得る。任意選択的に、１×１０^８～１×１０^１０個の細胞が対象に投与される。任意選択的に、細胞は、１週間以上にわたって週に１回以上投与される。任意選択的に、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間又はそれを超えて週に１回又は２回投与される。

【0079】

別の実施形態では、総用量は、体表面積のｍ^２によっても計算され得る。対象に約１０００個の細胞／注入／ｍ^２～最大で約１００億個の細胞／注入／ｍ^２、例えば１注入当たり、約、少なくとも約又は多くとも約１×１０^１０個／ｍ^２、１×１０^９個／ｍ^２、１×１０^８個／ｍ^２、１×１０^７個／ｍ^２、５×１０^７個／ｍ^２、１×１０^６個／ｍ^２、５×１０^６個／ｍ^２、１×１０^５個／ｍ^２、５×１０^５個／ｍ^２、１×１０^４個／ｍ^２、５×１０^４個／ｍ^２、１×１０^３個／ｍ^２、５×１０^３個／ｍ^２（など）のＮＫ細胞又は数値のいずれか２つの間の任意の範囲（端点を含む）が投与され得る。任意選択的に、１ｍ^２当たり１×１０^３～１×１０^１０個のＮＫ細胞が対象に投与される。任意選択的に、２×１０^９個／ｍ^２のＮＫ細胞が対象に投与される。

【0080】

ある実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞及び培地、例えばヒト血清又はその均等物を含む組成物中で投与される。培地は、ヒト血清アルブミン及び／又はヒト血漿を含み得る。任意選択的に、培地は、約１％～約１５％のヒト血清又はヒト血清均等物を含む。任意選択的に、培地は、約１％～約１０％のヒト血清又はヒト血清均等物を含む。任意選択的に、培地は、約１％～約５％のヒト血清又はヒト血清均等物を含む。任意選択的に、培地は、約２．５％のヒト血清又はヒト血清均等物を含む。任意選択的に、血清は、ヒトＡＢ血清である。任意選択的に、ヒト治療薬に使用するために許容される血清代替物がヒト血清の代わりに使用される。このような血清代替物は、当技術分野で公知であり得る。任意選択的に、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞及び細胞生存を補助する等張液体溶液を含む組成物中で投与される。任意選択的に、ＮＫ細胞は、凍結保存された試料から再構成された組成物中で投与される。

【0081】

本明細書に提供される方法及び使用に従い、有効量又は治療有効量の、本明細書に提供される薬剤の１つ以上が対象に投与される。有効量、治療有効量及び有効な投与量という用語は、同義的に使用される。有効量という用語は、所望の生理反応（例えば、炎症の減少）を発生させるために必要な任意の量として定義される。薬剤を投与するための有効量及びスケジュールは、当業者によって経験的に決定され得る。投与のための投与量範囲は、疾患又は障害の１つ以上の症状に影響を及ぼす（例えば、減少させるか又は遅らせる）所望の効果を発生させるのに十分に多いものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの実質的な有害な副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般に、投与量は、年齢、病態、性別、疾患のタイプ、疾患若しくは障害の程度、投与経路又は他の薬剤が治療計画に含まれるかどうかによって異なり、当業者によって決定され得る。投与量は、何らかの禁忌がある場合には個々の医師によって調整され得る。投与量は、変化され得、１つ以上の用量の投与で毎日、１日又は数日間にわたって投与され得る。所与の種類の医薬品のための適切な投与量についての指針が文献に見出され得る。例えば、所与のパラメータについて、有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％又は少なくとも１００％の増加又は減少を示す。有効性は、「－倍」の増加又は減少としても表され得る。例えば、治療有効量は、対照と比べて少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍又はそれを超える効果を有し得る。正確な用量及び配合は、治療の目的に応じて決まり、公知の技術を用いて当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２０１２）及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）。

【0082】

注射用に好適な組成物は、滅菌注射用溶液の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性である場合）及び滅菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒であり得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの、組成物における使用によってもたらされ得る。

