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特表2024-527138様々な血清型のストレプトコッカス・スイスに対して保護するためのワクチン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-19
(54)【発明の名称】様々な血清型のストレプトコッカス・スイスに対して保護するためのワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/02 20060101AFI20240711BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240711BHJP
C12N 9/52 20060101ALN20240711BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20240711BHJP
【ＦＩ】
A61K39/02
A61P31/04
C12N9/52 ZNA
C12N1/20 E
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024506499
(86)(22)【出願日】2022-06-29
(85)【翻訳文提出日】2024-03-29
(86)【国際出願番号】 EP2022067890
(87)【国際公開番号】W WO2023011810
(87)【国際公開日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】21189277.3
(32)【優先日】2021-08-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510000976
【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ジェイコブス，アントニウス・アーノルドゥス・クリスチャン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
【Ｆターム（参考）】
4B065AA49X
4B065CA45
4C085AA03
4C085BA14
4C085BB22
4C085CC07
4C085EE03
(57)【要約】
本発明は、ストレプトコッカス・スイス血清型（７）のＩｇＭプロテアーゼ抗原と、ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型（９）、配列型（１６）と、薬学的に許容され得る担体とを組み合わせて含むワクチンに関する。本発明は、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症に対してブタを保護するための方法において使用するための、ストレプトコッカス・スイス血清型（７）のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型（９）、配列型（１６）の組み合わせ、並びにストレプトコッカス・スイス血清型（７）のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型（９）、配列型（１６）をブタに投与することによって、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症に対してブタを保護するための方法にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原と、ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６と、薬学的に許容され得る担体とを組み合わせて含むワクチン。
【請求項2】
ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原が、ストレプトコッカス・スイス血清型７細菌の対応する天然に存在するＩｇＭプロテアーゼと少なくとも９０％の配列同一性を有する完全なＩｇＭプロテアーゼ抗原であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項3】
ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原が、ストレプトコッカス・スイス血清型７細菌の対応する天然に存在するＩｇＭプロテアーゼと少なくとも９５％の配列同一性を有する完全なＩｇＭプロテアーゼ抗原であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項4】
ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原が、そのアミノ酸配列中に４つ未満の反復を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項5】
ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原が、そのアミノ酸配列中に３つ未満の反復を含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項6】
ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原が、そのアミノ酸配列中に２つの反復を含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項7】
ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原が、配列型２９のものであることを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項8】
ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原及び前記ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６以外の他のストレプトコッカス・スイス抗原を含まないか、又は多くてもストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原を含むことを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項9】
ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症に対してブタを保護するための方法において使用するための、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６の組み合わせ。
【請求項10】
前記保護が、血清型１、２、７及び９のいずれかのストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症に対するものであることを特徴とする、請求項９に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項11】
前記方法が、ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原及び前記ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６を最大３５日齢の前記ブタに投与することを含むことを特徴とする、請求項９及び１０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ。
【請求項12】
前記方法が、雌ブタの初乳の摂取を通じてブタを保護するために、前記雌ブタにストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原及び前記ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６を投与することを含むことを特徴とする、請求項９及び１０のいずれかに記載の使用のための組み合わせ。
【請求項13】
ストレプトコッカス・スイス血清型７の前記ＩｇＭプロテアーゼ抗原及び前記ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６が、前記ブタが前記初乳を摂取する前に前記雌ブタに２回投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項14】
ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症に対してブタを保護するためのワクチンを製造するための、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６の使用。
【請求項15】
ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６をブタに投与することによって、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症から前記ブタを保護するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の一般的な分野
本発明は、様々な血清型、特に最も蔓延している血清型１、２、７及び９のストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）細菌による病原性感染症に対するブタの保護に関する。
本発明は、様々な血清型、特に最も蔓延している血清型１、２、７及び９のストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）細菌による病原性感染症に対するブタの保護に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ストレプトコッカス・スイス（Ｓ．スイス）は、ブタにおける伝染性細菌疾患の主要な病原因子の１つである。この病原体は、髄膜炎、関節炎、心膜炎、多発性漿膜炎、敗血症、肺炎及び突然死を含む様々な臨床症候群を引き起こし得る。Ｓ．スイスは、当初にはランスフィールド群Ｒ、Ｓ、Ｒ／Ｓ又はＴとして定義されたグラム陽性の通性嫌気性球菌である。後に、細胞壁内に位置する型特異的莢膜多糖抗原に基づく新しい分類系が提案された。これにより、３５の血清型を含む系が得られ（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｓｅｎ，１９９８，“１６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４８，１０６３－１０６５）、そのうち血清型１、２、７及び９が現在、特にヨーロッパで最も蔓延している。しかしながら、莢膜血清型は病原性の優れたマーカーではないことが認識されている。そこで、Ｓ．スイス感染の疫学及び血清型決定アプローチの生物学的関連性の理解を助ける代替的な系、すなわち、Ｋｉｎｇらによって、ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｃｔ．２００２，ｐ．３６７１－３６８０（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｉｇ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｐｓｕｌａｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ）”に記載されているような、いわゆる多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）が開発された。その研究では、９２の配列型が同定され、そのうち、それぞれ複数の配列型を含有する、ＳＴ複合体ＳＴ１、ＳＴ２７及びＳＴ８７が集団において支配的である。Ｋｉｎｇらの論文を参照しており、任意のストレプトコッカス・スイス株の配列型の容易な同定を可能にする、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ（Ｊｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓ ２０１８，３：１２４（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔが資金を拠出するサイト）に掲載されているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ＭＬＳＴウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｓｓｕｉｓ／）も参照されたい。
