特表 2024-527142 リキッドバイオプシーにおける変異検出の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-19

(54)【発明の名称】リキッドバイオプシーにおける変異検出の方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240711BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024506585

(86)(22)【出願日】2022-08-02

(85)【翻訳文提出日】2024-02-19

(86)【国際出願番号】 EP2022071749

(87)【国際公開番号】W WO2023012186

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】21189685.7

(32)【優先日】2021-08-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524042610

【氏名又は名称】オンコディーエヌエー

【氏名又は名称原語表記】ＯＮＣＯＤＮＡ

【住所又は居所原語表記】Ａｖｅｎｕｅ Ｌｏｕｉｓ Ｂｒｅｇｕｅｔ １， ６０４１ Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ ＢＥＬＧＩＵＭ

(74)【代理人】

【識別番号】110002789

【氏名又は名称】弁理士法人ＩＰＸ

(72)【発明者】

【氏名】レーズ・ジャン・フランソワ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR62

4B063QX02

(57)【要約】

患者のリキッドバイオプシーによって変異を検出する方法であって、方法は、リキッドバイオプシーによってＤＮＡ断片を採取するステップと、ＤＮＡ断片のＤＮＡライブラリを調製するステップと、ＤＮＡライブラリを配列決定するステップと、変異を有するＤＮＡ断片のＤＮＡバリアント断片を同定するステップと、ＤＮＡバリアント断片の長さに基づいて、同定されたＤＮＡバリアント断片を第１グループ及び第２グループに関連付けるステップと、第１グループと第２グループとにおけるＤＮＡバリアント断片の存在に基づいて、変異が腫瘍性であるか健常であるかを検出するステップとを有する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者のリキッドバイオプシーによって変異を検出する方法であって、前記方法は、
前記リキッドバイオプシーによってＤＮＡ断片を採取するステップと、
ＤＮＡ断片長を保持して、前記リキッドバイオプシーによる前記ＤＮＡ断片のＤＮＡライブラリを調製するステップと、
前記ＤＮＡライブラリを配列決定し、前記ＤＮＡライブラリの前記ＤＮＡ断片の配列決定データを収集するステップであって、前記ＤＮＡライブラリの配列決定は、ターゲットパネルを用いるターゲットシーケンシングによって行われ、前記ターゲットパネルは、一般に腫瘍性であることが知られている複数の変異か、又は前記リキッドバイオプシー以前に採取された前記患者の試料から同定された複数の変異を定義する、ステップと、
前記配列決定のデータに基づいて、同じ変異を有する前記ＤＮＡ断片のＤＮＡバリアント断片を同定するステップと、
前記ＤＮＡバリアント断片が、第１中間長さ閾値よりも短い場合に、同定された前記ＤＮＡバリアント断片を第１グループに関連付けるステップであって、前記第１中間長さ閾値は、１５０ｂｐから１６６ｂｐの間にある、ステップと、
前記ＤＮＡバリアント断片が、第２中間長さ閾値よりも長い場合に、同定された前記ＤＮＡバリアント断片を第２グループに関連付けるステップであって、前記第２中間長さ閾値は、１５０ｂｐから１６６ｂｐの間にあり、好ましくは、前記第１中間長さ閾値と前記第２中間長さ閾値とは等しい、ステップと、
前記第１グループ及び前記第２グループにおける前記ＤＮＡバリアント断片の存在に基づいて、前記変異が腫瘍性であるか健常であるかを検出するステップであって、前記ＤＮＡバリアント断片が前記第２グループよりも前記第１グループにより多く存在する場合に、前記変異は腫瘍性であると検出される、ステップとを有する、
方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法において、
前記第１グループと前記第２グループとにおける前記ＤＮＡバリアント断片の存在と、前記変異の変異頻度とに基づいて、前記変異が腫瘍性であるか健常であるかを、検出する、
方法。

【請求項3】

前記請求項のいずれか１つに記載の方法において、
前記ＤＮＡバリアント断片が前記第２グループよりも前記第１グループにおいてより多く存在し、且つ前記変異が頻度閾値未満の変異頻度を有する場合に、前記変異は腫瘍性であると検出し、前記頻度閾値は、２％から５０％の間である、
方法。

【請求項4】

前記請求項のいずれか１つに記載の方法において、
前記ＤＮＡバリアント断片が、前記第２中間長さ閾値よりも長く、且つ上限長さ閾値よりも短い場合に、前記ＤＮＡバリアント断片は、前記第２グループに関連付けられる、
方法。

【請求項5】

前記請求項のいずれか１つに記載の方法において、
前記ＤＮＡライブラリは、一本鎖ＤＮＡライブラリ及び二本鎖ＤＮＡライブラリである、
方法。

【請求項6】

前記請求項のいずれか１つに記載の方法において、
前記第１グループ及び／又は前記第２グループからの変異の同定は、前記第１グループと前記第２グループとにおける前記変異の比較によって行われ、ここで
（ｉ）前記変異が前記第２グループにのみ存在する場合に、前記変異は健康な変異として検出され、及び／又は
（ｉｉ）前記ＤＮＡ変異のＤＮＡ変異頻度が前記頻度閾値よりも優れている場合に、前記変異は、健康な変異として検出され、及び／又は
（ｉｉｉ）前記変異が前記第１グループよりも前記第２グループにより多く存在する場合に、前記変異は、健康な変異として検出される、
方法。

【請求項7】

前記請求項のいずれか１つに記載の方法において、
前記リキッドバイオプシーは、（ｉ）治療前の腫瘍を有する患者、（ｉｉ）治療中の腫瘍を有する患者、（ｉｉｉ）治療終了後の腫瘍を有する患者、（ｉｖ）腫瘍寛解段階にある患者、（ｖ）腫瘍再発段階にある患者、のうちの少なくとも１つの段階にある患者に対して実施される、
方法。

【請求項8】

前記請求項のいずれか１つに記載の方法において、
前記ターゲットパネルにおいて定義される前記複数の変異のそれぞれの変異について、
前記配列決定のデータに基づいて、前記それぞれの変異を有する前記ＤＮＡ断片のＤＮＡバリアント断片を同定するステップと、
前記それぞれの変異の前記ＤＮＡバリアント断片が第１中間長さ閾値よりも短い場合に、前記それぞれの変異の同定された前記ＤＮＡバリアント断片を第１グループに関連付けるステップであって、前記第１中間長さ閾値は、１５０ｂｐから１６６ｂｐの間である、ステップと、
前記それぞれの変異の前記ＤＮＡバリアント断片が第２中間長さ閾値よりも長い場合に、前記それぞれの変異の同定された前記ＤＮＡバリアント断片を第２グループに関連付けるステップであって、前記第２中間長さ閾値は、１５０ｂｐから１６６ｂｐの間であり、好ましくは、前記第１中間長さ閾値と前記第２中間長さ閾値とは等しい、ステップと、
前記第１グループと前記第２グループとにおける前記それぞれの変異の前記ＤＮＡバリアント断片の存在に基づいて、前記それぞれの変異が腫瘍性であるか健常性であるかを検出するステップであって、前記ＤＮＡバリアント断片が前記第２グループよりも前記第１グループにより多く存在する場合に、前記それぞれの変異が腫瘍性であると検出するステップとを実施する、
方法。

