特表 2024-527313 タウ低減遺伝子療法のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-24

(54)【発明の名称】タウ低減遺伝子療法のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20240717BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240717BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240717BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

A61K35/76

A61K48/00

A61P25/28

A61P25/14

A61P25/00

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580435

(86)(22)【出願日】2022-06-27

(85)【翻訳文提出日】2024-02-26

(86)【国際出願番号】 US2022035091

(87)【国際公開番号】W WO2023278305

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/342,240

(32)【優先日】2022-05-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/215,833

(32)【優先日】2021-06-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/267,440

(32)【優先日】2022-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508152917

【氏名又は名称】ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗 由美

(72)【発明者】

【氏名】ベイリー，レイチェル，エム．

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA16

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA16

(57)【要約】

本開示は、タウオパシー、たとえば、アルツハイマー病またはＦＴＤＰ－１７等を処置するための方法および組成物について提示する。本開示の方法および組成物は、ＭＡＰＴを標的とする人工的マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶウイルスベクターを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つの人工的マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡが配列番号１３９～１８６のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。

【請求項2】

前記ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号４１～８８のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項3】

第１の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列をさらに含み、前記第１のＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項１または２に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項4】

前記第１のＩＴＲ配列が配列番号１５で表される配列を含む、請求項３に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項5】

第２のＩＴＲ配列をさらに含み、前記第２のＩＴＲ配列がＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項１から４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項6】

前記第２のＩＴＲ配列が配列番号１６で表される配列を含む、請求項５に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項7】

第１のプロモーター配列をさらに含み、前記第１のプロモーター配列がマウスＵ６プロモーター配列である、請求項１から６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項8】

前記マウスＵ６プロモーター配列が配列番号３１で表される核酸配列を含む、請求項７に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項9】

第２のプロモーター配列をさらに含み、前記第２のプロモーター配列がニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター配列である、請求項１から８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項10】

前記ＣＢｈプロモーター配列が配列番号２９で表される核酸配列を含む、請求項９に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項11】

終止シグナルをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項12】

前記終止シグナルが配列番号４０で表される核酸配列を含む、請求項１１に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項13】

５’から３’の方向に、
ａ．第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列と、
ｂ．マウスＵ６プロモーター配列と、
ｃ．ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードし、前記ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡが配列番号１３９～１８６のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含む、ポリヌクレオチド配列と、
ｄ．終止配列と、
ｅ．ＣＢｈプロモーター配列と、
ｆ．合成ポリＡ配列と、
ｇ．第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列と
を含むｒＡＡＶベクター。

【請求項14】

配列番号１４で表される配列を含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項15】

（ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質と、
（ｂ）請求項１から１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターと
を含むｒＡＡＶウイルスベクター。

【請求項16】

前記ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項１５に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。

【請求項17】

請求項１から１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、または請求項１５もしくは１６に記載のｒＡＡＶウイルスベクター、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤を含む医薬組成物。

【請求項18】

それを必要としている対象においてタウオパシーを処置するための方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、請求項１５もしくは１６に記載のｒＡＡＶウイルスベクター、または請求項１７に記載の医薬組成物について、その治療有効量を対象に投与するステップを含む方法。

【請求項19】

前記タウオパシーが、アルツハイマー病または第１７染色体と関連する前頭側頭型認知症およびパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記対象がＭＡＰＴ遺伝子内に１つまたは複数の突然変異を有する、請求項１８または１９に記載の方法。

【請求項21】

タウオパシーの処置で使用するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、請求項１５もしくは１６に記載のｒＡＡＶウイルスベクター、または請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記タウオパシーがアルツハイマー病またはＦＴＤＰ－１７である、請求項２１に記載の使用のためのｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、または医薬組成物。

【請求項23】

前記タウオパシーがＭＡＰＴ遺伝子内の１つまたは複数の突然変異と関連する、請求項２１または２２に記載のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、または医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年６月２８日出願の米国仮特許出願第６３／２１５，８３３号、２０２２年２月２日出願の同第６３／２６７，４４０号、および２０２２年５月１６日出願の同第６３／３４２，２４０号の優先権および利益を主張し、そのそれぞれの内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照による組み込み
本出願はＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２２年６月６日に作成され、「ＴＡＹＳ－０１３＿００１ＷＯ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名され、大きさ約１４８，９５３バイトである。

【0003】

本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ならびに第１７染色体と関連する前頭側頭型認知症およびパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）を含むタウオパシーを処置するための方法および組成物について提示する。

【0004】

本開示の方法および組成物は、ＭＡＰＴを標的とする人工的マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、およびｒＡＡＶウイルスベクターを含む。

【背景技術】

【0005】

神経変性疾患の一般的病理学的特徴は、ＣＮＳにおける特定タンパク質のミスフォールディングおよびその不溶性タンパク質性の沈着であり、罹患領域においてニューロンの進行的喪失を伴う。タウオパシーは、高度にリン酸化された線維状のタウタンパク質の凝集により広義に定義される神経変性疾患の群である。最も一般的なタウオパシーはアルツハイマー病（ＡＤ）である。ＡＤは、プラークとしてｂ－アミロイドおよび神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）として高度にリン酸化されたタウの両者が凝集することにより特徴づけられるが、ＮＦＴ病理のみが認知機能低下と密接な相関関係を有する。タウ線維は、疾患に依存して、異なる脳領域からタウ病理を経細胞的に安定的に伝播拡散する（Ｂｒａａｋら，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ８２，２３９～２５９頁，ｄｏｉ：１０．１００７／ｂｆ００３０８８０９（１９９１）；Ｂｒａａｋら，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １２１，５８９～５９５頁，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１－０１１－０８２５－ｚ（２０１１）；Ｉｒｗｉｎら，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ Ｒｅ／ａｔ Ｄｉｓｏｒｄ ２２ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ２９－３３頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐａｒｋｒｅｌｄｉｓ．２０１５．０９．０２０Ｓ１３５３－８０２０（１５）００３９５－８［ｐｉｉ］（２０１６））。

【0006】

タウをコードするＭＡＰＴ遺伝子はＡＤと遺伝学的に関連しないが、ＭＡＰＴ内の突然変異がその他のタウオパシー、たとえば第１７染色体と関連する前頭側頭型認知症およびパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）等を引き起こし（Ｈｕｔｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３９３，７０２～７０５頁，ｄｏｉ：１０．１０３８／３１５０８（１９９８）；Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ ９５，７７３７～７７４１頁，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．９５．１３．７７３７（１９９８））、タウホメオスタシスの破綻が神経変性を引き起こすのに十分であることが判明している。

【0007】

過去１０年にわたり、ミスフォールドして分解に至るタンパク質を標的とする分子療法において飛躍的な進歩を遂げた。ほとんどのアプローチは、開発中の２つの主要なＲＮＡｉプラットフォーム：オリゴヌクレオチド療法および遺伝子療法のうちの一方を使用することによる内因性ＲＮＡｉ機構を利用する。前者は、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）を処置するためのハンチンチンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（Ｋｏｒｄａｓｉｅｗｉｃｚら，Ｎｅｕｒｏｎ ７４，１０３１～１０４４頁，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１２．０５．００９（２０１２）；ＮＣＴ０３７６１８４９）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するためのＳＯＤ１（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒａｌ １２，４３５～４４２頁，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７４－４４２２（１３）７００６１～９頁（２０１３）；ＮＣＴ０２６２３６９９）、ＡＬＳを処置するためのＣ９０ｒｆ７２（Ｍｃｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２８，３５５８～３５６７頁，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣｌ９９０８１（２０１８））、ならびにＡＤおよび前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を処置するためのタウ（ＤｅＶｏｓら，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｇ０４８１（２０１７）．；ＮＣＴ０３１８６９８９）を用いながら臨床現場までより早期に導入された。

【0008】

ＡＳＯは、連続輸液または反復した髄腔内注射により脳脊髄液中に送達される必要があり、またその治療効果は脳室系に隣接した脳領域内で最も強力であると考えられている（Ｋｏｒｄａｓｉｅｗｉｃｚら，Ｎｅｕｒｏｎ ７４，１０３１～１０４４頁，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ．２０１２．０５．００９（２０１２））。ＡＳＯ療法は有望であるものの、これらの処置の注意点として、患者の生涯を通じて薬物を反復投与する必要があり、その経費負担が継続することが挙げられる。ヒトでは、現行のＡＳＯ処置法は３～４カ月毎に髄腔内注射を必要とし、瘢痕組織が経時的に蓄積し、そして高齢者集団において感染症に対する追加のリスクを惹起するおそれがある。あるいは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用するＲＮＡｉに基づく遺伝子療法アプローチも、神経変性疾患のために開発されている。ＲＮＡｉに基づく遺伝子療法は、ｓｈＲＮＡまたは人工的ｍｉＲＮＡ前駆体の連続的発現および後続する標的タンパク質の長期持続的降下を引き起こすウイルスベクターの単回投与を使用する。人工的ｍｉＲＮＡは天然のｍｉＲＮＡ構造を模倣するが、また標的ｍＲＮＡ上の相補的配列と塩基対形成することにより、おそらくは任意の目的とする遺伝子の発現を停止させるように工学操作可能である。ｍｉＲＮＡシャトルのベクター媒介式送達を使用する遺伝子療法試験は、前臨床モデルにおいてＨＤの処置にとって有望であることを明らかにし、また近年臨床現場にもたらされた（Ｅｖｅｒｓら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２６，２１６３～２１７７頁，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１８．０６．０２１（２０１８）；ＮＣＴ０４１２０４９３）。

