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特表2024-527125腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/352 20060101AFI20240711BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
A61K31/352
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024505646
(86)(22)【出願日】2022-04-20
(85)【翻訳文提出日】2024-01-30
(86)【国際出願番号】 CN2022087786
(87)【国際公開番号】W WO2023115766
(87)【国際公開日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】202111578422.3
(32)【優先日】2021-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505072650
【氏名又は名称】浙江大学
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】孫崇徳
(72)【発明者】
【氏名】王岳
(72)【発明者】
【氏名】陳雲義
(72)【発明者】
【氏名】曹錦萍
(72)【発明者】
【氏名】李鮮
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用に関し、薬剤調製の技術分野に属する。本発明は腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供した。ケルセチンのオキシメチル修飾物質は、腫瘍細胞の増殖を抑制し、ｉｎ ｖｉｖｏの移植腫瘍の増殖及び腫瘍細胞の遊走を抑制し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できる。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の適用。
【請求項2】
ｉｎ ｖｉｖｏの移植腫瘍の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の適用。
【請求項3】
腫瘍細胞の遊走を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の適用。
【請求項4】
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の適用。
【請求項5】
前記ケルセチンのオキシメチル修飾物質には、ケルセチン－３－メチルエーテル及び／又はケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが含まれることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の適用。
【請求項6】
前記腫瘍細胞には、骨肉腫、肝臓癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、肺癌、腸癌、神経膠腫、前立腺癌又は甲状腺癌の細胞が含まれることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の適用。
【請求項7】
ケルセチンのオキシメチル修飾物質を注射するステップを含むことを特徴とするケルセチンのオキシメチル修飾物質に基づく抗腫瘍方法。
【請求項8】
ケルセチンのオキシメチル修飾物質の添加量は１２．５～４００ｍｇ／Ｌであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ケルセチンのオキシメチル修飾物質には、ケルセチン－３－メチルエーテル及び／又はケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが含まれることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記腫瘍細胞には、骨肉腫、肝臓癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、肺癌、腸癌、神経膠腫、前立腺癌又は甲状腺癌の細胞が含まれることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記抗腫瘍には、腫瘍細胞の増殖の抑制、ｉｎ ｖｉｖｏの移植腫瘍の増殖の抑制、腫瘍細胞の遊走の抑制或は腫瘍細胞のアポトーシスの誘導が含まれることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、２０２１年１２月２２日に中国専利局に提出された出願番号が２０２１１１５７８４２２．３であり、発明の名称が「腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用」の中国特許出願の優先権を主張し、その全ての内容は、参照により本出願に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、薬剤調製の技術分野に関し、特に、腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
癌は最も致死率の高い病気のひとつである。生活習慣の変化や発癌性物質にさらされるリスクの増加により、癌の発生は徐々に若年化し、より一般的になっている。癌に関連する危険因子には、不健康な食事、汚染物質への暴露、ストレス、炎症などがある。従来の放射線療法や化学療法は患者の生活の質を著しく低下させるが、新たに登場した標的療法は非常に高価であり、大規模な普及は現在のところ困難である。
【0004】
疫学研究では、天然物が豊富な果物や野菜の摂取が胃癌の発生を抑制するのに大きな効果があることが示されている。既存の臨床癌治療薬と比較して、天然由来の生理活性化合物は生物学的安全性が高く、生活の質への影響が少ない。したがって、抗癌効果や補助治療効果のある天然産物をスクリーニングすることが非常に必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供することを目的とする。ケルセチンのオキシメチル修飾物質は、腫瘍細胞の増殖を抑制し、ｉｎ ｖｉｖｏの移植腫瘍の増殖及び腫瘍細胞の遊走を抑制し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供した。
