特表 2024-526895 標的遺伝子を調節するための系および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】標的遺伝子を調節するための系および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20240711BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240711BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20240711BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240711BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20240711BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240711BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20240711BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALN20240711BHJP

   C12N 5/074 20100101ALN20240711BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

C12Q1/02 ZNA

C07K14/005

C12N9/22

C40B40/08

C12N5/10

C12N15/33

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

C12N15/09 100

C12N15/11 Z

C07K19/00

C12N5/071

C12N5/0735

C12N5/074

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503594

(86)(22)【出願日】2022-07-20

(85)【翻訳文提出日】2024-03-12

(86)【国際出願番号】 US2022073920

(87)【国際公開番号】W WO2023004338

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】63/223,842

(32)【優先日】2021-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523471839

【氏名又は名称】エピクリスパー バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ハート， ダニエル オー．

(72)【発明者】

【氏名】チー， レイ エス．

(72)【発明者】

【氏名】デイリー， ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】ゲイナス， トーマス ブレア

(72)【発明者】

【氏名】カロッソ， ジョヴァンニ

(72)【発明者】

【氏名】コ， テンギュ

(72)【発明者】

【氏名】イェオ， ロビン ダブリュー．

(72)【発明者】

【氏名】スティル， クリストファー ダリル ザ セカンド

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ34

4B063QQ42

4B063QQ79

4B063QR72

4B063QR77

4B063QS36

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4H045BA10

4H045BA50

4H045CA01

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現をモジュレートするための組成物、方法、および系を提供する。本開示の複合体は、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターを標的遺伝子または標的遺伝子調節配列の極めて近傍に位置させ、それにより、標的遺伝子の発現または活性レベルのモジュレーションを容易にするために有用であり得る。本開示は、例えば、特定の標的遺伝子（複数可）の発現をモジュレートするために、ハイスループットスクリーンを行って、異種遺伝子エフェクタードメイン、およびエフェクタードメインとガイド部分との複合体を同定するための組成物、系、および方法を提供する。本開示は、研究などの他の目的のためにまたは治療薬として使用することができる、本明細書に開示される系によって同定される複合体も提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）細胞の集団を複合体のライブラリーと接触させるステップであって、前記ライブラリーの個々の複合体が、
（ｉ）前記ライブラリーの他の複合体内の異種遺伝子エフェクターとは異なる異種遺伝子エフェクター、および
（ｉｉ）前記ライブラリーの他の複合体内のガイド核酸配列に対して１００％の配列同一性を示すガイド核酸配列
を含み、
前記異種遺伝子エフェクターと前記ガイド核酸配列が、前記細胞の集団内の標的内因性遺伝子に対して特異的結合性を示す個々の複合体を形成しており、
前記ライブラリーが、少なくとも２５種の異なる複合体を含む、ステップ、
（ｂ）前記接触させるステップの後、前記細胞の集団を、前記細胞の集団内の前記標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化に基づいて選別するステップ、ならびに
（ｃ）前記変化をもたらす、前記ライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターを同定するステップ
を含む方法。

【請求項2】

（ａ）細胞の集団を複合体のライブラリーと接触させるステップであって、前記ライブラリーの個々の複合体が、
（ｉ）前記ライブラリーの他の複合体内の異種遺伝子エフェクターとは異なる異種遺伝子エフェクター、および
（ｉｉ）前記ライブラリーの他の複合体内のガイド核酸配列に対して１００％の配列同一性を示すガイド核酸配列
を含み、
前記異種遺伝子エフェクターと前記ガイド核酸配列が、前記細胞の集団内の標的内因性遺伝子に対して特異的結合性を示す個々の複合体を形成しており、
前記異種遺伝子エフェクターが、ウイルス遺伝子エフェクターを含む、ステップ、
（ｂ）前記接触させるステップの後、前記細胞の集団を、前記細胞の集団内の前記標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化に基づいて選別するステップ、ならびに
（ｃ）前記変化をもたらす、前記ライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターを同定するステップ
を含む方法。

【請求項3】

前記ウイルス遺伝子エフェクターが、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｅｒｉｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅからなる群から選択されるヒトウイルスに由来する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ウイルス遺伝子エフェクターが、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｙｓｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｖｉｒｉｄａｅ、およびＨａｎｔａｖｉｒｉｄａｅからなる群から選択されるヒト－コウモリ共通ウイルスに由来する、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記ウイルス遺伝子エフェクターが、古細菌トロピックウイルス、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅｓ、Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、サテライトウイルス、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｕｒｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ、ＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅおよびＭｙｏｖｉｒｉｄａｅからなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記ライブラリーが、少なくとも３０種、５０種、１００種、２００種、５００種、１，０００種、２，０００種、５，０００種、または１０，０００種の異なる複合体を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ガイド核酸配列が、約１０～約３０ヌクレオチド、約１５～約２５ヌクレオチド、または約１５ヌクレオチドを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記個々の複合体が、異種エンドヌクレアーゼをさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記個々の複合体の異種エンドヌクレアーゼが、他の複合体の異種エンドヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示す、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記異種遺伝子エフェクターと前記異種エンドヌクレアーゼが互いに融合している、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記異種遺伝子エフェクターと前記異種エンドヌクレアーゼが互いに非共有結合によりカップリングしている、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記異種エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質である、請求項８に記載の方法。

【請求項13】

前記Ｃａｓタンパク質が、核酸切断活性を欠く、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ガイド核酸配列が、ガイドＲＮＡ分子の一部である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記異種遺伝子エフェクターが、異種転写調節因子を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記異種遺伝子エフェクターが、異種クロマチン調節因子を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記変化が、前記標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの増強である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記変化が、前記標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの低減である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記異種遺伝子エフェクターが、配列番号１６～１６１５４、１６～１３６０５、または４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を示す、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記異種遺伝子エフェクターが、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つまたは配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を示す、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記異種遺伝子エフェクターが、複数の異なる異種遺伝子エフェクターを含み、前記個々の複合体の前記複数の異なる異種遺伝子エフェクターの組合せが、前記ライブラリーの他の複合体内の異種遺伝子エフェクターの組合せとは異なる、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記複数の異なる異種遺伝子エフェクターのうちの少なくとも１つが、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／またはＨＳＦ１ではない、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記複数の異なる異種遺伝子エフェクターのうちの少なくとも１つが、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）ではない、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記複数の異なる異種遺伝子エフェクターのうちの少なくとも１つが、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａではない、請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

前記異種遺伝子エフェクターが、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／またはＨＳＦ１ではない、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記異種遺伝子エフェクターが、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）ではない、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記異種遺伝子エフェクターが、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａではない、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターが、最大で１種の異種遺伝子エフェクター、最大で２種の異種遺伝子エフェクター、最大で５種の異種遺伝子エフェクター、最大で１０種の異種遺伝子エフェクター、最大で１５種の異種遺伝子エフェクター、最大で２０種の異種遺伝子エフェクター、または最大で５０種の異種遺伝子エフェクターである、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターによってもたらされる前記標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化の程度が、対照によるものより少なくとも２倍大きい、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記程度が、対照によるものより少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍大きい、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記対照が、前記複合体のライブラリーを伴わない細胞の集団である、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記対照が、対照異種遺伝子エフェクターと接触させた細胞の集団である、請求項２９に記載の方法。

【請求項33】

前記対照異種遺伝子エフェクターが、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／またはＨＳＦ１である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記対照異種遺伝子エフェクターが、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）である、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記対照異種遺伝子エフェクターが、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、ＥＲＤ、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａである、請求項３２に記載の方法。

【請求項36】

追加の細胞の集団において追加の標的内因性遺伝子に対して（ａ）～（ｃ）を実施することをさらに含み、（１）前記標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化をもたらす前記ライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターが、（２）前記追加の標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化をもたらす前記ライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターと異なる、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記細胞の集団と前記追加の細胞の集団が同じ細胞型のものである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞の集団と前記追加の細胞の集団が異なる細胞型のものである、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記細胞の集団が、哺乳動物細胞を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記細胞の集団が、ヒト細胞を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記細胞の集団が、幹細胞を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記細胞の集団が、分化した細胞を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記標的内因性遺伝子が、疾患関連遺伝子である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記標的内因性遺伝子が、分化関連遺伝子である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記標的内因性遺伝子が、加齢関連遺伝子である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前述の請求項のいずれか一項に記載の方法の複合体のライブラリーを含む系。

【請求項47】

前述の請求項のいずれか一項に記載の方法の複合体のライブラリーを含むキット。

【請求項48】

前述の請求項のいずれか一項に記載の方法の複合体のライブラリーの異種遺伝子エフェクターをコードする核酸ライブラリー。

【請求項49】

前述の請求項のいずれか一項に記載の方法の複合体のライブラリーをコードする核酸ライブラリー。

【請求項50】

前述の請求項のいずれか一項に記載の方法の複合体のライブラリーの異種遺伝子エフェクターを集合的に発現する細胞の集団。

【請求項51】

前述の請求項のいずれか一項に記載の方法の複合体のライブラリーを集合的に発現する細胞の集団。

【請求項52】

ガイド部分と異種遺伝子エフェクターとを含む複合体であって、前記異種遺伝子エフェクターが、配列番号２３６３１、１１０２、２０５７、５５４３、９０６６、１１９４８、１５６４６、１７６２９、１９８６０、２１０１５、２１１６６、２２１４９、２２７０７、２３６３９、２５４３０、２５５５５、３２６７８、３３８９０、３４０４７、３５７３７、３８１３８、３８７８０、４０９１３、４０９８５、４０９８６、および４２６２３のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、複合体。

【請求項53】

前記アミノ酸配列が、配列番号２３６３１、１１０２、２０５７、５５４３、９０６６、１１９４８、１５６４６、１７６２９、１９８６０、２１０１５、２１１６６、２２１４９、２２７０７、２３６３９、２５４３０、２５５５５、３２６７８、３３８９０、３４０４７、３５７３７、３８１３８、３８７８０、４０９１３、４０９８５、４０９８６、および４２６２３のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５２に記載の複合体。

【請求項54】

前記異種遺伝子エフェクターが、配列番号２３６３１、１１０２、２０５７、５５４３、９０６６、１１９４８、１５６４６、１７６２９、１９８６０、２１０１５、２１１６６、２２１４９、２２７０７、２３６３９、２５４３０、２５５５５、３２６７８、３３８９０、３４０４７、３５７３７、３８１３８、３８７８０、４０９１３、４０９８５、４０９８６、および４２６２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の複合体。

【請求項55】

前記アミノ酸配列が、配列番号２３６３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５２に記載の複合体。

【請求項56】

前記異種遺伝子エフェクターが、配列番号２３６３１のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の複合体。

【請求項57】

前記アミノ酸配列が、配列番号３３８９０と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５２に記載の複合体。

【請求項58】

前記異種遺伝子エフェクターが、配列番号３３８９０のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の複合体。

【請求項59】

前記アミノ酸配列が、配列番号４０９８５と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５２に記載の複合体。

【請求項60】

前記異種遺伝子エフェクターが、配列番号４０９８５のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の複合体。

【請求項61】

前記異種遺伝子エフェクターが、５００未満のアミノ酸を含有する、請求項５２から６０のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項62】

前記異種遺伝子エフェクターが、１００未満のアミノ酸を含有する、請求項５２から６１のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項63】

前記ガイド部分が、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列に特異的に結合する、請求項５２から６２のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項64】

前記ガイド部分が、ガイド核酸配列を含む、請求項５２から６３のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項65】

前記ガイド核酸配列が、約１０～約３０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、請求項６４に記載の複合体。

【請求項66】

前記ガイド核酸配列が、ガイドＲＮＡである、請求項６４から６５のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項67】

前記ガイド核酸配列が、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項68】

前記ガイド部分が、ヌクレアーゼまたはその一部を含む、請求項５２から６７のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項69】

前記ヌクレアーゼまたはその一部が、野生型バージョンのヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ活性が低下した改変ヌクレアーゼである、請求項６８に記載の複合体。

【請求項70】

前記ヌクレアーゼまたはその一部が、核酸切断活性を実質的に欠く、請求項６８または６９に記載の複合体。

【請求項71】

前記ヌクレアーゼまたはその一部が、Ｃａｓタンパク質またはその一部である、請求項６８から７０のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項72】

前記ヌクレアーゼまたはその一部が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質またはその一部である、請求項６８から７１のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項73】

前記ガイド部分と前記異種遺伝子エフェクターが、必要に応じてリンカーを介して、互いに融合している、請求項５２から７２のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項74】

前記ガイド部分と前記異種遺伝子エフェクターが、互いに非共有結合によりカップリングしている、請求項５２から７２のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項75】

請求項５２から７４のいずれか一項に記載の異種遺伝子エフェクターを含むベクター。

【請求項76】

前記ガイド部分をさらに含む、請求項７５に記載のベクター。

【請求項77】

請求項５２から７６のいずれか一項に記載の複合体を含むベクター。

【請求項78】

請求項５２から７４のいずれか一項に記載の異種遺伝子エフェクターをコードする核酸を含むベクター。

【請求項79】

前記ベクターが、前記ガイド部分またはその構成要素をコードする核酸をさらに含む、請求項７８に記載のベクター。

【請求項80】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７５から７９のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項81】

前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項７５から７９のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項82】

請求項５２から７４のいずれか一項に記載の複合体を含む細胞の集団。

【請求項83】

標的遺伝子の発現または活性をモジュレートする方法であって、前記標的遺伝子を含む細胞の集団を、請求項５２から７４のいずれか一項に記載の複合体または請求項７５から８１のいずれか一項に記載のベクターと接触させるステップを含む、方法。

【請求項84】

前記細胞の集団が、哺乳動物細胞を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記細胞の集団が、ヒト細胞を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項86】

前記細胞の集団が、幹細胞を含む、請求項８３から８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記細胞の集団が、分化した細胞を含む、請求項８３から８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏである、請求項８３から８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｖｏである、請求項８３から８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

それを必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に、請求項５２から７４のいずれか一項に記載の複合体または請求項７５から８１のいずれか一項に記載のベクターを投与するステップを含み、それにより、前記対象における細胞の集団における標的遺伝子の発現または活性をモジュレートする、方法。

【請求項91】

前記標的遺伝子が、標的内因性遺伝子である、請求項８３から９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記標的遺伝子が、疾患関連遺伝子である、請求項８３から９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記標的遺伝子が、分化関連遺伝子である、請求項８３から９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

発現または活性をモジュレートすることが、前記標的遺伝子の発現または活性レベルを増大させることを含む、請求項８３から９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

発現または活性をモジュレートすることが、前記標的遺伝子の発現または活性レベルを低減させることを含む、請求項８３から９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記標的遺伝子の発現または活性が、対照と比較して少なくとも２倍に増大する、請求項９４に記載の方法。

【請求項97】

前記標的遺伝子の発現または活性が、対照と比較して少なくとも２分の１に低減する、請求項９５に記載の方法。

【請求項98】

前記標的遺伝子の発現または活性が、対照よりも少なくとも１０％長い期間にわたってモジュレートされる、請求項８３から９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記標的遺伝子の発現または活性が、少なくとも１２時間にわたってモジュレートされる、請求項８３から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記標的遺伝子の発現または活性が、少なくとも２８日間にわたってモジュレートされる、請求項８３から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記対照が、前記接触させるステップの前の前記細胞の集団である、請求項９６から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記対照が、前記複合体と接触させていない細胞の集団である、請求項９６から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記対照が、対照複合体と接触させた細胞の集団である、請求項９６から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

複数の異種ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、前記複数の異種ポリヌクレオチド配列の各異種ポリヌクレオチド配列が、配列番号４９３３４～４９３３８のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の配列同一性を示す、発現ベクター。

【請求項105】

（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ標的配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列およびそれとは異なる追加のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列とを含むキメラ配列である異種ポリヌクレオチド配列
を含む核酸分子であって、
前記ＣＲＩＳＰＲ標的配列が、前記ＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列および前記追加のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列によって挟まれている、核酸分子。

【請求項106】

複数の異種ポリヌクレオチド配列
を含む核酸分子であって、
（ｉ）前記複数の異種ポリヌクレオチド配列の各異種ポリヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列およびそれとは異なるヒト染色体に由来する追加のポリヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）前記各異種ポリヌクレオチド配列のサイズが、最大で約５０核酸塩基である、核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年７月２０日出願の米国仮特許出願第６３／２２３，８４２号の優先権および利益を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、当該配列表はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２２年７月１７日に作成され、名称は５５１７６－７１５＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは４１，２７７，３７９バイトである。

【背景技術】

【0003】

背景
複雑なネットワークにより遺伝子発現が調節され、細胞の生存、成長、分化、および種々の生理機能が支えられている。一部の場合では、細胞におけるそのような調節をもたらすために１つまたは複数種の特定の遺伝子のスイッチがオンまたはオフになり得る。一部の場合では、特定の遺伝子の異常発現が多くの疾患および状態の一因となる。目的の遺伝子の異常発現は、遺伝子の発現レベルが異常な増大、遺伝子の発現レベルの異常な低減、遺伝子の発現の持続時間の異常な延長、または遺伝子の発現の持続時間の異常な短縮であり得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

概要
特定の遺伝子の発現を望ましいやり方でモジュレートすることが可能な作用剤には治療的利点があり得るが、現在用いられている多くの戦略では、頑強で、持続的、かつ／または可逆的な効果を引き出すことができない。さらに、選択されたわずかな遺伝子エフェクターのみが多種多様な標的遺伝子を調節するために探究され、利用されている。したがって、本開示の種々の態様は、特定の標的遺伝子を調節する（例えば、発現を上方調節する、発現を下方調節する、発現の持続時間を延長または短縮させるなど）の目的に合わせることができる１つまたは複数種の遺伝子エフェクターを含む系、方法、および組成物を提供する。

【0005】

本明細書において、一部の態様では、（ａ）細胞の集団を複合体のライブラリーと接触させるステップであって、ライブラリーの個々の複合体が、（ｉ）ライブラリーの他の複合体内の異種遺伝子エフェクターとは異なる異種遺伝子エフェクター、および（ｉｉ）ライブラリーの他の複合体内のガイド核酸配列と１００％の配列同一性を示すガイド核酸配列を含み、異種遺伝子エフェクターとガイド核酸分子が、細胞の集団内の標的内因性遺伝子に対して特異的結合性を示す個々の複合体を形成しており、ライブラリーが、少なくとも２５種の異なる複合体を含む、ステップ、（ｂ）接触させるステップの後、細胞の集団を、細胞の集団内の標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化に基づいて選別するステップ、ならびに（ｃ）変化をもたらす、ライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターを同定するステップを含む方法が開示される。

【0006】

本明細書において、一部の態様では、（ａ）細胞の集団を複合体のライブラリーと接触させるステップであって、ライブラリーの個々の複合体が、（ｉ）ライブラリーの他の複合体内の異種遺伝子エフェクターとは異なる異種遺伝子エフェクター、および（ｉｉ）ライブラリーの他の複合体内のガイド核酸配列と１００％の配列同一性を示すガイド核酸配列を含み、異種遺伝子エフェクターとガイド核酸配列が、細胞の集団内の標的内因性遺伝子に対して特異的結合性を示す個々の複合体を形成しており、異種遺伝子エフェクターが、ウイルス遺伝子エフェクターを含む、ステップ、（ｂ）接触させるステップの後、細胞の集団を、細胞の集団内の標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化に基づいて選別するステップ、ならびに（ｃ）変化をもたらす、ライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターを同定するステップを含む方法が開示される。

【0007】

一部の実施形態では、ウイルス遺伝子エフェクターは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｅｒｉｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅからなる群から選択されるヒトウイルスに由来する。一部の実施形態では、ウイルス遺伝子エフェクターは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｙｓｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｖｉｒｉｄａｅ、およびＨａｎｔａｖｉｒｉｄａｅからなる群から選択されるヒト－コウモリ共通ウイルスに由来する。一部の実施形態では、ウイルス遺伝子エフェクターは、古細菌トロピックウイルス、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅｓ、Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、サテライトウイルス、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｕｒｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ、ＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅおよびＭｙｏｖｉｒｉｄａｅからなる群から選択されるウイルスに由来する。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも３０種、５０種、１００種、２００種、５００種、１，０００種、２，０００種、５，０００種、または１０，０００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸配列は、約１０～約３０ヌクレオチド、約１５～約２５ヌクレオチド、または約１５ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、個々の複合体は、異種エンドヌクレアーゼをさらに含む。一部の実施形態では、個々の複合体の異種エンドヌクレアーゼは、他の複合体の異種エンドヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示す。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターと異種エンドヌクレアーゼは互いに融合している。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターと異種エンドヌクレアーゼは互いに非共有結合によりカップリングしている。一部の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼはＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は核酸切断活性を欠く。一部の実施形態では、ガイド核酸配列はガイドＲＮＡ分子の一部である。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、異種転写調節因子を含む。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、異種クロマチン調節因子を含む。一部の実施形態では、変化は、標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの増強である。一部の実施形態では、変化は、標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの低減である。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を示す。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つまたは配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を示す。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、複数の異なる異種遺伝子エフェクターを含み、個々の複合体の複数の異なる異種遺伝子エフェクターの組合せは、ライブラリーの他の複合体内の異種遺伝子エフェクターの組合せとは異なる。一部の実施形態では、複数の異なる異種遺伝子エフェクターは、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／またはＨＳＦ１ではない。一部の実施形態では、複数の異なる異種遺伝子エフェクターのうちの少なくとも１つは、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）ではない。一部の実施形態では、複数の異なる異種遺伝子エフェクターのうちの少なくとも１つは、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａではない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／またはＨＳＦ１ではない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）ではない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａではない。一部の実施形態では、１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターは、最大で１種の異種遺伝子エフェクター、最大で２種の異種遺伝子エフェクター、最大で５種の異種遺伝子エフェクター、最大で１０種の異種遺伝子エフェクター、最大で１５種の異種遺伝子エフェクター、最大で２０種の異種遺伝子エフェクター、または最大で５０種の異種遺伝子エフェクターである。一部の実施形態では、１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターによってもたらされる標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化の程度は、対照によるものより少なくとも２倍大きい。一部の実施形態では、程度が、対照によるものより少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍大きい。一部の実施形態では、対照は、複合体のライブラリーを伴わない細胞の集団である。一部の実施形態では、対照は、対照異種遺伝子エフェクターと接触させた細胞の集団である。一部の実施形態では、対照異種遺伝子エフェクターは、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／またはＨＳＦ１である。一部の実施形態では、対照異種遺伝子エフェクターは、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）である。一部の実施形態では、対照異種遺伝子エフェクターは、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ、ＥＲＤ、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａである。一部の実施形態では、方法は、追加の細胞の集団において追加の標的内因性遺伝子に対して（ａ）～（ｃ）を実施することをさらに含み、（１）標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化をもたらすライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターは、（２）追加の標的内因性遺伝子の発現または活性レベルの変化をもたらすライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターと異なる。一部の実施形態では、細胞の集団および追加の細胞の集団は、同じ細胞型のものである。一部の実施形態では、細胞の集団および追加の細胞の集団は、異なる細胞型のものである。一部の実施形態では、細胞の集団は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は、ヒト細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は、分化した細胞を含む。一部の実施形態では、標的内因性遺伝子は、疾患関連遺伝子である。一部の実施形態では、標的内因性遺伝子は、分化関連遺伝子である。一部の実施形態では、標的内因性遺伝子は、加齢関連遺伝子である。

【0008】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの方法の複合体のライブラリーを含む系が開示される。

【0009】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの方法の複合体のライブラリーを含むキットが開示される。

【0010】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの方法の複合体のライブラリーの異種遺伝子エフェクターをコードする核酸ライブラリーが開示される。

【0011】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの方法の複合体のライブラリーをコードする核酸ライブラリーが開示される。

【0012】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの方法の複合体のライブラリーの異種遺伝子エフェクターを集合的に発現する細胞の集団が開示される。

【0013】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの方法の複合体のライブラリーを集合的に発現する細胞の集団が開示される。

【0014】

本明細書において、一部の態様では、ガイド部分と異種遺伝子エフェクターとを含む複合体であって、異種遺伝子エフェクターが、配列番号２３６３１、１１０２、２０５７、５５４３、９０６６、１１９４８、１５６４６、１７６２９、１９８６０、２１０１５、２１１６６、２２１４９、２２７０７、２３６３９、２５４３０、２５５５５、３２６７８、３３８９０、３４０４７、３５７３７、３８１３８、３８７８０、４０９１３、４０９８５、４０９８６、および４２６２３のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、複合体が開示される。

【0015】

一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号２３６３１、１１０２、２０５７、５５４３、９０６６、１１９４８、１５６４６、１７６２９、１９８６０、２１０１５、２１１６６、２２１４９、２２７０７、２３６３９、２５４３０、２５５５５、３２６７８、３３８９０、３４０４７、３５７３７、３８１３８、３８７８０、４０９１３、４０９８５、４０９８６、および４２６２３のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２３６３１、１１０２、２０５７、５５４３、９０６６、１１９４８、１５６４６、１７６２９、１９８６０、２１０１５、２１１６６、２２１４９、２２７０７、２３６３９、２５４３０、２５５５５、３２６７８、３３８９０、３４０４７、３５７３７、３８１３８、３８７８０、４０９１３、４０９８５、４０９８６、および４２６２３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号２３６３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２３６３１のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号３３８９０と少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号３３８９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号４０９８５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号４０９８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、５００未満のアミノ酸を含有する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、１００未満のアミノ酸を含有する。一部の実施形態では、ガイド部分は、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列に特異的に結合する。一部の実施形態では、ガイド部分は、ガイド核酸配列を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸配列が、約１０～約３０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ガイド核酸配列は、ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイド核酸配列は、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ガイド部分は、ヌクレアーゼまたはその一部を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはその一部は、野生型バージョンのヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ活性が低下した改変ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはその一部は、核酸切断活性を実質的に欠く。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはその一部は、Ｃａｓタンパク質またはその一部である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼまたはその一部は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質またはその一部である。一部の実施形態では、ガイド部分と異種遺伝子エフェクターは、必要に応じてリンカーを介して、互いに融合している。一部の実施形態では、ガイド部分と異種遺伝子エフェクターは、互いに非共有結合によりカップリングしている。

【0016】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの異種遺伝子エフェクターを含むベクターが開示される。一部の実施形態では、ベクターは、ガイド部分をさらに含む。

【0017】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの複合体を含むベクターが開示される。

【0018】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの異種遺伝子エフェクターをコードする核酸を含むベクターが開示される。

【0019】

一部の実施形態では、ベクターは、ガイド部分またはその構成要素をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。

【0020】

本明細書において、一部の態様では、前述の実施形態のいずれか１つの複合体を含む細胞の集団が開示される。

【0021】

本明細書において、一部の態様では、標的遺伝子の発現または活性をモジュレートする方法であって、標的遺伝子を含む細胞の集団を、前述の実施形態のいずれか１つの複合体またはベクターと接触させるステップを含む、方法が開示される。

【0022】

一部の実施形態では、細胞の集団は、哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は、ヒト細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は、分化した細胞を含む。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏである。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏである。

【0023】

本明細書において、一部の態様では、それを必要とする対象を処置する方法であって、対象に、前述の実施形態のいずれか１つの複合体またはベクターを投与するステップを含み、それにより、対象における細胞の集団における標的遺伝子の発現または活性をモジュレートする、方法が開示される。

【0024】

一部の実施形態では、標的遺伝子は、標的内因性遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、疾患関連遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、分化関連遺伝子である。一部の実施形態では、発現または活性をモジュレートすることは、標的遺伝子の発現または活性レベルを増大させることを含む。一部の実施形態では、発現または活性をモジュレートすることは、標的遺伝子の発現または活性レベルを低減させることを含む。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現または活性が対照と比較して少なくとも２倍に増大する。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現または活性が対照と比較して少なくとも２分の１に低減する。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現または活性が対照よりも少なくとも１０％長い期間にわたってモジュレートされる。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現または活性が少なくとも１２時間にわたってモジュレートされる。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現または活性が少なくとも２８日間にわたってモジュレートされる。一部の実施形態では、対照は、接触させるステップの前の細胞の集団である。一部の実施形態では、対照は、複合体と接触させていない細胞の集団である。一部の実施形態では、対照は、対照複合体と接触させた細胞の集団である。

【0025】

本明細書において、一部の態様では、複数の異種ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、複数の異種ポリヌクレオチド配列の各異種ポリヌクレオチド配列が、配列番号４９３３４～４９３４１または４９３４４～４９３５２のうちのいずれか１つまたは複数のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の配列同一性を示す、発現ベクターが開示される。

【0026】

本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３３４と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。
本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３３５と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３３６と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３３７と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３３８と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３３９と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３４０と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３４１と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３４４と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３４５と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３４６と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３４７と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３４８と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３４９と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３５０と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３５１と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３５２と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。

【0027】

本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３３４～４９３４１または４９３４４～４９３５２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の配列同一性を示す。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９３３４～４９３４１または４９３４４～４９３５２のうちのいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の配列同一性を示す。

【0028】

本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、各異種ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ標的配列および（ｉｉ）１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ標的配列は、２つの異なるＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列によって挟まれている。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ１２ ＰＡＭ配列を含む。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９ ＰＡＭ配列を含む。

【0029】

本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、複数には、４つまたはそれよりも多くの異種ポリヌクレオチド配列が含まれる。本明細書に開示される発現ベクターのいずれか１つの一部の実施形態では、複数には、６つまたはそれよりも多くの異種ポリヌクレオチド配列が含まれる。

【0030】

別の態様では、本開示は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ標的配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列およびそれとは異なる追加のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列とを含むキメラ配列である異種ポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ＣＲＩＳＰＲ標的配列が、ＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列と追加のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列によって挟まれている、核酸分子を提供する。

【0031】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は一本鎖である。

【0032】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列と追加のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列の間の距離は、最大で約５０核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、距離は最大で約４０核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、距離は最大で約３５核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、距離は最大で約２５核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、距離は最大で約２０核酸塩基である。

【0033】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ標的配列のサイズは少なくとも約１０核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、サイズは少なくとも約１５核酸塩基である。

【0034】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列と追加のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列は、異なるＣＲＩＳＰＲ型によって認識される。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列と追加のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列のうちの一方は、Ｃａｓ１２またはそのバリアントによって認識される。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列と追加のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列のうちの一方は、Ｃａｓ９またはそのバリアントによって認識される。

【0035】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は非コード配列である。

【0036】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ標的配列は、配列番号４９３３４と少なくとも約８０％の配列同一性を示す。

【0037】

別の態様では、本開示は、複数の異種ポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、（ｉ）複数の異種ポリヌクレオチド配列の各異種ポリヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列およびそれとは異なるヒト染色体に由来する追加のポリヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）各異種ポリヌクレオチド配列のサイズが最大で約５０核酸塩基である、核酸分子を提供する。

【0038】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、サイズは最大で約４０核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、サイズは最大で約３０核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、サイズは最大で約２５核酸塩基である。

【0039】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列のサイズは少なくとも約５核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、追加のポリヌクレオチド配列のサイズは少なくとも約５核酸塩基である。

【0040】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、複数のうちの１つの異種ポリヌクレオチド配列と追加の異種ポリヌクレオチド配列の間の距離は最大で約１００核酸塩基である。

【0041】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、距離は最大で約８０核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、距離は最大で約６０核酸塩基である。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、距離は最大で約５０核酸塩基である。

【0042】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列はそれぞれが非コード配列である。

【0043】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列および追加のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが表面抗原分類（ＣＤ）タンパク質に由来する。

【0044】

本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、複数には、４つまたはそれよりも多くの異種ポリヌクレオチド配列が含まれる。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、複数には、６つまたはそれよりも多くの異種ポリヌクレオチド配列が含まれる。

【0045】

別の態様では、本開示は、本明細書に開示される核酸配列のいずれか１つを含む発現ベクターを提供する。

【0046】

本明細書に開示される発現ベクターまたは核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、発現ベクターまたは核酸分子は、異種ポリヌクレオチド配列（１つまたは複数）の下流に上流活性化配列（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＵＡＳ）をさらに含む。本明細書に開示される発現ベクターまたは核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ＵＡＳは非ヒトＵＡＳである。本明細書に開示される発現ベクターまたは核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、ＵＡＳは、酵母ＧＡＬ４プロモーターに由来する。

【0047】

本明細書に開示される発現ベクターまたは核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、発現ベクターまたは核酸分子は、プロモーターをさらに含む。

【0048】

本明細書に開示される発現ベクターまたは核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、複数の異種ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つはプロモーターの上流にある。本明細書に開示される発現ベクターまたは核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、プロモーターは、強力なヒト構成的プロモーターである。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、プロモーターは、弱いウイルス性最小プロモーターである。本明細書に開示される核酸分子のいずれか１つの一部の実施形態では、発現ベクターまたは核酸分子は、プロモーターの制御下にある標的遺伝子をさらに含む。

【0049】

別の態様では、本開示は、本明細書に開示される発現ベクターまたは核酸配列のいずれか１つを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞であり得る。

【0050】

別の態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、（ａ）（ｉ）本明細書に開示される核酸配列のいずれか１つ、（ｉｉ）プロモーター、および（ｉｉ）標的遺伝子を含むベクターを準備するステップ、ならびに、核酸配列を、プロモーターと相互作用して、標的遺伝子の発現レベルをモジュレートすることが可能なアクチュエーター部分と接触させるステップを含む、方法を提供する。

【0051】

本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、アクチュエーター部分は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと遺伝子エフェクターとを含む複合体である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、遺伝子エフェクターは、遺伝子活性化因子である。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、遺伝子エフェクターは、遺伝子リプレッサーである。本明細書に開示される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、複合体は、異種ポリヌクレオチド配列（１つまたは複数）に対して特異的結合性を示すガイド核酸分子をさらに含む。
参照による組込み

【0052】

本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。

【0053】

本開示の新規特色は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の詳細な説明および付属図を参照することにより、本開示の特色および利点のより良好な理解が得られよう。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】図１は、ＣＤ４５発現を活性化するまたはＣＤ７１発現を低減させるヒト核タンパク質を同定するための例示的なエフェクタースクリーン設計の概要を提示する。

【0055】

【図2】図２は、本開示のベクターを生成するために使用することができる出発ベクター骨格を例示する。

【0056】

【図3】図３は、下流のレポーター遺伝子のＩＲＥＳ駆動性発現を伴う、異種エフェクターと融合したｄＣａｓ９をコードする本開示のベクターを例示する。

【0057】

【図4】図４は、例示的な細胞株における相対的なベースラインＣＤ４５発現を示す。

【0058】

【図5】図５は、例示的な細胞株における相対的なベースラインＣＤ７１発現を示す。

【0059】

【図6】図６は、本開示の複合体によるＣＤ４５およびＣＤ７１のモジュレーション、ならびに得られたＣＤ４５およびＣＤ７１の発現プロファイルに基づいた細胞選別を示す。活性化因子スクリーンの実験条件でＣＤ４５発現の増大を観察することができ（右上のパネル）、リプレッサースクリーンの実験条件でＣＤ７１発現の低減を観察することができる（右下のパネル）。

【0060】

【図7】図７は、本開示のコンビナトリアルスクリーンのための発現構築物の例示的な概略図を提示する。

【0061】

【図8】図８は、ＧＡＩ－ｄＣａｓ９－ＡＢＩを安定に発現する細胞株を生成するための発現構築物の例示的な概略図を提示する。この試薬を本開示のコンビナトリアルスクリーンに使用することができる。

【0062】

【図9】図９は、ｄＣａｓ９と会合した転写調節因子とクロマチン調節因子の組合せを含む本開示の複合体によるＣＤ４５発現およびＣＤ７１発現のモジュレーションを例示する。上の画像は、ＣＤ４５についての例示的な活性化因子スクリーンを示すものであり、下の画像は、ＣＤ７１についての例示的なリプレッサースクリーンを示す。右のグラフは、本開示の複合体によるＣＤ４５発現の増大、および本開示の複合体によるＣＤ７１発現の抑制を例示する。

【0063】

【図10】図１０は、工学的に操作された合成レポーター（ＥＳＲ）の発現ベクターの構造の例を概略的に示す。図１０には配列番号４９３４０（完全な配列が示されている）が開示され、この配列には、配列番号４９３３４（「合成ガイド標的」）配列番号４９３４１（「ＵＡＳ」）、配列番号４９３３５（Ｃａｓ１２ａ／ＭＩＮＩ ＰＡＭ＋合成ガイド標的）、配列番号４９３３６（合成ガイド標的＋ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ）、配列番号４９３３７（合成ガイド標的＋ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭおよびＳａＣａｓ９ ＰＡＭ）、配列番号４９３３８（Ｃａｓ１２ａ／ｍｉｎｉ ＰＡＭ＋合成ガイド標的＋ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭおよびＳａＣａｓ９ ＰＡＭ）、および配列番号４９３３９（Ｃａｓ１２ａ／ｍｉｎｉ ＰＡＭ＋合成ガイド標的＋ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ）が含まれる。

【0064】

【図11】図１１は、ＥＳＲの配列の例を概略的に示す。図１１には、配列番号４９３４４（Ｃａｓ１２ａ／ｍｉｎｉ ＰＡＭ（ＴＴＴＡ）、異種ガイド標的（配列番号４９３３４）、Ｃａｓ９ ＰＡＭ（ＣＧＧ）、およびＵＡＳ（配列番号４９３４１）を含む単一ＥＳＲリピート）；配列番号４９３４５（７コピーのＥＳＲリピート）；配列番号４９３４６（ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター）；ならびに配列番号４９３４７（ＥＦ１αプロモーター）が開示される。

【0065】

【図12】図１２は、対照レポーターベクターの配列の例を概略的に示す。図１２には、配列番号４９３４８（Ｃａｓ１２ａ／ｍｉｎｉ ＰＡＭ（ＴＴＴＡ）、Ｃａｓ９ ＰＡＭ（ＣＣＣ）、Ｃａｓ９スペーサー（配列番号４９３４９）、およびＣａｓＭＩＮＩ／Ｃａｓ１２ａスペーサー（配列番号４９３５０）を含む単一ＴＲＥ３Ｇ＿リピート）；ならびに完全なＴＲＥ３ＧＳ＿プロモーター（７コピーのＴＲＥ３Ｇリピートおよび改変ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター（配列番号４９３５２）を含む配列番号４９３５１）が開示される。

【0066】

【図13】図１３は、ｍｉｎｉＣＭＶ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（ＥＳＲ１２１）のフローサイトメトリーデータ解析を示す。

【0067】

【図14】図１４は、ＥＦ１ａ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（ＥＳＲ２２１）のフローサイトメトリーデータ解析を示す。

【0068】

【図15】図１５は、ｍｉｎｉＣＭＶ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーターＫ５６２細胞株（ＥＳＲ１１１）のフローサイトメトリーデータ解析を示す。

【0069】

【図16】図１６は、ＥＦ１ａ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーターＫ５６２細胞株（ＥＳＲ２１１）のフローサイトメトリーデータ解析を示す。

【0070】

【図17】図１７は、ｍｉｎｉＣＭＶ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（ＥＳＲ１２１）の異なるフローサイトメトリーデータ解析を示す。

【0071】

【図18】図１８は、ＥＦ１ａ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（ＥＳＲ２２１）の異なるフローサイトメトリーデータ解析を示す。

【0072】

【図19】図１９は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（クローン１）、ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作された追加のレポーター２９３Ｔ細胞株（クローン２）、ＧＦＰをコードする対照発現ベクターを発現する対照レポーター２９３Ｔ細胞株（ＴＲＥ３Ｇ－ＧＦＰ）、およびＧＦＰをコードする対照発現ベクターを発現する追加の対照レポーター２９３Ｔ細胞株（ＳＶ４０－ＧＦＰ）のフローサイトメトリーデータ解析を示し、ここで、ＥＳＲ－ＥＦ１ａ ２９３Ｔクローン細胞株では既存のレポーター細胞よりも狭いＧＦＰ発現の分布が示される。

【0073】

【図20】図２０は、標的遺伝子（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ７１）の発現を活性化するもしくは低減させる異種遺伝子エフェクター、またはＧＦＰレポーター遺伝子を同定するための例示的なスクリーン設計の概要を提示する。

【0074】

【図21】図２１Ａは、それぞれ陽性対照構築物ＶＰＲまたはＫＲＡＢからのＥＳＲ－ＧＦＰ転写活性化または抑止の高いダイナミックレンジを示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを提示する。

【0075】

図２１Ｂは、２つの内因性ヒト遺伝子標的：活性化については低度に発現されるＣＤ４５、または抑止については高度に発現されるＣＤ７１の転写活性化または抑制を示す代表的なヒストグラムを提示する。

【0076】

【図22】図２２Ａは、増強された合成レポーター系を使用した候補活性化因子異種遺伝子エフェクターについてのスクリーンにおけるヒットを示す火山プロットである。

【0077】

図２２Ｂは、増強された合成レポーター系を使用した候補リプレッサー異種遺伝子エフェクターについてのスクリーンにおけるヒットを示す火山プロットである。

【0078】

【図23】図２３Ａは、野生型Ｋ５６２細胞における内因性遺伝子（ＣＤ４５）を使用した候補活性化因子異種遺伝子エフェクターについてのスクリーンにおけるヒットを示す火山プロットである。

【0079】

図２３Ｂは、野生型Ｋ５６２細胞における内因性遺伝子（ＣＤ７１）を使用した候補リプレッサー異種遺伝子エフェクターについてのスクリーンにおけるヒットを示す火山プロットである。

【0080】

【図24-1】図２４Ａは、ｓｇＲＮＡによってＣＸＣＲ４に標的化される本明細書に開示される異種遺伝子エフェクターを含む複合体をコードするプラスミドを用いたトランスフェクションの３日後および７日後のＣＸＣＲ４発現の幾何平均を示す。

【0081】

【図24-2】図２４Ｂは、１つの新規活性化因子（ＥＰＩＣＸＶ．１）の標準活性化因子（ＶＰＲ）に対する相対的な性能、および１つの新規サプレッサー（ＥＰＩＣＸＶ．７１）の標準サプレッサー（ＫＲＡＢ）に対する相対的な性能を示す。示されているモジュレーターはｄＣａｓＭｉｎｉと融合したものである。

【0082】

図２４Ｃは、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓＭｉｎｉ、標準活性化因子ＶＰＲ、およびこれらの融合物をコードする配列の相対的なサイズ（ｂｐ）を本明細書に開示される新規候補エフェクター（ＥＰＩＣＸＶ）と比較して例示する。

【0083】

【図25】図２５Ａは、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物およびヒトＩＦＮＧを標的化するｓｇＲＮＡで処理した３日後にＥＬＩＳＡによって決定されたＩＦＮｇ分泌を示す。

【0084】

図２５Ｂは、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物およびＣＤ４５を標的化するｓｇＲＮＡで処理した２日後にフローサイトメトリーによって決定されたＣＤ４５表面発現を示す。

【0085】

図２５Ｃは、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物およびＣＤ２を標的化するｓｇＲＮＡで処理した３日後にフローサイトメトリーによって決定されたＣＤ２表面発現を示す。

【0086】

図２５Ｄは、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物およびＣＤ２を標的化するｓｇＲＮＡで処理した５日後にフローサイトメトリーによって決定されたＣＤ２表面発現を示す。

【0087】

【図26】図２６Ａは、フローサイトメトリーによって決定された、ｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物およびレポーターを標的化するｓｇＲＮＡで処理した２日後の、ＴＲＥ３Ｇプロモーターにより駆動されるＧＦＰが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＧＦＰレポーター発現を示す。

【0088】

図２６Ｂは、フローサイトメトリーによって決定された、ｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物およびレポーターを標的化するｓｇＲＮＡで処理した２日後の、低発現ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ合成レポーターが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＧＦＰレポーター発現を示す。

【0089】

【図27】図２７Ａは、フローサイトメトリーによって決定された、ｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物およびレポーターを標的化するｓｇＲＮＡで処理した５日後の、高発現ＥＦ１αプロモーターによって駆動されるＧＦＰ合成レポーターが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＧＦＰレポーター発現を示す。

【0090】

図２７Ｂは、フローサイトメトリーによって決定された、ｄＣａｓ９－エフェクター融合物およびレポーターを標的化するｓｇＲＮＡで処理した５日後の、高発現ＥＦ１αプロモーターによって駆動されるＧＦＰ合成レポーターが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＧＦＰレポーター発現を示す。

【0091】

【図28-1】図２８Ａは、フローサイトメトリーによって決定された、ｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物およびＣＸＣＲ４を標的化するｓｇＲＮＡを用いたトランスフェクションの３日後、７日後、１５日後、および２８日後の異種遺伝子エフェクターの、内因性遺伝子ＣＸＣＲ４の発現に対する効果を要約する。

【0092】

【図28-2】図２８Ｂは、ｓｇＲＮＡによってＣＸＣＲ４に標的化される、本明細書に開示される異種遺伝子エフェクターを含む複合体または対照をコードするプラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションの３日後、７日後、１５日後、および２８日後の正規化されたＣＸＣＲ４発現値を示す。エフェクターが各時点における効果量によって順位付けされている。

