特表 2024-527098 以前の免疫から逃れるように進化する変異体を含むウイルス感染症を治療するための複数のウイルスエピトープに対するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を開発するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】以前の免疫から逃れるように進化する変異体を含むウイルス感染症を治療するための複数のウイルスエピトープに対するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞を開発するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20240711BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240711BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240711BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240711BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240711BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

A61K35/17

A61P31/12

A61P31/14

A61K45/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024505312

(86)(22)【出願日】2022-07-29

(85)【翻訳文提出日】2024-01-29

(86)【国際出願番号】 US2022038749

(87)【国際公開番号】W WO2023009770

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】63/227,690

(32)【優先日】2021-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523218441

【氏名又は名称】テヴォジェン バイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】サアディ， ライアン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AC20

4B065BA24

4B065BA30

4B065BB19

4B065CA44

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZB331

4C084ZB332

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087DA31

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB33

(57)【要約】

本明細書では、出現したウイルス株に対するペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を調製する方法が開示される。この方法は、以前のＣＴＬが感作されたウイルスの以前の株に特異的な初期ペプチド組成物を提供することであって、以前のＣＴＬが、ウイルスの以前の株に対する効力と比較して、出現したウイルス株に対する効力が低下している、ことと、初期ペプチド組成物中の、ウイルスの以前の株に対する免疫優性ペプチドを同定することと、初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合を減少させて、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物を得ることと、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物で単核細胞を感作し、それによって出現したウイルス株に対するペプチド特異的ＣＴＬの増殖を生じさせることとを含む。ウイルスはＳＡＲＳ－ＣＯＶ２（ＣＯＶＩＤ－１９）であることができ、出現した株はデルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５であることができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

出現したウイルス株に対するペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を調製する方法であって、
ａ．以前のＣＴＬが感作された前記ウイルスの以前の株に特異的な初期ペプチド組成物を提供することであって、前記以前のＣＴＬが、前記ウイルスの以前の株に対する効力と比較して、前記出現したウイルス株に対する効力が低下している、前記提供することと、
ｂ．前記初期ペプチド組成物中の、前記ウイルスの以前の株に対する免疫優性ペプチドを同定することと、
ｃ．前記初期ペプチド組成物中の前記免疫優性ペプチドの割合を減少させて、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物を得ることと、
ｄ．前記免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物で単核細胞を感作し、それによって前記出現したウイルス株に対するペプチド特異的ＣＴＬの増殖を生じさせることとを含む、前記方法。

【請求項2】

前記免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中の前記免疫優性ペプチドの割合が少なくとも３０％であるか、または前記初期ペプチド組成物中の前記免疫優性ペプチドの割合未満である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記免疫優性ペプチドが、前記免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中に本質的に存在しない、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記出現した株がデルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ａ１対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｂ７対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｂ４０対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｃｗ７対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ａ１、－Ａ２、－Ｂ７、－Ｂ４０、－Ｃｗ７対立遺伝子のいずれか１つ以上に結合するペプチドの組み合わせを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

出現したウイルス株を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法に従って調製された有効量のペプチド特異的ＣＴＬを投与することを含む、前記方法。

【請求項13】

前記ペプチド特異的ＣＴＬの調製の対象となるウイルスがＣＯＶＩＤ－１９である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記出現した株がデルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

更に、
前記ＣＴＬを投与する前に、１種以上の前投薬を投与することを含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

更に、
前記ＣＴＬの投与前、投与と同時、または投与後に１種以上の抗ウイルス製剤を投与することを含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法に従って調製されるペプチド特異的ＣＴＬを含む医薬組成物。

【請求項18】

前記ペプチド特異的ＣＴＬの調製の対象となるウイルスがＣＯＶＩＤ－１９である、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記出現した株がデルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中の前記免疫優性ペプチドの割合が少なくとも３０％であるか、または前記初期ペプチド組成物中の前記免疫優性ペプチドの割合未満である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記免疫優性ペプチドが、前記免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中に本質的に存在しない、請求項２０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２２７，６９０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

感染症は、２０世紀の終わりまで、早死と身体障害という世界最大の負担の原因となっていたが、その後、その区別は非感染性疾患に移った。感染症の中で、ウイルス感染は、パンデミックの脅威が出現する可能性を秘めた世界的な主要な健康問題である。

【0003】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）により、世界中で４００万人以上が死亡した。ワクチン接種により死亡率は減少したが、活動性感染症に対する治癒的療法の必要性は依然として残っている。ワクチン接種後の免疫の持続期間とこのウイルスによる変異進化の速さに関する不確実性は、予防策だけに頼るのは賢明ではないことを示唆している。

【0004】

体液性免疫及び細胞性免疫は、標的エピトープを除去した変異株の出現に対して選択圧を与える。免疫優性エピトープの除去は、新たに出現する株に対して最も強力な利点を提供し、その結果、免疫優性エピトープは、新たに出現する変異体における亜優性エピトープと比較して優先的に除去されると予想される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫学的治療は、新しい配列情報が利用可能になるにつれて継続的に再評価される必要がある。

【0005】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は２０１９年後半以来、世界の保健コミュニティの注目を集めているが、免疫優性エピトープの除去及び新しい変異体の出現は、ヒト及び他の動物種における多くのウイルス感染症に存在する現象である。

【0006】

したがって、感染性ウイルスの新たに出現する変異体から人間や動物の健康をよりよく守るために、多くのウイルスに対する免疫学的治療を再評価する技術が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示は、出現したウイルス株に対するペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を調製する方法に関する。

【0008】

この方法は、以前のＣＴＬが感作されたウイルスの以前の株に特異的な初期ペプチド組成物を提供することを含むことができ、ここで、以前のＣＴＬは、ウイルスの以前の株に対する効力と比較して、出現したウイルス株に対する効力が低下している。

【0009】

いくつかの実施形態では、以前のＣＴＬは、以前の株と比べて出現した株では免疫優性ペプチド標的が失われているため、出現したウイルス株に対する効力が低下する可能性がある。

【0010】

この方法は、初期ペプチド組成物中の、ウイルスの以前の株に対する免疫優性ペプチドを同定することを含むことができる。

【0011】

この方法は、初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合を減少させて、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物を得ることを含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合は少なくとも３０％であるか、または初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合未満であり得る。いくつかの実施形態では、免疫優性ペプチドは、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中に本質的に存在しない可能性がある。

【0012】

この方法は、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物で単核細胞を感作し、それによって出現したウイルス株に対するペプチド特異的ＣＴＬの増殖を生じさせることを含むことができる。

