特表 2024-527262 二重特異性抗ＭｅｒＴＫ及び抗ＰＤＬ１抗体ならびにその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-24

(54)【発明の名称】二重特異性抗ＭｅｒＴＫ及び抗ＰＤＬ１抗体ならびにその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240717BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240717BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20240717BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/18

C12N15/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 P

A61K39/395 U

A61P35/00

A61P1/00

A61P1/16

A61P15/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577539

(86)(22)【出願日】2022-06-15

(85)【翻訳文提出日】2024-02-06

(86)【国際出願番号】 US2022033632

(87)【国際公開番号】W WO2022266223

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/211,437

(32)【優先日】2021-06-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517041235

【氏名又は名称】アレクトル エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】リー スン－ジュ

(72)【発明者】

【氏名】ニヴィチャニョン タランスリ

(72)【発明者】

【氏名】ホー ウェイ－シェン

(72)【発明者】

【氏名】リー ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ロール マリナ ケー．

(72)【発明者】

【氏名】リャン スペンサー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA92Y

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA21

4C085BB11

4C085BB22

4C085BB33

4C085BB36

4C085BB37

4C085BB41

4C085BB43

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、概して、ＭｅｒＴＫポリペプチド（例えば、哺乳類ＭｅｒＴＫまたはヒトＭｅｒＴＫ）及びＰＤＬ１ポリペプチド（例えば、哺乳類ＰＤＬ１ポリペプチドまたはヒトＰＤＬ１ポリペプチド）に特異的に結合する二重特異性抗体、例えばモノクローナル抗体を含む、組成物、ならびにそれを必要とする個体の治療におけるそのような組成物の使用に関する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＭｅｒチロシンキナーゼ（ＭｅｒＴＫ）及びプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＭｅｒＴｋに結合する第１の抗原結合ドメイン及びＰＤＬ１に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、前記二重特異性抗体。

【請求項2】

前記第１の抗原結合ドメインが、ＭｅｒＴＫタンパク質のＩｇ１ドメインに結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体の、ＭｅｒＴＫへの結合を競合的に阻害する、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と同じＭｅｒＴＫエピトープに結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

前記第１の抗原結合ドメインが、
配列番号９のアミノ酸３１～３５を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号９のアミノ酸５０～６６を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号９のアミノ酸９９～１０９を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号１０のアミノ酸２４～３４を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸５０～５６を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１０のアミノ酸８９～９７を含むＨＶＲ－Ｌ３
、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

前記第１の抗原結合ドメインが、１６．２抗体のＨＶＲを含み、任意選択で、前記ＨＶＲが、Ｋａｂａｔ定義のＨＶＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義のＨＶＲ、ＡｂＭ定義のＨＶＲ、またはｃｏｎｔａｃｔ定義のＨＶＲである、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項9】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び／または配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項10】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と同じＭｅｒＴＫエピトープに結合する、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体の、ＭｅｒＴＫへの結合を競合的に阻害する、請求項１、２、及び１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１３のアミノ酸３１～３５を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸５０～６６を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号１３のアミノ酸９９～１０８を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号１４のアミノ酸２４～３４を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸５０～５６を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１４のアミノ酸８９～９７を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、請求項１、２、１０、及び１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項13】

前記第１の抗原結合ドメインが、１３．１１抗体のＨＶＲを含み、任意選択で、前記ＨＶＲが、Ｋａｂａｔ定義のＨＶＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義のＨＶＲ、ＡｂＭ定義のＨＶＲ、またはｃｏｎｔａｃｔ定義のＨＶＲである、請求項１、２、１０、及び１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項14】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１、２、及び１０～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項15】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１、２、及び１０～１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項16】

前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１、２、及び１０～１５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と同じＰＤＬ１エピトープに結合する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項18】

前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体の、ＰＤＬ１への結合を競合的に阻害する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項19】

前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号５２のアミノ酸３１～３５を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５２のアミノ酸５０～６６を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５２のアミノ酸９９～１０７を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号５３のアミノ酸２４～３４を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５３のアミノ酸５０～５６を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号５３のアミノ酸８９～９７を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項20】

前記第２の抗原結合ドメインが、アテゾリズマブ抗体のＨＶＲを含み、任意選択で、前記ＨＶＲが、Ｋａｂａｔ定義のＨＶＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義のＨＶＲ、ＡｂＭ定義のＨＶＲ、またはｃｏｎｔａｃｔ定義のＨＶＲである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項21】

前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項22】

前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項23】

前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項24】

ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラス、またはＩｇＡクラスのものである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項25】

ＩｇＧクラスのものであり、任意選択で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する、請求項２４に記載の二重特異性抗体。

【請求項26】

ＩｇＧ１抗体である、請求項２５に記載の二重特異性抗体。

【請求項27】

ＩｇＧ４抗体である、請求項２５に記載の二重特異性抗体。

【請求項28】

（ｉ）異なる抗原結合ドメインを含む２つのアームを有するか、（ｉｉ）２つの異なるエピトープに対する特異性を有する一本鎖抗体であるか、（ｉｉｉ）化学的に結合された二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメントであるか、（ｉｖ）標的抗原のそれぞれに対する２つの結合部位を有する４価の二重特異性抗体を生じさせる２つの一本鎖ダイアボディの融合体であるか、（ｖ）多価分子を生じさせるダイアボディとｓｃＦｖの組み合わせであるか、（ｖｉ）ヒトＦａｂアームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含むか、または（ｖｉｉ）ダイアボディである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項29】

カッパ－ラムダボディ、二重親和性リターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、ノブ・イン・ホール抗体、鎖交換操作ドメインボディ（ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ））、またはＤｕｏＢｏｄｙである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項30】

第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＦｃ領域を含み、ここで、
（ａ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｙ４０７Ｔを含む、
（ｂ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｗ、及びＹ４０７Ｖを含む、
（ｃ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｗ、及びＹ４０７Ｖを含む、
（ｄ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ、及びＳ３５４Ｃを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含む、
（ｅ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗを含む、
（ｆ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｋ３６０Ｄ、Ｄ３９９Ｍ、及びＹ４０７Ａを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３６６Ｖ、及びＫ４０９Ｖを含む、
（ｇ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｋ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む、
（ｈ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔを含む、
（ｉ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｌ３６０Ｅ、Ｋ４０９Ｗ、及びＹ３４９Ｃを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、及びＳ３５４Ｃを含む、または
（ｊ）前記第１のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｋ３７０Ｅ及びＫ４０９Ｗを含み、前記第２のポリペプチドが、アミノ酸置換Ｅ３５７Ｎ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔを含み、
ここで、前記置換がＥＵ付番に従う、
請求項１～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項31】

ノブ変異及びホール変異を含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項32】

前記ノブ変異が、ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含む、請求項３１に記載の二重特異性抗体。

【請求項33】

前記ホール変異が、ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む、請求項３１または３２に記載の二重特異性抗体。

【請求項34】

ヘテロ二量体化を促進するアミノ酸置換、付加、または欠失を含むＦｃ領域を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項35】

ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、請求項１～２５及び２７～３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項36】

ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項37】

ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｎ３２５Ｓ及びＬ３２８Ｆ（ＮＳＬＦ）を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項38】

配列番号１７のアミノ酸１～４４９または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項39】

配列番号１８のアミノ酸１～４４９または配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、２９、及び３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項40】

配列番号１９のアミノ酸１～４４９または配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、２９、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項41】

配列番号２０のアミノ酸１～４４６または配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２５、２７、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項42】

配列番号３２のアミノ酸１～４５３または配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、及び２８～３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項43】

配列番号３３のアミノ酸１～４４９または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８～３４、及び３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項44】

配列番号３４のアミノ酸１～４４９または配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８～３４、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項45】

配列番号３５のアミノ酸１～４４６または配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２５、及び２７～３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項46】

配列番号３６のアミノ酸１～４４６または配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～９、１７～２５、及び２７～３５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項47】

配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、２９、３６、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項48】

配列番号２２のアミノ酸１～４４８または配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項49】

配列番号２３のアミノ酸１～４４８または配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、２９、及び３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項50】

配列番号２４のアミノ酸１～４４８または配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、２９、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項51】

配列番号２５のアミノ酸１～４４５または配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２５、及び２７～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項52】

配列番号３７のアミノ酸１～４４８または配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、及び２８～３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項53】

配列番号３８のアミノ酸１～４４８または配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８～３４、及び３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項54】

配列番号３９のアミノ酸１～４４８または配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８～３４、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項55】

配列番号４０のアミノ酸１～４４５または配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２５、及び２７～３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項56】

配列番号４１のアミノ酸１～４４５または配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、２、１０～２５、及び２７～３５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項57】

配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、２９、３６、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項58】

配列番号２７のアミノ酸１～４４７または配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項59】

配列番号２８のアミノ酸１～４４７または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２６、２８、２９、及び３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項60】

配列番号２９のアミノ酸１～４４７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２６、２８、２９、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項61】

配列番号３０のアミノ酸１～４４４または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２５及び２７～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項62】

配列番号４２のアミノ酸１～４４７または配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２６及び２８～３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項63】

配列番号４３のアミノ酸１～４４７または配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２６、２８～３４、及び３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項64】

配列番号４４のアミノ酸１～４４７または配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２６、２８～３４、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項65】

配列番号４５のアミノ酸１～４４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２５及び２７～３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項66】

配列番号４６のアミノ酸１～４４４または配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１～２５及び２７～３５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項67】

配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～２６、２８、２９、３６、及び３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項68】

配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～２６、２８～３４、３６～３７、４７、５７、及び６７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項69】

配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～２６、２８～３４、３６～３７、４７、５７、及び６７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項70】

配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～２６、２８～３４、３６～３７、４７、５７、及び６７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項71】

配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～２６、２８～３４、３６～３７、４７、５７、及び６７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項72】

配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～２６、２８～３４、３６～３７、４７、５７、及び６７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項73】

配列番号１７のアミノ酸１～４４９または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２７のアミノ酸１～４４７または配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項74】

配列番号１８のアミノ酸１～４４９または配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２８のアミノ酸１～４４７または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項75】

配列番号１９のアミノ酸１～４４９または配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２９のアミノ酸１～４４７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項76】

配列番号２０のアミノ酸１～４４６または配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号３０のアミノ酸１～４４４または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２５、及び２７～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項77】

配列番号２２のアミノ酸１～４４８または配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２７のアミノ酸１～４４７または配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項78】

配列番号２３のアミノ酸１～４４８または配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２８のアミノ酸１～４４７または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項79】

配列番号２４のアミノ酸１～４４８または配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２９のアミノ酸１～４４７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項80】

配列番号２５のアミノ酸１～４４５または配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号３０のアミノ酸１～４４４または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２５、及び２７～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項81】

配列番号３２のアミノ酸１～４５３または配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４２のアミノ酸１～４４７または配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項82】

配列番号３３のアミノ酸１～４４９または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４３のアミノ酸１～４４７または配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項83】

配列番号３４のアミノ酸１～４４９または配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４４のアミノ酸１～４４７または配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項84】

配列番号３５のアミノ酸１～４４６または配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４５のアミノ酸１～４４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２５、及び２７～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項85】

配列番号３６のアミノ酸１～４４６または配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４６のアミノ酸１～４４４または配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９、１７～２５、及び２７～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項86】

配列番号３７のアミノ酸１～４４８または配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４２のアミノ酸１～４４７または配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項87】

配列番号３８のアミノ酸１～４４８または配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４３のアミノ酸１～４４７または配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項88】

配列番号３９のアミノ酸１～４４８または配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４４のアミノ酸１～４４７または配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項89】

配列番号４０のアミノ酸１～４４５または配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４５のアミノ酸１～４４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２５、及び２７～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項90】

配列番号４１のアミノ酸１～４４５または配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４６のアミノ酸１～４４４または配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、２、１０～２５、及び２７～２９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項91】

ＭｅｒＴＫ及びＰＤＬ１に同時に結合することができる、請求項１～９０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項92】

食細胞によるエフェロサイトーシスを低減する、請求項１～９１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項93】

約４ｎＭ～約１６ｎＭのＩＣ５０値でエフェロサイトーシスを低減する、請求項９２に記載の二重特異性抗体。

【請求項94】

約４ｎＭ～約５ｎＭ、または約１５ｎＭ～約１６ｎＭのＩＣ５０値でエフェロサイトーシスを低減する、請求項９３に記載の二重特異性抗体。

【請求項95】

前記食細胞が、マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、または樹状細胞である、請求項９３または４９に記載の二重特異性抗体。

【請求項96】

前記食細胞がマクロファージである、請求項９５に記載の二重特異性抗体。

【請求項97】

腫瘍の成長を抑制する、請求項１～９６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項98】

ＭｅｒＴＫへのＰｒｏＳの結合を低減する、請求項１～９７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項99】

ＭｅｒＴＫへのＧａｓ６の結合を低減する、請求項１～９８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項100】

ＭｅｒＴＫへのＰｒｏＳの結合を低減し、かつＭｅｒＴＫへのＧａｓ６の結合を低減する、請求項１～９９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項101】

約２ｎＭ～約３０ｎＭの結合親和性でヒトＭｅｒＴＫに結合し、任意選択で、約２ｎＭまたは約３０ｎＭの結合親和性でヒトＭｅｒＴＫに結合する、請求項１～１００のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項102】

カニクイザルＭｅｒＴｋにも結合する、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項103】

約２ｎＭ～約３０ｎＭの結合親和性でカニクイザルＭｅｒＴＫに結合し、任意選択で、約２ｎＭまたは約３０ｎＭの結合親和性でカニクイザルＭｅｒＴＫに結合する、請求項１０２に記載の二重特異性抗体。

【請求項104】

マウスＭｅｒＴＫにも結合する、請求項１～１０３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項105】

約４０ｎＭの結合親和性でマウスＭｅｒＴＫに結合する、請求項１０４に記載の二重特異性抗体。

【請求項106】

マウスＭｅｒＴＫに結合しない、請求項１～１０３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項107】

ＡＫＴのＧａｓ６媒介リン酸化を低減する、請求項１～１０６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項108】

約９ｎＭ～約１３ｎＭのＩＣ５０値でＡＫＴのＧａｓ６媒介リン酸化を低減し、任意選択で、約９ｎＭまたは約１３ｎＭのＩＣ５０値でＡＫＴのＧａｓ６媒介リン酸化を低減する、請求項１～１０７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項109】

マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、多価抗体、コンジュゲートされた抗体、またはキメラ抗体である、請求項１～１０８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項110】

請求項１～１０９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体のヒト化形態。

【請求項111】

組換え抗体である、請求項１～１１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項112】

単離された抗体である、請求項１～１１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項113】

請求項１～１１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする核酸配列を含む、単離された核酸。

【請求項114】

請求項１１３に記載の核酸を含むベクター。

【請求項115】

請求項１１３に記載の核酸または請求項１１４に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。

【請求項116】

（ｉ）請求項１～１１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の前記第１の抗原結合ドメインの前記可変重鎖をコードする核酸配列を含む核酸、（ｉｉ）前記二重特異性抗体の前記第１の抗原結合ドメインの前記可変軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸、（ｉｉｉ）前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合ドメインの前記可変重鎖をコードする核酸配列を含む核酸、及び（ｉｖ）前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合ドメインの前記可変軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸
を含む、単離された宿主細胞。

【請求項117】

（ｉ）請求項１～１１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の前記第１の抗原結合ドメインの前記可変重鎖を含む重鎖をコードする核酸配列を含む核酸、（ｉｉ）前記二重特異性抗体の前記第１の抗原結合ドメインの前記可変軽鎖を含む軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸、（ｉｉｉ）前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合ドメインの前記可変重鎖を含む重鎖をコードする核酸配列を含む核酸、及び（ｉｖ）前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合ドメインの前記可変軽鎖を含む軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸
を含む、単離された宿主細胞。

【請求項118】

ヒトＭｅｒＴＫ及びＰＤＬ１に結合する二重特異性抗体を産生する方法であって、前記二重特異性抗体が産生されるように、請求項１１５～１１７のいずれか１項に記載の細胞を培養することを含む、前記方法。

【請求項119】

前記細胞によって産生された前記二重特異性抗体を回収することをさらに含む、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

請求項１１８または１１９に記載の方法によって産生される二重特異性抗体。

【請求項121】

請求項１～１１２または１２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項122】

個体におけるがんを治療する方法であって、治療有効量の請求項１～１１２もしくは１２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１２１に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、前記方法。

【請求項123】

前記がんが、大腸癌、卵巣癌、肝臓癌、または子宮体癌である、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記投与が、前記個体において網膜病理を生じさせない、請求項１２２または１２３に記載の方法。

【請求項125】

試料を、請求項１～１１２または１２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と接触させることを含む、前記試料中のＭｅｒＴＫを検出する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１６日に出願された米国仮出願第６３／２１１，４３７号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：４５０３＿０２０ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：１６３，９２８バイト、及び作成日：２０２２年６月１４日）。

【0003】

本開示の分野
本開示は、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ抗体及び抗ＰＤＬ１抗体、ならびにそのような抗体の使用（例えば、治療的使用）に関する。

【背景技術】

【0004】

Ｍｅｒチロシンキナーゼ（ＭｅｒＴＫ）は、受容体チロシンキナーゼのＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、及びＭｅｒＴＫ）ファミリーに属する。ＭｅｒＴＫは、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様及び２つのフィブロネクチン（ＦＮ）ＩＩＩ型モチーフを有する細胞外ドメインを有する１回膜貫通型１型膜貫通タンパク質である（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１４：７６９－７８５（非特許文献1）；Ｒｏｔｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１５，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３３：３５５－３９１（非特許文献2））。

【0005】

プロテインＳ（ＰｒｏＳまたはＰｒｏＳ１）、Ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ６（Ｇａｓ６）、Ｔｕｂｂｙ、Ｔｕｂｂｙ様タンパク質１（ＴＵＬＰ－１）、及びガレクチン３を含む、ＭｅｒＴＫのいくつかのリガンドが同定されている。ＭｅｒＴＫは、リガンド結合とその後の活性化を介して細胞外空間からのシグナルを伝達し、ＭｅｒＴＫチロシン自己リン酸化（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９：５２７５－５２８０（非特許文献3）；Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，１０：１７６３－１７７３（非特許文献4））ならびにその後のＥＲＫ及びＡＫＴ関連シグナル伝達を生じさせる。

【0006】

ＭｅｒＴＫは、細胞の生存、遊走、及び分化を含む様々な生理学的プロセスを調節する。ＭｅｒＴＫリガンドであるＰｒｏＳ及びＧａｓ６は、細胞の生存、侵入、遊走、化学耐性、及び転移などのいくつかの発がんプロセスに寄与し、それらの発現は多くの場合、不十分な臨床転帰と相関する。さらに、ＭｅｒＴＫは多くのがんに関係しており、ＭｅｒＴＫまたはＰｒｏＳの欠損は抗腫瘍効果に関連している（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２３：３２３１－３２４２（非特許文献5）；Ｕｂｉｌ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２８：２３５６－２３６９（非特許文献6）；Ｈｕｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｃａｎｃｅｒｓ，８：１０１（非特許文献7））。しかしながら、ＭｅｒＴＫは、網膜色素上皮細胞にも発現しており、眼の脱落した視細胞外節を除去する上で重要な役割を果たし、ＭｅｒＴＫの機能喪失変異は、網膜色素変性症及び他の網膜ジストロフィーを引き起こす（例えば、Ａｌ－ｋｈｅｒｓａｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１７，２５５：１６１３－１６１９（非特許文献8）；Ｌｏｒａｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，８：１１３１２（非特許文献9）；Ａｕｄｏ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，２０１８，３９：９９７－９１３（非特許文献10）；ＬａＶａｉｌ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，２０１６，８５４：４８７－４９３（非特許文献11）を参照のこと）。

【0007】

ＭｅｒＴＫは、食細胞によるアポトーシス細胞の食作用（エフェロサイトーシス）において重要な役割を果たし、Ｍ２様マクロファージ分極、抗炎症性サイトカインの産生、及び免疫抑制性腫瘍微小環境の促進を引き起こす。食細胞によるエフェロサイトーシスの減少により、Ｍ１様マクロファージの分極が増加し、炎症誘発性サイトカイン及び免疫活性環境の産生が生じる。エフェロサイトーシスを調節することにより、抗腫瘍活性に有効な手段を提供することができる。

【0008】

抗ＭｅｒＴＫ抗体は、以前に、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０２０／２１４９９５号（特許文献1）、第ＷＯ２０２０／０７６７９９号（特許文献2）、第ＷＯ２０２０／１０６４６１号（特許文献3）、第ＷＯ２０２０／１７６４９７号（特許文献4）、第ＷＯ２０１９／０８４３０７号（特許文献5）、第ＷＯ２０１９／００５７５６号（特許文献6）、第ＷＯ２０１６／１０６２２１号（特許文献7）、第ＷＯ２０１６／００１８３０号（特許文献8）、第ＷＯ２００９／０６２１１２号（特許文献9）、及び第ＷＯ２００６／０５８２０２号（特許文献10）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６４６４０（ＷＯ２０２１／１１９５０８）号（特許文献11）、ならびに例えばＤａｙｏｕｂ ａｎｄ Ｂｒｅｋｋｅｎ，２０２０，Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１８：２９（非特許文献12）；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，２０２０，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５２：１－１７（非特許文献13）；Ｋｅｄａｇｅ ｅｔ ａｌ，２０２０，ＭＡＢＳ，１２：ｅ１６８５８３２（非特許文献14）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，５：１０４３４－１０４４５（非特許文献15）に記載されている。

