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特表2024-526909非天然アミノ酸及びその使用、それを含有する組換えタンパク質、並びに組換えタンパク質コンジュゲート
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】非天然アミノ酸及びその使用、それを含有する組換えタンパク質、並びに組換えタンパク質コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C07C 271/22 20060101AFI20240711BHJP
C07K 14/61 20060101ALI20240711BHJP
C07C 271/54 20060101ALI20240711BHJP
C07C 235/12 20060101ALI20240711BHJP
C07C 237/12 20060101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
C07C271/22 CSP
C07K14/61 ZNA
C07C271/54
C07C235/12
C07C237/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503678
(86)(22)【出願日】2021-07-29
(85)【翻訳文提出日】2024-01-17
(86)【国際出願番号】 CN2021109276
(87)【国際公開番号】W WO2023004686
(87)【国際公開日】2023-02-02
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524024074
【氏名又は名称】ノヴォコデックス バイオファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100166729
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 幸子
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ジンウェイ
(72)【発明者】
【氏名】イェ チェンハオ
(72)【発明者】
【氏名】シア ガン
(72)【発明者】
【氏名】フオ ペンチャオ
(72)【発明者】
【氏名】ディン ウェン
(72)【発明者】
【氏名】チェン ロンフェイ
(72)【発明者】
【氏名】ジャオ リン
(72)【発明者】
【氏名】ファン ハオ
(72)【発明者】
【氏名】ヘン シン
(72)【発明者】
【氏名】チュー ジンジン
(72)【発明者】
【氏名】イン ユエビン
(72)【発明者】
【氏名】リャン シュエジュン
【テーマコード（参考）】
4H006
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB20
4H006RA16
4H006RB04
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA50
4H045CA40
4H045DA31
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA74
(57)【要約】
本発明では、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物又はその鏡像異性体である非天然アミノ酸が提供されている。また、前記非天然アミノ酸の使用が提供されている。さらに、前記非天然アミノ酸を含有する組換えタンパク質及び前記組換えタンパク質から製造されたタンパク質コンジュゲートが提供されている。前記非天然アミノ酸は、製造が簡便で、安全性が良好で、タンパク質に挿入された場合に失活しにくく、カップリング部分との結合率が高く、得られたコンジュゲートの安定性もより高い、前記非天然アミノ酸は、多くの分野、特に組換えタンパク質又は組換えタンパク質コンジュゲートの製造に適用することができる。
【化１】
【選択図】なし
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）で表される構造を有する化合物又はその鏡像異性体であり、【化1】
前記Ｘ、Ｚ及びＡが夫々独立に置換された基を示す場合、置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロ基、アリール基、ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数である、
ことを特徴とする非天然アミノ酸。
【請求項2】
前記置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、Ｃ４～Ｃ１０ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数であり、好ましくは、前記Ｘ及びＺは夫々独立に、Ｃ０～Ｃ１０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、好ましくはＣ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－から選ばれた１つ又は複数に置換可能であり、より好ましくは、前記ＸとＺは同時にＣ０アルキレン基ではなく、及び／又は、
前記Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ１０アリール基を示し、より好ましくは、前記Ａは置換され若しくは置換されないフェニル基又はナフチル基を示す、
ことを特徴とする請求項１に記載の非天然アミノ酸。
【請求項3】
前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－１）で表される構造を有する化合物であり、【化2】
好ましくは、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－２）で表される構造を有する化合物であり、
【化3】
Ｒ１、Ｒ２は夫々独立に、水素、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、又はＣ４～Ｃ１０ヘテロアリール基を示す、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の非天然アミノ酸。
【請求項4】
前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－３）、式（Ｉ－４）、式（Ｉ－５）、又は式（Ｉ－６）で表される構造を有する化合物であり、【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
前記Ｒ１、Ｒ２は夫々独立に請求項３で定義されたものである、
ことを特徴とする請求項３に記載の非天然アミノ酸。
【請求項5】
前記非天然アミノ酸は、下記の何れか１つで表される構造を有する化合物である、【化8】
【請求項6】
請求項１乃至５の何れか一項に記載の非天然アミノ酸の組換えタンパク質又は組換えタンパク質コンジュゲートの製造における使用であって、好ましくは、前記組換えタンパク質は組換えヒト成長ホルモンであり、若しくは、好ましくは、前記組換えタンパク質コンジュゲートは組換えヒト成長ホルモンとポリエチレングリコールのコンジュゲートである、前記の使用。
【請求項7】
アミノ酸配列の少なくとも１つの部位に請求項１乃至５の何れか一項に記載の非天然アミノ酸が配列されている、ことを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項8】
請求項７に記載の組換えタンパク質中の非天然アミノ酸のカルボニル末端基と「ＮＨ２－Ｏ－」末端基含有カップリング部分がオキシム結合を形成することにより形成される、ことを特徴とする組換えタンパク質コンジュゲート。
【請求項9】
前記組換えタンパク質は組換えヒト成長ホルモンであり、前記「ＮＨ２－Ｏ－」末端基含有カップリング部分は「ＮＨ２－Ｏ－」末端基含有ポリエチレングリコールであり、好ましくは、分子量が１０～１００ＫＤのポリエチレングリコールであり、より好ましくは、前記組換えヒト成長ホルモンのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りであり、
さらに好ましくは、前記アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応する１０７位には請求項１乃至５の何れか一項に記載の非天然アミノ酸が配列されている、
ことを特徴とする請求項８に記載の組換えタンパク質コンジュゲート。
【請求項10】
請求項９に記載の組換えタンパク質コンジュゲートの、内因性成長ホルモンの分泌不足による成長発達障害治療用薬物、ターナー症候群による成長発達障害治療用薬物又は成人成長ホルモン欠乏症治療用薬物の製造における用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物製薬分野に関し、具体的には、非天然アミノ酸、前記非天然アミノ酸を含有する組換えタンパク質、及び前記組換えタンパク質のコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質に特殊な基を含有する非天然アミノ酸を導入することにより、多種の科学研究及び製品開発応用を実現することができ、例えば、タンパク質に感光性非天然アミノ酸を導入したり、非天然アミノ酸に特殊なマークを付与したりすることで、タンパク質間の相互作用の研究を容易にすることができる。また例えば、酵素活性や酵素の安定性が高くなったり、酵素の効率的な固定化が容易になったりするように、非天然アミノ酸を用いて酵素の配向を改変させる。さらに例えば、通常の宿主では非天然アミノ酸の挿入が不可であるという特徴を利用して、安全な生菌又は生ウイルスワクチンを製造することができる。コドン拡張技術による非天然アミノ酸のタンパク質への導入に関する１つの重要な使用として、タンパク質を部位特異的に修飾することでタンパク質の機能、安定性、半減期などの特徴を変化させ、且つ新規な生物薬の開発に用いることが可能である。現在、ＰＥＧが部位特異的にカップリングされた組換えヒト成長ホルモンによる長い効果を持つ組換えタンパク質の製造や、小分子毒素が部位特異的にカップリングされたモノクローナル抗体による抗体カップリング薬物の開発などの一連の成果がある。このことから分かるように、非天然アミノ酸は非常に重要な作用及び非常に広範な適用分野を有する。
【0003】
従来の技術（例えばＣＮ１０２８３８６７１Ｂ、ＣＮ１０６１４６６６３Ａ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，８７２０など）では非天然アミノ酸Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏが開示され、その構造式は以下の通りであった。
【0004】
【化1】
【化2】
【0005】
したがって、アミノ酸の種類及び使用を拡大するために、構造が新規で、製造が簡便で、コストが安い非天然アミノ酸を開発することは期待されている。
【発明の概要】
【0006】
従来の技術に存在する上記の欠点を解消するために、本発明の１つの目的は、非天然アミノ酸を提供することにある。
【0007】
本発明の別の目的は、前記非天然アミノ酸の使用を提供することにある。
【0008】
本発明のさらに別の目的は、組換えタンパク質及び組換えタンパク質コンジュゲートを提供することにある。
【0009】
本発明で提供される非天然アミノ酸は、式（Ｉ）で表される構造を有する化合物又はその鏡像異性体であり、
式中、Ｘ及びＺは夫々独立に、置換され若しくは置換されないＣ０～Ｃ２０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－から選ばれた１つ又は複数に置換可能であり、Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）－又は－ＣＨ２－を示し、Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ２０のアリール基を示し、
前記Ｘ、Ｚ及びＡが夫々独立に置換された基を示す場合、置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基（ｓｕｌｆｏｎｙｌ）、スルフィニル基（ｓｕｌｆｉｎｙｌ）、シクロアルキル基、ヘテロシクロ基、アリール基、ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数である。
【化3】
前記Ｘ、Ｚ及びＡが夫々独立に置換された基を示す場合、置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基（ｓｕｌｆｏｎｙｌ）、スルフィニル基（ｓｕｌｆｉｎｙｌ）、シクロアルキル基、ヘテロシクロ基、アリール基、ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数である。
【0010】
実施例１１に示すように、本発明の発明者は、コストが暴騰し、生産プロセスが複雑であることに加えて、Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏの末端にあるアジド構造（－Ｎ３）はタンパク質に挿入された際にアミノ構造（－ＮＨ２）に還元されやすいため、カップリング活性が失われやすく、よって、この還元反応によって製造過程中の収率が低下してしまうことを見出した。
【化4】
【0011】
本発明で提供される非天然アミノ酸は、その末端に活性反応基としてカルボニル基が導入されたものであり、構造が新規で、製造が簡便であるだけでなく、カップリング条件が温和で、生産コストが低く、タンパク質配列に挿入された場合に構造の変化が発生しにくいため、反応活性が失われにくい。本発明で提供される非天然アミノ酸は、末端基カルボニル基に結合されたアリール基も含有したものであり、アリール基の導入によって、得られたコンジュゲートの安定性がより強くなり、低いｐＨ条件下でもコンジュゲートが分解しにくい。また、本発明で提供される非天然アミノ酸は、所定の鎖長のアルキレン基も含有したものであり、化合物の柔軟性が良好で、多種のコンジュゲートを形成することがより一層容易になる。
【0012】
本発明で提供される非天然アミノ酸では、「Ｃ０～Ｃｎ」はＣ０～Ｃ１、Ｃ０～Ｃ２、…Ｃ０～Ｃｎを含み、それがＣ０を示す場合、この基が存在しないことを意味しており、その両端にあるＣ原子が直接連結して結合になっている。例を挙げて説明すると、前記「Ｃ０～Ｃ６」基とは、該当する部分に０～６個の炭素原子を含有し、即ち、基が存在しなく、１個の炭素原子含有、２個の炭素原子含有、３個の炭素原子含有、４個の炭素原子含有、５個の炭素原子含有、又は６個の炭素原子含有を指す。前記「Ｃ６～Ｃ１０」基とは、該当する部分に６～１０個の炭素原子を含有し、即ち、６個の炭素原子含有、７個の炭素原子含有、８個の炭素原子含有、９個の炭素原子含有、又は１０個の炭素原子含有を指す。
【0013】
