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特表2024-527193カゼインタンパク質を産生するための組換え宿主細胞及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-22
(54)【発明の名称】カゼインタンパク質を産生するための組換え宿主細胞及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/19 20060101AFI20240712BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240712BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240712BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240712BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240712BHJP
C12N 15/90 20060101ALN20240712BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240712BHJP
【ＦＩ】
C12N1/19 ZNA
C12N1/15
C12N1/21
C12P21/02 C
C12N15/12
C12N15/90 102Z
C12N15/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2024504154
(86)(22)【出願日】2022-07-25
(85)【翻訳文提出日】2024-03-15
(86)【国際出願番号】 EP2022070775
(87)【国際公開番号】W WO2023002061
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】21187364.1
(32)【優先日】2021-07-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511265718
【氏名又は名称】レッドバイオテック・アーゲー
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＤＢＩＯＴＥＣ ＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ドローズ，スアン
(72)【発明者】
【氏名】ビュールマン，マルティン
(72)【発明者】
【氏名】タンバスコ・スチュダート，マリーナ
(72)【発明者】
【氏名】シャウブ，クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】ヨーン，コリンヌ
(72)【発明者】
【氏名】ロスフェルド，マリー－エステル
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA10
4B065AA01X
4B065AA58X
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA77X
4B065AA77Y
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA24
4B065CA41
(57)【要約】
本発明は、カゼインを産生するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞及びカゼインを産生する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞であって、該カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか又はエピソームに維持され、異種分泌シグナル及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続き、ここでの該組換え宿主細胞はさらにｉ）キナーゼ、好ましくは配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している該キナーゼを同時発現するように工学操作され、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している；及び／又は
ｉｉ）１つ以上のプロテアーゼ（例えばＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有するアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される）、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群より選択されるか又は配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、若しくは５２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含んでいる、自然に発生した又は遺伝子工学操作された該宿主細胞であり；さらに好ましくは、該プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼであり、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼは、ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）宿主細胞であり；
好ましくは、ａ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、κ－カゼイン（カゼイン－κ）であり；及び／又は
ｂ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列、又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、β－カゼイン（カゼイン－β）であり；
場合により、ここでの宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生（例えば同時発現）するように遺伝子工学操作されている、組換え宿主細胞。
【請求項2】
ポリヌクレオチドによってコードされるカゼインタンパク質が、配列番号１、２若しくは１７のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列を有しているカゼインβ、又は配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列を有しているカゼインκに対して、少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であり、好ましくはここでの宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、請求項１記載の組換え宿主細胞。
【請求項3】
カゼインのセリン又はトレオニンをコードしているヌクレオチドの１つ以上が、グルタミン酸又はアスパラギン酸をコードしているヌクレオチドで置換されている、請求項１又は２記載の組換え宿主細胞。
【請求項4】
カゼインをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、又は２０～２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１～３のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項5】
前記異種分泌シグナルが、カゼイン分泌シグナルではない、請求項１～４のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項6】
前記宿主細胞が、生物、例えば細菌、酵母、又は糸状菌であり、場合により該生物は、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）及び枯草菌（Bacillus subtilis）からなる群より選択される細菌、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・バデンシス（Aspergillus vadensis）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からなる群より選択される糸状菌、又は好ましくはクルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、ピキア（Pichia）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、テトラヒメナ（Tetrahymena）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、ブラストボトリ（Blastobotrys）属、カンジダ（Candida）属、ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、及びデバリオマイセス（Debaryomyces）属の群から選択される酵母細胞であり、好ましくは該宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyceslactis）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項１～５のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項7】
前記宿主細胞が酵母細胞であり、前記異種分泌シグナルが、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、配列番号２５若しくは２６を有しているａＭＦ、又は配列番号２７を有しているキラータンパク質、又は配列番号３１、３２、３３、３４、３５若しくは３６の配列を有している分泌シグナルからなる群より選択される、請求項６記載の組換え宿主細胞。
【請求項8】
前記宿主細胞が、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり、好ましくは該プロモーターが、配列番号２８又は配列番号３７又は配列番号５３、５４、５５若しくは５６である、請求項６又は７記載の組換え宿主細胞。
【請求項9】
前記キナーゼが、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、請求項１～８のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項10】
自然に発生又は遺伝子工学操作された前記宿主細胞は、配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１及び５２からなる群より選択される１つ以上のプロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つ（例えば２つ又は３つ）のプロテアーゼ欠損を含み、該プロテアーゼは、ＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有しているアスパラギン酸エンドペプチダーゼであり、ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項11】
ａ．前記宿主細胞が、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり；ｂ．前記異種分泌シグナルが、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルであり；そして
ｃ．該宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、請求項１～１０のいずれか一項記載の組換え宿主生物。
【請求項12】
少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を製造するための請求項１～１１のいずれか一項記載の組換え宿主細胞の使用であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質は、κ－カゼイン及び／又はβ－カゼインである、使用。
【請求項13】
ａ．請求項１～１２のいずれか一項記載の組換え宿主細胞において、分泌シグナルに連結された、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程、ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含み、場合により、ここでは：
ｃ．工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二のカゼインタンパク質と同時発現している、及び／又は、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているキナーゼと同時発現し、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、
少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質は、κ－カゼイン及び／又はβ－カゼインである、方法。
【請求項14】
請求項１３記載の方法によって産生されるか、又は配列番号２、６、１０若しくは１４のアミノ酸配列を有しているカゼインタンパク質。
【請求項15】
請求項１４記載の１つ以上（例えばいくつかの）カゼインタンパク質を含んでいるミセル。
【請求項16】
請求項１４記載のカゼインタンパク質又は請求項１５記載のミセルを含んでいる組成物。
【請求項17】
ａ．配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、又は１４に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼをコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程、ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又はＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有しており、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し；ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルに；及び配列番号２８、３７、５３、５４、５５若しくは５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている、ｂ．場合により、少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼを該宿主細胞において同時発現させる工程、ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又はＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有しており、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、そして
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程を含む、
組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月２３日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第２１１８７３６４号の優先権を主張し、その全内容は、全ての目的のために本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２１年７月２３日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第２１１８７３６４号の優先権を主張し、その全内容は、全ての目的のために本明細書に組み入れられる。
【0002】
配列表
本出願は、コンピューターで解読可能な形式の配列表を含み、これは参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、コンピューターで解読可能な形式の配列表を含み、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【0003】
発明の分野
本発明は、少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞又は生物、及び、組換え宿主細胞又は生物を使用してカゼインを産生する方法に関する。
本発明は、少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞又は生物、及び、組換え宿主細胞又は生物を使用してカゼインを産生する方法に関する。
【0004】
背景
カゼインは、関連性のあるリン酸化タンパク質（αＳ１、αＳ２、β、κ）の一ファミリーである。これらのタンパク質は、一般的に哺乳動物の乳汁中に見られ、牛乳中にはタンパク質の約８０％に、ヒトの母乳中にはタンパク質の２０％～６０％に含まれている。ヒツジ及びバッファローの乳汁は、他の種類の乳汁よりもより高いカゼイン含量を有し、ヒトの母乳は、特に低いカゼイン含量を有している。牛乳は、４つの特殊なカゼイン、αＳ１－カゼイン、αＳ２－カゼイン、β－カゼイン、及びκ－カゼインを有することが知られている。
カゼインは、関連性のあるリン酸化タンパク質（αＳ１、αＳ２、β、κ）の一ファミリーである。これらのタンパク質は、一般的に哺乳動物の乳汁中に見られ、牛乳中にはタンパク質の約８０％に、ヒトの母乳中にはタンパク質の２０％～６０％に含まれている。ヒツジ及びバッファローの乳汁は、他の種類の乳汁よりもより高いカゼイン含量を有し、ヒトの母乳は、特に低いカゼイン含量を有している。牛乳は、４つの特殊なカゼイン、αＳ１－カゼイン、αＳ２－カゼイン、β－カゼイン、及びκ－カゼインを有することが知られている。
【0005】
カゼインは、チーズの主成分から、食品添加物としての用途まで、幅広い用途を有する。最も一般的な形態のカゼインは、カゼイン酸ナトリウムである。乳汁中でカゼインは相分離を受けて、コロイド状のカゼインミセルを形成する。食品源として、カゼインは、アミノ酸、炭水化物、及び２つの必須元素であるカルシウムとリンを供給する。
【0006】
カゼインは、多数のプロリンアミノ酸を含有し、これはタンパク質の一般的な二次構造モチーフの形成を妨害する。結果として、それは比較的僅かな三次構造を有する。それは比較的疎水性である。それは乳汁中にカゼインミセルとして見られ、これは親水性部分が表面にあり、それらは球状であるという意味で、界面活性剤型のミセルとほんの僅かな類似しか示さない。しかしながら、界面活性剤ミセルとは際立って対照的に、カゼインミセルの内部は高度に水和している。ミセル中のカゼインは、カルシウムイオン及び疎水性相互作用によってまとまっている。
【0007】
カゼインなどの乳汁タンパク質の組換え産生法は、例えば国際公開公報第２０１６／０２９１９３号から公知であるが、しかしながら、これらの方法は一般的には、限界がある。現在までに、乳汁タンパク質ミセルの低い収量範囲及び発現（これはどちらも、ウシを使わない乳汁及びその製品の分野における重要なパラメーターである）などの発現の限界を克服することのできる理想的なシステムは全くない。
【0008】
したがって、カゼインを産生するための改善された宿主生物及び方法を提供することが依然として必要である。
【0009】
要約
本発明は、この必要性に取り組み、少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞又は生物を提供し、ここで、カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか、又はエピソームに維持され、異種分泌シグナルに及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続く。特に、宿主細胞又は生物は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生するように遺伝子工学操作され得る。
本発明は、この必要性に取り組み、少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞又は生物を提供し、ここで、カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか、又はエピソームに維持され、異種分泌シグナルに及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続く。特に、宿主細胞又は生物は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生するように遺伝子工学操作され得る。
【0010】
