▶ アーバイン サイエンティフィック セールス カンパニー インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-24
(54)【発明の名称】トランスジェニックマウス系統の方法および使用
(51)【国際特許分類】
A01K 67/0275 20240101AFI20240717BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240717BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240717BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240717BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240717BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240717BHJP
【ＦＩ】
A01K67/0275 ZNA
C12N15/09 Z
C12N5/10
C12Q1/02
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023578878
(86)(22)【出願日】2022-06-21
(85)【翻訳文提出日】2024-02-20
(86)【国際出願番号】 US2022034294
(87)【国際公開番号】W WO2022271664
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】63/213,335
(32)【優先日】2021-06-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516008497
【氏名又は名称】フジフイルム アーバイン サイエンティフィック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】櫻井 久美
(72)【発明者】
【氏名】トラン，アン チウ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA29
2G045BA13
2G045BB20
2G045DA36
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QR90
4B063QX01
4B063QX02
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
本明細書で開示されるのは、特定の実施形態において、転写制御下でＯＣＴ４を含む融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスである。一部の実施形態において、また本明細書で開示されるのは、トランスジェニックマウスから得られた胚、幹細胞、および生殖系列細胞を含む。追加の実施形態において、本明細書で開示されるのは、トランスジェニックマウスを生成する方法、およびトランスジェニックマウスから得られた胚を使用して生成物を評価する方法を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
転写制御下における八量体結合転写因子４（ＯＣＴ４）を含む融合タンパク質の安定な発現を含むトランスジェニックマウスであって、前記融合タンパク質の遺伝子発現は、生殖系列ＤＮＡを介して安定して受け継がれる、トランスジェニックマウス。
【請求項2】
前記融合タンパク質が、蛍光タグの付いたＯＣＴ４である、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項3】
前記蛍光タグが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）から選択される蛍光タンパク質である、請求項１または２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項4】
前記蛍光タンパク質が、任意選択でＡ２０６Ｋ変異を含む、ＧＦＰまたは増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項5】
前記蛍光タンパク質が、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性または類似性を含むか、またはその断片を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項6】
前記転写制御が、ＯＣＴ４遺伝子座によって調節される、請求項１から５のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項7】
前記蛍光タンパク質が、前記ＯＣＴ４遺伝子座のＣ末端に作動可能に連結されている、請求項１から６のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項8】
前記ＯＣＴ４遺伝子座が、近位エンハンサーエレメントの欠失をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項9】
前記ＯＣＴ４が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性または類似性を含むか、またはその断片を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項10】
前記生殖系列が、精液、卵母細胞、幹細胞、または接合体から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項11】
前記トランスジェニックマウスが、生存可能であり繁殖可能であり、前記融合タンパク質の遺伝子発現が、トランスジェニックマウス子孫に安定して組み込まれている、請求項１から１０のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項12】
前記接合体における前記融合タンパク質の遺伝子発現が、２細胞期、３細胞期、または４細胞期の細胞の発生から始まる、請求項１から１１のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項13】
ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する胚であって、ここで、卵母細胞が、前記ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を含む精液と受精し、前記精液は、請求項１から１２のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスに由来する、胚。
【請求項14】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスに由来するＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する、幹細胞。
【請求項15】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスに由来するＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する、生殖系列細胞。
【請求項16】
トランスジェニックマウスを生産する方法であって、前記方法は、接合体を細菌人工染色体（ＢＡＣ）構築物でマイクロインジェクションするステップを含み、
ここで、前記構築物は、マウスＯＣＴ４遺伝子座に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含み、前記接合体をサロゲートマウスの生殖器官に着床させ、それによってトランスジェニックマウスを生産する、方法。
【請求項17】
前記トランスジェニックマウスが、前記レポーター遺伝子を安定して発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記レポーター遺伝子の遺伝子座が、前記トランスジェニックマウスの生殖系列ＤＮＡを介して安定して受け継がれる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項19】
前記生殖系列が、精液、卵母細胞、幹細胞、または接合体から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）から選択される、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記蛍光タンパク質が、任意選択でＡ２０６Ｋ変異を含む、ＧＦＰまたは増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から選択される、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記レポーター遺伝子が、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性または類似性を含む蛍光タンパク質をコードする核酸配列、またはその断片を含む、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記レポーター遺伝子が、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードするＯＣＴ４コード配列、またはその断片に作動可能に連結されている、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記レポーター遺伝子および前記遺伝子コード配列が、リンカーによって隔てられており、前記リンカーは、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１６から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記レポーター遺伝子が、前記ＯＣＴ４遺伝子座のＣ末端に作動可能に連結されている、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記蛍光タンパク質およびＯＣＴ４を含むポリペプチドが、配列番号４と少なくとも７０％の配列同一性または類似性を含む、請求項１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記構築物が、配列番号５と少なくとも７０％の配列同一性または類似性を含む核酸配列を含む、請求項１６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＯＣＴ４遺伝子座が、近位エンハンサーエレメントの欠失をさらに含む、請求項１６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記構築物が、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現を媒介する、請求項１６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質が、前記接合体に安定して組み込まれる、請求項１６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
生殖補助医療（ＡＲＴ）、疾患の処置、薬物のスクリーニング、または免疫モジュレーションのために使用される生成物を評価するための方法であって、（ａ）ＯＣＴ４を含む融合タンパク質の安定な発現を含むトランスジェニック胚を得るステップ；
（ｂ）前記トランスジェニック胚を培養するステップ；
（ｃ）前記融合タンパク質の発現を評価するステップ；および
（ｄ）前記生成物の容認性または失敗を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項33】
前記融合タンパク質が、ＯＣＴ４に融合した蛍光タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）から選択される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項35】
前記蛍光タンパク質が、任意選択でＡ２０６Ｋ変異を含む、ＧＦＰまたは増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から選択される、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
評価するステップが、前記融合タンパク質の核局在化または細胞質局在化を可視化することを含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記核局在化が、前記融合タンパク質が核中のＤＮＡに結合することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記評価するステップが、前記融合タンパク質の時間的および空間的な発現を決定することを含む、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記評価するステップが、４細胞期、８細胞期、または胚盤胞期で行われ、好ましくは８細胞期で行われる、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記融合タンパク質が、前記４細胞期で核において優勢に局在化または発現される、請求項３２から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記融合タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより多くが、前記４細胞期で核において局在化または発現される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記融合タンパク質が、前記８細胞期で核において局在化または発現される、請求項３２から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記融合タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％、またはそれより多くが、前記８細胞期で核において局在化または発現される、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記融合タンパク質が、前記胚盤胞期で内部細胞塊（ＩＣＭ）において局在化または発現される、請求項３２から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記融合タンパク質の少なくとも８０％、９０％、９５％、またはそれより多くが、前記胚盤胞期で前記ＩＣＭにおいて局在化または発現される、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