ストレプトコッカス・スイス（Ｓ．スイス）は、ブタにおける伝染性細菌疾患の主要な病原因子の１つである。この病原体は、髄膜炎、関節炎、心膜炎、多発性漿膜炎、敗血症、肺炎及び突然死を含む様々な臨床症候群を引き起こし得る。Ｓ．スイスは、当初にはランスフィールド群Ｒ、Ｓ、Ｒ／Ｓ又はＴとして定義されたグラム陽性の通性嫌気性球菌である。後に、細胞壁内に位置する型特異的莢膜多糖抗原に基づく新しい分類系が提案された。これにより、３５の血清型を含む系が得られ（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｓｅｎ，１９９８，“１６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４８，１０６３－１０６５）、そのうち血清型１、２、７及び９が現在、特にヨーロッパで最も蔓延している。しかしながら、莢膜血清型は病原性の優れたマーカーではないことが認識されている。そこで、Ｓ．スイス感染の疫学及び血清型決定アプローチの生物学的関連性の理解を助ける代替的な系、すなわち、Ｋｉｎｇらによって、ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｃｔ．２００２，ｐ．３６７１－３６８０（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｉｇ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｐｓｕｌａｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ）”に記載されているような、いわゆる多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）が開発された。その研究では、９２の配列型が同定され、そのうち、それぞれ複数の配列型を含有する、ＳＴ複合体ＳＴ１、ＳＴ２７及びＳＴ８７が集団において支配的である。Ｋｉｎｇらの論文を参照しており、任意のストレプトコッカス・スイス株の配列型の容易な同定を可能にする、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ（Ｊｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓ ２０１８，３：１２４（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔが資金を拠出するサイト）に掲載されているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ＭＬＳＴウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｓｓｕｉｓ／）も参照されたい。
【0003】
ブタの群れにおけるストレプトコッカス・スイスの制御は困難であるようである。ストレプトコッカス・スイスは、ブタの共生かつ日和見病原体である。明らかに、感染症の発生のたびに、免疫系の引き金が引かれるわけではない。これに次いで、ストレプトコッカス・スイスは、十分に莢膜に包まれた病原体であり、宿主免疫系を回避するために豊富な病原性因子を使用する。これらの特徴が相まって、この重要な病原体と戦うための有効なワクチンの開発する上での障害となってきた。数年前に概説論文が発表されており、この論文は、ストレプトコッカス・スイスに対する既存のワクチン及び試験的ワクチンを概説している（Ｍａｒｉｅｌａ Ｓｅｇｕｒａ：“Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｉｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １４，２０１５，Ｉｓｓｕｅ １２，ｐａｇｅｓ １５８７－１６０８）。この総説では、臨床現場情報及び実験データが編纂され、比較されており、本明細書で以下に概説されるようなストレプトコッカス・スイスに対するワクチン開発の状況の概要を説明する。
【0004】
現在市販されているワクチンは、主に全細胞型バクテリンである。しかしながら、現場報告には、疾患の制御及び管理の困難さが記載されており、とりわけ異種防御が極めて不十分であるため、特に、バクテリンワクチンを使用した際の「ワクチンの不成功」が一般的である。保菌ブタが主要な感染源であり、垂直伝播及び水平伝播の両方が群れの中での疾患の拡散に関与している。離乳及び輸送などのストレスの多い条件下で保菌動物を疾患に罹患しやすい動物と混合することによって、通常、臨床疾患がもたらされる。メディケィテッド早期離乳及び早期離乳・分離飼育の実践は、ストレプトコッカス・スイス感染を排除しない。したがって、疾患を予防するための効果的な制御手段は、予防的／感染伝播予防的処置（可能な場合）及びワクチン接種に依存する。現在、現場での免疫化の取り組みは、市販のバクテリン又は自家バクテリンの使用に重点を置いている。これらのワクチン戦略は、仔ブタ又は雌ブタのいずれかに適用されてきた。離乳以降、離乳及び一般的なその後の輸送に伴うストレスのために、仔ブタはストレプトコッカス・スイス感染症により罹患しやすい。したがって、仔ブタへの受動免疫を試み、伝達するために、及びこれらのストレスの多い環境下で生後早期にストレプトコッカス・スイスに対する保護を与えるために、雌ブタでの分娩前免疫化がしばしば使用される。さらに、雌ブタへのワクチン接種は、費用及び人手があまりかからないため、仔ブタへのワクチン接種に代わる経済的な方法である。しかしながら、入手できる結果は、バクテリンによる雌ブタのワクチン接種も議論の的となっていることを示しているようである。多くの事例で、ワクチン接種された雌ブタは、出産前に２回ワクチン接種された場合でさえ、ワクチン接種に対する応答が不十分であるか又は全く応答せず、その結果、同腹仔に移行する母子免疫が低くなる。また、母子免疫が十分なレベルで移行されたとしても、多くの事例で、移行抗体は、４～７週齢の最も重要な期間では低すぎて保護を与えることができない。
【0005】
仔ブタでは、自家バクテリンが、特にヨーロッパにおいて現場で頻繁に使用されている。自家バクテリンは、臨床上の問題を有する飼育場で単離された毒性株から調製され、同じ飼育場に適用される。自家バクテリンの欠点の１つは、ワクチンの安全性データが不足しており、重度の有害反応が起こり得ることである。（１匹又は２匹のブタ又はサンプルのみを使用することによる）サンプリングエラーの結果、最近の大流行に関連する株又は血清型の同定に失敗することがあり得る。この失敗は、蔓延している群れにおいて特に問題となり得る。最後に、自家バクテリンの最も重要な問題は、それらの実際の有効性が十分に研究されていないことである。自家ワクチンの適用は経験的であるので、これらのワクチンを用いて得られた結果が一貫せず、しばしば期待外れに終わることは驚くべきことではない。
【0006】
他の実験的ワクチンも当技術分野において記載されている。Ｋａｉ－Ｊｅｎ Ｈｓｕｅｈらは、バクテリン＋サブユニットが仔ブタに防御免疫を付与するための雌ブタのワクチン接種の成功の基礎となり得ることを示す（“Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｂａｃｔｅｒｉｎ ｐｌｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓａｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｏｗｓ ｃｏｎｖｅｙｓ ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｐｉｇｌｅｔｓ”，ｉｎ：ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＢＭＣ ｓｅｒｉｅｓ－ｏｐｅｎ，ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ａｎｄ ｔｒｕｓｔｅｄ，１３：１５，７ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１７）。
【0007】
弱毒生ワクチンも、当技術分野において想定されている。ストレプトコッカス・スイス血清型２の莢膜に包まれていない同質遺伝子型変異体は、無毒性であることが明確に示されている。それにもかかわらず、莢膜に包まれていない血清型２変異体に基づく生ワクチン製剤は、死亡に対して部分的な保護のみを誘導し、野生型株で攻撃されたブタにおいて臨床徴候の発生を予防することができなかった（Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ ＨＪ，Ｓｔｏｃｋｈｏｆｅ－Ｚｕｒｗｉｅｄｅｎ Ｎ，Ｈｉｌｇｅｒｓ ＬＡ，ｅｔ ａｌ．“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｌｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｌｌｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｎｏｎ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２．” ｉｎ：Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，８４：１５５－１６８．）。
【0008】
過去数年の間に、抗原性又は免疫原性のストレプトコッカス・スイス分子の広範なリストが報告されており、これらのほとんどは、感染したブタ若しくはヒトからの回復期血清及び／又は実験室で産生された免疫血清のいずれかを用いた免疫プロテオミクスを通じて発見された。国際公開第２０１５／１８１３５６号（ＩＤＴ Ｂｉｏｌｏｇｉｋａ ＧｍｂＨ）は、ＩｇＭプロテアーゼ抗原（全タンパク質又は完全タンパク質の約３５％に相当するに過ぎない高度に保存されたＭａｃ－１ドメインのいずれか）が、バクテリンを含有する予備刺激ワクチン接種と組み合わされてもよい、ＩｇＭプロテアーゼ抗原の２用量を投与するワクチン接種スキームにおいて、仔ブタに防御免疫応答を誘発することができることを示した。’３５６特許出願では、ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、すべてではないにしてもほとんどのストレプトコッカス・スイス血清型、特に最も蔓延している血清型１、２、７及び９全体にわたって高度に保存されているという事実のために、ＩｇＭプロテアーゼ抗原を使用して、ストレプトコッカス・スイス血清型、特に血清型１、２、７及び９の間で、広範な交差防御に到達することができることが示唆されている。