本発明に係る非天然アミノ酸では、「アリール基」とは、１個又は２個の環を含有する炭素環式芳香族系を指し、ここでかかる環は縮合様式で一緒に連結され得る。「アリール基」は、フェニル基、ナフチル基、テトラヒドロナフチル基の芳香族基などの単環式又は二環式のアリール基を含む。アリール基は、好ましくはＣ６～Ｃ１０アリール基、より好ましくはフェニル基、ナフチル基、最も好ましくはフェニル基である。
【0014】
本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記置換基は、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、Ｃ４～Ｃ１０ヘテロアリール基から選ばれた１つ又は複数である。
【0015】
本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記Ｘ及びＺは夫々独立に、Ｃ０～Ｃ１０の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－から選ばれた１つ又は複数に置換可能である。本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、前記Ｘ及びＺは夫々独立に、Ｃ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ２－は任意的に－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－から選ばれた１つ又は複数に置換可能である。本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、前記ＸとＺは同時にＣ０アルキレン基ではなく、言い換えれば、Ｘ基とＺ基は共に存在しないことが許可されない。
【0016】
本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記Ａは置換され若しくは置換されないＣ６～Ｃ１０アリール基を示し、より好ましくは、前記Ａは置換され若しくは置換されないフェニル基又はナフチル基を示す。
【0017】
本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－１）で表される構造を有する化合物であり、
式中、前記Ｘ、Ｚ及びＡは夫々独立に上述した技術案のうちの何れか１項で定義されたものである。
【化5】
【0018】
本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－２）で表される構造を有する化合物であり、
式中、前記Ｘは上述した技術案のうちの何れか１項で定義されたものであり、
Ｒ１、Ｒ２は夫々独立に、水素、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、又はＣ４～Ｃ１０ヘテロアリール基を示す。
【化6】
Ｒ１、Ｒ２は夫々独立に、水素、ヒドロキシル基、メルカプト基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、アシル基、アミド基、カルボキシル基、エステル基、アミノ基、スルホニル基、スルフィニル基、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロ基、Ｃ６～Ｃ２０アリール基、又はＣ４～Ｃ１０ヘテロアリール基を示す。
【0019】
本発明による幾つかの比較的好ましい実施形態では、前記非天然アミノ酸は、式（Ｉ－３）、式（Ｉ－４）、式（Ｉ－５）、又は式（Ｉ－６）で表される構造を有する化合物であり、
式中、Ｘ’はＣ０～Ｃ６の直鎖アルキレン基を示し、より好ましくはＣ０～Ｃ４の直鎖アルキレン基を示し、そのうちの１つ又は複数の－ＣＨ２－は任意的に－Ｏ－及び／又は－ＮＨ－に置換可能であり、
前記Ｒ１、Ｒ２は夫々独立に上述した技術案のうちの何れか１項で定義されたものである。
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
前記Ｒ１、Ｒ２は夫々独立に上述した技術案のうちの何れか１項で定義されたものである。
【0020】
本発明で提供される非天然アミノ酸は、光学的に純粋な鏡像異性体及びラセミ体を含む。
【0021】
本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、本発明で提供される非天然アミノ酸は、下記の何れか１つで表される構造を有する化合物である。
【化11】
【0022】
本発明ではさらに、上述した技術案のうちの何れか１項に記載された非天然アミノ酸の組換えタンパク質又は組換えタンパク質コンジュゲートの製造における使用が提供されている。
【0023】
本発明に係る使用では、組換えタンパク質は、上述した技術案のうちの何れか１項に記載された非天然アミノ酸が当分野でよく見られる任意の種類のタンパク質に任意の部位、任意の数で挿入されて得られた組換えタンパク質である。組換えタンパク質コンジュゲートは、得られた任意の組換えタンパク質が当分野でよく見られるカップリング部分とカップリングして得られたコンジュゲートであり、ここで、カップリング部分は、ポリマー（例えば任意分子量を持つポリエチレングリコール）、タンパク質、ポリペプチド、又は小分子薬物から選ばれた１つ又は複数を含むが、これらに限定されるものではない。
【0024】
本発明による幾つかの好ましい実施形態では、組換えタンパク質は組換えヒト成長ホルモンであり、組換えタンパク質コンジュゲートは組換えヒト成長ホルモンとポリエチレングリコールのコンジュゲートである。
【0025】
本発明ではさらに、アミノ酸配列の少なくとも１つの部位に上述した技術案のうちの何れか１項に記載された非天然アミノ酸が配列されている組換えタンパク質が提供されている。
【0026】
さらに、前記組換えタンパク質は、式（ＩＩ）で表される構造を有し、
式（ＩＩ）中、Ｄは上述した技術案のうちの何れか１項に記載された非天然アミノ酸からアミノカルボン酸部分が除去された残基を示し、Ｐ１、Ｐ２はそれぞれ、前記非天然アミノ酸中のアミノ基とカルボキシル基の前記アミノ酸配列における連結部分を示す。
【化12】
【0027】
本発明で提供される組換えタンパク質は、当分野でよく見られる製造方法によって製造できるものであり、例えば、遺伝子コドン拡張技術を用いて非天然アミノ酸を含有する組換えタンパク質のクローニング及び発現を実現することができる。
【0028】
本発明で提供される組換えタンパク質は、上述した技術案のうちの何れか１項に記載された非天然アミノ酸が当分野でよく見られる任意の種類のタンパク質に任意の部位、任意の数で挿入されて得られた組換えタンパク質、例えば組換えヒト成長ホルモンである。
【0029】
本発明ではさらに、上述した技術案のうちの何れか１項に記載された組換えタンパク質中の非天然アミノ酸のカルボニル末端基と「ＮＨ２－Ｏ－」末端基含有カップリング部分がオキシム結合を形成することにより形成される組換えタンパク質コンジュゲートが提供されている。
【0030】
さらに、前記組換えタンパク質コンジュゲートは、式（ＩＩＩ）で表される構造を有するものであり、
式（ＩＩＩ）中、Ｄ’は上述した技術案のうちの何れか１項に記載された組換えタンパク質から非天然アミノ酸のカルボニル末端基部分が除去された残基を示し、Ｄ”はカップリング部分から「ＮＨ２－Ｏ－」末端基が除去された残基を示す。
【化13】
【0031】
本発明で提供される組換えタンパク質コンジュゲートでは、カップリング部分は、ポリマー（例えば任意分子量を持つポリエチレングリコール）、タンパク質、ポリペプチド、又は小分子薬物から選ばれた１つ又は複数を含む。異なる種類のカップリング部分は単独で組換えタンパク質とカップリングしてもよいし、異なる種類のカップリング部分は連結してから組換えタンパク質とカップリングしてもよい。
【0032】
本発明による幾つかの好ましい実施形態では、前記組換えタンパク質は組換えヒト成長ホルモンであり、前記「ＮＨ２－Ｏ－」末端基含有カップリング部分は「ＮＨ２－Ｏ－」末端基含有ポリエチレングリコールである。
【0033】
本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、「ＮＨ２－Ｏ－」末端基含有ポリエチレングリコールは、下記の構造式を有する。
【0034】
【化14】
【0035】
本発明による幾つかのより好ましい実施形態では、前記組換えヒト成長ホルモンのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りであり、さらに好ましくは、前記アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応する１０７位には上述した技術案のうちの何れか１項に記載された非天然アミノ酸が配列されている。
【0036】
組換えタンパク質が組換えヒト成長ホルモンである場合、本発明ではさらに、上述した技術案のうちの何れか１項に記載された組換えタンパク質コンジュゲートの、内因性成長ホルモンの分泌不足による成長発達障害治療用薬物、ターナー症候群による成長発達障害治療用薬物又は成人成長ホルモン欠乏症治療用薬物の製造における用途が提供されている。
【0037】
本発明で提供される技術案は、下記の利点を有する。
【0038】
（１）本発明で提供される非天然アミノ酸は、その構造にカルボニル末端基及びそれに連結されたアリール基が導入されたものであり、現在のアジド末端基を持つ非天然アミノ酸（例えばＬｙｓ－ａｚｉｄｏ）に比べ、製造がより簡便で、安全性がより良好で、タンパク質に挿入された時に失活しにくく、カップリング部分との結合率がより高く、得られたコンジュゲートの安定性もより高い。
【0039】
（２）本発明で提供される非天然アミノ酸は、アミノ酸誘導体として、それ自体がアミノ酸の特性を有することができ、それによってアミノ酸の潜在的な種類が多くなっており、アミノ酸誘導体として多くの分野、特に組換えタンパク質又は組換えタンパク質コンジュゲートの製造に適用することができる。
【0040】
（３）本発明で提供される非天然アミノ酸は、原核発現系及び真核発現系中で成功識別されてタンパク質に挿入され、さらに特定の部位に非天然アミノ酸を含有するタンパク質を生成することができ、それによって、異なる理化学的特性、生化学的活性を有する組換えタンパク質を形成することができ、タンパク質の種類及び潜在的な使用範囲が広くなっている。また、本発明の非天然アミノ酸は、タンパク質中で発現効率が高く、実用性がより良好である。
【0041】
（４）本発明で提供される組換えタンパク質は、本発明の非天然アミノ酸を含有したものであり、それが含有する末端活性基カルボニル基によってタンパク質コンジュゲート（又はカップリング体）が容易に形成でき、例えば、ポリエチレングリコールコンジュゲート、ポリエチレングリコール－活性薬物コンジュゲートなどが挙げられる。これらのタンパク質コンジュゲートは、性能が改良されたため、多種の改良済み生物活性（例えば抗腫瘍活性）を有するものである。
【0042】
（５）本発明ではさらに、新規なタンパク質コンジュゲートプラットフォームが提供され、タンパク質に含有されている新規な非天然アミノ酸及びそれに連結されたカップリング部分によって、多種のタンパク質、多種のカップリング部分の結合を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【図1】実施例８における組換えヒト成長ホルモン発現プラスミドｐＥＴ２１－ｒｈＧＨ１０７のプロファイルである。
【図2】実施例８で得られた異なる種類の非天然アミノ酸が添加された発酵生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、図中の各レーンはそれぞれ下記のことを示す：レーン１：タンパク質分子量マーカー、レーン２：野生型組換えヒト成長ホルモン、レーン３：ＮＢＯＫが投与された組換えヒト成長ホルモン発現物、レーン４：ＮＰＡＫが投与された組換えヒト成長ホルモン発現物、レーン５：ＮＢＰＫが投与された組換えヒト成長ホルモン発現物、レーン６：ＮＢＧＫが投与された組換えヒト成長ホルモン発現物、レーン７：ＮＰＯＫが投与された組換えヒト成長ホルモン発現物、レーン８：ＮＰＯＫ－２が投与された組換えヒト成長ホルモン発現物、レーン９：ＮＢＧＫ－２が投与された組換えヒト成長ホルモン発現物、レーン１０：非天然アミノ酸が一切添加されない組換えヒト成長ホルモン発現物。
【図3】実施例８における非天然アミノ酸を含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、図中の各レーンはそれぞれ下記のことを示す：レーン１：分子量マーカー、レーン２：野生型組換えヒト成長ホルモン、レーン３：ＮＢＯＫを含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物、レーン４：ＮＰＡＫを含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物、レーン５：ＮＢＰＫを含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物、レーン６：ＮＢＧＫを含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物、レーン７：ＮＰＯＫを含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物、レーン８：ＮＰＯＫ－２を含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物。
【図4】実施例８における精製済みのＰＥＧがカップリングされた組換えヒト成長ホルモンのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図であり、図中の各レーンはそれぞれ下記のことを示す：レーン１：分子量マーカー、レーン２：組換えヒト成長ホルモン標準品、レーン３：ＮＰＯＫを含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物、レーン４：ＮＢＯＫを含有する組換えヒト成長ホルモンとＰＥＧのカップリング生成物。
【図6】実施例９におけるＣＨＯ細胞への非天然アミノ酸挿入の瞬時発現を示す蛍光顕微鏡画像である。
【図7】実施例１０における発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＵＡＧ１４２のプロファイルである。
【図8A】実施例１０におけるＮＢＰＫ含有トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＮＢＯＫ含有トラスツズマブ、及びＮＰＯＫ－２含有トラスツズマブに毒素がカップリングされた後のＨＩＣ－ＨＰＬＣスペクトルである。
【図8B】実施例１０におけるＮＢＰＫ含有トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＮＢＯＫ含有トラスツズマブ、及びＮＰＯＫ－２含有トラスツズマブに毒素がカップリングされた後のＨＩＣ－ＨＰＬＣスペクトルである。
【図8C】実施例１０におけるＮＢＰＫ含有トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＮＢＯＫ含有トラスツズマブ、及びＮＰＯＫ－２含有トラスツズマブに毒素がカップリングされた後のＨＩＣ－ＨＰＬＣスペクトルである。
【図9】実施例１０におけるＮＢＯＫ含有トラスツズマブとＤＭ１で修飾したＮＢＯＫ含有トラスツズマブのそれぞれによるＢＴ－４７４細胞への抑制効果を示す図である。
