特表 2024-526887 ベネズエラウマ脳炎ウイルスを結合し中和する単一ドメイン抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】ベネズエラウマ脳炎ウイルスを結合し中和する単一ドメイン抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/08 20060101AFI20240711BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240711BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20240711BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240711BHJP

【ＦＩ】

C07K16/08 ZNA

C07K16/46

A61K39/395 N

A61P31/14

A61P43/00 171

G01N33/569 L

G01N33/543 501A

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503557

(86)(22)【出願日】2022-06-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-15

(86)【国際出願番号】 US2022035483

(87)【国際公開番号】W WO2023003679

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/224,642

(32)【優先日】2021-07-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517405976

【氏名又は名称】ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ，アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ ネイビー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】リュー，ジニー リン

(72)【発明者】

【氏名】ザベタキス，ダン

(72)【発明者】

【氏名】ゴールドマン，エレン アール．

(72)【発明者】

【氏名】アンダーソン，ジョージ ピー．

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA14

4C085AA16

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA29

4H045EA52

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）の検出又は処置の何れかのための従来のモノクローナル抗体に対する代替物として働き得る単一ドメイン抗体が本明細書で記載される。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１～８からなる群から選択されるタンパク質配列を含む、単離された抗体。

【請求項2】

前記タンパク質配列が、ポリペプチドリンカーを介して連結された正確に２個のｓｄＡｂを含む、請求項１に記載の単離された抗体。

【請求項3】

ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として同定される３個の多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、単一ドメイン抗体であって、
配列番号１～８からなる群から選択される配列に対して少なくも７０％の同一性及び少なくとも７５％の前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を有し；
ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に対する結合活性を有する、
単一ドメイン抗体。

【請求項4】

ポリペプチドリンカーを介して一緒に連結された２つ以上の請求項３に記載の単一ドメイン抗体を含む、タンパク質。

【請求項5】

さらなる機能性を提供するために別のタンパク質ドメインに連結された、請求項１～４の何れか１項に記載のｓｄＡｂ。

【請求項6】

ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）を検出する方法であって、
ＶＥＥＶを含有することが知られているか又は疑われる試料を、それへの抗原結合を可能にする条件下で、結合されているか又は固定されている請求項１～４の何れか１項に記載の抗体と接触させることを含み；
前記試料中のＶＥＥＶの少なくとも一部が、前記抗体に結合したままであり、それにより前記試料中のＶＥＥＶの存在を示す応答が生じる、
方法。

【請求項7】

前記抗体が、前記接触の前に表面に捕捉される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体が、レポーターとして使用される、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記タンパク質配列が、ポリペプチドリンカーを介して連結された正確に２個のｓｄＡｂを含む、請求項６～８の何れか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記試料が、患者由来であり、ＶＥＥＶが前記試料中で検出される場合、ＶＥＥＶ感染に対する適切な処置を前記患者に提供する、請求項６～９の何れか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記患者が、非ヒト動物である、請求項６～１０の何れか１項に記載の方法。

【請求項12】

請求項１～５の何れか１項と薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬。

【請求項13】

それを必要とする個体に、請求項１２に記載の医薬を投与することを含む、処置の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２１年７月２２日提出の米国仮出願第６３／２２４，６４２号明細書の優先権を主張する。

【0002】

連邦政府により資金援助を受けた研究及び開発
米国政府は、本発明において所有権を有する。ライセンシングの照会は、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＵＳ Ｎａｖａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｄｅ １００４，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ ２０３７５，ＵＳＡ；＋１．２０２．７６７．７２３０；[e-mail]，ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ ＮＣ１１３７７５を対象とし得る。