【0093】

【図29-1】図２９Ａは、対照エフェクター（破線）と比較した、本明細書に開示される候補異種遺伝子エフェクターの遺伝子発現に対する経時的な効果を示す。示されているエフェクターはｄＣａｓＭｉｎｉと融合したものである。

【0094】

図２９Ｂは、持続的な抑制のための、ｄＣａｓ９と融合したＫＲＡＢ、ＤＮＭＴ３Ａ、およびＤＮＭＴ３Ｌドメインを含む構築物である陽性対照ｄＣａｓ９－ＫＡＬについての代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを提示する。時点が進むにつれて標的遺伝子発現の抑制が増大することが示されている。

【0095】

図２９Ｃは、ｄＣａｓＭｉｎｉと融合したエフェクターを比較する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを提示する。陰性対照（モジュレーターを伴わないｄＣａｓＭｉｎｉ）および陽性対照リプレッサーが新規サプレッサー（ＥＰＩＣＸＶ．６７）と比較して示されている。

【0096】

【図29-2】図２９Ｄは、ＥＳＲ－ＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるプラスミドトランスフェクション後のｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクターの経時的な発現を実証する測定値を示す（ｍＣｈｅｒｒｙレポーターに反映される）。

【0097】

図２９Ｅは、本発明でスクリーニングされた新規のコンパクトなモジュレーター（接頭辞ＥＰＩＣＸＶ）と比較した、陽性対照融合物（ＫＡＬ）およびそれを構成する構成要素の相対的なサイズ（ｂｐ）を比較する棒グラフを提示する。

【0098】

図２９Ｆは、本発明で試験した本ｄＣａｓＭｉｎｉ－ＥＰＩＣＸＶ構築物と比較した、遺伝子発現の持続的な抑止のためのｄＣａｓ９－ＫＡＬ対照の相対的なサイズ（ｂｐ）を比較する棒グラフを提示する。

【0099】

【図29-3】図２９Ｇは、ＥＳＲ－ＧＦＰ細胞についての７７ｄ．ｐ．ｔ．における陽性対照および選択された候補異種遺伝子エフェクター（ＥＰＩＣＸＶ）の各実験的反復についての正規化されたレポーターＧＦＰ蛍光値を示す。

【0100】

【図30】図３０は、ＥＳＲ－ＧＦＰ合成レポーター細胞における正規化されたＧＦＰ蛍光（３ｄ．ｐ．ｔ．から７７ｄ．ｐ．ｔ．までの全ての時点にわたって平均したもの；ｙ軸）と正規化されたＣＸＣＲ４－ＡＰＣ蛍光（３ｄ．ｐ．ｔ．から２８ｄ．ｐ．ｔ．までの全ての時点にわたって平均したもの；ｘ軸）の相関を示す。

【発明を実施するための形態】

【0101】

詳細な説明
遺伝子発現は、細胞および組織における種々の生理的および病理学的作用を支えるものであり、多くの疾患および状態の一因となっている。したがって、特定の遺伝子の発現を望ましいやり方でモジュレートする作用剤には治療的利点があり得る。

【0102】

しかし、多くの候補治療薬では、わずかであるか長続きしない効果しか実現されない、または逆にオフターゲット作用が生じるので、遺伝子発現の頑強、持続的かつ／または可逆的な変化を引き出す作用剤を開発することは困難であることが証明されている。さらに、遺伝子編集およびゲノム工学のための多くの現行の手法では、望ましくない毒性プロファイルを伴い得るオフターゲット作用がもたらされる恐れがあり、一部の場合では、望ましくない効果は恒久的なものであり得る。したがって、標的遺伝子の発現および活性、例えば、ヒト疾患に影響を及ぼす遺伝子の発現の頑強、持続的かつ／または可逆的モジュレーションを可能にする遺伝子発現を調節するための新規戦略が必要とされている。

【0103】

エピジェネティックに作用する分子ツールには、効率的であり、たいきゅうせいがあり、かつリスクが低い、遺伝子発現の治療的モジュレーションを引き出す潜在性がある。一部の実施形態では、本開示は、標的遺伝子発現を効率的、効果的、かつ持続的にエピジェネティック改変することが可能な新規エフェクタードメインを同定するための組成物および方法を提供する。例えば、特定の標的遺伝子（複数可）（例えば、標的内因性遺伝子（複数可））の発現または活性をモジュレートする（例えば、上方調節または下方調節する）ための異種遺伝子エフェクタードメインおよびエフェクタードメインとガイド部分の複合体が提供される。

【0104】

異種遺伝子エフェクターの組合せには、遺伝子発現の調節に関して、例えば相乗効果によって、有利なアウトカムを実現する潜在性もある。一部の実施形態では、本開示は、異種遺伝子エフェクターの新規組合せ、例えば、ヒト核プロテオーム、ウイルス性供給源、および／または本明細書に開示される他の型の異種遺伝子エフェクターに由来するクロマチン調節因子および／または転写調節因子であるエフェクタードメインの組合せを含む組成物および方法を提供する。

【0105】

状況依存的効果により、遺伝子発現および活性の治療的モジュレーションに関する追加の困難が示される。例えば、特定の標的遺伝子（例えば、特定の標的内因性遺伝子）の発現、細胞型、対象などに対する望ましい効果を実現する戦略または転写モジュレーターにより、異なる標的遺伝子（例えば、異なる標的内因性遺伝子）、細胞型、または対象に対しては所望の効果が実現されない場合がある。一部の場合では、本開示の系および方法は、特定の標的遺伝子（例えば、特定の標的内因性遺伝子）、特定の細胞型、特定の標的疾患、特定の対象などに対してカスタマイズされる、または適用可能である、または特に適する。

【0106】

一部の実施形態では、本開示は、特定の標的遺伝子（複数可）（例えば、特定の標的内因性遺伝子（複数可））の発現をモジュレートするために、ハイスループットスクリーンを行って、異種遺伝子エフェクタードメインおよびエフェクタードメインとガイド部分との複合体を同定するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、研究などの他の目的のためにまたは治療薬として使用することができる、本明細書に開示される系によって同定される複合体を提供する。
異種遺伝子エフェクター

【0107】

本開示は、異種遺伝子エフェクター（例えば、本開示の複合体内の遺伝子エフェクターおよび／または別の構成要素を含む細胞に対して異種である遺伝子エフェクター）を利用する組成物、系、方法および方法（例えば、複合体およびライブラリー）を提供する。異種遺伝子エフェクターは、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現をモジュレートする、例えば、遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを活性化させる、抑制する、上方調節する、下方調節する、または安定化させることが可能である、またはそのための候補であるドメインを含む。異種遺伝子エフェクターは、複合体に存在する別の構成要素、例えば、ガイド部分（例えば、本明細書に開示されるヌクレアーゼおよび／またはガイド核酸）に対して異種であり得る。一部の場合では、異種遺伝子エフェクターは、それらが導入される宿主細胞に対して異種であり得る。

【0108】

異種遺伝子エフェクターは、任意の適切な供給源由来の配列、例えば、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、または本明細書に開示される他のタンパク質由来のアミノ酸配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、主に核に局在しているタンパク質、例えば、ヒト核プロテオームのメンバー由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、１つまたは複数の天然のアミノ酸残基であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、１つまたは複数の合成アミノ酸残基であり得るまたはそれを含み得る。

【0109】

異種遺伝子エフェクターは、哺乳動物タンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ヒトタンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ウイルスタンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ヒト霊長類タンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、非ヒト哺乳動物タンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、非齧歯類哺乳動物タンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、植物タンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ブタタンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ウサギタンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、イヌタンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、トリタンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、爬虫類タンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、細菌タンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、古細菌タンパク質由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。

【0110】

異種遺伝子エフェクターは、クロマチン調節因子（ＣＲ）由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。クロマチン調節因子としては、種々のクラスのヒストンおよびＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＭＴ、ＨＡＴ、ＨＭＴなど）由来の機能的ドメインが挙げられる。

【0111】

異種遺伝子エフェクターは、クロマチン調節因子由来の２つまたはそれよりも多くのドメイン、例えば、ポリペプチド配列のＣ末端、Ｎ末端、または内部に、タンデムにまたは別々に位置するドメインを含み得る。

【0112】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヘテロクロマチン形成を容易にするものである。ヘテロクロマチン形成を容易にし得るタンパク質の非限定的な例としては、ＨＰ１α、ＨＰ１β、ＫＡＰ１、ＫＲＡＢ、ＳＵＶ３９Ｈ１、およびＧ９ａが挙げられる。

【0113】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヒストンをメチル化によってモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、アセチル化によってモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、リン酸化によってモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＡＤＰ－リボシル化によってモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、グリコシル化によってモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＳＵＭＯ化によってモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ユビキチン化によってモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、例えば、ＡＴＰ加水分解依存性プロセスによってヒストン構造をリモデリングすることによってヒストンをモジュレートする。

【0114】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、標的ポリヌクレオチド、例えば、転写リプレッサー、転写因子、ヒストンなどまたはその付近へのタンパク質の空間的位置づけを容易にする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、例えば、多様な細胞機能を調節するために、核および／または細胞質におけるゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ構成要素の時空間的組織化を操作するために有用である。

【0115】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、関連するヒストンアセチルトランスフェラーゼのファミリーに由来する。ヒストンアセチルトランスフェラーゼの非限定的な例としては、ＧＮＡＴサブファミリー、ＭＹＳＴサブファミリー、ｐ３００／ＣＢＰサブファミリー、ＨＡＴ１サブファミリー、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＭＯＦ、ＨＢＯ１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＨＡＴ１、ＡＴＦ－２、ＳＲＣ１、およびＴＡＦＩＩ２５０が挙げられる。

【0116】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼに由来する。ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼの非限定的な例としては、ＥＺＨサブファミリー、非ＳＥＴサブファミリー、他のＳＥＴサブファミリー、ＰＲＤＭサブファミリー、ＳＥＴ１サブファミリー、ＳＥＴ２サブファミリー、ＳＵＶ３９サブファミリー、ＳＹＭＤサブファミリー、ＡＳＨ１Ｌ、ＥＨＭＴ１、ＥＨＭＴ２、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＭＬＬ５、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１０、ＰＲＤＭ１１、ＰＲＤＭ１２、ＰＲＤＭ１３、ＰＲＤＭ１４、ＰＲＤＭ１５、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＤＭ２、ＰＲＤＭ４、ＰＲＤＭ５、ＰＲＤＭ６、ＰＲＤＭ７、ＰＲＤＭ８、ＰＲＤＭ９、ＳＥＴ１、ＳＥＴ１Ｌ、ＳＥＴ２Ｌ、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＤ３、ＳＥＴＤ４、ＳＥＴＤ５、ＳＥＴＤ６、ＳＥＴＤ７、ＳＥＴＤ８、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＳＥＴＭＡＲ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＳＹＭＤ１、ＳＹＭＤ２、ＳＹＭＤ３、ＳＹＭＤ４、およびＳＹＭＤ５が挙げられる。

【0117】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、クロマチンリモデリング複合体の構成要素に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＢＡＦ、例えば、アクチン、ＡＲＩＤＡ／Ｂ、ＢＡＦ１５５、ＢＡＦ１７０、ＢＡＦ４５ Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ、ＢＡＦ５３ Ａ／Ｂ、ＢＡＦ５７、ＢＡＦ６０ Ａ／Ｂ／Ｃ、ＢＲＧ１／ＢＲＭ、ＩＮＩ１、またはＳＳ１８の構成要素である。

【0118】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＰＢＡＦ、例えば、アクチン、ＡＲＩＤ２、ＢＡＦ１５５、ＢＡＦ１７０、ＢＡＦ１８０、ＢＡＦ４５ Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ、ＢＡＦ５３ Ａ／Ｂ、ＢＡＦ５７、ＢＡＦ６０ Ａ／Ｂ／Ｃ、ＢＲＤ７、ＢＲＧ１、またはＩＮＩ１の構成要素に由来する。

【0119】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＩＳＷＩファミリークロマチンリモデリング複合体、例えば、ＡＣＦサブファミリー、ＲＳＦサブファミリー、ＣＥＲＦサブファミリー、ＣＨＲＡＣサブファミリー、ＮＵＲＦサブファミリー、ＮｏＲＣサブファミリー、ＷＩＣＨサブファミリー、ｂ－ＷＩＣＨサブファミリー、ＡＣＦ１、ＡＴＰアーゼ、ＢＰＴＦ、ＣＥＣＲ２、ＣＨＲＡＣ１５、ＣＨＲＡＣ１７、ＣＳＢ、ＤＥＫ、ＭＹＢＢＰ１Ａ、ＮＭ１、ＲＢＡＰ４６／４８、ＲＨＩＩ／Ｇｕａ、ＲＳＦ１、ＳＡＰ１５５、ＳＮＦ２Ｈ、ＳＮＦ２Ｈ／Ｌ、ＳＮＦ２Ｌ、ＴＩＰ５、またはＷＳＴＦの構成要素に由来する。

【0120】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＣＨＤファミリー複合体、例えば、ＮｕＲＤ複合体、ＮｕＲＤ様複合体、またはＣＨＤ複合体の構成要素に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＣＨＤ１／２／６／７／８／９、ＣＨＤ３／４、ＣＨＤ５、ＧＡＴＡＤ２ Ａ／Ｂ、ＧＡＴＡＤ２ Ｂ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ２、ＭＢＤ２／３、ＭＴＡ１／２／３、ＭＴＡ３、またはＲＢＡＰ４６、ＲＢＡＰ４６／４８に由来する。

【0121】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＩＮＯ８０ファミリー複合体の構成要素、例えば、ＩＮＯ８０複合体、Ｔｉｐ６０／ｐ４００複合体、ＳＲＣＡＰ複合体、ＡＭＩＤＡ、ＡＲＰ６、ＢＡＦ５３、ＢＡＦ５３、ＢＡＦ５３Ａ、ＢＲＤ８、ＤＭＡＰ１、ＤＭＡＰ１、ＥＰＣ１／２、ＦＬＪ１１７３０、ＧＡＳ４１、ＧＡＳ４１、ＩＥＳ２、ＩＥＳ６、ＩＮＧ３、ＩＮＯ８０、ＩＮＯ８０Ｅ、ＭＣＲＳ１、ＭＲＧ１５、ＭＲＧＢＰ、ＭＲＧＸ、ＮＦＲＫＢ、ｐ４００、ＲＵＶＢＬ１／２、ＲＵＶＢＬ１／２、ＲＵＶＢＬ１／２、ＳＲＣＡＰ、Ｔｉｐ６０、ＴＲＲＡＰ、ＵＣＨ３７、ＹＬ－１、ＹＬ－１、ＹＹ１、またはＺｎＦ－ＨＩＴ１に由来する。

【0122】

異種遺伝子エフェクターは、転写調節因子（ＴＲ）由来の配列であり得るまたはそれを含み得る。ＴＲ遺伝子エフェクターとしては、種々のファミリーの転写因子（例えば、ＫＲＡＢ、ｐ６５、ＭＥＤ、ＧＴＦなど）由来の転写調節ドメインが挙げられる。

【0123】

異種遺伝子エフェクターは、転写活性化因子ドメインを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、例えば、ポリペプチド配列のＣ末端、Ｎ末端、または内部に位置する２つまたはそれよりも多くのタンデムな転写活性化ドメインを含み得る。

【0124】

転写活性化ドメインの非限定的な例としては、ＧＡＬ４、単純ヘルペス活性化ドメインＶＰ１６、ＶＰ６４（単純ヘルペス活性化ドメインＶＰ１６の四量体）、ＮＦ－ＫＢ ｐ６５サブユニット、エプスタイン・バーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）が挙げられる。転写活性化ドメインの例は、Chavez et al., Nat Methods, 2015, 12 (4): 326-328および米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号に記載されている。一部の実施形態では、そのような転写活性化ドメインを本開示の方法において対照として使用する。一部の実施形態では、そのような転写活性化ドメインを、少なくとも１つの追加の異種遺伝子エフェクター（例えば、異なるエフェクター）を含む複合体内の１つの異種遺伝子エフェクターとして使用する。

【0125】

異種遺伝子エフェクターは、転写リプレッサードメインを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、例えば、ポリペプチド配列のＣ末端、Ｎ末端、または内部にタンデムにまたは別々に位置する２つまたはそれよりも多くの転写リプレッサードメインを含み得る。

【0126】

転写リプレッサードメインの非限定的な例としては、ＫｏｘｌのＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス）ドメイン、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、およびＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）が挙げられる。転写リプレッサードメインの例は、Chavez et al., Nat Methods, 2015, 12 (4): 326-328および米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号に記載されている。一部の実施形態では、そのような転写リプレッサードメインを本開示の方法において対照として使用する。一部の実施形態では、そのような転写リプレッサードメインを、少なくとも１つの追加の異種遺伝子エフェクター（例えば、異なるエフェクター）を含む複合体内の１つの異種遺伝子エフェクターとして使用する。

【0127】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、転写因子である遺伝子産物に由来する。

【0128】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、造血幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。造血幹細胞転写因子の非限定的な例としては、ＡＨＲ、Ａｉｏｌｏｓ／ＩＫＺＦ３、ＣＤＸ４、ＣＲＥＢ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＧＲ１、ＦｏｘＯ３、ＧＡＴＡ－１、ＧＡＴＡ－２、ＧＡＴＡ－３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＨＥＳ－１、ＨＨＥＸ、ＨＩＦ－１アルファ／ＨＩＦ１Ａ、ＨＭＧＢ１／ＨＭＧ－１、ＨＭＧＢ３、Ｉｋａｒｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ＬＭＯ２、ＬＭＯ４、ｃ－Ｍａｆ、ＭａｆＢ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＩＬ３／Ｅ４ＢＰ４、Ｎｒｆ２、ｐ５３、ＰＩＴＸ２、ＰＲＤＭ１６／ＭＥＬ１、Ｐｒｏｘ１、ＰＵ．１／Ｓｐｉ－１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＳＡＬＬ４、ＳＣＬ／Ｔａｌ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ７、Ｓｐｉ－Ｂ、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害剤、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ６、およびＴＳＣ２２が挙げられる。

【0129】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、間葉系幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。間葉系幹細胞転写因子の非限定的な例としては、ＤＵＸ４、ＤＵＸ４／ＤＵＸ４ｃ、ＤＵＸ４ｃ、ＥＢＦ－１、ＥＢＦ－２、ＥＢＦ－３、ＥＴＶ５、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＦ１、ＧＡＴＡ－４、ＧＡＴＡ－６、ＨＭＧＡ２、ｃ－Ｊｕｎ、ＭＹＦ－５、ミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ）、ＭｙｏＤ、ミオゲニン（Ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、ＮＦＡＴＣ２、ｐ５３、Ｐａｘ３、ＰＤＸ－１／ＩＰＦ１、ＰＬＺＦ、ＰＲＤＭ１６／ＭＥＬ１、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８、Ｓｍａｄ９、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１１、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害剤、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＸ１８、Ｔｗｉｓｔ－１、およびＴｗｉｓｔ－２が挙げられる。

【0130】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、胚性幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。胚性幹細胞転写因子の非限定的な例としては、ブラキウリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ＥＯＭＥＳ、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＤ３、ＦｏｘＦ１、ＦｏｘＨ１、ＦｏｘＯ１／ＦＫＨＲ、ＧＡＴＡ－２、ＧＡＴＡ－３、ＧＢＸ２、グースコイド（Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ）、ＨＥＳ－１、ＨＮＦ－３アルファ／ＦｏｘＡ１、ｃ－Ｊｕｎ、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ－Ｍａｆ、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＩＸＬ１、ＭＴＦ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ活性化因子、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ阻害剤、ＮＦｋＢ１、ＮＦｋＢ２、Ｏｃｔ－３／４、Ｏｔｘ２、ｐ５３、Ｐａｘ２、Ｐａｘ６、ＰＲＤＭ１４、Ｒｅｘ－１／ＺＦＰ４２、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ４、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害剤、ＳＴＡＴ３、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ６、ＴＣＦ－３／Ｅ２Ａ、ＴＨＡＰ１１、ＵＴＦ１、ＷＤＲ５、ＷＴ１、ＺＮＦ２０６、およびＺＮＦ２８１が挙げられる。

【0131】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）転写因子である遺伝子産物に由来する。ｉＰＳＣ転写因子の非限定的な例としては、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍａｆ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－３／４、ｐ５３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、およびＴＢＸ１８が挙げられる。

【0132】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、上皮幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。上皮幹細胞転写因子の非限定的な例としては、ＡＳＣＬ２／Ｍａｓｈ２、ＣＤＸ２、ＤＮＭＴ１、ＥＬＦ３、Ｅｔｓ－１、ＦｏｘＭ１、ＦｏｘＮ１、ＧＡＴＡ－６、Ｈａｉｒｌｅｓｓ、ＨＮＦ－４アルファ／ＮＲ２Ａ１、ＩＲＦ６、ｃ－Ｍａｆ、ＭＩＴＦ、Ｍｉｚ－１／ＺＢＴＢ１７、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、ＭＹＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ニューロゲニン（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ）－３、ＮＦＡＴＣ１、ＮＫＸ３．１、Ｎｒｆ２、ｐ５３、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、Ｐａｘ２、Ｐａｘ３、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、Ｓｍａｄ８、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害剤、ＳＴＡＴ３、ＳＵＺ１２、ＴＣＦ－３／Ｅ２Ａ、およびＴＣＦ７／ＴＣＦ１が挙げられる。

【0133】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、がん幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。がん幹細胞転写因子の非限定的な例としては、アンドロゲン（Ａｎｄｒｏｇｅｎ）Ｒ／ＮＲ３Ｃ４、ＡＰ－２ガンマ、ベータカテニン、ベータカテニン阻害剤、ブラキウリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ＣＲＥＢ、ＥＲアルファ／ＮＲ３Ａ１、ＥＲベータ／ＮＲ３Ａ２、ＦｏｘＭ１、ＦｏｘＯ３、ＦＲＡ－１、ＧＬＩ－１、ＧＬＩ－２、ＧＬＩ－３、ＨＩＦ－１アルファ／ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ－２アルファ／ＥＰＡＳ１、ＨＭＧＡ１Ｂ、ｃ－Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍａｆ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ７、ＭＩＴＦ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ活性化因子、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ阻害剤、ＮＦｋＢ１、ＮＫＸ３．１、Ｏｃｔ－３／４、ｐ５３、ＰＲＤＭ１４、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害剤、ＳＴＡＴ３、ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１、ＴＢＸ３、Ｔｗｉｓｔ－１、Ｔｗｉｓｔ－２、ＷＴ１、およびＺＥＢ１が挙げられる。

【0134】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、がん関連転写因子である遺伝子産物に由来する。がん関連転写因子の非限定的な例としては、ＡＳＣＬ１／Ｍａｓｈ１、ＡＳＣＬ２／Ｍａｓｈ２、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ４、ＢＬＩＭＰ１／ＰＲＤＭ１、ＣＤＸ２、ＣＤＸ４、ＤＬＸ５、ＤＮＭＴ１、Ｅ２Ｆ－１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ３、Ｅｔｓ－１、ＦｏｓＢ／Ｇ０Ｓ３、ＦｏｘＣ１、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＦ１、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＴＡ－２、ＨＭＧＡ２、ＨＭＧＢ１／ＨＭＧ－１、ＨＮＦ－３アルファ／ＦｏｘＡ１、ＨＮＦ－６／ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＳＦ１、ＩＤ１、ＩＤ２、ＪｕｎＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１７、ＬＭＯ２、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＣＬ１／Ｌ－Ｍｙｃ、ＮＦｋＢ２、Ｏｃｔ－１、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、Ｐａｘ３、ＰＩＴＸ２、Ｐｒｏｘ１、ＲＡＰ８０、Ｒｅｘ－１／ＺＦＰ４２、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＳＡＬＬ４、ＳＣＬ／Ｔａｌ１、Ｓｉｒｔｕｉｎ ２／ＳＩＲＴ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、ＳＯＸ１１、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＴＣＦ７／ＴＣＦ１、ＴＯＲＣ１、ＴＯＲＣ２、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＰＳ１、およびＴＳＣ２２が挙げられる。

【0135】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、免疫細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。免疫細胞転写因子の非限定的な例としては、ＡＰ－１、Ｂｃｌ６、Ｅ２Ａ、ＥＢＦ、Ｅｏｍｅｓ、ＦｏｘＰ３、ＧＡＴＡ３、Ｉｄ２、Ｉｋａｒｏｓ、ＩＲＦ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢ、Ｐａｘ５、ＰＬＺＦ、ＰＵ．１、ＲＯＲガンマＴ、ＳＴＡＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、Ｔ－ｂｅｔ、ＴＣＦ７、およびＴｈＰＯＫが挙げられる。

【0136】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＲＮＡポリメラーゼ関連タンパク質である遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、塩基性ドメインを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、亜鉛配位ＤＮＡ結合性ドメインを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヘリックスターンヘリックスドメインを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、アルファヘリックスＤＮＡ結合性ドメインを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ベータ構造によって露出したアルファヘリックスを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、免疫グロブリンフォールドを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、アルファ／ベータ足場によって露出したベータヘアピンを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＤＮＡに結合するベータシートを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ベータバレルＤＮＡ結合性ドメインを有する転写因子に由来する。

【0137】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、核受容体、例えば核ホルモン受容体である遺伝子産物に由来する。核ホルモン受容体の非限定的な例としては、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ１Ａ１、ＮＲ１Ａ２、ＮＲ１Ｂ１、ＮＲ１Ｂ２、ＮＲ１Ｂ３、ＮＲ１Ｃ１、ＮＲ１Ｃ２、ＮＲ１Ｃ３、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｆ１、ＮＲ１Ｆ２、ＮＲ１Ｆ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｈ５、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｉ１、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ａ１、ＮＲ２Ａ２、ＮＲ２Ｂ１、ＮＲ２Ｂ２、ＮＲ２Ｂ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ａ１、ＮＲ３Ａ２、ＮＲ３Ｂ１、ＮＲ３Ｂ２、ＮＲ３Ｂ３、ＮＲ３Ｃ４、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ３Ｃ３、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、およびＮＲ６Ａ１によってコードされるものが挙げられる。

【0138】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヌクレオソームアセンブリに関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＤＮＡ代謝に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヌクレオチド代謝に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、リボソーム生合成に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、タンパク質フォールディングに関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、翻訳に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、シグナル伝達に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、タンパク質分解に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、エンドペプチダーゼ活性の負の調節に関与する遺伝子産物に由来する。

【0139】

一部の実施形態では、候補異種遺伝子エフェクターの一覧を、活性化するものであるか抑制するものであるか、標的細胞経路、進化的な配列の制約、ＤＮＡ／ＲＮＡ／その両方との結合性、タンパク質フォールディングパターン、宿主／細胞トロピズム、直接的／間接的活性、結合の柔軟な許容性、核／細胞質での作用、および他の基準などの因子によって層別化することができる。一部の実施形態では、そのような層別化により、広範囲の潜在的な分子機能を包含する本開示のスクリーンライブラリーを設計することが可能になり、それにより、本明細書に開示される目的に適した異種遺伝子エフェクターが発見される可能性が増大する。

【0140】

一部の実施形態では、例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、予測的フィルタリング技法を候補異種遺伝子エフェクター配列に適用する。予測的フィルタリング技法には、例えば、酵母における実験によるコア活性化因子ドメイン（例えば、１３ｂｐに至るまで）に適切な生物物理学的特性の同定；酸性のかさのある疎水性のアルファヘリックス、および／または負電荷の存在；効果の持続時間に影響を及ぼす可能性があるモチーフリピートの存在；ならびにＰＡＤＤＬＥ様畳み込みニューラルネットワーク／トランスフォーマアルゴリズムまたは同様の予測技法が含まれ得る。

【0141】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、宿主対象に対して外因性である標的遺伝子、例えば、病原体標的遺伝子または治療介入の結果として発現される外因性遺伝子の発現を調節することができる。

【0142】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くに対して、例えば全長にわたって、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９５％、少なくとも約９９．９９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0143】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くに対して、例えば、全長にわたって、最大で約７０％、最大で約７１％、最大で約７２％、最大で約７３％、最大で約７４％、最大で約７５％、最大で約７６％、最大で約７７％、最大で約７８％、最大で約７９％、最大で約８０％、最大で約８１％、最大で約８２％、最大で約８３％、最大で約８４％、最大で約８５％、最大で約８６％、最大で約８７％、最大で約８８％、最大で約８９％、最大で約９０％、最大で約９１％、最大で約９２％、最大で約９３％、最大で約９４％、最大で約９５％、最大で約９５．５％、最大で約９６％、最大で約９６．５％、最大で約９７％、最大で約９７．５％、最大で約９８％、最大で約９８．５％、最大で約９９％、最大で約９９．１％、最大で約９９．１％、最大で約９９．３％、最大で約９９．４％、最大で約９９．５％、最大で約９９．６％、最大で約９９．７％、最大で約９９．８％、最大で約９９．９％、最大で約９９．９５％、最大で約９９．９９％、または最大で約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0144】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くに対して、例えば、全長にわたって、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９５．５％、約９６％、約９６．５％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．１％、約９９．１％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％、約９９．９５％、約９９．９９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0145】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比較して１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するペプチド配列を含む。

【0146】

例えば、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて少なくとも１アミノ酸、少なくとも２アミノ酸、少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１３アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも１６アミノ酸、少なくとも１７アミノ酸、少なくとも１８アミノ酸、少なくとも１９アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも４５アミノ酸、または少なくとも５０アミノ酸の挿入を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0147】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列、例えば、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて最大で１アミノ酸、最大で２アミノ酸、最大で３アミノ酸、最大で４アミノ酸、最大で５アミノ酸、最大で６アミノ酸、最大で７アミノ酸、最大で８アミノ酸、最大で９アミノ酸、最大で１０アミノ酸、最大で１１アミノ酸、最大で１２アミノ酸、最大で１３アミノ酸、最大で１４アミノ酸、最大で１５アミノ酸、最大で１６アミノ酸、最大で１７アミノ酸、最大で１８アミノ酸、最大で１９アミノ酸、最大で２０アミノ酸、最大で２５アミノ酸、最大で３０アミノ酸、最大で３５アミノ酸、最大で４０アミノ酸、最大で４５アミノ酸、または最大で５０アミノ酸の挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0148】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0149】

１つまたは複数の挿入は、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、内部、またはこれらの組合せにおけるものであり得る。１つまたは複数の挿入は、連続したもの、連続していないもの、またはこれらの組合せであり得る。

【0150】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列、例えば、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０アミノ酸の欠失を有するアミノ酸配列を含む。

【0151】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列、例えば、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて最大で１、最大で２、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、最大で９、最大で１０、最大で１１、最大で１２、最大で１３、最大で１４、最大で１５、最大で１６、最大で１７、最大で１８、最大で１９、最大で２０、最大で２５、最大で３０、最大で３５、最大で４０、最大で４５、または最大で５０アミノ酸の欠失を有するアミノ酸配列を含む。

【0152】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列、例えば、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の欠失を有するアミノ酸配列を含む。

【0153】

１つまたは複数の欠失はアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、内部、またはこれらの組合せにおけるものであり得る。１つまたは複数の欠失は、連続したもの、連続していないもの、またはこれらの組合せであり得る。

【0154】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列、例えば、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０アミノ酸の置換を有するアミノ酸配列を含む。

【0155】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列、例えば、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて最大で１、最大で２、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、最大で９、最大で１０、最大で１１、最大で１２、最大で１３、最大で１４、最大で１５、最大で１６、最大で１７、最大で１８、最大で１９、最大で２０、最大で２５、最大で３０、最大で３５、最大で４０、最大で４５、または最大で５０アミノ酸の置換を有するアミノ酸配列を含む。

【0156】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列、例えば、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸の置換を有するアミノ酸配列を含む。

【0157】

１つまたは複数の置換はアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、内部、またはこれらの組合せにおけるものであり得る。１つまたは複数の置換は、連続したもの、連続していないもの、またはこれらの組合せであり得る。１つまたは複数の置換は、Ｎ末端メチオニンの、異なる残基、例えばロイシンによる置換を含み得る。

【0158】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、Ｎ末端メチオニンを含有しない。一部の実施形態では、配列番号１６～１６１５４、１６～１３６０５、１６１５５～４７３５０、１６１５５～４３９５３、４７３５１～４９３３３、または１６～４９３３３のうちのいずれか１つにおいて見いだされるＮ末端メチオニンは欠失しているか、存在しないか、または異なる残基によって置換されている。例えば、配列番号４９３５３～５００５２は、Ｎ末端メチオニンがＮ末端ロイシンによって置換された配列の実例を提示する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、Ｎ末端メチオニンを含む。

【0159】

１つまたは複数の置換は、保存的置換、非保存的置換、またはこれらの組合せであり得る。保存的アミノ酸置換は、１アミノ酸の、生化学的特性（例えば、電荷、サイズ、および／または疎水性）が同様の別のアミノ酸による置換であり得る。非保存的アミノ酸置換は、１アミノ酸の、生化学的特性（例えば、電荷、サイズ、および／または疎水性）が異なる別のアミノ酸による置換であり得る。保存的アミノ酸の変化は、例えば、ポリペプチドの二次構造または三次構造に対する影響が最小限の置換であり得る。

【0160】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１１０２、２０５７、５５４３、９０６６、１１９４８、１５６４６、１７６２９、１９８６０、２１０１５、２１１６６、２２１４９、２２７０７、２３６３１、２３６３９、２５４３０、２５５５５、３２６７８、３３８９０、３４０４７、３５７３７、３８１３８、３８７８０、４０９１３、４０９８５、４０９８６、および４２６２３のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0161】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１１０２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0162】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２０５７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0163】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号５５４３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0164】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号９０６６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0165】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１１９４８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0166】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１５６４６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0167】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１７６２９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0168】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１９８６０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0169】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２１０１５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0170】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２１１６６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0171】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２２１４９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0172】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２２７０７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0173】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２３６３１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0174】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２３６３９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0175】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２５４３０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0176】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号２５５５５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0177】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号３２６７８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0178】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号３３８９０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0179】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号３４０４７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0180】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号３５７３７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0181】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号３８１３８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0182】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号３８７８０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0183】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号４０９１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0184】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号４０９８５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0185】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号４０９８６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0186】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号４２６２３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0187】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６、１７、２３、２６、３５、６６、６７、７１、７４、１２６、１４８、１５９、１６０、１６６、１７１、１７２、１７４、１７６、１７８、１８５、１８８、１８９、２１０、２２５、２３７、２４０、２４５、２５３、２５９、２９８、３０２、３０８、３１６、３３４、３３５、３６０、３６２、３７５、３７７、３９４、３９８、４１５、４２６、４６０、４７６、４８０、４８６、５１５、５２７、５３９、５４８、５６５、５７１、６０４、６３０、６４３、６７６、７２０、７３４、７４６、７７４、７９７、８１２、８３３、８３５、８４１、８５２、８７１、８７４、８７９、８８１、９２７、９３４、９４７、９５２、９６７、９８６、９９３、１００９、１０３３、１０４２、１０４４、１０５４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７９、１０８４、１０９４、１１０２、１１１１、１１１３、１１２０、１１２９、１１３１、１１４９、１１５６、１１６１、１１８６、１１９０、１２２５、１２５３、１２５８、１２６１、１２６２、１２６５、１２８９、１２９５、１２９９、１３０３、１３０８、１３１１、１３１３、１３１５、１３２８、１３５０、１３５５、１３６８、１３７４、１３７５、１３８０、１３８８、１３９５、１４００、１４０６、１４２４、１４２７、１４３０、１４３７、１４４０、１４９３、１４９８、１５０２、１５１０、１５１１、１５１９、１５２２、１５８１、１５９１、１５９７、１６１５、１６３０、１６４４、１６６２、１６７５、１７１４、１７１８、１７２０、１７３０、１７３５、１７４５、１７７８、１７８５、１７９１、１８０３、１８１２、１８２０、１８２８、１８３５、１８６９、１８７０、１８８８、１８８９、１９０８、１９１１、１９１２、１９４０、１９８０、１９８１、２０１１、２０４６、２０５７、２０８６、２１０９、２１１９、２１９２、２２０４、２２３３、２２４７、２２５７、２２７６、２２８５、２２９６、２３０４、２３０９、２３１６、２３３５、２３３８、２３３９、２３４７、２３５２、２３７８、２３８２、２３９４、２３９７、２４２９、２４９３、２５０７、２５１９、２５３４、２５５７、２５７２、２５９５、２６４２、２６５０、２６８１、２７０７、２７２５、２７６７、２７６８、２８０４、２８０７、２８２５、２８３７、２８６５、２８７８、２８８８、２８８９、２８９９、２９６６、２９８０、３０６９、３０７３、３０７８、３０８１、３０９３、３１１６、３１３０、３１７５、３１９１、３２１７、３２２２、３２２５、３２４４、３２５４、３２５５、３２５６、３２６１、３２８７、３２９２、３２９９、３３０９、３３３０、３３５３、３３６１、３３６３、３３７９、３３８３、３３８９、３３９２、３４０２、３４０７、３４１６、３４２４、３４２５、３４４４、３４４５、３４５７、３４６２、３４８６、３５０８、３５２８、３５３１、３５３５、３５４１、３５５０、３５６１、３５６３、３５７２、３５８６、３５９０、３５９７、３６０８、３６３０、３７１４、３７１８、３７２３、３７２６、３７３０、３７３５、３７６４、３７７１、３７８６、３８０３、３８０４、３８５１、３８６９、３８７３、３９０７、３９１１、３９１４、３９１８、３９２６、３９４６、３９６５、４０１０、４０１６、４０２５、４０３２、４０４７、４０６３、４０６５、４０７２、４０８２、４１３１、４１４３、４１５０、４１６１、４２０１、４２２５、４２３１、４２３９、４２６１、４２７４、４２８４、４２８９、４２９５、４２９８、４３２５、４３２７、４３４６、４３５８、４３６２、４３６８、４４４４、４４５９、４５１６、４５４７、４５４９、４５６２、４５７１、４５９８、４６１０、４６１８、４６４０、４６５３、４６６９、４６８４、４７０６、４７２１、４７５１、４７５３、４７６３、４７７０、４７７６、４８０７、４８１２、４８２０、４８２６、４８５２、４８５７、４８６７、４８８０、４８８６、４８９２、４８９９、４９５８、４９６１、４９７２、４９９１、４９９８、５００２、５００５、５００６、５００９、５０２５、５０２７、５０２８、５０３８、５０４５、５０５５、５０６２、５０８１、５０９３、５０９５、５１２９、５１６９、５１７２、５１８９、５２１１、５２１９、５２４５、５２５０、５２７２、５２７３、５２７４、５２８５、５２９４、５３０６、５３０７、５３５１、５３５９、５３９５、５４０２、５４０５、５４１２、５４４４、５４４８、５４９７、５５０２、５５２４、５５４３、５５５９、５５７０、５５７７、５６０４、５６１２、５６４６、５６４９、５６５５、５６６７、５６９７、５６９９、５７２４、５７３４、５７３５、５７４３、５７４７、５７５８、５７６４、５７８２、５７８３、５８４９、５８５６、５８５８、５８７５、５８９８、５９０１、５９１３、５９２１、５９２８、５９５４、５９５９、５９６３、５９６９、５９８０、５９８５、５９９８、６００３、６０２１、６０３３、６０３６、６０５０、６０５２、６０７３、６０７５、６１０２、６１０７、６１２１、６１３４、６１５８、６１７３、６１７９、６１８２、６１９８、６２０５、６２３６、６２７２、６２７６、６２９８、６３１０、６３３２、６３３５、６３５６、６３８４、６３８６、６３８９、６４１４、６４３１、６４４６、６４４７、６４７０、６５０２、６５０８、６５２２、６５３３、６５４５、６５５８、６５８０、６５８８、６６０４、６６０８、６６１０、６６２８、６６３２、６６４８、６６５１、６６５２、６６５９、６６７３、６６８１、６６８２、６６９８、６６９９、６７５２、６７５７、６７６１、６７９５、６８１３、６８１８、６８１９、６８２８、６８３８、６８４２、６８４８、６８６８、６８７３、６８７４、６８８２、６８９３、６８９５、６９００、６９０２、６９０３、６９２８、６９３１、６９４１、６９５２、６９５３、６９５５、６９８４、７０２７、７０２９、７０３０、７０３４、７０７０、７０７６、７１０６、７１１５、７１２８、７１４０、７１４３、７１６６、７１７１、７１８７、７２２６、７２５９、７２７９、７２８１、７２８６、７２９１、７２９６、７３０４、７３２０、７３２５、７３３６、７３７５、７３９１、７４０５、７４１４、７４３２、７４３３、７４４３、７４６２、７４８９、７５００、７５０１、７５０８、７５２０、７５５１、７５７０、７５７６、７５９０、７５９６、７６０８、７６１１、７６１３、７６２１、７６２５、７６３７、７６４３、７６５１、７６６１、７６９６、７７０１、７７０３、７７０５、７７１１、７７１７、７７２２、７７２８、７７３６、７７７０、７７８１、７８０３、７８０７、７８０９、７８３１、７８３３、７８３４、７８５６、７８８８、７８９０、７８９４、７９２６、７９２７、７９４３、７９４９、７９６５、７９８４、８０１０、８０１８、８０２７、８０２８、８０４１、８０６８、８０８９、８０９７、８１０２、８１０５、８１１１、８１２９、８１４９、８１８６、８１８９、８２１９、８２２３、８２２７、８２３６、８２４３、８２４９、８２５５、８２５６、８２５８、８２５９、８２７２、８２７８、８２８０、８２８３、８２９７、８３０１、８３０８、８３１４、８３２４、８３２８、８３４７、８３５７、８３６３、８３７１、８３８６、８３９４、８４０８、８４２０、８４２１、８４２９、８４３２、８４３６、８４３７、８４３９、８４６８、８４８５、８４８８、８４８９、８５０５、８５３８、８５５１、８５６３、８５６４、８５７４、８５７９、８６２８、８６２９、８６３１、８６３４、８６３６、８６３７、８６４１、８６７０、８６９２、８６９９、８７２９、８７３０、８７５２、８７７９、８８０５、８８４１、８８５４、８８６５、８８８６、８８９３、８９３１、８９３３、８９７３、８９８１、８９８５、８９９８、９０００、９００３、９０１７、９０２１、９０２４、９０２６、９０２７、９０４０、９０５０、９０５３、９０５５、９０６６、９０６９、９０７２、９０７８、９０９４、９０９５、９１００、９１１０、９１１９、９１３０、９１５２、９１５３、９１８９、９１９４、９２２２、９２２３、９２２５、９２３１、９２６２、９２６４、９２６７、９２７３、９２８３、９２９７、９３０４、９３０７、９３１４、９３２０、９３２４、９３２８、９３３８、９３８０、９３８６、９３９７、９４０３、９４１３、９４４２、９４７２、９５１６、９５２８、９５３４、９５４２、９５５２、９５６８、９６０２、９６１１、９６２６、９６３２、９６４８、９６４９、９６６３、９６６７、９６６９、９６７０、９６７２、９６７３、９６７５、９６７８、９６８２、９７００、９７４１、９７５０、９７６１、９７７１、９８２９、９８４５、９８５３、９８５４、９８７９、９８８０、９８９１、９８９３、９８９４、９８９９、９９０１、９９０３、９９２２、９９３３、９９３７、９９４０、９９４３、９９４８、９９６２、９９６５、９９７１、９９８８、９９９０、１０００７、１００１４、１００１６、１００２５、１００４０、１００５８、１００６９、１００７２、１００９５、１００９７、１０１１３、１０１２３、１０１６０、１０２３０、１０２３４、１０２３５、１０２３６、１０２３８、１０２５０、１０２５２、１０２７９、１０２８９、１０２９２、１０３０９、１０３１３、１０３１４、１０３１５、１０３１６、１０３２９、１０３４８、１０３５７、１０３６４、１０３８３、１０３９４、１０４０５、１０４０７、１０４１４、１０４２０、１０４２１、１０４２３、１０４２７、１０４２８、１０４３６、１０４３７、１０４３９、１０４４６、１０４５１、１０４５９、１０４６３、１０４６６、１０４８９、１０４９０、１０４９１、１０５１２、１０５１６、１０５５５、１０５６６、１０５７０、１０５８４、１０５８７、１０５８８、１０６０７、１０６１５、１０６２４、１０６３７、１０６４８、１０６６３、１０７０１、１０７３２、１０７５９、１０７７８、１０７８８、１０７９６、１０８１３、１０８５３、１０８６５、１０８７８、１０９１９、１０９４３、１０９４５、１０９５０、１０９５５、１０９５７、１０９６９、１０９８４、１０９９１、１０９９８、１０９９９、１１０１８、１１０１９、１１０２７、１１０３５、１１０３６、１１０４２、１１０４５、１１０７９、１１０９０、１１０９５、１１１０６、１１１２９、１１１８７、１１２０７、１１２１８、１１２２３、１１２３３、１１２６０、１１２６５、１１２７２、１１２９０、１１２９７、１１３０６、１１３２６、１１３７４、１１３８６、１１３９６、１１４１１、１１４３２、１１４３７、１１４５５、１１４５９、１１４７１、１１４８１、１１４８５、１１４８６、１１５０６、１１５１１、１１５５０、１１５５５、１１５５７、１１５７７、１１６０１、１１６２１、１１６４２、１１６５２、１１６７０、１１６７３、１１７０５、１１７０９、１１７１２、１１７１３、１１７１５、１１７１６、１１７２３、１１７３０、１１７３７、１１７４１、１１７４９、１１７５０、１１７７８、１１７８４、１１７８５、１１７９４、１１７９７、１１７９９、１１８０４、１１８１０、１１８３５、１１８８８、１１８９３、１１８９５、１１９０４、１１９３１、１１９３２、１１９４８、１１９６９、１１９８２、１１９８５、１２０２０、１２０２４、１２０２９、１２０５５、１２０６１、１２０６６、１２０６７、１２０６９、１２０７２、１２０９６、１２１１４、１２１２１、１２１３２、１２１６１、１２１８３、１２１８７、１２１９１、１２１９９、１２２２７、１２２５４、１２２６６、１２３４４、１２３４５、１２３６２、１２３９３、１２４００、１２４０１、１２４２２、１２４２７、１２４３６、１２４４８、１２４５１、１２４７６、１２４９８、１２５２６、１２５４２、１２５５８、１２５６０、１２５６７、１２５７０、１２５９０、１２５９１、１２６０９、