【0007】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏの移植腫瘍の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供した。
【0008】
本発明はまた、腫瘍細胞の遊走を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供した。
【0009】
本発明はまた、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供した。
【0010】
好ましくは、上記ケルセチンのオキシメチル修飾物質には、ケルセチン－３－メチルエーテル及び／又はケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが含まれる。
【0011】
好ましくは、上記腫瘍細胞には、骨肉腫、肝臓癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、肺癌、腸癌、神経膠腫、前立腺癌又は甲状腺癌の細胞が含まれる。
【発明の効果】
【0012】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供する。本発明は、ケルセチンを特定の部位で修飾することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制する物質の能力が著しく向上することを発見した。例えば、３位及び３，３’位でのメチル化の後、腫瘍細胞増殖に対する誘導体の半数抑制濃度は大幅に減少する。ケルセチンのオキシメチル修飾は、腫瘍細胞の増殖を抑制し、ｉｎ ｖｉｖｏの移植腫瘍の増殖及び腫瘍細胞の遊走を抑制し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できる。試験結果は、ケルセチン－３－メチルエーテルが試験したすべての腫瘍細胞株に対して抑制効果を有し、その抑制効果がケルセチンと比較して２．４～３．６倍増加し、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの抑制効果は、ケルセチン－３－メチルエーテルと比較してさらに４．３～１４．５倍増加し、その中でも、ＨｅｐＧ２に対する抑制効果が最も強く、半数抑制濃度はわずか５．８５ｍｇ／Ｌであることを示した。ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルは、１５種類の癌細胞に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果があり、４種類の正常細胞に対して生物学的に安全であり、ＨｅｐＧ２マウスの移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を抑制する効果があり、ＨｅｐＧ２細胞の遊走能力を抑制する効果があり、１４種類の細胞に対して顕著なアポトーシス誘導効果があることを示した。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明により提供されるケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの液相図である。
【図2】本発明により提供されるケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの質量スペクトルである。
【図3】本発明により提供されるケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの１５種類の癌細胞と４種類の正常細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏでの増殖抑制効果を比較した結果を示すグラフである。
【図4】本発明により提供されるケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルのＨｅｐＧ２マウスの移植腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を抑制する効果の結果を示す図である。ここで、Ａは腫瘍体積、Ｂは腫瘍重量、Ｃは腫瘍写真、Ｄはマウス重量、Ｅは肝臓指数、Ｆは脾臓指数、Ｇは腎臓指数である。
【図5】本発明により提供されるケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルによるＨｅｐＧ２細胞の遊走の抑制結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供する。本発明において、上記ケルセチンのオキシメチル修飾物質には、ケルセチン－３－メチルエーテル及び／又はケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが含まれる。本発明において、上記腫瘍細胞には、骨肉腫、肝臓癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、肺癌、腸癌、神経膠腫、前立腺癌又は甲状腺癌の細胞が含まれる。本発明は、ケルセチンを特定の部位で修飾することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制する物質の能力が著しく向上し、例えば、３位及び３，３’位でのメチル化の後、腫瘍細胞増殖に対する誘導体の半数抑制濃度は大幅に減少することを発見した。本発明において、上記ケルセチン、ケルセチン－３－メチルエーテル、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの供給源には特に制限はなく、当業者に周知の従来の市販品を使用できる。
【0015】
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルは、一般的なフラボノールであるケルセチンの誘導体であり、本発明により、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが広範な腫瘍増殖抑制能を有することが判明した。ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル、英語名：Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ３，３’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ、中文名：槲皮素３，３’－ジメチルエーテル、ＣＡＳ：４３８２－１７－６、構造を式Ｉに示し、液相図を図１に示し、質量スペクトルを図２に示した。ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルは、腫瘍の増殖を大幅に抑制する能力がある一方で、正常細胞に対する毒性が低く、腹腔内に注射しても安全である。