【0009】

がんなどの疾患の治療に有効な新規治療用抗ＭｅｒＴＫ抗体が必要とされている。

【0010】

特許出願及び刊行物を含む本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】第ＷＯ２０２０／２１４９９５号

【特許文献2】第ＷＯ２０２０／０７６７９９号

【特許文献3】第ＷＯ２０２０／１０６４６１号

【特許文献4】第ＷＯ２０２０／１７６４９７号

【特許文献5】第ＷＯ２０１９／０８４３０７号

【特許文献6】第ＷＯ２０１９／００５７５６号

【特許文献7】第ＷＯ２０１６／１０６２２１号

【特許文献8】第ＷＯ２０１６／００１８３０号

【特許文献9】第ＷＯ２００９／０６２１１２号

【特許文献10】第ＷＯ２００６／０５８２０２号

【特許文献11】第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６４６４０（ＷＯ２０２１／１１９５０８）号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１４：７６９－７８５

【非特許文献2】Ｒｏｔｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１５，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３３：３５５－３９１

【非特許文献3】Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９：５２７５－５２８０

【非特許文献4】Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，１０：１７６３－１７７３

【非特許文献5】Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２３：３２３１－３２４２

【非特許文献6】Ｕｂｉｌ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２８：２３５６－２３６９

【非特許文献7】Ｈｕｅｙ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｃａｎｃｅｒｓ，８：１０１

【非特許文献8】Ａｌ－ｋｈｅｒｓａｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１７，２５５：１６１３－１６１９

【非特許文献9】Ｌｏｒａｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，８：１１３１２

【非特許文献10】Ａｕｄｏ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，２０１８，３９：９９７－９１３

【非特許文献11】ＬａＶａｉｌ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，２０１６，８５４：４８７－４９３

【非特許文献12】Ｄａｙｏｕｂ ａｎｄ Ｂｒｅｋｋｅｎ，２０２０，Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１８：２９

【非特許文献13】Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，２０２０，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５２：１－１７

【非特許文献14】Ｋｅｄａｇｅ ｅｔ ａｌ，２０２０，ＭＡＢＳ，１２：ｅ１６８５８３２

【非特許文献15】Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，５：１０４３４－１０４４５

【発明の概要】

【0013】

国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６４６４０号（ＷＯ２０２１／１１９５０８）では、マウス腫瘍モデルにおいて、抗ＭｅｒＴＫ抗体と抗ＰＤＬ１抗体の併用投与により、抗体単独の投与と比較して腫瘍体積がより大幅に減少したことが開示されたが、これは、併用療法によってより良好な効力が得られることを示している。しかしながら、２つの別個の抗体の投与は、臨床医及び患者の双方に負担を与える。本開示は、抗腫瘍免疫を媒介する際の効力を向上させた二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体を提供することにより、このニーズを満たす。

【0014】

本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、一部、または全部を組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。本開示のこれらの及び他の態様は、当業者に明らかになるであろう。本開示のこれらの及び他の態様を、以下の詳細な記載によってさらに説明する。

【0015】

いくつかの態様では、本明細書において、ヒトＭｅｒチロシンキナーゼ（ＭｅｒＴＫ）及びプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）に結合する二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、ヒトＭｅｒＴｋに結合する第１の抗原結合ドメイン及びＰＤＬ１に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。

【0016】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、ＭｅｒＴＫタンパク質のＩｇ１ドメインに結合する。

【0017】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体の、ＭｅｒＴＫへの結合を競合的に阻害する。

【0018】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と同じＭｅｒＴＫエピトープへ結合する。

【0019】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、
配列番号９のアミノ酸３１～３５を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号９のアミノ酸５０～６６を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号９のアミノ酸９９～１０９を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号１０のアミノ酸２４～３４を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸５０～５６を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１０のアミノ酸８９～９７を含むＨＶＲ－Ｌ３ 。

【0020】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、１６．２抗体のＨＶＲを含み、任意選択で、ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ定義のＨＶＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義のＨＶＲ、ＡｂＭ定義のＨＶＲ、またはｃｏｎｔａｃｔ定義のＨＶＲである。

【0021】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。

【0022】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

【0023】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び／または配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

【0024】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と同じＭｅｒＴＫエピトープへ結合する。

【0025】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体の、ＭｅｒＴＫへの結合を競合的に阻害する。

【0026】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１３のアミノ酸３１～３５を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸５０～６６を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号１３のアミノ酸９９～１０８を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号１４のアミノ酸２４～３４を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸５０～５６を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１４のアミノ酸８９～９７を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。

【0027】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、１３．１１抗体のＨＶＲを含み、任意選択で、ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ定義のＨＶＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義のＨＶＲ、ＡｂＭ定義のＨＶＲ、またはｃｏｎｔａｃｔ定義のＨＶＲである。

【0028】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。

【0029】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

【0030】

いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

【0031】

いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体と同じＰＤＬ１エピトープへ結合する。

【0032】

いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗体の、ＰＤＬ１への結合を競合的に阻害する。

【0033】

いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５２のアミノ酸３１～３５を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５２のアミノ酸５０～６６を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５２のアミノ酸９９～１０７を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号５３のアミノ酸２４～３４を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５３のアミノ酸５０～５６を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号５３のアミノ酸８９～９７を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。

【0034】

いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、アテゾリズマブ抗体のＨＶＲを含み、任意選択で、ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ定義のＨＶＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ定義のＨＶＲ、ＡｂＭ定義のＨＶＲ、またはｃｏｎｔａｃｔ定義のＨＶＲである。

【0035】

いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。

【0036】

いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

【0037】

いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。

【0038】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラス、またはＩｇＡクラスのものである。

【0039】

いくつかの態様では、二重特異性抗体はＩｇＧクラスのものであり、任意選択で、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。

【0040】

いくつかの態様では、二重特異性抗体はＩｇＧ１抗体である。

【0041】

いくつかの態様では、二重特異性抗体はＩｇＧ４抗体である。

【0042】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、（ｉ）異なる抗原結合ドメインを含む２つのアームを有するか、（ｉｉ）２つの異なるエピトープに対する特異性を有する一本鎖抗体であるか、（ｉｉｉ）化学的に結合された二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメントであるか、（ｉｖ）標的抗原のそれぞれに対する２つの結合部位を有する４価の二重特異性抗体を生じさせる２つの一本鎖ダイアボディの融合体であるか、（ｖ）多価分子を生じさせるダイアボディとｓｃＦｖの組み合わせであるか、（ｖｉ）ヒトＦａｂアームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含むか、または（ｖｉｉ）ダイアボディである。

【0043】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、カッパ－ラムダボディ、二重親和性リターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、ノブ・イン・ホール抗体、鎖交換操作ドメインボディ（ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ））、またはＤｕｏＢｏｄｙである。

【0044】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むＦｃ領域を含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ｔを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｗ、及びＹ４０７Ｖを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ、及びＳ３５４Ｃを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｋ３６０Ｄ、Ｄ３９９Ｍ、及びＹ４０７Ａを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３６６Ｖ、及びＫ４０９Ｖを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｋ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｌ３６０Ｅ、Ｋ４０９Ｗ、及びＹ３４９Ｃを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、及びＳ３５４Ｃを含む。いくつかの態様では、第１のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｋ３７０Ｅ及びＫ４０９Ｗを含み、第２のポリペプチドは、アミノ酸置換Ｅ３５７Ｎ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む。いくつかの態様では、置換は、ＥＵ付番に従う。

【0045】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ノブ変異及びホール変異を含む。

【0046】

いくつかの態様では、ノブ変異は、ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含む。

【0047】

いくつかの態様では、ホール変異は、ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。

【0048】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ヘテロ二量体化を促進するアミノ酸の置換、付加、または欠失を含むＦｃ領域を含む。

【0049】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。

【0050】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）を含む。

【0051】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｎ３２５Ｓ及びＬ３２８Ｆ（ＮＳＬＦ）を含む。

【0052】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号１７のアミノ酸１～４４９または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0053】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号１８のアミノ酸１～４４９または配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0054】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号１９のアミノ酸１～４４９または配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0055】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２０のアミノ酸１～４４６または配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0056】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３２のアミノ酸１～４５３または配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0057】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３３のアミノ酸１～４４９または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0058】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３４のアミノ酸１～４４９または配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0059】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３５のアミノ酸１～４４６または配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0060】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３６のアミノ酸１～４４６または配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0061】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0062】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２２のアミノ酸１～４４８または配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0063】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸１～４４８または配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0064】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２４のアミノ酸１～４４８または配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0065】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２５のアミノ酸１～４４５または配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0066】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３７のアミノ酸１～４４８または配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0067】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３８のアミノ酸１～４４８または配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0068】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３９のアミノ酸１～４４８または配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0069】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４０のアミノ酸１～４４５または配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0070】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４１のアミノ酸１～４４５または配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0071】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0072】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２７のアミノ酸１～４４７または配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0073】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２８のアミノ酸１～４４７または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0074】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２９のアミノ酸１～４４７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0075】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３０のアミノ酸１～４４４または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0076】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４２のアミノ酸１～４４７または配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0077】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４３のアミノ酸１～４４７または配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0078】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４４のアミノ酸１～４４７または配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0079】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４５のアミノ酸１～４４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0080】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４６のアミノ酸１～４４４または配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0081】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0082】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。

【0083】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。

【0084】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。

【0085】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。

【0086】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。

【0087】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号１７のアミノ酸１～４４９または配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２７のアミノ酸１～４４７または配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0088】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号１８のアミノ酸１～４４９または配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２８のアミノ酸１～４４７または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0089】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号１９のアミノ酸１～４４９または配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２９のアミノ酸１～４４７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0090】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２０のアミノ酸１～４４６または配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号３０のアミノ酸１～４４４または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0091】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２２のアミノ酸１～４４８または配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２７のアミノ酸１～４４７または配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0092】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２３のアミノ酸１～４４８または配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２８のアミノ酸１～４４７または配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0093】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２４のアミノ酸１～４４８または配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号２９のアミノ酸１～４４７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0094】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号２５のアミノ酸１～４４５または配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号３０のアミノ酸１～４４４または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0095】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３２のアミノ酸１～４５３または配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４２のアミノ酸１～４４７または配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0096】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３３のアミノ酸１～４４９または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４３のアミノ酸１～４４７または配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0097】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３４のアミノ酸１～４４９または配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４４のアミノ酸１～４４７または配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0098】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３５のアミノ酸１～４４６または配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４５のアミノ酸１～４４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0099】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３６のアミノ酸１～４４６または配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４６のアミノ酸１～４４４または配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0100】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３７のアミノ酸１～４４８または配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４２のアミノ酸１～４４７または配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0101】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３８のアミノ酸１～４４８または配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４３のアミノ酸１～４４７または配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0102】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号３９のアミノ酸１～４４８または配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４４のアミノ酸１～４４７または配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0103】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４０のアミノ酸１～４４５または配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４５のアミノ酸１～４４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0104】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、配列番号４１のアミノ酸１～４４５または配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号４６のアミノ酸１～４４４または配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0105】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＭｅｒＴＫ及びＰＤＬ１に同時に結合することができる。

【0106】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、食細胞によるエフェロサイトーシスを減少させる。

【0107】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、約４ｎＭ～約１６ｎＭのＩＣ５０値でエフェロサイトーシスを減少させる。

【0108】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、約４ｎＭ～約５ｎＭ、または約１５ｎＭ～約１６ｎＭのＩＣ５０値でエフェロサイトーシスを減少させる。

【0109】

いくつかの態様では、食細胞は、マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、または樹状細胞である。

【0110】

いくつかの態様では、食細胞はマクロファージである。

【0111】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、腫瘍の成長を抑制する。

【0112】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＭｅｒＴＫへのＰｒｏＳの結合を減少させる。

【0113】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＭｅｒＴＫへのＧａｓ６の結合を減少させる。

【0114】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＭｅｒＴＫへのＰｒｏＳの結合を減少させ、ＭｅｒＴＫへのＧａｓ６の結合を減少させる。

【0115】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、約２ｎＭ～約３０ｎＭの結合親和性でヒトＭｅｒＴＫに結合し、任意選択で、二重特異性抗体は、約２ｎＭまたは約３０ｎＭの結合親和性でヒトＭｅｒＴＫに結合する。

【0116】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、カニクイザルＭｅｒＴｋにも結合する。

【0117】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、約２ｎＭ～約３０ｎＭの結合親和性でカニクイザルＭｅｒＴＫに結合し、任意選択で、二重特異性抗体は、約２ｎＭまたは約３０ｎＭの結合親和性でカニクイザルＭｅｒＴＫに結合する。

【0118】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、マウスＭｅｒＴＫにも結合する。

【0119】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、約４０ｎＭの結合親和性でマウスＭｅｒＴＫに結合する。

【0120】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、マウスＭｅｒＴＫに結合しない。

【0121】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、ＡＫＴのＧａｓ６媒介リン酸化を減少させる。

【0122】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、約９ｎＭ～約１３ｎＭのＩＣ５０値でＡＫＴのＧａｓ６媒介リン酸化を減少させ、任意選択で、二重特異性抗体は、約９ｎＭまたは約１３ｎＭのＩＣ５０値でＡＫＴのＧａｓ６媒介リン酸化を減少させる。

【0123】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、多価抗体、コンジュゲートされた抗体、またはキメラ抗体である。

【0124】

いくつかの態様では、本明細書において、本明細書に記載の二重特異性抗体のいずれかのヒト化形態を提供する。

【0125】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は組換え抗体である。

【0126】

いくつかの態様では、二重特異性抗体は、単離された抗体である。

【0127】

いくつかの態様では、本明細書において、本明細書に記載の二重特異性抗体のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。いくつかの態様では、本明細書において、核酸を含むベクターを提供する。

【0128】

いくつかの態様では、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載のベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。

【0129】

いくつかの態様では、単離された宿主細胞は、（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体のいずれかの第１の抗原結合ドメインの可変重鎖をコードする核酸配列を含む核酸、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合ドメインの可変軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合ドメインの可変重鎖をコードする核酸配列を含む核酸、及び（ｉｖ）二重特異性抗体の第２の抗原結合ドメインの可変軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸を含む。

【0130】

いくつかの態様では、単離された宿主細胞は、（ｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合ドメインの重鎖をコードする核酸配列を含む核酸、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合ドメインの軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸、（ｉｉｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体のいずれかの第２の抗原結合ドメインの重鎖をコードする核酸配列を含む核酸、及び（ｉｖ）二重特異性抗体の第２の抗原結合ドメインの軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸を含む。

【0131】

いくつかの態様では、本明細書において、ヒトＭｅｒＴＫ及びＰＤＬ１に結合する二重特異性抗体を産生する方法を提供し、方法は、二重特異性抗体が産生されるように本明細書に記載の細胞のいずれかを培養することを含む。

【0132】

いくつかの態様では、方法は、細胞によって産生された二重特異性抗体を回収することをさらに含む。

【0133】

いくつかの態様では、本明細書に記載の方法によって産生される二重特異性抗体を提供する。

【0134】

いくつかの態様では、本明細書において、本明細書に記載の二重特異性抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0135】

いくつかの態様では、本明細書において、個体におけるがんを治療する方法を提供し、方法は、治療有効量の本明細書に記載の二重特異性抗体のいずれかまたは本明細書に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの態様では、がんは、大腸癌、卵巣癌、肝臓癌、または子宮体癌である。

【0136】

いくつかの態様では、投与は、個体において網膜病理を生じさせない。

【0137】

いくつかの態様では、本明細書において、試料を本明細書に記載の二重特異性抗体のいずれかと接触させることを含む、前記試料中のＭｅｒＴＫを検出する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0138】

【図1A】ヒトＰＤＬ１を過剰発現するＣＨＯ細胞に対する本開示の特定の抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１二重特異性抗体の結合を示すデータを示す。

【図1B】ヒトＭｅｒＴＫを過剰発現するＣＨＯ細胞に対する本開示の特定の抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１二重特異性抗体の結合を示すデータを示す。

【図1C】Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージに対する本開示の特定の抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１二重特異性抗体の結合を示すデータを示す。

【図2】食細胞によるエフェロサイトーシスの、本開示の様々な二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体による減少を示すデータを示す。

【図3】本開示の様々な二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体で処置した細胞におけるｐＡＫＴ／ｔＡＫＴレベルを示すデータを示す。

【図4】ＭｅｒＴＫリガンドであるヒトＧａｓ６の非存在下での本開示の様々な二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１で処置された細胞におけるｐＡＫＴ活性の倍率変化を示すデータを示す。

【図5】二価抗ＰＤＬ１抗体と、二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２または抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１のいずれかとの組合せを用いて処置した動物と比較した、二価抗ＰＤＬ１抗体を用いて処置した動物において観察されたｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍体積の減少を示すデータを示す。

【図6】対照抗体、二価抗ＰＤＬ１抗体、及び二価抗ＰＤＬ１抗体と二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２または二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１のいずれかとの組合せを投与した個々のマウスにおける腫瘍体積の変化を示すデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0139】

本開示の詳細な説明
本開示は、抗ＭｅｒＴＫ抗体（例えば、モノクローナル抗体）、そのような抗体の作製方法及び使用方法、そのような抗体を含む医薬組成物、そのような抗体をコードする核酸、ならびにそのような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞に関する。

【0140】

本明細書に記載または参照される技術及び手順は、当業者には一般に十分に理解されており、広く利用されている方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）などの従来の方法論を使用して一般的に使用される。

【0141】

Ｉ． 定義
用語「ＭｅｒＴＫ」または「ＭｅｒＴＫポリペプチド」または「ＭｅｒＴＫタンパク質」は、本明細書では同じ意味で使用され、特に断りのない限り、哺乳類、例えば、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏｓ））及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む、任意の脊椎動物源に由来する任意の天然のＭｅｒＴＫを指す。ＭｅｒＴＫは、ｃ－ｍｅｒ、ＭＥＲ、がん原遺伝子ｃ－Ｍｅｒ、受容体チロシンキナーゼＭｅｒＴＫ、チロシンリン酸化酵素Ｍｅｒ、ＳＴＫキナーゼ、ＲＰ３８、及びＭＧＣ１３３３４９とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、この用語には、野生型配列と、天然のバリアント配列、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントの双方が含まれる。いくつかの実施形態では、この用語は、「全長」の非プロセス型ＭｅｒＴＫ、ならびに細胞内プロセシングによって生じるＭｅｒＴＫの任意の形態を包含する。いくつかの実施形態では、ＭｅｒＴＫはヒトＭｅｒＴＫである。本明細書で使用される場合、用語「ヒトＭｅｒＴＫ」とは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。

【0142】

用語「抗ＭｅｒＴＫ抗体」、「ＭｅｒＴＫに結合する抗体」、及び「ＭｅｒＴＫに特異的に結合する抗体」とは、抗体がＭｅｒＴＫを標的とする際に診断薬及び／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＭｅｒＴＫに結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＭｅｒＴＫポリペプチドへの抗ＭｅｒＴＫ抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した場合に、ＭｅｒＴＫへのこの抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＭｅｒＴＫに結合する抗体は、＜１μＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、または＜０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施形態では、抗ＭｅｒＴＫ抗体は、異なる種由来のＭｅｒＴＫ間で保存されているＭｅｒＴＫのエピトープに結合する。

【0143】

抗体の標的分子への結合に関して、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドもしくはエピトープに対する用語「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」とは、非特異的相互作用とはある程度異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を対照分子の結合と比較して決定することによって測定することができる。例えば、標的に類似の対照分子、例えば、過剰量の非標識標的との競合によって、特異的結合を測定することができる。この場合、プローブへの標識された標的の結合が過剰量の非標識標的によって競合的に阻害される場合に特異的結合が示される。特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに対して本明細書中で使用される用語「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」とは、例えば、標的に対して約１０^－４Ｍ以下、１０^－５Ｍ以下、１０^－６Ｍ以下、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、１０^－１２Ｍ以下のＫＤ、または１０^－４Ｍ～１０^－６Ｍもしくは１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍもしくは１０^－７Ｍ～１０^－９ＭのＫＤを有する分子によって表され得る。当業者には理解されるように、親和性及びＫＤの値は、逆相関している。抗原に対する高い親和性は、低いＫＤ値によって測定される。一実施形態では、用語「特異的結合」とは、ある分子がいずれの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく特定のポリペプチド上の特定のポリペプチドまたはエピトープに結合する結合を指す。

【0144】

用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書において、「抗体」と同じ意味で使用される。本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された抗体を含む多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を呈する限りにおいて抗原結合抗体の断片を具体的に包含する。