【0013】

この方法は、任意のウイルスの任意の出現した株に対するペプチド特異的ＣＴＬを調製するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）であり得る。いくつかの実施形態では、出現した株は、デルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５であり得る。

【0014】

この方法は、任意のＨＬＡ対立遺伝子に対して拘束される初期ペプチド組成物と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ａ１対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｂ７対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｂ４０対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｃｗ７対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ａ１、Ａ２、Ｂ７、Ｂ４０、Ｃｗ７対立遺伝子のいずれか１つ以上に結合するペプチドの組み合わせを含むことができる。

【0015】

本開示はまた、出現したウイルス株を治療する方法にも関する。この方法は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載の方法に従って調製された有効量のペプチド特異的ＣＴＬを投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、治療方法において、ペプチド特異的ＣＴＬの調製の対象となるウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９であり得る。いくつかの実施形態では、治療方法において、出現した株は、デルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５であり得る。

【0016】

いくつかの実施形態では、治療方法は、ＣＴＬを投与する前に１種以上の前投薬を投与することを更に含むことができる。

【0017】

いくつかの実施形態では、治療方法は、ＣＴＬの投与前、投与と同時、または投与後に１種以上の抗ウイルス製剤を投与することを更に含むことができる。

【0018】

本開示はまた、本明細書に記載の方法に従って調製されるペプチド特異的ＣＴＬを含む医薬組成物にも関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物において、ペプチド特異的ＣＴＬの調製の対象となるウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物において、出現した株は、デルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５であり得る。

【0019】

いくつかの実施形態では、医薬組成物において、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合は少なくとも３０％であるか、または初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合未満であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物において、免疫優性ペプチドは、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中に本質的に存在しない可能性がある。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A】実施例１に記載されるように、ＨＬＡ拘束性にＣＯＶＩＤ－１９遺伝子／ＯＲＦ産物に由来するペプチドを認識するＣＤ８＋ＣＴＬを含む組成物についての四量体染色アッセイの結果を示す図である。

【0021】

【図1B】実施例１に記載の、ＨＬＡ拘束性にＣＯＶＩＤ－１９遺伝子／ＯＲＦ産物に由来するペプチドを認識するＣＤ８＋ＣＴＬを含む組成物についての細胞毒性アッセイの結果を示す図である。

【0022】

【図2A】実施例１に記載されるように、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合する７つのペプチドを含む組成物について、２人のドナーからのアフェレーシス産物から生成されたＣＴＬの四量体染色アッセイによって測定した免疫優性の円グラフを示す図である。

【0023】

【図2B】実施例１に記載されるように、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１に結合する８つのペプチドを含む組成物について、１人のドナーからのアフェレーシス産物から生成されたＣＴＬの四量体染色アッセイによって測定した免疫優性の円グラフを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本開示は、出現したウイルス株に感染した対象の免疫学的治療に使用できるペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の調製に関する。ＣＴＬは、以前のＣＴＬが感作されたウイルスの以前の株に特異的な初期ペプチド組成物を提供することであって、以前のＣＴＬが、ウイルスの以前の株に対する効力と比較して、出現したウイルス株に対する効力が低下している、ことと、初期ペプチド組成物中の、ウイルスの以前の株に対する免疫優性ペプチドを同定することと、初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合を減少させて、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物を得ることと、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物で単核細胞を感作し、それによって出現したウイルス株に対するペプチド特異的ＣＴＬの増殖を生じさせることとによって調製することができる。

【0025】

本開示で引用されるすべての出版物及び特許は、その全体が参照により組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するかまたは一致しない場合、本明細書はそのような資料に優先する。本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本開示に対する先行技術であることを認めるものではない。値の範囲が表現される場合、その範囲内の任意の特定の値を使用する実施形態が含まれる。更に、範囲内に記載された値への言及には、その範囲内のあらゆる値が含まれる。すべての範囲は端点を含み、結合可能である。先行詞「約」を使用して値が近似値として表現される場合、その特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。特定の数値への言及には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、少なくともその特定の値が含まれる。「または」の使用は、その使用の特定の文脈で別段の指示がない限り、「及び／または」を意味する。

【0026】

本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって説明の態様に関連する様々な用語が使用されている。このような用語には、別段の指示がない限り、当該技術分野における通常の意味が与えられるものとする。他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供される定義と一致するように解釈されるべきである。本明細書に記載または参照される技術及び手順は、一般に十分に理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．（２０１２） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている広く利用されている分子クローニング方法などの従来の方法を使用して当業者によって一般的に使用されている。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は、特に断りのない限り、一般に製造業者が定めたプロトコール及び条件に従って実施される。

【0027】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形を含む。「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」などの用語は、特に明記しない限り、制限なく包含を意味するものとする。

【0028】

別段の指示がない限り、一連の要素または範囲に先行する「少なくとも」、「未満」、及び「約」という用語または同様の用語は、その一連または範囲内のすべての要素を指すものと理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または日常的な実験のみを用いて確認することができる。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0029】

本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の動物、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、一般にペットとして飼われる哺乳動物（例えば、とりわけイヌ及びネコ）、家畜（例えば、とりわけウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、及びラクダ）などを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、哺乳動物はマウスである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。

【0030】

本明細書では、方法のさらなる説明及び方法実施のためのガイダンスが提供される。

【0031】

ウイルス及び株
多くのウイルスは、人間または動物の健康に負担をかけ、また、それらの以前の株に対して発達した体液性免疫及び細胞性免疫を回避するために、以前の株のエピトープとは十分に異なるエピトープを持つ新しい株が頻繁に出現する。このようなウイルスの例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、メタニューモウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ジョン・カニンガムウイルス（ＪＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、及びアデノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0032】

いくつかの実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）であり得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、以前の株は、以前にＣＴＬによる免疫学的治療を受けたウイルスの株である。具体的には、初期ペプチド組成物は以前の株に由来し、以前のＣＴＬは初期ペプチド組成物に対して感作され、以前のＣＴＬは以前の株による哺乳動物の感染の治療において効力を有していた。

【0034】

本明細書で使用される場合、出現した株は、以前の株とは異なるウイルスの株であり、ここで、以前のＣＴＬは、ウイルスの以前の株に対する効力と比較して、出現したウイルス株に対する効力が低下している。

【0035】

いくつかの実施形態では、ウイルスがＣＯＶＩＤ－１９である場合、出現した株は、デルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５であり得る。

【0036】

初期ペプチド組成物及び以前のＣＴＬ
この方法は、以前のＣＴＬが感作されたウイルスの以前の株に特異的な初期ペプチド組成物を提供することを含むことができ、ここで、以前のＣＴＬは、ウイルスの以前の株に対する効力と比較して、出現したウイルス株に対する効力が低下している。