１）前記融合タンパク質の核局在化もしくは発現がある、および／または２）前記ＩＣＭにおける前記融合タンパク質の局在化もしくは発現がある場合、前記生成物は容認される、請求項３２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記４細胞期または８細胞期における前記融合タンパク質の核局在化または発現が４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満の場合、前記生成物は容認されない、請求項３２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記８細胞期における前記融合タンパク質の核局在化または発現がない場合、前記生成物は容認されない、請求項３２から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記ＩＣＭにおける前記融合タンパク質の局在化または発現が４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満の場合、前記生成物は容認されない、請求項３２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記ＩＣＭにおける前記融合タンパク質の局在化または発現がない場合、前記生成物は容認されない、請求項３２から４６または４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記培養するステップが、インビトロである、請求項３２から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記融合タンパク質が、培養の約２４時間～約９６時間、約２４時間～約７２時間、約２４時間～約４８時間、約２４時間～約３６時間、約３６時間～約９６時間、約３６時間～約７２時間、約３６時間～約４８時間、約４８時間～約７２時間、もしくは約４８時間～約９６時間；または
培養の約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、もしくは約９６時間
のあたりで検出可能である、請求項３２から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記融合タンパク質が、前記２細胞期、３細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、桑実胚期、または胚盤胞期の細胞の発生において検出可能である、請求項３２から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記生成物が、針、カテーテル、マイクロツール、実験器具、シリンジ、組織培養ディッシュ、組織培養プレート、ピペットチップ、ディッシュ、プレート、水、浄水システム、培地、培地サプリメント、または胚と物理的に接触した状態になる他のデバイスもしくは試薬から選択される、請求項３２から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記生成物が、疾患に関連するタンパク質または遺伝子である、請求項３２から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記疾患が、がんまたは自己免疫疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記生成物が、胚の発生に関連するタンパク質または遺伝子である、請求項３２から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記トランスジェニック胚から１つまたは複数の胚性幹細胞を得るステップ、および前記１つまたは複数の胚性幹細胞を培養して、複数の胚性幹細胞を生成するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項59】
前記複数の胚性幹細胞を薬物と共にインキュベートするステップ、前記融合タンパク質の発現を評価するステップ、および前記薬物の容認性または失敗を決定するステップをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記薬物が、疾患、任意選択でがんまたは自己免疫疾患の処置における使用のためのものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記薬物が、免疫応答をモジュレートすることにおける使用のためのものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
請求項１から１２に記載のトランスジェニックマウス、請求項１３に記載の胚、請求項１４に記載の幹細胞、または請求項１５に記載の生殖系列細胞を含み、任意選択で使用のための説明書を含む、キット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
背景
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０２１年６月２２日に出願された米国仮出願第６３／２１３，３３５号に対して合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０２１年６月２２日に出願された米国仮出願第６３／２１３，３３５号に対して合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張する。
【0002】
遺伝子操作されたマウスモデルは、全動物のレベルで遺伝子の機能を研究するために重要である。遺伝子機能喪失戦略を代表する遺伝子ノックアウトマウスおよび機能獲得アプローチを代表するトランスジェニックマウスを利用して、目的の遺伝子またはタンパク質の分子および細胞機能を評価することができる。一般的に、トランスジェニックマウスは、受精卵（卵母細胞または接合体）にトランスジェニック構築物をマイクロインジェクションすることによって生成することができる。代替として、後続のトランスジェニックマウスの生成のために、導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターを卵に導入してもよい。
【0003】
発生中の間、着床前胚は、わずか数日で、母体の転写物の遺伝学的制御下における代謝的に静止状態の未分化の単一細胞から、発達した恒常性維持機構とそれ自体の機能化したゲノムを有する動的な多細胞化した胚に急速に変化する（Leese 1991; Lane 2001; Gardner et al. 2005）。初期胚は、ピルビン酸ベースの代謝に依存しており、エネルギー生産に関してミトコンドリアの酸化的リン酸化のみに依存している；単細胞生物のように、初期胚は、ｐＨおよび浸透圧制御に関する多くの主要な調節機能を欠いている。８～１６細胞期へのコンパクションの後、高度に解糖系の代謝への代謝制御における変化がある。同時に、また胚の生理機能が体細胞の生理機能により近くなるにつれて、他の細胞メカニズムの機能的な複雑さにおいても著しい変遷がある。これは、初期胚における恒常性調節初期とそれに続く着床前発達の後期段階を介した発達のありのままの性質であり、これは、実験室において深刻な問題を引き起こす。特定には１つまたは複数の目的の遺伝子またはタンパク質のモジュレーションを用いた、好都合なインビトロ環境の維持が、生存率を最大化し、進行中の発達を促進するために必須である。
【0004】
生殖器官で遭遇する「通常の」条件に対して培養における発生中の胚周辺の環境への変動は、胚生存率の低減と発生の障害を引き起こす。したがって、胚発生および毒性を評価するための高感度で再現可能な方法およびアッセイへの必要性がある。
【0005】
発明の要旨
特定の実施形態において、本明細書で開示されるのは、転写制御下でＯＣＴ４を含む融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスである。一部の実施形態において、また本明細書で開示されるのは、トランスジェニックマウスから得られた胚、幹細胞、および生殖系列細胞を含む。追加の実施形態において、本明細書で開示されるのは、トランスジェニックマウスを生成する方法、およびトランスジェニックマウスから得られた胚を使用して生成物を評価する方法を含む。
特定の実施形態において、本明細書で開示されるのは、転写制御下でＯＣＴ４を含む融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスである。一部の実施形態において、また本明細書で開示されるのは、トランスジェニックマウスから得られた胚、幹細胞、および生殖系列細胞を含む。追加の実施形態において、本明細書で開示されるのは、トランスジェニックマウスを生成する方法、およびトランスジェニックマウスから得られた胚を使用して生成物を評価する方法を含む。
【0006】
一部の実施形態において、本明細書で開示されるのは、転写制御下における八量体結合転写因子４（ＯＣＴ４）を含む融合タンパク質の安定な発現を含むトランスジェニックマウスである。一部の場合において、前記融合タンパク質の遺伝子発現は、生殖系列ＤＮＡ（germline DNA）を介して安定して受け継がれる（transmitted）。一部の場合において、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する胚を生成することができ、それにおいて、卵母細胞は、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を含む精液と受精し、精液は、トランスジェニックマウスに由来する。一部の場合において、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する幹細胞は、トランスジェニックマウスに由来する。一部の場合において、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する生殖系列細胞は、トランスジェニックマウスに由来する。
【0007】
一部の実施形態において、また本明細書で開示されるのは、トランスジェニックマウスを生産する方法であって、その方法は、接合体を細菌人工染色体（ＢＡＣ）構築物でマイクロインジェクションするステップを含み、構築物は、マウスＯＣＴ４遺伝子座に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含み、接合体をサロゲートマウスの生殖器官に着床させ（implanted）、それによってトランスジェニックマウスを生産する、方法である。
【0008】
一部の実施形態において、加えて本明細書で開示されるのは、生殖補助医療（assistedreproductive technologies）（ＡＲＴ）、疾患の処置、薬物のスクリーニング、または免疫モジュレーションのために使用される生成物を評価するための方法であって、（ａ）ＯＣＴ４を含む融合タンパク質の安定な発現を含むトランスジェニック胚を得るステップ；（ｂ）トランスジェニック胚を培養するステップ；（ｃ）融合タンパク質の発現を評価するステップ；および（ｄ）生成物の容認性（acceptability）または失敗（failure）を決定するステップを含む、方法である。
【0009】
一部の実施形態において、さらに本明細書で開示されるのは、本明細書に記載されるトランスジェニックマウス、本明細書に記載される胚、本明細書に記載される幹細胞、または本明細書に記載される生殖系列細胞を含み、任意選択で使用のための説明書を含むキットである。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1-1】図１Ａ～図１Ｂは、４８時間における本明細書に記載されるトランスジェニック胚および対照胚への最適未満の油曝露（suboptimal oil exposure）の作用を示す。図１Ａは、研究プロトコールを例示する。方法Ａは、本明細書に記載されるトランスジェニック胚を使用する研究プロトコールを指す。方法Ｂは、対照胚を使用する研究プロトコールを指す。図１Ｂは、本明細書に記載されるトランスジェニック胚と対照胚との検出された割球（blastomer）の比較を示す。
【図1-2】図１Ａ～図１Ｂは、４８時間における本明細書に記載されるトランスジェニック胚および対照胚への最適未満の油曝露の作用を示す。図１Ａは、研究プロトコールを例示する。方法Ａは、本明細書に記載されるトランスジェニック胚を使用する研究プロトコールを指す。方法Ｂは、対照胚を使用する研究プロトコールを指す。図１Ｂは、本明細書に記載されるトランスジェニック胚と対照胚との検出された割球の比較を示す。
【図2-1】図２Ａ～図２Ｃは、本明細書に記載される凍結保存されたトランスジェニック胚および対照胚における最適未満の条件の作用を示す。図２Ａは、研究設計を例示する。方法Ａは、本明細書に記載されるトランスジェニック胚を使用する研究プロトコールを指す。ＭＥＡは、対照胚を使用するマウス胚アッセイを指す。本明細書に記載されるトランスジェニック胚と対照胚との検出された割球の比較は、４８時間（図２Ｂ）および９６時間（図２Ｃ）で示される。
【図2-2】図２Ａ～図２Ｃは、本明細書に記載される凍結保存されたトランスジェニック胚および対照胚における最適未満の条件の作用を示す。図２Ａは、研究設計を例示する。方法Ａは、本明細書に記載されるトランスジェニック胚を使用する研究プロトコールを指す。ＭＥＡは、対照胚を使用するマウス胚アッセイを指す。本明細書に記載されるトランスジェニック胚と対照胚との検出された割球の比較は、４８時間（図２Ｂ）および９６時間（図２Ｃ）で示される。
【図2-3】図２Ａ～図２Ｃは、本明細書に記載される凍結保存されたトランスジェニック胚および対照胚における最適未満の条件の作用を示す。図２Ａは、研究設計を例示する。方法Ａは、本明細書に記載されるトランスジェニック胚を使用する研究プロトコールを指す。ＭＥＡは、対照胚を使用するマウス胚アッセイを指す。本明細書に記載されるトランスジェニック胚と対照胚との検出された割球の比較は、４８時間（図２Ｂ）および９６時間（図２Ｃ）で示される。
【0011】
詳細な説明
定義
以下で本発明の開示による実施形態をより詳細に説明する。しかしながら、本開示の態様は、様々な形態で具体化することができ、本明細書に明示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろこれらの実施形態は、この開示が徹底的で十分なものであり、当業者に開示の範囲を十分伝えるように提供される。本明細書における説明で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定することは意図されない。
定義
以下で本発明の開示による実施形態をより詳細に説明する。しかしながら、本開示の態様は、様々な形態で具体化することができ、本明細書に明示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろこれらの実施形態は、この開示が徹底的で十分なものであり、当業者に開示の範囲を十分伝えるように提供される。本明細書における説明で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定することは意図されない。
【0012】