【0009】
国際公開第２０１７／００５９１３号（Ｉｎｔｅｒｖａｃｃ ＡＢ）は、ＩｇＭプロテアーゼが様々なストレプトコッカス・スイス血清型全体にわたって高度に保存されているという事実、したがって、この抗原を使用して到達することができる予想される広範な保護を確認している。
【0010】
近年、他の血清型から保護するためのＩｇＭプロテアーゼ抗原、特に血清型２のＩｇＭプロテアーゼ抗原の使用に関する特許出願が公開された。これらの出願は、ＩｇＭプロテアーゼ抗原の交差防御性を確認する。
【0011】
特に、国際公開第２０２０／０９４７６２号は、血清型１４による攻撃に対する血清型２のＩｇＭプロテアーゼ抗原の使用を記載している。極めて十分な保護を得ることができるようである。
【0012】
国際公開第２０１９／１１５７４１号では、ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、血清型９のストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症から保護するのに有効であることが示されている。しかしながら、保護はさほど高くなく、せいぜい一般的なバクテリンワクチンで得ることができるレベル、すなわち人工的な攻撃実験での死亡及び陽性血液単離の約５０％の低下であるようである（実際には、多くはあまり激しくない攻撃を受けて、保護がより高いレベルとなることが排除されない）。一見すると、このやや期待外れの保護は、ＲｉｅｃｋｍａｎｎらによってＶａｃｃｉｎｅ，３（２０１９）１０００４６（“Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ，ＩｄｅＳｓｕｉｓ，ｌｅａｄｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９ ｓｔｒａｉｎ”）で報告されている、また人工的な攻撃実験における血清型９のストレプトコッカス・スイスによる感染症に対するＩｇＭプロテアーゼ抗原によって得られる高いレベルの保護、及び国際公開第２０２０／０９４７６２号に示されているような血清型１４のストレプトコッカス・スイスに対する保護とは相容れないように見える。当該技術に基づいて、一般的な血清型９の細菌に対する比較的低いレベルの保護を理解することはできない。
【0013】
少なくともいくらかの保護が予想されるが、当技術分野では、ＩｇＭプロテアーゼ血清型２の、血清型１及び７のストレプトコッカス・スイスによる攻撃に対する保護について利用可能なデータは存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】国際公開第２０１５／１８１３５６号
【特許文献2】国際公開第２０１７／００５９１３号
【特許文献3】国際公開第２０２０／０９４７６２号
【特許文献4】国際公開第２０１９／１１５７４１号
【非特許文献】
【0015】
【非特許文献1】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｓｅｎ，１９９８，“１６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４８，１０６３－１０６５
【非特許文献2】Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ． ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｃｔ．２００２，ｐ．３６７１－３６８０（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｉｇ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｐｓｕｌａｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ）
【非特許文献3】Ｊｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｏｐｅｎ Ｒｅｓ ２０１８，３：１２４
【非特許文献4】Ｍａｒｉｅｌａ Ｓｅｇｕｒａ：“Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｉｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １４，２０１５，Ｉｓｓｕｅ １２，ｐａｇｅｓ １５８７－１６０８
【非特許文献5】Ｋａｉ－Ｊｅｎ Ｈｓｕｅｈ ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｂａｃｔｅｒｉｎ ｐｌｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓａｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｏｗｓ ｃｏｎｖｅｙｓ ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｐｉｇｌｅｔｓ”，ｉｎ：ＢＭＣ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＢＭＣ ｓｅｒｉｅｓ－ｏｐｅｎ，ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ａｎｄ ｔｒｕｓｔｅｄ，１３：１５，７ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１７
【非特許文献6】Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ ＨＪ，Ｓｔｏｃｋｈｏｆｅ－Ｚｕｒｗｉｅｄｅｎ Ｎ，Ｈｉｌｇｅｒｓ ＬＡ，ｅｔ ａｌ．“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｌｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｌｌｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｎｏｎ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２．” ｉｎ：Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，８４：１５５－１６８
【非特許文献7】Ｒｉｅｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，３（２０１９）１０００４６（“Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ，ＩｄｅＳｓｕｉｓ，ｌｅａｄｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９ ｓｔｒａｉｎ”）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
発明の目的
本発明の目的は、ストレプトコッカス・スイスに対して、特に血清型１、２、７及び９を含む様々な血清型のストレプトコッカス・スイスに対してブタの（交差）防御を提供するための改善されたワクチンを見出すことである。好ましくは、ワクチンは、これらの４つの血清型より少ない血清型に由来する抗原を含むが、少なくともこれらの４つの血清型のすべてに対して、少なくとも現場に存在するこれらの血清型の代表的な株に対して、なお十分な保護を提供することができる。
本発明の目的は、ストレプトコッカス・スイスに対して、特に血清型１、２、７及び９を含む様々な血清型のストレプトコッカス・スイスに対してブタの（交差）防御を提供するための改善されたワクチンを見出すことである。好ましくは、ワクチンは、これらの４つの血清型より少ない血清型に由来する抗原を含むが、少なくともこれらの４つの血清型のすべてに対して、少なくとも現場に存在するこれらの血清型の代表的な株に対して、なお十分な保護を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明の目的を満たすために、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原、ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６、及び薬学的に許容され得る担体を組み合わせて含むワクチンが考案された。
【0018】
本発明は、２つの予想外の発見に基づいていた。第１に、血清型２のＩｇＭプロテアーゼによって与えられる異種防御は、特にＩｇＭプロテアーゼが異なる血清型のストレプトコッカス・スイスの間で高度に保存されているので、先行技術の教示に基づいて予想されるほど良好ではないようであった。特に、最もよく理解されるように、Ｍａｃ－１ドメインは、今日知られているすべてのストレプトコッカス・スイス血清型において非常に高い同一性レベルで存在する。それでも、血清型２攻撃に対する血清型のＩｇＭプロテアーゼ抗原によって与えられる同種防御は優れているが、ストレプトコッカス血清型１及び７に対する保護はなお著しく改善され得る。別の予想外の発見は、今度は、血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原によって与えられる異種防御は、特に血清型１及び２に対して極めて良好であることであった。特に、血清型２に対して与えられる異種防御のレベルが、血清型７に対して血清型２によって与えられる異種防御よりも著しく優れているという事実は全く予想外である。
【0019】
さらなる極めて想外の発見は、血清型２の、又は実際には任意の血清型のＩｇＭプロテアーゼ抗原が、最も蔓延している型のストレプトコッカス血清型９、すなわちストレプトコッカス血清型９、配列型１６に対してほとんど十分な保護を提供しないことであった（ある程度の保護は与えられるが、そのレベルは商業的に成功したワクチンとしては十分ではない）。一見すると、この発見は、Ｒｉｅｃｋｍａｎｎに報告されている結果とは相容れないように見える。しかしながら、詳細に検討すると、Ｒｉｅｃｋｍａｎｎ研究では、血清型９、配列型９４のストレプトコッカス・スイス株が使用されているようである。国際公開第２０１９／１１５７４１号では、示されていないが、配列型１６のストレプトコッカス・スイス株が使用されている。これは、Ｋｉｎｇら（上記参照）によって記載されたように、使用した攻撃株の型を多座位配列タイピングに従って決定することによって後に見出された。明らかに、後者の型（血清型９、配列型１６のＳ．スイス）に対して、ＩｇＭプロテアーゼ抗原は実質的により低いレベルで保護を提供する。この理由は完全には明らかではないが、多くの国、特にオランダなどのヨーロッパ諸国では、配列型１６のストレプトコッカス・スイスが、ストレプトコッカス・スイス血清型９細菌の最も蔓延している（最大約９５％の）病原性型であるので（Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１９，９：１５４２９，“Ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９ ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｃａｒｒｉａｇｅ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ”）、極めて不利である。このように、ＩｇＭプロテアーゼは血清型にわたって保護を生じ得るが、特にストレプトコッカス・スイス血清型９、配列型１６に関して、有効な保護に間隙が存在することが見出された。