【0037】

初期ペプチド組成物は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約１～約５、約１～約１０、約１～約１５、約１～約２０、約２～約５、約２～約１０、約２～約１５、約２～約２０、約５～約１０、約５～約１５、約５～約２０、約１０～約２０、または約１５～約２０個のペプチドを含むことができる。初期ペプチド組成物の特定のペプチドは、各ウイルス及び各以前の株ごとに異なる。本出願に記載されるペプチドのいずれのリストも、単なる例示であり、限定的なものではない。なぜなら、そのようなリストは網羅的ではなく、固定されておらず、動的で制限のないリストとして継続するからである。

【0038】

ペプチドは、目的のＨＬＡ拘束性エレメントに結合するものから選択することができる。目的のＨＬＡ拘束性エレメントは、ヒトのすべての有核細胞で発現される３つの古典的なＨＬＡ－Ｉ遺伝子、すなわちＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃから選択され得る。ＨＬＡ－Ｉ分子は、細胞内タンパク質に由来するペプチドを提示する。細胞内抗原提示経路には、プロテアソームによるサイトゾル内のウイルスタンパク質の切断、小胞体（ＥＲ）内腔への移行、ＥＲ常駐アミノペプチダーゼによるトリミング、ＨＬＡへの負荷、及び細胞表面での提示が関与している可能性がある。ＨＬＡ－ＩＩ遺伝子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、及びＨＬＡ－ＤＱ）は、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージなど、抗原提示に特化した細胞のサブセットでのみ構成的に発現されるが、例えばサイトカイン刺激に応答して、さらなる細胞型においても発現が誘導され得る。ＨＬＡ－ＩＩ分子は、エンドサイトーシス及び食作用を介して細胞に取り込まれる細胞外タンパク質に由来するペプチドと、オートファジーを介してＨＬＡ－ＩＩプロセシング経路にアクセスする細胞内タンパク質とを提示する。

【0039】

ＨＬＡ－Ｉ分子は典型的には、長さが８～１２アミノ酸（ａａ）のペプチドに結合する。ＨＬＡ－１ペプチド結合裂溝はＮ末端とＣ末端の両方で閉じており、最適な長さの好みは約９量体のペプチドの結合に偏っていることがよくある。ほとんどのＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子では、長さの好みは対立遺伝子間で異なる。所与のＨＬＡ対立遺伝子に対する高親和性リガンドは、通常、アンカー位置（ＨＬＡ－Ｉの場合は通常、２番目（Ｐ２）と最後（ＰΩ）、ＨＬＡ－ＩＩの場合は－Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、及びＰ９）に比較的厳密な選択性を有する共通のアミノ酸モチーフを共有し、対応するＨＬＡ結合ポケットの残基と特異的相互作用を形成する。ＨＬＡ遺伝子座はヒトゲノムの中で最も多型であり、現在までに数万の対立遺伝子が報告されている。ペプチド接触残基が異なるＨＬＡ変異体は、それらが提示するペプチドのレパートリーが異なる。集団におけるＨＬＡ対立遺伝子の多様性は、多様な病原体、例えば、急速に変異するウイルス、新たに出現したウイルス及びウイルス株などに対する防御のための重要な進化的メカニズムである。ＨＬＡ対立遺伝子は、ウイルス感染の重症度及び転帰に関連している可能性がある。例えば、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２対立遺伝子はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する防御と関連しており、ＨＬＡ－Ｂ５７は抗レトロウイルス療法がない場合の効率的なＨＩＶ－１制御及び長期非進行性感染症と高度に関連している。

【0040】

初期ペプチド組成物のペプチドは、任意のウイルスに由来し得る。ペプチドは、経験的に、バイオインフォマティクス技術によって、または公的に入手可能な供給源から見つけることができる。例えば、免疫エピトープデータベース及び分析リソース（ＩＥＤＢ）中で、広範囲のウイルスについてＴ細胞エピトープが同定、収集、及び報告されている。

【0041】

いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ａ１対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。

【0042】

追加的にまたは代替的に、いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。

【0043】

代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｂ７対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。

【0044】

追加的にまたは代替的に、いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｂ４０対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。

【0045】

代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物は、ＨＬＡ－Ｃｗ７対立遺伝子に対して拘束される１つ以上のペプチドを含むことができる。

【0046】

明らかなように、いくつかの実施形態では、初期ペプチド組成物はペプチドの組み合わせを含むことができ、各ペプチドはＨＬＡ－Ａ１、－Ａ２、－Ｂ７、－Ｂ４０、または－Ｃｗ７対立遺伝子のいずれか１つ以上に結合する。

【0047】

免疫優性ペプチドの同定
この方法はまた、初期ペプチド組成物中の、ウイルスの以前の株に対する免疫優性ペプチドを同定することを含むことができる。例えば、同定は、四量体アッセイ、インターフェロン産生アッセイ、細胞毒性アッセイ、または個々のペプチドに対して特異性を有するＴ細胞をＴ細胞集団内で見つけることができる他の既知の技術によって実施することができる。

【0048】

以前のＣＴＬを含むＴ細胞集団に対して初期ペプチド組成物中の各ペプチドを個別にアッセイした後、１つ以上の条件に基づいて免疫優性ペプチド（複数可）を同定することができる。四量体アッセイ、インターフェロン産生アッセイ、細胞毒性アッセイ、または他のアッセイにおいて最高スコアを有するペプチドは、免疫優性ペプチドとして同定することができる。このアプローチは、最高スコアが、約５０％、約４９％、約４８％、約４７％、約４６％、約４５％、約４４％、約４３％、約４２％、約４１％、約４０％、約３９％、約３８％、約３７％、約３６％、約３５％、約３４％、約３３％、約３２％、約３１％、約３０％、約２９％、約２８％、約２７％、約２６％、約２５％、約２４％、約２３％、約２２％、約２１％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、または約１０％などの閾値レベルよりも大きいことを要求することによって修正することができる。この修正されたアプローチでは、すべてのペプチドの中で最高スコアが閾値レベルを下回っている場合、初期ペプチド組成物には免疫優性ペプチドがないとみなされる可能性がある。

【0049】

別のアプローチでは、閾値レベルを超える任意のスコアは、ペプチドを免疫優性ペプチドとして同定するのに十分であるとみなすことができる。このアプローチでは、初期ペプチド組成物は、０、１、２、またはそれ以上の免疫優性ペプチドを有するとみなされる可能性がある。