別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての用語（専門用語や科学用語を含む）は、この開示が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。用語、例えば一般的に使用される辞書で定義された用語は、本出願の文脈や関連技術におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書においてそのように明示的に定義されない限り、理想的な、または過剰に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。以下で明示的に定義されていないが、このような用語は、それらの一般的な意味に従って解釈されるべきである。
【0013】
本明細書における説明で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、開示を限定することは意図されない。本明細書で述べられた全ての公報、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりそれら全体が本明細書に組み入れられる。
【0014】
本発明の技術の実施は、別段の指定がない限り、当業者の技術の範囲内の、組織培養、有機化学 薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術を採用することになる。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))を参照されたい。
【0015】
文脈上別段の指定がない限り、本明細書に記載される開示の様々な特徴は、あらゆる組合せで使用できることが具体的に意図される。さらに、本開示はまた、一部の実施形態において、本明細書に明示されるあらゆる特徴または特徴の組合せは、排除または省略できることも予期する。例示するために言えば、複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書で述べられる場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組合せを、単独で、またはあらゆる組合せで省略したり排除したりすることができることが具体的に意図される。
【0016】
全ての数の表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲を含めて、必要に応じて１．０または０．１の増加量で、または代替として＋／－１５％の変動で、もしくは代替として１０％、もしくは代替として５％、もしくは代替として２％の変動で（＋）または（－）に変化する近似値である。必ずしも明示的に述べられているとは限らないが、全ての数の表示は、用語「約」が前につくと理解されるものとする。また、必ずしも明示的に述べられているとは限らないが、本明細書に記載される試薬は単なる例示であり、このようなものの均等物は当該分野において公知であることも理解されるものとする。
【0017】
本開示の説明および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の形態を同様に含むことが意図される。
【0018】
用語「約」は、本明細書で使用される場合、測定可能な値、例えば量または濃度などを指し、特定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％の変動、またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。
【0019】
用語「含む」は、本明細書で使用される場合、組成物および方法が列挙された要素を含むが、それ以外のものを除外しないことを意味することが意図される。本明細書で使用される場合、用語「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するのに使用される場合、組合せにとって何らかの本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。例えば、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物または方法は、特許請求された発明の基礎となる新規の特徴に実質的に影響を与えない他の要素は除外されないであろう。「からなる」は、本明細書で使用される場合、微量を超える他の成分や列挙された実質的な方法のステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、この開示の範囲内である。
【0020】
用語「容認される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示されるいずれかの成分、範囲、用量の形態などの選択が、前記成分、範囲、用量の形態などが開示された目的に好適であることが意図されることを指す。
【0021】
「および／または」は、本明細書で使用される場合、関連する列挙された項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せ、加えて、どちらか一方として解釈される場合（「または」）、組合せの除外を指し、それらを包含する。
【0022】
用語「核酸配列」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを指す。したがって、この用語は、これらに限定されないが、単鎖、二本鎖、もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含むか、またはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、または代替としてそれから本質的になる、またはさらにはそれからなるポリマーを含む。
【0023】
用語「エンハンサー」は、本明細書で使用される場合、標的配列の発現を増加させる調節エレメントをコードするＤＮＡ配列の領域を指す。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターおよびエンハンサーの機能の両方を提供することが可能な配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスのロングターミナルリピートは、プロモーターおよびエンハンサーの機能の両方を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されたものである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的な技術）によって遺伝子と並んで配置されたものであり、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるようになっている。用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、および／またはＴＡＴＡボックスを含有し、関連する転写可能なポリヌクレオチド配列および／または遺伝子の転写および発現を補助または促進するＤＮＡ配列を指す。
【0024】
「転写制御下で」は、本明細書で使用される場合、当該分野においてよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列の転写、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与するか、または転写を促進するエレメントにそれが動作可能に連結されていることに依存することを示す。
【0025】
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、少なくとも２つの共有結合で連結されたアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドは、本明細書で提供されるポリヌクレオチドによってコードされ得る。本明細書で提供されるタンパク質は、本明細書で提供される核酸配列によってコードされ得る。タンパク質は、本明細書で提供されるポリペプチドまたはアミノ酸配列を含んでいてもよい。「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、細胞に構造または酵素活性を提供することが可能なアミノ酸残基の鎖を指す。「コード配列」は、本明細書で使用される場合、タンパク質をコードする核酸配列を指す。
【0026】
本明細書で使用される場合、用語「コードする」は、それが核酸配列に適用される場合、ポリヌクレオチドが、その天然状態において、または当業者周知の方法によって操作された場合、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを生産できる場合、ポリペプチドを「コードする」と称されることを指す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補物であり、コードされている配列は、それから推測できる。
【0027】
本明細書で使用される場合、用語「同等の（equivalent）」または「生物学的な均等物（biological equivalent）」または「類似の（similar）」は、特定の分子、生物学的な、または細胞性の材料に対して述べられる場合、同義的に使用され、最小限の相同性を有しながらもなお望ましい構造または機能性を維持するものを意図する。同等のポリペプチドの非限定的な例としては、所定のポリペプチドに対して、もしくはポリペプチド配列に対して、少なくとも６０％、または代替として少なくとも６５％、または代替として少なくとも７０％、または代替として少なくとも７５％、または代替として８０％、または代替として少なくとも８５％、または代替として少なくとも９０％、または代替として少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、またはこのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその相補物によってコードされるポリペプチドが挙げられる。高いストリンジェンシーの条件は本明細書に記載され、参照により本明細書に組み入れられる。代替として、それらの均等物は、参照ポリヌクレオチドに対して、例えば野生型ポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、または代替として少なくとも７５％、または代替として８０％、または代替として少なくとも８５％、または代替として少なくとも９０％、または代替として少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはその相補物によってコードされたポリペプチドである。
【0028】
用語「動作可能に連結された」または「作動可能に連結した」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが、細胞中でそれらを機能化できるような方式で配置されていることを意図する。
【0029】
また用語「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、転写され翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドも指す。「遺伝子産物」または代替として「遺伝子発現生成物」は、遺伝子が転写され翻訳されると生成するアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。
【0030】
用語「レポーター遺伝子」は、本明細書で使用される場合、生存マーカーの調節領域に作動可能に連結することができ、その発現を決定するために、可視化できる、またはそれ以外の方法で評価できる遺伝子を含む。好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、蛍光または発光タンパク質である。蛍光タンパク質としては、これらに限定されないが、青色／ＵＶタンパク質、例えばＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、アジュライト、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、シリウス、サファイア、およびＴ－サファイア；シアンタンパク質、例えばＥＣＦＰ、セルリアン、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーミドリイシ－シアン（Midoriishi-Cyan）、ＴａｇＣＦＰ、およびｍＴＦＰ１；緑色タンパク質、例えばＥＧＦＰ、エメラルド、スーパーフォルダーＧＦＰ、モノマーアザミグリーン（Azami Green）、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、またはクローバー；黄色蛍光タンパク質、例えばＥＹＦＰ、シトリン、ビーナス、ＳＹＦＰ２、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、およびＴａｇＹＦＰを挙げることができる；レポーター遺伝子として使用するためのオレンジ色タンパク質としては、モノマークサビラオレンジ（Kusabira-Orange）、ｍＫＯｋ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、およびｍＯｒａｎｇｅ２；赤色タンパク質、例えばＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、およびｍＲｕｂｙ２を挙げることができる；遠赤色タンパク質としては、これらに限定されないが、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、およびＮｉｒＦＰが挙げられる。一部の実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＰＥ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）から選択される。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、抗体によって認識されるエピトープタグ（例えばＨＩＳ、ＦＬＡＧ、ＨＡ）であってもよいし、または例えばそれを含んでいてもよい。
【0031】
用語「リンカー」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸またはペプチド模倣配列を指す。一部の実施形態において、リンカーは、フレキシブルなコンフォメーション、秩序だった二次構造を形成できないこと、または各ドメインの活性を促進したりもしくはそれと相互作用したりすることができる疎水性の、もしくは電荷を有するフレキシブルな特徴などの１つまたは複数の特性を有する。典型的にはフレキシブルなタンパク質領域に見出されるアミノ酸としては、これらに限定されないが、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒが挙げられる。リンカー配列の長さは、機能または活性に著しい影響を及ぼすことなく変更することができる。
【0032】
用語「融合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、単一のタンパク質として転写され翻訳されるように一体化した、別々にコードされる少なくとも２つのドメインを有するタンパク質を指す。
【0033】
