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特表2024-527089細胞溶解および核酸抽出用組成物、これを用いた核酸抽出方法およびこれを用いた分子診断方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】細胞溶解および核酸抽出用組成物、これを用いた核酸抽出方法およびこれを用いた分子診断方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/10 20060101AFI20240711BHJP

C12Q 1/6844 20180101ALI20240711BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 100Z

C12Q1/6844 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505224

(86)(22)【出願日】2022-08-01

(85)【翻訳文提出日】2024-01-26

(86)【国際出願番号】 KR2022011277

(87)【国際公開番号】W WO2023014009

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】10-2021-0101536

(32)【優先日】2021-08-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524035852

【氏名又は名称】インビトロスカンパニーリミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩｎｖｉｔｒｏｓＣｏ．，Ｌｔｄ．

【住所又は居所原語表記】２０Ｆ，１０Ｇｕｋｊｅｇｅｕｍｙｕｎｇ－ｒｏ，Ｙｅｏｎｇｄｅｕｎｇｐｏ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ０７３２６ＲＥＰＵＢＬＩＣＯＦＫＯＲＥＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110000394

【氏名又は名称】弁理士法人岡田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リム，ミンジ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジャンディ

(72)【発明者】

【氏名】キム，セリュン

(72)【発明者】

【氏名】パク，チャンジュ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR90

4B063QS25

4B063QS33

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、細胞溶解および核酸抽出用組成物、これを用いた核酸抽出方法およびこれを用いた分子診断方法に関するものであって、具体的には、核酸を抽出するための溶液としてＲＮＡ分解酵素抑制剤を含む組成物を用いて、特定の温度で加熱するステップを含んで別途の精製過程と溶離過程なしに重合酵素連鎖反応を行って分子診断のための時間を最小化し、抽出に用いられる専用の装置および消耗品を最小化することによって、分子診断の費用を節減することができる細胞溶解および核酸抽出用組成物、これを用いた核酸抽出方法およびこれを用いた分子診断方法に関するものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡ分解酵素抑制剤と、緩衝溶液とを含む、
細胞溶解および核酸抽出用組成物。

【請求項2】

前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、ＲＮＡ分解酵素Ａを抑制する抑制剤を含むものである、
請求項１に記載の細胞溶解および核酸抽出用組成物。

【請求項3】

前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、タンパク質に由来したものである、
請求項１に記載の細胞溶解および核酸抽出用組成物。

【請求項4】

前記緩衝溶液は、ｐＨ６．０以上ｐＨ９．０以下のものである、
請求項１に記載の細胞溶解および核酸抽出用組成物。

【請求項5】

前記緩衝溶液は、グリセロール、ハイドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、ＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、塩化カリウムおよびこれらの組合わせから選択されたいずれか一つを含むものである、
請求項１に記載の細胞溶解および核酸抽出用組成物。

【請求項6】

核酸を含む試料を、請求項１に記載の細胞溶解および核酸抽出用組成物に添加して混合物を製造するステップと、
前記混合物を２５℃以上４５℃以下の温度に維持する１次加熱するステップと、
前記１次加熱された混合物を７５℃以上１００℃未満の温度に維持する２次加熱するステップと、を含む、
細胞溶解および核酸抽出方法。

【請求項7】

前記１次加熱するステップおよび２次加熱するステップを、それぞれ１分以上３０分以下で行う、
請求項６に記載の細胞溶解および核酸抽出方法。

【請求項8】

前記混合物におけるＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度は、前記混合物の体積が３０μＬであることを基準に、７．５Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上６０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下である、請求項６に記載の細胞溶解および核酸抽出方法。

【請求項9】

請求項６に記載の細胞溶解および核酸抽出方法で抽出された核酸を含む混合物に、プライマーおよびプローブが含まれた溶液とプレミックスとを添加するステップと、
前記抽出された核酸を重合酵素連鎖反応で増幅するステップと、を含む、分子診断方法。

【請求項10】

ＲＮＡ分解酵素抑制剤と、緩衝溶液とを含む組成物を含む、細胞溶解および核酸抽出用または分子診断用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、２０２１年８月２日付にて韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０－２０２１－０１０１５３６号の出願利益を主張して、その内容全部は本発明に含まれる。

【0002】

本発明は、細胞溶解および核酸抽出用組成物、これを用いた核酸抽出方法およびこれを用いた分子診断方法に関するものであって、具体的には、核酸を抽出するための溶液としてＲＮＡ分解酵素抑制剤を含む組成物を用いて、特定の温度で加熱するステップを含んで別途の精製過程と溶離過程なしに重合酵素連鎖反応を行って分子診断のための時間を最小化し、抽出に用いられる専用装置および消耗品を最小化することによって、分子診断の費用を節減することができる細胞溶解および核酸抽出用組成物、これを用いた核酸抽出方法およびこれを用いた分子診断方法に関するものである。

【背景技術】

【0003】

最近、人間遺伝体研究結果に基づいて遺伝子水準で疾病の原因を解釈することによって、人間の疾病を治癒するか予防しようとする目的で、生体試料の操作および生化学的分析に対する要求が徐々に増加している。また、疾病の診断外にも、新薬開発、ウイルスやバクテリア感染有無の事前検査および法医学などの多様な分野で生体試料や細胞が含まれた試料から核酸を抽出、分析する技術が要求される。

【0004】

一方、分子診断をするためには、ウイルスや細菌に感染した人の唾液または血液などから遺伝子情報を有しているＤＮＡまたはＲＮＡである核酸を抽出し、これを増幅して疾病の感染有無を確認することが一般的である。

【0005】

図１は、従来技術に係る重合酵素連鎖反応を示したフローチャートである。前記図１を参考にすると、従来の場合、検体（Ｓ１０）から遺伝子情報を有している核酸を抽出（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ、Ｓ３０）し、これを重合酵素連鎖反応を行って核酸を増幅（Ｓ７０、Ｓ９０）して結果を分析することが一般的である。前記核酸を抽出するためには、溶解（Ｌｙｓｉｓ、Ｓ３１）、溶離（Ｅｌｕｔｉｏｎ、Ｓ３３）および精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓ５０）する過程を必要とした。但し、核酸を抽出するために溶解および精製する過程では、これを行うための専用の抽出装備および抽出のために消耗する用品（プラスチックからなる道具、磁性ビーズまたは溶液など）を必要とした。

【0006】

前述の従来技術で核酸を抽出する場合、純度の高い核酸を抽出することができるが、抽出する過程で長時間がかかり、緊急な状況や応急室で診断または検診するには適していないという問題があり、ウイルスの急激な拡散で国家防疫が必要な状況でこれを適用することと抽出のための専用の器機および消耗品を持続的に使用しなければならないので、診断のために高価な費用を支払わなければならないという問題点があった。

