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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】骨標的療法のための操作された組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20240711BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240711BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240711BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20240711BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240711BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240711BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240711BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240711BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20240711BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240711BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
A61P19/08
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K38/05
A61P35/00
A61P35/04
A61P43/00 121
A61K47/64
C07K16/28 ZNA
C07K7/06
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503729
(86)(22)【出願日】2022-07-20
(85)【翻訳文提出日】2024-03-12
(86)【国際出願番号】 US2022073940
(87)【国際公開番号】W WO2023004348
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】63/223,875
(32)【優先日】2021-07-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510166102
【氏名又は名称】ウィリアム マーシュ ライス ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＷＩＬＬＩＡＭ ＭＡＲＳＨ ＲＩＣＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】６１００ Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ７７００５， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】シャオ ハン
(72)【発明者】
【氏名】ティアン ゼル
(72)【発明者】
【氏名】ユ チェンフェイ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC09
4C076CC27
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF68
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA23
4C084BA32
4C084NA13
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA25
4C085AA26
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA12
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA40
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA51
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、操作された骨標的化組成物、例えば、抗体又は１つ以上のポリペプチド、例えば、骨ホーミングペプチドを含むように操作された抗体又はポリペプチドを投与することによって、骨がん又はがんの骨転移などの骨疾患を治療するための方法を提供する。更に、骨標的化組成物、例えば、抗体又は１つ以上のポリペプチド、例えば、骨ホーミングペプチドを含むように操作された抗体又はポリペプチドが、本明細書において提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、骨標的化抗体。
【請求項2】
前記少なくとも１つの骨ホーミングペプチドが、抗体の許容的な内部部位に挿入されている、請求項１記載の抗体。
【請求項3】
前記少なくとも１つの骨ホーミングペプチドが、抗体の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＣＨ１）、及び／又はＣ末端（ＣＴ）に挿入されている、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項4】
２つ、３つ、又は４つの骨ホーミングペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項5】
前記骨ホーミングペプチドが、Ｌ－Ａｓｐ３、Ｌ－Ａｓｐ４、Ｌ－Ａｓｐ５、Ｌ－Ａｓｐ６、Ｌ－Ａｓｐ７、Ｌ－Ａｓｐ８、Ｌ－Ａｓｐ９、又はＬ－Ａｓｐ１０である、請求項１～４のいずれか一項記載の抗体。
【請求項6】
前記骨ホーミングペプチドが、Ｌ－Ａｓｐ６である、請求項１～４のいずれか一項記載の抗体。
【請求項7】
モノクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はナノボディである、請求項１～６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項8】
免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１～７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項9】
抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－２抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－３抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－５抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－６抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ９抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１１抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗Ｔｒｏｐ－２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ１５２抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ＧＤ２抗体、又は抗ＴＧＦβ抗体である、請求項１～８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項10】
抗ＣＤ９９抗体である、請求項１～８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項11】
薬物にコンジュゲートされている、請求項１～９のいずれか一項記載の抗体。
【請求項12】
前記薬物が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オゾガマイシン、チウキセタン、ベドチン、パスドトクスｔｄｆｘ、ベドチン、マフォドチン、カリケアマイシン、メイタンシン、又はデルクステカンである、請求項１１記載の抗体。
【請求項13】
前記薬物が、抗有糸分裂薬である、請求項１１記載の抗体。
【請求項14】
前記抗有糸分裂薬が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項１３記載の抗体。
【請求項15】
抗ＨＥＲ２抗体である、請求項１～９のいずれか一項記載の抗体。
【請求項16】
トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブ（パージェタ）、又はアテゾリズマブである、請求項１～１５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項17】
トラスツズマブである、請求項１～１６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項18】
前記トラスツズマブが、ＭＭＡＥにコンジュゲートされている、請求項１７記載の抗体。
【請求項19】
前記骨ホーミングペプチドが、トラスツズマブの残基Ａ１５３、Ａ１６５、及び／又はＧ４４９に挿入されている、請求項１～１７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項20】
Ｔｒａｓ－ＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～４）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～６）、Ｔｒａｓ－ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１０）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１２）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１４）、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１６）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～１９のいずれか一項記載の抗体。
【請求項21】
Ｔｒａｓ－ＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～４）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～６）、Ｔｒａｓ－ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１０）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１２）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１４）、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１６）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～２０のいずれか一項記載の抗体。
【請求項22】
Ｔｒａｓ－ＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～４）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～６）、Ｔｒａｓ－ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１０）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１２）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１４）、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１６）を含む、請求項１～２１のいずれか一項記載の抗体。
【請求項23】
前記骨標的化抗体が、骨ホーミングペプチドを含まない抗体と比較して、ＨＡに対する増加した結合親和性を有する、請求項１～２２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項24】
前記骨標的化抗体が、骨ホーミングペプチドを含まない抗体と比較して、ＨＡに対する２倍～３倍高い結合親和性を有する、請求項１～２３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項25】
対象における骨疾患を治療又は予防する方法であって、請求項１～２３のいずれか一項記載の骨標的化抗体の有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項26】
前記対象が、骨がん又は骨転移を有する、請求項２５記載の方法。
【請求項27】
前記骨がんが、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である、請求項２６記載の方法。
【請求項28】
前記骨転移が、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである、請求項２６記載の方法。
【請求項29】
前記乳がんが、トリプルネガティブ乳がんである、請求項２５～２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項30】
前記乳がんが、ＨＥＲ２陰性乳がんである、請求項２８～２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項31】
前記乳がんが、ＨＥＲ２陽性乳がんである、請求項２８～３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項311】
前記骨疾患が、骨粗しょう症、骨軟化症、歯周炎、関節リウマチ、代謝性骨疾患、副甲状腺障害、ステロイド誘発性骨粗しょう症、化学療法誘発性骨量減少、閉経前骨量減少、脆弱性及び再発性骨折、腎性骨異栄養症、骨感染症、又はパジェット病である、請求項２５～３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項32】
前記骨標的化抗体が、骨腫瘍ニッチでの治療用抗体の濃度の増加を結果としてもたらし、骨におけるがん発生を阻害し、かつ／又は他の臓器への二次転移を制限する、請求項２５～３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項33】
前記骨標的化抗体が、微小転移誘発性溶骨性病変の減少を結果としてもたらす、請求項２５～３２のいずれか一項記載の方法。
【請求項34】
追加の抗がん療法を更に施与する工程を含む、請求項２５～３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項35】
前記追加の抗がん療法が、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、又はサイトカイン療法を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項36】
前記追加の抗がん療法が、免疫療法又は化学療法を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項37】
がんを有する対象における骨腫瘍の治療又は予防のための、請求項１～２３のいずれか一項記載の骨標的化抗体の使用。
【請求項38】
前記対象が、骨がん又は骨転移を有する、請求項３７記載の使用。
【請求項39】
前記骨がんが、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である、請求項３８記載の使用。
【請求項40】
前記骨転移が、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである、請求項３８記載の使用。
【請求項41】
請求項１～２３のいずれか一項記載の骨標的化抗体を操作するための方法であって、少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを、該抗体の許容的な内部部位に挿入する工程を含む、該方法。
【請求項42】
前記抗体が、２つ、３つ、又は４つの骨ホーミングペプチドを含む、請求項４１記載の方法。
【請求項43】
前記骨ホーミングペプチドが、Ｌ－Ａｓｐ６である、請求項４１又は４３記載の方法。
【請求項44】
骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された１つ以上のポリペプチドを含む、骨標的化組成物。
【請求項45】
前記少なくとも１つの骨ホーミングペプチドが、ポリペプチドの許容的な内部部位に挿入されている、請求項４４記載の抗体。
【請求項46】
前記少なくとも１つの骨ホーミングペプチドが、ポリペプチドのＣ末端又はＮ末端に挿入されている、請求項４４又は４５記載の抗体。
【請求項47】
前記ポリペプチドが、２つ、３つ、又は４つの骨ホーミングペプチドを含む、請求項４４～４６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項48】
前記骨ホーミングペプチドが、Ｌ－Ａｓｐ３、Ｌ－Ａｓｐ４、Ｌ－Ａｓｐ５、Ｌ－Ａｓｐ６、Ｌ－Ａｓｐ７、Ｌ－Ａｓｐ８、Ｌ－Ａｓｐ９、又はＬ－Ａｓｐ１０である、請求項４４～４７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項49】
前記骨ホーミングペプチドが、Ｌ－Ａｓｐ６である、請求項４４～４７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項50】
前記１つ以上のポリペプチドが、アドレナリンアゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、サイトトキシン、赤血球生成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経原性因子、神経原性因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテートアンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、タンパク質分解タンパク質、タンパク質分解タンパク質阻害剤、セマフォリン、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、又は腫瘍抑制剤を含む、請求項４４～４９のいずれか一項記載の抗体。
【請求項51】
前記１つ以上のポリペプチドが、サイトカインを含む、請求項４４～５０のいずれか一項記載の抗体。
【請求項52】
前記サイトカインが、ＩＬ－６である、請求項５１記載の抗体。
【請求項53】
前記１つ以上のポリペプチドが、薬物にコンジュゲートされている、請求項４４～５２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項54】
前記薬物が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オゾガマイシン、チウキセタン、ベドチン、パスドトクスｔｄｆｘ、ベドチン、マフォドチン、カリケアマイシン、メイタンシン、又はデルクステカンである、請求項５３記載の抗体。
【請求項55】
前記薬物が、抗有糸分裂薬である、請求項５３記載の抗体。
【請求項56】
前記抗有糸分裂薬が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項５５記載の抗体。
【請求項57】
前記骨標的化組成物が、骨ホーミングペプチドを含まないポリペプチドと比較して、ＨＡに対する増加した結合親和性を有する、請求項４４～２２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項58】
前記骨標的化組成物が、骨ホーミングペプチドを含まないポリペプチドと比較して、ＨＡに対する２倍～３倍高い結合親和性を有する、請求項４４～５７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項59】
対象における骨疾患を治療又は予防する方法であって、請求項４４～５７のいずれか一項記載の骨標的化組成物の有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項60】
前記対象が、骨がん又は骨転移を有する、請求項５９記載の方法。
【請求項61】
前記骨がんが、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である、請求項６０記載の方法。
【請求項62】
前記骨転移が、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである、請求項６０記載の方法。
【請求項63】
前記乳がんが、トリプルネガティブ乳がんである、請求項５９～６２のいずれか一項記載の方法。
【請求項64】
前記乳がんが、ＨＥＲ２陰性乳がんである、請求項６２～６３のいずれか一項記載の方法。
【請求項65】
前記乳がんが、ＨＥＲ２陽性乳がんである、請求項６２～６４のいずれか一項記載の方法。
【請求項651】
前記骨疾患が、骨粗しょう症、骨軟化症、歯周炎、関節リウマチ、代謝性骨疾患、副甲状腺障害、ステロイド誘発性骨粗しょう症、化学療法誘発性骨量減少、閉経前骨量減少、脆弱性及び再発性骨折、腎性骨異栄養症、骨感染症、又はパジェット病である、請求項６０記載の方法。
【請求項66】
前記骨標的化組成物が、骨腫瘍ニッチでの治療用ポリペプチドの濃度の増加を結果としてもたらし、骨におけるがん発生を阻害し、かつ／又は他の臓器への二次転移を制限する、請求項５９～６８のいずれか一項記載の方法。
【請求項67】
前記骨標的化組成物が、微小転移誘発性溶骨性病変の減少を結果としてもたらす、請求項５９～６６のいずれか一項記載の方法。
【請求項68】
追加の抗がん療法を更に施与する工程を含む、請求項５９～６７のいずれか一項記載の方法。
【請求項69】
前記追加の抗がん療法が、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、又はサイトカイン療法を含む、請求項６８記載の方法。
【請求項70】
前記追加の抗がん療法が、免疫療法又は化学療法を含む、請求項６８記載の方法。
【請求項71】
がんを有する対象における骨腫瘍の治療又は予防のための、請求項４４～５７のいずれか一項記載の骨標的化組成物の使用。
【請求項72】
前記対象が、骨がん又は骨転移を有する、請求項７１記載の使用。
【請求項73】
前記骨がんが、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である、請求項７２記載の使用。
【請求項74】
前記骨転移が、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである、請求項７２記載の使用。
【請求項75】
請求項４４～５７のいずれか一項記載の骨標的化組成物を操作するための方法であって、少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを、ポリペプチドの許容的な内部部位に挿入する工程を含む、該方法。
【請求項76】
前記ポリペプチドが、２つ、３つ、又は４つの骨ホーミングペプチドを含む、請求項７５記載の方法。
【請求項77】
前記骨ホーミングペプチドが、Ｌ－Ａｓｐ６である、請求項７５又は７７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０２１年７月２０日出願の米国特許仮出願第６３／２２３，８７５号の優先権の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２１年７月２０日出願の米国特許仮出願第６３／２２３，８７５号の優先権の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【0002】
配列表の組み入れ
本出願は、電子的に提出されおり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、配列表ＸＭＬを含有する。２０２２年７月１８日に作成された前記ＸＭＬ配列表は、ＲＩＣＥＰ００８５ＷＯ．ｘｍｌという名称であり、サイズが３０，３２７バイトである。
本出願は、電子的に提出されおり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、配列表ＸＭＬを含有する。２０２２年７月１８日に作成された前記ＸＭＬ配列表は、ＲＩＣＥＰ００８５ＷＯ．ｘｍｌという名称であり、サイズが３０，３２７バイトである。
【0003】
１．分野
本開示は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、抗体又はポリペプチドの部位特異的送達の方法に関する。
本開示は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、抗体又はポリペプチドの部位特異的送達の方法に関する。
【背景技術】
【0004】
２．関連技術
抗体ベースの治療法は、３０年超前に臨床現場に入り、悪性腫瘍１，２、感染性疾患３，４、及び移植拒絶反応５を有する患者にとって主流の治療選択肢になってきている。これらの生物学的治療薬は、伝統的な化学療法と比較して、腫瘍関連抗原を提示する細胞を優先的に標的とし、治療転帰の改善及び副作用の低減を結果としてもたらす６，７，８，９。腫瘍抗原に対するその高い親和性にかかわらず、脳及び骨における治療用抗体の不十分な腫瘍組織浸透及び不均一な分布により、これらの組織における疾患の治療においてその有効性が有意に限定されている。これらの組織において腫瘍全体にわたって有効な抗体用量を送達できないことは、治療の失敗だけでなく、獲得薬剤耐性の発生ももたらす１０。治療に満たない抗体レベルに対する曝露は、抗体媒介性殺傷を回避する腫瘍細胞の能力を促進することが示されている１１，１２。更に、腫瘍ニッチにおいて抗体の有効濃度を確保する試みは、通常、他の組織において高い濃度をもたらし、治療薬の使用を限定又は排除し得る有害な全身副作用を結果としてもたらす。したがって、全身送達後に特定の組織において抗体の腫瘍浸透及び分布を改善する戦略が、これらの作用物質の臨床的可能性を最適化するために必要とされる。
抗体ベースの治療法は、３０年超前に臨床現場に入り、悪性腫瘍１，２、感染性疾患３，４、及び移植拒絶反応５を有する患者にとって主流の治療選択肢になってきている。これらの生物学的治療薬は、伝統的な化学療法と比較して、腫瘍関連抗原を提示する細胞を優先的に標的とし、治療転帰の改善及び副作用の低減を結果としてもたらす６，７，８，９。腫瘍抗原に対するその高い親和性にかかわらず、脳及び骨における治療用抗体の不十分な腫瘍組織浸透及び不均一な分布により、これらの組織における疾患の治療においてその有効性が有意に限定されている。これらの組織において腫瘍全体にわたって有効な抗体用量を送達できないことは、治療の失敗だけでなく、獲得薬剤耐性の発生ももたらす１０。治療に満たない抗体レベルに対する曝露は、抗体媒介性殺傷を回避する腫瘍細胞の能力を促進することが示されている１１，１２。更に、腫瘍ニッチにおいて抗体の有効濃度を確保する試みは、通常、他の組織において高い濃度をもたらし、治療薬の使用を限定又は排除し得る有害な全身副作用を結果としてもたらす。したがって、全身送達後に特定の組織において抗体の腫瘍浸透及び分布を改善する戦略が、これらの作用物質の臨床的可能性を最適化するために必要とされる。
【0005】
９０％よりも高い５年生存率にかかわらず、乳がん生存者の２０～４０％は、最初の治療の数年後であっても、遠隔臓器への転移を最終的に経験する１３。骨は、乳がん転移の最も頻繁な組織である１４，１５。骨微小環境への投薬は、血管新生の比較的低い密度及び浸透に対する物理的障壁の存在のために、困難であることが判明している。抗体ベースの治療法は、これらの作用物質の大きな分子サイズのために、特別な分布の困難に直面する。したがって、原発性乳腺腫瘍の治療に優れた有効性を示す治療用抗体は、骨転移を有する患者において最適に満たない応答のみを生じる。例えば、原発性乳腫瘍においてヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を成功裏に標的とするトラスツズマブ（ハーセプチン）抗体はまた、転移性乳がんを有する患者のための治療選択肢としても評価されている。いくらかの乳がん患者は、これらの治療から恩恵を受けるが、骨転移を有する乳がん患者の多数は、１年以内に更なる腫瘍進行を経験し、わずかな患者しか長期の寛解を達成しない１６。したがって、治療用抗体の有効性は、骨転移の症例において、特に限定されているように見える。
【発明の概要】
【0006】
概要
ある特定の実施形態では、本開示は、骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、骨標的化ポリペプチド又はタンパク質（例えば、抗体）のための方法を提供する。一実施形態では、本開示は、骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、骨標的化抗体のための方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、骨ＨＡに選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、１つ以上の骨標的化ポリペプチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、骨標的化ポリペプチド又はタンパク質（例えば、抗体）のための方法を提供する。一実施形態では、本開示は、骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、骨標的化抗体のための方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、骨ＨＡに選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、１つ以上の骨標的化ポリペプチドを提供する。
【0007】