用語「変異」は、本明細書で使用される場合、生物のゲノム、ウイルス、または染色体外ＤＮＡのヌクレオチド配列における変更を指す。
【0034】
用語「安定して発現する（stably expresses）」または「安定して発現する（stably express）」は、本明細書で使用される場合、ゲノムへの外来遺伝子の組込みを指す。
【0035】
用語「Ｃ末端」、「カルボキシル末端」、「カルボキシ末端」、「Ｃ末端テール」、「Ｃ末端の最末端」、または「ＣＯＯＨ末端」は、本明細書で使用される場合、遊離のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）によって終結したアミノ酸鎖の末端を指す。用語「Ｎ末端」、「アミノ末端」、「ＮＨ２末端」、「Ｎ末端」、または「アミン末端」は、本明細書で使用される場合、遊離のアミン基（－ＮＨ２）に関するアミノ酸鎖の開始部分を指す。タンパク質がメッセンジャーＲＮＡから翻訳される場合、翻訳はＮ末端からＣ末端になされる。
【0036】
用語「細菌人工染色体構築物」または「ＢＡＣ構築物」は、本明細書で使用される場合、細菌における形質転換やクローニングのために使用されるＤＮＡ構築物を指す。
【0037】
用語「生殖系列」は、本明細書で使用される場合、その遺伝物質が後代に継承される多細胞生物細胞の集団を指す。一部の実施形態において、生殖系列は、卵、精液および受精卵を形成する細胞である。
【0038】
用語「培養する」は、本明細書で使用される場合、様々な種類の培地上または培地中での細胞または生物のインビトロにおける増殖を指す。培養中に増殖した細胞の子孫（descendant）は、親細胞と完全には同一でない可能性がある（すなわち、形態学的に、遺伝学的に、または表現型的に）ことが理解される。
【0039】
用語「哺乳動物」は、本明細書で使用される場合、哺乳綱に分類されたあらゆる種を指す。
【0040】
用語「マウス」は、本明細書で使用される場合、ハツカネズミ（Mus musculus）を指す。
【0041】
用語「生存可能な」は、本明細書で使用される場合、動物または細胞が特定の環境条件下で生き残るかまたは生きることができることを指す。
【0042】
用語「繁殖可能な（fertile）」は、本明細書で使用される場合、子孫（offspring）をもたらすことができる能力を指す。
【0043】
用語「子孫（offspring）」または「後代（progeny）」は、本明細書で使用される場合、生物から産まれた若い世代を指す。
【0044】
用語「生殖器官」または「生殖系」は、本明細書で使用される場合、生殖プロセスに寄与し、それに役立つ一連の臓器を指す。
【0045】
用語「サロゲート」は、本明細書で使用される場合、別の動物の代わりに子孫をもたらすために胚移植または人工授精によって妊娠させられる雌性動物を指す。
【0046】
用語「トランスジェニック」は、本明細書で使用される場合、宿主ゲノムに取り込まれたＤＮＡのセグメント、または宿主細胞中での複製が可能であり、１種または複数の細胞生成物を発現させることが可能であるＤＮＡのセグメントを指す。例示的な導入遺伝子は、対応する形質転換されていない細胞または動物と比べて、新規の表現型を有する宿主細胞またはそれから発達した動物を提供することができる。用語「トランスジェニック動物」は、本明細書で使用される場合、その細胞の少なくとも一部において染色体外エレメントとして存在する、またはその生殖系列ＤＮＡに安定して組み込まれた非内因性核酸配列を有する非ヒト動物、通常は哺乳動物を指す。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、トランスジェニックマウスである。
【0047】
遺伝子導入は、目的の遺伝子に連結されたレポーター遺伝子と共に、トランスジェニック哺乳動物、例えばマウスを作り出すのに使用される。分子遺伝学および遺伝子工学における方法は、一般的に、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et al.); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed.); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3.sup.rd Edition (F. M. Ausubel et al., eds.);およびRecombinant DNA Methodology (R. Wu ed., Academic Press)の最新版で説明されている。したがって、トランスジェニック技術は、十分に確立されている。例えば、Transgenic Mouse: Methods and Protocols (M. Hofker and J. Deursen, Eds.) in Methods in Molecular Biology (Vol. 209)（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【0048】
用語「マイクロインジェクション」は、本明細書で使用される場合、顕微鏡レベルで物質を注射するためのガラスマイクロピペットの使用を指す。
【0049】
本明細書で使用される場合、用語「生殖補助医療」または「ＡＲＴ」は、本明細書で使用される場合、雌性配偶子（卵または卵母細胞）と雄性配偶子（精液）の両方が取り扱われるあらゆる妊娠のための処置を含む。体外受精（ＩＶＦ）は、子供を儲けることにおいて不妊のカップルを支援するために使用される数々の生殖補助技術の１つである。ＩＶＦは、女性の卵巣から卵を取り出し、実験的手順で精液と受精させる手順を指す。受精卵（胚）は、将来の使用のために凍結保存してもよいし、または子宮に移してもよい。
【0050】
「桑実胚」は、本明細書で使用される場合、透明帯内に含有される固体の球体の形状の約１６個の細胞を含む早期段階の胚を指す。桑実胚はまた、割球とも称される。
【0051】
「胚盤胞」は、本明細書で使用される場合、胎盤を形成することになる周囲の壁（栄養外胚葉またはＴＥ）、羊膜腔を形成することになる流体で満たされた空孔（割腔）、およびそこから胎児が発生する内部細胞塊（ＩＣＭ）と呼ばれる細胞の内部クラスターを有する、細胞の球体からなる初期胚発生における構造を指す。
【0052】
八量体結合転写因子４（Ｏｃｔ－４またはＯＣＴ４；ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１（ＰＯＵ５Ｆ１）とも称される）は、本明細書で使用される場合、未分化胚性幹細胞の自己再生に関与するタンパク質である。ＯＣＴ４は、３つのドメイン、すなわちＮ末端ドメイン、ＰＯＵドメイン、およびＣ末端ドメインを含有する。Ｎ末端およびＣ末端ドメインの両方はトランス活性化に関与するが、Ｃ末端ドメインの活性は細胞型特異的であり、リン酸化を介して調節される。ＰＯＵ－ドメインは、細胞型特異的な調節因子による結合のための相互作用部位として機能する。
【0053】
マウス胚アッセイ（ＭＥＡ）は、毒性および最適未満の化合物を検出するのに利用される機能的および毒物学的なバイオアッセイである。ＭＥＡは、ヒト材料を関与させることなく培養培地および環境の適応性を検査するためのゴールドスタンダードであり続けている。ＭＥＡを実行するために採用される基礎技術およびプロトコールは、In Vitro Fertilization and Embryo Transfer: A Manual of Basic Techniques (Don P. Wolf, Editor), 1988, pages 57-75；および米国食品医薬品局によって発行された、Mouse Embryo Assay for Assisted Reproduction Technology Devices: Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staffに記載されており、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。簡単に言えば、このアッセイは、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）と共に雌マウスの過剰排卵を含む。マウスをｈＣＧ注射のときに雄と共に配置し、ｈＣＧの２４時間後に致死させて、１細胞胚を得るか、または注射の３６時間後に２細胞胚を得る。１細胞胚は、目に見える２つの極体を有する場合、使用のために選択され；２細胞胚は、形態学的に正常に見える場合、使用のために選択される。試験物品がマウス胚に対して何らかの毒性を提示する可能性があるかどうかを検査するために、通常の培養条件（例えば、３７℃および５％ＣＯ２）下で、１細胞系が使用される場合は約９６時間、または２細胞系の場合は７２時間、胚を試験物品中でインキュベートすることができる。代替として、培養はまた、５日、６日、またはそれより長く延長してもよい。胚の培養が完了したら、胚は、発生（例えば、胚盤胞の発生）に関して評価することができる。容認は、８０％またはそれより多くの胚が拡張期胚盤胞（expanded blastocysts）に発達した場合を含む場合がある。
【0054】
トランスジェニックマウス
特定の実施形態において、本明細書で開示されるのは、八量体結合転写因子４（ＯＣＴ４）を含む融合タンパク質の安定な発現を含む、それから本質的になる、またはそれからなるトランスジェニックマウスである。一部の場合において、融合タンパク質は、転写制御下にある。一部の場合において、融合タンパク質の遺伝子発現は、生殖系列ＤＮＡを介して安定して受け継がれる。
特定の実施形態において、本明細書で開示されるのは、八量体結合転写因子４（ＯＣＴ４）を含む融合タンパク質の安定な発現を含む、それから本質的になる、またはそれからなるトランスジェニックマウスである。一部の場合において、融合タンパク質は、転写制御下にある。一部の場合において、融合タンパク質の遺伝子発現は、生殖系列ＤＮＡを介して安定して受け継がれる。
【0055】
一部の実施形態において、ＯＣＴ４タンパク質は、マウスＯＣＴ４である。ＯＣＴ４タンパク質は、全長ＯＣＴ４、またはその断片、例えば、その機能的な断片を含んでいてもよい。用語「機能的な断片」は、本明細書で使用される場合、野生型ＯＣＴ４と同等の機能、例えばトランス活性化、未分化胚性幹細胞の自己再生、および／または胚細胞の多能性などの同等の機能を誘導することが可能なＯＣＴ４断片を指す。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、タンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部領域に、欠失（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０個、またはそれより多くの残基の欠失）を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、ドメインの欠失を含み、例えば、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、および／またはＰＯＵドメインの欠失を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、野生型ＯＣＴ４タンパク質を含む。他の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、１つまたは複数の変異、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの変異を含む。
【0056】
ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約７０％の配列同一性または類似性を含んでいてもよい。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約８０％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９０％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９５％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９６％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９７％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９８％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９９％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１に記載の配列を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１からなる。
【0057】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、蛍光タグの付いたＯＣＴ４タンパク質である。一部の場合において、蛍光タグは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を含む蛍光タンパク質である。一部の場合において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰまたは増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）である。一部の場合において、蛍光タンパク質は、野生型タンパク質、例えば、野生型ＧＦＰまたはｅＧＦＰである。他の場合において、蛍光タンパク質は、１つまたは複数の変異を含み、例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ内に１つまたは複数の変異を含む。
【0058】
一部の実施形態において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰ（例えば、ｅＧＦＰ）である。一部の場合において、ＧＦＰ（例えば、ｅＧＦＰ）は、全長ＧＦＰである。他の例において、ＧＦＰ（例えば、ｅＧＦＰ）は、その断片であり、例えば、その機能的な断片である。用語「機能的な断片」は、本明細書で使用される場合、蛍光を生じさせることが可能なＧＦＰ断片を指す。一部の場合において、ＧＦＰ（例えば、ｅＧＦＰ）は、タンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部領域に、欠失（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０個、またはそれより多くの残基の欠失）を含む。一部の場合において、ＧＦＰ（例えば、ｅＧＦＰ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの変異を含む。一部の場合において、ＧＦＰ（例えば、ｅＧＦＰ）は、Ａ２０６Ｋ変異を含む。
【0059】