【0007】

したがって、前述の問題点を解決するために、特定の組成物を用いることによって、精製過程や溶離過程なしに細胞溶解だけで重合酵素連鎖反応を行うことができる技術に対する開発が至急な実情であった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明が成そうとする技術的課題は、細胞内の核酸を抽出するために細胞を溶解する過程で、特定の成分を含む組成物を用いて、前記溶解された細胞を含む混合物を加熱することによって、別途の細胞が溶解された溶液の精製および溶離過程を省略し、前記溶解された溶液を用いて重合酵素連鎖反応を行うことができる細胞溶解および核酸抽出用組成物、およびこれを用いた分子診断方法を提供することである。

【0009】

但し、本発明が解決しようとする課題は、前記言及した課題に制限されず、言及されていないまた他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解できるだろう。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の一実施形態は、ＲＮＡ分解酵素抑制剤と、緩衝溶液とを含む細胞溶解および核酸抽出用組成物を提供する。

【0011】

本発明の一実施形態によると、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、ＲＮＡ分解酵素Ａを抑制する抑制剤を含むものであってもよい。

【0012】

本発明の一実施形態によると、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、タンパク質に由来したものであってもよい。

【0013】

本発明の一実施形態によると、前記緩衝溶液は、ｐＨ６．０以上ｐＨ９．０以下のものであってもよい。

【0014】

本発明の一実施形態によると、前記緩衝溶液は、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ハイドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、ＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、塩化カリウムおよびこれらの組合わせから選択されたいずれか一つを含むものであってもよい。

【0015】

本発明の一実施形態は、核酸を含む試料を前記細胞溶解および核酸抽出用組成物に添加して混合物を製造するステップと、前記混合物を２５℃以上４５℃以下の温度に維持する１次加熱するステップと、前記１次加熱された混合物を７５℃以上１００℃未満の温度に維持する２次加熱するステップと、を含む細胞溶解および核酸抽出方法を提供する。

【0016】

本発明の一実施形態によると、前記１次加熱するステップおよび２次加熱するステップは、それぞれ１分以上３０分以下で行うものであってもよい。

【0017】

本発明の一実施形態によると、前記混合物におけるＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度は、前記混合物の体積が３０μＬであることを基準に、７．５Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上６０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下のものであってもよい。

【0018】

本発明の一実施形態は、前記細胞溶解および核酸抽出方法で抽出された核酸を含む混合物にプライマーおよびプローブが含まれた溶液と、プレミックスとを添加するステップと、前記抽出された核酸を重合酵素連鎖反応で増幅するステップと、を含むものである分子診断方法を提供する。

【発明の効果】

【0019】

本発明の一実施形態に係る細胞溶解および核酸抽出用組成物は、別途の細胞が溶解された溶液の精製過程および溶離過程を省略し、前記溶解された溶液を用いて重合酵素連鎖反応を行うことによって、核酸を増幅して分子診断する過程でかかる時間を最小化することができる。

【0020】

本発明の一実施形態に係る細胞溶解および核酸抽出方法は、核酸を抽出する過程で加熱を通じて重合連鎖反応の正確性を阻害する要素を非活性化することによって、分子診断の正確性を向上させることができる。

【0021】

本発明の一実施形態に係る分子診断方法は、抽出に用いられる専用の装置および消耗品を最小化することによって、分子診断の費用を節減させることができる。

【0022】

本発明の効果は、前述の効果に限定されるものではなく、言及されない効果は本願明細書および添付の図面から当業者に明確に理解できるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、従来技術に係る重合酵素連鎖反応を示したフローチャートである。

【図2】図２は、本発明の一実施形態に係る分子診断方法の概略図およびチューブ内部の成分の反応を簡略に示した概略図である。

【図3】図３は、本発明の一実施形態に係る分子診断方法のフローチャートである。

【図4】図４は、実施例１に係る分子診断方法の概略図と実施例１－１および１－２のＣｔ値を示したグラフである。

【図5】図５は、実施例２に係る分子診断方法の概略図と実施例２－１ないし２－４のＣｔ値を示したグラフである。

【図6】図６は、実施例３に係る分子診断方法の概略図と実施例３－１および３－２のＣｔ値を示したグラフである。

【図7】図７は、実施例４に係る分子診断方法の概略図と実施例４－１および４－２のＣｔ値を示したグラフである。

【図8】図８は、実施例４－３ないし４－６に係る分子診断方法の概略図である。

【図9】図９は、従来技術であるＲＮＡの抽出過程および精製過程を含むＰＣＲと製造例のＣｔ値を示したグラフである。

【図10】図１０は、製造例の１次加熱ステップでＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度によるＣｔ値を示したグラフである。

【図11】図１１は、製造例の１次加熱ステップの温度によるＣｔ値を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本願明細書の全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特別に反対される記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含む可能性があることを意味する。

【0025】

本願明細書の全体において、「Ａおよび／またはＢ」は「ＡおよびＢ、またはＡまたはＢ」を意味する。

【0026】

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

【0027】

本発明の一実施形態は、ＲＮＡ分解酵素抑制剤と、緩衝溶液とを含む細胞溶解および核酸抽出用組成物を提供する。

【0028】

本発明の一実施形態に係る細胞溶解および核酸抽出用組成物は、別途の細胞が溶解された溶液の精製過程および溶離過程を省略し、前記溶解された溶液を用いて重合酵素連鎖反応を行うことによって、核酸を増幅して分子診断する過程でかかる時間を最小することができる。

【0029】

前記図１を参考にすると、従来技術に係る分子診断法は、細胞内のＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を抽出（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ、Ｓ３０）するために試料を検体採取（Ｓ１０）した以後、溶解（Ｌｙｓｉｓ、Ｓ３１）、溶離（Ｅｌｕｔｉｏｎ、Ｓ３３）および精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓ５０）過程を経て溶離された溶液に追加的なＰＣＲ緩衝溶液（ｂｕｆｆｅｒ）を添加してＲＴ－ＰＣＲ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎＰＣＲ、Ｓ７０）およびＰＣＲ（重合酵素連鎖反応、Ｓ９０）を行う。以後、前記ＰＣＲによって増幅された核酸を診断に用いることが一般的であった。但し、前記方法は、溶解過程、溶離過程および精製過程に用いられる専用の器機が要求され、前記過程で用いられる溶液またはプラスチックウェア（ｐｌａｓｔｉｃｗａｒｅ）であるプレートおよび／またはチューブなどのような多様な消耗品を持続的に使用しなければならないという問題点があった。

【0030】

但し、従来技術に係る分子診断法で核酸を抽出した以後、サンプルを濃縮して濃度が高いサンプルに対してＰＣＲを行うので、Ｃｔ値が低い傾向が見られた。これに対して、ダイレクトＰＣＲ（ｄ－ＰＣＲ）は、細胞を検体採取して溶解（Ｌｙｓｉｓ）のための緩衝溶液が添加されて希薄されるため、ＰＣＲを行うためのサンプルの濃度が低くなるので、前記従来技術に係る分子診断法に比べてＣｔ値が高くなるしかないという限界があった。したがって、少量の細胞サンプルを検体採取してＲＮＡを抽出しても、ＲＮＡの損傷および損失を最小化してＰＣＲ効率を極大化し、時間を短縮することができる分子診断方法が要求された。