いくつかの態様では、少なくとも１つの骨ホーミングペプチドは、抗体の許容的な内部部位に挿入されている。ある特定の態様では、少なくとも１つの骨ホーミングペプチドは、抗体の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＣＨ１）、及び／又はＣ末端（ＣＴ）に挿入されている。
【0008】
いくつかの態様では、少なくとも１つの骨ホーミングペプチドは、１つ以上のポリペプチドのＣ末端又はＮ末端に挿入されている。
【0009】
ある特定の態様では、抗体又はポリペプチドは、２つ、３つ、又は４つの骨ホーミングペプチドを含む。特定の態様では、骨ホーミングペプチドは、Ｌ－Ａｓｐ３、Ｌ－Ａｓｐ４、Ｌ－Ａｓｐ５、Ｌ－Ａｓｐ６、Ｌ－Ａｓｐ７、Ｌ－Ａｓｐ８、Ｌ－Ａｓｐ９、又はＬ－Ａｓｐ１０である。いくつかの態様では、骨ホーミングペプチドは、少なくとも３個の連続したアスパラギン酸、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、又は１０個のアスパラギン酸を含む。具体的な態様では、骨ホーミングペプチドは、Ｌ－Ａｓｐ６である。
【0010】
いくつかの態様では、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はナノボディである。特定の態様では、抗体は、免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの態様では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－２抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－３抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－５抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－６抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ９抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１１抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗Ｔｒｏｐ－２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ１５２抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ＧＤ２抗体、又は抗ＴＧＦβ抗体である。いくつかの態様では、抗体は、抗ＣＤ９９抗体である。
【0011】
いくつかの態様では、１つ以上のポリペプチドは、アドレナリンアゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、サイトトキシン、赤血球生成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経原性因子、神経原性因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテートアンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、タンパク質分解タンパク質、タンパク質分解タンパク質阻害剤、セマフォリン、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、又は腫瘍抑制剤を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、サイトカインを含む。具体的な態様では、サイトカインは、ＩＬ－６である。特定の態様では、ＩＬ－６は、Ｃ末端に骨ホーミングペプチドを含む。
【0012】
更なる態様では、抗体又はポリペプチドは、薬物にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オゾガマイシン、チウキセタン、ベドチン、パスドトクスｔｄｆｘ、ベドチン、マフォドチン、カリケアマイシン、メイタンシン、又はデルクステカンである。特定の態様では、薬物は、抗有糸分裂薬、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
【0013】
いくつかの態様では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。例えば、抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブ（パージェタ）、又はアテゾリズマブである。特定の態様では、抗体は、トラスツズマブであり、例えば、トラスツズマブは、ＭＭＡＥにコンジュゲートされている。具体的な態様では、骨ホーミングペプチドは、トラスツズマブの残基Ａ１５３、Ａ１６５、及び／又はＧ４４９に挿入されている。
【0014】
ある特定の態様では、抗体は、Ｔｒａｓ－ＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～４）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～６）、Ｔｒａｓ－ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１０）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１２）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１４）、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１６）に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。特定の態様では、抗体は、Ｔｒａｓ－ＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～４）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～６）、Ｔｒａｓ－ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１０）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１２）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１４）、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１６）を含む。
【0015】
いくつかの態様では、骨標的化抗体又はポリペプチドは、骨ホーミングペプチドを含まない抗体又はポリペプチドと比較して、ＨＡに対する増加した結合親和性を有する。特定の態様では、骨標的化抗体は、骨ホーミングペプチドを含まない抗体又はポリペプチドと比較して、ＨＡに対する２倍～３倍高い結合親和性を有する。
【0016】
更なる実施形態は、対象における骨疾患（例えば、骨腫瘍）を治療又は予防する方法であって、本実施形態及びその態様のいずれかの骨標的化抗体又はポリペプチド（例えば、骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、骨標的化抗体又はポリペプチド）の有効量を該対象に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【0017】
いくつかの態様では、対象は、骨がん又は骨転移を有する。ある特定の態様では、骨がんは、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である。特定の態様では、骨転移は、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである。具体的な態様では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がん、ＨＥＲ２陰性乳がん、又はＨＥＲ２陽性乳がんである。
【0018】
ある特定の態様では、骨疾患は、骨粗しょう症、骨軟化症、歯周炎、関節リウマチ、代謝性骨疾患、副甲状腺障害、ステロイド誘発性骨粗しょう症、化学療法誘発性骨量減少、閉経前骨量減少、脆弱性及び再発性骨折、腎性骨異栄養症、骨感染症、又はパジェット病である。本明細書で提供される方法及び組成物は、皮質骨及び／若しくは海綿骨の減少を低減し、皮質骨及び／若しくは海綿骨のミネラル含有量減少を低減し、骨の生体力学的耐性を改善し、骨形成を増加させ、かつ／又は骨吸収を低減するために使用され得る。
【0019】
ある特定の態様では、骨標的化抗体又はポリペプチドは、骨腫瘍ニッチでの治療用抗体又はポリペプチドの濃度の増加を結果としてもたらし、骨におけるがん発生を阻害し、かつ／又は他の臓器への二次転移を制限する。いくつかの態様では、骨標的化抗体又はポリペプチドは、微小転移誘発性溶骨性病変の減少を結果としてもたらす。
【0020】
更なる態様では、方法は、追加の抗がん療法を更に施与する工程を含む。いくつかの態様では、追加の抗がん療法は、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、又はサイトカイン療法を含む。例えば、追加の抗がん療法は、免疫療法又は化学療法を含む。
【0021】
別の実施形態は、がんを有する対象における骨疾患（例えば、骨腫瘍）の治療又は予防のための、本実施形態及びその態様のいずれかの骨標的化抗体又はポリペプチド（例えば、骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、骨標的化抗体）の使用を提供する。
【0022】
いくつかの態様では、対象は、骨がん又は骨転移を有する。ある特定の態様では、骨がんは、ユーイング肉腫、骨肉腫、又は軟骨肉腫である。特定の態様では、骨転移は、乳がん、骨髄腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、甲状腺がん、又は膀胱がんからのものである。具体的な態様では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がん、ＨＥＲ２陰性乳がん、又はＨＥＲ２陽性乳がんである。
【0023】
ある特定の態様では、骨疾患は、骨粗しょう症、骨軟化症、歯周炎、関節リウマチ、代謝性骨疾患、副甲状腺障害、ステロイド誘発性骨粗しょう症、化学療法誘発性骨量減少、閉経前骨量減少、脆弱性及び再発性骨折、腎性骨異栄養症、骨感染症、又はパジェット病である。本明細書で提供される方法及び組成物は、皮質骨及び／若しくは海綿骨の減少を低減し、皮質骨及び／若しくは海綿骨のミネラル含有量減少を低減し、骨の生体力学的耐性を改善し、骨形成を増加させ、かつ／又は骨吸収を低減するために使用され得る。
【0024】
ある特定の態様では、骨標的化抗体又はポリペプチドは、骨腫瘍ニッチでの治療用抗体又はポリペプチドの濃度の増加を結果としてもたらし、骨におけるがん発生を阻害し、かつ／又は他の臓器への二次転移を制限する。いくつかの態様では、骨標的化抗体は、微小転移誘発性溶骨性病変の減少を結果としてもたらす。
【0025】
更なる態様では、使用は、追加の抗がん療法を更に含む。いくつかの態様では、追加の抗がん療法は、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、又はサイトカイン療法を含む。例えば、追加の抗がん療法は、免疫療法又は化学療法を含む。
【0026】
別の実施形態は、本実施形態及びその態様のいずれかの骨標的化抗体又はポリペプチド（例えば、骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に選択的に結合する少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを含むように操作された、骨標的化抗体又はポリペプチド）を操作するための方法であって、少なくとも１つの骨ホーミングペプチドを、該抗体の許容的な内部部位に、又は該ポリペプチドのＣ末端若しくはＮ末端に挿入する工程を含む、前記方法を提供する。
【0027】
いくつかの態様では、少なくとも１つの骨ホーミングペプチドは、抗体の許容的な内部部位に挿入されている。ある特定の態様では、少なくとも１つの骨ホーミングペプチドは、抗体の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＣＨ１）、及び／又はＣ末端（ＣＴ）に挿入されている。
【0028】
ある特定の態様では、抗体又はポリペプチドは、２つ、３つ、又は４つの骨ホーミングペプチドを含む。特定の態様では、骨ホーミングペプチドは、Ｌ－Ａｓｐ３、Ｌ－Ａｓｐ４、Ｌ－Ａｓｐ５、Ｌ－Ａｓｐ６、Ｌ－Ａｓｐ７、Ｌ－Ａｓｐ８、Ｌ－Ａｓｐ９、又はＬ－Ａｓｐ１０である。いくつかの態様では、骨ホーミングペプチドは、少なくとも３個の連続したアスパラギン酸、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、又は１０個のアスパラギン酸を含む。具体的な態様では、骨ホーミングペプチドは、Ｌ－Ａｓｐ６である。
【0029】
いくつかの態様では、抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、又はナノボディである。特定の態様では、抗体は、免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの態様では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－２抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－３抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－５抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－６抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ９抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１０抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１１抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗Ｔｒｏｐ－２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ１５２抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ＧＤ２抗体、又は抗ＴＧＦβ抗体である。
【0030】
いくつかの態様では、１つ以上のポリペプチドは、アドレナリンアゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、サイトトキシン、赤血球生成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経原性因子、神経原性因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテートアンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、タンパク質分解タンパク質、タンパク質分解タンパク質阻害剤、セマフォリン、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取り込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、又は腫瘍抑制剤を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、サイトカインを含む。具体的な態様では、サイトカインは、ＩＬ－６である。特定の態様では、ＩＬ－６は、Ｃ末端に骨ホーミングペプチドを含む。
【0031】
更なる態様では、抗体又はポリペプチドは、薬物にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オゾガマイシン、チウキセタン、ベドチン、パスドトクスｔｄｆｘ、ベドチン、マフォドチン、カリケアマイシン、メイタンシン、又はデルクステカンである。特定の態様では、薬物は、抗有糸分裂薬、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
【0032】
いくつかの態様では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。例えば、抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペルツズマブ（パージェタ）、又はアテゾリズマブである。特定の態様では、抗体は、トラスツズマブであり、例えば、トラスツズマブは、ＭＭＡＥにコンジュゲートされている。具体的な態様では、骨ホーミングペプチドは、トラスツズマブの残基Ａ１５３、Ａ１６５、及び／又はＧ４４９に挿入されている。
【0033】
ある特定の態様では、抗体は、Ｔｒａｓ－ＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～４）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～６）、Ｔｒａｓ－ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１０）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１２）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１４）、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１６）に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。特定の態様では、抗体は、Ｔｒａｓ－ＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～４）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～６）、Ｔｒａｓ－ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～８）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１０）、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１２）、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３～１４）、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１６）を含む。
【0034】
本明細書に記載の任意の方法又は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法又は組成物に関して実施できることが企図される。例えば、１つの方法によって合成された化合物は、異なる方法による最終化合物の調製に使用され得る。
【0035】
本開示の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明及び具体的な例は、本開示の具体的な実施形態を示すが、例示としてのみ与えられていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0036】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様を更に実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、より良好に理解され得る。
【0037】
【図1】図１Ａ～１Ｂ：（図１Ａ）ヒドロキシアパタイト結合タンパク質のタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２６）。（図１Ｂ）治療用抗体は、骨ヒドロキシアパタイトマトリックスに結合する骨ホーミングペプチド配列を導入することによって、骨に特異的に送達することができる。
【図2】図２Ａ～２Ｈ：骨標的化抗体の調製及び特徴評価。（図２Ａ）骨ホーミングペプチドを、３つの場所：軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＣＨ１）、及びｃ末端（ＣＴ）に挿入した。（図２Ｂ）還元試薬の存在下（左）及び非存在下（右）での骨標的化抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（図２ＣＣ）骨標的化抗体の質量分析法での分析。（図２Ｄ）ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に対するＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの結合動態。（図２Ｅ）Ｔｒａｓ及び骨標的化コンジュゲートの差次的な骨標的化能力。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの非脱石灰化骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ又は骨標的化コンジュゲートと一晩インキュベートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ及び４μｇ／ｍＬのキシレノールオレンジ（ＸＯ、骨を標識することが知られている）で染色した。スケールバー、２００μｍ。（図２Ｆ）ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－）細胞に対するＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ結合のフローサイトメトリープロファイル。（図２Ｇ）ＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴのインビトロ細胞傷害性。（図２Ｈ）Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ抗体の後眼窩注射の７２時間後又は１２０時間後の、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスの下肢のエクスビボ蛍光画像。腫瘍細胞を、傍脛骨（ｐａｒａ－ｔｉｂｉａｌ）注射を介してヌードマウスの右脛骨中に接種した。
【図3】図３Ａ～３Ｓ：骨標的化抗体は、乳がん骨転移を阻害する。（図３Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、ヌードマウスの右後肢中に傍脛骨注射し、続いて、ＰＢＳ、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回）、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（Ｔｒａｓと同じ）で治療した。腫瘍負荷を、毎週の生物発光撮像によって監視した。（図３Ｂ～３Ｃ）図３Ａに記載されるように治療したマウスにおける、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の平均発光強度の倍率変化。ｐ値は、二元配置分散分析検定に基づく。（図３Ｄ）図３Ａに記載されるように治療したマウスの、安楽死までの時間のカプラン・マイヤープロット。各個々のマウスについて、全身におけるＢＬＩシグナルが１０７光子秒－１に到達したことをエンドポイントと見なした。（図３Ｅ）経時的な腫瘍担持マウスの体重変化。（図３Ｆ）ＰＢＳ、Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴで治療した群の、仰臥位でのＭｉｃｒｏＣＴ走査。（図３Ｇ）骨体積（ＢＶ）の定量的分析。（図３Ｈ）骨表面／骨体積の比（ＢＳ／ＢＶ）の定量的分析。（図３Ｉ）骨体積／組織体積の比（ＢＶ／ＴＶ）の定量的分析。（図３Ｊ）海綿骨の厚さ（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）（Ｔｂ．Ｔｈ）の定量的分析。（図３Ｋ）海綿骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の定量的分析。（図３Ｌ）各群からの脛骨／大腿骨の代表的な長手方向、正中矢状のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片。Ｔ：腫瘍；Ｂ：骨；ＢＭ：骨髄。（図３Ｍ）各群からの骨切片のＨＥＲ２及びＴＲＡＰ染色の代表的な画像。（図３Ｎ）各群における腫瘍－骨界面で計算した、画像当たりの破骨細胞数（図３Ｋにおけるピンク色の細胞を、破骨細胞陽性細胞と見なした）。（図３Ｏ）ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、ヌードマウスの右後肢中に傍脛骨注射し、続いて、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、２週間毎２ヶ月間）及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（Ｔｒａｓと同じ）で治療した。腫瘍負荷を、毎週の生物発光撮像によって監視した。（図３Ｐ）図３Ｏに記載されるように治療したマウスにおける、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の平均発光強度の倍率変化。（図３Ｑ）（Ｏ）に記載されるように治療したマウスにおける、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の個々の発光強度の倍率変化。（図３Ｒ）図３Ｏに記載されるように治療したマウスの、安楽死までの時間のカプラン・マイヤープロット。各個々のマウスについて、全身におけるＢＬＩシグナルが１０８光子ｓ－１に到達したことをエンドポイントと見なした。（図３Ｓ）経時的な図３Ｏにおける腫瘍担持マウスの体重変化。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、及びｎ．s．Ｐ＞０．０５。
【図4】図４Ａ～４Ｃ：（図４Ａ）骨病変は、複数の臓器への二次転移をより容易に引き起こす。（図４Ｂ）Ｔｒａｓ又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスの様々な臓器において観察された二次転移。（図４Ｃ）ＰＢＳ、Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスからの組織における、エクスビボＢＬＩ強度及び転移関与の状態のヒートマップ。各列は個々の動物を表し、各行は組織の種類を表す。転移の存在は、１２０秒の露光時間下で１８カウント／ピクセルを上回るＢＬＩシグナルの存在として定義した。多部位転移は、少なくとも３つの組織の転移関与として定義した。ｐ値は、転移関与の頻度についてはフィッシャーの正確検定によって決定し、一方、転移負荷についてはマン・ホイットニー検定によって決定した。
【図5】ＴｒａｓのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図6】Ｔｒａｓ－ＬＣのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図7】Ｔｒａｓ－ＣＨ１のＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図8】Ｔｒａｓ－ＣＴのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図9】Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１のＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図10】Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図11】Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図12】Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図13】Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの差次的な海綿骨標的化能力。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの非脱石灰化骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴと一晩インキュベートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ及び４μｇ／ｍＬのキシレノールオレンジ（ＸＯ、骨を標識することが知られている）で染色した。スケールバー、２００μｍ。
【図14】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓとインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図15】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ－ＬＣ結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓ－ＬＣとインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図16】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ－ＣＴ結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓ－ＣＴとインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図17】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ－ＣＨ１結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓ－ＣＨ１とインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図18】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＴとインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図19】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴとインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図20】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴとインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図21】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１とインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図22】ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ結合。ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、増加する濃度のＴｒａｓとインキュベートし、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ＫＤを、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（ＫＤ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］。