【0050】

望ましくは、初期ペプチド組成物に対して感作された以前のＣＴＬがウイルスの以前の株に対する効力と比較して、出現したウイルス株に対する効力が低下していることが判明していることを考慮すると、初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドを同定するための条件は、少なくとも１つのペプチドが免疫優性ペプチドとして同定されるように選択されるべきである。理論に束縛されるものではないが、以前のＣＴＬは、出現した株で失われた免疫優性ペプチドの不均衡な認識により、効力が低下した可能性がある。したがって、初期ペプチド組成物の修飾が必要である。

【0051】

初期ペプチド組成物中の２つ以上のペプチドが免疫優性であると同定された場合、以下のさらなる工程を、免疫優性ペプチドの１つ、一部、またはすべてに対して行うことができる。

【0052】

ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合の減少
この方法はまた、初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合を減少させて、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物を得ることを含むことができる。

【0053】

減少は、初期ペプチド組成物からペプチド分子を除去すること、または初期ペプチド組成物に含まれる同じペプチドの割合が制御された組成物を生成することを含むことができる。

【0054】

免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合は任意の所望のレベル、例えば、約５０％以下、約４９％以下、約４８％以下、約４７％以下、約４６％以下、約４５％以下、約４４％以下、約４３％以下、約４２％以下、約４１％以下、約４０％以下、約３９％以下、約３８％以下、約３７％以下、約３６％以下、約３５％以下、約３４％以下、約３３％以下、約３２％以下、約３１％以下、約３０％以下、約２９％以下、約２８％以下、約２７％以下、約２６％以下、約２５％以下、約２４％以下、約２３％以下、約２２％以下、約２１％以下、約２０％以下、約１９％以下、約１８％以下、約１７％以下、約１６％以下、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、若しくは約１％、または初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合未満に減少させることができる。

【0055】

いくつかの実施形態では、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合は、少なくとも３０％または初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合未満に減少させることができる。

【0056】

いくつかの実施形態では、免疫優性ペプチドは、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物中に本質的に存在しなくてもよい（すなわち、存在するとしても、初期ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドを同定するために使用されるのと同じアッセイでは検出できないレベルで存在する）。

【0057】

出現したウイルス株に対するペプチド特異的ＣＴＬの産生
この方法はまた、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物で単核細胞を感作し、それによって出現したウイルス株に対するペプチド特異的ＣＴＬの増殖を生じさせることを含むことができる。

【0058】

１つの例示的なアプローチでは、リンパ球（単核細胞の一種）は、３回のインビトロ刺激－増殖サイクルを受けて、本明細書に記載の治療方法で使用される最終ＣＴＬ産物を産生する。これら３つの刺激－増殖サイクルのそれぞれは、全体的な産生プロセスにおいて目的が異なるため、それぞれが異なる手順に従う。任意選択で、４回目の再刺激を行ってもよい。４回目の再刺激は、（１）放出基準を満たすにはわずかに及ばない産物に対して、追加ラウンドの刺激と増殖により産物がこれらの基準を満たすことが可能になると予想される場合、または、（２）追加の細胞増殖が望まれ、かつ追加ラウンドの刺激と増殖が、そのバッチから得られる治療用量の数を大幅に増加させる可能性があると考えられる場合に実施することができる。このような任意の４回目の再刺激は、３回目の刺激と同じプロセスに従って実施することができる。

【0059】

いくつかの実施形態では、健康なボランティアドナーからの単核細胞を水簸によってリンパ球画分及び単球画分に分離することができる。リンパ球は、免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物で刺激することができる。ウイルス由来産物を使用する必要はない。

【0060】

１回目の刺激では、収集された単球のサブセットを処理して、樹状細胞への成熟を誘導することができる。樹状細胞を、１つ以上のウイルス特異的ペプチドでパルスし、リンパ球と７日間共培養することができる。２回目と３回目の刺激では、単球を使用してペプチドを提示することができ、また、刺激されたリンパ球を７～１２日間増殖／拡張させることができる。２番目の刺激はまた、濃縮工程を含むことができ、この工程は、ペプチド特異的ＣＴＬの選択に役立ち（パルスペプチドを認識するＴ細胞が接着単球層に優先的に接着するため）、ドナーからの他の非特異的な「傍観者」リンパ球または他の免疫細胞の含有量を減少させる。３回目の刺激でも単球及びペプチドを使用することができるが、この選択工程を繰り返す必要はない。

【0061】

本明細書に記載の手順のほとんどは、１０％非働化ＡＢ血清を含むＲＰＭＩ－１６４０中で実施することができる。培地中のＡＢ血清の量は、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％に減少し得る。無血清培地及び自己血漿を代替として使用してもよい。これは「完全培地」またはＣＭと呼ばれる。当業者によって決定されるように、約１０％以下の濃度のプール血清または自己血清または血漿を含むＡＩＭ Ｖまたは他の無血清培地調製物単独、より低い濃度のプール血清または自己血清または血漿を有するかまたは有しない血清代替物を含むＲＰＭＩ－１６４０など、任意の適切な培地を使用することができる。

【0062】

いくつかの実施形態では、初期インビトロ感作と呼ばれる１回目の刺激では、リンパ球を、個々のペプチドとしてではなくプールとして免疫優性ペプチド希釈ペプチド組成物を用いて刺激することができる。

【0063】

初期インビトロ感作では、樹状細胞を抗原提示細胞として使用することができる。これらの細胞は水簸した単球から調製することができる。新鮮な単球または新たに解凍した単球は、プラスチックに接着させることによって濃縮することができる。適切な数の単球を培地に再懸濁し、その後細胞を組織培養プレートに移すことができる。次に、細胞を適切な時間（例えば、少なくとも６０分、少なくとも９０分、少なくとも１２０分）インキュベートして、単球を培養プレートに接着させることができる。インキュベーション後、上清を培養プレートから除去することができる。次に、接着細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４とともに適切な時間（例えば、２４時間）培養し、その時点で成熟サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１ β、ＩＬ－６、及び／またはプロスタグランジンＥ２）を添加することができる。更に２４時間培養した後、樹状細胞が剥離し、培地の吸引及び遠心分離によって採取できる状態になる。成熟サイトカインにおける培養期間は、必要に応じて、２４時間を超えて、約３０時間、約３６時間、約４２時間、または最大約４８時間まで延長することができる。

