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▶ バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】大規模なアデノ随伴ウイルス産生システム
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20240711BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240711BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20240711BHJP
C12Q 1/6897 20180101ALI20240711BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20240711BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01 ZNA
C12N5/10
C12Q1/70
C12Q1/6897 Z
C12N15/864 100Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024504489
(86)(22)【出願日】2022-07-22
(85)【翻訳文提出日】2024-01-24
(86)【国際出願番号】 US2022074046
(87)【国際公開番号】W WO2023009968
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】63/226,564
(32)【優先日】2021-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/226,626
(32)【優先日】2021-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506136483
【氏名又は名称】バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002631
【氏名又は名称】弁理士法人クオリオ
(74)【代理人】
【識別番号】100161469
【弁理士】
【氏名又は名称】赤羽 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100141771
【弁理士】
【氏名又は名称】星野 宏和
(74)【代理人】
【識別番号】100118809
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 育男
(74)【代理人】
【識別番号】100164345
【弁理士】
【氏名又は名称】後藤 隆
(72)【発明者】
【氏名】チネク・トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ペルティエ・ジョセフ チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】アポンテ－ウビルス・フアン ホセ
(72)【発明者】
【氏名】バラハス・ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】パンデ・サントッシュ ジー
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA20
4B063QQ10
4B063QQ13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR79
4B063QR80
4B063QS36
4B063QS38
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA29
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、アデノ随伴ウイルス粒子及びバキュロウイルス粒子を産生及び特徴付けるためのプロセスを提供する。本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生を改善する方法を対象とする。本発明は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を使用したｒＡＡＶの産生に関連する問題に対処し、ｒＡＡＶを産生するための改善された方法を達成する。本発明は、組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生するための異なる方法を開発した。これらの方法は、ゲノム不安定性などの問題に対処し、また、ｒＡＡＶの産生の改善をもたらすとともに、特性が改善されたｒＡＡＶを産生する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、細胞を少なくとも１つの組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）に感染させるステップであって、前記少なくとも１つのｒＢＶが、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する、感染させるステップと、
前記感染した細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、を含み、
前記感染させるステップの前に、少なくとも１つのｒＢＶが、前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つでトランスフェクトされた細胞を含む、少なくとも１つの細胞培養物から単離される、方法。
【請求項2】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、細胞を少なくとも１つの組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）に感染させるステップであって、前記少なくとも１つのｒＢＶが、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する、感染させるステップと、
前記感染した細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、を含み、
前記感染させるステップの前に、前記少なくとも１つのｒＢＶが、
バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有し、かつ
前記バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分と組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、少なくとも１つのヌクレオチド配列でトランスフェクトされた細胞を含む少なくとも１つの細胞培養物から単離される、方法。
【請求項3】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、細胞を継代ゼロ（Ｐ０）組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）に感染させるステップであって、前記ｒＢＶが、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する、感染させるステップと、
前記感染した細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、を含む、方法。
【請求項4】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、細胞を０．０１未満の感染多重度（ＭＯＩ）で組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）に感染させるステップであって、前記ｒＢＶが、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する、感染させるステップと、
前記感染した細胞を培養して、ｒＡＡＶを生成するステップと、を含む、方法。
【請求項5】
前記ＭＯＩが、０．００２以下である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＭＯＩが、１０Ｅ－４未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記ＭＯＩが、１０Ｅ－５未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
前記ｒＢＶが、継代ゼロ（Ｐ０）ｒＢＶである、請求項４に記載の方法。
【請求項9】
前記ｒＢＶが、ｒＡＡＶベクターゲノムに対するヌクレオチド配列を有する第１のｒＢＶと、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する１つ以上の第２のｒＢＶとを含み、前記細胞を、０．０１～１０．０の範囲の前記第１のｒＢＶのＭＯＩ：前記１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの比で感染させる、請求項４に記載の方法。
【請求項10】
生成された前記ｒＡＡＶが、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのナノグラム当たり１Ｅ－９ナノグラム未満であるキャプシド化バキュロウイルスヌクレオチド配列の濃度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項11】
前記生成されたｒＡＡＶが、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－２コピー未満であるバキュロウイルスＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一部分をコードするキャプシド化バキュロウイルスヌクレオチド配列の濃度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項12】
前記生成されたｒＡＡＶが、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－３コピー未満であるキャプシド化細胞１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列の濃度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項13】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生を増加させ、前記産生されたｒＡＡＶ内にキャプシド化されたヌクレオチド不純物を低減するための方法であって、異なる細胞培養物を、ｒＡＡＶベクターゲノムのヌクレオチド配列を有する第１の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）と、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する１つ以上の第２のｒＢＶとに感染させるステップであって、各細胞培養物を、前記第１のｒＢＶの感染多重度（ＭＯＩ）：前記１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの異なる比で、前記第１のｒＢＶ及び前記１つ以上の第２のｒＢＶに感染させる、感染させるステップと、
前記異なる細胞培養物からｒＡＡＶを単離するステップと、
前記異なる細胞培養物からの前記単離されたｒＡＡＶの力価を決定するステップと、
前記異なる細胞培養物からの前記単離されたｒＡＡＶ内のキャプシド化ヌクレオチド不純物の濃度を決定するステップと、
両方の決定するステップから、前記第１のｒＢＶのＭＯＩ：前記１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの１つ以上の比（複数可）を特定するステップと、を含む、方法。
【請求項14】
組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を測定する方法であって、インジケーター細胞をｒＢＶに感染させるステップであって、前記インジケーター細胞が、バキュロウイルス感染によって活性化された誘導性バキュロウイルスプロモーター配列に作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を有し、前記誘導性バキュロウイルスプロモーター配列が、初期バキュロウイルスプロモーター配列及び中間バキュロウイルスプロモーター配列のうちの少なくとも１つから選択される、感染させるステップと、
前記レポーターヌクレオチド配列の発現を測定するステップと、
前記レポーターヌクレオチド配列の前記発現からｒＢＶ力価を決定するステップと、を含む、方法。
【請求項15】
前記レポーターヌクレオチド配列が、バキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記レポーターヌクレオチド配列の発現が、フローサイトメトリーを使用して測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記決定するステップが、前記感染させるステップの３時間以上後に起こる、請求項１４に記載の方法。
【請求項18】
組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を測定するためのインジケーター細胞を生成するための方法であって、バキュロウイルス感染によって活性化された誘導性バキュロウイルスプロモーター配列に作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を含むベクターを細胞内にトランスフェクトするステップを含み、前記誘導性バキュロウイルスプロモーター配列が、早期バキュロウイルスプロモーター配列及び中間バキュロウイルスプロモーター配列のうちの少なくとも１つから選択される、方法。
【請求項19】
前記レポーターヌクレオチド配列が、バキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ベクターが、発現制御配列に作動可能に連結された耐性ヌクレオチド配列を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞を培養するステップと、前記ベクターが安定して維持される少なくとも１つの細胞を正に選択するステップと、を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞を培養するステップと、前記培養物から細胞を単離するステップと、前記単離された細胞を別々に培養するステップと、を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項23】
前記レポーターヌクレオチド配列が、レポータータンパク質をコードする、請求項１４又は１８に記載の方法。
【請求項24】
前記誘導性バキュロウイルスプロモーター配列が、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、ｇｐ６４プロモーター、Ｐｏｌｈプロモーター、及びｐ１０プロモーターのうちの少なくとも１つから選択される、請求項１４又は１８に記載の方法。
【請求項25】
前記レポーターヌクレオチド配列及び前記誘導性バキュロウイルスプロモーター配列が、前記細胞内で安定して維持される、請求項１８に記載の方法。
【請求項26】
前記レポーターヌクレオチド配列、前記誘導性バキュロウイルスプロモーター配列、及び前記バキュロウイルス由来エンハンサー配列が、前記細胞内で安定して維持される、請求項１９に記載の方法。
【請求項27】
前記細胞が、昆虫細胞である、請求項１、２、３、４、１４、及び１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ、Ａｎｏｐｈｅｌｅ、Ｃｕｌｅｘ、又はＡｅｄｅｓに由来する昆虫細胞である、請求項１、２、３、４、１４、及び１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞が、Ｓｆ９細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、Ｓｅ３０１細胞、ＳｅＩＺＤ２１０９細胞、ＳｅＵＣＲ１細胞、Ｓｆ９００＋細胞、Ｓｆ２１細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞、ＭＧ－１細胞、Ｔｎ３６８細胞、ＨｚＡｍ１細胞、ＢＭ－Ｎ細胞、Ｈａ２３０２細胞、Ｈｚ２Ｅ５細胞、又はＡｏ３８細胞である、請求項１、２、３、４、１４、及び１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞培養物が各々、昆虫細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項31】
前記細胞培養物が各々、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ、Ａｎｏｐｈｅｌｅ、Ｃｕｌｅｘ、又はＡｅｄｅｓに由来する昆虫細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項32】
前記細胞培養物が各々、Ｓｆ９細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、Ｓｅ３０１細胞、ＳｅＩＺＤ２１０９細胞、ＳｅＵＣＲ１細胞、Ｓｆ９００＋細胞、Ｓｆ２１細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞、ＭＧ－１細胞、Ｔｎ３６８細胞、ＨｚＡｍ１細胞、ＢＭ－Ｎ細胞、Ｈａ２３０２細胞、Ｈｚ２Ｅ５細胞、又はＡｏ３８細胞から選択される細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項33】
バキュロウイルス感染によって活性化された誘導性バキュロウイルスプロモーター配列に作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を含む細胞であって、前記誘導性バキュロウイルスプロモーターが、初期バキュロウイルスプロモーター配列及び中間バキュロウイルスプロモーター配列のうちの少なくとも１つから選択され、前記レポーターヌクレオチド配列及び前記誘導性バキュロウイルスプロモーター配列が、前記細胞内で安定して維持される、細胞。
【請求項34】
前記レポーターヌクレオチド配列が、バキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結され、前記バキュロウイルス由来エンハンサー配列が、前記細胞内で安定して維持される、請求項３３に記載の細胞。
【請求項35】
前記レポーターヌクレオチド配列が、レポータータンパク質をコードする、請求項３３に記載の細胞。
【請求項36】
前記誘導性バキュロウイルスプロモーター配列が、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、ｇｐ６４プロモーター、Ｐｏｌｈプロモーター、及びｐ１０プロモーターのうちの少なくとも１つから選択される、請求項３１に記載の細胞。
【請求項37】
前記細胞が、昆虫細胞である、請求項３３に記載の細胞。
【請求項38】
前記細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ、Ａｎｏｐｈｅｌｅ、Ｃｕｌｅｘ、又はＡｅｄｅｓに由来する、請求項３３に記載の細胞。
【請求項39】
前記細胞が、Ｓｆ９細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、Ｓｅ３０１細胞、ＳｅＩＺＤ２１０９細胞、ＳｅＵＣＲ１細胞、Ｓｆ９００＋細胞、Ｓｆ２１細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞、ＭＧ－１細胞、Ｔｎ３６８細胞、ＨｚＡｍ１細胞、ＢＭ－Ｎ細胞、Ｈａ２３０２細胞、Ｈｚ２Ｅ５細胞、又はＡｏ３８細胞である、請求項３３に記載の細胞。
【請求項40】
発現制御配列に作動可能に連結された耐性ヌクレオチド配列を更に含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項41】
前記耐性ヌクレオチド配列及び発現制御配列が、前記細胞内で安定して維持される、請求項４０に記載の細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の参照
２０２２年７月２１日に作成され、サイズが６ＫＢである「６４３９－０１１３ＰＷＯ１」という名前のＸＭＬファイルとして本明細書と同時に提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って参照により本明細書に組み込まれる。
２０２２年７月２１日に作成され、サイズが６ＫＢである「６４３９－０１１３ＰＷＯ１」という名前のＸＭＬファイルとして本明細書と同時に提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を産生するための方法及びプロセスを対象とする。
【背景技術】
【0003】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生を改善する方法を対象とする。ＡＡＶは、末端に少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を有する一本鎖ＤＮＡゲノムを有する非エンベロープウイルスである。例えば、ＡＡＶ２血清型は、２つの１４５ヌクレオチド長の逆位末端反復（ＩＴＲ）を末端に有する、およそ４．７キロベース（ｋｂ）の一本鎖ＤＮＡゲノムを有し得る。このウイルスは、ポリメラーゼをコードせず、したがって、ゲノム複製のために細胞のポリメラーゼに依存する。ＩＴＲは、それぞれ非構造タンパク質及び構造タンパク質をコードするｒｅｐ（複製）及びｃａｐ（キャプシド）の２つのウイルス遺伝子に隣接している。Ｒｅｐ遺伝子は、２つのプロモーターの使用及び選択的スプライシングを介して、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０と称される４つの調節タンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶゲノムの複製及びパッケージングに関与している。Ｃａｐ遺伝子は、選択的スプライシング及び翻訳の開始を介して、ＶＰ１（ビリオンタンパク質１）、ＶＰ２、及びＶＰ３の３つのキャプシドタンパク質を生じさせる。ＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の分子量は、それぞれ８７、７２、及び６２ｋＤａである。これらのキャプシドタンパク質は、６０サブユニットのほぼ球状のタンパク質シェルに組み立てられる。
【0004】
ＡＡＶは、自己で複製することができず、ヘルパーウイルス、典型的には、アデノウイルス又はヘルペスウイルスの同時感染を必要とする。ＡＡＶが単独でヒト細胞に感染すると、ＡＡＶの遺伝子発現プログラムは自己抑制され、細胞の潜伏感染が発生する。しかしながら、潜伏感染細胞が、アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスに同時感染すると、ＡＡＶ遺伝子発現が活性化されて、宿主細胞染色体からのプロウイルスＤＮＡの切除、続いて、ウイルスゲノムの複製及びパッケージングを導く。
【0005】
ＡＡＶ遺伝子及び治療用遺伝子を含有するバキュロウイルスは、Ｓｆ９細胞に感染して、治療遺伝子を含有するＡＡＶキャプシドを産生するために使用されている。例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子又は治療用遺伝子のいずれかを含有するバキュロウイルスを使用して、Ｓｆ９細胞を共感染させる。この方法では、バキュロウイルスは、ＡＡＶ産生に必要な「ヘルパー」ウイルスとして、かつＡＡＶ及び治療用遺伝物質のビヒクルとして機能する、二重の役割を果たす。
【0006】
バキュロウイルスＡＡＶの産生方法は、多くの利点を提供する。第一に、Ｓｆ９細胞は、最大２０００リットル（Ｌ）の容量を有する大型バイオリアクター内で自由浮遊性懸濁液として高密度で培養することができ、接着細胞培養で達成されるよりも効率的なＡＡＶ産生を可能にする。加えて、Ｓｆ９細胞は、無血清条件下で成長させることができ、これは、潜在的に免疫原性又は毒性の動物由来タンパク質の存在を排除することによって生体安全性を改善する。更に、バキュロウイルスは、ヒト細胞で複製することができない。
【0007】
しかしながら、ＡＡＶキャプシドのバキュロウイルス／Ｓｆ９産生にも著しい制限がある。例えば、バキュロウイルスゲノムは、複数の継代から不安定になる可能性がある。ｒｅｐ遺伝子が失われると、ｒＡＡＶの産生が停止する。Ｐｉｊｌｍａｎ（Ｐｉｊｌｍａｎ，Ｇｏｒｂｅｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒａｐｉｄｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８３．１（２００１）：１３２－１３８）は、２つの継代内のバキュロウイルスゲノムにおける欠失を具体的に開示している。Ａｉｒｅｎｎｅ（Ａｉｒｅｎｎｅ，Ｋａｒｉ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１．１７（２００３）：ｅ１０１－ｅ１０１）は、組換えバクミドを有するＥ．ｃｏｌｉコロニーを選択するための致死的選択戦略を開示している。Ｓｃｈｏｌｚ及びＳｕｐｐｍａｎｎ（Ｓｃｈｏｌｚ，Ｊｕｄｉｔｈ，ａｎｄ Ｓａｂｉｎｅ Ｓｕｐｐｍａｎｎ．“Ａ ｎｅｗ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ－ｄｒｉｖｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ”ＢＭＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７．１（２０１７）：８３）は、組換えタンパク質の産生時間を短縮するための懸濁液中のバクミドトランスフェクション及びＰ０バキュロウイルスの単離を開示しているが、ゲノム不安定性に対処するための、又はＡＡＶ産生における使用のためのＰ０ ＢＶの単離は開示していない。Ｎｅｇｒｅｔｅ（Ｎｅｇｒｅｔｅ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｃｏｎｏｍｉｚｅｄ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｒＡＡＶ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａ ｃｒｏｓｓ－ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ９．１１（２００７）：９３８－９４８）は、Ｓｆ細胞を０．０３のＭＯＩでバキュロウイルスに感染させてＡＡＶを産生することを開示している。Ｍｅｎａ（Ｍｅｎａ，Ｊｉｍｍｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｙｉｅｌｄ ｉｎ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａ ｃｒｏｓｓ－ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １２．２（２０１０）：１５７－１６７）もまた、Ｓｆ細胞を０．３のＭＯＩでバキュロウイルスに感染させてＡＡＶを産生することを開示している。ＮｅｇｒｅｔｅもＭｅｎａも、ＡＡＶ産生のために０．３未満のＢＶのＭＯＩを使用することを示唆していない。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を使用したｒＡＡＶの産生に関連する問題に対処し、ｒＡＡＶを産生するための改善された方法を達成する。本発明者らは、組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生するための異なる方法を開発した。これらの方法は、ゲノムの不安定性などの問題に対処し、またｒＡＡＶの産生の改善をもたらすとともに、改善された特性（例えば、より高い感染性、より低いキャプシド化核酸不純物など）を有するｒＡＡＶを産生する。
【0009】
ｒＡＡＶを産生する実施形態が開示される。
【0010】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、細胞を少なくとも１つのｒＢＶに感染させるステップを含む。少なくとも１つのｒＢＶは、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。この方法は、感染した細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップを更に含む。この方法では、少なくとも１つのｒＢＶは、ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つでトランスフェクトされた細胞を含む少なくとも１つの細胞培養物から単離される。
【0011】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、細胞を少なくとも１つのｒＢＶに感染させるステップを含む。少なくとも１つのｒＢＶは、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。この方法は、感染した細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップを更に含む。この方法では、少なくとも１つのｒＢＶは、感染させるステップの前に、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有する細胞を含む少なくとも１つの細胞培養物から単離される。細胞はまた、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分と組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、少なくとも１つのヌクレオチド配列でトランスフェクトされる。