【請求項9】

患者の腫瘍の個別化された変異プロファイルに適合する治療を同定し、追跡し、及び／又は適合させる方法であって、前記方法は、
前記患者の腫瘍試料からＤＮＡを採取するステップと、
前記腫瘍試料から前記ＤＮＡの配列決定をするステップと、
前記配列決定から変異を同定するステップと、
同定された前記変異を標的とする特異的ＤＮＡプローブのパネルを設計するステップと、
前記請求項のいずれか１つに記載の方法を行うステップであって、前記患者の液体試料の前記ＤＮＡ断片を設計された前記パネルで収集する、ステップと、
腫瘍性の及び／又は健常な変異の前記検出に基づいて、前記腫瘍の前記個別化された変異プロファイルを特性評価するステップとを有する、
方法。

【請求項10】

１つ前の請求項に記載の方法において、
前記液体試料は、腫瘍寛解段階にある前記患者から生じる、
方法。

【請求項11】

請求項９又は請求項１０に記載の方法において、
前記治療を同定し、追跡し及び／又は適合させることは、前記腫瘍の前記個別化された変異プロファイルの前記特性評価に適合される、
方法。

【請求項12】

請求項９～請求項１１のいずれか１つに記載の方法において、
前記患者の前記腫瘍の前記個別化された変異プロファイルの前記特性評価に適合する治療が、前記患者に適用される、
方法。

【請求項13】

請求項９～請求項１２のいずれか１つに記載の方法において、
前記液体試料は、腫瘍寛解段階にある前記患者から生じる、
方法。

【請求項14】

請求項９～請求項１３のいずれか１つに記載の方法に基づいて作成されたセラノスティックレポート。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ゲノムに関連した分析に関する。特に、循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の発見は、侵襲的なサンプリング法に伴うリスクを伴わずに、リキッドバイオプシーによる遺伝物質を分析する機会を提供してきた。

【0002】

より具体的には、限定されないが、本開示は、患者のリキッドバイオプシーから変異を検出する方法、患者の腫瘍の変異プロファイルに適合する治療を同定し、追跡し、及び／又は適合させる方法、ならびに患者の腫瘍のセラノスティックレポートに言及する。

【背景技術】

【0003】

腫瘍、特に悪性腫瘍に由来する少量の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、癌患者の血液中のｃｆＤＮＡの中に見つかることがある。疾病を診断又はより適切に同定するために、血液からｃｔＤＮＡを検出するアッセイは、リキッドバイオプシーとして知られている。現在、リキッドバイオプシーにおける既存の癌診断方法にはいくつかの限界があり、特に初期の癌段階では、ｃｔＤＮＡは血液中のｃｆＤＮＡに比べて非常に低いレベルで存在する。これにより、既存のほとんどの方法の感度は、ｃｔＤＮＡを初期の段階において検出できるほど高くないか、方法が非常に複雑であるため、臨床で使用することができない。

【0004】

さらに、腫瘍細胞のｃｔＤＮＡ断片の平均長は、癌の影響を受けていない正常且つ健常な細胞のｃｆＤＮＡ断片よりも短いことが知られている。リキッドバイオプシーからの特定のｃｔＤＮＡを検出する感度を増加させる方法を提供する様々な文献が知られている。

【0005】

文献国際公開第２０２０／９４７７５号は、セルフリー核酸含有試料からバリアント核酸を検出するためのコンピュータ実装方法を提供している。当該方法は、ａ）試料から得られた核酸断片の断片サイズを表すデータ、及び／又は試料から得られた核酸断片のコピー数中立からの偏差の尺度を表すデータを提供するステップと、ｂ）コンピュータのプロセッサに、バリアント核酸を含むセルフリー核酸の複数の試料及びバリアント核酸を含まない複数の試料を含む訓練セットで訓練された分類アルゴリズムに従って、ステップａ）からのデータを処理させるステップであって、分類アルゴリズムが、試料データを少なくとも２つのクラスのうちの１つに分類するように動作し、該少なくとも２つのクラスは、複数のセルフリー核酸断片サイズの特徴及び／又はコピー数中立からの偏差の特徴に基づいて、バリアント核酸を含む第１クラス及びバリアント核酸を含まない第２クラスを含む、ステップと、ｃ）ステップｂ）からの試料の分類を出力し、よって試料がバリアント核酸を含むか否かを決定するか、又は試料がバリアント核酸を含む確率を決定するステップとを有する。

【0006】

文献米国特許出願公開第ＵＳ２０２００２９４６２４号明細書（国際公開第２０２０／１８６０２４号）は、サイズ選択されたセルフリーＤＮＡ配列を用いて癌を分類するための、高感度で、高速で、且つ安価な方法を提供している。この文献に記載された方法によると、腫瘍由来ｃｆＤＮＡが少ない癌を含む、すべての癌タイプの癌試料中の癌由来ｃｆＤＮＡ断片の分画を濃縮することができる。さらに、この方法論は、腫瘍分画が１％未満であっても、腫瘍分画が非常に低い癌（例えば、初期段階の癌及び低ｃｔＤＮＡ癌）の分類を容易にする。この方法は、影響を受けた領域から試料を採取し、影響を受けていない領域から液体試料を採取することを提案している。２つの試料のＤＮＡ断片長のヒストグラムが作成される。２つのヒストグラムの比に基づいて、非腫瘍試料のｃｆＤＮＡに対して腫瘍試料のｃｆＤＮＡ断片の濃度が高い順に断片サイズビンをランク付けする。そして、癌性であることが知られている特定のｃｔＤＮＡを、最高ランクの断片サイズビンに基づいて液体試料から検出することができる。