【0031】

さらに、従来のｄ－ＰＣＲで界面活性剤を用いた化学的溶解過程を行う場合、検体採取した細胞とともに存在するＲＮＡ分解酵素が不可欠に含まれているという問題があった。すなわち細胞を検体採取する過程で、ＲＮＡ分解酵素がともに存在し、界面活性剤を用いて前記細胞を溶解（Ｌｙｓｉｓ）する過程で、前記ＲＮＡ分解酵素は、前記細胞から出たＲＮＡを分解してＰＣＲの効率が急激に低下するという問題点があった。

【0032】

本発明の一実施形態によると、前記細胞溶解および核酸抽出用組成物は、ＲＮＡ分解酵素抑制剤を含む。具体的には、加熱しても非活性にならないＲＮＡ分解酵素を抑制することができるＲＮＡ分解酵素抑制剤を含むことによって、分子診断を単純化して、分子診断にかかる時間を短縮することができる。

【0033】

本発明の一実施形態によると、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、ＲＮＡ分解酵素Ａを抑制する抑制剤を含むものであってもよい。前述のように、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤を、ＲＮＡ分解酵素Ａを抑制する抑制剤として選択することによって、加熱によって他のＲＮＡ分解酵素を抑制するとともに、温度に安定したＲＮＡ分解酵素Ａを非活性化することによって、分子診断を単純化して、分子診断にかかる時間を短縮することができる。
ＲＮＡ分解酵素の特性を検討すると、下記の表１の通りである。

【0034】

【表1】

【0035】

具体的には、ＲＮＡ分解酵素は、温度によって影響を受ける酵素に該当する。但し、加熱をする場合、ＲＮＡ分解酵素Ｔ２、ＲＮＡ分解酵素Ｔ１、ＲＮＡ分解酵素Ｈ、ＲＮＡ分解酵素ＰおよびＲＮＡ分解酵素Ｉは、低い温度で非活性になってＲＮＡを分解する活性を失うことになるが、ＲＮＡ分解酵素Ａは１００℃まで加熱しても安定するので、加熱を通じてＲＮＡ分解酵素をいずれも非活性にすることができないという問題点があった。

【0036】

図２は、本発明の一実施形態に係る分子診断方法の概略図およびチューブ内部の成分の反応を簡略に示した概略図である。前記図２（ａ）および（ｂ）を参考にすると、細胞またはウイルスを人体から検体を採取する。前記採取した検体を前記細胞溶解および核酸抽出用組成物に添加して混合物を製造し、前記混合物に含まれたＲＮＡ分解酵素Ａ抑制剤は、前記検体に含まれたＲＮＡ分解酵素Ａを非活性化し、前記混合物を加熱してＲＮＡ分解酵素Ａ以外のＲＮＡ分解酵素をいずれも非活性化して熱非活性化（ｔｈｅｒｍａｌｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させ、これと同時に細胞を熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）して細胞内部にある核酸、すなわちＲＮＡまたはＤＮＡを抽出する。以後、前記抽出された核酸にプライマー、プローブおよびプレミックスを混合してＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを行う場合、核酸の増幅時間を減少させることができる。

【0037】

本発明の一実施形態によると、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、タンパク質に由来したものであってもよい。具体的には、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、分子が大きいものであってもよい。すなわち前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、タンパク質に由来したものとして分子が大きいものであってもよく、ＲＮＡ分解酵素と自ら結合して巨大分子（Ｌａｒｇｅｍｏｌｅｃｕｌｅ）を形成してＰＣＲ反応の阻害を防止するものであってもよい。より具体的には、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、マウスの肺に由来したもの、人間の胎盤に由来したもの、またはこれらの組合わせから選択された一つのものであってもよい。前記マウスの肺に由来したものであるＲＮＡ分解酵素抑制剤は、ｎａｎｏｈｅｌｉｘＲＩ（ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）であってもよい。前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、ＮａｎｏｈｅｌｉｘＨｅｌｉｘＡｙｍｅＲｎａｓｅＩｎｂｉｂｉｔｏｒ（ＲＮＩ２０００）、ＴｈｅｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｉｂｏＬｏｃｋＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＥＯ０３８１）、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＲＮａｓｅＯＵＴＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０７７７０１９）、ＴａｋａｒａＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（２３１３Ａ）、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＳＵＰＥＲａｓｅＩｎＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＡＭ２６９４）、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎ８０８０１１９）、ＲｏｃｈｅＰｒｏｔｅｃｔｏｒＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＮＡＩＮＨ－ＲＯ／３３３５３９９００１）、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｕｍａｎ（Ｒ２５２０）、ＰｒｏｍｅｇａＲＮａｓｉｎ／ＲＮａｓｉｎＰｌｕｓＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤＢｉｏＬａｂｓＩｎｃ．ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｍｕｒｉｎｅ（Ｍ０３１４）、ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤＢｉｏＬａｂｓＩｎｃ．ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＨｕｍａｎＰｌａｃｅｎｔａ（Ｍ０３０７）、ＡＢｃｌｏｎａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ（ＲＫ２１４０１）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎＲＮａｓｅＯＦＦｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｍ１２３８）、ＰＣＲＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＲｉｂｏＳｈｉｅｌｄＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＢ３０．２３－０２）、ＢｌｉｒｔＲＩＢＯＰＲＯＴＥＣＴＨｕＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＴ３５）、ｈｉｇｈＱｕＧｍｂＨＳｅｃｕｒＲＩＮＡｄｖａｎｃｅｄＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＮＩ０３０５）、ＥｎｚｙｎｏｍｉｃｓＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｍ００７）、ＭｅｒｉｄｉａｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲｉｂｏＳａｆｅＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＩＯ－６５０２７）、ＱＩＡＧＥＮＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ９２４０Ｌ）、ＬｕｃｉｇｅｎＲｉｂｏＧｕａｒｄＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＧ９０９２５）、ＪｅｎａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＰＣＲ３９２Ｓ）、ａｂｍＲＮａｓｅＯＦＦＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｇ１３８）、ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＲ０４００９０１）、ＢｉｏＦＡＣＴＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＩ１５２－２０ｈ）、ＣａｎｖａｘＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐ０２６９）、ＳｈｉｎｅＧｅｎｅＲＮａｓｉｎ（ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＺＰ００８０１）、ＴＯＹＯＢＯＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＩＮ－２０１）、またはこれらの組合わせから選択された群より一つであってもよい。前述のように、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤は、タンパク質に由来したものは分子が大きい特徴があり、前記分子が大きいタンパク質由来のＲＮＡ分解酵素抑制剤を用いる場合、後述する分子診断過程でのＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）の阻害を防止することができるが、ＰＶＳＡのような化学物質に由来したＲＮＡ分解酵素抑制剤は分子の大きさが小さいため、分子診断過程でのＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）を阻害する役目を果たすことがある。グアニジニウムイソチオシアネート（Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、ＧＩＴＣ）のような化学由来の物質も、ＲＮＡ分解酵素を抑制させるものの、ＰＣＲ反応の阻害が行われるものと知られている。また、ベータ－メルカプトエタノール（ｂｅｔａ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）のような還元剤もＲＮＡ分解酵素抑制剤として用いることができるが、還元剤は長期間の保管性および安全性の面でデメリットがある。したがって、前述のように、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤をタンパク質に由来したものから選択することによって、分子診断過程でのＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）の阻害を防止し、分子診断過程にかかる時間を減少させることができる。