【背景技術】

【0003】

トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のアルファウイルス属のメンバーであるベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）は、ヒト及びウマにおける重要な蚊媒介性病原体である。ＶＥＥＶ感染は主に、中枢神経系及びリンパ系組織を標的とし、ウマにおける重篤な脳炎及び、明白でないか又は亜臨床的な感染～急性脳炎に及ぶ多様なヒト疾患を引き起こす。神経学的疾患は、症例の４～１４％において出現する。ウマの流行期中のヒト感染の発生は、最大３０％であり得る。小児における脳炎と関連する死亡率は、３５％と高い。１９９５年のベネズエラ及びコロンビアでの大流行は、１００，０００例前後のヒト症例をもたらし、致死的な脳炎の症例は３００例を超えた。さらに、ＶＥＥＶは、ヒト及び他の動物においてエアロゾル吸入により非常に感染しやすい。

【0004】

ＶＥＥＶに対して有効であると示された抗ウイルス薬はないと考えられている。治験用の新規薬物ＶＥＥＶワクチンの２つの形態がヒト及び獣医学での使用について利用可能になった一方で、それらは満足には程遠い。例えば、１回のワクチン接種を受けるレシピエントのおよそ２０％は、中和Ａｂを生じず、一方で別の２０％は、反応原性を呈し、さらにこのワクチンは野生型に復帰し得る。他のワクチンは、複数回のワクチン接種、周期的なブースト注射を必要とし、いくつかのげっ歯類モデルにおいてエアロゾル負荷試験に対する防御を与えられない。

【0005】

他のアルファウイルスのように、ＶＥＥＶは、エンベロープウイルスであり、３つの構造タンパク質：ウイルスＲＮＡゲノムを被包するカプシド、及び２つのエンベロープ糖タンパク質、Ｅ１及びＥ２、を有する。Ｅ１とＥ２は、ヘテロ二量体を形成し、これは三量体スパイクとしてウイルスエンベロープから突出する。スパイク上のエピトープは、中和Ａｂの標的である。試験は、ウイルス中和エピトープがＥ２タンパク質上に主に配置されること、及びＥ２Ｃエピトープが中和エピトープの中心であると思われることを示している。マウスモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）１Ａ４Ａ１１４は、Ｅ２Ｃに特異的である。このｍＡｂは、毒性ＶＥＥＶによる致死的な末梢曝露から動物を防御することにおいて有効であることが示されている。しかし、マウスｍＡｂは、ヒトにおける治療剤として重大な欠点を有する。例えば、ヒトでのマウスｍＡｂの使用に付随する問題の１つは、それらが抗マウスＡｂ応答を誘導し得ることである。さらに、マウスｍＡｂの反復投与は、マウスｍＡｂの急速なクリアランス及び、時として致死的であり得るアナフィラキシーを起こし得る。マウスｍＡｂのヒト化は、ヒトにおいてＡｂの免疫原性を低下させると提言されている。しかし、これらは依然として、製造するのに費用がかかり得る大型の複雑な分子であり、コールドチェーンの維持を要する短い保存可能期間を有する。加えてそれらのサイズのため、これらは、血液脳関門を横断できず、従って脳炎の感染を処置するために効果がなく、かつこれらは、さらなる望ましい特性を持つために遺伝子操作することが困難である。

【0006】

検出での適用のために、多くの免疫アッセイは、認識エレメントとしてマウス、ウサギ、ヤギ又はヒツジ由来のモノクローナル又はポリクローナル抗体（ＩｇＧ）に依存する。機能的なＩｇＧは、４本のポリペプチド鎖から構成され、２本は同一の重（Ｈ）鎖であり、２本は同一の軽（Ｌ）鎖であり、ジスルフィド結合により連結される。各抗体は、Ｈ及びＬ鎖からの隣接する可変（Ｖ）ドメインの相互作用により形成される２つの抗原結合ドメインを有する。抗原結合面は、６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）から構成され、３個がＶＨ及びＶＬタンパク質ドメインのそれぞれに存在する。様々なサイズ及び配列のこれらの６個のＣＤＲループの相互作用は、多岐にわたる抗原性標的を認識するためのトポロジーを有する多様化した抗原結合面の形成を可能にする。高感度で特異的であるものの、従来の抗体は、開発に時間及び費用がかかり得、限られた安定性を有する。図１は、ＩｇＧ並びにクローン化された結合誘導体の略図を示す。最小の抗原結合コンストラクトを形成するためのＶＨ及びＶＬドメインのみを含む、従来のＩｇＧのクローン化誘導体は、バイオセンサー適用のための認識エレメントとして使用されている。これらの単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、細菌において発現され、抗体断片の機能性及び特性を目的に合わせるためにタンパク質工学により修飾され得る。しかし、ＳｃＦｖはしばしば、親の全長抗体ほど安定でなく、及びちょうど全長抗体のように、これらは、それらの２ドメイン構造のため高温で不可逆的に凝集する。理想的には、抗原結合できる単一ドメイン構造の開発は、加熱時の凝集を回避し、かつ高い環境温度での又は長時間にわたる連続使用のためのバイオセンサーの適用を促進し得る。

