特表 2024-526982 ガドリニウム系化合物、これを含むＭＲＩ造影剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】ガドリニウム系化合物、これを含むＭＲＩ造影剤

(51)【国際特許分類】

   C07D 257/02 20060101AFI20240711BHJP

   A61K 49/10 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 31/555 20060101ALI20240711BHJP

【ＦＩ】

C07D257/02 CSP

A61K49/10

A61K9/08

A61P25/00

A61P25/28

A61P25/16

A61K31/555

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024504187

(86)(22)【出願日】2022-07-21

(85)【翻訳文提出日】2024-01-22

(86)【国際出願番号】 KR2022010745

(87)【国際公開番号】W WO2023003413

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】10-2021-0095823

(32)【優先日】2021-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0089938

(32)【優先日】2022-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524029714

【氏名又は名称】テーランオキュア カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ヨン ミン

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ポ キョン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076BB13

4C076CC01

4C076FF11

4C076FF68

4C085HH01

4C085HH07

4C085JJ02

4C085KA09

4C085KA28

4C085KB12

4C085KB56

4C085LL13

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC58

4C086HA05

4C086HA28

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZC78

(57)【要約】

ガドリニウム系化合物、これを含むＭＲＩ造影剤が開示される。前記ガドリニウム系化合物は、バニリン酸が結合されたＤＯ３Ａ系ガドリニウム化合物であってもよい。前記ＭＲＩ造影剤は、前記化合物を含んでもよい。一方、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、神経炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を開示する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記化学式（１）を有する、化合物：

【化1】

式（１）において、
Ｌは、＊－（ＣＨ_２）_ｘ－Ａ^１－（ＣＨ_２）_ｙ－Ａ^２－（ＣＨ_２）_ｚ－＊であり、
ｘ，ｙおよびｚは、０～５のいずれの整数にそれぞれ独立的に選択され、
Ａ^１およびＡ^２は、単一結合、＊－ＣＯＯ－＊、＊－ＣＯ－＊、＊－ＮＨ－＊、＊－ＣＨ_２－＊、＊－ＣＯＮＨ－＊および＊－Ｏ－＊を含む群からそれぞれ独立的に選択された一つ以上の構造であり、
Ｘは、下記化学式（２）を有する構造であり：

【化2】

＊は、結合部位である。

【請求項2】

前記Ａ^２は、＊－ＮＨ－＊である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記Ａ^１は、＊－ＣＯＮＨ－＊である、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

前記ｘは、１であり、
前記ｙは、２であり、
前記ｚは、０である、請求項３に記載の化合物。

【請求項5】

下記化学式（３）を有する、化合物。

【化3】

【請求項6】

前記ガドリニウム（Ｇｄ）が1つ以上の水分子と配位する、請求項１に記載の化合物。

【請求項7】

前記化合物は、哺乳動物のアミロイドβ重合体（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）に特異的に結合する、請求項１に記載の化合物。

【請求項8】

前記化合物は、３．７～４．６ｓ^－１の緩和度（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）を有する、請求項１に記載の化合物。

【請求項9】

前記化合物は、静脈注射によって注入される場合、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ－Ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）を通過する、請求項１に記載の化合物。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項による化合物を含む、ＭＲＩ造影剤。

【請求項11】

前記ＭＲＩ造影剤は、退行性脳疾患の診断に用いられる、請求項１０に記載のＭＲＩ造影剤。

【請求項12】

前記ＭＲＩ造影剤は、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病の診断に用いられる、請求項１１に記載のＭＲＩ造影剤。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか一項による化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、神経炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項14】

前記神経炎症性疾患は、炎症性神経退行性脳疾患で、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記炎症性神経退行性脳疾患は、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病またはパーキンソン病から選択された疾患である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ガドリニウム系化合物、これを含むＭＲＩ造影剤に関する。

【背景技術】

【0002】

今日、人口の高齢化によって退行性脳疾患患者が増加しており、これによって、該疾病に対する早期発見の必要性が台頭されている。退行性脳疾患としては、パーキンソン病、血管性痴ほう、アルツハイマー病などがあり、該疾患の発生原因の一つとして、アミロイドβ重合体（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）の過剰蓄積による神経毒性が考慮されている。

【0003】

アミロイドβ（Ａβ）は、アルツハイマー患者の脳で発見されるアミロイドプラークの主成分で、アルツハイマー病に決定的に関与する３６～４３個のアミノ酸ペプチドを意味する。前記ペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から誘導される。