【0038】

本発明の一実施形態によると、細胞溶解および核酸抽出用組成物は緩衝溶液を含む。前述のように、前記細胞溶解および核酸抽出用組成物が緩衝溶液を含むことによって、分子診断過程でのＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）の反応性を向上させ、分子診断過程にかかる時間を減少させることができる。

【0039】

本発明の一実施形態によると、前記緩衝溶液は、ｐＨ６．０以上ｐＨ９．０以下のものであってもよい。具体的には、前記緩衝溶液は、ｐＨ６．１以上ｐＨ８．９以下、ｐＨ６．２以上ｐＨ８．７以下、ｐＨ６．３以上ｐＨ８．６以下、ｐＨ６．４以上ｐＨ８．５以下、ｐＨ６．５以上ｐＨ８．４以下、ｐＨ６．６以上ｐＨ８．３以下、ｐＨ６．７以上ｐＨ８．２以下、ｐＨ６．８以上ｐＨ８．１以下、ｐＨ６．９以上ｐＨ８．０以下、ｐＨ７．０以上ｐＨ７．９以下、ｐＨ７．１以上ｐＨ７．８以下、ｐＨ７．２以上ｐＨ７．７以下、ｐＨ７．３以上ｐＨ７．６以下またはｐＨ７．４以上ｐＨ７．５以下であってもよい。前述の範囲で前記緩衝溶液のｐＨを調節することによって、前記細胞溶解過程での効率を向上させることができ、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤とＲＮＡ分解酵素との反応を促進させることができる。

【0040】

本発明の一実施形態によると、前記緩衝溶液は、グリセロール、ハイドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、ＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、塩化カリウムおよびこれらの組合わせから選択されたいずれか一つを含むものであってもよい。前述したことから前記緩衝溶液に含まれた成分を調節することによって、前記細胞溶解過程での効率を向上させることができ、前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤とＲＮＡ分解酵素との反応を促進させ、分子診断過程でのＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）の反応性を向上させ、分子診断過程にかかる時間を減少させることができる。

【0041】

【0042】

【0043】

図３は、本発明の一実施形態に係る分子診断方法のフローチャートである。人間から生物学的な検体を採取する検体採取ステップと、前記採取された検体を前記細胞溶解および核酸抽出用組成物に添加して混合物を製造するステップ（Ｓ１１０）と、前記混合物を１次加熱（インキュベイティング、ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）するステップ（Ｓ１３０）と、前記インキュベイティングされた混合物を２次加熱（熱溶解、ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）するステップ（Ｓ１５０）と、を含んでもよい。

【0044】

本発明の一実施形態によると、核酸を含む試料を細胞溶解および核酸抽出用組成物に添加して混合物を製造するステップ（Ｓ１１０）を含む。具体的には、前記細胞溶解および核酸抽出用組成物に核酸を含む試料、すなわち人間から採取された生物学的な検体を含むことによってＲＮＡ分解酵素が含まれているので、前記組成物に含まれたＲＮＡ分解酵素抑制剤を用いてＲＮＡ分解酵素を非活性化して、後述する２次加熱（熱溶解）ステップを行う前に細胞から溶出するＲＮＡなどをＲＮＡ分解酵素から保護することができる。さらに、特定のＲＮＡ分解酵素抑制剤を用いることによって、不要な成分を最小化してＰＣＲ感度を向上させることができ、分子診断にかかる時間を最小化することができる。

【0045】

本明細書の細胞溶解および核酸抽出方法で細胞溶解および核酸抽出用組成物と重複される内容は省略する。

【0046】

本発明の一実施形態によると、前記混合物製造ステップ（Ｓ１１０）以前に人間から生物学的な検体を採取するステップをさらに含んでもよい。具体的には、前記人間からの生物学的な検体は、血液、体液、唾液など核酸、すなわちＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む細胞などの検体として制限されることなく採取することができる。前述のように、前記混合物製造ステップ（Ｓ１１０）以前に人間から生物学的な検体を採取することによって、分子診断対象、すなわち新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ１９）の原因となるＳＡＲ－ＣｏＶ－２遺伝子などを増幅して分子診断を容易に行うことができる。

【0047】

本発明の一実施形態によると、前記混合物を２５℃以上４５℃以下の温度に維持する１次加熱するステップ（Ｓ１３０）を含む。具体的には、前記１次加熱ステップは、インキュベイティングするステップであって、前記混合物に含まれたＲＮＡ分解酵素とＲＮＡ分解酵素抑制剤が充分に結合して前記ＲＮＡ分解酵素を非活性化するステップであってもよい。より具体的には、１次加熱するステップの温度は、２６℃以上４４℃以下、２７℃以上４３℃以下、２８℃以上４２℃以下、２９℃以上４１℃以下、３０℃以上４０℃以下、３１℃以上３９℃以下、３２℃以上３８℃以下、３３℃以上３７℃以下または３４℃以上３７℃以下であってもよい。最も好ましくは、１次加熱するステップの温度を３７℃に維持することである。前述の範囲で前記１次加熱（インキュベイティング）するステップの温度を調節することによって、ＲＮＡ分解酵素とＲＮＡ分解酵素抑制剤の反応を促進させ、ＲＮＡ分解酵素を非活性化することができ、細胞の熱溶解前にＲＮＡ分解酵素を非活性化することによって、細胞から放出されるＲＮＡの分解を防止することができる。

【0048】

本発明の一実施形態によると、前記１次加熱された混合物を７５℃以上１００℃未満の温度に維持する２次加熱するステップ（Ｓ１５０）を含む。具体的には、前記２次加熱するステップは、細胞の熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）ステップであって、前記混合物に含まれ、核酸を含む試料、すなわち人間からの生物学的な検体である細胞を含む試料で前記細胞を溶解して細胞内に含まれた、すなわちＤＮＡおよび／またはＲＮＡを細胞の外に露出させるステップであってもよい。さらに、前記細胞の熱溶解とともにＲＮＡ分解酵素を非活性化する熱非活性化（ｔｈｅｒｍａｌｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を同時に具現するものであって、追加的にＰＣＲを阻害する細胞内の成分を非活性化することを同時に具現するものであってもよい。具体的には、２次加熱するステップ（Ｓ１５０）は、細胞の熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）、ＲＮＡ分解酵素の熱非活性化（ｔｈｅｒｍａｌｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）および細胞内の成分の非活性化を同時に具現するものであってもよい。具体的には、前記２次加熱するステップは、前記１次加熱された混合物を、７６℃以上９９℃以下、７７℃以上９８℃以下、７６℃以上９７℃以下、７７℃以上９６℃以下、７８℃以上９５℃以下、７９℃以上９４℃以下、８０℃以上９３℃以下、８１℃以上９２℃以下、８２℃以上９１℃以下、８３℃以上９０℃以下、８４℃以上８９℃以下、８５℃以上８８℃以下、８６℃以上８７℃以下に維持するものであってもよい。好ましくは、前記２次加熱するステップは、前記１次加熱された混合物を９４．５℃以上９５．５℃以下または９５℃に維持するものであってもよい。前述の範囲で前記２次加熱（熱溶解）するステップの温度を調節することによって、別途のＲＮＡ分解酵素を抑制するための添加物を省略し、核酸以外の物質の濃度を低く維持して最大限阻害要素を除くことができ、別途のＲＮＡ分解酵素を抑制するための添加物を含まないため、前記添加物によるＰＣＲ阻害を防止することができる。また、ＲＮＡ分解酵素Ａ以外のＲＮＡ分解酵素を非活性化すると同時に、細胞内物質を非活性化し、細胞を熱溶解して細胞内の核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を露出して分子診断にかかる時間を減少させることができる。