【図10A】実施例１１における１４０位がＬｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異したｒｈＧＨ及び１４０位がＮＢＯＫに突然変異したｒｈＧＨの質量スペクトル図である。
【図10B】実施例１１における１４０位がＬｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異したｒｈＧＨ及び１４０位がＮＢＯＫに突然変異したｒｈＧＨの質量スペクトル図である。
【図11A】実施例１１における１４０位がＬｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異したｒｈＧＨ及び１４０位がＮＢＯＫに突然変異したｒｈＧＨのそれぞれと３０ＫＤ ＰＥＧとのカップリング過程のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。図１１Ａ中の各レーンはそれぞれ下記のことを示す：レーン１：分子量マーカー、レーン２：野生型組換えヒト成長ホルモン、レーン３：ｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０、レーン４：ｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０と３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧが１：１５（モル比であり、以下では同じ）で７２時間カップリング反応した生成物、レーン５：ｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０と３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧが１：２５で７２時間カップリング反応した生成物。
【図11B】図１１Ｂ中の各レーンはそれぞれ下記のことを示す。レーン１：分子量マーカー、レーン２：ｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０、レーン３：ｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０と３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧが１：１５で６時間カップリング反応した生成物、レーン４：ｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０と３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧが１：１５で９時間カップリング反応した生成物、レーン５：ｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０と３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧが１：１５で１２時間カップリング反応した生成物、レーン６：ｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０と３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧが１：１５で２４時間カップリング反応した生成物、レーン７：ｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０と３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧが１：１５で４８時間カップリング反応した生成物。
【発明を実施するための形態】
【0044】
以下、本発明の技術案について具体的な実施例を用いてさらに詳細に説明する。
【0045】
本発明の実施例で使用される試薬又は原料は、特に説明しない限り、市販品である。
【0046】
実施例１：非天然アミノ酸ＮＢＯＫの製造
ＮＢＯＫの構造式は、以下に示す通りであった。
ＮＢＯＫの構造式は、以下に示す通りであった。
【0047】
【化15】
【0048】
【化16】
【0049】
ａ）反応フラスコに、ｐ－メチルアセトフェノン（４．０ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（５０．０ｍＬ）を加え、ＮＢＳ（６．４１ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及びＢＰＯ（０．０５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を８０℃で２４時間還流した後、容器を氷水に入れて冷却し、固体を析出させ、固体をろ過除去し、飽和Ｎａ２ＣＯ３で３回洗浄し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物１－１（５．４６ｇ、収率８５％）を獲得し、粗生成物１－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0050】
ｂ）反応フラスコに、生成物１－１（２．７３ｇ、１２．８０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（４０ｍＬ）及び水（４０ｍＬ）を加え、さらに炭酸カルシウム（７．６８ｇ、７６．８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１０５℃で２４時間還流した後、室温に冷却させ、固体をろ過除去し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝３：１）により精製した後、生成物１－２（１．８０ｇ、収率９４％）を獲得した。
【0051】
ｃ）二口型反応フラスコに、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（２．９０ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（１０．０ｍＬ）を加え、０℃に降温し、生成物１－２（１．８０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）及びピリジン（１．２ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した後、反応液に飽和炭酸ナトリウム溶液（１０ｍＬ）を加え、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で３回抽出し、有機相を合併し、水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝５：１）により精製した後、生成物１－３（３．１４ｇ、収率８３％）を獲得した。
【0052】
ｄ）反応フラスコに、生成物１－３（１．２６ｇ、４．０ｍｍｏｌ）及びＦｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（１．４０ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（１５ｍＬ）及び水（５ｍＬ）を加え、さらにトリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で２４時間反応させた後、１Ｍ ＨＣｌ溶液を適量で加え、ＤＣＭで抽出し、減圧濃縮した後、粗生成物１－４を獲得し、粗生成物１－４を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0053】
ｅ）反応フラスコ中で、生成物１－４（１．１０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、ジエチルアミン（５．０ｍＬ）を加え、室温で６時間反応させ、生成物を析出させ、ろ過後にＤＣＭで３回ビーティングしたと、目的生成物ＮＢＯＫ（１－５、８１７ｍｇ、２段階収率６３％）を獲得した。
【0054】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ８．０４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），１．９５－１．８３（ｍ，２Ｈ），１．６２－１．５２（ｍ，２Ｈ），１．４７－１．３５（ｍ，２Ｈ）．
【0055】
実施例２：非天然アミノ酸ＮＰＡＫの製造
ＮＰＡＫの構造式は、以下に示す通りであった。
ＮＰＡＫの構造式は、以下に示す通りであった。
【0056】
【化17】
【0057】
【化18】
【0058】
ａ）反応フラスコに、ｐ－クロロアセトフェノン（１．００ｇ、６．４７ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、マロン酸ジエチル（６．８４ｇ、４７．７０ｍｍｏｌ）、ＫＨＣＯ３（０．９７ｇ、９．７０ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１．３４ｇ、９．７０ｍｍｏｌ）を加え、さらにＰｄ（ｄｂａ）２（０．０１９ｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）及びＰ（ｔ－Ｂｕ）３ＨＢＦ４（０．０２１ｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を加え、加えが完了した後、窒素保護を置換し、１６０℃に昇温して４０時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、反応液に水（３０ｍＬ）を加え、ＥＡで３回抽出し、有機相を合併し、水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、０～５℃で減圧濃縮し、無色透明液体を獲得し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝１０：１）により精製した後、生成物２－１（０．８０ｇ、収率６０％）を獲得した。
【0059】
ｂ）反応フラスコに、ＬｉＯＨ（０．３０ｇ、１１．６４ｍｍｏｌ）及び水（５．０ｍＬ）を加え、エタノール（１０ｍＬ）を加え、生成物２－１（０．８０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した後、ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、反応液に２Ｍ ＨＣｌ溶液を加えてｐＨを１～２に調節し、ＥＡで３回抽出し、有機相を合併し、水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、生成物２－２（０．５ｇ、収率７２％）を獲得した。
【0060】
ｃ）反応フラスコに、生成物２－２（０．２０ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ、０．１９ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．０７ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（２．０ｍＬ）をこの順に加えた。０～５℃に降温した後、ＤＣＣ（０．２３ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）とＤＣＭ（２．０ｍＬ）の溶液を加え、２時間保温しながら反応させた。室温に昇温して一晩撹拌した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、ろ過し、ＤＣＭで洗浄し、母液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝５：１）により精製した後、生成物２－３（０．１９ｇ、収率６２％）を獲得した。
【0061】
ｄ）反応フラスコに、生成物２－３（０．１０ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、トリエチルアミン（０．０４ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（０．１３ ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ジオキサン（２．０ｍＬ）及び水（２．０ｍＬ）をこの順に加え、室温で１８時間撹拌しながら反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、減圧濃縮し、ＥＡで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１５：１）により精製した後、油状の液体生成物２－４（０．０３ｇ、収率６１％）を獲得した。
【0062】
ｅ）反応フラスコに、生成物２－４（０．０８ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）及びピペリジン（０．０４ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、減圧濃縮し、石油エーテル（５ｍＬ）で１時間ビーティングし、ろ過し、得られたろ過ケーキを石油エーテル（５ｍＬ）で１時間ビーティングし、ろ過し、得られたろ過ケーキをエタノールで４回繰り返しビーティングして残留ピペリジンを除去し、最終的にオフホワイト固体２－５（０．０２ｇ、収率４３％）を獲得した。
【0063】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ７．８５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），３．９４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．５６（ｓ，２Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），１．８０－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．５４－１．４５（ｍ，２Ｈ），１．４０－１．２２４（ｍ，２Ｈ）．
【0064】
実施例３：非天然アミノ酸ＮＢＰＫの製造
ＮＢＰＫの構造式は、以下に示す通りであった。
ＮＢＰＫの構造式は、以下に示す通りであった。
【0065】
【化19】
【0066】
【化20】
【0067】
ａ）反応フラスコに、ｐ－メチルアセトフェノン（４．０ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（５０．０ｍＬ）を加え、ＮＢＳ（６．４１ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及びＢＰＯ（０．０５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を８０℃で２４時間還流した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、容器を氷水に入れて冷却し、固体を析出させ、固体をろ過除去し、飽和Ｎａ２ＣＯ３で３回洗浄し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物３－１（５．４６ｇ、収率８５％）を獲得し、粗生成物３－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0068】