【0007】

文献欧州特許出願公開第３６１２９６４号明細書（国際公開第２０１８／１９５４８３号）には、被験試料から得られたｃｆＤＮＡ断片のサイズ及び配列を分析することにより、被験試料中の腫瘍に関連する遺伝子配列バリアントの存在又はコピー数を決定する方法が開示されている。この文献は、ｃｆＤＮＡのサイズ情報と配列情報とを効果的に組み合わせることにより、腫瘍関連バリアントを検出して癌を判定するための高い分析感度及び特異性を実現したリキッドバイオプシーのプロセスとシステムとを提供している。この文献によれば、この開示の一側面は、被験試料から得られたｃｆＤＮＡ断片のサイズ及び配列を分析することにより、被験試料中の腫瘍に関連する遺伝子配列バリアントの存在又はコピー数を決定する方法に関する。

【0008】

文献国際公開第２０２０／１０４６７０号には、被験者から得られた試料中のバリアントセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出する方法が開示されており、試料の分析は、ＤＮＡの異なる断片サイズを分離するサイズ選択ステップを含む。

【0009】

これらの文献は、ｃｆＤＮＡ断片とｃｔＤＮＡ断片のサイズ及び配列情報の違いを利用して、腫瘍関連バリアントを検出し、癌を判定するための高い分析感度及び特異性を実現している。これにより、たとえ特定のバリアントＤＮＡが低濃度しか存在しなかったとしても、液体試料中の特定のバリアントＤＮＡ（例えば、癌性であることが知られているもの）の存在を検出するための感度を増加させることができる。

【0010】

残念ながら、これらの文献にはその技術の利点が述べられているが、現在、患者のリキッドバイオプシーから採取したＤＮＡに基づいて、変異が腫瘍性か健常かを検出でき、日常的な臨床現場で適用できるほどに十分に高い感度を持つ方法は存在しない。実際、これらの文献では、腫瘍に関連する遺伝子配列変異の存在を判定する方法が開発されている。しかしながら、リキッドバイオプシーから未知の変異を同定し、この未知の変異を腫瘍性か健常かを分類できる方法は存在しない。癌治療の有効性を向上させ、リキッドバイオプシー解析のコストを低減するためには、高感度でリキッドバイオプシーから変異を検出し、腫瘍に関連する遺伝子配列バリアントの存在を検出できることが重要であるだけでなく、癌治療を最も効率的な方法で適合させるために、変異が腫瘍性（腫瘍細胞に由来する）か健常（正常且つ健常な細胞に由来する）かを検出することも必要である。実際、同じ変異でも、腫瘍がある場合と健常な場合とでは、推奨される癌治療が異なる。

【発明の概要】

【0011】

したがって、患者のリキッドバイオプシーに基づいて、腫瘍性変異であるか健常変異であるかの同定を達成する方法が必要とされている。

【0012】

本発明によれば、独立請求項にしたがう、患者のリキッドバイオプシーから変異を検出する方法が提供される。

【0013】

従来の技術では、ＤＮＡバリアント断片のサイズは、特定の変異を検出するために感度を増加させるためのみに使用されていたが、本発明者らは、ＤＮＡバリアント断片のサイズが、変異が腫瘍性であるかどうかを検出するために使用できることを発見した。実際、本発明に係る方法は、両方の群のＤＮＡバリアント断片を分析することにより、変異の存在を検出できるだけでなく、この変異が腫瘍性か健常かを検出することもできる。変異の腫瘍由来又は健常由来の検出が、患者の治療処置に対して異なる結果をもたらすために、患者の個別化癌治療を向上させることが実に求められている。さらに、本発明による方法は、教師なしでも機能するため、どのような変異でも、たとえ未知の変異であっても、腫瘍性又は健常として検出することができる。本発明による方法はまた、非常に高い感度でリキッドバイオプシーから変異を同定及び検出することができ、ディープシーケンシングに頼る必要性を防止し、これにより、方法のコストを低減し、臨床現場における方法の日常的な適用を可能にする。さらに、リキッドバイオプシーのＤＮＡ分析の多くの既知の方法は、その方法の感度を向上させるために、固有の分子識別子（ＵＭＩ）の使用に頼っている。ＵＭＩは、次世代シーケンシングプロトコルのＤＮＡライブラリ調製中にＤＮＡ断片に追加される短い配列である。これらのＵＭＩはＤＮＡ断片を同定するための特異的なタグであり、配列決定前のＰＣＲ増幅の際に生じるエラーを減らすために使用される。本発明に係る方法は、第１グループ及び第２グループにおけるＤＮＡバリアント断片の存在を分析するので、クローン性造血による偽陽性を自然に補完することができる。当分野の技術水準とは異なり、本発明は、そのＤＮＡ断片の２つのサイズグループにおける特定の変異の存在に基づくものであり、２つのサイズグループにおける異なる変異を混合するものではない。これは、特定の変異の存在を検出する感度をさらに増加させ、特定の変異が腫瘍性か健康かを検出する鍵となることがわかった。

【0014】

ＤＮＡ断片は、リキッドバイオプシーによって採取されたＤＮＡの断片である。好ましくは、ＤＮＡ断片は、１５０ｂｐから３００ｂｐの間のＤＮＡ配列長を有するが、本発明がこれらのサイズに限定されないことは明らかであり、この範囲外のＤＮＡ配列も本発明に使用することができる。ＤＮＡ断片は、ＤＮＡバリアント断片及び／又はＤＮＡ野生型断片からなる。ＤＮＡ野生型断片は、参照ゲノムの対応するＤＮＡ配列と同一のＤＮＡ配列を有する。好ましくは、参照ゲノムのＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩのｈｇ１９（例えば：ｇｒｃｈ３７）のような公開データベースによって得られる。しかし、参照ゲノムは、患者の健常ＤＮＡ試料に由来するゲノムでもあり得る。ＤＮＡバリアント断片は、参照ゲノムのＤＮＡ配列から少なくとも１つのバリアントを有するＤＮＡ断片を参照するか、又はそのような全ＤＮＡ断片である、すなわち、ＤＮＡバリアント断片は、変異を有する。ＤＮＡバリアント断片は、異なる変異を区別せず、全ＤＮＡ断片が任意の変異を持つことを指す。ＤＮＡバリアント断片は、ＤＮＡのある特定のバリエーション（特定のＤＮＡバリアント）を有する全ＤＮＡ断片を指す、言い換えると、同じ変異を有する全ＤＮＡ断片である。「変異」という用語は、参照ゲノムの対応するＤＮＡ配列と比較したＤＮＡ断片のＤＮＡ配列における特定のバリアントを意味する。したがって、変異は、ＤＮＡのある部分のあるバリエーションを意味する。ＤＮＡバリアント断片の少なくとも一部は、全て同じ変異を示す。ＤＮＡバリアント断片は、ＤＮＡバリアント断片の異なる部分に異なる変異を持つことができる。同じ変異は、（全ＤＮＡバリアント断片が同じＤＮＡバリアント配列の実現であるように）ＤＮＡバリアント（断片）の完全な配列を意味することもあれば、（ＤＮＡバリアント断片がＤＮＡの当該サブ部分で同一であり、ＤＮＡの他の部分で異なり得るように）ＤＮＡ配列が同じ変異を有するＤＮＡのサブ部分のみを指すこともある。そのため、後者の実施形態では、２つの異なるサブ部分に２つの変異を持つＤＮＡバリアント断片は、２つの異なる特定の変異とみなされる／同定され得る。つまり、リキッドバイオプシーにより採取された全変異のＤＮＡバリアント断片の組み合わせが、ＤＮＡバリアント断片を形成する。好ましくは、変異は、一塩基多型、インデル、欠失、転座、コピー数バリアント、又はそれらの組み合わせを含むバリアントのグループに属する。