１つの態様では、本発明は、少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞に関し、好ましくは前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列又は配列番号１３、１４若しく１９に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκであり、ここでのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか又はエピソームに維持され、異種分泌シグナルに及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続き、ここでの該組換え宿主細胞はさらに、（ｉ）キナーゼ、好ましくは配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％）の配列同一率を有している該キナーゼを同時発現するように遺伝子工学操作され；及び／又は、（ｉｉ）１つ以上のプロテアーゼ、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１及び５２からなる群より選択される１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含んでいる該宿主細胞であり；さらに好ましくは、該プロテアーゼはアスパラギン酸プロテアーゼであり、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼは、ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばここでのＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス宿主細胞である。別の態様では、本発明は、少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞に関し、ここでのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか又はエピソームに維持され、異種分泌シグナル及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続き、ここでの該組換え宿主細胞はさらに、（ｉ）キナーゼ、好ましくは配列番号２３、４０、４１又は４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している該キナーゼを同時発現するように工学操作され、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し；及び／又は（ｉｉ）１つ以上のプロテアーゼ（例えばＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有するアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される）、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群より選択されるか又は配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含んでいる自然に発生した又は遺伝子工学操作された該宿主細胞であり；さらに好ましくは、該プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼであり、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼは、ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）宿主細胞であり；好ましくは：ａ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、κ－カゼイン（カゼイン－κ）であり；及び／又は（ｂ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列、又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、β－カゼイン（カゼイン－β）であり；場合により、ここでの宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生（例えば同時発現）するように遺伝子工学操作されている。
【0011】
ポリヌクレオチドによってコードされるカゼインタンパク質は、配列番号１若しくは１７のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、配列番号９若しくは１８のアミノ酸配列を有しているカゼインβ、又は配列番号１３若しくは１９のアミノ酸配列を有しているカゼインκに対して、少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一である、任意の哺乳動物カゼインタンパク質、好ましくはウシ又はヒトカゼインタンパク質であり得る。該ポリヌクレオチドは、図１に示されるような、配列番号４、７、１１、１５、２０、２１又は２２のそれぞれのヌクレオチド配列を有し得る。ウシカゼインに対する他の哺乳動物のカゼインの配列同一率は、以下に見ることができる：
【0012】
【表1】
【0013】
１つの態様では、組換え宿主細胞又は生物は、配列番号１若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号４に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は配列番号９若しくは２１に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている。
【0014】
場合により、哺乳動物カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは改変されていてもよく、ここではカゼインのセリン又はトレオニンをコードしている１つ以上のヌクレオチドは、グルタミン酸又はアスパラギンをコードしているヌクレオチドで置換されている。このようなカゼインタンパク質は、リン酸化模倣体カゼインタンパク質と呼ばれ、図２のアラインメントで下線の引かれた位置は、このような修飾に適格であろう。これらのタンパク質では、配列番号２３で示されているようなｈＦＡＭ２０ｃキナーゼとの同時発現は、必要ではない。したがって、カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号４、８、１２若しくは１６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるポリヌクレオチドによってコードされた、配列番号２、６、１０若しくは１４からなる群より選択される配列を有しているポリヌクレオチドに対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であり得る。
【0015】
本発明の脈絡では、組換え宿主細胞又は生物は、細菌、酵母細胞、又は糸状菌であり得る。好ましい細菌は、大腸菌（Escherichia coli）及び枯草菌（Bacillus subtilis）であり、好ましい真菌は、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・バデンシス（Aspergillus vadensis）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）であり、好ましい酵母細胞は、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、ピキア（Pichia）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、テトラヒメナ（Tetrahymena）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、ブラストボトリ（Blastobotrys）属、カンジダ（Candida）属、ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、及びデバリオマイセス（Debaryomyces）属の群から選択され、最も好ましくは該宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス（K.lactis）又はピキア・パストリス（P.pastoris）である。
【0016】
いくつかの実施態様では、組換え宿主細胞又は生物に導入された異種分泌シグナルは、カゼイン分泌シグナルではない。好ましくは、該異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、配列番号２５若しくは２６を有しているａＭＦ、又は配列番号２７を有しているキラータンパク質、又は配列番号２４、２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルからなる群より選択される。
【0017】
宿主細胞がクルイベロマイセス・ラクティスである場合、好ましいプロモーターは、配列番号２８、５３～５６、ＰＤＣ１、ＫｌＡＤＨ３、トリコデルマ・リーセイのＣＢＨ１又はＬＡＣ４からなる群より選択される構成性又は誘導性プロモーターである。宿主細胞がピキア・パストリスである場合、該プロモーターは、ＡＯＸ１、ＧＡＰ１、Ｇ１、ＤＡＳ、ＦＬＤ１、ＬＲＡ３、ＴＨＩ１１、ＴＥＦ１又はＧＣＷ１４からなる群より選択される構成性又は誘導性プロモーターであり得る。
【0018】
１つの特定の態様では、組換え宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり、異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルであり；該宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている。
【0019】
カゼインがリン酸化模倣体ではない場合、例えばカゼインが、配列番号１、４、８、１２若しくは１７～１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する場合、少なくとも１つのカゼインタンパク質は、ウシ若しくはヒトカゼインキナーゼＩ（例えば配列番号４２を有しているウシカゼインキナーゼ）若しくはＩＩ（例えば配列番号４０）、又は配列番号２３に対して少なくとも７０％の配列同一率を有しているＦＡＭ２０ｃキナーゼなどのキナーゼと同時発現されていてもよい。
【0020】
本発明はまた、少なくとも１つの関心対象のタンパク質を製造するための上記の組換え宿主生物の使用、並びに関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法にも関する。
【0021】
具体的には、本発明は、
ａ．請求項１～１５のいずれか一項記載の組換え宿主生物において、分泌シグナルに連結された配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程；及び
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で宿主生物を培養する工程を含む、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する新規な方法に関する。
ａ．請求項１～１５のいずれか一項記載の組換え宿主生物において、分泌シグナルに連結された配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程；及び
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で宿主生物を培養する工程を含む、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する新規な方法に関する。
【0022】
別の態様では、本発明は、
ａ．本明細書で何処かに記載されているような組換え宿主生物において、分泌シグナルに連結された、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程；及び
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で宿主生物を培養する工程を含む、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する新規な方法に関する。
ａ．本明細書で何処かに記載されているような組換え宿主生物において、分泌シグナルに連結された、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程；及び
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で宿主生物を培養する工程を含む、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する新規な方法に関する。
【0023】
１つの態様では、工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二の異なるカゼインタンパク質と同時発現され、及び／又は、配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているＦＡＭ２０ｃキナーゼと同時発現される。
【0024】
本発明はまた、上記の方法によって産生されたカゼインタンパク質、特に配列番号２、６、１０、又は１４のアミノ酸配列を有しているカゼインタンパク質にも関する。また、このようなカゼインを含んでいるミセル、及びこのようなカゼイン又はミセルを含んでいる食品などの組成物も包含される。
【0025】
さらに、本発明は、
（ｉ）配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼをコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦに、及び配列番号２８又は５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
（ｉｉ）場合により、少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼを該宿主細胞において同時発現させる工程、及び
（ｉｉｉ）カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法を提供する。
（ｉ）配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼをコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦに、及び配列番号２８又は５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
（ｉｉ）場合により、少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼを該宿主細胞において同時発現させる工程、及び
（ｉｉｉ）カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法を提供する。
【0026】
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、又は１４に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一率を有している少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼ、好ましくは配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している該キナーゼをコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ、及び配列番号２７を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
（ｉｉ）場合により、少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及び（ｉ）で定義されているような該キナーゼを宿主細胞において同時発現させる工程、及び
（ｉｉｉ）カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法を提供する。
（ｉ）配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、又は１４に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一率を有している少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼ、好ましくは配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している該キナーゼをコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ、及び配列番号２７を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
（ｉｉ）場合により、少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及び（ｉ）で定義されているような該キナーゼを宿主細胞において同時発現させる工程、及び
（ｉｉｉ）カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法を提供する。
【0027】
別の態様では、本発明は、
ｉ）配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、又は１４に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼ（ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している）をコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程（好ましくは、該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し；ここでの該ポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ、又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルに；及び配列番号２８、３７、５３、５４、５５若しくは５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｉｉ）場合により、少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼ（ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している）を該宿主細胞において同時発現させる工程（好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している）、そして
ｉｉｉ）カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法を提供する。
ｉ）配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、又は１４に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼ（ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している）をコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程（好ましくは、該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し；ここでの該ポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ、又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルに；及び配列番号２８、３７、５３、５４、５５若しくは５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｉｉ）場合により、少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼ（ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している）を該宿主細胞において同時発現させる工程（好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している）、そして
ｉｉｉ）カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法を提供する。
【0028】
１つの具体的な態様では、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法は、
ａ．少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦに及びプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号１０に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｂ．宿主細胞において少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質を同時発現させる工程、及び
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で宿主細胞を培養する工程
含む。