【0020】
上記発見のすべてを認識した後で初めて、現場で血清型１、２、７及び９のストレプトコッカス・スイスに対して（したがって、最も蔓延している株型に対して）十分に保護する改良されたワクチン、本ワクチンを考案することができたと結論付けることができた。血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原を使用すると、当技術分野で使用される血清型２のＩｇＭプロテアーゼによって得られるよりも優れたレベルで、血清型１、２及び７に対して十分な保護を得ることができることが見出された。また、血清型９、配列型１６に対する保護の間隙は、血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイスバクテリンを使用して、ストレプトコッカス・スイス血清型９、配列型１６による病原性感染症に対してブタを保護することによって閉じることができることが見出された。組み合わせ中に存在するＩｇＭプロテアーゼは、それ自体は血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイスに対して十分な保護を与えるのに適していないが、バクテリンの保護を改善さえし得る。
【0021】
本発明では、２つの異なる血清型（７及び９）の２つのストレプトコッカス・スイス抗原のみを使用することによって、最も蔓延しているストレプトコッカス・スイス細菌に対する十分な保護を得ることができ、血清型２細菌のＩｇＭプロテアーゼを使用した際のストレプトコッカス・スイス細菌に対する保護における間隙又は欠点を閉じることができる。本発明は、重要な代表として配列型１６を含む血清型９のストレプトコッカス・スイスに対して可能な限り最良の保護に到達することを可能にするだけでなく、すべての蔓延している血清型、特に血清型１、２、７及び９にわたって極めて広くかつ高いレベルの保護に到達するための方法に到達することも可能にする。
【0022】
本発明は、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症に対してブタを保護する方法において使用するための、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原と、ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６との組み合わせにも関する。
【0023】
これに続いて、本発明は、ストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症に対してブタを保護するためのワクチンを製造するための、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６の使用、並びにストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６をブタに投与することによって、ストレプトコッカス・スイスによう病原性感染症に対してブタを保護するための方法に関する。
【0024】
定義
ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ブタＩｇＭを特異的に分解する酵素（ブタＩｇＧ又はブタＩｇＡを分解しない；Ｓｅｅｌｅ ａｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２０１３、１９５ ９３０－９４０；及びＶａｃｃｉｎｅ ３３：２２０７－２２１２；５ Ｍａｙ ２０１５）、ＩｄｅＳｓｕｉｓと表記されるタンパク質、又はその免疫原性部分（典型的には、完全長酵素の少なくとも約３０～３５％の長さを有する）である。完全な酵素は、約１０００～１１５０アミノ酸に相当する約１００～１２５ｋＤａの重量を有し、サイズはＳ．スイスの血清型に依存する。国際公開第２０１５／１８１３５６号には、ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原に相当するいくつかの配列、すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（本出願にも組み込まれる）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５が与えられており、後者は完全長酵素の免疫原性部分（Ｍａｃ－１ドメインとして表される、すなわちＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸８０～４１４）である。完全長酵素の免疫原性部分の他の例は、国際公開第２０１７／００５９１３号に与えられている。ＩｇＭプロテアーゼの特定の例は、国際公開第２０１５／１８１８３５６号のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によるプロテアーゼ、又は重複する領域において少なくとも９０％、又はさらには９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最大１００％の配列同一性を有するタンパク質である。アミノ酸配列の同一性は、初期設定パラメータでｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用してＢＬＡＳＴプログラムで確立され得る。様々な血清型のストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼは、７５％より高い配列同一性を有すると予想され、特に、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最大１００％であると予想される。例えば抗原の組換え産生系において収量を最適化するように作製された人工タンパク質は、必要とされる免疫原性機能を維持しながら、完全な酵素と比較して８５％、８０％、７５％、７０％、６５、６０、５５又はさらには５０％などのより低いアミノ酸配列同一性をもたらし得、本発明の意味においてストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原であると理解される。
ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ブタＩｇＭを特異的に分解する酵素（ブタＩｇＧ又はブタＩｇＡを分解しない；Ｓｅｅｌｅ ａｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２０１３、１９５ ９３０－９４０；及びＶａｃｃｉｎｅ ３３：２２０７－２２１２；５ Ｍａｙ ２０１５）、ＩｄｅＳｓｕｉｓと表記されるタンパク質、又はその免疫原性部分（典型的には、完全長酵素の少なくとも約３０～３５％の長さを有する）である。完全な酵素は、約１０００～１１５０アミノ酸に相当する約１００～１２５ｋＤａの重量を有し、サイズはＳ．スイスの血清型に依存する。国際公開第２０１５／１８１３５６号には、ストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原に相当するいくつかの配列、すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（本出願にも組み込まれる）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５が与えられており、後者は完全長酵素の免疫原性部分（Ｍａｃ－１ドメインとして表される、すなわちＳＥＤ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸８０～４１４）である。完全長酵素の免疫原性部分の他の例は、国際公開第２０１７／００５９１３号に与えられている。ＩｇＭプロテアーゼの特定の例は、国際公開第２０１５／１８１８３５６号のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によるプロテアーゼ、又は重複する領域において少なくとも９０％、又はさらには９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最大１００％の配列同一性を有するタンパク質である。アミノ酸配列の同一性は、初期設定パラメータでｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用してＢＬＡＳＴプログラムで確立され得る。様々な血清型のストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼは、７５％より高い配列同一性を有すると予想され、特に、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、最大１００％であると予想される。例えば抗原の組換え産生系において収量を最適化するように作製された人工タンパク質は、必要とされる免疫原性機能を維持しながら、完全な酵素と比較して８５％、８０％、７５％、７０％、６５、６０、５５又はさらには５０％などのより低いアミノ酸配列同一性をもたらし得、本発明の意味においてストレプトコッカス・スイスのＩｇＭプロテアーゼ抗原であると理解される。
【0025】
ストレプトコッカス・スイスの完全なＩｇＭプロテアーゼ抗原は、少なくともＭａｃ－１ドメイン、構造的機能と関連する領域、ＣＮＶ領域を含み、細胞接着領域を含んでもよい抗原である（ストレプトコッカス・スイスのゲノムにおけるこれらの領域の同定については実施例１を参照のこと）。いずれにしても、天然に存在する（野生型）分泌型酵素にはシグナルペプチドは欠けていると考えられ、細胞接着領域はプロテアーゼとしての機能に必須ではないと考えられるので、これは完全なＩｇＭプロテアーゼ抗原とみなすことができる。
【0026】
ワクチンは、対象への適用に適した構成であり、典型的には薬学的に許容され得る担体と組み合わされて、免疫学的有効量で（すなわち、標的対象の免疫系を十分に刺激して、野生型微生物の攻撃の負の作用を少なくとも低減することができる）１つ又は複数の抗原を含み、対象に投与したときに、感染症を処置するために、すなわち感染症又はその感染症から生じる任意の疾患若しくは障害を予防し、改善し、又は治癒することを助けるために免疫応答を誘導する。
【0027】
ゲノム又は対応するアミノ酸配列中のリピートは、生物のゲノム又は対応するアミノ酸配列中で１回又は複数回繰り返されているコピー（正確に同じであるか又は高度に類似している、例えばホモログ）である。リピートは、ゲノムの区画が繰り返されるコピー数多型という現象の一部である。典型的には、リピートの数は、同じ生物の異なる株間で変動する。コピー数多型は、構造的多型の一種である。コピー数多型は、典型的にはかなりの数の塩基対、例えば、１０～１３０アミノ酸に相当する３０～４００塩基対の間のどこかに影響を及ぼす重複事象の一種である。
【0028】
微生物による病原性感染症に対する保護は、防御免疫に到達すること、すなわち、例えば、実際の感染症又は病原体による病原性感染症に起因する１つ若しくは複数の臨床徴候を予防又は軽減するために、その微生物による病原性感染症又はその感染症から生じる障害を予防し、改善し、又は治癒するのを助けることと同じである。