【0004】

前記アミロイドβ分子は凝集されて多数の形態で存在し得る可溶性重合体を形成することができる。形成されたアミロイドβ重合体（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）は、神経細胞に毒性があって、脳に過剰に蓄積されながらアルツハイマー病の発病に直接関与することと知られている。よって、アミロイドβ重合体の濃度変化を感知することは、退行性脳疾患の早期診断ができることと予想した。

【0005】

一方、磁気共鳴画像（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｅ、以下、ＭＲＩ）は、体内組職間水素原子の分布が異なり、磁場の中で水素原子が弛緩される現象を利用して、体の解剖学的、生理学的、生化学的情報映像を得る方法である。ＭＲＩは、ＣＴやＰＥＴとは違って、人体に有害な放射線を使用せず、強い磁場下で磁場の勾配および無線周波を利用して、体の内部のイメージを生成するので、非侵襲的であり、解像度が高く、軟部組職検査に優れている。

【0006】

このようなＭＲＩ装備をさらに精密に活用するために、造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔ）を対象に注入してＭＲＩ画像を得る。ＭＲＩイメージ上での組職間のコントラスト（ｃｏｎｔｒａｓｔ）は、組職内の水分子核スピンが平衡状態に戻る弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）作用が組職別に異なることから発生する現象である。造影剤は常磁性または超常磁性を有する物質を利用して、前記弛緩作用に影響を及ぼして、組職間の弛緩度差を広げてＭＲＩ信号の変化を誘発して、組職間のコントラストをより明確にする役割をする。

【0007】

現在、臨床的に最も一般的に用いられている造影剤は、ガドリニウム（Ｇｄ）キレートに基づいた造影剤である。現在は、ＤＴＰＡ（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標））、Ｇｄ－ＤＯＴＡ（Ｄｏｔａｒａｍ（登録商標））、Ｇｄ（ＤＴＰＡ－ＢＭＡ）（Ｏｍｎｉｓｃａｎ（登録商標））、Ｇｄ（ＤＯ３Ａ－ＨＰ）（ＰｒｏＨａｎｃｅ（登録商標））、Ｇｄ（ＢＯＰＴＡ）（ＭｕｌｔｉＨａｎｃｅ（登録商標））などが用いられている。しかしながら、常用化されている造影剤の大部分が細胞外空間（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｉｄｅ、ＥＣＦ）に分布される非特異的造影剤である。特異的造影剤としては、特別に肝臓特異的造影剤が使用されているだけである。

【0008】

最近の研究は、特定標的性を有するか、生理的活性（ｐＨ変化、酵素活性）によって信号増強を示すことができる造影剤の開発が推進されているが、今までは、特定標的性を有するＭＲＩ造影剤、特に、退行性脳疾患に対する特異的ＭＲＩ造影剤に対して十分な結果が得られなかった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の一目的は、アミロイドβ重合体に特異的に結合する化合物を提供することにある。

【0010】

本発明の他の目的は、前記化合物を含むＭＲＩ造影剤を提供することにある。

【0011】

本発明のまた他の目的は、前記化合物を含む神経炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

一側面において、本発明は下記化学式（１）を有する、化合物を提供する。

【化1】

【0013】

式において、
Ｌは、＊－（ＣＨ_２）_ｘ－Ａ^１－（ＣＨ_２）_ｙ－Ａ^２－（ＣＨ_２）_ｚ－＊であり、
ｘ，ｙおよびｚは、０～５のいずれの整数にそれぞれ独立的に選択され、
Ａ^１およびＡ^２は、単一結合、＊－ＣＯＯ－＊、＊－ＣＯ－＊、＊－ＮＨ－＊、＊－ＣＨ_２－＊、＊－ＣＯＮＨ－＊および＊－Ｏ－＊を含む群からそれぞれ独立的に選択された一つ以上の構造であり、
Ｘは、下記化学式（２）を有する構造であり：

【化2】

＊は、結合部位である。

【0014】

一実施例において、前記Ａ^２は、＊－ＮＨ－＊であってもよい。
一実施例において、前記Ａ^１は、＊－ＣＯＮＨ－＊であってもよい。
一実施例において、前記ｘは、１であってもよい。
一実施例において、前記ｙは、２であってもよい。
一実施例において、前記ｚは、０であってもよい。
一実施例において、前記化合物は、下記化学式（３）を有してもよい。