【0016】
【化1】
【0017】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの移植腫瘍の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供した。本発明において上記ケルセチンのオキシメチル修飾物質には、ケルセチン－３－メチルエーテル及び／又はケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが含まれる。本発明において上記腫瘍細胞には、骨肉腫、肝臓癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、肺癌、腸癌、神経膠腫、前立腺癌又は甲状腺癌の細胞が含まれる。
【0018】
本発明はまた、腫瘍細胞の遊走を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供した。本発明において上記ケルセチンのオキシメチル修飾物質には、ケルセチン－３－メチルエーテル及び／又はケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが含まれる。本発明において上記腫瘍細胞には、骨肉腫、肝臓癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、肺癌、腸癌、神経膠腫、前立腺癌又は甲状腺癌の細胞が含まれる。
【0019】
本発明はまた、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を提供した。本発明において上記ケルセチンのオキシメチル修飾物質には、ケルセチン－３－メチルエーテル及び／又はケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが含まれる。本発明において上記腫瘍細胞には、骨肉腫、肝臓癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、肺癌、腸癌、神経膠腫、前立腺癌又は甲状腺癌の細胞が含まれる。
【0020】
本発明による腫瘍細胞の増殖を抑制する薬剤の調製におけるケルセチンのオキシメチル修飾物質の使用を、特定の実施例を参照して以下にさらに詳細に説明するが、本発明の技術的解決策には以下の実施例が含まれるが、これらに限定されない。
【0021】
実施例１
ケルセチン、ケルセチン－３－メチルエーテル及びケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制の比較
方法：
骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｔ４７Ｄ、胃癌細胞株ＡＧＳ、ＢＧＣ－８２３、ＳＧＣ－７９０１、子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、肺癌細胞Ａ５４９、腸癌細胞Ｃａｃｏ２、マウス神経膠腫細胞ＢＶ－２、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰ、ヒト正常肝臓細胞株Ｌ０２、ヒト正常胃細胞株ＧＥＳ、ヒト臍帯静脈上皮細胞ＨＵＶＥＣ及びヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ－３８を湿式インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１０％ウシ胎児血清及び１×ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞は対数増殖期にトリプシン－ＥＤＴＡで継代した。一定密度の細胞（ＡＧＳ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＢＣＰＡＰ、ＧＥＳ、ＨＵＶＥＣは１ウェルあたり１×１０５細胞、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＧＣ－８２３、Ａ５４９、ＰＣ３、Ｌ０２は１ウェルあたり８×１０４細胞、１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、ＳＧＣ－７９０１、Ｈｅｌａ、ＢＶ－２は１ウェルあたり５×１０４細胞、ＷＩ－３８は１ウェルあたり３×１０５細胞）を９６ウェルプレートに播種して２４時間培養した後、処理した。新しい培地に交換した後、ＤＭＳＯに溶解した培地に１２．５～４００ｍｇ／Ｌのケルセチン、ケルセチン－３－メチルエーテル及びケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル（最終体積比０．１％、陽性対照としてＤＭＳＯ）を添加した。４８時間培養した後、完全培地は１０％ｃｃｋ－８試薬を含む無血清培地と交換される。細胞を１時間培養した後、４５０ｎｍ及び６２０ｎｍでの吸光度を測定した。各実験は独立して３回繰り返した。
ケルセチン、ケルセチン－３－メチルエーテル及びケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルによるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制の比較
方法：
骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｔ４７Ｄ、胃癌細胞株ＡＧＳ、ＢＧＣ－８２３、ＳＧＣ－７９０１、子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、肺癌細胞Ａ５４９、腸癌細胞Ｃａｃｏ２、マウス神経膠腫細胞ＢＶ－２、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰ、ヒト正常肝臓細胞株Ｌ０２、ヒト正常胃細胞株ＧＥＳ、ヒト臍帯静脈上皮細胞ＨＵＶＥＣ及びヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ－３８を湿式インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１０％ウシ胎児血清及び１×ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞は対数増殖期にトリプシン－ＥＤＴＡで継代した。