【0064】

採取後、樹状細胞をペプチド（例えば、それぞれ２μｇ／ｍｌ）で適切な時間（例えば、約６０、７５、９０、または１２０分間）パルスし、その後組織培養フラスコ（例えば、７５ｃｍ^２）内の培地（例えば、ＣＭ）中でリンパ球と共培養することができる。培養物中のリンパ球と樹状細胞の比は、約１５：１、約１６：１、約１７：１、約１８：１、約１９：１、約２０：１、約２１：１、約２２：１、約２３：１、約２４：１、または約２５：１であり得る。次に、リンパ球（例えば、合計８０×１０^６、１００×１０^６、１２０×１０^６）を各フラスコに添加することができる。これは、ＣＴＬ培養プロセスの０日目と考えることができる。この刺激後、培養物を７日間そのままにしておくことができる。

【0065】

２回目の刺激では、ウイルス特異的ＣＴＬの濃縮とそれに続く増殖が起こる。最初の感作から７日後に、濃縮工程の一部としてＣＴＬを再刺激することができ、この工程は、ペプチド特異的ＣＴＬの選択に役立ち、ドナーからの他の非特異的な「傍観者」リンパ球または他の免疫細胞の含有量を減少させる。濃縮は、最初の感作に使用されたペプチドでパルスされた単球層へのペプチド特異的ＣＴＬの優先的な接着に基づくことができる。適切なＨＬＡ対立遺伝子によって提示されるペプチドのいずれかを認識するＣＴＬは、穏やかに洗い流すことができる「傍観者」リンパ球とは対照的に、免疫学的シナプスの形成を通じて単球＋ペプチド層に優先的に接着する。一部の「傍観者」リンパ球は非特異的に接着する場合があるが、これにより通常、出発物質と比較してペプチド特異的ＣＴＬが約１０倍以上濃縮される。この濃縮工程を実施するために、単球（例えば、１０ｘ１０^６）を組織培養プレートに添加することができる。ペプチドを添加し（例えば、それぞれ最終濃度２μｇ／ｍｌで）、単球と共にインキュベートすることができる（例えば、約９０分間）。次に、リンパ球（例えば、約６０×１０^６、約７０×１０^６、約８０×１０^６、約９０×１０^６、約１００×１０^６、約１１０×１０^６、または約１２０×１０^６、典型的には、７５ｃｍ^２組織培養フラスコのうちの１つの内容物）をウェルに添加することができる。「傍観者」リンパ球は、適切な時間（例えば、約５、約７．５、約１０、または約１２分）後にＰＢＳで穏やかに洗浄することによってウェルから除去することができる。接着リンパ球をペプチドパルス単球と一晩接触させて、活性化／再刺激プロセスを完了させることができる。翌日、リンパ球を単球層から除去することができる。除去された接着リンパ球を、組換えヒトＩＬ－２（例えば、５０Ｕ／ｍｌの濃度）を含む培地の組織培養フラスコに移すことができる。ＩＬ－２を経時的に添加することができる（例えば、４８時間ごとに５０Ｕ／ｍｌ）。フラスコの色がよりオレンジ色／黄色に変化した場合は、培地を交換することができる。２回目の刺激後、細胞を合計７日間培養することができる。この２回目の刺激の一部として単球層の濃縮が望ましく、従来の方法に勝る利点を提供することができる。理論に束縛されることを望まないが、単球層の濃縮は、全Ｔ細胞中で本発明以前には達成されていなかった有意に高い純度レベルの原因であると考えられる。

【0066】

３回目の刺激を行ってウイルスペプチド特異的ＣＴＬを更に増殖させることができる。２回目の刺激の一部として実施される濃縮工程は、３回目の刺激の一部として繰り返す必要はない。ただし、ウイルス－ペプチド反応性リンパ球のパーセンテージの評価（細胞内サイトカインアッセイまたは四量体アッセイで測定した）が、計画された３回目の刺激から１日以内に特定の限界（例えば、約１２～１８％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％または約１８％）を下回った場合、３回目の刺激の通常の手順の代わりに２回目の刺激の手順を繰り返すことができる。ＣＴＬ産生プロセス全体のうち、濃縮工程は最も多くの操作を含み、汚染が最も入り込みやすいポイントとなる可能性があるため、可能な限りこの工程を複数回繰り返すことを避けることが望ましい場合がある。濃縮工程を繰り返さなくても、３回目の刺激後にウイルスペプチド特異的ＣＴＬのパーセンテージが更に濃縮されることが予想される。これは、刺激された細胞はＩＬ－２含有培地中で増殖するが、刺激されていない「傍観者」細胞は増殖せず、そして時間の経過とともに、刺激されていない「傍観者」細胞が培養中に死滅し、より濃縮された産物が得られるという事実を反映している。２回目の刺激からの濃縮工程が繰り返され得る場合について上記の閾値を設定することにより、それが頻繁に繰り返されず、製造プロセスに不可欠な場合にのみ繰り返されることが予想される。

【0067】

組織培養フラスコ内で７日間培養した後（ＣＴＬ刺激／培養全体の１４日目）、細胞を計数し、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ内の単球及びペプチドで再刺激することができる。リンパ球：単球の比は、約４：１～約５：１、約４：１、約４．１：１、約４．２：１、約４．３：１、約４．４：１、約４．５：１、約４．６：１、約４．７：１、約４．８：１、約４．９：１、または約５：１であり得る。各ペプチドを約２μｇ／ｍｌの濃度で再度添加することができる。この二次再刺激のために、リンパ球（例えば、１５ｘ１０^６）を各Ｇ－Ｒｅｘ１０フラスコに添加することができる。感作は、ＩＬ－２（例えば、５０Ｕ／ｍｌ）を含む培地（例えば、４０ｍｌの完全培地）中で行うことができる。

【0068】

３回目の刺激後、ＣＴＬを再度培養することができる（例えば、７日間）。培地とＩＬ－２の交換は、培地の色の変化がいつ観察されるかに応じて３～４日ごとに行うことができる。

【0069】

この２１日間の刺激及び増殖期間の終了後、ＣＴＬが必要な基準を満たしているか否かを評価することができ、満たしている場合には、凍結保存のために（例えば、その後２４時間以内に）採取することができる。任意選択で、状況によっては、３回目の刺激のガイドラインに従って４回目の刺激を実施することができる。これは通常、生成されるＣＴＬの用量数を増やすためにさらなる細胞増殖が望ましいと考えられる場合、または産物が放出基準をわずかに下回っており、追加ラウンドの刺激と増殖により産物がすべての基準を満たすことが可能になると考えられる場合に実施される。再刺激工程は６～１０日間隔（例えば、６日、７日、８日、９日、１０日間隔）で実施することができるが、これらの工程は必要に応じて、この典型的な７日間隔よりも最大１日早くまたは遅く行うことができる。