一部の場合において、蛍光タンパク質は、配列番号２と、少なくとも、または約７０％の配列同一性または類似性を含むＧＦＰである。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２と、少なくとも、または約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２と、少なくとも、または約８０％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２と、少なくとも、または約９０％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２と、少なくとも、または約９５％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２と、少なくとも、または約９６％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２と、少なくとも、または約９７％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２と、少なくとも、または約９８％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２と、少なくとも、または約９９％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２に記載の配列を含む。一部の場合において、ＧＦＰは、配列番号２からなる。
【0060】
蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）は、ＯＣＴ４タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部部位に作動可能に連結されていてもよい。一部の場合において、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰまたはｅＧＦＰ）は、ＯＣＴ４タンパク質のＣ末端に作動可能に連結されている。
【0061】
一部の実施形態において、生殖系列は、これらに限定されないが、精液、卵母細胞、幹細胞、または接合体から選択される。一部の場合において、生殖系列は、精液から選択される。一部の場合において、生殖系列は、卵母細胞から選択される。一部の場合において、生殖系列は、幹細胞から選択される。一部の場合において、生殖系列は、接合体から選択される。
【0062】
一部の場合において、トランスジェニックマウスは、生存可能であり繁殖可能なマウスである。一部の場合において、トランスジェニックマウスは、子孫に安定して組み込まれる融合タンパク質を含む、子孫をもたらすことが可能な生存可能な雄である。他の例において、トランスジェニックマウスは、子孫に安定して組み込まれる融合タンパク質を含む、子孫をもたらすことが可能な生存可能な雌である。
【0063】
一部の場合において、接合体における融合タンパク質の遺伝子発現は、２細胞期、３細胞期、または４細胞期の細胞の発生から始まる。
【0064】
特定の実施形態において、本明細書で開示されるのは、上述したトランスジェニックマウスを生産する方法である。一部の実施形態において、本方法は、接合体を、マウスＯＣＴ４遺伝子座に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む、または代替としてそれから本質的になる、またはさらにはそれからなる構築物でマイクロインジェクションするステップを含み、または代替としてそれから本質的になり、またはさらにはそれからなり、接合体をサロゲートマウスの生殖器官に着床させ、それによってトランスジェニックマウスを生産する。一部の場合において、構築物は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）構築物であり、構築物は、マウスＯＣＴ４遺伝子座に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む、または代替としてそれから本質的になる、またはさらにはそれからなる。一部の場合において、トランスジェニックマウスは、レポーター遺伝子を安定して発現する。
【0065】
一部の実施形態において、レポーター遺伝子座は、トランスジェニックマウスの生殖系列ＤＮＡを介して安定して受け継がれる。生殖系列は、精液、卵母細胞、幹細胞、または接合体から選択することができる。
【0066】
一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、蛍光タンパク質は、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）から選択される。一態様において、ＧＦＰは、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）である。一態様において、ｅＧＦＰは、Ａ２０６Ｋ変異を含む、または代替としてそれから本質的になる、またはさらにはそれからなる。
【0067】
一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、配列番号２と、少なくとも、または約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性を含む蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２と、少なくとも、または約８０％の配列同一性を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２と、少なくとも、または約８５％の配列同一性を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２と、少なくとも、または約９０％の配列同一性を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２と、少なくとも、または約９５％の配列同一性を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２と、少なくとも、または約９６％の配列同一性を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２と、少なくとも、または約９７％の配列同一性を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２と、少なくとも、または約９８％の配列同一性を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２と、少なくとも、または約９９％の配列同一性を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２を含む蛍光タンパク質をコードする。一部の場合において、核酸配列は、配列番号２からなる蛍光タンパク質をコードする。
【0068】
一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、コード配列に作動可能に連結されている。一態様において、コード配列は、ＯＣＴ４タンパク質をコードする。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約８０％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９０％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９５％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９６％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９７％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９８％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１と、少なくとも、または約９９％の配列同一性を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１に記載の配列を含む。一部の場合において、ＯＣＴ４タンパク質は、配列番号１からなる。
【0069】
一部の実施形態において、レポーター遺伝子および遺伝子コード配列（例えば、ＯＣＴ４）は、リンカーによって隔てられている。一態様において、リンカーは、複数のＡｌａ、Ｇｌｙ、またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列をコードする。一態様において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーを含むアミノ酸配列をコードしており、ｎは、１～１０から選択される整数であり；任意選択で、１～６、１～４、および１～３から選択される整数であり；さらに任意選択で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される整数である。一態様において、リンカーは、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）を含むアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、コード配列（例えば、ＯＣＴ４）のＮ末端、Ｃ末端、または内部領域に作動可能に連結されている。一態様において、リンカーは、レポーター遺伝子をコード配列（例えば、ＯＣＴ４）のＣ末端に接続する。
【0070】
一部の実施形態において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約７０％の配列同一性または類似性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約８０％の配列同一性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約９０％の配列同一性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約９５％の配列同一性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約９６％の配列同一性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約９７％の配列同一性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約９８％の配列同一性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４と、少なくとも、または約９９％の配列同一性を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４に記載の配列を含む。一部の場合において、蛍光タンパク質およびＯＣＴ４タンパク質を含むポリペプチドは、配列番号４からなる。
【0071】
一部の実施形態において、構築物は、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質をコードする。一部の場合において、構築物は、配列番号５と、少なくとも、または約７０％の配列同一性または類似性を含む核酸配列を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約８０％の配列同一性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約８５％の配列同一性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約９０％の配列同一性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約９５％の配列同一性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約９６％の配列同一性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約９７％の配列同一性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約９８％の配列同一性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５と、少なくとも、または約９９％の配列同一性を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５に記載の配列を含む。一部の場合において、核酸配列は、配列番号５からなる。
【0072】
一部の場合において、構築物は、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現を媒介する。一部の場合において、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質は、接合体に安定して組み込まれている。
【0073】
一部の場合において、構築物内のＯＣＴ４遺伝子座は、近位エンハンサーエレメントの欠失を含む。
【0074】
一部の実施形態において、本明細書で開示されるのは、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する胚であって、卵母細胞は、ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を含む精液と受精し、精液は、上述したトランスジェニックマウスに由来する、胚である。
【0075】
一部の実施形態において、本明細書で開示されるのは、上述したトランスジェニックマウスに由来するＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する幹細胞である。
【0076】
一部の実施形態において、本明細書で開示されるのは、上述したトランスジェニックマウスに由来するＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現する生殖系列細胞である。
【0077】
生成物評価の方法
特定の実施形態において、本明細書で開示されるのは、生殖補助医療（ＡＲＴ）、疾患の処置、薬物のスクリーニング、または免疫モジュレーションのために使用される生成物を評価するための方法である。一部の場合において、本方法は、（ａ）ＯＣＴ４を含む融合タンパク質の安定な発現を含むトランスジェニック胚を得るステップ；（ｂ）トランスジェニック胚を培養するステップ；（ｃ）融合タンパク質の発現を評価するステップ；および（ｄ）生成物の容認性または失敗を決定するステップを含む。
特定の実施形態において、本明細書で開示されるのは、生殖補助医療（ＡＲＴ）、疾患の処置、薬物のスクリーニング、または免疫モジュレーションのために使用される生成物を評価するための方法である。一部の場合において、本方法は、（ａ）ＯＣＴ４を含む融合タンパク質の安定な発現を含むトランスジェニック胚を得るステップ；（ｂ）トランスジェニック胚を培養するステップ；（ｃ）融合タンパク質の発現を評価するステップ；および（ｄ）生成物の容認性または失敗を決定するステップを含む。