一定密度の細胞（ＡＧＳ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＢＣＰＡＰ、ＧＥＳ、ＨＵＶＥＣは１ウェルあたり１×１０５細胞、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＧＣ－８２３、Ａ５４９、ＰＣ３、Ｌ０２は１ウェルあたり８×１０４細胞、１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、ＳＧＣ－７９０１、Ｈｅｌａ、ＢＶ－２は１ウェルあたり５×１０４細胞、ＷＩ－３８は１ウェルあたり３×１０５細胞）を９６ウェルプレートに播種して２４時間培養した後、処理した。新しい培地に交換した後、ＤＭＳＯに溶解した培地に１２．５～４００ｍｇ／Ｌのケルセチン、ケルセチン－３－メチルエーテル及びケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル（最終体積比０．１％、陽性対照としてＤＭＳＯ）を添加した。４８時間培養した後、完全培地は１０％ｃｃｋ－８試薬を含む無血清培地と交換される。細胞を１時間培養した後、４５０ｎｍ及び６２０ｎｍでの吸光度を測定した。各実験は独立して３回繰り返した。
【0022】
結果は表１に示すとおりである。
【0023】
【表1】
【0024】
表１に示すように、ケルセチンの３位と３，３’位をオキシメチル基で修飾した後、多様な腫瘍細胞の増殖を抑制する能力が大幅に向上し、半数抑制濃度が大幅に低下した。ケルセチンは、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＡＧＳ、Ｈｅｌａ及びＢＣＰＡＰに対してのみ抑制効果を持っている。ケルセチン－３－メチルエーテルは、試験したすべての腫瘍細胞株に対して抑制効果があり、その抑制効果はケルセチンと比較して２．４～３．６倍増加した。ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの抑制効果は、ケルセチン－３－メチルエーテルと比較してさらに４．３～１４．５倍増加し、その中でもＨｅｐＧ２に対する抑制効果が最も強く、半数抑制濃度はわずか５．８５ｍｇ／Ｌである。
【0025】
実施例２
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの１５種類の癌細胞と４種類の正常細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果の比較
方法：
骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｔ４７Ｄ、胃癌細胞株ＡＧＳ、ＢＧＣ－８２３、ＳＧＣ－７９０１、子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、肺癌細胞Ａ５４９、腸癌細胞Ｃａｃｏ２、マウス神経膠腫細胞ＢＶ－２、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰ、ヒト正常肝臓細胞株Ｌ０２、ヒト正常胃細胞株ＧＥＳ、ヒト臍帯静脈上皮細胞ＨＵＶＥＣ及びヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ－３８を湿式インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１０％ウシ胎児血清及び１×ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞は対数増殖期にトリプシン－ＥＤＴＡで継代した。一定密度の細胞（ＡＧＳ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＢＣＰＡＰ、ＧＥＳ、ＨＵＶＥＣは１ウェルあたり１×１０５細胞、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＧＣ－８２３、Ａ５４９、ＰＣ３、Ｌ０２は１ウェルあたり８×１０４細胞、１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、ＳＧＣ－７９０１、Ｈｅｌａ、ＢＶ－２は１ウェルあたり５×１０４細胞、ＷＩ－３８は１ウェルあたり３×１０５細胞）を９６ウェルプレートに播種して２４時間培養した後、処理した。新鮮培地に交換した後、ＤＭＳＯに溶解した培地に１２．５～４００ｍｇ／Ｌのケルセチン、ケルセチン－３－メチルエーテル及びケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル（最終体積比０．１％、陽性対照としてＤＭＳＯ）を添加した。４８時間の培養した後、完全培地は１０％ｃｃｋ－８試薬を含む無血清培地と交換される。細胞を１時間培養した後、４５０ｎｍ及び６２０ｎｍでの吸光度を測定した。各実験は独立して３回繰り返した。
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの１５種類の癌細胞と４種類の正常細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果の比較
方法：
骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｔ４７Ｄ、胃癌細胞株ＡＧＳ、ＢＧＣ－８２３、ＳＧＣ－７９０１、子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、肺癌細胞Ａ５４９、腸癌細胞Ｃａｃｏ２、マウス神経膠腫細胞ＢＶ－２、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰ、ヒト正常肝臓細胞株Ｌ０２、ヒト正常胃細胞株ＧＥＳ、ヒト臍帯静脈上皮細胞ＨＵＶＥＣ及びヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ－３８を湿式インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１０％ウシ胎児血清及び１×ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞は対数増殖期にトリプシン－ＥＤＴＡで継代した。一定密度の細胞（ＡＧＳ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＢＣＰＡＰ、ＧＥＳ、ＨＵＶＥＣは１ウェルあたり１×１０５細胞、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＧＣ－８２３、Ａ５４９、ＰＣ３、Ｌ０２は１ウェルあたり８×１０４細胞、１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、ＳＧＣ－７９０１、Ｈｅｌａ、ＢＶ－２は１ウェルあたり５×１０４細胞、ＷＩ－３８は１ウェルあたり３×１０５細胞）を９６ウェルプレートに播種して２４時間培養した後、処理した。新鮮培地に交換した後、ＤＭＳＯに溶解した培地に１２．５～４００ｍｇ／Ｌのケルセチン、ケルセチン－３－メチルエーテル及びケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル（最終体積比０．１％、陽性対照としてＤＭＳＯ）を添加した。４８時間の培養した後、完全培地は１０％ｃｃｋ－８試薬を含む無血清培地と交換される。細胞を１時間培養した後、４５０ｎｍ及び６２０ｎｍでの吸光度を測定した。各実験は独立して３回繰り返した。