【0049】

本発明の一実施形態によると、前記核酸を含む試料を用いて核酸を抽出した以後、別途に溶離ステップおよび精製ステップを含まない。前述のように、核酸抽出した以後、別途に溶離ステップおよび精製ステップを含まないことによって、分子診断にかかる時間を減少させることができ、核酸抽出のための消耗品や専用の装置を用いないため、費用を節減させることができる。

【0050】

本発明の一実施形態によると、前記１次加熱するステップおよび２次加熱するステップは、それぞれ１分以上３０分以下で行うものであってもよい。具体的には、前記１次加熱するステップおよび２次加熱するステップは、それぞれ２分以上２９分以下、３分以上２８分以下、４分以上２７分以下、５分以上２６分以下、６分以上２５分以下、７分以上２４分以下、８分以上２３分以下、９分以上２２分以下、１０分以上２１分以下、１１分以上２０分以下、１２分以上１９分以下、１３分以上１８分以下、１４分以上１７分以下または１５分以上１６分以下で行うものであってもよい。より具体的には、前記１次加熱するステップおよび２次加熱するステップは、それぞれ４．５分以上５．５分以下または５分間行われるものであってもよい。前述の範囲で前記１次加熱するステップおよび２次加熱するステップのそれぞれが行われる時間を調節することによって、ＲＮＡ分解酵素の非活性化を極大化することができ、細胞の熱溶解効果を向上させることができる。

【0051】

本発明の一実施形態によると、前記混合物におけるＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度は、前記混合物の体積が３０μＬであることを基準に、７．５Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上６０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下のものであってもよい。前記混合物におけるＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度は、全体体積の増加または減少によって変化することができる。具体的には、前記混合物におけるＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度は、７．５Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上６０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下、８．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上５９．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下、９．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上５８．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下、１０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上５７．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下、１５．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上５５．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下、２０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上５０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下、２５．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上４５．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下、３０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上４０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下であってもよい。より具体的には、前記混合物におけるＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度は、７．５Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上５２．５Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下、３０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上５２．５Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下または３０．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以上４５．０Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ以下であってもよい。前述の範囲で前記混合物におけるＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度を調節することによって、前記細胞の熱溶解以前にＲＮＡ分解酵素の非活性化を極大化することができ、前記細胞の熱溶解以後に、前記細胞から露出されるＲＮＡの分解を防止することができ、以後にＰＣＲを阻害する要素を最小化して分子診断にかかる時間を減少させることができる。

【0052】

本明細書において、単位「Ｕｎｉｔ／ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｕ／ｒｘｎ）」は、１回の反応当たり５ｎｇのＲＮＡ分解酵素Ａの活性を５０％阻害するために要求されるＲＮＡ分解酵素抑制剤の量を意味する。

【0053】

【0054】

【0055】

前記図３を参考にすると、本発明の一実施形態によると、前記細胞溶解および核酸抽出方法で抽出された核酸を含む混合物にプライマーおよびプローブが含まれた溶液と、プレミックスとを添加するステップ（Ｓ１７０）を含む。本明細書において、プライマーおよびプローブが含まれた溶液と、プレミックスとを含む組成物は、「ＰＣＲ試料」を意味する。具体的には、プライマーおよびプローブが含まれた溶液と、プレミックスとを含むＰＣＲ試料を、前記細胞溶解および核酸抽出方法で抽出された核酸を含む混合物に添加することによって、核酸の増幅に用いられる成分を完備して容易に核酸を増幅することができる。

【0056】

本発明の一実施形態によると、ＰＣＲ試料は、プライマーを含み、前記プライマーの塩基配列は特別に限定されるものではないが、前記プライマーは、ＣＤＣ（米国疾病管理予防センター）で公開した２０１９－ＣＯＶＩＤプライマー配列（Ｎ１）を用いることができる。前記配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｔ－ｐｃｒ－ｐａｎｅ；－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｐｄｆで公開するものであってもよく、ＰＣＲ反応が行われるものであれば、制限されることなく用いることができる。

【0057】

本発明の一実施形態によると、ＰＣＲ試料はプローブを含み、前記プローブの塩基配列は特別に限定されるものではないが、前記プローブは、ＣＤＣ（米国疾病管理予防センター）で公開した２０１９－ＣＯＶＩＤプローブ配列（Ｎ１）を用いることができる。前記配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｔ－ｐｃｒ－ｐａｎｅ；－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｐｄｆで公開するものであってもよく、ＰＣＲ反応が行われるものであれば、制限されることなく用いることができる。

【0058】

本発明の一実施形態によると、ＰＣＲ試料はプレミックスを含み、前記プレミックスは特別に限定されるものではないが、Ｎａｎｏｈｅｌｉｘ社のＲｅａｌＨｅｌｉｘＴＭｑＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ［ｖ６］（ＵＤＧＳｙｓｔｅｍ）を用いることが好ましく、ＰＣＲ反応が行われるものであれば、制限されることなく用いることができる。

【0059】

本発明の一実施形態によると、前記添加するステップは、前記細胞溶解および核酸抽出方法で抽出された核酸を含む混合物が含まれたｗｅｌｌ（またはチューブ）にプライマーおよびプローブが含まれた溶液と、プレミックス、すなわちＰＣＲ試料を添加するものであってもよい。前述のように、前記混合物から試料を採取して別途のチューブに置き、前記ＰＣＲ試料を添加しないことによって、前記抽出された核酸を全て核酸の増幅に用いるようにしてターゲット遺伝子の損失を最小化してＰＣＲ性能を極大化することができる。また、別途の溶液移動過程が不要であるため、ＰＣＲ準備時間を減少させることができる。さらに、前記細胞の熱溶解によって露出した核酸を最大限用いて、添加されるＰＣＲ試料による濃度の希薄を防止し、分子診断にかかる時間と添加物によるＰＣＲ阻害を防止することができる。