【0029】
バクテリンは、ワクチンとして使用するための死菌の懸濁液である。
【0030】
抗原の組み合わせとは、１つのワクチン製剤中で別個の抗原を一緒にすることによって、又は別個の製剤の同時投与のために別個の抗原製剤を使用することによって、１つのワクチン接種戦略においてこれらの（個別に異なる）抗原を一緒に使用することである。
【0031】
混合ワクチン（すなわち、抗原の組み合わせを含むワクチン）は、同時に異なる抗原を含む１つの（単一の）製剤である。これらの異なる抗原は、抗原が最終的に同じ製剤になる限り、いわゆる即時使用型混合ワクチンを提供するために工場において混合され得、又は投与直前若しくは投与中に混合され得る（例えば、別個の抗原のための２つの別個のチャンバを有する装置を使用して、これらのチャンバの内容物は、投与のための装置を使用する際に混合される）。
【0032】
ブタ（ｐｉｇ）は、イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）に属する任意の動物である。
【0033】
薬学的に許容され得る担体は、生体適合性媒体、すなわち、投与後に、処置された対象に著しい有害反応を誘発せず、その担体を含む組成物の投与後に対象の免疫系に抗原を提示することができる媒体である。このような薬学的に許容され得る担体は、例えば、水及び／若しくは任意の他の生体適合性溶媒を含有する液体、又は免疫刺激剤（アジュバントとも呼ばれる）を含んでもよい、（糖及び／又はタンパク質をベースとする）凍結乾燥ワクチンを得るために一般的に使用されるような固体担体であり得る。対応するワクチンの意図される用途又は要求される特性に応じて、安定剤、粘度調整剤又は他の成分などの他の物質が添加されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【0034】
発明のさらなる態様
本発明によるワクチンのさらなる態様では、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ストレプトコッカス・スイス血清型７細菌の対応する天然に存在する（すなわち野生型の）ＩｇＭプロテアーゼと少なくとも９０％の配列同一性を有する完全なＩｇＭプロテアーゼ抗原である。当技術分野から、ＩｇＭプロテアーゼのＭａｃ－１ドメインのみ（約３５％）が保護を提供するのに十分であることが知られているが、完全な抗原がより効果的な免疫応答を提供すると考えられている。特に、天然に存在するＩｇＭプロテアーゼと９０％又はそれを上回る、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくはさらには１００％の配列同一性が、十分な同種及び異種防御に達するために好ましい。
本発明によるワクチンのさらなる態様では、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ストレプトコッカス・スイス血清型７細菌の対応する天然に存在する（すなわち野生型の）ＩｇＭプロテアーゼと少なくとも９０％の配列同一性を有する完全なＩｇＭプロテアーゼ抗原である。当技術分野から、ＩｇＭプロテアーゼのＭａｃ－１ドメインのみ（約３５％）が保護を提供するのに十分であることが知られているが、完全な抗原がより効果的な免疫応答を提供すると考えられている。特に、天然に存在するＩｇＭプロテアーゼと９０％又はそれを上回る、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくはさらには１００％の配列同一性が、十分な同種及び異種防御に達するために好ましい。
【0035】
本発明によるワクチンのなおさらなる態様では、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原は、そのアミノ酸配列中に４つ未満のリピートを含む。ストレプトコッカス・スイスのゲノムの構造分析は、この細菌のゲノムが、ゲノムの区画が繰り返されるコピー数多型（ＣＮＶ）の現象を起こしやすいことを明らかにする。特に、リピートは、加水分解酵素活性を有する既知のタンパク質配列と類似性を有する。血清型２のＩｇＭプロテアーゼは、血清型２が４つのリピートを含むという点で、より良好な異種防御を提供するもの（血清型１及び７など）とは主に異なることが見出された。したがって、リピートの数が４未満、又はさらには３未満、例えば２などであれば、可能な限り最良の（異種）防御に到達することが有利であると考えられる。
【0036】
最も好ましいのは、２つのリピートを含む配列型２９のストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原である。
【0037】
ワクチンは、例えば血清型２のＩｇＭプロテアーゼなどの追加のストレプトコッカス・スイス抗原を含み得るが、ワクチンは、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６以外の他のストレプトコッカス・スイス抗原を含まないか、又は多くてもストレプトコッカス・スイス血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原を含むことが十分であることが見出された。より多くの抗原は、より高い原価及びより高い抗原負荷によるより高いリスク副作用を意味する。
【0038】
ストレプトコッカス・スイスに対して保護する上での使用のための組み合わせのさらなる態様において、保護は、血清型１、２、７及び９のいずれかのストレプトコッカス・スイスによる病原性感染症に対するものである。
【0039】
本発明による使用のための組み合わせのさらなる態様において、前記方法は、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６を最大３５日齢のブタに投与することを含む。
【0040】
別の態様では、前記方法は、雌ブタの初乳の摂取を通じてブタ（通常は仔ブタ）を保護するために、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６をこの雌ブタに投与することを含む。仔ブタがワクチン接種された雌ブタから初乳を摂取すると、ＩｇＭプロテアーゼ（国際公開第２０１９／１９３０７８号を参照）が、仔ブタに対して十分かつ長期の保護を与えることが知られている。また、バクテリンによって与えられる保護は、初乳を介して仔ブタに移行されることが一般的に知られている。
【0041】
一態様において、ストレプトコッカス・スイス血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原及びストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６は、仔ブタが前記初乳を摂取する前に雌ブタに２回投与されている。
【0042】
ここで、以下の具体例を用いて本発明をさらに説明する。
【0043】
［実施例］
実施例１ ストレプトコッカス・スイスのゲノムの構造分析。
実施例１ ストレプトコッカス・スイスのゲノムの構造分析。
【0044】
実施例２は、血清型１に対するＩｇＭプロテアーゼ血清型２の交差防御について調べる。
【0045】
実施例３は、血清型７に対するＩｇＭプロテアーゼ血清型２の交差防御について調べる。
【0046】
実施例４は、血清型９、配列型１６に対するＩｇＭプロテアーゼ血清型２の交差防御について調べる。
【0047】
実施例５は、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼによって与えられる、血清型１による攻撃に対する保護について調べる。
【0048】
実施例６は、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼによって与えられる、血清型２による攻撃に対する保護について調べる。
【0049】
実施例７は、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼによって与えられる、血清型７による攻撃に対する保護について調べる。
【0050】
実施例８は、血清型９、配列型１６による攻撃に対するバクテリンによって与えられる保護について調べる。
【0051】
［実施例１］
本実施例では、ＩｇＭプロテアーゼをコードするゲノムの部分がどのような構造になっているかを示すために、ストレプトコッカス・スイスのゲノム、すなわちＩｇＭプロテアーゼをコードする部分の分析が提供される。このために、本発明者らは、国際公開第２０１５／１８１３５６号から既知であり、その特許出願においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として公開されている血清型２のストレプトコッカス・スイス細菌のゲノムを使用する。この配列は、本特許の配列表においてもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として含まれている。タンパク質アノテーション（ＰＤＢＳｕｍ及びＩｎｔｅｒＰｒｏ）に加えてＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアラインメント（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ １９７０，Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ １９９７，Ａｐｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０００参照；初期設定）を使用する配列類似性検索は、その中に５つの領域を同定することができるＩｇＭプロテアーゼゲノムの構造を明らかにする。
本実施例では、ＩｇＭプロテアーゼをコードするゲノムの部分がどのような構造になっているかを示すために、ストレプトコッカス・スイスのゲノム、すなわちＩｇＭプロテアーゼをコードする部分の分析が提供される。このために、本発明者らは、国際公開第２０１５／１８１３５６号から既知であり、その特許出願においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として公開されている血清型２のストレプトコッカス・スイス細菌のゲノムを使用する。この配列は、本特許の配列表においてもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として含まれている。タンパク質アノテーション（ＰＤＢＳｕｍ及びＩｎｔｅｒＰｒｏ）に加えてＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアラインメント（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ １９７０，Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ １９９７，Ａｐｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０００参照；初期設定）を使用する配列類似性検索は、その中に５つの領域を同定することができるＩｇＭプロテアーゼゲノムの構造を明らかにする。
【0052】
領域１（Ｍｅｔ１～Ｔｈｒ３４）：位置１からのシグナル配列；
領域２（Ｖａｌ３５～Ｇｌｕ４２６）：予測される加水分解酵素活性を有するＭａｃ－１ドメイン；