【図23】ＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＴｒａｓ－ＣＨ１、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１の細胞表面結合。ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋＋＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－）細胞に対するＴｒａｓ－ＣＨ１、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１結合のフローサイトメトリープロファイル。
【図24】主臓器のエクスビボ蛍光画像。Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの後眼窩注射の４８時間後の、Ｃ５７／ＢＬ６マウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳。
【図25】図２５Ａ～２５Ｃ：Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの生体内分布についてのインビボ及びエクスビボの蛍光画像分析。（図２５Ａ）Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの後眼窩注射の７２時間後又は１２０時間後。骨及び主臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳）を収集し、分析した。（図２５Ｂ）様々な組織（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、及び骨）におけるＴｒａｓ及び骨標的化抗体の分布の定量的分析。（図２５Ｃ）ＰＢＳ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴでの治療後の、Ｈ＆Ｅ染色での心臓の組織学的分析。＊Ｐ＜０．０５、及びｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
【図26】図２６Ａ～２６Ｃ：治療中のＢＬＩシグナル強度の倍率変化。ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、ヌードマウスの右後肢中に傍脛骨注射し、続いて、ＰＢＳ、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回）、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ（Ｔｒａｓと同じ）で治療した。腫瘍負荷を、毎週の生物発光撮像によって監視した。（図２６Ａ）図３Ａに記載されるように治療したマウスにおける、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の平均発光強度の倍率変化。Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの群を比較する二元配置分散分析。（図２６Ｂ）Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの群の間で平均発光強度の倍率変化を比較する二元配置分散分析。（図２６Ｃ）Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの間で個々の発光強度の倍率変化を比較する二元配置分散分析。
【図27】図２７Ａ～２７Ｄ：ＢＬＩシグナル伝達の定量化。（図２７Ａ）関心対象の領域において検出された放射輝度によって定量化した、各治療群からのＢＬＩ。（図２７Ｂ）Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの群の間でＢＬＩを比較する二元配置分散分析。（図２７Ｃ）Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの群の間でＢＬＩを比較する二元配置分散分析。（図２７Ｄ）図２７Ｃに記載されるような様々な治療群の個々の発光強度。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図28】ＭｉｃｒｏＣＴに基づく骨の３Ｄレンダリング。皮質骨、皮質区画の画像は、対照（Ｃｏｎ）、Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＬ／ＣＴの治療群の皮質骨破壊を示す。海綿骨、皮質区画の画像は、対照、Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＬ／ＣＴの治療群の海綿骨破壊を示す。
【図29】各治療群からの代表的なｍｉｃｒｏＣＴスライス。成長板近傍（下パネル）、成長板の１．２５ｍｍ遠位（中央パネル、海綿骨と見なす）、及び成長板の３．２５ｍｍ遠位（中央プレート、皮質骨と見なす）のＭｉｃｒｏＣＴスライス。
【図30】各群からの骨切片のＨＥＲ２染色の代表的な画像。
【図31】対照及びＴｒａｓ群からの骨切片のＴＲＡＰ染色。
【図32】Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴからの骨切片のＴＲＡＰ染色。
【図33】図３３Ａ～３３Ｂ：ＭＤＡ－ＭＢ－３６１モデルに対する骨標的化抗体の効果：血清ＴＲＡＣＰ ５ｂ及びカルシウムレベルの分析。（図３３Ａ）ＰＢＳ、Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスの血清ＴＲＡｃＰ ５ｂレベル。（図３３Ｂ）各治療群からのマウスの血清カルシウムレベル。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、及びｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
【図34】図３４Ａ～３４Ｂ：ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞株における多臓器転移に対する骨標的化抗体の効果。（図３４Ａ）ＰＢＳ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスの様々な臓器において観察された二次転移。（図３４Ｂ）ＰＢＳ、Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスからの組織における、エクスビボＢＬＩ強度及び転移関与の状態のヒートマップ。各列は個々の動物を表し、各行は組織の種類を表す。転移の存在は、１２０秒の露光時間下で１８カウント／ピクセルを上回るＢＬＩシグナルの存在として定義した。多部位転移は、少なくとも３つの組織の転移関与として定義した。ｐ値は、転移関与の頻度についてはフィッシャーの正確検定によって決定し、一方、転移負荷についてはマン・ホイットニー検定によって決定した。
【図35】骨ホーミングペプチドで修飾された抗体－薬物コンジュゲートであるトラスツズマブ－モノメチルアウリスタチンＥ ＡＤＣは、より良好な抗腫瘍活性を実証した。
【図36】図３６Ａ～３６Ｅ：（図３６Ａ）ＭＣＦ－７細胞を、ヌードマウスの右後肢中に傍脛骨注射し、続いて、Ｔｒａｓ（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回２ヶ月間）及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（Ｔｒａｓと同じ）で治療した。腫瘍負荷を、毎週の生物発光撮像によって監視した。（図３６Ｂ）図３６Ａに記載されるように治療したマウスにおける、ＭＣＦ－７腫瘍の平均発光強度の倍率変化。ｐ値は、二元配置分散分析検定に基づく。（図３６Ｃ）図３６Ａに記載されるように治療したマウスにおける、ＭＣＦ－７腫瘍の個々の発光強度の倍率変化。（図３６Ｄ）図３６Ａに記載されるように治療したマウスの、安楽死までの時間のカプラン・マイヤープロット。各個々のマウスについて、５×１０７光子ｓ－１に到達する全身におけるＢＬＩシグナルをエンドポイントと見なした。（図３６Ｅ）経時的な図３６Ａにおける腫瘍担持マウスの体重変化。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊Ｐ＜０．０５、及びｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
【図37】図３７Ａ～３７Ｋ：（図３７Ａ）骨標的化抗体－薬物コンジュゲートの調製。Ｔｒａｓ抗体を、最初に重鎖（ＣＨ１）及びｃ末端（ＣＴ）での骨ホーミングペプチドで修飾し、続いて、ｐＣｌｉｃｋ抗体コンジュゲーション技術を用いてＭＭＡＥで修飾した。（図３７Ｂ）非還元条件下（左）及び還元条件下（右）でのＴｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（図３７Ｃ、Ｄ）ＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８がん細胞に対する、ＭＭＡＥ、Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ、及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥのインビトロ細胞傷害性。（図３７Ｅ）Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの差次的な骨標的化能力。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの非脱石灰化骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥと一晩インキュベートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ及び４μｇ／ｍＬのキシレノールオレンジ（ＸＯ、骨を標識することが知られている）で染色した。（図３７Ｆ）ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、ヌードマウスの右後肢中に傍脛骨注射し、続いて、Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ（滅菌ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、毎週２ヶ月間）及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ（Ｔｒａｓと同じ）で治療した。腫瘍負荷を、毎週の生物発光撮像によって監視した。（図３７Ｇ）図３７Ｆに記載されるように治療したマウスにおける、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の平均発光強度の倍率変化。（図３７Ｈ）図３７Ｆに記載されるように治療したマウスにおける、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の個々の発光強度の倍率変化。（図３７Ｉ）経時的な図３７Ｆにおける腫瘍担持マウスの体重変化。（図３７Ｊ）腫瘍移植後にＴｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥで治療したマウスからの骨のＭｉｃｒｏ－ＣＴ走査。（図３７Ｋ）Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥで治療したマウスからの組織における、エクスビボＢＬＩ強度及び転移関与の状態のヒートマップ。各列は個々の動物を表し、各行は組織の種類を表す。転移の存在は、１２０秒の露光時間下で１８カウント／ピクセルを上回るＢＬＩシグナルの存在として定義した。多部位転移は、少なくとも３つの組織の転移関与として定義した。ｐ値は、転移関与の頻度についてはフィッシャーの正確検定によって決定し、転移負荷についてはマン・ホイットニー検定によって決定した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１及びｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
【図39】図３９Ａ～３９Ｇ：骨部位での腫瘍負荷の分析。（図３９Ａ）ＰＢＳ、Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ、及びシャムで治療した群の、仰臥位でのＭｉｃｒｏＣＴ走査。（図３９Ｂ）骨体積（ＢＶ）の定量的分析。（図３９Ｃ）骨体積／組織体積の比（ＢＶ／ＴＶ）の定量的分析。（図３９Ｄ）海綿骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の定量的分析。（図３９Ｅ）海綿骨の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）の定量的分析。（図３９Ｆ）骨表面／骨体積の比（ＢＳ／ＢＶ）の定量的分析。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、及びｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。（図３９Ｇ）各群からの脛骨／大腿骨の代表的な長手方向及び正中矢状のＨ＆Ｅ染色切片。Ｔ：腫瘍；Ｂ：骨；ＢＭ：骨髄。
【図40】図４０Ａ～４０Ｂ：Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴのインビトロ安定性。（図４０Ａ）ＰＢＳ中、４℃で３ヶ月間インキュベートした後のＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。（図４０Ｂ）ＰＢＳ中、４℃で３ヶ月間インキュベートした後のＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。
【図41】Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴの薬物動態プロファイル。腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウス（手術の３ヶ月後）に、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇのＴｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴを後眼窩注射した。血清中の抗体濃度を、ＥＬＩＳＡキットによって決定した（データは、３つの独立した反復の平均±ＳＤとして提示した）。
【図42】高用量の骨標的化抗体は、乳がん骨転移を阻害する。腫瘍負荷を、毎週のＢＬＩによって監視した。
【図43】図４３Ａ～４３Ｂ：ＭＤＡ－ＭＢ－３６１治療群における高用量からのＢＬＩシグナル伝達の定量化。（図４３Ａ）関心対象の領域において検出された放射輝度によって定量化した、各治療群からのＢＬＩ。Ｔｒａｓ群とＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ群との間でＢＬＩを比較する、二元配置分散分析。（図４３Ｂ）図３Ｏに記載されるような様々な治療群の個々の発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図44】図４４Ａ～４４Ｂ：ＭＣＦ－７モデルの治療群からのＢＬＩシグナル伝達の定量化。（図４４Ａ）関心対象の領域において検出された放射輝度によって定量化した、各治療群からのＢＬＩ。Ｔｒａｓ群とＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ群との間でＢＬＩを比較する、二元配置分散分析。（図４４Ｂ）図４Ａ～Ｃに記載されるような様々な治療群の個々の発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図45】図４５Ａ～４５Ｃ：原発腫瘍を有するマウスに対するＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴの治療効果。（図４５Ａ）接種の２１日後のヌードマウスから外科的に取り出した腫瘍組織。（図４５Ｂ）接種後の様々な時点で、ＰＢＳ、Ｔｒａｓ、又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスの腫瘍体積。（図４５Ｃ）接種後の様々な時点で、Ｔｒａｓ又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスの腫瘍体積。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
【図46】図４６Ａ～４６Ｅ：Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴでの治療後のマウスの免疫応答の評価。（図４６Ａ）血液から得たＢ細胞、単球、好中球、マクロファージ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の懸濁液を、様々な表面マーカーで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。（図４６Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ、及びＢ細胞におけるＩＦＮγレベル。（図４６Ｃ、４６Ｄ、４６Ｅ）マウスからの血漿試料のＩＬ２、ＩＬ４、及びＩＦＮγの分析。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
【図47】Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴを注射したマウスにおいて発生した抗トラスツズマブ抗体レベル。Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ群：マウスを、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（５ｍｇ／ｋｇ）で、週２回１ヶ月間治療した。
【図48】Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図49】Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥのＥＳＩ－ＭＳスペクトル。
【図50】ＳＫＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するＴｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの細胞表面結合。細胞を、培地中の３０ｎＭ Ｔｒａｓ－ＡＬＮと３７℃で３０分間インキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色（青色蛍光）をした。
【図51】図５１Ａ～５１Ｂ：Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ治療中のＢＬＩシグナル強度の倍率変化。（図５１Ａ）図３７Ｆに記載されるように治療したマウスにおける、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍の平均発光強度の倍率変化。Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの群を比較する二元配置分散分析。（図５１Ｂ）Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥとＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥとの間で個々の発光強度の倍率変化を比較する二元配置分散分析。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図52】図５２Ａ～５２Ｄ：Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ治療群からのＢＬＩシグナル伝達の定量化。（図５２Ａ）関心対象の領域において検出された放射輝度によって定量化した、各治療群からのＢＬＩ。ＰＢＳ、Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ、及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴＭＭＡＥの群の間でＢＬＩを比較する二元配置分散分析。（図５２Ｂ）ＰＢＳ、Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ、及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの治療群の個々の発光強度。（図５２Ｃ）Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ群とＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ群との間でＢＬＩを比較する二元配置分散分析。（図５２Ｄ）Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの治療群の個々の発光強度。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図53】各治療群からの皮質骨及び海綿骨の代表的なｍｉｃｒｏＣＴスライス。
【図54】図５４Ａ～５４Ｂ：ＭＤＡ－ＭＢ－３６１モデルに対するＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの効果：ＢＶ／ＴＶ及びＴｂ．Ｔｈの分析。（図５４Ａ）骨体積／組織体積の比（ＢＶ／ＴＶ）の定量的分析。（図５４Ｂ）海綿骨の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）の定量的分析。＊＊Ｐ＜０．０１及びｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５。
【図55】図５５Ａ～５５Ｂ：Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ治療群と他の治療群との比較。（図５５Ａ）各群からの脛骨／大腿骨の代表的な長手方向、正中矢状のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片。（図５５Ｂ）各群からの骨切片のＨＥＲ２染色の代表的な画像。
【図56】Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥで治療したマウスの様々な臓器において観察された二次転移。
【図57】図５７Ａ～５７Ｄ：骨標的化抗体の調製及び特徴評価。（図５７Ａ）骨ホーミングペプチドを、３つの場所：軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＣＨ１）、及びｃ末端（ＣＴ）に挿入した。（図５７Ｂ）抗体のＥＳＩ－ＭＳ分析。（図５７Ｃ）ユーイング肉腫及び骨肉腫細胞株に対するαＣＤ９９抗体の結合。（図５７Ｄ）フローサイトメトリーによって検出されたＥＳ細胞におけるαＣＤ９９抗体により誘発された細胞アポトーシス。
【図58】図５８Ａ～５８Ｄ：（図５８Ａ）ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）に対するαＣＤ９９抗体の結合動態。（図５８Ｂ）野生型αＣＤ９９及び骨標的化αＣＤ９９変異体の差次的な骨標的化能力。スケールバー、２００μｍ。（図５８Ｃ）ＮＩＲ標識αＣＤ９９及びαＣＤ９９－ＣＨ１／ＣＴの後眼窩注射の７日後又は９日後の、ＳＫ－ＥＳ－１腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスの下肢のエクスビボ蛍光画像。（図５８Ｄ～５８Ｅ）ＨＵＶＥＣ細胞及び単球に対するαＣＤ９９のインビトロ細胞傷害性。
【図59】図５９Ａ～５９Ｄ：１２Ｅ７抗体は異種移植片モデルにおいてユーイング肉腫腫瘍を阻害する。（図５９Ａ）ＳＫ－ＥＳ－１細胞を、ヌードマウスの右後肢中に脛骨内注射し、続いて、ＰＢＳ及び１２Ｅ７抗体（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの後眼窩静脈洞、週２回）で治療した。腫瘍負荷を、毎週の生物発光撮像によって監視した。（図５９Ｂ）図５９Ａに記載されるように治療したマウスにおける、Ｆｌｕｃ活性のシグナル進行。ｐ値は、二元配置分散分析検定に基づく。（図５９Ｃ）図５９Ａに記載されるように治療したマウスの体重。（図５９Ｄ）ＳＫ－ＥＳ－１細胞を、ヌードマウスの脛骨に近接して筋肉内注射し、続いて、ＰＢＳ及び１２Ｅ７抗体（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの眼窩後静脈洞、週２回）で治療した。（図５９Ｅ）図５９Ｄに記載されるように治療したマウスにおける、Ｆｌｕｃ活性のシグナル進行。ｐ値は、二元配置分散分析検定に基づく。（図５９Ｆ）図５９Ｄに記載されるように治療したマウスの体重。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ＞０．０５。
【図60】右脚における脛骨内導入骨病変の確立後に、マウスの様々な臓器において観察された肺転移及び骨格転移。
【発明を実施するための形態】
【0038】
例示的な実施形態の説明
治療用抗体は、その臨床的可能性の実現に大いに役立ち、様々な病態の治療に有用となってきた。治療用抗体の急速な進化にもかかわらず、骨腫瘍の治療におけるその臨床的有効性は、これらの大きな高分子の不適当な薬物動態及び不十分な骨組織への接触性によって妨げられてきた。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、骨転移ニッチにおけるその濃度を向上させ、乳がん骨転移の生存及び進行の有意な低減を結果としてもたらす骨ホーミングペプチド配列を含むように、治療用抗体又はポリペプチドを操作するための方法を提供する。操作された抗体の骨腫瘍標的化能力を向上させるために、様々な数の骨ホーミングペプチドが、抗体の許容的な内部部位に導入され得る。非修飾抗体と比較して、操作された骨標的化抗体は、類似した薬物動態及びインビトロ細胞傷害活性を有することが示されたが、インビボで改善された骨腫瘍分布を示した。これらの結果は、抗体療法への骨特異的標的化の付加が、治療用抗体の骨腫瘍ニッチへの堅牢な送達を結果としてもたらすことを実証している。これは、骨がんの不適当な治療及び治療に対する獲得耐性の発生を克服するための、強力な戦略を提供する。
治療用抗体は、その臨床的可能性の実現に大いに役立ち、様々な病態の治療に有用となってきた。治療用抗体の急速な進化にもかかわらず、骨腫瘍の治療におけるその臨床的有効性は、これらの大きな高分子の不適当な薬物動態及び不十分な骨組織への接触性によって妨げられてきた。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、骨転移ニッチにおけるその濃度を向上させ、乳がん骨転移の生存及び進行の有意な低減を結果としてもたらす骨ホーミングペプチド配列を含むように、治療用抗体又はポリペプチドを操作するための方法を提供する。操作された抗体の骨腫瘍標的化能力を向上させるために、様々な数の骨ホーミングペプチドが、抗体の許容的な内部部位に導入され得る。非修飾抗体と比較して、操作された骨標的化抗体は、類似した薬物動態及びインビトロ細胞傷害活性を有することが示されたが、インビボで改善された骨腫瘍分布を示した。これらの結果は、抗体療法への骨特異的標的化の付加が、治療用抗体の骨腫瘍ニッチへの堅牢な送達を結果としてもたらすことを実証している。これは、骨がんの不適当な治療及び治療に対する獲得耐性の発生を克服するための、強力な戦略を提供する。
【0039】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、骨ホーミングペプチドを含むための抗体又はポリペプチドの操作を介して、治療用抗体又はポリペプチドの骨への特異的送達を可能にする、革新的な骨標的化技術を提供する。この種類の、治療用抗体又はポリペプチドの骨への特異的送達は、骨関連疾患に対する抗体療法の幅及び効力を両方とも向上させる可能性を有する。
【0040】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、特定の構成成分に関して「本質的に含まない」は、特定の構成成分のいずれも、意図的に組成物へと製剤化されておらず、かつ／又は汚染物質としてのみ存在するか若しくは微量のみ存在することを意味するように本明細書で使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染物質から生じる特定の構成成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましくは、標準的な分析方法では特定の構成成分の量を検出することができない組成物である。
本明細書で使用される場合、特定の構成成分に関して「本質的に含まない」は、特定の構成成分のいずれも、意図的に組成物へと製剤化されておらず、かつ／又は汚染物質としてのみ存在するか若しくは微量のみ存在することを意味するように本明細書で使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染物質から生じる特定の構成成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましくは、標準的な分析方法では特定の構成成分の量を検出することができない組成物である。