ａ．少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦに及びプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号１０に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｂ．宿主細胞において少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質を同時発現させる工程、及び
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で宿主細胞を培養する工程
含む。
【0029】
詳細な説明
上記のように、本発明は、いくつかの異なるアプローチを個々に又は組み合わせて使用した、カゼインの発現のための、新規な組換え細胞及び生物並びに方法を提供する。具体的には、１つのアプローチは、特殊な異種分泌シグナル又はプロモーターを適用して、収量及び／又は分泌を増強させる。第二の選択肢は、配列番号２、５、１０及び１４などの、それらのアミノ酸組成において変化を有する、リン酸化模倣体カゼインの提供である。第三のアプローチは、１つ又はいくつかの異なるカゼインとカゼインκなどの、異なるカゼインの同時発現である。これらのアプローチは、いくつかの利点を有する。第一に、野生型カゼイン分泌シグナルではない異種分泌シグナルの使用は、分泌を改善させる。
上記のように、本発明は、いくつかの異なるアプローチを個々に又は組み合わせて使用した、カゼインの発現のための、新規な組換え細胞及び生物並びに方法を提供する。具体的には、１つのアプローチは、特殊な異種分泌シグナル又はプロモーターを適用して、収量及び／又は分泌を増強させる。第二の選択肢は、配列番号２、５、１０及び１４などの、それらのアミノ酸組成において変化を有する、リン酸化模倣体カゼインの提供である。第三のアプローチは、１つ又はいくつかの異なるカゼインとカゼインκなどの、異なるカゼインの同時発現である。これらのアプローチは、いくつかの利点を有する。第一に、野生型カゼイン分泌シグナルではない異種分泌シグナルの使用は、分泌を改善させる。
【0030】
第二に、カゼインのいくつかのアミノ酸組成の変化は、リン酸化工程を回避し、それ故、配列番号２３を有しているＦＡＭ２０ｃなどのキナーゼを同時発現する必要性は回避される。本発明のキナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し得、及び／又は、ＥＣ．２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有し得る。本発明のキナーゼの非限定的な例としては、配列番号２３、４０、４１、又は４２が挙げられる。
【0031】
さらに、カゼイン収量は、プロテアーゼの欠損した株／宿主において改善する。したがって、１つ以上のプロテアーゼ（例えば、ＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有しているアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは１～５２からなる群より選択される）、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１及び５２からなる群より選択されるか、又は配列番号配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１若しくは５２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つ（例えば２つ又は３つ）のプロテアーゼ欠損を含んでいる、自然に発生又は遺伝子工学操作された宿主細胞（さらに、好ましくは該プロテアーゼはアスパラギン酸プロテアーゼであり、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼは、ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス宿主細胞である）は、未修飾の親株／宿主と比較してカゼインのより良好な収量を生じることができる。
【0032】
最後に、カゼインを発現させるための組換えアプローチの使用は、それらの収量を高め、それらの正しい折り畳みを促進する。該タンパク質の同時発現は以下のシナリオを促進し、ここでは１つのタンパク質は、他に対するシャペロンとして機能し、それ故、正しい折り畳み及びカゼインのミセルをもたらすことが可能である。
【0033】
出願の脈絡における「宿主生物」という用語は、細菌、酵母、及び糸状菌からなる群より選択される生物である。好ましい細菌は、大腸菌及び枯草菌であり、好ましい真菌は、トリコデルマ・リーセイ、アスペルギルス・バデンシス、アスペルギルス・オリゼー、及びアスペルギルス・ニガーであり、好ましい酵母細胞は、クルイベロマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、テトラヒメナ属、ヤロウィア属、ハンゼヌラ属、ブラストボトリ属、カンジダ属、ザイゴサッカロマイセス属、及びデバリオマイセス属の群から選択され、最も好ましくは該宿主生物は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスである。
【0034】
「宿主細胞」という用語は、上記の宿主生物並びに細胞培養液に由来する細胞、例えばウシ哺乳動物上皮細胞を含み得る(Sakamoto et al., 2005, Monzani et al., 2011)。
【0035】
本明細書において使用する「遺伝子工学操作された」という用語は、発現ベクター内でエピソームに維持されているか又は宿主生物のゲノム内に組み込まれているかのいずれかである、外来性で非天然の核酸配列を含み、並びに／あるいはさらに、１つ以上の内因性配列（例えば核酸）内の１つ以上の位置に人工的に（例えば組換えで）導入された改変又は修飾、例えば置換、挿入及び／又は欠失、並びに／あるいは、関心対象のタンパク質（例えば本明細書に記載のようなプロテアーゼ）の発現レベル、産生及び／又は機能に影響を及ぼす、他の改変（群）又は修飾（群）を、例えば遺伝子サイレンシング法によって、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ＣＲＩＳＰＲ及び／又はｓｉＲＮＡなどによって含み得る、生物に関し得る。置換は、ある位置を占めているアミノ酸又は核酸を、異なるアミノ酸又は核酸を用いて置換することを意味し；欠失は、ある位置（群）を占めているアミノ酸（群）又は核酸（群）を除去することを意味し；そして、挿入は、ある位置を占めているアミノ酸又は核酸の隣に及び直後に、アミノ酸（群）又は核酸（群）を付加することを意味する。
【0036】
本明細書において同義語として使用される「天然に」又は「天然に存在する」という用語は、野生型宿主細胞を指し得る。
【0037】
本明細書において使用する「完全に欠損している」という用語は、１つ以上のプロテアーゼの産生及び／又は機能を１００％欠失（例えばノックアウト又は欠失）している、例えば、ＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有する１つ以上のアスパラギン酸エンドペプチダーゼの産生及び／又は機能を１００％欠失している宿主細胞を指し得、ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される。
【0038】
本明細書において使用する「部分的に欠損している」という用語は、未修飾／工学操作されていない親株／宿主と比較して、１つ以上のプロテアーゼの産生及び／又は機能の１００％未満（例えばノックダウン、例えば９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又はそれ未満など）、例えば、未修飾／工学操作されていない親株／宿主と比較して、例えば、ＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性（ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される）を有している１つ以上のアスパラギン酸エンドペプチダーゼの１００％未満の産生及び／又は機能を有する、宿主細胞を指し得る。例えば、例えばＲＮＡ干渉、ＣＲＩＳＰＲ、又はｓｉＲＮＡ技術を使用した、突然変異誘発及び／又は遺伝子サイレンシングを使用して、関心対象の遺伝子／タンパク質（例えば、本明細書に記載のようなプロテアーゼ）の発現を約５０％～８０％低減させることができる。
【0039】
本発明の脈絡において、「カゼインタンパク質」は、天然の哺乳動物カゼインタンパク質に対して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は完全に同一なタンパク質を指す。好ましいカゼインタンパク質は、ウシ又はヒトのカゼインタンパク質である。本発明の脈絡において、好ましい天然カゼインタンパク質は、配列番号１（ウシαＳ１）、配列番号５（ウシαＳ２）、配列番号９（ウシβ）、配列番号１３（ウシκ）、配列番号１７（ヒトαＳ１）、配列番号１８（ヒトβ）、又は配列番号１９（ヒトκ）、又は図１及び２で示されるカゼインタンパク質のいずれかに対して少なくとも７０％の同一率を有しているものである。
【0040】
「配列同一率」又は「同一率％」は、標準化アルゴリズムを使用してアラインさせた少なくとも２つのポリペプチド配列間の残基の一致率を指す。このようなアルゴリズムは、標準化された再現可能な方法で、比較される配列にギャップを挿入し、これにより、２つの配列間のアラインメントを最適化し、それ故、より意味のある２つの配列の比較を成し遂げる。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一率は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．３．０（２０１６年１月１３日）を使用して決定される（Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402）。２つのアミノ酸配列の配列同一率は、以下のパラメーターで設定されたｂｌａｓｔｐを用いて決定され得る：マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、ワードサイズ３；期待値：１０；ギャップコスト：エグジステンス＝１１、エクステンション＝１；組成調整：条件付組成スコアマトリックス調整。図２から分かるように、様々な種に由来するカゼインタンパク質は高度に保存され、よって、ウシ（配列番号１、４、８、１２）又はヒト（配列番号２０～２２）のカゼインに基づいた７０％の同一率は、他の哺乳動物カゼインタンパク質も含む。
【0041】
「ポリヌクレオチド」は、鎖内で共有結合しているヌクレオチドモノマーのポリマーを含んでいる分子を指す。本発明の脈絡では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）鎖である。該用語は、本明細書において、特定の長さの分子を指すものではなく、それ故、本明細書では「ＤＮＡ」という用語の同義語として使用される。本発明の脈絡において、カゼインをコードしているポリヌクレオチドは、宿主の生物のために最適化されていてもよい。例えば、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５及び１６として示されるヌクレオチド配列は、酵母宿主細胞、特にピキア・パストリスにおける発現のために最適化されたコドンである。
【0042】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸のポリマーを含んでいる分子を指す。該用語は、本明細書において特定の長さの分子を指すことを意味せず、それ故、「タンパク質」という用語の同義語として使用される。本明細書において使用する場合、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語はまた、発現カセット若しくはベクターによって発現されるか、又は本発明の宿主細胞から単離され得る、「関心対象のポリペプチド」又は「関心対象のタンパク質」も含む。ポリペプチドはアミノ酸配列を含み、したがって、時に、アミノ酸配列を含んでいるポリペプチドは、本明細書において、「ポリペプチド配列を含んでいるポリペプチド」と称される。したがって、本明細書において「ポリペプチド配列」という用語は、「アミノ酸配列」という用語の同義語として使用される。「アミノ酸」すなわち「ａａ」という用語は、天然に存在するアミノ酸を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるものである。
【0043】
「宿主ゲノムに組み込まれている」及び「エピソームに維持されている」という用語は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に含める公知の方法を指す。本発明の脈絡において、カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、異種分泌シグナルに連結されている。
【0044】
本発明の「異種分泌シグナル」（「シグナル配列」、「リーダー配列」又は「シグナルペプチド」の同義語として使用される）は、宿主生物ゲノムに含まれる天然分泌シグナルではない。好ましい実施態様では、該分泌シグナルは、天然カゼイン分泌シグナルではないが、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ＡＭＦ分泌シグナル（J. J. Barrero, J. C. Casler, F. Valero, P. Ferrer, and B. S. Glick, “An improved secretion signal enhances the secretion of model proteins from Pichia pastoris,” Microb Cell Fact, vol. 17, no. 1, p. 161, Oct. 2018, doi: 10.1186/s12934-018-1009-5.に由来）、配列番号２５若しくは２６を有しているＡＭＦ分泌シグナル、及び以下に示される配列番号２７を有しているキラー分泌シグナルから選択される。
【0045】
「アスパラギン酸プロテアーゼ（群）」すなわち（ＡＰ（群））又は「ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼ（群）」という用語は同義語として使用され得るが、これは酸性プロテアーゼ（群）（[intenz:3.4.23.-], https://enzyme.expasy.org/EC/3.4.23.-）を指し得、これは脊椎動物、真菌、植物、レトロウイルス、及びいくつかの植物ウイルスに存在することが知られている幅広く分布しているタンパク質分解酵素ファミリーである。ＡＰは、ペプチド結合を加水分解するためにアスパラギン酸ダイアドを使用する。
【0046】
真核細胞に見られるＡＰは、２つの非対称ローブ（「２葉（ｂｉｌｏｂｅｄ）」）から構成されるα／βモノマーである。各ローブは、特徴的なモチーフＡｓｐ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ－Ｇｌｙ内に位置する触媒性アスパラギン酸残基を活性部位に提供する。Ｎ末端及びＣ末端ドメインは、２回回転軸に構造的に関連しているが、活性部位の近傍を除いて、ほんの僅かな配列相同性しか有さない。このことは、古代の複製事象によって進化した酵素を示唆する。該酵素は、Ｐ１位及びＰ１’位の両方において疎水性残基を有する少なくとも６残基長を有する、ペプチド内の結合を特異的に切断する。活性部位は、２つのローブによって形成された溝に位置し、伸びたループが間隙の上に突き出して、１１残基のフラップを形成し、これが活性部位内の基質及び阻害剤を囲む。特異性は、触媒のアスパラギン酸を囲む最近傍の疎水性残基によって、及びフラップ内の３つの残基によって決定される。酵素は大半が、不活性なプロ酵素として細胞から分泌され、これは酸性ｐＨで自己触媒的に活性化される。真核細胞のＡＰは、クランＡＡのペプチダーゼファミリーＡ１を形成する。
【0047】
分泌シグナル（シグナル配列）：
配列番号２４ｐＯｓｔ１－ＡＭＦ
配列番号２４ｐＯｓｔ１－ＡＭＦ
【化1】
【0048】
配列番号２５＿ａＭＦ、クルイベロマイセス・ラクティスの分泌シグナル（ＤＮＡ）
【化2】
【0049】
配列番号２６＿ａＭＦプレ配列、ピキア・パストリスの分泌シグナル（ＤＮＡ）
【化3】
【0050】
配列番号２７＿キラータンパク質、サッカロマイセス・セレビシエの分泌シグナル（ＤＮＡ）
【化4】
【0051】
配列番号３１＿α－アミラーゼのシグナル配列
【化5】
【0052】
配列番号３２＿グルコアミラーゼのシグナル配列
【化6】
【0053】
配列番号３３＿血清アルブミンのシグナル配列
【化7】
【0054】
配列番号３４ イヌリナーゼのプレ配列
【化8】
【0055】
配列番号３５ インベルターゼのシグナル配列
【化9】
【0056】
配列番号３６ リゾチームのシグナル配列
【化10】
【0057】
本発明の脈絡において、前記プロモーターは、宿主生物においてポリヌクレオチドの翻訳を可能とする、任意のプロモーターであり得る。宿主細胞がクルイベロマイセス・ラクティスである場合、好ましいプロモーターは、配列番号２７、ＰＤＣ１、ＫＩＡＤＨ３、トリコデルマ・リーセイのＣＢＨ１又はＬａｃ４からなる群より選択される、構成性又は誘導性プロモーターである。該宿主細胞がピキア・パストリスである場合、該プロモーターは、Ａｏｘ１、ＧＡＢ、Ｇ１、ＤＡＳ、ＦＬＤ１、ＬＲＡ３、ＴＨＩ１１、ＴＥＦ１又はＧＣＷ１４からなる群より選択される構成性又は誘導性プロモーターであり得る。
【0058】
ピキア・パストリスについて、適切なプロモーターは、ＡＤＨ３、ｐＧＡＰ、Ｇ１、又は最も好ましくは以下に示される配列を有しているｐＡＯＸ１である。
【0059】
配列番号３７ ｐＡＯＸ１
【化11】
【0060】
クルイベロマイセス・ラクティスについて、適切なプロモーターは、ｐ３５０、ｐＬＡＣ４、又はＰＤＣ１、最も好ましくは以下の配列を有しているｐ３５０である。
【0061】
配列番号２８＿ｐ３５０
【化12】
【0062】
転写終結因子は、宿主生物において転写を終結させることが知られている任意の転写終結因子であり得る。ピキア・パストリスについて、適切な転写終結因子は、ＣＹＣ１ｔｔ又はＡＯＸ１ｔｔである。クルイベロマイセス・ラクティスについて、適切な転写終結因子はｐＬＡＣ４ｔｔである。
【0063】
本発明の脈絡において、前記宿主生物は、２、３又は４つの異なるカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作されていてもよい。これらのカゼインタンパク質は、同じ生物に由来する天然カゼインタンパク質であっても、又は異なる生物に由来するものであってもよい。さらに、該カゼインタンパク質は、リン酸化模倣体であってもよく、ここでいくつかのセリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）残基は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換されている。例えば、該カゼインタンパク質は、配列番号４、８、１２又は１６をそれぞれ有しているヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号２、６、１０又は１４として示されるアミノ酸配列を有し得る。
【0064】
配列番号１３、１４又は１９などのκカゼインをコードしているポリヌクレオチドを、α又はβカゼインをコードしているポリヌクレオチドと組み合わせることが特に好ましい。好ましい構築物は、以下の表１及び２に見られ得る。
【0065】
さらに、前記カゼインタンパク質がリン酸化模倣体ではない場合、該カゼインタンパク質は、配列番号２３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、カゼインタンパク質をリン酸化することのできる、ｈＦＡＭ２０ｃなどのキナーゼと同時発現されてもよい。
【0066】
本発明の脈絡における「同時発現」という用語は、少なくとも２つのポリヌクレオチドが、少なくとも１つ、２つ又はそれ以上の発現カセットを使用して発現されることを意味する。場合によっては、少なくとも２つのポリヌクレオチドが、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを有する１つの発現カセット上に存在する。
【0067】
本明細書において使用する「宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生するように遺伝子工学操作されている」という用語は、例えば複数の発現カセットから発現される（例えば２、３又は４つの発現カセットから発現される２、３、又は４つのκ－カゼイン）同じ種類の様々なカゼインタンパク質（例えばαＳ１、ａＳ２、β又はκカゼイン）の同時発現、又は同じ種類のカゼインタンパク質のポリシストロン性発現（例えばポリシストロン性ＲＮＡから発現される２、３又は４つのκ－カゼイン）、及び例えば複数の発現カセットから発現される（例えば、αＳ１、αＳ２、β及び／又はκカゼインは、２、３又は４つの発現カセットから発現される）異なる種類の様々なカゼインタンパク質（例えばαＳ１、αＳ２、β及びκカゼイン）の同時発現、又は同じ種類のカゼインタンパク質のポリシストロン性発現（例えばポリシストロン性ＲＮＡから発現されるαＳ１、αＳ２、β及び／又はκカゼイン）を含む、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を同時発現するように工学操作されている宿主細胞を指し得る。