領域３（Ｔｈｒ４２７～Ｐｒｏ６８７）：構造的機能（例えば、適切な折り畳みに関与する）及び基質結合に関連する領域。
領域４（Ｔｈｒ６８８～Ｓｅｒ９１９）：加水分解酵素活性を有する既知のタンパク質配列と類似性を有する４つのリピート（１＊｛Ｔｈｒ６８８～Ｓｅｒ７４４｝、２＊｛Ｔｈｒ７４５～Ｓｅｒ８０１｝、３＊｛Ｔｈｒ８０２～Ｓｅｒ８５８｝、４＊｛Ｔｈｒ８５９～Ｓｅｒ９１９｝）からなる領域；
領域５（Ｔｈｒ９２０～Ｌｙｓ１１４１）：細胞壁アンカー機能を示す予測される膜貫通領域を含有する。
領域２（Ｖａｌ３５～Ｇｌｕ４２６）：予測される加水分解酵素活性を有するＭａｃ－１ドメイン；
領域３（Ｔｈｒ４２７～Ｐｒｏ６８７）：構造的機能（例えば、適切な折り畳みに関与する）及び基質結合に関連する領域。
領域４（Ｔｈｒ６８８～Ｓｅｒ９１９）：加水分解酵素活性を有する既知のタンパク質配列と類似性を有する４つのリピート（１＊｛Ｔｈｒ６８８～Ｓｅｒ７４４｝、２＊｛Ｔｈｒ７４５～Ｓｅｒ８０１｝、３＊｛Ｔｈｒ８０２～Ｓｅｒ８５８｝、４＊｛Ｔｈｒ８５９～Ｓｅｒ９１９｝）からなる領域；
領域５（Ｔｈｒ９２０～Ｌｙｓ１１４１）：細胞壁アンカー機能を示す予測される膜貫通領域を含有する。
【0053】
他の血清型のストレプトコッカス・スイス細菌の構造は概ね同じであるが、血清型９、配列型１６については、実質的な差異が存在する（ここで以下に示されている）：
－シグナルペプチドは、ストレプトコッカス・スイス株の間で高度に保存されている；
－Ｍａｃ－１ドメインは常に存在し、血清型９、配列型１６株を含むすべての既知の株の間で高度に保存されている；
－構造的機能に関連する領域３は常に存在し、同じく高度に保存されているが、血清型９、配列型１６の長さの約半分に過ぎない；
－ＣＮＶ領域に関しては、リピートは異なる血清型間で極めて類似しているが、数は変動し、典型的には２～６である。血清型９、配列型１６は、他の血清型のリピートと比較してはるかにより短い、完全に異なる型の１２のリピートを有し（すなわち、約６０に対して１２ＡＡ）、３つの大幅に異なるリピートに細分することができる；
－細胞接着領域も異なる血清型間で高度に保存されているが、血清型９、配列型１６の株の領域とのアミノ酸配列同一性は実質的に存在しない。
－シグナルペプチドは、ストレプトコッカス・スイス株の間で高度に保存されている；
－Ｍａｃ－１ドメインは常に存在し、血清型９、配列型１６株を含むすべての既知の株の間で高度に保存されている；
－構造的機能に関連する領域３は常に存在し、同じく高度に保存されているが、血清型９、配列型１６の長さの約半分に過ぎない；
－ＣＮＶ領域に関しては、リピートは異なる血清型間で極めて類似しているが、数は変動し、典型的には２～６である。血清型９、配列型１６は、他の血清型のリピートと比較してはるかにより短い、完全に異なる型の１２のリピートを有し（すなわち、約６０に対して１２ＡＡ）、３つの大幅に異なるリピートに細分することができる；
－細胞接着領域も異なる血清型間で高度に保存されているが、血清型９、配列型１６の株の領域とのアミノ酸配列同一性は実質的に存在しない。
【0054】
手短に言えば、ほとんどの血清型及び配列型の間で、ゲノムは概ね同じ構造であり、最も顕著な相違はＣＮＶ領域におけるリピートの数である。血清型９、配列型１６のゲノムのＩｇＭプロテアーゼ部分は、Ｍａｃ－１ドメインに関する限り高度に類似しているが、残りの部分については大幅に異なる。
【0055】
［実施例２］
研究の目的
先行技術から、ストレプトコッカス・スイス血清型２の完全なＩｇＭプロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、同種攻撃に対して優れた保護を提供することが知られている。また、血清型９及び１４に対するいくらかの交差防御が当技術分野から公知である。本実施例では、血清型１攻撃に対する、この抗原による実際の保護のレベルを評価する。このために、細菌の一般的な種類であり、現場におけるこの血清型の優れた代表物である配列型１３の株を使用した。
研究の目的
先行技術から、ストレプトコッカス・スイス血清型２の完全なＩｇＭプロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、同種攻撃に対して優れた保護を提供することが知られている。また、血清型９及び１４に対するいくらかの交差防御が当技術分野から公知である。本実施例では、血清型１攻撃に対する、この抗原による実際の保護のレベルを評価する。このために、細菌の一般的な種類であり、現場におけるこの血清型の優れた代表物である配列型１３の株を使用した。
【0056】
研究デザイン
まず、血清型１細菌による攻撃に対する保護を評価するために、利用可能な唯一の攻撃モデルは、３週齢の仔ブタが攻撃を受けるモデルである。これは、有効な免疫応答を発達させるための時間が短すぎると予想されるので、ＩｇＭプロテアーゼ抗原によって誘導される保護効果を評価するために、仔ブタ自体にワクチン接種することができないことを意味する。したがって、ワクチンによって与えられる保護を評価するために、誘導された抗体が初乳の摂取を介して仔ブタに移行するように、分娩前に雌ブタにワクチン接種する。ＩｇＭプロテアーゼ抗原がワクチン接種された動物自体に保護を提供する場合、ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ワクチン接種された雌ブタの子孫にも優れた保護を与えることが当技術分野（米国特許第１０，７５１，４０３号）から知られている。換言すれば、この（間接的な）攻撃モデルに見られる保護は、当然のことながら、ワクチン接種された雌ブタの初乳の摂取を介して仔ブタに与えられる保護に次いで、ワクチン接種された動物自体に与えられる保護を示す。
まず、血清型１細菌による攻撃に対する保護を評価するために、利用可能な唯一の攻撃モデルは、３週齢の仔ブタが攻撃を受けるモデルである。これは、有効な免疫応答を発達させるための時間が短すぎると予想されるので、ＩｇＭプロテアーゼ抗原によって誘導される保護効果を評価するために、仔ブタ自体にワクチン接種することができないことを意味する。したがって、ワクチンによって与えられる保護を評価するために、誘導された抗体が初乳の摂取を介して仔ブタに移行するように、分娩前に雌ブタにワクチン接種する。ＩｇＭプロテアーゼ抗原がワクチン接種された動物自体に保護を提供する場合、ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ワクチン接種された雌ブタの子孫にも優れた保護を与えることが当技術分野（米国特許第１０，７５１，４０３号）から知られている。換言すれば、この（間接的な）攻撃モデルに見られる保護は、当然のことながら、ワクチン接種された雌ブタの初乳の摂取を介して仔ブタに与えられる保護に次いで、ワクチン接種された動物自体に与えられる保護を示す。
【0057】
本研究のために、１０匹の妊娠中の雌ブタを使用し、それぞれ５匹の雌ブタからなる２つの群に分けた。予想される出産の６週間及び２週間前に、水中油型アジュバント（μＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ、ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）中に８０μｇ／用量で血清型２の組換えｒＩｄｅＳｓｕｉｓ ＩｇＭプロテアーゼ抗原を含むサブユニットワクチン（Ｓｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ：Ｖａｃｃｉｎｅ ３３：２２０７－２２１２；５ Ｍａｙ ２０１５，ｐａｒ．２．２．）を１つの群にワクチン接種し、１つの群を非ワクチン接種対照群として残した。出産後、３週齢で、ワクチン接種された雌ブタからの１０匹の仔ブタ及び対照雌ブタからの１０匹の仔ブタを攻撃のために選択した（各群は雌ブタあたり２匹の仔ブタを含んだ）。カテーテルを使用して、１０ｍｌの攻撃接種材料（５．０×１０１０ＣＦＵ／ｍｌを目標とする）で仔ブタ（２×１０、ワクチン接種及び対照）を気管内攻撃するか、又は（それが不可能であれば）代替として経気管注射を使用することによって攻撃した。攻撃後、うつ病、運動障害及び／又は神経学的徴候などのＳ．スイス感染の臨床徴候について仔ブタを毎日観察し、０（徴候なし）から重篤な症例に対する３までの定型的なスコアリングシステムを使用してスコアを付けた。人道的な終点に達した動物を安楽死させた。ワクチン接種の前及び後の定期的な時間（１０匹の雌ブタ）並びに攻撃の直前（２０匹の仔ブタ）に、抗体決定のために血清血液を採取した。攻撃の前及び後の定期的な時間に（２０匹の仔ブタ）、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。研究の終了時（すなわち、攻撃の１１日後）に、生存しているすべての仔ブタを安楽死させた。
【0058】
結果
いずれのワクチンも許容され得ない部位（すなわち、局所）又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表１に示す。
いずれのワクチンも許容され得ない部位（すなわち、局所）又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表１に示す。
【表1】
【0059】
結論
血清型２のＩｇＭプロテアーゼは、血清型１のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する保護を与えない。
血清型２のＩｇＭプロテアーゼは、血清型１のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する保護を与えない。
【0060】
［実施例３］
研究の目的
本実施例では、血清型７攻撃に対する、実施例２において使用されたのと同じ抗原（血清型２のＩｇＭプロテアーゼ）による実際の保護のレベルを評価する。このために、細菌の一般的な種類であり、現場におけるこの血清型を代表する配列型２９の株を使用した。
研究の目的
本実施例では、血清型７攻撃に対する、実施例２において使用されたのと同じ抗原（血清型２のＩｇＭプロテアーゼ）による実際の保護のレベルを評価する。このために、細菌の一般的な種類であり、現場におけるこの血清型を代表する配列型２９の株を使用した。
【0061】
研究デザイン
血清型１と同様に、血清型７細菌による攻撃に対する保護を評価するために、利用可能な唯一の攻撃モデルは、３．５週齢の仔ブタが攻撃を受けるモデルである。したがって、本研究においても、誘導された抗体が初乳の摂取を介して仔ブタに移行するように、分娩前に雌ブタにワクチン接種する。
血清型１と同様に、血清型７細菌による攻撃に対する保護を評価するために、利用可能な唯一の攻撃モデルは、３．５週齢の仔ブタが攻撃を受けるモデルである。したがって、本研究においても、誘導された抗体が初乳の摂取を介して仔ブタに移行するように、分娩前に雌ブタにワクチン接種する。
【0062】