ｂ）反応フラスコに、ＮａＨ（０．５８ｇ、１４．６４ｍｍｏｌ、６０％）を加え、乾燥溶媒ＴＨＦ（２０ｍＬ）を加え、氷浴冷却下、エチレングリコール（６．７ｍＬ、１２２．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、室温条件下で１時間撹拌した。次いで、生成物３－１（２．６０ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で４８時間加熱還流して完全に反応させた。氷浴冷却下、飽和ＮＨ４Ｃｌをゆっくり滴下してＮａＨを急冷し、水で洗浄し、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝２：１）により精製した後、生成物３－２（１．３９ｇ、収率５９％）を獲得した。
【0069】
ｃ）反応フラスコに、生成物３－２（１．３９ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（１０ｍＬ）を加え、氷浴冷却下、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（１．７４ｇ、８．６４ｍｍｏｌ）及びピリジン（０．７ｍＬ、８．６４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、水を加えて洗浄し、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＰＥ：ＥＡ＝３：１）により精製した後、生成物３－３（２．２７ｇ、収率８８％）を獲得した。
【0070】
ｄ）反応フラスコに、生成物３－３（２．２７ｇ、６．３２ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（１６ｍＬ）及び水（４ｍＬ）を加え、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（２．１３ｇ、５．２７ｍｍｏｌ）を加え、さらにトリエチルアミン（１．８５ｍＬ、１３．２ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌して完全に反応させた。１Ｍ ＨＣｌを適量で加えてｐＨを２程度に調節し、酢酸エチルで抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物３－４を獲得し、粗生成物３－４を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0071】
ｅ）反応フラスコ中で、前の工程で獲得した生成物３－４をＤＣＭ（１０ ｍＬ）に溶解させ、ジエチルアミン（５ｍＬ）を加え、室温で６時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４０：１０：１）により精製した後、白色固体生成物（３－５、０．９５ ｇ、２段階収率４９％）を獲得した。
【0072】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ８．０４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），３．８１（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１６－３．０８（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），１．９７－１．７９（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．４８（ｍ，２Ｈ），１．４８－１．３５（ｍ，２Ｈ）．
【0073】
実施例４：非天然アミノ酸ＮＰＯＫの製造
ＮＰＯＫの構造式は、以下に示す通りであった。
ＮＰＯＫの構造式は、以下に示す通りであった。
【0074】
【化21】
【0075】
【化22】
【0076】
ａ）反応フラスコに、トリホスゲン（Ｔｒｉｐｈｏｓｇｅｎｅ）（ＢＴＣ、２．１８ ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＴＨＦ（１０．０ｍＬ）を加え、氷浴冷却下、ｐ－ヒドロキシアセトフェノン（２．０ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及びピリジン（１．５ｍＬ、１７．６４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で２４時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、水を適量で加え、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、有機相を合併した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物４－１（１．２０ｇ）を獲得し、粗生成物４－１をそのまま次の工程に使用した。
【0077】
ｂ）反応フラスコに、Ｂｏｃ－リジン（１．１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（１０．０ｍＬ）を加え、生成物４－１（１．２０ｇ）及びトリエチルアミン（２ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２４時間撹拌し、ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、１ＭＨＣｌを適量で加えてｐＨを弱酸性に調節し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５：１）により、生成物４－２（１．７０ｇ、収率８４％）を獲得した。
【0078】
ｃ）反応フラスコに、生成物４－２（１．７０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（５ｍＬ）を加え、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加え、得られた混合物を室温で１時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、そのまま減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４０：１０：１）により、生成物４－３（１．１９ｇ、収率９２％）を獲得した。
【0079】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ８．０９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），１．９８－１．８７（ｍ，２Ｈ），１．７２－１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５５－１．４３（ｍ，２Ｈ）．
【0080】
実施例５：非天然アミノ酸ＮＢＧＫの製造
ＮＢＧＫの構造式は、以下に示す通りであった。
ＮＢＧＫの構造式は、以下に示す通りであった。
【0081】
【化23】
【0082】
【化24】
【0083】
ａ）反応フラスコに、ｐ－メチルアセトフェノン（８．０ｍＬ、６０．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（８０．０ｍＬ）を加え、ＮＢＳ（１２．８２ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）及びＢＰＯ（１４５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を９０℃で２４時間還流した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、容器を氷水に入れて冷却し、固体を析出させ、固体をろ過除去し、飽和Ｎａ２ＣＯ３で３回洗浄し、ＤＣＭで３回抽出し、有機相を合併した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した後、粗生成物５－１（１１．１２ｇ、収率８７％）を獲得し、粗生成物５－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0084】
ｂ）反応フラスコ中で、４ÅのＭＳ（１４ｇ）及びＬｉＯＨ（１．４５ｇ、３４．５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７０ｍＬ）で溶解させ、室温で２０分間撹拌した後、グリシンメチルエステル塩酸塩（２．０ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）を加え、さらに４５分間撹拌した後、生成物５－１（４．０ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、固体をろ過除去し、得られたろ過ケーキをＥＡで洗浄し、得られた濾液を水で２回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した後に、粗生成物５－２を獲得し、そのまま次の工程に使用した。
【0085】
ｃ）反応フラスコ中で、前の工程で獲得した生成物５－２をジオキサン（２０ｍＬ）に溶解させ、１ＭＮａＯＨをゆっくり滴下し、２時間反応させた後、ＴＬＣ検査で加水分解反応が完了して生成物５－３が得られた。飽和ＮａＨＣＯ３を２０ｍＬ加えた後、ジオキサン（１０ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－ＯＳｕをゆっくり加え、室温で一晩撹拌し、ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、１Ｍ ＨＣｌで弱酸性に調節し、ＥＡで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）により、生成物５－４（３．６０ｇ、収率８９％）を獲得した。
【0086】
ｄ）反応フラスコに、生成物５－３（３．６０ｇ、８．０ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（１．１０ｇ、９．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１．８５ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ＤＣＭ（５０ｍＬ）を加え、得られた混合物を室温で１８時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した後、生成物５－５（３．２０ｇ、収率７５％）を獲得した。
【0087】
ｅ）反応フラスコに、生成物５－５（３．２０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（４０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）を加え、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（３．０ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加え、さらにトリエチルアミン（２．０ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌して完全に反応させた。１Ｍ ＨＣｌを適量で加えてｐＨを２程度に調節し、ＥＡで抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝２０：１：０．５）により、生成物５－５（３．５０ｇ、収率７５％）を獲得した。
【0088】
ｆ）反応フラスコ中で、生成物５－５をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解させ、ジエチルアミン（２０ｍＬ）を加え、室温で６時間反応させた。ＴＬＣ検査で反応が完全になったら、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝３０：１０：１）により、最終生成物として白色粉末５－７（０．５５ｇ、収率３７％）を獲得した。
【0089】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ７．９８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，１Ｈ），３．３１（ｓ，２Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），１．９７－１．７３（ｍ，２Ｈ），１．５８－１．４５（ｍ，２Ｈ），１．４４－１．２７（ｍ，２Ｈ）．
【0090】
実施例６：非天然アミノ酸ＮＰＯＫ－２の製造
ＮＰＯＫ－２の構造式は、以下に示す通りであった。
ＮＰＯＫ－２の構造式は、以下に示す通りであった。
【0091】
【化25】
【0092】
【化26】
【0093】
ａ）反応フラスコに、ｐ－アセチルフェノール（２．０５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）及びブロモ酢酸（２．５０ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を加え、さらにＮａＯＨ（１．２０ｇ、３０ｍｍｏｌ）の水溶液（６ｍＬ）を加えた。得られた混合物を１００℃で２４時間還流して完全に反応させた。反応を室温に冷却し、１Ｍ塩酸を加えて酸性に調整し、固体を析出させ、ろ過した後、白色粗生成物６－１（３．３２ｇ、収率１１３％）を獲得し、粗生成物６－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0094】
ｂ）反応フラスコ中で、前の工程で獲得した粗生成物６－１（３．３２ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させ、ＮＨＳ（２．３５ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（３．９０ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を常温で１８時間撹拌して完全に反応させた。ＤＣＭで抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。さらにカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝２０：１：０．５）により精製した後、生成物６－２（１．６７ ｇ、収率３８％）を獲得した。
【0095】