【化3】

【0015】

一実施例において、前記ガドリニウム（Ｇｄ）が一つ以上の水分子と配位してもよい。
一実施例において、前記化合物は、哺乳動物のアミロイドβ重合体（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）に特異的に結合してもよい。
一実施例において、前記化合物は、３．７～４．６ｓ^－１の緩和度（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）を有してもよい。
一実施例において、前記化合物は、静脈注射を介して注入される場合、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ－Ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）を通過することができる。

【0016】

他の側面において、本発明は、前記化合物を含むＭＲＩ造影剤を提供する。
一実施例において、前記ＭＲＩ造影剤は、退行性脳疾患の診断に用いられることができる。
一実施例において、前記ＭＲＩ造影剤は、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病の診断に用いられることができる。

【0017】

また他の側面において、本発明は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む神経炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
一実施例において、前記神経炎症性疾患は、炎症性神経退行性脳疾患であってもよい。
一実施例において、前記炎症性神経退行性脳疾患は、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病またはパーキンソン病から選択された疾患であってもよい。

【発明の効果】

【0018】

本発明の実施例による化合物は、アミロイドβ重合体に特異的に結合することができ、これにより、前記化合物を含むＭＲＩ造影剤は、アルツハイマーを含む退行性脳疾患の診断に用いられることができる。

【0019】

一方、本発明の実施例による化合物は、神経炎症発生と関連する因子であるＮＬＲＰ３、ＡＳＣ、ｉＬ－１βなどを減少させ、アミロイドβ発現と関連するＡβおよびＢａｃｅ－１を減少させて、アミロイドβ形成を抑制する抗炎症機能によって、神経炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物の有効成分として用いられることができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【図2】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【図3】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【図4】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【図5】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【図6】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【図7】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【図8】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【図9】本発明の実験例による実験結果を示した図面である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、添付図面を参照して本発明の実施例について詳しく説明する。本発明は多様に変化してもよく、様々な形態を有することができるため、特定の実施形態を図面に例示し本文に詳細に説明する。しかしながら、これは本発明を特定の開示形態に対して限定しようとするのではなく、本発明の思想および技術範囲に含まれるすべての変更、均等物ないし代替物を含むことに理解されるべきである。各図面を説明するに当たり、類似する構成要素には類似する参照符号を付している。添付の図面における構造物の寸法は、本発明を明確にするために拡大して示している。

【0022】

本出願で用いた用語は、ただ特定の実施例を説明するために用いられたもので、本発明を限定しようとする意図ではない。単数の表現は文脈上明らかに相違する意味を持たない限り、複数の表現を含む。本出願において、「含む」または「有する」などの用語は、明細書上に記載された特徴、数字、段階、動作、構成要素またはこれらの組み合わせが存在することを示すものであって、１つもしくはそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素またはこれらの組み合わせの存在または付加可能性を予め排除するものではないことに理解されるべきである。

【0023】

特に定義しない限り、技術的または科学的な用語を含んでここで使われるすべての用語は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有している。一般的に使われる辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈上有する意味と一致する意味を有するものと解析されるべきであり、本出願で明白に定義しない限り、理想的または過度に形式的な意味に解析されない。

【0024】

本発明の実施例による化合物は、下記化学式（１）を有することができる。

【化4】

【0025】

前記化学式（１）において、ガドリニウムイオン（Ｇｄ^３＋）は、前記化学式（１）のカルボキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＯＯ^－）基と配位して、錯体を形成することができる。

【0026】

前記化学式（１）において、Ｌは、＊－（ＣＨ_２）_ｘ－Ａ^１－（ＣＨ_２）_ｙ－Ａ^２－（ＣＨ_２）_ｚ－＊であってもよく、ｘ，ｙおよびｚは、０～５のいずれの整数にそれぞれ独立的に選択されてもよく、Ａ^１およびＡ^２は、単一結合、＊－ＣＯＯ－＊、＊－ＣＯ－＊、＊－ＮＨ－＊、＊－ＣＨ_２－＊、＊－ＣＯＮＨ－＊および＊－Ｏ－＊を含む群からそれぞれ独立的に選択された一つ以上の構造であってもよい。＊は、結合部位である。