【0012】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、少なくとも１つの細胞を継代ゼロ（Ｐ０）ｒＢＶに感染させ、感染した少なくとも１つの細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップを含む。Ｐ０ ｒＢＶは、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。
【0013】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、細胞を０．０１未満の感染多重度（ＭＯＩ）でｒＢＶに感染させるステップを含む。ｒＢＶは、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。この方法はまた、感染した細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップを含む。
【0014】
様々な実施形態では、少なくとも１つのｒＢＶを使用する大規模なｒＢＶベースのｒＡＡＶ産生の方法が開示される。方法は、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子、及びｒＡＡＶベクターゲノムを有するバクミドを含有する組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のバンクを作製するステップと、該Ｅ．ｃｏｌｉバンクを凍結保存するステップと、該Ｅ．ｃｏｌｉバンクを解凍するステップと、解凍されたＥ．ｃｏｌｉバンクからバクミドを単離するステップと、該解凍されたＥ．ｃｏｌｉバンクからのバクミドを用いて昆虫細胞をトランスフェクトして、トランスフェクトされた昆虫細胞を培養するステップと、トランスフェクトされた昆虫細胞からｒＢＶを単離するステップと、バイオリアクター内で昆虫細胞を単離されたｒＢＶに更に感染させ、感染した昆虫細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップと、を含む。
【0015】
ｒＡＡＶのｒＢＶベースの産生に関する他の実施形態も開示される。
【0016】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶの産生を増加させ、産生されたｒＡＡＶ内にキャプシド化された核酸不純物を低減するための方法が開示される。方法は、異なる細胞培養物を、ｒＡＡＶベクターゲノムのヌクレオチド配列を有するｒＢＶと、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する１つ以上の第２のｒＢＶとに感染させるステップを含む。各細胞培養物は、第１のｒＢＶ及び１つ以上の第２のｒＢＶに、第１のｒＢＶのＭＯＩ：１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの異なる比で、感染する。この方法はまた、異なる細胞培養物からｒＡＡＶを単離するステップと、異なる細胞培養物からの単離されたｒＡＡＶの力価を決定するステップと、異なる細胞培養物からの単離されたｒＡＡＶ内のキャプシド化核酸不純物の濃度を決定するステップと、両方の決定するステップからの第１のｒＢＶのＭＯＩ：１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの１つ以上の比（複数可）を特定するステップと、を含む。
【0017】
様々な実施形態では、ｒＢＶ力価を測定するための方法は、インジケーター細胞をｒＢＶに感染させるステップを含む。インジケーター細胞は、早期又は中間バキュロウイルスプロモーター配列に作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、レポーターヌクレオチド配列は、バキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結されている。この方法はまた、レポーターヌクレオチド配列の発現を測定するステップと、レポーターヌクレオチド配列の発現からｒＢＶ力価を決定するステップと、を含む。
【0018】
様々な実施形態では、ｒＢＶ力価を測定するための細胞は、早期又は中間バキュロウイルスプロモーター配列に作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を含む。レポーターヌクレオチド配列及び早期又は中間バキュロウイルスプロモーター配列は、細胞内で安定して維持される。異なる実施形態では、レポーターヌクレオチド配列は、バキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結され、バキュロウイルス由来エンハンサー配列は、細胞内で安定して維持される。
【0019】
様々な実施形態では、ｒＢＶ力価を測定するためのインジケーター細胞を生成するための方法が開示される。方法は、早期又は中間バキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を含むベクターを細胞内にトランスフェクトするステップを含む。他の実施形態では、レポーターヌクレオチド配列は、バキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結されている。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ｒＢＶから産生されたＡＡＶ力価（ベクターゲノム（ｖｇ）／ミリリットル（ｍＬ））を示すグラフ表示であり、ｒＢＶは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）、Ｒｅｐ、及びＣａｐを有するｖｇを提供する／コードする。ｒＢＶを、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、及び０．００００１のＭＯＩで、ナイーブＳｆ９細胞とともに培養した。
【0021】
【図2】インジケーター細胞株を開発するために使用されるプラスミドのマップである。３９ｋプロモーター配列に作動可能に連結された強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列を有する。
【図3】インジケーター細胞株を開発するために使用されるプラスミドのマップである。ｐ６．９プロモーター配列に作動可能に連結されたｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を有する。
【図4】インジケーター細胞株を開発するために使用されるプラスミドのマップである。ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター配列に作動可能に連結されたｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を有する。
【0022】
【図5】トランスフェクトされていないＳｆ９細胞のフローサイトメトリーデータを示す。点線は、細胞の約０．１％が蛍光を示す、緑色蛍光を示すゲートである。
【0023】
【図6】３９ｋプロモーター配列に作動可能に連結されたｅＧＦＰヌクレオチド配列を含有するプラスミドでトランスフェクトされたＳｆ９細胞のフローサイトメトリーデータを示す。細胞は、ｒＢＶでトランスフェクトされていない。点線は、細胞の約０．１％が蛍光を示す、緑色蛍光を示すゲートである。
【0024】
【図7】３９ｋプロモーター配列に作動可能に連結されたｅＧＦＰヌクレオチド配列を含有するプラスミドでトランスフェクトされたＳｆ９細胞のフローサイトメトリーデータを示す。細胞をｒＢＶに感染させた。点線は、緑色蛍光を示すゲートである。３９ｋプロモーター細胞の５５．５％が緑色蛍光を示した。
【図8】ｐ６．９プロモーター配列に作動可能に連結されたｅＧＦＰヌクレオチド配列を含有するプラスミドでトランスフェクトされたＳｆ９細胞のフローサイトメトリーデータを示す。細胞をｒＢＶに感染させた。点線は、緑色蛍光を示すゲートである。ｐ６．９プロモーター細胞の１１％が緑色蛍光を示した。
【図9】Ｐｏｌｈプロモーター配列に作動可能に連結されたｅＧＦＰヌクレオチド配列を含有するプラスミドでトランスフェクトされたＳｆ９細胞のフローサイトメトリーデータを示す。細胞をｒＢＶに感染させた。点線は、緑色蛍光を示すゲートである。Ｐｏｌｈプロモーター細胞の２％が緑色蛍光を示した。
【0025】
【図10】ｒＢＶ感染後の、ある時間におけるｅＧＦＰ発現を示すグラフ表示である。示されるように、ｒＢＶ感染後１９時間で、３９ｋプロモーター細胞の５５．５％が緑色蛍光を示し、ｐ６．９プロモーター細胞の１１％が緑色蛍光を示し、Ｐｏｌｈプロモーター細胞の２％が緑色蛍光を示した。
【図11】ｒＢＶ感染後の、ある時間におけるｅＧＦＰ発現を示すグラフ表示である。示されるように、ｒＢＶ感染後４０時間で、３９ｋプロモーター細胞の６５．４％が緑色蛍光を示し、ｐ６．９プロモーター細胞の１９％が緑色蛍光を示し、Ｐｏｌｈプロモーター細胞の１１％が緑色蛍光を示した。
【図12】ｒＢＶ感染後の、ある時間におけるｅＧＦＰ発現を示すグラフ表示である。示されるように、ｒＢＶ感染後６８時間で、３９ｋプロモーター細胞の６６．３％が緑色蛍光を示し、ｐ６．９プロモーター細胞の１９％が緑色蛍光を示し、Ｐｏｌｈプロモーター細胞の１５％が緑色蛍光を示した。
【0026】
【図13】ｒＢＶ感染後の、ある時間における３９ｋプロモーター細胞のｅＧＦＰ発現を示すグラフ表示である。ｅＧＦＰを発現する３９ｋプロモーター細胞のパーセンテージは、４１．１％（１５時間）、３９．９％（１８時間）、４０．７％（２４時間）、６８．０％（４３時間）、６６．４％（６５時間）、６７．３％（７０時間）、及び６９．３％（９４時間）であった。
【0027】
【図14】ｅＧＦＰ、又は昆虫細胞での発現にコドン最適化されたｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含有する発現細胞を比較するグラフ表示である。示されるように、２０時間で、３９ｋプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを５６．５％から５７．８％に増加させ、ＰｏｌＨプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを４．０％から１０．５％に増加させた。
【図15】ｅＧＦＰ、又は昆虫細胞での発現にコドン最適化されたｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含有する発現細胞を比較するグラフ表示である。示されるように、２５時間で、３９ｋプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージに本質的に差をもたらさず（５６．６％及び５５．９％）、ＰｏｌＨプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを４．８％から１２．０％に増加させた。
【図16】ｅＧＦＰ、又は昆虫細胞での発現にコドン最適化されたｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含有する発現細胞を比較するグラフ表示である。示されるように、４８時間で、３９ｋプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを５８．５％から５９．３％に増加させ、ＰｏｌＨプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを１０．９％から１７．５％に増加させた。
【0028】
【図17】ｒＡＡＶ５の生産性に対するｒＢＶのＭＯＩの効果の統計分析を強調する。図は、正規化された生産性を示すグラフィック表現であり、値は、第１の条件（ＧＯＩ ０．０１／Ｒｅｐ ０．０１／Ｃａｐ ０．０１）に対して提示される。
【図18】ｒＡＡＶ５の生産性に対するｒＢＶのＭＯＩの効果の統計分析を強調する。図は、ｒＢＶに感染した異なる実験細胞培養条件から得られたキャプシド対ｖｇ比を示すグラフ表示である。
【0029】
【図19】ＡＡＶ５の生産性に対するｒＢＶのＭＯＩ及びｒＢＶ共感染の効果を示す。２つの異なるｒＢＶ導入遺伝子セットを使用した、４つの実験条件間の生産性を示すグラフ表示である。各セットについて、値は、そのＧＯＩ ０．０３／Ｒｅｐ ０．００３／Ｃａｐ ０．００３条件に対して正規化した。
【図20】ＡＡＶ５の生産性に対するｒＢＶのＭＯＩ及びｒＢＶ共感染の効果を示す。正規化された生産性とＣａｐコピー数（ＶＰ３／１８ｓ）との比較を示すグラフ表示である。ピーク細胞密度は、共感染細胞のパーセンテージに基づいて調整した。ＶＰ３／１８ｓ比（菱形で示される）について、最終値をｄＴｏｍａｔｏ発現細胞のパーセンテージに基づいて調整した。調整された出力間の相関係数は、０．８４９である。
【0030】
【図21】バキュロウイルスＤＮＡ不純物のパッケージングに対するＲｅｐ及びＣａｐ ＢＶのＭＯＩの効果を示す。ＧＯＩ－Ｂ－ｒＢＶ、Ｒｅｐ ｒＢＶ、及びＣａｐ ｒＢＶに感染した状態における平均α－β：ｃｐを示すグラフ表示である。値は、第１の条件、ＧＯＩ ０．０３／Ｒｅｐ ０．００３／Ｃａｐ ０．００３に正規化される。分析を、ヌクレアーゼ処理された清澄化ハーベストから実施した。ＧＯＩ－Ｂ－ｒＢＶのみ及びＲｅｐ Ｃａｐ－ｒＢＶのみ、及びＣａｐ－ｒＢＶのみの条件を対照として含めた。
【図22】バキュロウイルスＤＮＡ不純物のパッケージングに対するＲｅｐ及びＣａｐ ＢＶのＭＯＩの効果を示す。ＧＯＩ－Ｂ－ｒＢＶ、Ｒｅｐ ｒＢＶ、及びＣａｐ ＢＶに感染した状態における平均δ－γ：ｃｐを示すグラフ表示である。値は、第１の条件、ＧＯＩ ０．０３／Ｒｅｐ ０．００３／Ｃａｐ ０．００３に正規化される。分析を、ヌクレアーゼ処理された清澄化ハーベストから実施した。ＧＯＩ－Ｂ－ｒＢＶのみ及びＲｅｐ Ｃａｐ－ｒＢＶのみ、及びＣａｐ－ｒＢＶのみの条件を対照として含めた。
【発明を実施するための形態】
【0031】
必要に応じて、本開示の詳細な実施形態が、本明細書に開示されるが、開示される実施形態は、単に例示であり、様々な形態及び代替形態で具現化され得ることを理解されたい。
【0032】
実施例を除いて、又は別途明示的に示されている場合を除いて、材料の量又は反応及び／若しくは使用の条件を示す本明細書中の全ての数値は、「約」という言葉によって修飾されるものとして理解されるべきである。例えば、「約Ｘ」を参照する説明は、「Ｘ」の説明を含む。一例では、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の２標準偏差以内として理解される。異なる例では、「約」は、±０．０００１％、±０．０００５％、±０．００１％、±０．００５％、±０．０１％、±０．０５％、±０．１％、±０．５％、±１％、±５％、又は±１０％の変動を指す。更なる例では、「約」は、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、又は±２％以内と理解することができる。
【0033】
頭字語又は他の略語の第１の定義は、同じ略語の本明細書におけるその後の全ての使用に適用され、最初に定義された略語の通常の文法的変形に準用され、反対に明示的に示されない限り、特性の測定は、以前に又は後で同じ特性について参照されたのと同じ技術によって決定される。
【0034】
別途示されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0035】
また、具体的な構成要素及び／又は条件は、もちろん、変動し得るため、本開示は、以下に記載される具体的な実施形態及び方法に限定されないことを理解されたい。更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ使用され、なんら限定することは意図されていない。
【0036】
また、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に示さない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。例えば、単数形の構成要素への言及は、複数の構成要素を含むことが意図されている。
【0037】
「又は」及び「及び」という用語は、互換的に使用することができ、「及び／又は」を意味すると理解することができる。
【0038】
「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」、又は「ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ（によって特徴付けられる）」と同義である。これらの用語は、包含的かつオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法のステップを排除するものではない。
【0039】
「～からなる」という語句は、特許請求の範囲で特定されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外するものである。この語句がプリアンブルの直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に出現する場合、その条項に示されている要素のみを制限し、他の要素は全体として特許請求の範囲から除外されない
【0040】
「～から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、特許請求される主題の特定の材料又はステップに加えて、本質的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
【0041】
「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語は、代替的に使用することができる。これらの３つの用語のうちの１つが使用される場合、本開示の特許請求される主題は、他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる。
【0042】
本出願全体を通して、刊行物が参照される場合、本発明が関連する技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示全体は、参照により本出願に援用される。
【0043】
「異種」という用語は、ＡＡＶ若しくは細胞に非天然であるか、又はＡＡＶ若しくは細胞に天然であるが、ウイルスゲノム又は宿主細胞ゲノム内のその天然の場所又は位置に位置しないポリヌクレオチド配列を指す。
【0044】
「コードする（ｅｎｃｏｄｅｓ）」、「コードされた（ｅｎｃｏｄｅｄ）」、及び「コードすること（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指し、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として機能する。したがって、遺伝子は、その遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖との両方は、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードしていると呼ぶことができる。
【0045】
「発現制御エレメント」という用語は、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を調節することができるポリヌクレオチド中の核酸配列を指す。「作動的に連結された」は、一方の部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が、他方の部分の作用（例えば、配列の転写）をもたらす、２つの部分の間の機能的関係を指す。エレメントがヌクレオチド配列の転写又は翻訳を制御又は調節する場合、発現制御エレメントは、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」。発現制御エレメントの例としては、プロモーター（例えば、誘導性又は構成性）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、停止コドン、内部リボソーム侵入部位、相同領域エレメント（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の相同領域２）、ＡＡＶ調節エレメント（例えば、Ｒｅｐ結合エレメント）などの配列が挙げられる。
【0046】
「プロモーター」又は「プロモーターポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼと結合／それを動員し、プロモーターの下流又は３’方向の配列の転写を開始することができる調節配列／エレメント又は制御配列／エレメントを意味すると理解される。プロモーターは、例えば、構成的に活性（常にオン）であり得るか、又はプロモーターが外部刺激の存在下で活性又は不活性である誘導性であり得る。プロモーターは、高濃度でタンパク質を発現することができる。例えば、プロモーターの転写レベルは、調節タンパク質をコードするオペロンについての天然プロモーターの転写レベルよりも約又は少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１０．５倍、１１倍、１１．５倍、１２倍、１２．５倍、１３倍、１３．５倍、１４倍、１４．５倍、１５倍、１５．５倍、１６倍、１６．５倍、１７倍、１７．５倍、１８倍、１８．５倍、１９倍、１９．５倍、２０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、５０００倍、５５００倍、６０００倍、６５００倍、７０００倍、７５００倍、８０００倍、８５００倍、９０００倍、９５００倍、又は１００００倍高い。異なる実施例では、構成的プロモーターポリヌクレオチドの転写レベルは、上に列挙された任意の２つのレベルの間の範囲である。プロモーターはまた、転写発現を制御するために他の発現制御エレメント（複数可）に配置することができる。例えば、プロモーター、相同領域エレメント、及び／又はＡＡＶ調節エレメントを有する発現カセットは、昆虫細胞のバキュロウイルス感染が発現カセットからの転写発現を誘導するように、昆虫細胞のゲノムに安定して組み込むことができる（ＵＳ２０１２／０１００６０６参照されたい）。
【0047】
アデノ随伴ウイルス
【0048】
治療上有効なｒＡＡＶ粒子には、ＵＳ９，５０４，７６２、ＷＯ２０１９／２２２１３６、ＵＳ２０１９／０３７６０８１、及びＷＯ２０２１／０９７１５７（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるｒＡＡＶ粒子が含まれる。
【0049】
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、キャプシドによってキャプシド化されたゲノムを有する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型には１３種類がある。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見出され得る。しかしながら、様々な血清型が、遺伝子レベルにおいても、構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることが周知であるため、これらの同じ原理が、追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，ｐｐ．１６５－１７４，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型が、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明白に示し、全てが、３つの関連するキャプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆位末端反復」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。同様の感染性パターンは、各血清型における複製機能が同様の調節制御下にあることも示唆する。
【0050】
本明細書で使用される「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質及びキャプシド化ＡＡＶゲノムからなる感染性ウイルス粒子を指す。「組換えＡＡＶ」、又は「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶビリオン」、又は「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、本明細書に記載される少なくとも１つのキャプシド又はＣａｐタンパク質及びキャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムから構成されるウイルス粒子を指す。したがって、ｒＡＡＶ粒子の産生には、ｒＡＡＶベクターゲノムの産生が含まれる。異なる実施形態のｒＡＡＶウイルス粒子には、ＵＳ９，５０４，７６２、ＷＯ２０１９／２２２１３６、ＵＳ２０１９／０３７６０８１、及びＷＯ２０２１／０９７１５７（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＡＡＶ粒子及びｒＡＡＶ粒子が含まれる。
【0051】
「キャプシド」は、ｒＡＡＶベクターゲノムがパッケージングされている構造を指す。キャプシドは、ＶＰ１タンパク質又はＶＰ３タンパク質を含むが、より典型的には、天然ＡＡＶに見られるように、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の３つ全てを含む。キャプシドタンパク質の配列は、ｒＡＡＶビリオンの血清型を決定する。ｒＡＡＶビリオンには、いくつかのＡＡＶ血清型に由来するものが含まれ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、Ｂｂａ２１、Ｂｂａ２６、Ｂｂａ２７、Ｂｂａ２９、Ｂｂａ３０、Ｂｂａ３１、Ｂｂａ３２、Ｂｂａ３３、Ｂｂａ３４、Ｂｂａ３５、Ｂｂａ３６、Ｂｂａ３７、Ｂｂａ３８、Ｂｂａ４１、Ｂｂａ４２、Ｂｂａ４３、Ｂｂａ４４、Ｂｃｅ１４、Ｂｃｅ１５、Ｂｃｅ１６、Ｂｃｅ１７、Ｂｃｅ１８、Ｂｃｅ２０、Ｂｃｅ３５、Ｂｃｅ３６、Ｂｃｅ３９、Ｂｃｅ４０、Ｂｃｅ４１、Ｂｃｅ４２、Ｂｃｅ４３、Ｂｃｅ４４、Ｂｃｅ４５、Ｂｃｅ４６、Ｂｅｙ２０、Ｂｅｙ２２、Ｂｅｙ２３、Ｂｍａ４２、Ｂｍａ４３、Ｂｐｏ１、Ｂｐｏ２、Ｂｐｏ３、Ｂｐｏ４、Ｂｐｏ６、Ｂｐｏ８、Ｂｐｏ１３、Ｂｐｏ１８、Ｂｐｏ２０、Ｂｐｏ２３、Ｂｐｏ２４、Ｂｐｏ２７、Ｂｐｏ２８、Ｂｐｏ２９、Ｂｐｏ３３、Ｂｐｏ３５、Ｂｐｏ３６、Ｂｐｏ３７、Ｂｒｈ２６、Ｂｒｈ２７、Ｂｒｈ２８、Ｂｒｈ２９、Ｂｒｈ３０、Ｂｒｈ３１、Ｂｒｈ３２、Ｂｒｈ３３、Ｂｆｍ１７、Ｂｆｍ１８、Ｂｆｍ２０、Ｂｆｍ２１、Ｂｆｍ２４、Ｂｆｍ２５、Ｂｆｍ２７、Ｂｆｍ３２、Ｂｆｍ３３、Ｂｆｍ３４、Ｂｆｍ３５、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、又はそれらの任意のバリアントが含まれる（例えば、米国特許第８，３１８，４８０号を、非天然の混合血清型の開示について参照されたい）。例示的なキャプシドは、国際出願第２０１８／０２２６０８号及び同第２０１９／２２２１３６号（その全体が本明細書に組み込まれる）にも提供されている。キャプシドタンパク質はまた、変異タンパク質、キメラタンパク質、又はシャフルタンパク質を含む、天然のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のバリアントであり得る。キャプシドタンパク質は、ＡＡＶの様々なクレード内のｒｈ．１０又は他のサブタイプのものであり得る。様々なクレード及びサブタイプは、例えば、米国特許第７，９０６，１１１号に開示されている。様々な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、ＡＡＶ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ２７７５７．１）、ＡＡＶ－２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿６８０４２６．１）、ＡＡＶ－３（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０４３９４１．１）、ＡＡＶ－３Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＢ９５４５２．１）、ＡＡＶ－４（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０４４９２７．１）、ＡＡＶ－５（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０６８４０９．１）、ＡＡＶ－６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＢ９５４５０．１）、ＡＡＶ－７（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０７７１７８．１）、ＡＡＶ－８（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０７７１７９．１）、ＡＡＶ－９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４．１）、ＡＡＶ－１０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＴ４６３３７．１）、ＡＡＶ－１１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＴ４６３３９．１）、ＡＡＶ－１２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＩ１６６３９．１）、ＡＡＶ－１３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＺ１０８１２．１）からのアミノ酸配列、又はＷＯ２０１８／０２２６０８及びＷＯ２０１９／２２２１３６に開示される任意のアミノ酸配列の一部分と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するアセチル化又は非アセチル化ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３タンパク質を有する。異なる血清型のＡＡＶタンパク質の構成及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１において考察されている。