【0145】

「天然抗体」とは、通常、２つの同一の軽（「Ｌ」）鎖及び２つの同一の重（「Ｈ」）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で様々に異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的な間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、これにいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並んで配置され、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んで配置される。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。

【0146】

異なる抗体クラスの構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ ７１ ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。

【0147】

任意の脊椎動物種に由来する軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に異なる型のうちの１つに割り当てられ得る。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスがあり、それぞれ、アルファ（「α」）、デルタ（「δ」）、イプシロン（「ε」）、ガンマ（「γ」）、及びミュー（「μ」）と表記される重鎖を有する。γ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能の相対的にわずかな相違に基づいて、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現する。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造及び三次元構成は既知であり、例えば、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４^ｔｈ ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，２０００）に大まかに記載されている。

【0148】

本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体などの抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、「Ｖ_Ｈ」及び「Ｖ_Ｌ」と称され得る。これらのドメインは、一般に、可変性の最も高い抗体部分であり（同じクラスの他の抗体と比べて）、抗原結合部位を含有する。

【0149】

用語「可変」とは、可変ドメインの特定のセグメントが、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体などの抗体間で配列が大幅に異なるという事実を指す。可変ドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。むしろ、それは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインにおいて、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、３つのＨＶＲによって接続されたβシート立体配置を主とする４つのＦＲ領域を含み、これらのＨＶＲは、βシート構造を接続し、いくつかの場合ではβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖中のＨＶＲは、ＦＲ領域によって極めて近接して一緒に保持され、他方の鎖に由来するＨＶＲと共に、その抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。

【0150】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体、例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫモノクローナル抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る天然に発生し得る変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化など）を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象としている。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象としている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンが混入されていないという点で、有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特性を示しており、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体を、以下の方法の１つ以上を含むがこれらに限定されない様々な技法、すなわち、１つ以上のＤＮＡ（複数可）、ウイルス様粒子、ポリペプチド（複数可）、及び／または細胞（複数可）によるラット、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター、及び／またはニワトリを含むがこれらに限定されない動物の免疫法、ハイブリドーマ法、Ｂ細胞クローニング法、組換えＤＮＡ法、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を有する動物におけるヒト抗体またはヒト様抗体の産生技法によって作製してもよい。

【0151】

用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「全抗体」は、同じ意味で使用され、抗体断片とは対照的に、実質的にインタクトな形態の抗体、例えば抗ＭｅｒＴＫ抗体を指す。具体的には、全抗体には、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有する抗体が含まれる。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。いくつかの場合では、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。

【0152】

用語「一価抗体」または「モノアーム抗体」とは、標的抗原に特異的な単一の抗原結合ドメインを有する抗体を指す（すなわち、抗体は１つ以下の抗原結合ドメインを含む）。いくつかの実施形態では、単一の抗原結合ドメインは、単一の可変領域重鎖ポリペプチド及び単一の可変領域軽鎖ポリペプチドを含む。標的に対して「一価」である抗体は、その標的に対して１つ以下の抗原結合ドメインを含む。

【0153】

「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５）を参照のこと）；一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0154】

本明細書で使用される場合、用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合部位」、及び類似の用語は、抗体分子において抗原に対するその特異性を付与するアミノ酸残基を含む抗体分子の部分（例えば、超可変領域（ＨＶＲ））を指す。

【0155】

抗体（例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体）をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して表記される１つの残余の「Ｆｃ」フラグメントとが生成される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖全体に加えて、重鎖の可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）、及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）からなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関しては一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体をペプシン処理すると、単一の大型のＦ（ａｂ’）_２フラグメントが生じ、これは、異なる抗原結合活性を有するジスルフィド結合した２つのＦａｂフラグメントにほぼ対応し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｃ_Ｈ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むいくつかの追加の残基を有することにより、Ｆａｂフラグメントとは異なっている。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有している、Ｆａｂ’の本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントのペアとして産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。

【0156】

Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドによって一緒に保持された両方の重鎖のカルボキシ末端を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定され、この領域はまた、特定の細胞型に認められるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される。

【0157】

抗体（例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体）の「機能性断片」は、インタクトな抗体の部分を含み、一般に、インタクトな抗体の抗原結合領域もしくは可変領域、またはＦｃＲ結合能力を保持するか、もしくは改変されたＦｃＲ結合能力を有する抗体のＦｃ領域を含む。抗体断片の例としては、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0158】

用語「ダイアボディ」とは、鎖内ではなく鎖間の可変ドメイン対合を達成し、それによって二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間に短いリンカー（約５～１０個の残基）を用いてｓＦｖフラグメントを構築することによって調製される小型の抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在している、２つの「交差」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。

【0159】

本明細書中で使用する場合、「キメラ抗体」とは、抗体（免疫グロブリン）、例えば、本開示のキメラ抗ＭｅｒＴＫ抗体であって、重鎖及び／または軽鎖の部分が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、かつ、その鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である抗体、ならびにそのような抗体の断片（ただし、所望の生物活性を呈する場合に限る）を指す。本明細書中で対象とするキメラ抗体には、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれ、その場合、抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルに目的の抗原を免疫することによって産生される抗体に由来する。本明細書中で使用する場合、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。

【0160】

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態、例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体のヒト化形態は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体である。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全部または実質的に全部が非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲの全部または実質的に全部がヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化形態」とは、ヒト化された抗体を指す。

【0161】

「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体、例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、及び／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製する技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義からは、特に、非ヒト抗原結合残基を有するヒト化抗体が除外される。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ及び酵母ディスプレイライブラリを含む、当技術分野で公知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、そのような抗体を抗原チャレンジに応答して産生するように改変されているがその内在性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化異種マウスに抗原を投与することにより調製することができ、同様に、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成することができる。

【0162】

本明細書中で使用する場合、用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」とは、配列が超可変性であり、及び／または構造的に定義されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域、例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体の抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲ（Ｖ_Ｈ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、Ｖ_Ｌ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つ）を含む。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３が６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を呈し、特にＨ３が抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられる。重鎖のみからなる天然のラクダ抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定している。

【0163】

いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用されており、本明細書に包含される。いくつかの実施形態では、ＨＶＲは、配列可変性に基づくＫａｂａｔによる相補性決定領域（ＣＤＲ）であってもよく、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上記）。いくつかの実施形態では、ＨＶＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲであってもよい。Ｃｈｏｔｈｉａは、むしろ、構造的ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。いくつかの実施形態では、ＨＶＲは、ＡｂＭ ＨＶＲであってもよい。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の妥協案を示し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。いくつかの実施形態では、ＨＶＲは、「ｃｏｎｔａｃｔ」ＨＶＲであってもよい。「ｃｏｎｔａｃｔ」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々に由来する残基を以下に記載する。

【0164】

ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬ中の２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ中の２６～３５（Ｈ１）、５０～６５または４９～６５（好ましい実施形態）（Ｈ２）及び９３～１０２、９４～１０２または９５～１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの伸長ＨＶＲ定義の各々に対して、Ｋａｂａｔら（上記）に従って付番される。

【0165】

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

【0166】

本明細書中で使用する「アクセプターヒトフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するＶ_ＬフレームワークまたはＶ_Ｈフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、そのフレームワークと同じアミノ酸配列を含んでいてもよいし、既存のアミノ酸配列変化を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下である。既存のアミノ酸変化がＶＨに存在する場合、好ましいそれらの変化は、位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈのうちの３つ、２つ、または１つにのみ生じ、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ、及び／または７８Ａであってもよい。一実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、配列において、Ｖ_Ｌヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。

【0167】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶ_ＬまたはＶ_Ｈフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンのＶ_Ｌ配列またはＶ_Ｈ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）などのサブグループである。例として、Ｖ_Ｌに関するものを挙げると、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）におけるようなサブグループκＩ、κＩＩ、κＩＩＩ、またはκＩＶであってもよい。さらに、Ｖ_Ｈについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）におけるようなサブグループＩ、サブグループＩＩ、またはサブグループＩＩＩであってもよい。

【0168】

例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体の、指定位置における「アミノ酸改変」は、指定残基の置換もしくは欠失、または少なくとも１つのアミノ酸残基の指定残基に隣接する挿入を指す。指定残基に「隣接する」挿入とは、その１～２残基内への挿入を意味する。挿入は、指定残基のＮ末端側またはＣ末端側であってよい。本明細書における好ましいアミノ酸改変は、置換である。

【0169】

「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインが非共有結合で緊密に結合した二量体からなる。抗原結合のためのアミノ酸残基を提供すると共に抗原結合特異性を抗体に付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が、これらの２つのドメインの折り畳みによって生じる。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性であるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半体）でさえも、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。

【0170】

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」と略記されることもある「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖の状態に連結された、ＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーにより、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能となっている。

【0171】

抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に帰属する生物活性を指し、抗体のアイソタイプに応じて様々である。

【0172】

本明細書における用語「Ｆｃ領域」とは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用され、天然配列のＦｃ領域及びバリアントＦｃ領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、アミノ酸残基の位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで及ぶものと定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ付番方式によると残基４４７）を、例えば、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え改変することによって除去してもよい。したがって、インタクトな抗体の組成は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体と有していない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。本開示の抗体における使用に好適な天然配列のＦｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が含まれる。

【0173】

「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然のバリアントが含まれる。

【0174】

「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変、好ましくは１つ以上のアミノ酸置換（複数可）により、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１～約１０個のアミノ酸置換、及び好ましくは約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは、それらと少なくとも９０％の相同性、より好ましくは、それらと少なくとも９５％の相同性を保有する。

【0175】

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）と結合するＦｃＲであり、これには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体（これらの受容体のアレルバリアント及び選択的スプライシング形態を含む）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、同様のアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なるＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（「ＩＴＡＭ」）を含有する。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（「ＩＴＩＭ」）を含有する。今後同定されるＦｃＲを含む他のＦｃＲは、本明細書における用語「ＦｃＲ」に包含される。ＦｃＲはまた、抗体の血清中半減期を延長させることができる。

【0176】

本明細書で使用する場合、ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性の割合（％）」及び「アミノ酸配列相同性の割合（％）」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大の配列同一性の割合を達成した後の、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮しない、指定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合を指す。アミノ酸配列同一性の割合を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術範囲内である様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる当技術分野で公知の任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを評価するための適切なパラメータを決定することができる。

【0177】

用語「競合する」とは、同じエピトープまたは重複エピトープについて競合する抗体に関して使用される場合、被験抗体が共通抗原（例えば、ＭｅｒＴＫまたはその断片）に対する参照分子（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を防止または阻害（例えば、低減）するアッセイによって測定される抗体間の競合を意味する。多種の競合的結合アッセイを使用して、抗体が別の抗体と競合するか否かを判定することができ、例えば、固相直接または間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３を参照のこと）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９を参照のこと）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、１－１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５を参照のこと）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５５２を参照のこと）、及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２を参照のこと）。通常、そのようなアッセイは、固体表面に結合した精製された抗原、または非標識の被験抗体及び標識された参照抗体のいずれかを有する細胞の使用を含む。競合阻害は、被験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を測定することによって測定される。通常、被験抗体を過剰に存在させる。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び参照抗体によって結合したエピトープに十分に近接する隣接エピトープに結合して立体障害を生じさせる抗体が含まれる。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、競合抗体は、共通の抗原に対する参照抗体の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、及び／または１００％近くの特異的結合を阻害する（例えば、減少させる）であろう。

【0178】

本明細書中で使用する場合、ＭｅｒＴＫポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の「相互作用」は、限定するものではないが、タンパク質－タンパク質相互作用、物理的相互作用、化学的相互作用、結合、共有結合、及びイオン結合を包含する。本明細書中で使用する場合、抗体が２つのポリペプチド間の相互作用を中断、低減または完全に排除する場合、その抗体は、２つのポリペプチド間の「相互作用を阻害する」。本開示の抗体は、その抗体が２つのポリペプチドのうちの１つに結合する場合、その抗体は、２つのポリペプチド間の「相互作用を阻害する」。いくつかの実施形態では、相互作用を、少なくとも、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、及び／または１００％近くのいずれかで阻害することができる。

【0179】

用語「エピトープ」には、抗体が結合することができる任意の決定基が含まれる。エピトープとは、抗原を標的とする抗体が結合する抗原の領域であり、抗原がポリペプチドである場合、抗体と直接接触する特定のアミノ酸を含む。最も多くの場合、エピトープはポリペプチド上に存在するが、いくつかの場合では、核酸などの他の種類の分子に存在し得る。エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基が含まれ得、特定の三次元構造特徴及び／または特定の電荷特徴を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、ポリペプチド及び／または高分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識するであろう。

【0180】

「単離された」抗体、例えば、本開示の単離された抗ＭｅｒＴＫ抗体は、その産生環境（例えば、天然または組換え）の成分から同定、分離、及び／または回収された抗体である。好ましくは、単離された抗体は、その産生環境に由来する他のすべての夾雑成分との会合がない。その産生環境に由来する夾雑成分、例えば、組換えトランスフェクション細胞に起因する夾雑成分は、通常、抗体の研究、診断、または治療における使用を妨げる物質であり、これらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体を、（１）例えばローリー法による測定における９５重量％超の、及びいくつかの実施形態では、９９重量％超の抗体に、（２）スピニングカップシーケネーターを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルー、好ましくは銀染色を用いた非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて均一となるように精製する。単離された抗体には、組み換えＴ細胞内でのｉｎ ｓｉｔｕ抗体が含まれるが、これは、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在していないためである。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドまたは抗体を、少なくとも１つの精製ステップによって調製する。

【0181】

抗体（例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体）をコードする「単離された」核酸分子は、その核酸分子が生成された環境において通常会合している少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定及び分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に関連するすべての成分との会合を含まない。本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、それが天然に認められる形態または設定以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞中に天然に存在する本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする核酸とは区別される。

【0182】

用語「ベクター」とは、本明細書中で使用する場合、ベクターに連結させた別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一種には「プラスミド」があり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類はファージベクターである。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムへとライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結する遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」、または単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、同じ意味で使用され得る。

【0183】

本明細書中で同義に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりまたは合成反応により重合体中に組み込まれ得る任意の基質であり得る。

【0184】

「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を組み込むためのベクター（複数可）のレシピエントになり得るか、またはレシピエントになっている個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、天然の、突発的、または意図的変異が生じるため、子孫は必ずしも元の親細胞と（形態においてまたはゲノムＤＮＡ相補鎖において）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（複数可）を用いてｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が含まれる。

【0185】

本明細書で使用される「担体」には、使用される用量及び濃度で、その担体に曝露される細胞または哺乳類に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤が含まれる。

【0186】

本明細書中で使用する場合、用語「治療」とは、臨床的病理の経過中に、治療中の個体の自然経過を改変するように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果には、特定の疾患、障害、または病態の進行速度の低下、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれる。例えば、特定の疾患、障害、または病態に関連する１つ以上の症状が軽減または排除される場合、個体は成功裏に「治療」される。

【0187】

「有効量」とは、必要な用量及び期間において、所望の治療結果を達成するために少なくとも有効な量を指す。有効量は、１回以上の投与で提供され得る。有効量はまた、治療上有益な効果が治療の任意の毒性効果または有害効果を上回る量でもある。治療的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、疾患に起因する１つ以上の症状の減少、疾患に罹患している者の生活の質の向上、疾患の処置に必要な他の薬剤の用量の減少、別の薬剤の効果の増強、例えば、標的化を介した、疾患の進行の遅延、及び／または生存期間の延長などの臨床結果が含まれる。薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、直接的または間接的のいずれかの治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床的状況において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて達成されてもよいし、そうでなくてもよい。したがって、「有効量」は、１つ以上の治療薬の投与に関連して考慮してもよく、単一の剤は、１つ以上の他の剤と併せると望ましい結果が達成され得るか、または達成される場合、有効量で与えられるとみなされ得る。

【0188】

治療目的のための「個体」は、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、競技用または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを含む、哺乳類に分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。

【0189】

本明細書中で使用する場合、別の化合物または組成物との「併用」または「複合」投与には、同時投与及び／または異なる時点での投与が含まれる。併用投与または複合投与はまた、合剤としての投与または別個の組成物としての投与を包含し、異なる投与頻度または間隔で、かつ同じ投与経路または異なる投与経路を使用することを含む。いくつかの実施形態では、併用投与を、同じ治療レジメンの一部として投与する。

【0190】

本明細書で使用される用語「約」とは、本技術分野の当業者に容易に理解される、各値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。

【0191】

本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含む。例えば、「抗体」への言及は、モル量などの１つ～多数の抗体への言及であり、これには当業者に公知のその均等物などが含まれる。

【0192】

本明細書に記載される本開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態を「含む」、態様及び実施形態「からなる」、ならびに態様及び実施形態「から本質的になる」を含むことを理解されたい。

【0193】

ＩＩ． 二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体
本明細書において、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体を提供する。本明細書で提供される抗体は、例えば、ＭｅｒＴＫ関連障害の治療に有用である。

【0194】

一態様では、本開示は、本開示のＭｅｒＴＫタンパク質またはポリペプチド内のエピトープに結合する単離された（例えば、モノクローナル）抗体を提供する。本開示のＭｅｒＴＫタンパク質またはポリペプチドには、哺乳類ＭｅｒＴＫタンパク質またはポリペプチド、ヒトＭｅｒＴＫタンパク質またはポリペプチド、マウス（ネズミ）ＭｅｒＴＫタンパク質またはポリペプチド、及びカニクイザルＭｅｒＴＫタンパク質またはポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本開示のＭｅｒＴＫタンパク質及びポリペプチドには、ＭｅｒＴＫの天然のバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のＭｅｒＴＫタンパク質及びポリペプチドは膜結合型である。いくつかの実施形態では、本開示のＭｅｒＴＫタンパク質及びポリペプチドは、ＭｅｒＴＫの可溶性細胞外ドメインである。

【0195】

いくつかの実施形態では、ＭｅｒＴＫを、細胞内で発現させる。いくつかの実施形態では、ＭｅｒＴＫを、限定されないが、マクロファージ及び樹状細胞を含む食細胞中で発現させる。いくつかの実施形態では、ＭｅｒＴＫを、単球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ミクログリア、内皮細胞、巨核球、及び血小板で発現させる。いくつかの実施形態では、高レベルのＭｅｒＴＫ発現が、卵巣、前立腺、精巣、肺、網膜、及び腎臓においても認められる。さらに、ＭｅｒＴＫは、多数のがんにおいて異所性発現または過剰発現を示す（Ｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，２００８，Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１００：３５－８３）。

【0196】

ＩＩＩ． ＭｅｒＴＫ結合パートナー
本開示のＭｅｒＴＫタンパク質は、タンパク質Ｓ（ＰｒｏＳまたはＰｒｏＳ１）、Ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ６（Ｇａｓ６）、Ｔｕｂｂｙ、Ｔｕｂｂｙ様タンパク質１（ＴＵＬＰ－１）、及びガレクチン３を含むがこれらに限定されない、１つ以上のリガンドまたは結合パートナーと（例えば、結合）相互作用する。本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体は、ＭｅｒＴＫとその様々なリガンド及び結合パートナーの１つ以上との相互作用に影響を及ぼすことができる。特に、親マウス抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６及び親マウス抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６４６４０号（ＷＯ２０２１／１１９５０８）に開示されるように、ＭｅｒＴＫに対するＧａｓ６リガンド及びＰｒｏＳリガンドの両方の結合を遮断するのに有効である。

【0197】

ＩＶ． ｐＡＫＴ
ＡＫＴ活性は、ＭｅｒＴＫ、Ａｘｌ、またはＴｙｒｏ－３受容体に結合するＧａｓ６の下流の標的である。例えば、ＭｅｒＴＫリガンドＧａｓ６とＭｅｒＴＫとの結合は、ＡＫＴリン酸化（ｐＡＫＴ）を誘導する（例えば、Ａｎｇｅｌｉｌｌｏ－Ｓｃｈｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１８：５８３－５９６；Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１３９：１３４０－１３４９を参照のこと）。本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトマクロファージ（例えば、Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージ）におけるＧａｓ６媒介リンＡＫＴ（ｐＡＫＴ）活性を用量依存的に低減するのに有効であった。したがって、本開示の抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ｐＡＫＴレベルの減少により証明されるように、Ｇａｓ６媒介ＭｅｒＴＫシグナル伝達を減少させるのに有効であった。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧａｓ６媒介ｐＡＫＴ活性を阻害または低減する。

【0198】

ＩＣ５０値を測定することにより、細胞内のｐＡＫＴ活性を低下させた際の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の相対的有効性を判定することができる。Ｇａｓ６媒介ｐＡＫＴ活性の低下に関するＩＣ５０値は、当業者に公知の方法、例えば本明細書において以下の実施例１３に記載の方法を使用して測定することができる。