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６７６、３０７０２、３０７０９、３０７２４、３０７２８、３０７７７、３０７８１、３０７９３、３０８０２、３０８１５、３０８１８、３０８６１、３０８７４、３０８８３、３０８９２、３０８９８、３１０２０、３１０４１、３１０４４、３１０５４、３１０

５８、３１０５９、３１０６０、３１１１２、３１１３１、３１１５３、３１１６０、３１２１１、３１２１３、３１２３４、３１２４０、３１２５３、３１２５７、３１３１６、３１３３９、３１３４７、３１３７２、３１４１３、３１４３０、３１４８４、３１４８８、３１５２７、３１５５０、３１５８３、３１６０８、３１６２３、３１６２８、３１６４１、３１６５４、３１６６３、３１６９７、３１７０１、３１７０３、３１７２１、３１７５０、３１７５５、３１７８４、３１７８６、３１７９７、３１８３２、３１８４６、３１８７８、３１８８９、３１９５４、３１９６９、３１９７５、３１９９３、３２００９、３２０１４、３２０３４、３２０５５、３２０５７、３２０７６、３２０７７、３２１２７、３２１３３、３２２０５、３２２３６、３２２９３、３２３０１、３２３６０、３２３６５、３２３７９、３２３８６、３２４１９、３２４５３、３２４５４、３２４５５、３２４６４、３２４６６、３２４８９、３２５１４、３２５２０、３２５３４、３２５３８、３２５４２、３２５７３、３２５９２、３２６３４、３２６４２、３２６５３、３２６５９、３２６７８、３２６７９、３２７２５、３２７５８、３２７６７、３２７７１、３２７８８、３２８１６、３２８２９、３２８５１、３２８７４、３２８７５、３２８８１、３２８８３、３２８８５、３２８８７、３２８９１、３２８９２、３２９００、３２９０５、３２９１２、３２９１３、３２９２２、３２９３２、３２９４０、３２９６１、３３００８、３３０２１、３３０４８、３３０５９、３３１０８、３３１１０、３３１１５、３３１５１、３３１６６、３３２０７、３３２１０、３３２２０、３３２２３、３３２３０、３３２６１、３３３１４、３３３２６、３３３４９、３３３５１、３３３５９、３３３６５、３３３６８、３３３７９、３３３９１、３３４２３、３３４３８、３３４７３、３３４９７、３３５２７、３３５３８、３３５５５、３３５７６、３３５８２、３３６０７、３３６１３、３３６１９、３３６２５、３３６３０、３３６４１、３３６７０、３３６７１、３３６８９、３３６９６、３３７３０、３３７３３、３３７７７、３３７９９、３３８３０、３３８６９、３３８８２、３３８８６、３３８９０、３３９１５、３３９７４、３４０４３、３４０４７、３４０４８、３４０５９、３４０７４、３４０７９、３４１３４、３４１４９、３４１６３、３４１８２、３４２３４、３４２４４、３４２６０、３４２９１、３４３６５、３４３７３、３４３８４、３４４１５、３４４２１、３４４２３、３４４４５、３４４５２、３４４６２、３４４８１、３４４８３、３４４８７、３４５０１、３４５０７、３４５０９、３４５２４、３４５６０、３４５６３、３４５８４、３４６４２、３４６６０、３４６７２、３４６８５、３４６８９、３４７２３、３４７５４、３４７５５、３４７７８、３４７９４、３４８０１、３４８１６、３４８１８、３４８１９、３４８２４、３４８２６、３４８５６、３４８８３、３４８８６、３４８８８、３４９０２、３４９３３、３４９４５、３４９４９、３５０１７、３５１０６、３５１３８、３５１５８、３５１８３、３５２１６、３５２２６、３５２７４、３５２７５、３５２９３、３５２９７、３５３２９、３５３６８、３５３７１、３５３８２、３５４４０、３５４７０、３５５０３、３５５１７、３５５３０、３５５４３、３５５５７、３５５７１、３５５９７、３５６０５、３５６１７、３５６５４、３５６７６、３５７３０、３５７３７、３５７５５、３５７６２、３５７６３、３５７８１、３５７８７、３５８３３、３５８６３、３５８７１、３５９０７、３５９２８、３５９５３、３５９７３、３６０６２、３６０６７、３６０７１、３６１２２、３６１５９、３６１６０、３６１６５、３６１７９、３６１８０、３６１９０、３６２３８、３６２４１、３６２７０、３６２７１、３６２７５、３６２７６、３６３１２、３６３２９、３６３８８、３６４５０、３６４５３、３６４６０、３６４６４、３６４８０、３６５１２、３６５１３、３６５２５、３６５４１、３６５４７、３６５５０、３６５６６、３６５９３、３６６０２、３６６５２、３６６５６、３６７１６、３６７５４、３６７６０、３６７６３、３６７７７、３６７９０、３６７９２、３６７９３、３６８０８、３６８１３、３６８１８、３６８３９、３６８６２、３６８８７、３６９００、３６９７７、３６９８７、３７０００、３７０１４、３７０３９、３７０４１、３７０６７、３７０７６、３７１０１、３７１１４、３７１１６、３７１２５、３７１７５、３７１９５、３７１９７、３７１９９、３７２００、３７２０３、３７２０４、３７３２０、３７３２１、３７３２４、３７３７９、３７３９４、３７３９７、３７４２２、３７４２６、３７４３６、３７４５６、３７４８１、３７４８５、３７４８６、３７４９５、３７５４０、３７５６０、３７５６４、３７５８４、３７５９３、３７５９５、３７６１７、３７６１９、３７６６３、３７６８７、３７７３４、３７７３６、３７７３８、３７７３９、３７７４９、３７７８２、３７７８３、３７７９２、３７８３２、３７８３９、３７８４１、３７８５６、３７８７１、３７８７６、３７９００、３７９３１、３７９３２、３７９４６、３７９７１、３８００２、３８０１４、３８０２５、３８０５９、３８０６４、３８０８０、３８０９９、３８１００、３８１０２、３８１０３、３８１１０、３８１１６、３８１３１、３８１３４、３８１３５、３８１３８、３８１４６、３８１４７、３８１６７、３８１７０、３８２１４、３８２２０、３８２５０、３８２５５、３８２６４、３８２９１、３８３０３、３８３０８、３８３２５、３８３３１、３８３４７、３８３５２、３８３６８、３８３８２、３８３９７、３８３９９、３８４４８、３８４５６、３８４５７、３８５０４、３８５１５、３８５２０、３８５２４、３８５３６、３８５４０、３８５６０、３８５６７、３８６０１、３８６１０、３８６３２、３８６３７、３８６４１、３８６８７、３８６９０、３８７０４、３８７６５、３８７８０、３８７８９、３８８０３、３８８４７、３８８５０、３８８５３、３８８５５、３８８６０、３８８７９、３８８８２、３８８９６、３８９０５、３８９３７、３９０２０、３９０４９、３９１０９、３９１１０、３９１１７、３９１３２、３９１３７、３９１６１、３９１６５、３９１６６、３９１７１、３９１８０、３９２３１、３９２３９、３９２４３、３９２４９、３９２６６、３９２９８、３９３２９、３９３３２、３９３８５、３９３８９、３９４０９、３９４１３、３９４１９、３９４３５、３９４５７、３９４６３、３９５１１、３９５１２、３９５２５、３９５２７、３９５５１、３９５５９、３９５７６、３９６０６、３９６４６、３９６７０、３９６７５、３９６９５、３９７０２、３９７７２、３９７８３、３９７８５、３９８０２、３９８０４、３９８１８、３９８７５、３９８７９、３９８９０、３９８９１、３９９２４、３９９９７、４００００、４００２７、４００３３、４００４８、４００６７、４０１１９、４０１３２、４０１７０、４０２２６、４０２６１、４０２６８、４０２８４、４０２９２、４０３１４、４０３２１、４０３２４、４０３３８、４０３４１、４０３４５、４０３５７、４０３８５、４０３９５、４０４１１、４０４６２、４０４７６、４０４７７、４０４７９、４０４８６、４０４８９、４０５１１、４０５２４、４０５３１、４０５６１、４０５６２、４０５７７、４０６１４、４０６３２、４０６４８、４０６５１、４０６６１、４０６７３、４０６７７、４０６８０、４０６８６、４０６９０、４０６９１、４０７０４、４０７１０、４０７１１、４０７３３、４０７４７、４０７６３、４０７６４、４０７８８、４０８３０、４０９００、４０９０９、４０９１３、４０９１８、４０９２５、４０９３２、４０９３５、４０９６６、４０９７０、４０９７３、４０９８５、４０９８６、４１００６、４１００８、４１０３２、４１０４０、４１０４１、４１０６１、４１０６９、４１０８１、４１１１９、４１１７３、４１１７５、４１１７６、４１１７９、４１１８０、４１２２７、４１２３０、４１２３４、４１２７２、４１２９９、４１３１４、４１３１８、４１３８２、４１３８５、４１４１７、４１４２４、４１４３５、４１４８１、４１５１３、４１５２２、４１５２４、４１５３６、４１５６７、４１５７８、４１６５４、４１７０１、４１７０２、４１７０７、４１７０９、４１７５２、４１７６２、４１７６５、４１７６８、４１７７１、４１７８１、４１７９５、４１８０４、４１８０５、４１８２４、４１８７６、４１９００、４１９０２、４１９２２、４１９２６、４１９６８、４２００８、４２０２１、４２０８１、４２１０３、４２１１５、４２１３９、４２１４７、４２１７４、４２１８５、４２１８６、４２２６２、４２２７０、４２２７７、４２２７９、４２２９９、４２３０１、４２３０２、４２３０３、４２３１０、４２３２７、４２３３９、４２３４３、４２３４８、４２３５０、４２３５４、４２３７３、４２４０６、４２４５０、４２４６２、４２４７２、４２４８６、４２５０７、４２５４０、４２５７１、４２５８１、４２５８２、４２５８７、４２５９２、４２６２３、４２６５６、４２６６７、４２６７３、４２６８９、４２７１８、４２７２３、４２７７２、４２７８１、４２８００、４２８０５、４２８３５、４２８３８、４２８７２、４２９６３、４２９６４、４２９６６、４２９７７、４３０１０、４３０３９、４３０４０、４３０４３、４３０５３、４３０８０、４３１２２、４３１２６、４３１４８、４３１５６、４３２２４、４３２２８、４３２３６、４３２３７、４３２６０、４３２９２、４３３１４、４３３９４、４３４３４、４３４４６、４３４５１、４３４６５、４３４７７、４３４８１、４３４９２、４３５２３、４３５３１、４３５７１、４３６１２、４３６１５、４３６４０、４３６５６、４３７２５、４３７３７、４３７５１、４３７６９、４３８０３、４３８１０、４３８１９、４３８８１、４３８８５、４３９０２、４３９０３、４３９１１、４３９４１、４３９４６、４３９５２、４９３５４、４９３７４、４９３９０、４９４９８、４９５１８、４９５２０、４９５３２、４９５４７、４９５５９、４９５８８、４９５９４、４９５９５、４９６０６、４９６１９、４９６２２、４９６２５、４９６４６、４９６４９、４９６６２、４９６７５、４９６８０、４９６８７、４９６９１、４９６９５、４９７１２、４９７２０、４９７２８、４９７３７、４９７３８、４９７４７、４９７６０、４９７７２、４９７７９、４９７８０、４９７８８、４９８３２、４９８５０、４９８７４、４９８９４、４９９０４、４９９５５、４９９６９、４９９７１、および４９９７４のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0188】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、最大で約５００、最大で約４５０、最大で約４００、最大で約３５０、最大で約３００、最大で約２５０、最大で約２００、最大で約１９０、最大で約１８０、最大で約１７０、最大で約１６０、最大で約１５０、最大で約１４０、最大で約１３０、最大で約１２０、最大で約１１０、最大で約１００、最大で約９０、最大で約８５、最大で約８０、最大で約７５、最大で約７０、最大で約６５、最大で約６０、最大で約５５、最大で約５０、最大で約４５、最大で約４０、最大で約３５、最大で約３０、最大で約２５、または最大で約２０アミノ酸の長さのアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0189】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、または少なくとも約８５アミノ酸の長さのアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0190】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、約２０～５００、約２０～４００、約２０～３００、約２０～２５０、約２０～２００、約２０～１５０、約２０～１２５、約２０～１００、約２０～７５、約２０～５０、５０～５００、約５０～４００、約５０～３００、約５０～２５０、約５０～２００、約５０～１５０、約５０～１２５、約５０～１００、約５０～７５、約８０～５００、約８０～４００、約８０～３００、約８０～２５０、約８０～２００、約８０～１５０、約８０～１２５、約８０～１００、または約８０～９０アミノ酸の長さのアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、約８５アミノ酸の長さのアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0191】

２つの配列間の配列同一性の程度は、例えば、この目的のために一般に使用されるコンピュータプログラム、例えば、グローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列を比較することによって決定することができる。非限定的な例として、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴｎ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、または別の適切な方法またはアルゴリズムが挙げられる。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をそれらの全長にわたって、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小限にしながらアラインメントすることができる。デフォルト設定を使用することができる。

【0192】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、本明細書に開示される２つまたはそれよりも多くの配列、例えば、配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２またはそれよりも多く、３またはそれよりも多く、４またはそれよりも多く、５またはそれよりも多く、６またはそれよりも多く、７またはそれよりも多く、８またはそれよりも多く、９またはそれよりも多く、または１０またはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの配列は、同じＤＮＡ配列を起源とするまたは同じＤＮＡ配列によってコードされ、例えば、同じ供給源遺伝子またはゲノム由来の隣接する一続きのヌクレオチド、例えば、推定または予測される終止コドンの前後のヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの配列は、異なるＤＮＡ配列、例えば異なる遺伝子を起源とする、または異なるＤＮＡ配列、例えば異なる遺伝子によってコードされる。

【0193】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、以前に同定されているクロマチン調節因子由来の配列ではない、またはそれを含有しない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、以前に遺伝子の発現を調節するために本明細書に開示されるガイド部分を使用して標的化されているクロマチン調節因子由来の配列ではない、またはそれを含有しない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／もしくはＨＳＦ１ではない、またはＰ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／もしくはＨＳＦ１由来の配列を含有しない。

【0194】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、以前に同定されている転写活性化因子由来の配列ではない、またはそれを含有しない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、以前に遺伝子の発現を調節するために本明細書に開示されるガイド部分を使用して標的化されている転写活性化因子由来の配列ではない、またはそれを含有しない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）由来の配列ではない、またはそれを含有しない。

【0195】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、以前に同定されている転写リプレッサー由来の配列ではない、またはそれを含有しない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、以前に遺伝子の発現を調節するために本明細書に開示されるガイド部分を使用して標的化されている転写リプレッサー由来の配列ではない、またはそれを含有しない。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａ由来の配列ではない、またはそれを含有しない。

【0196】

異種遺伝子エフェクターは、文献およびデータベースという供給源から引き出すことができ、多様なタンパク質ファミリーが含まれるように標的化することができる。
ウイルス異種遺伝子エフェクター

【0197】

本明細書において、一部の実施形態では、ウイルス性供給源由来の異種遺伝子エフェクター、例えばウイルス遺伝子エフェクターを利用する組成物および方法が開示される。

【0198】

ヒトに感染するウイルスは数百種存在する。遺伝子エフェクタードメインをウイルスゲノムにコードさせて、宿主および／またはウイルス遺伝子の発現をモジュレートすることができる。２０種のウイルスの科由来のウイルス転写調節因子のセンサスにより、４１９種の転写調節因子が同定され、そのうち１７１種がＤＮＡ結合性であった（Liu, Xing, et al. "Human virus transcriptional transcriptionalregulators." Cell 182.1 (2020): 24-37）。さらに、存在すると推定された膨大な数のウイルス粒子が、その大多数は特徴付けられていないが、本開示の組成物および方法に組み入れた場合に有用であり得る異種遺伝子エフェクターを有する可能性がある。例えば、そのようなウイルス性供給源由来のウイルス異種遺伝子エフェクターは、新規エフェクター活性、ゲノム組織化制御、および／または核酸パッケージング機能を含む可能性がある。ヒトトロピズムを欠くウイルスでも、それにもかかわらず、本開示の組成物および方法に使用した場合（例えば、本明細書に開示される工学的に作製された複合体に使用した場合）に望ましい活性がもたらされる可能性がある。疫学研究により、コウモリなどの重要なウイルス保有宿主における恵まれた進化プロセスで出現する、ヒトトロピック活性が検証された人畜共通感染ウイルス種が同定されており、ヒトトロピズムを欠くウイルスにも遺伝子エフェクター活性が存在する可能性があるという観念が裏付けられる。したがって、一部の実施形態では、本開示は、メタゲノム調査によって収集された配列データを包含する。

【0199】

ウイルス異種遺伝子エフェクターの転写調節活性は、例えば、クロマチンリモデリング、ＲＮＡポリメラーゼ動員（例えば、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ）、転写模倣、転写延長、ＤＮＡ複製、ウイルス転写、核酸輸送、またはこれらの組合せを含み得るまたはそれに影響を及ぼし得る。ウイルス異種遺伝子エフェクターの転写調節活性は、例えば、核酸への直接的な結合（例えば、Ｅ２、ＩＣＰ４、Ｚｔａ、ＩＲＦ）、核酸への間接的な結合（例えば、ＥＢＮＡ２、Ｅ１Ａ）、転写機構またはその構成要素の調節（例えば、Ｔａｔ、Ｅ１Ａ、ＩＥ２）、クロマチンの修飾（例えば、Ｅ１Ａ、Ｈｂｘ、Ｔａｔ）、またはこれらの組合せに関与し得る。

【0200】

ヒト転写調節因子と比較して、ウイルス転写調節因子では、ＤＮＡ結合性ドメインの配列保存がわずかしか示されず、より高い変異率が示され、また、不十分にしか構造的に定義されない（＜１２％）可能性がある。別個のウイルス転写調節因子の定義には種オルソログ相同性に関する信頼性が必要になり得、ＤＮＡモチーフに関する知見が限られていることは、標的に結合するウイルス転写調節因子の定義に実験データ（ＣｈＩＰ、ＥＭＳＡ、ＤＮＡ分解酵素フットプリンティングなど）が必要であることを意味し得る。

【0201】

一部の実施形態では、候補ウイルス異種遺伝子エフェクターの一覧は、活性化するものであるか抑制するものであるか、標的細胞経路、進化的な配列の制約、ＤＮＡ／ＲＮＡ／その両方との結合性、タンパク質フォールディングパターン、宿主／細胞トロピズム、直接的／間接的活性、結合の柔軟な許容性、核／細胞質での作用、および他の基準などの因子によって層別化することができる。一部の実施形態では、そのような層別化により、広範囲の潜在的な分子機能を包含する本開示のスクリーンライブラリーを設計することが可能になり、それにより、新規エフェクターが発見される可能性が増大する。

【0202】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、検証されたヒトウイルス転写調節因子に由来する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。そのような転写調節因子は、例えば、ＣｈＩＰ／ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、ＥＭＳＡ、ＳＥＬＥＸ、レポーターアッセイ、結合アッセイ、または結晶構造によって検証され得る。検証されたヒトウイルス転写調節因子を有し得るウイルスの科の非限定的な例としては、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｅｒｉｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅが挙げられる。

【0203】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、ヒトに人畜共通感染することが可能であることが示されているウイルスまたはウイルスの科に由来する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。ウイルスは、例えば、哺乳動物、鳥類、ブタ、非ヒト霊長類、齧歯類、有蹄動物、爬虫類、または両生類に感染することが可能であり得る。ヒトに人畜共通感染することが可能であることが示されているウイルスの科の非限定的な例としては、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｙｓｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｖｉｒｉｄａｅ、Ｈａｎｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、およびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅが挙げられる。

【0204】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、ヒトおよびコウモリに感染し得るウイルスまたはウイルスの科に由来する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。一部の実施形態では、ヒトおよびコウモリに感染し得るウイルスまたはウイルスの科に由来する候補異種遺伝子エフェクターの配列データは、ｄＢａｔＶｉｒなどのデータベースから得られる。ヒトおよびコウモリに感染し得るウイルスの科の非限定的な例としては、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｙｓｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｖｉｒｉｄａｅ、Ｈａｎｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、およびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅが挙げられる。

【0205】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、メタゲノムウイルス配列に由来する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。ウイルスメタゲノムデータの供給源の非限定的な例としては、ヒト腸内ビローム、極限環境（例えば、例えば古細菌トロピックウイルス（例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、海洋、熱水噴出孔を含めた、最適なエフェクター品質が富化され得る高温および／または高酸生態系、非ヒト種に感染するウイルスおよび／またはヒトへの人畜共通感染を示すウイルスの科由来のウイルス、ならびに公共データベースからの構造データ（例えば、Ｘ線、ＮＭＲ）を利用する供給源が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、古細菌、細菌、シアノバクテリア、藻類、植物などに感染するウイルスに由来する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。メタゲノム供給源から配列データが得られるウイルスの種の非限定的な例としては、ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅｓ、Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、サテライトウイルス、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｕｒｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ、およびＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅが挙げられる。

【0206】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、以下の科：Ａｂｙｓｓｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｃｋｅｒｍａｎｎｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｉｎｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｉｕｓｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｌｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｐｈａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｐｈａｓａｔｅｌｌｉｔｉｄａｅ、Ａｌｐｈａｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｖｅｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｍａｌｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｍｎｏｏｎｖｉｒｉｄａｅ、Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｐｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｔｋｉｎｓｖｉｒｉｄａｅ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｖｓｕｎｖｉｒｏｉｄａｅ、Ｂａｃｉｌｌａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｅｌｐａｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｅｎｙｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｅｔａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｌｕｍｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｏｔｏｕｒｍｉａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｒｍｏｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｈａｓｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｈｕｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｒｅｍｅｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｒｅｐｕｓｃｕｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｒｕｌｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｕｒｖｕｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｅｌｔａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｅｍｅｒｅｃｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｒｅｘｌｅｒｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｕｉｎｖｉｒｉｄａｅ、Ｅｎｄｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｅｕｒｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｅｒｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｎｎｌａｋｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇａｍｍａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｒｅｓｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｕｅｌｉｎｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈａｌｓｐｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈａｎｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｅｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｆｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｋｉｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｋｏｌｍｉｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｌａｖｉｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｅｉｓｈｂｕｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｓｐｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｌａｃｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｔｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｔｓｈｕｓｈｉｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｙｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｄｉｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｇａｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｓｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｔａｘｙｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｏｎｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｙｍｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｙｒｉａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｉｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｎｇｈｏｓｈａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｎｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｔａｒｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｌｉｆｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｖａｌｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｕｌｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｅｒｉｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｅｒｍｕｔｏｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌｅｃｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌｅｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｃｉｐｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｍｙｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｒｔｏｇｌｏｂｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄａｅ、Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｑｉｎｖｉｒｉｄａｅ、Ｑｕａｄｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｄｏｎｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｏｕｎｔｒｅｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｓａｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｓａｒｔｈｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｃｈｉｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｅｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｉｍｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｉｎｈａｌｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｍａｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｏｌｅｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｏｌｉｎｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｏｌｓｐｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｉｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｔｅｉｔｚｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｕｎｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｈａｓｐｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｂａｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｌｅｃｕｓａｔｅｌｌｉｔｉｄａｅ、Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｓｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｒｉｓｔｒｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｕｒｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｙｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｖｉｒｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｗｕｐｅｄｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｘｉｎｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｙｕｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｚｏｂｅｌｌｖｉｒｉｄａｅ、またはこれらの任意の組合せからの１つまたは複数のウイルスに由来する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。

【0207】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、以下の亜科：Ａｃｔａｎｔａｖｉｒｉｎａｅ、Ａｇａｎｔａｖｉｒｉｎａｅ、Ａｇｌｉｍｖｉｒｉｎａｅ、Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ａｌｐｈａｉｒｉｄｏｖｉｒｉｎａｅ、Ａｌｐｈａｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｎａｅ、Ａｒｑｕａｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ａｖｕｌａｖｉｒｉｎａｅ、Ａｚｅｒｅｄｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｂａｓｔｉｌｌｅｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｃｌａｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｅｅｐｈｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｅｔａｉｒｉｄｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｅｔａｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｒａｕｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｒｏｃｋｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｒｏｎｆｅｎｂｒｅｎｎｅｒｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｕｌｌａｖｉｒｉｎａｅ、Ｃａｌｖｕｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｅｒｏｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｈｅｂｒｕｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｈｉｍａｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｌｅｏｐａｔｒａｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｏｂａｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｏｌｗｅｌｌｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｏｍｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｏｒｋｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｒｏｃａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｒｕｓｔｏｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｖｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｄｃｌａｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｄｅｅｊａｙｖｉｒｉｎａｅ、Ｄｅｎｎｉｓｗａｔｓｏｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｄｏｌｉｃｈｏｃｅｐｈａｌｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｅｋａｙｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｍｍｅｒｉｃｈｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｎｑｕａｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｑｕａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｒｍｏｌｙｅｖａｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｒｓｋｉｎｅｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ、Ｆｉｒｓｔｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｎａｅ、Ｆｕｈｒｍａｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｇａｍｍａｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｇｅｍｉｎｉａｌｐｈａｓａｔｅｌｌｉｔｉｎａｅ、Ｇｏｃｈｎａｕｅｒｖｉｒｉｎａｅ、Ｇｏｆｏｓａｖｉｒｉｎａｅ、Ｇｏｋｕｓｈｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｇｏｒｇｏｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｇｕｅｒｎｓｅｙｖｉｒｉｎａｅ、Ｇｕｔｍａｎｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｈａｍａｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｈｅｎｄｒｉｘｖｉｒｉｎａｅ、Ｈｅｒｏａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｈｅｘｐｏｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｈｙｐｏｒｈａｍｓａｖｉｒｉｎａｅ、Ｊａｓｉｎｋａｖｉｒｉｎａｅ、Ｋｒｙｌｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｌａｎｇｌｅｙｈａｌｌｖｉｒｉｎａｅ、Ｌｅｔｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｍａｍｍａｎｔａｖｉｒｉｎａｅ、Ｍａｒｋａｄａｍｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｃｃｌｅｓｋｅｙｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｃｃｏｒｑｕｏｄａｌｅｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｃｌａｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｅｄｉｏｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｅｌｎｙｋｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｅｔａｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｉｇｕｌａｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｏｌｉｎｅｕｘｖｉｒｉｎａｅ、Ｍｏｎｏｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｎａｎｏａｌｐｈａｓａｔｅｌｌｉｔｉｎａｅ、Ｎｃｌａｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｎｅｆｅｒｔｉｔｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｎｏｒｔｈｒｏｐｖｉｒｉｎａｅ、Ｎｙｍｂａｘｔｅｒｖｉｒｉｎａｅ、Ｏｋａｂｅｖｉｒｉｎａｅ、Ｏｋａｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ、Ｏｒｔｈｏｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｏｒｔｈｏｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｃｌａｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｅｔｒｏｍｏａｌｐｈａｓａｔｅｌｌｉｔｉｎａｅ、Ｐｉｃｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｉｓｃａｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｏｎｔｏｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｒｏｃｅｄｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｑｕｅｕｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｑｕｉｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｒａｋｉｅｔｅｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｅｇｒｅｓｓｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｅｍｏｔｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｅｐａｎｔａｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｅｔｅｒｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｈｏｄｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｏｄｅｐｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｏｇｕｎａｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｏｔｈｍａｎｄｅｎｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｉｎａｅ、Ｓａｒｌｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｅｃｏｎｄｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｅｄｏｒｅｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｅｐｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｅｒｐｅｎｔｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｉｍａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｋｒｙａｂｉｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｌｏｐｅｋｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｉｎａｒｅｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｔｕｄｉｅｒｖｉｒｉｎａｅ、Ｔａｔａｒｓｔａｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｅｍｐｅｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｉａｍａｔｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｏｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｒａｂｙｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｒｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｕｎａｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｕｎｉｃａｎｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｗａｒｏｇｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｗｏｒｔｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｙｂｅｃｋｖｉｒｉｎａｅ、Ｖａｒｉａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｎａｅ、Ｖｅｑｕｉｎｔａｖｉｒｉｎａｅ、Ｚｅａｌａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｎａｅ、またはこれらの任意の組合せ１つまたは複数のウイルスに由来する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。

【0208】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、高度の実証された転写調節因子モジュール性を有するウイルス、例えば、ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、またはＡｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。一部の実施形態では、高度の実証された転写調節因子モジュール性を有するウイルスに由来する異種遺伝子エフェクターは、他の遺伝子エフェクターとの組合せで有用であり得、例えば、遺伝子転写に対するコンビナトリアルまたは相乗効果を容易にする可能性がより高い可能性がある。

【0209】

いかなる特定の理論にも制約されることなく、ウイルスエフェクターは、代替供給源由来の遺伝子エフェクターと比較して、コンパクトなサイズおよび新規機能特性という利点をもたらす。
ガイド部分

【0210】

本開示の組成物および方法では、ガイド部分を利用して、異種遺伝子エフェクターを標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に方向付けることができる。ガイド部分により、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列を認識し、それに特異的に結合することができるようになる。

【0211】

ガイド部分は、ガイド核酸を含み得る。ガイド部分は、本明細書に開示されるヌクレアーゼおよびガイド核酸を含み得る。ガイド部分は、ヌクレアーゼまたはその一部、例えばエンドヌクレアーゼ、例えば異種エンドヌクレアーゼを含み得る。ヌクレアーゼは、例えば、ＤＮＡヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ欠損もしくは野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ活性が低下した改変ヌクレアーゼ、その誘導体、そのバリアント、またはその断片であり得る。一部の実施形態では、ガイド部分は最小限のヌクレアーゼ活性を有する。

【0212】

任意の適切なヌクレアーゼ、その断片、または誘導体をガイド部分に使用することができる。適切なヌクレアーゼとしては、これだけに限定されないが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを含めたＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）；ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合性タンパク質；リコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポザーゼ；アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、原核生物アルゴノート（ｐＡｇｏ）、古細菌アルゴノート（ａＡｇｏ）、および真核生物アルゴノート（ｅＡｇｏ））；任意のその誘導体；任意のそのバリアントおよび任意のその断片が挙げられる。

【0213】

一部の実施形態では、ガイド部分は、ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、ヌクレアーゼ欠損である工学的に操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＤＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、本開示の１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターとの複合体に存在していない限りは標的ＤＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導しないＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、標的ＤＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導し得る（例えば、本開示の異種遺伝子エフェクターが存在することで変更または強化され得る）ＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合性タンパク質を含む。

【0214】

一部の実施形態では、ガイド部分は、ＲＮＡヌクレアーゼ、例えば、工学的に操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＲＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、本開示の１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターとの複合体に存在していない限りは標的ＲＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導しないＲＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、標的ＲＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導し得る（例えば、本開示の異種遺伝子エフェクターが存在することで変更または強化され得る）ＲＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合性タンパク質を含む。

【0215】

一部の実施形態では、ガイド部分は、核酸によりガイドされる標的化系を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、ＤＮＡによりガイドされる標的化系を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、ＲＮＡによりガイドされる標的化系を含む。ガイド部分は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（例えば、そのヌクレアーゼ欠損型、例えばｄＣａｓ９）の標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に対する特異的結合を容易にするガイド核酸配列を含み、それを利用し得る。結合特異性は、ガイド核酸、例えばシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはその一部を使用することによって決定することができる。一部の実施形態では、異なるｓｇＲＮＡを使用することにより、本開示の組成物および方法を、異なる標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に対して使用する（例えば、それに標的化する）ことができる。

【0216】

原核生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）－ＣＲＩＳＰＲ関連）系、例えば、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１を本開示の組成物および方法における遺伝子発現、エピゲノム編集、およびクロマチンループ形成を調節するためのツールとして転用することができる。異種遺伝子エフェクターと複合体を形成したヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質により、ｄＣａｓが結合した部位に隣接する標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現を調節することが可能になり得る。

【0217】

一部の実施形態では、ガイド部分は、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ））／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系において機能するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼを含む。細菌では、この系により、外来ＤＮＡに対する適応免疫がもたらされ得る。

【0218】

多様な哺乳動物、動物、植物、微生物、および酵母を含めた多種多様な生物体において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、改変されたものおよび／または改変されていないもの）をゲノム工学ツールとして利用することができる、または、工学的に操作されたタンパク質の本明細書に開示される標的遺伝子座に対する特異的結合を方向付けるように改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子発現および／または活性または核酸結合の標的化調節のための、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などのガイド核酸を含み得る。ＲＮＡによりガイドされるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）は、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に配列依存的に特異的に結合し得る。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有する場合、ＤＮＡを切断し得る。

【0219】

一部の場合では、Ｃａｓタンパク質を変異させるおよび／または改変して、ヌクレアーゼ欠損タンパク質または野生型Ｃａｓタンパク質と比べてヌクレアーゼ活性が低下したタンパク質を得る。ヌクレアーゼ欠損タンパク質は、ＤＮＡに結合する能力は保持し得るが、核酸切断活性を欠くまたは核酸切断活性が低下したものであり得る。

【0220】

一部の実施形態では、ガイド部分は、ガイド核酸、例えばガイドＲＮＡまたはその一部と複合体を形成するＣａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、シングルガイド核酸、例えばシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と複合体を形成するＣａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができるガイド核酸、例えばガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と必要に応じて複合体を形成したＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、標的ＤＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導し得るＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、ＲＮＡに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合性タンパク質を含む。

【0221】

本開示の組成物および方法に使用されるガイド核酸は、例えば、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、または少なくとも４０ヌクレオチドであり得る。

【0222】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法に使用されるガイド核酸は、最大で１０、最大で１１、最大で１２、最大で１３、最大で１４、最大で１５、最大で１６、最大で１７、最大で１８、最大で１９、最大で２０、最大で２１、最大で２２、最大で２３、最大で２４、最大で２５、最大で２６、最大で２７、最大で２８、最大で２９、最大で３０、最大で３１、最大で３２、最大で３３、最大で３４、最大で３５、最大で３６、最大で３７、最大で３８、最大で３９、または最大で４０ヌクレオチドである。

【0223】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法に使用されるガイド核酸は、約８～約４０ヌクレオチド、約１０～約４０ヌクレオチド、約１１～約４０ヌクレオチド、約１２～約４０ヌクレオチド、約１３～約４０ヌクレオチド、約１４～約４０ヌクレオチド、約１５～約４０ヌクレオチド、約１６～約４０ヌクレオチド、約１７～約４０ヌクレオチド、約１８～約４０ヌクレオチド、約１９～約４０ヌクレオチド、約２０～約４０ヌクレオチド、約２２～約４０ヌクレオチド、約２４～約４０ヌクレオチド、約２６～約４０ヌクレオチド、約２８～約４０ヌクレオチド、約３０～約４０ヌクレオチド、約８～約３０ヌクレオチド、約１０～約３０ヌクレオチド、約１１～約３０ヌクレオチド、約１２～約３０ヌクレオチド、約１３～約３０ヌクレオチド、約１４～約３０ヌクレオチド、約１５～約３０ヌクレオチド、約１６～約３０ヌクレオチド、約１７～約３０ヌクレオチド、約１８～約３０ヌクレオチド、約１９～約３０ヌクレオチド、約２０～約３０ヌクレオチド、約２２～約３０ヌクレオチド、約２４～約３０ヌクレオチド、約２６～約３０ヌクレオチド、約２８～約３０ヌクレオチド、約８～約２５ヌクレオチド、約１０～約２５ヌクレオチド、約１１～約２５ヌクレオチド、約１２～約２５ヌクレオチド、約１３～約２５ヌクレオチド、約１４～約２５ヌクレオチド、約１５～約２５ヌクレオチド、約１６～約２５ヌクレオチド、約１７～約２５ヌクレオチド、約１８～約２５ヌクレオチド、約１９～約２５ヌクレオチド、約２０～約２５ヌクレオチド、約２２～約２５ヌクレオチド、約２４～約２５ヌクレオチド、約８～約２０ヌクレオチド、約１０～約２０ヌクレオチド、約１１～約２０ヌクレオチド、約１２～約２０ヌクレオチド、約１３～約２０ヌクレオチド、約１４～約２０ヌクレオチド、約１５～約２０ヌクレオチド、約１６～約２０ヌクレオチド、約１７～約２０ヌクレオチド、約１８～約２０ヌクレオチド、約１９～約２０ヌクレオチド、約８～約１８ヌクレオチド、約１０～約１８ヌクレオチド、約１１～約１８ヌクレオチド、約１２～約１８ヌクレオチド、約１３～約１８ヌクレオチド、約１４～約１８ヌクレオチド、約１５～約１８ヌクレオチド、約１６～約１８ヌクレオチド、約８～約１６ヌクレオチド、約１０～約１６ヌクレオチド、約１１～約１６ヌクレオチド、約１２～約１６ヌクレオチド、約１３～約１６ヌクレオチド、約１４～約１６ヌクレオチド、または約１５～約１６ヌクレオチドである。

【0224】

ガイド核酸は、ガイドＲＮＡまたはその一部であり得る。

【0225】

任意の適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、種々の命名方式を使用して称され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型系、または任意の他の適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、本明細書で使用される場合、クラス１、クラス２、または任意の他の適切に分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る。クラス１であるかクラス２であるかの決定は、エフェクターモジュールをコードする遺伝子に基づき得る。クラス１系は、一般に、マルチサブユニットｃｒＲＮＡ－エフェクター複合体を有し、一方、クラス２系は、一般に、単一のタンパク質、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３またはｃｒＲＮＡ－エフェクター複合体を有する。クラス１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用して調節をもたらすことができる。クラス１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型（例えば、Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦ、ＩＵ）、ＩＩＩ型（例えば、ＩＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ）、およびＩＶ型（例えば、ＩＶ、ＩＶＡ、ＩＶＢ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ型を含み得る。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、単一の大きなＣａｓタンパク質を使用して調節をもたらすことができる。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、ＩＩ型（例えば、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ）およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ型を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、互いに補完的であり得る、および／または、機能単位をトランスでもたらしてＣＲＩＳＰＲによる遺伝子座の標的化を容易にし得る。

【0226】

本明細書に開示されるガイド部分は、ヌクレアーゼ、例えば、異種ヌクレアーゼ（例えば、異種遺伝子エフェクターに作動可能にカップリングするＣａｓタンパク質）を含み得る。ヌクレアーゼは、閾値長未満の長さを有し得る。閾値長は、最大で約１，０００アミノ酸、最大で約９５０アミノ酸、最大で約９００アミノ酸、最大で約８５０アミノ酸、最大で約８００アミノ酸、最大で約７５０アミノ酸、最大で約７００アミノ酸、最大で約６５０アミノ酸、最大で約６００アミノ酸、最大で約５５０アミノ酸、最大で約５００アミノ酸、最大で約４５０アミノ酸、最大で約４００アミノ酸、最大で約３５０アミノ酸、または最大で約３００アミノ酸であり得る。閾値長は、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８５０アミノ酸、少なくとも約９００アミノ酸、少なくとも約９５０アミノ酸、または少なくとも約１，０００アミノ酸であり得る。

【0227】

ガイド部分がＣａｓタンパク質またはその誘導体を含む場合、Ｃａｓタンパク質またはその誘導体は、クラス１ Ｃａｓタンパク質またはクラス２ Ｃａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型Ｃａｓタンパク質、またはＶＩ型Ｃａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のドメインを含み得る。ドメインの非限定的な例としては、ガイド核酸認識および／または結合性ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮＡ分解酵素またはＲＮａｓｅドメイン、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）、ＤＮＡ結合性ドメイン、ＲＮＡ結合性ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、および二量体形成ドメインが挙げられる。ガイド核酸認識および／または結合性ドメインは、ガイド核酸と相互作用し得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸を切断するための触媒活性を含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸の切断を防止するために触媒活性を欠くものであり得る。Ｃａｓタンパク質は、他のタンパク質またはポリペプチドと融合したキメラＣａｓタンパク質またはその断片であり得る。Ｃａｓタンパク質は、種々のＣａｓタンパク質のキメラ、例えば、異なるＣａｓタンパク質由来のドメインを含むキメラであり得る。

【0228】

Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｕ１９６６、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３Ｘ、Ｃａｓ１３Ｙ、およびホモログまたはその改変バージョンが挙げられる。

【0229】

一部の場合では、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａでなくてもよく、また、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａである必要はない。本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ比較してサイズが小さいものであり得る。本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１（またはＣａｓ１４ａ１）に由来し得る。例えば、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、配列番号４９３４２のポリペプチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または実質的に約１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。別の例では、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、配列番号４９３４３のポリペプチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または実質的に約１００％同一のアミノ酸配列を含み得る。本明細書に開示される場合、配列番号４９３４２は、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１（またはＣａｓ１４ａ１）のポリペプチド配列をコードする。本明細書に開示される場合、配列番号４９３４３は、ヌクレアーゼ活性が低下した、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１の工学的に操作されたバリアントをコードする。一部の実施形態では、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１またはその誘導体、例えば、ヌクレアーゼ活性が低下した、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１の工学的に操作されたバリアントは、ＣａｓＭｉｎｉまたはｄＣａｓＭｉｎｉと称され得る。

【0230】

表1:例示的なCas配列

【表1】

【0231】

Ｃａｓタンパク質またはその断片、または誘導体は、任意の適切な生物体に由来し得る。非限定的な例として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏ ｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａが挙げられる。一部の態様では、生物体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。一部の態様では、生物体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。一部の態様では、生物体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。

【0232】

Ｃａｓタンパク質は、これだけに限定されないが、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．Ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａを含めた種々の細菌種に由来し得る。

【0233】

本明細書で使用されるＣａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質の改変形態であり得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型または改変Ｃａｓタンパク質の活性バリアント、不活性バリアント、または断片であり得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型バージョンのＣａｓタンパク質と比べて欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはこれらの任意の組合せなど、アミノ酸の変化を含み得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質と少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドであり得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型の例示的なＣａｓタンパク質に対して最大で約５％、最大で約１０％、最大で約２０％、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約７０％、最大で約８０％、最大で約９０％、または最大で約１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドであり得る。バリアントまたは断片は、野生型または改変Ｃａｓタンパク質またはその一部と少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を含み得る。バリアントまたは断片は、ガイド核酸との複合体内の核酸遺伝子座に標的化することができるが、核酸切断活性を持たない。