【0041】
本明細書で使用される場合、「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語とともに使用される場合、単語「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」は、１つ又は１つ以上を意味し得る。
【0042】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されるか、又は選択肢が互いに排他的であることのない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢及び「及び／又は」のみを指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２の、又はそれ以上を意味し得る。
【0043】
「約」という用語は、一般に、記載の値を測定するための標準的な分析技術を使用して決定される、記載の値の標準偏差内であることを意味する。用語はまた、記載の値のプラス又はマイナス５％を指すことによって使用され得る。
【0044】
「有効量」又は「治療上有効な」という語句は、所望の結果を生じるのに十分な薬物又は薬剤の投薬量を意味する。所望の結果は、投薬のレシピエントにおける主観的若しくは客観的な改善、肺成長の増加、肺修復の増加、組織浮腫の低減、ＤＮＡ修復の増加、アポトーシスの減少、腫瘍サイズの減少、がん細胞の成長速度の減少、転移の減少、又は上の任意の組み合わせであり得る。
【0045】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン、特異的結合能力を維持するその誘導体、及び免疫グロブリン結合ドメインに相同であるか又は大部分相同である結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然源に由来してもよいか、又は部分的若しくは完全に合成的に産生されてもよい。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトクラスのうちのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンクラスのメンバー：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥであり得る。抗体は、二重特異性抗体であり得る。例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用される抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。抗体という用語はまた、抗原結合抗体断片を指す。そのような抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂｙ、Ｆ（ａｂｙ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、及びＦｄ断片が挙げられる。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、そのままの抗体の断片化によって酵素的若しくは化学的に産生され得、部分抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生され得るか、又は完全に若しくは部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、一本鎖抗体断片であり得る。代替的に、断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結される複数の鎖を含み得る。断片はまた、任意選択的に、多分子複合体であり得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約１０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含むであろう。
【0046】
「対象」及び「患者」は、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物などのヒト又は非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【0047】
本明細書で使用される場合、疾患、障害、又は医学的状態に関して使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、又は「改善」という用語は、状態の療法的治療を指し、その目的が、症状又は状態の進行又は重症度を逆転させること、緩和すること、改善すること、阻害すること、減速させること、又は停止させることである。「治療すること」という用語は、状態の少なくとも１つの有害作用又は症状を低減又は緩和することを含む。１つ以上の症状又は臨床マーカーが低減される場合、治療は、一般に「有効」である。代替的に、状態の進行が低減又は停止される場合、治療は、「有効」である。すなわち、「治療」は、症状又はマーカーの改善だけでなく、治療の不在下で予想されるであろう症状の進行又は悪化の停止又は少なくとも減速も含む。有益な又は所望の臨床結果としては、限定されないが、１つ以上の症状の緩和、欠損の程度の減少、腫瘍又は悪性腫瘍の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、腫瘍成長及び／又は転移の遅延又は減速、並びに治療の不在下で予想されるものと比較した寿命の増加が挙げられる。
【0048】
ＩＩ．骨標的化抗体
骨は、主に、カルシウム及びリンの不溶性塩であるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結晶から構成されている。骨などの硬組織におけるＨＡの限られた分布のために、それは、選択的骨標的化のための魅力的な標的になる。自然は、細胞固定のため及び骨ミネラル化プロセスを調節するための部位を提供する、シアロタンパク質及びオステオポンチンを含む様々なＨＡ結合タンパク質を進化させてきた。興味深いことに、配列分析により、これらのタンパク質は、可能性がある骨結合部位を表す酸性アミノ酸の繰り返し配列を有することが明らかになっている（図１Ａ）１７。アスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる短い骨ホーミングペプチドが、小分子、マイクロＲＮＡ、及びナノ粒子の骨ニッチへの特異的送達について試験されてきた１８～２２。これらの短いペプチドは、より高いレベルの結晶化度を有するＨＡ表面への結合に有利であることが示されている。この表面は、骨吸収表面の存在を特徴とし、溶骨性骨転移ニッチとして知られている２３。溶骨性骨病変の形成は、がん細胞、骨芽細胞、及び破骨細胞の間のパラクリンクロストークによって駆動される２２～２６。具体的には、がん細胞は、核因子κＢ活性化受容体リガンド（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ－κＢ ｌｉｇａｎｄ）（ＲＡＮＫＬ）及びオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの骨芽細胞遺伝子の発現を調節するように作用することによって破骨細胞の形成を直接的に又は間接的に刺激する、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）及びインターロイキン８などの分子を分泌する。その結果としての骨吸収の増加が、腫瘍成長を相互に刺激する成長因子（例えば、ＩＧＦ１）の放出をもたらす。したがって、治療剤の骨転移ニッチへの選択的送達は、この悪循環の溶骨サイクルを中断する可能性を有する。したがって、骨腫瘍の標的化の向上が可能な抗体を操作するための方法が、本明細書において提供される。骨ホーミングペプチド配列の抗腫瘍抗体中への挿入後に、これらの操作された抗体の有用性が、骨における乳がん転移の治療について実証された（図１Ｂ）。
骨は、主に、カルシウム及びリンの不溶性塩であるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結晶から構成されている。骨などの硬組織におけるＨＡの限られた分布のために、それは、選択的骨標的化のための魅力的な標的になる。自然は、細胞固定のため及び骨ミネラル化プロセスを調節するための部位を提供する、シアロタンパク質及びオステオポンチンを含む様々なＨＡ結合タンパク質を進化させてきた。興味深いことに、配列分析により、これらのタンパク質は、可能性がある骨結合部位を表す酸性アミノ酸の繰り返し配列を有することが明らかになっている（図１Ａ）１７。アスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる短い骨ホーミングペプチドが、小分子、マイクロＲＮＡ、及びナノ粒子の骨ニッチへの特異的送達について試験されてきた１８～２２。これらの短いペプチドは、より高いレベルの結晶化度を有するＨＡ表面への結合に有利であることが示されている。この表面は、骨吸収表面の存在を特徴とし、溶骨性骨転移ニッチとして知られている２３。溶骨性骨病変の形成は、がん細胞、骨芽細胞、及び破骨細胞の間のパラクリンクロストークによって駆動される２２～２６。具体的には、がん細胞は、核因子κＢ活性化受容体リガンド（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ－κＢ ｌｉｇａｎｄ）（ＲＡＮＫＬ）及びオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの骨芽細胞遺伝子の発現を調節するように作用することによって破骨細胞の形成を直接的に又は間接的に刺激する、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）及びインターロイキン８などの分子を分泌する。その結果としての骨吸収の増加が、腫瘍成長を相互に刺激する成長因子（例えば、ＩＧＦ１）の放出をもたらす。したがって、治療剤の骨転移ニッチへの選択的送達は、この悪循環の溶骨サイクルを中断する可能性を有する。したがって、骨腫瘍の標的化の向上が可能な抗体を操作するための方法が、本明細書において提供される。骨ホーミングペプチド配列の抗腫瘍抗体中への挿入後に、これらの操作された抗体の有用性が、骨における乳がん転移の治療について実証された（図１Ｂ）。
【0049】
ある特定の実施形態では、１つ以上の骨ホーミングペプチドを含むように操作された抗体などの、骨標的化抗体に関する方法及び組成物が、本明細書において提供される。いくつかの態様では、骨ホーミングペプチドは、Ｌ－Ａｓｐ６などの、骨ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）マトリックスに結合するペプチドである。
【0050】
骨ホーミングペプチドは、ペプチドの挿入が、天然ＩｇＧの構造及び機能に対して最小限に破壊的であり、骨マトリックスに対するペプチドの高い親和性の保持を依然として可能にする部位として本明細書で言及される「許容的な内部部位」で、抗体に挿入され得る。許容的な内部部位をスクリーニングするために、フローサイトメトリーを用いて、それが抗体機能を破壊しないことを確認してもよい。骨標的化抗体の結合親和性は、ＨＡ結合アッセイを用いて評価することができる。骨ホーミングペプチドは、抗体の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＣＨ１）、及び／又はＣ末端（ＣＴ）に挿入され得る。例えば、抗体は、トラスツズマブであり得る。具体的な態様では、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～１６のタンパク質配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するタンパク質配列を含み得る。非修飾及び修飾トラスツズマブの例示的なアミノ酸配列を、骨ホーミングペプチドに下線を引いて、以下に提供する。
【0051】
本抗体は、撮像剤又は診断剤にコンジュゲートされ得る。
【0052】
本明細書で使用される「治療剤」は、疾患又は健康関連状態の治療上の利益を得る目的で対象に投与することができる、任意の薬剤を指す。例えば、治療剤にコンジュゲートされた抗体は、腫瘍のサイズを低減するか、腫瘍の局所侵襲性を低減若しくは阻害するか、又は転移の発生のリスクを低減する目的で、対象に投与され得る。
【0053】
本明細書で使用される「診断剤」又は「撮像剤」（互換的に言及される）は、対象における疾患又は健康関連状態を診断する目的で対象に投与することができる、任意の薬剤を指す。診断は、疾患が存在するかどうか、疾患が進行しているかどうか、又は疾患状態の任意の変化を決定することを含み得る。
【0054】
治療剤又は診断剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ＤＮＡ、又はＲＮＡであり得る。
【0055】
Ａ．製剤及び投与
本開示は、骨標的化抗体を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、予防有効量又は治療有効量の抗体若しくはその断片、又はペプチド免疫原、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬とともに投与される希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌液体、例えば、水及び油であってもよく、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。薬学的組成物が静脈内投与される場合、特定の担体は水である。生理食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。他の好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
本開示は、骨標的化抗体を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、予防有効量又は治療有効量の抗体若しくはその断片、又はペプチド免疫原、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬とともに投与される希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌液体、例えば、水及び油であってもよく、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。薬学的組成物が静脈内投与される場合、特定の担体は水である。生理食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。他の好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【0056】
所望な場合、組成物はまた、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬グレードの標準的な担体を含み得る。好適な薬学的薬剤の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するのに好適な量の担体と一緒に、好ましくは精製された形態の、予防有効量又は治療有効量の抗体又はその断片を含有するであろう。製剤は、経口、静脈内、動脈内、口腔内、鼻腔内、噴霧、気管支吸入であり得るか、又は機械的換気によって送達され得る投与モードに適合するべきである。
【0057】
開示のもののような抗体が、ポックスウイルス感染のリスクのある対象においてインビボで産生される場合、活性ワクチンも想定される。そのようなワクチンは、非経口投与のために製剤化され得、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、皮下、又は更には腹腔内経路を介して注射するために製剤化され得る。皮内経路及び筋肉内経路による投与が企図される。代替的に、ワクチンは、例えば、点鼻、吸入、又はネブライザーによる、粘膜への局所経路によって直接投与され得る。薬学的に許容される塩としては、酸性塩と、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とで形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基と、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基とから誘導され得る。
【0058】
人工的に獲得した受動免疫として知られている抗体の受動的移行は、一般に、静脈内又は筋肉内注射の使用を伴うであろう。抗体の形態は、静脈内（ＩＶＩＧ）又は筋肉内（ＩＧ）使用のためにプールされたヒト免疫グロブリンとしての、免疫化されているか又は疾患から回復中のドナーからの高力価のヒトＩＶＩＧ又はＩＧとしての、及びモノクローナル抗体（ＭＡｂ）としての、ヒト又は動物の血漿又は血清であり得る。そのような免疫は、一般に短期間しか持続せず、過敏症反応、及び特に非ヒト由来のガンマグロブリンからの血清病の潜在的なリスクも存在する。しかしながら、受動的免疫は、即時保護を提供する。抗体は、注射に好適な担体、すなわち、滅菌及び注射可能な担体中に製剤化されるであろう。
【0059】
一般に、本開示の組成物の成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェなどの気密容器内の乾燥した凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、単位剤形で別々に又は一緒に混合されて供給される。組成物が注入によって投与されるものである場合、医薬グレードの滅菌水又は生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【0060】
本開示の組成物は、中性又は塩の形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンを用いて形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンを用いて形成されるものが挙げられる。
【0061】
Ｂ．過剰増殖性疾患
過剰増殖性疾患は、細胞が制御不能に再生し始めることを引き起こす任意の疾患に関連付けられる場合があるが、原型的な例は、がんである。がんの重要な要素のうちの１つは、細胞の正常なアポトーシスサイクルが中断されることであり、したがって、細胞の成長を中断する薬剤は、これらの疾患を治療するための治療剤として重要である。本開示では、骨標的化抗体を使用して、骨がん及び骨に転移するがんなどの様々な種類のがんを治療することができる。
過剰増殖性疾患は、細胞が制御不能に再生し始めることを引き起こす任意の疾患に関連付けられる場合があるが、原型的な例は、がんである。がんの重要な要素のうちの１つは、細胞の正常なアポトーシスサイクルが中断されることであり、したがって、細胞の成長を中断する薬剤は、これらの疾患を治療するための治療剤として重要である。本開示では、骨標的化抗体を使用して、骨がん及び骨に転移するがんなどの様々な種類のがんを治療することができる。
【0062】
本開示の化合物で治療することができるがん細胞としては、限定されないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、膵臓、精巣、舌、子宮頸部、又は子宮からの細胞が挙げられる。加えて、がんは、これらに限定されないが、具体的には、以下の組織学的種類のものであり得る：新生物、悪性；がん；がん、未分化；巨細胞及び紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭状がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛様体がん；移行細胞がん；乳頭状移行細胞がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管がん；肝細胞がん；複合的な肝細胞がん及び胆管がん；海綿状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープの腺がん；腺がん、家族性多発性大腸腺腫症；固形がん；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞上皮がん；乳頭状腺がん；嫌色素性細胞がん；好酸性がん；酸親和性腺がん；好塩基球がん；透明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞性腺がん；乳頭状及び濾胞性腺がん；非被包性硬化がん；副腎皮質がん；子宮内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘表皮がん；嚢胞線がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞性腺がん；粘液腺がん；印環細胞がん；浸潤性導管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳房；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生を伴う腺がん；胸腺腫、悪性；卵巣間質性腫瘍、悪性；莢膜細胞種、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；男性胚腫、悪性；セルトリ細胞がん；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂肪細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑におけるマリグ（ｍａｌｉｇ）メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；肺胞性横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性がん；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉系軟骨肉腫；骨の巨大細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；グリオーマ、悪性；上衣腫；星細胞腫；原形質星細胞腫；原線維性星細胞腫；星芽腫；膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；並びに有毛細胞白血病。ある特定の態様では、腫瘍は、骨肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、膠芽腫、神経芽腫、又は白血病を含み得る。
【0063】
Ｃ．治療の方法
特に、対象（例えば、ヒト対象）におけるがんの治療に使用され得る組成物が、本明細書に開示される。上記の組成物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコなど）に、有効量、すなわち、治療される対象において所望の結果を生じることが可能である（例えば、がん性細胞のアポトーシスを引き起こすか、又は細菌細胞を殺傷する）量で投与されることが好ましい。本開示の方法で利用される組成物の毒性及び治療有効性は、標準的な薬学的手順によって決定することができる。医学及び獣医学分野で周知であるように、任意の１匹の動物の投薬量は、対象のサイズ、体表面積、体重、年齢、投与される特定の組成物、投与時間及び投与経路、一般的な健康、感染症又はがんの臨床症状、並びに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。本明細書に記載の組成物は、典型的には、がん細胞の成長若しくは増殖の低減を同定することによってアッセイして、がん性細胞の死を誘発する（例えば、がん細胞のアポトーシスを誘発する）投薬量で投与される。
特に、対象（例えば、ヒト対象）におけるがんの治療に使用され得る組成物が、本明細書に開示される。上記の組成物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコなど）に、有効量、すなわち、治療される対象において所望の結果を生じることが可能である（例えば、がん性細胞のアポトーシスを引き起こすか、又は細菌細胞を殺傷する）量で投与されることが好ましい。本開示の方法で利用される組成物の毒性及び治療有効性は、標準的な薬学的手順によって決定することができる。医学及び獣医学分野で周知であるように、任意の１匹の動物の投薬量は、対象のサイズ、体表面積、体重、年齢、投与される特定の組成物、投与時間及び投与経路、一般的な健康、感染症又はがんの臨床症状、並びに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。本明細書に記載の組成物は、典型的には、がん細胞の成長若しくは増殖の低減を同定することによってアッセイして、がん性細胞の死を誘発する（例えば、がん細胞のアポトーシスを誘発する）投薬量で投与される。
【0064】
本開示の治療方法（予防治療を含む）は、一般に、その必要のある、哺乳類、特にヒトを含む対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与する工程を含む。そのような治療は、疾患、障害、又はその症状に罹患しているか、有するか、感受性があるか、又はそのリスクのある対象、特にヒトに好適に行われるであろう。これらの「リスクのある」対象の決定は、対象又は医療提供者の診断試験又は意見による任意の客観的又は主観的決定（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー（本明細書で定義される）、家族歴など）によって行われ得る。
【0065】
一実施形態では、本開示は、治療の進行を監視する方法を提供する。方法は、対象が、治療量の本明細書に記載の組成物を投与されている、がん（例えば、白血病）に関連付けられる障害又はその症状に罹患しているか又は感受性がある対象における、診断マーカー（例えば、限定されないが、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、及びＣＤ１１７を含み得る）又は診断測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）として、細胞表面タンパク質を用いる血液学的パラメータ及び／又はがん幹細胞（ＣＳＣ）分析の変化のレベルを決定するステップを含む。方法で決定されるマーカーのレベルは、対象の疾患状態を確立するために、健康な正常対照又は他の罹患している患者のいずれかにおけるマーカーの既知のレベルと比較され得る。好ましい実施形態では、対象におけるマーカーの第２のレベルは、第１のレベルの決定より後の時点で決定され、２つのレベルを比較して、疾患の経過又は治療の有効性が監視される。ある特定の好ましい実施形態では、対象におけるマーカーの治療前レベルは、本明細書に記載の方法に従って治療を開始する前に決定され、次いで、マーカーのこの治療前レベルを、治療を開始した後の対象におけるマーカーのレベルと比較して、治療の有効性が決定され得る。
【0066】
Ｄ．追加の療法
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、第２の又は追加の療法と組み合わせた骨標的化抗体を含む。そのような療法は、骨腫瘍を伴う任意の疾患の治療に適用され得る。例えば、疾患は、骨がん又は骨転移であり得る。
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、第２の又は追加の療法と組み合わせた骨標的化抗体を含む。そのような療法は、骨腫瘍を伴う任意の疾患の治療に適用され得る。例えば、疾患は、骨がん又は骨転移であり得る。
【0067】
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、少なくとも１つの追加の療法と組み合わせた骨標的化抗体を含む。追加の療法は、放射線療法、手術（例えば、腫瘍摘出手術及び乳房切除）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、又は前述の組み合わせであり得る。追加の療法は、アジュバント療法又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
【0068】
併用療法を含む方法及び組成物は、治療又は保護効果を向上し、かつ／又は別の抗がん療法若しくは抗過剰増殖療法の治療効果を増加する。治療及び予防の方法及び組成物は、がん細胞の殺傷及び／又は細胞過剰増殖の阻害などの所望の効果を達成するのに有効な組み合わせた量で提供され得る。このプロセスは、細胞を、抗体又は抗体断片、及び第２の療法の両方と接触させることを含み得る。組織、腫瘍、又は細胞を、薬剤（すなわち、抗体若しくは抗体断片、又は抗がん剤）のうちの１つ以上を含む１つ以上の組成物若しくは薬理学的製剤と接触させてもよいか、又は組織、腫瘍、及び／若しくは細胞を、２つ以上の別個の組成物若しくは製剤と接触させることによるものであり得、１つの組成物が、１）抗体若しくは抗体断片、２）抗がん剤、又は３）抗体若しくは抗体断片、及び抗がん剤の両方を提供する。また、そのような併用療法は、化学療法、放射線療法、手術療法、又は免疫療法と同時に使用され得ることが企図される。
【0069】
「接触させる」及び「曝露させる」という用語は、細胞に適用される場合、本明細書では、治療構築物及び化学療法剤又は放射線療法剤が、標的細胞に送達されるか、又は標的細胞と直接並置して配置されるプロセスについて記載するために使用される。細胞殺傷を達成するために、例えば、両方の薬剤は、細胞を殺傷するか、又は細胞が分裂するのを防止するのに有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【0070】
阻害抗体は、抗がん治療と比較して、その前、その間、その後、又は様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時～数分～数日～数週間の範囲の間隔であり得る。抗体又は抗体断片が、抗がん剤とは別々に患者に提供される実施形態では、一般に、２つの化合物が、依然として患者に有利な複合効果を発揮することが可能であるように、各送達時間の間に顕著な期間が過ぎてしまわないことが確認されるであろう。そのような場合、互いに約１２～２４又は７２時間以内、より具体的には、互いに約６～１２時間以内に、抗体療法及び抗がん療法が患者に提供され得ることが企図される。いくつかの状況では、治療期間を顕著に延長することが望ましい場合があり、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６、又は７）～数週間（１、２、３、４、５、６、７、又は８）が経過する。