【0007】

ラクダ類（即ちラクダ、ラマ）及びサメなどの、ある特定の動物は、抗原結合が単一Ｖドメインを介して仲介される、重鎖ホモ二量体からなる免疫グロブリンのクラスを保持する。これらのＶドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ又はＶＨＨとしても知られる）としてクローン化される場合、従来の抗体のおよそ１０分の１の大きさの、最小の既知の抗原結合断片（１２～１５ｋＤａ）を含む。これは、それらが、従来の抗体により認識されない、比較的近づきにくいエピトープに到達しかつそれらを認識することを可能にし得る。それらの小さいサイズにもかかわらず、ｓｄＡｂは、それらの抗原に対する高レベルの特異性及び親和性を示し、かつハプテン及びタンパク質に対するナノモル濃度の親和性を有することが示されている。これらは、化学的変性又は熱変性の後に再度折り畳んで抗原を結合でき、それらが高温への曝露後に抗原を結合する能力を保持することを可能にする。いくつかの試験は、ｓｄＡｂが本質的に熱安定性であることを見出し、高温での抗原結合を示し、このことは、それらが、冷蔵がしばしば可能でない長期のフィールド適用によく適することを示唆する。ｓｄＡｂに基づく認識エレメントは、高温での使用及び保管並びにセンサー面の再生の可能性を有する従来の抗体の特異性をもたらすはずである。ｓｄＡｂの一般的配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる３つの多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び４つのより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。特定のｓｄＡｂのエピトープ結合は、主にＣＤＲにより決定され、ＣＤＲ３が、抗原認識において支配的に寄与する。

【0008】

ｓｄＡｂはまた、治療適用のためのいくつかの魅力的な特性ももたらす。繰り返しになるが、それらの安定性は、それらを室温で安定にし得、一方で殆どの抗体療法は、冷蔵を必要とする。それらの小さなサイズは、同じ重量のタンパク質がより大きな比活性を有し、かつ組織全体にはるかにより速く拡散することを意味する。そのＦｃドメインの欠如はまた、免疫応答のＦｃが介在する効果がＶＥＥＶ感染の非常に長期の負の影響、即ち多発性関節炎、に寄与すると思われる、ＶＥＥＶ治療薬のケースに対し有益であり得る。

【発明の概要】

【0009】

一実施形態では、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に対する、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はナノボディとしても知られるラクダ類重鎖抗体（ＶＨＨ）の単離された可変ドメインは、配列番号１～８からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％の全体的なアミノ酸配列同一性を有し、同時に少なくとも７５％のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域におけるアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。

【0010】

第２の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択される配列と少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の全体的なアミノ酸配列同一性を有する第１の実施形態のｓｄＡｂである。

【0011】

第３の実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域のそれぞれにおけるアミノ酸配列同一性が７５％超、例えば７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％である、第１又は第２の実施形態のｓｄＡｂである。