【0052】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクターゲノム」、「ベクターゲノム」、又は「ｒＡＡＶベクターゲノム」は、一本鎖核酸を指す。ｒＡＡＶウイルス粒子は、キャプシド内にキャプシド化されたｒＡＡＶベクターゲノムを有する。ｒＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶウイルスゲノムに対して異種である転写調節エレメント（すなわち、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサー、並びに任意選択的に、ポリアデニル化配列、及び／又は調節エレメント内、若しくは調節エレメントとタンパク質コード配列との間、若しくはタンパク質コード配列のエクソン間に挿入された１つ以上のイントロン）に作動可能に連結されたタンパク質コード配列（好ましくは、機能的な治療用タンパク質コード配列；例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、及びＰＡＨ）に隣接するＡＡＶ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを有する。ｒＡＡＶベクターゲノムは、ｒＡＡＶウイルス粒子中に存在する核酸を指し、本明細書に開示される核酸配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかであり得る。そのような一本鎖核酸のサイズは、塩基数で提供される。本明細書で使用される「逆位末端反復」及び「ＩＴＲ」という用語は、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として、及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしてシスで機能する、ｒＡＡＶゲノムの５’末端及び３’末端に見出される、当該技術分野で認識されている領域を指す。ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質とともに、宿主細胞ゲノムからの効率的な除去及びレスキュー、並びに宿主細胞ゲノムへの２つの隣接するＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列の組み込みを提供する。ある特定のＡＡＶ関連ＩＴＲの配列は、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１）：３６４－３７９（２００５）によって開示されている。ＩＴＲはまた、「フリップ」又は「フロップ」構成において見出され、「フリップ」又は「フロップ」構成において、（ヘアピンのアームを形成する）ＡＡ’逆位反復間の配列が、逆補体内に存在する（Ｗｉｌｍｏｔｔ，Ｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ３０．６（２０１９）：２０６－２１３）。異なる血清型のＡＡＶベクターゲノムの構築及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１において考察されている。広範な構築物の利用可能性及び広範な特性評価のために、以下に開示される例示的なＡＡＶベクターゲノムは、血清型２に由来する。
【0053】
治療上有効なｒＡＡＶ粒子又は治療用ｒＡＡＶは、感染した細胞が（例えば、転写及び／又は翻訳によって）目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を発現するように、細胞に感染することができる。この程度まで、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、異なる特性を有するキャプシド又はベクターゲノム（ｖｇ）を有するＡＡＶ粒子を含むことができる。例えば、治療上有効なＡＡＶ粒子は、異なる翻訳後修飾を有するキャプシドを有することができる。他の例では、治療上有効なＡＡＶ粒子は、異なるサイズ／長さ、プラス又はマイナス鎖配列、異なるフリップ／フロップＩＴＲ構成（フリップ／フロップ、フロップ／フリップ、フリップ／フリップ、フロップ／フロップなど）、異なる数（１、２、３など）のＩＴＲ又は切断を有するｖｇを含有し得る。例えば、大きいタンパク質をコードする「完全」核酸が生成され、それによって機能的で完全長の遺伝子を再構築するように、ＡＡＶ感染細胞において、重複切断プラス及びマイナスゲノムのアニーリング／相補化が起こる。治療上有効なＡＡＶ粒子は、「重い」又は「完全な」キャプシドとも呼ばれる。
【0054】
一例として、治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオン、ｒＡＡＶウイルス粒子、ｒＡＡＶベクター粒子、又はｒＡＡＶを指す「治療用ｒＡＡＶ」を使用して、インビボでタンパク質を置換又は補完することができる。「治療用タンパク質」は、対応する内因性タンパク質を置換するか、又はその活性の喪失若しくは低減を補完する生物活性を有するポリペプチドを指す。例えば、機能的フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のための治療用タンパク質である。したがって、例えば、組換えＡＡＶ ＰＡＨウイルスを、ＰＫＵに罹患した対象の治療のための薬剤に使用することができる。薬剤は、静脈内（ＩＶ）投与によって投与され得、薬剤の投与は、対象における神経伝達物質の代謝産物又は神経伝達物質のレベルを変更するのに十分なレベルで、対象におけるＰＡＨタンパク質の発現をもたらす。任意選択的に、薬剤はまた、ＰＡＨをコードするｒＡＡＶの投与に関連する任意の肝毒性の予防及び／又は治療のための、予防的及び／又は治療的コルチコステロイドも含み得る。予防的又は治療的コルチコステロイドの処置は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍｇ／日、又はそれ以上のコルチコステロイドを含み得る。予防的又は治療的コルチコステロイドを含む薬剤は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０週間、又はそれ以上の連続的な期間にわたって投与され得る。ＰＫＵ療法は、任意選択的に、チロシンサプリメントを含んでもよい。
【0055】
ＡＡＶキャプシドに取り込まれた導入遺伝子は、限定されないが、治療目的の任意の異種遺伝子であり得る。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、又は他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するＡＡＶ ＩＴＲ配列に対して異種の核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節構成要素に作動的に連結される。
【0056】
導入遺伝子配列の組成は、得られるウイルスの使用に依存する。例えば、あるタイプの導入遺伝子配列は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。そのようなレポーター配列には、限定するものではないが、ｂ－ラクタマーゼ、ｂ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む）、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、及び当該技術分野で周知の他のものであって、それらに対する高親和性抗体が存在するか又は従来の手段によって産生することができるもの、並びに特にヘマグルチニン又はＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。
【0057】
これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと会合したときに、酵素アッセイ、放射線撮影アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイ、又は他のスペクトログラフィーアッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、並びに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルをコードするｒＡＡＶによって感染した細胞の存在は、β－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼである場合、シグナルをコードするｒＡＡＶは、蛍光又は発光を測定する器具によって検出することができる。
【0058】
しかしながら、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体、又は触媒ＲＮＡなどの、生物学及び医学において有用な産物をコードする非マーカー配列であることが望ましい。望ましいＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される対象において標的の核酸配列の発現を阻害するか又は消失させる配列である。典型的には、好適な標的配列には、腫瘍学的標的及びウイルス性疾患が含まれる。そのような標的の例については、以下の免疫原に関連するセクションで特定される腫瘍標的及びウイルスを参照されたい。
【0059】
導入遺伝子は、遺伝子欠損を修正又は改善するために使用され得、遺伝子欠損は、正常な遺伝子が正常レベル未満で発現される欠損、又は機能遺伝子産物が発現されない欠損を含み得る。好ましいタイプの導入遺伝子配列は、感染した細胞で発現される治療用タンパク質又はポリペプチドをコードする。ベクターゲノムは、例えば、マルチサブユニットタンパク質によって引き起こされる遺伝子欠損を修正又は改善するために、複数の導入遺伝子を更に含み得る。ある特定の状況では、異なる導入遺伝子は、タンパク質の各サブユニットをコードするために、又は異なるペプチド若しくはタンパク質をコードするために使用することができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合（例えば、免疫グロブリン、血小板由来成長因子、又はジストロフィンタンパク質）に望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を産生するために、異なるサブユニットの各々を含有する組換えウイルスを細胞に感染させる。代替的に、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によってコードされていてもよい。この場合、単一の導入遺伝子は、各サブユニットのＤＮＡが内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離された、サブユニットの各々をコードするＤＮＡを含む。これは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡのサイズが小さい場合（例えば、サブユニットをコードするＤＮＡ及びＩＲＥＳの総サイズが５キロベース未満）に望ましい。ＩＲＥＳの代替として、翻訳後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする配列によってコード配列が分離されていてもよい。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ １）：１３－２１（Ｊａｎｕａｒｙ １９９７）、Ｆｕｒｌｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４－８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）、Ｋｌｕｍｐ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（ｌＯ）：８１１－８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照されたい。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも著しく小さく、これは、２Ａペプチドを、スペースが制限要因であるときの使用に十分に好適にする。より多くの場合、導入遺伝子が大きい場合、マルチサブユニットからなる場合、又は２つの導入遺伝子が同時送達される場合、所望の導入遺伝子（複数可）又はサブユニットを保有するｒＡＡＶを同時投与することで、インビボでそれらをコンカテマー化して、単一のベクターゲノムを形成することが可能になる。そのような実施形態では、宿主細胞での同時発現のために、第１のＡＡＶは、単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを保有し得、第２のＡＡＶは、異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを保有し得る。しかしながら、選択される導入遺伝子は、任意の生物学的に活性な産物又は他の産物（例えば、研究に望ましい産物）をコードすることができる。
【0060】
好適な導入遺伝子は、当業者によって容易に選択することができる。導入遺伝子の選択は、本発明を限定するとみなすものではない。導入遺伝子は異種タンパク質であってもよく、この異種タンパク質が、治療用タンパク質であってもよい。例示的な治療用タンパク質には、限定されないが、血液因子、例えば、ｂ－グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、及び凝固因子；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン、例えば、ＩＬ－ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９など；増殖因子、例えば、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、例えば塩基性ＦＧＦ及び酸性ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、増殖分化因子９（ＧＤＦ－９）、肝がん由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－ａ．）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－．ｂ．）など；可溶性受容体、例えば、可溶性ＴＮＦ－ａ．受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ－ｌ受容体及び可溶性ＩＩ型ＩＬ－ｌ受容体）、可溶性ｇ／ｄＴ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合断片など；酵素、例えば、ａ－グルコシダーゼ、イミグルカラーゼ、ｂ－グルコセレブロシダーゼ、及びアルグルセラーゼ；酵素活性化剤、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子；ケモカイン、例えば、１Ｐ－１０、インターフェロン－γによって誘導されるモノカイン（Ｍｉｇ）、Ｇｒｏａ／ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－ｌａ、ＭＩＲ－１ｂ．、ＭＣＰ－ｌ、ＰＦ－４など；血管新生剤、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－２）、神経膠腫由来増殖因子、アンギオゲニン、アンギオゲニン－２など；抗血管新生剤、例えば可溶性ＶＥＧＦ受容体；タンパク質ワクチン；神経活性ペプチド、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、β－エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワーファリン，ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、ニューロペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、睡眠ペプチドなど；血栓溶解剤；心房性ナトリウム利尿ペプチド；リラキシン；グリア線維性酸性タンパク質；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトα－１アンチトリプシン；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；組織因子、黄体形成ホルモン；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；好中球走化性因子（ＮＣＦ）；メタロプロテイナーゼの組織阻害剤；血管作動性腸管ペプチド；アンギオゲニン；アンギオトロピン；フィブリン；ヒルディン；ＩＦ－ｌ受容体アンタゴニストなどが含まれる。いくつかの他の非限定的な目的のタンパク質の例には、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３及び４／５（ＮＴ－３及び４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）；血友病関連凝固タンパク質、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子；ジストロフィン、ミニジストロフィン、又はマイクロジストロフィン；リソソーム酸性リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；グリコーゲン蓄積疾患関連酵素、例えば、グルコース－６－ホスファターゼ、酸マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えば、ＰＨＫＡ２）、グルコーストランスポーター（例えば、ＧＦＵＴ２）、アルドラーゼＡ、ｂ－エノラーゼ、及びグリコーゲンシンターゼ；リソソーム酵素（例えば、β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼＡ）；並びにそれらの任意のバリアントが含まれる。ＡＡＶベクターゲノムはまた、ベクターでトランスフェクトされた細胞で又はウイルスに感染した細胞でその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にするような様式で導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメント又は配列を含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで、又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。好適な遺伝子としては、Ａｎｇｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｅｒａ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．ｏｆ Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．７０，ｐａｇｅｓ ２７２－２８８（２０１９）及びＤｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３５９，Ｉｓｓｕｅ ６３７２，ｅａａｎ４６７２（２０１８）において考察されている遺伝子が挙げられる。
【0061】
発現制御配列は、導入遺伝子に連結され得る。発現制御配列の例としては、適切な転写開始、終結、プロモーター、及びエンハンサーの配列；スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）のシグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強させる配列；及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強させる配列が挙げられる。天然の、構成的、誘導性、及び／又は組織特異的プロモーターを含む多くの発現制御配列が当該技術分野で既知であり、利用することができる。構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを有する）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｌ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ｂ－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外来的に供給される化合物、温度などの環境因子、又は特定の生理学的状態（例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、若しくは複製細胞中のみ）の存在によって調節することができる。誘導性プロモーター及び誘導系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含むが限定するものではない、様々な商業的供給者から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外来的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［ＷＯ９８／１００８８］、エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６－３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８）も参照］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７）］並びにラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７）］が挙げられる。この文脈において有用であり得る他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、又は複製細胞中のみで調節されるものである。
【0062】
任意選択的に、導入遺伝子の天然のプロモーターを使用してもよい。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきである場合、天然のプロモーターが好ましいものであり得る。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が、一時的に若しくは発達的に、又は組織特異的な様式で、又は特定の転写刺激に応答して調節されなければならないときに使用され得る。更なる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、又はコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御エレメントはまた、天然の発現を模倣するために使用することができる。
【0063】
導入遺伝子はまた、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含み得る。例えば、骨格筋での発現が所望される場合、筋肉で活性なプロモーターが使用される必要がある。これらには、骨格ｂアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、及び天然に存在するプロモーターよりも高い活性を有する合成筋肉プロモーターが含まれる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１－２４５（１９９９）を参照されたい）。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝臓について知られている（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）；α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロンの、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））。
【0064】
組換えＡＡＶを使用して、例えば、細胞培養で目的のタンパク質をインビトロで産生することができる。例えば、ＡＡＶは、インビトロで目的のタンパク質を産生するための方法において使用することができ、本方法は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶを提供することと、組換えＡＡＶを細胞培養中の細胞と接触させることと、を含み、それによって、組換えＡＡＶが細胞において目的のタンパク質を発現する。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変動し得る。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．１キロ塩基（ｋｂ）長、少なくとも約０．２ｋｂ長、少なくとも約０．３ｋｂ長、少なくとも約０．４ｋｂ長、少なくとも約０．５ｋｂ長、少なくとも約０．６ｋｂ長、少なくとも約０．７ｋｂ長、少なくとも約０．８ｋｂ長、少なくとも約０．９ｋｂ長、少なくとも約１ｋｂ長、少なくとも約１．１ｋｂ長、少なくとも約１．２ｋｂ長、少なくとも約１．３ｋｂ長、少なくとも約１．４ｋｂ長、少なくとも約１．５ｋｂ長、少なくとも約１．６ｋｂ長、少なくとも約１．７ｋｂ長、少なくとも約１．８ｋｂ長、少なくとも約２．０ｋｂ長、少なくとも約２．２ｋｂ長、少なくとも約２．４ｋｂ長、少なくとも約２．６ｋｂ長、少なくとも約２．８ｋｂ長、少なくとも約３．０ｋｂ長、少なくとも約３．２ｋｂ長、少なくとも約３．４ｋｂ長、少なくとも約３．５ｋｂ長、少なくとも約４．０ｋｂ長、少なくとも約５．０ｋｂ長、少なくとも約６．０ｋｂ長、少なくとも約７．０ｋｂ長、少なくとも約８．０ｋｂ長、少なくとも約９．０ｋｂ長、又は少なくとも約１０．０ｋｂ長であり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは少なくとも約１．４ｋｂの長さである。
【0065】
組換えＡＡＶを使用して、動物（例えば、哺乳動物）において目的のタンパク質をインビボで産生することができる。いくつかの実施形態は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶを提供することと、組換えＡＡＶを対象に投与し、それにより組換えＡＡＶは対象において目的のタンパク質を発現することとを含む、目的のタンパク質をインビボで産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物、例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、又はウシであることができる。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変動し得る。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．１ｋｂ長、少なくとも約０．２ｋｂ長、少なくとも約０．３ｋｂ長、少なくとも約０．４ｋｂ長、少なくとも約０．５ｋｂ長、少なくとも約０．６ｋｂ長、少なくとも約０．７ｋｂ長、少なくとも約０．８ｋｂ長、少なくとも約０．９ｋｂ長、少なくとも約１ｋｂ長、少なくとも約１．１ｋｂ長、少なくとも約１．２ｋｂ長、少なくとも約１．３ｋｂ長、少なくとも約１．４ｋｂ長、少なくとも約１．５ｋｂ長、少なくとも約１．６ｋｂ長、少なくとも約１．７ｋｂ長、少なくとも約１．８ｋｂ長、少なくとも約２．０ｋｂ長、少なくとも約２．２ｋｂ長、少なくとも約２．４ｋｂ長、少なくとも約２．６ｋｂ長、少なくとも約２．８ｋｂ長、少なくとも約３．０ｋｂ長、少なくとも約３．２ｋｂ長、少なくとも約３．４ｋｂ長、少なくとも約３．５ｋｂ長、少なくとも約４．０ｋｂ長、少なくとも約５．０ｋｂ長、少なくとも約６．０ｋｂ長、少なくとも約７．０ｋｂ長、少なくとも約８．０ｋｂ長、少なくとも約９．０ｋｂ長、又は少なくとも約１０．０ｋｂ長であり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは少なくとも約１．４ｋｂの長さである。
【0066】