【0009】

遺伝子送達では、非分裂細胞に感染するその能力、高形質導入効率、１回の投与からの長期持続的発現、および比較的低い宿主免疫応答に起因して、ＡＡＶが最も安全かつ最も一般的に使用されるベクターの１つとして登場した。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは野生型ウイルスの末端逆位反復配列（送達される目的とする遺伝子と共にプロモーターから構成される導入遺伝子カセットに隣接する）のみを保持する。

【0010】

ＡＡＶベクターの設計ならびに脳および脊髄内送達における進歩により、ＣＮＳに対して最高の親和性を有するＡＡＶ９血清型を用いて神経学的疾患を処置する場合、ＡＡＶは理想的となった（Ｋａｎｔｏｒ、Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ ８７，１２５～１９７頁，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－ ８００１４９－３．００００３－２（２０１４））。

【0011】

髄腔内投与されるＡＡＶ９ベクターを使用する、小児を対象とした第Ｉ相臨床トライアルを支援するために、巨大軸索ニューロパチーＩＮＤ申請研究が実施され（ＮＣＴ０２３６２４３８）、２０１５年以降進行中である（Ｂａｉｌｅｙら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ９，１６０～１７１頁，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｍ．２０１８．０２．００５（２０１８））。ＧＡＮに付加して、ＡＡＶ９遺伝子療法は、複数の障害について現在進行中の臨床トライアルにおいて使用されており、またＦＤＡは髄性筋萎縮症についてＡＡＶ９ベクター療法の使用を最近承認した。

【0012】

現在のところ、疾患進行を有意に低速化させる、神経変性疾患に対する承認済みの療法は存在せず、また疾患特異的治療薬に対する多大な必要性が存続する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡが配列番号１３９～１８６のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含む、ｒＡＡＶベクターが本明細書に提示される。一部の実施形態では、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４１～８８のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含む。一部の実施形態では、ａｍｉＲＮＡはヒトＭＡＰＴを標的とする。一部の実施形態では、ヒトＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号１３９～１４９のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによりコードされ、ヒトＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号４１～４９のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含む。

【0014】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、第１の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列をさらに含み、第１のＩＴＲ配列はＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、第１のＩＴＲ配列は配列番号１５で表される配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは第２のＩＴＲ配列をさらに含み、第２のＩＴＲ配列はＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、第２のＩＴＲ配列は配列番号１６で表される配列を含む。

【0015】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは第１のプロモーター配列をさらに含み、第１のプロモーター配列はマウスＵ６プロモーター配列である。一部の実施形態では、マウスＵ６プロモーター配列は配列番号３１で表される核酸配列を含む。

【0016】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは第２のプロモーター配列をさらに含み、第２のプロモーター配列はＣＢｈプロモーター配列である。一部の実施形態では、ＣＢｈプロモーター配列は配列番号２９で表される核酸配列を含む。

【0017】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは終止シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、終止シグナルは配列番号４０で表される核酸配列を含む。

【0018】

別の態様では、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列と、マウスＵ６プロモーター配列と、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、終止配列と、ＣＢｈプロモーター配列と、合成ポリＡ配列と、第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列とを含み、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡが配列番号１３９～１８６のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含む、ｒＡＡＶベクターが本明細書に提示される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは配列番号１４で表される配列を含む。

【0019】

別の態様では、本明細書に記載されるＡＡＶカプシドタンパク質およびｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶウイルスベクターが本明細書に提示される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶ９カプシドタンパク質である。

【0020】

別の態様では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクター、または本明細書に記載されるｒＡＡＶウイルスベクター、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤を含む医薬組成物が本明細書に提示される。

【0021】

別の態様では、それを必要としている対象においてタウオパシーを処置するための方法であって、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、または医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法が本明細書に提示される。一部の実施形態では、タウオパシーはアルツハイマー病またはＦＴＤＰ－１７である。一部の実施形態では、対象はＭＡＰＴ遺伝子内に１つまたは複数の突然変異を有する。

【0022】

別の態様では、タウオパシーの処置で使用するための、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、または医薬組成物が本明細書に提示される。一部の実施形態では、タウオパシーはアルツハイマー病またはＦＴＤＰ－１７である。一部の実施形態では、タウオパシーはＭＡＰＴ遺伝子内の１つまたは複数の突然変異と関連する。

【0023】

上記のおよびさらなる特徴は、添付した図面と併せて取り上げた場合に、以下の詳細な説明からより明確に理解される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】Ｕ６プロモーターにより駆動される抗タウｍｉＲＮＡを含む自己相補性ＡＡＶ９ベクターの概略を示す図である。

【図2】デュアルレポーターアッセイにより測定した場合の、ヒトタウを標的とする様々なｍｉＲＮＡを用いた、ヒトＭＡＰＴのノックダウンを示す図である；ｓｃｒ＝スクランブル化タウｍｉＲＮＡ；ｈＴａｕ＝ヒト特異的タウｍｉＲＮＡ。

【図3A】ヒトタウを標的とする様々なｍｉＲＮＡを用いた、ヒトタウｍＲＮＡおよびタンパク質のノックダウンをそれぞれ示す図である。

【図3B】ヒトタウを標的とする様々なｍｉＲＮＡを用いた、ヒトタウｍＲＮＡおよびタンパク質のノックダウンをそれぞれ示す図である。

【図3C】免疫蛍光法により決定した場合の、スクランブル化コントロールｍｉＲＮＡおよびヒトタウに対して特異的なｍｉＲＮＡを用いて処置した後のＨＥＫ２９３細胞内タウ発現をそれぞれ示す図である。

【図3D】免疫蛍光法により決定した場合の、スクランブル化コントロールｍｉＲＮＡおよびヒトタウに対して特異的なｍｉＲＮＡを用いて処置した後のＨＥＫ２９３細胞内タウ発現をそれぞれ示す図である。

【図4A】ヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウス内に送達した後に、媒体コントロール、またはヒトタウを標的とするｍｉＲＮＡを発現し、ＧＦＰレポータータンパク質もコードするＡＡＶ９ベクターを用いたときの、グリアおよびニューロン内ＧＦＰ染色によるベクターの分布および対応するタウタンパク質の減少を示す図である。

【図4B】処置されたマウス脳におけるＭＡＰＴ ｍＲＮＡの定量を示す図である。

【図5】デュアルレポーターアッセイにより測定した場合の、マウスタウを標的とする様々なｍｉＲＮＡを用いたマウスＭａｐｔのノックダウンを示す図である；ｓｃｒ＝スクランブル化タウｍｉＲＮＡ；ｍＴａｕ＝マウス特異的タウｍｉＲＮＡ。

【図6A】マウスタウを標的とする様々なｍｉＲＮＡを用いた、マウスＭａｐｔ ｍＲＮＡのノックダウンを示す図である。

【図6B】マウスタウを標的とする様々なｍｉＲＮＡを用いた、ヒトタウタンパク質ではなくマウスタウタンパク質のノックダウンを示す図である。

【図7A】ヒトタウおよびマウスタウの両方を標的とする様々なｍｉＲＮＡを用いた、マウスＭａｐｔおよびヒトＭＡＰＴのノックダウンをそれぞれ示す図である。

【図7B】ヒトタウおよびマウスタウの両方を標的とする様々なｍｉＲＮＡを用いた、マウスＭａｐｔおよびヒトＭＡＰＴのノックダウンをそれぞれ示す図である。

【図8】媒体コントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスについて、その３月齢における生存率を示す図である。

【図9A】媒体コントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスについて、その体重の変化を示す図である（オスおよびメスのマウスに関するデータを図９Ａおよび図９Ｂにそれぞれ示す）。

【図9B】媒体コントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスについて、その体重の変化を示す図である（オスおよびメスのマウスに関するデータを図９Ａおよび図９Ｂにそれぞれ示す）。

【図10】ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰまたは媒体をＩＣＭ注射した後の、マウス脳においてＧＦＰ抗体を使用する免疫組織化学染色の代表的な画像を示す図である。

【図11】媒体コントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスに由来する脳幹組織において、ｑＰＣＲにより決定したときのＭＡＰＴ発現を示す図である。

【図12A】媒体コントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスに由来する脳幹、小脳、および皮質組織において、ＥＬＩＳＡにより決定したときのタウ発現を示す図である。