【0026】
結果は図３に示すとおりである。ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルは多様な癌細胞に対して広範囲の抑制能力を示し、骨肉腫細胞の半数抑制濃度は１４３Ｂ：２１．６２ｍｇ／Ｌ、ＨＯＳ：１８．６０ｍｇ／Ｌ、Ｕ２：４９．４７ｍｇ／Ｌ、肝癌ＨｅｐＧ２細胞の半数抑制濃度は５．８５ｍｇ／Ｌ、乳癌細胞の半数抑制濃度はＭＤＡ－ＭＢ－２３１：１１．３９ｍｇ／Ｌ、Ｔ４７Ｄ：１３．３３ｍｇ／Ｌ、胃癌細胞の半数抑制濃度はＳＧＣ７９０１：２８．３８ｍｇ／Ｌ、ＢＧＣ８２３：２６．０７ｍｇ／Ｌ、ＡＧＳ：１５．８３ｍｇ／Ｌ、子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞の半数抑制濃度は１１．１３ｍｇ／Ｌ、肺癌細胞Ａ５４９の半数抑制濃度は１７．３８ｍｇ／Ｌ、腸癌細胞Ｃａｃｏ２の半数抑制濃度は２１．３９ｍｇ／Ｌ、マウス神経膠腫ＢＶ２の半数抑制濃度は２１．１２ｍｇ／Ｌ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３の半数抑制濃度は３１．２９ｍｇ／Ｌ、ヒト甲状腺癌に対するＢＣＰＡＰの半数抑制濃度は１２．３０ｍｇ／Ｌであった。
【0027】
同時に、本発明は、ヒト正常肝細胞Ｌ０２、ヒト正常胃細胞ＧＥＳ、ヒト臍静脈上皮細胞ＨＵＶＥＣ、及びヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ－３８に対するケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの半数抑制濃度は全て１００ｍｇ／Ｌ以上であり、これは、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが、正常細胞に対して低い毒性を示しながら、癌細胞に対して選択的な増殖抑制効果を有することを示していることを発見した。
【0028】
実施例３
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルのＨｅｐＧ２マウス移植腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏ増殖抑制効果
方法：
体重１９～２２ｇのＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５～６週齢）を中国科学院の上海実験動物センターから購入した。ＨｅｐＧ２細胞を無血清ＤＭＥＭ培地に回収して細胞懸濁液を作製し、次いでその細胞懸濁液を各マウスの腋窩に約２．０×１０６個、マウス１匹につき１座ずつ注入した。マウスはすべて浙江大学実験動物センターで、２３～２５℃、湿度５０～６０％、１２時間明期／１２時間暗期サイクルで飼育された。腫瘍形成後、マウスをランダムに３つのグループに分け、各グループに７匹のマウスを割り当てた。モデルグループでは生理食塩水を腹腔内注射投与し、陽性薬物投与グループでは、テガフール（替吉奥）１０ｍｇ／ｋｇｂｗ・ｄを腹腔内注射投与し、治療グループでは、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルを５０ｍｇ／ｋｇｂｗ・ｄを腹腔内注射した。腫瘍体積の変化に応じて、腫瘍形成後、１～２日間隔で腹腔内に注射し、腫瘍体積の測定とマウス体重の測定を行い、異なる治療グループ間の腫瘍体積に顕著な差が生じると、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、腫瘍組織を慎重に剥がし、重量を測定し、次のように計算した：腫瘍形成率（％）＝（治療グループの腫瘍形成マウスの数／腫瘍移植グループ腫瘍形成マウスの数）×１００、腫瘍抑制率（％）＝（対照グループの平均腫瘍重量ｇ－治療グループの平均腫瘍重量ｇ）／対照グループの平均腫瘍重量ｇ×１００。血清、肝臓、脾臓、腎臓を採取し、重量を測定した。
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルのＨｅｐＧ２マウス移植腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏ増殖抑制効果
方法：
体重１９～２２ｇのＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５～６週齢）を中国科学院の上海実験動物センターから購入した。ＨｅｐＧ２細胞を無血清ＤＭＥＭ培地に回収して細胞懸濁液を作製し、次いでその細胞懸濁液を各マウスの腋窩に約２．０×１０６個、マウス１匹につき１座ずつ注入した。マウスはすべて浙江大学実験動物センターで、２３～２５℃、湿度５０～６０％、１２時間明期／１２時間暗期サイクルで飼育された。腫瘍形成後、マウスをランダムに３つのグループに分け、各グループに７匹のマウスを割り当てた。モデルグループでは生理食塩水を腹腔内注射投与し、陽性薬物投与グループでは、テガフール（替吉奥）１０ｍｇ／ｋｇｂｗ・ｄを腹腔内注射投与し、治療グループでは、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルを５０ｍｇ／ｋｇｂｗ・ｄを腹腔内注射した。腫瘍体積の変化に応じて、腫瘍形成後、１～２日間隔で腹腔内に注射し、腫瘍体積の測定とマウス体重の測定を行い、異なる治療グループ間の腫瘍体積に顕著な差が生じると、マウスを頸椎脱臼により屠殺し、腫瘍組織を慎重に剥がし、重量を測定し、次のように計算した：腫瘍形成率（％）＝（治療グループの腫瘍形成マウスの数／腫瘍移植グループ腫瘍形成マウスの数）×１００、腫瘍抑制率（％）＝（対照グループの平均腫瘍重量ｇ－治療グループの平均腫瘍重量ｇ）／対照グループの平均腫瘍重量ｇ×１００。血清、肝臓、脾臓、腎臓を採取し、重量を測定した。