特に興味深いのは、様々な疾患又は障害を治療するための１つ以上の治療用タンパク質を発現するための組換えＡＡＶの使用である。疾患の非限定的な例には、がん腫、肉腫、白血病、リンパ腫などのがん；並びに多発性硬化症などの自己免疫疾患が含まれる。がん腫の非限定的な例には、食道がん；肝細胞がん；基底細胞がん、扁平上皮がん（種々の組織）；移行上皮がんを含む膀胱がん；気管支原性がん；結腸がん；大腸がん；胃がん；肺の小細胞がん及び非小細胞がんを含む肺がん；副腎皮質がん；甲状腺がん；膵臓がん；乳がん；卵巣がん；前立腺がん；腺がん；汗腺がん；脂腺がん；乳頭がん；乳頭腺がん；嚢胞腺がん；髄様がん；腎細胞がん；非浸潤性乳管がん又は胆管がん；絨毛がん；セミノーマ；胎児性がん；ウィルムス腫瘍；子宮頸がん；子宮がん；精巣がん；骨形成がん；上皮がん；並びに鼻咽頭がんが含まれる。肉腫の非限定的な例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟部組織肉腫が挙げられる。固形腫瘍の非限定的な例には、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が含まれる。白血病の非限定的な例には、慢性骨髄増殖性症候群；急性骨髄性白血病；Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ前リンパ球性白血病及び有毛細胞白血病を含む、慢性リンパ球性白血病；並びに急性リンパ芽球性白血病が含まれる。リンパ腫の例には、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫等が含まれるが、これらに限定されない。
【0067】
本明細書に開示されるｒＡＡＶ及び方法を使用して治療することができる疾患の他の非限定的な例としては、鎌状赤血球症、嚢胞性線維症、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損１、テイ＝サックス病、フェニルケトン尿症、ムコ多糖症、糖原病（ＧＳＤ、例えば、ＧＳＤ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、及びＸＩＶ型）、ガラクトース血症、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー）、及び血友病（例えば、血友病Ａ（古典的血友病）及び血友病Ｂ（クリスマス病））、ウィルソン病、ファブリー病、ゴーシェ病、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、並びにα１アンチトリプシン欠損症が挙げられる。加えて、本明細書に開示されるｒＡＡＶ及び方法は、肝臓における導入遺伝子の局所発現によって、又は肝臓若しくは肝細胞からの分泌タンパク質の発現によって治療され得る他の障害を治療するために使用することができる。
【0068】
対象（例えば、対象の血清）において発現される異種タンパク質の量は変動し得る。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、対象の血清中に、少なくとも約９ミリグラム（ｍｇ）／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４９ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの量で発現され得る。目的のタンパク質は、対象の血清中に、約９ピコグラム（ｐｇ）／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約３００ｐｇ／ｍＬ、約４００ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、約６００ｐｇ／ｍＬ、約７００ｐｇ／ｍＬ、約８００ｐｇ／ｍＬ、約９００ｐｇ／ｍＬ、約１０００ｐｇ／ｍＬ、約１５００ｐｇ／ｍＬ、約２０００ｐｇ／ｍＬ、約２５００ｐｇ／ｍＬ、又はこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の量で発現され得る。当業者は、目的のタンパク質が治療有効性に必要な発現レベルは、目的の特定のタンパク質及び治療を受けている対象などの非限定的な因子によって変動し得るものであり、有効量のタンパク質は、過度の実験をすることなく当該技術分野で既知の従来の方法を使用して当業者によって容易に決定され得ることを理解するであろう。
【0069】
アデノ随伴ウイルスの産生方法
【0070】
本開示は、ｒＡＡＶビリオンを、昆虫細胞などの細胞内で産生するための材料及び方法を提供する。
【0071】
ＡＡＶウイルス粒子を作製する方法は、例えば、米国特許第６２０４０５９号、同第５７５６２８３号、同第６２５８５９５号、同第６２６１５５１号、同第６２７０９９６号、同第６２８１０１０号、同第６３６５３９４号、同第６４７５７６９号、同第６４８２６３４号、同第６４８５９６６号、同第６９４３０１９号、同第６９５３６９０号、同第７０２２５１９号、同第７２３８５２６号、同第７２９１４９８号、及び同第７４９１５０８号、同第５０６４７６４号、同第６１９４１９１号、同第６５６６１１８号、同第８１３７９４８号、又は国際公開第１９９６／０３９５３０号、同第１９９８／０１００８８号、同第１９９９／０１４３５４号、同第１９９９／０１５６８５号、同第１９９９／０４７６９１号、同第２０００／０５５３４２号、同第２０００／０７５３５３号、同第２００１／０２３５９７号、同第２０１５／１９１５０８号、同第２０１９／２１７５１３号、同第２０１８／０２２６０８号、同第２０１９／２２２１３６号、同第２０２０／２３２０４４号、同第２０１９／２２２１３２号、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）、Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２－８（１９８９）、Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６４６－５０（１９９１）、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２－３０（１９９２）、Ｋｉｍｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．，２１９：３７－４４（１９９６）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．２７２：３８２－９３（２０００）に記載されており、それらの各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【0072】
例えば、昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞又は非ヒト哺乳動物細胞）などの細胞は、ｒＡＡＶを生成することができる。例えば、細胞は、提供されたＡＡＶヘルパー機能、ＡＡＶ非ヘルパー機能、及び細胞がＡＡＶベクターゲノムを生成するために使用するヌクレオチド配列を生成することができる。様々な実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能、ＡＡＶ非ヘルパー機能、及び細胞がｒＡＡＶを生成するために使用するヌクレオチド配列は、例えば、トランスフェクション試薬によるトランスフェクションを介して、他の組換えウイルスによる形質導入／感染を介して、ヌクレオチド配列を細胞のゲノムに組み込むことによって、又は他の方法によって、細胞に送達されるベクターによって提供される。
【0073】
「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、バクミド、ミニプラスミド（例えば、細菌エレメントを含まないプラスミド）、ドギーボーンＤＮＡ（例えば、最小の閉じた線形構築物）、染色体、ウイルス、ビリオン（例えば、バキュロウイルス）などの、適切な制御エレメントを伴う場合に複製することができ、かつ細胞間で遺伝子配列を伝達することができる、任意の遺伝子エレメントを指すと理解される。本明細書で使用される「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の産生的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子を指す。例示的な生物学的ベクターとしては、プラスミド、直鎖核酸分子、及び組換えウイルスが挙げられる。任意のベクターが、昆虫細胞適合性である限り用いられ得る。ベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込まれ得るが、昆虫細胞中のベクターの存在は、永久的である必要はなく、一過性のエピソームベクターも含まれる。ベクターは、既知の任意の手段、例えば、細胞の化学処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入され得る。バキュロウイルスベクター及びその使用方法は、昆虫細胞の分子工学に関する上記引用文献に記載されている。
【0074】
細胞がｒＡＡＶベクターゲノムを生成するベクターは、プロモーターと、１つ以上の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするためのプロモーターの下流の制限部位と、を含み得、プロモーター及び制限部位は、５’ＡＡＶ ＩＴＲの下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に位置する。ベクターはまた、制限部位の下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流の転写後調節エレメントを含み得る。ウイルス構築物は、制限部位に挿入され、プロモーターと作動可能に連結されたポリヌクレオチドを更に含み得、ポリヌクレオチドが、対象となるタンパク質のコード領域を含む。
【0075】
「ＡＡＶヘルパー」という用語は、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得、ＡＡＶ遺伝子産物が、次いで生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能する、ＡＡＶ由来コード配列を指す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能には、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐ及びｃａｐの両方が含まれる。Ｒｅｐ発現産物は、特に以下のものを含む、多くの機能を有することが示されている：ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節。キャプシド（Ｃａｐ）発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターゲノムから失われたＡＡＶ機能をトランスで補完するために使用される。
【0076】
様々な実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能を提供するベクターは、キャプシドタンパク質又はＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む。任意のＡＡＶ血清型（限定されないが、ＡＡＶ１（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７．１）、ＡＡＶ２（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１．２）、ＡＡＶ３（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１７２９．１）、ＡＡＶ３Ｂ（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０２８７０５．１）、ＡＡＶ４（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９．１）、ＡＡＶ５（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００６１５２．１）、ＡＡＶ６（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０２８７０４．１）、ＡＡＶ７（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００６２６０．１）、ＡＡＶ８（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００６２６１．１）、ＡＡＶ９（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２５０．１）、ＡＡＶ１０（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６３１９６５．１）、ＡＡＶ１１（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６３１９６６．１）、ＡＡＶ１２（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ８１３６４７．１）、ＡＡＶ１３（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＵ２８５５６２．１）Ｂｂａ２１、Ｂｂａ２６、Ｂｂａ２７、Ｂｂａ２９、Ｂｂａ３０、Ｂｂａ３１、Ｂｂａ３２、Ｂｂａ３３、Ｂｂａ３４、Ｂｂａ３５、Ｂｂａ３６、Ｂｂａ３７、Ｂｂａ３８、Ｂｂａ４１、Ｂｂａ４２、Ｂｂａ４３、Ｂｂａ４４、Ｂｃｅ１４、Ｂｃｅ１５、Ｂｃｅ１６、Ｂｃｅ１７、Ｂｃｅ１８、Ｂｃｅ２０、Ｂｃｅ３５、Ｂｃｅ３６、Ｂｃｅ３９、Ｂｃｅ４０、Ｂｃｅ４１、Ｂｃｅ４２、Ｂｃｅ４３、Ｂｃｅ４４、Ｂｃｅ４５、Ｂｃｅ４６、Ｂｅｙ２０、Ｂｅｙ２２、Ｂｅｙ２３、Ｂｍａ４２、Ｂｍａ４３、Ｂｐｏ１、Ｂｐｏ２、Ｂｐｏ３、Ｂｐｏ４、Ｂｐｏ６、Ｂｐｏ８、Ｂｐｏ１３、Ｂｐｏ１８、Ｂｐｏ２０、Ｂｐｏ２３、Ｂｐｏ２４、Ｂｐｏ２７、Ｂｐｏ２８、Ｂｐｏ２９、Ｂｐｏ３３、Ｂｐｏ３５、Ｂｐｏ３６、Ｂｐｏ３７、Ｂｒｈ２６、Ｂｒｈ２７、Ｂｒｈ２８、Ｂｒｈ２９、Ｂｒｈ３０、Ｂｒｈ３１、Ｂｒｈ３２、Ｂｒｈ３３、Ｂｆｍ１７、Ｂｆｍ１８、Ｂｆｍ２０、Ｂｆｍ２１、Ｂｆｍ２４、Ｂｆｍ２５、Ｂｆｍ２７、Ｂｆｍ３２、Ｂｆｍ３３、Ｂｆｍ３４、Ｂｆｍ３５、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、又はそれらの任意のバリアントを含む）からのキャップ遺伝子及び／又はｒｅｐ遺伝子を本明細書で使用して、組換えＡＡＶを産生することができる。例示的なキャプシドはまた、国際出願第２０１８／０２２６０８号及び同第２０１９／２２２１３６号（それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においても提供される。上で提供された各ＮＣＢＩ参照配列番号又はＧｅｎｂａｎｋ受入番号も、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型３，血清型３Ｂ、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、血清型１３、又はこれらのバリアントからのキャプシドをコードする。
【0077】
生産のために、ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞は、キャプシドを形成するのに十分な組換えキャプシドタンパク質を産生する。これには、少なくともＶＰ１及びＶＰ３タンパク質が含まれるが、より典型的には、天然ＡＡＶに見出されるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の３つ全てが含まれる。キャプシドタンパク質の配列は、宿主細胞によって産生されるＡＡＶビリオンの血清型を決定する。本発明において有用なキャプシドは、１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は混合血清型を含むいくつかのＡＡＶ血清型に由来するものを含む（例えば、米国特許第８，３１８，４８０号を、非天然混合血清型のその開示について参照されたい）。キャプシドタンパク質はまた、変異タンパク質、キメラタンパク質、又はシャフルタンパク質を含む、天然のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のバリアントであり得る。キャプシドタンパク質は、ＡＡＶの様々なクレード内のｒｈ．１０又は他のサブタイプのものであり得る。様々なクレード及びサブタイプは、例えば、米国特許第７，９０６，１１１号に開示されている。広範な構築物の利用可能性及び広範な特徴付けのために、以下に開示される例示的なＡＡＶベクターは、血清型２に由来する。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１において考察されている。
【0078】
様々な実施形態では、ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、Ｐｏｌｈプロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。
【0079】
異なる実施例では、３９Ｋプロモーターは、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９超％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【0080】
ＴＴＣＧＧＡＣＴＧＣＴＴＧＡＣＴＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＣＧＴＣＴＧＣＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＴＣＧＴＴＴＧＡＧＣＧＴＡＴＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＴＡＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧＣＧＴＡＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＴＧＧＧＣＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＡＣＧＧＧＴＴＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣ
【0081】
異なる実施例では、ｐ６．９プロモーターは、配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９超％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【0082】
ＡＡＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＡＧＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＡＧＡＴＣＣＧＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＧＴＣＧＧＡＴＧＴＡＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＡＴＴＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＧＡＣＣＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＣＡＧＴＣＧＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＡＣＡＴＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＴＡＡＡＣ
【0083】
異なる実施例では、Ｐｏｌｈプロモーターは、配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９超％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【0084】
ＡＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＧＧＣＧＣＧ
【0085】
生産のために、ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞は、ｒＡＡＶの生産を促進するためのＲｅｐタンパク質を産生する。感染性粒子は、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）及び少なくとも１つの小さなＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）が細胞で発現される場合に産生され得ることが見出されている。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０の４つ全てが発現される。あるいは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２、又はＲｅｐ６８及びＲｅｐ４０が発現される。以下の例は、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２の組み合わせの使用を示す。Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ－２又は他の血清型に由来し得る。様々な実施形態では、Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。
【0086】
ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞はまた、キャプシドのアセンブリを助けるアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を産生することができる。様々な実施形態では、ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。
【0087】
「非ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、ＡＡＶがその複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス機能及び／又は細胞機能を指す。したがって、この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶキャプシドアセンブリに関与する部分を含む、ＡＡＶの複製に必要なタンパク質及びＲＮＡを捕捉する。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型を除く）、及びワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。
【0088】
「非ＡＡＶヘルパー機能ベクター」という用語は、一般に、アクセサリー機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。アクセサリー機能ベクターを、好適な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、ベクターは、次いで、宿主細胞におけるＡＡＶビリオンの産生をサポートすることができる。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス粒子など、自然界に存在する感染性ウイルス粒子は、この用語から明示的に除外される。したがって、アクセサリー機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、又はコスミドの形態であってもよい。特に、アデノウイルス遺伝子の完全相補体は、アクセサリーヘルパー機能に必要ではないことが実証されている。例えば、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成が不可能なアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製を許容することが示されている。Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製をサポートすることが示されており、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域がアクセサリー機能の提供におそらく関与していないことが示されている。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。しかしながら、Ｅ１領域に欠陥がある、又はＥ４領域が欠失しているアデノウイルスは、ＡＡＶ複製をサポートすることができない。したがって、Ｅ１Ａ及びＥ４領域は、直接的に又は間接的にいずれかで、ＡＡＶ複製に必要とされる可能性が高い。Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８、Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。その他の特徴付けられたＡｄ変異体には、以下のものが含まれる：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２），上記、Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９８１），上記、Ｏｓｔｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２）、Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９、Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５、Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．，１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３），上記）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３），上記、Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスによって提供されるアクセサリー機能の研究は、矛盾する結果をもたらしたが、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６－２１０は最近、Ｅ１Ｂ５５ｋがＡＡＶビリオンの産生に必要であるが、Ｅ１Ｂ１９ｋはそうではないことを報告した。加えて、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８－９４５には、様々なＡｄ遺伝子をコードするアクセサリー機能ベクターが記載されている。特に好ましいアクセサリー機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及びインタクトのＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。かかるベクターは、国際公開第０１／８３７９７号に記載されている。
【0089】
異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、文書により十分に説明されており、核酸、例えばベクター、例えば昆虫細胞適合性ベクターをそのような細胞に導入する方法、及びそのような細胞を培養液中で維持する方法も同様である。（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ Ｊ（１９９５）、Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）ｖｏｌ．６３，ｐｐ．３８２２－３８２８、Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）ｖｏｌ．８８，ｐｐ．４６４６－４６５０、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９９２）ｖｏｌ．６６，ｐｐ．６９２２－６９３０、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．（１９９６）ｖｏｌ．２１９，ｐｐ．３７－４４、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．（２０００）ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．３８２－３９３、及び米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたい）。使用することができる昆虫細胞株の例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓｆ９００＋、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株、蚊細胞株、例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株、飼育カイコ細胞株、例えば、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ細胞株、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞株、例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞株、又は鱗翅類細胞株、例えば、Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ細胞株に由来し得る。例示的な昆虫細胞は、バキュロウイルス感染に感受性である昆虫種由来の細胞であり、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｆ－ＲＶＮ、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＡｏ３８が含まれる。