【0083】

滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上に列挙される様々な他の成分とともに適切な溶媒中に組み込んだ後、例えば、ろ過滅菌又は他の適切な手段による滅菌によって調製される。分散体は、様々な滅菌された有効成分を、塩基性分散媒及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製され得る。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過された溶液から有効成分に加えて何らかのさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥技術を含む。

【0084】

有効成分が好適に保護される場合、それらは、例えば、不活性希釈剤若しくは吸収可能な可食性担体とともに経口投与され得るか、又はそれは、ハード若しくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入され得るか、又はそれは、錠剤に圧縮され得る。経口の治療用投与の場合、活性化合物は、賦形剤に組み込まれ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形態で使用され得る。

【0085】

上記の方法及び使用のいずれかに関連して、組成物は、別の薬物と組み合わせて投与され得る。いずれの場合にも、組成物は、他の薬物の投与前、投与と同時又は投与後に投与され得る。本明細書に記載される方法に従って、２つ以上の化合物又は組成物が１つ以上の他の化合物、例えば公知の化学療法薬、抗ウイルス化合物若しくは分子並びに抗生物質、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、肺炎を治療するための公知の薬物、鎮痛薬（リドカイン若しくはパラセタモールなど）、抗炎症薬（ベタメタゾン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセンなど）及び／又は他の好適な薬物と共投与され得る。提供される方法は、放射線療法、外科手術、ホルモン療法及び／又は免疫療法などの他の腫瘍治療とさらに組み合わされ得る。したがって、提供される方法は、１つ以上の追加的な治療剤を対象に投与することをさらに含み得る。好適な追加的な治療剤としては、限定されないが、鎮痛薬、麻酔薬、蘇生薬、コルチコステロイド、抗コリン剤、抗コリンエステラーゼ、抗けいれん薬、抗腫瘍薬、アロステリック阻害剤、アナボリックステロイド、抗リウマチ薬、精神治療薬、ニューロン遮断薬、抗炎症薬、駆虫薬、抗生物質、抗凝固剤、抗真菌剤、抗ヒスタミン剤、抗ムスカリン剤、抗抗酸菌薬、抗原虫剤、抗ウイルス剤、ドーパミン作動薬、血液作用薬、免疫剤、ムスカリン作動薬、プロテアーゼ阻害剤、ビタミン、成長因子及びホルモンが挙げられる。薬剤及び投与量の選択は、治療される所与の疾患に基づいて当業者によって容易に決定され得る。任意選択的に、追加的な治療剤は、酢酸オクトレオチド、インターフェロン、ペムブロリズマブ、グルコピラノシル脂質Ａ、カルボプラチン、エトポシド又はそれらの任意の組合せである。

【0086】

一態様では、組成物は、Ｎ－８０３（「ＡＬＴ－８０３」とも呼ばれる）とともに投与され得る。一態様では、Ｎ－８０３は、本明細書に開示されるペプチドを含む医薬組成物と一緒に又はそれとは別々に投与され得る。

【0087】

ある実施形態では、追加的な治療用物質は、ウイルス性癌ワクチン、細菌性癌ワクチン、酵母癌ワクチン、抗体、幹細胞移植及び腫瘍標的化サイトカインからなる群から選択され得る。

【0088】

任意選択的に、追加的な治療剤は、化学療法剤である。化学療法治療計画は、１つの化学療法剤又は化学療法剤の組合せの対象への投与を含み得る。化学療法剤としては、限定されないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、タキサン、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩの阻害剤、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、ヌクレオチド類似体及び前駆体類似体、ペプチド抗生物質、白金系化合物、レチノイド及びビンカアルカロイド及び誘導体が挙げられる。任意選択的に、化学療法剤は、カルボプラチンである。

【0089】

「共投与」は、同じか若しくは異なる経路を介した同じ製剤中で若しくは２つの異なる製剤中での同時の投与又は同じか若しくは異なる経路による連続投与を表す。「連続」投与は、２つ以上の別個の化合物の投与間の数秒、数分、数時間又は数日の時間差を表す。

【0090】

Ｎ－８０３は、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）スーパーアゴニスト複合体である。前臨床試験において、ＩＬ－１５は、定着腫瘍に対する強力な抗腫瘍活性を示す。さらに、Ｎ－８０３は、治療用抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性並びに抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ抗体などのチェックポイント阻害剤の抗腫瘍活性を相乗的に促進し得る（Ｒｈｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，２０１６）。