【0012】

さらなる実施形態では、単離された抗体は、ペプチドリンカーにより一緒に連結される上記のｓｄＡｂの２つを含む。

【0013】

別の実施形態は、所望の機能を提供するように構成されるさらなるアミノ配列を組み込む上記の実施形態の何れかに従うｓｄＡｂを含むポリペプチドである。

【0014】

別の実施形態では、ＶＥＥＶを検出する方法は、ＶＥＥＶを含有することが知られているか又は疑われる試料を、結合された又は固定された先行する実施形態の抗体と、それへの抗原結合を可能にする条件下で接触させること；及び未結合の構成成分を除去するために抗体をすすぎ（そこで試料中の何れかのＶＥＥＶの少なくとも一部は、その抗体に結合したままである）、それにより必要に応じてさらなる段階後に試料中のＶＥＥＶの存在を示す応答を生じさせることを含む。別の態様では、試料は患者由来であり、ＶＥＥＶが試料中で検出される場合、患者はＶＥＥＶ感染に対する適切な処置を提供される。

【0015】

また別の実施形態は、薬学的に許容可能な担体と一緒に上記のような１つ以上の抗体を含む医薬である。

【0016】

またさらなる実施形態は、それを必要とする個体に医薬の実施形態を投与することを含む処置の方法である。

【0017】

特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面付きのこの特許又は特許出願公開のコピーは、必要な料金の要求及び支払時にオフィス（Ｏｆｆｉｃｅ）により提供される。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、抗体及び組み換え誘導体を示す図である。ｓｄＡｂ以外、示されるものは全て、マルチドメイン性を示す。重鎖可変ドメインは、格子模様で陰影を付けて示され、軽鎖ドメインは、水平な線で薄く陰影を付けられ、定常ドメインは、陰影を付されない。

【図2】図２は、ＶＥＥＶを結合するｓｄＡｂの配列アライメントを提供する。これらのｓｄＡｂは、付番位置９７～１１４にある、それらの相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列の類似性に基づき、５種類の異なるファミリーに分類される。

【図3】図３Ａ及び３Ｂは、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）方式でのアッセイからのデータを示し、それぞれ、ｓｄＡｂ及びｓｄＡｂのある種の連結された融合物の、ＶＥＥＶのＴＣ８３株による細胞の感染を阻害する能力を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

定義
本発明を詳述する前に、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明する目的のためであり、必ずしも限定することを意図しないことを理解されたい。本明細書中に記載のものと同様の、その改変型の、又は同等の、多くの方法、構造及び材料が、過度の実験を行わずに、本発明の実施において使用され得るものの、本明細書中で、好ましい方法、構造及び材料を記載する。本発明を説明すること及び主張することにおいて、次の用語は、以下で示される定義に従い使用される。

【0020】

本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別段明らかに示されない限り、複数に対する言及を排除しない。

【0021】

本明細書中で使用される場合、用語「及び／又は」は、関連する列挙される項目の１つ以上のありとあらゆる組み合わせを含む。

【0022】

本明細書中で使用される場合、用語「約」は、述べられる数値又は範囲と組み合わせて使用される場合、述べられるものの±１０％の範囲内で、述べられる値又は範囲よりも幾分多いか又は少ないことを示す。

【0023】

「対象」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは哺乳動物、例えば、ウマ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、又は非ヒト霊長類、又はヒトである。

【0024】

概説
本明細書で記載されるのは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に結合するいくつかの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；ナノボディ又はＶＨＨとも呼ばれる）である。これらのｓｄＡｂは、治療適用において使用される可能性があり、免疫アッセイにおけるウイルスの検出のためにも使用され得る。

【0025】

ｓｄＡｂの一般的な配列は、３個の多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）及び４個のより保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。エピトープ結合は、主にＣＤＲ３により決定される。

【0026】

実施例
ラマを、死んだベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）を含有したウマワクチン（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｉｎｎｏｖａｔｏｒ＋ＶＥＷＴ）を使用して免疫化した。一連の免疫化後に、ラマの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたトータルＲＮＡを、精製した。このトータルＲＮＡを使用して、ラマ重鎖のみの抗体の可変重鎖ドメインのファージディスプレイライブラリを作製した。