【0090】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のためのベクターを有する昆虫細胞が提供される。ｒＡＡＶ産生のためのヌクレオチド配列を有する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を使用して、これらのヌクレオチド配列をｒＡＡＶ産生のために昆虫細胞に送達することができる。ｒＢＶなどのバキュロウイルスは、節足動物のエンベロープＤＮＡウイルスであり、そのうち２つのメンバーは、細胞培養で組換えタンパク質を産生するための周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、環状二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有し、これを操作して、特定の細胞に大量のゲノム内容物の送達を可能にすることができる。ベクターとして使用されるウイルスは、一般に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチキャプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス（Ｂｍ－ＮＰＶ）である（Ｋａｔｏｕ，Ｙａｓｕｈｉｒｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０４．２（２０１０）：２０４－２１４）。バキュロウイルスは、一般に、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞の感染に使用される。特に、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３１（１９８６）：３１－４９、ＥＰ １２７８３９、ＥＰ １５５４７６、Ｖｌａｋ，Ｊｕｓｔ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９．４（１９８８）：７６５－７７６、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌｏｉｓ Ｋ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４２．１（１９８８）：１７７－１９９、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，Ｌｕｉｓ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７３．２（１９８８）：４０９－４１８、Ｍａｅｄａ，Ｓｕｓｕｍｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１５．６０２０（１９８５）：５９２－５９４、Ｌｅｂａｃｑ－Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ，ＡＮＮＥ－ＭＡＲＩＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ８．８（１９８８）：３１２９－３１３５、Ｓｍｉｔｈ，Ｇａｌｅ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８２．２４（１９８５）：８４０４－８４０８、Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ａｔｓｕｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５８．２－３（１９８７）：２７３－２８１、及びＭａｒｔｉｎ，Ｂｒｉａｎ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ７．２（１９８８）：９９－１０６に記載されるように達成され得る。多数のバキュロウイルス株及びバリアント、並びにタンパク質の産生に使用することができる対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖｅｒｎｅ Ａ．，ａｎｄ Ｍａｘ Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６．１（１９８８）：４７－５５、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．８（ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｅｔｌｏｗ ａｎｄ Ａ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２７７－２９８，１９８６）、Ｍａｅｄａ，Ｓｕｓｕｍｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１５．６０２０（１９８５）：５９２－５９４、及びＭｃＫｅｎｎａ，Ｋｅｖｉｎ Ａ．，Ｈｕａｚｈｕ Ｈｏｎｇ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｒ．Ｇｒａｎａｄｏｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７１．１（１９９８）：８２－９０に記載されている。
【0091】
組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成するために、ドナーベクター及びバクミド又はトランスファーベクター及び線形化バキュロウイルスＤＮＡが使用される。バクミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）などの細菌で大きなプラスミドとして増殖する。バクミドは、昆虫細胞にトランスフェクトされた場合、バキュロウイルスを生成する。従来のバキュロウイルス生成、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃシステムにおけるものは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける部位特異的転置によって組換えバキュロウイルスを生成する。次いで、高分子量バクミドＤＮＡを単離し、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞にトランスフェクトし、そこから組換えバキュロウイルスを単離し、増幅する。
【0092】
昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターゲノムのヌクレオチド配列を有するか、又はｒＢＶを生成するためのＡＡＶヘルパー機能を提供するヌクレオチド配列を有するバクミドで別々にトランスフェクトすることができる。続いて、これらの異なるｒＢＶを使用してナイーブ昆虫細胞を共感染させて、ｒＡＡＶを生成する。
【0093】
昆虫細胞におけるＡＡＶ産生のために現在使用されているプロトコルに存在する重要な問題は、バキュロウイルスの不安定性である。この不安定性は、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）の生成につながる。不安定性は、部分的には、バキュロウイルスゲノム複製が本質的に不安定であり、目的の遺伝子を含む大きな欠失をもたらし、低いｒＡＡＶ生産性をもたらすために引き起こされる。この問題に対処するための一般的な緩和戦略は、非常に低い感染多重度（ＭＯＩ）でのｒＢＶによる継代及び感染を行うことを伴う。（ＭＯＩは、各細胞に感染するウイルス粒子の平均数、すなわち、感染中に細胞当たり追加されたウイルスの数を指す。）第２の戦略は、安定性のために選択するためにｒＢＶをクローニングすることである。他の戦略は、例えば、重要な遺伝子の近くに選択マーカーを再配置すること、及び／又は反復ｈｒ領域を移動／欠失させることによって安定性を最適化しようとする、バキュロウイルス骨格の修飾を伴う。
【0094】
上記に記載されるように、バキュロウイルスの不安定性に対処するための１つの戦略は、低ＭＯＩを使用することを伴う。低ＭＯＩを使用すると、小規模にバキュロウイルスの不安定性がいくらか改善されるが、その改善は、商業的生産には十分ではない。
【0095】
例えば、バキュロウイルス（ＢＶ）ゲノムが不安定であり、複数の継代後にｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子又は治療用遺伝子において欠失が起こることが発見された。これらの欠失は、ｒＡＡＶの生産性を損なう。欠失及び生産性低下に対処するために、異なるプロセスが開発された。第１のプロセスは、安定したＥ．ｃｏｌｉクローンをバクミドとともにバンクし、クローン内でバクミドを増殖させることである。第２のプロセスは、懸濁液中でＳｆ細胞のトランスフェクションを実施してＢＶを生成し、ｒＡＡＶの産生のために継代０（Ｐ０）ＢＶを単離することである。第３のプロセスは、超低感染多重度（ＭＯＩ）（例えば、０．０１未満）でＳｆ細胞をＰ０ ＢＶで感染させて、ｒＡＡＶを産生することである。
【0096】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、細胞を少なくとも１つの組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）に感染させるステップを含む。少なくとも１つのｒＢＶは、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。この方法は、感染した細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップを更に含む。この方法では、少なくとも１つのｒＢＶは、ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つでトランスフェクトされた細胞を含む少なくとも１つの細胞培養物から単離される。例えば、ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つは、バクミド中にある。
【0097】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶは、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｆ－ＲＶＮ、Ｓｅ３０ｌ、ＳｅＩＺＤ２ｌ０９、ＳｅＵＣＲｌ、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２ｌ、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－ｌ、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍｌ、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５及びＡｏ３８を含むがこれらに限定されない、ＡＡＶ又は生物学的産物の産生を可能にし、培養で維持され得、バキュロウイルス感染に感受性である任意の昆虫細胞型を使用して産生される。
【0098】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、細胞を少なくとも１つの組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）に感染させるステップを含む。少なくとも１つのｒＢＶは、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。この方法は、感染した細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップを更に含む。この方法では、少なくとも１つのｒＢＶは、感染させるステップの前に、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分を有する細胞を含む少なくとも１つの細胞培養物から単離される。細胞はまた、バキュロウイルスゲノムの少なくとも一部分と組み合わさって、ｒＢＶを生成することが可能なバキュロウイルスゲノムを形成する、少なくとも１つのヌクレオチド配列でトランスフェクトされる。例えば、線状化されたバキュロウイルスゲノムは、新しく形成されたバキュロウイルスゲノムを有する細胞がｒＢＶを生成することができるように、ヌクレオチド分子を含むバキュロウイルスゲノムが生成されるように、ヌクレオチド分子と組み換えることができる。
【0099】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、細胞を継代０（Ｐ０）ｒＢＶに感染させるステップと、感染した細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップと、を含む。Ｐ０ ｒＢＶは、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、ｒＡＡＶを生成するために細胞に感染するために使用されるｒＢＶは、１未満の継代である。
【0100】
様々な実施形態では、少なくとも１つのｒＢＶを使用する大規模なｒＢＶベースのｒＡＡＶ産生の方法が開示される。方法は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びｒＡＡＶベクターゲノムを有するバクミドを含有する組換えＥ．ｃｏｌｉのバンクを作製するステップと、該Ｅ．ｃｏｌｉバンクを凍結保存するステップと、該Ｅ．ｃｏｌｉバンクを解凍するステップと、解凍されたＥ．ｃｏｌｉバンクからバクミドを単離するステップと、該解凍されたＥ．ｃｏｌｉバンクからのバクミドを用いて昆虫細胞をトランスフェクトして、トランスフェクトされた昆虫細胞を培養するステップと、トランスフェクトされた昆虫細胞からｒＢＶを単離するステップと、バイオリアクター内で昆虫細胞を単離されたｒＢＶに更に感染させ、感染した昆虫細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップと、を含む。
【0101】
ｒＢＶに関連する「継代」という用語は、培養物中でＳｆ９細胞などのナイーブ昆虫細胞に感染させてより多くのｒＢＶを生成することによって、ｒＢＶ濃度を増殖させるプロセスである。「継代」という用語に関連付けられた数は、以前の継代からのバクミド又はｒＢＶがより多くのｒＢＶを生成するために使用された連続回数を指す。例えば、培養物中のナイーブＳｆ９細胞の少なくとも一部分にバクミドをトランスフェクトし、これらの細胞を培養することで、単離される継代０又はＰ０ ｒＢＶを産生する。Ｐ０ ｒＢＶを使用して培養物中のナイーブＳｆ９細胞の少なくとも一部分に感染させるとき、これらの細胞は、Ｐ１ ｒＢＶを生成する。
【0102】
様々な実施形態では、様々な実施形態の方法によって生成されたＰ０ ｒＢＶの少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９％超、又は１００％は、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。
【0103】
様々な実施形態では、様々な実施形態の方法によって生成されたＰ０ ｒＢＶの２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％は、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する様々な実施形態の方法によって生成されたＰ０ ｒＢＶのパーセンテージは、上記で提供されるいずれか２つのパーセンテージの間の範囲である。
【0104】
様々な実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉバンク又はクローンを既定の細胞密度まで増殖させて既定濃度のバクミドを抽出して、少なくとも５ミリリットル（ｍＬ）、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも５０ｍＬ、少なくとも１００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも１リットル（Ｌ）、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、又は少なくとも２５００Ｌの培養量で細胞をトランスフェクトする。
【0105】
様々な実施形態では、トランスフェクション後の細胞は、トランスフェクション後約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約１４４時間、約１６８時間、約１９２時間、約２１６時間、約２４０時間、又はこれらの２つの時点のうちのいずれかの間の時間にわたって培養される。
【0106】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、細胞を０．０１未満の感染多重度（ＭＯＩ）でｒＢＶに感染させるステップを含む。ｒＢＶは、ｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列を有する。この方法はまた、感染した細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップを含む。様々な実施形態のｒＡＡＶを生成するためのヌクレオチド配列は、ｒＡＡＶベクターゲノムを提供し、Ｒｅｐ及びキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0107】
様々な実施形態では、少なくとも１つのｒＢＶを使用する大規模なｒＢＶベースのｒＡＡＶ産生の方法が開示される。方法は、Ｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐタンパク質をコードするＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及びｒＡＡＶベクターゲノムを提供するヌクレオチド配列を含むバクミドで、ある量の懸濁液中の昆虫細胞を別々にトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた昆虫細胞を培養し、ｒＢＶを単離するステップと、バイオリアクター内で昆虫細胞をｒＢＶに更に感染させるステップと、感染した昆虫細胞を培養してｒＡＡＶを生成するステップと、を含む。様々な実施形態の量は、例えば、少なくとも０．０００１ミリリットル（ｍＬ）、少なくとも０．０００５ｍＬ、少なくとも０．００１ｍＬ、少なくとも０．００５ｍＬ、少なくとも０．０１ｍＬ、少なくとも０．０５ｍＬ、少なくとも０．１ｍＬ、少なくとも０．５ｍＬ、少なくとも１ｍＬ、少なくとも５ｍＬ、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも２０ｍＬ、少なくとも３０ｍＬ、少なくとも４０ｍＬ、少なくとも５０ｍＬ、少なくとも６０ｍＬ、少なくとも７０ｍＬ、少なくとも８０ｍＬ、少なくとも９０ｍＬ、少なくとも１００ｍＬ、少なくとも２００ｍＬ、少なくとも３００ｍＬ、少なくとも４００ｍＬ、又は少なくとも５００ｍＬである。
【0108】
「感染多重度」及び「ＭＯＩ」という用語は、感染中に細胞当たりに添加されるウイルス粒子の総数の比である。例えば、１×１０６ ｒＢＶ粒子を１×１０６細胞を含む培養物に添加する場合、ＭＯＩは、１である。
【0109】
様々な実施形態では、ＭＯＩは、０．０１、０．００９９、０．００９８、０．００９７、０．００９６、０．００９５、０．００９４、０．００９３、０．００９２、０．００９１、０．００９、０．００８９、０．００８８、０．００８７、０．００８６、０．００８５、０．００８４、０．００８３、０．００８２、０．００８１、０．００８、０．００７９、０．００７８、０．００７７、０．００７６、０．００７５、０．００７４、０．００７３、０．００７２、０．００７１、０．００７、０．００６９、０．００６８、０．００６７、０．００６６、０．００６５、０．００６４、０．００６３、０．００６２、０．００６１、０．００６、０．００５９、０．００５８、０．００５７、０．００５６、０．００５５、０．００５４、０．００５３、０．００５２、０．００５１、０．００５、０．００４９、０．００４８、０．００４７、０．００４６、０．００４５、０．００４４、０．００４３、０．００４２、０．００４１、０．００４、０．００３９、０．００３８、０．００３７、０．００３６、０．００３５、０．００３４、０．００３３、０．００３２、０．００３１、０．００３、０．００２９、０．００２８、０．００２７、０．００２６、０．００２５、０．００２４、０．００２３、０．００２２、０．００２１、０．００２、０．００１９、０．００１８、０．００１７、０．００１６、０．００１５、０．００１４、０．００１３、０．００１２、０．００１１、０．００１、０．０００９９、０．０００９８、０．０００９７、０．０００９６、０．０００９５、０．０００９４、０．０００９３、０．０００９２、０．０００９１、０．０００９、０．０００８９、０．０００８８、０．０００８７、０．０００８６、０．０００８５、０．０００８４、０．０００８３、０．０００８２、０．０００８１、０．０００８、０．０００７９、０．０００７８、０．０００７７、０．０００７６、０．０００７５、０．０００７４、０．０００７３、０．０００７２、０．０００７１、０．０００７、０．０００６９、０．０００６８、０．０００６７、０．０００６６、０．０００６５、０．０００６４、０．０００６３、０．０００６２、０．０００６１、０．０００６、０．０００５９、０．０００５８、０．０００５７、０．０００５６、０．０００５５、０．０００５４、０．０００５３、０．０００５２、０．０００５１、０．０００５、０．０００４９、０．０００４８、０．０００４７、０．０００４６、０．０００４５、０．０００４４、０．０００４３、０．０００４２、０．０００４１、０．０００４、０．０００３９、０．０００３８、０．０００３７、０．０００３６、０．０００３５、０．０００３４、０．０００３３、０．０００３２、０．０００３１、０．０００３、０．０００２９、０．０００２８、０．０００２７、０．０００２６、０．０００２５、０．０００２４、０．０００２３、０．０００２２、０．０００２１、０．０００２、０．０００１９、０．０００１８、０．０００１７、０．０００１６、０．０００１５、０．０００１４、０．０００１３、０．０００１２、０．０００１１、０．０００１、０．００００９９、０．００００９８、０．００００９７、０．００００９６、０．００００９５、０．００００９４、０．００００９３、０．００００９２、０．００００９１、０．００００９、０．００００８９、０．００００８８、０．００００８７、０．００００８６、０．００００８５、０．００００８４、０．００００８３、０．００００８２、０．００００８１、０．００００８、０．００００７９、０．００００７８、０．００００７７、０．００００７６、０．００００７５、０．００００７４、０．００００７３、０．００００７２、０．００００７１、０．００００７、０．００００６９、０．００００６８、０．００００６７、０．００００６６、０．００００６５、０．００００６４、０．００００６３、０．００００６２、０．００００６１、０．００００６、０．００００５９、０．００００５８、０．００００５７、０．００００５６、０．００００５５、０．００００５４、０．００００５３、０．００００５２、０．００００５１、０．００００５、０．００００４９、０．００００４８、０．００００４７、０．００００４６、０．００００４５、０．００００４４、０．００００４３、０．００００４２、０．００００４１、０．００００４、０．００００３９、０．００００３８、０．００００３７、０．００００３６、０．００００３５、０．００００３４、０．００００３３、０．００００３２、０．００００３１、０．００００３、０．００００２９、０．００００２８、０．００００２７、０．００００２６、０．００００２５、０．００００２４、０．００００２３、０．００００２２、０．００００２１、０．００００２、０．００００１９、０．００００１８、０．００００１７、０．００００１６、０．００００１５、０．００００１４、０．００００１３、０．００００１２、０．００００１１、０．００００１、０．０００００９９、０．０００００９８、０．０００００９７、０．０００００９６、０．０００００９５、０．０００００９４、０．０００００９３、０．０００００９２、０．０００００９１、０．０００００９、０．０００００８９、０．０００００８８、０．０００００８７、０．０００００８６、０．０００００８５、０．０００００８４、０．０００００８３、０．０００００８２、０．０００００８１、０．０００００８、０．０００００７９、０．０００００７８、０．０００００７７、０．０００００７６、０．０００００７５、０．０００００７４、０．０００００７３、０．０００００７２、０．０００００７１、０．０００００７、０．０００００６９、０．０００００６８、０．０００００６７、０．０００００６６、０．０００００６５、０．０００００６４、０．０００００６３、０．０００００６２、０．０００００６１、０．０００００６、０．０００００５９、０．０００００５８、０．０００００５７、０．０００００５６、０．０００００５５、０．０００００５４、０．０００００５３、０．０００００５２、０．０００００５１、０．０００００５、０．０００００４９、０．０００００４８、０．０００００４７、０．０００００４６、０．０００００４５、０．０００００４４、０．０００００４３、０．０００００４２、０．０００００４１、０．０００００４、０．０００００３９、０．０００００３８、０．０００００３７、０．０００００３６、０．０００００３５、０．０００００３４、０．０００００３３、０．０００００３２、０．０００００３１、０．０００００３、０．０００００２９、０．０００００２８、０．０００００２７、０．０００００２６、０．０００００２５、０．０００００２４、０．０００００２３、０．０００００２２、０．０００００２１、０．０００００２、０．０００００１９、０．０００００１８、０．０００００１７、０．０００００１６、０．０００００１５、０．０００００１４、０．０００００１３、０．０００００１２、０．０００００１１、０．０００００１、０．０００００１、９ｅ－７、８ｅ－７、７ｅ－７、６ｅ－７、５ｅ－７、４ｅ－７、３ｅ－７、２ｅ－７、１ｅ－７、９ｅ－８、８ｅ－８、７ｅ－８、６ｅ－８、５ｅ－８、４ｅ－８、３ｅ－８、２ｅ－８、１ｅ－８、９ｅ－９、８ｅ－９、７ｅ－９、６ｅ－９、５ｅ－９、４ｅ－９、３ｅ－９、２ｅ－９、１ｅ－９、９ｅ－１０、８ｅ－１０、７ｅ－１０、６ｅ－１０、５ｅ－１０、４ｅ－１０、３ｅ－１０、２ｅ－１０、１ｅ－１０未満である。他の実施形態では、ＭＯＩは、提供されるいずれかの２つのＭＯＩ間の範囲である。他の実施形態では、培養物に添加されるｒＢＶ粒子の数は、１ビリオン、２ビリオン、３ビリオン、４ビリオン、５ビリオン、６ビリオン、７ビリオン、８ビリオン、９ビリオン、又は１０ビリオンである。他の実施形態では、培養物に添加されるｒＢＶ粒子の数は、０．０１ ＭＯＩ～１ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～２ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～３ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～４ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～５ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～６ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～７ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～８ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～９ビリオン、０．０１ ＭＯＩ～１０ビリオンの範囲である。
【0110】
様々な実施形態では、０．０１未満のＰ０ ｒＢＶ又はｒＢＶのＭＯＩの使用は、ｒＡＡＶ力価が少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％、少なくとも５０００％、少なくとも１００００％、少なくとも１０００００％、少なくとも７ｌｏｇ増加、少なくとも８ｌｏｇ増加、又は少なくとも９ｌｏｇ増加する結果となる。例えば、ｒＡＡＶ力価の増加は、１以上の継代又は０．０１以上のｒＢＶのＭＯＩでのｒＢＶに対してである。
【0111】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶ産生のために細胞を感染させるように使用されるｒＢＶとしては、ｒＡＡＶベクターゲノムについてのヌクレオチド配列を有する第１のｒＢＶと、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する１つ以上の第２のｒＢＶとが挙げられる。様々な実施形態では、細胞は、０．０１～１０．０、０．０５～７．５、０．１～５、０．５～５、０．７～３．０、０．８～３．０、０．９～３．０、又は１．０～３．０の範囲の第１のｒＢＶのＭＯＩ：１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの比で感染する。他の実施形態では、第１のｒＢＶのＭＯＩ：１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの比は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０である。他の実施形態では、比は、上記の任意の２つの比の間の範囲である。
【0112】