【0029】
結果は図４に示すとおりである。図４のＡによると、初回投与から２４日まで、合計１０回の注射を行ったところ、対照グループと比較して２４日目の腫瘍体積は有意な減少が観察され、対照グループは４４３．２０±１２３．２７ｍｍ３であったのに対し、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル注射グループでは２８４．１９±８５．４７ｍｍ３であった。図４のＢに示すように、腫瘍を剥がして重さを測ったところ、対照グループの腫瘍重量は４０７．００±１３４．９１ｍｇであったのに対し、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル注射グループの腫瘍重量は１９４．５７±７５．４５ｍｇであり、対照グループより５２．１９％低く、有意であった。図４のＣは、対照グループと治療グループの腫瘍写真である。上記の結果は、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルがｉｎ ｖｉｖｏでのＨｅｐＧ２移植腫瘍の増殖に対する抑制効果を有することを示している。
【0030】
同時に、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルは生物学的安全性を示した。図４のＤに示すように、対照グループと治療グループの体重には有意差はなかったが、陽性薬物グループのマウスは１２日目に非常に顕著な体重減少が見られ、すべて死亡した。肝臓指数（図４のＥ）、脾臓指数（図４のＦ）、及び腎臓指数（図４のＧ）はすべて、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルと対照グループの間に有意差がないことを示した。上記の結果は、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが生物学的安全性を持っていることを示している。
【0031】
実施例４
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルのＨｅｐＧ２細胞の遊走能力に対する抑制
方法：
細胞密度５×１０５細胞／ｍＬのＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり１ｍＬ）、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を添加し、一晩培養して細胞の単層細胞を形成させた。２００μＬピペットガンの先端を使用して細胞の単層に「一」の形にスクラッチし、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、次に１ｍｇ／Ｌのケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル溶液を添加し、ＤＭＳＯを溶媒対照として使用して、２４時間培養した。
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルのＨｅｐＧ２細胞の遊走能力に対する抑制
方法：
細胞密度５×１０５細胞／ｍＬのＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり１ｍＬ）、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を添加し、一晩培養して細胞の単層細胞を形成させた。２００μＬピペットガンの先端を使用して細胞の単層に「一」の形にスクラッチし、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、次に１ｍｇ／Ｌのケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル溶液を添加し、ＤＭＳＯを溶媒対照として使用して、２４時間培養した。
【0032】
結果は図５に示すとおりである。図５によると、スクラッチ時の細胞間隙の例は、対照グループと治療グループで同じであり、１日間の培養後、治療グループの細胞間スペースはコントロールグループの細胞間スペースよりも有意に高かった。このことは、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルがＨｅｐＧ２細胞の遊走能を抑制する作用があることを示している。
【0033】
実施例５
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの細胞の遊走能力に対する抑制
方法：
一定密度の細胞（ＡＧＳ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＢＣＰＡＰ、ＧＥＳ、ＨＵＶＥＣは６×１０５細胞／ｍＬ、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＧＣ－８２３、Ａ５４９、ＰＣ３、Ｌ０２は５×１０５細胞／ｍＬ、１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、ＳＧＣ－７９０１、Ｈｅｌａ、ＢＶ－２は３×１０５細胞／ｍＬ、ＷＩ－３８は１．８×１０６細胞／ｍＬ）を６ウェルプレート（１ウェルあたり１ｍＬ）に播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を添加し、一晩培養し、一晩培養して細胞の単層細胞を形成させた。２００μＬピペットガンの先端を使用して細胞の単層に「一」の形にスクラッチし、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、次に対応する用量のケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル（骨肉腫細胞の用量は１４３Ｂ：４ｍｇ／Ｌ、ＨＯＳ：４ｍｇ／Ｌ、Ｕ２：１０ｍｇ／Ｌ、乳癌細胞の用量はＭＤＡ－ＭＢ－２３１：２ｍｇ／Ｌ、Ｔ４７Ｄ：３ｍｇ／Ｌ、胃癌細胞の用量はＳＧＣ７９０１：６ｍｇ／Ｌ、ＢＧＣ８２３：５ｍｇ／Ｌ、ＡＧＳ：３ｍｇ／Ｌ、子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞の用量は２ｍｇ／Ｌ、肺の用量癌細胞Ａ５４９は３ｍｇ／Ｌ、腸癌細胞Ｃａｃｏ２の用量濃度は４ｍｇ／Ｌ、マウス神経膠腫ＢＶ２の用量濃度は４ｍｇ／Ｌ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３の用量濃度は６ｍｇ／Ｌ、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰの用量濃度は２ｍｇ／Ｌ）溶液を加え、ＤＭＳＯを溶媒対照として使用して、２４時間培養した。顕微鏡でスクラッチ時の幅と測定時の幅を測定し、スクラッチ鎖率を計算し、スクラッチ率は、スクラッチ率＝（スクラッチ時の幅－測定時の幅）／スクラッチ時の幅×１００％であった。スクラッチ抑制率＝（対照グループスクラッチ閉鎖率－治療グループスクラッチ閉鎖率）／対照グループスクラッチ閉鎖率×１００％であった。