【0091】

Ｎ－８０３の有用な濃度は、該当する対象に好適な濃度である。当業者は、異なる個体が異なる総量のＮ－８０３を必要とし得ることを理解するであろう。ある実施形態では、Ｎ－８０３の量は、薬学的に有効な量である。当業者は、例えば、対象の年齢、体重及び身体状態などの因子に基づいて、対象を治療するために必要な組成物中のＮ－８０３の量を決定することができるであろう。Ｎ－８０３の薬学的に有効な量は、約１ｐｇの化合物／ｋｇ体重～約２０μｇ／ｋｇの化合物／ｋｇ体重；又は約０．１μｇ／ｋｇ～２０μｇ／ｋｇ；又は約１μｇ／ｋｇ体重～約１ｍｇの化合物／ｋｇ体重又は約１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０００ｍｇ／ｋｇ体重；又は約５ｍｇ／ｋｇ体重～約４０００ｍｇ／ｋｇ体重又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重～約３０００ｍｇ／ｋｇ体重；又は約５０ｍｇ／ｋｇ体重～約２０００ｍｇ／ｋｇ体重；又は約１００ｍｇ／ｋｇ体重～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重；又は約１５０ｍｇ／ｋｇ体重～約５００ｍｇ／ｇ体重であり得る。好ましくは、１００ｐｋ／ｋｇ～２０μｇ／ｋｇ。他の実施形態では、この用量は、約０．１、．５、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００又は５０００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。他の実施形態では、用量は、約５ｍｇの化合物／ｋｇ体重～約２０ｍｇの化合物／ｋｇ体重の範囲内であり得る。他の実施形態では、用量は、約８、１０、１２、１４、１６又は１８ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

【0092】

薬剤又は組成物の組合せは、併用して（例えば、混合物として）、別々であるが、同時に（例えば、別個の静脈ラインを介して）又は連続して（例えば、１つの薬剤がまず投与された後、第２の薬剤が投与される）のいずれかで投与され得る。したがって、組合せという用語は、２つ以上の薬剤又は組成物の併用、同時又は連続投与を指すために使用される。治療過程は、対象の特定の特性及び選択される治療のタイプに応じて、個別に最良に決定される。本明細書に開示されるものなどの治療は、１日１回、１日２回、隔週で、月に１回又は治療的に有効な任意の適用可能な基準で対象に投与され得る。治療は、単独で又は本明細書に開示されるか若しくは当技術分野で公知の任意の他の治療と組み合わせて投与され得る。追加的な治療は、第１の治療と同時に、異なる時点において又は全く異なる治療スケジュールで（例えば、第１の治療が１日１回であり得る一方、追加的な治療が週に１回である）投与され得る。

【0093】

ある実施形態では、組成物中に１つ以上の賦形剤を含むことが有益であり得る。当業者は、いずれか１つの賦形剤の選択が任意の他の賦形剤の選択に影響を与え得ることを理解するであろう。例えば、特定の賦形剤の選択は、賦形剤の組合せが望ましくない効果を生じ得るため、１つ以上のさらなる賦形剤の使用を除外することがある。当業者は、本明細書に開示される製剤又は組成物に含むべき賦形剤（存在する場合）を実験的に決定することができるであろう。賦形剤は、限定されないが、共溶媒、可溶化剤、緩衝液、ｐＨ調整剤、増量剤、界面活性剤、カプセル化剤、等張性調整剤、安定剤、保護剤及び粘度調整剤を含み得る。ある実施形態では、薬学的に許容される担体を含むことが有益であり得る。

【0094】

ある実施形態では、可溶化剤を含むことが有益であり得る。可溶化剤は、本明細書に開示されるペプチド又は賦形剤を含む、製剤又は組成物の成分のいずれかの可溶度を高めるのに有用であり得る。本明細書に記載される可溶化剤は、網羅的なリストを構成することを意図されず、使用され得る例示的な可溶化剤として示されるに過ぎない。特定の実施形態では、可溶化剤としては、限定されないが、エチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン並びにそれらの任意の薬学的に許容される塩及び／又は組合せが挙げられる。