【0027】

前記Ｌは、前記化合物の環状構造内の窒素と前記Ｘを連結するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であってもよい。前記Ａ^１およびＡ^２は、前記リンカーが前記化合物の環状構造内の窒素と前記Ｘを連結する方法またはその方法によって決まる官能基を決めることができる。前記ｘ，ｙおよびｚは、前記リンカー内の前記Ａ^１およびＡ^２を連結する鎖の長さを決めることができる。一実施例において、前記Ａ^２は、＊－ＮＨ－＊一であってもよい。一実施例において、前記Ａ^１は、＊－ＣＯＮＨ－＊であってもよい。一実施例において、前記ｘは、１であってもよい。一実施例において、前記ｙは２であってもよい。一実施例において、前記ｚは０であってもよい。

【0028】

本発明の実施例による化合物は、実質的に前記化学式（１）の構造を有する限り、当業者に許容可能な結合または結合の除去を本発明の範囲で排除しない。一例として、一実施例において、前記化合物で前記ガドリニウム（Ｇｄ）が一つ以上の水分子と配位することができる。

【0029】

前記化学式（１）において、Ｘは下記化学式（２）を有する構造であってもよい。

【化5】

＊は結合部位である。

【0030】

一実施例において、前記化合物は下記化学式（３）を有してもよい。

【化6】

【0031】

一実施例において、前記化合物は、哺乳動物のアミロイドβ重合体（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ Ａβ）に特異的に結合することができる。一実施例において、前記化合物は、３．７～４．６ｓ^－１の緩和度（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）を有してもよい。一実施例において、前記化合物は、静脈注射を介して注入される場合、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ－Ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）を通過することができる。

【0032】

以上で説明したように、本発明の実施例による化合物は、アミロイドβ重合体に特異的に結合することができる。

【0033】

本発明の一実施例によるＭＲＩ造影剤は、前記化合物を含んでもよい。一実施例において、前記ＭＲＩ造影剤は、退行性脳疾患の診断に用いられることができる。一実施例において、前記ＭＲＩ造影剤はアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病の診断に用いられることができる。

【0034】

以上で説明したように、本発明の実施例によるＭＲＩ造影剤は、アルツハイマーを含む退行性脳疾患の診断に用いられることができる。

【0035】

本発明の一実施例による神経炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含んでもよい。一実施例において、前記神経炎症性疾患は、炎症性神経退行性脳疾患であってもよい。一実施例において、前記炎症性神経退行性脳疾患は、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病またはパーキンソン病から選択された疾患であってもよい。

【0036】

一実施例において、前記「薬学的に許容可能な塩」は、前記化合物と付加塩を形成するものであれば限定されず、薬学的に許容可能な無機酸、有機酸、または塩基から誘導された塩を含む。本発明に係る前記化合物は、通常の方法によってその塩に転換されることができ、塩の製造は別途の説明がなくても化合物の構造に基づいて当業者によって容易に実行され得る。

【0037】

本発明の薬学的組成物は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を単独で含んでもよいが、それに加えて薬学的に許容可能な担体を追加的にさらに含んでもよい。前記薬学的に許容可能な担体は、薬剤学分野で通常的に用いられるものであってもよく、賦形剤（例えば、澱粉、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、セルロースなど）または希釈剤（例えば、生理食塩水、精製水など）であってもよい。

【0038】

本発明において、用語「予防」は、神経炎症性疾患または疾病を保有していると診断されたことがないが、このような疾患または疾病にかかりやすいきらいがある個体で、疾患または疾病の発生を抑制することを意味する。また、本発明において、用語「治療」とは、神経炎症性疾患または疾病の発展の抑制、疾患または疾病の軽減、および疾患または疾病の除去を意味する。

【0039】

本発明の薬学的組成物は、公知の方法によって多様な非経口または経口投与用形態に製造されてもよい。

【0040】

以下、本発明の実施例について叙述する。ただ、以下に記載された実施例は、本発明の一部実施形態に過ぎず、本発明の範囲が下記実施例に限定されるのではない。

【0041】

＜Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａの合成＞

【化7】

物質１から最終物質５までを段階的に合成して、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａ化合物を製造した。