【0071】
ある特定の実施形態では、治療過程は、１～９０日又はそれ以上続くであろう（このそのような範囲は、介在する日数を含む）。１つの薬剤は、１日目～９０日目のうちの任意の日（このそのような範囲は、介在する日を含む）又はそれらの任意の組み合わせに投与され得、別の薬剤は、１日目～９０日目のうちの任意の日（このそのような範囲は、介在する日を含む）又はそれらの任意の組み合わせに投与されることが企図される。１日（２４時間の期間）以内に、患者は、薬剤のうちの１つ又は複数の投与を受ける場合がある。更に、治療過程の後、抗がん治療が投与されない期間が存在することが企図される。この期間は、患者の予後、体力、健康などの状態に応じて、１～７日、及び／又は１～５週間、及び／又は１～１２ヶ月若しくはそれ以上続き得る（このそのような範囲は、介在する日数を含む）。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されるであろうことが予想される。
【0072】
一部の実施形態では、追加の療法は、小分子酵素阻害剤又は抗転移剤の投与である。一部の実施形態では、追加の療法は、副作用制限剤（例えば、抗吐き気剤などの、治療の副作用の発生及び／又は重症度を軽減することが意図される薬剤）の投与である。一部の実施形態では、追加の療法は、放射線療法である。一部の実施形態では、追加の療法は、手術である。一部の実施形態では、追加の療法は、放射線療法と手術との組み合わせである。一部の実施形態では、追加の療法は、ガンマ線照射である。一部の実施形態では、追加の療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、及び／又は化学抗がん剤（ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）である。追加の療法は、当該技術分野で既知の化学療法剤のうちの１つ以上であり得る。
【0073】
様々な組み合わせが用いられ得る。以下の例では、骨標的化抗体は、「Ａ」であり、抗がん療法は、「Ｂ」である：
【0074】
本実施形態の任意の化合物又は療法を患者に投与することは、存在する場合、薬剤の毒性を考慮して、そのような化合物を投与するための一般プロトコルに従うであろう。したがって、一部の実施形態では、併用療法に起因する毒性を監視するステップが存在する。
【0075】
１．化学療法
本実施形態に従って、多種多様な化学療法剤が使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物は、細胞内のそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるかどうか、及びどの段階で影響を与えるかによって分類される。代替的に、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、又は核酸合成に影響を与えることによって染色体異常及び有糸分裂異常を誘発する能力に基づいて、特徴評価され得る。
本実施形態に従って、多種多様な化学療法剤が使用され得る。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物は、細胞内のそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるかどうか、及びどの段階で影響を与えるかによって分類される。代替的に、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、又は核酸合成に影響を与えることによって染色体異常及び有糸分裂異常を誘発する能力に基づいて、特徴評価され得る。
【0076】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチイレンエチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホマイド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード及びウラシルマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロスレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンガンマｌＩ及びカリケアミシンオメガＩ１）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連するクロモプロテインエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オートラルナイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラルナイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの抗代謝物質；デノプテリン、プテロプテリン、及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトンなどのアンドロゲン；ミトタン及びトリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメトルヒオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、並びに上のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
【0077】
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ線、及び／又は放射性同位体の腫瘍細胞への直接送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体の組み立て及び維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）にわたって、５０～２００レントゲンの１日用量から２０００～６０００レントゲンの単回用量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ線、及び／又は放射性同位体の腫瘍細胞への直接送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体の組み立て及び維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）にわたって、５０～２００レントゲンの１日用量から２０００～６０００レントゲンの単回用量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
【0078】
３．免疫療法
当業者は、追加の免疫療法が、実施形態の方法と組み合わせで、又は同時に使用され得ることを理解するであろう。がん治療の文脈において、免疫療法剤は、一般に、がん細胞を標的とし、破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））が、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独は、治療のエフェクターとして機能することができるか、又は実際に細胞殺傷に影響を及ぼすように他の細胞を動員することができる。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートされ得、標的化剤として機能し得る。代替的に、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的又は間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
当業者は、追加の免疫療法が、実施形態の方法と組み合わせで、又は同時に使用され得ることを理解するであろう。がん治療の文脈において、免疫療法剤は、一般に、がん細胞を標的とし、破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））が、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独は、治療のエフェクターとして機能することができるか、又は実際に細胞殺傷に影響を及ぼすように他の細胞を動員することができる。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートされ得、標的化剤として機能し得る。代替的に、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的又は間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
【0079】
抗体－薬物コンジュゲートは、がん治療薬の開発への画期的なアプローチとして浮上している。がんは、世界的に主要な死因のうちの１つである。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞殺傷薬物に共有結合しているモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を非常に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせ、ペイロード（薬物）を腫瘍細胞に送達する「アーム型」ＭＡｂを生じ、抗原のレベルを豊富にする（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｔｅｉｃｈｅｒ ２０１４、Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。薬物の標的化送達はまた、正常な組織における曝露を最小限に抑え、毒性の減少及び治療指数の改善をもたらす。２０１１年のＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）及び２０１３年のＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシン又はＴ－ＤＭ１）の２つのＡＤＣ薬物のＦＤＡによる承認によって、このアプローチが妥当であると認められた。現在、様々な段階の臨床試験中である、がん治療のための３０以上のＡＤＣ薬物候補が存在する（Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。抗体操作及びリンカーペイロード最適化がより一層成熟するにつれて、新しいＡＤＣの発見及び開発は、このアプローチに好適である新しい標的の同定及び検証、並びに標的化ＭＡｂの生成への依存が増加している（Ｔｅｉｃｈｅｒ ２００９）。ＡＤＣ標的の２つの基準は、腫瘍細胞における上方制御／高レベルの発現、及び堅牢な内在化である。
【0080】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的とすることが容易である、すなわち、大部分の他の細胞に存在しない、いくつかのマーカーを担持する必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのうちのいずれも、本実施形態の文脈における標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、及びｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替的な態様は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。また、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８などのケモカイン、及びＦＬＴ３リガンドなどの成長因子を含む免疫刺激分子が存在する。
【0081】
現在調査中又は使用中の免疫療法の例としては、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号及び同第５，７３９，１６９号、Ｈｕｉ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、及びｐ５３（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ａｕｓｔｉｎ－Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８、米国特許第５，８３０，８８０号及び同第５，８４６，９４５号）、並びにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２、Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第５，８２４，３１１号）が挙げられる。１つ以上の抗がん療法が、本明細書に記載の抗体療法とともに用いられ得ることが企図される。
【0082】
一部の実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を上げるか、又はシグナルを下げるかのいずれかである、免疫系の分子である。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る阻害チェックポイント分子としては、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られている）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても知られている）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、並びにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸及び／又はＣＴＬＡ－４を標的とする。
【0083】
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え形態のリガンド若しくは受容体などの薬物であり得るか、又は特にヒト抗体などの抗体であり得る（例えば、両方が参照により本明細書に援用される、国際特許公開第２０１５／０１６７１８号、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２－６４，２０１２）。免疫チェックポイントタンパク質又はその類似体の既知の阻害剤が使用され得、特に、抗体のキメラ化、ヒト化、又はヒト形態が使用され得る。当業者であれば分かるように、代替名及び／又は等価名は、本開示で言及される特定の抗体のために使用され得る。そのような代替名及び／又は等価名は、本発明の文脈において互換的である。例えば、ランブロリズマブは、ＭＫ－３４７５及びペムブロリズマブという代替名及び等価名でも知られている。
【0084】
一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、全て参照により本明細書に援用される、米国特許第８７３５５５３号、同第８３５４５０９号、及び同第８００８４４９号に記載されている。全て参照により本明細書に援用される、米国特許出願第２０１４／０２９４８９８号、同第２０１４／０２２０２１号、及び同第２０１１／０００８３６９号に記載のものなどの、本明細書で提供される方法で使用するための他のＰＤ－１軸アンタゴニストは、当該技術分野で既知である。
【0085】
一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びＣＴ－０１１からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外部分又はＰＤ－１結合部分を含む、イムノアドヘシン）である。一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られているニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載の抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、及びＳＣＨ－９００４７５としても知られているペムブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載の抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１は、ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ－１としても知られ、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られているＡＭＰ－２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載のＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【0086】
本明細書で提供される方法において標的とされ得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られている細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見られ、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６に結合した場合、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上に発現され、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８に類似し、両方の分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６（それぞれ、Ｂ７－１及びＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に抑制性シグナルを伝達し、一方、ＣＤ２８は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞にも見出され、それらの機能に重要であり得る。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化は、Ｂ７分子の抑制性受容体であるＣＴＬＡ－４の発現の増加をもたらす。
【0087】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドである。
【0088】
本方法における使用に好適な抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（又は、それに由来するＶＨ及び／又はＶＬドメイン）は、当該技術分野で周知の方法を使用して生成され得る。代替的に、当該技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ－４抗体が使用され得る。例えば、ＵＳ８，１１９，１２９、ＷＯ０１／１４４２４、ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４（トレメリムマブ、以前チシリムマブとしても知られているＣＰ６７５，２０６）、米国特許第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（抗体ＣＰ－６７５２０６）；及びＭｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：５３０１－５３０４に開示の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、本明細書に開示の方法で使用され得る。前述の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に援用される。これらの技術分野で認識されているＣＴＬＡ－４への結合に対する抗体のうちのいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、全て参照により本明細書に援用される、国際特許出願第２００１／０１４４２４号、同第２０００／０３７５０４号、及び米国特許第８，０１７，１１４号に記載されている。
【0089】
例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、及びＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られている）又はその抗原結合断片及びバリアントである（例えば、ＷＯＯ１／１４４２４を参照されたい）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖のＣＤＲ又はＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と同じＣＴＬＡ－４上のエピトープとの結合に対して競合し、かつ／又はそれに結合する。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、又は９９％の可変領域同一性）を有する。
【0090】
ＣＴＬＡ－４を調節するための他の分子としては、全て参照により本明細書に援用される、米国特許第５８４４９０５号、同第５８８５７９６号、及び国際特許出願第１９９５／００１９９４号及び同第１９９８／０４２７５２号に記載のものなどのＣＴＬＡ－４リガンド及び受容体、並びに参照により本明細書に援用される、米国特許第８３２９８６７号に記載のものなどのイムノアドヘシンが挙げられる。
【0091】
４．手術
がんを有する人のおよそ６０％は、予防、診断、又は病期分類、治癒、及び緩和手術を含む、何らかの種類の手術を受けるであろう。治癒的手術としては、がん性組織の全部又は一部を物理的に除去、切り取り、かつ／又は破壊する切除が挙げられ、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／又は代替療法などの他の療法と同時に使用され得る。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部分の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡によって制御される手術（モーズ手術）が挙げられる。
がんを有する人のおよそ６０％は、予防、診断、又は病期分類、治癒、及び緩和手術を含む、何らかの種類の手術を受けるであろう。治癒的手術としては、がん性組織の全部又は一部を物理的に除去、切り取り、かつ／又は破壊する切除が挙げられ、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／又は代替療法などの他の療法と同時に使用され得る。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部分の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡によって制御される手術（モーズ手術）が挙げられる。
【0092】
がん性細胞、組織、又は腫瘍の一部分又は全部を切り取ると、身体に空洞が形成され得る。治療は、灌流、直接注射、又は追加の抗がん療法による領域の局所適用によって達成され得る。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、若しくは７日毎、又は１、２、３、４、及び５週間毎、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月毎に繰り返され得る。これらの治療も同様に、変動する投薬量のものであり得る。
【0093】
５．他の薬剤
他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の治療有効性を改善することができることが企図される。これらの追加の薬剤としては、細胞表面受容体及びＧＡＰ接合部の上方制御に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘発剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤が挙げられる。ＧＡＰ接合部の数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖性効果を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤又は分化剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の抗過剰増殖有効性を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる、抗体ｃ２２５などの他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療有効性を改善することができることが、更に企図される。
他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の治療有効性を改善することができることが企図される。これらの追加の薬剤としては、細胞表面受容体及びＧＡＰ接合部の上方制御に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘発剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤が挙げられる。ＧＡＰ接合部の数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖性効果を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤又は分化剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療の抗過剰増殖有効性を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる、抗体ｃ２２５などの他の薬剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用して、治療有効性を改善することができることが、更に企図される。
【0094】
ＩＩＩ．キット
実施形態の様々な態様では、治療剤、並びに／又は他の治療剤及び送達剤を含有する、キットが想定される。一部の実施形態では、本実施形態は、実施形態の抗体組成物を調製及び／又は投与するためのキットを企図する。キットは、本実施形態の薬学的組成物のうちのいずれかを含有する１つ以上の密封バイアルを備え得る。キットは、例えば、本実施形態の構成成分を調製、製剤化、及び／若しくは投与するか、又は本発明の方法の１つ以上のステップを実施するための、操作された抗体、並びに試薬を含み得る。一部の実施形態では、キットはまた、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、又はチューブなどのキットの構成要素と反応しないであろう容器である、好適な容器を備え得る。容器は、プラスチック又はガラスなどの滅菌可能な材料から作製され得る。
実施形態の様々な態様では、治療剤、並びに／又は他の治療剤及び送達剤を含有する、キットが想定される。一部の実施形態では、本実施形態は、実施形態の抗体組成物を調製及び／又は投与するためのキットを企図する。キットは、本実施形態の薬学的組成物のうちのいずれかを含有する１つ以上の密封バイアルを備え得る。キットは、例えば、本実施形態の構成成分を調製、製剤化、及び／若しくは投与するか、又は本発明の方法の１つ以上のステップを実施するための、操作された抗体、並びに試薬を含み得る。一部の実施形態では、キットはまた、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、又はチューブなどのキットの構成要素と反応しないであろう容器である、好適な容器を備え得る。容器は、プラスチック又はガラスなどの滅菌可能な材料から作製され得る。
【0095】
キットは、本明細書に記載された方法の手順ステップを概説する指示書を更に含み得、本明細書に記載のものと実質的に同じ手順に従うか、又は当業者に既知である。指示書情報は、コンピュータを使用して実行される場合に薬学的有効量の治療剤の送達の実際の又は仮想の手順を表示させる機械可読指示を含有するコンピュータ可読媒体内に存在する場合がある。
【実施例】
【0096】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示の技術は、本開示の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい態様を構成すると見なすことができることが、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、依然として本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく類似の又は同様の結果を得ることができることを理解するべきである。
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示の技術は、本開示の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい態様を構成すると見なすことができることが、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、依然として本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく類似の又は同様の結果を得ることができることを理解するべきである。
【0097】
実施例１－骨標的化抗体の操作
骨ホーミングペプチドでのトラスツズマブの修飾