【0068】
トリコデルマ・リーセイ、アスペルギルス・バデンシス及びアスペルギルス・ニガーなどの宿主生物では、少なくとも１つのカゼインは、アスペルギルス・ニデュランス（A.nidulans）ｇｐｄＡプロモーター及びｔｒｐＣ転写終結因子の制御下で、βカゼインに連結されたａＭＦ分泌シグナル（例えば配列番号２６又は２７）並びに他の分泌シグナル（例えば配列番号３１～３６、又はｇｌａＡ又はＣＢＨ２の分泌シグナル）、及びκカゼインに連結されたｐＯｓｔ１－ａＭＦ分泌シグナル（例えば配列番号２４）又は他の分泌シグナル（ｇｌａＡ又はＣＢＨ２の分泌シグナル）と共に発現され得る。配列番号２３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し、カゼインタンパク質をリン酸化することができるｈＦＡＭ２０ｃなどのキナーゼは、分泌シグナルを伴うことなく、アスペルギルス・ニデュランスのｇｐｄＡプロモーター及びｔｒｐＣ転写終結因子を伴い、カゼインと同時発現された。
【0069】
【表2】
【0070】
【表3】
【0071】
本発明の実施例では、前記宿主生物は、実施例に記載のようなクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスのいずれかである。
【0072】
組換え宿主生物の使用及びカゼインタンパク質を産生する方法
本発明はまた、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生するための、組換え宿主細胞又は生物の使用に関する。
本発明はまた、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生するための、組換え宿主細胞又は生物の使用に関する。
【0073】
具体的には、本発明は、
ａ．請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え宿主生物において、分泌シグナルに連結された配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程；及び
ｂ．培養培地中に少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で宿主細胞又は生物を培養する工程
を含む、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する新規方法に関する。
ａ．請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え宿主生物において、分泌シグナルに連結された配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程；及び
ｂ．培養培地中に少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で宿主細胞又は生物を培養する工程
を含む、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する新規方法に関する。
【0074】
１つの態様では、工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二の異なるカゼインタンパク質と同時発現される、及び／又は、配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているＦＡＭ２０ｃキナーゼと同時発現される。
【0075】
本発明はまた、上記の方法によって産生されるカゼインタンパク質、具体的には、配列番号２、６、１０、又は１４のアミノ酸配列を有しているカゼインタンパク質にも関する。また、このようなカゼインを含んでいるミセル、及びこのようなカゼイン又はミセルを含んでいる食品などの組成物も包含される。
【0076】
さらに、本発明は、
（ｉ）配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一率を有している少なくとも２つのカゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼをコードしているポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ、及び配列番号２８、３７又は５３～５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ２、及び／又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
（ｉｉ）場合により、宿主細胞において、少なくとも２つのカゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼを同時発現させる工程、及び
（ｉｉｉ）カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌法を提供する。
（ｉ）配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一率を有している少なくとも２つのカゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼをコードしているポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ、及び配列番号２８、３７又は５３～５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ２、及び／又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
（ｉｉ）場合により、宿主細胞において、少なくとも２つのカゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼを同時発現させる工程、及び
（ｉｉｉ）カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌法を提供する。
【0077】
１つの特定の態様では、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法は、
ａ．少なくとも２つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでの、ポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ及びプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ１、配列番号６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ２、及び／又は配列番号１０に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｂ．該宿主細胞において少なくとも２つのカゼインタンパク質を同時発現させる工程、及び
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む。
ａ．少なくとも２つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでの、ポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ及びプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ１、配列番号６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ２、及び／又は配列番号１０に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｂ．該宿主細胞において少なくとも２つのカゼインタンパク質を同時発現させる工程、及び
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む。
【0078】
実施例は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスのための本発明の方法を記載する。公知の方法は、大腸菌又は糸状菌などの他の宿主細胞のためにも使用することができる。
【0079】
本明細書において使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、内容からそうではないと明記されていない限り、複数の対象物も含むことが注記されなければならない。したがって、例えば、「１つの発現カセット」への言及は、本明細書に開示された１つ以上の発現カセットを含み、「その方法」への言及は、本明細書に記載の方法のために修飾又は置き換えることのできる、当業者には公知である等価な工程及び方法への言及も含む。
【0080】
本明細書及び以下の特許請求の範囲の全体を通して、内容からその他のものが必要とされない限り、「含む（comprise）」という単語、並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる」などの変化形は、記載の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の包含を意味すると理解されるが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の除外を意味するものではないと理解されるだろう。本明細書において使用する「含んでいる」という用語は、「含有している」という用語で置き換えることができるか、又は時には本明細書において使用する場合には「有している」という用語で置き換えることができる。
【0081】
本明細書において使用する場合の「からなる」は、特許請求の範囲の要素に明記されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書において使用する「実質的にからなる」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない、材料又は工程を除外しない。本明細書において各々の場合において、「含んでいる」、「本質的にからなる」及び「からなる」という用語のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。
【0082】
本明細書において使用する「約」又は「およそ」という用語は、所与の数値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。それはまた、具体的な数字を含み、例えば約２０は２０を含む。
【0083】
本明細書においてそうでないと定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するだろう。さらに、内容からそれ以外が必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法及び技術は一般的には、当技術分野において周知である従来の方法に従って実施される。一般的には、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝子学、並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションの技術に関連して使用される命名法は、当技術分野において周知であり一般的に使用されているものである。
【0084】
本発明の方法及び技術は一般的には、特記されない限り、当技術分野において周知である従来の方法に従って、並びに、本明細書全体を通して引用及び考察されている様々な一般的な及びより専門的な参考文献に記載のように実施される。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y. (2001); Ausubel et al.、Current Protocols in Molecular Biology, J, Greene Publishing Associates (１９９２年、及び２００２年までの補刊); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press参照。本明細書に記載の分子細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学、並びに医薬及び製薬化学に関連して使用される命名法、並びにその実験手順及び技術は、当技術分野において周知であり一般的に使用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【0085】
【図1-1】本発明のウシカゼインタンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列。
【図1-2】本発明のウシカゼインタンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列。
【図1-3】本発明のウシカゼインタンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列。
【図1-4】本発明のウシカゼインタンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列。
【図1-5】本発明のウシカゼインタンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列。
【図2-1】存在し得るリン酸化模倣体部位に下線を引いている、様々な種に由来するカゼインのアラインメント。
【図2-2】存在し得るリン酸化模倣体部位に下線を引いている、様々な種に由来するカゼインのアラインメント。
【図2-3】存在し得るリン酸化模倣体部位に下線を引いている、様々な種に由来するカゼインのアラインメント。
【図2-4】存在し得るリン酸化模倣体部位に下線を引いている、様々な種に由来するカゼインのアラインメント。
【図3】１コピーのｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κカゼインのゲノムへの挿入及びマルチコピーのａＭＦ－κカゼインの挿入（２つ以上）を有するクルイベロマイセス・ラクティス株のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。
【図4】１コピーのｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κカゼインのゲノムへの挿入及びマルチコピーのａＭＦ－κカゼインの挿入（２つ以上）を有するクルイベロマイセス・ラクティス株のウェスタンブロット分析。
【図5】配列表。
【図6】プロテアーゼ欠損クルイベロマイセス・ラクティス株は、野生型クルイベロマイセス・ラクティス株と比較して少なくとも２０倍多いκカゼインを産生する。各々の示された株に由来する類似した細胞数の培養上清に由来する試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗κカゼイン抗体を用いた免疫検出（例えばウェスタンブロット）によって分析した。ｙＲＢＴ００３は、野生型クルイベロマイセス・ラクティスである。
【図7】κカゼインの収量における、様々な推定ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼの欠失の効果。免疫検出分析（例えばウェスタンブロット）は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇの欠失を有するｙＲＢＴ２２５株が、他の推定ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼの欠失を有する株と比較して、最も高いκカゼイン収量を有することを示す。
【図8】ｈＦＡＭ２０ｃを伴い又は伴わずに、κカゼインがゲノムに組み込まれたクルイベロマイセス・ラクティス株の免疫検出分析（例えばウェスタンブロット）。κカゼインと同時発現されたｈＦＡＭ２０ｃを有する、ｙＲＢＴ２２５は、ｈＦＡｍ２０ｃの同時発現を有さない、ｙＲＢＴ３４３と比較して２倍増加したκカゼインシグナルを示した。
【図9A】質量分析による組換え産生されたκカゼインのリン酸化分析。Ａ．κカゼインの配列、黄色での強調は、同定されたペプチド（５４％の網羅率）であり、緑色はリン酸化によって修飾されたセリンである。Ｂ．同定されたペプチドのリスト、その同定確率スコア及び発見された修飾を伴い、青色での強調はリン酸化されている可能性のあるペプチドである。Ｃ．ＳＣＱＡＱＰＴＴＭＡＲペプチド（配列番号３８）のＭＳ２フラグメンテーションのスペクトル。Ｄ．ＳＣＱＡＱＰＴＴＭＡＲペプチド（配列番号３８）のフラグメンテーションイオン表。
【図9B】質量分析による組換え産生されたκカゼインのリン酸化分析。Ａ．κカゼインの配列、黄色での強調は、同定されたペプチド（５４％の網羅率）であり、緑色はリン酸化によって修飾されたセリンである。Ｂ．同定されたペプチドのリスト、その同定確率スコア及び発見された修飾を伴い、青色での強調はリン酸化されている可能性のあるペプチドである。Ｃ．ＳＣＱＡＱＰＴＴＭＡＲペプチド（配列番号３８）のＭＳ２フラグメンテーションのスペクトル。Ｄ．ＳＣＱＡＱＰＴＴＭＡＲペプチド（配列番号３８）のフラグメンテーションイオン表。
【図9C】質量分析による組換え産生されたκカゼインのリン酸化分析。Ａ．κカゼインの配列、黄色での強調は、同定されたペプチド（５４％の網羅率）であり、緑色はリン酸化によって修飾されたセリンである。Ｂ．同定されたペプチドのリスト、その同定確率スコア及び発見された修飾を伴い、青色での強調はリン酸化されている可能性のあるペプチドである。Ｃ．ＳＣＱＡＱＰＴＴＭＡＲペプチド（配列番号３８）のＭＳ２フラグメンテーションのスペクトル。Ｄ．ＳＣＱＡＱＰＴＴＭＡＲペプチド（配列番号３８）のフラグメンテーションイオン表。
【図9D】質量分析による組換え産生されたκカゼインのリン酸化分析。Ａ．κカゼインの配列、黄色での強調は、同定されたペプチド（５４％の網羅率）であり、緑色はリン酸化によって修飾されたセリンである。Ｂ．同定されたペプチドのリスト、その同定確率スコア及び発見された修飾を伴い、青色での強調はリン酸化されている可能性のあるペプチドである。Ｃ．ＳＣＱＡＱＰＴＴＭＡＲペプチド（配列番号３８）のＭＳ２フラグメンテーションのスペクトル。Ｄ．ＳＣＱＡＱＰＴＴＭＡＲペプチド（配列番号３８）のフラグメンテーションイオン表。
【図10】構成性ＴＥＦ１プロモーターから発現されたκカゼイン。ｐＴＥＦ１－ｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κを有しているＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ欠失株の様々なクローンの免疫検出分析（例えばウェスタンブロット）。
【図11】組換え産生されたβカゼインのホスファターゼによる処理。λホスファターゼは、ｈＦＡＭ２０ｃと同時発現されたβ－カゼインのバンドシフトを誘導した。
【図12】κカゼインの収量の増加が、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇΔ及びｐｅｐ４Δ二重プロテアーゼの欠失を有するｙＲＢＴ３８７株において、ガラクトースによる誘導から２４時間後に観察されたことを示す、ウェスタンブロット。
【図13】実施例４及び５に関連した配列表。
【0086】
発明の項目
以下の項目はさらに本発明を特徴付ける：
１．少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞（ここでのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか又はエピソームに維持され、異種分泌シグナル及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続く）。
以下の項目はさらに本発明を特徴付ける：
１．少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞（ここでのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか又はエピソームに維持され、異種分泌シグナル及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続く）。
【0087】
２．前記宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生するように遺伝子工学操作されている、項目１の組換え宿主細胞。
【0088】
３．ポリヌクレオチドによってコードされるカゼインタンパク質は、配列番号１、２若しくは１７のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列を有しているカゼインβ、又は配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列を有しているカゼインκに対して少なくとも７０％同一である、項目１又は２の組換え宿主細胞。
【0089】
４．前記宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、項目１～３のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0090】
５．前記カゼインのセリン又はトレオニンをコードしている１つ以上のヌクレオチドは、グルタミン酸又はアスパラギン酸をコードしているヌクレオチドで置換されている、項目１～４のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0091】