【0060】

本発明の一実施形態によると、前記分子診断方法は、前記抽出された核酸を重合酵素連鎖反応で増幅するステップ（Ｓ１９０）を含む。具体的には、前記重合酵素連鎖反応で増幅するステップは、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｓ１９１）とＰＣＲ（Ｓ１９３）とが順次に行われるものであってもよい。前述のように、前記抽出された核酸を重合酵素連鎖反応で増幅することによって、分子診断のための核酸を確保することができ、分子診断のためにかかる時間を最小化することができる。

【0061】

本発明の一実施形態によると、前記分子診断方法は、前記プライマーおよびプローブが含まれた溶液と、プレミックスとが添加されたｗｅｌｌ（またはチューブ）を、別途の精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）なしに重合酵素連鎖反応で核酸を増幅するものであってもよい。前述のように、ＰＣＲ試料が添加されたｗｅｌｌに別途の精製を行わずに重合酵素連鎖反応で核酸を増幅することによって、分子診断にかかる時間を最小化することができる。

【0062】

本発明の一実施形態は、ＲＮＡ分解酵素抑制剤と、緩衝溶液とを含む組成物の細胞溶解および核酸抽出の用途を提供する。

【0063】

本発明の一実施形態は、ＲＮＡ分解酵素抑制剤と、緩衝溶液とを含む組成物を含む、細胞溶解および核酸抽出用または分子診断用キットを提供する。

【0064】

本発明の一実施形態は、ＲＮＡ分解酵素抑制剤と、緩衝溶液とを含む組成物の、細胞溶解および核酸抽出用または分子診断用キットの製造のための用途を提供する。

【0065】

本発明の一実施形態では、ＲＮＡ分解酵素抑制剤および緩衝溶液を含む組成物を用いて溶液の精製過程および溶離過程を省略し、前記溶解された溶液を用いて重合酵素連鎖反応を行うことによって、核酸を増幅して分子診断する過程でかかる時間を最小することができるので、細胞溶解および核酸抽出の用途、細胞溶解および核酸抽出用または分子診断用キットおよびこれの製造のための用途として活用することができる。

【0066】

本発明の一実施形態に係る細胞溶解および核酸抽出の用途、キット、キットの製造のための用途について、細胞溶解および核酸抽出用組成物、分子診断法、ＲＮＡ分解酵素抑制剤、緩衝溶液については前記説明した通りである。

【0067】

［実施例］
以下、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて詳細に説明することにする。しかし、本発明に係る実施例は様々な他の形態に変形することができ、本発明の範囲が下記で記述する実施例に限定されるものと解釈されない。本明細書の実施例は、当業界における平均的な知識を有した者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。

【0068】

＜実施例１ないし４で用いられる化合物およびＰＣＲ実行条件＞
下記の実施例１ないし４で採取された検体は、クリニカル（臨床）スワブ（ｃｌｉｎｉｃａｌｓｗａｂ）を用いて採取した後、ウイルス輸送培地（ｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｐｏｒｔｍｅｄｉａ）に保管した検体に該当し、追加的に添加するＲＮＡ試料は精製されたターゲットＲＮＡを用いた。

【0069】

さらに、下記の実施例１ないし４で用いられたＲＮＡ分解酵素抑制剤は、マウスの肺に由来したＲＮＡ分解酵素抑制剤（ｎａｎｏｈｅｌｉｘ社のＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い、緩衝溶液は、グリセロール、ハイドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、ＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）および塩化カリウムを混合したものを用いた。

【0070】

また、下記の実施例１ないし４でＰＣＲを行うために添加されるＰＣＲ試料のプローブは、ＣＤＣ（米国疾病管理予防センター）で公開した２０１９－ＣＯＶＩＤプローブ配列（Ｎ１）を用い、前記配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｔ－ｐｃｒ－ｐａｎｅ；－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｐｄｆで公開するものであり、プライマーは、ＣＤＣ（米国疾病管理予防センター）で公開した２０１９－ＣＯＶＩＤプライマー配列（Ｎ１）を用い、前記配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｔ－ｐｃｒ－ｐａｎｅ；－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｐｄｆで公開するものを用いた。さらに、プレミックスは、Ｎａｎｏｈｅｌｉｘ社のＲｅａｌＨｅｌｉｘＴＭｑＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ［ｖ６］（ＵＤＧＳｙｓｔｅｍ）を用いた。

【0071】

下記の実施例１ないし４でＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを行った条件は、（１）５０℃で１０分間行い、（２）９５℃で５分間行った後、（３）９５℃で１０秒間／５８℃で３０秒間行うことである（３）のみを４０回繰り返し、この過程で、前記核酸を増幅して結果が確認できる最小限の閾値回数であるＣｔ（ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅ）を測定した。

【0072】

実施例１（熱溶解による効果確認）
図４は、実施例１に係る分子診断方法の概略図と実施例１－１および１－２のＣｔ値を示したグラフである。

【0073】

具体的には、図４（ａ）は、実施例１に係る分子診断方法の概略図である。前記図４（ａ）を参考にすると、実施例１－１では核酸を含む検体を採取し、前記採取された検体に蒸溜水を添加して熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を９５℃で５分間行った。以後、別途に培養したＲＮＡ試料をＲＴ－ＰＣＲを行う前に添加し、以後ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを順次に行った。

【0074】

実施例１－２は、前記実施例１－１で熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を行わないことを除いては、前記実施例１－１と同様に行った。

【0075】

図４（ｂ）は、実施例１－１および１－２のＣｔ値を示したグラフである。前記図４（ｂ）を参考にすると、実施例１－１のＣｔ値が実施例１－２に比べて０．５低いことを確認し、これは熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）過程で、前記検体とともに存在するＰＣＲ阻害物質（ＲＮＡ分解酵素Ａを除いたＲＮＡ分解酵素）が非活性化になって現われたものであることを確認した。

【0076】

実施例２（ＲＮＡ分解酵素抑制剤の種類による効果確認）
図５は、実施例２に係る分子診断方法の概略図と実施例２－１ないし２－４のＣｔ値を示したグラフである。

【0077】

具体的には、図５（ａ）は、実施例２に係る分子診断方法の概略図である。前記図５（ａ）を参考にすると、実施例２－１では核酸を含む検体を採取し、前記採取された検体に蒸溜水を添加して熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を９５℃で５分間行った。以後、別途に培養したＲＮＡ試料をＲＴ－ＰＣＲを行う前に添加し、以後ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを順次に行った。

【0078】

実施例２－２は、前記実施例２－１で前記ＲＮＡ試料を蒸溜水に検体とともに添加したことを除いては、前記実施例２－１と同様に行った。

【0079】

実施例２－３は、前記実施例２－２で蒸溜水の代わりに前記ＲＮＡ分解酵素抑制剤を添加した蒸溜水を用いることを除いては、前記実施例２－２と同様に行った。

【0080】

実施例２－４は、前記実施例２－２で蒸溜水の代わりに前記化学物質に由来したＲＮＡ分解酵素抑制剤であるＰＶＳＡ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）を添加した蒸溜水を用いることを除いては、前記実施例２－２と同様に行った。