【0070】

３つのインビトロ刺激－増殖サイクルの完了後、産物を適切な細胞含有量、機能、生存率、及び無菌性についてスクリーニングすることができる。

【0071】

適切な細胞含有量とは、細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）染色または四量体結合に基づいて細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）がウイルスペプチドに応答し、産物中のナイーブＴ細胞、単球、及びＮＫ細胞の含有量が約２．５％未満（例えば、約２．４％、約２．３％、約２．２％、約２．１％、約２．０％、約１．９％、約１．８％、約１．７％、約１．６％、約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、約１．０％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、または約０．１％）であり得ることを意味する。

【0072】

機能は、約４０：１のエフェクター：標的比での、ペプチドパルス標的に対するＣＴＬの約４０％の細胞溶解活性に基づくことができる。

【0073】

生存率は７０％を超えるべきであり、例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の生存率が適切であり得る。

【0074】

無菌性は、日常的な培養や真菌培養、並びにマイコプラズマ及びエンドトキシンのアッセイを通じて評価することができる。ＣＴＬは、任意の所望の濃度、例えば１ミリリットル当たり約２×１０^６の濃度で冷凍バッグ内に凍結保存し、本明細書に開示される方法で後で使用するために保存することができる。

【0075】

出現したウイルス株をペプチド特異的ＣＴＬで治療する方法
この方法は更に、上記のように調製された有効量のペプチド特異的ＣＴＬを対象に投与することを含むことができる。

【0076】

いくつかの実施形態では、この方法は、治療を必要とする対象に、有効量のペプチド特異的ＣＴＬを静脈内注入によって投与することを含むことができる。ペプチド特異的ＣＴＬは、対象への静脈内送達によって、例えば、中心ライン、ミッドライン、または末梢ＩＶを介した投与によって投与することができる。

【0077】

いくつかの実施形態では、ペプチド特異的ＣＴＬの投与前に、対象は完全なＨＬＡタイピングを受け、その後、適切なＣＴＬで治療され得る。

【0078】

いくつかの実施形態では、ペプチド特異的ＣＴＬの投与前に、対象は、高分解能ＰＣＲ ＳＳＰ補給により、迅速かつ低分解能のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングについて血液検査を受け、治療に適切な可能性のあるＨＬＡ抗原（ＨＬＡ－Ａ１、－Ａ２、－Ｂ７、－Ｂ４０、－Ｃｗ７）を有するか否かを判定することができる。高分解能補給は、対象がＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、－Ａ＊０２：０１、－Ｂ＊０７：０２、－Ｂ＊４０：０１、－Ｃ＊０７：０２であり、したがって１つ以上の対立遺伝子のＣＴＬと一致するという証拠を提供することができる。

【0079】

ペプチド特異的ＣＴＬの投与前に、前投薬を投与することができる。いくつかの実施形態では、対象は、ジフェンヒドラミン及びアセトアミノフェンなどの前投薬を受けることができる。ジフェンヒドラミンの用量は、約１５、約２０、約２５、または約３０ｍｇであり得る。アセトアミノフェンの用量は、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、または約７５０ｍｇであり得る。

【0080】

対象はまた、ペプチド特異的ＣＴＬの投与前、投与と同時、または投与後に、１種以上の抗ウイルス製剤（例えば、レムデシビルまたは他の標準治療医薬品を含む製剤）で治療することもできる。

【0081】

ペプチド特異的ＣＴＬの有効量は体重に基づき、約１×１０^５総細胞／ｋｇ～約３×１０^６総細胞／ｋｇであり得る。約１×１０^５総細胞／ｋｇ、約２×１０^５総細胞／ｋｇ、約３×１０^５総細胞／ｋｇ、約４×１０^５総細胞／ｋｇ、約５×１０^５総細胞／ｋｇ、約６×１０^５総細胞／ｋｇ、約７×１０^５総細胞／ｋｇ、約８×１０^５総細胞／ｋｇ、約９×１０^５総細胞／ｋｇ、約１×１０^６総細胞／ｋｇ、約２×１０^６総細胞／ｋｇ、約３×１０^６総細胞／ｋｇ、約４×１０^６総細胞／ｋｇ、約５×１０^６総細胞／ｋｇ、約６×１０^６総細胞／ｋｇ、約７×１０^６総細胞／ｋｇ、約８×１０^６総細胞／ｋｇ、または約９×１０^６総細胞／ｋｇの用量を投与することができる。いくつかの実施形態では、用量は、総量の代わりにウイルス反応性細胞の数によって測定することができる。例えば、有効量は、約１×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ～約３×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇであり得る。約１×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約２×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約３×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約４×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約５×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約６×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約７×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約８×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約９×１０^５ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約１×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約２×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約３×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約４×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約５×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約６×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約７×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇ、約８×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇ、または約９×１０^６ウイルス反応性細胞／ｋｇの用量を投与することができる。いくつかの実施形態では^、有効量は実際の体重に基づくことができる。実際の体重が理想体重よりも高い特定の実施形態では、用量は、補正体重（理想体重＋実際の体重と理想体重との差の４０％）に基づくことができる。身長に対する理想体重は、ＢＪ Ｄｅｖｉｎｅ（１９７４）の公式から計算することができる：男性：５０．０ｋｇ＋５フィート以上１インチあたり２．３ｋｇ、女性：４５．５ｋｇ＋５フィート以上１インチあたり２．３ｋｇ。

【0082】

ペプチド特異的ＣＴＬを含む有効量の医薬組成物は、それを必要とする個体、例えば、ウイルス感染症に罹患している個体、ウイルス様疾患に罹患している個体、ウイルス様症状を経験している個体、または出現したウイルス株による感染のリスクがある個体に投与することができる。有効量とは、所望の治療効果または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、ウイルス感染、ウイルス様疾患、またはウイルス様症状を軽減し、罹患期間を短縮し、ウイルス力価を低下させ、感染した個体がウイルス様症状を経験する日数を減少させ、ウイルス関連サイトカイン放出症候群を発症する対象の数を減少させ、及び／またはウイルス感染の発生率若しくは割合を減少させるのに十分な量である。当業者である臨床医は、例えば、個体の年齢、感受性、耐性及び全体的な健康状態に基づいて、適切な用量及び必要に応じて抗薬剤を決定することができる。ペプチド特異的ＣＴＬは、示されるように単回用量または複数回用量で投与することができる。