【0078】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＯＣＴ４タンパク質に融合した蛍光タンパク質である。一部の場合において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）から選択される。一部の場合において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰまたは増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から選択される。一部の場合において、ｅＧＦＰは、変異を含み、例えば、Ａ２０６Ｋ変異を含む。
【0079】
一部の実施形態において、評価するステップは、融合タンパク質の時間的および／または空間的な発現パターンを決定することを含む。評価するステップは、融合タンパク質の核局在化および／または細胞質局在化を可視化することを含んでいてもよい。核局在化は、核への融合タンパク質のシャトリング、加えて、核中の融合タンパク質によるＤＮＡの結合を包含していてもよい。評価するステップは、融合タンパク質の時間的および／または空間的な発現パターンを対照と比較して、胚発生に異常が生じたかどうかを決定することをさらに含んでいてもよい。対照は、本明細書で使用される場合、胚が正常な発生を経た同等の胚からの、融合タンパク質の時間的および／または空間的な発現パターンを指す。
【0080】
一部の場合において、評価するステップは、４細胞または８細胞期で行われる。一部の場合において、融合タンパク質が、４細胞期で核において優勢に局在化される。用語「優勢に（predominately）」は、本明細書で使用される場合、核において局在化される融合タンパク質の、少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより多くを指す。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約５０％が、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約６０％が、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約７０％が、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約８０％が、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９０％が、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９５％が、核において局在化される。
【0081】
一部の場合において、評価するステップは、４細胞期または８細胞期での融合タンパク質の発現の場所を決定することを含む。一部の場合において、融合タンパク質が、４細胞期で核において優勢に発現される（例えば、核において発現される融合タンパク質の、少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより多く）。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約５０％が、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約６０％が、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約７０％が、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約８０％が、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９０％が、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９５％が、核において発現される。
【0082】
一部の場合において、評価するステップは、８細胞期で行われる。一部の場合において、融合タンパク質の、少なくとも、または約８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれより多くが、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約８０％が、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９０％が、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９５％が、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の約１００％が、核において局在化される。
【0083】
一部の場合において、評価するステップは、８細胞期での融合タンパク質の発現の場所を決定することを含む。一部の場合において、融合タンパク質の、少なくとも、または約８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれより多くが、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約８０％が、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９０％が、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９５％が、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の約１００％が、核において発現される。
【0084】
一部の場合において、評価するステップは、桑実胚期で行われる。一部の場合において、融合タンパク質の、少なくとも、または約８０％、９０％、９５％、またはそれより多くが、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約８０％またはそれより多くが、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９０％またはそれより多くが、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９５％またはそれより多くが、核において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の約１００％が、核において局在化される。
【0085】
一部の場合において、評価するステップは、桑実胚期での融合タンパク質の発現の場所を決定することを含む。一部の場合において、融合タンパク質の、少なくとも、または約８０％、９０％、９５％、またはそれより多くが、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約８０％またはそれより多くが、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９０％またはそれより多くが、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９５％またはそれより多くが、核において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の約１００％が、核において発現される。
【0086】
一部の場合において、評価するステップは、胚盤胞期で行われる。一部の場合において、融合タンパク質の、少なくとも、または約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより多くが、内部細胞塊（ＩＣＭ）において局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約７０％またはそれより多くが、ＩＣＭにおいて局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約８０％またはそれより多くが、ＩＣＭにおいて局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９０％またはそれより多くが、ＩＣＭにおいて局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９５％またはそれより多くが、ＩＣＭにおいて局在化される。一部の場合において、融合タンパク質の約１００％が、ＩＣＭにおいて局在化される。一部の場合において、融合タンパク質は、栄養膜において局在化されない。
【0087】
一部の場合において、評価するステップは、胚盤胞期での融合タンパク質の発現の場所を決定することを含む。一部の場合において、融合タンパク質の、少なくとも、または約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより多くが、内部細胞塊（ＩＣＭ）において発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約７０％またはそれより多くが、ＩＣＭにおいて発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約８０％またはそれより多くが、ＩＣＭにおいて発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９０％またはそれより多くが、ＩＣＭにおいて発現される。一部の場合において、融合タンパク質の少なくとも、または約９５％またはそれより多くが、ＩＣＭにおいて発現される。一部の場合において、融合タンパク質の約１００％が、ＩＣＭにおいて発現される。一部の場合において、融合タンパク質は、栄養膜において発現されない。
【0088】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、培養の約２４時間～約９６時間、約２４時間～約７２時間、約２４時間～約４８時間、約２４時間～約３６時間、約３６時間～約９６時間、約３６時間～約７２時間、約３６時間～約４８時間、約４８時間～約７２時間、または約４８時間～約９６時間のあたりで検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約３６時間～約９６時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約３６時間～約７２時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約３６時間～約４８時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約４８時間～約９６時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約４８時間～約７２時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、目視検査を介して検出され、例えば、蛍光タンパク質の蛍光に基づいて検出される。他の例において、融合タンパク質は、核酸発現分析を介して検出される。追加の例において、融合タンパク質は、タンパク質発現分析を介して検出される。
【0089】
一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、または約９６時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約３６時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約４８時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約７２時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、培養の約９６時間において検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、目視検査を介して検出され、例えば、蛍光タンパク質の蛍光に基づいて検出される。他の例において、融合タンパク質は、核酸発現分析を介して検出される。追加の例において、融合タンパク質は、タンパク質発現分析を介して検出される。
【0090】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、２細胞期、３細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、桑実胚期、または胚盤胞で検出可能である。一部の実施形態において、融合タンパク質は、２細胞期、３細胞期、４細胞期、または８細胞期の細胞の発生で検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、４細胞期の細胞の発生で検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、８細胞期の細胞の発生で検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、１６細胞期の細胞の発生で検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、桑実胚期の細胞の発生で検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、胚盤胞期の細胞の発生で検出可能である。一部の場合において、融合タンパク質は、目視検査を介して検出され、例えば、蛍光タンパク質の蛍光に基づいて検出される。他の例において、融合タンパク質は、核酸発現分析を介して検出される。追加の例において、融合タンパク質は、タンパク質発現分析を介して検出される。
【0091】
一部の場合において、評価するステップは、１日１回、１日２回、１日３回、１日おき、または培養プロセス中の連続する各日に行われる。一部の場合において、１回または複数の評価するステップは、培養プロセスの開始から、約２４時間～約９６時間、約２４時間～約７２時間、約２４時間～約４８時間、約２４時間～約３６時間、約３６時間～約９６時間、約３６時間～約７２時間、約３６時間～約４８時間、約４８時間～約７２時間、または約４８時間～約９６時間行われる。
【0092】
一部の実施形態において、評価するステップは、例えば、ａ）特定の発生段階で、トランスジェニック胚の少なくとも１つの画像を取り込むこと、ｂ）画像に基づいて、融合タンパク質の場所を決定すること；およびｃ）融合タンパク質の場所を対照と比較することのうちの１つまたは複数を含んでいてもよい。対照は、特定の発生段階における同等のトランスジェニック胚における融合タンパク質の場所であってもよく、同等のトランスジェニック胚は、正常な胚発生を経ている。
【0093】
一部の実施形態において、評価するステップは、対照と共に融合タンパク質の発現レベルを決定することをさらに含む。一部の場合において、発現レベルは、核酸発現を決定することによって、またはタンパク質発現を決定することによって、視覚的に、またはそのためのデバイスを使用して、光の放出および／または強度を測定することによって決定される。
【0094】
一部の場合において、例えば、４細胞期、８細胞期、または桑実胚期で融合タンパク質の核局在化または発現がある場合、その生成物は容認される。一部の場合において、胚盤胞期中にＩＣＭにおける局在化または発現がある場合、その生成物は容認される。
【0095】