【0027】

抗ＶＥＥＶ ｓｄＡｂの５つの配列ファミリーを、図２で見られるように、ＣＤＲ３領域において高い類似度を共有するｓｄＡｂの群として定義される配列ファミリーを有して、免疫ファージディスプレイライブラリから選択した。本明細書中で、発明者らは、図２においてアミノ酸残基番号２６～３５の領域としてＣＤＲ１を定義し、番号５０～６５としてＣＤＲ２を定義し、番号９７～１１４としてＣＤＲ３を定義する。

【0028】

ＶＥＥＶ特異的な結合物質を、固定化された死んだＶＥＥＶ（株ＴＣ－８３）において、バイオパニング手順により単離した。選択された配列を、タンパク質調製のためにサブクローニングした。調製されたｓｄＡｂのサブセットを次に、結合アッセイに供し、それらはＭａｇｐｌｅｘアッセイによりＴＣ－８３結合について陽性であることが分かった。

【0029】

バイオパニング及び代表的クローンの分析から選択される抗ＶＥＥＶ ｓｄＡｂの群についての特異的なアミノ酸配列は、本開示の対象である。抗ＶＥＥＶアミノ酸配列を、次の通り記載する：

【0030】

配列番号１（Ｖ２Ｂ３）
ＥＶＱＬＱＡＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＶＳＩＮＶＭＡＷＹＲＱＳＰＧＫＥＲＥＬＶＡＫＳＳＧＰＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＮＤＡＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＥＧＬＲＹＰＳＧＴＹＧＰＳＡＶＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

【0031】

配列番号２（Ｖ８Ｃ３）
ＥＶＱＬＱＡＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＫＶＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＬＡＭＡＷＦＲＥＡＰＧＮＥＲＥＦＶＡＡＩＭＷＴＧＤＲＴＨＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＬＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＫＰＡＤＴＡＶＹＹＣＡＧＡＦＳＦＰＳＱＦＡＲＤＹＴＹＷＧＱＧＴＱＶＳＶＳＳ

【0032】

配列番号３（Ｖ１１Ａ１）
ＤＶＱＬＱＡＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＱＮＬＦＥＹＹＴＭＧＷＹＲＱＶＰＧＳＱＲＥＲＶＡＬＩＮＮＧＧＳＮＶＡＧＳＶＥＧＲＦＴＩＳＫＤＮＡＫＮＳＩＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＲＡＦＧＰＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

【0033】

配列番号４（Ｖ３Ｇ９）
ＥＶＱＬＱＡＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＫＶＳＣＡＡＳＧＲＴＦＮＮＬＡＭＡＷＦＲＥＡＰＥＮＥＲＥＦＶＡＡＩＭＷＴＧＤＲＴＨＹＡＤＦＶＫＧＲＹＴＩＳＲＤＮＡＬＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＫＰＡＤＴＡＶＹＹＣＡＧＡＦＳＦＰＳＱＦＡＲＤＹＴＹＷＧＱＧＴＱＶＳＶＳＳ

【0034】

配列番号５（Ｖ２Ｇ５）
ＥＶＱＬＱＡＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＶＳＩＮＶＭＡＷＹＲＱＳＰＧＫＱＲＥＬＶＡＫＳＳＧＰＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＮＤＡＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＥＧＬＲＹＰＳＧＴＹＧＰＳＡＶＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

【0035】

配列番号６（Ｖ２Ｃ３）
ＤＶＱＬＱＡＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＱＮＬＦＥＹＹＴＭＧＷＹＲＱＶＰＧＳＱＲＥＲＶＡＬＩＮＮＧＧＳＮＶＡＧＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＩＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＲＡＦＧＰＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

【0036】

配列番号７（Ｖ２Ｇ１）
ＤＶＱＬＱＡＳＧＧＧＬＶＱＡＧＤＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＫＧＹＡＶＧＷＦＲＱＡＳＧＫＥＲＥＦＶＡＶＩＳＹＦＤＥＲＡＤＹＡＨＳＡＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＤＴＶＶＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＦＣＡＡＧＬＳＥＳＴＬＰＳＥＹＩＹＷＧＱＧＴＱＶＳＶＳＳ