【0234】

Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン、例えば、ＤＮＡ分解酵素ドメインを含み得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨ様２０ヌクレアーゼドメインを含み得る。Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性形態では、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインは、それぞれが二本鎖ＤＮＡの異なる鎖をカットしてＤＮＡに二本鎖切断を生じさせ得る。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメインを１つのみ含み得る（例えば、Ｃｐｆ１はＲｕｖＣドメインを含むがＨＮＨドメインを欠く）。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは存在しない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは存在するが不活性であるまたは活性が低下しているもしくは最小限である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは存在し、かつ活性である。

【0235】

Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）を欠失または変異させ、その結果、もはや機能的でないまたは低下したヌクレアーゼ活性を含むものにすることができる。例えば、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含むＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）において、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを欠失または変異させた場合、得られるＣａｓタンパク質はニッカーゼとしてとして公知であり、二本鎖ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）認識配列において一本鎖切断を生じさせるが、二本鎖切断は生じさせない。そのようなニッカーゼは、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することはできない。Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインの全て（例えば、Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインの両方；Ｃｐｆ１タンパク質のＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン）を欠失または変異させた場合、得られるＣａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下しているまたはその能力を有さない可能性がある。Ｃａｓ９タンパク質をニッカーゼに変換することができる変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニン）変異である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位におけるヒスチジンからアラニン）またはＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位におけるヒスチジンからアラニン）により、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９タンパク質を不活性型Ｃａｓ９に変換することができる変異の例は、ＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニン）変異およびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位におけるヒスチジンからアラニン）またはＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位におけるヒスチジンからアラニン）である。

【0236】

ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓタンパク質は、当該タンパク質の野生型バージョンと比べて１つまたは複数の変異を含み得る。変異は、野生型Ｃａｓタンパク質の複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数における核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下をもたらし得る。変異は、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数を、標的核酸の相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断する能力が低下したものにし得る。変異は、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数を、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の相補鎖を切断する能力が低下したものにし得る。変異は、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数を、標的核酸の相補鎖および非相補鎖を切断する能力を欠くものにし得る。ヌクレアーゼドメイン内の変異させる残基は、ヌクレアーゼの１つまたは複数の触媒残基に対応し得る。例えば、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基、例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４およびＡｓｎ８５６を変異させて、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を不活化することができる。Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン内の変異させる残基は、例えば、配列および／または構造アラインメントによって決定される野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４およびＡｓｎ８５６に対応し得る。

【0237】

非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７（またはＣａｓタンパク質のいずれかの対応する変異）を変異させることができる。例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａ。アラニン置換以外の変異も適切であり得る。

【0238】

Ｄ１０Ａ変異をＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠くＣａｓ９タンパク質（例えば、不活性型Ｃａｓ９タンパク質）を作製することができる。Ｈ８４０Ａ変異をＤ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５４Ａ変異をＨ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５６Ａ変異をＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。

【0239】

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はクラス２ Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質の改変バージョンであり、またはＣａｓ９タンパク質に由来する。例えば、切断活性を欠くＣａｓ９タンパク質。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．Ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質の改変バージョンである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．Ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質に由来する。例えば、切断活性を欠くＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．Ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質。

【0240】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、一般に、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）と少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来）に対して最大で約５％、最大で約１０％、最大で約２０％、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約７０％、最大で約８０％、最大で約９０％、または約１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９タンパク質、またはアミノ酸の変化、例えば、欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、もしくはこれらの任意の組合せを含み得るＣａｓ９タンパク質の改変形態を指し得る。

【0241】

Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン）と少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0242】

Ｃａｓタンパク質、そのバリアントまたは誘導体を、例えば、本明細書に開示される複合体の一部として、本開示の組成物および方法による遺伝子発現の調節を増強するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、核酸結合親和性、核酸結合特異性、酵素活性、および／またはヘテロ二量体形成もしくはオリゴマー形成ドメインなどの他の因子に対する結合を増大または低減させ、また、リガンドを誘導するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の任意の他の活性または特性、例えば安定性を変化させるように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを、改変する、欠失させる、もしくは不活化することができる、またはＣａｓタンパク質を短縮して、タンパク質または複合体の所望の機能に必須ではないドメインを除去することができる。Ｃａｓタンパク質を、異種遺伝子エフェクターを含む本開示の複合体によって遺伝子発現を調節するためにＣａｓタンパク質の活性をモジュレートする（例えば、増強するまたは低下させる）ように改変することができる。

【0243】

例えば、Ｃａｓタンパク質を異種遺伝子エフェクター（例えば、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、および／または転写リプレッサードメイン）とカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）することができる。Ｃａｓタンパク質を本明細書に開示されるオリゴマー形成または二量体形成ドメイン（例えば、ヘテロ二量体形成ドメイン）とカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）することができる。Ｃａｓタンパク質を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）することができる。Ｃａｓタンパク質を、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質を含有する複合体の分解を容易にすることができる配列、例えば、デグロン、例えば誘導性デグロン（例えば、オーキシン誘導性）とカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）することができる。

【0244】

Ｃａｓタンパク質を、任意の適切な数のパートナー、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８のパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）することができる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、最大で２、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、または最大で１０のパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）する。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、１～５、１～４、１～３、１～２、２～５、２～４、２～３、３～５、３～４、または４～５のパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）する。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、１つのパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）する。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、２つのパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）する。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、３つのパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）する。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、４つのパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）する。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、５つのパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）する。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、６つのパートナーとカップリング（例えば、融合、共有結合によりカップリング、または非共有結合によりカップリング）する。

【0245】

Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質であり得る。融合したドメインまたは異種ポリペプチド（例えば、異種遺伝子エフェクター）は、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置してよい。

【0246】

Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の形態で、例えば、Ｃａｓタンパク質単独で、またはガイド核酸と複合体を形成したリボ核タンパク質として提供することができる。Ｃａｓタンパク質を、複合体、例えば、ガイド核酸および／または本開示の１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターとの複合体として提供することができる。Ｃａｓタンパク質を、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））、またはＤＮＡの形態で提供することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を特定の細胞または生物体におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。

【0247】

Ｃａｓタンパク質、その断片または誘導体をコードする核酸を細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸をプロモーター、例えば、細胞において構成的に活性であるまたは誘導的に活性になるプロモーターに作動可能に）連結することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を発現構築物内でプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を方向付けることが可能であり、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸構築物を含み得る。

【0248】

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、そのバリアントまたは誘導体は、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質である。不活性型Ｃａｓタンパク質は、核酸切断活性を欠くタンパク質であり得る。

【0249】

Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質の改変形態を含み得る。野生型Ｃａｓタンパク質の改変形態は、Ｃａｓタンパク質の核酸切断活性を低下させるアミノ酸の変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含み得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の改変形態は、野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）の核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下を有し得る。Ｃａｓタンパク質の改変形態は、実質的な核酸切断活性を有さないものであり得る。Ｃａｓタンパク質が実質的な核酸切断活性を有さない改変形態である場合、酵素的に不活性な、「不活性化された」および／または「不活性型」（「ｄ」と省略される）と称される。不活性型Ｃａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ、ｄＣａｓ９）は、標的ポリヌクレオチドに結合することができるが、標的ポリヌクレオチドを切断することはできないかまたは最小限に切断する。一部の態様では、不活性型Ｃａｓタンパク質は、不活性型Ｃａｓ９タンパク質である。

【0250】

ｄＣａｓ９ポリペプチドは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と会合して、例えば、本明細書に開示される異種遺伝子エフェクター（複数可）と組み合わさって、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の転写を活性化するまたは抑制する。ｓｇＲＮＡを、Ｃａｓまたは本開示のガイド部分構成要素を発現する細胞に導入することができる。一部の場合では、そのような細胞は、同じ標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列を標的化する１つまたは複数の異なるｓｇＲＮＡを含有し得る。他の場合では、ｓｇＲＮＡは、細胞内の異なる核酸（例えば、異なる標的遺伝子、異なる標的遺伝子調節配列、または同じ標的遺伝子もしくは標的遺伝子調節配列内の異なる配列）を標的化する。

【0251】

酵素的に不活性とは、ポリヌクレオチド内の核酸配列に配列特異的に結合することができるが、標的ポリヌクレオチドを切断しない、または実質的に低減した頻度で切断するヌクレアーゼを指し得る。酵素的に不活性なガイド部分は、酵素的に不活性なドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）を含み得る。酵素的に不活性とは、活性がないことを指し得る。酵素的に不活性とは、活性が実質的にないことを指し得る。酵素的に不活性とは、活性が本質的にないことを指し得る。酵素的に不活性とは、活性が比較可能な野生型活性（例えば、核酸切断活性、野生型Ｃａｓ９活性）と比較して１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、６％以下、７％以下、８％以下、９％以下、または１０％以下の活性であることを指し得る。

【0252】

一部の実施形態では、ガイド部分は、核酸によりガイドされる標的化系を含有しない。例えば、ガイド部分は、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に、タンパク質の構造的特色に基づいて結合するタンパク質、例えば、本明細書に開示されるある特定のヌクレアーゼを含み得る。

【0253】

一部の実施形態では、ガイド部分は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を含む。ＺＦＮは、切断ドメイン、例えばＦｏｋ１の切断ドメインと、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリヌクレオチドに結合することができる少なくとも１つのジンクフィンガーモチーフ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのジンクフィンガーモチーフ）との融合物を指し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列）への結合のためにＺＦＮを本開示の標的化部分に使用するが、ＺＦＮはポリヌクレオチドを切断しないまたは実質的に切断しない、例えば、ヌクレアーゼ不活性型ＺＦＮである。ＺＦＮまたはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターと融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0254】

ヌクレアーゼ活性ＺＦＮでは、２つの個々のＺＦＮのポリヌクレオチドのある特定の位置におけるある特定の向きおよび間隔でのヘテロ二量体形成によりポリヌクレオチドの切断がもたらされ得る。例えば、ＤＮＡに結合するＺＦＮにより、ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導することができる。２つの切断ドメインが二量体を形成してＤＮＡを切断することを可能にするために、２つの個々のＺＦＮがＤＮＡの逆の鎖に、それらのＣ末端がある特定の間隔になるように結合し得る。一部の場合では、ジンクフィンガードメインと切断ドメインの間のリンカー配列により、各結合性部位の５’端が約５～７塩基対離れることが必要になり得る。一部の場合では、切断ドメインを各ジンクフィンガードメインのＣ末端と融合する。

【0255】

一部の実施形態では、ＺＦＮを含むガイド部分の切断ドメインは、野生型切断ドメインの改変形態を含む。切断ドメインの改変形態は、切断ドメインの核酸切断活性を低下させるアミノ酸の変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含み得る。例えば、切断ドメインの改変形態は、対応する野生型切断ドメインの核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下を有し得る。切断ドメインの改変形態は、実質的な核酸切断活性を有さないものであり得る。一部の実施形態では、切断ドメインは、酵素的に不活性である。

【0256】

一部の実施形態では、ガイド部分は、「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬ－エフェクターヌクレアーゼ」またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を含む。ＴＡＬＥＮとは、ＤＮＡ結合性タンデムリピートの中心ドメインおよび切断ドメインを一般に含有する工学的に操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合性ドメインとＤＮＡ切断ドメインを融合することによって作製することができる。一部の場合では、ＤＮＡ結合性タンデムリピートは、３３～３５アミノ酸長を含み、少なくとも１つの特異的なＤＮＡ塩基対を認識することができる超可変アミノ酸残基を２つ、１２位と１３位に含有する。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を野生型または変異型Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼまたはＦｏｋ１の触媒ドメインヌクレアーゼと融合することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列）への結合のためにＴＡＬＥＮを本開示の標的化部分に使用するが、ＴＡＬＥＮはポリヌクレオチドを切断しないまたは実質的に切断しない、例えば、ヌクレアーゼ不活性型ＴＡＬＥＮである。ＴＡＬＥＮまたはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターと融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0257】

一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮを、ヌクレアーゼ活性が低下するように工学的に操作する。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの改変形態を含む。ヌクレアーゼドメインの改変形態は、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低下させるアミノ酸の変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含み得る。例えば、ヌクレアーゼドメインの改変形態は、野生型ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下を有し得る。ヌクレアーゼドメインの改変形態は、実質的な核酸切断活性を有さないものであり得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、酵素的に不活性である。ＴＡＬＥＮまたはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターと融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0258】

Ｆｏｋ１をＴＡＬＥＮに使用するために、Ｆｏｋ１に対して、いくつかの変異、例えば切断の特異性または活性を改善する変異がなされている。そのようなＴＡＬＥＮを、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように工学的に操作することができる。ＴＡＬＥＮを使用して、標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を創出し、それにより今度はＮＨＥＪまたはＨＤＲを受けさせることによって遺伝子改変（例えば、核酸配列編集）を生じさせることができる。

【0259】

ＴＡＬＥまたはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターと融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を異種遺伝子エフェクターと融合し、ヌクレアーゼは含めない。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、ポリヌクレオチドを切断しないまたは実質的に切断しない、例えば、ヌクレアーゼ不活性型ＴＡＬＥである。ＴＡＬＥまたはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターと融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0260】

一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質と異種遺伝子エフェクターの複合体を、転写活性化因子として機能するように設計する。一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質と異種遺伝子エフェクターの複合体を、転写リプレッサーとして機能するように設計する。例えば、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質のＤＮＡ結合性ドメインを転写活性化ドメインを含む１つもしくは複数の異種遺伝子エフェクター、または転写抑制ドメインを含む１つもしくは複数の異種遺伝子エフェクターと融合（例えば、連結）することができる。

【0261】

一部の実施形態では、ガイド部分は、メガヌクレアーゼを含む。メガヌクレアーゼとは、一般に、高度に配列特異的であり得るレアカッティングエンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、少なくとも１２塩基対の長さ、例えば、１２塩基対から４０塩基対まで、１２塩基対から５０塩基対まで、または１２塩基対から６０塩基対までの長さにわたるＤＮＡ標的部位を認識することができる。メガヌクレアーゼは、モジュラーＤＮＡ結合性ヌクレアーゼ、例えば、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと、少なくとも１つのＤＮＡ結合性ドメインまたは核酸標的配列を指定するタンパク質とを含む任意の融合タンパク質であり得る。ＤＮＡ結合性ドメインは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含有し得る。ヌクレアーゼとして活性なメガヌクレアーゼは、二本鎖切断を生じさせ得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列）への結合のためにメガヌクレアーゼを本開示の標的化部分に使用するが、メガヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドを切断しないまたは実質的に切断しない、例えば、ヌクレアーゼ不活性型メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼまたはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターと融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0262】

メガヌクレアーゼは、単量体または二量体であり得る。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、天然に存在する（天然に見いだされる）または野生型メガヌクレアーゼであり、他の場合では、メガヌクレアーゼは、非天然、人工、工学的に操作された、合成、合理的に設計された、または人造メガヌクレアーゼである。一部の実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼには、Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－Ｍｓｏｌメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ、そのバリアント、その誘導体、およびその断片が含まれる。

【0263】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの改変形態を含む。ヌクレアーゼドメインの改変形態は、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低下させるまたは除去するアミノ酸の変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含み得る。例えば、ヌクレアーゼドメインの改変形態は、野生型ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下を有し得る。ヌクレアーゼドメインの改変形態は、実質的な核酸切断活性を有さないものであり得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、酵素的に不活性である。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合することができるが、ＤＮＡを切断することはできない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼとして不活性なメガヌクレアーゼを１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターと融合または会合させて、本開示の複合体を生成する。

【0264】

一部の実施形態では、ガイド部分は、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性を調節することができる。一部の実施形態では、ガイド部分は、核酸（例えば、遺伝子および／または遺伝子産物）の配列を編集することができる。ヌクレアーゼとして活性なＣａｓタンパク質により、標的ポリヌクレオチドにおいて二本鎖切断または一本鎖切断を生じさせることによって核酸配列を編集することができる。

【0265】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼを含むガイド部分により、ＤＮＡなどの標的ポリヌクレオチドにおいて二本鎖切断を生じさせることができる。ＤＮＡにおける二本鎖切断により、ＤＮＡ切断修復をもたらすことができ、それにより、遺伝子改変（複数可）を導入することが可能になる（例えば、核酸編集）。一部の実施形態では、ヌクレアーゼにより、部位特異的一本鎖ＤＮＡ切断またはニックが誘導され、したがって、ＨＤＲがもたらされる。

【0266】

ＤＮＡにおける二本鎖切断により、ＤＮＡ切断修復をもたらすことができ、それにより、遺伝子改変（複数可）を導入することが可能になる（例えば、核酸編集）。ＤＮＡ切断修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって起こり得る。ＨＤＲでは、標的ＤＮＡの部位を挟む相同アームを含有するドナーＤＮＡ修復鋳型または鋳型ポリヌクレオチドを提供することができる。

【0267】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼを含むガイド部分または複合体は、ＤＮＡなどの標的ポリヌクレオチドにおける二本鎖切断を生じさせない。
複合体

【0268】

本明細書において、一部の態様では、異種遺伝子エフェクター、およびガイド部分、例えば、ガイド核酸および／またはヌクレアーゼ、例えば、切断活性を欠くまたは実質的に欠くエンドヌクレアーゼを含む複合体が開示される。

【0269】

本開示の複合体は、例えば、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターを標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列の極めて近傍に位置させ、それにより、標的遺伝子の発現または活性レベルのモジュレーションを容易にするために有用であり得る。

【0270】

一部の実施形態では、本開示の複合体は、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡに結合する。一部の実施形態では、本開示の複合体は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または非コードＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、本開示の複合体は、ＤＮＡおよびＲＮＡに結合する。

【0271】

一部の実施形態では、複合体により、ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、オペレーター、またはサイレンサー、インスレーター、シス調節エレメント、トランス調節エレメント、エピジェネティック改変（例えば、ＤＮＡメチル化）部位、コード配列）を物理的に妨害することによって標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性をモジュレートする（例えば、増大または低減させる）ことができる。

【0272】

一部の実施形態では、複合体により、標的遺伝子の発現を抑止または増強するために有効な追加の因子を動員することによって標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性をモジュレートする（例えば、増大または低減させる）ことができる。

【0273】

一部の実施形態では、本開示の複合体を、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、シス調節エレメント、トランス調節エレメント、またはエピジェネティック改変（例えば、ＤＮＡメチル化）部位）にエピジェネティック改変を導入するために使用する。一部の実施形態では、本開示の複合体を、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列（例えば、標的遺伝子に対して遠位または近位の遺伝子）を含む三次元構造、位相幾何学的に関連するドメイン、またはゲノム境界を生じさせるために使用する。

【0274】

一部の場合では、本明細書に開示される複合体、例えば、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターとガイド核酸とを含む複合体による標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の調節には、標的遺伝子と作動的にカップリングした内因性標的遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、サイレンサー、インスレーター、シス調節エレメント、トランス調節エレメント、エピジェネティック改変（例えば、ＤＮＡメチル化）部位など）を利用することができる。したがって、複合体による標的遺伝子のそのような調節は、対象または宿主細胞に対して異種である外因性、合成、および／または異種の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、サイレンサー、インスレーター、シス調節エレメント、トランス調節エレメント、エピジェネティック改変（例えば、ＤＮＡメチル化）部位などを伴わなくてよく、また、伴う必要はない。一部の実施形態では、複合体による標的遺伝子の調節は、工学的に操作された誘導性系、抑制可能な系、および／またはレポーター系の使用を伴わない。一部の実施形態では、複合体による標的遺伝子の調節は、外因性、工学的に操作された、または合成の調節エレメントの使用を伴わない、例えば、テトラサイクリンまたはその類似体によってモジュレートされる応答エレメントを伴わない。一部の実施形態では、複合体による標的遺伝子の調節は、工学的に操作された誘導性系、抑制可能な系、および／またはレポーター系の一部として機能するトランス活性化因子またはリバーストランス活性化因子の使用を伴わない。一部の実施形態では、複合体による標的遺伝子の調節は、Ｔｅｔ ｏｆｆまたはｔＴＡ依存性系、またはその構成要素を伴わない。一部の実施形態では、複合体による標的遺伝子の調節は、Ｔｅｔ ＯｎまたはｒｔＴＡ依存性系、またはその構成要素を伴わない。

【0275】

一部の場合では、本明細書に開示される複合体（例えば、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターとガイド核酸とを含む複合体）は、モジュレート剤、例えば、複合体により標的遺伝子の発現を増大または低減させることを直接的または間接的に可能にする作用剤によるいかなるさらなる制御を伴わずに標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）を調節することが可能なものであり得る。一部の実施形態では、複合体は、トランス活性化剤、リバーストランス活性化剤、小分子、薬物、二量体形成もしくは多量体形成の化学的誘導物質、追加の誘導剤、追加の抑制剤、またはこれらの任意の組合せを伴うことなく標的遺伝子を調節することが可能である。例えば、個々の複合体を宿主細胞に導入する（例えば、個々の複合体の個々の構成要素を宿主細胞に発現させるおよび／またはトランスフェクトする）際、そのような導入は、個々の複合体が標的遺伝子の発現または活性を調節することを可能にするために十分なものであり得る。

【0276】

一部の実施形態では、複合体は、異種遺伝子エフェクターとガイド部分とを含む。一部の実施形態では、複合体は、１つの異種遺伝子エフェクターと１つのガイド部分とを含む。一部の実施形態では、複合体は、２つの異種遺伝子エフェクターと１つのガイド部分とを含む。一部の実施形態では、複合体は、３つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターと１つのガイド部分とを含む。

【0277】

一部の実施形態では、複合体は、異種遺伝子エフェクターとガイド核酸とを含む。一部の実施形態では、複合体は、１つの異種遺伝子エフェクターと１つのガイド核酸とを含む。一部の実施形態では、複合体は、２つの異種遺伝子エフェクターと１つのガイド核酸とを含む。一部の実施形態では、複合体は、３つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターと１つのガイド核酸とを含む。

【0278】

一部の実施形態では、複合体は、異種遺伝子エフェクターとヌクレアーゼ（例えば、異種エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを含むガイド部分）とを含む。ヌクレアーゼと異種遺伝子エフェクターの組合せは、ヌクレアーゼと異種遺伝子エフェクターとを含むキメラ融合ポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼと異種遺伝子エフェクターは、キメラ融合ポリペプチドの一部ではない、例えば、同じポリペプチド鎖内には存在しない。ヌクレアーゼと異種遺伝子エフェクターの組合せの長さは、閾値長未満であり得る。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターとヌクレアーゼの合わせた長さは、最大で約１，２００アミノ酸、最大で約１，１００アミノ酸、最大で約１，０００アミノ酸、最大で約９５０アミノ酸、最大で約９００アミノ酸、最大で約８５０アミノ酸、最大で約８００アミノ酸、最大で約７５０アミノ酸、最大で約７００アミノ酸、最大で約６５０アミノ酸、最大で約６００アミノ酸、最大で約５５０アミノ酸、最大で約５００アミノ酸、最大で約４５０アミノ酸、最大で約４００アミノ酸、最大で約３５０アミノ酸、または最大で約３００アミノ酸である。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターとヌクレアーゼの合わせた長さは、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８５０アミノ酸、少なくとも約９００アミノ酸、少なくとも約９５０アミノ酸、少なくとも約１，０００アミノ酸、少なくとも約１，１００アミノ酸、または少なくとも約１，２００アミノ酸である。

【0279】

本明細書に開示される複合体は、（ｉ）ガイド部分（例えば、必要に応じてガイド核酸配列を伴う、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ、例えば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはＵｎ１Ｃａｓ１２ｆ１などのヌクレアーゼまたはその一部）と（ｉｉ）異種遺伝子エフェクターとを含み得、ここで、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くに対して、例えば、全長にわたって、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0280】

一部の実施形態では、本明細書に開示される複合体は、（ｉ）ガイド部分（例えば、ガイド核酸配列および／またはヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ、例えば、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはＵｎ１Ｃａｓ１２ｆ１などのヌクレアーゼまたはその一部）と（ｉｉ）異種遺伝子エフェクターとを含み、ここで、異種遺伝子エフェクターは、配列番号１１０２、２０５７、５５４３、９０６６、１１９４８、１５６４６、１７６２９、１９８６０、２１０１５、２１１６６、２２１４９、２２７０７、２３６３１、２３６３９、２５４３０、２５５５５、３２６７８、３３８９０、３４０４７、３５７３７、３８１３８、３８７８０、４０９１３、４０９８５、４０９８６、および４２６２３のうちのいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、または約１００％の配列同一性または配列類似性を有するペプチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0281】

複合体に存在する２つの構成要素を、共有結合により連結する、例えば、融合タンパク質として存在させることができ、または架橋させる、例えば、架橋剤で処理することができ、または本明細書に開示されるペプチドもしくは非ペプチドリンカーによって接合することができる。

【0282】

一部の実施形態では、複合体に存在する２つの構成要素は、同じ融合タンパク質の一部である。構成要素を必要に応じてペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーなどのリンカーによって接合することができる。

【0283】

一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ）をリンカーによって異種遺伝子エフェクターと接合する。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を同じまたは異なる第２のリンカーによって第２の異種遺伝子エフェクターとさらに接合する。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ）をリンカーを伴わずに異種遺伝子エフェクターと融合する。

【0284】

一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ）をリンカーによってオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインと接合する。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を同じまたは異なる第２のリンカーによって第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインとさらに接合する。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ）をリンカーを伴わずに第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインと融合する。

【0285】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターをリンカーによって第２の異種遺伝子エフェクターと接合する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターを同じまたは異なる第２のリンカーによって第３の異種遺伝子エフェクターとさらに接合する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターをリンカーを伴わずに第２の異種遺伝子エフェクターと融合する。

【0286】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターをリンカーによってオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインと接合する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターを同じまたは異なる第２のリンカーによって第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインとさらに接合する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターをリンカーを伴わずに第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインと融合する。

【0287】

任意の適切なリンカーを使用することができる。柔軟なリンカーは、グリシン残基とセリン残基の一続きを含有する配列を有し得る。グリシン残基およびセリン残基はサイズが小さいので、柔軟性がもたらされ、接続された機能的ドメインが動きやすくなる。セリンまたはトレオニンを組み入れることにより、水溶液中で、水分子との水素結合が形成され、それにより、リンカーとタンパク質部分の好ましくない相互作用が低減することにより、リンカーの安定性を維持することができる。柔軟なリンカーは、柔軟性を維持するためにトレオニンおよびアラニンなどの追加のアミノ酸、ならびに、溶解性を改善するためにリシンおよびグルタミンなどの極性アミノ酸も含有し得る。柔軟でないリンカーは、例えば、アルファヘリックス構造を有し得る。柔軟でないアルファヘリックスリンカーは、タンパク質ドメイン間のスペーサーとして作用し得る。リンカーの非限定的な例としては、表２の配列、およびそのリピート、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０リピートが挙げられる。配列番号１～６に柔軟なリンカーまたはそのサブユニットを提示する。配列番号７～１０に柔軟でないリンカーまたはそのサブユニットを提示する。

【表2-1】

【表2-2】

【0288】

リンカー配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸残基長であり得る。

【0289】

一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、少なくとも１３、少なくとも１５、または少なくとも２０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、最大で５、最大で７、最大で９、最大で１１、最大で１３、最大で１５、最大で２０、最大で２５、最大で３０、最大で４０、または最大で５０アミノ酸である。

【0290】

一部の実施形態では、非ペプチドリンカーを使用する。非ペプチドリンカーは、例えば、化学的リンカーであり得る。本開示の複合体の２つの部分を化学的リンカーによって接続することができる。本開示の各化学的リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり得、いずれも、必要に応じて置換されている。一部の実施形態では、本開示の化学的リンカーは、エステル、エーテル、アミド、チオエーテル、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。一部の実施形態では、リンカーにより、化合物内のアミノ酸配列の順序を逆転させることができ、例えば、その結果、リンカーによって連結したアミノ酸配列が頭尾ではなく頭頭になる。そのようなリンカーの非限定的な例として、ジカルボン酸のジエステル、例えば、オキサリルジエステル、マロニルジエステル、サクシニルジエステル、グルタリルジエステル、アジピルジエステル、ピメチルジエステル、フマリルジエステル、マレイルジエステル、フタリルジエステル、イソフタリルジエステル、およびテレフタリルジエステルが挙げられる。そのようなリンカーの非限定的な例として、ジカルボン酸のジアミド、例えば、オキサリルジアミド、マロニルジアミド、サクシニルジアミド、グルタリルジアミド、アジピルジアミド、ピメチルジアミド、フマリルジアミド、マレイルジアミド、フタリルジアミド、イソフタリルジアミド、およびテレフタリルジアミドが挙げられる。そのようなリンカーの非限定的な例として、ジアミノリンカーのジアミド、例えば、エチレンジアミン、１，２－ジ（メチルアミノ）エタン、１，３－ジアミノプロパン、１，３－ジ（メチルアミノ）プロパン、１，４－ジ（メチルアミノ）ブタン、１，５－ジ（メチルアミノ）ペンタン、１，６－ジ（メチルアミノ）ヘキサン、およびピピリジン（pipyrizine）が挙げられる。必要に応じた置換基の非限定的な例としては、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、ハロゲン、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキシアルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロ－アルキル基、アルケニル基、ハロ－アルケニル基、アルキニル基、ハロ－アルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレイド基、エポキシ基、およびエステル基が挙げられる。

【0291】

複合体内に存在する２つの構成要素を、例えば、イオン結合、水素結合、本明細書に開示されるオリゴマー形成または二量体形成ドメインによって媒介される相互作用などによって非共有結合によりカップリングすることができる。

【0292】

一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ）を非共有結合カップリングによって異種遺伝子エフェクターと接合する。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を非共有結合カップリングによって第２の異種遺伝子エフェクターとさらに接合する。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を共有結合により第１の異種遺伝子エフェクターと接合し（例えば、融合タンパク質として、必要に応じてリンカーを伴って）、ガイド部分またはその一部を非共有結合カップリングによって第２の異種遺伝子エフェクターとさらに接合する。

【0293】

一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ）を非共有結合カップリングによってオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインと接合する。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を非共有結合カップリングによって第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインとさらに接合する。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ）を共有結合カップリングによって第１のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインと融合し（例えば、必要に応じてリンカーによって融合する）、非共有結合カップリングによって第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインと接合する。

【0294】

一部の実施形態では、ガイド部分の第１の構成要素（例えば、ガイド核酸）を非共有結合によりガイド部分の第２の構成要素（例えば、ヌクレアーゼ）と接合する。一部の実施形態では、ガイド部分の第１の構成要素（例えば、ガイド核酸）を共有結合によりガイド部分の第２の構成要素（例えば、ヌクレアーゼ）と接合する。

【0295】

共有結合カップリングと非共有結合カップリングの任意の組合せを本開示の複合体に使用することができ、例えば、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターを非共有結合によりガイド部分と融合し、１つまたは複数のオリゴマー形成ドメインを共有結合により複合体の構成要素（例えば、ヌクレアーゼ）と結合させることができる。

【0296】

一部の実施形態では、安定性の増大または低減をもたらすポリペプチドを本開示の複合体の構成要素、例えば、ガイド部分または異種遺伝子エフェクターと融合するまたは他のやり方で会合させる。融合させるポリペプチドは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置してよい。

【0297】

一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数の複合体の構成要素を、望ましい細胞内局在を方向付けるドメイン、例えば、核局在化シグナルまたは核内膜、核外膜、カハール体、核スペックル、核膜孔複合体、ＰＭＬ体、核小体、Ｐ顆粒、ＧＷ体、ストレス顆粒、海綿体、小胞体、ミトコンドリアなどへの標的化のためのタンパク質と融合する。

【0298】

一部の実施形態では、本開示の複合体は、第１のオリゴマー形成（例えば、二量体形成）ドメインと連結した第１のタンパク質と、第２のオリゴマー形成（例えば、二量体形成）ドメインと連結した第２のタンパク質とを含む。一部の実施形態では、オリゴマー形成ドメインまたは二量体形成ドメインは、ペプチド相互作用ドメイン、例えば、ｓｇＲＮＡ２．０、ＳＡＭ、ＳｕｎＴａｇ、ＲＡＢ、ＦＬＡＧ－ビオチンを利用する系、または本明細書に開示される誘導性オリゴマー形成（例えば、二量体形成）系を含み得る。
異種遺伝子エフェクターの組合せを含む複合体

【0299】

本明細書において、一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターを含む複合体、ならびにそれを同定する系および方法が開示される。

【0300】

一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターを本明細書に開示される目的の遺伝子座に動員することにより、いずれかの異種遺伝子エフェクター単独と比較して優れた転写のモジュレーション、例えば、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）発現のより強力かつ／または持続的なモジュレーションをもたらすことができる。

【0301】

一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターを本開示の複合体内の本明細書に開示される目的の遺伝子座に動員することにより、異種遺伝子エフェクターの組合せを別々に、すなわち、本開示の複合体内に存在させずに動員した場合と比較して優れた転写のモジュレーションをもたらすことができる。優れた転写のモジュレーションには、例えば、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）発現のより強力かつおよび／または持続的なモジュレーション（例えば、活性化または抑制）が含まれ得る。

【0302】

一部の実施形態では、本開示のアッセイ系、例えば、ハイスループットスクリーンを使用して、所望の結果、例えば、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または遺伝子のセットの発現の増大、標的遺伝子または遺伝子のセットの発現の低減、ある特定の閾値を上回る発現の増大、ある特定の閾値を下回る発現の低減、望ましい時間量の所望の閾値を上回るまたは下回る発現の持続性などを実現するために適した異種遺伝子エフェクターの組合せを同定する。

【0303】

標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現を調節する、本開示の複合体内に存在するおよび／または遺伝子座に動員される異種遺伝子エフェクターの組合せは、通常のｉｎ ｖｉｖｏの状況では相互作用しないが（例えば、細胞型供給源、生物体、組織特異的発現、所与の細胞内区画もしくは細胞小器官への局在、補因子、構造的、または複合体の要件などに起因する）、それにもかかわらず、例えば本開示の複合体内の標的目的の遺伝子座に直交性に動員されると望ましいエピジェネティックおよび／または転写作用を媒介する因子の組合せであり得る。

【0304】

一部の実施形態では、本開示の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターの組合せは、異なる供給源に由来する、例えば、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、哺乳動物タンパク質、核に主に局在化するタンパク質、クロマチン調節因子、ヘテロクロマチン形成を容易にする因子、ヒストンをメチル化によってモジュレートする因子、ヒストンをアセチル化によってモジュレートする因子、ヒストンをリン酸化によってモジュレートする因子、ヒストンをＡＤＰ－リボシル化によってモジュレートする因子、ヒストンをグリコシル化によってモジュレートする因子、ヒストンをＳＵＭＯ化によってモジュレートする因子、ヒストンをユビキチン化によってモジュレートする因子、ヒストンを、例えばＡＴＰ加水分解依存性プロセスによってヒストン構造をリモデリングすることによってモジュレートする因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ、クロマチンリモデリング複合体の構成要素、転写調節因子、転写活性化因子、転写リプレッサードメイン、転写因子、間葉系幹細胞転写因子、胚性幹細胞転写因子、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）転写因子、上皮幹細胞転写因子、がん幹細胞転写因子、がん関連転写因子、免疫細胞転写因子、核受容体、核ホルモン受容体、検証されたヒトウイルス転写調節因子、ウイルス（例えば、本明細書に開示されるウイルスの科、亜科、属、種などのもの）のゲノム由来の因子、ヒトに人畜共通感染することが可能なウイルスのゲノム由来の因子、ヒト／コウモリ共通ウイルス由来の因子、メタゲノム調査によるウイルスゲノム由来の因子、ヒト腸内に見いだされるウイルス由来の因子、極限環境において見いだされるウイルス由来の因子、高度の実証された転写調節因子モジュール性を有するウイルスもしくはタンパク質クラス由来の因子、または本明細書に開示される別の供給源のうちの任意の２つまたはそれよりも多くに由来する。

【0305】

一部の実施形態では、本開示の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターの組合せは、同じまたは同様の供給源に由来する、例えば、２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターのそれぞれが、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、哺乳動物タンパク質、核に主に局在化するタンパク質、クロマチン調節因子、ヘテロクロマチン形成を容易にする因子、ヒストンをメチル化によってモジュレートする因子、ヒストンをアセチル化によってモジュレートする因子、ヒストンをリン酸化によってモジュレートする因子、ヒストンをＡＤＰ－リボシル化によってモジュレートする因子、ヒストンをグリコシル化によってモジュレートする因子、ヒストンをＳＵＭＯ化によってモジュレートする因子、ヒストンをユビキチン化によってモジュレートする因子、ヒストンを、例えばＡＴＰ加水分解依存性プロセスによってヒストン構造をリモデリングすることによってモジュレートする因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ、クロマチンリモデリング複合体の構成要素、転写調節因子、転写活性化因子、転写リプレッサードメイン、転写因子、間葉系幹細胞転写因子、胚性幹細胞転写因子、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）転写因子、上皮幹細胞転写因子、がん幹細胞転写因子、がん関連転写因子、免疫細胞転写因子、核受容体、核ホルモン受容体、検証されたヒトウイルス転写調節因子、ウイルス（例えば、本明細書に開示されるウイルスの科、亜科、属、種などのもの）のゲノム由来の因子、ヒトに人畜共通感染することが可能なウイルスのゲノム由来の因子、ヒト／コウモリ共通ウイルス由来の因子、メタゲノム調査によるウイルスゲノム由来の因子、ヒト腸内に見いだされるウイルス由来の因子、極限環境において見いだされるウイルス由来の因子、高度の実証された転写調節因子モジュール性を有するウイルスもしくはタンパク質クラス由来の因子、または本明細書に開示される別の供給源に由来する配列を含有する。

【0306】

一部の実施形態では、複合体は、同じまたは同様の供給源に由来する２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクター、および異なる供給源に由来する２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターを含む。

【0307】

本開示の複合体内に存在する２つの異種遺伝子エフェクターは、共有結合により複合体と連結する、例えば、融合タンパク質内に存在させることができ、本明細書の他の箇所で開示されている任意の様式で、架橋剤などで処理することができる。

【0308】

本開示の複合体内に存在する２つの異種遺伝子エフェクターは、複合体と、例えば、イオン結合、水素結合、誘導可能および／または可逆的系を使用することなどによって、本明細書の他の箇所で開示されている任意の様式で、非共有結合により会合させることができる。

【0309】

本開示の複合体内に存在する２つの異種遺伝子エフェクターは、誘導性系を使用することによって複合体と会合させることができる。一部の実施形態では、誘導性系は、例えば、誘導剤を取り除くと、または解離剤で処理すると、可逆的である。

【0310】

複合体の構成要素を会合させるための誘導性系は、二量体形成ドメイン、オリゴマー形成ドメイン、または多量体形成ドメインを、会合対象のタンパク質と融合することを含み得る。一部の実施形態では、二量体形成ドメイン、オリゴマー形成ドメイン、または多量体形成ドメインを、会合対象のタンパク質のＮ末端と融合する。一部の実施形態では、二量体形成ドメイン、オリゴマー形成ドメイン、または多量体形成ドメインを、会合対象のタンパク質のＣ末端に融合する。一部の実施形態では、二量体形成ドメイン、オリゴマー形成ドメイン、または多量体形成ドメインを、会合対象のタンパク質のＮ末端およびＣ末端に融合する（例えば、Ｎ末端およびＣ末端の同じまたは異なる二量体形成ドメイン、オリゴマー形成ドメイン、または多量体形成ドメインを）。一部の実施形態では、二量体形成ドメイン、オリゴマー形成ドメイン、または多量体形成ドメインを会合対象のタンパク質のアミノ酸配列内部にインフレームで付加する。

【0311】

複合体の構成要素を会合させるための誘導性系は、化学的誘導性系であり得る。化学的誘導性系の非限定的な例としては、小分子誘導性系、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンに基づく系、ポナステロンＡに基づく系、アブシジン酸（ＡＢＡ）誘導性ＡＢＩ－ＰＹＬ１、ジベレリン（ＧＡ）誘導性ＧＩＤ１－ＧＡＩ、ラパマイシン誘導性ＦＫＢＰ－ＦＲＢ、ＴＭＰ－Ｈｔａｇにより誘導されるＨａｌｏＴａｇ／ＤＨＦＲ二量体形成系、酵素触媒反応を使用する二量体形成系、および誘導性構成要素の組合せを利用する系が挙げられる。

【0312】

複合体の構成要素を会合させるための誘導性系は、光誘導性系（例えば、光遺伝学的系）であり得る。光誘導性系の非限定的な例としては、フィトクロムに基づく赤色光誘導性ＰＨＹＢ－ＰＩＦ、クリプトクロムに基づく青色光誘導性ＣＲＹ２ＰＨＲ－ＣＩＢＮ、光・酸素・電圧に基づく青色光誘導性ＦＫＦ１－ＧＩ、ｐＭＡＧ、ｎＭＡＧ、ＢｐｈＳ、および誘導性構成要素の組合せを利用する系が挙げられる。

【0313】

一部の実施形態では、本開示の複合体の構成要素を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の誘導性かつ可逆的なヘテロ二量体タンパク質対（ＰＹＬ１－ＡＢＩとＧＩＤ１－ＧＡＩ）を使用して会合させる。この系由来のヘテロ二量体形成ドメインを２つの別々に発現させたポリペプチドのそれぞれと融合することにより、誘導剤（植物ホルモンＡＢＡおよびＧＡ）で処理することでポリペプチドを会合させることが可能になる。

【0314】

例えば、ヘテロ二量体対の一方のタンパク質をガイド部分（例えば、ｄＣａｓ９）と融合し、他方を異種遺伝子エフェクターと融合することで、適当な植物ホルモンを添加することによってガイド部分へのエフェクターの動員を実現することができる。第２のヘテロ二量体対の一方のタンパク質をガイド部分と融合し、他方を第２の異種遺伝子エフェクターと融合することにより、第２の異種遺伝子エフェクターの動員を同様に実現することができる。一部の実施形態では、例えば、１つの異種遺伝子エフェクターとヌクレアーゼの間の複合体形成を可逆的に誘導するために、代替誘導性系として同じ系を使用して、２つまたはそれよりも多くの異なる異種遺伝子エフェクターを含有しない複合体の構成要素を会合させる。

【0315】

一部の実施形態では、誘導性系の構成要素を本開示の細胞において一過性にまたは永久に発現させることができる。例えば、細胞に形質導入を行って、ガイド部分（例えば、ｄＣａｓ９）をＧＡＩおよびＡＢＩのヘテロ二量体形成ドメインとの融合を伴って一過性にまたは安定に発現させることができる。

【0316】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法は、高度の実証された転写調節因子モジュール性を有する候補異種遺伝子エフェクターを利用する。一部の実施形態では、高度の実証された転写調節因子モジュール性を有する異種遺伝子エフェクターは、他の遺伝子エフェクターとの組合せで有用であり得、例えば、遺伝子転写に対するコンビナトリアルまたは相乗効果を容易にする可能性がより高い可能性がある。この系により、例えば、候補エフェクタードメインを試験対象である何千もの可能性のある組合せに不偏的に直交性に動員することが可能になる。系の誘導性および可逆性により、転写活性化または抑制に対する観察される効果の持続性を評価することが可能になる。系の態様（例えば、ＡＮＤ、ＯＲ、ＮＡＮＤ、およびＮＯＲ論理演算子、およびある１つの誘導因子を用いると遺伝子発現を活性化し、別の誘導因子を用いると遺伝子発現を抑制する対立的な調節因子を可能にする）は、Gao et al., "Complex transcriptional modulation with orthogonaland inducible dCas9 regulators." Nature methods 13.12 (2016): 1043-1049に記載されている。

【0317】

一部の実施形態では、複合体は、クロマチン調節因子と転写調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、第１のクロマチン調節因子と第２のクロマチン調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、第１の転写調節因子と第２の転写調節因子の組合せを含む。

【0318】

一部の実施形態では、複合体は、少なくとも１つのクロマチン調節因子と少なくとも１つの転写調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、第１のクロマチン調節因子と少なくとも第２のクロマチン調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、第１の転写調節因子と少なくとも第２の転写調節因子の組合せを含む。

【0319】

一部の実施形態では、複合体は、クロマチン調節因子と２つの転写調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、転写調節因子と２つのクロマチン調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、３つのクロマチン調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、３つの転写調節因子の組合せを含む。

【0320】

一部の実施形態では、複合体は、少なくとも１つのクロマチン調節因子と少なくとも２つの転写調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、少なくとも１つの転写調節因子と少なくとも２つのクロマチン調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、少なくとも３つのクロマチン調節因子の組合せを含む。一部の実施形態では、複合体は、少なくとも３つの転写調節因子の組合せを含む。