【0015】

本発明によれば、患者のリキッドバイオプシーによって変異を検出する方法が提供され、この方法は、
リキッドバイオプシーによってＤＮＡ断片を採取するステップと、
ＤＮＡ断片長を保持して、リキッドバイオプシーによるＤＮＡ断片のＤＮＡライブラリを調製するステップと、
ＤＮＡライブラリを配列決定し、ＤＮＡライブラリのＤＮＡ断片の配列決定データを収集するステップであって、ＤＮＡライブラリの配列決定は、ターゲットパネルを用いるターゲットシーケンシングによって行われ、ターゲットパネルは、一般に腫瘍性であることが知られている複数の変異か、又はリキッドバイオプシー以前に採取された患者の試料から同定された複数の変異を定義する、ステップと、
配列決定のデータに基づいて、同じ変異を有するＤＮＡ断片のＤＮＡバリアント断片を同定するステップと、
ＤＮＡバリアント断片が、第１中間長さ閾値よりも短い場合に、同定されたＤＮＡバリアント断片を第１グループに関連付けるステップであって、第１中間長さ閾値は、１５０ｂｐから１６６ｂｐの間にある、ステップと、
ＤＮＡバリアント断片が、第２中間長さ閾値よりも長い場合に、同定されたＤＮＡバリアント断片を第２グループに関連付けるステップであって、第２中間長さ閾値は、１５０ｂｐから１６６ｂｐの間にあり、好ましくは、第１中間長さ閾値と第２中間長さ閾値とは等しい、ステップと、
第１グループ及び第２グループにおけるＤＮＡバリアント断片の存在に基づいて、変異が腫瘍性であるか健常であるかを検出するステップであって、ＤＮＡバリアント断片が第２グループよりも第１グループにより多く存在する場合に、変異は腫瘍性であると検出される、ステップとを有する。

【0016】

本発明によれば、患者の腫瘍の個別化された変異プロファイルに適応する治療を同定し、追跡し、及び／又は適合させる方法を提供し、この方法は、
患者の腫瘍試料からＤＮＡを採取するステップと、
腫瘍試料からＤＮＡの配列決定をするステップと、
配列決定から変異を同定するステップと、
同定された変異を標的とする特異的ＤＮＡプローブのパネルを設計するステップと、
請求項のいずれか１つに記載の方法を実施するステップであって、患者の液体試料のＤＮＡ断片を設計されたパネルで収集する、ステップと、
腫瘍性の及び／又は健常な変異の検出に基づいて、腫瘍の個別化された変異プロファイルを特性評価するステップとを有する。

【0017】

本発明はまた、本発明に係る患者の腫瘍の個別化された変異プロファイルに適合させる治療を同定し、追跡し、及び／又は適合させる方法に基づいて作成された、患者の腫瘍のセラノスティックレポートに関する。

【0018】

本発明によれば、患者のリキッドバイオプシーからのＤＮＡバリアントが、腫瘍性か健常かを検出することが実際に可能である。リキッドバイオプシーにより、患者の腫瘍の個別化された変異プロファイルを確信を持って確立するためには、より高い感度で変異を検出する必要があるだけでなく、変異が患者の腫瘍細胞に由来するのか、患者の正常で健常な細胞に由来するのかを検出できることも重要である。本発明によれば、患者の腫瘍の特性を取り入れた患者のセラノスティックレポートを作成することもできる。このようなレポートは、例えば臨床の場において、医師が患者の腫瘍に関する利用可能な情報にしたがって最善の医療判断を下すことができるようにするために非常に有用である。

【0019】

従属請求項は、他の有利な実施形態に言及している。

【0020】

好ましくは、変異が腫瘍性であるか健常であるかの検出は、第１グループ及び第２グループにおけるＤＮＡバリアント断片の存在と、変異の変異頻度とに基づく。変異を有するＤＮＡバリアント断片の長さ及びＤＮＡ変異頻度に基づいて、変異を健常である又は腫瘍性であるとしてクラスタリングすることは実に有用である。

【0021】

有利には、ＤＮＡバリアント断片が第２グループよりも第１グループにおいてより多く存在し、且つ変異が頻度閾値未満の変異頻度を有する場合、変異が腫瘍性であると検出され、頻度閾値は２％から５０％の間である。

【0022】

好ましくは、ＤＮＡバリアント断片は、第２中間長さ閾値よりも長く、上限長さ閾値よりも短い場合、ＤＮＡバリアント断片は、第２グループに関連付けられる。実際、このような最初及び上限の長さの閾値は、健常ＤＮＡバリアントと腫瘍性ＤＮＡバリアントとを識別するために必要な、第１グループと第２グループとの適切なクラスタリングを可能にする。

【0023】

好ましくは、ターゲットシーケンシングは、二本鎖ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションターゲットシーケンシングである。実際、本発明者らは、二本鎖ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションステップが、ターゲットシーケンシングのための目的のＤＮＡを捕捉するためにより効率的であり、目的のＤＮＡの均一な捕捉を可能にし、したがって目的のＤＮＡの均一な配列決定を可能にすることを見出した。

【0024】

有利には、ＤＮＡライブラリは一本鎖及び二本鎖のＤＮＡライブラリである。実際、一本鎖ＤＮＡライブラリと二本鎖ＤＮＡライブラリとの両方が存在すると、正常で健常なＤＮＡ断片と比較して、腫瘍性ＤＮＡ断片が濃縮され、腫瘍性ＤＮＡバリアント検出の感度が向上する。