【0037】

配列番号８（Ｖ３Ａ８）
ＤＶＱＬＱＡＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＨＳＦＡＮＹＨＶＡＷＩＲＱＴＰＧＫＥＣＥＦＶＧＳＡＳＲＲＤＤＳＴＹＹＡＤＦＡＬＧＲＦＩＩＳＲＤＮＤＩＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＶＡＡＶＭＡＱＴＴＱＧＷＴＴＤＹＤＬＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

【0038】

次のような配列番号１２を有するコンセンサス配列もまた、図２で示す：
ＸＶＱＬＱＡＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＸＶＱＡＧＸＳＬＸＸＳＣＸＡＳＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＷＸＲＸＸＸＧＸＸＸＥＸＶＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＧＲＦＸＩＳＸＤＸＸＸＸＸＸＸＬＱＭＮＸＬＫＰＸＤＸＡＶＹＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＱＧＴＱＶＸＶＳＳ

【0039】

ｓｄＡｂのいくつかを、添加されたｓｄＡｂがウイルスによる細胞の感染を防御できるプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）においてウイルス中和について試験した。２つ組の平均を使用して、５０％及び８０％プラーク減少中和タイター（ＰＲＮＴ５０及びＰＲＮＴ８０）を計算した。図３Ａ中の表１は、ＰＲＮＴアッセイにおいてＶＥＥＶのＴＣ８３株を阻害する各ｓｄＡｂの能力を示す。

【0040】

２つの個別のｓｄＡｂがポリペプチドリンカーを介して連結されたものを含むｓｄＡｂの遺伝子融合物もまた、調べた。例えば、Ｖ２Ｂ３と、Ｖ３Ａ８ｆと呼ばれるＶ３Ａ８の誘導体（配列番号９）を、配列番号１３を有するグリシン－セリンに基づくリンカーを介し連結して、Ｖ２Ｂ３－Ｖ３Ａ８ｆ（配列番号１０）及びＶ３Ａ８ｆ－Ｖ２Ｂ３（配列番号１１）を作製した。これらのそれぞれの配列を、以下で提供する。

【0041】

配列番号９（Ｖ３Ａ８ｆ）
ＤＶＱＬＱＡＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＨＳＦＡＮＹＨＶＡＷＩＲＱＴＰＧＫＥＲＥＦＶＧＳＡＳＲＲＤＤＳＴＹＹＡＤＦＡＬＧＲＦＩＩＳＲＤＮＤＩＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＶＡＡＶＭＡＱＴＴＱＧＷＴＴＤＹＤＬＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

【0042】

配列番号１０（Ｖ２Ｂ３－Ｖ３Ａ８ｆ）
ＥＶＱＬＱＡＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＶＳＩＮＶＭＡＷＹＲＱＳＰＧＫＥＲＥＬＶＡＫＳＳＧＰＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＮＤＡＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＥＧＬＲＹＰＳＧＴＹＧＰＳＡＶＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＤＶＱＬＱＡＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＨＳＦＡＮＹＨＶＡＷＩＲＱＴＰＧＫＥＲＥＦＶＧＳＡＳＲＲＤＤＳＴＹＹＡＤＦＡＬＧＲＦＩＩＳＲＤＮＤＩＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＶＡＡＶＭＡＱＴＴＱＧＷＴＴＤＹＤＬＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

【0043】

配列番号１１（Ｖ３Ａ８ｆ－Ｖ２Ｂ３）
ＤＶＱＬＱＡＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＨＳＦＡＮＹＨＶＡＷＩＲＱＴＰＧＫＥＲＥＦＶＧＳＡＳＲＲＤＤＳＴＹＹＡＤＦＡＬＧＲＦＩＩＳＲＤＮＤＩＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＶＡＡＶＭＡＱＴＴＱＧＷＴＴＤＹＤＬＲＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＥＶＱＬＱＡＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＩＶＳＩＮＶＭＡＷＹＲＱＳＰＧＫＥＲＥＬＶＡＫＳＳＧＰＦＴＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＮＤＡＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＥＧＬＲＹＰＳＧＴＹＧＰＳＡＶＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ

【0044】

配列番号１３（リンカー）：ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳ

【0045】

いくつかの他の融合物を、同様に作製した。各ケースにおいて、融合物は、上の実施例でのように配列番号１３のリンカーにより連結される２つのｓｄＡｂを含んだ。ＣＣ３ ｓｄＡｂと呼ばれるｓｄＡｂもまた、試験し、それは、共同所有される米国特許第１１，０２８，１５２号明細書で以前に開示され、次の配列（配列番号１４）を有する：
ＥＶＱＬＱＡＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＴＳＱＮＬＦＥＹＹＴＭＧＷＹＲＱＶＰＧＳＱＲＥＲＶＡＬＩＮＮＧＧＳＴＶＡＧＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＨＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＹＬＫＰＥＤＳＡＶＹＹＣＲＡＦＧＰＡＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＣＣ３ ｓｄＡｂは先に、ＶＥＥＶと関連するアルファウイルスであるチクングニアウイルスに結合するとして同定された。抗ＶＥＥＶライブラリはＣＣ３に密接に関連する配列を明らかにしたので、試験はこのｓｄＡｂも含んだ。

【0046】

図３Ｂ中の表２は、単量体ｓｄＡｂ又は２つのｓｄＡｂのカクテルと比較した、ＶＥＥＶのＴＣ８３株を中和するこれらの連結された構造物の能力についての比較データを提供する。従って、本開示の態様は、任意選択的にそれらの間にスペーサー配列を伴う、２つ又はそれを超える上記のような個々のペプチド配列の融合物を含む、抗ＶＥＥＶ抗体を含む。

【0047】

さらなる実施形態
これらのｓｄＡｂ及びそれらの誘導体は診断アッセイにおいて使用され得ることが、予想される。例えば、ＶＥＥＶを含有することが知られているか又は疑われる試料を、本明細書に記載されるようなタンパク質配列を含む結合された又は固定された抗体と、それへの抗原結合を可能にする条件下で接触させ得る。未結合の構成成分を除去するために抗体―抗原複合体をすすいだ後（ここで、試料中の何れかのＶＥＥＶの少なくとも一部は抗体に結合したままである）、試料中のＶＥＥＶの存在を示す応答を、サンドイッチ蛍光免疫アッセイの完了についてストレプトアビジン－フィコエリスリンにより認識され得るビオチンをタグ付加された第２の抗ＶＥＥＶ ｓｄＡｂの添加により、得ることができる。捕捉（結合された又は固定された）及び／又はレポーター（例えばビオチンをタグ付加された）方式の両方での抗体の使用が、企図される。表面プラズモン共鳴、ＭａｇＰｌｅｘ蛍光免疫アッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの、当技術分野で公知の多くの代替的なアッセイ方式を、実現し得る。

【0048】

上記の例の変形物が可能である。例えば、同じ又は異なる何れかの２つの個々のｓｄＡｂが、ポリペプチドリンカーを介して連結され得る。１つの融合タンパク質として発現される２つを超える、例えば３、４、５個の又はさらに多くのｓｄＡｂを一緒に連結することも可能である。

【0049】

ポリペプチドリンカーは、実施例で使用されるものより短くても又は長くてもよく；例えば、リンカーは、１～５０の（１及び５０を含む）アミノ酸長であり得る。リンカーの長さは、通常の実験によって調整され得る。主にグリシン及びセリンを含むリンカーは、所望されるように機能すると予想される。従って、少なくとも５０％のグリシン及び／又はセリンを含むリンカーが企図される。

【0050】

さらに、１つ以上のｓｄＡｂが、さらなる機能性を提供するために、別のタンパク質に連結され得る。例えば、ｓｄＡｂは、検出アッセイにおいて役立つように酵素又は蛍光タンパク質に、及び／又は治療的使用に重要であり得る血清半減期の延長を可能にするタンパク質ドメイン（例えばアルブミン結合ドメイン）に、連結され得る。このような連結は、融合タンパク質（任意選択的に上記のようなリンカーを含む）の発現によって、又は翻訳後連結によって、遂行され得る。