【0199】

Ｖ． エフェロサイトーシス
エフェロサイトーシスとは、瀕死細胞またはアポトーシス細胞の食細胞クリアランスを指す。エフェロサイトーシスは、プロフェッショナル食細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、ミクログリア）、非プロフェッショナル食細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞、網膜色素上皮細胞）、または専門食細胞によって達成することができる。（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８：１３８７－１３９４）。エフェロサイトーシスは、死細胞または瀕死細胞を、その膜の完全性が損なわれ、その細胞内容物が周囲の組織に漏出する前に取り除き、それによって毒性を有する酵素、酸化剤、及び他の細胞内成分への組織の曝露を防ぐ。

【0200】

アポトーシス細胞は、食細胞上の受容体によって認識される様々な分子をその細胞表面上に露出させる（「ｅａｔ－ｍｅ」シグナル）。そのような「ｅａｔ ｍｅ」シグナル伝達分子の１つは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）であり、これは通常は細胞膜の内葉に限定される。アポトーシスの際に、ＰｔｄＳｅｒは細胞膜の外葉に露出する。ＭｅｒＴＫリガンドＰｒｏＳ及びＧａｓ６は、Ｎ末端ドメイン付近にγ－カルボキシル化グルタミン酸残基を含み、このグルタミン酸残基のγ－カルボキシル化により、ホスファチジルセリンへの結合が可能になる。Ｇａｓ６またはＰｒｏＳがアポトーシス細胞上のＰｔｄＳｅｒに結合し、同時に食細胞上のＭｅｒＴＫに結合する。ＭｅｒＴＫとのそのようなリガンドの結合は、エフェロサイトーシスを活性化する。

【0201】

以下の実施例１２に示すように、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、食細胞によるエフェロサイトーシス活性を低減するのに有効であった。

【0202】

したがって、いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、食細胞によるエフェロサイトーシスを低減する。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、マクロファージによるエフェロサイトーシスを低減する。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、樹状細胞によるエフェロサイトーシスを低減する。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、骨髄由来マクロファージによるエフェロサイトーシスを低減する。エフェロサイトーシスの減少は、本明細書において実施例１２に記載されているような、当業者に公知の標準的な方法を用いて判定することができる。

【0203】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、実施例１２に記載の方法によって評価されるように、約０．１３ｎＭ～約３０ｎＭの範囲のＩＣ５０で、食細胞（例えば、ヒトマクロファージ）によるエフェロサイトーシスを低減する。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、およそ４．４ｎＭ～およそ１５．６８ｎＭの範囲のＩＣ５０値で、食細胞によるエフェロサイトーシスを低減する。

【0204】

エフェロサイトーシスの遮断は、Ｍ１様マクロファージの分極を引き起こし、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ＩＬ－１２）の産生の増加、ならびに細胞傷害性細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の動員をもたらし、これらは抗腫瘍免疫を媒介する。したがって、食細胞によるエフェロサイトーシスを低減することによって、本開示の抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、Ｍ１様マクロファージ分極を増加させる際、ならびにＴＮＦ、ＩＦＮ、ＩＬ－６、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ－１、ＫＣ）、単球化学誘引性タンパク質１（ＭＣＰ１、ＣＣＬ２）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ－１α、ＣＣＬ３、及び／またはマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ－１β、ＣＣＬ４）を含む炎症促進性サイトカイン／ケモカインの産生、発現、及び／または分泌を増加させる際に効果的である。

【0205】

エフェロサイトーシスとがんの進行との関連性は、説明されている。例えば、アネキシンＶを用いたエフェロサイトーシスの遮断は、ＰｔｄＳｅｒが食細胞のエフェロサイトーシス機構と相互作用することを遮断し、腫瘍の進行及び転移を十分に低下させる（Ｓｔａｃｈ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆ，７：９１１；Ｂｏｎｄａｎｚａ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００：１１５７；Ｗｅｒｆｅｌ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，２０１８，Ｓｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，４０：５４５－５５４）。さらに、ＭｅｒＴＫは、そのＰｔｄＳｅｒ架橋リガンドＧａｓ６と同様に、多数のヒトのがんにおける予後不良及び生存率と相関している（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１４：７６９；Ｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，１４：１０７３－１０９０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３２：８７２；Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ，１１：７２８－７３５；Ｔｗｏｒｋｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｐ．ｍｏｌｃａｎｒｅｓ－０５１２；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１２：２６６２－２６６９；Ｋｅａｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２５：６０９２）。したがって、食細胞によるエフェロサイトーシスを低減する本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体は、腫瘍の進行及び転移を低下させるのに有効である。

【0206】

カニクイザルの実験は、いくつかの例において、Ｇａｓ６とＰｒｏＳとの結合を遮断する二価抗ＭｅｒＴＫ抗体（例えば、抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６）が、ＰｒｏＳとＭｅｒＴＫとの結合を遮断するがＧａｓ６とＭｅｒＴＫとの結合を遮断しない二価の抗ＭｅｒＴＫ抗体を投与したカニクイザルにおいて観察される毒性（例えば、体重減少）と比べて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより低い毒性を示したことを示唆した。したがって、いくつかの実施形態では、ＭｅｒＴＫに対して一価であり、かつＧａｓ６及びＰｒｏＳの両方のＭｅｒＴＫへの結合を遮断する本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ＰｒｏＳとＭｅｒＴＫとの結合を遮断するが、Ｇａｓ６とＭｅｒＴＫとの結合を遮断しない本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体と比較して、より低い全身性のｉｎ ｖｉｖｏ毒性を示し得る。抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６及び抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３（両方ともＧａｓ６及びＰｒｏＳの両方のＭｅｒＴＫへの結合を遮断する）は、ＭｅｒＴＫタンパク質のＩｇ１ドメインに結合し、一方、抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１５（ＰｒｏＳのＭｅｒＴＫへの結合を遮断するが、Ｇａｓ６のＭｅｒＴＫへの結合を遮断しない）は、ＭｅｒＴＫタンパク質のＩｇ２及びＦＮ１ドメインの双方に結合する（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６４６４０号（ＷＯ２０２１／１１９５０８）を参照のこと）。したがって、いくつかの実施形態では、ＭｅｒＴＫのＩｇ１ドメインに結合する二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体（例えば、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体ＭＴＫ－１６、ＭＴＫ－１６．２、ＭＴＫ－３３、及びＭＴＫ－３３．１１）は、ＭｅｒＴＫのＩｇ２及びＦＮ１ドメインの双方に結合する抗ＭｅｒＴＫ抗体に比べて、より低い全身性のｉｎ ｖｉｖｏ毒性を示し得る。さらに、いくつかの実施形態では、ＭｅｒＴＫ（例えば、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体ＭＴＫ－１６、ＭＴＫ－１６．２、ＭＴＫ－３３、及びＭＴＫ－３３．１１）のＩｇ１ドメインに結合し、かつ（一部は、その一価の構成に起因した）低いｐＡＫＴ活性を示す二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ＭｅｒＴＫのＩｇ２及びＦＮ１ドメインの双方に結合する二価抗ＭｅｒＴＫ抗体に比べて、より低い全身性のｉｎ ｖｉｖｏ毒性を示し得る。

【0207】

二重特異性抗体の構成
二重特異性抗体の多くの異なるフォーマット及び使用は当技術分野で公知である（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２０１５ Ｊｕｌｙ；２０（７）：８３８－４７；ＭＡｂｓ，２０１２ Ｍａｒｃｈ－Ａｐｒｉｌ；４（２）：１８２－９７に概説されている）。本発明による二重特異性抗体は、任意の特定の二重特異性フォーマットまたはその製造方法に限定されない。したがって、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合する第１の抗原結合ドメイン及びＰＤＬ１に結合する第２の抗原結合ドメインを有する二重特異性抗体の様々な構成を含み得る。

【0208】

本開示で使用し得る二重特異性抗体分子の例としては、（ｉ）異なる抗原結合ドメインを含む２つのアームを有する単一の抗体、（ｉｉ）例えば、余分のペプチドリンカーによってタンデムに連結された２つのｓｃＦｖを介して、２つの異なるエピトープに対する特異性を有する一本鎖抗体、（ｉｉｉ）各軽鎖と重鎖が短いペプチド結合を介して２つの可変ドメインを直列に含む二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））、（ｉｖ）化学的に結合した二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメント、（ｖ）標的抗原のそれぞれに対して２つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体を生じさせる２つの一本鎖ダイアボディの融合体であるＴａｎｄａｂ、（ｖｉ）多価分子を生じさせるダイアボディとｓｃＦｖの組み合わせであるフレキシボディ、（ｖｉｉ）Ｆａｂに適用した場合に２つの同一のＦａｂフラグメントが異なるＦａｂフラグメントに結合した三価の二重特異性結合タンパク質が得られるプロテインキナーゼＡの「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ」分子、（ｖｉｉｉ）例えば、ヒトＦａｂアームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子、ならびに（ｉｘ）ダイアボディが挙げられる。

【0209】

いくつかの態様では、アミノ酸の変異、置換、付加、または欠失を含むＦｃ領域によって本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の二量体化したＦｃ領域を形成させてヘテロ二量体化を促進し、その場合、異なるＦｃ領域を含む異なるポリペプチドが二量体化してヘテロ二量体構成が生じ得る。一態様では、本開示の二重特異性抗体は、第１のＣＨ３領域を含む第１のＦｃ配列及び第２のＣＨ３領域を含む第２のＦｃ配列を含み、第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体の相互作用が、前記第１及び第２のＣＨ３領域の各ホモ二量体の相互作用よりも強い。

【0210】

Ｆｃ領域のヘテロ二量体化を促進する方法には、例えば、一連の「ノブ・イントゥ・ホール」欠失、付加、もしくは置換を含めることによるか、または異なるポリペプチド鎖間の誘引性の相互作用を促進するために、Ｆｃの静電的ステアリングに影響を与えるアミノ酸の欠失、付加、または置換を含めることによって、Ｆｃ領域のアミノ酸配列のアミノ酸を欠失、付加、または置換することが含まれる。相補的Ｆｃポリペプチドのヘテロ二量体化を促進する方法は、例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，９：６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６：６７７－６８１；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，２０１１，ＭＡｂｓ，３：５４６－５５７；Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１３，５：６４６－６５４；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８５：１９６３７－１９４６４；Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２４：６４１－６５１；Ｈａ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：１；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２３：１９５－２０２；ＷＯ１９９６／０２７０１１；ＷＯ１９９８／０５０４３１；ＷＯ２００６／０２８９３６；ＷＯ２００９／０８９００４；ＷＯ２０１１／１４３５４５；ＷＯ２０１４／０６７０１１；ＷＯ２０１２／０５８７６８；ＷＯ２０１８／０２７０２５；ＵＳ２０１４／０３６３４２６；ＵＳ２０１５／０３０７６２８；ＵＳ２０１８／００１６３５４；ＵＳ２０１５／０２３９９９１；ＵＳ２０１７／００５８０５４；ＵＳＰＮ５７３１１６８；ＵＳＰＮ７１８３０７６；ＵＳＰＮ９７０１７５９；ＵＳＰＮ９６０５０８４；ＵＳＰＮ９６５０４４６；ＵＳＰＮ８２１６８０５；ＵＳＰＮ８７６５４１２；及びＵＳＰＮ８２５８２６８に以前に記載されている。

【0211】

例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃヘテロ二量体の相補的なＦｃポリペプチドは、Ｆｃ二量体の界面にわたる電荷極性を改変する変異を含み、その結果、静電的に適合するＦｃ領域の共発現が、好ましい誘引性相互作用をサポートし、それによって望ましいＦｃヘテロ二量体形成が促進され、一方、望ましくない反発電荷相互作用が、望ましくないＦｃホモ二量体形成を抑制する（Ｇｕｎｅｓｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８５：１９６３７－１９６４６）。細胞内で共発現する場合、ポリペプチド鎖間の会合は可能であるが、電荷反発のために鎖は実質的に自己会合しない。

【0212】

さらに、Ｆｃヘテロ二量体の相補的なＦｃポリペプチドは、２つのＦｃポリペプチドのヘテロ二量体化を促進するための「ノブ・イントゥ・ホール」配置を含む。「ノブ・イントゥ・ホール」技術については、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、第７，６９５，９３６号、第８，２１６，８０５号、第８，７６５，４１２号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）、及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般に、この方法は、突起（「ノブ」）を第１のポリペプチドの界面に、対応する空洞（「ホール」）を第２のポリペプチドの界面に導入することを含み、その結果、突起を空洞内に配置することができ、それによってヘテロ二量体の形成が促進され、ホモ二量体の形成が妨げられる。第１のポリペプチドの界面にある小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置き換えることによって、突起を構築する。第２のポリペプチドの界面に、突起と同一または同様のサイズの補償的な空洞を、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置き換えることによって作成する。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、例えば、部位特異的変異によって、またはペプチド合成によって作成することができる。特定の実施形態では、ノブの改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方におけるアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホールの改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方におけるアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施形態では、ノブの改変を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホールの改変を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これらの２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがって二量体がさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。したがって、そのような構成においては、第１のＦｃ領域ポリペプチドは、「ノブ」を形成するようにアミノ酸改変を含み、第２のＦｃ領域ポリペプチドは、「ホール」を形成するようにアミノ酸改変を含み、そのようにして相補的なＦｃポリペプチドを含むＦｃヘテロ二量体を形成させる。

【0213】

Ｆｃヘテロ二量体配置の相補的なＦｃポリペプチドの例示的なアミノ酸改変のペアを以下の表Ａに記載する（ＥＵ付番）。

【0214】

（表Ａ）

【0215】

「ノブ・イントゥ・ホール」配置の特定の一実施形態では、Ｆｃヘテロ二量体構成の第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｙアミノ酸置換を含み、Ｆｃヘテロ二量体構成の第２のＦｃポリペプチドは、Ｙ４０７Ｔアミノ酸置換を含む（ＥＵ付番）。「ノブ・イントゥ・ホール」配置の特定の別の実施形態では、Ｆｃヘテロ二量体構成の第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗアミノ酸置換を含み、Ｆｃヘテロ二量体構成の第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖアミノ酸置換を含む（ＥＵ付番）。

【0216】

Ａ． 例示的な抗体及び特定の他の抗体の実施形態
本開示は、ヒトＭｅｒＴＫに結合する第１の抗原結合ドメイン及びＰＤＬ１に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体を提供する。

【0217】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、野生型ＩｇＧ Ｆｃアミノ酸配列を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、及び野生型ＩｇＧ Ｆｃアミノ酸配列を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、及び野生型ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ＬＡＬＡＰＳアミノ酸置換を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、ＬＡＬＡＰＳアミノ酸置換を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ＬＡＬＡＰＳアミノ酸置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、ＬＡＬＡＰＳアミノ酸置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ＮＳＬＦアミノ酸置換を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、ＮＳＬＦアミノ酸置換を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ＮＳＬＦアミノ酸置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、ＮＳＬＦアミノ酸置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃアミノ酸配列を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、及び野生型ＩｇＧ４ Ｆｃアミノ酸配列を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、上記のアミノ酸置換のいずれかを有し、さらにＳ２２８Ｐアミノ酸置換を含むＩｇＧ４ Ｆｃアミノ酸配列を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖と、上記のアミノ酸置換のいずれかを有し、さらにＳ２２８Ｐアミノ酸置換を含むＩｇＧ４ Ｆｃアミノ酸配列を含むＰＤＬ１抗体重鎖を有する。

【0218】

いくつかの実施形態では、本開示の抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、Ｆｃ領域に「ノブ」アミノ酸置換を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、及びＦｃ領域に「ホール」アミノ酸置換を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、Ｆｃ領域に「ホール」アミノ酸置換を含む抗ＭｅｒＴＫ抗体重鎖、及びＦｃ領域に「ノブ」アミノ酸置換を含む抗ＰＤＬ１抗体重鎖を含む。

【0219】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0220】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0221】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0222】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0223】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0225】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0226】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0227】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0228】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0229】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0230】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0231】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0232】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0233】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0234】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0235】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0236】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0237】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0238】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号１７のアミノ酸１～４４９を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２７のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0240】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号１８のアミノ酸１～４４９を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２８のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0241】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号１９のアミノ酸１～４４９を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２９のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0242】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２０のアミノ酸１～４４６を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号３０のアミノ酸１～４４４を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0243】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３２のアミノ酸１～４５３を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４２のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0244】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３３のアミノ酸１～４４９を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４３のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３４のアミノ酸１～４４９を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４４のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0246】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３５のアミノ酸１～４４６を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４５のアミノ酸１～４４４を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0247】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３６のアミノ酸１～４４６を含む重鎖、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４６のアミノ酸１～４４４を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0248】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２２のアミノ酸１～４４８を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２７のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２３のアミノ酸１～４４８を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２８のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0250】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２４のアミノ酸１～４４８を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号２９のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0251】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号２５のアミノ酸１～４４５を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号３０のアミノ酸１～４４４を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0252】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３７のアミノ酸１～４４８を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４２のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0253】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３８のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４３のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0254】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号３９のアミノ酸１～４４８を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４４のアミノ酸１～４４７を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0255】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号４０のアミノ酸１～４４５を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４５のアミノ酸１～４４４を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0256】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫに結合し、配列番号４１のアミノ酸１～４４５を含む重鎖、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗原結合ドメイン、ならびにＰＤＬ１に結合し、配列番号４６のアミノ酸１～４４４を含む重鎖、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第２の抗原結合ドメインを含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、上記の実施形態のいずれかによる二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体には、以下の１～７節に記載される特徴のうちのいずれかが、単独または組み合わせで組み込まれ得る。

【0258】

（１） 抗ＭｅｒＴＫ抗体結合親和性
本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、＜１μＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、または＜０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。解離定数は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（例えばＦｏｒｔｅＢｉｏによるＯｃｔｅｔ Ｓｙｓｔｅｍを参照のこと）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円二色性（ＣＤ）、ストップフロー分析、及び比色分析または蛍光タンパク質融解分析などの任意の生化学的または生物物理学的技術を含む、任意の分析技術によって決定してもよい。一実施形態では、Ｋｄを、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定する。いくつかの実施形態では、ＲＩＡを、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）に記載されているように、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施する。いくつかの実施形態では、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫ_Ｄを測定する。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイを、固定化抗原ＣＭ５チップを約１０レスポンスユニット（ＲＵ）で使用して２５℃にて実施する。いくつかの実施形態では、一価抗体（例えば、Ｆａｂ）または全長抗体を使用してＫ_Ｄを決定する。いくつかの実施形態では、一価形態の全長抗体を使用してＫ_Ｄを決定する。

【0259】

いくつかの実施形態では、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体はヒトＭｅｒＴＫに結合し、ヒトＭｅｒＴＫに結合するＫ_Ｄは、約１．４ｎＭ～約８１ｎＭである。いくつかの実施形態では、抗ＭｅｒＴＫ抗体はカニクイザルＭｅｒＴＫに結合し、カニクイザルＭｅｒＴＫへの結合のＫ_Ｄは、約１．６ｎＭ～約１０７ｎＭである。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体はマウスＭｅｒＴＫに結合し、マウスＭｅｒＴＫへの結合のＫ_Ｄは、約３０ｎＭ～約１８６ｎＭである。

【0260】

（２） 抗体断片
本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメント、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントの総説については、例えば、ＷＯ９３／１６１８５、及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が延長されたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントの考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

【0261】

ダイアボディは、２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、二価または二重特異性であり得る。例えば、ＥＰ４０４０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む、抗体断片である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（例えば、米国特許第６２４８５１６号を参照のこと）。

【0262】

抗体断片は、本明細書に記載される、インタクトな抗体のタンパク質分解、ならびに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）の産生を含むが、これらに限定されない、様々な技法によって作製され得る。

【0263】

（３） キメラ抗体及びヒト化抗体
本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）、及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

【0264】

本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する一方で、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化される。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ヒト化抗体が由来する別の種由来の抗体と実質的に同じ親和性を標的に対して有する。例えば、米国特許第５５３０１０１号、第５６９３７６１号、第５６９３７６２号、及び第５５８５０８９号を参照のこと。特定の実施形態では、抗原性を低下させる一方で、抗原結合ドメインの天然の親和性を低下させることなく改変することができる抗体可変ドメインのアミノ酸を同定する。例えば、米国特許第５７６６８８６号及び第５８６９６１９号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（またはそれらの部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはそれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。任意選択で、ヒト化抗体はまた、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基を、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基の由来となった抗体）に由来する対応する残基で置換して、例えば、抗体特異性または親和性を復元または向上させる。

【0265】

ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１ ９－１６３３（２００８）に概説されており、さらに例えば、米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号に記載されている。ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては：「最良適合（ｂｅｓｔ－ｆｉｔ）」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照のこと）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位集団のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照のこと）、ヒト成熟（体細胞変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照のこと）、及びＦＲライブラリのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0266】