【0081】

図５（ｂ）は、実施例２－１ないし２－４のＣｔ値を示したグラフである。前記図５（ｂ）を参考にすると、実施例２－１は検体に含まれたＲＮＡ分解酵素が熱溶解によって大部分非活性化し、残りのＲＮＡ分解酵素Ａだけが一部影響を与えるので、ＲＴ－ＰＣＲ直前に添加されたＲＮＡ試料が増幅され、低いＣｔ値を有することを確認した。これに比べて、実施例２－２は検体に含まれたＲＮＡ分解酵素が熱溶解以前に一部影響を与えるので、Ｃｔ値が増加し、実施例２－１に比べて同一の条件で順序だけを変更してもおおよそ４．８ないし８程度の高いＣｔ値を有することを確認した。さらに、実施例２－３の場合、検体とともにＲＮＡ分解酵素抑制剤を添加するので、前記ＲＮＡ分解酵素Ａは非活性化して、実施例２－２に比べて２．６程度の低いＣｔ値が具現されることを確認した。但し、実施例２－４は、タンパク質由来のＲＮＡ分解酵素抑制剤ではなく、化学物質由来のＲＮＡ分解酵素抑制剤を用いるので、ＰＣＲを阻害する効果によってＣｔ値が、実施例２－２に比べてＣｔ値が０．０２高く具現されることを確認した。

【0082】

実施例３（緩衝溶液による効果確認）
図６は、実施例３に係る分子診断方法の概略図と実施例３－１および３－２のＣｔ値を示したグラフである。

【0083】

図６（ａ）は、実施例３に係る分子診断方法の概略図である。図６（ａ）を参考にすると、実施例３－１では核酸を含む検体を採取し、前記採取された検体に蒸溜水と別途に培養したＲＮＡ試料を添加して熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を９５℃で５分間行った。以後、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを順次に行った。

【0084】

実施例３－２は、前記実施例３－１で蒸溜水の代わりに緩衝溶液を用いることを除いては、前記実施例３－１と同様に行った。

【0085】

図６（ｂ）は、実施例３－１および３－２のＣｔ値を示したグラフである。前記図６（ｂ）を参考にすると、前記実施例３－２のＣｔ値が、前記実施例３－１に比べて１．８低く具現されることから、緩衝溶液のみを変化させてもＰＣＲ増幅効果を向上させることを確認した。

【0086】

実施例４（熱溶解、緩衝溶液およびＲＮＡ分解酵素抑制剤の種類による効果確認）
図７は、実施例４に係る分子診断方法の概略図と実施例４－１および４－２のＣｔ値を示したグラフである。

【0087】

具体的には、図７（ａ）は、実施例４に係る分子診断方法の概略図である。前記図７（ａ）を参考にすると、実施例４－１では核酸を含む検体を採取し、前記採取された検体を蒸溜水と別途に培養したＲＮＡ試料に添加して熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を９５℃で５分間行った。以後、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを順次に行った。

【0088】

実施例４－２では核酸を含む検体を採取し、前記採取された検体を蒸溜水に添加して熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を９５℃で５分間行った。以後、別途に培養したＲＮＡ試料をＲＴ－ＰＣＲを行う前に添加し、以後ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを順次に行った。

【0089】

図７（ｂ）は、実施例４－１および４－２のＣｔ値を示したグラフである。前記図７（ｂ）を参考にすると、実施例４－１は検体とともに存在するＲＮＡ分解酵素によってＲＮＡ試料が分解され、核酸の増幅のためのＲＮＡの濃度が低くなるので、Ｃｔ値が高く具現されることを確認することができ、これに比べて、実施例４－２は、核酸の増幅のためのＲＴ－ＰＣＲ直前にＲＮＡ試料を添加するので、前記ＲＮＡの非活性化が極めて少量進行されるため、高い濃度のＲＮＡが含まれ、Ｃｔ値が４．７と低く具現されることを確認した。

【0090】

図８は、実施例４－３ないし４－６に係る分子診断方法の概略図である。前記図８を参考にすると、実施例４－３は、前記実施例４－１で熱溶解過程を追加したことを除いては、前記実施例４－１と同様に行った。

【0091】

実施例４－４は、前記実施例４－３の蒸溜水にＲＮＡ分解酵素抑制剤を添加したことを除いては、前記実施例４－３と同様に行った。

【0092】

実施例４－５は、前記実施例４－３の蒸溜水に緩衝溶液を添加したことを除いては、前記実施例４－３と同様に行った。

【0093】

実施例４－６は、前記実施例４－３の蒸溜水にＲＮＡ分解酵素抑制剤および緩衝溶液を添加したことを除いては、前記実施例４－３と同様に行った。

【0094】

前記実施例４－３は、前記実施例４－１に比べてＣｔ値が０．５低く具現されたことを確認し、これは検体に含まれたＲＮＡ分解酵素が熱溶解過程で熱非活性化して具現されたものであることを確認した。

【0095】

さらに、実施例４－４は、前記実施例４－１に比べてＣｔ値が３．１低く具現されたことを確認し、これは実施例４－３で確認した熱非活性化効果とＲＮＡ分解酵素抑制剤がＲＮＡ分解酵素Ａを除去して分解されるＲＮＡを最小化することによって具現されたものであることを確認した。

【0096】

また、実施例４－５は、前記実施例４－１に比べてＣｔ値が１．８低く具現されたことを確認し、これは緩衝溶液がＰＣＲ増幅効果を向上させることを確認した。

【0097】

なお、実施例４－６は、前記実施例４－１に比べてＣｔ値が４．９低く具現されたことを確認し、これは実施例４－３で確認した熱非活性化効果と、実施例４－４で確認したＲＮＡ分解酵素抑制剤のＲＮＡ分解酵素Ａを非活性化効果が具現されるとともに、実施例４－５で確認した緩衝溶液のＰＣＲで阻害する要素を防止する効果をいずれも具現することによって、実施例４－２と同等の水準のＣｔ値を具現できることを確認した。

【0098】

＜製造例＞
下記の製造例で採取された検体は、クリニカル（臨床）スワブ（ｃｌｉｎｉｃａｌｓｗａｂ）を用いて採取した後、ウイルス輸送培地（ｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｐｏｒｔｍｅｄｉａ）に保管した検体を用いた。

【0099】

さらに、下記の製造例で用いられたＲＮＡ分解酵素抑制剤は、マウスの肺に由来したＲＮＡ分解酵素抑制剤（ｎａｎｏｈｅｌｉｘ社のＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い、緩衝溶液は、グリセロール、ハイドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、ＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）および塩化カリウムを混合したものを用いた。また、前記採取された検体、ＲＮＡ分解酵素抑制剤および緩衝溶液を混合した混合物を製造した。