【0095】

ｐＨは、組成物に望ましい特性を与える任意のｐＨであり得る。望ましい特性は、例えば、ペプチド安定性、他のｐＨにおける組成物と比較して増加したペプチド保持及び改善されたろ過効率を含み得る。

【0096】

ある実施形態では、等張性調整剤を含むことが有益であり得る。液体組成物の等張性は、例えば、非経口投与によって組成物を患者に投与するとき、重要な考慮事項である。したがって、等張性調整剤は、組成物を投与に好適なものにすることを促進するために使用され得る。等張性調整剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載される等張性調整剤は、網羅的なリストを構成することを意図されず、使用され得る例示的な等張性調整剤として示されるに過ぎない。等張性調整剤は、イオン性又は非イオン性であり得、限定されないが、無機塩、アミノ酸、炭水化物、糖、糖アルコール及び炭水化物を含み得る。例示的な無機塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸カリウムを含み得る。例示的なアミノ酸は、グリシンである。例示的な糖は、グリセロール、プロピレングリコール、グルコース、スクロース、ラクトース及びマンニトールなどの糖アルコールを含み得る。

【0097】

ある実施形態では、安定剤を含むことが有益であり得る。安定剤は、本発明の組成物中のペプチドの安定性を高めるのに役立つ。

【0098】

ある実施形態では、保護剤を含むことが有益であり得る。保護剤は、望ましくない条件（例えば、凍結若しくは凍結乾燥又は酸化によって引き起こされる不安定性）から薬学的に有効な成分（例えば、本明細書に開示されるペプチド）を保護する薬剤である。保護剤は、例えば、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤及び酸化防止剤を含み得る。凍結保護剤は、製剤がその凝固点未満の温度に曝されるとき、医薬品有効成分（例えば、本明細書に開示されるペプチド）の効力の低下を防止するのに有用である。例えば、製剤が静脈内（ＩＶ）投与のために希釈前に凍結され得るように、凍結保護剤は、再構成された凍結乾燥製剤に含まれ得る。凍結保護剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載される凍結保護剤は、網羅的なリストを構成することを意図されず、使用され得る例示的な凍結保護剤として示されるに過ぎない。凍結保護剤としては、限定されないが、溶媒、界面活性剤、カプセル化剤、安定剤、粘度調整剤及びそれらの組合せが挙げられる。凍結保護剤は、例えば、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース及びトレハロース）、ポリオール（例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール及びズルシトール）、グリコール（例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール）を含み得る。

【0099】

凍結乾燥保護剤は、凍結乾燥製剤又は組成物の成分を安定させるのに有用である。例えば、本明細書に開示されるペプチドは、再構成前に凍結乾燥保護剤とともに凍結乾燥され得る。凍結乾燥保護剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載される凍結乾燥保護剤は、網羅的なリストを構成することを意図されず、使用され得る例示的な凍結乾燥保護剤として示されるに過ぎない。凍結乾燥保護剤としては、限定されないが、溶媒、界面活性剤、カプセル化剤、安定剤、粘度調整剤及びそれらの組合せが挙げられる。例示的な凍結乾燥保護剤は、例えば、糖及びポリオール、トレハロース、スクロース、デキストラン及びヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンであり得、これらは、凍結乾燥保護剤の非限定的な例である。

【0100】

酸化防止剤は、組成物の成分の酸化を防止するのに有用である。酸化は、薬物製品の凝集又は薬物製品の純度若しくはその効力に対する他の有害な影響をもたらし得る。酸化防止剤は、当技術分野で周知である。したがって、本明細書に記載される酸化防止剤は、網羅的なリストを構成することを意図されず、使用され得る例示的な酸化防止剤として示されるに過ぎない。酸化防止剤は、例えば、アスコルビン酸ナトリウム、クエン酸塩、チオール、メタ重亜硫酸塩及びそれらの組合せであり得る。

【0101】

本明細書に記載されるものの変形形態、変更形態及び他の実装形態は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱せずに当業者に想到されるであろう。したがって、後続の特許請求の範囲は、前に記載される例示的な説明のみに限定されるわけではない。