様々な実施形態では、異なる実施形態の方法によって生成されたｒＡＡＶは、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノム１ナノグラム当たり１Ｅ－９ナノグラム未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノム１ナノグラム当たり１Ｅ－１０ナノグラム未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノム１ナノグラム当たり１Ｅ－１１ナノグラム未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノム１ナノグラム当たり１Ｅ－１２ナノグラム未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノム１ナノグラム当たり１Ｅ－１３ナノグラム未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノム１ナノグラム当たり１Ｅ－１４ナノグラム未満、又はキャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノム１ナノグラム当たり１Ｅ－１５ナノグラム未満のキャプシド化バキュロウイルスヌクレオチド配列の濃度を有する。他の実施形態では、異なる実施形態の方法によって生成されたｒＡＡＶは、規制当局（例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）など）による規制承認のために少なくとも許容レベルであるキャプシド化バキュロウイルスヌクレオチド配列の濃度を有する。
【0113】
様々な実施形態では、異なる実施形態の方法によって生成されたｒＡＡＶは、バキュロウイルスＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一部分をコードするキャプシド化バキュロウイルスヌクレオチド配列の濃度を有し、これは、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－３コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－４コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－６コピー未満、１Ｅ－７コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－８コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－９コピー未満、又はキャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－１０コピー未満である。他の実施形態では、異なる実施形態の方法によって生成されたｒＡＡＶは、規制当局（例えば、ＦＤＡ、ＥＭＡなど）による規制承認のために少なくとも許容されるレベルである、バキュロウイルスＤＮＡポリメラーゼの少なくとも一部分をコードするキャプシド化バキュロウイルスヌクレオチド配列の濃度を有する。
【0114】
様々な実施形態では、異なる実施形態の方法によって生成されたｒＡＡＶは、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－３コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり５Ｅ－３コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－４コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり５Ｅ－４コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり２Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり３Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり４Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり５Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり６Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり７Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり８Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり９Ｅ－５コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－６コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり５Ｅ－６コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－７コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり５Ｅ－７コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり１Ｅ－８コピー未満、キャプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムのコピー当たり５Ｅ－８コピー未満のキャプシド化細胞１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子ヌクレオチド配列の濃度を有する。他の実施形態では、異なる実施形態の方法によって生成されたｒＡＡＶは、規制当局（例えば、ＦＤＡ、ＥＭＡなど）による規制承認のために少なくとも許容されるレベルであるキャプシド化細胞１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列の濃度を有する。
【0115】
様々な実施形態では、ｒＢＶに感染した細胞を、ｒＡＡＶが収集される前に所定の期間培養する。例えば、ｒＡＡＶウイルス粒子は、感染の約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約１４４時間、約１６８時間、約１９２時間、約２１６時間、約２４０時間、又はこれらの２つの時点のうちのいずれかの間の時間後に収集され得る。
【0116】
様々な実施形態では、様々な実施形態の培養ステップ（例えば、Ｓｆ９細胞又はＥ．ｃｏｌｉ）は、少なくとも５ｍＬ、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも２０ｍＬ、少なくとも５０ｍＬ、少なくとも１００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも１リットル（Ｌ）、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、又は少なくとも２５００Ｌの量で発生する。
【0117】
実施例では、培養ステップ（例えば、Ｓｆ９細胞又はＥ．ｃｏｌｉ）は、スピンチューブ（複数可）又は振盪フラスコ（複数可）で発生することができる。様々な実施形態では、いずれかの態様又は実施形態の培養ステップは、０．０００１ｍＬ、０．０００５ｍＬ、０．００１ｍＬ、０．００５ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、又は５Ｌの量で発生する。他の実施形態では、培養ステップの量は、上記で提供されるいずれかの２つの量の間の範囲である。
【0118】
他の実施例では、培養ステップ（例えば、Ｓｆ９細胞又はＥ．ｃｏｌｉ）は、１つ又は複数のバイオリアクター内で発生し得る。様々な実施形態では、いずれかの態様又は実施形態の培養ステップは、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、６Ｌ、７Ｌ、８Ｌ、９Ｌ、１０Ｌ、１１Ｌ、１２Ｌ、１３Ｌ、１４Ｌ、１５Ｌ、１６Ｌ、１７Ｌ、１８Ｌ、１９Ｌ、２０Ｌ、２１Ｌ、２２Ｌ、２３Ｌ、２４Ｌ、２５Ｌ、２６Ｌ、２７Ｌ、２８Ｌ、２９Ｌ、３０Ｌ、３１Ｌ、３２Ｌ、３３Ｌ、３４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３７Ｌ、３８Ｌ、３９Ｌ、４０Ｌ、４１Ｌ、４２Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、４５Ｌ、４６Ｌ、４７Ｌ、４８Ｌ、４９Ｌ、５０Ｌ、５１Ｌ、５２Ｌ、５３Ｌ、５４Ｌ、５５Ｌ、５６Ｌ、５７Ｌ、５８Ｌ、５９Ｌ、６０Ｌ、６１Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７２Ｌ、７３Ｌ、７４Ｌ、７５Ｌ、７６Ｌ、７７Ｌ、７８Ｌ、７９Ｌ、８０Ｌ、８１Ｌ、８２Ｌ、８３Ｌ、８４Ｌ、８５Ｌ、８６Ｌ、８７Ｌ、８８Ｌ、８９Ｌ、９０Ｌ、９１Ｌ、９２Ｌ、９３Ｌ、９４Ｌ、９５Ｌ、９６Ｌ、９７Ｌ、９８Ｌ、９９Ｌ、１００Ｌ、１１０Ｌ、１２０Ｌ、１３０Ｌ、１４０Ｌ、１５０Ｌ、１６０Ｌ、１７０Ｌ、１８０Ｌ、１９０Ｌ、２００Ｌ、２１０Ｌ、２２０Ｌ、２３０Ｌ、２４０Ｌ、２５０Ｌ、２６０Ｌ、２７０Ｌ、２８０Ｌ、２９０Ｌ、３００Ｌ、３１０Ｌ、３２０Ｌ、３３０Ｌ、３４０Ｌ、３５０Ｌ、３６０Ｌ、３７０Ｌ、３８０Ｌ、３９０Ｌ、４００Ｌ、４１０Ｌ、４２０Ｌ、４３０Ｌ、４４０Ｌ、４５０Ｌ、４６０Ｌ、４７０Ｌ、４８０Ｌ、４９０Ｌ、５００Ｌ、５１０Ｌ、５２０Ｌ、５３０Ｌ、５４０Ｌ、５５０Ｌ、５６０Ｌ、５７０Ｌ、５８０Ｌ、５９０Ｌ、６００Ｌ、６１０Ｌ、６２０Ｌ、６３０Ｌ、６４０Ｌ、６５０Ｌ、６６０Ｌ、６７０Ｌ、６８０Ｌ、６９０Ｌ、７００Ｌ、７１０Ｌ、７２０Ｌ、７３０Ｌ、７４０Ｌ、７５０Ｌ、７６０Ｌ、７７０Ｌ、７８０Ｌ、７９０Ｌ、８００Ｌ、８１０Ｌ、８２０Ｌ、８３０Ｌ、８４０Ｌ、８５０Ｌ、８６０Ｌ、８７０Ｌ、８８０Ｌ、８９０Ｌ、９００Ｌ、９１０Ｌ、９２０Ｌ、９３０Ｌ、９４０Ｌ、９５０Ｌ、９６０Ｌ、９７０Ｌ、９８０Ｌ、９９０Ｌ、１０００Ｌ、１０１０Ｌ、１０２０Ｌ、１０３０Ｌ、１０４０Ｌ、１０５０Ｌ、１０６０Ｌ、１０７０Ｌ、１０８０Ｌ、１０９０Ｌ、１１００Ｌ、１１１０Ｌ、１１２０Ｌ、１１３０Ｌ、１１４０Ｌ、１１５０Ｌ、１１６０Ｌ、１１７０Ｌ、１１８０Ｌ、１１９０Ｌ、１２００Ｌ、１２１０Ｌ、１２２０Ｌ、１２３０Ｌ、１２４０Ｌ、１２５０Ｌ、１２６０Ｌ、１２７０Ｌ、１２８０Ｌ、１２９０Ｌ、１３００Ｌ、１３１０Ｌ、１３２０Ｌ、１３３０Ｌ、１３４０Ｌ、１３５０Ｌ、１３６０Ｌ、１３７０Ｌ、１３８０Ｌ、１３９０Ｌ、１４００Ｌ、１４１０Ｌ、１４２０Ｌ、１４３０Ｌ、１４４０Ｌ、１４５０Ｌ、１４６０Ｌ、１４７０Ｌ、１４８０Ｌ、１４９０Ｌ、１５００Ｌ、１５１０Ｌ、１５２０Ｌ、１５３０Ｌ、１５４０Ｌ、１５５０Ｌ、１５６０Ｌ、１５７０Ｌ、１５８０Ｌ、１５９０Ｌ、１６００Ｌ、１６１０Ｌ、１６２０Ｌ、１６３０Ｌ、１６４０Ｌ、１６５０Ｌ、１６６０Ｌ、１６７０Ｌ、１６８０Ｌ、１６９０Ｌ、１７００Ｌ、１７１０Ｌ、１７２０Ｌ、１７３０Ｌ、１７４０Ｌ、１７５０Ｌ、１７６０Ｌ、１７７０Ｌ、１７８０Ｌ、１７９０Ｌ、１８００Ｌ、１８１０Ｌ、１８２０Ｌ、１８３０Ｌ、１８４０Ｌ、１８５０Ｌ、１８６０Ｌ、１８７０Ｌ、１８８０Ｌ、１８９０Ｌ、１９００Ｌ、１９１０Ｌ、１９２０Ｌ、１９３０Ｌ、１９４０Ｌ、１９５０Ｌ、１９６０Ｌ、１９７０Ｌ、１９８０Ｌ、１９９０Ｌ、２０００Ｌ、２０１０Ｌ、２０２０Ｌ、２０３０Ｌ、２０４０Ｌ、２０５０Ｌ、２０６０Ｌ、２０７０Ｌ、２０８０Ｌ、２０９０Ｌ、２１００Ｌ、２１１０Ｌ、２１２０Ｌ、２１３０Ｌ、２１４０Ｌ、２１５０Ｌ、２１６０Ｌ、２１７０Ｌ、２１８０Ｌ、２１９０Ｌ、２２００Ｌ、２２１０Ｌ、２２２０Ｌ、２２３０Ｌ、２２４０Ｌ、２２５０Ｌ、２２６０Ｌ、２２７０Ｌ、２２８０Ｌ、２２９０Ｌ、２３００Ｌ、２３１０Ｌ、２３２０Ｌ、２３３０Ｌ、２３４０Ｌ、２３５０Ｌ、２３６０Ｌ、２３７０Ｌ、２３８０Ｌ、２３９０Ｌ、２４００Ｌ、２４１０Ｌ、２４２０Ｌ、２４３０Ｌ、２４４０Ｌ、２４５０Ｌ、２４６０Ｌ、２４７０Ｌ、２４８０Ｌ、２４９０Ｌ、２５００Ｌ、２５１０Ｌ、２５２０Ｌ、２５３０Ｌ、２５４０Ｌ、２５５０Ｌ、２５６０Ｌ、２５７０Ｌ、２５８０Ｌ、２５９０Ｌ、２６００Ｌ、２６１０Ｌ、２６２０Ｌ、２６３０Ｌ、２６４０Ｌ、２６５０Ｌ、２６６０Ｌ、２６７０Ｌ、２６８０Ｌ、２６９０Ｌ、２７００Ｌ、２７１０Ｌ、２７２０Ｌ、２７３０Ｌ、２７４０Ｌ、２７５０Ｌ、２７６０Ｌ、２７７０Ｌ、２７８０Ｌ、２７９０Ｌ、２８００Ｌ、２８１０Ｌ、２８２０Ｌ、２８３０Ｌ、２８４０Ｌ、２８５０Ｌ、２８６０Ｌ、２８７０Ｌ、２８８０Ｌ、２８９０Ｌ、２９００Ｌ、２９１０Ｌ、２９２０Ｌ、２９３０Ｌ、２９４０Ｌ、２９５０Ｌ、２９６０Ｌ、２９７０Ｌ、２９８０Ｌ、２９９０Ｌ、又は３０００Ｌの量で発生する。他の実施形態では、培養ステップの量は、上記で提供されるいずれかの２つの量の間の範囲である。
【0119】
様々な実施形態では、ｒＢＶの力価は、フォーカス／ウイルスプラークアッセイを使用して決定される。このアッセイは、細胞を、ｒＢＶを含有する溶液の段階希釈液で感染させるステップを、最初に含む。感染が所定の時間にわたって発生した後に、ｒＢＶは、培養物から除去され、細胞が、所定の時間にわたってインキュベートされる。所定の時間が経過した後に、（例えば、アガロースを含有する）プラーク培地が、培養物に付加され、硬化させる。細胞は、所定の時間にわたって更にインキュベートされ、プラークの数が、所定の時間後にカウントされる。力価は、以下の式を使用して計算される。
【0120】
力価（プラーク形成単位／ｍＬ）＝プラークの数×希釈係数×（１／（接種物のｍＬ／ウェル）
【0121】
上記のプロセスを含むｒＡＡＶを産生する任意のプロセスについて、不純物はまた、治療上有効なｒＡＡＶ粒子を有する組成物中で産生されるか、又は見出される。したがって、ｒＡＡＶ産生不純物は、治療上有効でないｒＡＡＶ粒子、外因性高分子量ＤＮＡ、小ポリヌクレオチド、タンパク質、緩衝液成分などを含むことができる。
【0122】
ｒＡＡＶのｒＢＶベースの産生に関する他の実施形態も開示される。
【0123】
様々な実施形態では、ｒＡＡＶの産生を増加させ、産生されたｒＡＡＶ内にキャプシド化されたポリヌクレオチド不純物を低減するための方法が開示される。方法は、異なる細胞培養物を、ｒＡＡＶベクターゲノムのヌクレオチド配列を有するｒＢＶと、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する１つ以上の第２のｒＢＶとに感染させるステップを含む。各細胞培養物は、第１のｒＢＶの感染多重度（ＭＯＩ）：１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの異なる比で、第１のｒＢＶ及び１つ以上の第２のｒＢＶに感染する。この方法はまた、異なる細胞培養物からｒＡＡＶを単離するステップと、異なる細胞培養物からの単離されたｒＡＡＶの力価を決定するステップと、異なる細胞培養物からの単離されたｒＡＡＶ内のキャプシド化ヌクレオチド不純物の濃度を決定するステップと、両方の決定するステップから第１のｒＢＶのＭＯＩ：１つ以上の第２のｒＢＶのＭＯＩの１つ以上の比（複数可）を特定するステップと、を含む。
【0124】
様々な実施形態では、ｒＢＶ力価を測定するためのインジケーター細胞は、バキュロウイルス感染によって活性化される誘導性バキュロウイルスプロモーター配列に作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を含む。誘導性バキュロウイルスプロモーター配列は、初期バキュロウイルスプロモーター配列及び中間バキュロウイルスプロモーター配列のうちの少なくとも１つから選択される。レポーターヌクレオチド配列及び誘導性バキュロウイルスプロモーター配列は、インジケーター細胞内で安定して維持される。様々な実施形態のレポーターヌクレオチド配列及び様々な実施形態の誘導性バキュロウイルスプロモーター配列は、インジケーター細胞内で安定して維持される（例えば、エピソームミニサークルなどのエピソーム発現）。他の実施形態では、レポーターヌクレオチド配列及び誘導性バキュロウイルスプロモーター配列は、インジケーター細胞のゲノムに安定して組み込まれる。様々な例では、異なる実施形態のレポーターヌクレオチド配列は、レポータータンパク質をコードする。レポータータンパク質の例としては、蛍光タンパク質、発光タンパク質、又は組織化学（例えば、免疫組織化学、免疫組織化学など）で使用されるタンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質の更なる例としては、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。様々な実施例では、誘導性バキュロウイルスプロモーター配列は、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、ｇｐ６４プロモーター、Ｐｏｌｈプロモーター、及びｐ１０プロモーターのうちの少なくとも１つから選択される。異なる実施形態の誘導性バキュロウイルスプロモーター配列はまた、転写発現を制御するために、他の発現制御エレメント（複数可）に配置される。
【0125】
異なる実施例では、インジケーター細胞は、配列番号１、２、又は３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９超％、又は１００％同一であるプロモーターヌクレオチド配列を含む。
【0126】
様々な実施形態では、異なる実施形態のレポーターヌクレオチド配列は、バキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結され、バキュロウイルス由来エンハンサー配列は、インジケーター細胞内で安定して維持される。様々な実施形態のバキュロウイルス由来エンハンサー配列は、インジケーター細胞内で安定して維持される（例えば、エピソームミニサークルなどのエピソーム発現）。他の実施形態では、バキュロウイルス由来エンハンサー配列は、インジケーター細胞のゲノムに安定して組み込まれる。様々な実施形態のバキュロウイルス由来エンハンサー配列の例としては、ＨＲ１、ＨＲ１ａ、ＨＲ２、ＨＲ２ａ、ＨＲ３、ＨＲ４ａ、ＨＲ４ｂ、ＨＲ４ｃ、ＨＲ５などの相同領域（ＨＲ）エンハンサー配列が挙げられる。例えば、プロモーター、相同領域エレメント、及び／又はアセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する発現カセットは、昆虫細胞のバキュロウイルス感染が発現カセットからの転写発現を誘導するように、昆虫細胞のゲノムに安定して組み込むことができる（ＵＳ２０１２／０１００６０６参照されたい）。
【0127】
様々な実施形態では、異なる実施形態のｒＢＶ力価を測定するためのインジケーター細胞は、異なる実施形態のレポーターヌクレオチド配列、異なる実施形態の誘導性バキュロウイルスプロモーター配列、又は異なる実施形態のバキュロウイルス由来エンハンサー配列（例えば、陽性抗生物質選択、選択マーカーなど）を有する細胞を選択するための１つ以上のエレメントを提供又はコードする１つ以上のヌクレオチド配列を更に含む。異なる実施例では、１つの選択エレメントは、１つの細胞タイプ（例えば、Ｓｆ９細胞）における選択のためであり得、別の選択エレメントは、別の細胞タイプ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためであり得る。異なる実施形態のヌクレオチド配列、並びに異なる実施形態の細胞を選択するためのエレメントの例を以下に提供する。耐性遺伝子及びタンパク質などのエレメントが利用可能な真核生物選択抗生物質の例としては、ブラスチジン（ブラスチジン－Ｓデアミナーゼをコードするブラスチジン耐性遺伝子（ｂｓｒ））、ジェネチシン（アミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼをコードするＴｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ＡＰＨ ３’ＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（ハイグロマイシン－Ｂ ４－Ｏキナーゼをコードするｈｐｈ遺伝子）、ピューロマイシン（ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＰａｃ遺伝子）、フレオマイシン（Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子）、又はゼオシン（Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子）が挙げられる。耐性遺伝子及びタンパク質などのエレメントが利用可能な細菌選択抗生物質の例としては、カナマイシン（ＫａｎＲ－Ｔｎ５遺伝子産物（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ））、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン（β－ラクタマーゼをコードするｂｌａ遺伝子）、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン（テトラサイクリン抑制タンパク質をコードするＴｅｔＲ－Ｔｎ１０遺伝子）、及びクロラムフェニコールが挙げられる。
【0128】
様々な実施形態では、異なる実施形態のｒＢＶ力価を測定するためのインジケーター細胞（複数可）を生成するための方法が開示される。この方法は、バキュロウイルス感染によって活性化された誘導性バキュロウイルスプロモーター配列に作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を含むベクターをトランスフェクトするステップを含む。異なる実施形態のレポーターヌクレオチド配列は、異なる実施形態のバキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結される。様々な実施形態では、ベクターは、発現制御配列に作動可能に連結された耐性ヌクレオチド配列を更に含み、この方法は、細胞を培養するステップと、ベクターが安定して維持されている少なくとも１つの細胞を正に選択するステップと、を更に含む。他の実施形態では、方法は、細胞を培養するステップと、培養物から細胞を単離するステップと、単離された細胞を別々に培養するステップと、を更に含む。
【0129】
様々な実施形態では、ｒＢＶ力価を測定するための方法は、細胞をｒＢＶに感染させるステップを含む。様々な実施形態のインジケーター細胞は、バキュロウイルス感染によって活性化された誘導性バキュロウイルスプロモーター配列に作動可能に連結されたレポーターヌクレオチド配列を含む。早期バキュロウイルスプロモーター配列及び中間バキュロウイルスプロモーター配列のうちの少なくとも１つから選択された誘導性バキュロウイルスプロモーター配列。異なる実施形態のレポーターヌクレオチド配列は、異なる実施形態のバキュロウイルス由来エンハンサー配列に作動可能に連結される。様々な実施形態の方法はまた、レポーターヌクレオチド配列の発現を測定するステップと、レポーターヌクレオチド配列の発現からｒＢＶ力価を決定するステップと、を含む。例えば、レポーターヌクレオチド配列は、フローサイトメトリーを使用して測定される。他の実施形態では、決定するステップは、感染させるステップの３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上後に起こる。
【0130】
概して、ｖｇ及びキャプシド（ｃｐ）力価は、それぞれのｖｇ及びキャプシドを測定するのに好適であるいずれかの様式で評価され得る。例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）が、ｖｇ力価を測定するために使用され得、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、Ｃｐ力価を測定するために使用され得る。代替的に、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）－ＨＰＬＣが、ｖｇ及びｃｐ力価を測定するために使用され得る。加えて、ＲＰ（逆相）－ＨＰＬＣアッセイが、ＶＰ比へのプロセスパラメータの潜在的な影響を評価するために使用され得る。
【0131】
ｑＰＣＲが、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムなどの標準的なｑＰＣＲシステムを使用する、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によるｖｇ定量化のために使用され得る。代替的に、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が、Ｖｇ定量化のために使用され得る。プライマー及びプローブは、ＡＡＶのＤＮＡを標的とするように設計され得、ＰＣＲ中に、ＤＮＡが蓄積されたときに、ＤＮＡの定量化を可能にする。ｄｄＰＣＲの例は、Ｐａｓｉ，Ｋ．Ｊｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｙｅａｒ Ｆｏｌｌｏｗ－Ｕｐ ｏｆ ＡＡＶ５－ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ．”Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３８２．１（２０２０）：２９－４０、Ｒｅｇａｎ，Ｊｏｈｎ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．“Ａ Ｒａｐｉｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ １０．３（２０１５）：ｅ０１１８２７０、及びＦｕｒｕｔａ－Ｈａｎａｗａ，Ｂｉｒｅｉ，Ｔｅｒｕｈｉｄｅ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，ａｎｄ Ｅｒｉｋｏ Ｕｃｈｉｄａ．“Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ３０．４（２０１９）：１２７－１３６に記載されている。ｖｇ定量化のための他のシステムは、ＳＥＣ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、及びサイズ交換クロマトグラフィー多角度光散乱を含み、これらの全ては、全体が参照により援用されるＷＯ２０２１／０６２１６４に記載されている。
【0132】
キャプシドＥＬＩＳＡ（ｃｐ－ＥＬＩＳＡ）アッセイは、インタクトなキャプシドを、例えば、ＡＡＶ５キャプシドＥＬＩＳＡ方法を使用して測定し、市販のキット（例えば、Ｐｒｏｇｅｎ ＰＲＡＡＶ５）を利用し得る。このキットＥＬＩＳＡは、アセンブルされたＡＡＶ５又は他のキャプシド上のコンフォメーションエピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用する。キャプシドは、プレート結合モノクローナル抗体上で捕捉され得、続いて、検出抗体の後続の結合が行われる。アッセイシグナルは、コンジュゲートストレプトアビジンペルオキシダーゼを付加し、続いて、比色ＴＭＢ基質溶液及び硫酸を付加して、反応を終了することによって生成され得る。試験試料の力価は、標的キャプシド標準物の４パラメータ較正曲線から補間される。キャプシド力価を定量化するための別のシステムは、ＷＯ２０２１／０６２１６４に記載されているＳＥＣ－ＭＡＬＳである。
【0133】
本発明は、以下の実施例で更に説明され、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例1】
【0134】
ｒＡＡＶ産生のために超低ＭＯＩでの継代０（Ｐ０）ｒＢＶを使用する
【0135】
バクミドの構築及び産生：Ｒｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードし、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を有するｒＡＡＶベクターゲノムを提供するＤＮＡ配列を、ドナープラスミドにクローニングした。次いで、ドナープラスミドを使用して、ＤＨ１０ＢａｃコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、ｒｅｐ及びｃａｐをコードするＤＮＡ配列を有するバクミドを生成し、プロモーターの下でＧＯＩを有する２つのＩＴＲに隣接するｒＡＡＶベクターゲノムを提供した。異なるＥ．ｃｏｌｉクローン由来のバクミドを単離し、サンガー配列決定技法を介して分析して、正しいヌクレオチド配列を有するクローンを選択した。正しいヌクレオチド配列を有するＥ．ｃｏｌｉクローンを使用して、マスターバクミドＥ．ｃｏｌｉ細胞バンク及びワーキングバクミドＥ．ｃｏｌｉ細胞バンクを生成した。
【0136】
Ｐ０ ｒＢＶ産生のためのバクミドを生成するために、マスターバクミドＥ．ｃｏｌｉ細胞バンク又はワーキングバクミドＥ．ｃｏｌｉ細胞バンクのいずれかからのバイアルを解凍し、培養物に入れた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を所定の細胞密度まで培養した後、細胞を濃縮し、溶解した。バクミドを、異なるクロマトグラフィー及び濾過プロセスを使用して溶解細胞から単離した。
【0137】
Ｐ０ ｒＢＶの産生：継代０（Ｐ０）ｒＢＶ産生ステップでは、Ｓｆ９細胞を培養物に入れ、所定の細胞密度に拡張した。次いで、Ｓｆ９細胞を、トランスフェクション試薬を使用して、生成されたバクミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされたＳｆ９細胞を所定の時間培養して、Ｐ０ ｒＢＶを生成した。Ｐ０ ｒＢＶを、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を使用して分析して、Ｐ０ ｒＢＶのゲノムがｒＡＡＶ産生のためのヌクレオチド配列の欠失を含有するかどうかを決定した。ｒＢＶのその後の継代は、Ｒｅｐタンパク質又はキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するｒＢＶゲノムの欠失をもたらしたか、又はＧＯＩを有するｒＡＡＶベクターゲノムを提供したことが注目された。所定の時間に、ｒＢＶを遠心分離を使用して細胞培養物から単離し、１５℃未満で保存した。