ｃ）反応フラスコに、生成物６－２（１．６７ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を加え、溶媒ジオキサン（２０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）を加え、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（１．９ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を加え、さらにトリエチルアミン（１．７ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間撹拌して完全に反応させ、１Ｍ ＨＣｌを適量で加えてｐＨを２程度に調節し、ＥＡで抽出し、有機相を合併し、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。得られた粗生成物６－３をＤＣＭ（１０ｍＬ）に直接溶解させ、ジエチルアミン（５ｍＬ）を加えた。得られた混合物を常温で１８時間撹拌して完全に反応させた。減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４０：１０：１）により精製した後、最終生成物６－４（７０９ｍｇ、２段階収率３９％）を獲得した。
【0096】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ７．９１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），３．５９（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．５２（ｓ，３Ｈ），１．８７－１．６５（ｍ，２Ｈ），１．５６－１．４０（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．１５（ｍ，２Ｈ）．
【0097】
実施例７：非天然アミノ酸ＮＢＧＫ－２の製造
ＮＢＧＫ－２の構造式は、以下に示す通りであった。
ＮＢＧＫ－２の構造式は、以下に示す通りであった。
【0098】
【化27】
【0099】
【化28】
【0100】
ａ）反応フラスコに、ブロモ酢酸（２．１０ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）とＮａＯＨ（０．８０ｇ、２０ｍｍｏｌ）の水溶液（１０ｍＬ）を加え、１０分間撹拌した。次いで、ｐ－アセトアニリド（１．４０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１００℃で１８時間還流して完全に反応させた。反応を室温に冷却し、ろ過し、水で洗浄し、白色粗生成物７－１（１．３０ｇ、収率６７％）を獲得し、粗生成物７－１を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0101】
ｂ）反応フラスコに、生成物７－１（１．３０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ３（１．７０ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）の水溶液（２０ｍＬ）を加えた。さらにＦｍｏｃ－ＯＳｕ（２．８０ｇ、８．１ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（２０ｍＬ）を加えた。得られた混合物を６０℃で１８時間撹拌して完全に反応させた。室温に冷却し、ＥＡで抽出した。１Ｍ塩酸で残留水相のｐＨを２程度に調節してから、ＥＡで抽出し、有機相を獲得した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。生成物７－２を獲得し、粗生成物７－２を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0102】
ｃ）反応フラスコに、前の工程で獲得した生成物７－２（約６．７ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（０．９０ｇ、８．０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１．５０ｇ、８．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を室温で２４時間撹拌して完全に反応させた。水を加え、ＤＣＭで抽出し、有機相を獲得した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。生成物７－３を獲得し、粗生成物７－３を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0103】
ｄ）反応フラスコに、前の工程で獲得した生成物７－３（約６．７ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ塩酸塩（２．３０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．０ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌して完全に反応させた。続いて、１Ｍ塩酸でｐＨを２程度に調節し、ＥＡで抽出した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。生成物７－４を獲得し、粗生成物７－４を精製せずそのまま次の工程に使用した。
【0104】
ｅ）反応フラスコに、前の工程で獲得した生成物７－４を加えた。溶媒ＤＣＭ（２０ｍＬ）及びジエチルアミン（１０ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌して完全に反応させた。先ず減圧濃縮し、アセトニトリル（５０ｍＬ）を加えて再び溶解させ、その後に減圧濃縮し、操作を３回繰り返して余分なジエチルアミンを除去した。ＤＣＭを加えて２回ビーティングした後、最終生成物７－５（１．６５ｇ、総収率５１％）を獲得した。
【0105】
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ７．７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｓ，２Ｈ），３．５３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），１．７３－１．６０（ｍ，２Ｈ），１．４２－１．３３（ｍ，２Ｈ），１．２５－１．１４（ｍ，２Ｈ）．
【0106】
実施例８
実施例１～７で製造されたＮＰＯＫ、ＮＰＡＫ、ＮＢＯＫ、ＮＢＰＫ、ＮＢＧＫ、ＮＰＯＫ－２、ＮＢＧＫ－２を用いて原核発現系で組換えヒト成長ホルモンを製造し、ＰＥＧが部位特異的にカップリングされたコンジュゲートを製造した。
実施例１～７で製造されたＮＰＯＫ、ＮＰＡＫ、ＮＢＯＫ、ＮＢＰＫ、ＮＢＧＫ、ＮＰＯＫ－２、ＮＢＧＫ－２を用いて原核発現系で組換えヒト成長ホルモンを製造し、ＰＥＧが部位特異的にカップリングされたコンジュゲートを製造した。
【0107】
（１）ヘルパープラスミドの獲得
ヘルパープラスミドｐＳｕｐＡＲ－ＭｂＰｙｌＲＳは、プラスミド保存機構Ａｄｄｇｅｎｅより購入されたもの（品番＃９１７０５）であり、該プラスミドは、大腸菌中でピロリシン由来非天然アミノ酸を特異的に識別するｔＲＮＡとｔＲＮＡ合成酵素を発現することができ、３７．５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールが添加されたＬＢ培地で振とうフラスコ培養した後に抽出したことによりヘルパープラスミドが得られる。
ヘルパープラスミドｐＳｕｐＡＲ－ＭｂＰｙｌＲＳは、プラスミド保存機構Ａｄｄｇｅｎｅより購入されたもの（品番＃９１７０５）であり、該プラスミドは、大腸菌中でピロリシン由来非天然アミノ酸を特異的に識別するｔＲＮＡとｔＲＮＡ合成酵素を発現することができ、３７．５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールが添加されたＬＢ培地で振とうフラスコ培養した後に抽出したことによりヘルパープラスミドが得られる。
【0108】
（２）読み枠内に終止コドンを含有する組換えヒト成長ホルモン発現プラスミドの構築
米国国立生物工学情報センターのデータベースからホモ・サピエンス成長ホルモン（アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りである）のコード遺伝子のｍＲＮＡ配列を獲得し、それから翻訳したタンパク質のＣ末端に６個のヒスチジン精製タグを付加するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１０７位のアミノ酸コドンをアンバーコドン（ＴＡＧ）に変更させ、さらに全遺伝子合成によって該完全なＤＮＡ配列を合成して組換えヒト成長ホルモンの遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を獲得した。
米国国立生物工学情報センターのデータベースからホモ・サピエンス成長ホルモン（アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す通りである）のコード遺伝子のｍＲＮＡ配列を獲得し、それから翻訳したタンパク質のＣ末端に６個のヒスチジン精製タグを付加するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１０７位のアミノ酸コドンをアンバーコドン（ＴＡＧ）に変更させ、さらに全遺伝子合成によって該完全なＤＮＡ配列を合成して組換えヒト成長ホルモンの遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を獲得した。
【0109】
ホモ・サピエンス成長ホルモンのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、以下の通りであった。
【0110】
【表1】
【0111】
組換えヒト成長ホルモンの遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、以下の通りであった。
【0112】
【表2】
【0113】
さらに、サブクローニングによって、組換えヒト成長ホルモンの遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、品番＃６９７４０－３）のＮｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉとの２つの酵素切断部位の間にクローニングして、発現プラスミドｐＥＴ２１－ｒｈＧＨ１０７を獲得し、配列を測定した結果、予想配列と一致したことが判明した。ｐＥＴ２１－ｒｈＧＨ１０７は、１０７位のアミノ酸コドンがアンバーコドンに置換された組換えヒト成長ホルモンを発現することができ、該タンパク質のＣ末端に６個のヒスチジン精製タグがある。組換えヒト成長ホルモン発現プラスミドｐＥＴ２１－ｒｈＧＨ１０７のプロファイルを図１に示した。
【0114】
（３）目的発現菌株の獲得
上記のヘルパープラスミドｐＳｕｐＡＲ－ＭｂＰｙｌＲＳと発現プラスミドｐＥＴ２１－ｒｈＧＨ１０７を大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、品番＃７０９１１－３）コンピテント細胞に同時形質転換し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３７．５ ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地でスクリーニングして得られた二重抵抗性菌株は即ち組換えヒト成長ホルモン発現菌株であった。
上記のヘルパープラスミドｐＳｕｐＡＲ－ＭｂＰｙｌＲＳと発現プラスミドｐＥＴ２１－ｒｈＧＨ１０７を大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、品番＃７０９１１－３）コンピテント細胞に同時形質転換し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３７．５ ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地でスクリーニングして得られた二重抵抗性菌株は即ち組換えヒト成長ホルモン発現菌株であった。
【0115】
（４）非天然アミノ酸が挿入された組換えタンパク質の発現
スクリーニングして得られた組換えヒト成長ホルモン発現菌株を、８組の２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３７．５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するもの）に接種し、３７℃で菌液のＯＤ６００が２．０±０．２に達するまで培養し、８組の菌液のそれぞれにＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）及びアラビノース（終濃度０．２％）を添加し、さらに１組目の菌液にＮＢＯＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、２組目の菌液にＮＰＡＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、３組目の菌液にＮＢＰＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、４組目の菌液にＮＢＧＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、５組目の菌液にＮＰＯＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、６組目の菌液にＮＰＯＫ－２（終濃度１ｍＭ）を添加し、７組目の菌液にＮＢＧＫ－２（終濃度１ｍＭ）を添加し、８組目の菌液に非天然アミノ酸を添加せず、それを陰性対照として用いた。３７℃で誘導発現培養を５～６時間行った後に各培養液を１ｍｌ取って１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ＰＢＳでＯＤ６００が１０に達するまで再懸濁させ、各菌懸濁液を取ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、各菌株のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を図２に示した。図２の結果から明らかなように、発現菌株は７種の非天然アミノ酸がそれぞれ添加された場合、目的タンパク質を発現することができる。