【図12B】媒体コントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスに由来する脳幹、小脳、および皮質組織において、ＥＬＩＳＡにより決定したときのタウ発現を示す図である。

【図12C】媒体コントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスに由来する脳幹、小脳、および皮質組織において、ＥＬＩＳＡにより決定したときのタウ発現を示す図である。

【図13A】シーディングアッセイ結果を示す図であり、媒体またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスに由来する脳ホモジネートをトランスフェクトしても、その結果ＦＲＥＴ陽性封入体は生じなかったが、Ｐ３０１Ｓ処置コホート由来の脳ライセートを添加すると細胞内ＦＲＥＴ陽性凝集物が誘発された一方、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置されたＰ３０１Ｓマウスでは、媒体で処置されたＰ３０１Ｓマウスと比較してそれより少量のＦＲＥＴ陽性凝集物が誘発される（一元配置分散分析、Ｐ３０１Ｓ＋媒体と比較したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図13B】シーディングアッセイ結果を示す図であり、媒体またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスに由来する脳ホモジネートをトランスフェクトしても、その結果ＦＲＥＴ陽性封入体は生じなかったが、Ｐ３０１Ｓ処置コホート由来の脳ライセートを添加すると細胞内ＦＲＥＴ陽性凝集物が誘発された一方、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置されたＰ３０１Ｓマウスでは、媒体で処置されたＰ３０１Ｓマウスと比較してそれより少量のＦＲＥＴ陽性凝集物が誘発される（一元配置分散分析、Ｐ３０１Ｓ＋媒体と比較したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図13C】シーディングアッセイ結果を示す図であり、媒体またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置された野生型マウスに由来する脳ホモジネートをトランスフェクトしても、その結果ＦＲＥＴ陽性封入体は生じなかったが、Ｐ３０１Ｓ処置コホート由来の脳ライセートを添加すると細胞内ＦＲＥＴ陽性凝集物が誘発された一方、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置されたＰ３０１Ｓマウスでは、媒体で処置されたＰ３０１Ｓマウスと比較してそれより少量のＦＲＥＴ陽性凝集物が誘発される（一元配置分散分析、Ｐ３０１Ｓ＋媒体と比較したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図14】媒体コントロール、ＡＡＶ９／スクランブル化（Ｓｃｒ）コントロール、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスについて、その６月齢における生存率を示す図である。

【図15A】媒体コントロール、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスについて、その６月齢における体重の変化を示す図である。

【図15B】媒体コントロール、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスについて、その６月齢における体重の変化を示す図である。

【図16A】シーディングアッセイ結果を示す図である。図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＡＡＶ９／Ｓｃｒは、媒体処置と比較して、ＷＴまたはＰ３０１Ｓマウスにおいてシーディング活性を変化させなかったことを示す。図１６Ｃは、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置されたマウスは脳幹において類似したシーディング活性を有したことを示す。図１６Ｄは、６月齢においてＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置すると、脳幹においてタウシーディング活性が有意に低下したことを示す。

【図16B】シーディングアッセイ結果を示す図である。図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＡＡＶ９／Ｓｃｒは、媒体処置と比較して、ＷＴまたはＰ３０１Ｓマウスにおいてシーディング活性を変化させなかったことを示す。図１６Ｃは、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置されたマウスは脳幹において類似したシーディング活性を有したことを示す。図１６Ｄは、６月齢においてＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置すると、脳幹においてタウシーディング活性が有意に低下したことを示す。

【図16C】シーディングアッセイ結果を示す図である。図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＡＡＶ９／Ｓｃｒは、媒体処置と比較して、ＷＴまたはＰ３０１Ｓマウスにおいてシーディング活性を変化させなかったことを示す。図１６Ｃは、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置されたマウスは脳幹において類似したシーディング活性を有したことを示す。図１６Ｄは、６月齢においてＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置すると、脳幹においてタウシーディング活性が有意に低下したことを示す。

【図16D】シーディングアッセイ結果を示す図である。図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＡＡＶ９／Ｓｃｒは、媒体処置と比較して、ＷＴまたはＰ３０１Ｓマウスにおいてシーディング活性を変化させなかったことを示す。図１６Ｃは、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置されたマウスは脳幹において類似したシーディング活性を有したことを示す。図１６Ｄは、６月齢においてＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置すると、脳幹においてタウシーディング活性が有意に低下したことを示す。

【図17】ＡＡＶ９／ＳｃｒコントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスの９月齢における生存率を示す図である。

【図18A】ＡＡＶ９／ＳｃｒコントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスの９月齢における体重変化を示す図である。

【図18B】ＡＡＶ９／ＳｃｒコントロールまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置された野生型マウスおよびヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを過剰発現するマウスの９月齢における体重変化を示す図である。

【図19A】媒体、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、またはＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉを用いて、３月齢において処置された野生型マウスに由来する注射後１カ月の臨床血液化学に変化が認められないことを示す図である。

【図19B】媒体、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、またはＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉを用いて、３月齢において処置された野生型マウスに由来する注射後１カ月の臨床血液化学に変化が認められないことを示す図である。

【図19C】媒体、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、またはＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉを用いて、３月齢において処置された野生型マウスに由来する注射後１カ月の臨床血液化学に変化が認められないことを示す図である。

【図19D】媒体、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、またはＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉを用いて、３月齢において処置された野生型マウスに由来する注射後１カ月の臨床血液化学に変化が認められないことを示す図である。

【図19E】媒体、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、またはＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉを用いて、３月齢において処置された野生型マウスに由来する注射後１カ月の臨床血液化学に変化が認められないことを示す図である。

【図20A】媒体、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、またはＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉを用いて、３月齢において処置された野生型マウスについて、注射後１カ月の行動に変化が認められないことを示す図である。

【図20B】媒体、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、またはＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉを用いて、３月齢において処置された野生型マウスについて、注射後１カ月の行動に変化が認められないことを示す図である。

【図20C】媒体、ＡＡＶ９／Ｓｃｒコントロール、またはＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉを用いて、３月齢において処置された野生型マウスについて、注射後１カ月の行動に変化が認められないことを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本開示は、特に、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、およびｒＡＡＶウイルスベクターについて提示する。本開示は、これらの単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶウイルスベクターを製造する方法、ならびにｓｈＲＮＡ分子を送達してタウオパシーを処置または予防するためのその使用についても提示する。

【0026】

本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、この名称に付随し、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、細胞中で増殖する一本鎖ＤＮＡウイルスであり、その中である種の機能が共感染するヘルパーウイルスによって提供される。ＡＡＶに関する一般的な情報および総説は、たとえばＣａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，１巻，１６９～２２８頁およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７４３～１７６４頁，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。種々の血清型が、遺伝子レベルであっても、構造的および機能的両方に極めて密接に関連していることがよく知られているので、これらの総説に記載された同じ原理が総説の発行日以後に特徴解析されたさらなるＡＡＶの血清型に適用可能であることが、完全に期待される（たとえばＢｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編，１６５～１７４頁、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１～６１頁（１９７４）を参照）。たとえば、全てのＡＡＶ血清型は同種ｒｅｐ遺伝子によって媒介される極めて類似した複製特性を明らかに呈し、全てが、ＡＡＶ２で発現されるもののような３つの関連するカプシドタンパク質を有している。ゲノムの長さに沿った血清型の間の広範な交叉ハイブリダイゼーションおよび「逆転ターミナルリピート配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニール性セグメントの存在を明らかにするヘテロデュプレックス解析によって、関連性の程度がさらに示唆されている。類似した感染性パターンも、各血清型における複製機能が同様の規制制御の下にあることを示唆している。このウイルスの多数の血清型が遺伝子送達に適していることが知られており、全ての既知の血清型が種々の組織型の細胞に感染することができる。連続的に番号付けされた少なくとも１１個のＡＡＶ血清型が当技術で知られている。本明細書で開示した方法において有用な非限定的な例示的血清型には、１１個の血清型、たとえばＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアント血清型、たとえばＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂのいずれかが含まれる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルスタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶｒｈ．１０を指す。

【0027】

例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、全ての血清型（たとえばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、およびＡＡＶｒｈ．１０）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）および１つの血清型のゲノムと別の血清型のカプシドとを含むＡＡＶハイブリッド（たとえばＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ、およびＡＡＶ－ＤＪ８）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＫＰ－１（Ｋｅｒｕｎら．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１９；４（２２）：ｅ１３１６１０に詳細に記載）およびＡＡＶ－ＮＰ５９（Ｐａｕｌｋら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８；２６（１）：２８９～３０３頁に詳細に記載）が含まれる。

【0028】

ＡＡＶの構造および機能
ＡＡＶは複製欠損性のパルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さで、２つの１４５ヌクレオチド逆転ターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには多数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。たとえば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５～５６４頁（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿ｌ８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９のゲノムはＧａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１～６３８８頁（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０のゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７～７６頁（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１のゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５～３８３頁（２００４）で提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は米国特許第９，４３４，９２８号で提供されている。米国特許第９，４３４，９２８号は、カプシドタンパク質および自己相補性ゲノムの配列も提供している。一態様では、ＡＡＶゲノムは自己相補性ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド封入／パッケージング、および宿主細胞染色体の一体化を指示するシス作用性配列は、ＡＡＶ ＩＴＲの中に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置によってｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）差別的スプライシングと一体になった２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、究極的にはウイルスゲノムの複製に関与する多種の酵素特性を有している。