一部の場合において、４細胞期または８細胞期における融合タンパク質の核局在化または発現が４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満の場合、その生成物は容認されない。一部の場合において、８細胞期で融合タンパク質の核局在化または発現がない場合、その生成物は容認されない。
【0096】
一部の場合において、桑実胚期における融合タンパク質の核局在化または発現が４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満の場合、その生成物は容認されない。一部の場合において、桑実胚期において融合タンパク質の核局在化または発現がない場合、その生成物は容認されない。
【0097】
一部の場合において、胚盤胞期でのＩＣＭにおける融合タンパク質の局在化または発現が４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満の場合、その生成物は容認されない。一部の場合において、胚盤胞期でのＩＣＭにおける融合タンパク質の局在化または発現がない場合、その生成物は容認されない。一部の場合において、胚盤胞期で、栄養膜において融合タンパク質の局在化または発現がある場合、その生成物は容認されない。
【0098】
一部の実施形態において、生成物は、生殖補助医療（ＡＲＴ）と共に使用するためのものである。生成物としては、消耗品が挙げられ、消耗品としては、これらに限定されないが、培地、培地サプリメント、プラスチック製品、管材料、ピペット、ピペットチップなど、または卵または胚と接触した状態になるあらゆる材料が挙げられる。プラスチックおよびガラス製品としては、生殖補助用の針、実験用グローブ、生殖補助用のカテーテル、および生殖補助用のマイクロツール、例えばピペット、または胚を露出させる、顕微操作する、保持する、もしくは移動させるために実験室で使用される他のデバイスを挙げることができる。ＩＶＦ消耗品としてはさらに、生殖補助用の実験器具が挙げられ、このような実験器具としては、これらに限定されないが、シリンジ、ＩＶＦ組織培養ディッシュ、ＩＶＦ組織培養プレート、ピペットチップ、ディッシュ、プレート、および配偶子、胚、または組織培養培地と物理的に接触した状態になる他の容器が挙げられる。ＩＶＦ消耗品としては、本明細書で使用される場合、生殖補助用の水や、ＩＶＦまたは他の生殖補助処置のための胚の吸引、インキュベーション、移動または貯蔵に使用される培地を再構成させるための、加えて胚と接触すると予想される実験器具または他の生殖補助デバイスのための最終的な濯ぎとして使用するための高品質の滅菌パイロジェンフリー水を生成することを意図した浄水システムを挙げることができる。一部の場合において、生成物は、針、カテーテル、マイクロツール、実験器具、シリンジ、組織培養ディッシュ、組織培養プレート、ピペットチップ、ディッシュ、プレート、水、浄水システム、培地、培地サプリメント、または胚と物理的に接触した状態になる他のデバイスもしくは試薬を含む。
【0099】
一部の実施形態において、生殖補助医療（ＡＲＴ）のために使用される生成物を評価するための方法は、形態学ベースの胚の格付けのばらつきを低減することができる。一部の場合において、本方法は、任意選択で胚培養の４８時間後における、融合タンパク質の核局在化の可視化を可能にする。一部の場合において、本方法は、同等のアッセイ、例えばマウス胚アッセイ（ＭＥＡ）と比較して、偽陽性を低減することができる。
【0100】
一部の実施形態において、生成物は、疾患に関連するタンパク質または遺伝子である。生成物はまた、マウスモデルとして使用するためのタンパク質または遺伝子を含むトランスジェニックマウスも包含する。疾患は、がんであってもよい。一部の場合において、がんは、固形腫瘍である。他の場合において、がんは、血液系腫瘍である。タンパク質または遺伝子は、がんに関連するものであってもよく、任意選択で固形腫瘍または血液系腫瘍に関連するものであってもよい。タンパク質または遺伝子は、腫瘍関連抗原であってもよい。例示的な腫瘍関連抗原としては、これらに限定されないが、ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２（シグレック２）；ＣＤ３７；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；または腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）が挙げられる。タンパク質または遺伝子はまた、正常な対象におけるタンパク質または遺伝子の発現と比較して、がん対象において過剰発現または抑制されたタンパク質または遺伝子であってもよい。
【0101】
一部の場合において、生成物は、自己免疫疾患に関連するタンパク質または遺伝子であるか、および／またはマウスモデルとして使用するためのタンパク質または遺伝子を含むトランスジェニックマウスである。タンパク質または遺伝子は、自己免疫疾患に罹っている対象において、正常な対象におけるタンパク質または遺伝子の発現と比較して過剰発現または抑制されていてもよい。
【0102】
一部の実施形態において、生成物は、胚の発生に関連するタンパク質または遺伝子である。タンパク質または遺伝子は、タンパク質－タンパク質相互作用もしくは遺伝子発現、代謝プロセス、細胞形態形成、細胞分裂、細胞増殖、ＤＮＡ複製、細胞分化、またはＤＮＡ修復および転写を調節することに関連するものであってもよい。タンパク質または遺伝子は、細胞のコミュニケーション、アポトーシス、免疫応答、ハウスキーピング、または組織特異的な機能に関連するものであってもよい。例示的なタンパク質または遺伝子としては、これらに限定されないが、多能性幹細胞（ＰＳ）特異的なマーカー、例えばＳｏｘ遺伝子のファミリー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８）；Ｋｌｆ遺伝子のファミリー、例えばＫｌｆ４およびＫｌｆ５；またはＮａｎｏｇ遺伝子のファミリー、例えばＮＡＮＯＧ；ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーおよびそれらそれぞれの受容体に関連するマーカー；クリプティックタンパク質ファミリーに関連するマーカー（例えば、クリプト－１（Cripto-1））；インテグリンファミリーに関連するマーカー（例えば、インテグリンアルファ６（ＣＤ４９ｆ）およびインテグリンベータ１（ＣＤ２９））；ポドカリキシンファミリー（ＰＯＤＸ－１）、ＦＧＦファミリー（例えば、ＦＧＦ４およびＦＧＦ－５）、フォークヘッドボックス転写因子ファミリー（例えば、ＦｏｘＤ３）、転写因子のＴ－ボックスファミリー（例えば、ＴＢＸ３およびＴＢＸ５）、発生多能性関連分子のファミリー（例えば、Ｄｐｐａ２、Ｄｐｐａ３／Ｓｔｅｌｌａ、Ｄｐｐａ４およびＤｐｐａ５／ＥＳＧ１）、ＬＲＲファミリー（例えば、５Ｔ４）、カドヘリンファミリー（例えば、Ｅ－カドヘリン）、膜貫通タンパク質のコネクシンファミリー（例えば、コネクシン－４３およびコネクシン－４５）、「他の」カテゴリーのＦ－ボックスファミリー（例えば、ＦＢＯＸＯ１５）、ケモカイン／ケモカイン受容体のファミリー（例えば、ＣＣＲ４およびＣＸＣＲ４）、またはＡＴＰ結合カセット輸送体（例えば、ＡＢＣＧ２）に関連するマーカーを挙げることができる。
【0103】
一部の実施形態において、１つまたは複数の胚性幹細胞はさらに、トランスジェニック胚から得ることもできる。１つまたは複数の胚性幹細胞を培養して、複数の胚性幹細胞を生成することができる。複数の胚性幹細胞は、その後、薬物と共に培養してもよい。融合タンパク質の発現を評価して、薬物の容認性または失敗を決定することもできる。一部の場合において、薬物は、疾患、任意選択でがんまたは自己免疫疾患の処置における使用のためのものである。一部の場合において、薬物は、免疫応答をモジュレートすることにおける使用のためのものである。
【0104】
胚発生の定性的な分析は、視覚的に、例えば、蛍光タンパク質発現を可視化するための紫外線を含み得る光学顕微鏡法を用いて、色、光の強度または蛍光を評価することによって発生中の胚を分析することによって達成することができる。また共焦点顕微鏡法も、発生中の胚を評価するために利用することができる。一部の場合において、胚発生は、胚子鏡（例えば、ＥｍｂｒｙｏＳｃｏｐｅ（登録商標）タイムラプスシステム、Ｕｎｉｓｅｎｓｅ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｅｃｈ Ａ／Ｓ）を介して観察され、この場合、発生中の胚の写真を、要求に応じて、例えばおよそ５、１０、２０、３０秒毎に、またはそれより長い数分毎に撮影することができ、胚発生の全ての段階を追跡するためにタイムラプスビデオを作成することができる。
【0105】
キットおよび製造品（articles of manufacture）
特定の実施形態において、本発明の開示は、この開示の方法を実行するためのキット、加えて、本発明の開示の方法を行うための説明書を提供する。キットは、上述した融合タンパク質を導入するための構築物、改変された卵（例えば、卵母細胞および／または接合体）、トランスジェニック胚、および／または上述したトランスジェニックマウス、および使用のための説明書の１つまたは複数を含む、または代替としてそれから本質的になる、またはさらにはそれからなる。
特定の実施形態において、本発明の開示は、この開示の方法を実行するためのキット、加えて、本発明の開示の方法を行うための説明書を提供する。キットは、上述した融合タンパク質を導入するための構築物、改変された卵（例えば、卵母細胞および／または接合体）、トランスジェニック胚、および／または上述したトランスジェニックマウス、および使用のための説明書の１つまたは複数を含む、または代替としてそれから本質的になる、またはさらにはそれからなる。
【0106】
キットは、この開示の方法との使用のための培養培地および／またはサプリメントを含んでいてもよい。一部の場合において、培養培地としては、これらに限定されないが、生殖補助手順に使用される生殖培地およびサプリメントが挙げられる。培地は、調製、維持、移動、または貯蔵の目的のための、胚と直接的に物理的に接触することになる様々な物質（例えば水、配偶子または胚を処置するのに使用される酸溶液、濯ぎ溶液、試薬、精液分離培地、または培地を覆うのに使用される油）の液体および粉末バージョンを含んでいてもよい。サプリメントは、培地の具体的な特性を増強するために培地に添加される具体的な試薬、例えばタンパク質、血清、抗生物質などを含んでいてもよい。適宜、これらの示唆されたキット成分は、当業者による使用にとって慣例的な方式でパッケージ化されていてもよい。
【0107】
部分的な配列表
ＯＣＴ４タンパク質配列－配列番号１
ＯＣＴ４タンパク質配列－配列番号１
【0108】
【化1】
【0109】
ＧＦＰタンパク質配列－配列番号２
【0110】
【化2】
【0111】
ＯＣＴ４：：ＥＧＦＰ融合タンパク質配列－配列番号４
【0112】
【化3】
【0113】
構築物配列－配列番号５
【0114】
【化4-1】
【0115】
【化4-2】
【0116】
【化4-3】
【0117】
【化4-4】
【0118】
【化4-5】
【0119】
【化4-6】
【0120】
【化4-7】
【0121】
【化4-8】
【実施例】
【0122】
これらの実施例は、単に例示的な目的で提供され、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
【0123】
実施例１ ＯＣＴ４－ＧＦＰトランスジェニックマウスの生産
材料および方法
ＢＡＣクローニングおよびマイクロインジェクション
細菌人工染色体（ＢＡＣ）構築物を、Ｏｃｔ４融合タンパク質の発現のために使用した。モノマーＥＧＦＰを、Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）遺伝子座に組換え処理した（recombineered）。ＥＧＦＰをＯＣＴ４のＣ末端に挿入した。レポータータンパク質とＯＣＴ４との間の立体障害を最小化するために、フレキシブルなアミノ酸リンカーコード配列（Ｓ（ＧＧＧＧＳ）３；配列番号３）を遺伝子コード配列とレポーター遺伝子との間に挿入した。
材料および方法
ＢＡＣクローニングおよびマイクロインジェクション
細菌人工染色体（ＢＡＣ）構築物を、Ｏｃｔ４融合タンパク質の発現のために使用した。モノマーＥＧＦＰを、Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）遺伝子座に組換え処理した（recombineered）。ＥＧＦＰをＯＣＴ４のＣ末端に挿入した。レポータータンパク質とＯＣＴ４との間の立体障害を最小化するために、フレキシブルなアミノ酸リンカーコード配列（Ｓ（ＧＧＧＧＳ）３；配列番号３）を遺伝子コード配列とレポーター遺伝子との間に挿入した。
【0124】
Ｂ６ＳＪＬＦ１（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）雌卵ドナーを使用した。ＰＭＳＧ（回収の３日前、正午に、動物１匹当たり５Ｕ：Ｐｒｏｓｐｅｃ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ、＃ＨＯＲ－２７２）およびｈＣＧホルモン（回収の１日前、正午に、動物１匹当たり５Ｕ、ＳＩＧＭＡ、 Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ、＃ＣＧ５－１ＶＬ）の逐次的な注射の後に。回収の前日に雌をＢ６ＳＪＬＦ１雄と交配させた。Ｂ６ＳＪＬＦ２胚をＥ０．５に回収し、各導入遺伝子に対するＢＡＣ構築物を前核に注射した。注射された胚を、偽妊娠したサロゲートマザーの生殖器官に着床させた（ＩＣＲ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）。着床の２０日後、新生仔の数を計数し、７～１０日齢に足指の生検を実行して、ＰＣＲ遺伝子型解析のためのＤＮＡを抽出した。
【0125】
遺伝子型解析
遺伝子型解析のための２つのＰＣＲ方法、従来のＰＣＲおよびｑＰＣＲを利用した。従来のＰＣＲの場合、アニーリング温度は５８℃であった。ｅＧＦＰ配列を検出するために以下のプライマーを使用した。
遺伝子型解析のための２つのＰＣＲ方法、従来のＰＣＲおよびｑＰＣＲを利用した。従来のＰＣＲの場合、アニーリング温度は５８℃であった。ｅＧＦＰ配列を検出するために以下のプライマーを使用した。
【0126】
ｅＧＦＰ（生成物サイズ＝２２７ｂｐ）
【0127】
ＴＭＦ７３８フォワード：５’－ＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣ－３’（配列番号６）
【0128】
ＴＭＦ７３９リバース：５’－ＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧ－３’（配列番号７）
【0129】
内部対照（マウスＦｎｄｃ３ａ遺伝子：生成物サイズ＝４００ｂｐ）
【0130】
ＴＭＦ７２５フォワード：５’－ＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＧＣＧＴＴＡＧＧＴ－３’（配列番号８）
【0131】
ＴＭＦ７２６リバース：５’－ＴＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴ－３’（配列番号９）。