【0051】

また企図されるのは、図２で示されるコンセンサス配列に基づく上記のｓｄＡｂのバリアントである。バリアントは、プログラムにより作製され、合成され、当技術分野で公知の技術を使用して結合について試験され得る。

【0052】

ヒトなどの対象への投与のために、１つ以上の抗ＶＥＥＶ抗体及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物を、使用し得る。本状況において、用語「薬学的に許容可能な」は、担体又は賦形剤が、使用される投与量及び濃度で、これらが投与される対象において何らかの不要な又は有害な効果を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容可能な担体及び賦形剤は、当技術分野で周知である。これらは好ましくは、無菌の溶液として処方され投与されるが、凍結乾燥された調製物を利用することも可能であり得る。無菌溶液は、無菌ろ過による又は当技術分野でそれ自身公知の他の方法により調製される。この溶液は次に、凍結乾燥されるか又は医薬投薬容器（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）中に満たされる。溶液のｐＨは一般に、ｐＨ３．０～９．５、例えばｐＨ５．０～７．５の範囲である。抗ＶＥＥＶ抗体は一般的に、適切な薬学的に許容可能な緩衝液を有する溶液中に存在し、本組成物は、塩も含有し得る。任意選択的に、アルブミンなどの、安定化剤が存在し得る。特定の実施形態では、界面活性剤が、添加される。特定の実施形態では、抗ＶＥＥＶ抗体は、注射用の調製物へと処方され得る。

【0053】

組成物は、対象、例えばヒト対象又はウマ対象に投与され得る。単回投与のための組成物中の抗ＶＥＥＶ抗体の総用量は、特に成体ウマの処置の場合、例えば、約０．０１μｇ～それよりもはるかに多いレベルであり得る（例えば約５０グラム）。予想されるヒト投与量は、約１００ｍｇ～約５グラムの範囲であり得る。推奨用量を決定することは、実験により行われ、当業者にとって通常のものである。

【0054】

本開示による組成物の投与は、標準的な投与経路を使用して行われ得る。非限定的な実施形態は、非経口投与、例えば皮内、筋肉内、皮下、経皮又は粘膜投与など、例えば鼻腔内、口腔などを含む。一実施形態では、組成物は、筋肉内注射により投与される。

【0055】

長所
従来の抗体と比較した場合、ｓｄＡｂは、小さく、より良好に組織に浸透し、血液脳関門を通過する可能性がより高い。これは、特に脳炎を処置又は予防するための、ＶＥＥＶ感染の処置のための診断及び治療適用に役立ち得る。見かけ上ｓｃＦｖはｓｄＡｂと多くの類似点を持つ一方で、ｓｃＦｖは重大な制限を有する：第一に、ｓｃＦｖの作製は、はるかにより困難である；第二に、ｓｃＦｖは、保管時に多量体化及び凝集する傾向があり、放射性標識に対しそれほど安定でない；第三に、ｓｃＦｖは、ｓｄＡｂのサイズの２倍であり、組織浸透性がより低く、かつ血液脳関門を通過する可能性がより低い。

【0056】

これらの新しい配列は、治療剤として及び検出アッセイにおける潜在的な使用を有する堅固な試薬に相当する。従来の抗体が低温での保管を必要とし、かつ様々な検出プラットフォームで最適に働くように容易に調整できない一方で、堅固な組み換え結合分子であるｓｄＡｂは、必要ならば、さらにより熱的に安定であるように改変され得るが、それらは天然に、変性されると再折り畳みできる堅牢な安定性を有し、かつそれらはまた、それらの有用性を促進するために様々な融合ドメインとともに発現され得る。ｓｄＡｂに基づく融合コンストラクトは、治療試薬の半減期を調整するためにも有利であり得る。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-03-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

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【国際調査報告】