【0025】

本発明によれば、腫瘍性ＤＮＡ断片という用語は、腫瘍細胞及び／又は患者の腫瘍に由来するＤＮＡ断片を意味する。

【0026】

好ましくは、ターゲットシーケンシングは、患者の腫瘍で同定された変異を定義する個別化パネルを用いて行われる。好ましくは、ターゲットシーケンシングは、患者の腫瘍のＤＮＡの少なくとも０．５Ｍｂ、好ましくは少なくとも０．８Ｍｂ、好ましくは少なくとも１Ｍｂの全長を有するＤＮＡ配列のターゲットシーケンシングであり、当該全長を有するＤＮＡ配列は、患者の腫瘍のＤＮＡの少なくとも０．５Ｍｂ、好ましくは少なくとも０．８Ｍｂ、好ましくは少なくとも１Ｍｂの累積全長を有する一連の連続的及び／又は不連続的ＤＮＡ配列であってもよい。配列決定されたＤＮＡ配列の全長は、読み取られた塩基対の累積数（読み取られた異なるＤＮＡ「ピース」についても累積される）を意味する。まず、患者の腫瘍に現れる変異が特定され、標的化／個別化パネルに定義されるため、本発明は個別化パネルで特に有利である。さらに、個別化パネルを用いて患者のリキッドバイオプシーから変異を検出する方法は、定義され、個別化された変異の存在を検出するだけでなく、腫瘍性変異と健常（又は非腫瘍性）変異とを区別することもできる。患者のリキッドバイオプシーから変異を検出する本発明の方法と、個別化パネルとの組み合わせは、癌サーベイランスのための非常に強力なツールである。その代わりに、又はそれに加えて、ターゲットシーケンシングは、患者の腫瘍タイプに頻繁に関連する既知のＤＮＡバリアント、及び／又は患者の腫瘍型の治療に対する応答又は耐性に関連する既知のＤＮＡバリアントを定義するターゲットパネルを用いて行うこともできる。

【0027】

有利には、本方法は、患者の腫瘍試料の配列決定を実施して、個別化又はターゲットパネルの変異を同定するステップを有する。好ましくは、第１グループからの変異及び／又は第２グループからの変異の同定は、第１グループ及び第２グループにおける変異の比較によって実施され、（ｉ）変異が第２グループにのみ存在する場合、変異は、健常な変異として検出され、及び／又は（ｉｉ）ＤＮＡ変異のＤＮＡ変異頻度が頻度閾値よりも優れている場合、変異は、健常な変異として検出され、及び／又は（ｉｉｉ）変異が第１グループよりも第２グループに多く存在する場合、変異は、健常な変異として検出される。実際、腫瘍性変異を検出する以外に、患者の腫瘍をよりよく定義するために、健常な変異を検出することも有利である。

【0028】

有利には、リキッドバイオプシーは、（ｉ）治療前の腫瘍を有する患者、（ｉｉ）治療中の腫瘍を有する患者、（ｉｉｉ）治療終了後の腫瘍を有する患者、（ｉｖ）腫瘍寛解段階にある患者、（ｖ）腫瘍再発段階にある患者のうちの少なくとも１つの段階にある患者に対して実施される。実際、患者の腫瘍の進化をよりよく追跡するため、及び／又は腫瘍治療の有効性をよりよく分析するために、リキッドバイオプシーから得られたＤＮＡ試料に対して本発明に係る方法を実施することが有用であり、ここで、リキッドバイオプシーは、患者の腫瘍進化の異なる段階、及び／又は患者の治療の異なる段階で実施される。特に、腫瘍の再発段階では、高い感度且つ低い偽陽性率で腫瘍の再発を検出できるため、この方法は特に有利である。

【0029】

好ましくは、ターゲットパネルにおいて定義された複数の変異のそれぞれの変異について、
配列決定のデータに基づいて、それぞれの変異を有するＤＮＡ断片のＤＮＡバリアント断片を同定するステップと、
それぞれの変異のＤＮＡバリアント断片が第１中間長さ閾値よりも短い場合に、それぞれの変異の同定されたＤＮＡバリアント断片を第１グループに関連付けるステップであって、第１中間長さ閾値は、１５０ｂｐから１６６ｂｐの間である、ステップと、
それぞれの変異のＤＮＡバリアント断片が第２中間長さ閾値よりも長い場合に、それぞれの変異の同定されたＤＮＡバリアント断片を第２グループに関連付けるステップであって、第２中間長さ閾値は、１５０ｂｐから１６６ｂｐの間であり、好ましくは、第１中間長さ閾値と第２中間長さ閾値とは等しい、ステップと、
第１グループと第２グループとにおけるそれぞれの変異のＤＮＡバリアント断片の存在に基づいて、それぞれの変異が腫瘍性であるか健常性であるかを検出するステップであって、ＤＮＡバリアント断片が第２グループよりも第１グループでより多く存在する場合に、それぞれの変異が腫瘍性であると検出するステップとを実施する。

【0030】

有利には、液体試料は、腫瘍寛解段階にある患者に由来する。実際、患者の腫瘍の再出現の可能性を非侵襲的に分析するために、腫瘍寛解段階にある患者で本発明による方法を実施することは有利である。

【0031】

好ましくは、治療を同定し、追跡し、及び／又は適合させることは、本発明に係る腫瘍の個別化された変異プロファイルの特性評価に適合される。実際、治療を同定し、追跡し、適合させることは、患者の腫瘍の個別化された変異プロファイルの特性評価に有益である。

【0032】

有利には、患者の腫瘍の個別化された変異プロファイルの特性評価に適合する治療が、当該患者に適用される。

【0033】

本発明の他の特徴、詳細及び利点は、非限定的に、添付図面を参照しながら以下に示す説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】特異的ＤＮＡプローブのターゲットパネルを設計する手順を説明するフローチャートである。

【図2】本発明に係る患者のリキッドバイオプシーから変異を検出する方法と、本発明に係る患者の腫瘍の個別化された変異プロファイルに適合する治療を同定し、追跡し、及び／又は適合させる方法とを示す。

【図3】ＤＮＡバリアント断片が、第１グループ又は第２グループの条件を満たす様子を示す。

【図4】第１変異を有するＤＮＡバリアント断片を第１グループと第２グループとにクラスタリングすることを示す模式図である。

【図5】第２ＤＮＡ変異を有するＤＮＡバリアント断片を第１グループと第２グループとにクラスタリングすることを示す模式図である。

【図6】変異が腫瘍性であるか健常であるかを同定するステップを説明するフローチャートである。

【図7】リキッドバイオプシーが腫瘍の進化及び／又は患者の臨床治療の異なる段階で実施できることを示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0035】

図面において、同じ参照番号は同じ又はアナログ要素に割り当てられている。

【0036】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の非限定的な説明から、また、図面及び実施例を参照することによって得られるであろう。