骨がん部位への抗体の選択的送達に骨ホーミングペプチドの力を利用するために、免疫グロブリン分子内の様々な部位に骨ホーミングペプチドＬ－Ａｓｐ６を持つ抗体のライブラリを、最初に操作した。設計の原則は、天然ＩｇＧの構造及び機能に対して最小限に破壊的であり、骨マトリックスに対するペプチドの高い親和性の保持を依然として可能にするであろう部位に、骨ホーミング配列を組み込むことであった。ＩｇＧ１モノクローナル抗体の結晶構造に基づいて、Ｌ－Ａｓｐ６ペプチドを、トラスツズマブの軽鎖（ＬＣ、Ａ１５３）、重鎖（ＣＨ１、Ａ１６５）、及びＣ末端（ＣＴ、Ｇ４４９）における許容的な内部部位に挿入して、それぞれ、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１、及びＴｒａｓ－ＣＴを得た（図２Ａ）。これらの内部部位は、抗体ペプチド配置ライブラリのスクリーニングによって、ペプチド挿入に対して安定であることが示されている２７。操作された抗体の骨腫瘍標的化能力を調節するために、免疫グロブリン分子当たりの骨ホーミングペプチド配列の数もまた変動させ、２つのＬ－Ａｓｐ６ペプチド配列を有するトラスツズマブ種（Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１）並びに３つのＬ－Ａｓｐ６ペプチド配列を有するトラスツズマブ種（Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ）のトラスツズマブ種を生成した。結果として生じた７つの構築物を、一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞において発現させ、続いて、プロテインＧクロマトグラフィーを用いた免疫グロブリンの精製、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによる発現タンパク質の分析を行った。これらの抗体変異体は全て、良好な収率（５０～１００ｍｇ／Ｌ）で発現された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＥＳＩ－ＭＳ分析により、骨ホーミングペプチドの挿入の成功が確認された（図２Ｂ、２Ｃ、５～１２）。抗体バリアントの中で、軽鎖及び重鎖の両方にＬ－Ａｓｐ６ペプチド配列を含有するＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１種は、有意の凝集を示した。したがって、この抗体変異体は、更には研究しなかった。
骨ホーミングペプチドでのトラスツズマブの修飾
骨がん部位への抗体の選択的送達に骨ホーミングペプチドの力を利用するために、免疫グロブリン分子内の様々な部位に骨ホーミングペプチドＬ－Ａｓｐ６を持つ抗体のライブラリを、最初に操作した。設計の原則は、天然ＩｇＧの構造及び機能に対して最小限に破壊的であり、骨マトリックスに対するペプチドの高い親和性の保持を依然として可能にするであろう部位に、骨ホーミング配列を組み込むことであった。ＩｇＧ１モノクローナル抗体の結晶構造に基づいて、Ｌ－Ａｓｐ６ペプチドを、トラスツズマブの軽鎖（ＬＣ、Ａ１５３）、重鎖（ＣＨ１、Ａ１６５）、及びＣ末端（ＣＴ、Ｇ４４９）における許容的な内部部位に挿入して、それぞれ、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１、及びＴｒａｓ－ＣＴを得た（図２Ａ）。これらの内部部位は、抗体ペプチド配置ライブラリのスクリーニングによって、ペプチド挿入に対して安定であることが示されている２７。操作された抗体の骨腫瘍標的化能力を調節するために、免疫グロブリン分子当たりの骨ホーミングペプチド配列の数もまた変動させ、２つのＬ－Ａｓｐ６ペプチド配列を有するトラスツズマブ種（Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１）並びに３つのＬ－Ａｓｐ６ペプチド配列を有するトラスツズマブ種（Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ）のトラスツズマブ種を生成した。結果として生じた７つの構築物を、一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞において発現させ、続いて、プロテインＧクロマトグラフィーを用いた免疫グロブリンの精製、及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによる発現タンパク質の分析を行った。これらの抗体変異体は全て、良好な収率（５０～１００ｍｇ／Ｌ）で発現された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＥＳＩ－ＭＳ分析により、骨ホーミングペプチドの挿入の成功が確認された（図２Ｂ、２Ｃ、５～１２）。抗体バリアントの中で、軽鎖及び重鎖の両方にＬ－Ａｓｐ６ペプチド配列を含有するＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１種は、有意の凝集を示した。したがって、この抗体変異体は、更には研究しなかった。
【0098】
骨標的化抗体のインビトロ評価
骨標的化抗体バリアントを手にして、ＨＡ結合アッセイを最初に用いて、ミネラル化骨に対するその結合を調べた。簡潔には、骨標的化抗体種を、変動する長さの時間にわたってＨＡとインキュベートし、溶液中に残った結合していない抗体を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を用いて測定した。図２Ｄに示されるように、非修飾Ｔｒａｓは、ＨＡに対してわずかな親和性しか示さなかったが、Ｌ－Ａｓｐ６ペプチド修飾抗体は、時間依存的様式でＨＡに結合した。複数のＬ－Ａｓｐ６ペプチドを有する抗体、すなわちＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴは、最も高いＨＡ結合能力を示し、抗体の８０％超が、９時間のインキュベーション後に結合した（表２）。単一のＬ－Ａｓｐ６ペプチドを含有する３つの抗体種に関しては、Ｃ末端構築物（Ｔｒａｓ－ＣＴ）が、最も高いＨＡ結合能力を示した。したがって、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化骨切片を染色した。非修飾Ｔｒａｓで処理した切片は、一晩のインキュベーション後に、いかなる蛍光も示さなかった（図２Ｅ）。対照的に、３つのＬ－Ａｓｐ６ペプチド含有バリアントで染色した切片全てにおいて、ＦＩＴＣシグナルが観察された。これらのＦＩＴＣ抗体シグナルは、骨からのキシレノールオレンジ（ＸＯ）シグナルとよく相関していた（図２Ｅ、１３）。
骨標的化抗体バリアントを手にして、ＨＡ結合アッセイを最初に用いて、ミネラル化骨に対するその結合を調べた。簡潔には、骨標的化抗体種を、変動する長さの時間にわたってＨＡとインキュベートし、溶液中に残った結合していない抗体を、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を用いて測定した。図２Ｄに示されるように、非修飾Ｔｒａｓは、ＨＡに対してわずかな親和性しか示さなかったが、Ｌ－Ａｓｐ６ペプチド修飾抗体は、時間依存的様式でＨＡに結合した。複数のＬ－Ａｓｐ６ペプチドを有する抗体、すなわちＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴは、最も高いＨＡ結合能力を示し、抗体の８０％超が、９時間のインキュベーション後に結合した（表２）。単一のＬ－Ａｓｐ６ペプチドを含有する３つの抗体種に関しては、Ｃ末端構築物（Ｔｒａｓ－ＣＴ）が、最も高いＨＡ結合能力を示した。したがって、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化骨切片を染色した。非修飾Ｔｒａｓで処理した切片は、一晩のインキュベーション後に、いかなる蛍光も示さなかった（図２Ｅ）。対照的に、３つのＬ－Ａｓｐ６ペプチド含有バリアントで染色した切片全てにおいて、ＦＩＴＣシグナルが観察された。これらのＦＩＴＣ抗体シグナルは、骨からのキシレノールオレンジ（ＸＯ）シグナルとよく相関していた（図２Ｅ、１３）。
【0099】
Ｌ－Ａｓｐ６配列の挿入が、Ｔｒａｓ抗体の結合及び特異性に対して無視できるほど少ない影響を有することを実証するために、ＦＩＴＣ標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ抗体を、ＨＥＲ２陽性細胞株及びＨＥＲ２陰性細胞株に対する結合について試験した。フローサイトメトリーにより、これらの抗体のいずれも、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に結合しないが、骨標的化抗体の各々は、ＨＥＲ２発現ＳＫ－ＢＲ－３細胞に、非修飾Ｔｒａｓのものに類似したＫｄ（７．０９ｎＭ）で結合することが明らかになった（図２Ｆ、１４～２３、及び表３）。Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ種は、恐らく、挿入された負に帯電した残基によって媒介される静電反発力の増加のために、Ｔｒａｓよりもわずかに高いＫｄ値（それぞれ、１４．６０ｎＭ、１９．３９ｎＭ、１２．９９ｎＭ、１９．４７ｎＭ、１９．４７ｎＭ、及び２５．２０ｎＭ）を有していた（図１４～２２）。次に、骨標的化抗体のインビトロ細胞傷害性を、ＨＥＲ２陽性細胞株及びＨＥＲ２陰性細胞株に対して評価した。フローサイトメトリーのデータと一致して、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ抗体は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、非修飾Ｔｒａｓのものに類似した効率で殺傷する（それぞれ、５．９７±５．６４ｎＭ、１３．０７±１２．０９ｎＭ、及び２１．１０±２０．２５ｎＭのＥＣ５０値（図２Ｇ））。対照的に、抗体のいずれも、同じ実験条件下で、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対して細胞傷害性を示さない（図２Ｇ）。これらの結果は、骨ホーミング配列の抗体中への導入が、その抗腫瘍活性を維持しながら、その骨親和性を有意に向上させたことを示している。骨細胞に対するＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴの潜在的毒性を調べるために、マウス前破骨細胞株ＲＡＷ２６４．７及び骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を、様々な濃度のＴｒａｓ又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴと４日間インキュベートし、細胞生存を評価した。図３８に示されるように、ＴｒａｓもＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴも、有意な毒性を示さなかった。これらの結果は、骨に対する結合の向上にもかかわらず、骨標的化抗体が、骨間質細胞に対して有意な毒性を引き起こす可能性が低いことを示している。
【0100】
骨標的化抗体のインビボ分布
Ｔｒａｓ抗体分布に対する骨ホーミングペプチドの効果を、マウス異種移植片モデルにおいて更に調査した。傍脛骨注射を用いて、ホタルルシフェラーゼ及び赤色蛍光タンパク質で標識された２×１０５個のＨＥＲ２発現ＭＤＡ－ＭＢ－３６１乳がん細胞を、最初にヌードマウスの右脚中に導入し、続いて、後眼窩注射を介してスルホ－Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴを投与した。抗体注入の７２時間後及び１２０時間後に、主臓器を収集し、抗体分布を撮像した。骨間蛍光シグナルの強度は、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ注射動物において、Ｔｒａｓ注射マウスよりも強かった（図２Ｈ、２４、及び２５）。図２５に示されるように、定量化した様々な組織からのエクスビボシグナルは、骨標的化抗体の有意により高いシグナルが、骨格組織において観察できたが、他の組織においては観察できなかったことを示唆している（図２５Ｂ）。更に、本発明者らは、収集された心臓組織の組織学的分析を行って、様々な治療時に心臓組織における明らかな病理学的変動を観察せず、これは、骨標的化抗体の良好な生体適合性を示している（図２５Ｃ）。更に、恐らく、骨吸収ニッチに対するＬ－Ａｓｐ６ペプチド媒介性標的化のために、左の健康な骨と比較して、より多い量の骨標的化抗体が、腫瘍を担持する右脚の骨に存在した。全体的に、これらの結果は、Ｌ－Ａｓｐ６配列の導入が、骨腫瘍部位における治療用抗体の濃度を有意に増加できることを示した。この効果は、同時に全身毒性を減少させながら、腫瘍部位で抗腫瘍活性を向上させる可能性を有する。
Ｔｒａｓ抗体分布に対する骨ホーミングペプチドの効果を、マウス異種移植片モデルにおいて更に調査した。傍脛骨注射を用いて、ホタルルシフェラーゼ及び赤色蛍光タンパク質で標識された２×１０５個のＨＥＲ２発現ＭＤＡ－ＭＢ－３６１乳がん細胞を、最初にヌードマウスの右脚中に導入し、続いて、後眼窩注射を介してスルホ－Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴを投与した。抗体注入の７２時間後及び１２０時間後に、主臓器を収集し、抗体分布を撮像した。骨間蛍光シグナルの強度は、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ注射動物において、Ｔｒａｓ注射マウスよりも強かった（図２Ｈ、２４、及び２５）。図２５に示されるように、定量化した様々な組織からのエクスビボシグナルは、骨標的化抗体の有意により高いシグナルが、骨格組織において観察できたが、他の組織においては観察できなかったことを示唆している（図２５Ｂ）。更に、本発明者らは、収集された心臓組織の組織学的分析を行って、様々な治療時に心臓組織における明らかな病理学的変動を観察せず、これは、骨標的化抗体の良好な生体適合性を示している（図２５Ｃ）。更に、恐らく、骨吸収ニッチに対するＬ－Ａｓｐ６ペプチド媒介性標的化のために、左の健康な骨と比較して、より多い量の骨標的化抗体が、腫瘍を担持する右脚の骨に存在した。全体的に、これらの結果は、Ｌ－Ａｓｐ６配列の導入が、骨腫瘍部位における治療用抗体の濃度を有意に増加できることを示した。この効果は、同時に全身毒性を減少させながら、腫瘍部位で抗腫瘍活性を向上させる可能性を有する。
【0101】
骨微小転移に対する骨標的化抗体のインビボ治療活性
骨標的化抗体が、骨への乳がん転移の治療用の新規治療実体として機能できるかどうかを判定するために、インビボ抗腫瘍実験を、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍を担持するヌードマウスにおいて行った。ホタルルシフェラーゼ及び赤色蛍光タンパク質で標識された２×１０５個のＭＤＡ－ＭＢ－３６１乳がん細胞を、傍脛骨注射を介してヌードマウスの右脚中に接種した。注射の１週間後に、野生型Ｔｒａｓ及び骨標的化Ｔｒａｓ抗体を、後眼窩注射によって投与した。図３Ａに示されるように、１ｍｇ／ｋｇの非修飾Ｔｒａｓを受けたマウスは、この治療に良好に応答しなかった。治療の最初の２週間中の初期阻害性効果にもかかわらず、非修飾Ｔｒａｓは、長期の腫瘍成長を制御することができず、対象のマウス生存期間中央値を９．７日だけ延長した（図３Ｂ及び３Ｃ）。対照的に、腫瘍担持マウスを骨標的化抗体で治療した場合、腫瘍成長は、有意に阻害された。Ｔｒａｓ－ＣＴ治療群、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療群、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ治療群は、それぞれ、２７．５、３５．８、及び１８．９日の腫瘍成長の顕著な遅延を示した（図３Ｂ及び３Ｃ）。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、２６、２７、及び表４は、１日目から８０日目までの各治療群の生物発光（ＢＬＩ）シグナルを示す。ＰＢＳ治療した対照群においては、経時的なＢＬＩシグナルの漸進性の増加があった。１から８０日目までのＢＬＩシグナルは、骨標的化Ｔｒａｓ抗体治療群が、Ｔｒａｓ治療群と比較して、腫瘍成長の有意な遅延を経験したことを実証した（図３Ｂ及び３Ｃ）。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスは、腫瘍サイズの最小の増加を示した（Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ対Ｔｒａｓ：９．３±４．２対１５６２．７±８０１．６、ｐ＜０．０００１）。更に、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療マウスは、６２．５％の生存率を経験し、Ｔｒａｓ治療マウスにおいて見られたものを上回る有意な改善であった（図３Ｄ）。したがって、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴでの治療は、Ｔｒａｓ治療マウスにおいて見られたものよりも有効な微小転移の進行の阻害を結果としてもたらしたように見られる。骨標的化抗体での治療は、良好な耐容性を示し、明らかな毒性の徴候は、治療群のいずれにおいても観察されなかった。例えば、体重におけるいかなる差も、様々な治療群にわたって観察されなかった（図３Ｅ）。
骨標的化抗体が、骨への乳がん転移の治療用の新規治療実体として機能できるかどうかを判定するために、インビボ抗腫瘍実験を、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍を担持するヌードマウスにおいて行った。ホタルルシフェラーゼ及び赤色蛍光タンパク質で標識された２×１０５個のＭＤＡ－ＭＢ－３６１乳がん細胞を、傍脛骨注射を介してヌードマウスの右脚中に接種した。注射の１週間後に、野生型Ｔｒａｓ及び骨標的化Ｔｒａｓ抗体を、後眼窩注射によって投与した。図３Ａに示されるように、１ｍｇ／ｋｇの非修飾Ｔｒａｓを受けたマウスは、この治療に良好に応答しなかった。治療の最初の２週間中の初期阻害性効果にもかかわらず、非修飾Ｔｒａｓは、長期の腫瘍成長を制御することができず、対象のマウス生存期間中央値を９．７日だけ延長した（図３Ｂ及び３Ｃ）。対照的に、腫瘍担持マウスを骨標的化抗体で治療した場合、腫瘍成長は、有意に阻害された。Ｔｒａｓ－ＣＴ治療群、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療群、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ治療群は、それぞれ、２７．５、３５．８、及び１８．９日の腫瘍成長の顕著な遅延を示した（図３Ｂ及び３Ｃ）。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、２６、２７、及び表４は、１日目から８０日目までの各治療群の生物発光（ＢＬＩ）シグナルを示す。ＰＢＳ治療した対照群においては、経時的なＢＬＩシグナルの漸進性の増加があった。１から８０日目までのＢＬＩシグナルは、骨標的化Ｔｒａｓ抗体治療群が、Ｔｒａｓ治療群と比較して、腫瘍成長の有意な遅延を経験したことを実証した（図３Ｂ及び３Ｃ）。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴで治療したマウスは、腫瘍サイズの最小の増加を示した（Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ対Ｔｒａｓ：９．３±４．２対１５６２．７±８０１．６、ｐ＜０．０００１）。更に、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療マウスは、６２．５％の生存率を経験し、Ｔｒａｓ治療マウスにおいて見られたものを上回る有意な改善であった（図３Ｄ）。したがって、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴでの治療は、Ｔｒａｓ治療マウスにおいて見られたものよりも有効な微小転移の進行の阻害を結果としてもたらしたように見られる。骨標的化抗体での治療は、良好な耐容性を示し、明らかな毒性の徴候は、治療群のいずれにおいても観察されなかった。例えば、体重におけるいかなる差も、様々な治療群にわたって観察されなかった（図３Ｅ）。
【0102】
実験の終了時（８１日目）に、脛骨（腫瘍を担持する脚から）を採取し、マイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｏ－ＣＴ）によって走査した。ｍｉｃｒｏ ＣＴ分析により、ＰＢＳ治療群及びＴｒａｓ治療群の両方において広範な溶骨性骨破壊が明らかになったが、骨量減少は、骨標的化抗体治療群において有意に低減された（図３Ｆ、２８、及び２９）。ＰＢＳ治療群及びＴｒａｓ治療群のマウスと比較して、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療マウスは、より大きな骨体積（ＢＶ、図３Ｇ）、より大きな骨体積／組織体積の比（ＢＶ／ＴＶ、図３Ｈ）、より大きな骨ミネラル密度（ＢＭＤ、図３Ｉ）、及びより厚い海綿骨（Ｔｂ．Ｔｈ、図３Ｊ）を示したが、より小さな骨表面／骨体積の比（ＢＳ／ＢＶ、図３Ｋ及び表５）を示した。これらのパラメータは全て、骨ホーミングペプチドで修飾された抗体による微小転移誘発性骨溶解の有意な遅延を示している。組織学的分析により、更に、Ｔｒａｓ治療群における腫瘍細胞の骨マトリックス中及び隣接組織中への浸潤が明らかになった（図３Ｌ）。組織学によりまた、ＢＬＩの結果によって示されたこれらのマウスにおける脛骨内腫瘍負荷の低減が確認された。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療マウスからの骨切片により、これらのマウスにおける腫瘍成長の低減及び比較的正常な骨形態が明らかになり、これは、腫瘍浸潤及び骨破壊の有意な阻害と一致していた（図３Ｌ）。様々な治療群からの骨試料をまた、骨吸収ＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸ホスファターゼ）陽性多核破骨細胞（ピンク色の細胞として示される）及びＨＥＲ発現がん細胞について分析した（図３Ｍ、３Ｎ、３０～３２）。Ｔｒａｓ治療と比較して、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療は、骨ニッチにおける破骨細胞及びＨＥＲ２陽性細胞の両方の数を有意に低減させ、これは、微小転移の進行を阻害する骨標的化抗体の能力と再び一致していた（図３Ｎ）。腫瘍誘発性高カルシウム血症及びＴＲＡＣＰ ５ｂタンパク質が、溶骨性骨破壊の指標であることから、骨標的化抗体治療の効果を評価した。結果は、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療群が、より良好な治療効果を有していたことを示唆した（図３３）。
【0103】
ｍｉｃｒｏＣＴ及び組織学的分析と一致して、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療は、血清中の高カルシウム血症及びＴＲＡＣＰ ５ｂタンパク質レベルによって評価されるように、最低レベルの骨破壊を示した（図３３）。インビトロで骨標的化抗体の安定性を評価するために、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（１ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を、ＰＢＳ中４℃で、３ヶ月間インキュベートした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＥＳＩ－ＭＳ分析により、骨標的化抗体のいかなる有意な分解又は凝集も観察されなかったことが明らかになった（図４０）。一方、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴの両方の血清レベルは、インビボで類似した薬物動態を示し（図４１）、これは、骨ホーミングペプチドの付加が抗体の安定性を変えないことを示唆した。次に、骨転移についての骨標的化抗体の有益性を、より高い用量で評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－３６１骨転移を有するヌードマウスを、１０ｍｇ／ｋｇのＴｒａｓ又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴで２週間毎に治療した。注目すべきことに、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療は、１０ｍｇ／ｋｇのＴｒａｓでの治療と比較して、統計的に有意な成長阻害及び全生存期間の延長を結果としてもたらす（図３Ｏ～Ｒ、４２、４３）。更に、いかなる体重減少も、高用量の骨標的化抗体で観察されなかった（図３Ｓ）。
【0104】
骨標的化抗体の治療有効性の向上をまた、ＭＣＦ－７乳がん細胞を用いた二次的骨転移モデルで評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－３６１モデルと一致して、転移負荷の有意な低減及びマウス生存期間の増加が、Ｔｒａｓ治療群と比較して、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療群において観察された（図３６Ａ～Ｄ、４４）。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療は、動物における追加的な体重変化を変えなかった（図３６Ｅ）。
【0105】
原発腫瘍の治療においてＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴの有効性を調べるために、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞（１×１０６個）を乳房脂肪体に注射し、続いて、ＰＢＳ、Ｔｒａｓ（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（１ｍｇ／ｋｇ）で治療した。図４５Ａ～Ｃに示されるように、Ｔｒａｓ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療は両方とも、乳房脂肪体における腫瘍成長を有意に減少させたが、２つの治療の間で腫瘍サイズに統計的な差はなかった（図４５Ｃ）。まとめると、これらのデータは、骨ホーミングペプチドの抗体中への導入が、原発腫瘍におけるその抗腫瘍活性を損なうことなく、乳がん骨転移を有意に阻害できることを示唆している。
【0106】
骨標的化抗体の免疫原性評価
骨標的化抗体の治療が特異的な免疫応答を引き起こすかを理解するために、免疫能を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＰＢＳ、Ｔｒａｓ、又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴで週２回、２週間治療した。図Ｓ３７Ａに示されるように、フローサイトメトリーによって決定された免疫プロファイリングは、Ｔｒａｓ又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴのいずれかで治療したマウスが、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除いて類似した免疫組成を有していたことを示唆している。更に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮγ染色は、Ｔｒａｓ治療マウス及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療マウスにおいて有意な差を有しておらず、これは、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴがＣＤ４＋Ｔ細胞の機能的活性を有意に変えないことを示している（図４６Ｂ）。更に、野生型抗体又は骨標的化抗体での治療の間で、ＩＮＦγ、ＩＬ－２、及びＩＬ－４レベルの血清レベルにおいていかなる有意な差もなかった（図４６Ｃ～Ｅ）。結果は、Ｌ－Ａｓｐ６の抗体への付加が、いかなる明らかな余分な免疫応答も引き起こさないことを示した。更に、骨標的化抗体に対するインビボ免疫応答はまた、以前に報告されたように、抗トラスツズマブ抗体ＥＬＩＳＡベースのアッセイに基づく免疫原性試験によって、試験することもできる。類似した抗トラスツズマブ抗体レベルが、Ｔｒａｓ（５ｍｇ／ｋｇ）又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物において観察され、これは、骨標的化ペプチドの付加が、抗体の免疫原性を変えないことを示唆している（図４７）。
骨標的化抗体の治療が特異的な免疫応答を引き起こすかを理解するために、免疫能を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＰＢＳ、Ｔｒａｓ、又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴで週２回、２週間治療した。図Ｓ３７Ａに示されるように、フローサイトメトリーによって決定された免疫プロファイリングは、Ｔｒａｓ又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴのいずれかで治療したマウスが、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除いて類似した免疫組成を有していたことを示唆している。更に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮγ染色は、Ｔｒａｓ治療マウス及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療マウスにおいて有意な差を有しておらず、これは、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴがＣＤ４＋Ｔ細胞の機能的活性を有意に変えないことを示している（図４６Ｂ）。更に、野生型抗体又は骨標的化抗体での治療の間で、ＩＮＦγ、ＩＬ－２、及びＩＬ－４レベルの血清レベルにおいていかなる有意な差もなかった（図４６Ｃ～Ｅ）。結果は、Ｌ－Ａｓｐ６の抗体への付加が、いかなる明らかな余分な免疫応答も引き起こさないことを示した。更に、骨標的化抗体に対するインビボ免疫応答はまた、以前に報告されたように、抗トラスツズマブ抗体ＥＬＩＳＡベースのアッセイに基づく免疫原性試験によって、試験することもできる。類似した抗トラスツズマブ抗体レベルが、Ｔｒａｓ（５ｍｇ／ｋｇ）又はＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物において観察され、これは、骨標的化ペプチドの付加が、抗体の免疫原性を変えないことを示唆している（図４７）。
【0107】
骨標的化抗体は骨病変からの二次転移を阻害する