スクリーニングして得られた組換えヒト成長ホルモン発現菌株を、８組の２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３７．５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコールを含有するもの）に接種し、３７℃で菌液のＯＤ６００が２．０±０．２に達するまで培養し、８組の菌液のそれぞれにＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）及びアラビノース（終濃度０．２％）を添加し、さらに１組目の菌液にＮＢＯＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、２組目の菌液にＮＰＡＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、３組目の菌液にＮＢＰＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、４組目の菌液にＮＢＧＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、５組目の菌液にＮＰＯＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、６組目の菌液にＮＰＯＫ－２（終濃度１ｍＭ）を添加し、７組目の菌液にＮＢＧＫ－２（終濃度１ｍＭ）を添加し、８組目の菌液に非天然アミノ酸を添加せず、それを陰性対照として用いた。３７℃で誘導発現培養を５～６時間行った後に各培養液を１ｍｌ取って１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ＰＢＳでＯＤ６００が１０に達するまで再懸濁させ、各菌懸濁液を取ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、各菌株のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を図２に示した。図２の結果から明らかなように、発現菌株は７種の非天然アミノ酸がそれぞれ添加された場合、目的タンパク質を発現することができる。
【0116】
（５）非天然アミノ酸が挿入された組換えタンパク質の精製
上記の誘導発現後の各菌液を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿物を取り、１／２０細胞成長体積のＮＴＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）及び終濃度１ｍＭのＰＭＳＦを加え、超音波ホモジェネート処理によって細胞を破砕させ、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を取り、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーカラムによってＨｉｓタグ付き目的タンパク質を吸着し、さらに溶離液ＮＴＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２５０ｍＭイミダゾール）で溶離させ、純度が約９０％の目的タンパク質（即ち非天然アミノ酸が挿入された組換えタンパク質）サンプルを獲得した。各サンプルを１０Ｋの硝酸セルロース透析バッグに置き、ｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液中で一晩透析し（タンパク質溶液１ｍｌ当たり２００ｍｌ透析液に対応）、液交換を１回行い、透析済みタンパク質溶液を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタンパク質の濃度を測定した。
上記の誘導発現後の各菌液を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿物を取り、１／２０細胞成長体積のＮＴＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）及び終濃度１ｍＭのＰＭＳＦを加え、超音波ホモジェネート処理によって細胞を破砕させ、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を取り、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーカラムによってＨｉｓタグ付き目的タンパク質を吸着し、さらに溶離液ＮＴＡ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．９、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２５０ｍＭイミダゾール）で溶離させ、純度が約９０％の目的タンパク質（即ち非天然アミノ酸が挿入された組換えタンパク質）サンプルを獲得した。各サンプルを１０Ｋの硝酸セルロース透析バッグに置き、ｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液中で一晩透析し（タンパク質溶液１ｍｌ当たり２００ｍｌ透析液に対応）、液交換を１回行い、透析済みタンパク質溶液を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタンパク質の濃度を測定した。
【0117】
（６）非天然アミノ酸が挿入された組換えタンパク質とＰＥＧとのカップリング反応
合成ルートは、上記の通りであった（但し、Ｒ１からＲ２への方向はアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への方向である）。
【化29】
【0118】
３０ＫＤのアミノオキシＰＥＧがオキシム化反応によって非天然アミノ酸の挿入された組換えタンパク質にカップリングされたことを例とすると、カップリング反応の操作は以下の通りであった：カップリング反応前、上記のように得られた目的タンパク質をｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液で０．５ｍｇ／ｍｌに調節し、１：１５（組換えタンパク質とアミノオキシＰＥＧのモル比）で３０ＫＤのアミノオキシＰＥＧ固体（北京鍵凱科技有限公司より購入）を加え、十分に揺動して溶解させ、澄明な透明溶液を獲得し、さらに反応液を密封し、恒温振とう台（２５℃、１００ｒｐｍ）で揺動しながら反応させた。４８時間経過後にＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてカップリング状況を分析し、図３を参照できる。図３の結果から明らかなように、６種の目的タンパク質の何れにも３０ＫＤ ＰＥＧがカップリングされたことが判明し、なお、上記７種の非天然アミノ酸が目的タンパク質に挿入されたことがさらに判明した。非天然アミノ酸が挿入された組換えタンパク質とＰＥＧのカップリング生成物を「ＰＥＧ－ｒｈＧＨ」と略記した。
【0119】
（７）ＰＥＧ－ｒｈＧＨの精製
カップリング済みＰＥＧ－ｒｈＧＨを、Ｂｕｔｙｌ ＨＰ疎水性クロマトグラフィーカラムにより分離精製し（ローディング緩衝液：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．８Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ８．５；溶離緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、４０倍カラム体積で勾配溶離を行う）、電気泳動の純レベル（＞９５％）に達した純品ＰＥＧ－ｒｈＧＨを獲得した。ＮＰＯＫ含有ＰＥＧ－ｒｈＧＨ及びＮＢＯＫ含有ＰＥＧ－ｒｈＧＨを例に説明すると、その電気泳動図を図４に示した。
カップリング済みＰＥＧ－ｒｈＧＨを、Ｂｕｔｙｌ ＨＰ疎水性クロマトグラフィーカラムにより分離精製し（ローディング緩衝液：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．８Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ８．５；溶離緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、４０倍カラム体積で勾配溶離を行う）、電気泳動の純レベル（＞９５％）に達した純品ＰＥＧ－ｒｈＧＨを獲得した。ＮＰＯＫ含有ＰＥＧ－ｒｈＧＨ及びＮＢＯＫ含有ＰＥＧ－ｒｈＧＨを例に説明すると、その電気泳動図を図４に示した。
【0120】
本発明の非天然アミノ酸を含有する他のＰＥＧ－ｒｈＧＨは同様に精製後に電気泳動の純レベルに達した。
【0121】
（８）ＰＥＧ－ｒｈＧＨの活性分析
具体的な過程は以下の通りであった：ＨＥＫ２９３－ＧＨＲ細胞（細胞株由来は中国特許２０２０１１２６４９８２７を参照）を、０．１ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（生工生物工程（上海）股分有限公司（Ｓａｎｇｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈ）製、品番Ａ６００２３０－０００１）、０．７５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（生工生物工程（上海）股分有限公司製、品番Ａ６００９５８－０００５）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製、１００９９１４１）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製、品番１１９９５０４０）培地を用いて、３７°Ｃ、５％ ＣＯ２条件下で十分な量まで培養し、黒色９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、品番３９０４）にＨＥＫ ２９３－ＧＨＲ細胞を１ウェル当たり９×１０４個接種し、９０μＬ／ウェルとし、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で１６時間飢餓培養した。ｒｈＧＨ標準品（中国食品医薬品検定研究院、略記すると「中検院」から購入）、ＮＰＯＫ含有ｒｈＧＨ（即ちｒｈＧＨ（ＮＰＯＫ））、ＰＥＧでＮＰＯＫが修飾されたＰＥＧ－ｒｈＧＨ（即ちＰＥＧ－ｒｈＧＨ（ＮＰＯＫ））、ＮＢＯＫ含有ＰＥＧ－ｒｈＧＨ（即ちｒｈＧＨ（ＮＢＯＫ））、ＰＥＧでＮＢＯＫが修飾されたＰＥＧ－ｒｈＧＨ（即ちＰＥＧ－ｒｈＧＨ（ＮＢＯＫ））、市販のｒｈＧＨ医薬品である賽増（登録商標）（長春金賽薬業有限責任公司製）、市販のＰＥＧ－ｒｈＧＨ医薬品である金賽増（登録商標）（長春金賽薬業有限責任公司製）サンプルに対して勾配希釈を行い、合計９段階の濃度とし、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で４時間培養した。ＯＮＥ－ＧｌｏＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、品番Ｅ６１２０）検出試薬を１ウェル当たり５０μＬ加え、酵素標識器での化学発光値を読み取った。サンプル濃度と酵素標識器の読み取り値により曲線をフィッティングして、ＥＣ５０を算出した。その結果を図５Ａ～図５Ｇ及び表１に示した。その結果から明らかなように、カップリング反応前、各部位の細胞活性は中検院からのｒｈＧＨ標準品と一致した。カップリング反応後、細胞活性は標準品の約２５％～５０％まで低下し、その生物学的活性の変化規律は市販のＰＥＧ－ｒｈＧＨと一致した。
具体的な過程は以下の通りであった：ＨＥＫ２９３－ＧＨＲ細胞（細胞株由来は中国特許２０２０１１２６４９８２７を参照）を、０．１ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（生工生物工程（上海）股分有限公司（Ｓａｎｇｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈ）製、品番Ａ６００２３０－０００１）、０．７５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（生工生物工程（上海）股分有限公司製、品番Ａ６００９５８－０００５）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製、１００９９１４１）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製、品番１１９９５０４０）培地を用いて、３７°Ｃ、５％ ＣＯ２条件下で十分な量まで培養し、黒色９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、品番３９０４）にＨＥＫ ２９３－ＧＨＲ細胞を１ウェル当たり９×１０４個接種し、９０μＬ／ウェルとし、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で１６時間飢餓培養した。ｒｈＧＨ標準品（中国食品医薬品検定研究院、略記すると「中検院」から購入）、ＮＰＯＫ含有ｒｈＧＨ（即ちｒｈＧＨ（ＮＰＯＫ））、ＰＥＧでＮＰＯＫが修飾されたＰＥＧ－ｒｈＧＨ（即ちＰＥＧ－ｒｈＧＨ（ＮＰＯＫ））、ＮＢＯＫ含有ＰＥＧ－ｒｈＧＨ（即ちｒｈＧＨ（ＮＢＯＫ））、ＰＥＧでＮＢＯＫが修飾されたＰＥＧ－ｒｈＧＨ（即ちＰＥＧ－ｒｈＧＨ（ＮＢＯＫ））、市販のｒｈＧＨ医薬品である賽増（登録商標）（長春金賽薬業有限責任公司製）、市販のＰＥＧ－ｒｈＧＨ医薬品である金賽増（登録商標）（長春金賽薬業有限責任公司製）サンプルに対して勾配希釈を行い、合計９段階の濃度とし、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で４時間培養した。ＯＮＥ－ＧｌｏＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、品番Ｅ６１２０）検出試薬を１ウェル当たり５０μＬ加え、酵素標識器での化学発光値を読み取った。サンプル濃度と酵素標識器の読み取り値により曲線をフィッティングして、ＥＣ５０を算出した。その結果を図５Ａ～図５Ｇ及び表１に示した。その結果から明らかなように、カップリング反応前、各部位の細胞活性は中検院からのｒｈＧＨ標準品と一致した。カップリング反応後、細胞活性は標準品の約２５％～５０％まで低下し、その生物学的活性の変化規律は市販のＰＥＧ－ｒｈＧＨと一致した。
【0122】
本発明の非天然アミノ酸を含有する他のＰＥＧ－ｒｈＧＨは、カップリング後の細胞活性も標準品の約２５％～５０％まで低下し、生物学的活性の変化規律も市販のＰＥＧ－ｒｈＧＨと一致した。
【0123】
【表3】
【0124】
実施例９
実施例１～７で製造された非天然アミノ酸ＮＰＯＫ、ＮＰＡＫ、ＮＢＯＫ、ＮＢＰＫ、ＮＢＧＫ、ＮＰＯＫ－２、ＮＢＧＫ－２を用いて真核発現系で組換えＧＦＰタンパク質を製造した。
実施例１～７で製造された非天然アミノ酸ＮＰＯＫ、ＮＰＡＫ、ＮＢＯＫ、ＮＢＰＫ、ＮＢＧＫ、ＮＰＯＫ－２、ＮＢＧＫ－２を用いて真核発現系で組換えＧＦＰタンパク質を製造した。
【0125】
（１）ヘルパープラスミドの獲得
ヘルパープラスミドｐＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳは、プラスミド保存機構ａｄｄｇｅｎｅより購入されたもの（品番＃９１７０６）であり、このプラスミドは、哺乳動物細胞における、ピロリシン由来非天然アミノ酸を特異的に識別するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、及びそれに対応するｔＲＮＡをコードする（アンバーコドンＵＡＧを識別する）ものであった。
ヘルパープラスミドｐＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳは、プラスミド保存機構ａｄｄｇｅｎｅより購入されたもの（品番＃９１７０６）であり、このプラスミドは、哺乳動物細胞における、ピロリシン由来非天然アミノ酸を特異的に識別するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、及びそれに対応するｔＲＮＡをコードする（アンバーコドンＵＡＧを識別する）ものであった。