【0100】

また、下記の製造例でＰＣＲを行うために添加されるＰＣＲ試料のプローブは、ＣＤＣ（米国疾病管理予防センター）で公開した２０１９－ＣＯＶＩＤプローブ配列（Ｎ１）を用い、前記配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｔ－ｐｃｒ－ｐａｎｅ；－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｐｄｆで公開するものであり、プライマーは、ＣＤＣ（米国疾病管理予防センター）で公開した２０１９－ＣＯＶＩＤプライマー配列（Ｎ１）を用い、前記配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｔ－ｐｃｒ－ｐａｎｅ；－ｐｒｉｍｅｒ－ｐｒｏｂｅｓ．ｐｄｆで公開するものを用いた。さらに、プレミックスは、Ｎａｎｏｈｅｌｉｘ社のＲｅａｌＨｅｌｉｘＴＭｑＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ［ｖ６］（ＵＤＧＳｙｓｔｅｍ）を用いた。

【0101】

下記の製造例でＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを行った条件は、（１）５０℃で１０分間行い、（２）９５℃で５分間行った後、（３）９５℃で１０秒間／５８℃で３０秒間行うことである（３）のみを４０回繰り返し、この過程で、前記核酸を増幅して結果が確認できる最小限の閾値回数であるＣｔ（ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅ）を測定した。

【0102】

実験例１（従来の抽出過程が含まれたＰＣＲと比較）
図９は、従来技術であるＲＮＡの抽出過程および精製過程を含むＰＣＲと製造例のＣｔ値を示したグラフである。

【0103】

製造例では、核酸を含む検体を採取し、前記採取された検体に蒸溜水、ＲＮＡ分解酵素抑制剤および緩衝溶液を添加して熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を９５℃で５分間行った。以後、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを順次に行った。

【0104】

前記図９を参考にすると、前記図１のように、従来技術でＰＣＲを行ったことを前記製造例と比較した結果である。検体にＲＮＡ分解酵素抑制剤を含む緩衝溶液を添加して熱溶解を通じて行う場合、既存のＰＣＲ方法に比べて同等の水準でＣｔ値が具現されることを確認した。

【0105】

実験例２（１次加熱ステップの混合物内のＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度による効果確認）
図１０は、製造例の１次加熱ステップ（インキュベイティング）でＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度によるＣｔ値を示したグラフである。

【0106】

具体的には、製造例でＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを行う以前に、前記製造例の混合物の濃度を異ならせて前記混合物を３７℃で５分間１次加熱ステップ（インキュベイティング）を行い、前記濃度によってＣｔ値を測定した。より具体的には、製造例では核酸を含む検体を採取し、前記採取された検体を蒸溜水、ＲＮＡ分解酵素抑制剤および緩衝溶液に添加して熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を９５℃で５分間行った。以後、前記製造例の混合物の濃度を異ならせて前記混合物を３７℃で５分間１次加熱ステップ（インキュベイティング）を行い、次にＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを順次に行った。前記変化された濃度は、０Ｕｎｉｔ／Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｕ／ｒｘｎ）、７．５Ｕ／ｒｘｎ、１５Ｕ／ｒｘｎ、２２．５Ｕ／ｒｘｎ、３０Ｕ／ｒｘｎ、３７．５Ｕ／ｒｘｎ、４５Ｕ／ｒｘｎおよび５２．５Ｕ／ｒｘｎであり、それぞれの濃度に対してＣｔ値を測定した。

【0107】

前記図１０を参考にすると、０Ｕ／ｒｘｎでは、ＲＮＡ分解酵素抑制剤が含まれないため、Ｃｔ値が高く具現されることを確認した。以後７．５Ｕ／ｒｘｎないし４５Ｕ／ｒｘｎの濃度では、ＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度増加によってＣｔ値が増々減少することを確認した。但し、５２．５Ｕ／ｒｘｎの場合、ＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度が増加してもＣｔ値が増加することを確認できるが、７．５Ｕ／ｒｘｎの濃度に比べてＣｔ値が低いことを確認した。

【0108】

実験例３（１次加熱ステップの温度による効果確認）
図１１は、製造例の１次加熱ステップの温度によるＣｔ値を示したグラフである。

【0109】

具体的には、製造例でＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを行う以前に、前記製造例の混合物でＲＮＡ分解酵素抑制剤の濃度を３０Ｕ／ｒｘｎに固定し、前記混合物を５分間１次加熱ステップ（インキュベイティング）の温度を変化させながら行い、前記温度によってＣｔ値を測定した。より具体的には、製造例では核酸を含む検体を採取し、前記採取された検体を蒸溜水、ＲＮＡ分解酵素抑制剤および緩衝溶液に添加して熱溶解（ｔｈｅｒｍａｌｌｙｓｉｓ）を９５℃で５分間行った。以後、前記製造例の混合物の濃度を３０Ｕ／ｒｘｎに固定し、前記混合物の温度を変化させながら５分間１次加熱ステップ（インキュベイティング）を行い、次にＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲを順次に行った。前記変化させた温度は、２５℃、３７℃、４５℃および６０℃であり、それぞれの温度に対してＣｔ値を測定した。

【0110】

前記図１１を参考にすると、２５℃ないし３７℃の温度では、Ｃｔ値が一定に具現されることを確認した。以後、４５℃を以上の温度に対してＣｔ値が増加することから温度が４５℃以上に具現される場合、ＲＮＡ分解酵素抑制剤が阻害されることを確認した。

【0111】

したがって、本発明の一実施形態に係る細胞溶解および核酸抽出用組成物、これを用いた核酸抽出方法およびこれを用いた分子診断方法は、核酸を抽出するための組成物としてＲＮＡ分解酵素抑制剤を含むとともに加熱してＲＮＡ分解酵素を非活性にすることによって、別途の核酸精製過程を省略し、全体実験時間を短縮することができ、ＲＮＡ損傷を最小化してＰＣＲ性能を改善させることができる。

【0112】

以上より、本発明は限定された実施例によって説明されているが、本発明はこれによって限定されず、本発明の属する技術分野における通常の知識を有した者によって本発明の技術思想と下記に記載される特許請求の範囲の均等範囲内で多様な修正および変形が可能であることは言うまでもない。

【産業上の利用可能性】

【0113】

本発明の細胞溶解および核酸抽出用組成物は、別途の細胞が溶解された溶液の精製過程および溶離過程を省略し、前記溶解された溶液を用いて重合酵素連鎖反応を行うことによって、核酸を増幅して分子診断する過程でかかる時間を最小することができ、核酸を抽出する過程で加熱を通じて重合連鎖反応の正確性を阻害する要素を非活性化することによって、分子診断の正確性を向上させることができるので、産業上の利用可能性がある。

【符号の説明】

【0114】

Ｓ１０：検体採取ステップ
Ｓ３０：抽出ステップ
Ｓ３１：溶解ステップ
Ｓ３３：溶離ステップ
Ｓ５０：精製ステップ
Ｓ７０：ＲＴ－ＰＣＲ
Ｓ９０：ＰＣＲ
Ｓ１１０：検体を含む混合物製造ステップ
Ｓ１３０：１次加熱（インキュベイティング）ステップ
Ｓ１５０：２次加熱（熱溶解）ステップ
Ｓ１７０：ＰＣＲ試料添加ステップ
Ｓ１９０：核酸の増幅ステップ
Ｓ１９１：ＲＴ－ＰＣＲ
Ｓ１９３：ＰＣＲ

【図1】