【0029】

ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的なスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位が、この３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与している。より具体的には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質のそれぞれがそれから翻訳される単一のｍＲＮＡが転写された後で、このｍＲＮＡは２つの異なる様式でスプライシングされ得る。長いイントロンまたは短いイントロンが切除され、ｍＲＮＡの２つのプール、即ち２．３ｋｂと２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡプールの形成がもたらされる。長いイントロンが好ましいことが多く、したがって２．３ｋｂの長さのｍＲＮＡは主要なスプライスバリアントと称され得る。この形態はＶＰ１タンパク質の合成がそれから始まる第１のＡＵＧコドンを欠き、ＶＰ１タンパク質合成の全体のレベルの低下をもたらす。主要なスプライスバリアントに残る第１のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかし、同じオープンリーディングフレーム中のそのコドンの上流には、最適のＫｏｚａｋ（翻訳開始）コンテクストによって囲まれたＡＣＧ配列（スレオニンをコードする）が存在する。これはＶＰ２タンパク質の合成の低いレベルに寄与する。ＶＰ２タンパク質は実際上、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＢｅｃｅｒｒａ ＳＰら，（１９８５年１２月）．“Ｄｉｒｅｃｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ： ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ＡＣＧ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．８２（２３）：７９１９～２３頁；Ｃａｓｓｉｎｏｔｔｉ Ｐら，（１９８８年１１月）．“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ： ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｉｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅｄ ｍＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１６７（１）：１７６～８４頁；Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ Ｓら，（１９９４年１月）．“Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６８（１）：１７０～６頁；およびＴｒｅｍｐｅ ＪＰ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ（１９８８年９月）．“Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６２（９）：３３５６～６３頁に記載されているように、ＶＰ１と同じく、ＶＰ３タンパク質にＮ末端残基が付加されたものである。単一のコンセンサスポリＡ部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置している。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝的特徴は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７～１２９頁（１９９２）に概説されている。

【0030】

それぞれのＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含む。ＶＰ１部分は、ＶＰ１タンパク質に特有のＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、ＶＰ２タンパク質のＮ末端部分にも見出される、ＶＰ１タンパク質の中に存在するアミノ酸配列である。ＶＰ３部分とＶＰ３タンパク質は同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、ＶＰ１タンパク質とＶＰ２タンパク質に共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。

【0031】

ＶＰ３タンパク質は、不連続の可変表面領域Ｉ～ＩＸ（ＶＲ－Ｉ～ＩＸ）にさらに分割することができる。可変表面領域（ＶＲ）のそれぞれは、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＤｉＭａｔｔａら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８６（１２）：６９４７～６９５８頁，２０１２年６月に記載されているように、単独でまたは他のＶＲのそれぞれの特定のアミノ酸配列との組合せで、特有の感染表現型（たとえば低下した抗原性、改善された形質導入および／または他のＡＡＶ血清型と比較した組織特異的向性）を特定の血清型に付与することができる特定のアミノ酸配列を含み得る。

【0032】

ＡＡＶは、たとえば遺伝子療法において外来のＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてこれを魅力的なものにする固有の特徴を有している。培養における細胞のＡＡＶ感染は細胞変性を起こさず、ヒトおよびその他の動物の天然の感染は症状がなく無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染してｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的とすることを可能にする。さらに、ＡＡＶは分裂している細胞および分裂していない細胞にゆっくりと形質導入し、実質的にこれらの細胞の生涯にわたって転写活性の核エピソーム（染色体外エレメント）として持続することができる。ＡＡＶのプロウイルスゲノムはクローニングされたＤＮＡとしてプラスミド中に挿入され、それにより組換えゲノムの構築が実行可能になる。さらに、ＡＡＶの複製とゲノムのカプシド封入を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲの中に含まれているので、ゲノムの内部の約４．３ｋｂの一部または全部（複製および構造のカプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）を外来のＤＮＡで置き換えて、ｒＡＡＶベクターを生成することができる。ｒｅｐおよびｃａｐのタンパク質はトランスで提供され得る。ＡＡＶの別の顕著な特徴は、これが極めて安定で元気なウイルスであることである。これはアデノウイルスを不活化するために用いられる条件（５６～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の問題を重要でなくしている。ＡＡＶは凍結乾燥することさえできる。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は重複感染に抵抗しない。

【0033】

多くの研究が筋肉における長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９～６６９頁（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２～１４０８７頁（１９９６）；およびＸｉａｏら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８～８１０８頁（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９～６２３頁（２０００）およびＣｈａｏら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７～２２２頁（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管新生しているので、Ｈｅｒｚｏｇら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４～５８０９頁（１９９７）およびＭｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１～１３９２６頁（１９９７）に記載されているように、組換えＡＡＶ形質導入によって、筋肉内注射の後の全身循環におけるトランスジーン産生物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９～８７７５頁（２００２）は、骨格筋筋線維が抗体の正しいグリコシル化、フォールディング、および分泌のために必要な細胞性因子を有していることを実証し、筋肉が分泌されたタンパク質治療剤を安定的に発現することができることを示した。

【0034】

本発明の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、核酸分子に隣接して１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸分子を含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される。偽型ｒＡＡＶの産生は、たとえばＷＯ２００１０８３６９２に開示されている。その他の型のｒＡＡＶバリアント、たとえばカプシド変異を有するｒＡＡＶも意図されている。たとえばＭａｒｓｉｃら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００～１９０９頁（２０１４）を参照されたい。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術で既知である。

【0035】

単離された核酸分子
本開示は、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子について提示する。

【0036】

ヒトＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡ配列をコードする例証的ポリヌクレオチド配列（「シャトルＤＮＡ」）、ならびに対応するヒトＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡ配列は表１に記載されている。マウスＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡ配列をコードする例証的ポリヌクレオチド配列は配列番号５２～７０で表され、またマウスＭＡＰＴを標的とする対応するａｍｉＲＮＡ配列は配列番号１５０～１６８で表される。マウスおよびヒトＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡ配列をコードする例証的ポリヌクレオチド配列は配列番号７１～８８で表され、またマウスおよびヒトＭＡＰＴを標的とする対応するａｍｉＲＮＡ配列は配列番号１６９～１６８で表される。

【0037】

【表1】

【0038】

一部の実施形態では、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号１３９～１８６のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される。一部の実施形態では、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号１３９～１８６のうちのいずれか１つで表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される。

【0039】

一部の実施形態では、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４１～８８のうちのいずれか１つで表される核酸配列を含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される。一部の実施形態では、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４１～８８のうちのいずれか１つで表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される。配列番号４１～８８はＤＮＡ配列であり、また対応するＲＮＡ配列は配列番号９０～１３７でそれぞれ表される。

【0040】

一般的に、本明細書に提示される、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡ（成熟したアンチセンス配列）、ループ配列、ならびに５’および３’オーバーハングに隣接するパッセンジャー配列を含む。

【0041】

ループ配列およびオーバーハングはｍｉＲＮＡ「骨格」を共に構成する。例示的ループ配列は、ＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧ（ＤＮＡ、配列番号１８８）またはＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧ（ＲＮＡ、配列番号１８９）である。例示的５’オーバーハング配列は、ＧＡＧＴＧＡＧＣＧ（ＤＮＡ、配列番号１９０）またはＧＡＧＵＧＡＧＣＧ（ＲＮＡ、配列番号１９１）である。例示的３’オーバーハング配列は、ＴＧＣＣＴＡＣＴ（ＤＮＡ、配列番号１９２）またはＵＧＣＣＵＡＣＵ（ＲＮＡ、配列番号１９３）である。理論に拘泥するものではないが、パッセンジャー配列およびＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡは密着してヘアピンループ構造を形成すると考えられている。ヘアピンループ構造は、次にダイサー（ヘアピンのループを取り除き、ｍｉＲＮＡ二本鎖をそのまま残すエンドリボヌクレアーゼ）によりさらに処理されるものと考えられている。ｍｉＲＮＡ二本鎖である、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡは、次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、その標的ｍＲＮＡ（たとえば、ＭＡＰＴ ｍＲＮＡ）と相互作用し、したがって翻訳をブロックする。Ｍｙｂｕｒｇｈら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１４）３、ｅ２０７頁を参照されたい。

【0042】

ループおよびオーバーハング配列はｍｉＲＮＡスキャフォールドを形成する。任意の適するスキャフォールドが本明細書に提示されるＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡを送達するのに使用され得ることは、当業者にとって明白である。例示的スキャフォールドとして、ｍｉＲ－３０スキャフォールド（Ｃｈａｎｇら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１３；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ０７５８５３）およびｍｉＲ－３３スキャフォールド（Ｘｉｅら，２０２０ Ｍｏｒ Ｔｈｅｒ．２８（２）：４２２頁）が挙げられる。当業者により認識されるように、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡは、任意の適するｍｉＲスキャフォールド中にクローニングされ得る。