【0037】

図１は、患者の腫瘍試料のＤＮＡのコレクションから、特異的ＤＮＡプローブのターゲットパネルを設計するための様々なステップを示している。

【0038】

最初のステップＳ１は、患者の腫瘍試料からＤＮＡを採取することから構成されている。いくつかの実施態様では、患者の腫瘍試料は、ソリッドバイオプシーに由来する。いくつかの実施態様では、患者の腫瘍試料は、リキッドバイオプシーに由来する。患者の腫瘍試料からのＤＮＡは、腫瘍からのＤＮＡ断片及び／又は腫瘍からのゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡであり得る。

【0039】

ステップＳ２では、腫瘍試料からのＤＮＡの配列決定を行う。好ましくは、当該ＤＮＡの配列決定は、患者の腫瘍試料からのＤＮＡの少なくとも１０００００塩基対（ｂｐ）又は１００キロｂｐ（ｋｂ）、好ましくは少なくとも５００ｋｂ、好ましくは少なくとも７００ｋｂ、好ましくは少なくとも８００ｋｂ、好ましくは少なくとも９００ｋｂ、好ましくは少なくとも１０００ｋｂ又は１メガ塩基（Ｍｂ）のターゲットシーケンシングである。好ましくは、ＤＮＡの配列決定は、患者の腫瘍試料からのＤＮＡの１０Ｍｂ未満、好ましくは５Ｍｂ未満、好ましくは３Ｍｂ未満のターゲットシーケンシングである。有利には、配列決定は、ＮｅｘｔＳｅｑ５００／５５０シーケンサー、又はイルミナもしくはＭＧＩの任意のシーケンサーによって行われる。好ましくは、配列決定は、ペアエンドシーケンス「ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」であるが、シングルエンドシーケンス「ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」であってもよい。

【0040】

次に、ステップＳ３において、腫瘍試料から変異を同定する。変異の同定は、腫瘍試料の配列決定ＤＮＡと参照ゲノムの対応するＤＮＡ配列との比較に基づいて同定される。

【0041】

次のステップＳ４は、同定された変異を標的とする特異的ＤＮＡプローブのターゲットパネルを設計することから構成されている。

【0042】

図２は、本発明に係る患者のリキッドバイオプシーから変異を検出する方法、及び患者の腫瘍の変異プロファイルに適合する治療を同定する方法の実施形態を開示する。ステップＳ１１からステップＳ１３は、どちらかというと方法の実験（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ステップを記述しているが、ステップ２２からステップ２７は、どちらかというとインシリコステップを記述している。しかし、ステップＳ１１からＳ１３のいくつかのステップをインシリコで実施すること、及び／又はステップ２２から２７の１つ以上のステップを非インシリコで実施することも可能である。

【0043】

ステップＳ１１は、リキッドバイオプシーからＤＮＡ断片を採取することから構成される。

【0044】

次のステップＳ１２は、ＤＮＡ断片の長さを保持してＤＮＡ断片のＤＮＡライブラリを調製することから構成される。有利には、ＤＮＡライブラリは、一本鎖及び／又は二本鎖ＤＮＡ断片を有するＤＮＡ断片に基づいて調製される。好ましくは、ＤＮＡライブラリは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ断片を有するＤＮＡ断片に基づいて調製される。

【0045】

次に、Ｓ１３において、ターゲットパネルに基づいて、ＤＮＡライブラリが配列決定される。ターゲットパネルは、複数の変異を定義する。ターゲットパネルは、リキッドバイオプシー又は定義された変異を持つライブラリにおいてＤＮＡ断片をシーケンスすることができる。したがって、ターゲットパネルに基づき、ＤＮＡライブラリを配列決定した結果の配列決定データは、ターゲットパネルに定義された変異を有する全ＤＮＡ断片を読み出し又は配列決定する（一方、定義された変異を示さないＤＮＡ断片は読み出し又は配列決定しない）。ターゲットパネルが変異を含まないＤＮＡ断片も配列決定するように、ターゲットパネルは、野生型ＤＮＡを定義することもできる。このようにして得られた配列決定データは、定義された変異（野生型ＤＮＡに属する可能性もある）を有する液体試料のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を含有する。好ましくは、ターゲットパネルは、患者の癌を標的としたパネル、すなわち、患者の試料に基づいて設計された患者専用パネルである。このような患者専用のターゲットパネルは、図１で説明したように作成することができる。有利には、ターゲットシーケンシングは、（ｉ）患者の腫瘍タイプに頻繁に関連する既知の変異、及び／又は（ｉｉ）患者の腫瘍タイプの治療に対する応答又は耐性に関連する既知の変異、及び／又は（ｉｉｉ）患者の腫瘍において同定された個別化された変異を有するＤＮＡを濃縮するために実施される。しかし、ターゲットパネルは、患者専用でなくてもよい。ターゲットパネルは、例えば、特定の癌タイプを引き起こすことが知られている複数の変異を含むことができる、言い換えると、癌特異的パネルである。特定の癌タイプとは、例えば肺癌、乳癌、皮膚癌等である。ターゲットシーケンシングは、ハイブリダイゼーションターゲットシーケンシングである。

【0046】

配列決定するステップは、（デジタル）ＤＮＡ配列決定データ（短い配列決定データ）を提供する。好ましくは、配列決定データは、各（配列決定された）ＤＮＡ断片について、このＤＮＡ断片の配列情報を提供する。この配列情報は、好ましくは、（配列決定された）ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を有する。図４及び図５は、配列決定データ３０と配列決定されたＤＮＡ断片とを示している。図を簡単にするため、野生型ＤＮＡ断片１、第１特定変異（灰色の四角で示す）を有する第１ＤＮＡバリアント断片１．１、１．２、及び第２特定変異（白色の丸で示す）を有する第２ＤＮＡバリアント断片１．１'、１．２'のみを示す。実施例は、本発明を限定するものではなく、配列決定データは、２つ以上の異なる変異のＤＮＡバリアント断片を有し得る。

【0047】

ステップＳ２２では、ＤＮＡ配列決定データのＤＮＡ断片の中から、特定の変異を有するＤＮＡバリアント断片を特定する。つまり、ステップＳ２２では、ＤＮＡ配列決定データ中の全ＤＮＡ断片の中から、（特定の変異を有する）ＤＮＡバリアント断片を選択する。この選択は、好ましくはインシリコで実行される、言い換えると、デジタル配列決定データに基づいて実行される。したがって、後続のステップＳ２３及びＳ２４で言及されるＤＮＡバリアント断片は、常に同じ特定の変異のＤＮＡバリアント断片を指す。図４の例では、第１ＤＮＡバリアント断片１．１、１．２のＤＮＡ断片が特定／選択される。図５の例では、第２ＤＮＡバリアント断片１．１'、１．２'のＤＮＡ断片が特定／選択される。ステップＳ２２の結果、ＤＮＡバリアント断片のセット、すなわち、同じ特定の変異に属するＤＮＡ断片のセットが得られる。