【0102】

本明細書に記載される実施形態のそれぞれは、個々に又は本発明の１つ以上の他の実施形態と組み合わせて組み合わされ得る。

【0103】

当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記載される化合物、組成物及びその使用方法の多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、本明細書に開示される組成物及び方法の範囲内にあると考えられる。

【0104】

本出願を通して引用される全ての参考文献、特許及び公開特許出願並びにそれらの添付図面の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。

【実施例】

【0105】

以下の実施例は、実施形態を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供しようとするものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定することを意図されず、以下の実験が行われる全ての又は唯一の実験であることを表すことも意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するように努めたが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏度単位である。標準的な略語が使用される。

【0106】

実施例１：この実施例は、本明細書に開示されるＲＮＡ構築物の生成を説明する。本明細書に開示されるＣＡＲ構築物をコードするベクターを、ＰＣＲフラグメント又は遺伝子ブロックのいずれかのＧｉｂｓｏｎアセンブリによって生成した。１５０－ポリＡテイルを、操作された制限部位を用いて各ＣＡＲ分子の３’末端において挿入した。ＤＮＡベクターを完全にシーケンシングし、ポリＡテイルの長さを決定した。次に、ＣＡＲ ＤＮＡを、ＳａｐＩを用いて線形化し、消化されたＤＮＡをさらに精製した。ＲＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを用いて、精製されたＤＮＡ鋳型から転写した。次に、ＲＮＡを、塩化リチウムを用いて沈殿させ、サイズ及び純度を決定するために電気泳動にかけた。

【0107】

【表1】

【0108】

【表2】

【0109】

【表3】

【0110】

【表4】

【0111】

【表5】

【0112】

【表6】

【0113】

【表7】

【0114】

【表8】

【0115】

【表9】

【0116】

【表10】

【0117】

実施例２：この実施例は、ＡＣＥ ｐＮＫＷ９７による結果を示す（図１、２Ａ～２Ｄ）。ＡＣＥ２タンパク質の細胞外ドメインを、ヒンジ、ＴＭ及びＣＤ２８の共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び１５０ｐ－Ａを含むベクターにクローニングした（図１）。構築物を、ＳａｐＩを用いて消化し、線形化されたＤＮＡを、ｍＲＮＡ生成のための鋳型として使用した。ＰＢＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ９７ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。一晩の回復後、ＡＣＥ２発現を、フローサイトメトリー及びコンジュゲートされた抗ＡＣＥ２抗体を用いて検出した。アイソタイプ対照抗体を用いて、ＡＣＥ２抗体の特異性を確認した（図２Ａ、２Ｃ）。非トランスフェクション対照（図２Ｂ）は、ＣＥＮＫ細胞内のＡＣＥ２の内因性発現を示さない。しかしながら、エレクトロポレートされたＣＥＮＫ細胞は、＞９０％のＡＣＥ２ ＣＡＲ発現を示す（図２Ｄ）。ＡＣＥ２ ＣＡＲをコードするベクターが図３に示される。

【0118】

実施例３：この実施例は、ｐＮＫＷ９２～９３による結果を示す（図４、５Ａ～５Ｆ）。ＣＤ６４又はＩｇＧＨシグナルペプチドが前にあるＢ７Ｈ４抗原を標的とするＣＡＲ分子を、図４に示されるように設計した。ＣＡＲ ＤＮＡを、ＳａｐＩを用いて線形化し、ｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として用いた。次に、ＣＥＮＫ細胞を、ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。一晩の回復後、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲの発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化Ｂ７Ｈ４、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。検出試薬の特異性についての対照として、ストレプトアビジン－ＡＰＣのみの染色を、各試料のために使用した。図５Ａ及び５Ｂに示されるように、非トランスフェクション対照は、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲを発現しなかった。他方、ｐＮＫＷ９２（ＣＤ６４シグナルペプチド）及びｐＮＫＷ９３（ＩｇＧＨｖシグナルペプチド）の両方（それぞれ図５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅ、５Ｆ）は、Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲの高い発現を示した。Ｂ７Ｈ４ ＣＡＲをコードするベクターが図６及び７に示される。