【0043】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるａｍｉＲＮＡに対するＭＡＰＴ転写物は、ヒトＭＡＰＴ転写物である。本明細書に提示されるａｍｉＲＮＡの標的となり得る例証的ヒトＭＡＰＴ転写物として、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１６８３５．５、ＮＭ＿００５９１０．６、ＮＭ＿０１６８３４．５、ＮＭ＿０１６８４１．５、ＮＭ＿００１１２３０６７．４、ＮＭ＿００１１２３０６６．４、ＮＭ＿００１２０３２５１．２、ＮＭ＿００１２０３２５２．２、ＮＭ＿００１３７７２６５．１、ＮＭ＿００１３７７２６６．１、ＮＭ＿００１３７７２６７．１、およびＮＭ＿００１３７７２６８．１（それぞれ配列番号２～１３）で表されるものが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるａｍｉＲＮＡは、１、２、３、４、５、または６個のＭＡＰＴ転写物を標的とする。一部の実施形態では、本明細書に記載されるａｍｉＲＮＡはヒトＭＡＰＴ転写物を標的とする。一部の実施形態では、本明細書に記載されるａｍｉＲＮＡは、１、２、３、４、５、または６個のヒトＭＡＰＴ転写物を標的とする。

【0044】

当業者により認識されるように、「ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡ」という句は、細胞内で産生されたら、内因性ＲＮＡｉ経路（たとえば、ダイサー経路、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路）に対して、ＭＡＰＴ ｍＲＮＡの分解および／または下方制御を開始するように指令を発するＲＮＡ分子を指す。用語「ＡＡＶ－ａｍｉＲＮＡを標的とするＭＡＰＴ」とは、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを指す。

【0045】

一部の態様では、単離された核酸分子は、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含み得る。したがって、一部の実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも約２個、または少なくとも約３個、または少なくとも約４個、または少なくとも約５個、または少なくとも約６個、または少なくとも約７個、または少なくとも約８個、または少なくとも約９個、または少なくとも約１０個、または少なくとも約１１個、または少なくとも約１２個、または少なくとも約１３個、または少なくとも約１４個、または少なくとも約１５個、または少なくとも約１６個、または少なくとも約１７個、または少なくとも約１８個、または少なくとも約１９個、または少なくとも約２０個のポリヌクレオチド配列を含み、それぞれＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードする。

【0046】

単離された核酸分子がＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含む複数の態様では、任意の数のポリヌクレオチド配列が同一配列であり得、また任意数は異なる配列であり得る。単離された核酸分子が３つのポリヌクレオチド配列（すなわち、第１のポリヌクレオチド配列、第２のポリヌクレオチド配列、および第３のポリヌクレオチド配列）を含み、それぞれＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードする非限定的な例では、３つのポリヌクレオチド配列はいずれも同一配列を有し得る。代替的に、３つのポリヌクレオチド配列全ては異なる配列を有し得る。なおも代替的に、３つのポリヌクレオチド配列の２つが同一配列を有し得、そして第３のポリヌクレオチド配列は異なる配列を有し得る。

【0047】

ｒＡＡＶベクター
一部の態様では、本明細書に記載される、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。

【0048】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、元のままのレプリコンを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸であって、それによりベクターが、細胞内に入れられた場合に、たとえばトランスフェクション、感染、または形質転換のプロセスによって複製される、核酸を指す。いったん細胞内に入れば、ベクターは染色体外（エピソーマル）エレメントとして複製され、または宿主細胞の染色体内に統合され得ることが当技術で理解されている。ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、改変されたバキュロウイルス、パポバウイルス、またはその他に改変された天然産生のウイルスから誘導される核酸が含まれ得る。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターには、裸のＤＮＡ、単独もしくはカチオン性ポリマーと組み合わせたカチオン性脂質とのＤＮＡの複合体、アニオン性およびカチオン性のリポソーム、ＤＮＡ－タンパク質複合体、ならびに不均一なポリリジン、定義された長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーと縮合し、ある場合にはリポソームに含まれるＤＮＡを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる粒子、ならびにウイルスおよびポリリジン－ＤＮＡを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる三元複合体の使用が含まれる。

【0049】

一般的な組換え手法に関しては、プロモーターとその中にポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位との両方を含むベクターは、当技術で周知である。そのようなベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）等の供給元から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を最適化するため、クローニングされたトランスジーンの５’および／または３’の翻訳されない部分を除去、付加、または変化させて、余分で潜在的で不適切な代替の翻訳開始コドンまたは転写もしくは翻訳のレベルにおいて発現に干渉しまたはこれを低減させ得る他の配列を排除することが必要であろう。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの５’のすぐ傍に挿入することができる。ＡＡＶベクターの核酸配列はコドン最適化され得る。

【0050】

「ｒＡＡＶベクター」とは、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の導入遺伝子および／または外因性ポリヌクレオチド配列、ならびに１つまたは複数のＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含み、それから実質的に構成されるか、またはそれから構成されるベクターを指す。そのようなｒＡＡＶベクターは、宿主細胞中に存在する場合に、たとえば宿主細胞のトランスフェクションによってｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子産物の機能を提供する感染性ウイルス粒子の中に、複製しパッケージすることができる。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、プロモーター、少なくとも１つのタンパク質もしくはＲＮＡをコードし得る少なくとも１つの核酸、および／または感染性ＡＡＶ粒子の中にパッケージされた側面ＩＴＲの中のエンハンサーおよび／またはターミネーターを含む。カプシド封入された核酸部分は、ｒＡＡＶベクターゲノムと称し得る。ｒＡＡＶベクターを含むプラスミドは、製造目的のためのエレメント、たとえば抗生剤耐性遺伝子、複製起点の配列、その他を含んでもよいが、これらはカプシド封入されず、したがってＡＡＶ粒子の一部を形成しない。

【0051】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ逆転ターミナル（ＩＴＲ）配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのエンハンサー配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのポリＡ配列を含み得る。

【0052】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、ＭＡＰＴを標的とする少なくともａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

【0053】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

【0054】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0055】

一部の態様では、本開示は、少なくとも約２個、または少なくとも約３個、または少なくとも約４個、または少なくとも約５個、または少なくとも約６個、または少なくとも約７個、または少なくとも約８個、または少なくとも約９個、または少なくとも約１０、または少なくとも約１１、または少なくとも約１２個、または少なくとも約１３個、または少なくとも約１４個、または少なくとも約１５個、または少なくとも約１６、または少なくとも約１７、または少なくとも約１８、または少なくとも約１９個、または少なくとも約２０個のポリヌクレオチド配列を含み、それぞれがＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする、ｒＡＡＶベクターについて提示する。

【0056】

一部の態様では、本開示は、約２個、または約３個、または約４個、または約５個、または約６個、または約７個、または約８、または約９個、または約１０個、または約１１個、または約１２個、または約１３個、または約１４個、または約１５個、または約１６個、または約１７個、または約１８個、または約１９個、または約２０個のポリヌクレオチド配列を含み、それぞれがＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする、ｒＡＡＶベクターについて提示する。

【0057】

ｒＡＡＶベクターがＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含む態様では、任意の数のポリヌクレオチド配列が同一配列であり得、また任意数は異なる配列であり得る。ｒＡＡＶベクターが、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする３つのポリヌクレオチド配列（すなわち、第１のポリヌクレオチド配列、第２のポリヌクレオチド配列、および第３のポリヌクレオチド配列）を含む非限定的な例では、３つのポリヌクレオチド配列はいずれも同一の配列を有し得る。代替的に、３つのポリヌクレオチド配列全てが異なる配列を有し得る。なおも代替的に、３つのポリヌクレオチド配列の２つが同一の配列を有し得、そして第３のポリヌクレオチド配列は異なる配列を有し得る。

【0058】

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つのプロモーター配列を含み得て、それによりｒＡＡＶベクターは第１のプロモーター配列および少なくとも第２のプロモーター配列を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、同じ配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、異なる配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、互いに隣接し得る。ｒＡＡＶベクターがＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列およびＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも第２のポリヌクレオチド配列も含む一部の態様では、第１のプロモーターは第１のポリヌクレオチド配列の上流（５’）に位置してよく、少なくとも第２のプロモーターは第１のポリヌクレオチド配列と少なくとも第２のポリヌクレオチド配列との間に位置してよく、それにより少なくとも第２のプロモーターは第１のポリヌクレオチド配列の下流（３’）かつ少なくとも第２のポリヌクレオチド配列の上流（５’）に位置する。

【0059】

先行するｒＡＡＶベクターのいずれも、少なくとも１つのエンハンサーをさらに含み得る。少なくとも１つのエンハンサーは、ｒＡＡＶベクターのいずれの場所に位置してもよい。