本研究のために、１０匹の妊娠中の雌ブタを使用し、それぞれ５匹の雌ブタからなる２つの群に分けた。予想される出産の６週間及び２週間前に、水中油型アジュバント（μＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ、ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）中に８０μｇ／用量で血清型２の組換えｒＩｄｅＳｓｕｉｓ ＩｇＭプロテアーゼ抗原を含むサブユニットワクチン（Ｓｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ：Ｖａｃｃｉｎｅ ３３：２２０７－２２１２；５ Ｍａｙ ２０１５，ｐａｒ．２．２．）を１つの群にワクチン接種し、１つの群を非ワクチン接種対照群として残した。出産後、３．５週齢で、ワクチン接種された雌ブタからの１０匹の仔ブタ及び対照雌ブタからの１０匹の仔ブタを攻撃のために選択した（各群は雌ブタあたり２匹の仔ブタを含んだ）。仔ブタ（２×１０、ワクチン接種及び対照）を１０ ｍｌの攻撃接種材料（１．０×１０９ＣＦＵ／ｍｌを目標とする）で気管内攻撃した。攻撃後、うつ病、運動障害及び／又は神経学的徴候などのＳ．スイス感染の臨床徴候について仔ブタを毎日観察し、０（徴候なし）から重篤な症例に対する３までの定型的なスコアリングシステムを使用してスコアを付けた。人道的な終点に達した動物を安楽死させた。ワクチン接種の前及び後の定期的な時間（１０匹の雌ブタ）並びに攻撃の直前（２０匹の仔ブタ）に、抗体決定のために血清血液を採取した。攻撃の前及び後の定期的な時間に（２０匹の仔ブタ）、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。研究の終了時（すなわち、攻撃の１１日後）に、生存しているすべての仔ブタを安楽死させた。
【0063】
結果
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表２に示す。
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表２に示す。
【表2】
【0064】
結論
血清型２のＩｇＭプロテアーゼは、血清型７のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する保護を与えない。
血清型２のＩｇＭプロテアーゼは、血清型７のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する保護を与えない。
【0065】
［実施例４］
研究の目的
本研究の目的は、血清型９攻撃、特に血清型９、配列型１６の細菌による攻撃に対する、実施例２及び３において使用したのと同じ抗原（すなわち、血清型２のＩｇＭプロテアーゼ）による実際の保護のレベルを試験することであった。
研究の目的
本研究の目的は、血清型９攻撃、特に血清型９、配列型１６の細菌による攻撃に対する、実施例２及び３において使用したのと同じ抗原（すなわち、血清型２のＩｇＭプロテアーゼ）による実際の保護のレベルを試験することであった。
【0066】
研究デザイン
２４匹の３週齢の血清陰性ＳＰＦ仔ブタを使用した。それぞれ１０匹の仔ブタの２つの群（異なる同腹仔にわたって均等に分配）に仔ブタを割り当てた。群１は、実施例２及び３に記載されているように、３週齢及び５週齢で筋肉内に２回ワクチン接種され、群２は、ワクチン接種していない攻撃対照群として残した。７週齢で、本明細書で上記されているＳ．スイス血清型９の毒性培養物で、ブタを気管内攻撃した。攻撃後、１０日の間、うつ病、運動障害及び／又は神経学的徴候などのＳ．スイス感染の臨床徴候についてブタを毎日観察した。特定の臨床徴候（すなわち、運動又は神経学的）徴候を示した後に、人道的終点に達した動物を剖検せずに安楽死させた。特定の臨床徴候を示さずに人道的終点に到達した動物を安楽死させ、細菌学的検査を含む剖検を行ってＳ．スイス感染を確認した。攻撃の前及び後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。最初のワクチン接種の日（５週齢）に、ブタは血清型２由来のＩｇＭプロテアーゼに対して血清陰性であった。
２４匹の３週齢の血清陰性ＳＰＦ仔ブタを使用した。それぞれ１０匹の仔ブタの２つの群（異なる同腹仔にわたって均等に分配）に仔ブタを割り当てた。群１は、実施例２及び３に記載されているように、３週齢及び５週齢で筋肉内に２回ワクチン接種され、群２は、ワクチン接種していない攻撃対照群として残した。７週齢で、本明細書で上記されているＳ．スイス血清型９の毒性培養物で、ブタを気管内攻撃した。攻撃後、１０日の間、うつ病、運動障害及び／又は神経学的徴候などのＳ．スイス感染の臨床徴候についてブタを毎日観察した。特定の臨床徴候（すなわち、運動又は神経学的）徴候を示した後に、人道的終点に達した動物を剖検せずに安楽死させた。特定の臨床徴候を示さずに人道的終点に到達した動物を安楽死させ、細菌学的検査を含む剖検を行ってＳ．スイス感染を確認した。攻撃の前及び後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。最初のワクチン接種の日（５週齢）に、ブタは血清型２由来のＩｇＭプロテアーゼに対して血清陰性であった。
【0067】
結果
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表３に示す。
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表３に示す。
【表3】
【0068】
結論
血清型２のＩｇＭプロテアーゼは、血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する保護を与えない。
血清型２のＩｇＭプロテアーゼは、血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイス細菌による攻撃に対する保護を与えない。
【0069】
［実施例５］
研究の目的
本実施例では、血清型１及び血清型７ストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について、血清型１攻撃に対する保護を評価する。このために、実施例２、３及び４において使用されたように、すなわち当技術分野で記載されているように大腸菌発現系を使用して（Ｓｅｅｌｅら、上記参照）、血清型２のＩｇＭプロテアーゼに対応する抗原を作製した。血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原に使用された配列は添付のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されているのに対して、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原に使用された配列は添付のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されている。両配列は、Ｍａｃ－１領域の隣にＣＮＶ領域を含み、この領域に２つのリピートを有する。攻撃株は実施例２において使用されたものと同じであった。
研究の目的
本実施例では、血清型１及び血清型７ストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について、血清型１攻撃に対する保護を評価する。このために、実施例２、３及び４において使用されたように、すなわち当技術分野で記載されているように大腸菌発現系を使用して（Ｓｅｅｌｅら、上記参照）、血清型２のＩｇＭプロテアーゼに対応する抗原を作製した。血清型７のＩｇＭプロテアーゼ抗原に使用された配列は添付のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されているのに対して、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ抗原に使用された配列は添付のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されている。両配列は、Ｍａｃ－１領域の隣にＣＮＶ領域を含み、この領域に２つのリピートを有する。攻撃株は実施例２において使用されたものと同じであった。
【0070】
研究デザイン
研究デザインは実施例２及び３のものと同じであったが、攻撃のための各事例において、３．５週齢の仔ブタを使用し、１０匹の仔ブタの群を使用した。血清型のそれぞれについての攻撃は、実施例２及び３における攻撃に対応した。群１には血清型１のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、群２には血清型７のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、群３を攻撃対照として残した。
研究デザインは実施例２及び３のものと同じであったが、攻撃のための各事例において、３．５週齢の仔ブタを使用し、１０匹の仔ブタの群を使用した。血清型のそれぞれについての攻撃は、実施例２及び３における攻撃に対応した。群１には血清型１のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、群２には血清型７のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、群３を攻撃対照として残した。
【0071】
結果
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表４に示す。
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表４に示す。
【表4】
【0072】
結論
データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型１株による毒性のある攻撃に対して保護すると結論付けることができる。血清型１抗原によって与えられる同種防御は、血清型７抗原によって与えられる異種防御よりもわずかに良好であるようである。
データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型１株による毒性のある攻撃に対して保護すると結論付けることができる。血清型１抗原によって与えられる同種防御は、血清型７抗原によって与えられる異種防御よりもわずかに良好であるようである。
【0073】
［実施例６］
研究の目的
本実施例では、血清型１及び血清型７ストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について、血清型２攻撃に対する保護を評価する。このために、実施例５と同じ抗原を使用した。攻撃株は、現場の株を代表する血清型２、配列型１株であった。
研究の目的
本実施例では、血清型１及び血清型７ストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について、血清型２攻撃に対する保護を評価する。このために、実施例５と同じ抗原を使用した。攻撃株は、現場の株を代表する血清型２、配列型１株であった。
【0074】
研究デザイン
研究デザインは、実施例４のものと概ね同じであった。３０匹の３週齢の仔ブタを使用した。それぞれ１０匹の仔ブタの３つの群（異なる同腹仔にわたって均等に分配）に仔ブタを割り当てた。群１及び群２には、３週齢及び５週齢でそれぞれのサブユニットワクチンを２回筋肉内にワクチン接種したが、群３はワクチン接種しないままとした。７週齢で、Ｓ．スイス血清型２株の毒性培養物で、ブタを気管内攻撃した。攻撃後の１１日の間、うつ病、運動障害及び／又は神経学的徴候などのＳ．スイス感染の臨床徴候についてブタを毎日観察した。人道的終点（ＨＥＰ）に達した動物を安楽死させた。攻撃の直前、攻撃の２日後、及び該当する場合、ＨＥＰの日（安楽死の直前）に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。