（４） ヒト抗体
本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。

【0267】

抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を含むインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって、ヒト抗体を調製してもよい。そのようなマウスがマウス抗体の非存在下でヒト抗体を産生することを期待して、ヒトＩｇ遺伝子座の大断片を有するマウス抗体産生欠損マウス系統を設計することが可能である。ヒトＩｇの大断片は、抗体の産生及び発現を適切に制御するだけでなく、大きな可変遺伝子の多様性を保存することができる。抗体の多様化及び選択のためのマウス機構、ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如を利用することにより、これらのマウス系統で再現されたヒト抗体レパートリーから、ヒト抗原を含む任意の目的の抗原に対する高親和性の完全ヒト抗体を産生することができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを作製し、選択することができる。特定の例示的な方法は、米国特許第５５４５８０７号、第ＥＰ５４６０７３号、及び第ＥＰ５４６０７３号に記載されている。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載した米国特許第６０７５１８１号及び第６１５０５８４号、ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術について記載した米国特許第５７７０４２９号、Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載した米国特許第７０４１８７０号、ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載した米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物によって生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域を、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変してもよい。

【0268】

ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するための、ヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６（１９９１）を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）に記載されている方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成してもよい。そのような可変ドメイン配列を、次いで所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技法を、以下に記載する。

【0269】

本明細書中で提供する抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法、及び／または所望の活性を有する抗体に関するコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離されたヒト抗体である。好適な例としては、ファージディスプレイ（ＣＡＴ，Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，Ｄｙａｘ，Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｘｏｍａ，Ｓｙｍｐｈｏｒｇｅｎ，Ａｌｅｘｉｏｎ（以前のＰｒｏｌｉｐｏｎ），Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイ（Ａｄｉｍａｂ）などが挙げられるが、これらに限定されない。特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングし、ファージライブラリ中でランダムに組み換えて、それを次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されるように抗原結合ファージとしてスクリーニングすることができる。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、そのようなライブラリを、所望の結合特性を保有する抗体についてスクリーニングするための多様な方法が当技術分野で公知である。Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０，２００４、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３，２００４、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（－２）：１１９－１３２ （２００４）も参照のこと。ファージは通常、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして、抗体断片を提示する。免疫された供給源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とせずに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５－７３４（１９９３）により記載されるように、ナイーブレパートリーを、クローニングし（例えば、ヒトから）、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原また自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８，１９９２に記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＨＶＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再配列を達成することによって、合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリを記載する特許刊行物としては、例えば、米国特許第５７５０３７３号、ならびに米国特許公開第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号が挙げられる。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。

【0270】

（５） Ｆｃ領域を含む定常領域
本明細書で提供する抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び／またはＩｇＧ４アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラス、またはＩｇＡクラスの抗体である。

【0271】

本明細書で提供する抗体のいずれかの特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ２定常領域を含有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ２定常領域は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体への結合とは独立して、１つ以上のＭｅｒＴＫ活性を誘導する。いくつかの実施形態では、抗体は、阻害性Ｆｃ受容体に結合する。特定の実施形態では、阻害性Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃγ受容体ＩＩＢ（ＦｃγＩＩＢ）である。

【0272】

本明細書で提供する抗体のいずれかの特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、マウスＩｇＧ１定常領域を含有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、阻害性Ｆｃ受容体に結合する。特定の実施形態では、阻害性Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃγ受容体ＩＩＢ（ＦｃγＩＩＢ）である。

【0273】

本明細書で提供する抗体のいずれかの特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４定常領域は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、阻害性Ｆｃ受容体に結合する。特定の実施形態では、阻害性Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃγ受容体ＩＩＢ（ＦｃγＩＩＢ）である。

【0274】

本明細書で提供する抗体のいずれかの特定の実施形態では、抗体は、ハイブリッドＩｇＧ２／４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ２のアミノ酸１１８～２６０（ＥＵ付番に従う）と、ヒトＩｇＧ４のアミノ酸２６１～４４７（ＥＵ付番に従う）とを含むアミノ酸配列を含む（ＷＯ１９９７／１１９７１、ＷＯ２００７／１０６５８５）。

【0275】

いくつかの実施形態では、アミノ酸置換を含まないＦｃ領域を含む対応する抗体と比べて、Ｆｃ領域は、補体を活性化することなくクラスター化を増加させる。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体が特異的に結合する標的の１つ以上の活性を誘導する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭｅｒＴＫに結合する。

【0276】

また、抗体のエフェクター機能を改変し、及び／または血清中半減期を延長するために、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体を改変することが望ましい場合がある。例えば、定常領域上のＦｃ受容体結合部位を改変または変異させて、特定のＦｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及び／またはＦｃγＲＩＩＩに対する結合親和性を除去または低減して、抗体依存性細胞傷害を低下させてもよい。いくつかの実施形態では、抗体のＦｃ領域（例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン中）のＮ－グリコシル化を除去することによって、エフェクター機能を低下させる。いくつかの実施形態では、ＷＯ９９／５８５７２及びＡｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：５８５－５９３（２００３）、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：１９２５－１９３３（２０００）に記載されているように、ヒトＩｇＧの２３３～２３６、２９７、及び／または３２７～３３１などの領域を改変することによって、エフェクター機能を低下させる。他の実施形態では、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体を改変してエフェクター機能を改変して、ＩＴＩＭを含有するＦｃｇＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）に対する発見選択性を向上させて、抗体依存性細胞傷害及び抗体依存性細胞貪食を含む体液性反応を活性化することなく、隣接細胞上でＭｅｒＴＫ抗体のクラスター化を増加させることも望ましい場合がある。

【0277】

抗体の血清半減期を延長するために、例えば、米国特許第５７３９２７７号に記載されるようなサルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体断片）中に組み込んでもよい。本明細書で使用する場合、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を延長させるのに貢献するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、またはＩｇＧ_４）のＦｃ領域のエピトープを指す。他のアミノ酸配列改変

【0278】

（６） 抗体バリアント
本明細書中で提供する抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。

【0279】

（ｉ） 置換、挿入、及び欠失バリアント
本明細書中で提供する抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントを提供する。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製してもよい。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／またはそこへ残基の挿入、及び／または残基の置換が含まれる。

【0280】

（表Ａ）アミノ酸置換

【0281】

抗体の生物学的特性の実質的な改変は、置換を選択することにより達成され、これらは、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはヘリックス立体配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの影響が有意に異なる。天然の残基は、一般的な側鎖特性に従って分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0282】

例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを含み得る。そのような置換残基を、例えば、非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域に、または分子の非相同領域に導入することができる。

【0283】

本明細書に記載のポリペプチドまたは抗体に変更を加える際に、特定の実施形態によれば、アミノ酸の親水性指標を考慮することができる。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいて親水性指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（－０．４）、スレオニン（－０．７）、セリン（－０．８）、トリプトファン（－０．９）、チロシン（－１．３）、プロリン（－１．６）、ヒスチジン（－３．２）、グルタミン酸（－３．５）、グルタミン（－３．５）、アスパラギン酸（－３．５）、アスパラギン（－３．５）、リジン（－３．９）、及びアルギニン（－４．５）である。

【0284】

タンパク質にインタラクティブな生物学的機能を付与する際の親水性アミノ酸指標の重要性は、Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５－１３１（１９８２）の技術分野で理解されている。特定のアミノ酸を、同様の親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用することができ、それでも同様の生物学的活性を保持することが知られている。親水性指標に基づいて変更する場合に、特定の実施形態では、親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。特定の実施形態では、±１の範囲内にある置換が含まれ、特定の実施形態では、±０．５の範囲内にある置換が含まれる。

【0285】

同様のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効果的に行うことができることも当技術分野では理解されており、特に、それによって作製される生物学的機能を有するタンパク質またはペプチドは、本明細書の場合のように、免疫学的実施形態における使用が意図されている。特定の実施形態では、タンパク質の最大の局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性に左右され、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。

【0286】

これらのアミノ酸残基には以下の親水性の値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０±１）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（－０．４）、プロリン（－０．５±１）、アラニン（－０．５）、ヒスチジン（－０．５）、システイン（－１．０）、メチオニン（－１．３）、バリン（－１．５）、ロイシン（－１．８）、イソロイシン（－１．８）、チロシン（－２．３）、フェニルアラニン（－２．５）、及びトリプトファン（－３．４）。同様の親水性の値に基づく変更の際に、特定の実施形態では、親水性の値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施形態では、±１以内のアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸の置換が含まれる。また、親水性に基づいて第一級アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は、「エピトープ性コア領域」とも呼ばれる。

【0287】

上記に示したバリアントＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＨＶＲは、未変更である。

【0288】

アミノ酸配列挿入には、長さが１残基～１００残基またはそれ以上を含むポリペプチドの範囲である、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端への融合、ならびに単一のまたは多数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型バリアントには、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用の）または抗体の血清半減期を延長させるポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。

【0289】

ＨＶＲの外側にあり、抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基も一般にセリンに置換して、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を阻止してもよい。逆に、システイン結合（複数可）を抗体に付加して、その安定性を向上させてもよい（具体的には、抗体がＦｖフラグメントなどの抗体断片である場合）。

【0290】

（ｉｉ） グリコシル化バリアント
本明細書に提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように抗体を改変する。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、または除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって簡便に遂行され得る。

【0291】

抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド内でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖類であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも使用され得る。

【0292】

抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた、元の抗体の配列に１つ以上のセリン残基もしくはスレオニン残基を付加するか、これらの残基で置換することによっても行ってもよい（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。

【0293】

抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合した炭水化物を改変してもよい。哺乳類細胞によって産生される天然抗体は、通常、一般にＮ－結合によって、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７（Ｋａｂａｔ付番に従う）に結合される、分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖類構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の抗体中におけるオリゴ糖の修飾を、特定の特性の改善を有する抗体バリアントを作製するために行ってもよい。

【0294】

一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントを提供する。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号及び第２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｄ３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）、ＵＳ２００３／０１５７１０８）、及びα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株が挙げられる（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）及びＫａｎｄａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（４）：６８０－６８８（２００６）を参照のこと）。

【0295】

（ｉｉｉ） 改変された定常領域
本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体Ｆｃは、抗体Ｆｃのアイソタイプ及び／または改変型である。いくつかの実施形態では、抗体Ｆｃアイソタイプ及び／または改変型は、Ｆｃγ受容体に結合することができる。

【0296】

本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、改変型抗体Ｆｃは、ＩｇＧ１改変型Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、１つ以上の改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域と比較して）。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｎ２９７Ａ（Ｂｏｌｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：４０３－４１１）、Ｄ２６５Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，６５９１－６６０４）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９２：１１９８０－１１９８４；Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７－１５４３．３１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：１６－２６）、Ｇ２３７Ａ（Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７－１５４３．３１；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：１６－２６）、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ（ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１０９：１１８５－１１９２）、Ｐ３３１Ｓ（Ｓａｚｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００８，１０５：２０１６７－２０１７２）、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及び／またはＴ２５６Ｅから選択される（アミノ酸の位置は、ＥＵ付番規則に従う）。

【0297】

ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＮ２９７Ａ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＤ２６５Ａ及びＮ２９７Ａ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＤ２７０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＰ２３８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｅ２３３、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、及びＡ３３０Ｒ変異のうちの１つ以上（すべてを含む）を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＰ２３８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、及びＡ３３０Ｒ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＰ２３８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、及びＡ３３０Ｒ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＰ２３８Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｅ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、及びＡ３３０Ｒ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＰ２３８Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｅ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、及びＡ３３０Ｒ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、及びＬ２３５Ａ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３３１Ｓ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＮ３２５Ｓ及びＬ３２８Ｆ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＳ２６７Ｅ変異を含む。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、κ軽鎖と共に、ＩｇＧ１の定常重鎖１（ＣＨ１）及びヒンジ領域から、ＩｇＧ２のＣＨ１及びヒンジ領域（ＥＵ付番に従うＩｇＧ２のアミノ酸１１８～２３０）への置換を含む。

【0298】

ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、２つ以上のアミノ酸置換を含まないＦｃ領域を有する対応する抗体と比較して、補体を活性化することなく、抗体のクラスター化を増加させる２つ以上のアミノ酸置換を含む。したがって、ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、Ｆｃ領域を含む抗体であり、この抗体は、位置Ｅ４３０Ｇのアミノ酸置換と、ＥＵ付番に従うＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、Ｋ３２２Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、及びこれらの任意の組み合わせから選択される残基位置においてＦｃ領域内に１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｌ２４３Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ及びＫ３２２Ａにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｋ３２２Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｋ３２２Ａ、及びＡ３３０Ｓにアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｋ３２２Ａ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。

【0299】

ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、補体活性化を排除するために、本明細書において、ＥＵ付番規則に従うＡ３３０Ｌ変異（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３：４００５－４０１０（２００６））、またはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及び／またはＰ３３１Ｓ変異（Ｓａｚｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０５：２０１６７－２０１７２（２００８））のうちの１つ以上を組み合わせてさらに含み得る。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＡ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及び／またはＰ３３１Ｓのうちの１つ以上をさらに含み得る。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、ヒト血清中の抗体半減期を延長させる１つ以上の変異（例えば、ＥＵ付番規則に従うＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅのうちの１つ以上（すべてを含む）の変異）をさらに含み得る。ＩｇＧ１改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１改変型Ｆｃは、Ｅ４３０Ｇ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、Ｅ４３０Ｔ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｓ４４０Ｙ、及び／またはＳ４４０Ｗのうちの１つ以上をさらに含み得る。

【0300】

本開示の他の態様は、改変された定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）を有する抗体に関する。標的とされた受容体を活性化するためにＦｃｇＲ受容体に対する結合に依存する抗体は、ＦｃｇＲ結合を排除するように改変された場合、そのアゴニスト活性を喪失し得る（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １９：１０１－１１３（２０１１）；Ａｒｍｏｕｒ ａｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：５８５－５９３（２００３）；及びＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２７：１３８－１４８（２０１５）を参照されたい）。したがって、正しいエピトープ特異性を有する本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体は、その抗体がヒトＩｇＧ２アイソタイプ由来のＦｃドメイン（ＣＨ１及びヒンジ領域）または阻害性ＦｃｇＲＩＩＢ ｒ受容体に優先的に結合することができる別のタイプのＦｃドメイン、またはそのバリアントを有する場合、最小限の副作用で標的抗原を活性化することができると考えられる。

【0301】

本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、改変型抗体Ｆｃは、ＩｇＧ２改変型Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２改変型Ｆｃは、１つ以上の改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２改変型Ｆｃは、１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域と比較して）。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、ＥＵ付番規則に従うＶ２３４Ａ（Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７－１５４３（１９９４）；Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：１６－２６（２０００））；Ｇ２３７Ａ（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６８：５６３－５７１（１９９９））；Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ（ＵＳ２００７／０１４８１６７；Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２６１３－２６２４（１９９９）；Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １（Ｓｕｐｐｌ．１）：２７（２０００）；Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １（Ｓｕｐｐｌ．１）：２７（２０００））、Ｃ２１９Ｓ、及び／またはＣ２２０Ｓ（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２７，１３８－１４８（２０１５））；Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４５：３９２６－３９３３（２００８））；ならびにＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及び／またはＴ２５６Ｅから選択される。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｖ２３４Ａ及びＧ２３７Ａにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｃ２１９Ｓ及びＣ２２０Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆにアミノ酸置換を含む。

【0302】

ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番規則に従うＣ１２７Ｓアミノ酸置換を含む（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２７，１３８－１４８；Ｌｉｇｈｔｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９：７５３－７６２（２０１０）；及びＷＯ２００８／０７９２４６）。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、κ軽鎖定常ドメインと共にＩｇＧ２アイソタイプを有し、ＥＵ付番規則に従うＣ２１４Ｓアミノ酸置換を含む（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２７：１３８－１４８（２０１５）；Ｌｉｇｈｔｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９：７５３－７６２（２０１０）；及びＷＯ２００８／０７９２４６）。

【0303】

ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番規則に従うＣ２２０Ｓアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、κ軽鎖定常ドメインと共にＩｇＧ２アイソタイプを有し、ＥＵ付番規則に従うＣ２１４Ｓアミノ酸置換を含む。

【0304】

ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番規則に従うＣ２１９Ｓアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、κ軽鎖定常ドメインと共にＩｇＧ２アイソタイプを有し、ＥＵ付番規則に従うＣ２１４Ｓアミノ酸置換を含む。

【0305】

ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ２アイソタイプ重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）及びヒンジ領域を含む（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２７：１３８－１４８（２０１５））。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかの特定の実施形態では、ＩｇＧ２アイソタイプＣＨ１及びヒンジ領域は、ＥＵ付番に従う１１８～２３０のアミノ酸配列を含む。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体Ｆｃ領域は、ＥＵ付番規則に従うＳ２６７Ｅアミノ酸置換、Ｌ３２８Ｆアミノ酸置換、もしくはその両方、及び／またはＮ２９７ＡもしくはＮ２９７Ｑアミノ酸置換を含む。

【0306】

ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ、Ｅ４３０Ｔ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｓ４４０Ｙ、及びＳ４４０Ｗにおいて１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒト血清中の抗体半減期を延長させる１つ以上の変異（例えば、ＥＵ付番規則に従うＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅのうちの１つ以上（すべてを含む）の変異）をさらに含み得る。ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓをさらに含み得る。

【0307】

ＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、ＦｃはＩｇＧ２／４ハイブリッドＦｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２／４ハイブリッドＦｃは、ＩｇＧ２のアミノ酸１１８～２６０及びＩｇＧ４のアミノ酸２６１～４４７を含む。任意のＩｇＧ２改変型Ｆｃのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓに１つ以上のアミノ酸置換を含む。

【0308】

ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＡ３３０Ｌ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、またはＰ３３１Ｓ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の追加のアミノ酸置換を含む。

【0309】

ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかの特定の実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＣ１２７Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、Ｋ３２２Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、Ｓ４４０Ｙ、及びこれらの任意の組み合わせから選択される残基位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｌ２４３Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ及びＫ３２２Ａにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｋ３２２Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｋ３２２Ａ、及びＡ３３０Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｋ３２２Ａ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｃ１２７Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ１及び／またはＩｇＧ２改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、及びＳ４４０Ｙにアミノ酸置換を含む。

【0310】

本明細書で提供される抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、改変型抗体Ｆｃは、ＩｇＧ４改変型Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４改変型Ｆｃは、１つ以上の改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４改変型Ｆｃは、１つ以上のアミノ酸置換を含む（例えば、同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域と比較して）。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、ＥＵ付番規則に従うＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ２２９Ｐ、Ｌ２３６Ｅ（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１９２５－１９３３（２０００））、Ｓ２６７Ｅ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及び／またはＴ２５６Ｅから選択される。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番規則に従うＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａをさらに含み得る。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番規則に従うＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅをさらに含み得る。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ４改変型Ｆｃは、ＥＵ付番規則に従うＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆをさらに含み得る。

【0311】

ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体の安定化を高めるために、ＩｇＧ４改変型Ｆｃは、ＥＵ付番規則（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５－１０８（１９９３））に従うＳ２２８Ｐ変異、及び／または（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８７（２９）：２４５２５－３３（２０１２））に記載されている１つ以上の変異と組み合わせて含む。

【0312】

ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ４改変型Ｆｃは、ヒト血清中の抗体半減期を延長させる１つ以上の変異（例えば、ＥＵ付番規則に従うＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅのうちの１つ以上（すべてを含む）の変異）をさらに含み得る。

【0313】

ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＬ２３５Ｅを含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかの特定の実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従うＣ１２７Ｓ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、Ｋ３２２Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、Ｓ４４０Ｙ、及びこれらの任意の組み合わせから選択される残基位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ、Ｌ２４３Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ及びＰ３３１Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ及びＫ３２２Ａにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０にアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵ付番に従う位置Ｅ４３０Ｇ及びＫ３２２Ａにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｃ１２７Ｓにアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ４改変型Ｆｃのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＥＵ付番に従う位置Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、及びＳ４４０Ｙにアミノ酸置換を含む。

【0314】

他の抗体改変
抗体のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は誘導体である。用語「誘導体」とは、アミノ酸（または核酸）の挿入、欠失、または置換以外の化学的修飾を含む分子を指す。特定の実施形態では、誘導体は、ポリマー、脂質、または他の有機部分もしくは無機部分との化学結合を含むが、これらに限定されない共有結合修飾を含む。特定の実施形態では、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、化学的に修飾されていない抗原結合タンパク質よりも高い循環半減期を有し得る。特定の実施形態では、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織、及び／または器官に対する標的化能力を向上させることができる。いくつかの実施形態では、誘導体抗原結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない１つ以上の水溶性ポリマー結合剤を含むように共有結合により修飾される。例えば、米国特許第４６４０８３５号、第４４９６６８９号、第４３０１１４４号、第４６７０４１７号、第４７９１１９２号、及び第４１７９３３７号を参照のこと。特定の実施形態では、誘導体抗原結合タンパク質には、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）－ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール、ならびにそのようなポリマーの混合物を含むがこれらに限定されない、１つ以上のポリマーが含まれる。

【0315】

特定の実施形態では、誘導体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットを用いて共有結合で修飾する。特定の実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーを、誘導体の１つ以上の特定の位置、例えばアミノ末端に結合する。特定の実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーを、誘導体の１つ以上の側鎖にランダムに結合する。特定の実施形態では、ＰＥＧを使用して、抗原結合タンパク質の治療能力を向上させる。特定の実施形態では、ＰＥＧを使用して、ヒト化抗体の治療能力を向上させる。そのような特定の方法は、例えば米国特許第６１３３４２６号に記載されており、任意の目的のために参照により本明細書に援用される。