【0083】

ＣＴＬの静脈内送達（例えば、末梢ライン、中心ライン、またはミッドラインを介した注入）にかかる時間は１０分未満であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＬを注入する時間は、約１０分、約９分、約８分、約７分、約６分、約５分、約４分、約３分、約２分、または約１分であり得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、この方法は、ウイルス感染の疑いがある個体、ウイルス感染が確認された個体、またはウイルス感染のリスクがある個体に有効量の医薬組成物を投与することを含むことができる。この方法は、ウイルス様疾患を患う個体に有効量の医薬組成物を投与することを含むことができる。

【0085】

医薬組成物は、対象の血液への投与を目的とすることができ、また、静脈内などの任意の適切な形態で投与することができる。

【0086】

いくつかの実施形態では、この方法は、ウイルス感染症を患っている疑いのある個体、またはウイルス感染症を患うリスクのある個体に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、個体は、ＣＯＶＩＤ－１９に感染している疑いがある可能性があり、及び／またはＣＯＶＩＤ－１９の１つ以上の症状を有する可能性がある。ＣＯＶＩＤ－１９の症状はよく知られており、発熱、咳、息切れなどがある。ＣＯＶＩＤ－１９のその他の症状には、呼吸困難、胸部の持続的な痛みまたは圧迫感、錯乱、意識障害、唇または顔の青みなどがある。

【0087】

いくつかの実施形態では、この方法は感染症を治療するためのものである可能性があり、治療を必要とする個体に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。他の実施形態では、この方法は感染予防のためのものである可能性があり、出現したウイルス株による感染のリスクがある個体に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。他の実施形態では、この方法は、感染の広がりを低減するためのものである可能性があり、出現したウイルス株に感染した個体、または出現したウイルス株による感染のリスクがある個体に、本明細書に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む。

【0088】

所望の治療効果を提供する適切な投与間隔は、病気（例えば、感染症）の重症度、対象の全体的な健康状態、医薬組成物に対する対象の耐性、及び他の考慮事項に基づいて決定することができる。これら及びその他の考慮事項に基づいて、臨床医は適切な投与間隔を決定することができる。一般に、医薬組成物は１回投与することができるが、必要に応じて１～４日ごとに、または週に１回投与することができる。

【0089】

投与後、ウイルス診断、ＣＴＬ持続性、内因性ＣＴＬの形成、及び出現したウイルス株に対する抗体反応について、対象の血液及び／または鼻若しくは鼻咽頭ぬぐい液検体を検査することによって、治療の成功を判定することができる。治療に対する反応は、例えば、注入後約４日、約７日、約１４日、約２８日、約２ヶ月、約３ヶ月、及び約６ヶ月後に試験することができる。

【0090】

いくつかの実施形態では、ウイルスはＣＯＶＩＤ－１９であり得る。いくつかのさらなる実施形態では、ＣＯＶＩＤ－１９の出現した株は、デルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５であり得る。

【0091】

医薬組成物
医薬組成物は、本明細書に開示される方法に従って調製されたペプチド特異的ＣＴＬを含むことができる。

【0092】

医薬組成物は、例えば、末梢ＩＶ、中心ライン、またはミッドラインカテーテルを介した注入によってそれを必要とする個体に静脈内送達するために製剤化することができる。医薬組成物はまた、凍結保存されたＣＴＬの送達に適した１種以上の担体または賦形剤、例えばＤＭＳＯなどを含むこともできる。

【0093】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、特異的ＨＬＡ－Ａ１対立遺伝子に結合するペプチドに対して感作された特異的ＣＴＬを含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、特異的ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子に結合するペプチドに対して感作された特異的ＣＴＬを含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、特異的ＨＬＡ－Ｂ７対立遺伝子に結合するペプチドに対して感作された特異的ＣＴＬを含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、特異的ＨＬＡ－Ｂ４０対立遺伝子に結合するペプチドに対して感作された特異的ＣＴＬを含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、特異的ＨＬＡ－Ｃｗ７対立遺伝子に結合するペプチドに対して感作された特異的ＣＴＬを含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＨＬＡ－Ａ１、－Ａ２、－Ｂ７、－Ｂ４０、及び－Ｃｗ７対立遺伝子のいずれか１つまたは組み合わせに結合する１つ以上のペプチドに対して感作された特異的ＣＴＬを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、対立遺伝子の組み合わせに結合するペプチドの組み合わせに対して感作された特異的ＣＴＬ（例えば、半用量の－Ａ２ ＣＴＬと半用量の－Ｂ７ ＣＴＬを組み合わせたもの）を含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＤＭＳＯ、ＲＰＭＩ－１６４０、アルブミン、またはそれらの組み合わせ中に凍結保存されたＣＴＬを含む。

【0100】

必要に応じて、本明細書に記載の医薬組成物はまた、１種以上の追加の抗ウイルス剤（レムデシビルなど）を含むこともできる。

【0101】

医薬組成物は、静脈内投与などの所望の経路による投与に適した任意の形態とすることができる。

【0102】

いくつかの実施形態では、ペプチド特異的ＣＴＬの調製の対象とするウイルスはＣＯＶＩＤ－１９であり、出現した株はデルタまたはオミクロンＢＡ．２．７５であり得る。

【0103】

同等物
本明細書に記載される本発明の方法の他の適切な修正及び改変は明らかであり、本開示または実施形態の範囲から逸脱することなく、適切な同等物を使用して行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。ここまで、特定の組成物及び方法を詳細に説明してきたが、それらは、以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。これらの実施例は、説明のためにのみ紹介されており、限定を意図するものではない。

【実施例】

【0104】

以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。本明細書に提供される一般的な説明を考慮すれば、様々な他の実施形態を実施することができることが理解される。

【0105】

実施例１．ＣＯＶＩＤ－１９のデルタ変異体におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の免疫優性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１拘束性エピトープの喪失：免疫回避の例及び免疫学的治療への影響
ＴＶＧＮ－４８９は、ＨＬＡ拘束性にＣＯＶＩＤ－１９遺伝子／ＯＲＦ産物に由来するペプチドを認識する、高度に濃縮された非常に強力なＣＤ８＋ＣＴＬからなる臨床グレードの製品である。ＣＯＶＩＤ－１９感染症から回復した個体からのアフェレーシス産物からＣＴＬを生成した。特定のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に結合することが予測または実証されたＣＯＶＩＤ－１９ゲノムによってコードされる少数のペプチドでパルスしたこれらのドナーからのＡＰＣを使用してリンパ球を連続的にプライミングし、選択した。得られた産物は、典型的には９５％を超えるＣＤ３＋／ＣＤ８＋であり、四量体染色による陽性率が６０％を超え、典型的には３：１のエフェクター対標的比でペプチドパルス標的の溶解率が６０％を超えるという強力な細胞溶解活性を示した（図１Ａ及び図１Ｂを参照）。