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの細胞の遊走能力に対する抑制
方法：
一定密度の細胞（ＡＧＳ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＢＣＰＡＰ、ＧＥＳ、ＨＵＶＥＣは６×１０５細胞／ｍＬ、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＧＣ－８２３、Ａ５４９、ＰＣ３、Ｌ０２は５×１０５細胞／ｍＬ、１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、ＳＧＣ－７９０１、Ｈｅｌａ、ＢＶ－２は３×１０５細胞／ｍＬ、ＷＩ－３８は１．８×１０６細胞／ｍＬ）を６ウェルプレート（１ウェルあたり１ｍＬ）に播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を添加し、一晩培養し、一晩培養して細胞の単層細胞を形成させた。２００μＬピペットガンの先端を使用して細胞の単層に「一」の形にスクラッチし、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、次に対応する用量のケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル（骨肉腫細胞の用量は１４３Ｂ：４ｍｇ／Ｌ、ＨＯＳ：４ｍｇ／Ｌ、Ｕ２：１０ｍｇ／Ｌ、乳癌細胞の用量はＭＤＡ－ＭＢ－２３１：２ｍｇ／Ｌ、Ｔ４７Ｄ：３ｍｇ／Ｌ、胃癌細胞の用量はＳＧＣ７９０１：６ｍｇ／Ｌ、ＢＧＣ８２３：５ｍｇ／Ｌ、ＡＧＳ：３ｍｇ／Ｌ、子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞の用量は２ｍｇ／Ｌ、肺の用量癌細胞Ａ５４９は３ｍｇ／Ｌ、腸癌細胞Ｃａｃｏ２の用量濃度は４ｍｇ／Ｌ、マウス神経膠腫ＢＶ２の用量濃度は４ｍｇ／Ｌ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３の用量濃度は６ｍｇ／Ｌ、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰの用量濃度は２ｍｇ／Ｌ）溶液を加え、ＤＭＳＯを溶媒対照として使用して、２４時間培養した。顕微鏡でスクラッチ時の幅と測定時の幅を測定し、スクラッチ鎖率を計算し、スクラッチ率は、スクラッチ率＝（スクラッチ時の幅－測定時の幅）／スクラッチ時の幅×１００％であった。スクラッチ抑制率＝（対照グループスクラッチ閉鎖率－治療グループスクラッチ閉鎖率）／対照グループスクラッチ閉鎖率×１００％であった。
【0034】
結果は表２に示すように、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルは１４種類の細胞のスクラッチ閉鎖に対して有意な抑制能力を示した。骨肉腫細胞のスクラッチ閉鎖に対するの抑制率は１４３Ｂ：５４．３４％、ＨＯＳ：５７．６０％、Ｕ２：７０．４６％であり、乳癌細胞の抑制率はＭＤＡ－ＭＢ－２３１：８１．９８％、Ｔ４７Ｄ：６４．１２％であり、胃癌細胞の抑制率はＳＧＣ７９０１：７２．０２％、ＢＧＣ８２３：７３．６７％、ＡＧＳ：６０．９１％、子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞の抑制率は５３．９７％、肺癌細胞Ａ５４９の抑制率は６９．６１％、腸癌細胞Ｃａｃｏ２の抑制率は６６．６４％、マウス神経膠腫ＢＶ２の抑制率は７５．２２％、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３の抑制率は７０．９２％、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰの抑制率は６４．６６％であった。ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル処理には、多様な腫瘍細胞の遊走を抑制する効果がある。
【0035】
【表2】
【0036】
実施例６
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの腫瘍細胞に対するアポトーシス促進効果
方法：
トリプシンは対数期にある腫瘍細胞を消化し、終結後に遠心分離により回収し、懸濁液を作り、細胞を計数し、一定濃度（ＡＧＳ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＢＣＰＡＰ、ＧＥＳ、ＨＵＶＥＣは６×１０５細胞／ｍＬ、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＧＣ－８２３、Ａ５４９、ＰＣ３、Ｌ０２は５×１０５細胞／ｍＬ、１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、ＳＧＣ－７９０１、Ｈｅｌａ、ＢＶ－２は３×１０５細胞／ｍＬ、ＷＩ－３８は１．８×１０６細胞／ｍＬ）に調整し、一定濃度の細胞を１ウェルあたり１ｍＬの濃度で６ウェルプレートに移した。細胞培養インキュベーターに入れて１２時間培養し、細胞を壁に接着させた。対応する用量のケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル（骨肉腫細胞の用量は１４３Ｂ：４ｍｇ／Ｌ、ＨＯＳ：４ｍｇ／Ｌ、Ｕ２：１０ｍｇ／Ｌ、乳癌細胞の用量はＭＤＡ－ＭＢ－２３１：２ｍｇ／Ｌ、Ｔ４７Ｄ：３ｍｇ／Ｌ、胃癌細胞の用量はＳＧＣ７９０１：６ｍｇ／Ｌ、ＢＧＣ８２３：５ｍｇ／Ｌ、ＡＧＳ：３ｍｇ／Ｌ、子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞の用量は２ｍｇ／Ｌ、肺の用量癌細胞Ａ５４９は３ｍｇ／Ｌ、腸癌細胞Ｃａｃｏ２の用量濃度は４ｍｇ／Ｌ、マウス神経膠腫ＢＶ２の用量濃度は４ｍｇ／Ｌ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３の用量濃度は６ｍｇ／Ｌ、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰの用量濃度は２ｍｇ／Ｌ）溶液を加えた。