研究デザインは、実施例４のものと概ね同じであった。３０匹の３週齢の仔ブタを使用した。それぞれ１０匹の仔ブタの３つの群（異なる同腹仔にわたって均等に分配）に仔ブタを割り当てた。群１及び群２には、３週齢及び５週齢でそれぞれのサブユニットワクチンを２回筋肉内にワクチン接種したが、群３はワクチン接種しないままとした。７週齢で、Ｓ．スイス血清型２株の毒性培養物で、ブタを気管内攻撃した。攻撃後の１１日の間、うつ病、運動障害及び／又は神経学的徴候などのＳ．スイス感染の臨床徴候についてブタを毎日観察した。人道的終点（ＨＥＰ）に達した動物を安楽死させた。攻撃の直前、攻撃の２日後、及び該当する場合、ＨＥＰの日（安楽死の直前）に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。
【0075】
最初のワクチン接種の日に、仔ブタは血清陰性であったか、又は特異的ＩｇＭ抗体ＥＬＩＳＡにおいて極めて低い力価を有していた。ワクチン接種後、群１及び２はＩｇＭプロテアーゼに対して良好な抗体応答を示したのに対して、対照は極めて低いレベルのままであった。
【0076】
結果
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表５に示す。群１中の１匹の動物は、ストレプトコッカス・スイス特有でない理由のために攻撃後に安楽死させなければならなかった。
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表５に示す。群１中の１匹の動物は、ストレプトコッカス・スイス特有でない理由のために攻撃後に安楽死させなければならなかった。
【表5】
【0077】
結論
データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型２株による毒性のある攻撃に対して保護すると結論付けることができる。
データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型２株による毒性のある攻撃に対して保護すると結論付けることができる。
【0078】
［実施例７］
研究の目的
本実施例では、血清型１及び血清型７ストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について、血清型７攻撃に対する保護を評価する。このために、実施例５及び６と同じ抗原を使用した。攻撃株は、現場の株を代表する血清型７、配列型２９株であった。
研究の目的
本実施例では、血清型１及び血清型７ストレプトコッカス・スイス株のＩｇＭプロテアーゼ抗原について、血清型７攻撃に対する保護を評価する。このために、実施例５及び６と同じ抗原を使用した。攻撃株は、現場の株を代表する血清型７、配列型２９株であった。
【0079】
研究デザイン
研究デザインは、（攻撃株を除いて）実施例５のものと同じであった。血清型のそれぞれについての攻撃は、実施例２及び３における攻撃に対応した。群１には血清型１のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、群２には血清型７のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、群３を攻撃対照として残した。
研究デザインは、（攻撃株を除いて）実施例５のものと同じであった。血清型のそれぞれについての攻撃は、実施例２及び３における攻撃に対応した。群１には血清型１のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、群２には血清型７のＩｇＭプロテアーゼをワクチン接種し、群３を攻撃対照として残した。
【0080】
結果
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表６に示す。
いずれのワクチンも許容され得ない部位又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表６に示す。
【表6】
【0081】
結論
攻撃は以前の研究におけるようにより低い毒性であるように見えたが、データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型７株による毒性のある攻撃に対して保護すると結論付けることができる。
攻撃は以前の研究におけるようにより低い毒性であるように見えたが、データから、血清型１のＩｇＭプロテアーゼ並びに血清型７のＩｇＭプロテアーゼは、血清型７株による毒性のある攻撃に対して保護すると結論付けることができる。
【0082】
［実施例８］
研究の目的
本研究の目的は、血清型９攻撃、特に現場に広がっている株を代表する血清型９、配列型１６の細菌による攻撃に対する感染防御抗原を見出すことであった。評価された選択肢は、バクテリン単独及び当技術分野においてバクテリンの有効性を改善すると理解されているＩｇＭプロテアーゼと組み合わせたバクテリンであった（Ｓｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｐ．９３０－９４０ Ｍａｒｃｈ ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ １９５ Ｎｕｍｂｅｒ ５，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｏｓｔ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ”を参照；国際公開第２０１５／１８１３５６号で確認された）。
研究の目的
本研究の目的は、血清型９攻撃、特に現場に広がっている株を代表する血清型９、配列型１６の細菌による攻撃に対する感染防御抗原を見出すことであった。評価された選択肢は、バクテリン単独及び当技術分野においてバクテリンの有効性を改善すると理解されているＩｇＭプロテアーゼと組み合わせたバクテリンであった（Ｓｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｐ．９３０－９４０ Ｍａｒｃｈ ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ １９５ Ｎｕｍｂｅｒ ５，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｏｓｔ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ”を参照；国際公開第２０１５／１８１３５６号で確認された）。
【0083】
研究デザイン
研究デザインは実施例４で使用されたものと同じであったが、非ＳＰＦ仔ブタを使用し、それぞれ１２匹の仔ブタの３つの群（異なる同腹仔にわたって均等に分配）に割り当てた。群１には、血清型９、配列型１６の不活化されたストレプトコッカス・スイス細菌を２×１０９細胞のレベルで含有するバクテリンワクチンを３週齢及び５週齢で２回筋肉内にワクチン接種した。群２はさらに、実施例２のＩｇＭプロテアーゼを８０μｇ／用量で含有した。両ワクチンは、他の実施例で使用された水中油型アジュバント中に製剤化された。群３は、ワクチン接種されていない攻撃対照群として残した。７週齢で、本明細書で上記されているＳ．スイス血清型９の毒性培養物で、ブタを気管内攻撃した。攻撃後、１０日の間、うつ病、運動障害及び／又は神経学的徴候などのＳ．スイス感染の臨床徴候についてブタを毎日観察した。特定の臨床徴候（すなわち、運動又は神経学的）徴候を示した後に、人道的終点に達した動物を剖検せずに安楽死させた。特定の臨床徴候を示さずに人道的終点に到達した動物を安楽死させ、細菌学的検査を含む剖検を行ってＳ．スイス感染を確認した。攻撃の前及び後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。最初のワクチン接種の日（５週齢）に、ブタは血清型２由来のＩｇＭプロテアーゼに対して血清陰性であった。
研究デザインは実施例４で使用されたものと同じであったが、非ＳＰＦ仔ブタを使用し、それぞれ１２匹の仔ブタの３つの群（異なる同腹仔にわたって均等に分配）に割り当てた。群１には、血清型９、配列型１６の不活化されたストレプトコッカス・スイス細菌を２×１０９細胞のレベルで含有するバクテリンワクチンを３週齢及び５週齢で２回筋肉内にワクチン接種した。群２はさらに、実施例２のＩｇＭプロテアーゼを８０μｇ／用量で含有した。両ワクチンは、他の実施例で使用された水中油型アジュバント中に製剤化された。群３は、ワクチン接種されていない攻撃対照群として残した。７週齢で、本明細書で上記されているＳ．スイス血清型９の毒性培養物で、ブタを気管内攻撃した。攻撃後、１０日の間、うつ病、運動障害及び／又は神経学的徴候などのＳ．スイス感染の臨床徴候についてブタを毎日観察した。特定の臨床徴候（すなわち、運動又は神経学的）徴候を示した後に、人道的終点に達した動物を剖検せずに安楽死させた。特定の臨床徴候を示さずに人道的終点に到達した動物を安楽死させ、細菌学的検査を含む剖検を行ってＳ．スイス感染を確認した。攻撃の前及び後の定期的な時間に、攻撃株の再単離のためにヘパリン血液を採取した。最初のワクチン接種の日（５週齢）に、ブタは血清型２由来のＩｇＭプロテアーゼに対して血清陰性であった。
【0084】
結果
いずれのワクチンも許容され得ない部位（ｓｉｔｅｌ）又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表７に示す。群２中の１匹の動物は、ストレプトコッカス・スイス特有でない理由のために攻撃後に安楽死させなければならなかった。
いずれのワクチンも許容され得ない部位（ｓｉｔｅｌ）又は全身反応を誘発せず、したがって安全と考えることができた。安楽死前の期間の攻撃後のデータを表７に示す。群２中の１匹の動物は、ストレプトコッカス・スイス特有でない理由のために攻撃後に安楽死させなければならなかった。
【表7】
【0085】
結論
血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイスの毒性のある攻撃に対する保護は、その血清型のバクテリン、及びＩｇＭプロテアーゼと組み合わせたバクテリンによって提供され得る。２つの種類の抗原は悪い方向に干渉せず、先行技術に基づいて予想されたものと一致する。
血清型９、配列型１６のストレプトコッカス・スイスの毒性のある攻撃に対する保護は、その血清型のバクテリン、及びＩｇＭプロテアーゼと組み合わせたバクテリンによって提供され得る。２つの種類の抗原は悪い方向に干渉せず、先行技術に基づいて予想されたものと一致する。
【0086】
上記実施例に基づいて、組み合わされたワクチン接種戦略において、ストレプトコッカス・スイス血清型７又は１のＩｇＭプロテアーゼ抗原を、ストレプトコッカス・スイスバクテリン血清型９、配列型１６と組み合わせることによって、本発明の目的を満たすことができる。また、血清型１及び７攻撃の両方に対するより優れた保護に到達するために必要であれば、２つのＩｇＭプロテアーゼ抗原は、組み合わされ得ることも考えられる。また、血清型２と比較したときに、ＣＮＶ領域が血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼ分子との間で差がある場所であり、血清型１及び７のＩｇＭプロテアーゼはそれぞれ２つのリピートを有するのに対して、血清型２は４つのリピートを有するので、交差防御のレベルは、ＩｇＭプロテアーゼのＣＮＶ領域におけるリピートの数と関係していると考えるのが合理的である。交差防御の差の理由は明白（ｃｌｅａｔ）ではないが、より少ない数のリピートが、より良いレベルの交差防御に到達するために有利であるように見受けられる。
【配列表】
【国際調査報告】