【0321】

本開示の複合体は、任意の適切な数の異種遺伝子エフェクター、例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの異種遺伝子エフェクターを含み得る。一部の実施形態では、本開示の複合体は、最大で２つ、最大で３つ、最大で４つ、または最大で５つの異種遺伝子エフェクターを含む。一部の実施形態では、本開示の複合体は、１～５つ、１～４つ、１～３つ、１～２つ、２～５つ、２～４つ、２～３つ、３～５つ、３～４つ、または４～５つの異種遺伝子エフェクターを含む。一部の実施形態では、本開示の複合体は、最大で１つ、最大で２つ、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、最大で９、または最大で１０の異種遺伝子エフェクターを含む。一部の実施形態では、本開示の複合体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異種遺伝子エフェクターを含む。一部の実施形態では、本開示の複合体は、１つの異種遺伝子エフェクターを含む。一部の実施形態では、本開示の複合体は、２つの異種遺伝子エフェクターを含む。一部の実施形態では、本開示の複合体は、３つの異種遺伝子エフェクターを含む。

【0322】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現を調節する２つの異種遺伝子エフェクターが本開示の複合体内に存在するおよび／または遺伝子座に動員される。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現を調節する３つの異種遺伝子エフェクターが本開示の複合体内に存在するおよび／または遺伝子座に動員される。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現を調節する４つの異種遺伝子エフェクターが本開示の複合体内に存在するおよび／または遺伝子座に動員される。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現を調節する５つの異種遺伝子エフェクターが本開示の複合体内に存在するおよび／または遺伝子座に動員される。

【0323】

標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現を調節する２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターが本開示の複合体内に存在するおよび／または遺伝子座に動員される場合、それらの異種遺伝子エフェクターは、同じであっても異なってもよい。一部の実施形態では、本開示の複合体内に存在するおよび／または遺伝子座に動員される、標的遺伝子の発現を調節する２つの異種遺伝子エフェクターは、互いに異なる（例えば、異なる起源タンパク質に由来する）。一部の実施形態では、本開示の複合体内に存在するおよび／または遺伝子座に動員される、標的遺伝子の発現を調節する３つの異種遺伝子エフェクターは、互いに異なる（例えば、異なる起源タンパク質に由来する）。

【0324】

一部の実施形態では、本開示の複合体は、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／もしくはＨＳＦ１ではない、またはＰ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、および／もしくはＨＳＦ１由来の配列を含有しない、少なくとも１つの異種遺伝子エフェクターを含む。

【0325】

一部の実施形態では、本開示の複合体は、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）ではない、またはそれ由来の配列を含有しない少なくとも１つの異種遺伝子エフェクターを含む。

【0326】

一部の実施形態では、本開示の複合体は、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａではない、またはそれ由来の配列を含有しない少なくとも１つの異種遺伝子エフェクターを含む。
標的遺伝子

【0327】

本開示は、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現をモジュレートするための組成物、方法、および系を提供する。例えば、本明細書において、ガイド部分と、標的遺伝子の活性または発現レベルを増大または低減させることができる１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターとを含む複合体が開示される。

【0328】

一部の実施形態では、標的遺伝子またはその調節配列は、対象に対して内因性である、例えば、対象のゲノム内に存在する。一部の実施形態では、標的遺伝子またはその調節配列は、工学的に操作されたレポーター系の一部ではない。

【0329】

一部の実施形態では、標的遺伝子は、宿主対象に対して外因性であり、例えば、病原体標的遺伝子、または遺伝子治療および／もしくは細胞治療などの治療介入の結果として発現される外因性遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、外因性レポーター遺伝子、例えば、本明細書に開示されるレポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質）である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、外因性合成遺伝子である。

【0330】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現を増大させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。一部の実施形態では、発現レベルは、ＲＮＡ発現レベルであり、例えば、ＲＮＡｓｅｑ、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイ、ＦＩＳＨなどによって測定することができる。一部の実施形態では、発現レベルは、タンパク質発現レベルであり、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、マルチプレックスイムノアッセイ、質量分析、ＮＭＲ、プロテオミクス、フローサイトメトリー、マスサイトメトリーなどによって測定することができる。

【0331】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍に、少なくとも３倍に、少なくとも４倍に、少なくとも５倍に、少なくとも６倍に、少なくとも７倍に、少なくとも８倍に、少なくとも９倍に、少なくとも１０倍に、少なくとも１１倍に、少なくとも１２倍に、少なくとも１３倍に、少なくとも１４倍に、少なくとも１５倍に、少なくとも２０倍に、少なくとも３０倍に、少なくとも４０倍に、少なくとも５０倍に、少なくとも６０倍に、少なくとも７０倍に、少なくとも８０倍に、少なくとも９０倍に、少なくとも１００倍に、少なくとも１５０倍に、少なくとも２００倍に、少なくとも２５０倍に、少なくとも３００倍に、少なくとも３５０倍に、少なくとも４００倍に、少なくとも５００倍に、少なくとも６００倍に、少なくとも７００倍に、少なくとも８００倍に、少なくとも９００倍に、少なくとも１０００倍に、少なくとも１５００倍に、少なくとも２０００倍に、または少なくとも３０００倍に、増大させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0332】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現を最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で２倍に、最大で３倍に、最大で４倍に、最大で５倍に、最大で６倍に、最大で７倍に、最大で８倍に、最大で９倍に、最大で１０倍に、最大で１１倍に、最大で１２倍に、最大で１３倍に、最大で１４倍に、最大で１５倍に、最大で２０倍に、最大で３０倍に、最大で４０倍に、最大で５０倍に、最大で６０倍に、最大で７０倍に、最大で８０倍に、最大で９０倍に、最大で１００倍に、最大で１５０倍に、最大で２００倍に、最大で２５０倍に、最大で３００倍に、最大で３５０倍に、最大で４００倍に、最大で５００倍に、最大で６００倍に、最大で７００倍に、最大で８００倍に、最大で９００倍に、最大で１０００倍に、最大で１５００倍に、最大で２０００倍に、最大で３０００倍に、最大で５０００倍に、または最大で１００００倍に、増大させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0333】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約２倍に、約３倍に、約４倍に、約５倍に、約６倍に、約７倍に、約８倍に、約９倍に、約１０倍に、約１１倍に、約１２倍に、約１３倍に、約１４倍に、約１５倍に、約２０倍に、約３０倍に、約４０倍に、約５０倍に、約６０倍に、約７０倍に、約８０倍に、約９０倍に、約１００倍に、約１５０倍に、約２００倍に、約２５０倍に、約３００倍に、約３５０倍に、約４００倍に、約５００倍に、約６００倍に、約７００倍に、約８００倍に、約９００倍に、約１０００倍に、約１５００倍に、約２０００倍に、約３０００倍に、約５０００倍に、または約１００００倍に、増大させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0334】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現レベルを検出限界未満から検出可能なレベルまで増大させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0335】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２分の１に、少なくとも３分の１に、少なくとも４分の１に、少なくとも５分の１に、少なくとも６分の１に、少なくとも７分の１に、少なくとも８分の１に、少なくとも９分の１に、少なくとも１０分の１に、少なくとも１１分の１に、少なくとも１２分の１に、少なくとも１３分の１に、少なくとも１４分の１に、少なくとも１５分の１に、少なくとも２０分の１に、少なくとも３０分の１に、少なくとも４０分の１に、少なくとも５０分の１に、少なくとも６０分の１に、少なくとも７０分の１に、少なくとも８０分の１に、少なくとも９０分の１に、少なくとも１００分の１に、少なくとも１５０分の１に、少なくとも２００分の１に、少なくとも２５０分の１に、少なくとも３００分の１に、少なくとも３５０分の１に、少なくとも４００分の１に、少なくとも５００分の１に、少なくとも６００分の１に、少なくとも７００分の１に、少なくとも８００分の１に、少なくとも９００分の１に、少なくとも１０００分の１に、少なくとも１５００分の１に、少なくとも２０００分の１に、または少なくとも３０００分の１に、低減させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0336】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現を最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で２分の１に、最大で３分の１に、最大で４分の１に、最大で５分の１に、最大で６分の１に、最大で７分の１に、最大で８分の１に、最大で９分の１に、最大で１０分の１に、最大で１１分の１に、最大で１２分の１に、最大で１３分の１に、最大で１４分の１に、最大で１５分の１に、最大で２０分の１に、最大で３０分の１に、最大で４０分の１に、最大で５０分の１に、最大で６０分の１に、最大で７０分の１に、最大で８０分の１に、最大で９０分の１に、最大で１００分の１に、最大で１５０分の１に、最大で２００分の１に、最大で２５０分の１に、最大で３００分の１に、最大で３５０分の１に、最大で４００分の１に、最大で５００分の１に、最大で６００分の１に、最大で７００分の１に、最大で８００分の１に、最大で９００分の１に、最大で１０００分の１に、最大で１５００分の１に、最大で２０００分の１に、最大で３０００分の１に、最大で５０００分の１に、または最大で１００００分の１に、低減させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0337】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約２分の１に、約３分の１に、約４分の１に、約５分の１に、約６分の１に、約７分の１に、約８分の１に、約９分の１に、約１０分の１に、約１１分の１に、約１２分の１に、約１３分の１に、約１４分の１に、約１５分の１に、約２０分の１に、約３０分の１に、約４０分の１に、約５０分の１に、約６０分の１に、約７０分の１に、約８０分の１に、約９０分の１に、約１００分の１に、約１５０分の１に、約２００分の１に、約２５０分の１に、約３００分の１に、約３５０分の１に、約４００分の１に、約５００分の１に、約６００分の１に、約７００分の１に、約８００分の１に、約９００分の１に、約１０００分の１に、約１５００分の１に、約２０００分の１に、約３０００分の１に、約５０００分の１に、または約１００００分の１に、低減させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0338】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現レベルを検出可能なレベルから検出限界未満まで低減させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0339】

一部の実施形態では、発現の変化の程度は、複合体が細胞または細胞の集団に導入される前と比べたものである。一部の実施形態では、発現の変化の程度は、複合体を用いて処理していない、対応する対照細胞または細胞の集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現の変化の程度は、代替の複合体または遺伝子発現調節因子、例えば、代替の異種遺伝子エフェクターもしくはその組合せを含む複合体、または標的遺伝子の発現をモジュレートする異なる作用剤を用いて処理された、対応する対照細胞または細胞の集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現の変化の程度は、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＨＳＦ１、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。

【0340】

一部の実施形態では、発現の変化の程度は、ＶＰＲ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現の変化の程度は、ＫＲＡＢ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現の変化の程度は、ＶＰ６４由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現の変化の程度は、Ｒｔａ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現の変化の程度は、ｐ６５由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現の変化の程度は、ＫＡＬである異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。

【0341】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを上昇させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。活性レベルは、標的遺伝子の機能的特徴に応じて、当該の標的遺伝子に対する適切な機能アッセイによって決定することができる。例えば、マイトジェンである標的遺伝子の活性レベルは細胞増殖を測定することによって決定することができ、アポトーシスを誘導する標的遺伝子の活性レベルはアネキシンＶアッセイまたは他の適切な細胞死アッセイによって測定することができ、抗炎症性サイトカインの活性レベルはＬＰＳにより誘導されるサイトカイン放出アッセイによって測定することができる。

【0342】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍に、少なくとも３倍に、少なくとも４倍に、少なくとも５倍に、少なくとも６倍に、少なくとも７倍に、少なくとも８倍に、少なくとも９倍に、少なくとも１０倍に、少なくとも１１倍に、少なくとも１２倍に、少なくとも１３倍に、少なくとも１４倍に、少なくとも１５倍に、少なくとも２０倍に、少なくとも３０倍に、少なくとも４０倍に、少なくとも５０倍に、少なくとも６０倍に、少なくとも７０倍に、少なくとも８０倍に、少なくとも９０倍に、少なくとも１００倍に、少なくとも１５０倍に、少なくとも２００倍に、少なくとも２５０倍に、少なくとも３００倍に、少なくとも３５０倍に、少なくとも４００倍に、少なくとも５００倍に、少なくとも６００倍に、少なくとも７００倍に、少なくとも８００倍に、少なくとも９００倍に、少なくとも１０００倍に、少なくとも１５００倍に、少なくとも２０００倍に、または少なくとも３０００倍に、上昇させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0343】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で２倍に、最大で３倍に、最大で４倍に、最大で５倍に、最大で６倍に、最大で７倍に、最大で８倍に、最大で９倍に、最大で１０倍に、最大で１１倍に、最大で１２倍に、最大で１３倍に、最大で１４倍に、最大で１５倍に、最大で２０倍に、最大で３０倍に、最大で４０倍に、最大で５０倍に、最大で６０倍に、最大で７０倍に、最大で８０倍に、最大で９０倍に、最大で１００倍に、最大で１５０倍に、最大で２００倍に、最大で２５０倍に、最大で３００倍に、最大で３５０倍に、最大で４００倍に、最大で５００倍に、最大で６００倍に、最大で７００倍に、最大で８００倍に、最大で９００倍に、最大で１０００倍に、最大で１５００倍に、最大で２０００倍に、最大で３０００倍に、最大で５０００倍に、または最大で１００００倍に、上昇させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0344】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約２倍に、約３倍に、約４倍に、約５倍に、約６倍に、約７倍に、約８倍に、約９倍に、約１０倍に、約１１倍に、約１２倍に、約１３倍に、約１４倍に、約１５倍に、約２０倍に、約３０倍に、約４０倍に、約５０倍に、約６０倍に、約７０倍に、約８０倍に、約９０倍に、約１００倍に、約１５０倍に、約２００倍に、約２５０倍に、約３００倍に、約３５０倍に、約４００倍に、約５００倍に、約６００倍に、約７００倍に、約８００倍に、約９００倍に、約１０００倍に、約１５００倍に、約２０００倍に、約３０００倍に、約５０００倍に、または約１００００倍に、上昇させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0345】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを検出限界未満から検出可能なレベルまで上昇させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0346】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２分の１に、少なくとも３分の１に、少なくとも４分の１に、少なくとも５分の１に、少なくとも６分の１に、少なくとも７分の１に、少なくとも８分の１に、少なくとも９分の１に、少なくとも１０分の１に、少なくとも１１分の１に、少なくとも１２分の１に、少なくとも１３分の１に、少なくとも１４分の１に、少なくとも１５分の１に、少なくとも２０分の１に、少なくとも３０分の１に、少なくとも４０分の１に、少なくとも５０分の１に、少なくとも６０分の１に、少なくとも７０分の１に、少なくとも８０分の１に、少なくとも９０分の１に、少なくとも１００分の１に、少なくとも１５０分の１に、少なくとも２００分の１に、少なくとも２５０分の１に、少なくとも３００分の１に、少なくとも３５０分の１に、少なくとも４００分の１に、少なくとも５００分の１に、少なくとも６００分の１に、少なくとも７００分の１に、少なくとも８００分の１に、少なくとも９００分の１に、少なくとも１０００分の１に、少なくとも１５００分の１に、少なくとも２０００分の１に、または少なくとも３０００分の１に、低下させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0347】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で２分の１に、最大で３分の１に、最大で４分の１に、最大で５分の１に、最大で６分の１に、最大で７分の１に、最大で８分の１に、最大で９分の１に、最大で１０分の１に、最大で１１分の１に、最大で１２分の１に、最大で１３分の１に、最大で１４分の１に、最大で１５分の１に、最大で２０分の１に、最大で３０分の１に、最大で４０分の１に、最大で５０分の１に、最大で６０分の１に、最大で７０分の１に、最大で８０分の１に、最大で９０分の１に、最大で１００分の１に、最大で１５０分の１に、最大で２００分の１に、最大で２５０分の１に、最大で３００分の１に、最大で３５０分の１に、最大で４００分の１に、最大で５００分の１に、最大で６００分の１に、最大で７００分の１に、最大で８００分の１に、最大で９００分の１に、最大で１０００分の１に、最大で１５００分の１に、最大で２０００分の１に、最大で３０００分の１に、最大で５０００分の１に、または最大で１００００分の１に、低下させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0348】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約２分の１に、約３分の１に、約４分の１に、約５分の１に、約６分の１に、約７分の１に、約８分の１に、約９分の１に、約１０分の１に、約１１分の１に、約１２分の１に、約１３分の１に、約１４分の１に、約１５分の１に、約２０分の１に、約３０分の１に、約４０分の１に、約５０分の１に、約６０分の１に、約７０分の１に、約８０分の１に、約９０分の１に、約１００分の１に、約１５０分の１に、約２００分の１に、約２５０分の１に、約３００分の１に、約３５０分の１に、約４００分の１に、約５００分の１に、約６００分の１に、約７００分の１に、約８００分の１に、約９００分の１に、約１０００分の１に、約１５００分の１に、約２０００分の１に、約３０００分の１に、約５０００分の１に、または約１００００分の１に、低下させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0349】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の活性レベルを検出可能なレベルから検出限界未満まで低下させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。

【0350】

一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、複合体が細胞または細胞の集団に導入される前と比べたものである。一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、複合体を用いて処理していない、対応する対照細胞または細胞の集団と比べたものである。一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、代替の複合体または遺伝子発現調節因子、例えば、代替の異種遺伝子エフェクターもしくはその組合せを含む複合体、または標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の活性レベルをモジュレートする異なる作用剤を用いて処理された、対応する対照細胞または細胞の集団と比べたものである。一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＨＳＦ１、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。

【0351】

一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、ＶＰＲ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、ＫＲＡＢ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、ＶＰ６４由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、Ｒｔａ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、ｐ６５由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、活性レベルの変化の程度は、ＫＡＬである異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。

【0352】

一部の場合では、本開示の複合体により、代替の組成物および方法を用いて実現することができるよりも長く持続する、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルの変化を引き出すことができる。一部の実施形態では、遺伝子発現の持続的なモジュレーションが一過性のモジュレーションと比較して有利である。

【0353】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、対照よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍長い期間にわたって、ある特定の閾値を上回る発現および／または活性レベルに増大させることができる。

【0354】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、対照よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍長い期間にわたって、ある特定の閾値を下回る発現および／または活性レベルに低減させることができる。

【0355】

一部の実施形態では、例えば、持続的な過剰発現または過少発現により毒性またはオフターゲット作用が導かれる場合、遺伝子発現の一過性のモジュレーションが持続的なモジュレーションと比較して有利である。一部の場合では、本開示の複合体により、代替の組成物および方法を用いて実現することができるよりも短い期間にわたって持続する、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルの変化を引き出すことができる。

【0356】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、対照よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％短い時間、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも５０分の１、または少なくとも１００分の１の時間にわたって、ある特定の閾値を上回る発現および／または活性レベルに増大させることができる。

【0357】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、対照よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％短い時間、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも５０分の１、または少なくとも１００分の１の時間にわたって、ある特定の閾値を下回る発現および／または活性レベルに低減させることができる。

【0358】

発現および／または活性レベルがモジュレートされる時間量についての対照は、例えば、代替の複合体または遺伝子発現調節因子、例えば、代替の異種遺伝子エフェクターもしくはその組合せを含む複合体、または標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の活性レベルをモジュレートする異なる作用剤を用いて処理された、対応する対照細胞または細胞の集団であり得る。一部の実施形態では、発現および／または活性レベルの変化の持続性は、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＨＳＦ１、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰＲ、ＡＤ２、ＣＲ３、ＥＬＫＦ１、ＧＡＴＡ４、ＰＲＶＩＥ、ｐ５３、ＳＰ１、ＭＹＯＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＡＸ、ＰＰＡＲガンマ、ＭＥＤ１、ＭＥＤ７、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２９、ＴＢＰ、ＧＴＦ２Ｈ－２Ｄ、ＧＴＦ２Ｂ、ＣＢＰ、ＨＳＦ１、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、ＭＳ２－ＴＥＴ１、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、Ｐ３００、ｐ６５、ＰＲＤＭ９、ＰＵＦａ－ＧＡＤＤ４５Ａ－ＴＥＴ１、Ｒ２、ＳｕｎＴａｇ－ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＴＥＴ１ＣＤ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＶＰ１２０、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ６４またはｐ６５＋／－ＨＳＦ１またはＭｙｏＤ１、および／またはＶＰＲ（Ｖｐ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ）、ＫＲＡＢ、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｃａｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ａアイソフォーム１の最後の３０１アミノ酸、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８７Ｅ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌ、ＬＳＤ１、Ｍ．ＳｓｓＩ、ＭＱ１、ＭＱ１ Ｑ１４７Ｅ、ＳＩＤ４ｘ、および／またはＳｕｎｔＴａｇ－ＤＮＭＴ３Ａ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。

【0359】

一部の実施形態では、発現および／または活性レベルの変化の持続性は、ＶＰＲ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現および／または活性レベルの変化の持続性は、ＫＲＡＢ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現および／または活性レベルの変化の持続性は、ＶＰ６４由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現および／または活性レベルの変化の持続性は、Ｒｔａ由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現および／または活性レベルの変化の持続性は、ｐ６５由来の異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。一部の実施形態では、発現および／または活性レベルの変化の持続性は、ＫＡＬである異種遺伝子エフェクターを含む対照作用剤を用いて処理された、対応する細胞またはその集団と比べたものである。

【0360】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも１日、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１４週間、少なくとも１８週間、少なくとも２０週間、または少なくとも２６週間にわたって、ある特定の閾値を上回る発現および／または活性レベルに増大させることができる。閾値は、複合体を用いて処理する前に観察されたベースラインレベル、または複合体を用いて処理していない対応する細胞の集団におけるレベルであり得る。

【0361】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも１日、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１４週間、少なくとも１８週間、少なくとも２０週間、または少なくとも２６週間にわたって、ある特定の閾値を下回る発現および／または活性レベルに低減させることができる。閾値は、例えば、複合体を用いて処理する前に観察されたベースラインレベル、または複合体を用いて処理していない対応する細胞の集団におけるレベルであり得る。

【0362】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、最大で１時間、最大で２時間、最大で３時間、最大で４時間、最大で５時間、最大で６時間、最大で７時間、最大で８時間、最大で９時間、最大で１０時間、最大で１２時間、最大で１４時間、最大で１８時間、最大で２０時間、最大で１日、最大で２日間、最大で３日間、最大で４日間、最大で５日間、最大で６日間、最大で７日間、最大で８日間、最大で９日間、最大で１０日間、最大で１４日間、最大で２１日間、最大で２８日間、最大で５週間、最大で６週間、最大で７週間、最大で８週間、最大で９週間、最大で１０週間、最大で１２週間、最大で１４週間、最大で１８週間、最大で２０週間、または最大で２６週間にわたって、ある特定の閾値を上回る発現および／または活性レベルに増大させることができる。閾値は、例えば、複合体を用いて処理する前に観察されたベースラインレベル、または複合体を用いて処理していない対応する細胞の集団におけるレベルであり得る。

【0363】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、最大で１時間、最大で２時間、最大で３時間、最大で４時間、最大で５時間、最大で６時間、最大で７時間、最大で８時間、最大で９時間、最大で１０時間、最大で１２時間、最大で１４時間、最大で１８時間、最大で２０時間、最大で１日、最大で２日間、最大で３日間、最大で４日間、最大で５日間、最大で６日間、最大で７日間、最大で８日間、最大で９日間、最大で１０日間、最大で１４日間、最大で２１日間、最大で２８日間、最大で５週間、最大で６週間、最大で７週間、最大で８週間、最大で９週間、最大で１０週間、最大で１２週間、最大で１４週間、最大で１８週間、最大で２０週間、または最大で２６週間にわたって、ある特定の閾値を下回る発現および／または活性レベルに低減させることができる。閾値は、例えば、複合体を用いて処理する前に観察されたベースラインレベル、または複合体を用いて処理していない対応する細胞の集団におけるレベルであり得る。

【0364】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１８時間、約２０時間、約１日、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間、約２８日間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１２週間、約１４週間、約１８週間、約２０週間、または約２６週間にわたって、ある特定の閾値を上回る発現および／または活性レベルに増大させることができる。閾値は、例えば、複合体を用いて処理する前に観察されたベースラインレベル、または複合体を用いて処理していない対応する細胞の集団におけるレベルであり得る。

【0365】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルを、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１８時間、約２０時間、約１日、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１４日間、約２１日間、約２８日間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１２週間、約１４週間、約１８週間、約２０週間、または約２６週間にわたって、ある特定の閾値を下回る発現および／または活性レベルに低減させることができる。閾値は、例えば、複合体を用いて処理する前に観察されたベースラインレベル、または複合体を用いて処理していない対応する細胞の集団におけるレベルであり得る。

【0366】

標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）またはその調節配列は、細胞、例えば、幹細胞、造血細胞、免疫細胞、または本明細書に開示される他の細胞型に存在する任意の適切な遺伝子またはその調節配列であり得る。

【0367】

標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、免疫細胞調節に関与する遺伝子であり得る。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、がんに関連する。がんに関連する標的遺伝子は、細胞周期遺伝子、細胞応答遺伝子、アポトーシス遺伝子、またはファゴサイトーシス遺伝子であり得る。

【0368】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）という用語は、例えば、複合体、異種遺伝子エフェクター、および／または他の因子が当該調節配列に結合すると標的遺伝子の発現または活性レベルに影響を及ぼす可能性がある、標的遺伝子調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、サイレンサー、インスレーター、シス調節エレメント、トランス調節エレメント、エピジェネティック改変（例えば、ＤＮＡメチル化）部位なども包含し得る。標的遺伝子調節配列は、物理的に、標的遺伝子の産物をコードする転写単位またはオープンリーディングフレームの外側に位置していてよい。

【0369】

標的遺伝子調節配列は、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）と作動的にカップリングした、内因性調節配列、例えば、内因性プロモーター、内因性エンハンサー、内因性リプレッサー、内因性サイレンサー、内因性インスレーター、内因性シス調節エレメント、内因性トランス調節エレメント、内因性エピジェネティック改変（例えば、ＤＮＡメチル化）部位などであり得る。一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、工学的に操作されたまたは合成レポーター系の構成要素を含有しない。一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、工学的に操作されたレポーター系の一部として機能するものではない。一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、外因性、工学的に操作された、または合成の調節エレメントを含有しない、例えば、テトラサイクリンまたはその類似体によってモジュレートされる応答エレメントを含有しない。一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、外因性、工学的に操作された、または合成の因子によってモジュレートされる応答エレメントを含有しない、例えば、トランス活性化因子またはリバーストランス活性化因子によってモジュレートされる応答エレメントを含有しない。一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、工学的に操作された誘導性系、抑制可能な系、および／またはレポーター系の一部として機能するトランス活性化因子またはリバーストランス活性化因子に対して応答性のエレメントを含有しない。一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、Ｔｅｔ ｏｆｆまたはｔＴＡ依存性系の構成要素ではない。一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、Ｔｅｔ ＯｎまたはｒｔＴＡ依存性系の構成要素ではない。

【0370】

一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、対象または宿主細胞に対して外因性であるヌクレオチド配列を含有しない。一部の実施形態では、標的遺伝子調節配列は、工学的に操作されたまたは人工的に生成されたまたは導入されたヌクレオチド配列を含有しない。

【0371】

一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、特定の標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）に特異的な望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、２つまたはそれよりも多くの標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）に適用可能である望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、３つまたはそれよりも多くの標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）に適用可能である望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、あるクラスの標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）、例えば、同じ経路において機能する、または同様の内因性刺激に応答性である、重複する機能的役割を有する遺伝子に適用可能である望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、多種多様な標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）に広範に適用可能である望ましい変化がもたらされる、例えば、標的遺伝子またはその調節配列との結合を方向付けるための適切なガイド部分を有する複合体内に存在する場合、複数の標的遺伝子についてある特定の閾値を上回るまたは下回る発現レベルが引き出される。

【0372】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、疾患または状態の状況で過剰発現または過小発現される遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、遺伝性疾患の状況で過剰発現または過小発現される遺伝子である。

【0373】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、自己免疫疾患の状況で過剰発現または過小発現される遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、急性散在性脳脊髄炎、急性運動性軸索型ニューロパチー、アジソン病、有痛脂肪症、成人発症型スチル病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗糸球体基底膜腎炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体脳炎、抗リン脂質症候群、抗シンテターゼ症候群、再生不良性貧血、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性脳炎、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、多腺性自己免疫症候群、多腺性自己免疫症候群２型、多腺性自己免疫症候群３型、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロー同心円硬化症、ベーチェット病、ビッカースタッフ脳幹脳炎、水疱性類天疱瘡、小児脂肪便症、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、複合性局所疼痛症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、円板状エリテマトーデス、子宮内膜症、腱付着部炎、腱付着部炎関連関節炎、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合性クリオグロブリン血症、エバンス症候群、フェルティ症候群、線維筋痛症、胃炎、妊娠性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、グレーブス眼症、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、化膿性汗腺炎、特発性拡張型心筋症、特発性炎症性脱髄性疾患、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連全身性疾患、封入体筋炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、中間部ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病、ループス腎炎、ループス血管炎、ライム病、メニエール病、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、モーレン潰瘍、斑状強皮症、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、パリー・ロンベルク症候群、パーソネージ・ターナー症候群、小児自己免疫性溶連菌関連性神経精神障害、尋常性天疱瘡、悪性貧血、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性免疫不全症、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性ニューロパチー、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球ろう、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、再発性多発性軟骨炎、レストレスレッグ症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、リウマトイド血管炎、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少症、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、蕁麻疹、蕁麻疹様血管炎、血管炎、または白斑の状況で過剰発現または過小発現される遺伝子である。

【0374】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、がん、例えば、急性白血病、星状細胞腫、胆道がん（胆管細胞癌）、骨がん、乳がん、脳幹神経膠腫、細気管支肺胞上皮がん、副腎のがん、肛門領域のがん、膀胱のがん、内分泌系のがん、食道のがん、頭部または頸部のがん、腎臓のがん、副甲状腺のがん、陰茎のがん、胸膜／腹膜のがん、唾液腺のがん、小腸のがん、甲状腺のがん、尿管のがん、尿道のがん、子宮頸部の癌腫、子宮内膜の癌腫、卵管の癌腫、腎盤の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、子宮頸がん、慢性白血病、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚黒色腫、上衣腫、類上皮腫、ユーイング肉腫、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、神経膠腫、血液悪性腫瘍、肝細胞（肝）癌、ヘパトーマ、ホジキン病、眼内黒色腫、カポジ肉腫、肺がん、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、筋肉のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、ニューロンのがん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、小児悪性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、軟部組織の肉腫、シュワン細胞腫、皮膚がん、脊髄軸腫瘍、扁平上皮癌、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、滑膜肉腫、精巣がん、子宮がん、または腫瘍およびそれらの転移、上記のがんのいずれかの治療抵抗性バージョンを含む、またはこれらの組合せの状況で過剰発現または過小発現される遺伝子である。

【0375】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、分化関連遺伝子、例えば、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＡＨＲ、Ａｉｏｌｏｓ／ＩＫＺＦ３、ＣＤＸ４、ＣＲＥＢ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＧＲ１、ＦｏｘＯ３、ＧＡＴＡ－１、ＧＡＴＡ－２、ＧＡＴＡ－３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＨＥＳ－１、ＨＨＥＸ、ＨＩＦ－１アルファ／ＨＩＦ１Ａ、ＨＭＧＢ１／ＨＭＧ－１、ＨＭＧＢ３、Ｉｋａｒｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ＬＭＯ２、ＬＭＯ４、ｃ－Ｍａｆ、ＭａｆＢ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＩＬ３／Ｅ４ＢＰ４、Ｎｒｆ２、ｐ５３、ＰＩＴＸ２、ＰＲＤＭ１６／ＭＥＬ１、Ｐｒｏｘ１、ＰＵ．１／Ｓｐｉ－１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＳＡＬＬ４、ＳＣＬ／Ｔａｌ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ７、Ｓｐｉ－Ｂ、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害因子、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ６、ＴＳＣ２２、ＤＵＸ４、ＤＵＸ４／ＤＵＸ４ｃ、ＤＵＸ４ｃ、ＥＢＦ－１、ＥＢＦ－２、ＥＢＦ－３、ＥＴＶ５、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＦ１、ＧＡＴＡ－４、ＧＡＴＡ－６、ＨＭＧＡ２、ｃ－Ｊｕｎ、ＭＹＦ－５、ミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ）、ＭｙｏＤ、ミオゲニン（Ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、ＮＦＡＴＣ２、ｐ５３、Ｐａｘ３、ＰＤＸ－１／ＩＰＦ１、ＰＬＺＦ、ＰＲＤＭ１６／ＭＥＬ１、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８、Ｓｍａｄ９、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１１、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害因子、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＸ１８、Ｔｗｉｓｔ－１、Ｔｗｉｓｔ－２、ブラキウリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ＥＯＭＥＳ、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＤ３、ＦｏｘＦ１、ＦｏｘＨ１、ＦｏｘＯ１／ＦＫＨＲ、ＧＡＴＡ－２、ＧＡＴＡ－３、ＧＢＸ２、グースコイド（Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ）、ＨＥＳ－１、ＨＮＦ－３アルファ／ＦｏｘＡ１、ｃ－Ｊｕｎ、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ－Ｍａｆ、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＩＸＬ１、ＭＴＦ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ活性化因子、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ阻害因子、ＮＦｋＢ１、ＮＦｋＢ２、Ｏｃｔ－３／４、Ｏｔｘ２、ｐ５３、Ｐａｘ２、Ｐａｘ６、ＰＲＤＭ１４、Ｒｅｘ－１／ＺＦＰ４２、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ４、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害因子、ＳＴＡＴ３、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ６、ＴＣＦ－３／Ｅ２Ａ、ＴＨＡＰ１１、ＵＴＦ１、ＷＤＲ５、ＷＴ１、ＺＮＦ２０６、ＺＮＦ２８１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍａｆ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－３／４、ｐ５３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＴＢＸ１８、ＡＳＣＬ２／Ｍａｓｈ２、ＣＤＸ２、ＤＮＭＴ１、ＥＬＦ３、Ｅｔｓ－１、ＦｏｘＭ１、ＦｏｘＮ１、ＧＡＴＡ－６、Ｈａｉｒｌｅｓｓ、ＨＮＦ－４アルファ／ＮＲ２Ａ１、ＩＲＦ６、ｃ－Ｍａｆ、ＭＩＴＦ、Ｍｉｚ－１／ＺＢＴＢ１７、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、ＭＹＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ニューロゲニン（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ）－３、ＮＦＡＴＣ１、ＮＫＸ３．１、Ｎｒｆ２、ｐ５３、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、Ｐａｘ２、Ｐａｘ３、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、Ｓｍａｄ８、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害因子、ＳＴＡＴ３、ＳＵＺ１２、ＴＣＦ－３／Ｅ２Ａ、ＴＣＦ７／ＴＣＦ１、アンドロゲン（Ａｎｄｒｏｇｅｎ）Ｒ／ＮＲ３Ｃ４、ＡＰ－２ガンマ、ベータカテニン、ベータカテニン阻害因子、ブラキウリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ＣＲＥＢ、ＥＲアルファ／ＮＲ３Ａ１、ＥＲベータ／ＮＲ３Ａ２、ＦｏｘＭ１、ＦｏｘＯ３、ＦＲＡ－１、ＧＬＩ－１、ＧＬＩ－２、ＧＬＩ－３、ＨＩＦ－１アルファ／ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ－２アルファ／ＥＰＡＳ１、ＨＭＧＡ１Ｂ、ｃ－Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍａｆ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ７、ＭＩＴＦ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ活性化因子、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ阻害因子、ＮＦｋＢ１、ＮＫＸ３．１、Ｏｃｔ－３／４、ｐ５３、ＰＲＤＭ１４、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴ阻害因子、ＳＴＡＴ３、ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１、ＴＢＸ３、Ｔｗｉｓｔ－１、Ｔｗｉｓｔ－２、ＷＴ１、またはＺＥＢ１である。

【0376】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、造血幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、間葉系幹細胞転写因子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、胚性幹細胞転写因子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）転写因子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、上皮幹細胞転写因子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、がん幹細胞転写因子である。

【0377】

一部の実施形態では、標的遺伝子は、加齢関連遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、老化関連タンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、薬物標的である。

【0378】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、がん関連遺伝子である。がん関連遺伝子の非限定的な例としては、Ａ１ＣＦ、ＡＢＩ１、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＳＬ３、ＡＣＳＬ６、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＤＮ、ＡＦＦ１、ＡＦＦ３、ＡＦＦ４、ＡＫＡＰ９、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＤＨ２、ＡＬＫ、ＡＭＥＲ１、ＡＮＫ１、ＡＰＣ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＨＧＥＦ１０、ＡＲＨＧＥＦ１０Ｌ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＮＴ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＦ１、ＡＴＩＣ、ＡＴＭ、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＬ９Ｌ、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＣＲ、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ６、ＢＬＭ、ＢＭＰ５、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＩＰ１、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＢＵＢ１Ｂ、Ｃ１５ｏｒｆ６５、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＬＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＤＣ６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＤ２０９、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１１、ＣＤＨ１７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＰ８９、ＣＨＣＨＤ７、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＥＫ２、ＣＨＩＣ２、ＣＨＳＴ１１、ＣＩＣ、ＣＩＩＴＡ、ＣＬＩＰ１、ＣＬＰ１、ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ１、ＣＮＢＤ１、ＣＮＢＰ、ＣＮＯＴ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＮＴＲＬ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＰＥＢ３、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＮＫＬ１、ＣＲＴＣ１、ＣＲＴＣ３、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＮＮＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＮＮＤ１、ＣＴＮＮＤ２、ＣＵＬ３、ＣＵＸ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＬＤ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＳＬＴＲ２、ＤＡＸＸ、ＤＣＡＦ１２Ｌ２、ＤＣＣ、ＤＣＴＮ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＲ２、ＤＤＸ１０、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＧＣＲ８、ＤＩＣＥＲ１、ＤＮＡＪＢ１、ＤＮＭ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲＯＳＨＡ、ＤＵＸ４Ｌ１、ＥＢＦ１、ＥＣＴ２Ｌ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＬＦ４、ＥＬＫ４、ＥＬＬ、ＥＬＮ、ＥＭＬ４、ＥＰ３００、ＥＰＡＳ１、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ７、ＥＰＳ１５、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＮＫ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、ＥＺＲ、ＦＡＭ１３１Ｂ、ＦＡＭ１３５Ｂ、ＦＡＭ４７Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＳ、ＦＡＴ１、ＦＡＴ３、ＦＡＴ４、ＦＢＬＮ２、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＲＬ４、ＦＥＮ１、ＦＥＳ、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＨ、ＦＨＩＴ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ９、ＦＬＣＮ、ＦＬＩ１、ＦＬＮＡ、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＮＢＰ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＲ１、ＦＳＴＬ３、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＳ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＬＩ１、ＧＭＰＳ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＧＰＣ３、ＧＰＣ５、ＧＰＨＮ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＭ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＥＹ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＭＧＮ２Ｐ４６、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＯＯＫ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＳ４、ＩＳＸ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＡＺＦ１、ＪＵＮ、ＫＡＴ６Ａ、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＡＴ７、ＫＣＮＪ５、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＤＳＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ６、ＫＬＫ２、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＮＬ１、ＫＮＳＴＲＮ、ＫＲＡＳ、ＫＴＮ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＡＳＰ１、ＬＡＴＳ１、ＬＡＴＳ２、ＬＣＫ、ＬＣＰ１、ＬＥＦ１、ＬＥＰＲＯＴＬ１、ＬＨＦＰＬ６、ＬＩＦＲ、ＬＭＮＡ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＰＰ、ＬＲＩＧ３、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＳＭ１４Ａ、ＬＹＬ１、ＬＺＴＲ１、ＭＡＣＣ１、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＡＬＴ１、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＤＳ２、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＤ１２、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＧＭＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＦ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬＴ１、ＭＬＬＴ１０、ＭＬＬＴ１１、ＭＬＬＴ３、ＭＬＬＴ６、ＭＮ１、ＭＮＸ１、ＭＰＬ、ＭＲＴＦＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＩ２、ＭＳＮ、ＭＴＣＰ１、ＭＴＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ４、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＨ１１、ＭＹＨ９、ＭＹＯ５Ａ、ＭＹＯＤ１、Ｎ４ＢＰ２、ＮＡＢ２、ＮＡＣＡ、ＮＢＥＡ、ＮＢＮ、ＮＣＫＩＰＳＤ、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＲ１、ＮＣＯＲ２、ＮＤＲＧ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＩＮ、ＮＫＸ２－１、ＮＯＮＯ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＮＴ５Ｃ２、ＮＴＨＬ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＮＵＭＡ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＮＵＴＭ１、ＮＵＴＭ２Ｂ、ＮＵＴＭ２Ｄ、ＯＬＩＧ２、ＯＭＤ、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＢＰＣ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、ＰＡＬＢ２、ＰＡＴＺ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＢＸ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＭ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＲ１、ＰＨＦ６、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＬＣＧ１、ＰＭＬ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＧ、ＰＯＬＱ、ＰＯＴ１、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＦＩＢＰ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＣＣ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＤＭ２、ＰＲＥＸ２、ＰＲＦ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＰＲＲＸ１、ＰＳＩＰ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＫ６、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ１３、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＢ、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＴ、ＰＷＷＰ２Ａ、ＱＫＩ、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＣ１、ＲＡＤ１７、ＲＡＤ２１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＬＧＤＳ、ＲＡＮＢＰ２、ＲＡＰ１ＧＤＳ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ１５、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＦＷＤ３、ＲＧＰＤ３、ＲＧＳ７、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＨ、ＲＭＩ２、ＲＮＦ２１３、ＲＮＦ４３、ＲＯＢＯ２、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ５、ＲＰＮ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、Ｓ１００Ａ７、ＳＡＬＬ４、ＳＢＤＳ、ＳＤＣ４、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＡＦ２、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、４４４４４、４４４４５、４４４４８、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＤＢ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＰ４、ＳＧＫ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ３ＧＬ１、ＳＨＴＮ１、ＳＩＲＰＡ、ＳＩＸ１、ＳＩＸ２、ＳＫＩ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＣ１Ａ、ＳＭＯ、ＳＮＤ１、ＳＮＸ２９、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２１、ＳＰＥＣＣ１、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＲＣ、ＳＲＧＡＰ３、ＳＲＳＦ２、ＳＲＳＦ３、ＳＳ１８、ＳＳ１８Ｌ１、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＳＴＡＧ１、ＳＴＡＧ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ１１、ＳＴＲＮ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＥＡ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＣ、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＴＥＲＴ、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＦＧ、ＴＦＰＴ、ＴＦＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３、ＴＭＥＭ１２７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＣ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰＭ３、ＴＰＭ４、ＴＰＲ、ＴＲＡ、ＴＲＡＦ７、ＴＲＢ、ＴＲＤ、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＰ１１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＲ５、ＵＳＰ４４、ＵＳＰ６、ＵＳＰ８、ＶＡＶ１、ＶＨＬ、ＶＴＩ１Ａ、ＷＡＳ、ＷＤＣＰ、ＷＩＦ１、ＷＮＫ２、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＴＲ１、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＰＯ１、ＹＷＨＡＥ、ＺＢＴＢ１６、ＺＣＣＨＣ８、ＺＥＢ１、ＺＦＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＭＹＭ３、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ３８４、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ５２１、ＺＮＲＦ３、およびＺＲＳＲ２が挙げられる。

【0379】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、免疫細胞関連遺伝子、例えば、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、共阻害免疫受容体、共刺激免疫受容体、免疫細胞転写因子などである。

【0380】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、サイトカイン、例えば、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１７８、ＣＤ７０、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０、ＩＬ－２３、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ－β、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＳＣＦ、ＴＡＬＬ－１、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＮＣＥ、またはＴＷＥＡＫである。

【0381】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、サイトカイン受容体、例えば、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、インターフェロン受容体、ＴＮＦファミリー受容体、ＴＧＦ－Ｂ受容体、Ａｐｏ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１２０、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ１３、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤｗ１１９、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤｗ１２５、ＣＤｗ１３１、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤｗ２１０、ＣＤｗ２１７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１１Ｒａ、ＩＬ－１４Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－２０Ｒ、ＩＬ－２０Ｒα、ＩＬ－２０Ｒβ、ＩＬ－９Ｒ、ＬＩＦＲ、ＬＴβＲ、ＯＰＧ、ＯＳＭＲ、ＯＸ４０、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＴＧＦ－βＲ１、ＴＧＦ－βＲ２、ＴＧＦ－βＲ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、またはＴＲＡＩＬＲ４である。