【0048】

ステップＳ２３では、特定されたＤＮＡバリアント断片を、ＤＮＡバリアント断片の長さに基づいて、第１グループ及び第２グループに関連付ける。第１グループのＤＮＡバリアント断片は、第２グループのＤＮＡバリアント断片よりも短く、少なくとも第１グループのＤＮＡバリアント断片の大部分は、第２グループのＤＮＡバリアント断片よりも短い。好ましくは、第１グループの全ＤＮＡバリアント断片は、第２グループ全ＤＮＡバリアント断片よりも短い。第１／第２グループのＤＮＡバリアント断片は、第１／第２グループに関連するＤＮＡバリアント断片を意味するものとする。ステップＳ２３の結果、より短いＤＮＡバリアント断片の第１セット／グループ１０と、より長いＤＮＡバリアント断片の第２セット／グループ２０とが得られる。第１及び第２グループ１０、２０は、特定の変異のＤＮＡ断片のみを有する、すなわち、１つの（及び／又は同じ）変異のみを有する。好ましくは、第１中間長さ閾値よりも短いＤＮＡバリアント断片１．１は、第１グループ１０に関連付けられ、第２中間長さ閾値よりも長いＤＮＡバリアント断片１．２は、第２グループ２０に関連付けられる。最も好ましくは、第１中間長さ閾値と第２中間長さ閾値とは同じである、言い換えると、（共通の）中間長さ閾値は、図３の例で示すようになる。しかし、第１中間長さ閾値と第２中間長さ閾値とは、異なっていてもよい。この場合、第１中間長さ閾値と第２中間長さ閾値とは、好ましくは５塩基対（ｂｐ）未満、好ましくは３ｂｐ未満で区別される。中間長さ閾値、第１中間長さ閾値及び／又は第２中間長さ閾値は、好ましくは１６７ｂｐ未満であり、好ましくは１６６ｂｐ未満であり、好ましくは１６５ｂｐ未満であり、好ましくは１６４ｂｐ未満であり、好ましくは１６３ｂｐ未満であり、好ましくは１６２ｂｐ未満であり、好ましくは１６１ｂｐ未満であり、及び／又は好ましくは１５０ｂｐよりも大きく、好ましくは１５５ｂｐよりも大きく、好ましくは１５７ｂｐよりも大きく、好ましくは１５８ｂｐよりも大きく、好ましくは１５９ｂｐよりも大きい。好ましい実施形態では、中間長さ閾値は、１６０ｂｐの長さである。ＤＮＡ断片を第１グループ１０又は第２グループ２０に関連付ける追加の基準があってもよい。好ましくは、第２中間長さ閾値（又は中間長さ閾値）よりも長く、上限長さ閾値よりも短いＤＮＡバリアント断片１．２は、第２グループ２０に関連付けられる。上限長さ閾値は、（第２）中間長さ閾値よりも大きい。好ましくは、上限長さ閾値は、２５０ｂｐ未満であり、好ましくは２００ｂｐ未満であり、好ましくは１９０ｂｐ未満であり、好ましくは１８５ｂｐ未満である。好ましい実施形態では、上限長さ閾値は１８０ｂｐである。

【0049】

図３は、（特定された）ＤＮＡバリアント断片が、その長さに基づいて第１及び第２グループにどのように関連付けられるかを例示する図である。これは、特定されたＤＮＡバリアント断片ごとに図３の方法を行うことで実現される。したがって、図２のステップＳ２３は、各（特定された）ＤＮＡバリアント断片に対して、図３に示す方法を実行することによって実現することができる。ＤＮＡバリアント断片が中間長さ閾値よりも小さい場合、ＤＮＡバリアント断片は第１グループ１０の条件を満たす、及び／又は、ステップＳ３２で第１グループ１０に関連付けられる。ＤＮＡバリアント断片が中間長さ閾値よりも小さくないか、又は大きい場合、プロセスは、ステップＳ３３に進み、ＤＮＡバリアント断片が上限長さ閾値よりも小さいかどうかがさらにチェックされる。この場合（つまり、ＤＮＡバリアント断片が中間長さ閾値と上限長さ閾値との間の長さを持つ場合）、ステップＳ３４においてＤＮＡバリアント断片を第２グループ２０に関連付ける。なお、本手順と同様に、第１及び第２グループ１０、２０に同じＤＮＡバリアント断片が対応付けられていれば、ステップＳ３２～Ｓ３４のステップ及びチェックの順序を任意に並べ替えることができる。つまり、図４に示すように、短いＤＮＡバリアント断片１．１は、第１グループ１０に関連付けられ、長いＤＮＡバリアント断片１．２は、第２グループ２０に関連付けられる。

【0050】

ステップＳ２２とＳ２３の順序は、本発明にとって重要ではない。１つの変異に属するＤＮＡバリアント断片のいずれかが最初に特定され、次にその長さに基づいて２つのグループ１０、２０に関連付けられるか、又は全ＤＮＡ（バリアント）断片が最初にその長さに基づいて２つのグループ１０、２０に関連付けられ、次に１つの変異に属するＤＮＡバリアント断片が第１及び第２グループ１０，２０中で特定される。なお、特定されたＤＮＡバリアント断片が、第１グループ１０及び／又は第２グループ２０に関連付けられると記載する場合、特定ステップＳ２２が関連付けステップＳ２３の前に必ず実行されることを意味するものではない。

【0051】

ステップＳ２４では、（ＤＮＡバリアント断片の）特定の変異が腫瘍性か健常かを検出する。この検出は、好ましくは、第１及び第２グループ１０，２０中の特定の変異のＤＮＡバリアント断片の存在に基づく。好ましくは、特定の変異は、（特定の変異の）ＤＮＡバリアント断片が第２グループ２０よりも第１グループ１０に多く、好ましくは第２グループ２０よりも統計的に有意に多く存在する場合、腫瘍性であると検出される。この検出は、好ましくは変異の頻度に基づく。この検出は、好ましくは、第１及び第２グループ１０，２０中の特定の変異のＤＮＡバリアント断片の存在に基づき、変異頻度に基づく。好ましくは、特定の変異は、変異の変異頻度が頻度閾値未満であること、及び（特定の変異の）ＤＮＡバリアント断片が第２グループ２０よりも第１グループ１０に多く、好ましくは第２グループ２０よりも統計的に有意に多く存在するという２つの条件を累積的に満たす場合に、腫瘍性であると検出される。統計的有意性は、例えばカイ二乗検定で検定できる。