ＤＭＳＯを溶媒対照として使用して、２４時間培養した。２４時間の作用後、３００ｇ、４℃で５分間遠心分離して細胞を収集し、上清を廃棄し、細胞を予冷したＰＢＳで２回洗浄し、毎回３００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。１～５×１０５個の細胞を収集した。１００μｌの１×結合バッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を加えて細胞を再懸濁した。５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣと５μｌのＰＩを加え、軽く混ぜた。室温、暗所で１０分間反応させた。４００μｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、均一に混合し、サンプルは１時間以内にフローサイトメトリーで測定した。解析はフローサイトメーターの標準的な測定手順に従って実施し、励起波長は４８８ｎｍ、細胞数は２０，０００個で、結果は細胞周期フィッティングソフトウェアＭｏｄＦｉｔを用いて解析した。解析時にはＦＬ２－ｗとＦＬ２－Ａディスプレイを使用し、結合細胞を除去した。
ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルの腫瘍細胞に対するアポトーシス促進効果
方法：
トリプシンは対数期にある腫瘍細胞を消化し、終結後に遠心分離により回収し、懸濁液を作り、細胞を計数し、一定濃度（ＡＧＳ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＢＣＰＡＰ、ＧＥＳ、ＨＵＶＥＣは６×１０５細胞／ｍＬ、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＧＣ－８２３、Ａ５４９、ＰＣ３、Ｌ０２は５×１０５細胞／ｍＬ、１４３Ｂ、ＨＯＳ、Ｕ２、ＳＧＣ－７９０１、Ｈｅｌａ、ＢＶ－２は３×１０５細胞／ｍＬ、ＷＩ－３８は１．８×１０６細胞／ｍＬ）に調整し、一定濃度の細胞を１ウェルあたり１ｍＬの濃度で６ウェルプレートに移した。細胞培養インキュベーターに入れて１２時間培養し、細胞を壁に接着させた。対応する用量のケルセチン－３，３’－ジメチルエーテル（骨肉腫細胞の用量は１４３Ｂ：４ｍｇ／Ｌ、ＨＯＳ：４ｍｇ／Ｌ、Ｕ２：１０ｍｇ／Ｌ、乳癌細胞の用量はＭＤＡ－ＭＢ－２３１：２ｍｇ／Ｌ、Ｔ４７Ｄ：３ｍｇ／Ｌ、胃癌細胞の用量はＳＧＣ７９０１：６ｍｇ／Ｌ、ＢＧＣ８２３：５ｍｇ／Ｌ、ＡＧＳ：３ｍｇ／Ｌ、子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞の用量は２ｍｇ／Ｌ、肺の用量癌細胞Ａ５４９は３ｍｇ／Ｌ、腸癌細胞Ｃａｃｏ２の用量濃度は４ｍｇ／Ｌ、マウス神経膠腫ＢＶ２の用量濃度は４ｍｇ／Ｌ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３の用量濃度は６ｍｇ／Ｌ、ヒト甲状腺癌ＢＣＰＡＰの用量濃度は２ｍｇ／Ｌ）溶液を加えた。ＤＭＳＯを溶媒対照として使用して、２４時間培養した。２４時間の作用後、３００ｇ、４℃で５分間遠心分離して細胞を収集し、上清を廃棄し、細胞を予冷したＰＢＳで２回洗浄し、毎回３００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。１～５×１０５個の細胞を収集した。１００μｌの１×結合バッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を加えて細胞を再懸濁した。５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣと５μｌのＰＩを加え、軽く混ぜた。室温、暗所で１０分間反応させた。４００μｌの１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加え、均一に混合し、サンプルは１時間以内にフローサイトメトリーで測定した。解析はフローサイトメーターの標準的な測定手順に従って実施し、励起波長は４８８ｎｍ、細胞数は２０，０００個で、結果は細胞周期フィッティングソフトウェアＭｏｄＦｉｔを用いて解析した。解析時にはＦＬ２－ｗとＦＬ２－Ａディスプレイを使用し、結合細胞を除去した。
【0037】
結果は表３に示すように、ケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルは１５種類の細胞に対して顕著なアポトーシス誘導効果がある。
【0038】
【表3】
【0039】
前述の内容は、本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者であれば、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改良及び修正ができ、これらの改良及び装飾もまた、本発明の保護範囲とみなされるべきであることに留意されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗腫瘍薬剤であって、前記薬剤にはケルセチンのオキシメチル修飾物質が含まれることを特徴とする抗腫瘍薬剤。
【請求項2】
前記薬剤がｉｎ ｖｉｖｏの移植腫瘍の増殖を抑制できることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項3】
前記薬剤が腫瘍細胞の遊走を抑制できることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項4】
前記薬剤が腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項5】
前記薬剤が腫瘍細胞の増殖を抑制できることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項6】
前記ケルセチンのオキシメチル修飾物質には、ケルセチン－３－メチルエーテル及び／又はケルセチン－３，３’－ジメチルエーテルが含まれることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項7】
前記腫瘍細胞には、骨肉腫、肝臓癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、肺癌、腸癌、神経膠腫、前立腺癌又は甲状腺癌の細胞が含まれることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤。
【国際調査報告】