【0138】
ｒＡＡＶの産生：ｒＡＡＶ産生のために、Ｓｆ９細胞を培養物に入れ、所定の細胞密度に拡張した。培養されたＳｆ９細胞が所定の細胞密度に達したとき、Ｒｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有し、ＧＯＩを有するｒＡＡＶベクターゲノムを提供するｒＢＶを培養物に添加した。異なるｒＡＡＶ産生において、ｒＢＶを、０．１～１ｅ－１０の範囲から選択された異なるＭＯＩ（例えば、細胞数に対するｒＢＶ粒子数）で培養物に添加した。
【0139】
Ｓｆ９細胞をｒＢＶに感染させた後、細胞を所定時間培養してｒＡＡＶを生成した。所定の時間が経過した後、ｒＡＡＶを含有する上清を回収し、ヌクレアーゼで処理し、異なるデプスフィルターを使用して濾過した。次いで、親和性クロマトグラフィーを使用して、ｒＡＡＶを上清から単離した。Ｐ０ ｒＢＶを生成する、Ｅ．ｃｏｌｉでバクミドを増殖させてトランスフェクションのためにそれらを単離する、Ｓｆ９細胞（５ｍＬ以上）でバクミドをトランスフェクトしてＰ０ ｒＢＶを生成する、又はＳｆ９細胞を０．０１未満のＭＯＩでｒＢＶに感染させるための、バクミドＥ．ｃｏｌｉ細胞バンクの使用は、ｒＢＶの安定性を実質的に改善し、Ｓｆ９細胞におけるｒＡＡＶの産生並びに生成されたｒＡＡＶの感染性を実質的に改善した。
【0140】
ｒＡＡＶ産生におけるｒＢＶ継代の分析：バキュロウイルス感染昆虫細胞系（ＢＩＩＣ）を使用して、ｒＢＶの異なる継代を含有するＢＩＩＣを分析した。特に、４つの継代レベルにまたがり、ＧＯＩ、Ｒｅｐ、及びＣａｐを提供する／コードするＢＩＩＣを使用して、ｒＡＡＶを産生した。ＢＩＩＣを、１：５００のＭＯＩでナイーブＳｆ９細胞と共培養し、各ＢＩＩＣは、およそ数百のｒＢＶを放出することができると理解される。最低継代のＢＩＩＣは、およそ９．５５×１０ｅ１１ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ力価をもたらす。次の継代のＢＩＩＣは、およそ１．８×１０ｅ１１ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ力価をもたらす。次の継代のＢＩＩＣは、およそ３．８×１０ｅ１０ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ力価をもたらす。最高継代のＢＩＩＣは、およそ５．２×１０ｅ９ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ力価をもたらす。したがって、ｒＢＶの連続通過は、ＡＡＶ力価を低減し、ＢＩＩＣをｒＡＡＶの大規模産生に不十分にする。
【0141】
ＢＩＩＣに関連する制限を克服するために、高力価ｒＢＶを産生するための出発物質としてバクミドを用いる新規ｒＡＡＶ産生プロセスを開発した。ｒＢＶストックは、各産生実行中に振盪懸濁培養物中でＳｆ９細胞をトランスフェクトすることによってプロセス中に生成され、２，０００Ｌの産生タンクを低ＭＯＩで感染させるのに十分なｒＢＶ力価をもたらす。ｒＢＶ継代を、ＢＩＩＣ増殖又はｒＢＶストック増幅のいずれかの形態で排除することによって、ｒＢＶをＳｆ９産生培養物に感染させるために利用した後、ｒＢＶ固有の不安定性が、得られるｒＡＡＶ力価に著しく影響を及ぼすことができる。したがって、低継代ＢＩＩＣＳに由来するｒＢＶで達成可能なものと同等以上のｒＡＡＶ力価を達成したが、スケーラビリティ及び供給に制限はなかった。
【0142】
ＧＯＩ、Ｒｅｐ、及びＣａｐを提供する／コードするＰ０ ｒＢＶをその後使用して、ｒＡＡＶを生成した。図１に示されるように、ナイーブｓｆ９細胞を、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、及び０．００００１でｒＢＶに感染させた。図１は、Ｓｆ９細胞を０．０１以下のＭＯＩでＰ０ ｒＢＶに感染させると、ｒＡＡＶ力価が著しく改善したことを示す。
【実施例2】
【0143】
インジケーター細胞株の生成
【0144】
プラスミドの構築：ギブソンアセンブリを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ選択カセット、及びｐＩＢ ＣＭＶ ＧＦＰからの昆虫細胞選択カセット、ＡｃＭＮＰＶ Ｅ２ゲノムＫＭ６６７９４０からの相同領域５配列、並びに３９ｋ（配列番号１）、ｐ６．９（配列番号２）、及びＰｏｌｈ（配列番号３）プロモーターを含む断片を連結した。最初に、各々が異なるプロモーター、３９ｋ（図２）、ｐ６．９（図３）、又はＰｏｌｈ（図４）のいずれかを使用して、３つのプラスミドを構築した。各プラスミドは、レポーターカセット、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）選択カセット、及び昆虫細胞選択カセットを含有した。レポーターカセットは、レポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された３９ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、又はＰｏｌｈプロモーターのいずれかを含有した。Ｅ．ｃｏｌｉ選択カセットは、アンピシリン耐性遺伝子に作動可能に連結されたアンピシリン耐性プロモーターを含むアンピシリン耐性カセットであった。昆虫細胞選択カセットは、ＥＭ７プロモーターに作動可能に連結されたブラストサイジン耐性遺伝子を含有した。後で、３つのプラスミドの第２のセットを構築し、そこでＧＦＰ遺伝子を、昆虫細胞での発現のために最適化されたものに置き換えた。プラスミドミニ調製物を正確なアセンブリについて検証し、正しい構築物を持つＥ．ｃｏｌｉクローンをスケールアップし、プラスミドを抽出し、マキシ調製物を使用して精製した。加えて、次いで、トランスフェクションの前に、最適化されたＧＦＰ遺伝子を含有する構築物をＳｃａＩで線形化した。
【0145】
トランスフェクション：トランスフェクションは、６ウェルプレートで実施した。０．５Ｅ６細胞／ｍＬのＳｆ９細胞の２ｍＬ／ウェルをＳＦ９００ ＩＩＩにプレーティングして、１ｅ６細胞／ウェルを得た。５６μＬのＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ試薬を７００ｕＬのＰＢＳ中で希釈し、３μｇの各プラスミドを１００μＬのＰＢＳ中に希釈した。１００μｌの希釈したＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎを、希釈されたプラスミド溶液の各々に添加し、次いで、３０分間室温でインキュベートした。次いで、Ｓｆ９００ＩＩＩ（０．８ｍＬ）をプラスミド溶液に添加し、プレート中の培地を除去し、プラスミド溶液で置き換えた。次いで、プレートを２８℃で４～５時間インキュベートした後、ウェルからトランスフェクションミックスを除去し、ウェルに応じて、２５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬのブラストサイジンを含む３ｍＬのＳｆ９００ＩＩＩ培地で置き換えた。次いで、それらを２８℃で更に７２～９６時間インキュベートした。
【0146】
選択：トランスフェクション中に２５μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬのブラストサイジンのいずれかを含む培地中で選択を実施した。細胞を振盪フラスコに移した後、選択的圧力を維持するために、ブラストサイジンの濃度を全ての培養物について２５μｇ／ｍＬのままにした。
【0147】
最初のクローンの特定及びスクリーニング：振盪フラスコからの分裂物を、高いＭＯＩで組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）に感染させ、次いで、１５～９６時間の間の様々な時間でＧＦＰの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。３９ｋ－ｕｎｏｐｔＧＦＰ培養物由来の細胞を希釈し、サブクローニングのために９６ウェルプレートに播種した。細胞を、馴化培地＋２５μｇ／ｍＬのブラストサイジン中で５細胞／ｍＬに希釈し、２０のプレート中で２００μＬ／ウェル（１細胞／ウェル）で播種した。別の１０個のプレートを同じ方法で播種したが、１ｅ４フィーダー細胞／ウェル（トランスフェクトされていないＳｆ９細胞）を添加した。
【0148】
細胞バンキング：０日目に０．５Ｅ６細胞／ｍＬで細胞を播種し、播種後２日目にバンクに入れた。５つのバイアルを、３０Ｅ６細胞／バイアルで調製した。細胞を振盪フラスコから取り出し、３００ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。凍結培地を、７．５％のＤＭＳＯを有する５０％の新鮮培地及び５０％の使用済み培地の濃度で調製した。凍結培地を濾過し、５ｍＬを使用して細胞を再懸濁した。１ｍＬの細胞を各バイアルに添加し、それらを凍結容器に－８０℃で２４時間入れた後、凍結タンクに移した。
【0149】
３９ｋ－ＧＦＰ安定プールのサブクローニング：馴化培地をナイーブＳｆ９細胞（４ｅ６細胞／ｍＬ、３日目培養物）から収穫し、滅菌濾過した。３９ｋ－ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトしたＳｆ９細胞を、馴化培地＋２５μｇ／ｍＬのブラストサイジン中５細胞／ｍＬに希釈し、２０プレート中２００μＬ／ウェル（１細胞／ウェル）で播種した。単一細胞クローンを、９６ウェルプレートに選別し、拡張した。クローンの試料を抽出し、異なるＭＯＩでｒＢＶに感染させた。ＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【0150】
インジケーター細胞株の分析
【0151】
インジケーター細胞を９６ウェルのディープウェルプレートに播種し、続いてバキュロウイルスの連続希釈液で感染させ、シェーカーにて２８℃で１８時間インキュベートした。インジケーター細胞を、３９ｋプロモーターヌクレオチド配列、ｐ６．９プロモーターヌクレオチド配列、又はポリヘドリンプロモーターヌクレオチド配列のいずれかを含有するＧＦＰ発現カセットを有するプラスミドでトランスフェクトした。
【0152】
感染後、細胞を、ＧＦＰの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。図５は、ナイーブＳｆ９細胞のフローサイトメトリー分析からのグラフである。図６は、３９ｋプロモーターヌクレオチド配列を含有するＧＦＰ発現カセットでトランスフェクトしたＳｆ９細胞のフローサイトメトリー分析からのグラフである。これらのＳｆ９細胞は、ｒＢＶに感染させなかった。両方の図について、点線は緑色蛍光を示し、ナイーブＳｆ９細胞も３９ｋプラスミドを有する未感染Ｓｆ９細胞も蛍光を発していなかった。具体的には、細胞の約０．１％が緑色蛍光を示した。
【0153】
図７は、３９ｋプロモーターヌクレオチド配列を含有するＧＦＰ発現カセットでトランスフェクトしたＳｆ９細胞のフローサイトメトリー分析からのグラフである。図８は、ｐ６．９プロモーターヌクレオチド配列を含有するＧＦＰ発現カセットでトランスフェクトしたＳｆ９細胞のフローサイトメトリー分析からのグラフである。図９は、ポリヘドリンプロモーターヌクレオチド配列を含有するＧＦＰ発現カセットでトランスフェクトしたＳｆ９細胞のフローサイトメトリー分析からのグラフである。これらのＳｆ９細胞をｒＢＶに感染させた。これらの図では、点線は緑色蛍光を示し、異なる細胞は蛍光を示した。図７について、３９ｋプロモーター細胞の５５．５％が緑色蛍光を示した。図８について、ｐ６．９プロモーター細胞の１１％が緑色蛍光を示した。図９について、Ｐｏｌｈプロモーター細胞の２％が緑色蛍光を示した。
【0154】
各プロモーターヌクレオチド配列下のＧＦＰ発現を、経時的に測定した。図１０に示されるように、ｒＢＶ感染後１９時間で、３９ｋプロモーター細胞の５５．５％が緑色蛍光を示し、ｐ６．９プロモーター細胞の１１％が緑色蛍光を示し、Ｐｏｌｈプロモーター細胞の２％が緑色蛍光を示した。図１１に示されるように、ｒＢＶ感染後４０時間で、３９ｋプロモーター細胞の６５．４％が緑色蛍光を示し、ｐ６．９プロモーター細胞の１９％が緑色蛍光を示し、Ｐｏｌｈプロモーター細胞の１１％が緑色蛍光を示した。図１２に示されるように、ｒＢＶ感染後６８時間で、３９ｋプロモーター細胞の６６．３％が緑色蛍光を示し、ｐ６．９プロモーター細胞の１９％が緑色蛍光を示し、Ｐｏｌｈプロモーター細胞の１５％が緑色蛍光を示した。図１０、１１、及び１２に示されるように、ｐ６．９及びポリヘドリンプロモーター配列はともに、ＧＦＰ発現の大きな増加を示すが、発現は、３９Ｋプロモーター配列よりも遅い。更に、３９Ｋプロモーター配列は、最高のＧＦＰ発現を示した。
【0155】
図１３は、３９ｋプロモーターの分析からのデータを示し、３９ｋプロモーターを有するレポーターカセットを含む昆虫細胞を、昆虫細胞をｒＢＶに感染させ、所定の期間インキュベートした後、フローサイトメトリーを介してＧＦＰの発現について分析した。ｅＧＦＰを発現する３９ｋプロモーター細胞のパーセンテージは、４１．１％（１５時間）、３９．９％（１８時間）、４０．７％（２４時間）、６８．０％（４３時間）、６６．４％（６５時間）、６７．３％（７０時間）、及び６９．３％（９４時間）であった。また、図１３に示されるように、３９ｋプロモーター下のＧＦＰ発現は、感染の１５時間後という早さで発現される。ＧＦＰ発現が維持されたことが注目され、これは２４時間後の二次的なｒＢＶ感染に起因する可能性がある。この程度まで、アッセイは、二次的なｒＢＶ感染（例えば、２４時間）の前に実施され得る。
【0156】
細胞を、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドでトランスフェクトもして、ヌクレオチド配列を、昆虫細胞におけるＧＦＰの発現のためにコドン最適化した。これらのヌクレオチド配列は、３９Ｋ及びＰｏｌｈプロモーターに作動可能に連結された。図１４、１５、及び１６に示されるように、コドン最適化ＧＦＰヌクレオチド配列の使用は、３９Ｋ及びＰｏｌｈプロモーターのＧＦＰ発現を増加させた。図１４に示されるように、２０時間で、３９ｋプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを５６．５％から５７．８％に増加させ、ＰｏｌＨプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを４．０％から１０．５％に増加させた。図１５に示されるように、２５時間で、３９ｋプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰ発現に本質的に差をもたらさず（５６．６％及び５５．９％）、Ｐｏｌｈプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを４．８％から１２．０％に増加させた。図１６に示されるように、４８時間で、３９ｋプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを５８．５％から５９．３％に増加させ、Ｐｏｌｈプロモーター細胞に対するコドン最適化ｅＧＦＰ配列の使用は、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを１０．９％から１７．５％に増加させた。ＧＦＰの発現は、依然として、３９Ｋプロモーターの方が大きいことが注目された。
【0157】
以下は、インジケーター細胞株を使用したｒＢＶ滴定の例である。Ｐ０バキュロウイルス感染力価は、フローサイトメトリーベースのバキュロウイルス感染力価アッセイ（ＦＣ－ＢＩＴＡ）を使用して測定し、生産を開始するためにＳｆ９細胞に感染するために必要なｒＢＶの体積を計算する。このアッセイは、ｒＢＶに感染するとＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現するＳｆ９細胞株を使用する。ＧＦＰレベルをフローサイトメトリーによって検出し、ポアソン分布を使用して蛍光細胞のパーセンテージをｒＢＶ濃度に変換する。陽性対照が、アッセイ性能を確認するために全てのアッセイで実行される。
【実施例3】
【0158】
ＡＡＶ生産性及びキャプシド化されたバキュロウイルス由来ＤＮＡプロファイルに対するバキュロウイルスＭＯＩの影響
【0159】
組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）の昆虫細胞ベースの産生は、典型的には、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子、及び目的の導入遺伝子をコードするｒＢＶでＳｆ９細胞を感染させることによって達成される。Ｓｆ９産生、ＡＡＶベクター収率、及びＤＮＡ不純物のパッケージングに対するｒＢＶのＭＯＩの効果を評価した。低ＭＯＩでの独立した効果を調査するために、バイオリアクター内で全要素、３レベルの実験を実施し、続いて小規模な試験を行った。全てのｒＢＶについて、１０倍のＭＯＩ範囲（０．００３～０．０３）を調べた。統計分析は、ＡＡＶ５の生産性が、Ｒｅｐ及びＣａｐの初期遺伝子レベルによって正の影響を受けたが、ＧＯＩの初期レベルによって負の影響を受けたことを示した。全キャプシド産生について同様の傾向が観察され、これは条件間の同等のキャプシド対ベクターゲノム比（ｃｐ：ｖｇ）に変換された。ＡＡＶ５におけるＢＶ ＤＮＡ不純物のパッケージングは、ＡＡＶ ＩＴＲから近く（α及びβ）及び遠く（γ及びδ）に位置するＢＶ遺伝子マーカーのコピー数を追跡することによって計算した。結果は、ＭＯＩ効果がＩＴＲからの距離に依存していたことを示唆している。全てのｒＢＶのＭＯＩの増加は、ＩＴＲに近い遺伝子座からのＤＮＡ蓄積（α：ｖｇ及びβ：ｖｇ比）に軽度の負の効果を及ぼした。一方、ＩＴＲから遠い遺伝子座からのＤＮＡ蓄積（γ：ｖｇ及びδ：ｖｇ比）は、Ｒｅｐ初期遺伝子レベルによって正の影響を受け、ＧＯＩ初期レベルによって負の影響を受けた。特定された傾向は、ＢＶのＭＯＩがベクターの生産性及び産物の品質に与える大きな影響を浮き彫りにしている。全体として、我々のデータは、より高いＲｅｐ及びＣａｐ初期レベルが、より高い生産性につながる可能性があるが、共パッケージングされたｒＢＶ ＤＮＡ不純物の追加増加を犠牲にしている可能性があることを示唆している。この負の効果は、同様のＭＯＩで全てのｒＢＶを感染させることによって緩和され得る。我々は、ｒＢＶ ＤＮＡ不純物のパッケージングは、Ｒｅｐ依存性であり、キャプシド化されたｒＢＶ ＤＮＡ不純物のレベルは、Ｒｅｐ濃度に依存すると推測する。
【0160】
序論
ｒＡＡＶは、様々な単一遺伝子障害の効果を治癒又は緩和することを意図した最も有望な治療モダリティのうちの１つである。ＡＡＶの生物学の理解に焦点を当てた広範な科学的証拠、並びにｒＡＡＶの安全性及び有効性の臨床評価は、患者の使用のために遺伝子療法を利用可能にするための現在の努力を支持する［Ａｇｕｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１８；１８：６８１－９３、Ｒａｍｌｏｇａｎ－Ｓｔｅｅｌ ＣＡ ｅｔ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１９；４７：５２１－３６；Ｌｉ Ｃ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２０２０；２１：２５５－７２］。ｒＡＡＶは、プラスミドトランスフェクションによって、ＨＥＫ２９３などの固定依存性哺乳動物細胞株において伝統的に産生されてきた。特定の生産性、プロセスの堅牢性及びスケーラビリティを改善する必要性は、様々な宿主を使用する代替細胞培養プロセスの開発につながった。昆虫細胞／ｒＢＶシステムは、ｒＡＡＶ製造のための最もスケーラブルで生産性の高いもののうちの１つとして多くの人に認識されている。Ｒｏｂｅｒｔ Ｋｏｔｉｎ及びＭａｓａｓｈｉ Ｕｒａｂｅの顕著な論文は、ウイルスベクター産生のための効率的な手段として、昆虫細胞／ＢＶシステムの基礎を確立した［Ｕｒａｂｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；１３：１９３５－４３、Ｕｒａｂｅ Ｍ ｅｔａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００６；８０：１８７４－８５］。彼らのアプローチは、昆虫特異的プロモーターによって制御され、２つ又は３つのバキュロウイルス間のそれらのシス又はトランス調節活性によって分布するＡＡＶ遺伝子の配列を含んでいた。時を経て、いくつかのグループが、組換えＢＶの分子設計を改善する方法を特定し、これはより堅牢なベクター産生につながった［Ｃｈｅｎ Ｈ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００８；１６：９２４－３０、Ｓｍｉｔｈ ＲＨ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００９；１７：１８８８－９６、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１７；２８：１５－２２］。
ｒＡＡＶは、様々な単一遺伝子障害の効果を治癒又は緩和することを意図した最も有望な治療モダリティのうちの１つである。ＡＡＶの生物学の理解に焦点を当てた広範な科学的証拠、並びにｒＡＡＶの安全性及び有効性の臨床評価は、患者の使用のために遺伝子療法を利用可能にするための現在の努力を支持する［Ａｇｕｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１８；１８：６８１－９３、Ｒａｍｌｏｇａｎ－Ｓｔｅｅｌ ＣＡ ｅｔ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１９；４７：５２１－３６；Ｌｉ Ｃ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２０２０；２１：２５５－７２］。ｒＡＡＶは、プラスミドトランスフェクションによって、ＨＥＫ２９３などの固定依存性哺乳動物細胞株において伝統的に産生されてきた。特定の生産性、プロセスの堅牢性及びスケーラビリティを改善する必要性は、様々な宿主を使用する代替細胞培養プロセスの開発につながった。昆虫細胞／ｒＢＶシステムは、ｒＡＡＶ製造のための最もスケーラブルで生産性の高いもののうちの１つとして多くの人に認識されている。Ｒｏｂｅｒｔ Ｋｏｔｉｎ及びＭａｓａｓｈｉ Ｕｒａｂｅの顕著な論文は、ウイルスベクター産生のための効率的な手段として、昆虫細胞／ＢＶシステムの基礎を確立した［Ｕｒａｂｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；１３：１９３５－４３、Ｕｒａｂｅ Ｍ ｅｔａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００６；８０：１８７４－８５］。彼らのアプローチは、昆虫特異的プロモーターによって制御され、２つ又は３つのバキュロウイルス間のそれらのシス又はトランス調節活性によって分布するＡＡＶ遺伝子の配列を含んでいた。時を経て、いくつかのグループが、組換えＢＶの分子設計を改善する方法を特定し、これはより堅牢なベクター産生につながった［Ｃｈｅｎ Ｈ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００８；１６：９２４－３０、Ｓｍｉｔｈ ＲＨ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００９；１７：１８８８－９６、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１７；２８：１５－２２］。
【0161】
ほとんどの生物製剤の生産プラットフォームと同様に、徹底的なプロセス特性評価が、プロセス性能及び製品品質に影響を与えるパラメータを特定するための鍵である。ＭＯＩは、感染性ｒＢＶの数を細胞の総数で割った数として定義され、組換えタンパク質発現中に重要な役割を果たすことが周知である。いくつかの研究は、様々なＭＯＩ濃度が、ｒＢＶ複製ダイナミクス、宿主－ｒＢＶ代謝相互作用、及び全体的なタンパク質発現にどのように影響するかを記載している［Ｒａｄｆｏｒｄ ＫＭ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９７；２４：７３－８１、Ｐａｓｔｏｒ ＡＲ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１９；３７：６９６２－９、Ｖｉｒａｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００９；２０：８０７－１７］。ｒＡＡＶ産生の文脈において、この情報は、後続のベクター特異的分子事象（例えば、キャプシドアセンブリ、ｒＡＡＶ ＤＮＡ複製及びパッケージング）が、感染性ベクター粒子を生成するためにタンパク質発現後に行われなければならないため、部分的にのみ適用可能である［Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１８；１０２：１０４５－５４］。組換えＡＡＶ産生に対するＭＯＩの効果を評価するいくつかの研究がある。Ｍｅｇｈｒｏｕｓ及びＡｕｃｏｉｎは、ＡＡＶ遺伝子を提供するために３つのｒＢＶを使用して、総ＭＯＩ及びＭＯＩ比の効果を評価した。最初の評価は、高ＭＯＩ戦略（ＭＯＩ＞３）を使用することの利点、及び高生産性のためのバランスのとれたＢＶのＭＯＩ比の重要性を強調した［Ｍｅｇｈｒｏｕｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２００５；２１：１５４－６０］。後の報告書は、高ＭＯＩ戦略に関する研究を強化し、感染性ベクターの収率に対するＲｅｐ ＢＶ及びＣａｐ ＢＶのＭＯＩの正の効果を確認した［Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００６；９５：１０８１－９２］。ｒＡＡＶ産生プロセスにおける非同期、低ＭＯＩのＢＶ感染を特徴付ける研究が不足している。低ＭＯＩ感染では、ウイルスの添加後に少数の細胞が感染する。二次感染ラウンドは、ウイルス複製の結果であり、細胞集団の全体の感染につながる。Ｍｅｎａら［Ｍｅｎａ ＪＡ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２０１０；１２：１５７－６７］は、３－ｒＢＶプロセスで低ＭＯＩ（０．３）又は高ＭＯＩ（９）のいずれを使用する場合にも同等のＡＡＶ感染収率を記載した。播種細胞密度及び給餌戦略の更なる最適化は、更なる収率増加をもたらした。あまり理解されていないのは、ｒＡＡＶ産物の品質に対するＢＶのＭＯＩの効果である。ベクター品質は、ＡＡＶ由来導入遺伝子の堅牢な発現及び活性を保証するため、ベクター生産性と同程度に重要である。ＤＮＡ不純物のパッケージングは、ヘルパープラスミド又はＢＶのＤＮＡに由来する配列が誤ってキャプシド化される、ｒＡＡＶ産生中に文書化されている現象である［Ｃｈａｄｅｕｆ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００５；１２：７４４－５３、Ｗｒｉｇｈｔ ＪＦ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ２０１４；２：８０－９７］。研究では、プラスミド骨格及びｒＢＶ骨格配列が、それぞれ６％及び３％の高いパーセンテージでｒＡＡＶベクターストックに存在し得ることが報告されている［Ｌｅｃｏｍｔｅ Ｅ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０１５；４：ｅ２６０、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１７；２８：１４８－６２］。昆虫細胞システムの文脈では、ｒＢＶ分子設計だけでなく、上流のプロセスパラメータもＤＮＡ不純物のパッケージングに役割を果たす可能性があると考えられている。この産物関連の不純物の形成に対する生物学的入力及び細胞培養パラメータの寄与に関する手がかりを得るためには、より多くの研究を実施する必要がある。
【0162】
大規模では、低いｒＢＶのＭＯＩ戦略は、ＢＶ拡張操作を簡素化し、運用コストを削減し、ＢＶ遺伝的安定性を改善することができ得る。したがって、ｒＡＡＶ生成に対する低ＭＯＩ戦略の意味の理解が重要になる。本試験では、我々は、細胞当たりの生産性、キャプシド対ベクターゲノム比、及びｒＢＶ由来のＤＮＡ不純物のパッケージングなどの特定の出力をモニタリングすることによって、異なる低いＢＶのＭＯＩ及び遺伝子初期比が生産性及びｒＡＡＶ品質にどのように影響するかを調査した。フォローアップ評価を実施し、特定された傾向を説明することができ得る仮説を構築した。
【0163】
材料及び方法
細胞株及び培養の維持
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株Ｓｆ９からのサブクローニングを本試験に使用した。細胞を、５×１０５細胞／ｍＬの初期細胞密度を標的にして、独自の無血清培地を含有する振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で、週に２回継代させた。振盪フラスコを、２８℃でインキュベートした。
細胞株及び培養の維持