【0060】

一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターのすぐ上流（５’）に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、エンハンサー、プロモーター配列、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターのすぐ下流（３’）に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、エンハンサー、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のすぐ下流に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、エンハンサー、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

【0061】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、Ｄエレメントが削除された突然変異体ＡＡＶ２ ＩＴＲ、Ｕ６プロモーター、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、Ｔ６終止シグナル、ＣＢｈプロモーター、ポリアデニル化シグナル、および野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

【0062】

ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶベクターの例証的配列は配列番号１４で表される。配列番号１４においてＩＴＲ配列に下線を付す；プロモーター領域はイタリック体で表し、ｈＴａｕ５ｉをコードする配列を太字イタリック体で表す。

【0063】

【化1】

【0064】

ＡＡＶ ＩＴＲ配列
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、当技術で既知の任意のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列であってよい。

【0065】

即ち、一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0066】

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列または改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。ＡＡＶ２ ＩＴＲは、たとえばＤ領域を削除することにより改変され得る。

【0067】

一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１５～２４のうちのいずれか１つで表される核酸配列のうちのいずれか１つまたはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0068】

一部の態様では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号１５で表される核酸配列またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0069】

一部の態様では、第２のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号１６で表される核酸配列またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0070】

プロモーター配列およびエンハンサー
本明細書で使用される用語「プロモーター」および「プロモーター配列」は、遺伝子またはトランスジーンまたはｓｈＲＮＡ配列等のコーディング配列の転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である調節配列を意味する。プロモーターは、たとえば構造的、誘起的、抑制的、または組織特異的であってよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子等の制御性のタンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含み得る。非限定的な例示的プロモーターには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーとと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ミニマルＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、またはＥＦ１プロモーターが含まれる。プロモーターは、たとえばヒトプロモーター配列またはマウスプロモーター配列であり得る。

【0071】

本明細書で提供されるさらなる非限定的な例示的プロモーターには、それだけに限らないが、ＥＦｌａ、Ｕｂｃ、ヒトβ－アクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、Ｕｂｉ、およびα－１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）が含まれる。ｍＲＮＡ転写の効率を増大または低減させるために、そのようなプロモーターのヌクレオチド配列を改変し得ることは、当技術で既知である。たとえばＧａｏら．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：１３５～１４５頁を参照されたい（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写を無効にし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激するために、７ＳＫ、Ｕ６、およびＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスを改変する）。遍在性または組織特異的な発現のために、合成由来のプロモーターを用いてもよい。さらに、そのいくつかを上で言及したウイルス由来プロモーター、たとえばＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルス、およびＡＡＶのプロモーターは、本明細書に記載した方法において有用であり得る。一部の態様では、転写効率を増大させるために、プロモーターは少なくとも１つのエンハンサーと共に用いられる。エンハンサーの非限定的な例には、間質性レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーが含まれる。

【0072】

一部の態様では、プロモーター配列は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター配列（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター配列、β－アクチンプロモーター配列、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター配列、ヒトＵ６プロモーター配列、マウスＵ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター配列、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター配列、ＭｅＣＰ２プロモーター配列、ＭｅＰ４１８プロモーター配列、ＭｅＰ４２６プロモーター配列、ｍｅＰ２２９プロモーター配列、ミニマルＭｅＣＰ２プロモーター配列、ＶＭＤ２プロモーター配列、ｍＲｈｏプロモーター配列、ＥＦＩプロモーター配列、ＥＦｌａプロモーター配列、Ｕｂｃプロモーター配列、ヒトβ－アクチンプロモーター配列、ＣＡＧプロモーター配列、ＴＲＥプロモーター配列、Ａｃ５プロモーター配列、ポリヘドリンプロモーター配列、ＣａＭＫＩＩａプロモーター配列、Ｇａｌ１プロモーター配列、ＴＥＦ１プロモーター配列、ＧＤＳプロモーター配列、ＡＤＨ１プロモーター配列、Ｕｂｉプロモーター配列、またはα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。

【0073】

エンハンサーは、標的配列の発現を増大させる制御エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むポリヌクレオチドである。たとえば、レトロウイルスの長いターミナルリピートは、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を含んでいる。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であり得る。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子に天然に連結されたエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作（即ち分子生物学的手法）または合成手法の手段によって遺伝子に並置され、それによりその遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示される、エンハンサー／プロモーターである。本明細書で提供される方法、組成物、および構築物における使用のための連結されたエンハンサー／プロモーターの非限定的な例には、ＰＤＥプロモータープラスＩＲＢＰエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサープラスＵ１ａプロモーターが含まれる。エンハンサーは遠方から、また内因性または異種のプロモーターの位置に対するそれらの配向とは関係なく、作動し得ることが当技術で理解されている。即ち、プロモーターから離れて作動するエンハンサーは、したがってベクター中のその位置またはプロモーターの位置に対するその配向とは関係なく、そのプロモーターに「作動可能に連結」されていることがさらに理解される。

【0074】

本開示全体を通じて使用されるように、用語「作動可能に連結された」とは、プロモーターの制御下に置かれ、それと空間的に連結しているポリヌクレオチド配列（すなわち、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列）の発現を指す。プロモーターは、その制御下に置かれたポリヌクレオチド配列の５’（上流）または３’（下流）に配置可能である。プロモーターは、その制御下にあるポリヌクレオチド配列の５’（上流）に位置し得る。プロモーターとその制御下にあるポリヌクレオチド配列との間の距離は、プロモーターとそのプロモーターがそれから誘導された遺伝子内でプロモーターが制御するポリヌクレオチド配列との間の距離とほぼ同じであってよい。プロモーターとポリヌクレオチド配列との間の距離の変動は、プロモーター機能の損失なしに適応させることができる。

【0075】

一部の態様では、プロモーター配列は、ＪｅＴプロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。ＪｅＴプロモーター配列は、配列番号２５またはその相補体と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0076】

一部の態様では、プロモーター配列は、ＭｅＰ２２９プロモーター配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。ｍｅＰ２２９プロモーター配列は、配列番号２６またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0077】

一部の態様では、プロモーター配列は、ＭｅＰ４２６プロモーター配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。ｍｅＰ４２６プロモーター配列は、配列番号２７またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0078】

一部の態様では、プロモーター配列は、ＣＢｈプロモーター配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。ＣＢｈプロモーター配列は、配列番号２８またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。ＣＢｈプロモーター配列は、配列番号２９またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0079】

一部の態様では、プロモーター配列は、Ｕ６プロモーター配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。Ｕ６プロモーター配列は、配列番号３０またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。マウスＵ６プロモーター配列は、配列番号３１またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0080】

一部の態様では、本開示の細菌プラスミドは原核生物プロモーターを含み得る。原核生物プロモーターは、配列番号３２またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0081】

一部の実施形態では、本明細書に提示されるｒＡＡＶベクターは、２つプロモーター、たとえばマウスＵ６プロモーターとＣＢｈプロモーターとを含む。

【0082】

ポリＡ配列
一部の態様では、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、当技術で既知の任意のポリＡ配列を含み得る。ポリＡ配列の非限定的な例には、それだけに限らないが、ＭｅＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列が含まれる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は合成ポリＡ配列である。

【0083】

即ち、ポリＡ配列は、ＭｅＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

【0084】

一部の態様では、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ｐＡ配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。一部の態様では、ＳＶ４０ｐＡ配列は、配列番号３３で表される配列またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0085】

一部の態様では、ポリＡ配列は、ＢＧＨｐＡ配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。一部の態様では、ＢＧＨｐＡ配列は、配列番号３４で表される配列またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。一部の態様では、ＢＧＨｐＡ配列は、配列番号３５で表される配列またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含み、それから実質的に構成され、またはそれから構成され得る。

【0086】

一部の態様では、合成ポリＡ配列は、配列番号３６で表される配列またはその相補体と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。

【0087】

終止配列
一部の実施形態では、本明細書に提示されるｒＡＡＶベクターは終止配列を含み得る。終止配列は、転写ユニットの末端を定義し、また新規に合成されたＲＮＡを転写機構から放出させるプロセスを開始する。終止配列はいくつかのチミン残基を含み得る。たとえば、Ｔ６終止は配列ＴＴＴＴＴＴ（配列番号４０）を含む。Ｔ７ターミネーターは配列ＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４１）を含む。

【0088】

細菌プラスミド
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒＡＡＶベクターの増殖を可能にするために細菌プラスミドの中に含ませてよい。即ち、本開示は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれかを含む細菌プラスミドを提供する。

【0089】

細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターは、複製開始点配列をさらに含み得る。一部の態様では、複製の起点の配列は、当技術で既知の任意の複製の起点の配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。複製の起点の配列は、細菌の複製の起点の配列であってよく、それにより前記細菌の複製の起点の配列を含むｒＡＡＶベクターが当技術で標準的な方法を用いることによって細菌内で産生され、増殖し、維持されることが可能になる。一部の実施形態では、複製開始点は配列番号３６で表される配列を含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される。