６．前記カゼインをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、又は２０～２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、項目１～５のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0092】
７．前記異種分泌シグナルは、カゼイン分泌シグナルではない、項目１～６のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0093】
８．前記宿主細胞は、生物、例えば細菌、酵母、又は糸状菌である、項目１～７のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0094】
９．前記生物は、好ましくは大腸菌及び枯草菌からなる群より選択される細菌、トリコデルマ・リーセイ、アスペルギルス・バデンシス、アスペルギルス・オリゼー、及びアスペルギルス・ニガーからなる群より選択される糸状菌、又は好ましくはクルイベロマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、テトラヒメナ属、ヤロウィア属、ハンゼヌラ属、ブラストボトリ（Blastobotrys）属、カンジダ属、ザイゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、及びデバリオマイセス（Debaryomyces）属の群から選択される酵母細胞であり、好ましくは該宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyceslactis）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、項目８の組換え宿主細胞。
【0095】
１０．前記宿主細胞は酵母細胞であり、前記異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、配列番号２５若しくは２６を有しているａＭＦ、又は配列番号２７を有しているキラータンパク質からなる群より選択される、項目９の組換え宿主細胞。
【0096】
１１．前記宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり、好ましくは前記プロモーターは配列番号２８又は配列番号３７である、項目９又は１０の組換え宿主細胞。
【0097】
１２．ａ．前記宿主細胞はクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり；
ｂ．前記異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦであり；そして
ｃ．該宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、項目９～１１のいずれか一項の組換え宿主生物。
ｂ．前記異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦであり；そして
ｃ．該宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、項目９～１１のいずれか一項の組換え宿主生物。
【0098】
１３．少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号２３に対して少なくとも７０％の配列同一率を有しているＦＡＭ２０ｃキナーゼと同時発現される、項目９～１２のいずれか一項の組換え宿主生物。
【0099】
１４．少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞であって、好ましくは前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκであり、ここでのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか、又はエピソームに維持され、異種分泌シグナル及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続き、ここでの該組換え宿主細胞はさらに：
ｉ）キナーゼ（例えばセリン／トレオニンプロテインキナーゼ）、好ましくは配列番号２３、４０、４１、若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１（例えばhttps://enzyme.expasy.org/EC/2.7.11.1）を有している該キナーゼを同時発現するように遺伝子工学操作され；及び／又は
ｉｉ）１つ以上のプロテアーゼ、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１及び５２からなる群より選択される、又は配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１若しくは５２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能（例えば、ＥＣ３．４．２３．Ｘ酵素活性を有しているアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは１～５２から選択される（例えば、https://enzyme.expasy.org/EC/3.4.23.-））を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含んでいる該宿主細胞であり；さらに好ましくは、該プロテアーゼはアスパラギン酸プロテアーゼであり（例えばＥＣ３．４．２３．Ｘを有しているアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは１～５２から選択される（例えばhttps://enzyme.expasy.org/EC/3.4.23.-））、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼはｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり（例えばhttps://pfam.xfam.org/family/PF00026）、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス宿主細胞であり；
場合により、ここでの宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生するように遺伝子工学操作されている、
組換え宿主細胞。
ｉ）キナーゼ（例えばセリン／トレオニンプロテインキナーゼ）、好ましくは配列番号２３、４０、４１、若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１（例えばhttps://enzyme.expasy.org/EC/2.7.11.1）を有している該キナーゼを同時発現するように遺伝子工学操作され；及び／又は
ｉｉ）１つ以上のプロテアーゼ、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１及び５２からなる群より選択される、又は配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１若しくは５２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能（例えば、ＥＣ３．４．２３．Ｘ酵素活性を有しているアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは１～５２から選択される（例えば、https://enzyme.expasy.org/EC/3.4.23.-））を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含んでいる該宿主細胞であり；さらに好ましくは、該プロテアーゼはアスパラギン酸プロテアーゼであり（例えばＥＣ３．４．２３．Ｘを有しているアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは１～５２から選択される（例えばhttps://enzyme.expasy.org/EC/3.4.23.-））、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼはｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり（例えばhttps://pfam.xfam.org/family/PF00026）、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス宿主細胞であり；
場合により、ここでの宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生するように遺伝子工学操作されている、
組換え宿主細胞。
【0100】
１５．前記カゼインをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、又は２０～２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、項目１～１４のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0101】
１６．前記異種分泌シグナルは、カゼイン分泌シグナルではない、項目１～１５のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0102】
１７．前記宿主細胞は、生物、例えば細菌、酵母又は糸状菌であり、場合により該生物は、好ましくは大腸菌及び枯草菌からなる群より選択される細菌、トリコデルマ・リーセイ、アスペルギルス・バデンシス、アスペルギルス・オリゼー、及びアスペルギルス・ニガーからなる群より選択される糸状菌、又は好ましくはクルイベロマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、テトラヒメナ属、ヤロウィア属、ハンゼヌラ属、ブラストボトリ属、カンジダ属、ザイゴサッカロマイセス属、及びデバリオマイセス属の群から選択される酵母細胞であり、好ましくは該宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスである、項目１～１６のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0103】
１８．前記宿主細胞は酵母細胞であり、前記異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、配列番号２５若しくは２６を有しているａＭＦ、又は配列番号２７を有しているキラータンパク質からなる群より選択される、項目１～１７のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0104】
１９．前記宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり、好ましくは前記プロモーターは配列番号２８若しくは配列番号３７又は配列番号５３、５４、５５若しくは５６である、項目１～１８のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0105】
２０．前記キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％の配列同一率を有している、項目１～１９のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0106】
２１．前記宿主細胞は、配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１及び５２からなる群より選択される１つ以上のプロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つ（例えば２つ又は３つ）のプロテアーゼ欠損を含んでいる、項目１～２０のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0107】
２２．配列番号１～５６からなる群より選択される１つ以上の配列を含んでいる、及び／又は本明細書に示された任意の表（例えば本明細書の表１又は２又は３）に示されているような株／構築物のリストから選択された、項目１～２１のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0108】
２３．少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞であって、ここでのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか、又はエピソームに維持され、そして異種分泌シグナル及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続き、ここでの該組換え宿主細胞はさらに：
ｉ）キナーゼ、好ましくは配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している該キナーゼを同時発現するように遺伝子工学操作され、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し；及び／又は
ｉｉ）１つ以上のプロテアーゼ（例えばＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有するアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される）、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群より選択されるか又は配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、若しくは５２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含んでいる、自然に発生した又は遺伝子工学操作された該宿主細胞であり；さらに好ましくは、該プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼであり、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼは、ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス宿主細胞であり；
好ましくは、ａ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、κ－カゼイン（カゼイン－κ）であり；及び／又は
ｂ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列、又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、β－カゼイン（カゼイン－β）であり；
場合により、ここでの該宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生（例えば同時発現）するように遺伝子工学操作されている。
ｉ）キナーゼ、好ましくは配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している該キナーゼを同時発現するように遺伝子工学操作され、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し；及び／又は
ｉｉ）１つ以上のプロテアーゼ（例えばＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有するアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される）、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群より選択されるか又は配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、若しくは５２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含んでいる、自然に発生した又は遺伝子工学操作された該宿主細胞であり；さらに好ましくは、該プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼであり、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼは、ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス宿主細胞であり；
好ましくは、ａ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、κ－カゼイン（カゼイン－κ）であり；及び／又は
ｂ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列、又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、β－カゼイン（カゼイン－β）であり；
場合により、ここでの該宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生（例えば同時発現）するように遺伝子工学操作されている。
【0109】
２４．ポリヌクレオチドによってコードされるカゼインタンパク質は、配列番号１、２若しくは１７のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列を有しているカゼインβ、又は配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列を有しているカゼインκに対して、少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であり、好ましくはここでの宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、項目１～２３のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0110】
２５．前記カゼインのセリン又はトレオニンをコードしている１つ以上のヌクレオチドは、グルタミン酸又はアスパラギン酸をコードしているヌクレオチドで置換されている、項目１～２４のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0111】
２６．前記カゼインをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、又は２０～２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、項目１～２５のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0112】
２７．前記異種分泌シグナルは、カゼイン分泌シグナルではない、項目１～２６のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0113】
２８．前記宿主細胞は、生物、例えば細菌、酵母、又は糸状菌であり、場合により該生物は、好ましくは大腸菌及び枯草菌からなる群より選択される細菌、トリコデルマ・リーセイ、アスペルギルス・バデンシス、アスペルギルス・オリゼー、及びアスペルギルス・ニガーからなる群より選択される糸状菌、又は好ましくはクルイベロマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、テトラヒメナ属、ヤロウィア属、ハンゼヌラ属、ブラストボトリ属、カンジダ属、ザイゴサッカロマイセス属、及びデバリオマイセス属の群から選択される酵母細胞であり、好ましくは該宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスである、項目１～２７のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0114】
２９．前記宿主細胞は酵母細胞であり、前記異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、配列番号２５若しくは２６を有しているａＭＦ、又は配列番号２７を有しているキラータンパク質、又は配列番号３１、３２、３３、３４、３５若しくは３６を有している分泌シグナルからなる群より選択される、項目１～２８のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0115】
３０．前記宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり、好ましくは該プロモーターは、配列番号２８又は配列番号３７又は配列番号５３、５４、５５若しくは５６である、項目１～２９のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0116】
３１．前記キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、項目１～３０のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0117】