【0382】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、ケモカイン、例えば、ＡＣＴ－２、ＡＭＡＣ－ａ、ＡＴＡＣ、ＡＴＡＣ、ＢＬＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＫｂ－６、ＣＫｂ－８、ＣＴＡＣＫ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＤＣ－ＣＫ１、ＥＬＣ、ＥＮＡ－７８、エオタキシン、エオタキシン－２、エオタキシン－３、Ｅｓｋｉｎｅ、ｅｘｏｄｕｓ－１、ｅｘｏｄｕｓ－２、ｅｘｏｄｕｓ－３、フラクタルカイン、ＧＣＰ－２、ＧＲＯａ、ＧＲＯｂ、ＧＲＯｇ、ＨＣＣ－１、ＨＣＣ－２、ＨＣＣ－４、Ｉ－３０９、ＩＬ－８、ＩＬＣ、ＩＰ－１０、Ｉ－ＴＡＣ、ＬＡＧ－１、ＬＡＲＣ、ＬＣＣ－１、ＬＤ７８α、ＬＥＣ、Ｌｋｎ－１、ＬＭＣ、リンフォタクチン（lymphoactin）、リンフォタクチンｂ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、ＭＤＣ、ＭＤＮＣＦ、ＭＧＳＡ－ａ、ＭＧＳＡ－ｂ、ＭＧＳＡ－ｇ、Ｍｉｇ、ＭＩＰ－１ｄ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－２ａ、ＭＩＰ－２ｂ、ＭＩＰ－３、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、ＭＩＰ－４、ＭＩＰ－４ａ、ＭＩＰ－５、ＭＰＩＦ－１、ＭＰＩＦ－２、ＮＡＦ、ＮＡＰ－１、ＮＡＰ－２、オンコスタチン、ＰＡＲＣ、ＰＦ４、ＰＰＢＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＭ－１ａ、ＳＣＭ－１ｂ、ＳＤＦ－１α／β－、ＳＬＣ、ＳＴＣＰ－１、ＴＡＲＣ、ＴＥＣＫ、ＸＣＬ１、またはＸＣＬ２である。

【0383】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、ケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＸＣＲ１、またはＸＣＲ１である。

【0384】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、活性化ＮＫ受容体、例えば、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１６（ＦｃｇＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２７、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ｈ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１、Ｌｙ４９、ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ（ＫＬＲＫ１、ＣＤ３１４）、ＮＫｐ３０（ＮＣＲ３）、ＮＫｐ４４（ＮＣＲ２）、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１、ＣＬＥＣ５Ｃ）、ＮＴＢ－Ａ（ＳＬＡＭＦ６）、ＰＳＧＬ１、またはＳＬＡＭＦ７（ＣＲＡＣＣ、ＣＳ１、ＣＤ３１９）である。

【0385】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、阻害性ＮＫ受容体、例えば、ＣＤ１６１（ＮＫＲ－Ｐ１Ａ、ＮＫ１．１）、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＬＩＲ１（ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ１）、Ｌｙ４９ａ、Ｌｙ４９ｂ、ＮＫＲ－Ｐ１Ａ（ＫＬＲＢ１）、ＳＩＧＬＥＣ－１０、ＳＩＧＬＥＣ－１１、ＳＩＧＬＥＣ－１４、ＳＩＧＬＥＣ－１６、ＳＩＧＬＥＣ－３（ＣＤ３３）、ＳＩＧＬＥＣ－５（ＣＤ１７０）、ＳＩＧＬＥＣ－６（ＣＤ３２７）、ＳＩＧＬＥＣ－７（ＣＤ３２８）、ＳＩＧＬＥＣ－８、ＳＩＧＬＥＣ－９（ＣＤ３２９）、ＳＩＧＬＥＣ－Ｅ、ＳＩＧＬＥＣ－Ｆ、ＳＩＧＬＥＣ－Ｇ、ＳＩＧＬＥＣ－Ｈ、またはＴＩＧＩＴである。

【0386】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、共阻害免疫受容体、例えば、２Ｂ４、Ｂ７－１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ６、Ｆａｓ、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、Ｌｙ１０８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１Ｈ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、またはＴＩＭ３である。

【0387】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、共刺激免疫受容体、例えば、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ２２６、ＣＤ３５５、ＣＲＡＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｙ９、Ｌｙ１０８、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ、ＯＸ４０、ＳＬＡＭ、ＴＩＭ１、またはＴＩＭ２である。

【0388】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、遺伝子エフェクター自体、例えば、本明細書に開示される遺伝子エフェクターのいずれか（例えば、本明細書に開示される転写因子）である。

【0389】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、免疫細胞転写因子、例えば、ＡＰ－１、Ｂｃｌ６、Ｅ２Ａ、ＥＢＦ、Ｅｏｍｅｓ、ＦｏｘＰ３、ＧＡＴＡ３、Ｉｄ２、Ｉｋａｒｏｓ、ＩＲＦ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢ、Ｐａｘ５、ＰＬＺＦ、ＰＵ．１、ＲＯＲ－ガンマ－Ｔ、ＳＴＡＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、Ｔ－ｂｅｔ、ＴＣＦ７、またはＴｈＰＯＫである。

【0390】

一部の実施形態では、標的遺伝子は、キナーゼ、例えば、チロシンキナーゼ、またはセリン／トレオニンキナーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ホスファターゼ、例えば、チロシンホスファターゼ、またはセリン／トレオニンホスファターゼである。

【0391】

一部の実施形態では、標的遺伝子は、受容体である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、イオンチャネルである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＧＰＣＲである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、受容体チロシンキナーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、リボソームタンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、膜タンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、細胞質タンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、核タンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ユビキチンリガーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、メチルトランスフェラーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、グリコシルトランスフェラーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ヒドロラーゼである。

【0392】

一部の実施形態では、ＣＤ４５は本開示の組成物および方法に使用される標的遺伝子である（例えば、遺伝子発現活性化のスクリーン用）。一部の実施形態では、ＣＤ４５は、標的遺伝子として使用されない。ＣＤ４５発現をモジュレートする複合体を同定するための本明細書に開示される組成物および方法を、本明細書に開示されるものを含めた他の標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）に対して同様に改変し、適合させることができる。

【0393】

一部の実施形態では、ＣＤ７１は本開示の組成物および方法に使用される標的遺伝子である（例えば、遺伝子発現の低減のスクリーン用）。一部の実施形態では、ＣＤ７１は標的遺伝子として使用されない。ＣＤ７１発現をモジュレートする複合体を同定するための本明細書に開示される組成物および方法を、本明細書に開示されるものを含めた他の標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）に対して同様に改変し、適合させることができる。
ライブラリー

【0394】

本明細書において、一部の態様では、複合体のライブラリーが開示される。本開示のライブラリーは、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性レベルの望ましい変化を引き出す異種遺伝子エフェクター、その組合せ、およびそれを含有する複合体を同定するためのスクリーニングアッセイに有用であり得る。本開示のライブラリーを、本明細書に開示される方法を使用し、種々の供給源に由来する種々の細胞型においてアッセイして、目的の細胞型において、例えば、ある特定の対象、特定の組織または系列、所与の疾患または状態を有する対象など由来の細胞において、標的遺伝子（複数可）（例えば、標的内因性遺伝子（複数可））の発現および／または活性レベルの望ましい変化を引き出すことができる異種遺伝子エフェクター、その組合せ、およびそれを含有する複合体を同定することができる。

【0395】

ライブラリーのメンバーである複合体は、例えば、同じガイド部分、ガイド核酸、ライブラリー内に存在する異種遺伝子エフェクターの供給源、あるクラスの標的遺伝子などを共有するなど、共通の特質を共有し得る。ライブラリーが複合体当たり２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターを有する複合体を含む一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターのうちの１つがライブラリーの他のメンバーと共通の特質を共有していてよく、一方、他の異種遺伝子エフェクターは共通の特質を共有していなくてもよい。ライブラリーが複合体当たり２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターを有する複合体を含む一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターのうちの１つがライブラリーの他のメンバーと第１の共通の特質を共有していてよく、第２の異種遺伝子エフェクターがライブラリーの他のメンバーと第２の共通の特質を共有していてよい。一部の実施形態では、ライブラリーは、異種遺伝子エフェクターの間で共通の特質がないように、例えば、不偏ライブラリーに設計される。

【0396】

一部の実施形態では、複合体のライブラリーは、ヒト供給源由来の異種遺伝子エフェクターを含む。一部の実施形態では、複合体のライブラリーは、ウイルス性供給源由来の異種遺伝子エフェクターを含む。一部の実施形態では、複合体のライブラリーは、本明細書に開示される他の供給源由来の異種遺伝子エフェクターを含む。

【0397】

一部の実施形態では、複合体のライブラリーは、特定の供給源由来の異種遺伝子エフェクターを含み、例えば、異種遺伝子エフェクターのそれぞれが、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、哺乳動物タンパク質、核に主に局在化するタンパク質、クロマチン調節因子、ヘテロクロマチン形成を容易にする因子、ヒストンをメチル化によってモジュレートする因子、ヒストンをアセチル化によってモジュレートする因子、ヒストンをリン酸化によってモジュレートする因子、ヒストンをＡＤＰ－リボシル化によってモジュレートする因子、ヒストンをグリコシル化によってモジュレートする因子、ヒストンをＳＵＭＯ化によってモジュレートする因子、ヒストンをユビキチン化によってモジュレートする因子、ヒストンを、例えばＡＴＰ加水分解依存性プロセスによってヒストン構造をリモデリングすることによってモジュレートする因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ、クロマチンリモデリング複合体の構成要素、転写調節因子、転写活性化因子、転写リプレッサードメイン、転写因子、間葉系幹細胞転写因子、胚性幹細胞転写因子、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）転写因子、上皮幹細胞転写因子、がん幹細胞転写因子、がん関連転写因子、免疫細胞転写因子、核受容体、核ホルモン受容体、検証されたヒトウイルス転写調節因子、ウイルス（例えば、本明細書に開示されるウイルスの科、亜科、属、種などのもの）のゲノム由来の因子、ヒトに人畜共通感染することが可能なウイルスのゲノム由来の因子、ヒト／コウモリ共通ウイルス由来の因子、メタゲノム調査によるウイルスゲノム由来の因子、ヒト腸内に見いだされるウイルス由来の因子、極限環境において見いだされるウイルス由来の因子、高度の実証された転写調節因子モジュール性を有するウイルスもしくはタンパク質クラス由来の因子、または本明細書に開示される別の供給源に由来し得る。

【0398】

一部の実施形態では、複合体のライブラリーは、例えば、ヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、哺乳動物タンパク質、核に主に局在化するタンパク質、クロマチン調節因子、ヘテロクロマチン形成を容易にする因子、ヒストンをメチル化によってモジュレートする因子、ヒストンをアセチル化によってモジュレートする因子、ヒストンをリン酸化によってモジュレートする因子、ヒストンをＡＤＰ－リボシル化によってモジュレートする因子、ヒストンをグリコシル化によってモジュレートする因子、ヒストンをＳＵＭＯ化によってモジュレートする因子、ヒストンをユビキチン化によってモジュレートする因子、ヒストンを、例えばＡＴＰ加水分解依存性プロセスによってヒストン構造をリモデリングすることによってモジュレートする因子、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ、クロマチンリモデリング複合体の構成要素、転写調節因子、転写活性化因子、転写リプレッサードメイン、転写因子、間葉系幹細胞転写因子、胚性幹細胞転写因子、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）転写因子、上皮幹細胞転写因子、がん幹細胞転写因子、がん関連転写因子、免疫細胞転写因子、核受容体、核ホルモン受容体、検証されたヒトウイルス転写調節因子、ウイルス（例えば、本明細書に開示されるウイルスの科、亜科、属、種などのもの）のゲノム由来の因子、ヒトに人畜共通感染することが可能なウイルスのゲノム由来の因子、ヒト／コウモリ共通ウイルス由来の因子、メタゲノム調査によるウイルスゲノム由来の因子、ヒト腸内に見いだされるウイルス由来の因子、極限環境において見いだされるウイルス由来の因子、高度の実証された転写調節因子モジュール性を有するウイルスもしくはタンパク質クラス由来の因子、または本明細書に開示される別の供給源のうちの任意の２つまたはそれよりも多くからの供給源の組合せに由来する異種遺伝子エフェクターを含む。

【0399】

一部の実施形態では、複合体のライブラリーは、特定の細胞内局在化、例えば、細胞の核に局在化することが可能であるまたは主に局在化する因子に由来する異種遺伝子エフェクターを含む。

【0400】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体は、（ｉ）ライブラリーの他の複合体内の異種遺伝子エフェクターとは異なる異種遺伝子エフェクター、および（ｉｉ）ライブラリーの他の複合体内のガイド核酸配列と１００％の配列同一性を示すガイド核酸配列を含む。

【0401】

一部の実施形態では、ライブラリーの異なる個々の複合体は、ライブラリーの他の複合体内のガイド核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するガイド核酸を含む。一部の場合では、本明細書に開示されるライブラリー内のガイド核酸分子（例えば、ｓｇＲＮＡ）が互いに１００％の配列同一性を示さない（例えば、互いの配列同一性が約８０％から９９％の間である）場合であっても、ガイド核酸分子は、同じ標的遺伝子（例えば、同じ標的ポリヌクレオチド配列、例えば、同じゲノム配列）と結合し、複合体を形成することが可能であり得る。

【0402】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体は、（ｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる異種遺伝子エフェクター、および（ｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体と同様または同じである、例えば、ライブラリー内の個々の複合体全てについて同じであるガイド部分（例えば、ガイド核酸配列を含むもの）を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、本明細書に開示されるヌクレアーゼ、例えば、遺伝子エフェクターに対して異種であるエンドヌクレアーゼを含む。ヌクレアーゼは、本開示のヌクレアーゼ欠損またはヌクレアーゼ不活性型ヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼは、ライブラリー内の他の複合体（例えば、他の全ての複合体）の異種ヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示し得る。

【0403】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体は、（ｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる第１の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターと同じである第２の異種遺伝子エフェクター；および（ｉｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体と同じである、例えば、ライブラリー内の個々の複合体全てについて同じであるガイド部分を含む。ガイド部分は、ライブラリー内の他の（例えば、他の全ての）個々の複合体に対して１００％の同一性を示すガイド核酸であり得るまたはそれを含み得る。ガイド部分は、ライブラリー内の他の複合体（例えば、他の全ての複合体）の異種ヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示すヌクレアーゼ（例えば、異種エンドヌクレアーゼ）を含み得る。

【0404】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体は、（ｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる第１の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターと同じである第２の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターと同じである第３の異種遺伝子エフェクター、および（ｉｖ）ライブラリー内の他の個々の複合体と同じである、例えば、ライブラリーの個々の複合体全てについて同じであるガイド部分を含む。ガイド部分は、ライブラリー内の他の（例えば、他の全ての）個々の複合体に対して１００％の同一性を示すガイド核酸であり得るまたはそれを含み得る。ガイド部分は、ライブラリー内の他の複合体（例えば、他の全ての複合体）の異種ヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示すヌクレアーゼ（例えば、異種エンドヌクレアーゼ）を含み得る。

【0405】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体は、（ｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる第１の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる第２の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターと同じである第３の異種遺伝子エフェクター、および（ｉｖ）ライブラリー内の他の個々の複合体と同じである、例えば、ライブラリーの個々の複合体全てについて同じであるガイド部分を含む。ガイド部分は、ライブラリー内の他の（例えば、他の全ての）個々の複合体に対して１００％の同一性を示すガイド核酸であり得るまたはそれを含み得る。ガイド部分は、ライブラリー内の他の複合体（例えば、他の全ての複合体）の異種ヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示すヌクレアーゼ（例えば、異種エンドヌクレアーゼ）を含み得る。

【0406】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体は、（ｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる第１の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なり、ライブラリー内のさらに他の個々の複合体と同じである第２の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターと同じである第３の異種遺伝子エフェクター、および（ｉｖ）ライブラリー内の他の個々の複合体と同じである、例えば、ライブラリーの個々の複合体全てについて同じであるガイド部分を含む。ガイド部分は、ライブラリー内の他の（例えば、他の全ての）個々の複合体に対して１００％の同一性を示すガイド核酸であり得るまたはそれを含み得る。ガイド部分は、ライブラリー内の他の複合体（例えば、他の全ての複合体）の異種ヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示すヌクレアーゼ（例えば、異種エンドヌクレアーゼ）を含み得る。

【0407】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体は、（ｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる第１の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なり、ライブラリー内のさらに他の個々の複合体と同じである第２の異種遺伝子エフェクター、（ｉｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる第３の異種遺伝子エフェクター、および（ｉｖ）ライブラリー内の他の個々の複合体と同じである、例えば、ライブラリーの個々の複合体全てについて同じであるガイド部分を含む。ガイド部分は、ライブラリー内の他の（例えば、他の全ての）個々の複合体に対して１００％の同一性を示すガイド核酸であり得るまたはそれを含み得る。ガイド部分は、ライブラリーの他の複合体（例えば、他の全ての複合体）の異種ヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示すヌクレアーゼ（例えば、異種エンドヌクレアーゼ）を含み得る。

【0408】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体は、（ｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在する異種遺伝子エフェクターとは異なる異種遺伝子エフェクター、および（ｉｉ）ライブラリー内の他の個々の複合体とは異なるガイド部分（例えば、ガイド核酸配列を含むもの）を含む。ガイド部分は、ライブラリー内の他の個々の複合体内に存在するガイド配列とは異なるガイド核酸配列を含み得る。ガイド部分は、ライブラリーの他の複合体（例えば、他の全ての複合体）の異種ヌクレアーゼに対して１００％の配列同一性を示すヌクレアーゼ（例えば、異種エンドヌクレアーゼ）を含み得る。ガイド部分は、ライブラリー内の他の個々の複合体とは異なるヌクレアーゼ（例えば、異種エンドヌクレアーゼ）を含み得る。

【0409】

一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体（例えば、異なる異種遺伝子エフェクターを含む複合体）は、同じ標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に特異的に結合する。一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体（例えば、同じおよび／または異なる異種遺伝子エフェクターを含む複合体）は、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列の異なる部分（例えば、部分配列）に特異的に結合する。一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体（例えば、同じおよび／または異なる異種遺伝子エフェクターを含む複合体）は、そのそれぞれが同じ遺伝子の発現を調節することが可能な異なる標的遺伝子調節配列に特異的に結合する。一部の実施形態では、ライブラリーの個々の複合体（例えば、同じおよび／または異なる異種遺伝子エフェクターを含む複合体）は、異なる標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に特異的に結合する。

【0410】

本開示のライブラリーは、ライブラリーの意図された目的のために適した任意の数の異なる複合体を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。一部の実施形態では、「異なる複合体」、「個々の複合体」、または「異なる個々の複合体」とは、互いに組成が異なる、例えば、互いに比較して異なる異種遺伝子エフェクター（または異種遺伝子エフェクターの組合せ）を含む、ライブラリーのメンバーを指し得る。そのような場合では、「異なる複合体」、「個々の複合体」、または「異なる個々の複合体」の複数のコピーがライブラリー内に存在し得、同じ複合体の複数のコピーは、「異なる複合体」、「個々の複合体」、または「異なる個々の複合体」ではない。例えば、ライブラリー内に５つの異なる複合体が含まれ得、そのそれぞれが異なる異種遺伝子エフェクターを含有し、各複合体の１００コピーがライブラリー内に存在し得ると、その結果、５００の分子複合体を有するライブラリーがもたらされるが、「異なる複合体」は５つのみである。

【0411】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、少なくとも１６００、少なくとも１７００、少なくとも１８００、少なくとも１９００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも３５００、少なくとも４０００、少なくとも４５００、少なくとも５０００、少なくとも５５００、少なくとも６０００、少なくとも６５００、少なくとも７０００、少なくとも７５００、少なくとも８０００、少なくとも８５００、少なくとも９０００、少なくとも９５００、少なくとも１００００、少なくとも１０５００、少なくとも１１０００、少なくとも１１５００、少なくとも１２０００、少なくとも１２５００、少なくとも１３０００、少なくとも１３５００、少なくとも１４０００、少なくとも１４５００、少なくとも１５０００、少なくとも１５５００、少なくとも１６０００、少なくとも１６５００、少なくとも１７０００、少なくとも１７５００、少なくとも１８０００、少なくとも１８５００、少なくとも１９０００、少なくとも１９５００、少なくとも２００００、少なくとも２０５００、少なくとも２１０００、少なくとも２１５００、少なくとも２２０００、少なくとも２２５００、少なくとも２３０００、少なくとも２３５００、少なくとも２４０００、少なくとも２４５００、少なくとも２５０００、少なくとも２５５００、少なくとも２６０００、少なくとも２６５００、少なくとも２７０００、少なくとも２７５００、少なくとも２８０００、少なくとも２８５００、少なくとも２９０００、少なくとも２９５００、少なくとも３００００、少なくとも３５０００、少なくとも４００００、少なくとも４５０００、少なくとも５００００、少なくとも６００００、少なくとも７００００、少なくとも８００００、少なくとも９００００、または少なくとも１０００００種の異なる複合体を含む。

【0412】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも２５種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも１００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも５００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも１０００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも１５０００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも２５０００種の異なる複合体を含む。

【0413】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、最大で５、最大で１０、最大で１５、最大で２０、最大で２５、最大で３０、最大で３５、最大で４０、最大で４５、最大で５０、最大で６０、最大で７０、最大で８０、最大で９０、最大で１００、最大で１１０、最大で１２０、最大で１３０、最大で１４０、最大で１５０、最大で１６０、最大で１７０、最大で１８０、最大で１９０、最大で２００、最大で２５０、最大で３００、最大で３５０、最大で４００、最大で４５０、最大で５００、最大で５５０、最大で６００、最大で６５０、最大で７００、最大で７５０、最大で８００、最大で８５０、最大で９００、最大で９５０、最大で１０００、最大で１１００、最大で１２００、最大で１３００、最大で１４００、最大で１５００、最大で１６００、最大で１７００、最大で１８００、最大で１９００、最大で２０００、最大で２５００、最大で３０００、最大で３５００、最大で４０００、最大で４５００、最大で５０００、最大で５５００、最大で６０００、最大で６５００、最大で７０００、最大で７５００、最大で８０００、最大で８５００、最大で９０００、最大で９５００、最大で１００００、最大で１０５００、最大で１１０００、最大で１１５００、最大で１２０００、最大で１２５００、最大で１３０００、最大で１３５００、最大で１４０００、最大で１４５００、最大で１５０００、最大で１５５００、最大で１６０００、最大で１６５００、最大で１７０００、最大で１７５００、最大で１８０００、最大で１８５００、最大で１９０００、最大で１９５００、最大で２００００、最大で２０５００、最大で２１０００、最大で２１５００、最大で２２０００、最大で２２５００、最大で２３０００、最大で２３５００、最大で２４０００、最大で２４５００、最大で２５０００、最大で２５５００、最大で２６０００、最大で２６５００、最大で２７０００、最大で２７５００、最大で２８０００、最大で２８５００、最大で２９０００、最大で２９５００、最大で３００００、最大で３５０００、最大で４００００、最大で４５０００、最大で５００００、最大で６００００、最大で７００００、最大で８００００、最大で９００００、または最大で１０００００種の異なる複合体を含む。

【0414】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、最大で１０００００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、最大で５００００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、最大で３００００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、最大で２００００種の異なる複合体を含む。

【0415】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも２５種の異なる複合体、かつ最大で１００、最大で１１０、最大で１２０、最大で１３０、最大で１４０、最大で１５０、最大で１６０、最大で１７０、最大で１８０、最大で１９０、最大で２００、最大で２５０、最大で３００、最大で３５０、最大で４００、最大で４５０、最大で５００、最大で５５０、最大で６００、最大で６５０、最大で７００、最大で７５０、最大で８００、最大で８５０、最大で９００、最大で９５０、最大で１０００、最大で１１００、最大で１２００、最大で１３００、最大で１４００、最大で１５００、最大で１６００、最大で１７００、最大で１８００、最大で１９００、最大で２０００、最大で２５００、最大で３０００、最大で３５００、最大で４０００、最大で４５００、最大で５０００、最大で５５００、最大で６０００、最大で６５００、最大で７０００、最大で７５００、最大で８０００、最大で８５００、最大で９０００、最大で９５００、最大で１００００、最大で１０５００、最大で１１０００、最大で１１５００、最大で１２０００、最大で１２５００、最大で１３０００、最大で１３５００、最大で１４０００、最大で１４５００、最大で１５０００、最大で１５５００、最大で１６０００、最大で１６５００、最大で１７０００、最大で１７５００、最大で１８０００、最大で１８５００、最大で１９０００、最大で１９５００、最大で２００００、最大で２０５００、最大で２１０００、最大で２１５００、最大で２２０００、最大で２２５００、最大で２３０００、最大で２３５００、最大で２４０００、最大で２４５００、最大で２５０００、最大で２５５００、最大で２６０００、最大で２６５００、最大で２７０００、最大で２７５００、最大で２８０００、最大で２８５００、最大で２９０００、最大で２９５００、最大で３００００、最大で３５０００、最大で４００００、最大で４５０００、最大で５００００、最大で６００００、最大で７００００、最大で８００００、最大で９００００、または最大で１０００００種の異なる複合体を含む。

【0416】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも１００種の異なる複合体、かつ最大で１００、最大で１１０、最大で１２０、最大で１３０、最大で１４０、最大で１５０、最大で１６０、最大で１７０、最大で１８０、最大で１９０、最大で２００、最大で２５０、最大で３００、最大で３５０、最大で４００、最大で４５０、最大で５００、最大で５５０、最大で６００、最大で６５０、最大で７００、最大で７５０、最大で８００、最大で８５０、最大で９００、最大で９５０、最大で１０００、最大で１１００、最大で１２００、最大で１３００、最大で１４００、最大で１５００、最大で１６００、最大で１７００、最大で１８００、最大で１９００、最大で２０００、最大で２５００、最大で３０００、最大で３５００、最大で４０００、最大で４５００、最大で５０００、最大で５５００、最大で６０００、最大で６５００、最大で７０００、最大で７５００、最大で８０００、最大で８５００、最大で９０００、最大で９５００、最大で１００００、最大で１０５００、最大で１１０００、最大で１１５００、最大で１２０００、最大で１２５００、最大で１３０００、最大で１３５００、最大で１４０００、最大で１４５００、最大で１５０００、最大で１５５００、最大で１６０００、最大で１６５００、最大で１７０００、最大で１７５００、最大で１８０００、最大で１８５００、最大で１９０００、最大で１９５００、最大で２００００、最大で２０５００、最大で２１０００、最大で２１５００、最大で２２０００、最大で２２５００、最大で２３０００、最大で２３５００、最大で２４０００、最大で２４５００、最大で２５０００、最大で２５５００、最大で２６０００、最大で２６５００、最大で２７０００、最大で２７５００、最大で２８０００、最大で２８５００、最大で２９０００、最大で２９５００、最大で３００００、最大で３５０００、最大で４００００、最大で４５０００、最大で５００００、最大で６００００、最大で７００００、最大で８００００、最大で９００００、または最大で１０００００種の異なる複合体を含む。

【0417】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも５００種の異なる複合体、かつ最大で１００、最大で１１０、最大で１２０、最大で１３０、最大で１４０、最大で１５０、最大で１６０、最大で１７０、最大で１８０、最大で１９０、最大で２００、最大で２５０、最大で３００、最大で３５０、最大で４００、最大で４５０、最大で５００、最大で５５０、最大で６００、最大で６５０、最大で７００、最大で７５０、最大で８００、最大で８５０、最大で９００、最大で９５０、最大で１０００、最大で１１００、最大で１２００、最大で１３００、最大で１４００、最大で１５００、最大で１６００、最大で１７００、最大で１８００、最大で１９００、最大で２０００、最大で２５００、最大で３０００、最大で３５００、最大で４０００、最大で４５００、最大で５０００、最大で５５００、最大で６０００、最大で６５００、最大で７０００、最大で７５００、最大で８０００、最大で８５００、最大で９０００、最大で９５００、最大で１００００、最大で１０５００、最大で１１０００、最大で１１５００、最大で１２０００、最大で１２５００、最大で１３０００、最大で１３５００、最大で１４０００、最大で１４５００、最大で１５０００、最大で１５５００、最大で１６０００、最大で１６５００、最大で１７０００、最大で１７５００、最大で１８０００、最大で１８５００、最大で１９０００、最大で１９５００、最大で２００００、最大で２０５００、最大で２１０００、最大で２１５００、最大で２２０００、最大で２２５００、最大で２３０００、最大で２３５００、最大で２４０００、最大で２４５００、最大で２５０００、最大で２５５００、最大で２６０００、最大で２６５００、最大で２７０００、最大で２７５００、最大で２８０００、最大で２８５００、最大で２９０００、最大で２９５００、最大で３００００、最大で３５０００、最大で４００００、最大で４５０００、最大で５００００、最大で６００００、最大で７００００、最大で８００００、最大で９００００、または最大で１０００００種の異なる複合体を含む。

【0418】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも１０００種の異なる複合体、かつ最大で１００、最大で１１０、最大で１２０、最大で１３０、最大で１４０、最大で１５０、最大で１６０、最大で１７０、最大で１８０、最大で１９０、最大で２００、最大で２５０、最大で３００、最大で３５０、最大で４００、最大で４５０、最大で５００、最大で５５０、最大で６００、最大で６５０、最大で７００、最大で７５０、最大で８００、最大で８５０、最大で９００、最大で９５０、最大で１０００、最大で１１００、最大で１２００、最大で１３００、最大で１４００、最大で１５００、最大で１６００、最大で１７００、最大で１８００、最大で１９００、最大で２０００、最大で２５００、最大で３０００、最大で３５００、最大で４０００、最大で４５００、最大で５０００、最大で５５００、最大で６０００、最大で６５００、最大で７０００、最大で７５００、最大で８０００、最大で８５００、最大で９０００、最大で９５００、最大で１００００、最大で１０５００、最大で１１０００、最大で１１５００、最大で１２０００、最大で１２５００、最大で１３０００、最大で１３５００、最大で１４０００、最大で１４５００、最大で１５０００、最大で１５５００、最大で１６０００、最大で１６５００、最大で１７０００、最大で１７５００、最大で１８０００、最大で１８５００、最大で１９０００、最大で１９５００、最大で２００００、最大で２０５００、最大で２１０００、最大で２１５００、最大で２２０００、最大で２２５００、最大で２３０００、最大で２３５００、最大で２４０００、最大で２４５００、最大で２５０００、最大で２５５００、最大で２６０００、最大で２６５００、最大で２７０００、最大で２７５００、最大で２８０００、最大で２８５００、最大で２９０００、最大で２９５００、最大で３００００、最大で３５０００、最大で４００００、最大で４５０００、最大で５００００、最大で６００００、最大で７００００、最大で８００００、最大で９００００、または最大で１０００００種の異なる複合体を含む。

【0419】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも５０００種の異なる複合体、かつ最大で１００、最大で１１０、最大で１２０、最大で１３０、最大で１４０、最大で１５０、最大で１６０、最大で１７０、最大で１８０、最大で１９０、最大で２００、最大で２５０、最大で３００、最大で３５０、最大で４００、最大で４５０、最大で５００、最大で５５０、最大で６００、最大で６５０、最大で７００、最大で７５０、最大で８００、最大で８５０、最大で９００、最大で９５０、最大で１０００、最大で１１００、最大で１２００、最大で１３００、最大で１４００、最大で１５００、最大で１６００、最大で１７００、最大で１８００、最大で１９００、最大で２０００、最大で２５００、最大で３０００、最大で３５００、最大で４０００、最大で４５００、最大で５０００、最大で５５００、最大で６０００、最大で６５００、最大で７０００、最大で７５００、最大で８０００、最大で８５００、最大で９０００、最大で９５００、最大で１００００、最大で１０５００、最大で１１０００、最大で１１５００、最大で１２０００、最大で１２５００、最大で１３０００、最大で１３５００、最大で１４０００、最大で１４５００、最大で１５０００、最大で１５５００、最大で１６０００、最大で１６５００、最大で１７０００、最大で１７５００、最大で１８０００、最大で１８５００、最大で１９０００、最大で１９５００、最大で２００００、最大で２０５００、最大で２１０００、最大で２１５００、最大で２２０００、最大で２２５００、最大で２３０００、最大で２３５００、最大で２４０００、最大で２４５００、最大で２５０００、最大で２５５００、最大で２６０００、最大で２６５００、最大で２７０００、最大で２７５００、最大で２８０００、最大で２８５００、最大で２９０００、最大で２９５００、最大で３００００、最大で３５０００、最大で４００００、最大で４５０００、最大で５００００、最大で６００００、最大で７００００、最大で８００００、最大で９００００、または最大で１０００００種の異なる複合体を含む。

【0420】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、少なくとも１００００種の異なる複合体、かつ最大で１００、最大で１１０、最大で１２０、最大で１３０、最大で１４０、最大で１５０、最大で１６０、最大で１７０、最大で１８０、最大で１９０、最大で２００、最大で２５０、最大で３００、最大で３５０、最大で４００、最大で４５０、最大で５００、最大で５５０、最大で６００、最大で６５０、最大で７００、最大で７５０、最大で８００、最大で８５０、最大で９００、最大で９５０、最大で１０００、最大で１１００、最大で１２００、最大で１３００、最大で１４００、最大で１５００、最大で１６００、最大で１７００、最大で１８００、最大で１９００、最大で２０００、最大で２５００、最大で３０００、最大で３５００、最大で４０００、最大で４５００、最大で５０００、最大で５５００、最大で６０００、最大で６５００、最大で７０００、最大で７５００、最大で８０００、最大で８５００、最大で９０００、最大で９５００、最大で１００００、最大で１０５００、最大で１１０００、最大で１１５００、最大で１２０００、最大で１２５００、最大で１３０００、最大で１３５００、最大で１４０００、最大で１４５００、最大で１５０００、最大で１５５００、最大で１６０００、最大で１６５００、最大で１７０００、最大で１７５００、最大で１８０００、最大で１８５００、最大で１９０００、最大で１９５００、最大で２００００、最大で２０５００、最大で２１０００、最大で２１５００、最大で２２０００、最大で２２５００、最大で２３０００、最大で２３５００、最大で２４０００、最大で２４５００、最大で２５０００、最大で２５５００、最大で２６０００、最大で２６５００、最大で２７０００、最大で２７５００、最大で２８０００、最大で２８５００、最大で２９０００、最大で２９５００、最大で３００００、最大で３５０００、最大で４００００、最大で４５０００、最大で５００００、最大で６００００、最大で７００００、最大で８００００、最大で９００００、または最大で１０００００種の異なる複合体を含む。

【0421】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約７５００、約８０００、約８５００、約９０００、約９５００、約１００００、約１０５００、約１１０００、約１１５００、約１２０００、約１２５００、約１３０００、約１３５００、約１４０００、約１４５００、約１５０００、約１５５００、約１６０００、約１６５００、約１７０００、約１７５００、約１８０００、約１８５００、約１９０００、約１９５００、約２００００、約２０５００、約２１０００、約２１５００、約２２０００、約２２５００、約２３０００、約２３５００、約２４０００、約２４５００、約２５０００、約２５５００、約２６０００、約２６５００、約２７０００、約２７５００、約２８０００、約２８５００、約２９０００、約２９５００、約３００００、約３５０００、約４００００、約４５０００、約５００００、約６００００、約７００００、約８００００、約９００００、または約１０００００種の異なる複合体を含む。

【0422】

一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、約１００００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、約１６０００種の異なる複合体を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、約２８０００種の異なる複合体を含む。
細胞

【0423】

本開示の組成物、方法、および系を種々の型の細胞、およびその集団に適用することができる。例えば、本開示の複合体を使用して、特定の型の細胞またはその集団における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化を引き出すことができる。本開示の方法を使用して、特定の型の細胞またはその集団における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性の変化を引き出すことができる複合体を同定することができる。

【0424】

一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、特定の細胞型に特異的な標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現の望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、２種またはそれよりも多くの細胞型に適用可能である、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現の望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、３種またはそれよりも多くの細胞型に適用可能である、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現の望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、あるクラスの細胞型、例えば、同様の組織内に存在するまたは同じもしくは同様の分化系列に由来する、重複する機能的役割を有する細胞型、例えば、幹細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｔエフェクター細胞などに適用可能である、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現の望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、多種多様な細胞型に広範に適用可能である、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現の望ましい変化がもたらされる、例えば、複数の標的細胞型について、適切な方法を使用して細胞に導入した場合に、ある特定の閾値を上回るまたは下回る標的遺伝子の発現レベルが引き出される。

【0425】

一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、初代細胞における標的遺伝子の発現または活性レベルの変化をもたらす。一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、細胞株における標的遺伝子の発現または活性レベルの変化をもたらす。一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、不死化細胞における標的遺伝子の発現または標的遺伝子の活性レベルの変化をもたらす。

【0426】

一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、非齧歯類哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ブタ細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞などにおける標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらす。一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、植物細胞、トリ細胞、爬虫類細胞、細菌細胞、または古細菌細胞における標的遺伝子の発現または活性レベルの変化をもたらす。

【0427】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、ヒト細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0428】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、幹細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0429】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、分化した細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0430】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、疾患関連細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0431】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、がん細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0432】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、非がん細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0433】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、リンパ系細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞）、ナチュラルキラー細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞（例えば、ＵＳ２００８０２４１１９４を参照されたい）；骨髄細胞、例えば、顆粒球（好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球／過分葉好中球）、単球／マクロファージ、赤血球、網状赤血球、肥満細胞、血小板／巨核球、樹状細胞；甲状腺（甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、副甲状腺（副甲状腺主細胞、好酸性細胞）、副腎（クロム親和性細胞）、松果体（松果体細胞）細胞を含めた内分泌系由来の細胞；グリア細胞（アストロサイト、ミクログリア）、大細胞性神経分泌細胞、星細胞、ベッチェル細胞、および下垂体（性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、プロラクチン産生細胞）を含めた神経系の細胞；肺細胞（Ｉ型肺細胞、ＩＩ型肺胞細胞）、クララ細胞、杯細胞、塵埃細胞を含めた呼吸器系の細胞；心筋細胞、周皮細胞を含めた循環系の細胞；胃（胃主細胞、壁細胞）、杯細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞を含めた消化器系の細胞；腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、肝臓細胞（例えば、肝細胞、またはクッパー細胞）、軟骨／骨／筋肉を含めた腸内分泌細胞；骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、歯の細胞（セメント芽細胞、エナメル芽細胞）を含めた骨細胞；軟骨芽細胞、軟骨細胞を含めた軟骨細胞；毛胞、ケラチノサイト、メラニン細胞（母斑細胞）を含めた皮膚細胞；筋細胞を含めた筋肉細胞；有足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞／糸球体外メサンギウム細胞、腎近位尿細管刷子縁細胞、緻密斑細胞を含めた泌尿器系細胞；精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵子を含めた生殖系細胞；ならびに、脂肪細胞、線維芽細胞、腱細胞、表皮ケラチノサイト、表皮基底細胞、指の爪および足指の爪のケラチノサイト、爪床基底細胞、髄様毛幹細胞、皮質毛幹細胞、クチクラ毛幹細胞、クチクラ毛根鞘細胞、ハクスリー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞、湿性重層バリア上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および膣の上皮の基底細胞、泌尿器上皮細胞、外分泌上皮細胞、唾液腺粘液細胞、唾液腺漿液細胞、舌のフォン・エブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳の耳垢腺細胞、エクリン腺暗細胞、エクリン腺明細胞、アポクリン腺細胞、眼瞼のモル腺細胞、皮脂腺細胞、鼻のボーマン腺細胞、十二指腸のブルンナー腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトレ腺細胞、子宮内膜細胞、気道および消化管の単独で存在する杯細胞、胃内層粘液細胞、胃腺酵素原細胞、胃腺酸分泌細胞、膵腺房細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺胞細胞、肺のクララ細胞、ホルモン分泌細胞、下垂体前葉細胞、成長ホルモン産生細胞、プロラクチン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、下垂体中葉細胞、大細胞性神経分泌細胞、腸管および気道細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロム親和性細胞、精巣のライディッヒ細胞、卵胞の内莢膜細胞、破裂卵胞の黄体細胞、顆粒膜ルテイン細胞、卵胞膜ルテイン細胞、傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、代謝および貯蔵細胞、バリア機能細胞（例えば、肺、腸、外分泌腺および尿生殖路）、腎臓、Ｉ型肺胞上皮細胞、膵管細胞（腺房中心細胞）、非線条部導管細胞（汗腺、唾液腺、乳腺などの）、導管細胞（精嚢、前立腺などの）、閉じた内部体腔の内側を覆う上皮細胞、推進機能を有する線毛細胞、細胞外マトリックス分泌細胞、収縮性細胞；骨格筋細胞、幹細胞、心筋細胞、血液および免疫系細胞、赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ（種々の型）、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中性顆粒球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、肥満細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、血液および免疫系（種々の型）の幹細胞および委任前駆細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、感覚変換細胞、ニューロン、自律神経ニューロン細胞、感覚器および末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞、水晶体細胞、色素細胞、メラニン細胞、網膜色素上皮細胞、生殖細胞、卵原細胞／卵母細胞、精細胞、精母細胞、精原細胞、精子、ナース細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、間質細胞、腎臓間質細胞、骨髄系共通前駆細胞、リンパ球系共通前駆細胞、および本明細書に開示される任意の細胞型に分化するまたは分化させようとする幹細胞を含めた他の細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0434】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、幹細胞、例えば、単離された幹細胞（例えば、ＥＳＣ）または誘導性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0435】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、造血幹細胞、例えば、対象由来、例えば、骨髄、または末梢血（例えば、例えばＧＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、モゾビル、またはこれらの組合せを投与することによって動員された動員末梢血アフェレーシス産物）由来の造血幹細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0436】

一部の場合では、幹細胞（例えば、ＥＳＣまたはｉＰＳＣ）の多能性を、一部において、細胞の多能性の特徴を評定することによって決定することができる。多能性の特徴には、これだけに限定されないが、多能性幹細胞形態；無限に自己再生する潜在性；これだけに限定されないが、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０および／もしくはＣＤ５０を含めた多能性幹細胞マーカーの発現；３つの体細胞系列（外胚葉、中胚葉および内胚葉）の全てに分化する能力；３つの体細胞系列の奇形腫を形成する能力；ならびに／または（ｖｉ）３つの体細胞系列由来の細胞を含む胚様体の形成が含まれ得る。

【0437】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、免疫細胞、例えば、リンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、エフェクター－メモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、レジデントメモリーＴ細胞（ＴＲＭ）、濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）、ＩＬＣ１細胞、ＩＬＣ２細胞、ＩＬＣ３細胞、リンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞、Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、Ｂ２細胞、形質細胞、Ｂ調節細胞、メモリーＢ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、単球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、組織関連マクロファージ、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、好中球、肥満細胞、好塩基球、好酸球、骨髄系共通前駆細胞、リンパ球系共通前駆細胞、またはこれらの任意の組合せにおける標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0438】

本開示の組成物、複合体、系、または方法を使用して、生物学的製剤、例えば、抗体または他のタンパク質に基づく治療薬の製造に使用される工学的に操作された細胞の発現または活性レベルの変化をもたらすことができる。
アッセイ系、対象、および例示的な適用

【0439】

本開示のアッセイ系は、例えば、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの望ましい変化を引き出す１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターまたは複合体を同定するために、異種遺伝子エフェクター、その組合せ、異種遺伝子エフェクター（複数可）を含む複合体、およびそのライブラリーを体系的かつ大規模に調査することを可能にする。

【0440】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法を使用して、望ましい変化、例えば、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現のある特定の閾値を上回るまでの増大、または標的遺伝子の発現のある特定の閾値を下回るまでの低減をもたらす、ライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターを同定することができる。

【0441】

一部の実施形態では、本開示の方法によって同定された異種遺伝子エフェクター（例えば、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多く、または別の配列）を、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含むように改変し、標的遺伝子において引き出される発現の変化に対する当該変異（複数可）の影響を評価する。そのような戦略を、例えば、異種遺伝子エフェクターの活性を改良するため、または最初に同定された配列と比較して改善された特性を有する異種遺伝子エフェクター配列を同定するために使用することができる。一部の実施形態では、本開示の方法は、１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターを同定するステップ、異種遺伝子エフェクターの１つまたは複数のアミノ酸残基を変異させるステップ（例えば、１つまたは複数の欠失、挿入、および／または置換、本明細書に開示される元の配列に対するある程度の配列同一性または配列類似性に達するように）、および、異種遺伝子エフェクターによって引き出される標的遺伝子の発現の変化に対する１つまたは複数のアミノ酸変異の影響を試験するステップを含む。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６～１６１５４のうちのいずれか１つ、配列番号１６～１３６０５のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４７３５０のうちのいずれか１つ、配列番号１６１５５～４３９５３のうちのいずれか１つ、配列番号４７３５１～４９３３３のうちのいずれか１つ、配列番号４９３５３～５００５２のうちのいずれか１つ、または配列番号１６～４９３３３および４９３５３～５００５２のうちのいずれか２つもしくはそれよりも多くと比べて１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む異種遺伝子エフェクターを提供する。

【0442】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法を使用して、望ましい変化、例えば、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現のある特定の閾値を上回るまでの増大、または標的遺伝子の発現のある特定の閾値を下回るまでの低減をもたらす２つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターの組合せ（例えば、同じ複合体内に存在する）を同定することができる。