【0090】

細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶウイルスベクターは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含み得る。一部の態様では、抗生剤耐性遺伝子は、当技術で既知の任意の抗生剤耐性遺伝子を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。当技術で既知の抗生剤耐性遺伝子の例には、それだけに限らないが、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ポリミキシンＢ耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれる。一部の実施形態では、カナマイシン耐性遺伝子は、配列番号３８で表される配列を含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される。一部の実施形態では、カナマイシン耐性遺伝子はプロモーターと作動的に連結している。一部の実施形態では、カナマイシン耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子プロモーター（ＡｍｐＲプロモーター）と作動的に連結している。一部の実施形態では、ＡｍｐＲプロモーターは、配列番号３７で表される配列を含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される。

【0091】

細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターは、原核生物プロモーターをさらに含み得る。

【0092】

ＡＡＶウイルスベクター
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞中に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えで産生されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。アルファウイルスベクター、たとえばＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス系ベクターおよびＳｉｎｄｂｉｓウイルス系ベクターも、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。たとえばＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４～４３９頁およびＹｉｎｇら，（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３～８２７頁を参照されたい。

【0093】

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ｒＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド封入されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。即ち、ｒＡＡＶウイルスベクターの産生には必然的にｒＡＡＶベクターの産生が含まれ、したがってベクターはｒＡＡＶベクターの中に含まれる。

【0094】

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスカプシド」または「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性シェルまたはコートを指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシド封入し、保護し、輸送し、また宿主細胞中に放出するように機能する。カプシドは一般に、タンパク質（「カプシドタンパク質」）のオリゴマー性構造サブユニットからなっている。本明細書で使用される場合、用語「カプシド封入」は、ウイルスカプシド中に封入されることを意味する。ＡＡＶのウイルスカプシドは３つのウイルスカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物からなっている。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物は、そのそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるＳｏｎｎｔａｇ Ｆら，（２０１０年６月）“Ａ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１０７（２２）：１０２２０～５頁、およびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（２０００年１２月）．“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ： ｔｈｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎｓ”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２７８（２）：３０１～８頁に記載されているように、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）または１：１：２０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比でＴ＝１の２０面体対称に配置された６０個のモノマーを含む。

【0095】

本開示は、ａ）本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれか、またはその相補体；およびｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。

【0096】

ＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術で既知の任意のＡＡＶカプシドタンパク質であってよい。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質であってよい。

【0097】

組成物および医薬組成物
本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物は医薬組成物であってよい。したがって、本開示は、本明細書に記載される単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか、ならびに任意選択的に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物について提示する。

【0098】

医薬組成物は、本明細書に記載したように、薬理学の技術において既知のまたは開発された任意の方法によって製剤化することができ、その方法には、それだけに限らないが、活性成分（たとえばウイルス粒子または組換えベクター）を賦形剤および／または添加物および／またはその他の補助的成分と接触させ、産生物を用量単位に分割または包装することが含まれる。本開示のウイルス粒子は、望ましい特徴、たとえば増大した安定性、増大した細胞トランスフェクション、持続したまたは遅延した放出、生体分布もしくは向性、コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの調節されたまたは増進された翻訳、およびコードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの放出プロファイルを有して製剤化され得る。

【0099】

したがって、医薬組成物は、食塩水、脂質類、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞（たとえば対象への移植のための）、ナノ粒子模倣体、またはそれらの組合せをさらに含んでよい。一部の態様では、医薬組成物はナノ粒子として製剤化される。一部の態様では、ナノ粒子は自己アセンブルした核酸ナノ粒子である。

【0100】

本開示による医薬組成物は、単一の単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、バルクで調製され、包装され、および／または販売され得る。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投薬量に等しくおよび／またはそのような投薬量の都合の良い割合、たとえばそのような投薬量の半分または３分の１等である。本発明の製剤は、１つまたは複数の賦形剤および／または添加物を、それぞれ共にウイルスベクターの安定性を増大し、ウイルスベクターによる細胞のトランスフェクションまたは形質導入を増大し、ウイルスベクターによってコードされたタンパク質の発現を増大し、および／またはウイルスベクターによってコードされたタンパク質の放出プロファイルを変更させる量で含み得る。一部の態様では、医薬組成物は、賦形剤および／または添加物を含む。賦形剤および／または添加物の非限定的な例には、溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散または懸濁の助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、またはそれらの組合せが含まれる。

【0101】

一部の態様では、医薬組成物は凍結保護剤を含む。用語「凍結保護剤」は、凍結中の物質に対する損傷を低減または排除することができる薬剤を指す。凍結保護剤の非限定的な例には、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース、および／またはマンニトールが含まれる。

【0102】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な薬学的担体のいずれか、たとえばリン酸塩緩衝食塩溶液、水、およびエマルジョン、たとえば水中油もしくは油中水エマルジョン、ならびに種々の種類の湿潤剤を包含する。組成物は安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。

【0103】

一部の態様では、本開示の医薬組成物は、リン酸塩緩衝食塩水、Ｄ－ソルビトール、塩化ナトリウム、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８またはそれらの任意の組合せを含んでよい。

【0104】

一部の態様では、医薬組成物は塩化ナトリウムを含んでよく、塩化ナトリウムは約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、または約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、または約３００ｍＭ～約４００ｍＭの濃度で存在する。一部の態様では、塩化ナトリウムが約３５０ｍＭの濃度で存在してよい。

【0105】

一部の態様では、医薬組成物はＤ－ソルビトールを含んでよく、Ｄ－ソルビトールは約１％～約１０％、または約２．５％～約７．５％の濃度で存在する。一部の態様では、Ｄ－ソルビトールは約５％の濃度で存在してよい。

【0106】

一部の態様では、医薬組成物はプルロニック（登録商標）Ｆ－６８を含み得るが、その場合プルロニック（登録商標）Ｆ－６８は、約０．００００１％～約０．０１％、または約０．０００５％～約０．００５％の濃度で存在する。一部の態様では、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８は約０．００１％の濃度で存在することができる。

【0107】

次に、本開示は、リン酸緩衝化生理食塩溶液中に本開示のｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物について提示するが、その場合医薬組成物は、３５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、５％の濃度でＤ－ソルビトール、および０．００１％の濃度でプルロニック（登録商標）Ｆ－６８をさらに含む。

【0108】

次に、本開示は、本開示のｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物について提示するが、その場合医薬組成物は、３５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、５％の濃度でＤ－ソルビトール、および０．００１％の濃度でプルロニック（登録商標）Ｆ－６８をさらに含む。

【0109】

次に、本開示は、リン酸緩衝化生理食塩溶液中に本開示のｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物について提示するが、その場合医薬組成物は、３５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、５％の濃度でＤ－ソルビトールをさらに含む。

【0110】

次に、本開示は、本開示のｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物について提示するが、その場合医薬組成物は、３５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、５％の濃度でＤ－ソルビトールをさらに含む。

【0111】

本開示の組成物を使用する方法
本開示は、開示した組成物または医薬組成物を用いる、たとえば細胞、組織、器官、動物、または対象に治療有効量の組成物または医薬組成物を投与する、または接触させる、当技術で既知のまたは本明細書に記載した細胞、組織、器官、動物、または対象における疾患または障害の処置のための開示した組成物または医薬組成物の使用を提供する。一態様では、対象は哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」は、本明細書では相互交換可能に用いられる。

【0112】

本開示は、障害を防止または処置する方法であって、治療有効量の、本明細書に開示される単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物のいずれか１つを対象に投与するステップを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる方法を提供する。

【0113】

１つの態様では、対象におけるタウオパシーを処置する方法であって、本明細書に記載される単離された核酸、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、または組成物の有効量を対象に投与するステップを含む方法が本明細書に提示される。

【0114】

一部の実施形態では、対象はＭＡＰＴ遺伝子内の突然変異に関連する障害に罹患している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に基づき処置される対象は、ＭＡＰＴ遺伝子内に１つまたは複数の突然変異を有する。タウ機能に対して効果を有するＭＡＰＴ内の突然変異は当技術分野において公知であり、たとえばＳｔｒａｎｇら，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９年７月；９９（７）：９１２～９２８頁を参照されたい。一部の実施形態では、突然変異は、Ｒ５Ｈ、Ｒ５Ｌ、Ｇ５５Ｒ、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｌ２６６Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２７９Ｋ、Δ２８０Ｋ、Ｓ２８５Ｒ、Ｋ２９８Ｅ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｐ３０１Ｔ、Ｇ３０３Ｖ、Ｓ３０５Ｉ、Ｓ３０５Ｎ、Ｋ３１７Ｍ、Ｋ３１７Ｎ、Ｓ３２０Ｆ、Ｐ３３２Ｓ、Ｇ３３５Ｖ、Ｑ３３６Ｈ、Ｑ３３６Ｒ、Ｖ３３７Ｍ、Ｓ３５２Ｌ、Ｓ３５６Ｔ、Ｐ３６４Ｓ、Ｋ３６９Ｉ、Ｅ３７２Ｇ、Ｇ３８９Ｒ（Ｇ→Ａ）、Ｇ３８９Ｒ（Ｇ→Ｃ）、およびＮ４１０Ｈからなる群から選択される。