【0316】

ペプチド類似体は一般的に、鋳型ペプチドの特性に類似した特性を有する非ペプチド薬として製薬産業において使用される。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」または「ペプチド模倣薬」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１５：２９（１９８６）、及びＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７）、これは任意の目的で参照により本明細書に援用される。そのような化合物は、多くの場合、コンピュータ分子モデルの支援を借りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物を使用して、同様の治療的効果を生み出すことができる。一般的に、ペプチド模倣薬は、ヒト抗体などのパラジウムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、任意選択で、１つ以上のペプチド結合が、当技術分野で周知の方法によって、－ＣＨ_２ＮＨ－、－ＣＨ_２Ｓ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シス及びトランス）、－ＣＯＣＨ_２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－、ならびに－ＣＨ_２ＳＯ－から選択される結合に置換されている。特定の実施形態では、同一の種類のＤ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リジンの代わりにＤ－リジン）による、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の系統的な置換を使用して、より安定なペプチドを生成することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列バリアントを含む拘束されたペプチドを、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによって生成することができる（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：３８７（１９９２）、任意の目的のために参照により本明細書に援用される）。

【0317】

薬物コンジュゲーションは、生物活性細胞傷害性（抗がん）ペイロードまたは薬物を、特定の腫瘍マーカー（例えば、理想的には、腫瘍細胞内または腫瘍細胞上にのみ認められるポリペプチド）を特異的に標的とする抗体にカップリングすることを伴う。抗体は、身体内でこれらのタンパク質を見つけ出し、それ自体をがん細胞の表面に結合させる。抗体と標的タンパク質（抗原）との生化学反応により腫瘍細胞内でシグナルが誘起され、次いで、細胞毒素と一緒に抗体が吸収または内在化される。ＡＤＣが内在化した後に細胞傷害薬が放出され、がんを死滅させる。この標的化により、理想的には、薬物は、他の化学療法剤よりも低い副作用を有し、より広い治療ウインドウを提供する。抗体をコンジュゲートする技法は、当技術分野において開示されており、公知である（例えば、Ｊａｎｅ ｄｅ Ｌａｒｔｉｇｕｅ ＯｎｃＬｉｖｅ Ｊｕｌｙ ５，２０１２；ＡＤＣ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；及びＤｕｃｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１（１）：５－１３（２０１０）を参照のこと。

【0318】

ＶＩ． 核酸、ベクター、及び宿主細胞
本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載の組換え方法及び組成物を使用して産生され得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸を提供する。そのような核酸は、抗ＭｅｒＴＫ抗体のＶ_Ｌを含むアミノ酸配列及び／またはＶ_Ｈを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードしていてもよい。いくつかの実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶ_Ｌを含むアミノ酸配列及び抗体のＶ_Ｈを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶ_Ｌを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶ_Ｈを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらを形質導入されている）。

【0319】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体の軽鎖（軽鎖はＶ_Ｌを含む）を含むアミノ酸配列をコードする核酸、及び（２）抗体の重鎖（重鎖はＶ_Ｈを含む）を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含み、その場合、ＶＬとＶＨは、ＭｅｒＴＫに結合する抗原結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体の軽鎖（軽鎖はＶ_Ｌを含む）を含むアミノ酸配列をコードする核酸、（２）抗体の重鎖（重鎖はＶ_Ｈを含む）を含むアミノ酸配列をコードする核酸、及び（３）重鎖（重鎖はＶ_Ｈを含まない）の断片（例えば、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む重鎖の断片）をコードする核酸を含み（例えば、それらを形質導入されており）、Ｖ_ＬとＶ_Ｈは、ＭｅｒＴＫに結合する抗原結合ドメインを形成する。核酸は、同じベクター内にあってもよいし、異なるベクター内にあってもよい。

【0320】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。本開示の宿主細胞にはまた、限定されないが、単離された細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞、及びｅｘ ｖｉｖｏ培養細胞が含まれる。

【0321】

本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、抗ＭｅｒＴＫ抗体をコードする核酸を含む本開示の宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することを含む。いくつかの実施形態では、抗体を、その後、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収する。

【0322】

本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体を組み換え生成するには、抗ＭｅｒＴＫ抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／または発現のために１つ以上のベクター中に挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定することができる。

【0323】

本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体、または本明細書に記載のその細胞表面発現断片もしくはポリペプチド（抗体を含む）のうちのいずれかをコードする核酸配列を含む好適なベクターとしては、限定されないが、クローニングベクター及び発現ベクターが挙げられる。好適なクローニングベクターは、標準的技術に従って構築することができ、あるいは当技術分野において入手可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択されるクローニングベクターは、使用予定の宿主細胞に応じて変わり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製能を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を有していてもよく、及び／またはベクターを含むクローンの選択に用いることができるマーカーの遺伝子を保持していてもよい。好適な例としては、プラスミド及び細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）及びその誘導体、ｍｐｌ８、ｍｐｌ９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えばｐＳＡ３及びｐＡＴ２８が挙げられる。これら及び多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの市販ベンダーから入手可能である。

【0324】

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、原核生物細胞または真核生物細胞が挙げられる。例えば、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には、細菌において産生してもよい。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号、及び第５８４０５２３号を参照されたい。発現後、抗体を、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離してもよく、さらに精製することができる。

【0325】

原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物もまた、抗体をコードするベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす、真菌株及び酵母株が含まれる（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）；及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６））。

【0326】

グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から得ることもできる。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と共に、特に、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用することができる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる（例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号、及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載されている））。

【0327】

脊椎動物細胞もまた、宿主として使用してもよい。例えば、懸濁液中で増殖するように適合される哺乳類細胞株は、有用であり得る。有用な宿主哺乳類細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胚性腎臓株（２９３細胞または例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されているような２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ科腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載のＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な宿主哺乳類細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０，ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適な特定の宿主哺乳類細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。

【0328】

ＶＩＩ． 医薬組成物／製剤
本明細書において、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物及び／または医薬製剤を提供する。

【0329】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、好ましくは、使用する用量及び濃度においてレシピエントに対して無毒性である。ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用する医薬組成物及び／または医薬製剤は、無菌であり得る。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。

【0330】

本明細書で提供する医薬組成物及び／または医薬製剤は、例えばがんを治療するための医薬品として有用である。

【0331】

ＶＩＩＩ． 治療用途
本明細書に開示されるように、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、疾患及び障害の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体の治療方法を提供する。

【0332】

ＭｅｒＴＫの異所性または発現は様々な腫瘍で観察されており、ＭｅｒＴＫの過剰発現及び活性化は、リンパ性白血病、リンパ腫、腺腫、黒色腫、胃癌、前立腺癌、及び乳癌に関係しており、そしてＭｅｒＴＫの過剰発現は転移と関連している。（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２３：２２５７－２２６７；Ｔｗｏｒｋｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｌａｎｏｍａ，２６：５２７－５４１；Ｙｉ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：９６６５６－９６６６７；Ｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｂｌｏｏｄ，１２２：１５９９－１６０９；Ｌｅｅ－Ｓｈｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３２：５３５９－５３６８；Ｂｒａｎｄａｏ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ，３：ｅ１０１；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，６：９２０６－９２１９；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１１：４３）。したがって、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体を用いてＭｅｒＴＫの活性を調節することは、がん治療の有効な手段である。

【0333】

特定の態様では、本明細書において、治療を必要とする対象におけるがんの治療方法を提供し、この方法は、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体、または本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象におけるがんの治療方法を提供し、この方法は、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体を対象に投与することを含み、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、食細胞によるエフェロサイトーシスを低減する。

【0334】

いくつかの実施形態では、がんは、肉腫、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮体癌、腎臓癌、腎癌、白血病、肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、甲状腺癌、子宮癌、肝臓癌、子宮頸癌、精巣癌、扁平上皮癌、神経膠腫、神経膠芽腫、腺腫、及び神経芽腫から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、多形神経膠芽腫、膀胱癌、及び食道癌から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、三種陰性乳癌である。いくつかの実施形態では、がんは、原発性腫瘍であってもよい。いくつかの実施形態では、がんは、上記がん種のいずれかに由来する、第２部位の転移性腫瘍であってもよい。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、治療を必要とする対象におけるがんの治療に有用であり、その場合、がんはＭｅｒＴＫを発現している。

【0335】

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、チェックポイント阻害剤として作用する１つ以上の治療剤と併せて投与してもよい。いくつかの実施形態では、方法は、抑制性免疫チェックポイント分子に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を個体に投与し、及び／または別の標準的もしくは治験中の抗がん療法を実施することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抑制性チェックポイント分子は、ＰＤ１、ＰＤＬ１、及びＰＤ－Ｌ２から選択され、いくつかの実施形態では、抑制性チェックポイント分子に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体と組み合わせて投与する。

【0336】

いくつかの実施形態では、抑制性チェックポイント分子に特異的に結合する少なくとも１つの抗体は、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、及び抗ＰＤ－１抗体から選択される。

【0337】

いくつかの実施形態では、対象または個体は哺乳類である。哺乳類には、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。いくつかの実施形態では、対象または個体はヒトである。

【0338】

ＩＸ． 製品
本明細書において、本明細書に記載の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体を含む製品（例えば、キット）を提供する。製品は、本明細書に記載の抗体を含む１つ以上の容器を含み得る。容器は、バイアル、ボトル、瓶、可撓性パッケージング（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）などを含むが、これらに限定されない任意の好適なパッケージングであり得る。容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数回用量包装）または分割単位用量でもよい。

【0339】

いくつかの実施形態では、キットはさらに第２の剤を含み得る。いくつかの実施形態では、第２の剤は、以下を含む、薬学的に許容される緩衝剤または希釈剤である。いくつかの実施形態では、第２の剤は、薬学的に活性な剤である。

【0340】

製品のいずれかのいくつかの実施形態では、製品は、本開示の方法に従って使用するための説明書をさらに含む。説明書は、一般に、目的の治療のための用量、投与計画、及び投与経路に関する情報を含む。いくつかの実施形態では、これらの説明書は、本開示の任意の方法に従って、疾患、障害、または損傷を有する個体を治療するための、本開示の単離された抗体（例えば、本明細書に記載の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体）の投与の説明を含む。いくつかの実施形態では、説明書は、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体及び第２の剤（例えば、第２の薬学的に活性な剤）を使用するための説明を含む。

【0341】

本開示は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本開示全体におけるすべての引用文献は、参照により本明細書に明示的に援用される。

【実施例】

【0342】

実施例１：Ｈｉｓとコンジュゲートされた及びマウスＦｃとコンジュゲートされた、ＭｅｒＴＫポリペプチドの産生
本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体の生成及び特徴決定に使用するためのポリＨｉｓまたはＴＥＶＳ／トロンビン／マウスＩｇＧ２ａ－Ｆｃタグ付き融合タンパク質を含むヒト、カニクイザル、及びマウスＭｅｒＴＫポリペプチドを以下のように生成した。ヒトＭｅｒＴＫ（配列番号２）、カニクイザルＭｅｒＴＫ（配列番号３）、及びマウスＭｅｒＴＫ（配列番号４）の細胞外領域（ＥＣＤ）をコードする核酸を、異種シグナルペプチドをコードする核酸、及びポリＨｉｓ ＦｃタグまたはＴＥＶＳ／トロンビン／マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタグのいずれかを含む哺乳類発現ベクターにクローニングした。

【0343】

ヒトＭｅｒＴＫ、ヒトＭｅｒＴＫ細胞外ドメイン、カニクイザルＭｅｒＴＫ細胞外ドメイン、及びマウスＭｅｒＴＫ細胞外ドメインのアミノ酸配列を以下に記載する。

【0344】

ヒトＭｅｒＴＫアミノ酸配列（配列番号１）：
ｍｇｐａｐｌｐｌｌｌｇｌｆｌｐａｌｗｒｒａｉｔｅａｒｅｅａｋｐｙｐｌｆｐｇｐｆｐｇｓｌｑｔｄｈｔｐｌｌｓｌｐｈａｓｇｙｑｐａｌｍｆｓｐｔｑｐｇｒｐｈｔｇｎｖａｉｐｑｖｔｓｖｅｓｋｐｌｐｐｌａｆｋｈｔｖｇｈｉｉｌｓｅｈｋｇｖｋｆｎｃｓｉｓｖｐｎｉｙｑｄｔｔｉｓｗｗｋｄｇｋｅｌｌｇａｈｈａｉｔｑｆｙｐｄｄｅｖｔａｉｉａｓｆｓｉｔｓｖｑｒｓｄｎｇｓｙｉｃｋｍｋｉｎｎｅｅｉｖｓｄｐｉｙｉｅｖｑｇｌｐｈｆｔｋｑｐｅｓｍｎｖｔｒｎｔａｆｎｌｔｃｑａｖｇｐｐｅｐｖｎｉｆｗｖｑｎｓｓｒｖｎｅｑｐｅｋｓｐｓｖｌｔｖｐｇｌｔｅｍａｖｆｓｃｅａｈｎｄｋｇｌｔｖｓｋｇｖｑｉｎｉｋａｉｐｓｐｐｔｅｖｓｉｒｎｓｔａｈｓｉｌｉｓｗｖｐｇｆｄｇｙｓｐｆｒｎｃｓｉｑｖｋｅａｄｐｌｓｎｇｓｖｍｉｆｎｔｓａｌｐｈｌｙｑｉｋｑｌｑａｌａｎｙｓｉｇｖｓｃｍｎｅｉｇｗｓａｖｓｐｗｉｌａｓｔｔｅｇａｐｓｖａｐｌｎｖｔｖｆｌｎｅｓｓｄｎｖｄｉｒｗｍｋｐｐｔｋｑｑｄｇｅｌｖｇｙｒｉｓｈｖｗｑｓａｇｉｓｋｅｌｌｅｅｖｇｑｎｇｓｒａｒｉｓｖｑｖｈｎａｔｃｔｖｒｉａａｖｔｒｇｇｖｇｐｆｓｄｐｖｋｉｆｉｐａｈｇｗｖｄｙａｐｓｓｔｐａｐｇｎａｄｐｖｌｉｉｆｇｃｆｃｇｆｉｌｉｇｌｉｌｙｉｓｌａｉｒｋｒｖｑｅｔｋｆｇｎａｆｔｅｅｄｓｅｌｖｖｎｙｉａｋｋｓｆｃｒｒａｉｅｌｔｌｈｓｌｇｖｓｅｅｌｑｎｋｌｅｄｖｖｉｄｒｎｌｌｉｌｇｋｉｌｇｅｇｅｆｇｓｖｍｅｇｎｌｋｑｅｄｇｔｓｌｋｖａｖｋｔｍｋｌｄｎｓｓｑｒｅｉｅｅｆｌｓｅａａｃｍｋｄｆｓｈｐｎｖｉｒｌｌｇｖｃｉｅｍｓｓｑｇｉｐｋｐｍｖｉｌｐｆｍｋｙｇｄｌｈｔｙｌｌｙｓｒｌｅｔｇｐｋｈｉｐｌｑｔｌｌｋｆｍｖｄｉａｌｇｍｅｙｌｓｎｒｎｆｌｈｒｄｌａａｒｎｃｍｌｒｄｄｍｔｖｃｖａｄｆｇｌｓｋｋｉｙｓｇｄｙｙｒｑｇｒｉａｋｍｐｖｋｗｉａｉｅｓｌａｄｒｖｙｔｓｋｓｄｖｗａｆｇｖｔｍｗｅｉａｔｒｇｍｔｐｙｐｇｖｑｎｈｅｍｙｄｙｌｌｈｇｈｒｌｋｑｐｅｄｃｌｄｅｌｙｅｉｍｙｓｃｗｒｔｄｐｌｄｒｐｔｆｓｖｌｒｌｑｌｅｋｌｌｅｓｌｐｄｖｒｎｑａｄｖｉｙｖｎｔｑｌｌｅｓｓｅｇｌａｑｇｓｔｌａｐｌｄｌｎｉｄｐｄｓｉｉａｓｃｔｐｒａａｉｓｖｖｔａｅｖｈｄｓｋｐｈｅｇｒｙｉｌｎｇｇｓｅｅｗｅｄｌｔｓａｐｓａａｖｔａｅｋｎｓｖｌｐｇｅｒｌｖｒｎｇｖｓｗｓｈｓｓｍｌｐｌｇｓｓｌｐｄｅｌｌｆａｄｄｓｓｅｇｓｅｖｌｍ

【0345】

ヒトＭｅｒＴＫ ＥＣＤアミノ酸配列（配列番号２）：
ＭＧＰＡＰＬＰＬＬＬＧＬＦＬＰＡＬＷＲＲＡＩＴＥＡＲＥＥＡＫＰＹＰＬＦＰＧＰＦＰＧＳＬＱＴＤＨＴＰＬＬＳＬＰＨＡＳＧＹＱＰＡＬＭＦＳＰＴＱＰＧＲＰＨＴＧＮＶＡＩＰＱＶＴＳＶＥＳＫＰＬＰＰＬＡＦＫＨＴＶＧＨＩＩＬＳＥＨＫＧＶＫＦＮＣＳＩＳＶＰＮＩＹＱＤＴＴＩＳＷＷＫＤＧＫＥＬＬＧＡＨＨＡＩＴＱＦＹＰＤＤＥＶＴＡＩＩＡＳＦＳＩＴＳＶＱＲＳＤＮＧＳＹＩＣＫＭＫＩＮＮＥＥＩＶＳＤＰＩＹＩＥＶＱＧＬＰＨＦＴＫＱＰＥＳＭＮＶＴＲＮＴＡＦＮＬＴＣＱＡＶＧＰＰＥＰＶＮＩＦＷＶＱＮＳＳＲＶＮＥＱＰＥＫＳＰＳＶＬＴＶＰＧＬＴＥＭＡＶＦＳＣＥＡＨＮＤＫＧＬＴＶＳＫＧＶＱＩＮＩＫＡＩＰＳＰＰＴＥＶＳＩＲＮＳＴＡＨＳＩＬＩＳＷＶＰＧＦＤＧＹＳＰＦＲＮＣＳＩＱＶＫＥＡＤＰＬＳＮＧＳＶＭＩＦＮＴＳＡＬＰＨＬＹＱＩＫＱＬＱＡＬＡＮＹＳＩＧＶＳＣＭＮＥＩＧＷＳＡＶＳＰＷＩＬＡＳＴＴＥＧＡＰＳＶＡＰＬＮＶＴＶＦＬＮＥＳＳＤＮＶＤＩＲＷＭＫＰＰＴＫＱＱＤＧＥＬＶＧＹＲＩＳＨＶＷＱＳＡＧＩＳＫＥＬＬＥＥＶＧＱＮＧＳＲＡＲＩＳＶＱＶＨＮＡＴＣＴＶＲＩＡＡＶＴＲＧＧＶＧＰＦＳＤＰＶＫＩＦＩＰＡＨＧＷＶＤＹＡＰＳＳＴＰＡＰＧＮＡＤＰＶＬＩＩ

【0346】

カニクイザルＭｅｒＴＫ ＥＣＤアミノ酸配列（配列番号３）：
ＭＧＬＡＰＬＰＬＰＬＬＬＧＬＦＬＰＡＬＷＳＲＡＩＴＥＡＲＥＥＡＫＰＹＰＬＦＰＧＰＬＰＧＳＬＱＴＤＨＴＳＬＬＳＬＰＨＴＳＧＹＱＰＡＬＭＦＳＰＴＱＰＧＲＰＹＴＧＮＶＡＩＰＲＶＴＳＡＧＳＫＬＬＰＰＬＡＦＫＨＴＶＧＨＩＩＬＳＥＨＫＤＶＫＦＮＣＳＩＳＶＰＮＩＹＱＤＴＴＩＳＷＷＫＤＧＫＥＬＬＧＡＨＨＡＩＴＱＦＹＰＤＤＥＶＴＡＩＩＡＳＦＳＩＴＳＶＱＲＳＤＮＧＳＹＩＣＫＭＫＩＮＮＥＥＩＶＳＤＰＩＹＩＥＶＱＧＬＰＨＦＴＫＱＰＥＳＭＮＶＴＲＮＴＡＦＮＬＴＣＱＡＶＧＰＰＥＰＶＮＩＦＷＶＱＮＳＳＲＶＮＥＱＰＥＫＳＰＳＶＬＴＶＰＧＬＴＥＭＡＶＦＳＣＥＡＨＮＤＫＧＬＴＶＳＫＧＶＱＩＮＩＫＡＩＰＳＰＰＴＥＶＳＩＨＮＳＴＡＨＳＩＬＩＳＷＶＰＧＦＤＧＹＳＰＦＲＮＣＳＶＱＶＫＥＶＤＰＬＳＮＧＳＶＭＩＦＮＴＳＡＳＰＨＭＹＱＩＫＱＬＱＡＬＡＮＹＳＩＧＶＳＣＭＮＥＩＧＷＳＡＶＳＰＷＩＬＡＳＴＴＥＧＡＰＳＶＡＰＬＮＶＴＶＦＬＮＥＳＲＤＮＶＤＩＲＷＭＫＰＬＴＫＲＱＡＧＥＬＶＧＹＲＩＳＨＶＷＱＳＡＧＩＳＫＥＬＬＥＥＶＧＱＮＮＳＲＡＱＩＳＶＱＶＨＮＡＴＣＴＶＲＩＡＡＶＴＫＧＧＶＧＰＦＳＤＰＶＫＩＦＩＰＡＨＧＷＶＤＨＡＰＳＳＴＰＡＰＧＮＡＤＰＶＬＩＩ