【0052】

変異頻度は、しばしば対立遺伝子頻度又は遺伝子頻度とも呼ばれる。変異頻度は、リキッドバイオプシー及び／又はリキッドバイオプシーから取得された配列決定データにおける特定の変異の頻度に基づいて決定される。変異の変異頻度は、変異の存在と野生型ＤＮＡの存在との比率に基づいて決定することができる。好ましくは、これは、配列決定データ中のＤＮＡバリアント断片数＃Ｖと配列決定データ中のＤＮＡ断片数＃Ｒとの比＃Ｖ／＃Ｒによって決定される。配列決定データ＃ＲのＤＮＡ断片数は、リード数、すなわち、配列決定プロセスで読み取られた全ＤＮＡ断片数に相当する。しかし、他の定義も可能である。例えば、変異頻度は、ＤＮＡ断片の特定のサイズ範囲内で先に定義された対応比率、又は変異頻度を表す他の定義によっても定義され得る。頻度閾値は、好ましくは５％よりも大きく、好ましくは１０％よりも大きく、好ましくは１５％よりも大きく、好ましくは１８％よりも大きい。頻度閾値は、好ましくは４０％未満であり、好ましくは３０％未満であり、好ましくは２５％未満であり、好ましくは２２％未満である。好ましい実施形態では、頻度閾値は２０％である。

【0053】

好ましくは、変異は、腫瘍性変異に対する上記で定義された条件が満たされない場合、及び／又は変異の変異頻度が頻度閾値よりも大きい場合、及び／又はＤＮＡバリアント断片が第１グループ１０よりも第２グループ２０に多い場合、健常又は非腫瘍性として検出される。しかし、この方法は、変異が腫瘍性かどうかだけを判定することも可能である。この場合、変異が腫瘍として検出されなかった際の検出は、変異が健常として検出された特許とみなされる。

【0054】

図６は、変異が腫瘍性又は健常性としてどのように検出されるかを説明する例示的なフローチャートである。図６は、図２のステップＳ２４を実現するための方法例である。ステップＳ４２では、変異の変異頻度が頻度閾値未満であるかどうかのチェックが行われる。Ｓ４４では、変異頻度が頻度閾値未満でなければ、変異は健常であると検出される。変異頻度が頻度閾値未満の場合、Ｓ４３において、ＤＮＡバリアント断片が第２グループ２０よりも第１グループ１０に多く存在するかどうかのチェックが実行される。変異を有するＤＮＡバリアント断片が第２グループ２０よりも第１グループ１０に多く存在する場合には、ステップＳ４５において変異が腫瘍性であると検出され、一方、変異を有するＤＮＡバリアント断片が第２グループ２０よりも第１グループ１０に多く存在していない場合、及び／又は、第１グループ１０よりも第２グループ２０に多く存在する場合には、ステップＳ４６において変異が健常であると検出される。

【0055】

本発明に係る方法は、１つの変異についてのみ適用することができる。この場合、方法はステップＳ２４の後に終了するか、ステップＳ２７に進む。好ましくは、本発明に係る方法は、複数の変異の各々について、ＤＮＡバリアントが健常であるか腫瘍性であるかが検出されるように、複数の変異について適用される。複数の変異のそれぞれは、ターゲットパネルに定義されている。この場合、複数の変異の各変異についてステップＳ２２～Ｓ２４を繰り返すことにより、Ｓ２４において、複数の変異の各変異について、その変異が腫瘍性であるか健常であるかを判定することができる。複数の変異の全ての変異が処理された場合、方法はステップＳ２６に進む。図４は、ＤＮＡ断片３０のうち第１変異の第１ＤＮＡバリアント断片Ｓ２２を特定し、第１ＤＮＡバリアント断片を第１グループ１０及び第２グループＳ２３に関連付けるステップを示す一方、図５は、ＤＮＡ断片３０のうち第２変異の第２ＤＮＡバリアント断片Ｓ２２を特定し、第２ＤＮＡバリアント断片を第１グループ１０及び第２グループＳ２３に関連付けるステップを示す。第１変異と第２変異とは異なる。

【0056】

ステップＳ２６は任意であり、変異又は複数の変異の検出のステップＳ２４の結果に基づいて、腫瘍を特性評価することからなる。腫瘍性及び／又は健常な変異の検出に基づいて腫瘍を特性評価することは、例えば、特定の腫瘍治療に対して感受性及び／又は耐性を有することが特に知られている腫瘍サブタイプを同定することを意味する。つまり、腫瘍の特性評価は、患者の腫瘍によく適合した特定の腫瘍治療の同定を可能にする。

【0057】

また、ステップＳ２７は任意であり、ステップＳ２６における腫瘍の特性評価に基づいて、又はステップＳ２４の検出の結果（複数可）に基づいて、患者の腫瘍の個別化された変異プロファイルに適合する治療を同定し、追跡し及び／又は適合させることからなる。好ましくは、患者の腫瘍のセラノスティックレポートは、腫瘍の医療情報及び／又は配列決定データと、腫瘍性及び／又は健常である同定済みの変異のリストとを有し得る。腫瘍のセラノスティックレポートはまた、（ｉ）腫瘍の特性評価に基づく治療に対する応答の可能性に関するデータ、（ｉｉ）臨床的利益に関連し得る、及び／又は臨床的利益に関連しない特性を有する治療のリスト、（ｉｉｉ）腫瘍の特性評価に関連付けられた臨床アッセイのリスト、及び／又は腫瘍の特性評価に関連する科学的刊行物のリストを含み得る。

【0058】

図７は、腫瘍の進化をモニターするために、患者に対してリキッドバイオプシーを実施できるさまざまな時点を示している。好ましくは、リキッドバイオプシーは、（ｉ）治療前の腫瘍を有する患者２．１、（ｉｉ）治療中の腫瘍を有する患者２．２、（ｉｉｉ）治療終了後の腫瘍を有する患者２．３、（ｉｖ）腫瘍寛解段階にある患者２．４、（ｖ）腫瘍再発段階にある患者２．４のうちの少なくとも１つの段階にある患者に対して実施される。好ましくは、リキッドバイオプシーは、腫瘍寛解段階にある患者から採取される。
本発明は、記載された実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲を逸脱することなくバリエーションを適用できることを理解されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】