患者の３分の２超において、乳がん転移は、骨格に制限されず、その後、他の臓器においても起こる２８、２９、３０、３１。最近のゲノム分析により、罹患率及び死亡率の主な原因であるこれらの転移は、原発腫瘍に由来するものではなく、他の転移部位から播種されることが示唆されている。がん細胞を後肢骨に選択的に送達する最近開発されたアプローチを利用して、確立された骨病変から複数の他の臓器への頻繁な「転移から転移」の播種が観察されている３２～３４。したがって、骨標的化抗体が、骨病変に由来するこれらの二次転移を阻害できるかどうかを評価した。傍脛骨注射法を用いると、高度に骨特異的な脛骨担持腫瘍は、発生の早期段階にあった。骨病変が進行するにつれて、生物発光シグナルによってマークされる転移が、他の骨、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び脳を含む多くの他の臓器に現れ始めた。このモデルを用いて、２×１０５個のルシフェラーゼ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、傍脛骨注射を介してヌードマウスの右後肢中に導入し、続いて、非修飾Ｔｒａｓ抗体及び骨標的化Ｔｒａｓ抗体で治療した。マウスを、治療の開始の８１日後に安楽死させ、エクスビボ生物発光撮像のために臓器を採取した。右後肢骨及び６つの軟部組織臓器を含む７つの臓器を、転移の評価のために単離した。図４Ａ、４Ｂ、及び３４に示されるように、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴでの治療は、対側の後肢（左後肢骨）、心臓、及び肝臓への二次転移の頻度を有意に低減した。原発骨病変からの二次転移のエクスビボＢＬＩ強度は、骨標的化抗体で治療した実験群、特にＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療群において低減された。非修飾Ｔｒａｓでの治療と比較して、肺及び肝臓からの転移シグナルは、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療後に有意に減少した（図４Ｂ）。まとめると、これらのデータにより、初期骨転移及び骨から他の遠隔臓器への二次転移の両方に対する、骨標的化抗体の治療有効性の向上が明らかになる。
患者の３分の２超において、乳がん転移は、骨格に制限されず、その後、他の臓器においても起こる２８、２９、３０、３１。最近のゲノム分析により、罹患率及び死亡率の主な原因であるこれらの転移は、原発腫瘍に由来するものではなく、他の転移部位から播種されることが示唆されている。がん細胞を後肢骨に選択的に送達する最近開発されたアプローチを利用して、確立された骨病変から複数の他の臓器への頻繁な「転移から転移」の播種が観察されている３２～３４。したがって、骨標的化抗体が、骨病変に由来するこれらの二次転移を阻害できるかどうかを評価した。傍脛骨注射法を用いると、高度に骨特異的な脛骨担持腫瘍は、発生の早期段階にあった。骨病変が進行するにつれて、生物発光シグナルによってマークされる転移が、他の骨、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び脳を含む多くの他の臓器に現れ始めた。このモデルを用いて、２×１０５個のルシフェラーゼ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞を、傍脛骨注射を介してヌードマウスの右後肢中に導入し、続いて、非修飾Ｔｒａｓ抗体及び骨標的化Ｔｒａｓ抗体で治療した。マウスを、治療の開始の８１日後に安楽死させ、エクスビボ生物発光撮像のために臓器を採取した。右後肢骨及び６つの軟部組織臓器を含む７つの臓器を、転移の評価のために単離した。図４Ａ、４Ｂ、及び３４に示されるように、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴでの治療は、対側の後肢（左後肢骨）、心臓、及び肝臓への二次転移の頻度を有意に低減した。原発骨病変からの二次転移のエクスビボＢＬＩ強度は、骨標的化抗体で治療した実験群、特にＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療群において低減された。非修飾Ｔｒａｓでの治療と比較して、肺及び肝臓からの転移シグナルは、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ治療後に有意に減少した（図４Ｂ）。まとめると、これらのデータにより、初期骨転移及び骨から他の遠隔臓器への二次転移の両方に対する、骨標的化抗体の治療有効性の向上が明らかになる。
【0108】
骨ホーミングペプチドでの抗体－薬物コンジュゲートの修飾は、インビボで治療有効性の向上を示す
抗体の腫瘍特異性と化学療法薬の高い毒性とを組み合わせる抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、乳がん患者、特に進行性乳がんを有する患者に対する抗がん薬の重要な種類として出現している。ＨＥＲ２陽性乳がんに対するトラスツズマブエムタンシン（Ｔ－ＤＭ１）の最初のＦＤＡ承認に続いて、トラスツズマブデルクステカンが、切除不能又は転移性のＨＥＲ２陽性乳がんを有する成人の治療について、最近承認された。骨標的化ＡＤＣが、骨転移の治療においてその有効性を更に改善することができるかを試験するために、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーション技術を最初に用いて、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を野生型抗体Ｔｒａｓ及び骨標的化抗体Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴの両方に部位特異的に結合させた（図３７Ｅ）。コンジュゲーションの成功は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＥＳＩ－ＭＳによって実証された（図３７Ｂ、４８、４９）。毒素のコンジュゲーションが、抗原標的化能力及び特異性を変えなかったことを確認するために、インビトロ結合アッセイを、ＨＥＲ２陽性細胞及びＨＥＲ２陰性細胞を用いて行った（図５０）。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥは、ＨＥＲ２陽性ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対して高い結合親和性を示したが、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞には示さなかった。次に、これらのＡＤＣのインビトロ細胞傷害性を、ＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８乳がん細胞株において評価した（図３７Ｃ～Ｄ）。Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥは両方とも、ＳＫ－ＢＲ－３においてのみ高い効力を示し（それぞれ、ＥＣ５０：０．１８±０．８２ｎＭ及び０．４９±０．３０ｎＭ）、いかなる有意な毒性もＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において観察されなかった。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの骨標的化能力をインビトロで試験するために、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ又はＴｒａｓ－ＭＭＡＥのいずれかを、非脱石灰化骨切片とインキュベートした。予想されたように、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥのシグナルのみがＸＯシグナルとよく相関し、その骨標的化能力が確認された（図３７Ｅ）。
抗体の腫瘍特異性と化学療法薬の高い毒性とを組み合わせる抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、乳がん患者、特に進行性乳がんを有する患者に対する抗がん薬の重要な種類として出現している。ＨＥＲ２陽性乳がんに対するトラスツズマブエムタンシン（Ｔ－ＤＭ１）の最初のＦＤＡ承認に続いて、トラスツズマブデルクステカンが、切除不能又は転移性のＨＥＲ２陽性乳がんを有する成人の治療について、最近承認された。骨標的化ＡＤＣが、骨転移の治療においてその有効性を更に改善することができるかを試験するために、ｐＣｌｉｃｋコンジュゲーション技術を最初に用いて、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を野生型抗体Ｔｒａｓ及び骨標的化抗体Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴの両方に部位特異的に結合させた（図３７Ｅ）。コンジュゲーションの成功は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＥＳＩ－ＭＳによって実証された（図３７Ｂ、４８、４９）。毒素のコンジュゲーションが、抗原標的化能力及び特異性を変えなかったことを確認するために、インビトロ結合アッセイを、ＨＥＲ２陽性細胞及びＨＥＲ２陰性細胞を用いて行った（図５０）。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥは、ＨＥＲ２陽性ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対して高い結合親和性を示したが、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞には示さなかった。次に、これらのＡＤＣのインビトロ細胞傷害性を、ＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８乳がん細胞株において評価した（図３７Ｃ～Ｄ）。Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥ及びＴｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥは両方とも、ＳＫ－ＢＲ－３においてのみ高い効力を示し（それぞれ、ＥＣ５０：０．１８±０．８２ｎＭ及び０．４９±０．３０ｎＭ）、いかなる有意な毒性もＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において観察されなかった。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの骨標的化能力をインビトロで試験するために、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ又はＴｒａｓ－ＭＭＡＥのいずれかを、非脱石灰化骨切片とインキュベートした。予想されたように、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥのシグナルのみがＸＯシグナルとよく相関し、その骨標的化能力が確認された（図３７Ｅ）。
【0109】
次に、骨標的化ＡＤＣの治療有効性を、骨転移の異種移植片モデルにおいて調べた。Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥの毎週の投与は、非修飾Ｔｒａｓ－ＭＭＡＥと比較して、骨における転移性増殖の有意な阻害をもたらした（図３７Ｆ～Ｈ、５１、５２）。更に、骨標的化ＡＤＣは、治療中の様々な群にわたる体重の継続的な増加によって示されるように、明らかな毒性を示さなかった（図３７Ｉ）。ｍｉｃｒｏ－ＣＴ分析により、ＰＢＳ治療群及びＴｒａｓ－ＭＭＡＥ治療群の両方において広範な溶骨性骨破壊が明らかになったが、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ治療群においてはならなかった（図３７Ｊ、５３）。ＰＢＳ治療群及びＴｒａｓ－ＭＭＡＥ治療群のマウスと比較して、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥ治療マウスは、より高い骨体積／組織体積の比（ＢＶ／ＴＶ、図Ｓ４６Ａ）及びより厚い海綿骨（Ｔｂ．Ｔｈ、図５４Ｂ）を示した。組織学によりまた、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ－ＭＭＡＥマウスにおける脛骨内腫瘍負荷の低減が確認される（図５５）。一貫して、骨標的化ＡＤＣはまた、骨病変に由来する二次転移の頻度及びサイズを有意に低減した（図３７Ｋ、５６）。
【0110】
したがって、抗体療法への骨特異性の付加は、他の組織と比べて、骨転移ニッチにおいて抗体濃度の増加をもたらすことが実証された。このアプローチにより、骨転移に対する、及び骨病変からの二次的な多臓器転移播種に対する標的療法が生じる。骨転移の異種移植片モデルを用いて、非修飾トラスツズマブは、不十分な骨組織浸透及び分布を有し、したがって、抗体のその標的に対する接触を低減し、骨微小環境におけるがん細胞に対するその有効性を限定することが見出された。非修飾抗体と比較して、骨ホーミングペプチド配列（Ｌ－Ａｓｐ６）で修飾されたトラスツズマブは、骨転移の部位への標的化の向上を示した。これは、骨への乳がん転移に対する、及び骨病変から他の臓器への転移性播種に対する活性の改善を結果としてもたらした。最も重要なことに、中程度の骨結合能力を有する修飾抗体が、インビボで最適な有効性を有していたことが実証された。対照的に、より高い骨結合能力を有する抗体は、骨転移に対して最適に満たない活性を有する。これは、後者の実体の骨マトリックスからの遅い放出、又は負電荷を有するペプチドの数の増加に起因する静電反発力の増加のためであり得る。抗体療法への骨特異性の付加は、これらの作用物質の骨への特異的送達を可能にした。これは、治療有効性の向上だけではなく、薬物の全身分布に伴う有害な副作用の低減も結果としてもたらした。したがって、抗体ベースの治療法を、抗原特異的なものから抗原及び組織の両方に特異的なものへと移行させるため、したがって、抗体療法を臨床トランスレーションに向かって進めるのに有望な新たな道を提供するための新たな戦略が、本明細書において提供される。
【0111】
実施例２－材料及び方法
材料
特に明記されていない限り、使用した化学物質及び溶媒は、分析グレードのものであり、商業的供給源から受け取ったまま使用した。ＬＢ寒天は、Ｆｉｓｈｅｒに発注した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入した（表１）。プラスミドＤＮＡの調製は、ＧｅｎＣａｔｃｈ（商標） Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ及びＧｅｎＣａｔｃｈ（商標） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで実施した。ＥＳＩ－ＭＳ分析前にグリカンを除去するために、ＰＮＧａｓｅ ＦをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＮｕＰＡＧＥ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ［６×］は、ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳから購入した。ＰＭ２５００ ＥｘｃｅｌＢａｎｄ ３－ｃｏｌｏｒ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒは、ＳＭＯＢＩＯ から購入した。ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（カタログ番号：Ｈ１３９９）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）から購入した。３，３－ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩 （ＤｉＩＣ１８、カタログ番号：Ｍ１１９７）は、Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
材料
特に明記されていない限り、使用した化学物質及び溶媒は、分析グレードのものであり、商業的供給源から受け取ったまま使用した。ＬＢ寒天は、Ｆｉｓｈｅｒに発注した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入した（表１）。プラスミドＤＮＡの調製は、ＧｅｎＣａｔｃｈ（商標） Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ及びＧｅｎＣａｔｃｈ（商標） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで実施した。ＥＳＩ－ＭＳ分析前にグリカンを除去するために、ＰＮＧａｓｅ ＦをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＮｕＰＡＧＥ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ［６×］は、ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳから購入した。ＰＭ２５００ ＥｘｃｅｌＢａｎｄ ３－ｃｏｌｏｒ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒは、ＳＭＯＢＩＯ から購入した。ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（カタログ番号：Ｈ１３９９）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）から購入した。３，３－ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩 （ＤｉＩＣ１８、カタログ番号：Ｍ１１９７）は、Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
【0112】
細胞株
ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株を、ＡＴＣＣの指示に従って培養した。ホタルルシフェラーゼ及びＲＦＰ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞株を、以前に記載されたように生成した４０。
ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株を、ＡＴＣＣの指示に従って培養した。ホタルルシフェラーゼ及びＲＦＰ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞株を、以前に記載されたように生成した４０。
【0113】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
そのままの及び還元した抗体試料を、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを用いて分析した。２０μＬの０．２ｍｇ／ｍＬ抗体試料を、ゲルへのローディング前に、４μＬのサンプルローディング色素と混合した。ゲルを、１６０Ｖ下でＭＥＳ緩衝液において３５分間泳動し、クマシーブルー緩衝液を用いて染色した。ゲル画像を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００によって撮り、ＩｍａｇｅＱｕａｎＴＬソフトウェアによって分析した。
そのままの及び還元した抗体試料を、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを用いて分析した。２０μＬの０．２ｍｇ／ｍＬ抗体試料を、ゲルへのローディング前に、４μＬのサンプルローディング色素と混合した。ゲルを、１６０Ｖ下でＭＥＳ緩衝液において３５分間泳動し、クマシーブルー緩衝液を用いて染色した。ゲル画像を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００によって撮り、ＩｍａｇｅＱｕａｎＴＬソフトウェアによって分析した。
【0114】
ＥＳＩ－ＭＳ分析
抗体を、１２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｐｕｍｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ：Ｇ７１１１Ｂ）と結合したシングル四重極質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ：Ｇ７１２９Ａ）を用いて分析した。（カラム：Ｐｕｒｓｕｉｔ ５ Ｄｉｐｈｅｎｙｌ １５０×２．０ｍｍ）。抗体の溶出条件は、以下の通りであった：移動相Ａ＝０．１％ギ酸水；移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ギ酸；勾配０～０．１分、１０～１５％Ｂ；０．１～８分、１５～５０％Ｂ；８～８．１分、５０～１０％Ｂ；流速＝０．５ｍＬ／分。吸光度は、２８０ｎｍで測定した。自動データ処理を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ ＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）で行って、そのまま及び還元のＭＳスペクトルを分析した。
抗体を、１２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｐｕｍｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ：Ｇ７１１１Ｂ）と結合したシングル四重極質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ：Ｇ７１２９Ａ）を用いて分析した。（カラム：Ｐｕｒｓｕｉｔ ５ Ｄｉｐｈｅｎｙｌ １５０×２．０ｍｍ）。抗体の溶出条件は、以下の通りであった：移動相Ａ＝０．１％ギ酸水；移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ギ酸；勾配０～０．１分、１０～１５％Ｂ；０．１～８分、１５～５０％Ｂ；８～８．１分、５０～１０％Ｂ；流速＝０．５ｍＬ／分。吸光度は、２８０ｎｍで測定した。自動データ処理を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ ＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）で行って、そのまま及び還元のＭＳスペクトルを分析した。
【0115】
ＨＡ結合アッセイ
簡潔には、１ｍｇのＴｒａｓ又は骨標的化抗体を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の０．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した。ＨＡ（２０当量、２０ｍｇ）は、０．５ｍＬのＰＢＳ中の懸濁液であった。次いで、抗体及びＨＡをボルテックスで混合し、結果として生じた懸濁液を、２２０ｒｐｍ、３７℃で振盪させた。ＨＡを含まない試料を、対照として使用した。０．２５、０．５、１、２、３、６、及び８時間後に、懸濁液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、３分）、２８０ｎｍでの上清の吸光度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって測定した。ＨＡに対する結合パーセントを、以下のように計算した。式中、ＯＤは、光学密度を表す。
［（ＯＤＨＡを含まない－ＯＤＨＡを含む）／（ＯＤＨＡを含まない）］×１００％
簡潔には、１ｍｇのＴｒａｓ又は骨標的化抗体を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中の０．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した。ＨＡ（２０当量、２０ｍｇ）は、０．５ｍＬのＰＢＳ中の懸濁液であった。次いで、抗体及びＨＡをボルテックスで混合し、結果として生じた懸濁液を、２２０ｒｐｍ、３７℃で振盪させた。ＨＡを含まない試料を、対照として使用した。０．２５、０．５、１、２、３、６、及び８時間後に、懸濁液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、３分）、２８０ｎｍでの上清の吸光度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって測定した。ＨＡに対する結合パーセントを、以下のように計算した。式中、ＯＤは、光学密度を表す。
［（ＯＤＨＡを含まない－ＯＤＨＡを含む）／（ＯＤＨＡを含まない）］×１００％
【0116】
Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴのインビトロ細胞傷害性
９６ウェルプレート中、２×１０３細胞／ウェルのＢＴ４７４及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞。２４時間のインキュベーション後に、細胞を、様々な濃度のＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴで処理し、次いで４日間インキュベートした。次いで、２０μＬの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、更に４時間インキュベートした。培地を吸引し、１５０μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。生細胞を定量化するために、５６５ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＴｅｃａｎによるＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ Ｐｌｅｘ）によって測定した。
９６ウェルプレート中、２×１０３細胞／ウェルのＢＴ４７４及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞。２４時間のインキュベーション後に、細胞を、様々な濃度のＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴで処理し、次いで４日間インキュベートした。次いで、２０μＬの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、更に４時間インキュベートした。培地を吸引し、１５０μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。生細胞を定量化するために、５６５ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＴｅｃａｎによるＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ Ｐｌｅｘ）によって測定した。
【0117】
フローサイトメトリー
がん細胞（３×１０５個）を、３０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ及び骨標的化抗体と、４℃で３０分間インキュベートした。結合していない抗体を洗い流した後、結合した抗体を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（コード：１０９－０９５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を４℃で３０分間用いて検出した。蛍光強度を、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。
がん細胞（３×１０５個）を、３０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ及び骨標的化抗体と、４℃で３０分間インキュベートした。結合していない抗体を洗い流した後、結合した抗体を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（コード：１０９－０９５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を４℃で３０分間用いて検出した。蛍光強度を、ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。
【0118】
Ｋｄ値の決定
ＨＥＲ２に対する骨標的化抗体の機能的親和性を、報告されたように決定した４１。簡潔には、合計２×１０５個のＳＫ－ＢＲ－３又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、段階的濃度のＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴと氷上で４時間インキュベートした。次いで、結合した抗体を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）によって検出した。細胞を、ヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）染色後に、蛍光強度について分析した。飽和曲線の線形部分を使用し、蛍光中央値の逆数を抗体濃度の逆数の関数としてプロットするＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ方法を用いて、解離定数、ＫＤを計算した。ＫＤは、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（Ｋｄ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］）、式中、Ｆは、バックグラウンドを差し引いた蛍光中央値に対応し、Ｆｍａｘは、プロットから計算した。
ＨＥＲ２に対する骨標的化抗体の機能的親和性を、報告されたように決定した４１。簡潔には、合計２×１０５個のＳＫ－ＢＲ－３又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、段階的濃度のＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴと氷上で４時間インキュベートした。次いで、結合した抗体を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）によって検出した。細胞を、ヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）染色後に、蛍光強度について分析した。飽和曲線の線形部分を使用し、蛍光中央値の逆数を抗体濃度の逆数の関数としてプロットするＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ方法を用いて、解離定数、ＫＤを計算した。ＫＤは、以下のように決定した：１／Ｆ＝１／Ｆｍａｘ＋（Ｋｄ／Ｆｍａｘ）（１／［Ａｂ］）、式中、Ｆは、バックグラウンドを差し引いた蛍光中央値に対応し、Ｆｍａｘは、プロットから計算した。
【0119】
骨凍結切片に対する結合