【0106】

優性標的エピトープを失う免疫学的圧力を考慮して、初期のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のゲノム配列に由来するペプチド（これらの初期株に感染したドナーからＣＴＬを生成するために使用することに成功した）が、より最近に進化したデルタ変異体にまだ存在しているか否かを評価した。

【0107】

７つのペプチドを使用して、世界中で最も一般的な対立遺伝子であるＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって拘束されるＣＴＬ産物を生成した。これらのペプチドは、スパイク（Ｓ）タンパク質及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、並びにＯＲＦ３ａ及びＯＲＦ１ａｂに由来した。全体的な細胞毒性及び四量体染色に対する７つのペプチドの寄与は２％～１８％の範囲であり、これらのペプチドの１つによる明らかな免疫優性はなかった（表１及び表２）。これらの配列は初期のウイルス株で同定されたが、ＮＩＨデータベースに存在する１２０を超えるデルタ変異体配列の９７．５～１００％に存在し続けた。

【0108】

四量体アッセイを使用して、Ｔ細胞集団内のウイルスペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（この例では、ＣＯＶＩＤ－１９のプレデルタ株に対して感作されたＣＤ８＋Ｔ細胞）を定量した。

【0109】

ウイルス特異的ＣＴＬの機能分析を、ウイルスペプチドパルス標的に対するＣＴＬ細胞毒性に応じて測定した。エフェクター細胞を２μｇ／ｍＬのウイルスペプチドでパルスし、３７℃で適切な時間インキュベートした。ウイルスペプチドとのインキュベーション後、培地を吸引し、エフェクター細胞を温かいＰＢＳですすぎ、新鮮な完全培地と交換した。エフェクター細胞を３０：１、１０：１、３：１、及び１：１の比率で播種したウェルにＣＴＬを滴定した（非ウイルスペプチドパルスエフェクター細胞条件を対照として保持した）。細胞毒性を、溶解を受けた細胞からの放射性トレーサー（５１Ｃｒ）の放出に応じて測定した（すべての細胞が化学的に溶解された対照と比較）。ＣＴＬ媒介細胞毒性は、通常、Ｅ：Ｔ比３０：１～３：１で８０％を超えることが観察された。細胞毒性は、１：１のエフェクター対標的比で約６０％であった。

【0110】

ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１については、マトリックス（Ｍ）タンパク質に由来する８つのペプチド、並びにＯＲＦ１ａｂ及びＯＲＦ３ａを利用してＣＴＬを生成した。８つのペプチドのうち７つは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ペプチドで見られたものと同様の結合を示した（１％～１８％）（表３）。しかし、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１とは対照的に、観察された四量体結合の半分の原因である免疫優性ペプチド（ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＯＲＦ１ａｂ １６３７－１６４６、配列番号１）が注目された（表３、ペプチド３）。ＯＲＦ１ａｂのこの領域はデルタ変異体で変異しており、ＮＩＨデータベースのデルタゲノム配列のほぼ９３％からこの免疫優性エピトープが失われていた。残りの亜優性ペプチドはすべて、配列の１００％に保存されていた。

【0111】

ペプチド３に関する同様の結果が、オミクロン変異体ＢＡ．２．７５でも見られた（データは示されていない）。

【0112】

デルタ症例数の増加を考慮すると、デルタ変異体ではなくウイルスの初期株を認識する細胞の増殖を促進することを避けるために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを刺激するために使用されるＨＬＡ－Ａ＊０１：０１ペプチドプールからこのペプチドを除去することが不可欠となる。ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ（配列番号１）の非存在下で生成された残りのＣＴＬは、ＣＯＶＩＤ－１９の初期の原型株だけでなく、デルタも根絶することができるはずである。

【0113】

ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ（配列番号１）の非存在下で生成されたＣＴＬの、オミクロン変異体ＢＡ．２．７５に対する効力についても、同様の予想が成り立つ。

【0114】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のような突然変異の頻度が高いウイルスでは、免疫優性エピトープの喪失は驚くべきことではない。これは、ＨＬＡ－Ａ２４の場合のデルタ変異体について記載されているものと同様の免疫回避の例を提供する。これらのデータは、ウイルスが進化し続けるにつれて免疫優性エピトープが優先的に除去されるという仮説と一致している。それらは更に、ＣＯＶＩＤ－１９の新たに出現する変異体を認識し、効果的に治療し続けることができることを確実にするために、ウイルス配列を監視し、ＣＴＬの産生を調整する必要性を示している。

【表1】

【表2】

【表3】

【0115】

実施例２．免疫優性ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１拘束性エピトープの希釈
実施例１で使用した８つのＨＬＡ－Ａ＊０１：０１ペプチドを含む組成物を、ペプチド８を除外することによって修飾した。ペプチド８は、四量体染色アッセイ結果によって決定されるように、無視できるほどの免疫原性を有し、バックグラウンドと本質的に同じであった。実施例１に基づいて、ペプチド３を免疫優性ペプチドとして同定した。

【0116】

６つのサンプルを調製し、各サンプルは同じ濃度の６つのペプチド、すなわち、ペプチド１～２及び４～７、並びに実施例１の組成物中のペプチド３濃度（２μｇ／ｍｌ）のパーセンテージとして表される様々な濃度のペプチド３を含んだ。したがって、０％ペプチド３を含むサンプルには６つのペプチドが含まれ、６．２５％～１００％のペプチド３を含むすべてのサンプルには７つのペプチドが含まれていた。

【0117】

表４に示すように、０％ペプチド３を含むサンプルでは６４．１％の四量体染色が得られた。ペプチド３の四量体染色値０．３％はバックグラウンド染色を反映しており、０％ペプチド３を含むサンプルと一致した。

【0118】

１００％ペプチド３（通常の濃度、約２μｇ／ｍｌ）では、総四量体染色は０％サンプルの場合とほぼ同じ（６６．８％～６４．１％）であったが、今回はペプチド３が２５．７％を占めた。他のペプチドは抑制されるため、合計は同様のままであった。

【0119】

ペプチド３の４段階の５０％希釈にわたって、四量体染色の範囲は７４．３％～８３．１％であった。ペプチド３による総四量体染色への寄与は一般に、サンプルに占めるペプチド３の割合が減少するにつれて減少した。

【0120】

結論として、表４に示す四量体染色の結果は、ペプチド組成物の望ましいレベルの効力を維持しながら、ペプチド組成物中の免疫優性ペプチドの割合を低減することができることを示す。

【表4】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【配列表】

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【国際調査報告】