【0347】

マウスＭｅｒＴＫ ＥＣＤアミノ酸配列（配列番号４）：
ＭＶＬＡＰＬＬＬＧＬＬＬＬＰＡＬＷＳＧＧＴＡＥＫＷＥＥＴＥＬＤＱＬＦＳＧＰＬＰＧＲＬＰＶＮＨＲＰＦＳＡＰＨＳＳＲＤＱＬＰＰＰＱＴＧＲＳＨＰＡＨＴＡＡＰＱＶＴＳＴＡＳＫＬＬＰＰＶＡＦＮＨＴＩＧＨＩＶＬＳＥＨＫＮＶＫＦＮＣＳＩＮＩＰＮＴＹＱＥＴＡＧＩＳＷＷＫＤＧＫＥＬＬＧＡＨＨＳＩＴＱＦＹＰＤＥＥＧＶＳＩＩＡＬＦＳＩＡＳＶＱＲＳＤＮＧＳＹＦＣＫＭＫＶＮＮＲＥＩＶＳＤＰＩＹＶＥＶＱＧＬＰＹＦＩＫＱＰＥＳＶＮＶＴＲＮＴＡＦＮＬＴＣＱＡＶＧＰＰＥＰＶＮＩＦＷＶＱＮＳＳＲＶＮＥＫＰＥＲＳＰＳＶＬＴＶＰＧＬＴＥＴＡＶＦＳＣＥＡＨＮＤＫＧＬＴＶＳＫＧＶＨＩＮＩＫＶＩＰＳＰＰＴＥＶＨＩＬＮＳＴＡＨＳＩＬＶＳＷＶＰＧＦＤＧＹＳＰＬＱＮＣＳＩＱＶＫＥＡＤＲＬＳＮＧＳＶＭＶＦＮＴＳＡＳＰＨＬＹＥＩＱＱＬＱＡＬＡＮＹＳＩＡＶＳＣＲＮＥＩＧＷＳＡＶＳＰＷＩＬＡＳＴＴＥＧＡＰＳＶＡＰＬＮＩＴＶＦＬＮＥＳＮＮＩＬＤＩＲＷＴＫＰＰＩＫＲＱＤＧＥＬＶＧＹＲＩＳＨＶＷＥＳＡＧＴＹＫＥＬＳＥＥＶＳＱＮＧＳＷＡＱＩＰＶＱＩＨＮＡＴＣＴＶＲＩＡＡＩＴＫＧＧＩＧＰＦＳＥＰＶＮＩＩＩＰＥＨＳＫＶＤＹＡＰＳＳＴＰＡＰＧＮＴＤＳＭ

【0348】

ヒト、カニクイザル、及びマウスＭｅｒＴＫ核酸融合構築物を、ＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。組換え融合ポリペプチドを、製造業者の指示に従ってＭａｂｓｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７５１９９０２）を使用して、細胞の上清から精製した。さらに、市販のＤＤＤＤＫタグ付きヒトＭｅｒＴＫ融合ポリペプチド（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ，カタログ番号１０２９８－ＨＣＣＨ）またはヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグ付きマウスＭｅｒＴＫ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＡ，カタログ番号５９１－ＭＲ－１００）を、以下に記載されるように抗ＭｅｒＴＫ抗体を特徴決定するためにも使用した。

【0349】

実施例２：ヒト及びマウスＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ細胞株の生成
ヒトＭｅｒＴＫ及びマウスＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ細胞株を以下のように調製した。ヒトＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ－Ｋ１及びマウスＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ－Ｋ１の安定細胞株を調製するために、それぞれ、ヒトＭｅｒＴＫオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）クローンのレンチウイルス粒子（カタログ番号ＲＣ２１５２８９Ｌ４Ｖ）、及びマウスＭｅｒＴＫ ＯＲＦクローンのレンチウイルス粒子（カタログ番号ＭＲ２２５３９２Ｌ４Ｖ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（双方ともｍＧＦＰタグ付き）を使用した。

【0350】

ＣＨＯ細胞を、＞８０％のコンフルエントまで１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＦ１２－Ｋ培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＴＣＣ ３０－２００４）中で培養した。次いで、細胞をトリプシン緩衝液（０．２５％のＥＤＴＡ／トリプシン、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２０００５６）で解離し、ヒトまたはマウスのＭｅｒＴＫレンチウイルス構築物のいずれかによる形質導入の２４時間前に、６ウェルプレート内に７０～８０％の培養密度で播種した。翌日、細胞をレンチウイルス粒子と共に４℃で２時間インキュベートし、次いで、プレートを５％ＣＯ_２中、３７℃でインキュベートした。２日後、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号ａｎｔ－ｐｒ－１）を選択のために添加し、選択されたピューロマイシン耐性細胞を、引き続き使用するためにＣｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１２６４８０１０）中で凍結させた。

【0351】

これらの細胞株のＦＡＣＳ分析のために、上記のように生成したヒトＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞）及びマウスＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－マウスＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞）を、９６ウェルＵボトムプレート内に１～２×１０^５細胞／ウェルで播種し、市販のマウス抗ヒトＭｅｒＴＫモノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，クローン：５９０Ｈ１１Ｇ１Ｅ３、カタログ番号３６７６０８、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または市販のラット抗マウスＭｅｒＴＫモノクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，クローン：ＤＳ５ＭＭＥＲ，カタログ番号１２－５７５１－８２）と共に、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳ＋ＰＢＳ）で２回濯ぎ、次いでＡＰＣとコンジュゲートされたヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，カタログ番号１１５－６０６－０７１）またはヤギ抗ラット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１２－６０６－０７１）と共に氷上で３０分間インキュベートした。二次抗体インキュベーションの後、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで０．２５μｌ／ウェルのヨウ化プロピジウム（ＢＤ，カタログ番号５５６４６３）を含有する最終容量５０～２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析を実施した。

【0352】

得られたヒトＭｅｒＴＫ及びマウスＭｅｒＴＫ過剰発現（ＯＥ）ＣＨＯ細胞株を、以下に記載するように抗ＭｅｒＴＫ抗体を特徴決定するための後続の試験に使用した。

【0353】

実施例３：抗ＭｅｒＴＫハイブリドーマ抗体の生成
抗ＭｅｒＴＫハイブリドーマを生成するために、以下の実験を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）またはＭｅｒＴＫノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、アジュバントの存在下または非存在下で、ヒト、カニクイザル、及びマウスＭｅｒＴＫの精製細胞外ドメインポリペプチド（上記の実施例１で得られたもの）の皮下または腹腔内注射により週２回免疫した。計８回の注射を４週間にわたって実施した。最終注射の３日後に、ハイブリドーマ細胞株を生成するためにマウスから脾臓及びリンパ節を採取した。

【0354】

免疫したマウスの脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離し、次いでエレクトロフュージョン（Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ，ＢＴＸ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を介してＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＣＲＬ－１５８０，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）またはＳＰ２／ｍＩＬ－６（ＣＲＬ－２０１６，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）マウスミエローマ細胞と融合させ、３７℃、５％ＣＯ_２にて、Ｃｌｏｎａｃｅｌｌ－ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ，カタログ番号０３８０３）中で一晩インキュベートした。翌日、融合細胞を遠心分離し、抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で１０ｍｌのＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃに再懸濁し、次いでＨＡＴ成分を含有する９０ｍｌのメチルセルロース系ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０３８０４）と穏やかに混合した。細胞をＮｕｎｃ ＯｍｎｉＴｒａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｓｔｅｒ，ＮＹ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２にて７日間にわたって増殖させた。次いで、蛍光コロニーを選択し、Ｃｌｏｎｅｌｐｉｘ ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用してＣｌｏｎａｃｅｌｌ－ＨＹ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０３８０５）を含有する９６ウェルプレートに移した。培養６日後、以下に記載するようにヒトＭｅｒＴＫまたはマウスＭｅｒＴＫへの結合特異性について、ハイブリドーマ由来の組織培養上清をＦＡＣＳ分析によりスクリーニングした。

【0355】

実施例４：ＦＡＣＳによる抗ＭｅｒＴＫ抗体ハイブリドーマ上清のスクリーニング
上記のようにして得られたハイブリドーマ培養上清を、ヒトＭｅｒＴＫを安定に過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞）またはマウスＭｅｒＴＫを安定に過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－マウスＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞）（上記のように生成した）、及びＣＨＯ親細胞；Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５９３．２）、ＳＫ－ＭＥＬ－５細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－７０）（ヒトＭｅｒＴＫを内在的に発現する）、Ｊ７７４Ａ．１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－６７）（マウスＭｅｒＴＫを内在的に発現する）、及びＡ３７５細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６１９）を含む様々な細胞型上のＭｅｒＴＫに結合する能力についてスクリーニングした。ＭｅｒＴＫの発現を示さないかまたは最小限しか示さないＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－２０２）は、これらの実験においてＭｅｒＴＫを発現しない陰性対照細胞として機能した。

【0356】

ハイブリドーマ細胞培養上清のスクリーニングのために、多重ＦＡＣＳ実験設計を利用して、これらの多重細胞株への抗ＭｅｒＴＫ抗体の結合を測定した。簡潔に述べると、細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ細胞増殖色素ＣＦＳＥ及びＶｉｏｌｅｔ（それぞれ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５４及びカタログ番号３４５５７）の様々な濃度及び組合せで染色して、一意的なバーコード付き細胞集団を作製した。各バーコード付き細胞型の細胞７０，０００個を９６ウェルＵ底プレートにアリコートし、ハイブリドーマ細胞培養上清５０μｌまたは５μｇ／ｍｌの市販の精製マウス抗ヒトＭｅｒＴＫモノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号３６７６０２；陽性抗ＭｅｒＴＫ抗体として役立つ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。この一次抗ＭｅｒＴＫハイブリドーマ上清を様々なＭｅｒＴＫ発現細胞型と共にインキュベートした後、上清を遠心分離により除去し、１７５μｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，カタログ番号１１５－１３６－０７１）（希釈１：１０００）と共に、氷上で２０分間、さらにインキュベートした。この二次抗体インキュベーションの後、細胞を再度氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、０．２５μｌ／ウェルのヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５６４６３）を含有する最終容量３０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞への結合強度を分析し、ソーティングゲートを抜き出して、死（すなわち、ヨウ化プロピジウム陽性）細胞を除外した。各バーコード付き細胞集団に対するＡＰＣ平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比を、試験した抗ＭｅｒＴＫハイブリドーマ上清ごとに測定した。

【0357】

この特異的なハイブリドーマ上清スクリーニングから、ヒトまたはマウスＭｅｒＴＫを安定に過剰発現するまたは内在的に発現する細胞への結合（ＭＦＩにより測定）において、親または陰性対照の細胞型で観察される結合と比較して２倍超の差を示す抗ＭｅｒＴＫハイブリドーマクローンを同定した。このスクリーニングを用いて同定された抗ＭｅｒＴＫ抗体について、さらに以下に記載するように特徴決定した。

【0358】

実施例５：組換えＭｅｒＴＫタンパク質結合アッセイによる抗ＭｅｒＴＫ抗体ハイブリドーマ上清のスクリーニング
上記のようにして得られたハイブリドーマ培養上清を、無関係なＨｉｓタグ付き対照タンパク質への結合と比較して、ポリＨｉｓタグ付きのヒト、カニクイザル、及びマウスＭｅｒＴＫ（実施例１において、上記のように調製した）に結合するそれらの能力についてスクリーニングした。簡潔に述べると、９６ウェルポリスチレンプレートを、コーティング緩衝液（０．０５Ｍカーボネート緩衝液，ｐＨ９．６，Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｃ３０４１）中の１μｇ／ｍｌのヒト、カニクイザル、またはマウスポリＨｉｓタグ付きＭｅｒＴＫポリペプチドと共に４℃で一晩コーティングした。次いで、コーティングしたプレートをＥＬＩＳＡ希釈剤（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１時間ブロッキングし、３００μｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｈｅｒｍｏ２８３５２）で３回洗浄した。ハイブリドーマ細胞培養上清または２つの市販の精製マウス抗ヒトＭｅｒＴＫモノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ カタログ番号３６７６０２；Ｒ＆Ｄカタログ番号ＭＡＢ８９１２）を各ウェルに添加した（５０μｌ／ウェル）。３０分間のインキュベーション（室温、振盪）後、プレートを３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１５－０３５－０７１）二次抗体をＥＬＩＳＡ希釈液で１：５０００に希釈し、各ウェルに５０μｌ／ウェルで添加し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。最後の一連の洗浄（ＰＢＳＴ中３×３００μｌ）の後に、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ＢｉｏＦｘ，カタログ番号ＴＭＢＷ－１０００－０１）をウェルに添加した。次いで、５～１０分後に５０μｌ／ウェルの停止液（ＢｉｏＦｘ，カタログ番号ＢＳＴＰ－１０００－０１）で反応をクエンチした。クエンチした反応ウェルを、ＧＥＮ５ ２．０４ソフトウェアを用いたＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで６５０ｎｍでの吸光度について検出した。このハイブリドーマ上清スクリーニングから、バックグラウンドに対して組換えＭｅｒＴＫとの結合に１０倍超の差を示す抗ＭｅｒＴＫハイブリドーマクローンを同定した。このスクリーニングを用いて同定された抗ＭｅｒＴＫ抗体について、さらに以下に記載するように特徴決定した。

【0359】

実施例６：抗ＭｅｒＴＫ抗体の分子クローニング
上記のハイブリドーマ由来の抗ＭｅｒＴＫ抗体を以下のようにサブクローニングした。５ｘ１０^５ハイブリドーマ細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、次いで細胞ペレットをドライアイス中でフラッシュ凍結し、－２０℃で保存した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，カタログ番号７４１０４）を使用して、製造業者のプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，カタログ番号６３４８５９）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってｃＤＮＡを生成した。可変重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン領域を、ＲＡＣＥキットに付属の５’ＵＰＭプライマーと、重鎖及び軽鎖定常領域を認識するリバースプライマーとを使用したタッチダウンＰＣＲによって個別にクローニングした。得られたＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯクローニングベクター（ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号４５０６４１）にライゲートし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換コロニーを単離し、それぞれの対応するハイブリドーマ細胞株について、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の核酸を配列決定した。配列決定に続いて、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を、エンドヌクレアーゼ制限酵素部位を含むプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、次いでヒトＩｇＧ１－Ｆｃ－ＬＡＬＡＰＳ（ＥＵ付番に従うアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）およびＩｇＧκをコードするｐＬＥＶ－１２３（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）哺乳類発現ベクターにサブクローニングした。上記のように得られる本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体としては、抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６、ＭＴＫ－３３、及びＭＴＫ－１５が挙げられる。

【0360】

実施例７：マウス抗ＭＥＲＴＫ抗体のヒト化及び親和性成熟
本開示の特定の親マウス抗ＭｅｒＴＫ抗体のヒト化バリアントを以下のように生成した。

【0361】

非ヒト抗体をヒト化する方法のうちの１つは、非ヒト（例えば、マウス）抗体由来のＣＤＲをヒト抗体アクセプターフレームワークに移植することである。そのようなＣＤＲ移植は、そのフレームワークにおける擾乱に起因して、その標的に対するヒト化抗体の親和性が減弱するかまたは完全に失われる場合がある。その結果、ヒト化の結果として減弱または失われた親和性を回復するためには、ヒトフレームワーク内の特定のアミノ酸残基を、マウス抗体フレームワークの対応する位置にあるアミノ酸残基で置き換える必要がある（逆変異と呼ばれる）。したがって、選択されたヒト抗体生殖細胞系列アクセプターフレームワークに関して置換されるべきアミノ酸残基は、ヒト化抗体が機能及びパラトープを実質的に保持するように決定されなければならない。さらに、熱安定性及び溶解性の保持または改善が、良好な生産性及び下流の開発のためには望ましい。

【0362】

簡潔に述べると、ヒト化しようとするマウス抗ＭｅｒＴＫモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）から取得したヒトＶＬ、ＶＨ、ＬＪ、及びＨＪ機能的生殖細胞系列アミノ酸配列と比較した。偽遺伝子及びオープンリーディングフレームをこれらの解析から除外した。マウスモノクローナル抗体（クエリ）１つあたり、最も類似したＶＨのうちの１つまたは２つ、及び最も類似したＶＬゲノム配列のうちの１つを選択し、最も類似したＶＪ及びＨＪ遺伝子と組み合わせて、１つまたは２つのヒト化アミノ酸配列を生成した。ヒトフレームワークに移植されるべきＣＤＲをＡｂＭ定義に従って定義した。

【0363】

クエリ及びヒト化アミノ酸配列を使用して、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）のＢｉｏＭＯＥモジュールまたはＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｅｌｅｒモジュールを使用してＦｖ相同性モデルを作製した。抗体ホモロジーモデリングプロセス全体を通したエネルギー最小化のために、ＡＭＢＥＲ１０：ＥＨＴ力場分析を使用した。得られたＦｖ相同性モデルに基づいて、ＶＬとＶＨとの間の相互作用エネルギー、座標ベース等電点（３Ｄ ｐＩ）、疎水性パッチ、及び荷電表面積などの分子記述子を、ＭＯＥによって提供されるスコアリング測定基準によって計算、分析及び分類した。これらの分子記述子を、タンパク質の発現、精製、結合親和性試験、及び機能的アッセイを含む、下流の実験手順に関して、ヒト化モノクローナル抗体の優先順位を付けるために利用した。

【0364】

ＭＯＥのＢｉｏＭＯＥモジュールは、逆変異の可能性のある残基を可視化及び分類するためのツールであるＭｕｔａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓを提供する。これに関して、逆変異は、元のクエリアミノ酸配列に戻すようなアミノ酸置換と定義され、それによりヒト化アミノ酸配列を置き換える。このツールを用いて、元のクエリ（参照）を、３Ｄ Ｆｖホモロジーモデルの第一級アミノ酸配列及び３Ｄ構造の両方について選択されたヒト化バリアントと個々に比較した。

【0365】

参照（すなわち、親）抗体とヒト化バリアントとの間の変化を、アミノ酸の種類の違い、ＣＤＲ残基との相互作用ポテンシャル、ＶＬ／ＶＨ対合に対する衝突ポテンシャル、及びＣＤＲ内及びＣＤＲ近位の疎水性及び荷電表面積のポテンシャル変化に基づいて分類した。

【0366】

有意な電荷差を有するかまたは強いＨ結合相互作用を含むＣＤＲまたはＶＬ／ＶＨ界面付近の変異を個々に評価し、有意に妨害する変異を元のクエリ残基に戻した。

【0367】

ヒト化抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３及びＭＴＫ－１６の親和性成熟を実施した。簡潔に述べると、重鎖または軽鎖中の特定のアミノ酸残基を選択的に変異誘発し、結合が改善されたバリアントを、スクリーニングの追加ラウンドによって選択した。このプロセスは、特異性、種の交差反応性、及び開発特性を同時に改善した。本明細書に記載の親和性成熟抗ＭｅｒＴＫ抗体の特徴決定には、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ上のＳＰＲ親和性測定とヒトマクロファージ上のエフェロサイトーシス遮断アッセイが含まれていた。複数回の親和性成熟の後に、所望の親和性を有する抗ＭｅｒＴＫ抗体が得られた。

【0368】

本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列を、以下の表１に示す。表１では、親マウス抗ＭｅｒＴＫ抗体には、ＭＴＫ－１５、ＭＴＫ－１６、及びＭＴＫ－３３が含まれ、ＭＴＫ－１６及びＭＴＫ－３３のヒト化及び親和性成熟バリアントは、それぞれ、ＭＴＫ－１６．２及びＭＴＫ－３３．１１である。表１では、各抗体鎖における超可変領域（ＨＶＲ）に下線を引いている。

【0369】

（表１）

【0370】

実施例８：本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体及び二重特異性抗体構築物において使用するための様々なＦｃ領域を含む抗ＰＤＬ１抗体
様々なＩｇＧ Ｆｃ領域：野生型ヒトＩｇＧ１、ＬＡＬＡＰＳ改変を含むヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３３１Ｓ；ＥＵ付番）、ＮＳＬＦを含むヒトＩｇＧ１（Ｎ３２５Ｓ、Ｌ３２８Ｆ；ＥＵ付番）、及び野生型ヒトＩｇＧ４に重鎖抗体可変配列を導入した。ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域に軽鎖抗体可変配列を導入した。得られた抗ＭｅｒＴｋ抗体配列を、以下の表２に示す。