【0132】
ＣＦＸ－ＢｉｏＲＡＤ ｑＰＣＲのセットアップに、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲプロトコールを使用した。ＥＧＦＰ導入遺伝子の遺伝子型を、公知のホモ接合型（ＨＯ）およびヘミ接合型（ＨＥＭＩ）対照および内因性参照（ＡｐｏＢ遺伝子）に対してＥＧＦＰのδＣｔ値を比較することによって決定した。
【0133】
以下のＰＣＲ条件を使用した：９５℃で３分間－＞（９５℃で１５秒間－＞６０℃３０秒間）×４０サイクル。
【0134】
表１は、使用されるｑＰＣＲプライマーおよびプローブを例示する。
【0135】
【表1】
【0136】
Ｇ０戻し交配
トランスジェニック対立遺伝子を単離するために、ＰＣＲ陽性Ｇ０ファウンダーをＢ６ＳＪＬＦ１動物に戻し交配した。Ｏｃｔ４－ＧＦＰ子孫をＧ３世代まで戻し交配して、導入遺伝子のコピー数を安定化した。
トランスジェニック対立遺伝子を単離するために、ＰＣＲ陽性Ｇ０ファウンダーをＢ６ＳＪＬＦ１動物に戻し交配した。Ｏｃｔ４－ＧＦＰ子孫をＧ３世代まで戻し交配して、導入遺伝子のコピー数を安定化した。
【0137】
画像化のための胚の回収
ヘミ接合型（ＨＥＭＩ）雄をＢ６Ｊ雌と交雑し、ＨＥＭＩ雌をＢ６Ｊ雄またはＴｇ（Ｐｏｕ５ｆ１－ＥＧＦＰ）２Ｍｎｎ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号００４６５４：ＴｇＯＧ２）ＨＯ雄と交雑した。Ｂ６Ｊ雌およびＴｇＯＧ２雌を、後続のホルモン注射（ＰＭＳＧ：交配の３日前、および５ＵのｈＣＧ：交配の１日前に）によって過剰排卵させた。動物を、一晩（１細胞胚回収のために）または２日（２細胞期胚回収）一緒に格納した。胚を回収し、ＰＬＡＮＥＲ ＢＴ－３７インキュベーター（Ｏｒｉｇｉｏ、Ｍａｌｏｖ、Ｄｅｎｍａｒｋ）において、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２で、平衡化した鉱油を上に積層したＫＳＯＭ液滴中で培養した。
ヘミ接合型（ＨＥＭＩ）雄をＢ６Ｊ雌と交雑し、ＨＥＭＩ雌をＢ６Ｊ雄またはＴｇ（Ｐｏｕ５ｆ１－ＥＧＦＰ）２Ｍｎｎ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号００４６５４：ＴｇＯＧ２）ＨＯ雄と交雑した。Ｂ６Ｊ雌およびＴｇＯＧ２雌を、後続のホルモン注射（ＰＭＳＧ：交配の３日前、および５ＵのｈＣＧ：交配の１日前に）によって過剰排卵させた。動物を、一晩（１細胞胚回収のために）または２日（２細胞期胚回収）一緒に格納した。胚を回収し、ＰＬＡＮＥＲ ＢＴ－３７インキュベーター（Ｏｒｉｇｉｏ、Ｍａｌｏｖ、Ｄｅｎｍａｒｋ）において、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２で、平衡化した鉱油を上に積層したＫＳＯＭ液滴中で培養した。
【0138】
画像化
Ｎｉｋｏｎの顕微鏡を使用した。倍率を１１．５×に設定した。同腹子間または各胚間でシグナル強度を比較するために、蛍光画像化パラメーターを同じゲイン／露出時間で固定した。明視野画像を自動露出曝露設定で撮影した。
Ｎｉｋｏｎの顕微鏡を使用した。倍率を１１．５×に設定した。同腹子間または各胚間でシグナル強度を比較するために、蛍光画像化パラメーターを同じゲイン／露出時間で固定した。明視野画像を自動露出曝露設定で撮影した。
【0139】
精液の凍結保存
精液の凍結保存を、Nakagata, N. (2011) Cryopreservation of Mouse Spermatozoa and In Vitro Fertilization. In: Hofker M., van Deursen J. (eds) Transgenic Mouse Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 693. Humana Pressで例示されるような確立されたプロトコールを用いて実行した。
精液の凍結保存を、Nakagata, N. (2011) Cryopreservation of Mouse Spermatozoa and In Vitro Fertilization. In: Hofker M., van Deursen J. (eds) Transgenic Mouse Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 693. Humana Pressで例示されるような確立されたプロトコールを用いて実行した。
【0140】
結果
ドナー株としてＢ６ＳＪＬＦ２受精卵母細胞を使用して、マイクロインジェクションを実行した。１４２個の胚を注射し、３６匹の仔が産まれ、７Ｇ０動物が導入遺伝子を有することを確認した。
ドナー株としてＢ６ＳＪＬＦ２受精卵母細胞を使用して、マイクロインジェクションを実行した。１４２個の胚を注射し、３６匹の仔が産まれ、７Ｇ０動物が導入遺伝子を有することを確認した。
【0141】
トランスジェニック対立遺伝子を単離するために、７匹の陽性Ｇ０動物をそれぞれ野生型Ｂ６ＳＪＬＦ１動物と戻し交配した。７匹のファウンダーのうち５匹が、生殖系列を介して導入遺伝子アレイを受け継いだ（５匹のファウンダーからの後続の系統または子孫を、それぞれＡ系統、Ｂ系統、Ｃ系統、Ｄ系統、またはＥ系統と名付けた）。最初に、従来のＰＣＲによって遺伝子型解析を実行して、マウスゲノムにおけるｍＥＧＦＰ挿入を検出した。各系統でｍＥＧＦＰ発現強度の差が観察された後、ｑＰＣＲ－ｄＣＴアッセイを展開して、各系統におけるｍＥＧＦＰの相対的なコピー数を測定した。
【0142】
独立した系統を生じさせるための繁殖中に、Ｂ系統における導入遺伝子のコピー数の異常な変動が世代間で観察された。Ｇ２世代でさえも、同腹子内でｍＥＧＦＰコピー数の変化が観察された。導入遺伝子コピー数変動の原因は不明なままである。しかしながら、少なくとも２世代にわたる各系統におけるＢ６ＳＪＬ Ｆ１野生型マウスへの導入遺伝子の戻し交配後、コピー数の変動はなくなった。変動は、導入遺伝子アレイを含む染色体内組換えによって起こった可能性がある。
【0143】
相対的なｍＥＧＦＰコピー数を、内部対照（ＡｐｏＢ遺伝子の二倍体コピー）に対してｍＥＧＦＰシグナルを正規化することによって決定した。
【0144】
ＨＯマウスが生存可能であり繁殖可能であるかどうかを決定するために、さらに、ＯＣＴ４－ｍＥＧＦＰシグナルの増加を試みるために、Ｇ３ ＨＥＭＩ雄をＧ３ ＨＥＭＩ雌と交雑した。遺伝子型を、ｑＰＣＲ－ｄＣＴ方法によって決定した：ＨＯ遺伝子型を、各系統のＨＥＭＩ対照と比べて、ＧＦＰ導入遺伝子の二重の投与量によって決定した。ＨＯ動物は、Ａ系統、Ｂ系統、Ｃ系統、およびＥ系統で生存可能であると確認された。カイ二乗分析は、Ｃ系統のＨＥＭＩ異種交配からの子孫の遺伝子型が、予想されるメンデル比に従っていることを示す。結果から、Ａ系統のＨＯ胚が、ＨＥＭＩおよびＷＴと比較して生存率を増加させたこと、Ｂ系統のＨＯ胚が、生存率を減少させたこと、Ａ系統およびＣ系統のＨＯは繁殖可能であることが確認された。Ｂ系統のＨＯは交配して胚を生産できるが、Ｂ系統のＨＯ雌は、Ｂ系統のＨＯまたはＨＥＭＩ雄と交雑した場合、仔をまったく産まなかった。
【0145】
ＨＥＭＩまたはＨＯ雄を、過剰排卵されたＢ６Ｊ雌（父系統）と交雑した。胚を回収し、従来の蛍光立体顕微鏡、または共焦点蛍光顕微鏡によってｍＥＧＦＰシグナルを観察した。５つの系統から胚を回収した。Ｎｉｋｏｎの立体顕微鏡下でのＧＦＰ発現を検査した。胚を、１細胞期から胚盤胞期まで培養し、毎日観察した。発現を、８細胞期（９６時間）から胚盤胞期（１２０時間）まで観察した。これは、ＯＧ２のＧＦＰ発現と類似していた。各系統における発現レベルは、それらのｍＥＧＦＰコピー数と比例していた。Ｂ系統は、最大のＧＦＰ発現レベルを有し、Ｄ系統は、最も低い発現レベルを有していた。ｍＥＧＦＰ発現は、各細胞において斑点状のパターンで観察された。このパターンは、ＯＧ２ＧＦＰと明らかに異なっていた。これは、ＯＧ２系統の場合のようにｍＥＧＦＰが単にＯｃｔ４プロモーターから生産されたのではなく、ＩＳ構築物がＯＣＴ４に融合したｍＥＧＦＰを有することに起因した。
【0146】
実施例２ 生殖補助医療のための定量的なバイオアッセイの開発
ＧＦＰタグの付いたＰＯＵ５Ｆ１を発現するＰｏｕ５ｆ１－ＧＦＰトランスジェニックマウス系統（transgenic mouse lines）を生成して、ＰＯＵ５Ｆ１の核局在化を利用し、着床前の期間中に有害な培養条件およびエピジェネティックな欠陥を検出した。またＰｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ発現を使用して、生細胞における細胞計数のために割球の核も可視化した。Ｐｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ胚を、最適な、または最適未満の油を上に積層して９６時間培養して、ＰＯＵ５Ｆ１－ＧＦＰ発現を、マウス胚発生の異なる段階で（２ＰＮから拡張期／孵化中の胚盤胞（expanded/hatching blastocyst）まで）観察した。（実験、ｎ＞３）。
ＧＦＰタグの付いたＰＯＵ５Ｆ１を発現するＰｏｕ５ｆ１－ＧＦＰトランスジェニックマウス系統（transgenic mouse lines）を生成して、ＰＯＵ５Ｆ１の核局在化を利用し、着床前の期間中に有害な培養条件およびエピジェネティックな欠陥を検出した。またＰｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ発現を使用して、生細胞における細胞計数のために割球の核も可視化した。Ｐｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ胚を、最適な、または最適未満の油を上に積層して９６時間培養して、ＰＯＵ５Ｆ１－ＧＦＰ発現を、マウス胚発生の異なる段階で（２ＰＮから拡張期／孵化中の胚盤胞（expanded/hatching blastocyst）まで）観察した。（実験、ｎ＞３）。
【0147】
Ｐｏｕ５ｆ１－ＧＦＰの１細胞胚（新鮮な、または凍結した）を、コンティニュアスシングルカルチャーメディウムコンプリート（Continuous Single Culture Medium-Complete；ＣＳＣＭ－Ｃ、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、９６時間まで中断されない試験条件で、対照または最適未満の油（５、７．５、または１０％の不純物を含む油）を上に積層して胚盤胞まで培養し、毎日観察した。標準的なマウス胚アッセイ（ＭＥＡ）で典型的に使用されるＢ６の１細胞胚も平行して培養した。これらの胚を４８時間（８細胞以上の％）および９６時間（胚盤胞の％）で評価した。
【0148】
Ｐｏｕ５ｆ１－ＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスは生存可能であり、繁殖可能であり、生殖系列受継の成功および時間的および空間的に調節された遺伝子発現が確認された。接合体のＰｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ遺伝子発現は４細胞期周辺で始まり、７２時間培養した後にピークに達した。マウス胚におけるＰＯＵ５Ｆ１－ＧＦＰの核局在化は、４細胞期あたりでＧＦＰ発現が検出されたらすぐに、生細胞において割球の核を可視化し細胞を数えることを可能にした。最適未満の油を上に積層して培養したＰｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ胚は、発生の著しい遅延を示した（４８時間および９６時間において、対照油グループと比較して）。最適未満の油を上に積層して培養した一部の胚では、ＰＯＵ５Ｆ１－ＧＦＰのモザイクパターン化された発現が観察された。Ｐｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ胚培養は、統計的有意性を有する５、７．５、および１０％の最適未満の条件を検出し、一方で標準的なＭＥＡ（≧８０％の合格基準）は、２８．３％の割合で５％の最適未満の条件を合格させた。図１Ａ～１Ｂおよび図２Ａ～２Ｃを参照されたい。新鮮な、および凍結したＰｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ胚との間で性能における差はなかった。有害な培養条件で培養されたＰｏｕ５ｆ１－ＧＦＰ胚は、有害なエピジェネティックな作用を引き起こす胚の格付けの主観性の低減をもたらした。図３および図４を参照されたい。
【0149】
別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、この技術が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0150】
本明細書に例証として記載される本発明の技術は、本明細書で具体的に開示されていないいずれの要素または複数の要素、１つまたは複数の限定の非存在下でも、好適に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する」などは、拡大的に、制限なく理解されるものとする。加えて、本明細書において採用される用語および表現は、限定のためではなく説明のための用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示される特徴や記載される特徴のあらゆる均等物またはそれらの一部を除外する意図はないが、特許請求された本発明の技術の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。
【0151】
したがって、本明細書において提供される材料、方法、および例は、好ましい態様の代表であり、例示的であり、本発明の技術の範囲への限定としての意図はないことが理解されるものとする。
【0152】
本発明の技術は、本明細書において広義的かつ一般的に説明された。包括的な開示の範囲内に含まれるより狭義の種および下位に属する群のそれぞれもまた、本発明の技術の一部を構成する。これには、本発明の技術の包括的な説明が含まれるが、但し書きまたは否定的限定により、切り出された物質が本明細書で具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、類概念からいずれかの主題が除外される。
【0153】
加えて、本発明の技術の特徴または態様がマーカッシュ群の単位で記載される場合、当業者は、それによって本発明の技術が、マーカッシュ群のいずれか個々のメンバーまたはメンバーの下位群の単位でも記載されることを認識しているであろう。
【0154】
本明細書で述べられた全ての公報、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが個々に参照により組み入れられるのと同程度に明示的に参照によりそれら全体が本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合、定義を含め本明細書を優先させる。
【0155】
他の態様は、以下の特許請求の範囲で明示される。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】