３２．自然に発生した又は遺伝子工学操作された前記宿主細胞は、配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１及び５２からなる群より選択される１つ以上のプロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含み、ここでの該プロテアーゼは、ＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有しているアスパラギン酸エンドペプチダーゼであり、ここでのＸは１～５２からなる群より選択される、項目１～３１のいずれか一項の組換え宿主細胞。
【0118】
３３．ａ．前記宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり；
ｂ．前記異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルであり；そして
ｃ．該宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、項目１～３２のいずれか一項の組換え宿主生物。
ｂ．前記異種分泌シグナルは、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルであり；そして
ｃ．該宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、項目１～３２のいずれか一項の組換え宿主生物。
【0119】
３４．少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を製造するための項目１～３３のいずれか一項の組換え宿主細胞の使用であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質はκ－カゼイン及び／又はβ－カゼインである、使用。
【0120】
３５．少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を製造するための項目１～３４のいずれか一項の組換え宿主細胞の使用であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質はκ－カゼインである、使用。
【0121】
３６．ａ．項目１～３５のいずれか一項記載の組換え宿主細胞において、分泌シグナルに連結された、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％同一であるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程、
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含み、場合により、ここでは：
ｃ．工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二のカゼインタンパク質と同時発現している、及び／又は、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているキナーゼを同時発現している、
少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質は、κ－カゼインである、方法。
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含み、場合により、ここでは：
ｃ．工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二のカゼインタンパク質と同時発現している、及び／又は、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているキナーゼを同時発現している、
少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質は、κ－カゼインである、方法。
【0122】
３７．ａ．項目１～３６のいずれか一項記載の組換え宿主細胞において、分泌シグナルに連結された、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程；
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含み、場合により、ここでは：
ｃ．工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二のカゼインタンパク質を同時発現している、及び／又は、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率であるアミノ酸配列を有しているキナーゼを同時発現しており、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、
少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質はκ－カゼイン及び／又はβ－カゼインである、方法。
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含み、場合により、ここでは：
ｃ．工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二のカゼインタンパク質を同時発現している、及び／又は、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率であるアミノ酸配列を有しているキナーゼを同時発現しており、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、
少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質はκ－カゼイン及び／又はβ－カゼインである、方法。
【0123】
３８．少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を製造するための、項目１～３７のいずれか一項の組換え宿主細胞の使用。
【0124】
３９．ａ．項目１～１５のいずれか一項記載の組換え宿主細胞において、分泌シグナルに連結された、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％同一であるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程；
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法。
ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む、少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法。
【0125】
４０．工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二のカゼインタンパク質と同時発現される、及び／又は、配列番号２３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているＦＡＭ２０ｃキナーゼと同時発現される、項目３９の方法。
【0126】
４１．項目１～４０のいずれか一項の方法によって産生されるカゼインタンパク質。
【0127】
４２．配列番号２、６、１０又は１４のアミノ酸配列を有しているカゼインタンパク質。
【0128】
４３．項目１～４２のいずれか一項記載の１つ又はいくつか又はそれ以上のカゼインタンパク質を含んでいるミセル。
【0129】
４４．項目１～４３のいずれか一項のカゼインタンパク質又は項目１～４３のいずれか一項のミセルを含んでいる組成物。
【0130】
４５．ａ．配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、又は１４に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一率を有している少なくとも２つのカゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一率を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼをコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ、及び配列番号２８、３７、又は５３～５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｂ．場合により、少なくとも２つのカゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼを該宿主細胞において同時発現させる工程、そして
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程、
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法。
ｂ．場合により、少なくとも２つのカゼインタンパク質、及び配列番号２３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有している１つのＦａｍ２０ｃキナーゼを該宿主細胞において同時発現させる工程、そして
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程、
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法。
【0131】
４６．ａ．少なくとも２つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込む工程（ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ及びプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ１、配列番号６に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαＳ２、及び／又は、配列番号１０に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１４に対して７０％同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｂ．宿主細胞（例えば本発明に記載の）において少なくとも２つのカゼインタンパク質を同時発現させる工程、及び
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法。
ｂ．宿主細胞（例えば本発明に記載の）において少なくとも２つのカゼインタンパク質を同時発現させる工程、及び
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法。
【0132】
４７．ａ．配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、又は１４に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している少なくとも２つのカゼインタンパク質及びキナーゼ（ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又はＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している）をコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程（好ましくは、該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し；ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ、又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルに；及び配列番号２８、３７、５３、５４、５５若しくは５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている）、
ｂ．場合により、少なくとも２つのカゼインタンパク質及びキナーゼ（配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有し、好ましくは配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している該キナーゼ）を該宿主細胞において同時発現させる工程、そして
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程、
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法。
ｂ．場合により、少なくとも２つのカゼインタンパク質及びキナーゼ（配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有し、好ましくは配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している該キナーゼ）を該宿主細胞において同時発現させる工程、そして
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程、
を含む、組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法。
【0133】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するが、本発明の範囲を限定すると捉えられるべきではない。
以下の実施例は、本発明を説明するが、本発明の範囲を限定すると捉えられるべきではない。
【0134】
実施例１：組換えクルイベロマイセス・ラクティスの産生
酵母株：ＮＥＢ（Ｅ１０００Ｓ）由来のクルイベロマイセス・ラクティス
酵母株：ＮＥＢ（Ｅ１０００Ｓ）由来のクルイベロマイセス・ラクティス
【表4】
【0135】
【表5】
【0136】
ベクターの構築、酵母の形質転換並びに発現試験は、製造業者の説明書に従って実施される。
【0137】
ピキアに類似したクルイベロマイセス・ラクティスの同時発現戦略は、野生型カゼイン（群）の（同時）発現の場合を除いて、分泌シグナルを伴わないｈＦＡＭ２０ｃキナーゼは、カゼインと同じゲノム遺伝子座に組み込まれる。キナーゼの発現は誘導性である。
【0138】
ありとあらゆるカゼイン（野生型又はリン酸化模倣体）が、ｐＫＬＡＣ２ベクターにクローニングされるだろう。それ故、１つ１つのカゼインは、それ自体のｐＬＡＣ４プロモーター（配列番号５６）を有し、これは誘導性発現及び相同的組換えに必要とされる。同時発現は、複数の鎖状化ｐＫＬＡＣ２ベクターの同時形質転換によって達成されるだろう。複数のカゼインが、相同的組換えによってゲノムＬＡＣ４遺伝子座に組み込まれるだろう。ピキア同時発現系と比較して、２Ａペプチドリンカーは、クルイベロマイセス・ラクティスにおいて必要とされない。
【0139】
１．１．クルイベロマイセス・ラクティスの電気穿孔
SANCHEZ et al. 1993（M. Sanchez, F. J. Iglesias, C. Santamaria及びA. Dominguez, “Transformation of Kluyveromyces lactis by Electroporation,” Appl Environ Microbiol, vol. 59, no. 7, pp. 2087-2092, Jul. 1993）及びWesolowski-Louvel 2011（Wesolowski-Louvel, “An efficient method to optimize Kluyveromyces lactis gene targeting,” FEMS Yeast Res, vol. 11, no. 6, pp. 509-513, Sep. 2011）から適応させる。
SANCHEZ et al. 1993（M. Sanchez, F. J. Iglesias, C. Santamaria及びA. Dominguez, “Transformation of Kluyveromyces lactis by Electroporation,” Appl Environ Microbiol, vol. 59, no. 7, pp. 2087-2092, Jul. 1993）及びWesolowski-Louvel 2011（Wesolowski-Louvel, “An efficient method to optimize Kluyveromyces lactis gene targeting,” FEMS Yeast Res, vol. 11, no. 6, pp. 509-513, Sep. 2011）から適応させる。
【0140】
・クルイベロマイセス・ラクティスの一晩の前培養液を、５０mLのＹＰＤで０．２の吸光度（６００nm）となるまで希釈し、０．８～１．０の吸光度となるまで増殖させた。
・２．細胞を４℃で３０００ｇ、５分間でペレット化し、その後、等容量の氷冷蒸留水で洗浄した。
・３．ペレット化した細胞を、２mLの前処理緩衝液中に再度懸濁した：２５mMのジチオトレイトール及び２０mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）を含有しているＹＰＤ。
・４．３０℃で３０分間インキュベートする。
・５．細胞を再度ペレット化し、１０mLの氷冷電気穿孔用緩衝液で洗浄する：１０mMのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２７０mMのショ糖、１mMのＭｇＣｌ２。
・６．１００μLのそれぞれの氷冷電気穿孔用緩衝液中にペレットを再度懸濁する。
・７．５０μLのエレクトロコンピテント細胞を、カラムで精製したＳａｃＩＩ消化ｐＫＬＡＣ２ベクター（群）（各々１．０μg）＋１μLのサケ精子一本鎖ＤＮＡと混合する。
・８．電気穿孔法計画：２mmのキュベット、１．０Kvの測定：５．６～６．０ミリ秒。
・９．パルス後、１mLの冷ＹＰＤを細胞に加え、懸濁液を培養チューブに戻し、氷上に５分間保持し、その後、３０℃でインキュベートする。
・１０．１時間後に３０℃で回収した後、５０μLから３００μLの各々の形質転換回収培養液をＹＣＢ＋５mMのアセトアミドプレート上に蒔く。
・１１．直径１～２mmのコロニーが出現するまで、３０℃で３～５日間プレートをインキュベートする。＊（注記：クルイベロマイセス・ラクティスは、選択培地上での形質転換されていない細胞の最小限の増殖を可能とするであろう弱活性の天然のアセトアミドを含有しているので、陰性クローンのバックグラウンドが存在するだろう）。
・１２．その後、ＹＣＢ＋５mMのアセトアミドプレートのコロニーを、ＹＣＢ＋５mMのアセトアミドプレート上に再度画線塗付して、１つのコロニーを単離し、その後、ゲノムへの組み込みの確認のために酵母コロニーＰＣＲを行なった。
・２．細胞を４℃で３０００ｇ、５分間でペレット化し、その後、等容量の氷冷蒸留水で洗浄した。
・３．ペレット化した細胞を、２mLの前処理緩衝液中に再度懸濁した：２５mMのジチオトレイトール及び２０mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）を含有しているＹＰＤ。
・４．３０℃で３０分間インキュベートする。
・５．細胞を再度ペレット化し、１０mLの氷冷電気穿孔用緩衝液で洗浄する：１０mMのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２７０mMのショ糖、１mMのＭｇＣｌ２。
・６．１００μLのそれぞれの氷冷電気穿孔用緩衝液中にペレットを再度懸濁する。
・７．５０μLのエレクトロコンピテント細胞を、カラムで精製したＳａｃＩＩ消化ｐＫＬＡＣ２ベクター（群）（各々１．０μg）＋１μLのサケ精子一本鎖ＤＮＡと混合する。
・８．電気穿孔法計画：２mmのキュベット、１．０Kvの測定：５．６～６．０ミリ秒。
・９．パルス後、１mLの冷ＹＰＤを細胞に加え、懸濁液を培養チューブに戻し、氷上に５分間保持し、その後、３０℃でインキュベートする。
・１０．１時間後に３０℃で回収した後、５０μLから３００μLの各々の形質転換回収培養液をＹＣＢ＋５mMのアセトアミドプレート上に蒔く。
・１１．直径１～２mmのコロニーが出現するまで、３０℃で３～５日間プレートをインキュベートする。＊（注記：クルイベロマイセス・ラクティスは、選択培地上での形質転換されていない細胞の最小限の増殖を可能とするであろう弱活性の天然のアセトアミドを含有しているので、陰性クローンのバックグラウンドが存在するだろう）。
・１２．その後、ＹＣＢ＋５mMのアセトアミドプレートのコロニーを、ＹＣＢ＋５mMのアセトアミドプレート上に再度画線塗付して、１つのコロニーを単離し、その後、ゲノムへの組み込みの確認のために酵母コロニーＰＣＲを行なった。
【0141】
１．２ ゲノムへの組み込みを確認するためのクルイベロマイセス・ラクティスのコロニーＰＣＲ
１つのコロニーを１０μLの滅菌水に溶解し、１μLのクルイベロマイセス・ラクティス細胞懸濁液を、ＰＣＲ鋳型溶液として使用した。残りの細胞を使用して、マスタープレート、並びにグリセロールストック及び発現試験のための液体培養液を作成した。
１つのコロニーを１０μLの滅菌水に溶解し、１μLのクルイベロマイセス・ラクティス細胞懸濁液を、ＰＣＲ鋳型溶液として使用した。残りの細胞を使用して、マスタープレート、並びにグリセロールストック及び発現試験のための液体培養液を作成した。
【0142】
関心対象の遺伝子の増幅を、キットに含まれるプライマー、又はカゼイン遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて実施する。
【0143】
実施例２：組換えピキア・パストリスの産生
ピキア株：サーモフィッシャー社製のピキアＰｉｎｋ（PichiaPink）（Ａ１１１５０）