【0042】

＜１＞トリ-ｔｅｒｔ-ブチル２，２’，２’’－（１０－（２－エトキシ－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）トリアセテート（ｔｒｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ２，２’，２’’－（１０－（２－ｅｔｈｏｘｙ－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ）－１，４，７，１０－ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ－１，４，７－ｔｒｉｙｌ）ｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）、１の合成
１６０ｍＬのアセトニトリルにトリ-ｔｅｒｔ-ブチル２，２’，２’’－（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）トリアセテート（ｔｒｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ２，２’，２’’－（１，４，７，１０－ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ－１，４，７－ｔｒｉｙｌ）ｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）（９．７２ｍｍｏｌ）を溶かした後、炭酸水素カリウム（２９．６９ｍｍｏｌ）を添加して３０分間撹拌した。その後、ブロモ酢酸エチル（１０．６９ｍｍｏｌ）を添加して、６０℃で２４時間撹拌した。２４時間後に生成物をフィルタで濾過し、減圧濾過して、溶媒を取り除いた。生成物をジクロロメタンに溶かした後、溶けていない物質を取り除き、溶媒を全部取り除いた後、真空乾燥してやや黄色固体を得た。収率：９９％

【0043】

＜２＞トリ-ｔｅｒｔ-ブチル２，２’，２’’－（１０－（２－オキソ－２－（（２－（３，４，５－トリヒドロキシベンズアミド）エチル）アミノ）エチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）トリアセテート（ｔｒｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ２，２’，２’’－（１０－（２－ｏｘｏ－２－（（２－（３，４，５－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ）－１，４，７，１０－ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ－１，４，７－ｔｒｉｙｌ）ｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）、２の合成
７ｍＬのメタノールに１（５．３３ｍｍｏｌ）を溶かした後、６ｍＬのエチレンジアミンを添加し、常温で４日間反応した。真空下で５５℃に加熱して、溶媒を取り除き、オイルのような状態の固体を得て、エチルエーテルで数回洗浄した。真空乾燥させた後、メタノールに溶かし、溶けていな物質を濾過して取り除いた後、ジクロロメタン／メタノール混合溶媒条件でオープンカラムクロマトグラフィーを行って、やや黄色固体を分離精製した。収率：５７％

【0044】

＜３＞トリ-ｔｅｒｔ-ブチル２，２’，２’’－（１０－（２－（（２－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンズアミド）エチル）アミノ）－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）トリアセテート（ｔｒｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ２，２’，２’’－（１０－（２－（（２－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ）－１，４，７，１０－ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ－１，４，７－ｔｒｉｙｌ）ｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）、３の合成
バニリン酸（６．９７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミドに溶かし、０℃で撹拌した。その後、ジメチルホルムアミドに溶かしたＥＤＣ・ＨＣｌ（７．６７ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ ｈｙｄｒａｔｅ（７．６７ｍｍｏｌ）を没食子酸溶液に添加して、３０分間撹拌した。次に、ジメチルホルムアミドに溶かした２（４．８８ｍｍｏｌ）を反応物に入れ、ＤＩＰＥＡ（１３．９４ｍｍｏｌ）を添加して、常温で２４時間撹拌した。その後、減圧濾過して、ジメチルホルムアミドを最大限に濃縮させた後、ジクロロメタンとブライン（ｂｒｉｎｅ）を利用して抽出し、硫酸ナトリウムで脱水して減圧濾過した。その後、ジクロロメタン／メタノール混合溶媒条件でオープンカラムクロマトグラフィーを行って、固体を分離した。追加の分離精製なしに次の反応を実行した。

【0045】

＜４＞２，２’，２’’－（１０－（２－（（２－（４－ヒドロキシ－３－メトキシベンズアミド）エチル）アミノ）－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）トリアセテート（２，２’，２’’－（１０－（２－（（２－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ）－１，４，７，１０－ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ－１，４，７－ｔｒｉｙｌ）ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、４の合成
０℃で３にトリフルオロ酢酸を過量で添加した後、反応物を常温で２０時間撹拌した。その後、ジクロロメタンを添加して減圧濾過を繰り返した。次に、０．１％トリフルオロ酢酸が添加された水／アセトニトリル混合溶媒条件で高性能液体クロマトグラフィーをして精製された固体を得た。収率（２→４）：４４％

【0046】

＜５＞Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａ、５の合成
４（０．８４ｍｍｏｌ）を水に溶かした後、１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを３に調節し、水に溶かしたＧｄＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ（０．５９ｍｍｏｌ）を添加した。その後、１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを７に調節した後、常温で２０時間撹拌した。減圧濾過して得た固体を１０ｍＭ酢酸アンモニウムが添加された水／アセトニトリル混合溶媒条件で高性能液体クロマトグラフィーを用いて分離精製して固体を得た。収率：７３％