【0371】

（表２）

【0372】

上記の表２はまた、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ野生型、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＬＡＬＡＰＳ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＮＳＬＦ、ヒトＩｇＧ４、及びヒトＩｇＧ軽鎖をそれぞれ含む抗ＰＤＬ１抗体アテゾリズマブ由来の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＰＤＬ１抗体のアミノ酸配列も含む。

【0373】

実施例９：抗ＭｅｒＴＫ抗体の産生
抗ＭｅｒＴＫハイブリドーマクローンを無血清ハイブリドーマ培地中で培養し、上清中の抗ＭｅｒＴＫ抗体を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲプラットフォーム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）上で、プロテインＡチップ（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて精製した。また、ヒトＦｃドメインを含むキメラ抗体（上記のＬＡＬＡＰＳアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１）を産生するために、ハイブリドーマから得られた可変遺伝子領域を、組換え発現プラスミドへ直接クローニングすることによって、抗ＭｅｒＴＫ抗体を産生した。Ｔｕｎａ２９３（商標）Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞を振盪フラスコに播種し、無血清の化学的に定義された培地を使用して増殖させた。発現プラスミドを細胞に一過性にトランスフェクトし、７日後に培養上清を回収した。遠心分離及び濾過による清澄化後、上清中の抗ＭｅｒＴＫ抗体をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。

【0374】

実施例１０：二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体配列
表３は、Ｆｃ領域のヘテロ二量体化に関連して、重鎖抗ＭｅｒＴＫ抗体配列のＦｃ領域に「ノブ」アミノ酸改変を含み、かつ重鎖抗ＰＤＬ１アミノ酸配列のＦｃ領域に「ホール」アミノ酸改変を含む、本開示の様々な抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。表３では、「ノブ」配置に関するＩｇＧ１及びＩｇＧ４ Ｆｃ領域改変は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ付番）を含み、「ホール」配置は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。特定のＩｇＧ４配置には、Ｆａｂアーム交換を防ぐためのアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（ＥＵ付番）を含むＦｃ領域ヒンジ改変も含まれる（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ，（２０１５），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２９０：５４６２－５４６９を参照のこと）。具体的には、ヒトＩｇＧ４の野生型ヒンジ領域は、アミノ酸配列

を含み、一方、ＩｇＧ４ヒンジ領域のＳ２２８Ｐアミノ酸置換は、アミノ酸配列

を含む。

【0375】

（表３）

【0376】

（表４）

【0377】

実施例１１：ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞、ＣＨＯ－ヒトＰＤＬ１ ＯＥ細胞、及びＭ２ｃ分化ヒトマクロファージに対する二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の結合活性
本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体が異なる細胞型に結合するかどうかを判定するために、以下の実験を行った。これらの試験で使用した細胞は、ヒトＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞）、ヒトＰＤＬ１過剰発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ヒトＰＤＬ１ ＯＥ細胞）、及びＭ２ｃ分化ヒトマクロファージを含んでいた。

【0378】

ヒトマクロファージをヒトＭ－ＣＳＦの存在下で７日間ヒト単球から分化させ、Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージを得た。７日後に、分化ヒトマクロファージを回収し（掻き取ることにより）、ＰＢＳに再懸濁し、使用するために９６ウェルプレート上に播種した。ヒトＭｅｒＴＫ（ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ）過剰発現ＣＨＯ細胞、ヒトＰＤＬ１（ＣＨＯ－ヒトＰＤＬ１ ＯＥ）過剰発現ＣＨＯ細胞、及びＭ２ｃ分化ヒトマクロファージを、Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０とコンジュゲートされた二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体、または二価抗ＭｅｒＴＫ抗体で氷上３０分間染色した。これらの試験では、様々な抗体濃度を使用して結合曲線を得た。これらの試験における被験抗体はすべて、ＬＡＬＡＰＳ変異を含むＦｃ領域を有するＩｇＧ１であった。細胞を固定し、次いでＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーターで取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＫｄ値を計算した。これらの結果におけるＫｄ値は、ＥＣ５０値と同様であったが、ＦＡＣＳ分析によって生成されたデータからＰｒｉｓｍソフトウェアによって計算された。Ｋｄ値の低下は、細胞への抗体の結合の増加を反映する。

【0379】

図１Ａは、二重特異性抗ＭｅｒＴＫであるＭＴＫ－１６．２：抗ＰＤＬ１抗体、二重特異性抗ＭｅｒＴＫであるＭＴＫ－３３．１１：抗ＰＤＬ１抗体、二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２（全長ＩｇＧ）、二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ３３．１１（全長ＩｇＧ）、一価抗ＰＤＬ １抗体、及びＩｇＧ１－Ｆｃ ＬＡＬＡＰＳ対照抗体の、ＣＨＯ－ヒトＰＤＬ１ ＯＥ細胞に対する結合曲線を示す。

【0380】

図１Ｂは、二重特異性抗ＭｅｒＴＫであるＭＴＫ－１６．２：抗ＰＤＬ１抗体、二重特異性抗ＭｅｒＴＫであるＭＴＫ－３３．１１：抗ＰＤＬ１抗体、二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２、二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ３３．１１、及び一価（モノアーム）抗ＰＤＬ１抗体の、ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞に対する結合曲線を示す。

【0381】

図１Ａに示すように、二重特異性抗ＭｅｒＴＫであるＭＴＫ－１６．２：抗ＰＤＬ１抗体、及び二重特異性抗ＭｅｒＴＫであるＭＴＫ－３３．１１：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＰＤＬ１過剰発現ＣＨＯ細胞に対して同様の結合を示した。さらに、これらの２つの二重特異性抗体は、抗ＰＤＬ１抗体の一価（モノアーム）配置としてヒトＰＤＬ１発現ＣＨＯ細胞に対して同様の結合を示した。これらのデータは、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体が、細胞内で発現させたヒトＰＤＬ１に結合するそれらの能力を維持することを示している。

【0382】

図１Ｂに示すように、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ－ＭＴＫ－３３．１１：抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ細胞に、二価（全長ＩｇＧ）抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１で観察された結合と同程度に結合した。さらに、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ－ＭＴＫ－１６．２：抗ＰＤＬ１抗体は、二価（全長ＩｇＧ）抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２で観察される結合と同程度にヒトＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ細胞に結合した。予想通り、一価（モノアーム）抗ＰＤＬ１抗体は、ヒトＭｅｒＴＫ過剰発現ＣＨＯ細胞への結合を示さなかった。

【0383】

図１Ｃは、Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージにおける本開示の二重特異性抗体の結合を示す。

【0384】

以下の表５は、ＦＡＣＳ分析から得られたＫｄ値（ｎＭ）をまとめたものである。図１Ａ及び図１Ｂならびに表５に示すように、一価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２及び二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２の双方が、およそ４０～４３ｎＭの範囲内の同様の親和性でＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞に結合することを示した。一価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２及び二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２は、本アッセイによる測定でそれぞれおよそ７８ｎＭ及び５２ｎＭの親和性でＭ２ｃ分化ヒトマクロファージに匹敵する結合を示した。これらの結果は、抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２が、抗体が有する結合アームが１本であるか２本であるかに関わらず、同様の親和性でＭｅｒＴＫに結合することを示した。

【0385】

二価の抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１は、一価の抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１と比較して、ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞及びＭ２ｃ分化ヒトマクロファージの双方に対して高い結合親和性を示し、その一価形態と比較して、ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞に対しておよそ１０倍高い親和性、及びＭ２ｃ分化ヒトマクロファージに対しておよそ５倍高い親和性を示す。予想通り、対照抗体である一価抗ＰＤＬ１は、ＣＨＯ－ヒトＭｅｒＴＫ ＯＥ細胞への結合を示さなかったが、Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージには結合した。

【0386】

（表５）

【0387】

一価抗ＰＤＬ１抗体及び二重特異性抗体は、同様のＫｄ値でＣＨＯ－ヒトＰＤＬ１ ＯＥ細胞に結合した。興味深いことに、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２：抗ＰＤＬ１は、Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージに対して、一価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２または二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２よりも強い結合活性を示し、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２：抗ＰＤＬ１が、ＭｅｒＴＫ及びＰＤＬ１を介してヒトマクロファージに対して相乗的に結合し得ることが示唆された。この結果はさらに、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１：抗ＰＤＬ１が、ＭｅｒＴＫに対する親和性が比較的強いために、結合に関して二価性により依存的である一方で、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２：抗ＰＤＬ１の結合は、ＭｅｒＴＫに対するその親和性が弱いために、ＰＤＬ１結合に依存し得ることを示唆した。

【0388】

実施例１２：二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体によるエフェロサイトーシスの低減
食細胞（例えば、ヒトマクロファージ）によるエフェロサイトーシスを低減するための本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の能力を、以下のように評価した。上記のように、ヒトマクロファージをヒトＭ－ＣＳＦの存在下で７日間ヒト単球から分化させ、Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージを得た。７日後に、Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージを回収し（掻き取ることにより）、ＰＢＳに再懸濁し、９６ウェルプレート上に播種した。エフェロサイトーシスのＩＣ５０を測定するために、細胞を１時間飢餓状態とし、続いて３７℃で３０分間にわたり各ウェルに抗ＭｅｒＴＫ抗体を添加した。

【0389】

Ｊｕｒｋａｔ細胞を１μＭスタウロスポリン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）で３７℃にて３時間処理し（アポトーシスを誘導するために）、室温で３０分間、ｐＨｒｏｄｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した。ＰＢＳで洗浄後、ヒトマクロファージを１：４の比率（１個のマクロファージ：４個のＪｕｒｋａｔ細胞）で含有する各ウェルに、ｐＨｒｏｄｏ標識Ｊｕｒｋａｔ細胞を１時間添加した。これらのプレートをＰＢＳで洗浄し、次いで細胞を、ＡＰＣとコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ１４と共に暗所にて氷上で３０分間染色した。細胞を固定し、次いでＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーターで取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。

【0390】

これらの実験では、ｐＨｒｏｄｏ ＣＤ１４二重陽性細胞を分析ゲートとして設定し、次いでこの正確なゲートをすべての試料に適用することによって、エフェロサイトーシス陽性マクロファージを同定した。培地のみを用いて培養したマクロファージを使用してベースラインのエフェロサイトーシスのレベルを確認し、これを１００％のエフェロサイトーシス活性に設定した。相対的なエフェロサイトーシスのレベルを、抗ＭｅｒＴＫ抗体で処理した細胞において観察されたエフェロサイトーシスに対する、培地のみで処理した細胞において観察されたエフェロサイトーシスの百分率として計算した。これらの試験の結果を、図２及び以下の表６に示す。

【0391】

（表６）

【0392】

表６に示すように、本開示の一価抗ＭｅｒＴＫ抗体は、一価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１及びＭＴＫ－１６．２について、それぞれおよそ４．４ｎＭ及び３７．９ｎＭのＩＣ５０でＭ２ｃ分化ヒトマクロファージによるエフェロサイトーシスを遮断することができた。これらのデータからは、一価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２及びＭＴＫ－３３．１１が、それらの二価抗体と比較して比較的弱いエフェロサイトーシス低減活性を示し、二価抗ＭＴＫ－３３．１１抗体が、０．３４１ｎＭのＩＣ５０値を示した一方で、一価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１が、約４．４ＭのＩＣ５０値を有し、さらに二価抗ＭＴＫ－１６．２抗体が、０．４３６ｎＭのＩＣ５０値を有していた一方で、一価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２が、３７．８６ｎＭのＩＣ５０値を有していたことも示された。一価の抗ＰＤＬ１抗体は、エフェロサイトーシスの抑制活性を示さなかった（図２を参照のこと）。

【0393】

これらのデータからは、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体が、食細胞によるエフェロサイトーシスを低減するのに有効であることが示された。

【0394】

実施例１３：二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体のｐＡＫＴ活性
ＭｅｒＴＫリガンドＧａｓ６の非存在下または存在下でｐＡＫＴシグナル伝達を増加または減少させるための本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の能力を以下のように調べた。（上記のように生成された）Ｍ２ｃ分化ヒトマクロファージを、様々な抗ＭｅｒＴＫ抗体（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃にて３０分間処理し、続いて２００ｎＭの組換えヒトＧａｓ６またはＰＢＳを添加した。さらに３０分間のインキュベーション後、細胞を溶解させ、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いて、細胞内でのｐＡＫＴレベルについて、全ＡＫＴと比較して分析した。ｐＡＫＴシグナルを全ＡＫＴシグナルに対して正規化することにより、最終的なｐＡＫＴ活性測定を定量化した。これらの試験の結果を、図３及び表７に示す。図４は、ヒトＧａｓ６の非存在下でのｐＡＫＴ活性の倍率変化を示す。

【0395】

（表７）

【0396】

図３及び表７に示すように、一価の抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２及びＭＴＫ－３３．１１は、ＭｅｒＴＫリガンドＧａｓ６の非存在下で、ｐＡＫＴ／ｔＡＫＴにおいて、二価の同抗体と比較してより低い倍率変化を示した。このデータからは、本開示の一価の抗ＭｅｒＴＫ抗体が、ＭｅｒＴＫリガンドＧａｓ６（例えば、リガンド非依存的ｐＡＫＴ活性）の非存在下で、ヒトマクロファージ中のｐＡＫＴレベルを増加させる場合に、本開示の二価の抗ＭｅｒＴＫ抗体によって観察される有効性と比較して、有効性がより低いことが示された。抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１５は、ｐＡＫＴ活性の増大に有効な陽性対照抗体として使用した。抗ＭｅｒＴＫ抗体投与と関連するｐＡＫＴ活性がより少ないことが望ましい場合があることから、これらのデータからは、二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の使用が、治療環境において二価抗ＭｅｒＴＫ抗体と二価抗ＰＤＬ１抗体の組み合わせを使用することと比較して、より安全な毒性を提供し得ることが示唆された。

【0397】

上述したように、Ｇａｓ６は、ＭｅｒＴＫに対するリガンドであり、ＭｅｒＴＫとの相互作用に基づいてｐＡＫＴ活性化を増加させる。本試験ではまた、ＭｅｒＴＫリガンドＧａｓ６の存在下でのｐＡＫＴに対する本開示の一価対二価抗ＭｅｒＴＫ抗体の効果も比較した。以下の表８に、本開示の一価及び二価の抗ＭｅｒＴＫ抗体によるヒトＧａｓ６を介したｐＡＫＴ低減活性のＩＣ５０値を示す。表８に示すように、一価の抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２及びＭＴＫ－３３．１１は、Ｇａｓ６の存在下でｐＡＫＴ活性に影響を及ぼす際に、それらの二価の同抗体に比べてより高いＩＣ５０値を示した。一価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２及びＭＴＫ－３３．１１は、このアッセイで測定した場合に、およそ１５．３５ｎＭ～１７．８５ｎＭの範囲のＩＣ５０値でヒトＧａｓ６媒介（例えば、リガンド依存性）ｐＡＫＴ活性を低下させた一方で、本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体は、およそ１２．２６ｎＭ～９．０２７ｎＭの範囲のＩＣ５０値でリガンド依存性ｐＡＫＴ活性を低下させた。これらのデータからは、本開示の二価抗ＭｅｒＴＫ抗体が、一価及び二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体と比較して、Ｇａｓ６媒介ｐＡＫＴ活性をより効果的に低減することが示された。

【0398】

（表８）

【0399】

実施例１４：二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の結合速度
本開示の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体のヒト、カニクイザル、及びマウスＭｅｒＴＫへの結合速度を、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ機器を使用して評価した。簡潔に述べると、１０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ４．２５（Ｃａｒｔｅｒｒａ）中で１０μｇ／ｍｌまで希釈することによって、抗ＭｅｒＴＫ抗体を調製した。ＨＣ３０センサチップ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）を、１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、１００ｍＭ スルホ－ＮＨＳ、４００ｍＭ ＥＤＣの１：１：１混合物（すべて、ＭＥＳ ｐＨ５．５で再構成し、ランニングアッセイ直前に各１００μｌをバイアル中で混合）の７分間注入によってシングルチャネルフローセルを使用して活性化した。マルチチャネルアレイフローセルに切り替えた後、活性化されたチップ上で抗体を９６スポットアレイに１５分間注入した。チップの第２のブロックに抗体を２つ組で注入し、前述のようにスポットした。次いで、シングルチャネルフローセルを用いて１ＭエタノールアミンｐＨ８．５（Ｃａｒｔｅｒｒａ）を７分間注入することにより、チップ上の残りの非コンジュゲート活性基をブロックした。

【0400】

０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むランニング緩衝液（ＨＢＳ－ＴＥ，Ｃａｒｔｅｒｒａ）でプライミングした後に、固定化された抗ＭｅｒＴＫ抗体を、上記のヒト、カニクイザル、及びマウスオーソログを含むいくつかの形態の組換えＭｅｒＴＫ細胞外ドメインに結合する能力について試験した。親和性の推定は、シングルチャネルフローセルを使用して抗体アレイ全体にわたって各分析物を注入することによって生成した。ＭｅｒＴＫ分析物（ヒトＭｅｒＴＫ １．２ｍＭ～４．９ｎＭ；カニクイザル及びマウスＭｅｒＴＫ ３～１．２ｎＭ）の６つの３倍連続希釈物をランニング緩衝液中で調製し、最低濃度から最高濃度まで連続して３００秒間にわたって注入した。１０ｍＭグリシンｐＨ２．５を２×３０秒間、それぞれ注入した後、再生させる前に解離を３００秒間追跡した。各シリーズ間で３つのバッファーブランクを実行した（シリーズごとに１種）。ＭｅｒＴＫの３種すべての濃度を注入した後、３種すべての各濃度が間隔をあけて２回ずつ注入されるように２回の注入セットを実施した。データを処理し、ＮｅｘｔＧｅｎＫＩＴ高スループット速度分析ソフトウェア（Ｃａｒｔｅｒｒａ）を使用して分析した。すべての試料について２回の注入はほぼ完全に重なったが、これは実験中に表面が劣化しなかったことを示している。

【0401】

次いで、本開示の抗ＭｅｒＴＫ抗体について、フィッティングした結合速度定数及び解離速度定数（ｋ－ｏｎ及びｋ－ｏｆｆ）から平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を計算した。一般に、抗体の結合特性は複雑であり、１：１モデルに理想的にフィットしなかったため、Ｋ_Ｄ値を、以下の表９にまとめるが、これは抗体と抗原の間の比較のための推定値を表す。

【0402】

（表９）

【0403】

表９に示すように、試験した一価または二価の抗ＭｅｒＴＫ抗体について、親和性の差は観察されなかったが、これは、一価及び二価の抗ＭｅｒＴＫ抗体が一価の結合特性を維持することを示している。

【0404】

実施例１５：ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおける二価抗ＭｅｒＴＫ抗体治療の効果
本開示の二価抗ＭｅｒＴＫ抗体がｉｎ ｖｉｖｏでＭＣ３８腫瘍増殖を遅延させる能力を以下のように調べた。ＭＣ３８細胞を、ヒトＭｅｒＴＫノックイン（ＫＩ）マウスに皮下移植した。腫瘍サイズがおよそ８０～１００ｍｍ^３の容量に達した時点で、１０ｍｇ／ｋｇの二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１＋３ｍｇ／ｋｇの二価抗ＰＤＬ１抗体、二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２＋３ｍｇ／ｋｇの二価抗ＰＤＬ１抗体、３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＬ１のみ、または１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体で、週２回、３週間にわたってマウスを処置した。腫瘍体積を週３回測定した。

【0405】

図５は、二価抗ＰＤＬ１抗体と、二価抗ＭｅｒＴＫ ＭＴＫ－３３．１１抗体または二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２のいずれかとの併用により、マウスにおける腫瘍成長速度（経時的な腫瘍体積の変化によって測定される）が、二価抗ＰＤＬ１抗体のみで処置したマウスで観察された速度と比較して、より低下したことを示している。図６は、各群（対照抗体、二価抗ＰＤＬ１抗体、二価抗ＰＬＤ１抗体＋二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－３３．１１、及び二価抗ＰＬＤ１抗体＋二価抗ＭｅｒＴＫ抗体ＭＴＫ－１６．２）の個々のマウスの腫瘍成長を示す。これらの結果は、二価抗ＰＤＬ１抗体と組み合わせた本開示の二価抗ＭｅｒＴＫ抗体が、腫瘍成長の抑制において、二価抗ＰＬＤ１抗体のみで観察される抑制と比較してより効果的であることを示している。

【0406】

実施例１６：特定の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の構成
以下の表１０及び表１１は、本開示の特定の二価抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体の構成を示す。

【0407】

（表１０）

【0408】

（表１１）

【0409】

以下の表１２及び表１３は、抗ＭｅｒＴＫ重鎖アームのＦｃ領域内に重鎖「ノブ」アミノ酸置換を含み、抗ＰＤＬ１重鎖アームのＦｃ領域内に重鎖「ホール」アミノ酸置換を含む、特定の二重特異性抗ＭｅｒＴＫ：抗ＰＤＬ１抗体構成を示す。

【0410】

（表１２）

【0411】

（表１３）

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】