【0126】
（２）遺伝子読み枠内にアンバーコドンを含有する緑色蛍光タンパク質発現ベクターの構築
精製タグ付き野生型緑色蛍光タンパク質（その遺伝子コード配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す通りであった）を発現する発現ベクターを点突然変異させ、読み枠における４０位のアミノ酸コドンがアンバーコドンに突然変異した発現プラスミドｐＥＧＦＰ４０を獲得し、その完全な配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りであった。
精製タグ付き野生型緑色蛍光タンパク質（その遺伝子コード配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す通りであった）を発現する発現ベクターを点突然変異させ、読み枠における４０位のアミノ酸コドンがアンバーコドンに突然変異した発現プラスミドｐＥＧＦＰ４０を獲得し、その完全な配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す通りであった。
【0127】
精製タグ付き野生型緑色蛍光タンパク質の遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、以下の通りであった。
【0128】
【表4】
【0129】
発現プラスミドｐＥＧＦＰ４０の遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、以下の通りであった。
【0130】
【表5(1)】
【表5(2)】
【表5(3)】
【0131】
（３）非天然アミノ酸が挿入された組換えＧＦＰタンパク質の発現
米国タイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）より中国ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ－Ｋ１（品番＃ＣＣＬ－６１－ＡＴＣ）を購入し、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地を用いて壁着培養を行った。上記の工程で獲得したヘルパープラスミドｐＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳ及び緑色蛍光タンパク質発現プラスミドｐＥＧＦＰ４０を抽出し、ｌｉｐｏ２０００トランスフェクション試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、品番＃１２５６６０１４）を用い、その取扱書に従って瞬時トランスフェクションを行い、（細胞を５０，０００個の細胞／ウェルの接種量で２４ウェルプレートに接種し、合計８個のウェルとし、接種して２４時間培養した後にトランスフェクションを行い、１ウェル当たり５００ｎｇのプラスミドとした）、トランスフェクションと同時に１個目のウェルにＮＰＯＫ（終濃度１ｍＭ）、２個目のウェルにＮＰＡＫ（終濃度１ｍＭ）、３個目のウェルにＮＢＯＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、４個目のウェルにＮＢＰＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、５個目のウェルにＮＢＧＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、６個目のウェルにＮＰＯＫ－２（終濃度１ｍＭ）を添加し、７個目のウェルにＮＢＧＫ－２（終濃度１ｍＭ）を添加し、８個目のウェルに非天然アミノ酸を添加せず、それを陰性対照として用いた。ＣＯ２培養箱で４８時間静置培養した後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察した結果、１個目～７個目のウェルでは緑色蛍光が明らかに存在することが判明し（図６を参照）、このことから明らかなように、非天然アミノ酸が緑色蛍光タンパク質に挿入されて完全な緑色蛍光タンパク質が得られ、蛍光タンパク質の機能が影響されることがない。
米国タイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）より中国ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ－Ｋ１（品番＃ＣＣＬ－６１－ＡＴＣ）を購入し、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地を用いて壁着培養を行った。上記の工程で獲得したヘルパープラスミドｐＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳ及び緑色蛍光タンパク質発現プラスミドｐＥＧＦＰ４０を抽出し、ｌｉｐｏ２０００トランスフェクション試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、品番＃１２５６６０１４）を用い、その取扱書に従って瞬時トランスフェクションを行い、（細胞を５０，０００個の細胞／ウェルの接種量で２４ウェルプレートに接種し、合計８個のウェルとし、接種して２４時間培養した後にトランスフェクションを行い、１ウェル当たり５００ｎｇのプラスミドとした）、トランスフェクションと同時に１個目のウェルにＮＰＯＫ（終濃度１ｍＭ）、２個目のウェルにＮＰＡＫ（終濃度１ｍＭ）、３個目のウェルにＮＢＯＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、４個目のウェルにＮＢＰＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、５個目のウェルにＮＢＧＫ（終濃度１ｍＭ）を添加し、６個目のウェルにＮＰＯＫ－２（終濃度１ｍＭ）を添加し、７個目のウェルにＮＢＧＫ－２（終濃度１ｍＭ）を添加し、８個目のウェルに非天然アミノ酸を添加せず、それを陰性対照として用いた。ＣＯ２培養箱で４８時間静置培養した後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察した結果、１個目～７個目のウェルでは緑色蛍光が明らかに存在することが判明し（図６を参照）、このことから明らかなように、非天然アミノ酸が緑色蛍光タンパク質に挿入されて完全な緑色蛍光タンパク質が得られ、蛍光タンパク質の機能が影響されることがない。
【0132】
実施例１０
実施例１～７で製造されたＮＰＯＫ、ＮＰＡＫ、ＮＢＯＫ、ＮＢＰＫ、ＮＢＧＫ、ＮＰＯＫ－２、ＮＢＧＫ－２を用いて真核発現系で非天然アミノ酸含有抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を発現し、毒素とのコンジュゲートを製造した。
実施例１～７で製造されたＮＰＯＫ、ＮＰＡＫ、ＮＢＯＫ、ＮＢＰＫ、ＮＢＧＫ、ＮＰＯＫ－２、ＮＢＧＫ－２を用いて真核発現系で非天然アミノ酸含有抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を発現し、毒素とのコンジュゲートを製造した。
【0133】
（１）ヘルパープラスミドの獲得
ヘルパープラスミドｐＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳは、プラスミド保存機構ａｄｄｇｅｎｅより購入されたもの（品番＃９１７０６）であり、このプラスミドは、哺乳動物細胞における、ピロリシン由来非天然アミノ酸を特異的に識別するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、及びそれに対応するｔＲＮＡをコードする（アンバーコドンＵＡＧを識別する）ものであった。
ヘルパープラスミドｐＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳは、プラスミド保存機構ａｄｄｇｅｎｅより購入されたもの（品番＃９１７０６）であり、このプラスミドは、哺乳動物細胞における、ピロリシン由来非天然アミノ酸を特異的に識別するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、及びそれに対応するｔＲＮＡをコードする（アンバーコドンＵＡＧを識別する）ものであった。
【0134】
（２）遺伝子読み枠内にアンバーコドンを含有する抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ）発現ベクターの構築
全遺伝子合成によって、トラスツズマブをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ（対応するアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６である）を合成し、真核発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１＋にサブクローニングし、得られた発現ベクターを点突然変異させ、重鎖の読み枠における１４２位のアミノ酸コドンがアンバーコドンに突然変異した発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＵＡＧ１４２を獲得した。そのプロファイルは図７に示す通り、その完全な配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す通りであった。
全遺伝子合成によって、トラスツズマブをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ（対応するアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６である）を合成し、真核発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１＋にサブクローニングし、得られた発現ベクターを点突然変異させ、重鎖の読み枠における１４２位のアミノ酸コドンがアンバーコドンに突然変異した発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＵＡＧ１４２を獲得した。そのプロファイルは図７に示す通り、その完全な配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す通りであった。
【0135】
トラスツズマブの重鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）は、以下の通りであった。
【0136】
【表6】
【0137】
トラスツズマブの軽鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）は、以下の通りであった。
【0138】
【表7】
【0139】
発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＵＡＧ１４２の遺伝子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）は、以下の通りであった。
【0140】
【表8(1)】
【表8(2)】
【表8(3)】
【0141】
（３）非天然アミノ酸の挿入
浮遊馴化したＨＥＫ２９３細胞を用い、０．３×１０５／ｍＬの密度でＷａｙｎｅ２９３ＴＭ培地（Ｑｕａｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、品番Ａ２１５０１）に接種し、１Ｌ振とうフラスコを用い、充填液量を２４０ｍＬとし、１２０ｒｐｍ、５％ ＣＯ２、湿度８０％の条件下で振とう培養し、細胞密度が約１×１０６／ｍＬに達した時にトランスフェクションを行い、工程（１）及び工程（２）で説明したヘルパープラスミドｐＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳ及び発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＵＡＧ１４２を抽出し、エンドトキシンを除去してスタンドバイ状態に進んだ。各振とうフラスコ毎にトランスフェクションを行う際に、発現プラスミド及びヘルパープラスミドをそれぞれ１２０μｇ用い、プラスミドを遠心分離管中に加え、１×ＰＢＳ緩衝液で７．２ｍＬに希釈させ、さらに、別の遠心分離管中にＰＥＩトランスフェクション試薬（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）を７２０μｇ加え、１×ＰＢＳ緩衝液を加えて７．２ｍＬに希釈させ、均一混合後、２つの遠心分離管をそれぞれ５分間静置した後、２つの遠心分離管中の液体を軽く均一混合してから１０分間静置し、得られたものを１Ｌ振とうフラスコ中の２４０ｍＬの細胞懸濁液に合計１４．４ｍＬゆっくり滴下し、滴下過程中に絶えず軽く揺動し、１２０ｒｐｍ、５％ ＣＯ２、湿度８０％の条件下で４時間振とう培養した後、終濃度１ｍＭの非天然アミノ酸を添加し、続いて、１２０ｒｐｍ、５％ ＣＯ２、湿度８０％の条件下で５日間振とう培養した後、抗体を精製するための細胞培養上清を獲得した。
浮遊馴化したＨＥＫ２９３細胞を用い、０．３×１０５／ｍＬの密度でＷａｙｎｅ２９３ＴＭ培地（Ｑｕａｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、品番Ａ２１５０１）に接種し、１Ｌ振とうフラスコを用い、充填液量を２４０ｍＬとし、１２０ｒｐｍ、５％ ＣＯ２、湿度８０％の条件下で振とう培養し、細胞密度が約１×１０６／ｍＬに達した時にトランスフェクションを行い、工程（１）及び工程（２）で説明したヘルパープラスミドｐＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳ及び発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ＵＡＧ１４２を抽出し、エンドトキシンを除去してスタンドバイ状態に進んだ。各振とうフラスコ毎にトランスフェクションを行う際に、発現プラスミド及びヘルパープラスミドをそれぞれ１２０μｇ用い、プラスミドを遠心分離管中に加え、１×ＰＢＳ緩衝液で７．２ｍＬに希釈させ、さらに、別の遠心分離管中にＰＥＩトランスフェクション試薬（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）を７２０μｇ加え、１×ＰＢＳ緩衝液を加えて７．２ｍＬに希釈させ、均一混合後、２つの遠心分離管をそれぞれ５分間静置した後、２つの遠心分離管中の液体を軽く均一混合してから１０分間静置し、得られたものを１Ｌ振とうフラスコ中の２４０ｍＬの細胞懸濁液に合計１４．４ｍＬゆっくり滴下し、滴下過程中に絶えず軽く揺動し、１２０ｒｐｍ、５％ ＣＯ２、湿度８０％の条件下で４時間振とう培養した後、終濃度１ｍＭの非天然アミノ酸を添加し、続いて、１２０ｒｐｍ、５％ ＣＯ２、湿度８０％の条件下で５日間振とう培養した後、抗体を精製するための細胞培養上清を獲得した。
【0142】
（４）精製
Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた１ｍｌ予充填カラムによって、細胞培養上清を精製した。溶離緩衝液：１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、２００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸塩、ｐＨ３．５によって、非天然アミノ酸が挿入された精製済みトラスツズマブを獲得した。
Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた１ｍｌ予充填カラムによって、細胞培養上清を精製した。溶離緩衝液：１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、２００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸塩、ｐＨ３．５によって、非天然アミノ酸が挿入された精製済みトラスツズマブを獲得した。
【0143】
（５）カップリング
合成ルート（ＮＢＯＫを例に）は、以下の通りであった。
合成ルート（ＮＢＯＫを例に）は、以下の通りであった。
【0144】
【化30】
【0145】
ＤＭ１－ＰＥＧ－ＯＮＨ２の製造過程は、以下の通りであった。
【0146】
【化31】
【0147】
カップリングして得られたモノクローナル抗体－毒素コンジュゲートを５０ｋＤａ限外ろ過遠心分離管に通過させて液交換を行って、反応が発生しない毒素原料を除去し、置換緩衝液を２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）とした。
【0148】
ＨＩＣ－ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りであった。
【0149】
移動相Ａ（２Ｍ硫酸アンモニウム、７５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２±０．２）、
移動相Ｂ（７５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、２５％イソプロパノール、ｐＨ７．２±０．２）。
移動相Ｂ（７５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、２５％イソプロパノール、ｐＨ７．２±０．２）。
【0150】
【表9】
【0151】
（６）活性の分析
ＢＴ－４７４細胞株（ＡＴＣＣより購入、品番ＨＴＢ－２０）を用いてサンプルによる細胞増殖への抑制作用を測定した。
ＢＴ－４７４細胞株（ＡＴＣＣより購入、品番ＨＴＢ－２０）を用いてサンプルによる細胞増殖への抑制作用を測定した。
【0152】
具体的な過程は以下の通りであった：ＢＴ－４７４細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製、品番１００９９１４１）を含有するＡＴＣＣ Ｈｙｂｒｉ－Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣより購入、品番４６－Ｘ）培地を用いて、３７°Ｃ、５％ ＣＯ２条件下で十分な量まで培養し、９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、品番３５９９）にＢＴ－４７４細胞を１ウェル当たり１．５×１０４個接種し（溶媒対照ウェルを含む）、ブランク対照ウェルに細胞を含有しない培地を加え、８０μＬ／ウェルとした。ＮＢＯＫ含有トラスツズマブ及びＤＭ１で修飾したＮＢＯＫ含有トラスツズマブを、１７μｇ／ｍＬから０．１３μｇ／ｍＬまで勾配希釈させ、合計８段階の濃度とし、希釈度ごとに２つの重複ウェルがあった。希釈済みサンプルをＢＴ－４７４細胞が接種された培養プレートに移し、１ウェル当たり１０μＬとし、溶媒対照ウェル及びブランク対照ウェルに培地を１０μＬ加え、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養した。第５日にＣＣＫ－８（碧雲天社製、品番Ｃ００４３）検出試薬を１ウェル当たり１０μＬ加え、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で６時間発色させ、酵素標識器の４５０ｎｍ波長での光密度値を読み取った。次の式によって、被検サンプルの抑制率（Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を算出した：抑制率（％）＝（ＯＤ化合物－ＯＤブランク対照）／（ＯＤ溶媒対照－ＯＤブランク対照）×１００％。Ｅｘｃｅｌで異なる濃度の化合物の抑制率を算出してから、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを用いて抑制グラフを作成し、ＩＣ５０を算出した。その結果を図９に示した。その結果から明らかなように、ＤＭ１で修飾したＮＢＯＫ含有トラスツズマブはＮＢＯＫ含有トラスツズマブに比べ、ＩＣ５０が約３倍低くなり、腫瘍殺傷効果が顕著に向上した。
【0153】
（７）ＤＭ１で修飾した非天然アミノ酸含有トラスツズマブの安定性考察
カップリングして得られたモノクローナル抗体－毒素コンジュゲートを５０ｋＤａ限外ろ過遠心分離管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、品番ＵＦＣ９０５０２４＃）に通過させて液交換を行って、反応が発生しない毒素原料を除去した。置換緩衝液を２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）とした。タンパク質溶液を３部に分け、１Ｍクエン酸溶液又は１ Ｍ Ｔｒｉｓ溶液でそれぞれをｐＨ４．０、ｐＨ６．０、ｐＨ８．０に調節し、２５℃水浴中に置き、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間のそれぞれにサンプリングし、ＨＩＣ－ＨＰＬＣによる検出を行い（検出条件は同上）、その結果を表２に示した。
カップリングして得られたモノクローナル抗体－毒素コンジュゲートを５０ｋＤａ限外ろ過遠心分離管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、品番ＵＦＣ９０５０２４＃）に通過させて液交換を行って、反応が発生しない毒素原料を除去した。置換緩衝液を２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）とした。タンパク質溶液を３部に分け、１Ｍクエン酸溶液又は１ Ｍ Ｔｒｉｓ溶液でそれぞれをｐＨ４．０、ｐＨ６．０、ｐＨ８．０に調節し、２５℃水浴中に置き、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間のそれぞれにサンプリングし、ＨＩＣ－ＨＰＬＣによる検出を行い（検出条件は同上）、その結果を表２に示した。
【0154】
【表10】
【0155】
表２の結果から明らかなように、本発明で提供されるＤＭ１で修飾した非天然アミノ酸含有トラスツズマブでは、形成されたオキシム結合が低ｐＨ下でも比較的に安定であった。
【0156】
実施例１１：Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏの活性基還元現象
（１）高分解能質量スペクトルによる生成物分子量の分析
文献（宋礼華など、生物学雑誌、１６（１）：６－８、１９９９）による分泌型成長ホルモン発現法を参考にし、文献で提供されるシグナルペプチド配列に基づき、発現ベクターのｒｈＧＨのＮ末端にＯｍｐＡシグナルペプチドのコード配列を添加し、実施例８におけるヘルパープラスミドｐＳｕｐＡＲ－ＭｂＰｙｌＲＳと合わせることで、Ｋ１４０コドンがアンバーコドン（ＴＡＧ）に突然変異したｒｈＧＨのＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）発現菌株を構築し、発酵過程中にＬｙｓ－ａｚｉｄｏを添加することで、１４０位がＬｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異した天然ｒｈＧＨを発現し、その番号がｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０であり、なお、発酵過程中にＮＢＯＫを添加することで、１４０位がＮＢＯＫに突然変異した天然ｒｈＧＨを発現し、その番号がｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０であり、上記の参考文献による精製手段を参考にして精製を行った。ｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０とｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０について液体クロマトグラフィーと質量分析法（高分解能質量分析計：ＸｅｖｏＧ２－ＸＳ Ｑ－Ｔｏｆ、Ｗａｔｅｒｓ社製；超高速液体クロマトグラフィー：ＵＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓ）、Ｗａｔｅｒｓ社製）によって完全な分子量の分析を行った。
（１）高分解能質量スペクトルによる生成物分子量の分析
文献（宋礼華など、生物学雑誌、１６（１）：６－８、１９９９）による分泌型成長ホルモン発現法を参考にし、文献で提供されるシグナルペプチド配列に基づき、発現ベクターのｒｈＧＨのＮ末端にＯｍｐＡシグナルペプチドのコード配列を添加し、実施例８におけるヘルパープラスミドｐＳｕｐＡＲ－ＭｂＰｙｌＲＳと合わせることで、Ｋ１４０コドンがアンバーコドン（ＴＡＧ）に突然変異したｒｈＧＨのＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）発現菌株を構築し、発酵過程中にＬｙｓ－ａｚｉｄｏを添加することで、１４０位がＬｙｓ－ａｚｉｄｏに突然変異した天然ｒｈＧＨを発現し、その番号がｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０であり、なお、発酵過程中にＮＢＯＫを添加することで、１４０位がＮＢＯＫに突然変異した天然ｒｈＧＨを発現し、その番号がｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０であり、上記の参考文献による精製手段を参考にして精製を行った。ｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０とｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０について液体クロマトグラフィーと質量分析法（高分解能質量分析計：ＸｅｖｏＧ２－ＸＳ Ｑ－Ｔｏｆ、Ｗａｔｅｒｓ社製；超高速液体クロマトグラフィー：ＵＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓ）、Ｗａｔｅｒｓ社製）によって完全な分子量の分析を行った。
【0157】
図１０Ａに示すように、ｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０サンプルには理論分子量（２２２６５Ｄａ）よりも２６Ｄａ小さい成分が現れ、この成分は推断によりＬｙｓ－ａｚｉｄｏの末端にあるアジド構造（－Ｎ３）が（－ＮＨ２）に還元された生成物であり、このことから明らかなように、現在よく使われている非天然アミノ酸Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏはタンパク質に挿入された時にアジド基が不安定で、還元されて還元生成物を形成しやすいため、カップリング活性が失われやすい。図１０Ｂに示すように、ｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０サンプルには割合の高い不純物が現れておらず、このことから明らかなように、Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏに比べ、ＮＢＯＫより製造された組換えタンパク質生成物がより安定であった。
【0158】
（２）カップリング効率の比較
上記の反応ルートに示すように、Ｃｌｉｃｋ反応によって、３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧ（中国特許ＣＮ１１２２７９９０６Ａを参考にして自製したもの）とｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ－１４０を部位特異的にカップリングした（但し、Ｒ１からＲ２への方向はアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への方向である）。上記のように得られた目的タンパク質をｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液で０．５ｍｇ／ｍｌに調節し、それぞれ１：１５、１：２５（組換えタンパク質と３０ＫＤ ＢＣＮ－ＰＥＧのモル比）でＢＣＮ－ＰＥＧ固体をｒｈＧＨ－Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏ溶液中に投入し、十分に揺動して溶解させ、澄明な透明溶液を獲得し、さらに反応液を密封し、恒温振とう台（２５℃、７０ｒｐｍ）で揺動しながら反応させた。所定の時間経過したごとに、サンプリングし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて反応結果を測定し、７２時間経過後に反応を停止させ、その転化率は約５０％～７０％であった。その反応結果は図１１Ａに示す通りであった。
【化32】
【0159】
実施例８を参照にして、オキシム化反応によって、３０ＫＤのアミノオキシ基ＰＥＧとｒｈＧＨ－ＮＢＯＫ－１４０を部位特異的にカップリングした。所定の時間経過したごとに、サンプリングし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて反応結果を測定し、４８時間経過後に反応を停止させ、その転化率は約９０％であった。その反応結果は図１１Ｂに示す通りであった。
【0160】
高分解能質量スペクトルによる分子量測定結果を結合すれば、Ｌｙｓ－ａｚｉｄｏの還元によって、生成物がＢＣＮ－ＰＥＧとカップリングできず、さらにカップリング率が低下したと判断することができる。一方、本発明の非天然アミノ酸を含有する組換えタンパク質はＬｙｓ－ａｚｉｄｏを含有する組換えタンパク質に比べ、ＰＥＧとカップリングした場合の転化率が明らかに高くなり、しかも反応時間も明らかに短縮され、それ故、反応効率が著しく向上した。
【0161】
特に限定されない限り、本発明で使用される用語は何れも、当業者が一般的に理解する意味を持つものである。
【0162】
本発明で記述される実施形態は、例示的なものに過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものではない。当業者であれば、本発明の範囲内で種々の他の代替、変更、改良を行うことができ、それ故、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、請求項のみによって限定されるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【配列表】
【国際調査報告】