ピキア株：サーモフィッシャー社製のピキアＰｉｎｋ（PichiaPink）（Ａ１１１５０）
【0144】
【表6】
【0145】
同時発現の組合せ：
【表7】
【0146】
ベクターの構築、酵母の形質転換、並びに発現試験は、公知のプロトコールに従って実施されるだろう。
【0147】
野生型カゼイン（群）の（同時）発現を達成するために、ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼを、ＧＡＰ１遺伝子座に組み込むことにより、構成性発現を達成した。その後、１つの野生型カゼイン（天然シグナルペプチドを含まない）又は２Ａペプチドリンカー（群）を有する複数の野生型カゼインを、ｐＰＩＮＫ－ＨＣベクターにクローニングする。２Ａリンカー（群）と共に１つのカゼイン又は複数のカゼインを発現している鎖状化ベクターを、続いて、誘導性分泌のために、ＡＯＸ１遺伝子座に組み込むことができる。分泌プロセスを最適化するために、様々な分泌シグナルが試験されるだろう。
【0148】
ｐＯＳｔ１－ａＭＦ
配列番号２４
配列番号２４
【化13】
【0149】
リンカー２Ａペプチド配列
配列番号２９／３０
Ｔ２Ａ＿１
Ｔ２Ａ＿２
配列番号２９／３０
Ｔ２Ａ＿１
【化14】
Ｔ２Ａ＿２
【化15】
【0150】
誘導性分泌カゼイン突然変異体（群）の場合、１つの突然変異体カゼイン（天然シグナルペプチドを含まない）又は複数の突然変異体カゼインを、２Ａペプチドリンカー（群）と共に、誘導性分泌のためにＡＯＸ１遺伝子座に組み込むことができる。分泌プロセスを最適化するために、様々な分泌シグナルが試験されるだろう。
【0151】
２．１ ピキアの電気穿孔
・５０mlのピキア株（Ｘ－３３、ＧＳ１１５、又はピキアＰＩＮＫ）培養液を、ＹＰＤ中で３０℃で良好な通気の下で、０．２の吸光度から１～２の吸光度（６００nm）となるまで増殖させた。
・その後、培養液に、１mlの１．０ＭのＮａ＋ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）及び１mlの１．０Ｍのジチオトレイトールを補充し、インキュベーションを、３０℃でさらに１５分間続けた。
・該細胞を、冷却した５０mlのファルコンチューブに移し、４０００ｇで４℃で３分間遠心分離にかけ、５０mlの氷冷二回蒸留水に再度懸濁した。この水での洗浄工程を繰り返し、その後、２０mlの冷１．０Mのソルビトールでの洗浄を行なった。最後に、該細胞を、２００μlの冷１．０Ｍのソルビトールに再度懸濁した。８０μlのアリコートの酵母細胞を、５μlの低塩溶液中、０．１～１μgのＤＮＡと混合した。この混合物を冷却した電気穿孔用キュベット（０．２cmのギャップ）に移し、１．５ｋV、２５μF、２００オーム（時定数５ミリ秒）に設定されたバイオラッド社のGene Pulserを用いてパルスをかけた。
・細胞懸濁液を、キュベットへの１mlの冷ＹＰＤＳ培地（ＹＰＤ＋１．０Ｍのソルビトール）を用いて直ちに希釈し、ピペッティングによって混合した。
・キュベット中の細胞を２４℃～３０℃で少なくとも２時間（１２時間まで）振盪することなくインキュベートした。
・最後に、該細胞を、適切な選択プレート（これは１．０Ｍのソルビトールで補充されていてもよい）上に広げ、プレートを３０℃で２～３日間、コロニーが出現するまでインキュベートした。
・５０mlのピキア株（Ｘ－３３、ＧＳ１１５、又はピキアＰＩＮＫ）培養液を、ＹＰＤ中で３０℃で良好な通気の下で、０．２の吸光度から１～２の吸光度（６００nm）となるまで増殖させた。
・その後、培養液に、１mlの１．０ＭのＮａ＋ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）及び１mlの１．０Ｍのジチオトレイトールを補充し、インキュベーションを、３０℃でさらに１５分間続けた。
・該細胞を、冷却した５０mlのファルコンチューブに移し、４０００ｇで４℃で３分間遠心分離にかけ、５０mlの氷冷二回蒸留水に再度懸濁した。この水での洗浄工程を繰り返し、その後、２０mlの冷１．０Mのソルビトールでの洗浄を行なった。最後に、該細胞を、２００μlの冷１．０Ｍのソルビトールに再度懸濁した。８０μlのアリコートの酵母細胞を、５μlの低塩溶液中、０．１～１μgのＤＮＡと混合した。この混合物を冷却した電気穿孔用キュベット（０．２cmのギャップ）に移し、１．５ｋV、２５μF、２００オーム（時定数５ミリ秒）に設定されたバイオラッド社のGene Pulserを用いてパルスをかけた。
・細胞懸濁液を、キュベットへの１mlの冷ＹＰＤＳ培地（ＹＰＤ＋１．０Ｍのソルビトール）を用いて直ちに希釈し、ピペッティングによって混合した。
・キュベット中の細胞を２４℃～３０℃で少なくとも２時間（１２時間まで）振盪することなくインキュベートした。
・最後に、該細胞を、適切な選択プレート（これは１．０Ｍのソルビトールで補充されていてもよい）上に広げ、プレートを３０℃で２～３日間、コロニーが出現するまでインキュベートした。
【0152】
２．２ ゲノムへの組み込みを確認するためのピキアコロニーＰＣＲ
１つのコロニーを１０μLの滅菌水に溶解し、１μLのクルイベロマイセス・ラクティス細胞懸濁液を、ＰＣＲ鋳型溶液として使用した。残りの細胞を使用して、マスタープレート、並びにグリセロールストック及び発現試験のための液体培養液を作成した。
１つのコロニーを１０μLの滅菌水に溶解し、１μLのクルイベロマイセス・ラクティス細胞懸濁液を、ＰＣＲ鋳型溶液として使用した。残りの細胞を使用して、マスタープレート、並びにグリセロールストック及び発現試験のための液体培養液を作成した。
【0153】
ｐＰＩＮＫプラスミドの組み込まれたピキアＰＩＮＫ株
関心対象の遺伝子の増幅が、キットに含まれる３’ＣＹＣ１逆方向プライマーと対を形成した、５’ＡＯＸ１正方向プライマー（ｐＰｉｎｋ－ＨＣ、ｐＰｉｎｋ―ＬＣ及びｐＰｉｎｋα－ＨＣ）又はα因子正方向プライマー（ｐＰｉｎｋα－ＨＣのみ）のいずれかを用いて実施される。
関心対象の遺伝子の増幅が、キットに含まれる３’ＣＹＣ１逆方向プライマーと対を形成した、５’ＡＯＸ１正方向プライマー（ｐＰｉｎｋ－ＨＣ、ｐＰｉｎｋ―ＬＣ及びｐＰｉｎｋα－ＨＣ）又はα因子正方向プライマー（ｐＰｉｎｋα－ＨＣのみ）のいずれかを用いて実施される。
【0154】
ｐＧＡＰプラスミドの組み込まれたＸ－３３株
関心対象の遺伝子の増幅は、ｐＧＡＰ正方向プライマー及びＡＯＸ１転写終結因子逆方向プライマーのいずれかを使用して実施される。
関心対象の遺伝子の増幅は、ｐＧＡＰ正方向プライマー及びＡＯＸ１転写終結因子逆方向プライマーのいずれかを使用して実施される。
【0155】
ｐＰＩＮＫプラスミドの組み込まれたＸ－３３株
関心対象の遺伝子の増幅は、ｐＡＯＸ１正方向プライマー及びＡＯＸ１転写終結因子逆方向プライマーを使用して実施される。
関心対象の遺伝子の増幅は、ｐＡＯＸ１正方向プライマー及びＡＯＸ１転写終結因子逆方向プライマーを使用して実施される。
【0156】
実施例３：κカゼイン発現
配列番号１６のアミノ酸をコードしている核酸のｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κカゼインのゲノムへの１回の挿入、又はａＭＦ－κカゼインの複数回の挿入を有する、クルイベロマイセス・ラクティス株を、ＹＰＤ培地中で増殖させ、その後、誘導培地、すなわち、２％のガラクトースの補充されたＹＰ培地中で０．２の吸光度（６００nm）となるまで希釈した。培養液を、７２時間、１２０又は２４０rpmで、バッフル付き又はバッフルの付いていない振盪フラスコ中でインキュベートした。ガラクトースのフィーディングを、１６時間、２４時間、４０時間及び４８時間の培養時間後に加えた。培養上清を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その後、抗κカゼインウェスタンブロットを実施した。κカゼインのシグナルを、乳汁標準物質との比較によって定量した。
配列番号１６のアミノ酸をコードしている核酸のｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κカゼインのゲノムへの１回の挿入、又はａＭＦ－κカゼインの複数回の挿入を有する、クルイベロマイセス・ラクティス株を、ＹＰＤ培地中で増殖させ、その後、誘導培地、すなわち、２％のガラクトースの補充されたＹＰ培地中で０．２の吸光度（６００nm）となるまで希釈した。培養液を、７２時間、１２０又は２４０rpmで、バッフル付き又はバッフルの付いていない振盪フラスコ中でインキュベートした。ガラクトースのフィーディングを、１６時間、２４時間、４０時間及び４８時間の培養時間後に加えた。培養上清を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その後、抗κカゼインウェスタンブロットを実施した。κカゼインのシグナルを、乳汁標準物質との比較によって定量した。
【0157】
結果
・グリコシル化
ウェスタンブロット分析（図４）により、ｐＯｓｔ１－ｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κカゼイン構築物から発現及び分泌されたκカゼインが、ａＭＦ－κカゼイン構築物からのものよりもゆっくりと移動することが判明した。これは、前者の構築物におけるより高いレベル又は一様ではないグリコシル化パターンの結果であり得る。
・培養条件
培養条件の点では、２０℃のインキュベーション温度（３０℃より良好、データは示されていない）、２４０rpmの振盪速度、及びバッフル付振盪フラスコの使用の組合せが最善の結果を与えるようであった。
・収量及びクローンのばらつき
最善の培養条件下で、異なるクローンに由来するｐＯｓｔ１－ａＭＦ―κカゼインの収量を、以下の表に列挙する。
・グリコシル化
ウェスタンブロット分析（図４）により、ｐＯｓｔ１－ｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κカゼイン構築物から発現及び分泌されたκカゼインが、ａＭＦ－κカゼイン構築物からのものよりもゆっくりと移動することが判明した。これは、前者の構築物におけるより高いレベル又は一様ではないグリコシル化パターンの結果であり得る。
・培養条件
培養条件の点では、２０℃のインキュベーション温度（３０℃より良好、データは示されていない）、２４０rpmの振盪速度、及びバッフル付振盪フラスコの使用の組合せが最善の結果を与えるようであった。
・収量及びクローンのばらつき
最善の培養条件下で、異なるクローンに由来するｐＯｓｔ１－ａＭＦ―κカゼインの収量を、以下の表に列挙する。
【0158】
【表8】
【0159】
＊ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図３）に示されているように、ａＭＦ－κカゼインＣｌ．１試料は、他の全ての試料と比較して、ローディングされたタンパク質の全量の半分しか有さなかった。同じ量の全タンパク質が負荷されていれば、このクローンは、ａＭＦ－κカゼインＣｌ．３と比較してより高いκ突然変異体の収量を有する可能性がある。
【0160】
分析されたクローンにおけるｐＯｓｔ１－ａＭＦ及びａＭＦ分泌シグナルから産生されたκカゼインの量は、同じ範囲内にあり、すなわち約０．２５ｇ/Ｌである。重要なことには、ｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κカゼイン組換え生物は、１つのコピーの挿入を有するが、ａＭＦ－κ組換え生物は複数のコピー（２つ以上）の挿入を有する。したがって、本発明者らは、複数のコピーのｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κカゼイン組換え生物と複数のコピーのａＭＦ－κ組換え生物を比較した場合、本発明者らは、前者の構築物からより良好な収量を有するであろうと推測する。
【0161】
ａＭＦ－κカゼインＣｌ．１とＣｌ．３の間に示されたクローンのばらつきは、挿入コピー数の差の結果である可能性がある。
【0162】
実施例４：κ及びβカゼインの発現
１．κカゼインの発現
１．１ 方法
１．１．１ 細胞培養
ガラクトース誘導性構築物がゲノムに挿入されたクルイベロマイセス・ラクティス株を、ＹＰＤ培地中で増殖させ、その後、誘導培地、すなわち、２％のガラクトースの補充された緩衝化されたＹＰ培地中で０．４の吸光度となるまで希釈した。培養液を、２５℃でバッフル付の振盪フラスコ中で２４０rmでインキュベートし、１６時間及び２０時間誘導した後にガラクトース含有フィードをフィードした。培養上清を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その後、抗κカゼインの免疫検出を行なった。
１．κカゼインの発現
１．１ 方法
１．１．１ 細胞培養
ガラクトース誘導性構築物がゲノムに挿入されたクルイベロマイセス・ラクティス株を、ＹＰＤ培地中で増殖させ、その後、誘導培地、すなわち、２％のガラクトースの補充された緩衝化されたＹＰ培地中で０．４の吸光度となるまで希釈した。培養液を、２５℃でバッフル付の振盪フラスコ中で２４０rmでインキュベートし、１６時間及び２０時間誘導した後にガラクトース含有フィードをフィードした。培養上清を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その後、抗κカゼインの免疫検出を行なった。
【0163】
構成性プロモーターにより駆動される構築物がゲノムに挿入されたクルイベロマイセス・ラクティス株をＹＰＤ培地中で増殖させ、その後、緩衝化ＹＰＤ培地で２０分の１まで希釈した。培養液を、２４０rpmで２５℃でインキュベートし、２４時間の培養時間後に、グルコース含有フィードをフィードした。培養上清を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その後、抗κカゼインの免疫検出を行なった。
【0164】
１．１．２ 質量分析
ｙＲＢＴ２２５培養上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、κカゼイン候補のバンドを切り出し、トリプシン及びＧｌｕＣによるゲル内タンパク質消化にかけた。得られたペプチドを、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計に連結したnanoAcquityＵＰＬＣカラムに注入した。取得された質量分析データを、PEAKS Studio（バイオインフォマティック・ソルーションズ社）に移入し、データを、ＵｎｉＰｒｏｔ酵母プロテオーム及び予想される配列を含有しているデータベースを検索した。
ｙＲＢＴ２２５培養上清を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、κカゼイン候補のバンドを切り出し、トリプシン及びＧｌｕＣによるゲル内タンパク質消化にかけた。得られたペプチドを、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計に連結したnanoAcquityＵＰＬＣカラムに注入した。取得された質量分析データを、PEAKS Studio（バイオインフォマティック・ソルーションズ社）に移入し、データを、ＵｎｉＰｒｏｔ酵母プロテオーム及び予想される配列を含有しているデータベースを検索した。
【0165】
１．２ 結果：
プロテアーゼ欠損株におけるκカゼイン収量の改善：
免疫検出分析（図６）により、κカゼインが、クルイベロマイセス・ラクティス野生型ＧＧ７９９バックグラウンド（ｙＲＢＴ０６７及びｙＲＢＴ０６５）及びＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇの欠失を有する株（ｙＲＢ－κ２２５）の両方における、ゲノムに組み込まれたｐＬＡＣ４－ｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κ構築物から発現及び分泌されたことが判明した。顕著には、その野生型バックグラウンドの親株と比較して、ｙＲＢＴ２２５において分泌されたκカゼインは少なくとも２０倍増加している。この株において増加したκカゼインの収量は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇによりコードされる推定ｐｆａｍ０００２６アスパルギン酸プロテアーゼ（配列番号３９）の欠失に起因する可能性が高い。
プロテアーゼ欠損株におけるκカゼイン収量の改善：
免疫検出分析（図６）により、κカゼインが、クルイベロマイセス・ラクティス野生型ＧＧ７９９バックグラウンド（ｙＲＢＴ０６７及びｙＲＢＴ０６５）及びＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇの欠失を有する株（ｙＲＢ－κ２２５）の両方における、ゲノムに組み込まれたｐＬＡＣ４－ｐＯｓｔ１－ａＭＦ－κ構築物から発現及び分泌されたことが判明した。顕著には、その野生型バックグラウンドの親株と比較して、ｙＲＢＴ２２５において分泌されたκカゼインは少なくとも２０倍増加している。この株において増加したκカゼインの収量は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇによりコードされる推定ｐｆａｍ０００２６アスパルギン酸プロテアーゼ（配列番号３９）の欠失に起因する可能性が高い。
【0166】
κカゼインの収量に対する、他の推定ｐｆａｍ０００２６アスパルギン酸プロテアーゼの欠失の効果も調べられた。図７は、Ｋｌｙｐｓ１ｐ（ｙＲＢＴ２１７）及びＢａｒ１ｐ（ｙＲＢＴ２３２）などの他の推定ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼの欠失を有する株と比較して、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇの欠失を有する株（ｙＲＢＴ２２５）の方が、優れたκカゼイン収量を示す。
【0167】
ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼは、κカゼインの収量を改善する：
翻訳後修飾（ＰＴＭ）はκカゼインの機能に重要であるので、本発明者らは、カゼインを特異的にリン酸化するｈＦＡＭ２０ｃとκカゼインを同時発現させた。興味深いことには、ｙＲＢＴ２２５におけるｈＦＡＭ２０ｃとκカゼインの同時発現により、ｈＦＡＭ２０ｃの同時発現されていない株（ｙＲＢＴ３４３）と比較して、κカゼインの２倍の増加がもたらされた（図８）。
翻訳後修飾（ＰＴＭ）はκカゼインの機能に重要であるので、本発明者らは、カゼインを特異的にリン酸化するｈＦＡＭ２０ｃとκカゼインを同時発現させた。興味深いことには、ｙＲＢＴ２２５におけるｈＦＡＭ２０ｃとκカゼインの同時発現により、ｈＦＡＭ２０ｃの同時発現されていない株（ｙＲＢＴ３４３）と比較して、κカゼインの２倍の増加がもたらされた（図８）。
【0168】
κカゼインのリン酸化：
ｈＦＡＭ２０ｃと同時発現させたκカゼインのリン酸化を確認するために、ｙＲＢＴ２２５株に由来するκカゼインを質量分析によって分析した。少なくとも１つのペプチドが、セリン上でリン酸化されていると同定された（図９Ｂ）。
ｈＦＡＭ２０ｃと同時発現させたκカゼインのリン酸化を確認するために、ｙＲＢＴ２２５株に由来するκカゼインを質量分析によって分析した。少なくとも１つのペプチドが、セリン上でリン酸化されていると同定された（図９Ｂ）。
【0169】
ゴルジ関連分泌経路キナーゼである、細胞外セリン／トレオニンキナーゼｈＦＡＭ２０ｃとは別に、他のキナーゼ、特にセリン／トレオニンプロテインキナーゼもまた、ウシ及びシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.pombe）のカゼインキナーゼ２などのカゼインをリン酸化すると報告されている。
【0170】
構成性プロモーターによって駆動されるκカゼインの発現：
κカゼインは、構成性ＴＥＦ１プロモーターから組換え産生された（図１０）。本発明によって、ｈＦＡＭ２０ｃがｐＴＥＦ１により駆動されるκカゼインと同時発現される場合には、さらにより良好な収量を示すと考えられる。
κカゼインは、構成性ＴＥＦ１プロモーターから組換え産生された（図１０）。本発明によって、ｈＦＡＭ２０ｃがｐＴＥＦ１により駆動されるκカゼインと同時発現される場合には、さらにより良好な収量を示すと考えられる。
【0171】
２．βカゼインの発現
２．１ 方法
２．１．１ 細胞培養及びホスファターゼによる処理
吸光度（８０nm）で化学組成の規定された培地中で、０時間目及び２４時間目に３％メタノールによって誘導された、２４℃及び２５０rpmで４８時間培養されたｙＲＢＴ２２７の上清を、アセトンで沈降させた。沈降したペレットを水に再度懸濁し、３つの試料に分割した。最初の試料は、さらに処理しなかった。λホスファターゼ緩衝液を第二の試料に加え、３７℃で３０分間放置した。λホスファターゼ緩衝液及びλホスファターゼを、第三の試料に加え、３７℃で３０分間放置した。その後、試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上にローディングし、その後、ポリクローナル抗βカゼイン抗体を用いて免疫検出した。
２．１ 方法
２．１．１ 細胞培養及びホスファターゼによる処理
吸光度（８０nm）で化学組成の規定された培地中で、０時間目及び２４時間目に３％メタノールによって誘導された、２４℃及び２５０rpmで４８時間培養されたｙＲＢＴ２２７の上清を、アセトンで沈降させた。沈降したペレットを水に再度懸濁し、３つの試料に分割した。最初の試料は、さらに処理しなかった。λホスファターゼ緩衝液を第二の試料に加え、３７℃で３０分間放置した。λホスファターゼ緩衝液及びλホスファターゼを、第三の試料に加え、３７℃で３０分間放置した。その後、試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上にローディングし、その後、ポリクローナル抗βカゼイン抗体を用いて免疫検出した。