【0047】

＜Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－ＶａのＨＲ－ＭＳおよび純度分析結果＞
Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－ＶａをＨＲ－ＭＳによって分析した。図１は、その結果を示した図面である。図１を参照すると、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａに対して予測されたピーク（７５２．１８９０ｍ／ｚ）に対応するピーク（７５２．１８９４ｍ／ｚ）が現われることを確認することができる。
また、ＨＰＬＣを利用してＧｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａの純度を分析した結果を図２に示した。図２を参照すると、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａは、約９８％の純度を有することを確認することができる。

【0048】

＜Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａ性能評価方法および結果＞
１）緩和度（Ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）測定
合成したＧｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａと環状常用造影剤であるＧａｄｏｖｉｓｔ（登録商標）、Ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標）を比較群として、各物質の緩和度（ｒ_１、ｒ_２）を測定した。具体的には、３次蒸溜水にガドリニウム複合体を５種類の濃度（０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１ｍＭ）に希釈してファントムを製作した後、３Ｔ ＭＲＩでＴ_１、Ｔ_２緩和度（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を測定した。これによって、各濃度のＲ（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｒａｔｅ＝１／Ｔ）を計算し、線型回帰分析（図３参照）を通じてガドリニウム複合体の緩和度（ｒ_１、ｒ_２）結果を得て、下記表１に示した。

【0049】

【表1】

【0050】

前記表１を参照すると、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａのｒ_１は、３．８±０．１、ｒ_２は４．４±０．２値を有することが分かり、これは臨床で活用するのに十分な緩和度値であるので、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａを造影剤として活用することができることを確認した。

【0051】

２）速度論的安定性（Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）評価
Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａと各種の常用造影剤を２．５ｍＭ濃度にＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈してファントムを製作した後、２５０ｍＭ塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２）を１当量添加して、ＤＯ３Ａリガンド（ｌｉｇａｎｄ）とＧｄ金属イオンの結合安定性を評価した。これは亜鉛イオンによるガドリニウムイオンの金属交換反応（Ｔｒａｎｓｍｅｔａｌｌａｔｉｏｎ）を緩和度変化で測定して確認することができる。
その結果を示した図４を参照すると、本発明のＧｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａは、Ｒ_２変化率が１に近い値を保持するので、ＭＲＩ造影剤として活用するのに十分な安定性を有することを確認することができる。

【0052】

３）ｐＨ安定性評価
１ｍＭ Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａおよび比較群として常用造影剤であるＧａｄｏｖｉｓｔ（登録商標）をｐＨ１、３、５、７、９、１１のバッファー溶液に希釈した後、３週間の間、３ＴＭＲＩで、Ｔ_２強調映像を撮影して、Ｒ_２値を測定する。時間によるＲ_２値を測定して、希釈直後に対する数値変化を確認することができ、その値が一定に保持されるほど、ｐＨに対する安定性が高いことに評価することができる。
その結果を示した図５を参照すると、本発明のＧｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａは、ｐＨ３～１１の範囲で、３週の間Ｒ_２値の変化がなかった。ｐＨ１の強い酸条件でその値が若干変化したが、その変化が大きくなかった。この結果により、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａが体内ｐＨ条件で安定しており、強い酸塩基条件でも安定していることを確認した。

【0053】

４）アミロイドβ重合体標的性評価
４－１）アミロイドβ重合体標的性の確認のためのファントム実験方法
＜１＞１ｍｇの１ｍＭ濃度のアミロイドβに２２１．５ｕＬのＨＦＩＰを入れた後、シェーカーを用いて常温で１時間シェーキングして、Ｐｒｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎを取り除いた。
＜２＞Ｐｒｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎを取り除いたアミロイドβを乾燥し、２２１．５ｕＬのＤＭＳＯを入れて１ｍＭ濃度に作った後、ミキサーと超音波機で懸濁液が形成されるようにし、その後、８７８．５ｕＬのＰＢＳ（１Ｘ、ｐＨ７．４）を入れて、０．２ｍＭ濃度に作る。
＜３＞シェーカーを用いて、３７℃で４日間培養した後、重合が完了されたアミロイドβ重合体を２００ｕＬずつ分注し、ＰＢＳに２ｍＭ濃度に溶かしたＧｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａと常用造影剤（Ｇａｄｏｖｉｓｔ）を２０ｕＬずつ添加し、その後、シェーカーを用いて、３７℃で２４時間培養した。
＜４＞２４時間後に遠心分離して上層液を取り除いた後、ＰＢＳでアミロイドβ重合体を洗浄し、その後、ペレット（Ｐｅｌｌｅｔ）にＰＢＳ：ＤＭＳＯ＝９：１溶液を２００ｕＬ入れて、ＭＲＩファントム試料を製作した。対照群としては、アミロイドβ重合体のみを培養したファントム試料を使用した。