【0443】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法を使用して、望ましい変化、例えば、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現のある特定の閾値を上回るまでの増大、または標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現のある特定の閾値を下回るまでの低減をもたらす３つまたはそれよりも多くの異種遺伝子エフェクターの組合せ（例えば、同じ複合体内に存在する）を同定することができる。

【0444】

一部の実施形態では、アッセイ系は、設計ごとに不偏である。一部の実施形態では、アッセイ系は、設計ごとに標的化される。

【0445】

異種遺伝子エフェクター（複数可）を含む複合体を、任意の適切な方法を使用して細胞に送達することができる。

【0446】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクター（複数可）を含む複合体を、複合体の１つまたは複数の構成要素をコードする核酸として、任意の適切な方法、例えば、エレクトロポレーション、またはウイルスベクター、リポソームベクター、微小粒子、ナノ粒子、デンドリマーなどの適切なベクターの使用を使用して送達する。一部の実施形態では、複合体の１つまたは複数の構成要素を、一過性発現がもたらされる様式で、例えば、一過性トランスフェクションによって送達する。一部の実施形態では、複合体の１つまたは複数の構成要素を、持続的な発現がもたらされる様式で、例えば、レンチウイルスによる形質導入、本明細書に開示されるヌクレアーゼ系を使用したゲノムへの組込みなどによって送達する。複合体の構成要素を別々のベクター／方法を使用して送達することもでき、同じベクターを使用して送達することもできる。一部の実施形態では、１つまたは複数の構成要素を持続的な発現がもたらされる様式で、例えばレンチウイルスによる形質導入を使用して送達し、１つまたは複数の他の構成要素を一過性発現がもたらされる様式で送達する。

【0447】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクター（複数可）を含む複合体を、タンパク質またはリボ核タンパク質として、例えば、リポソームベクター、ナノ粒子、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどの適切なベクターを使用して送達する。

【0448】

必要に応じて、本開示の系または複合体の１つまたは複数の構成要素（例えば、ガイド部分、ガイド核酸、ヌクレアーゼ、異種遺伝子エフェクター、誘導性系の構成要素など）を十分なレベルで発現する細胞を、例えば、選択マーカー（例えば、耐性もしくは感受性遺伝子）を使用することによって、または、細胞選別、例えば、構成要素の発現に基づく細胞選別もしくは構成要素と共発現されるレポーター遺伝子の発現に基づく細胞選別によって、富化させることができる。

【0449】

複合体または複合体の構成要素を細胞に送達してから任意の適切な時間量が経った後に標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルを測定することができる。一部の実施形態では、複合体または複合体の構成要素を細胞に送達してから少なくとも１時間後、少なくとも２時間後、少なくとも３時間後、少なくとも４時間後、少なくとも５時間後、少なくとも６時間後、少なくとも７時間後、少なくとも８時間後、少なくとも９時間後、少なくとも１０時間後、少なくとも１２時間後、少なくとも１４時間後、少なくとも１８時間後、少なくとも２０時間後、少なくとも１日後、少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、少なくとも５日後、少なくとも６日後、少なくとも７日後、少なくとも８日後、少なくとも９日後、少なくとも１０日後、少なくとも１４日後、少なくとも２１日後、少なくとも２８日後、少なくとも５週間後、少なくとも６週間後、少なくとも７週間後、少なくとも８週間後、少なくとも９週間後、少なくとも１０週間後、少なくとも１２週間後、少なくとも１４週間後、少なくとも１８週間後、少なくとも２０週間後、または少なくとも２６週間後に標的遺伝子の発現または活性レベルを測定する。

【0450】

一部の実施形態では、複合体または複合体の構成要素を細胞に送達してから最大で１時間後、最大で２時間後、最大で３時間後、最大で４時間後、最大で５時間後、最大で６時間後、最大で７時間後、最大で８時間後、最大で９時間後、最大で１０時間後、最大で１２時間後、最大で１４時間後、最大で１８時間後、最大で２０時間後、最大で１日後、最大で２日後、最大で３日後、最大で４日後、最大で５日後、最大で６日後、最大で７日後、最大で８日後、最大で９日後、最大で１０日後、最大で１４日後、最大で２１日後、最大で２８日後、最大で５週間後、最大で６週間後、最大で７週間後、最大で８週間後、最大で９週間後、最大で１０週間後、最大で１２週間後、最大で１４週間後、最大で１８週間後、最大で２０週間後、または最大で２６週間後に標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルを測定する。

【0451】

一部の実施形態では、複合体または複合体の構成要素を細胞に送達してから約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約７時間後、約８時間後、約９時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１８時間後、約２０時間後、約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、約１０日後、約１４日後、約２１日後、約２８日後、約５週間後、約６週間後、約７週間後、約８週間後、約９週間後、約１０週間後、約１２週間後、約１４週間後、約１８週間後、約２０週間後、または約２６週間後に標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルを測定する。

【0452】

一部の実施形態では、発現レベルは、タンパク質発現レベルであり、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、マルチプレックスイムノアッセイ、質量分析、ＮＭＲ、プロテオミクス、フローサイトメトリー、マスサイトメトリーなどによって測定することができる。

【0453】

一部の実施形態では、本開示の複合体により、標的遺伝子の発現を増大させることができる（例えば、複合体が細胞または細胞の集団に導入された際に）。一部の実施形態では、発現レベルは、ＲＮＡ発現レベルであり、例えば、ＲＮＡｓｅｑ、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子アレイ、ＦＩＳＨなどによって測定することができる。

【0454】

標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）を高レベルまたは低レベルで発現する細胞を、必要に応じて、例えば、蛍光活性化細胞選別、磁気活性化細胞選別、またはこれらの組合せを使用して選別することによって富化することができる。標的遺伝子の活性レベルが高いまたは低い細胞を機能アッセイを使用して同定することができる。

【0455】

標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性レベルの望ましい変化を引き出す１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターまたは複合体を、特定の異種遺伝子エフェクター、その組合せ、複合体などに対応するように設計された一意的な分子識別子（例えば、バーコード）の使用に基づいて同定することができる。

【0456】

一意的な分子識別子は、別個の構築物に一意的にタグ付けするために使用される短い配列であり得、例えば、各異種遺伝子エフェクターに一意的な分子識別子を所定の様式で付随させ、情報を記憶して、例えば一意的な分子識別子が配列決定によって見いだされた際に、一意的な分子識別子を特定の異種遺伝子エフェクターにマッピングすることを可能にすることができる。例えば、ベクター、例えば、レンチウイルスベクター、発現プラスミド、ゲノムに組み込まれる配列などへのクローニングのために、一意的な分子識別子を本明細書に開示される異種遺伝子エフェクターのコード配列と共に合成することができる。一意的な分子識別子は、任意の適切な長さ、例えば、約８～３０、約８～２５、約８～２０、約８～１５、約１０～３０、約１０～２５、約１０～２０、約１０～１５ヌクレオチド長であり得る。一意的な分子識別子は、約１２ヌクレオチド長であり得る。

【0457】

一部の実施形態では、単一の一意的な分子識別子を使用して、異種遺伝子エフェクターをタグ付けし、同定する。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの一意的な分子識別子を使用して、異種遺伝子エフェクターを同定する、例えば、同じ供給源タンパク質、タンパク質のクラス、またはサブライブラリーに由来する異種遺伝子エフェクター間で共有される１つの配列を使用することができ、別個の配列間を区別するために第２の一意的な分子識別子を使用し、例えば、ライブラリーの異なるメンバーによってコードされるタンパク質のセグメントをタイル状に並べる。一部の実施形態では、例えば、重複排除のために、一意的な分子識別子の１つのセットを使用して異種遺伝子エフェクターを同定し、一意的な分子識別子の別のセットを使用して、配列決定のための試料の処理中に生成された分子に一意的にタグ付けする。

【0458】

一意的な分子識別子は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで合理的に設計することができる。一意的な分子識別子を設計する方法は、例えば、一意的な分子識別子間の最小のペアワイズハミング距離、ホモポリマーの最大長、ＧＣ含量の下限および上限、ブラックリストに入れられる配列（例えば、ライブラリーおよび／もしくはゲノムの内容に基づいて）、マルコフ連鎖モデル、ならびに／またはグリッド検索によるハイパーパラメータ最適化に関する基準を含み得る。

【0459】

一部の実施形態では、本開示のアッセイ系を、例えばエフェクターの強力な２成分組合せについて繰り返すことができ、スクリーンを実施して、３成分複合体を同定することができる。このシナリオでは、ＧＡ１－ｄＣａｓ－２成分エフェクターを用いて安定な細胞株を生成することができ、ＧＩＤ１でタグ付けした個々のエフェクターを導入することができる。

【0460】

一部の実施形態では、本開示の複合体の一部であるポリペプチド（例えば、異種遺伝子エフェクター、ガイド部分、融合タンパク質など）を精製タグまたはエピトープタグなどのタグと融合する。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵＳ、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、ＳＩ、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。

【0461】

一部の実施形態では、本開示の複合体の一部であるポリペプチド（例えば、異種遺伝子エフェクター、ガイド部分、ヌクレアーゼ、融合タンパク質など）をデグロン、例えばミニオーキシン誘導性デグロン（ｍＡＩＤ；Yesbolatova et al., Nature Communications 2020）と融合して、ｄＣａｓ９－エフェクター発現の時間的制御を可能にする。一部の実施形態では、レポーター細胞株を生成する。細胞株を、ＯｓＴＩＲ１を発現するように工学的に操作することができる。ＴＩＲ（輸送阻害因子１タンパク質）は、オーキシンの存在下でＡＩＤと相互作用する、Ｏｒｙｚａ ｓａｌｉｖａ由来のユビキチンリガーゼ複合体のサブユニットである。この相互作用により、ＡＩＤでタグ付けしたタンパク質のユビキチン化および分解が容易になり、それにより、オーキシンによる処理でｄＣａｓ９－エフェクターを分解することが可能になる。スクリーニングアッセイにおける発現レベルを一貫させるために、ＯｓＴＩＲ１発現構築物をセーフハーバー部位（例えば、ＡＡＶＳ１）に組み込むことができる。ＯｓＴＩＲ１構築物を、所与のスクリーニングアッセイにおいてｄＣａｓ９を目的のゲノム遺伝子座（例えば、プロモーター）に標的化するガイドＲＮＡを発現するように改変することもでき、ガイドＲＮＡを別に導入することもできる。

【0462】

一部の実施形態では、本開示の複合体の一部であるポリペプチド（例えば、異種遺伝子エフェクター、ガイド部分、融合タンパク質など）を、蛍光タンパク質または発光タンパク質などのレポーター遺伝子と融合する。一部の実施形態では、本開示の複合体の一部であるポリペプチド（例えば、異種遺伝子エフェクターまたはガイド部分）をレポーター遺伝子と共発現させる、例えば、ＩＲＥＳで隔てられた発現構築物から共発現させる。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。

【0463】

一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、特定の対象に特異的な、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現の望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、２例またはそれよりも多くの対象に適用可能である、標的遺伝子の発現の望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、あるクラスの対象、例えば、哺乳動物対象、ヒト対象、雄対象、雌対象、所与の年齢範囲に入る対象、同様の疾患または状態を有する対象（例えば、遺伝学的基礎がある疾患および／または標的遺伝子もしくは関連するもしくは対立する機能を有する遺伝子を含めた１つもしくは複数の内因性遺伝子の発現レベルの影響を受ける疾患を有する対象）に適用可能である、標的遺伝子の発現の望ましい変化がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定される複合体または異種遺伝子エフェクターにより、多種多様な対象に広範に適用可能である、標的遺伝子の発現の望ましい変化がもたらされる、例えば、複数の対象について、適切な方法を使用して対象の細胞に導入した場合に、ある特定の閾値を上回るまたは下回る標的遺伝子の発現レベルが引き出される。

【0464】

一部の実施形態では、疾患機構を理解するために、本開示の組成物および方法を使用して、誘導性かつ可逆的な疾患モデルを確立することができる。

【0465】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法を使用して、１種または複数種の特定の遺伝子の異常発現を含む疾患に対する潜在的な治療剤または治療剤を同定および／または試験することができる。

【0466】

一部の実施形態では、例えば、特定の細胞型への分化、または複数の経路に分化することが可能な細胞型、例えば幹細胞への脱分化を誘導するために、本開示の組成物および方法を使用して、細胞の運命および系列決定の重要な駆動因子の発現をモジュレートすることによって細胞分化を制御することができる。

【0467】

本開示は、本明細書に開示される要素、例えば、異種遺伝子エフェクター（複数可）、ガイド部分、ガイド核酸、複合体、オリゴマー形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメイン、これらの組合せ、およびこれらを複数含むライブラリーのいずれか１つまたは複数をコードする核酸をさらに包含する。

【0468】

本開示は、本明細書に開示される要素、例えば、異種遺伝子エフェクター（複数可）、ガイド部分、ガイド核酸、複合体、オリゴマー形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメイン、これらの組合せ、およびこれらを複数含むライブラリーの１つまたは複数、ならびにこれらをコードする核酸を含むキットをさらに包含する。キットは、例えば、使用説明書をさらに含み得る。
レポーター発現ベクター

【0469】

本開示は、例えば本明細書に開示されるアッセイ系および方法に利用することができるレポーター発現ベクターを提供する。レポーター発現ベクターを、例えば、本明細書に記載の工学的に操作された合成レポーター（ＥＳＲ）系または細胞株に使用することができる。

【0470】

一部の実施形態では、本開示は、異種遺伝子エフェクターおよび／またはガイド核酸配列（例えば、（ｉ）転写／クロマチン調節因子とカップリングしたＣａｓタンパク質と（ｉｉ）ガイドＲＮＡとを含む複合体）のいずれかによって標的化することができる少なくとも１つのポリヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数の異種ポリヌクレオチド配列）を含む発現ベクター（例えば、異種発現ベクター）を提供する。少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を標的遺伝子に作動的にカップリングし（例えば、標的遺伝子のプロモーターなどの調節配列の上流に隣接させて配置する）、したがって、異種遺伝子エフェクターおよび／またはガイド核酸配列のいずれかによって少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を標的化することにより、標的遺伝子の発現をモジュレートすることができる。少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は、例えば、標的遺伝子の発現をモジュレートするための望ましい特性を示す異種遺伝子エフェクタードメイン（複数可）およびその複合体（複数可）のスクリーニング時などのオフターゲット作用（複数可）を最小限にする（例えば、回避する）ために、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に通常は存在しない合成配列であり得る。したがって、本開示の追加の態様は、そのような発現ベクター、それを含む細胞、およびその使用方法の種々の実施形態を提供する。

【0471】

発現ベクターは、ある１つの異種ポリヌクレオチド配列（例えば、単一の異種ポリヌクレオチド配列）を含み得る。その代わりにまたはそれに加えて、発現ベクターは、複数の異種ポリヌクレオチド配列を含み得る。発現ベクターは、少なくともまたは最大約２つの異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約３つの異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約４つの異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約５つの異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約６つの異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約７つの異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約８つの異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約９つの異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約１０の異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約１５の異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約２０の異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約３０の異種ポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約４０の異種ポリヌクレオチド配列、または少なくともまたは最大約５０の異種ポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0472】

発現ベクターの複数の異種ポリヌクレオチド配列のそれぞれは、実質的に同じであり得る。一部の実施形態では、複数の異種ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部（例えば、そのそれぞれ）は、互いに異なり得る（例えば、少なくともまたは最大約１核酸塩基、少なくともまたは最大約２核酸塩基、少なくともまたは最大約３核酸塩基、少なくともまたは最大約４核酸塩基、少なくともまたは最大約５核酸塩基、６核酸塩基、少なくともまたは最大約７核酸塩基、少なくともまたは最大約８核酸塩基、少なくともまたは最大約９核酸塩基、または少なくともまたは最大約１０核酸塩基が異なるなど）。

【0473】

発現ベクターの複数の異種ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つ（例えば、そのそれぞれ）は、互いにすぐ隣にあってよい（例えば、いかなる他の核酸塩基によっても隔てられていない）。あるいは、発現ベクターの複数の異種ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つ（例えば、そのそれぞれ）は、スペーサー、例えば、１つまたは複数の核酸塩基（例えば、少なくともまたは最大約１核酸塩基、少なくともまたは最大約２核酸塩基、少なくともまたは最大約３核酸塩基、少なくともまたは最大約４核酸塩基、少なくともまたは最大約５核酸塩基、少なくともまたは最大約６核酸塩基、少なくともまたは最大約７核酸塩基、少なくともまたは最大約８核酸塩基、少なくともまたは最大約９核酸塩基、少なくともまたは最大約１０核酸塩基、少なくともまたは最大約１５核酸塩基、少なくともまたは最大約２０核酸塩基、少なくともまたは最大約３０核酸塩基、少なくともまたは最大約４０核酸塩基、少なくともまたは最大約５０核酸塩基、少なくともまたは最大約６０核酸塩基、少なくともまたは最大約７０核酸塩基、少なくともまたは最大約８０核酸塩基、少なくともまたは最大約９０核酸塩基、または少なくともまたは最大約１００核酸塩基など）によって隔てられていてもよい。

【0474】

本明細書に開示される発現ベクターの異種ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ標的配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質標的配列）および／または（ｉｉ）１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含み得る。異種ポリヌクレオチド配列は、単一のＰＡＭ配列を含み得る。あるいは、異種ポリヌクレオチド配列は、複数のＰＡＭ配列（例えば、少なくともまたは最大約２つのＰＡＭ配列、少なくともまたは最大約３つのＰＡＭ配列、少なくともまたは最大約４つのＰＡＭ配列、少なくともまたは最大約５つのＰＡＭ配列、少なくともまたは最大約６つのＰＡＭ配列、少なくともまたは最大約７つのＰＡＭ配列、少なくともまたは最大約８つのＰＡＭ配列、少なくともまたは最大約９つのＰＡＭ配列、または少なくともまたは最大約１０のＰＡＭ配列）を含み得る。複数のＰＡＭ配列は、同一であってよい。一部の実施形態では、複数のＰＡＭ配列のうちの２つまたはそれよりも多くが異なってよく、例えば、第１のＰＡＭ配列は第１の型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、例えばＳｐＣａｓ９および／またはＳａＣａｓ９）に対するものであってよく、第２のＰＡＭ配列は第２の型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ）に対するものであってよい。複数のＰＡＭ配列のうちの少なくとも２つは互いにオーバーラップするものでなくてよい（例えば、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭとＣａｓ９ ＰＡＭ）。あるいは、複数のＰＡＭ配列のうちのいくつかが互いにオーバーラップするものであってもよい（例えば、ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭとＳａＣａｓ９ ＰＡＭ）。

【0475】

本明細書に開示される２つのＰＡＭ配列間の距離は、少なくともまたは最大約１核酸塩基、少なくともまたは最大約５核酸塩基、少なくともまたは最大約１０核酸塩基、少なくともまたは最大約１５核酸塩基、少なくともまたは最大約２０核酸塩基、少なくともまたは最大約２５核酸塩基、少なくともまたは最大約３０核酸塩基、少なくともまたは最大約３５核酸塩基、少なくともまたは最大約４０核酸塩基、少なくともまたは最大約４５核酸塩基、少なくともまたは最大約５０核酸塩基、少なくともまたは最大約５５核酸塩基、少なくともまたは最大約６０核酸塩基、少なくともまたは最大約７０核酸塩基、少なくともまたは最大約８０核酸塩基、少なくともまたは最大約９０核酸塩基、または少なくともまたは最大約１００核酸塩基であり得る。一部の場合では、少なくとも２つのＰＡＭ配列を異種ポリヌクレオチド配列の末端（例えば５’末端または３’末端）に配置することができる。少なくとも２つのＰＡＭ配列を異種ポリヌクレオチド配列の逆の末端に配置することができる（例えば、異種ポリヌクレオチド配列が２つの異なるＰＡＭ配列で挟まれていてよい）。

【0476】

本明細書に開示される異種ポリヌクレオチド配列のエンドヌクレアーゼ標的配列（例えば、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体のガイドＲＮＡ分子によって標的化される）は、少なくともまたは最大約１０核酸塩基、少なくともまたは最大約１５核酸塩基、少なくともまたは最大約２０核酸塩基、少なくともまたは最大約２５核酸塩基、少なくともまたは最大約３０核酸塩基、少なくともまたは最大約３５核酸塩基、少なくともまたは最大約４０核酸塩基、少なくともまたは最大約４５核酸塩基、少なくともまたは最大約５０核酸塩基、少なくともまたは最大約６０核酸塩基、少なくともまたは最大約７０核酸塩基、少なくともまたは最大約８０核酸塩基、少なくともまたは最大約９０核酸塩基、または少なくともまたは最大約１００核酸塩基であり得る。

【0477】

本明細書に開示される異種ポリヌクレオチド配列のエンドヌクレアーゼ標的配列（例えば、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体のガイドＲＮＡ分子によって標的化される）は、異なる供給源に由来する複数のポリヌクレオチド配列を含み得る。異なる供給源の非限定的な例は、同じ遺伝子、異なる遺伝子、異なる染色体（例えば、異なるヒト染色体）などのエクソンおよびイントロンであり得る。異なる染色体は、１番染色体、２番染色体、３番染色体、４番染色体、５番染色体、６番染色体、７番染色体、８番染色体、９番染色体、１０番染色体、１１番染色体、１２番染色体、１３番染色体、１４番染色体、１５番染色体、１６番染色体、１７番染色体、１８番染色体、１９番染色体、２０番染色体、２１番染色体、２２番染色体、Ｘ染色体、および／またはＹ染色体に由来し得る。一部の実施例では、複数のポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド配列は、表面抗原分類（ＣＤ）タンパク質、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９９、ＣＤ１０３、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６３などをコードする遺伝子に由来し得る。

【0478】

複数のポリヌクレオチド配列は、少なくともまたは最大約２つのポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約３つのポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約４つのポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約５つのポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約６つのポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約７つのポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約８つのポリヌクレオチド配列、少なくともまたは最大約９つのポリヌクレオチド配列、または少なくともまたは最大約１０のポリヌクレオチド配列を含み得る。複数のポリヌクレオチド配列のサイズ（例えば、長さ）は同じであり得る。あるいは、複数のポリヌクレオチド配列のサイズは異なり得る。複数のポリヌクレオチド配列のうちの２つのポリヌクレオチド配列のサイズは、少なくともまたは最大約２ポリヌクレオチド、少なくともまたは最大約３ポリヌクレオチド、少なくともまたは最大約４ポリヌクレオチド、少なくともまたは最大約５ポリヌクレオチド、少なくともまたは最大約６ポリヌクレオチド、少なくともまたは最大約７ポリヌクレオチド、少なくともまたは最大約８ポリヌクレオチド、少なくともまたは最大約９ポリヌクレオチド、または少なくともまたは最大約１０ポリヌクレオチド異なり得る。

【0479】

本明細書に開示される発現ベクターは、本明細書に開示される１つまたは複数の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、各異種ポリヌクレオチド配列）の下流にある上流活性化配列（ＵＡＳ）を含み得る。ＵＡＳは、非ヒトＵＡＳであり得る。ＵＡＳは、プロモーター（例えば、ＧＡＬ４プロモーター）に由来し得る。そのようなプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６、Ｈ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、Ｔ７、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびＥＦ１ａを挙げることができる。ＵＡＳは、例えば、プロモーター、および／または、レポーター遺伝子などのレポーター発現ベクターによって発現が調節される標的遺伝子の上流にあり得る。

【0480】

本明細書に開示される発現ベクターは、プロモーターを含み得る。一部の場合では、１つまたは複数の異種ポリヌクレオチド配列は、プロモーターの上流にあり得る。一部の場合では、１つまたは複数の異種ポリヌクレオチド配列は、プロモーターの下流にあり得る。一部の場合では、プロモーターは、強力な構成的プロモーター（例えば、ＥＦ１ａ）であり得る。一部の場合では、プロモーターは、弱いウイルス性最小プロモーター（例えば、ＣＭＶ）であり得る。プロモーターにより標的遺伝子の発現を制御することができ、例えば、標的遺伝子をプロモーターの調節制御下に置くことができる。

【0481】

本明細書に開示される発現ベクターの異種ポリヌクレオチド配列は、表３に提示される配列番号４９３３４～４９３４１または４９３４４～４９３５２のうちのいずれか１つまたは複数と少なくともまたは最大約７０％、少なくともまたは最大約７５％、少なくともまたは最大約８０％、少なくともまたは最大約８５％、少なくともまたは最大約９０％、少なくともまたは最大約９１％、少なくともまたは最大約９２％、少なくともまたは最大約９３％、少なくともまたは最大約９４％、少なくともまたは最大約９５％、少なくともまたは最大約９６％、少なくともまたは最大約９７％、少なくともまたは最大約９８％、少なくともまたは最大約９９％、または実質的に約１００％の配列同一性または配列類似性を示し得る。本明細書に開示される発現ベクターの異種ポリヌクレオチド配列を、配列番号４９３４６、４９３４７、４９３５１、または４９３５２のうちのいずれか１つと少なくともまたは最大約７０％、少なくともまたは最大約７５％、少なくともまたは最大約８０％、少なくともまたは最大約８５％、少なくともまたは最大約９０％、少なくともまたは最大約９１％、少なくともまたは最大約９２％、少なくともまたは最大約９３％、少なくともまたは最大約９４％、少なくともまたは最大約９５％、少なくともまたは最大約９６％、少なくともまたは最大約９７％、少なくともまたは最大約９８％、少なくともまたは最大約９９％、または実質的に約１００％の配列同一性または配列類似性を示すプロモーターに接合または作動的にカップリングすることができる。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0482】

本開示の別の態様は、本明細書に開示される発現ベクターのいずれかを含む細胞（例えば、レポーター細胞株）、細胞を作製する方法、および、細胞を、例えば、本明細書に開示されるライブラリーの１つまたは複数のリード異種遺伝子エフェクターを同定するためのスクリーンに使用する方法を提供する。発現ベクターを細胞の１つまたは複数の染色体（例えば、核染色体）に組み込むことができる。あるいは、発現ベクターを染色体に組み込まなくてもよい（例えば、非染色体性であってよい）。

【0483】

本明細書に開示される発現ベクター（例えば、図１１参照）を含む細胞の集団により示される標的遺伝子陽性細胞の分布は、対照発現ベクター（例えば、図１２参照）を含む対照細胞の集団と比較して、少なくともまたは最大約１パーセント（％）、少なくともまたは最大約２％、少なくともまたは最大約５％、少なくともまたは最大約１０％、少なくともまたは最大約１５％、少なくともまたは最大約２０％、少なくともまたは最大約３０％、少なくともまたは最大約４０％、少なくともまたは最大約５０％、少なくともまたは最大約６０％、少なくともまたは最大約７０％、少なくともまたは最大約８０％、少なくともまたは最大約９０％、少なくともまたは最大約９５％、少なくともまたは最大約１００％、少なくともまたは最大約０．１倍、少なくともまたは最大約０．２倍、少なくともまたは最大約０．５倍狭い、少なくともまたは最大約１分の１、少なくともまたは最大約１．５分の１、少なくともまたは最大約２分の１、少なくともまたは最大約３分の１、少なくともまたは最大約４分の１、少なくともまたは最大約５分の１、または少なくともまたは最大約１０分の１であり得る（図１９参照）。分布は、例えば、フローサイトメトリーによって決定される、集団内の細胞によるレポーター遺伝子の発現の蛍光強度の四分位範囲、または約５番目のパーセンタイルから９５番目のパーセンタイルまでの範囲にわたり得る。

【実施例】

【0484】

以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を例示する目的で提示され、本開示をいかなる様式でも限定するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在の代表的な好ましい実施形態であり、例示であり、本開示の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
ヒトエピジェネティックエフェクタースクリーン

【0485】

本実施例には、ヒト核プロテオーム由来の新規遺伝子エフェクター（例えば、遺伝子発現をモジュレートするドメイン）の同定および特徴付けを記載する。

【0486】

ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列とを含有する複合体のライブラリーを利用したハイスループットスクリーンを実施する。各異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列をｄＣａｓ９と融合し、ヒト細胞における標的遺伝子調節配列（例えば、プロモーター）に動員し、標的遺伝子発現に対する効果を決定する。例示的なエフェクタースクリーン設計の概要を図１に提示する。

【0487】

ライブラリー設計

【0488】

異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列を、ヒト核プロテオームからのタンパク質配列をカバーするように設計する。核に局在化する（例えば、排他的に局在化する）ことが実験により決定されたヒトタンパク質（ＰｒｏｔｅｉｎＡｔｌａｓ．ｏｒｇ）の解析を実施し、５４９種のタンパク質のショートリストを得る。３００ヌクレオチド長であり、そのうちの２５５ヌクレオチドが標的特異的である合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドから異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列を生成する。各オリゴの５’末端および３’末端はデスティネーションベクター（ｐ－ｄＣａｓ９）と相補的な配列を含有し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｒｅａｄ １ Ｐｒｉｍｅｒの一部を含む３’１５ヌクレオチドのオーバーラップを伴う。オリゴヌクレオチドは、各異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列に対して一意的な分子識別子（例えば、「バーコード」）も含有する。この設計により、ＮＥＢ ＨｉＦｉクローニングを使用してライブラリーをクローニングすること、および下流のＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑに適合するＮＧＳライブラリーを生成することが可能になる。各標的遺伝子に対して、オリゴを、遺伝子のコードヌクレオチド配列が５’から３’まで、１２９ヌクレオチドのオーバーラップを伴ってタイル状に並べられるように、設計する。

【0489】

この最初のエフェクターライブラリーでは、陽性対照および陰性対照を含め、全部で１６１３９種のオリゴが設計される。以下に、以下の通りアノテートされる本実施例のオリゴヌクレオチドの実例を提示する：ベクターオーバーラップ１（配列番号１１）－標的配列（配列番号１２）－［終止コドン；配列番号１３］－一意的な分子識別子（配列番号１４）－ベクターオーバーラップ２（配列番号１５；（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｒｅａｄ１部分的））：

【0490】

【化1】

【化2】

【0491】

本開示のライブラリーに使用されるオリゴには、各標的配列に一意的な分子識別子を結び付けるため、およびクローニング用のベクターオーバーラップ配列を提供するために同様のフォーマットを利用することができる。

【0492】

ライブラリークローニング

【0493】

オリゴヌクレオチドをオリゴ（例えば、数百ナノグラムの凍結乾燥ＤＮＡ）当たり＞０．２ｆｍｏｌの収量で得る。オリゴを１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に再懸濁させてストック濃度を２０ｎｇ／μＬとする。ストック溶液を－２０℃で維持することができる。

【0494】

ＰＣＲを行って、ｓｓＤＮＡをｄｓＤＮＡに変換し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉクローニングに備える。ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰＣＲ Ｋｉｔ（カタログ番号ＫＫ２５０２）を使用し、およそ１２～１４サイクルを行う。

【0495】

表４に、ライブラリー増幅のための例示的なＰＣＲ反応の構成成分を提示する。反応物４００μＬを８つのＰＣＲ管にそれぞれ５０μＬの量を分割する。

【表4】

【0496】

表５に、例示的なＰＣＲ条件を提示する。

【表5】

【0497】

ＰＣＲ産物をカラム精製によってクリーンアップする。

【0498】

各オリゴの５’末端および３’末端にオーバーラップ配列が存在することにより、デスティネーションベクターへのクローニングが可能になる（例えば、ＮＥＢ ＨｉＦｉによって）。

【0499】

デスティネーションベクター（ｐ－ｄＣａｓ９）をｐＳＬＱ６６０４に基づくレンチウイルス骨格を改変することによって生成する。デスティネーションベクターを、異種遺伝子エフェクターをｄＣａｓ９のＣ末端と短い柔軟なＧＳリンカーを介して融合することが可能になるように設計する。デスティネーションベクターを直接合成（例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によってまたはアセンブリ（例えば、ＩＤＴからの３つの合成ｇＢｌｏｃ断片を使用したＨｉＦＩ ＰＣＲアセンブリ、続いてＥｃｏＲＩ ＮｏｔＩで直線化したｐＳＬＱ６６０４へのライゲーション）によって生成する。

【0500】

図２に例示されている出発デスティネーションベクターを直線化する（例えば、ＥｃｏＲＩ（高忠実度）およびＮｏｔＩ（高忠実度）制限酵素を用いた消化によって）。３つの合成ｇＢｌｏｃｋ断片から生成した挿入断片配列をＨｉＦｉアセンブリによって挿入して、図３に例示されているｐ－ｄＣａｓ９を生成する。

【0501】

ｐ－ｄＣａｓ９デスティネーションベクターを直線化し（例えば、ＭｌｕＩ（高忠実度）を用いた消化によって）、異種遺伝子エフェクター配列をコードする挿入断片をＨｉＦｉアセンブリを使用して挿入断片のベクターに対する比をおよそ１０：１としてベクターに付加する。
例示的な活性化因子スクリーン

【0502】

ライブラリーを使用して、標的遺伝子の発現を活性化するまたは増大させる異種遺伝子エフェクターを同定する。各スクリーンのために、適切な細胞型／細胞株および標的遺伝子または標的遺伝子調節配列を選択する。ガイドＲＮＡを使用して、ｄＣａｓ９－エフェクターを内因性遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター）に方向付ける。ガイドＲＮＡは、検証されたガイドＲＮＡであり得る。ライブラリーは、陽性対照オリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、およびＨＳＦ１遺伝子にわたってタイル状に並べられたもの）を含む。

【0503】

所与の細胞型において低レベルで発現される細胞表面タンパク質をコードする標的遺伝子を使用することができる。例えば、ＣＤ４５を低レベルで発現する細胞株が図４に例示されている。

【0504】

１回の反復では、Ｋ５６２細胞を使用し、ＣＤ４５を標的遺伝子として用いる。Ｋ５６２細胞はＣＤ４５を低レベルで発現する。ガイドＲＮＡを使用して、ｄＣａｓ９－エフェクターをＣＤ４５の調節配列（例えば、プロモーター）に方向付ける。

【0505】

１回の反復では、Ｋ５６２細胞を使用し、ＣＤＢ１を標的遺伝子として用いる。Ｋ５６２細胞はＣＤＢ１を低レベルで発現する。ガイドＲＮＡを使用して、ｄＣａｓ９－エフェクターをＣＤＢ１の調節配列（例えば、プロモーター）に方向付ける。

【0506】

細胞にベクター（例えば、レンチウイルス粒子）を用いた形質導入を行って、ライブラリーの複合体の発現を誘導する。形質導入された細胞において候補異種遺伝子エフェクターが１つよりも多く発現されないように感染多重度を選択する。スクリーンにおいてｄＣａｓ９－エフェクターを発現しないバックグラウンド細胞の数を最小限にするために、形質導入された細胞をレポーター遺伝子（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）発現に基づいて選別する。次いで、細胞にベクター（例えば、高い感染多重度のレンチウイルス粒子）を用いた形質導入を行って、スクリーンに特異的なガイドＲＮＡ（例えば、ＣＤ４５プロモーターを標的化するガイドＲＮＡ）の発現を誘導する。形質導入された細胞を培養下で最大約５日間維持する。

【0507】

標的遺伝子をより高レベルで発現する細胞を、例えば、細胞を標的遺伝子の発現に基づいて選別すること（例えば、蛍光活性化細胞選別および／または磁気活性化細胞選別により）によって同定することができる。

【0508】

ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、組み込まれたエフェクターカセットをＰＣＲによって単離し、それを使用して、ＨｉＳｅｑシングルエンドバーコードシーケンシングのためのライブラリーを生成する。標的遺伝子の発現を増大させる遺伝子エフェクターを同定する。

【0509】

この手法は、異種遺伝子エフェクターの組合せのスクリーニングにも適合させることができる。

【0510】

例示的なリプレッサースクリーン

【0511】

ライブラリーを使用して、標的遺伝子の発現を低減させる異種遺伝子エフェクターを同定する。各スクリーンのために、適切な細胞型／細胞株および標的遺伝子または標的遺伝子調節配列を選択する。ガイドＲＮＡを使用して、ｄＣａｓ９－エフェクターを内因性遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター）に方向付ける。ガイドＲＮＡは、検証されたガイドＲＮＡであり得る。

【0512】

所与の細胞型において比較的高いレベルで発現される細胞表面タンパク質をコードする標的遺伝子を使用することができる。例えば、トランスフェリン受容体ＣＤ７１を高レベルで発現する細胞株が図５に例示されている。

【0513】

１回の反復では、Ｋ５６２細胞を使用し、ＣＤ７１を標的遺伝子として用いる。Ｋ５６２細胞はＣＤ７１を比較的高いレベルで発現する。ガイドＲＮＡを使用して、ｄＣａｓ９－エフェクターをＣＤ７１の調節配列（例えば、プロモーター）に方向付ける。ガイドＲＮＡは、例えば、ＧＧＡＣＧＣＧＣＴＡＧＴＧＴＧＡＧＴＧＣまたはＣＧＡＴＡＴＣＣＣＧＡＣＧＣＴＣＴＧＡＧによってコードされ得る。

【0514】

細胞にベクター（例えば、レンチウイルス粒子）を用いた形質導入を行って、ライブラリーの複合体の発現を誘導する。形質導入された細胞において候補異種遺伝子エフェクターが１つよりも多く発現されないように感染多重度を選択する。スクリーンにおいてｄＣａｓ９－エフェクターを発現しないバックグラウンド細胞の数を最小限にするために、形質導入された細胞をレポーター遺伝子（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）発現に基づいて選別する。次いで、細胞にベクター（例えば、高い感染多重度のレンチウイルス粒子）を用いた形質導入を行って、スクリーンに特異的なガイドＲＮＡ（例えば、ＣＤ７１プロモーターを標的化するガイドＲＮＡ）の発現を誘導する。形質導入された細胞を培養下で最大約５日間維持する。

【0515】

標的遺伝子をより低レベルで発現する細胞を、例えば、標的遺伝子の発現に基づいて細胞を選別すること（例えば、蛍光活性化細胞選別および／または磁気活性化細胞選別により）によって同定することができる。

【0516】

ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、組み込まれたエフェクターカセットをＰＣＲによって単離し、それを使用して、ＨｉＳｅｑシングルエンドバーコードシーケンシングのためのライブラリーを生成する。標的遺伝子の発現を低減させる遺伝子エフェクターを同定する。

【0517】

この手法は、異種遺伝子エフェクターの組合せのスクリーニングにも適合させることができる。
（実施例２）
本開示の複合体による遺伝子発現の活性化および抑制を実証するパイロット実験

【0518】

本実施例には、本開示の複合体により標的遺伝子の発現を活性化することおよび抑制することができること、ならびに、本開示の方法を使用して標的遺伝子の上方調節および下方調節を検出することができることを実証するパイロット実験を記載する。

【0519】

それぞれがヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列とを含有する複合体のライブラリーを実施例１に記載の方法を使用して生成した。各異種遺伝子エフェクターをコードし、５’および３’クローニング配列を含有する合成ＤＮＡヌクレオチドを生成し、デスティネーションベクターｐ－ｄＣａｓ９にクローニングした。候補エフェクターのライブラリーをパイロットスクリーンのためにプールした。ライブラリーは、転写活性をモジュレートすることが同定された遺伝子からのものを含めた候補転写活性化因子および候補転写リプレッサー（例えば、Ｐ３００、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＨＤＡＣ３、ＨＳＦ１およびＺＩＭ３、ＭｅＣｐ２、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、Ｇ９ａ、およびＥＺＨ２）を含む。

【0520】

Ｋ５６２細胞株を使用して、複合体の遺伝子発現に対する影響を試験した。細胞に候補エフェクターをコードする構築物を用いた形質導入を行って、ライブラリーの複合体の発現を誘導した。細胞に、レンチウイルスベクターを用いた形質導入も行って、ｄＣａｓ９－エフェクターを（ｉ）ＣＤ４５の調節配列（活性化因子スクリーン、実験条件）、（ｉｉ）ＣＤ７１の調節配列（リプレッサースクリーン、実験条件）、または（ｉｉｉ）ＧＡＬ４（対照）に方向付けるためのガイドＲＮＡの安定発現を誘導した。形質導入された細胞をレポーター遺伝子発現に基づいて選別して、ガイドＲＮＡとｄＣａｓ９－エフェクターの両方を発現する細胞を富化させた。

【0521】

形質導入された細胞を培養下で最大約５日維持し、ＣＤ４５またはＣＤ７１発現をフローサイトメトリーによって数量化した。活性化因子スクリーンの実験条件においてＣＤ４５発現の増大が観察され（図６、右上のパネル）、リプレッサースクリーンの実験条件においてＣＤ７１発現の低減が観察された（図６、右下のパネル）。
（実施例３）
ウイルスエピジェネティックエフェクタースクリーン設計

【0522】

ウイルスゲノムからのタンパク質配列をカバーするように異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列を設計する。候補配列を以下に基づいて選択する：

【0523】

（ｉ）ＣｈＩＰ／ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、ＥＭＳＡ、ＳＥＬＥＸ、レポーターアッセイ、結合アッセイ、および／または結晶構造によって実験により検証されたウイルス転写調節因子。実験により検証されたウイルス転写調節因子は、例えば、以下の科：Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｅｒｉｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅのうちのいずれか１つまたは複数からのウイルスを表し得る。Liu et al., Human virus transcriptional regulators. Cell, 182(1),pp.24-37からの転写調節因子を含めることができる。

【0524】

（ｉｉ）ヒト－コウモリ共通ウイルスおよびウイルスタンパク質、例えば、コウモリから人畜共通感染することが実証されているウイルスの科および／またはヒト細胞において機能的であることが実証されているウイルスに由来するウイルス転写調節因子。ヒト－コウモリ共通ウイルスおよびウイルスタンパク質に由来するウイルス転写調節因子は、例えば、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｙｓｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｅｎｕｖｉｒｉｄａｅ、およびＨａｎｔａｖｉｒｉｄａｅのうちのいずれか１つまたは複数からのウイルスを表し得る。例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅおよびｐｏｘｖｉｒｉｄａｅには高度の転写調節因子モジュール性があるので、これらのウイルスからの配列を含めることができる。配列はｄＢａｔＶｉｒデータベースから手動で入手することができる。

【0525】

（ｉｉｉ）メタゲノムウイルスゲノムおよびウイルスタンパク質。配列は、例えば、腸ビロームを評価した研究からのデータ；ヒト腸内に豊富に存在し、転写調節因子を含有し、酸性環境下で存在するＳｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、およびｍｙｏｖｉｒｉｄａｅのゲノム；海洋で検出されたウイルス配列；熱水噴出孔で検出されたウイルス配列；公共のデータベースからの構造データ（例えば、Ｘ線、ＮＭＲ）を利用した供給源；水平伝播よりも垂直伝播に好都合な進化的圧力に起因して酸性残基および残留官能基などの望ましい特性を有するエフェクターに富む可能性がある、極限環境（例えば、高酸、高温環境）からの古細菌トロピックウイルス（例えば、ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）の記録；および公共の供給源（例えば、ＮＣＢＩ）から手動で入手した配列から入手することができる。

【0526】

予測的フィルタリング技法を、例えば、酵母における実験を通じたコア活性化因子ドメイン（例えば、１３ｂｐに至るまで）の適切な生物物理学的特性の同定；酸性のかさのある疎水性のアルファヘリックス、および／または負電荷の存在；効果の持続時間に影響を及ぼす可能性があるモチーフリピートの存在；ならびにＰＡＤＤＬＥ様畳み込みニューラルネットワーク／トランスフォーマアルゴリズムまたは同様の予測技法に基づいて候補配列に適用することができる。
（実施例４）
ウイルスエピジェネティックエフェクタースクリーン

【0527】

本実施例には、ウイルスゲノム由来の新規遺伝子エフェクター（例えば、ヒト遺伝子の発現をモジュレートするドメイン）の同定および特徴付けを記載する。

【0528】

それぞれがヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）とウイルスゲノム由来の異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列とを含有する複合体のライブラリーを利用してハイスループットスクリーンを実施する。異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列（例えば、実施例３において同定されたもの）をｄＣａｓ９と融合し、ヒト細胞における標的遺伝子調節配列（例えば、プロモーター）に動員し、標的遺伝子発現に対する効果を決定する（例えば、実施例１においてヒト核プロテオームスクリーンに関して記載した技法を使用して）。

【0529】

およそ３５００種の遺伝子とそれに加えておよそ３０００種の対照を標的化する２７７９９種のオリゴを設計する。陽性対照および陰性対照を実施例１に開示されている通り使用する。実験データが公開されているウイルス転写調節因子をアッセイ性能についてのベンチマークとして使用し、データ解析の手引きとするために既知の活性を手動で系統立てる。

【0530】

標的遺伝子の発現を増強するまたは低減させる遺伝子エフェクターを同定する。

【0531】

この手法は、異種遺伝子エフェクターの組合せのスクリーニングにも適合させることができる。
（実施例５）
コンビナトリアルエピジェネティックエフェクタースクリーン

【0532】

本実施例には、遺伝子発現をモジュレートする遺伝子エフェクターの新規組合せの同定および特徴付けを記載する。

【0533】

異種遺伝子エフェクター候補ペプチド配列の組合せと複合体を形成したヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む複合体のライブラリーを利用してハイスループットスクリーンを実施する。このスクリーンは、ヒト細胞における遺伝子エフェクター（例えば、遺伝学的／エピジェネティック因子）の組合せの体系的かつ大規模な調査が可能になるように設計する。