【0172】
２．２ 結果
ｈＦＡＭ２０ｃを同時発現しているｙＲＢＴ２２７に由来するβカゼインに対するホスファターゼの処理は、免疫検出分析においてバンドシフトを示し（図１１）、このことは、βカゼインのリン酸化を示す。λホスファターゼによる処理前及び処理後のβカゼインを質量分析にかけ、実体を確認した（データは示されていない）。
ｈＦＡＭ２０ｃを同時発現しているｙＲＢＴ２２７に由来するβカゼインに対するホスファターゼの処理は、免疫検出分析においてバンドシフトを示し（図１１）、このことは、βカゼインのリン酸化を示す。λホスファターゼによる処理前及び処理後のβカゼインを質量分析にかけ、実体を確認した（データは示されていない）。
【0173】
３．本発明の株のリスト
【表9】
【0174】
４．本発明の例示的な配列
４．１ 本発明の例示的なキナーゼ
・ＣＳＮＫ２Ａ１＿ウシ（B. taurus）（カゼインキナーゼＩＩサブユニットα）配列番号４０
４．１ 本発明の例示的なキナーゼ
・ＣＳＮＫ２Ａ１＿ウシ（B. taurus）（カゼインキナーゼＩＩサブユニットα）配列番号４０
【化16】
【0175】
・ＣＳＫ２Ａ＿シゾサッカロマイセス・ポンベ（カゼインキナーゼＩＩ触媒サブユニットα）配列番号４１
【化17】
【0176】
・ＣＳＮＫ１Ａ１＿ウシ（B. taurus）（カゼインキナーゼＩ）、配列番号４２
【化18】
【0177】
４．２ 本発明の例示的なプロテアーゼ
・Ｙｐｓ１ｐ＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号４３
・Ｙｐｓ１ｐ＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号４３
【化19】
【0178】
・Ｙｐｓ１ｐ＿ピキア・パストリス、配列番号４４
【化20】
【0179】
・Ｙｐｓ７ｐ＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号４５
【化21】
【0180】
・Ｙｐｓ７ｐ＿ピキア・パストリス、配列番号４６
【化22】
【0181】
・ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号４７
【化23】
【0182】
・Ｂａｒ１ｐ＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号４８
【化24】
【0183】
・Ｐｒｂ１＿ピキア・パストリス、配列番号４９
【化25】
【0184】
・Ｐｒｂ１＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号５０
【化26】
【0185】
・Ｐｅｐ４＿ピキア・パストリス、配列番号５１
【化27】
【0186】
・Ｐｅｐ４＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号５２
【化28】
【0187】
４．２ 本発明の例示的な構成性又は誘導性プロモーター：
・ｐＴＥＦ１＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号５３
・ｐＴＥＦ１＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号５３
【化29】
【0188】
・ｐＰＧＫ１＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号５４
【化30】
【0189】
・ｐＧＡＰ１＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号５５
【化31】
【0190】
・ｐＬＡＣ４＿クルイベロマイセス・ラクティス、配列番号５６
【化32】
【0191】
結論：
以下の実験結果は、とりわけ少なくとも以下の点において、特許請求の範囲を支持する：
－プロテアーゼの欠失と、少なくとも１つのカゼインとのｈＦＡＭ２０ｃキナーゼの同時発現の組合せは、カゼインの分泌を改善する；及び／又は
－少なくとも１つのカゼインとのｈＦＡＭ２０ｃキナーゼの同時発現により、カゼインタンパク質、例えばκカゼインのリン酸化が起こり、これは、質量分析による少なくとも１つのリン酸化部位で同定され、並びに、βカゼインの酵素的脱リン酸化により、免疫検出時のバンドシフトがもたらされる。
以下の実験結果は、とりわけ少なくとも以下の点において、特許請求の範囲を支持する：
－プロテアーゼの欠失と、少なくとも１つのカゼインとのｈＦＡＭ２０ｃキナーゼの同時発現の組合せは、カゼインの分泌を改善する；及び／又は
－少なくとも１つのカゼインとのｈＦＡＭ２０ｃキナーゼの同時発現により、カゼインタンパク質、例えばκカゼインのリン酸化が起こり、これは、質量分析による少なくとも１つのリン酸化部位で同定され、並びに、βカゼインの酵素的脱リン酸化により、免疫検出時のバンドシフトがもたらされる。
【0192】
実施例５：κカゼインの発現
追加のプロテアーゼの欠失（群）がさらに、κカゼイン及びｈＦＡＭ２０ｃを同時発現している、KLLA0D01507gの欠失した親株ｙＲＢＴ２２５において、κカゼインの収量を改善し得るかどうかを探索するために、３つの異なるプロテアーゼ（Ｂａｒ１ｐ、Ｐｒｂ１ｐ及びＰｅｐ４ｐ）をそれぞれｙＲＢＴ２２５において欠失させた。
追加のプロテアーゼの欠失（群）がさらに、κカゼイン及びｈＦＡＭ２０ｃを同時発現している、KLLA0D01507gの欠失した親株ｙＲＢＴ２２５において、κカゼインの収量を改善し得るかどうかを探索するために、３つの異なるプロテアーゼ（Ｂａｒ１ｐ、Ｐｒｂ１ｐ及びＰｅｐ４ｐ）をそれぞれｙＲＢＴ２２５において欠失させた。
【0193】
１．１ 方法
Ｂａｒ１、Ｐｒｂ１及びＰｅｐ４をコードしている遺伝子を、それぞれ、標準的な手順を使用して、親ｙＲＢＴ２２５株において欠失させることにより、二重欠失株を作成した。カゼインを発現しているクルイベロマイセス・ラクティス株を標準的な手順に従って培養した。
Ｂａｒ１、Ｐｒｂ１及びＰｅｐ４をコードしている遺伝子を、それぞれ、標準的な手順を使用して、親ｙＲＢＴ２２５株において欠失させることにより、二重欠失株を作成した。カゼインを発現しているクルイベロマイセス・ラクティス株を標準的な手順に従って培養した。
【0194】
１．２ 結果
κカゼインの収量は、二重プロテアーゼ欠失株においてさらに改善された（図１２）。κカゼインの収量の定量が、二重プロテアーゼ欠失株ｙＲＢＴ３８７において実施された。親株と比較した収量の増加は１９％であった。
κカゼインの収量は、二重プロテアーゼ欠失株においてさらに改善された（図１２）。κカゼインの収量の定量が、二重プロテアーゼ欠失株ｙＲＢＴ３８７において実施された。親株と比較した収量の増加は１９％であった。
【0195】
２．本発明の株のリスト
【表10】
【0196】
３．例示的な誘導性プロモーター：
・ｐＬＡＣ４＿クルイベロマイセス・ラクティス（配列番号５６）
・ｐＬＡＣ４＿クルイベロマイセス・ラクティス（配列番号５６）
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-09-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのカゼインタンパク質を発現するように遺伝子工学操作された組換え宿主細胞であって、該カゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているか又はエピソームに維持され、異種分泌シグナル及びプロモーターに連結され、転写終結配列が続き、ここでの該組換え宿主細胞はさらにｉ）キナーゼ、好ましくは配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又は、ＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有している該キナーゼを同時発現するように工学操作され、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している；
好ましくは、ａ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、κ－カゼイン（カゼイン－κ）であり；及び／又は
ｂ）前記の少なくとも１つのカゼインタンパク質は、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列、又は配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、β－カゼイン（カゼイン－β）であり；
場合により、ここでの宿主細胞は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの異なるカゼインタンパク質を産生（例えば同時発現）するように遺伝子工学操作されている、組換え宿主細胞。
【請求項2】
ｉｉ）前記宿主細胞は、１つ以上のプロテアーゼ（例えばＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有するアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される）、好ましくは配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群より選択されるか又は配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、若しくは５２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している１つ以上の該プロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つの（例えば２つ又は３つの）プロテアーゼ欠損を含んでいる、自然に発生した又は遺伝子工学操作された該宿主細胞であり；さらに好ましくは、該プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼであり、最も好ましくは該アスパラギン酸プロテアーゼは、ｐｆａｍ０００２６アスパラギン酸プロテアーゼであり、さらに最も好ましくは該宿主細胞は、ＫＬＬＡ０Ｄ０１５０７ｇ遺伝子座（例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＣＳＦ３又は配列番号３９を有している）の欠失を含んでいるクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）宿主細胞である、請求項１記載の組換え宿主細胞。
【請求項3】
ポリヌクレオチドによってコードされるカゼインタンパク質が、配列番号１、２若しくは１７のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６のアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、配列番号９、１０若しくは１８のアミノ酸配列を有しているカゼインβ、又は配列番号１３、１４若しくは１９のアミノ酸配列を有しているカゼインκに対して、少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であり、好ましくはここでの宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、請求項１又は２記載の組換え宿主細胞。
【請求項4】
カゼインのセリン又はトレオニンをコードしているヌクレオチドの１つ以上が、グルタミン酸又はアスパラギン酸をコードしているヌクレオチドで置換されている、請求項１～３のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項5】
カゼインをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、又は２０～２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１～４のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項6】
前記異種分泌シグナルが、カゼイン分泌シグナルではない、請求項１～５のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項7】
前記宿主細胞が、生物、例えば細菌、酵母、又は糸状菌であり、場合により該生物は、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）及び枯草菌（Bacillus subtilis）からなる群より選択される細菌、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・バデンシス（Aspergillus vadensis）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）からなる群より選択される糸状菌、又は好ましくはクルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、ピキア（Pichia）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、テトラヒメナ（Tetrahymena）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、ブラストボトリ（Blastobotrys）属、カンジダ（Candida）属、ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、及びデバリオマイセス（Debaryomyces）属の群から選択される酵母細胞であり、好ましくは該宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyceslactis）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項１～６のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項8】
前記宿主細胞が酵母細胞であり、前記異種分泌シグナルが、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、配列番号２５若しくは２６を有しているａＭＦ、又は配列番号２７を有しているキラータンパク質、又は配列番号３１、３２、３３、３４、３５若しくは３６の配列を有している分泌シグナルからなる群より選択される、請求項７記載の組換え宿主細胞。
【請求項9】
前記宿主細胞が、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり、好ましくは該プロモーターが、配列番号２８又は配列番号３７又は配列番号５３、５４、５５若しくは５６である、請求項７又は８記載の組換え宿主細胞。
【請求項10】
前記キナーゼが、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、請求項１～９のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項11】
自然に発生又は遺伝子工学操作された前記宿主細胞は、配列番号３９、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１及び５２からなる群より選択される１つ以上のプロテアーゼの産生及び／又は機能を該宿主細胞において完全に又は部分的に欠損させる、少なくとも１つ（例えば２つ又は３つ）のプロテアーゼ欠損を含み、該プロテアーゼは、ＥＣ：３．４．２３．Ｘ酵素活性を有しているアスパラギン酸エンドペプチダーゼであり、ここでのＸは、１～５２からなる群より選択される、請求項１～１０のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項12】
ａ．前記宿主細胞が、クルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリスであり；ｂ．前記異種分泌シグナルが、配列番号２４を有しているｐＯｓｔ１－ａＭＦ、又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルであり；そして
ｃ．該宿主細胞は、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκを同時発現するように遺伝子工学操作されている、請求項１～１１のいずれか一項記載の組換え宿主生物。
【請求項13】
少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を製造するための請求項１～１１のいずれか一項記載の組換え宿主細胞の使用であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質は、κ－カゼイン及び／又はβ－カゼインである、使用。
【請求項14】
ａ．請求項１～１３のいずれか一項記載の組換え宿主細胞において、分泌シグナルに連結された、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３又は１４に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのカゼインタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを発現させる工程、ｂ．培養培地中への少なくとも１つのカゼインタンパク質の分泌を可能とするに十分な条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養する工程
を含み、場合により、ここでは：
ｃ．工程（ａ）のカゼインタンパク質は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３若しくは１４のいずれか１つに対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有している少なくとも１つの第二のカゼインタンパク質と同時発現している、及び、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているキナーゼと同時発現し、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、
少なくとも１つの関心対象のカゼインタンパク質を産生する方法であって、好ましくは前記の少なくとも１つの関心対象のタンパク質は、κ－カゼイン及び／又はβ－カゼインである、方法。
【請求項15】
ａ．配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、又は１４に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）のアミノ酸同一率を有している少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼをコードしているポリヌクレオチドを、宿主細胞ゲノムに組み込む工程、ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又はＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有しており、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有し；ここでのポリヌクレオチドは、配列番号２４を有している異種分泌シグナルｐＯｓｔ１－ａＭＦ又は配列番号２５、２６、２７、３１～３６からなる群より選択される分泌シグナルに；及び配列番号２８、３７、５３、５４、５５若しくは５６を有しているプロモーターに連結され、ここでのポリヌクレオチドは、配列番号１、２若しくは１７に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ１、配列番号５若しくは６に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインαｓ２、及び／又は、配列番号９、１０若しくは１８に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインβと組み合わせて、配列番号１３、１４若しくは１９に対して７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）同一であるアミノ酸配列を有しているカゼインκをコードしている、ｂ．少なくとも１つの（例えば少なくとも２つの）カゼインタンパク質及びキナーゼを該宿主細胞において同時発現させる工程、ここでの該キナーゼは、配列番号２３、４０、４１若しくは４２に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、及び／又はＥＣ：２．７．１１．１セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有しており、好ましくは該キナーゼは、配列番号２３（ｈＦＡＭ２０ｃキナーゼ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有しているか、又は配列番号４２（ウシカゼインキナーゼＩ）に対して少なくとも７０％（例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）の配列同一率を有している、そして
ｃ．カゼインタンパク質の分泌を可能とする培養培地中で該宿主細胞を培養する工程を含む、
組換えクルイベロマイセス・ラクティス又はピキア・パストリス宿主細胞からのカゼインの分泌を増加させる方法。
【国際調査報告】