【0054】

４－２）アミロイドβ重合体標的効果分析結果
前記ファントム試料を使用して、本発明の実施例によるＧｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａおよび常用造影剤（Ｇａｄｏｖｉｓｔ（登録商標））のアミロイドβ重合体標的性評価を９．４Ｔ ＭＲ装備で行った。
その結果を示した図６を参照すると、アミロイドβ重合体のみを培養したファントム（Ａβ）とＧａｄｏｖｉｓｔ（登録商標）を一緒に培養したファントム（Ａβ＋Ｇａｄｏｖｉｓｔ）は、造影増強効果の差がほとんどなかったが、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａと一緒に処理したファントム（（Ａβ＋Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａ）は、アミロイドβ重合体のみ培養したファントムに比べて増加した信号強度を見せた。これによって、本発明のガドリニウム造影剤がアミロイドβ重合体を標的効果を有することを確認した。
過剰発現されたアミロイドβ重合体は、神経細胞に蓄積されて毒性を誘発し、神経細胞を破壊して、退行性脳疾患であるアルツハイマー病を引き起こす。本発明の実施例によるＧｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａは、毒性タンパク質であるアミロイドβ重合体を標的する機能を有するので、アルツハイマー病を診断する製剤として活用されることができる。

【0055】

５）イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）毒性評価
Ｃ８－Ｄ１Ａ（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌｓ）とＳＩＭ－Ａ９（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）に対する細胞毒性を評価する実験をそれぞれ行い、その結果を図７、８に示した。
図７を参照すると、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａを各種濃度（０、１００、２００、４００μＭ）で処理した時、４００μＭの高濃度まで約１００％の細胞生存率（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を見せた。
ＳＩＭ－Ａ９（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）に対する細胞毒性評価も図８に示したように、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａを各種濃度（０、１００、２００、４００μＭ）で処理した時、４００μＭの高濃度まで約１００％の細胞生存率を見せた。

【0056】

脳細胞の２つの主な類型は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）と神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａ；ｇｌｉｃａ ｃｅｌｌｓ）である。神経膠細胞（ｇｌｉａ ｃｅｌｌｓ）にはアストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）とミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）が含まれ、このような神経膠細胞（ｇｌｉａ ｃｅｌｌｓ）は、ニューロンを支援し、栄養素を提供するなどの機能をすることと知られている。Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａは、アストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、ミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）のような脳細胞で、４００μＭの高濃度まで細胞毒性がないことに確認された。

【0057】

６）イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）効能評価
痴ほうマウスモデルである５ＸＦＡＤ（６ヶ月、雄）に、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａを２ヶ月間１５回繰り返し投与した。対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、同一週齢のマウスに食塩水（ｓａｌｉｎｅ）を投与したグループであり、ＷＢは未処理（ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）６ヶ月マウスグループである。実験が終わったマウスの脳を摘出して、海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）と皮質（Ｃｏｒｔｅｘ）を分離した後、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によって分析した。
その結果を示した図９を参照すると、ＷＢに比べて、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）グループで、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ、ｉＬ－１βなどの炎症発生に関する因子が増加することを確認した。一方、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａ投与グループで、該因子とアミロイドβ発現に関するＡβおよびＢａｃｅ－１が全部減少する結果を得た。この実験により、Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－Ｖａは、炎症性因子を減少させ、アミロイドβ 形成を抑制して、アルツハイマー病を治療することを確認することができる。

【0058】

上記では本発明の好ましい実施例を参照して説明したが、当該技術分野において熟練された当業者は、添付の特許請求範囲に記載された本発明の思想および領域から逸脱しない範囲内で本発明を多様に修正および変更させることができることを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【国際調査報告】