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化長骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴとインキュベートし、４℃で一晩コンジュゲートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧで、室温で６０分間染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、標本を、キシレノールオレンジ（ＸＯ）（ストック：２ｍｇ／ｍｌ、１：５００希釈、希釈緩衝液：ＰＨ６．５のＰＢＳ）と３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳでの３回の洗浄後に、標本を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ストック１０ｍｇ／ｍｌ、１：２０００希釈）で１０分間染色した。次いで、スライドを、ＰＢＳで洗浄し、空気乾燥させ、（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの）ＰＲＯＬＯＮＧ（商標）金退色防止封入剤で密封した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化長骨切片を、５０μｇ／ｍＬのＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、又はＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴとインキュベートし、４℃で一晩コンジュゲートし、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧで、室温で６０分間染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、標本を、キシレノールオレンジ（ＸＯ）（ストック：２ｍｇ／ｍｌ、１：５００希釈、希釈緩衝液：ＰＨ６．５のＰＢＳ）と３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳでの３回の洗浄後に、標本を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ストック１０ｍｇ／ｍｌ、１：２０００希釈）で１０分間染色した。次いで、スライドを、ＰＢＳで洗浄し、空気乾燥させ、（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの）ＰＲＯＬＯＮＧ（商標）金退色防止封入剤で密封した。
【0120】
Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴのインビボ評価
骨転移を確立するために、ホタルルシフェラーゼ及びＲＦＰ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞（２×１０５個）を、傍脛骨注射法を用いて、３～４週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脛骨中に接種した。手術の７日後に、マウスを、各群において類似した腫瘍負荷を得るようにランク付け／無作為に分割した。ＰＢＳ及び抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）を、週２回の後眼窩注射を介して注射した。動物を、推奨される手順及び製造業者の設定に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ）を用いて週１回撮像した。マウスの全てを、８１日目に、血液を収集した後に安楽死させ、全ての臓器（腫瘍担持脛骨、心臓、肝臓、脾臓、肺、脳、及び腎臓）を、更なる試験のために収集した。
骨転移を確立するために、ホタルルシフェラーゼ及びＲＦＰ標識ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞（２×１０５個）を、傍脛骨注射法を用いて、３～４週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脛骨中に接種した。手術の７日後に、マウスを、各群において類似した腫瘍負荷を得るようにランク付け／無作為に分割した。ＰＢＳ及び抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）を、週２回の後眼窩注射を介して注射した。動物を、推奨される手順及び製造業者の設定に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ）を用いて週１回撮像した。マウスの全てを、８１日目に、血液を収集した後に安楽死させ、全ての臓器（腫瘍担持脛骨、心臓、肝臓、脾臓、肺、脳、及び腎臓）を、更なる試験のために収集した。
【0121】
エクスビボの転移から転移の分析
エンドポイントで、生きている動物にＤ－ルシフェリンを与え、直ちに解剖した。組織を、エクスビボＢＬＩ撮像によって調べた。全プロセスの臓器収集手順及びエクスビボ撮像プロセスは、各マウスについて１５分以内に終了させるべきである。
エンドポイントで、生きている動物にＤ－ルシフェリンを与え、直ちに解剖した。組織を、エクスビボＢＬＩ撮像によって調べた。全プロセスの臓器収集手順及びエクスビボ撮像プロセスは、各マウスについて１５分以内に終了させるべきである。
【0122】
骨組織学及び免疫組織化学
８１日目に、マウスを安楽死させて、脛骨を採取し、固定し、次いで、１２％のＥＤＴＡ中で１０日間脱石灰化させた。脛骨を、パラフィンに包埋して、切片化した。腫瘍負荷を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）切片で評価した。Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ＴＲＡＰ） Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で染色した後に、腫瘍内及び骨－腫瘍界面上の破骨細胞を計数した。免疫組織化学分析は、製造業者のプロトコルに従って、ＨＲＰ／ＤＡＢ ＡＢＣ ＩＨＣ ＫＩＴ（ａｂｃａｍ）を用いて、脱石灰化パラフィン包埋組織切片に対して行った。
８１日目に、マウスを安楽死させて、脛骨を採取し、固定し、次いで、１２％のＥＤＴＡ中で１０日間脱石灰化させた。脛骨を、パラフィンに包埋して、切片化した。腫瘍負荷を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）切片で評価した。Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ＴＲＡＰ） Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で染色した後に、腫瘍内及び骨－腫瘍界面上の破骨細胞を計数した。免疫組織化学分析は、製造業者のプロトコルに従って、ＨＲＰ／ＤＡＢ ＡＢＣ ＩＨＣ ＫＩＴ（ａｂｃａｍ）を用いて、脱石灰化パラフィン包埋組織切片に対して行った。
【0123】
Ｘ線写真分析
脛骨を解剖し、固定して、１６．１６μｍ／ピクセルの解像度のマイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ、Ｓｋｙｓｃａｎ１２７２、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって走査した。未修正画像を、ＮＲｅｃｏｎｎで再構築し、関心対象の領域（ＲＯＩ）を用いてＣＴａｎ（ＳｋｙＳｃａｎ、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で分析した。分析した骨パラメータは、海綿骨の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ）、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、及び骨表面／骨体積の比（ＢＳ／ＢＶ）を含んでいた。
脛骨を解剖し、固定して、１６．１６μｍ／ピクセルの解像度のマイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ、Ｓｋｙｓｃａｎ１２７２、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって走査した。未修正画像を、ＮＲｅｃｏｎｎで再構築し、関心対象の領域（ＲＯＩ）を用いてＣＴａｎ（ＳｋｙＳｃａｎ、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で分析した。分析した骨パラメータは、海綿骨の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ）、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、及び骨表面／骨体積の比（ＢＳ／ＢＶ）を含んでいた。
【0124】
生体内分布
雌の無胸腺ヌードマウスに、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞（２×１０５細胞／動物）を傍脛骨注射した。８０日後に、Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ及び骨標的化抗体を、後眼窩注射によって投与した。注射の７２時間後及び１２０時間後に、マウスを、ＩＶＩＳを用いて撮像した。注射して７２時間及び１２０時間で、マウスを殺傷し、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び骨腫瘍組織を含む主臓器を取り出した。臓器及び腫瘍担持脛骨における蛍光強度を、ＩＶＩＳを用いて観察した。
雌の無胸腺ヌードマウスに、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞（２×１０５細胞／動物）を傍脛骨注射した。８０日後に、Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ及び骨標的化抗体を、後眼窩注射によって投与した。注射の７２時間後及び１２０時間後に、マウスを、ＩＶＩＳを用いて撮像した。注射して７２時間及び１２０時間で、マウスを殺傷し、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺、及び骨腫瘍組織を含む主臓器を取り出した。臓器及び腫瘍担持脛骨における蛍光強度を、ＩＶＩＳを用いて観察した。
【0125】
野生型マウスについては、Ｃｙ７．５標識Ｔｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴを、後眼窩注射を介してＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した。４８時間後に、臓器を解剖して、ＩＶＩＳを用いて撮像した。
【0126】
血清中のＴＲＡＰ及びカルシウムレベルの定量化
８１日目に、血液を、心臓穿刺によって収集し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、血清を得た。破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ ５ｂの濃度を、Ｍｏｕｓｅ ＡＣＰ５／ＴＲＡＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（カタログ番号ＩＴ５１８０、ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることによって測定した。血清カルシウムレベルを、カルシウム検出キット（カタログ番号ＤＩＣＡ－５００、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）を用いて、比色測定的に決定した。
８１日目に、血液を、心臓穿刺によって収集し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、血清を得た。破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ ５ｂの濃度を、Ｍｏｕｓｅ ＡＣＰ５／ＴＲＡＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（カタログ番号ＩＴ５１８０、ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることによって測定した。血清カルシウムレベルを、カルシウム検出キット（カタログ番号ＤＩＣＡ－５００、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）を用いて、比色測定的に決定した。
【0127】
統計的方法
データは、平均プラス又はマイナスＳＥＭとして提示し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて統計的に分析する。時間経過にわたって収集した全てのデータには、二元配置分散分析、続いてＳｉｄａｋの多重比較を用いた。Ｍｉｃｒｏ－ＣＴデータには、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較を用いた。多臓器転移データには、対応のないスチューデントｔ検定を用いた。Ｐ＜０．０５は、統計的有意性を表すと見なした。
データは、平均プラス又はマイナスＳＥＭとして提示し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて統計的に分析する。時間経過にわたって収集した全てのデータには、二元配置分散分析、続いてＳｉｄａｋの多重比較を用いた。Ｍｉｃｒｏ－ＣＴデータには、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較を用いた。多臓器転移データには、対応のないスチューデントｔ検定を用いた。Ｐ＜０．０５は、統計的有意性を表すと見なした。
【0128】
プラスミド構築
ｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓ－ＬＣ：プライマーＲＧ０３、ＲＧ０４、ＲＧ０７、及びＲＧ０８、並びに鋳型としてのｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓを用いたＰＣＲによって、６Ｄ遺伝子を、Ｔｒａｓ配列のＬＣ鎖（境界残基Ａ１５３、Ｑ１５５）中に挿入した。遺伝子断片は、ギブソンアセンブリー法を用いることによってアニールした。
ｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓ－ＬＣ：プライマーＲＧ０３、ＲＧ０４、ＲＧ０７、及びＲＧ０８、並びに鋳型としてのｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓを用いたＰＣＲによって、６Ｄ遺伝子を、Ｔｒａｓ配列のＬＣ鎖（境界残基Ａ１５３、Ｑ１５５）中に挿入した。遺伝子断片は、ギブソンアセンブリー法を用いることによってアニールした。
【0129】
ｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓ－ＣＨ１：プライマーＲＧ０５、ＲＧ０６、ＲＧ０７、及びＲＧ００８、並びに鋳型としてのｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓを用いたＰＣＲによって、６Ｄ遺伝子を、Ｔｒａｓ配列のＣＨ１鎖（境界残基Ａ１６５、Ｇ１６９）中に挿入した。遺伝子断片は、ギブソンアセンブリー法を用いることによってアニールした。
【0130】
ｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓ－ＣＴ：プライマーＲＧ０１、ＲＧ０２、ＲＧ０７、及びＲＧ００８、並びに鋳型としてのｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓを用いたＰＣＲによって、６Ｄ遺伝子を、Ｔｒａｓ配列のＣ末端（境界残基Ｇ４４９）中に挿入した。遺伝子断片は、ギブソンアセンブリー法を用いることによってアニールした。
【0131】
ｐＣＤＮＡ－Ｔｒａｓ－ＬＣＣＨ１／ＬＣＣＴ／ＣＨ１ＣＴ／ＬＣＣＨ１ＣＴ－６Ｄ：上述のプライマー及び鋳型としての構築されたプラスミドを用いることによって、６Ｄ遺伝子を、Ｔｒａｓ配列中に挿入した。遺伝子断片は、ギブソンアセンブリー法を用いることによってアニールした。
【0132】
（表１）ＤＮＡオリゴマー
【0133】
抗体変異体の発現及び精製
Ｔｒａｓ及び６Ｄ挿入変異体を、ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒのＥｘｐｉＣＨＯ発現プロトコルに従って、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞によって発現させた。細胞を、８０％超の相対湿度及び８％のＣＯ２を有する３７℃インキュベーターにおいて、オービタルシェーカープラットフォーム（１２５ｒｐｍ）上で、培養物が４×１０６～６×１０６生存細胞／ｍＬの密度に到達するまで、増殖させ、継代培養した。トランスフェクションの前に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製して、室温で５分間インキュベートし、次いで、細胞培養物にゆっくり添加した。トランスフェクションの１８～２２時間後に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ及びＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄを、細胞培養物に添加した。１２日の発現後に、分泌された抗体を、９０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって採取し、製造業者の指示に従ってプロテインＧ樹脂で精製した。注射の前に、各抗体試料を、ＰＤ－１０脱塩カラムを介してＰＢＳに緩衝液交換し、濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定した。全ての抗体試料を、ＥＳＩ－ＭＳ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって特徴評価した。
Ｔｒａｓ及び６Ｄ挿入変異体を、ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒのＥｘｐｉＣＨＯ発現プロトコルに従って、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞によって発現させた。細胞を、８０％超の相対湿度及び８％のＣＯ２を有する３７℃インキュベーターにおいて、オービタルシェーカープラットフォーム（１２５ｒｐｍ）上で、培養物が４×１０６～６×１０６生存細胞／ｍＬの密度に到達するまで、増殖させ、継代培養した。トランスフェクションの前に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製して、室温で５分間インキュベートし、次いで、細胞培養物にゆっくり添加した。トランスフェクションの１８～２２時間後に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ及びＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄを、細胞培養物に添加した。１２日の発現後に、分泌された抗体を、９０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって採取し、製造業者の指示に従ってプロテインＧ樹脂で精製した。注射の前に、各抗体試料を、ＰＤ－１０脱塩カラムを介してＰＢＳに緩衝液交換し、濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定した。全ての抗体試料を、ＥＳＩ－ＭＳ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって特徴評価した。
【0134】
（表２）ＨＡに結合する６Ｄ挿入変異体の吸着
抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍｇ／ｍｌのヒドロキシアパタイトと３７℃で９時間インキュベートした。ヒドロキシアパタイト結合画分のパーセンテージを示す（平均±ＳＥＭ）。
【0135】
（表３）乳がん上皮細胞株に対するＴｒａｓ、Ｔｒａｓ－ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＬＣ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１、Ｔｒａｓ－ＬＣ／ＣＴ、Ｔｒａｓ－ＣＨ１／ＣＴ、及びＴｒａｓ－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴの効力及び細胞表面反応性
略語：ＭＦＩ、蛍光強度中央値。結合は、ＰＢＳ対照に対する蛍光中央値の平均増加倍率として決定した。
【0136】
（表４）複数のアッセイにおける様々な治療群の比較
略語：ＢＬＩ、生物発光撮像；ＴＲＡＰ、酒石酸耐性酸ホスファターゼ。ａ実験の過程にわたる全身におけるＢＬＩのシグナル強度。ｂ治療後のＢＬＩのシグナル強度増加倍率（８０日目のＢＬＩ／１日目のＢＬＩ）。Ｃ実験の終了時のＴＲＡＰ染色した脛骨切片からの破骨細胞数測定値。ｄ実験の終了時の血清ＴＲＡＣＰ ５ｂ濃度。ｅ実験の終了時の血清カルシウム濃度。ｆ実験の過程にわたる体重進行。ｇ１０７超のマウスＢＬＩ強度を、エンドポイントに到達したと見なした。ａ、ｂは、二元配置反復測定分散分析、続いてＳｉｄａｋの多重比較検定を用いることによって、統計的に分析した。ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定を用いることによって分析した。ｇは、ログランク検定を用いることによって分析した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓはＰ＞０．０５を表す。
【0137】
（表５）様々な治療群からのｍｉｃｒｏＣＴパラメータの比較
略語：ＢＶ：骨体積；ＢＶ／ＴＶ：骨体積／組織体積の比；ＢＳ／ＢＶ：骨表面／骨体積の比；ＢＭＤ：骨ミネラル密度；Ｔｂ．Ｔｈ：海綿体の厚さ。データは平均±ｓｅｍとして提示した。ｍｉｃｒｏＣＴデータは、一元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定を用いることによって分析した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓはＰ＞０．０５を表す。
【0138】
実施例３－骨ホーミングペプチドでのユーイング肉腫用αＣＤ９９抗体の操作
ペプチドを用いて、骨標的化のためにαＣＤ９９抗体を操作した。ＥＳ腫瘍は、正常細胞よりもはるかに高いＣＤ９９発現レベルを有する。正常ヒト細胞ではなく、ＣＤ９９を高発現するＥＳ腫瘍の特異的標的化を達成するために、比較的低いＣＤ９９親和性を有する全長抗体を最初に発現させた（クローン：１２Ｅ７、ＫＤ＝１０ｎＭ、図５７）。抗体クローンは、最近臨床試験において使用され、優れた安全性プロファイルを実証している。この精製αＣＤ９９抗体は、ＣＤ９９陽性のＲＤ－ＥＳ細胞、ＳＫ－ＥＳ－１細胞に特異的に結合できるが、ＣＤ９９陰性のＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞には結合できないことが実証された（図５７Ｃ）。更に、１２Ｅ７抗体処理は、それぞれ、ＲＤ－ＥＳ細胞及びＳＫ－ＥＳ－１細胞の６０％及び７０％よりも多くにおいてアポトーシスを誘発した（図５７Ｄ）。このαＣＤ９９抗体のインビボ治療有効性はまた、本発明者らが異種移植片モデルにおいて検証した（図５９）。
ペプチドを用いて、骨標的化のためにαＣＤ９９抗体を操作した。ＥＳ腫瘍は、正常細胞よりもはるかに高いＣＤ９９発現レベルを有する。正常ヒト細胞ではなく、ＣＤ９９を高発現するＥＳ腫瘍の特異的標的化を達成するために、比較的低いＣＤ９９親和性を有する全長抗体を最初に発現させた（クローン：１２Ｅ７、ＫＤ＝１０ｎＭ、図５７）。抗体クローンは、最近臨床試験において使用され、優れた安全性プロファイルを実証している。この精製αＣＤ９９抗体は、ＣＤ９９陽性のＲＤ－ＥＳ細胞、ＳＫ－ＥＳ－１細胞に特異的に結合できるが、ＣＤ９９陰性のＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞には結合できないことが実証された（図５７Ｃ）。更に、１２Ｅ７抗体処理は、それぞれ、ＲＤ－ＥＳ細胞及びＳＫ－ＥＳ－１細胞の６０％及び７０％よりも多くにおいてアポトーシスを誘発した（図５７Ｄ）。このαＣＤ９９抗体のインビボ治療有効性はまた、本発明者らが異種移植片モデルにおいて検証した（図５９）。
【0139】
骨吸収ニッチを標的とする抗体を調製するために、骨ホーミングペプチドであるＬ－Ａｓｐ６ペプチドを、αＣＤ９９抗体の軽鎖（ＬＣ、Ａ１５３）、重鎖（ＣＨ１、Ａ１６５）、及びＣ末端（ＣＴ、Ｇ４４９）における許容的な内部部位に導入して、骨標的化αＣＤ９９抗体を得た（図５７Ａ及びＢ）。これらの内部部位は、抗体ペプチド配置ライブラリをスクリーニングすることによって、追加のペプチド挿入を担うことが示された。１つのＬ－Ａｓｐ６ペプチドを有するαＣＤ９９を調製した（αＣＤ９９－ＣＴ、図５７Ｂ）。
【0140】
様々な数のＬ－Ａｓｐ６ペプチドを有する抗体を調製し、その骨標的化活性を評価した。Ｌ－Ａｓｐ６ペプチドを、２つ（ＣＨ１及びＣＴ）並びに３つの許容的な内部部位（ＬＣ、ＣＨ１、及びＣＴ）にクローニングして、それぞれ、２つ及び３つのＬ－Ａｓｐ６ペプチドを有するαＣＤ９９抗体変異体を得た。αＣＤ９９－ＣＨ１／ＣＴの調製の成功は、ＥＳＩ－ＭＳによって確認した（図５７Ｂ）。
【0141】
骨親和性の差を、骨標的化抗体の間で評価した。αＣＤ９９、αＣＤ９９－ＣＴ、αＣＤ９９－ＣＨ１／ＣＴ、及びαＣＤ９９－ＬＣ／ＣＨ１／ＣＴ抗体を、ヒドロキシアパタイト／天然骨とインキュベートした。Ｌ－Ａｓｐ６配列の抗体中への導入は、その骨標的化能力を有意に向上させることができる。図５８Ａに示されるように、野生型αＣＤ９９は、ＨＡとわずかな結合親和性を示したが、Ｌ－Ａｓｐ６ペプチド配列を含有する抗体の８０％～９５％は、４時間以内にＨＡに結合した。一般に、より多くの骨ホーミングペプチドを有する骨標的化抗体は、より良好なＨＡ結合親和性を示す（図５８Ａ）。更に、図５８Ｂに示されるように、ＦＩＴＣ標識αＣＤ９９、αＣＤ９９－ＣＴ、及びαＣＤ９９－ＣＨ１／ＣＴ変異体を更に用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非脱石灰化骨切片を染色した。ＦＩＴＣシグナルは、αＣＤ９９－ＣＴ、αＣＤ９９－ＣＨ１／ＣＴ抗体変異体で染色した切片で観察されたが、野生型αＣＤ９９では観察されなかった（図５８Ｂ）。
【0142】
１２Ｅ７抗体のいかなる細胞傷害性も、ヒトマクロファージ及び内皮細胞で観察されなかった（図５８Ｄ及びＥ）。ＥＳを治療するために骨特異的抗体を使用する実現可能性を調べるために、Ｌ－Ａｓｐ６配列で操作されたαＣＤ９９抗体の同所モデルへの影響を、確立された細胞株及び患者由来の異種移植片モデルを用いて調べた（図５９Ａ～Ｃ）。Ｌ－Ａｓｐ６配列修飾が、抗体の骨結合親和性を向上できることを実証するために、異種移植片ヌードマウスモデルを確立した。ホタルルシフェラーゼ及び赤色蛍光タンパク質で標識された５×１０５個のＳＫ－ＥＳ－１（ＣＤ９９＋＋＋）ＥＳ細胞を、脛骨内注射を介してヌードマウスの右脚中に接種した（図５８Ｃ）。ＮＩＲ色素で修飾された野生型αＣＤ９９（滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇ、後眼窩）及びαＣＤ９９－ＣＨ１／ＣＴ（Ｔｒａｓと同じレジメン）を、後眼窩注射を用いて入れた。投与の７日後及び９日後に、主臓器を取り出して、Ｃａｌｉｐｅｒ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩインビボ撮像機を用いて分析した。骨組織における蛍光強度は、野生型αＣＤ９９よりもＬ－Ａｓｐ６ペプチド配列を有する抗体の方が高かった（図５８Ｃ）。
【0143】
骨及び軟部組織においてインビボでＥＳの発生を阻害する、骨標的化αＣＤ９９の能力を実証するために、異種移植片モデルを確立して、骨におけるＥＳ腫瘍に対するαＣＤ９９のインビボ治療有効性を研究した。ホタルルシフェラーゼ及び赤色蛍光タンパク質で標識された５×１０５個のＳＫ－ＥＳ－１細胞を、脛骨内注射を介してヌードマウス中に接種した。図５９Ａ及び５９Ｂに示されるように、全身生物発光撮像（ＢＬＩ）シグナルにより、骨標的化αＣＤ９９での治療は、野生型αＣＤ９９治療マウスにおいて見られたものと比較して、ＥＳ腫瘍進行のより有意な阻害を結果としてもたらしたことが示唆された（図５９Ａ～Ｃ）。
【0144】
非骨ＥＳ腫瘍の治療について骨標的化αＣＤ９９の有効性を評価するために、筋肉内注射を用いて、５×１０５個のＳＫ－ＥＳ－１細胞を、脛骨に近接して注射した。骨標的化αＣＤ９９抗体は、野生型αＣＤ９９と比較して、軟部組織に位置するＥＳの治療について優れたかつ類似した有効性を示した（図５９Ａ～Ｃ）。
【0145】
実施例４－骨標的化ＩＬ－６
更に、骨標的化インターロイキン－６（ＩＬ６）を、６個のアスパラギン酸をＩＬ－６のＣ末端に挿入することによって生成した（図６１Ａ）。結果として生じた骨標的化ＩＬ６（ＩＬ６－６Ｄ）は、ヒドロキシアパタイト構造に対して向上した結合親和性を示した（図６１Ｂ）。
更に、骨標的化インターロイキン－６（ＩＬ６）を、６個のアスパラギン酸をＩＬ－６のＣ末端に挿入することによって生成した（図６１Ａ）。結果として生じた骨標的化ＩＬ６（ＩＬ６－６Ｄ）は、ヒドロキシアパタイト構造に対して向上した結合親和性を示した（図６１Ｂ）。
【0146】
本明細書において開示され、かつ特許請求される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験を伴わずに作製及び実施することができる。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して説明されてきたが、当業者には、本明細書に記載の方法及び方法のステップ又は一連のステップに、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、変形例が適用され得ることが明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方で関連するある特定の作用物質が、本明細書に記載の作用物質と置換されてもよく、一方で、同じ又は類似した結果が達成され得ることが明らかであろう。当業者にとって明らかな全てのそのような類似した置換及び修正は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあると見なされる。
【0147】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図60】
【図61】
【配列表】
【国際調査報告】