【0534】

第１の手法では、多様なタンパク質ファミリーに由来するクロマチン調節因子（ＣＲ）および転写調節因子（ＴＲ）を文献およびデータベースから抜き出す。ＣＲとＴＲの組合せをスクリーニングして、標的遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、増大または低減させる）因子の新規組合せを同定する。このスクリーンにより、ｉｎ ｖｉｖｏの状況では相互作用しないものであり得るが（例えば、細胞型特異性、補助因子または複合体の要件などに起因して）、それにもかかわらず、目的の遺伝子座に直交性に動員されるとエピジェネティックおよび／または転写作用を媒介し得る因子の組合せを同定することが可能になる。

【0535】

ＣＲ遺伝子エフェクターとしては、種々のクラスのヒストンおよびＤＮＡ修飾酵素由来の機能的ドメイン（例えば、ＤＮＭＴ、ＨＡＴ、ＨＭＴなど）が挙げられる。これらは、主にヒト起源のものであるが、植物または他の種に由来する因子も含めることができる。ＣＲライブラリーは、候補遺伝子エフェクター約１００種ほどのものである。

【0536】

ＴＲ遺伝子エフェクターとしては、ＴＦの種々のファミリー由来の転写調節ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ｐ６５、ＭＥＤ、ＧＴＦなど）が挙げられる。ＣＲライブラリーと同様に、これらのドメインは主にヒト配列を含み、また、同様に、因子約１００種ほどのものであり、ＣＲ＋ＴＲの独特の組合せがおよそ１０，０００種もたらされる。

【0537】

第２の手法では、実施例１～３において同定された遺伝子エフェクターをスクリーニングする。この手法により、互いにまたは他のエフェクタードメイン（例えば、文献からのエフェクタードメイン）と組み合わせて利用するとその活性を強化することができる新規エフェクタードメインを同定することが可能になる。ある特定の閾値を上回る活性化または抑制を実現する、最初のスクリーンからのエフェクター、ならびに他の活性化因子およびリプレッサーを含む対のライブラリーを生成する。次いで、これらのライブラリーをペアワイズ様式で試験して、望ましい（例えば、相乗的な）活性を示すエフェクターの組合せを同定する。

【0538】

候補エフェクタードメインの直交性の動員を容易にし、何千もの可能性のある組合せを標的化または不偏様式で試験することを可能にする誘導性系を使用する。この系の誘導性および可逆性により、転写活性化または抑制に対する観察される効果の持続性を評価することも可能になる。

【0539】

この系では、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａに由来する誘導性ヘテロ二量体タンパク質対（ＰＹＬ１－ＡＢＩおよびＧＩＤ１－ＧＡＩ）を利用する。各ヘテロ二量体対の一方のタンパク質をｄＣａｓ９と融合し、同類のタンパク質をエフェクタードメインと融合し、誘導分子（植物ホルモンＡＢＡおよびＧＡ）を添加することによってｄＣａｓ９へのエフェクターの動員を実現する。最大８０アミノ酸の遺伝子エフェクターがヘテロ二量体形成ドメインに融合される。

【0540】

ライブラリー要素はそれぞれが一意的な分子識別子（バーコード）を含有し、一意的な分子識別子は、細胞内に存在する、選択閾値を超える組合せがペアエンドＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングによりデコンボリューションされるように調整されたものである。最大８０アミノ酸の遺伝子エフェクター断片および一意的な分子識別子をコードするＤＮＡをおよそ３００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの形態で得る。ＣＲ遺伝子エフェクターおよびＴＲ遺伝子エフェクターをそれぞれＧＩＤ１およびＰＹＬ１とインフレームで有する単一のプラスミドを用いてレンチウイルス発現プラスミドを生成する。コンビナトリアルスクリーンのための発現構築物の例示的な概略図を図７に提示する。

【0541】

実施例１～３に記載のスクリーンと適合させるために、同じ遺伝子座を標的化する（活性化に関してはＣＤ４５、抑制に関してはＣＤ７１）。ＧＡＩ－ｄＣａｓ９－ＡＢＩを発現する安定なＫ５６２細胞株を、例えば図８に例示されている発現構築物を使用して生成する。

【0542】

コンビナトリアルライブラリーをレンチウイルス粒子として、ＧＡＩ－ｄＣａｓ９－ＡＢＩを安定に発現するＫ５６２細胞に形質導入する。形質導入された細胞を、ＰＹＬでタグ付けした候補エフェクタードメインおよびＧＩＤ１でタグ付けした候補エフェクタードメインの動員が誘導されることが実験により決定された濃度のＡＢＡおよびＧＡに曝露させる。遺伝子エフェクターとｄＣａｓ９のアセンブルされた複合体を最大５日間にわたって標的遺伝子座（リプレッサースクリーンではＣＤ７１、活性化因子スクリーンではＣＤ４５）と会合したままにした後、誘導性ホルモンを取り除く。

【0543】

エフェクターの組合せの活性を、誘導後５日間の間隔で最大３０日間にわたって所望の細胞の集団を選別し、収集することによって決定する。次いで、候補組合せの同一性を、示されている時点で単離された細胞から抽出されたＤＮＡからの一意的な分子識別子の配列を決定することによって決定する。

【0544】

図９に、ｄＣａｓ９と会合した転写調節因子とクロマチン調節因子の組合せを含む本開示の複合体によるＣＤ４５発現およびＣＤ７１発現のモジュレーションが例示されている。上の画像は、ＣＤ４５についての例示的な活性化因子スクリーンを示し、下の画像は、ＣＤ７１についての例示的なリプレッサースクリーンを示す。右のグラフは、本開示の複合体によるＣＤ７１発現の抑制、およびＣＤ４５発現の増大を例示する。

【0545】

目的の遺伝子の発現を増大させるまたは抑制する遺伝子エフェクターの組合せを同定する。

【0546】

追加の候補遺伝子エフェクターを用いて、および／または３成分複合体を同定するために、スクリーンのさらなる反復を実施することができる。例えば、ＧＡ１－ｄＣａｓ－２成分エフェクターを用いてＫ５６２細胞の安定株を生成し、ＧＩＤ１でタグ付けした個々のエフェクターを導入することができる。
（実施例６）
本明細書に開示される系および方法の治療への適用

【0547】

本明細書に開示される系および方法を使用して、例えば、新規遺伝子エフェクター複合体を同定することができる。新規遺伝子エフェクター複合体は、新規遺伝子エフェクターおよび／または複数の遺伝子エフェクターの新規組合せを含み得る。本明細書に開示される、同定される新規遺伝子エフェクターは、特定の標的遺伝子、特定の細胞型、特定の標的疾患、特定の対象などに独特のものであり得る。

【0548】

ａ．同じ細胞型の異なる標的遺伝子

【0549】

本明細書に開示される複合体のライブラリーを使用して、同じ細胞型由来の異なる標的遺伝子に対する新規遺伝子エフェクター複合体を同定することができる。同じ細胞型内で、第１の遺伝子の発現または活性レベルを調節する（例えば、最適に上方調節または下方調節する）ものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、第２の遺伝子（第１の遺伝子とは異なる）の発現または活性レベルを調節する（例えば、最適に上方調節または下方調節する）ものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。

【0550】

例えば、同じ幹細胞型内で、幹細胞の若返りを誘導するためにテロメラーゼの発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、組織修復／再生のためにトランスフォーミング増殖因子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。

【0551】

ｂ．異なる細胞型の同じ標的遺伝子

【0552】

本明細書に開示される複合体のライブラリーを使用して、同じ標的遺伝子であるが異なる細胞型におけるものに対する新規遺伝子エフェクター複合体を同定することができる。スクリーニングに同じ標的遺伝子を利用した場合であっても、第１の細胞型において標的遺伝子の発現または活性レベルを調節する（例えば、最適に上方調節または下方調節する）ものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、第２の細胞型における同じ標的遺伝子の発現または活性レベルを調節する（例えば、最適に上方調節または下方調節する）ものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。

【0553】

例えば、標的遺伝子が同じものであるとして、幹細胞の若返りを誘導するためにテロメラーゼをコードする遺伝子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、より分化した細胞（例えば、皮膚細胞、筋肉細胞、ニューロンなど）の若返りを誘導するためにテロメラーゼをコードする同じ遺伝子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。

【0554】

異なる例では、標的遺伝子が同じものであるとして、第１の型の分化した細胞（例えば、皮膚細胞）の若返りを誘導するためにテロメラーゼをコードする遺伝子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、第２の型の分化した細胞（例えば、筋肉細胞）の若返りを誘導するためにテロメラーゼをコードする同じ遺伝子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。

【0555】

ｃ．異なる細胞型の異なる標的遺伝子

【0556】

本明細書に開示される複合体のライブラリーを使用して、異なる細胞型における異なる標的遺伝子に対する新規遺伝子エフェクター複合体を同定することができる。第１の細胞型における第１の標的遺伝子の発現または活性レベルを調節する（例えば、最適に上方調節または下方調節する）ものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、第２の細胞型における第２の標的遺伝子の発現または活性レベルを調節する（例えば、最適に上方調節または下方調節する）ものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。

【0557】

例えば、筋形成を誘導するために筋肉幹細胞（または筋肉サテライト細胞）における筋芽細胞決定タンパク質１（ＭｙｏＤ）をコードする第１の遺伝子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、骨形成を誘導するために間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるＲｕｎｔ関連転写因子２（ＲＵＮＸ２）をコードする第２の遺伝子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。

【0558】

ｄ．異なる対象の同じ標的遺伝子

【0559】

本明細書に開示される複合体のライブラリーを使用して、同じ標的細胞型における同じ標的遺伝子であるが、異なる標的細胞供給源に由来するものに対する新規遺伝子エフェクター複合体を同定することができる。一部の場合では、同じ型の標的細胞は異なる対象由来であり得る。異なる対象は、例えば、性別、年齢、体調（例えば、病態）などが異なり得る。第１の対象由来の細胞型における標的遺伝子の発現または活性レベルを調節する（例えば、最適に上方調節または下方調節する）ものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、第１の対象とは異なる第２の対象由来の同じ細胞型における同じ標的遺伝子の発現または活性レベルを調節する（例えば、最適に上方調節または下方調節する）ものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。

【0560】

例えば、標的遺伝子が同じものであるとして、雌対象由来の幹細胞型の若返りを誘導するためにテロメラーゼをコードする遺伝子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第１の新規遺伝子エフェクター複合体は、雄対象由来の同じ幹細胞型におけるテロメラーゼをコードする同じ遺伝子の発現または活性レベルを最適に増強するものと同定される第２の新規遺伝子エフェクター複合体とは異なり得る。
（実施例７）
工学的に操作された合成レポーター（ＥＳＲ）の設計

【0561】

図１０に、ＥＳＲの発現ベクターの構造の例が概略的に実証されている。発現ベクターは、異種ポリヌクレオチド配列の複数のコピー（例えば、７コピー）を含み得る。各異種ポリヌクレオチド配列は、合成ガイド標的（例えば、ガイドＲＮＡによって標的化可能な、例えば、配列番号４９３３４）、複数のＣＲＩＳＰＲ ＰＡＭ配列（例えば、「ＴＴＴＡ」などのＣａｓ１２ａ ＰＡＭ配列、「ＣＧＧ」などのＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ配列、「ＣＧＧＡＧ」などのＳａＣａｓ９ ＰＡＭ配列、および／または上流活性化配列（ＵＡＳ）配列を含み得、これらの構成要素のいくつかは互いにオーバーラップするものであってよい（例えば、１つまたは複数の共通の核酸塩基、例えば共通のポリヌクレオチド配列を共有し得る）。ＵＡＳ（例えば、プロモーターの上流）は、転写活性化因子によって標的化することができ、そのような標的化は、プロモーターの制御下にある標的遺伝子の発現を調節する（例えば、増強する）ために十分なものであり得る。

【0562】

合成ガイド標的は、２つの異なる供給源からの、ポリヌクレオチド配列と追加のポリヌクレオチド配列とを含み得る（例えば、ヒトＣＤ４５（ｃｈｒ１）のガイド標的由来のポリヌクレオチド配列（例えば、１０核酸塩基長）とヒトＣＤ７１（ｃｈｒ３）ガイド標的由来の追加のポリヌクレオチド配列（例えば、１０核酸塩基長））。

【0563】

ＵＡＳは、酵母ＧＡＬ４プロモーター由来であり得る（例えば、酵母においてＧＡＬ４タンパク質が結合するもの）。ＵＡＳは哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）においていかなる機能も示さず影響も及ぼさない可能性があり、したがって、哺乳動物細胞に発現ベクターをもたらすことの副作用またはオフターゲット作用を最小化することができる。

【0564】

異種ポリヌクレオチド配列の複数のコピーは、遺伝子、例えば標的遺伝子（例えば、遺伝子およびそのプロモーター配列）の上流にあり得る。標的遺伝子は、細胞において天然に存在するタンパク質をコードし得る。標的遺伝子は、細胞において天然に存在し得るタンパク質をコードし得る。あるいは、標的遺伝子は、細胞において天然に存在しないタンパク質（例えば、レポータータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質）をコードし得る。標的遺伝子をプロモーター、例えば強力なヒト構成的プロモーター（ＥＦ１ａ）または弱いウイルス性最小プロモーター（例えば、ｍｉｎｉＣＭＶ）の制御下に置くことができる。

【0565】

一部の実施例では、発現ベクターを含むＥＳＲ細胞の集団を、異なる異種遺伝子エフェクターおよび合成ガイド標的に対するガイド核酸配列のライブラリーを用いて処理し、標的遺伝子の発現レベルの変化を測定して、リード異種遺伝子エフェクター（例えば、強力なヒト構成的プロモーターを含む発現ベクターについてはリプレッサー、または弱いウイルス性最小プロモーターを含む発現ベクターについては活性化因子）についてスクリーニングすることができる。

【0566】

図１１にＥＳＲの配列の例が概略的に示されている。図１２に対照レポーターベクターの配列の例が概略的に示されている。一部の場合では、ＥＳＲ内の各合成ガイド標的配列間の間隔は、対照レポーターベクターにおけるものとは異なってよい。例えば、ＥＳＲ内の各合成ガイド標的配列間の間隔は、対照レポーターベクターにおけるものよりも長くてよい。
（実施例８）
ＥＳＲを含むレポーター細胞株の生成

【0567】

異なる型の種々の細胞をＥＳＲを含むように工学的に操作して（例えば、実施例７において実証されている通り）、例えば、標的遺伝子発現をモジュレートするための望ましい特性を示す異種遺伝子エフェクタードメイン（複数可）およびその複合体（複数可）のスクリーニングに使用することができる種々の型のレポーター細胞株を生成することができる。

【0568】

新規遺伝子活性化因子についてスクリーニングするために、ｍｉｎｉＣＭＶ－ＧＦＰを含むＥＳＲを用いてＫ５６２細胞を工学的に操作することができる（ＥＳＲ１１１）。遺伝子リプレッサーについてスクリーニングするために、ＥＦ１ａ－ＧＦＰを含むＥＳＲを用いてＫ５６２細胞を工学的に操作することができる（ＥＳＲ２１１）。遺伝子活性化因子を検証するために、ｍｉｎｉＣＭＶ－ＧＦＰを含むＥＳＲを用いて２９３Ｔ細胞を工学的に操作することができる（ＥＳＲ１２１）。遺伝子リプレッサーを検証するために、ＥＦ１ａ－ＧＦＰを含むＥＳＲを用いて２９３Ｔ細胞を工学的に操作することができる（ＥＳＲ２２１）。

【0569】

図１３に、ｍｉｎｉＣＭＶ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（ＥＳＲ１２１）についての（ｉ）トランスフェクトなしの場合、（ｉｉ）ｄＣａｓ９およびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓ９＋ｓｇＴ）、（ｉｉｉ）ｄＣａｓ９－ＶＰＲ活性化因子およびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓ９－ＶＰＲ＋ｓｇＴ）、または（ｉｖ）ｄＣａｓ９－ＶＰＲ活性化因子およびＥＳＲベクターに対する非標的化対照ガイドＲＮＡ（ｄＣａｓ９－ＶＰＲ＋ｓｇＮＴ）をトランスフェクトした場合のフローサイトメトリーデータ解析が示されている。図１４に、ＥＦ１ａ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（ＥＳＲ２２１）についての（ｉ）トランスフェクトなしの場合、（ｉｉ）ｄＣａｓ９およびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓ９－空）、（ｉｉｉ）ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢリプレッサーおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ）、または（ｉｖ）ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３ＬリプレッサーおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡ（ｄＣａｓ９－ＫＬ）をトランスフェクトした場合のフローサイトメトリーデータ解析が示されている。図１３および図１４に基づいて、ｄＣａｓ９－ＶＰＲまたはｄＣａｓ９－ＫＲＡＢトランスフェクション後に２９３Ｔ ＥＳＲ細胞の強力な活性化または抑制が示される。

【0570】

図１５に、ｍｉｎｉＣＭＶ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーターＫ５６２細胞株（ＥＳＲ１１１）についての（ｉ）トランスフェクトなしの場合、または（ｉｉ）ｄＣａｓ９－ＶＰＲおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓ９－ＶＰＲ）のフローサイトメトリーデータ解析が示されている。図１６に、ＥＦ１ａ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーターＫ５６２細胞株（ＥＳＲ２１１）についての、トランスフェクトなしで３日目に測定した場合（トランスフェクトなし、Ｄ３）、トランスフェクトなしで１４日目に測定した場合（トランスフェクトなし、Ｄ１４）、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトし、３日目に測定した場合（ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｄ３）、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトし、４日目に測定した場合（ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｄ４）、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトし、５日目に測定した場合（ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｄ５）、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトし、６日目に測定した場合（ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｄ６）、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトし、１０日目に測定した場合（ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｄ１０）、またはｄＣａｓ９－ＫＲＡＢおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトし、１４日目に測定した場合（ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、Ｄ１４）のフローサイトメトリーデータ解析が示されている。図１５および図１６に基づいて、ｄＣａｓ９－ＶＰＲまたはｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ ｍＲＮＡトランスフェクション後にＫ５６２ ＥＳＲ細胞の強力な活性化または抑制が示される。

【0571】

図１７に、ｍｉｎｉＣＭＶ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（ＥＳＲ１２１）についての、（ｉ）ｄＣａｓＭＩＮＩおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓＭＩＮＩ＋ｓｇ２０）、（ｉｉ）ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＶＰＲおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＶＰＲ＋ｓｇ２０）、（ｉｉｉ）ｄＣａｓＭＩＮＩおよびＥＳＲベクターに対する異なるガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓＭＩＮＩ＋ｓｇ２３）、（ｉｖ）ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＶＰＲおよびＥＳＲベクターに対する異なるガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＶＰＲ＋ｓｇ２３）、または（ｖ）ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＶＰＲおよび非特異的な対照ガイドＲＮＡ配列をトランスフェクトした場合（ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＶＰＲ＋ｓｇＮＴ）のフローサイトメトリーデータ解析が示されている。図１８に、ＥＦ１ａ－ＧＦＰをコードするＥＳＲを用いて工学的に操作されたレポーター２９３Ｔ細胞株（ＥＳＲ２２１）についての、（ｉ）ｄＣａｓＭＩＮＩおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓＭＩＮＩ＋ｓｇＴ）、（ｉｉ）ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＫＲＡＢおよびＥＳＲベクターに対するガイドＲＮＡをトランスフェクトした場合（ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＫＲＡＢ＋ｓｇＴ）、または（ｉｉｉ）ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＫＲＡＢおよび非特異的な対照ガイドＲＮＡ配列をトランスフェクトした場合（ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＫＲＡＢ＋ｓｇＮＴ）のフローサイトメトリーデータ解析が示されている。図１７および図１８に基づいて、２９３Ｔ ＥＳＲ細胞はｄＣａｓＭｉｎｉ－ＫＲＡＢによって強力に抑制されるが、ｄＣａｓＭＩＮＩ－ＶＰＲによる活性化の強さはより小さい。
（実施例９）
エフェクターライブラリースクリーン

【0572】

独特の１２ｍｅｒのＤＮＡである一意的な分子識別子（例えば、バーコード）と対にした、４６，０００種を超える候補異種遺伝子エフェクター（それぞれ２５５ｂｐ）をコードするカスタムＤＮＡオリゴライブラリー、およびクローニング相同アームをｄＣａｓ９レンチウイルス発現プラスミドにクローニングした。コードされる候補異種遺伝子エフェクターには、ヒトタンパク質に由来する候補異種遺伝子エフェクター（例えば、配列番号１６～１３６０５、実施例１に記載の通り同定されたもの）、対照エフェクター（例えば、配列番号１３６０６～１６１５４）、ウイルスタンパク質に由来する候補異種遺伝子エフェクター（例えば、配列番号１６１５５～４３９５３、実施例３および４に記載の通り同定されたもの）、および追加の対照エフェクター（例えば、配列番号４３９５４～４７３５０）が含まれる配列番号１６～４７３５０および４９３５３～５００５２のそれぞれを含めた。２５５ｂｐの配列内の推定終止コドンの下流でコードされる追加のペプチド配列が配列番号４７３５１～４９３３３に提示される。

【0573】

並行して、７コピーの独特のガイドＲＮＡ標的化配列（

【化3】

、配列番号４９３３９；ＣａｓＭｉｎｉおよびＣａｓ９ ＰＡＭ配列がそれぞれ太字および下線が引かれた文字列で示されている）を、活性化因子を試験するためにＧＦＰを駆動する最小ＣＭＶプロモーターの上流に置くか、またはリプレッサーを試験するためにＧＦＰを駆動する構成的ヒトＥＦ１αプロモーターの上流に置くことにより、カスタムＧＦＰレポーター（工学的に操作された合成レポーター（ＥＳＲ）－ＧＦＰ）を生成した（例えば、実施例７および図１０に記載の通り）。これらのレポータープラスミドをレンチウイルスにパッケージングし、Ｋ５６２細胞への形質導入を行った。形質導入された細胞についてピューロマイシンによる選択を行った後、個々の細胞を限界希釈によって単離した。クローンの拡大後、各レポーター細胞株のいくつかのクローンを、標準モジュレーターのトランスフェクションによって試験し、好都合なクローンを下流の実験のために選択した。

【0574】

ＥＳＲ－ＧＦＰ、ＣＤ４５、またはＣＤ７１を標的化するｓｇＲＮＡ－ＢＦＰ発現カセットを個々にＥＳＲ－ＧＦＰまたはＷＴ Ｋ５６２細胞に形質導入し、その後、ＢＦＰ＋細胞についてＦＡＣＳを行った。ｄＣａｓ９－候補エフェクターライブラリーをレンチウイルスにパッケージングし、適当なｓｇＲＮＡを発現するＫ５６２細胞に送達した。形質導入された細胞をブラストサイジンによる選択によって富化させ、その後、形質導入の１０日後に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳＡｒｉａ）を行って、目的の集団（活性化についてはＧＦＰ－ＯＮ細胞および抑制についてはＧＦＰ－ＯＦＦ細胞）を分離した。選別された目的の集団を、さらに６日間培養し、４方向ゲーティングＦＡＣＳ分離に供して、ＧＦＰ蛍光強度に基づいて別個のビンに入れることによってさらに富化させた。ゲノムＤＮＡを別個のビンそれぞれ、ならびにバルクＧＦＰ－ＯＮ細胞およびＧＦＰ－ＯＦＦ細胞から抽出し、次いで、並行して処理して次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリーに入れ、配列を決定して、各試料に存在するバーコードを同定した（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔ－Ｓｅｑ、１×７５ｂｐ）。ワークフローが図２０に要約されている。

【0575】

工学的に操作された合成レポーター（ＥＳＲ）系を使用したスクリーン

【0576】

候補異種遺伝子エフェクターのライブラリーをＥＳＲ－ＧＦＰレポーターＫ５６２細胞においてスクリーニングした。対照ｄＣａｓ９－ＶＰＲを用いた活性化および対照ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢに応答した抑制に応答するＥＳＲ－ＧＦＰレポーターの高いダイナミックレンジが示された（図２１Ａ）。

【0577】

各ライブラリーについて、異種遺伝子エフェクターに対応する配列決定されたバーコードのアラインメントに基づいてリードカウント行列を生成した。その後のデータ解析は全て、Ｒバージョン４．１．０を使用して実施した。

【0578】

活性化スクリーンのために、ＧＦＰ－ＯＦＦライブラリーについての技術的反復実験を折りたたみ（バーコード当たりのカウントを合計し）、２つのＧＦＰ－ＯＦＦ反復実験を得た。ＧＦＰ－ＯＮ条件については、１つのＧＦＰ－ＯＮライブラリーを形質導入の１０日後に収集し、別のＧＦＰ－ＯＮライブラリーをｉｎ ｓｉｌｉｃｏにおいて全てのＧＦＰ－ＯＮゲートの重み付けされた合計（さらに６日間の富化後に収集した）を考慮することによって樹立した。ＤＥＳＥＱ２（バージョン１．３２．０）を使用して、２つのＧＦＰ－ＯＮライブラリーにおいて２つのＧＦＰ－ＯＦＦライブラリーと比較して富化された統計的に有意な活性化因子エレメントを同定した。活性化因子スクリーンにおけるヒットを示す火山プロットを図２２Ａに提示する。

【0579】

リプレッサースクリーンのために、ＧＦＰ－ＯＮライブラリーについての技術的反復実験を折りたたみ（バーコード当たりのカウントを合計した）、２つのＧＦＰ－ＯＮ反復実験を得た。ＧＦＰ－ＯＦＦ条件については、１つのＧＦＰ－ＯＦＦライブラリーを形質導入の１０日後に収集し、別のＧＦＰ－ＯＦＦライブラリーをｉｎ ｓｉｌｉｃｏにおいて全てのＧＦＰ－ＯＦＦゲートの重み付けされた合計（さらに６日間の富化後に収集した）を考慮することによって樹立した。ＤＥＳＥＱ２（バージョン１．３２．０）を使用して、２つのＧＦＰ－ＯＦＦライブラリーにおいて２つのＧＦＰ－ＯＮライブラリーと比較して富化された統計的に有意なサプレッサーエレメントを同定した。リプレッサースクリーンにおけるヒットを示す火山プロットを図２２Ｂに提示する。

【0580】

内因性標的を使用したスクリーン

【0581】

候補異種遺伝子エフェクターのライブラリーを、２種の内因性ヒト遺伝子標的：活性化についてスクリーニングするには低度に発現されるＣＤ４５、または、抑制についてスクリーニングするには高度に発現されるＣＤ７１に対するｓｇＲＮＡを安定に発現する野生型Ｋ５６２細胞においてスクリーニングした（図２１Ｂ）。形質導入された細胞をＦＡＣＳによって富化し、次いで、それぞれに対するフルオロフォアとコンジュゲートした抗体を用いて染色した後、４方向ゲーティングＦＡＣＳビニングを行い、その後、ＮＧＳライブラリー調製および配列決定を上記の通り行った。

【0582】

各ライブラリーについて、異種遺伝子エフェクターに対応する配列決定されたバーコードのアラインメントに基づいてリードカウント行列を生成した。その後のデータ解析は全て、Ｒバージョン４．１．０を使用して実施した。活性化スクリーンのために（ＣＤ４５）、最低ＧＦＰゲート（ＧＦＰ－ＯＦＦ）の２つの反復実験を最高ＧＦＰゲート（ＧＦＰ－ＯＮ）の２つの反復実験と比較して、新規活性化因子を同定した。全ての条件においてリードカウントがゼロのあらゆるバーコードを除去し、次いで、ＤＥＳＥＱ２（バージョン１．３２．０）を使用して、２つのＧＦＰ－ＯＮライブラリーにおいて２つのＧＦＰ－ＯＦＦライブラリーと比較して富化された統計的に有意な活性化因子エレメントを同定した。活性化因子スクリーンにおけるヒットを示す火山プロットを図２３Ａに提示する。リプレッサースクリーン（ＣＤ７１）についての解析も、２つのＧＦＰ－ＯＦＦライブラリーにおいて２つのＧＦＰ－ＯＮライブラリーと比較して富化された統計的に有意なリプレッサーエレメントを同定したこと以外は同一であった。リプレッサースクリーンにおけるヒットを示す火山プロットを図２３Ｂに提示する。
（実施例１０）
内因性ヒト遺伝子座におけるアレイ化フォーマットの異種遺伝子エフェクター検証

【0583】

実施例９のスクリーンにおいて同定された候補異種遺伝子エフェクターを偽発見率（ＦＤＲ）によって順位付けした上位約２００種を個々に再合成し、実験的検証のために、アレイ化９６ウェルプレートフォーマットで一過性プラスミドトランスフェクションによってｄＣａｓＭｉｎｉ発現プラスミドにクローニングした。野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり細胞２０，０００個の密度で播種した。播種の１６時間後、細胞に、ｓｇＲＮＡを発現するプラスミドおよび候補エフェクター複合体（エフェクター－ｄＣａｓＭｉｎｉ融合物）を発現するプラスミドを均一の質量で、アレイ化フォーマットで共トランスフェクトし、したがって、各ウェルに、試験される異なる単一の候補エフェクター構築物がもたらされるが、標的化ｓｇＲＮＡは全てのウェルにわたって同じ（ｓｇＣＸＣＲ４）になるようにした。各ウェルに、エフェクターをコードするプラスミド１００ｎｇおよびｓｇＲＮＡプラスミド５０ｎｇをもたらし、実験を技術的３連で実施した。陰性対照は、ｄＣａｓ９およびいかなるエフェクター融合物も伴わないｄＣａｓＭｉｎｉ発現プラスミドを、標的化ｓｇＲＮＡプラスミドおよび非標的化ｓｇＲＮＡプラスミドと共トランスフェクトしたものであった。陽性対照は、ｄＣａｓ９および標準転写モジュレーター：リプレッサー対照としてＫＲＡＢならびに活性化対照としてｐ６５、Ｒｔａ、ＶＰ６４、およびＶＰＲとのｄＣａｓＭｉｎｉ融合物であった。

【0584】

トランスフェクション後（ｄ．ｐ．ｔ．）３日目および７日目に、細胞を、ＣＸＣＲ４－ＡＰＣとコンジュゲートした抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて染色し、エフェクタープラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミド両方の発現をそれぞれｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰ蛍光によって検証するために、生存しており、シングレットであり、かつ２重トランスフェクトされた細胞を確実に測定するために、解析用ゲート（ＦｌｏｗＪｏ）を用いてフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ）によって解析して、ＣＸＣＲ４タンパク質発現をモニタリングした。各モジュレーターについてのＡＰＣ蛍光の幾何平均を陰性対照に対して正規化し、陰性対照と比べた倍率変化として報告した。

【0585】

いくつかの候補エフェクターの遺伝子発現に対する影響が、２つの独立した実験間および時点間で正に相関することが示された（図２４Ａ；ｘ軸は、３ｄ．ｐ．ｔ．（それぞれ３連で実施した２つの独立した実験のうちの第１の実験）における正規化された蛍光を示し、ｙ軸は、第２の独立した実験（３連で実施した）において測定された正規化された蛍光を示す。データ点は、特に示されていなければｄＣａｓＭｉｎｉ－モジュレーター融合物（ｄＣａｓ９）を表す。候補エフェクターは、「ＥＰＩＣ」で始まる接頭辞、例えば、「ＥＰＩＣＸＶ」、「ＥＰＩＣ９Ｖ」、「ＥＰＩＣＸＨ」、または「ＥＰＩＣ９Ｈ」などとそれに続く数字表示で表示されている。３日目および／もしくは７日目にＣＸＣＲ４発現の上方調節をもたらしたエフェクター（例えば、ＥＰＩＣＸＶ．１、配列番号２３６３１；ＥＰＩＣＸＶ．８、配列番号３５７３７；ＥＰＩＣＸＶ．３、配列番号２３６３９）；ＥＰＩＣＸＶ．１６、配列番号１７６２９；もしくはＥＰＩＣＸＶ．１３、配列番号３８１３８；または３日目および／もしくは７日目にＣＸＣＲ４発現の下方調節をもたらしたエフェクター（例えば、ＥＰＩＣＸＶ．５５、配列番号１９８６０；ＥＰＩＣＸＶ．６６、配列番号４０９８６；ＥＰＩＣＸＶ．７１、配列番号３３８９０）を同定した。これらの候補エフェクターにより、標的遺伝子の発現が対照活性化因子またはサプレッサーと比較して同等またはより優れた程度まで変更された（図２４Ｂ、候補異種遺伝子エフェクターとｄＣａｓＭｉｎｉの融合物についての３ｄ．ｐ．ｔ．における代表的なフローサイトメトリーヒストグラム）。候補エフェクターは対照エフェクターよりも相当に小さいにもかかわらず、標的遺伝子発現の観察される変化を誘導した（図２４Ｃ）。
（実施例１１）
内因性遺伝子座における遺伝子発現モジュレーション

【0586】

本実施例では、ｄＣａｓＭｉｎｉと融合した候補異種遺伝子エフェクターの内因性標的遺伝子の発現に対する効果を実証する。

【0587】

野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、候補エフェクター－ｄＣａｓＭｉｎｉ融合物を発現するプラスミドおよびヒトＩＦＮＧ、ＣＤ４５、またはＣＤ２のプロモーターを標的化するｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを実施例１０と同様に一過性にトランスフェクトした。

【0588】

トランスフェクションの７２時間後に、蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ ＦＬ）によりエフェクタープラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミド両方の発現をそれぞれｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰ蛍光によって検証した後、ＩＦＮＧを標的化するｓｇＲＮＡをトランスフェクトした細胞の上清を収集して、ＩＦＮＧタンパク質発現をＥＬＩＳＡによってモニタリングした。各エフェクターについてのインターフェロンガンマＥＬＩＳＡタンパク質濃度を陰性対照に対して正規化し、陰性対照と比べた倍率変化として報告した。インターフェロンガンマ産生に対する様々効果が観察された（図２５Ａ）。

【0589】

トランスフェクション後２日目に、ＣＤ４５を標的化するｓｇＲＮＡをトランスフェクトした細胞をＡＰＣとコンジュゲートした抗ＣＤ４５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、エフェクタープラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミド両方の発現をそれぞれｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰ蛍光によって検証するために、生存しており、シングレットであり、かつ２重トランスフェクトされた細胞を確実に測定するために、解析用ゲート（ＦｌｏｗＪｏ）を用いてフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ）によって解析した。各エフェクターについてのＡＰＣ蛍光の幾何平均を陰性対照に対して正規化し、陰性対照と比べた倍率変化として報告した。ＣＤ４５発現に対する様々な効果が観察された（図２５Ｂ）。

【0590】

トランスフェクション後３日目および５日目に、ＣＤ２を標的化するｓｇＲＮＡをトランスフェクトした細胞をＡＰＣとコンジュゲートした抗ＣＤ２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、エフェクタープラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミド両方の発現をそれぞれｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰ蛍光によって検証するために、生存しており、シングレットであり、かつ２重トランスフェクトされた細胞を確実に測定するために、解析用ゲート（ＦｌｏｗＪｏ）を用いてフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ）によって解析した。各エフェクターについてのＡＰＣ蛍光の幾何平均を陰性対照に対して正規化し、陰性対照と比べた倍率変化として報告した。ＣＤ２発現に対する様々な効果が観察された（図２５Ｃおよび２５Ｄ）。
（実施例１２）
レポーター細胞における遺伝子発現モジュレーション

【0591】

ＴＲＥ３Ｇプロモーターにより駆動されるＧＦＰレポーターが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、候補エフェクター－ｄＣａｓＭｉｎｉ融合物を発現するプラスミドおよび合成ＴＥＴプロモーターを標的化するｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを実施例１０と同様に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、エフェクタープラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミド両方の発現をそれぞれｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰ蛍光によって検証するために、生存しており、シングレットであり、かつ２重トランスフェクトされた細胞を確実に測定するために、解析用ゲート（ＦｌｏｗＪｏ）を用いてフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ）によって解析して、ＧＦＰ発現をモニタリングした。各エフェクターについてのＧＦＰ蛍光の幾何平均を陰性対照に対して正規化し、陰性対照と比べた倍率変化として報告した。レポーター発現に対する様々な効果が観察された（図２６Ａ）。

【0592】

低発現ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ合成レポーターが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞株ＥＳＲ１２１）を播種し、候補エフェクター－ｄＣａｓＭｉｎｉ融合物を発現するプラスミドおよびレポーターを標的化するｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを実施例１０と同様に一過性にトランスフェクトし、トランスフェクション後２日目に上記の通り解析して、ｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物による転写活性化を測定した。レポーター発現に対する様々な効果が観察された（図２６Ｂ）。
（実施例１３）
レポーター細胞における遺伝子発現の抑制

【0593】

ヒトペプチド配列に由来する候補エフェクターのライブラリーから同定された、抑制活性を有するエフェクターを個々にｄＣａｓＭｉｎｉとの融合として試験した。高発現ＥＦ１αプロモーターによって駆動されるＧＦＰ合成レポーターが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞株ＥＳＲ２２１）を播種し、候補エフェクター－ｄＣａｓＭｉｎｉ融合物または候補エフェクター－ｄＣａｓ９融合物を発現するプラスミドおよびレポーターを標的化するｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを実施例１０と同様に一過性にトランスフェクトし、トランスフェクション後５日目に解析して、ｄＣａｓＭｉｎｉ－エフェクター融合物による転写抑制を測定した。例示的な候補エフェクタードメインＥＰＩＣＸＨ．６（配列番号９０６６）およびＥＰＩＣＸＨ．１（配列番号１１０２）により、レポーター発現の強力な抑制が示された（図２７Ａ）。

【0594】

追加の候補ヒトリプレッサードメインをｄＣａｓ９との融合物として試験した。高発現ＥＦ１αプロモーターによって駆動されるＧＦＰ合成レポーターが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞株ＥＳＲ２２１）を播種し、一過性にトランスフェクトし、トランスフェクション後５日目に上記の通り解析して、転写抑止を測定した。例示的なエフェクタードメインＥＰＩＣ９Ｈ．１（配列番号１１０２）、ＥＰＩＣ９Ｈ．２（配列番号５５４３）、ＥＰＩＣ９Ｈ．３（配列番号２０５７）、ＥＰＩＣ９Ｈ．４（配列番号１５６４６）、ＥＰＩＣ９Ｈ．５（配列番号１１９４８）、およびＥＰＩＣ９Ｈ．６（配列番号９０６６）により、レポーター発現の強力な抑制が示された（図２７Ｂ）。
（実施例１４）
内因性ＣＸＣＲ４遺伝子座における転写に対する効果の耐久性

【0595】

野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＸＣＲ４を標的化するｓｇＲＮＡを発現するプラスミドおよび候補エフェクター複合体（エフェクター－ｄＣａｓＭｉｎｉ融合物）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクション後３日目、７日目、１５日目、および２８日目にＣＸＣＲ４転写モジュレーションについて実施例１０と同様に順次解析した（図２８Ａ、対照エフェクターＫＲＡＢ、ＶＰ６４、およびＶＰＲが白抜きの丸で示されており、新規エフェクターが黒丸で示されており、個々のモジュレーターそれぞれについて、反復実験の平均が表されている）。各時点における選択された個々の新規モジュレーターについての陽性対照と比べた正規化された蛍光値が図２８Ｂに示されており、モジュレーターが各時点における効果量によって順位付けられている。興味深い活性を示した候補異種遺伝子エフェクターには、ＥＰＩＣＸＶ．１（配列番号２３６３１）、ＥＰＩＣＸＶ．９５（配列番号４０９１３）、ＥＰＩＣＸＶ．９２（配列番号２２７０７）、ＥＰＩＣＸＶ．９０（配列番号４２６２３）、ＥＰＩＣＸＶ．６５（配列番号２２１４９）、ＥＰＩＣＸＶ．８０（配列番号２５４３０）、ＥＰＩＣＸＶ．４３（配列番号３４０４７）、ＥＰＩＣＸＶ．５８（配列番号２１１６６）、ＥＰＩＣＸＶ．６９（配列番号２５５５５）、ＥＰＩＣＸＶ．６７（配列番号４０９８５）、ＥＰＩＣＸＶ．７９（配列番号３８７８０）、およびＥＰＩＣＸＶ．７１（配列番号３３８９０）が含まれる。ＥＰＩＣＸＶ．１によるＣＸＣＲ４発現の強力な上方調節を含め、いくつかの候補エフェクターが興味深い活性を示し、活性はどの時点においても観察された。
（実施例１５）
転写に対する効果の耐久性

【0596】

高発現ＥＦ１αプロモーターによって駆動されるＧＦＰ合成レポーターが安定に組み込まれたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、候補エフェクター－ｄＣａｓＭｉｎｉ融合物を発現するプラスミドおよびレポーターを標的化するｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトし、最長でトランスフェクション後７７日目まで順次解析した。ＥＰＩＣＸＶ．６７（配列番号４０９８５）を含めたいくつかの候補異種遺伝子エフェクターについて遺伝子発現の耐久耐久的な抑制が観察された（図２９Ａ、陽性対照抑止エフェクターが破線で示されており、実線は新規モジュレーターである。

【0597】

図２９Ｂに陽性対照ｄＣａｓ９－ＫＡＬ（持続的抑止のための、ｄＣａｓ９と融合したＫＲＡＢ、ＤＮＭＴ３Ａ、およびＤＮＭＴ３Ｌドメインを含む構築物）についてレポーター遺伝子発現が経時的に示されており、時点が進むにつれＧＦＰの抑制が増大することが実証される。陰性対照、陽性対照、および候補異種遺伝子エフェクター（ＥＰＩＣＸＶ．９７）についての代表的なヒストグラムが図２９Ｃに提示されており、候補エフェクターが遺伝子発現に対して強力かつ耐久的な効果を示すことが示される。

【0598】

異種遺伝子エフェクターの発現を示すｍＣｈｅｒｒｙレポーターの発現の縦断的測定により、エフェクターの発現が、６～９ｄ．ｐ．ｔ．後に急激に降下し、その後の時点全体を通して検出不可能なままであることが示された。これにより、９ｄ．ｐ．ｔ．を過ぎてから観察されたいかなる転写に対する効果もエフェクターの発現の維持に起因するものではないことが示唆される（図２９Ｄ）。エフェクタードメイン（２５５ヌクレオチドのコード配列によってコードされる）は対照エフェクター内のドメイン（図２９Ｅ）および融合タンパク質内のドメイン（図２９Ｆ）と比較してサイズが小さいにもかかわらず、遺伝子発現に対する強力かつ耐久的な効果が観察された。

【0599】

トランスフェクション後７７日目に収集したデータから、いくつかの候補異種遺伝子エフェクターにより、この時点まで持ちこたえた様々な程度の標的遺伝子発現の抑制が示されたことが示された（図２９Ｇ）。発現に対する耐久的な効果を示すエフェクターには、ＥＰＩＣＸＶ．６７（配列番号４０９８５）、ＥＰＩＣＸＶ．９２（配列番号２２７０７）、ＥＰＩＣＸＶ．９０（配列番号４２６２３）、ＥＰＩＣＸＶ．９５（配列番号４０９１３）、ＥＰＩＣＸＶ．８０（配列番号２５４３０）、ＥＰＩＣＸＶ．５８（配列番号２１１６６）、ＥＰＩＣＸＶ．４３（配列番号３４０４７）、ＥＰＩＣＸＨ．１（配列番号１１０２）、ＥＰＩＣＸＶ．７９（配列番号３８７８０）、ＥＰＩＣＸＶ．７１（配列番号３３８９０）、およびＥＰＩＣＸＶ．６９（配列番号２５５５５）が含まれた。
（実施例１６）
内因性レポーターデータと合成レポーターデータの比較

【0600】

異種遺伝子エフェクターについて収集したデータを、内因性遺伝子ＣＸＣＲ４およびＥＳＲ－ＧＦＰ合成レポーター細胞の発現に対する効果について比較した（図３０；同定されたエフェクターには、ＥＰＩＣＸＶ．８１（配列番号２１０１５）、ＥＰＩＣＸＶ．８７（配列番号３２６７８）、および本明細書に記載の他のエフェクターが含まれる）。ＥＳＲ－ＧＦＰ合成レポーター細胞における正規化されたＧＦＰ蛍光（３ｄ．ｐ．ｔ．から７７ｄ．ｐ．ｔ．までの全ての時点にわたって平均したもの；ｙ軸）と正規化されたＣＸＣＲ４－ＡＰＣ蛍光（３ｄ．ｐ．ｔ．から２８ｄ．ｐ．ｔ．までの全ての時点にわたって平均したもの；ｘ軸）の間に相関を観察することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図29-1】

【図29-2】

【図29-3】

【図30】

【配列表】

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【国際調査報告】