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞株Ｓｆ９からのサブクローニングを本試験に使用した。細胞を、５×１０５細胞／ｍＬの初期細胞密度を標的にして、独自の無血清培地を含有する振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で、週に２回継代させた。振盪フラスコを、２８℃でインキュベートした。
【0164】
組換えＢＶの生成
組換えバクミド及びｒＢＶを、ｂａｃ－ｔｏ－ｂａｃ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）を使用して設計し、産生した。Ｂａｃ－ＧＯＩ－Ａ（導入遺伝子Ａ）及びＢａｃ－ＧＦＰ－ＧＯＩ－Ｂ（導入遺伝子Ｂ）は、それぞれ、４．６及び４．８ｋｂの長さのＩＴＲ隣接導入遺伝子を含有した。Ｂａｃ－ＧＦＰ－ＧＯＩ－Ｂは、導入遺伝子Ｂに加えて、ＧＰ６４プロモーターによって制御されるＧＦＰ遺伝子を含有した。バキュロウイルスは、異なるバキュロウイルスプロモーターを介してＲｅｐ（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）及びＣａｐ遺伝子を発現するように設計された。追加の構築物は、別のバキュロウイルスプロモーターによって調節されるｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質発現カセットを含有した。感染性ＢＶの定量化は、３９ｋプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するＳｆ９由来のインジケーター細胞株を使用して、フローサイトメトリーによって決定した。この滴定法は、後続の実験（データは示されていない）で使用される感染多重度値（ＭＯＩ）の正確性を保証するために、他の十分に確立されたプロトコルに対して評価されている。
実験の設計
組換えバクミド及びｒＢＶを、ｂａｃ－ｔｏ－ｂａｃ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）を使用して設計し、産生した。Ｂａｃ－ＧＯＩ－Ａ（導入遺伝子Ａ）及びＢａｃ－ＧＦＰ－ＧＯＩ－Ｂ（導入遺伝子Ｂ）は、それぞれ、４．６及び４．８ｋｂの長さのＩＴＲ隣接導入遺伝子を含有した。Ｂａｃ－ＧＦＰ－ＧＯＩ－Ｂは、導入遺伝子Ｂに加えて、ＧＰ６４プロモーターによって制御されるＧＦＰ遺伝子を含有した。バキュロウイルスは、異なるバキュロウイルスプロモーターを介してＲｅｐ（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）及びＣａｐ遺伝子を発現するように設計された。追加の構築物は、別のバキュロウイルスプロモーターによって調節されるｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質発現カセットを含有した。感染性ＢＶの定量化は、３９ｋプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するＳｆ９由来のインジケーター細胞株を使用して、フローサイトメトリーによって決定した。この滴定法は、後続の実験（データは示されていない）で使用される感染多重度値（ＭＯＩ）の正確性を保証するために、他の十分に確立されたプロトコルに対して評価されている。
実験の設計
【0165】
ＡＡＶ５の生産性及びＢＶ由来のキャプシド化ＤＮＡ不純物に対するｒＢＶのＭＯＩの効果を評価するために、バイオリアクター試験を実施した。完全要因実験マトリックスを、ＪＭＰ１４（ＳＡＳ）を用いて設計した。ＭＯＩ評価範囲は、細胞増殖又は栄養素消費の著しい違いによるプロセスの変動を防ぐために、１つのログとして定義された。容器当たりに添加されたＢＶ体積の量は、全ての場合において、作動体積（３Ｌ）の０．１％未満の割合を表した。Ｄａｓｇｉｐコントローラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＣＴ）を使用して、バイオリアクターを操作した。全ての播種細胞密度、感染時間、収穫時間、及び物理化学的パラメータ（ｐＨ、ＤＯ、温度）は、条件間で一貫していた。上清は、追加のｒＡＡＶ粒子放出を促進し、プロセス関連の不純物を除去するために化学処理を受けた。４０００×ｇで１５分間遠心分離し、デプス濾過を実施して、収穫材料を更に清澄化した。
【0166】
振盪フラスコのフォローアップ試験を実行して、バイオリアクター試験中に観察された傾向を一般化した。２つの異なるＧＯＩ ＢＶを試験した。１２５ｍＬの振盪フラスコを使用して、以前の試験で特定された４つの代表的な条件を試験した。バイオリアクター試験と同一の接種、感染、及び収穫スケジュールに従い、最終的な上流材料として清澄化した収穫物を得た。
【0167】
ＡＡＶアフィニティ精製
各清澄化された収穫材料のアリコートを、ＡＶＢセファロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）のスラリーとともに、室温及び一定の撹拌で２時間インキュベートした。次いで、各ＡＶＢ樹脂／収穫混合物を遠心分離し、ペレット化した樹脂をＡｃｒｏｐｒｅｐフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ）に移し、そこでそれらを並行して処理した。樹脂をリン酸緩衝液で３回洗浄し、低ｐＨ緩衝液とともに、３．５分間インキュベートして、ｒＡＡＶキャプシドを溶出した。液体の内容物を、マルチプレート吸引マニホールド（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ）を使用して、フィルタープレートから９６ディープウェルプレートに除去した。収集した溶出液を、貯蔵前にｐＨ７．０～７．２に調整した。
各清澄化された収穫材料のアリコートを、ＡＶＢセファロース樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）のスラリーとともに、室温及び一定の撹拌で２時間インキュベートした。次いで、各ＡＶＢ樹脂／収穫混合物を遠心分離し、ペレット化した樹脂をＡｃｒｏｐｒｅｐフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ）に移し、そこでそれらを並行して処理した。樹脂をリン酸緩衝液で３回洗浄し、低ｐＨ緩衝液とともに、３．５分間インキュベートして、ｒＡＡＶキャプシドを溶出した。液体の内容物を、マルチプレート吸引マニホールド（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ）を使用して、フィルタープレートから９６ディープウェルプレートに除去した。収集した溶出液を、貯蔵前にｐＨ７．０～７．２に調整した。
【0168】
デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によるＤＮＡ定量化
キャプシド保護導入遺伝子及びＢＶ由来ＤＮＡ不純物の存在を、Ｂａｒａｊａｓら［Ｂａｒａｊａｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１７；１２］に記載されるプロトコルに従い、ｄｄＰＣＲによって追跡した。試験した標的配列の広い濃度範囲をカバーするために、ＡＶＢ溶出液の連続希釈を実施した。－５０００コピー／マイクロリットル未満の反応をもたらした希釈を定量化に使用した。適切な非テンプレート対照では、常にコピー数が１未満であることが示された。自動液滴生成器及びリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）を使用した。陽性液滴の検出及びコピー数の決定は、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）によって実施した。細胞からＶＰ３／１８ｓ比を決定するために、２ｍＬの細胞培養物を５００×ｇで２分間スピンダウンさせ、細胞ペレットを回収し、－８０℃で凍結した。凍結したペレットを後でＴＥ緩衝液＋０．５％ ＳＤＳに再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。この懸濁液を、ｄｄＰＣＲ定量化のための出発物質として使用した。
キャプシド保護導入遺伝子及びＢＶ由来ＤＮＡ不純物の存在を、Ｂａｒａｊａｓら［Ｂａｒａｊａｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１７；１２］に記載されるプロトコルに従い、ｄｄＰＣＲによって追跡した。試験した標的配列の広い濃度範囲をカバーするために、ＡＶＢ溶出液の連続希釈を実施した。－５０００コピー／マイクロリットル未満の反応をもたらした希釈を定量化に使用した。適切な非テンプレート対照では、常にコピー数が１未満であることが示された。自動液滴生成器及びリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）を使用した。陽性液滴の検出及びコピー数の決定は、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）によって実施した。細胞からＶＰ３／１８ｓ比を決定するために、２ｍＬの細胞培養物を５００×ｇで２分間スピンダウンさせ、細胞ペレットを回収し、－８０℃で凍結した。凍結したペレットを後でＴＥ緩衝液＋０．５％ ＳＤＳに再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。この懸濁液を、ｄｄＰＣＲ定量化のための出発物質として使用した。
【0169】
キャプシド定量化
Ｏｃｔｅｔシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）ベースのハイスループット法を使用して、異なる濃度のＡＡＶ５標準材料を使用して抗体－キャプシド結合動態情報から構築された標準曲線に基づいて総キャプシドを定量化した。アッセイのダイナミックレンジを満たすように希釈を実施した。各試料を、３つの希釈に沿って二重で分析した。アッセイの精度を追跡するために、陽性対照を含めた。
Ｏｃｔｅｔシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）ベースのハイスループット法を使用して、異なる濃度のＡＡＶ５標準材料を使用して抗体－キャプシド結合動態情報から構築された標準曲線に基づいて総キャプシドを定量化した。アッセイのダイナミックレンジを満たすように希釈を実施した。各試料を、３つの希釈に沿って二重で分析した。アッセイの精度を追跡するために、陽性対照を含めた。
【0170】
フローサイトメトリー分析
Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）を使用して、培養時間にわたってＧＦＰ発現細胞及びｄＴｏｍａｔｏ発現細胞のパーセンテージをモニタリングした。チャネルＹＬ１及びＢＬ１を使用して、異なるシグナルを追跡した。アナライザーで実行した試料ごとに、条件当たり１００万個の細胞を収集した。ＧＦＰ陽性、ｄＴｏｍａｔｏ陽性、及び陰性（未感染）対照を分析中に含めた。試料を、ＢＶ感染後の異なる時点で採取した。感染パーセンテージを計算するために、試料当たり少なくとも２０，０００の事象を分析した。
Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）を使用して、培養時間にわたってＧＦＰ発現細胞及びｄＴｏｍａｔｏ発現細胞のパーセンテージをモニタリングした。チャネルＹＬ１及びＢＬ１を使用して、異なるシグナルを追跡した。アナライザーで実行した試料ごとに、条件当たり１００万個の細胞を収集した。ＧＦＰ陽性、ｄＴｏｍａｔｏ陽性、及び陰性（未感染）対照を分析中に含めた。試料を、ＢＶ感染後の異なる時点で採取した。感染パーセンテージを計算するために、試料当たり少なくとも２０，０００の事象を分析した。
【0171】
結果
ＡＡＶ導入遺伝子Ａを産生するバイオリアクター内で実施された予備試験。ウイルス負荷の変化によって引き起こされる細胞培養成長能力への影響を最小限に抑えるために、１０倍のＭＯＩ範囲をカバーすることを決定した。生存率及び成長率の傾向は、試験された条件間の細胞成長及び死亡傾向の潜在的な変動性は重要ではなく、生産性及び産物の品質に対するＢＶのＭＯＩの効果に関する結論に影響を及ぼすことはないという主張を支持している。
ＡＡＶ導入遺伝子Ａを産生するバイオリアクター内で実施された予備試験。ウイルス負荷の変化によって引き起こされる細胞培養成長能力への影響を最小限に抑えるために、１０倍のＭＯＩ範囲をカバーすることを決定した。生存率及び成長率の傾向は、試験された条件間の細胞成長及び死亡傾向の潜在的な変動性は重要ではなく、生産性及び産物の品質に対するＢＶのＭＯＩの効果に関する結論に影響を及ぼすことはないという主張を支持している。
【0172】
清澄化された収穫物及び親和性精製された材料を、ｒＡＡＶ－導入遺伝子Ａ ｖｇ力価及びキャプシド対ベクターゲノム（ｃｐ：ｖｇ）比についてアッセイした。生産性を正規化し、図１７に示す。最高の生産性値は、ＡＡＶ遺伝子が、以下のｒＢＶのＭＯＩ、すなわちＧＯＩ ０．００３／Ｒｅｐ ０．０３／Ｃａｐ ０．０３で提供されたときに得られたが、最小値は、それらが初期遺伝子レベルＧＯＩ ０．０３／Ｒｅｐ ０．００３／Ｃａｐ ０．００３で提供されたときに得られた。ＧＯＩ、Ｒｅｐ、及びＣａｐを提供／コードするｒＢＶのＭＯＩの効果、並びに細胞当たりの生産性に対するそれらの相互作用を記述するために、統計モデルを開発した。Ｃｐ：ｖｇ比は、試験条件間で１．５～３の範囲である（図１８）。当初、Ｒｅｐ及びＣａｐ ＢＶのＭＯＩが高い条件は、空のキャプシド産生の可能性が高いため、より高い比を示す可能性があると仮定されたが、この実験ではその現象は証明されなかった。１０倍を超える評価範囲が、キャプシド化効率の有意差を検出することができることは妥当である。
【0173】
ｒＡＡＶ材料の品質に対するｒＢＶのＭＯＩの影響が、精製された産物に存在する４つの特異的なヌクレアーゼ耐性のｒＢＶ由来の遺伝子マーカーを定量化することによって特徴付けられた。マーカーα及びβは、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するが、バキュロウイルスゲノム内のｒＡＡＶベクターゲノムヌクレオチド配列の外部の１０キロベース（ｋｂ）領域内に位置し、マーカーγ及びδは、ＩＴＲから離れており、およそ１３５ｋｂのＢＶ ＤＮＡゲノムをカバーする。表１は、マーカー：ｖｇ比として、及びｒＢＶ由来ｃＤＮＡ不純物のパーセンテージとして決定された結果を示す。表１は、ｒＢＶ由来ＤＮＡ不純物のキャプシド化に対するｒＢＶのＭＯＩの効果を示す。個々のｒＢＶのＭＯＩ及びｒＢＶのＭＯＩ比に基づいて、実験条件を提示する。比を平均化し（α－β、γ－δ）、条件＃１０に正規化した。更に、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ［Ｇｒｏｓｓｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１７；９１］からの方法論を参照として使用して、精製されたベクターに存在するｒＢＶ由来のＤＮＡ不純物のパーセンテージを推定した。ＤＮＡ汚染物質のパーセンテージを、ｒＡＡＶ導入遺伝子、平均化されたα－β、及び平均化されたγ－δのコピー数から計算し、各参照サイズに正規化した（ＡＡＶ導入遺伝子＝４．８ｋｂ、α－β近ＩＴＲ領域＝１０ｋｂ、γ－δ骨格領域＝１３５ｋｂ）。平均αβ：ｖｇ又はγ－δ：ｖｇ比を使用して、各領域からのＢＶ由来ＤＮＡ不純物頻度のパッケージングのより代表的な推定値を提供した。Ｒｅｐ及びＣａｐレベルの増加は、１０ｋｂセクション内のＩＴＲを囲むマーカーの濃度の低下に寄与すると推定した。低ＧＯＩレベル（０．００３）では、Ｒｅｐ及びＣａｐ ＢＶのＭＯＩレベルの低（０．００３）から高（０．０３）までの変動により、正規化されたα－β ＤＮＡ比が１．５５から０．７５に低減する（５２％減少）。更に、γ－δマーカーの濃度パターンは、ＧＯＩ ＢＶのＭＯＩによって悪影響を受けた。評価された条件内の正規化されたγ－δ：ｖｇ濃度は、０．９８～１６．０９の範囲であり、ＢＶのＭＯＩが、ＩＴＲから遠く離れた遺伝子配列に強い影響を与えることを示唆し、ＩＴＲは、リバースパッケージング事象の一部である可能性が低い。ｒＡＡＶ粒子中のＢＶ由来ＤＮＡ不純物のパーセンテージの推定は、０．２２～０．６０％の範囲の合計（α－β＋γ－δ）値を示し、これは以前の報告［Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１７；２８：１４８－６２］と一致した。全体として、より高いＲｅｐ及びＣａｐ初期レベルは、より高い生産性につながる可能性があるが、ＢＶ由来のＤＮＡ不純物の更なる増加を犠牲にしていることが示唆される。この負の効果は、ｒＢＶ比を１に近づけることによって緩和することができる。
【表1】
【0174】
ＢＶ由来ＤＮＡ不純物の生産性及び傾向の理解を高めるために、振盪フラスコにおけるフォローアップ試験を実施した。異なるＢＶセット、すなわちＧＯＩ－Ａ、Ｒｅｐ、及びＣａｐ（上記と同じ）を提供する／コードするｒＢＶと、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、及びＧＦＰ－ＧＯＩ－Ｂを提供する／コードする蛍光標識されたｄＴｏｍａｔｏ－ｒＢＶとを使用して、異なるＢＶのＭＯＩ条件を複製して、以前の生産性傾向を確認した。蛍光タンパク質産生ＢＶセットに感染した全ての条件を、フローサイトメトリー及びｄｄＰＣＲを使用してモニタリングして、Ｒｅｐ又はＣａｐをコードするｒＢＶ間の感染レベル、Ｃａｐ発現及び生産性の潜在的な相関を特定した。フローサイトメトリー分析は、ＡＡＶ－ＧＦＰ－ＧＯＩ－Ｂの産生中の感染後９０時間（ｈｐｉ）での共感染細胞のパーセンテージを強調した。ＢＶのＭＯＩ比の著しい不均衡は、低い共感染パーセント（ＧＯＩ ０．０３／Ｒｅｐ ０．００３／Ｃａｐ ０．００３条件及びＧＯＩ ０．００３／Ｒｅｐ ０．０３／Ｃａｐ ０．０３条件の場合、それぞれ３２．２％及び２８．９％）をもたらすことができるが、ＢＶ比が１：１：１の条件は、６８．８～７０．６％の間の共感染パーセントを示した。タンパク質産生を目的とした昆虫細胞／ＢＶプロセスと比較して、ｒＡＡＶ粒子の良好な生成は、細胞を全てのＢＶに共感染させることを必要とする。したがって、ＢＶ共感染率は、理論上、細胞当たりの生産性に影響を与えることができる。図１９は、導入遺伝子同一性にかかわらず、ＧＯＩ／Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＶのＭＯＩ比が１：１：１以下（例えば、１：＜１：＜１）の条件間の同等の生産性を示す。以前の結果は、ベクター収率に対するＲｅｐ又はＣａｐをコードするｒＢＶのＭＯＩの正の影響を示唆したため、感染後の細胞ペレット中のＶＰ３遺伝子コピー数を測定した。この例では、ＶＰ３は、細胞Ｒｅｐ又はＣａｐコピー数のプロキシとして機能する。宿主細胞１８ｓリボソームＲＮＡ遺伝子マーカーもまた、異なる細胞密度を説明するために追跡した。図２０は、様々なＢＶのＭＯＩの組み合わせに対するＡＡＶ－ＧＯＩ－Ｂの生産性及びＶＰ３／１８ｓの比を比較する。生産性及びＶＰ３／１８ｓ比は、共感染した細胞のみが「完全な」ＡＡＶ粒子を産生し、Ｒｅｐ又はＣａｐをコードするｒＢＶに感染した細胞のみが検出可能なレベルのＡＡＶ ＶＰ３ ＤＮＡを含むという仮定に基づいて調整された。これらの結果は、調整されたＶＰ３／１８ｓ ＤＮＡ比と調整された細胞当たりの生産性との間に正の相関を示した。まとめると、図１９及び図２０の結果は、Ｒｅｐ又はＣａｐをコードするｒＢＶのＭＯＩが生産性に及ぼす強力な影響を確認する。ＧＯＩ／Ｒｅｐ／Ｃａｐ ｒＢＶのＭＯＩ比が１：１：１未満（例えば、１：＜１：＜１）で作動する条件は、より少ない数の細胞を共感染させるように見えるが、この亜集団は、より高いＲｅｐ又はＣａｐコピー数を含む。この効果は、その特定の亜集団におけるベクター生産性を改善し、バルク細胞の生産性を、ＢＶのＭＯＩ比が１：１：１に等しい条件と同様のレベルにするように思われる。
【0175】
最後に、Ｒｅｐ又はＣａｐをコードするｒＢＶのＭＯＩが、ＢＶ由来のＤＮＡ不純物のキャプシド化に及ぼす効果を確認した。Ｒｅｐ、Ｃａｐ、及びＧＦＰ－ＧＯＩ－Ｂ ＭＯＩ条件を提供する／コードする別個のｄＴｏｍａｔｏ－ｒＢＶから作製されたベクター粒子を精製し、キャプシド当たりのＢＶ由来ＤＮＡ不純物のレベル（ｒｅｓ ＤＮＡ：ｃｐ比）を決定した。図２１及び図２２は、それぞれ、平均化されたα－βマーカー及びγ－δマーカーの正規化されたＢＶ由来ＤＮＡ：ｃｐ比を示す。バイオリアクター試験と同様に、Ｒｅｐ又はＣａｐをコードするｒＢＶのＭＯＩの増加は、α－β：ｃｐ比に悪影響を及ぼし、ＧＯＩ／Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＶのＭＯＩ比を１０（例えば、１０：１：１）から０．１（例えば、０．１：１：１）に切り替えると、５０％の低減につながる。Ｒｅｐ又はＣａｐをコードするｒＢＶのみで産生されたキャプシド中のＢＶ由来ＤＮＡ不純物の濃度は、この蓄積傾向と十分に一致した。ＧＯＩ／Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＶのＭＯＩを１０から０．１とする切り替えは、γ－δ ＤＮＡ：ｃｐ比でおよそ１５倍の増加をもたらし、Ｒｅｐ又はＣａｐのみをコードするｒＢＶで産生されるｒＡＡＶ粒子では最大３０倍の増加が見られた。更に、ＧＯＩ／Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＶのＭＯＩ比が１で感染した条件では、正確なＭＯＩに関係なく、同等の結果を示した。加えて、９０ｈｐｉでＲｅｐ又はＣａｐのみに感染した細胞をコードするｒＢＶ％は、α－β ＤＮＡ：ｃｐ比と負の相関があり、γ－δ ＤＮＡ：ｃｐ比と正の相関がある。全体として、これらの結果は、Ｒｅｐ又はＣａｐをコードするｒＢＶのより高いＭＯＩに傾いているＢＶのＭＯＩ比の不均衡が、細胞のパーセンテージの増加が導入遺伝子を含まないキャプシドを産生し得る細胞亜集団のシフトにつながり、導入遺伝子を含まないキャプシドにおけるＢＶ由来ＤＮＡの不均衡な蓄積が、ｒＡＡＶキャプシドにおけるＢＶ由来ＤＮＡ不純物の全体的な増加につながり得ることを示唆している。これらの結果はまた、ＢＶゲノム内のマーカーの位置に応じて、ＢＶ由来ＤＮＡ不純物のキャプシド化の対照的な傾向を確認した。
【0176】
低ｒＢＶのＭＯＩ感染戦略の概念は、ウイルスストック調製に重要な利点をもたらす。ＢＶストックの１００～１０００倍の低減は、バキュロウイルス生成における著しい操作上の緩和を表し、これは、大規模に操作するときに究極的に重要になる［Ｖｉｒａｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００９；２０：８０７－１７］。低ＢＶ接種物は、接種物の拡張中の「継代効果」の結果としての欠陥干渉粒子の生成を最小限に抑えるため、ＢＶの遺伝的安定性にもプラスの影響を与える［Ｋｒｅｌｌ ＰＪ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６；２０：１２５－３７］。ｒＡＡＶ製造の文脈では、昆虫細胞／ＢＶ操作中の低ＢＶのＭＯＩ戦略の有用性は、様々なＭＯＩがベクター粒子の収率及び品質にどのように影響するかについての徹底的な調査を正当化する。
【0177】
総ＢＶのＭＯＩが減少するにつれて、最初のウイルス感染ラウンド中に共感染される細胞のパーセンテージは減少する。その後の非同期感染プロセスは、細胞株挙動、使用されるＢＶの数、及び感染時間などの他の入力の影響を受ける［Ｍｅｎａ ＪＡ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００７；７：３９、Ｌｅｅ ＤＦ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０００；７４：１１８７３－８０、Ｓｏｋｏｌｅｎｋｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ ２０１２；３０：７６６－８１］。培養温度などの物理化学パラメータもまた、ＡＡＶタンパク質発現及びベクター産生のタイミングに影響を及ぼし、このパラメータがＢＶ複製及び細胞死動態に影響を及ぼす可能性があることを示唆している［Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００７；９７：１５０１－９］。本試験は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及びＧＯＩ配列を含有するｒＢＶについて様々なＭＯＩ値を探索したが、他の全てのプロセスパラメータは一定のままであった。データ分析は、感染プロセス中のｖｇ生産性に対するＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子のプラスの効果を強調する。この結果は、高ＭＯＩでＭｅｇｈｒｏｕｓ及びＡｕｃｏｉｎによって実施された以前の実験と一致する［Ｍｅｇｈｒｏｕｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２００５；２１：１５４－６０、Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００６；９５：１０８１－９２］。Ｒｅｐ及びＣａｐ ＢＶの感染に成功すると、ｒＡＡＶ ＤＮＡ複製、ゲノム分解、及び事前形成されたキャプシドへのパッケージングに必要なＲｅｐタンパク質の強力な発現が促進される［Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１４；１：４２７－５１］。これはまた、ＡＡＶ ＶＰタンパク質及びアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の発現を促進し、後者は、適切なキャプシドアセンブリのためのタンパク質輸送のシャペロニングにとって重要である［Ｇｒｏｓｓｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１７；９１］。関連文献のレビューは、一貫したプロセス性能につながるため、１のＢＶのＭＯＩ比で操作することが好ましいことを示した。結果はその経験則を支持したが、その比に柔軟性があるという考えにも寄与している。Ａｕｃｏｉｎ［Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００６；９５：１０８１－９２］は、ＧＯＩ：Ｒｅｐ：Ｃａｐ ＢＶ比を１０：１０：１０（３０の合計ＭＯＩ）から３：１０：１０（２３の合計ＭＯＩ）に低減することが同等の感染力価結果をもたらすことを示し、同期感染プロセスで提供される導入遺伝子（ＧＯＩ）コピーの初期数が、Ｒｅｐ及びＣａｐコピー数と比較して少ない量で必要とされることを示唆する。この理論に縛られるものではないが、本発明者らは、低い初期ＧＯＩコピー数の条件下で、Ｒｅｐ駆動型導入遺伝子複製は、後続のパッケージングのために豊富なＩＴＲ隣接ＤＮＡを供給することができるという仮説を立てる。ＧＯＩが低いが、Ｒｅｐ及びＣａｐレベルが高い条件では、フローサイトメトリーデータは、ウイルスに感染した細胞のパーセンテージ及び重感染レベルの両方が潜在的に影響を受けることを示唆する（データは示されていない）。興味深いことに、そのような比は、バルクの細胞生産性を改善した。
【0178】
ＢＶ由来ＤＮＡ不純物のキャプシド化もまた、本試験で評価した。Ｓｆ９産生システムにおいて、次世代シーケンシング及びＰＣＲベースの技法によるＤＮＡ不純物の評価は、ゲノムの０．２～２％の範囲の合計パーセンテージでＢＶ及び宿主細胞由来ＤＮＡ配列を特定し、ＢＶ ＤＮＡは最も豊富である［Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１７；２８：１４８－６２、Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１７；２５：２６６１－７５］。ＤＮＡ不純物はわずかなパーセンテージで存在するが、規制保健当局は、いかなる潜在的な遺伝毒性リスクも低減するために、この製品関連の不純物を制御するようメーカーに助言する［ＦＤＡ Ｂｒｉｅｆｉｎｇ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ：Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９，２０１２：Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒｓ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｎ．ｄ．：３０］。上流及び下流のｒＡＡＶ産生操作は、原薬中のＤＮＡ不純物レベルに影響を与えると考えられる。しかしながら、これらの仮説を評価する研究は不足している。これは、昆虫細胞培養におけるＢＶ由来のパッケージ化ＤＮＡ不純物に対するＢＶのＭＯＩの効果を体系的に特徴付ける最初の報告であると考えられる。予備的な結果は、ＧＯＩのＭＯＩと比較してＲｅｐ及びＣａｐ ＢＶのＭＯＩを増加させると、ＩＴＲ隣接遺伝子座からのＢＶ ＤＮＡのパッケージングが低下する一方で、ＩＴＲから離れた遺伝子座のキャプシド化が増加することを示唆しており、これらの効果は対照的であるだけでなく、強度が異なる。これらのデータは、ＢＶ由来ＤＮＡ不純物パッケージングの２つの潜在的な機序を説明する。１）ＩＴＲ配列の存在に大きく影響される、以前に報告された「リバースパッケージング」、及び２）全てのバキュロウイルスゲノム配列に適用されるＲｅｐ依存性機序。例示的な実施形態が上に説明されているが、これらの実施形態が本発明の全ての可能な形態を説明することは意図されていない。むしろ、本明細書で使用される語は、限定ではなく説明の語であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得ることが理解される。更に、様々な実施形態の特徴を組み合わせて、本発明の更なる実施形態を形成し得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】