【0119】

実施例４：この実施例は、ｐＮＫＷ８８～９１による結果を示す（図８Ａ、Ｂ、９Ａ～９Ｅ、１０～１４）。ＢＣＭＡ抗原を標的とする４つのＣＡＲ分子を、図８Ａ及び８Ｂに示されるように設計した。ＣＡＲ ＤＮＡを、ＳａｐＩを用いて線形化し、ｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として用いた。次に、ＣＥＮＫ細胞を、ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。一晩の回復後、ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化ＢＣＭＡ、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。検出試薬の特異性についての対照として、ストレプトアビジン－ＡＰＣのみの染色を、各試料のために使用した。図９Ａに示されるように、非トランスフェクション対照は、ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現しなかった。他方、４つ全ての異なる構築物（図９Ｂ～９Ｅ）は、高いレベルのＢＣＭＡ ＣＡＲを示した。構築物を、ＢＣＭＡを安定的に発現するＳＵＰ－Ｂ１５細胞株に対する細胞傷害活性について試験した（データは、全ての構築物について示されていない）。図１０において、１つのＣＡＲ構築物（ｐＮＫＷ８９）は、ＢＣＭＡ発現標的細胞株を特異的に溶解させることが示される一方、それは、ＢＣＭＡ陰性親細胞株に対する細胞傷害活性を有していなかった。非トランスフェクション対照は、親ＳＵＰ－Ｂ１５又はＢＣＭＡ発現ＳＵＰ－Ｂ１５細胞株のいずれに対しても細胞毒性を有さない。ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするベクターが図１１～１４に示される。

【0120】

実施例５：この実施例は、モノペプチドＣＤ１９ ＣＡＲを開発することの論理的根拠を示す。安定したＣＤ１９－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞株を作製するために以前に使用されたトリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲを用いて、ＰＢ－ＮＫ細胞のエレクトロポレーションのためのｍＲＮＡを生成した。エレクトロポレーションからの一晩の回復後、ＣＤ１９ ＣＡＲを、フローサイトメトリー及びビオチン化抗ＣＡＲ（Ｆ（ａｂ’）２）、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。検出試薬の特異性についての対照として、ストレプトアビジン－ＡＰＣのみの染色を、各試料のために使用した。図１５Ａに示されるように、非トランスフェクション陰性対照は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現せず、そのとき、陽性対照細胞株は、ＣＤ１９ ＣＡＲの高い発現を示した。エレクトロポレーションプロトコルを評価するために、２つの異なるＲＮＡ鋳型（ＧＦＰ及びＰＤＬ１）を使用し、それらの両方は、エレクトロポレーションの２４時間後、対応するコードされたタンパク質の高い発現を示した（図１５Ｂ）。トリペプチドＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡは、ＰＢ－ＮＫ細胞内で発現されることができなかった（図１５Ｃ）。ＣＤ１９ ＣＡＲ発現の欠如がＰＢ－ＮＫ細胞特異的でないことを確実にするために、メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）を、増加する電気パルスを用いて、３つの異なるプロトコルを用いて、同じＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。非トランスフェクト陰性対照（図１６Ａ）もトランスフェクトされたＴｓｃｍ細胞（図１６Ｂ～Ｄ）も、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現しない。次の工程は、初代ＮＫ細胞内のｍＲＮＡ発現のために最適化されたドメインを用いてモノペプチドＣＤ１９ ＣＡＲを設計することであった。ＣＤ１９抗原を標的とする２つのＣＡＲ分子（それらのシグナルペプチドが異なる）を、図１７に示されるように設計した。ＣＡＲ ＤＮＡを、ＳａｐＩを用いて線形化し、ｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として用いた。次に、ＰＢ－ＮＫ細胞を、ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。一晩の回復後、ＣＤ１９ ＣＡＲを、フローサイトメトリー及びビオチン化ＣＤ１９、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。検出試薬の特異性についての対照として、ストレプトアビジン－ＡＰＣのみの染色を、各試料のために使用した。図１８Ａ～１８Ｂに示されるように、非トランスフェクション対照は、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現しない。他方、両方の構築物でトランスフェクトされたＰＢ－ＮＫ細胞（図１８Ｃ、１８Ｄ及び１８Ｅ、１８Ｆ）は、高いレベルのＣＤ１９ ＣＡＲを示した。ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９抗原を発現するＳＵＰ－Ｂ１５細胞株（親）に対する細胞傷害活性を示し、同じ細胞株のＣＤ１９陰性変異体に対して活性を示さなかった（図１９Ａ及びＢ）。メモリーＮＫ細胞（ＣＩＭＬ）の使用は、腫瘍微小環境中のＮＫ細胞の生存及び活性を延長させるのに有望である。ＰＢ－ＮＫ細胞を、１６時間にわたってサイトカイン処理（ＩＬ１２／ＩＬ１８／Ｎ－８０３）にかけた。サイトカインを除去し、対照及びＣＩＭＬ細胞の両方を、ｐＮＫＷ８７ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。図２０Ａ～２０Ｂに示されるように、トランスフェクトされた細胞は、メモリー（図２０Ａ）及び対照（図２０Ｂ）ＰＢＮＫ細胞の両方において、ＣＤ１９陽性標的細胞のみに対する細胞傷害活性を示す。次に、モノペプチドＣＤ１９ ＣＡＲを、活性化Ｔ細胞（Ｔｓｃｍに対する対照）及びＴｓｃｍ細胞内で試験した。この実験について、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現の安定性も、７２時間の期間にわたって試験した。図２１Ｂ及び２１Ｃ（ｐＮＫＷ８７）及び図２１Ｄ及び２１Ｅ（ｐＮＫＷ５９）に示されるように、ＣＤ１９ ＣＡＲレベルは、活性化Ｔ細胞のエレクトロポレーションの７２時間後でも高いままである。非トランスフェクション陰性対照（図２１Ａ）は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示さない。同様の安定性試験を、同じＣＡＲ ＲＮＡ分子（図２２Ｂ及び２２Ｃ並びに図２２Ｄ及び２２Ｅ：それぞれｐＮＫＷ８７及びｐＮＫＷ５９）によるＴｓｃｍ細胞のエレクトロポレーションを用いて行った。結果は、トランスフェクションの７２時間後でも、トランスフェクトされたＴｓｃｍ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡの高い安定性を示す。非トランスフェクション陰性対照（図２２Ａ）は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示さない。ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするベクターが図２３及び２４に示される。

【0121】

実施例６：この実施例は、ＣＤ３０ ｐＮＫＷ９５による結果を示す（図２５、２６Ａ～２６Ｆ及び２７）。ＣＤ３０α抗原を標的とするＣＡＲ分子を、ヒンジ、ＴＭ及びＣＤ２８の共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び１５０ｐ－Ａを含むベクターにおいて設計した（図２５）。ベクターを、ＳａｐＩを用いて消化し、線形化されたＤＮＡを、ｍＲＮＡ生成のための鋳型として使用した。ＣＥＮＫ細胞を、ｐＮＫＷ９５ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレートした。一晩の回復後、ＣＤ３０発現を、フローサイトメトリー及びビオチン化ＣＤ３０、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣを用いて検出した。ストレプトアビジン－ＡＰＣ染色のみを用いて、検出方法の特異性を確認した。非トランスフェクション対照（図２６Ａ、２６Ｂ）は、ＣＥＮＫ細胞内のＣＤ３０の内因性発現を示さない。ｐＮＫＷ９５が由来する元のプラスミド（ｐＸＬ４６）を、比較に使用した。ｐＸＬ４６は、長鎖ポリＡテイルを有さないため、ポリＡテイル（５０未満のヌクレオチド）を、インビトロ転写中に付加した。図２６Ｅ、２６Ｆに示されるように、ｐＮＫ９５は、元の構築物（ｐＸＬ４６：図２６Ｃ、２６Ｄ）と比較して、より高いＣＤ３０ ＣＡＲ発現を示す。ＣＤ３０ ＣＡＲをコードするベクターが図２７に示される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図18F】

【図19A-B】

【図20A-B】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図22E】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図27】

【配列表】

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【国際調査報告】