【0115】

一部の実施形態では、疾患はＡＤである。一部の実施形態では、疾患はＦＮＴＤ－１７である。

【0116】

したがって、本開示は、対象におけるタウオパシーを予防または処置する方法であって、本明細書に開示の単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物のうちのいずれか１つについて、その治療有効量を対象に投与するステップを含み、それから実質的に構成されるかまたはそれから構成される方法について提示する。本開示は、タウオパシーの処置または予防を目的とする医薬を製造するための、本明細書に開示の単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物のうちのいずれか１つの使用について提示する。本開示は、タウオパシーを処置または予防する際に使用するための、本明細書に開示の単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物のうちのいずれか１つについて提示する。一部の実施形態では、タウオパシーはＡＤである。一部の実施形態では、疾患はＦＮＴＤ－１７である。

【0117】

本明細書で開示した処置および防止の方法は、治療または防止のための患者を特定および選択するために適切な診断手法と組み合わせてよい。

【0118】

本開示は、宿主細胞を本明細書で開示したｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つと接触させることを含む、宿主細胞中の１つまたは複数のタンパク質のレベルを低減させる方法を提供し、ｒＡＡＶウイルスベクターは、本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのいずれか１つを含む。一部の態様では、宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏである。一部の態様では、宿主細胞は対象、たとえば、タウオパシーに罹患している対象由来である。

【0119】

一部の態様では、本明細書内の単離された核酸、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターを投与すると、その結果宿主細胞におけるタウタンパク質発現が減少する。タウのレベルは、宿主細胞において、約１×１０^－７ｎｇ、約３ｘ１０^－７ｎｇ、約５ｘ１０^－７ｎｇ、約７ｘ１０^－７ｎｇ、約９ｘ１０^－７ｎｇ、約１ｘ１０^－６ｎｇ、約２ｘ１０^－６ｎｇ、約３ｘ１０^－６ｎｇ、約４ｘ１０^－６ｎｇ、約６ｘ１０^－６ｎｇ、約７ｘ１０^－６ｎｇ、約８ｘ１０^－６ｎｇ、約９ｘ１０^－６ｎｇ、約１０ｘ１０^－６ｎｇ、約１２ｘ１０^－６ｎｇ、約１４ｘ１０^－６ｎｇ、約１６ｘ１０^－６ｎｇ、約１８ｘ１０^－６ｎｇ、約２０ｘ１０^－６ｎｇ、約２５ｘ１０^－６ｎｇ、約３０ｘ１０^－６ｎｇ、約３５ｘ１０^－６ｎｇ、約４０ｘ１０^－６ｎｇ、約４５ｘ１０^－６ｎｇ、約５０ｘ１０^－６ｎｇ、約５５ｘ１０^－６ｎｇ、約６０ｘ１０^－６ｎｇ、約６５ｘ１０^－６ｎｇ、約７０ｘ１０^－６ｎｇ、約７５ｘ１０^－６ｎｇ、約８０ｘ１０^－６ｎｇ、約８５ｘ１０^－６ｎｇ、約９０ｘ１０^－６ｎｇ、約９５ｘ１０^－６ｎｇ、約１０ｘ１０^－５ｎｇ、約２０ｘ１０^－５ｎｇ、約３０ｘ１０^－５ｎｇ、約４０ｘ１０^－５ｎｇ、約５０ｘ１０^－５ｎｇ、約６０ｘ１０^－５ｎｇ、約７０ｘ１０^－５ｎｇ、約８０×１０^－５ｎｇ、または約９０×１０^－５ｎｇのレベルまで低下し得る。

【0120】

一部の実施形態では、タウタンパク質のレベルは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下し得る。

【0121】

一部の実施形態では、タウタンパク質のレベルは、少なくとも約１／１．２５、少なくとも約１／１．５、少なくとも約１／１．２５、少なくとも約１／２、少なくとも約１／２．２５、少なくとも約１／２．５、少なくとも約１／２．７５、少なくとも約１／３、少なくとも約１／４、少なくとも約１／５、少なくとも約１／６、少なくとも約１／７、少なくとも約１／８、少なくとも約１／９、または少なくとも約１／１０に低下し得る。

【0122】

本開示は、宿主細胞内のＲＮＡ分子のレベルを減少させる方法であって、宿主細胞を本明細書に開示のｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つと接触させるステップを含み、ｒＡＡＶウイルスベクターが本明細書に開示のｒＡＡＶベクターのいずれか１つを含む、方法について提示する。一部の態様では、ＲＮＡ分子はｍＲＮＡ分子またはノンコーディングＲＮＡ分子である。一部の態様では、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏである。一部の態様では、宿主細胞は、対象、たとえばタウオパシーに罹患している対象に由来する。一部の実施形態では、宿主細胞は、タウオパシーに罹患している対象の脳幹、小脳、または皮質に由来する細胞である。

【0123】

一部の態様では、本明細書内の単離された核酸、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターを投与すると、その結果宿主細胞においてＭＡＰＴ ｍＲＮＡが減少する。ｍＲＮＡ分子のレベルは、宿主細胞において、約１×１０^－７ｎｇ、約３×１０^－７ｎｇ、約５ｘ１０^－７ｎｇ、約７ｘ１０^－７ｎｇ、約９ｘ１０^－７ｎｇ、約１ｘ１０^－６ｎｇ、約２ｘ１０^－６ｎｇ、約３ｘ１０^－６ｎｇ、約４ｘ１０^－６ｎｇ、約６ｘ１０^－６ｎｇ、約７ｘ１０^－６ｎｇ、約８ｘ１０^－６ｎｇ、約９ｘ１０^－６ｎｇ、約１０ｘ１０^－６ｎｇ、約１２ｘ１０^－６ｎｇ、約１４ｘ１０^－６ｎｇ、約１６ｘ１０^－６ｎｇ、約１８ｘ１０^－６ｎｇ、約２０ｘ１０^－６ｎｇ、約２５ｘ１０^－６ｎｇ、約３０ｘ１０^－６ｎｇ、約３５ｘ１０^－６ｎｇ、約４０ｘ１０^－６ｎｇ、約４５ｘ１０^－６ｎｇ、約５０ｘ１０^－６ｎｇ、約５５ｘ１０^－６ｎｇ、約６０ｘ１０^－６ｎｇ、約６５ｘ１０^－６ｎｇ、約７０ｘ１０^－６ｎｇ、約７５ｘ１０^－６ｎｇ、約８０ｘ１０^－６ｎｇ、約８５ｘ１０^－６ｎｇ、約９０ｘ１０^－６ｎｇ、約９５ｘ１０^－６ｎｇ、約１０ｘ１０^－５ｎｇ、約２０ｘ１０^－５ｎｇ、約３０ｘ１０^－５ｎｇ、約４０ｘ１０^－５ｎｇ、約５０ｘ１０^－５ｎｇ、約６０ｘ１０^－５ｎｇ、約７０ｘ１０^－５ｎｇ、約８０×１０^－５ｎｇ、または約９０×１０^－５ｎｇのレベルまで低下し得る。

【0124】

一部の実施形態では、ＭＡＰＴ ｍＲＮＡのレベルは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％減少する。

【0125】

一部の実施形態では、ＭＡＰＴ ｍＲＮＡのレベルは、少なくとも約１／１．２５、少なくとも約１／１．５、少なくとも約１／１．２５、少なくとも約１／２、少なくとも約１／２．２５、少なくとも約１／２．５、少なくとも約１／２．７５、少なくとも約１／３、少なくとも約１／４、少なくとも約１／５、少なくとも約１／６、少なくとも約１／７、少なくとも約１／８、少なくとも約１／９、または少なくとも約１／１０に低下する。

【0126】

本開示は、目的とするポリヌクレオチド配列（たとえば、ＭＡＰＴを標的とする少なくとも１つのａｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列）を対象内の細胞に導入する方法であって、細胞を、本明細書に開示のｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つについて、その有効量と接触させるステップを含み、ｒＡＡＶウイルスベクターが目的とするポリヌクレオチド配列を含む本明細書に開示のｒＡＡＶベクターのいずれか１つを含有する、方法について提示する。

【0127】

本開示の方法の一部の態様では、対象には、本開示のｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶウイルスベクターを投与することに加えて、予防的免疫抑制処置レジメンを施行することもできる。一部の態様では、免疫抑制処置レジメンには、少なくとも１つの免疫抑制治療剤を投与することが含まれる。免疫抑制治療剤の非限定的な例には、それだけに限らないが、シロリムス（ラパマイシン）、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、ＩＶメチルプレドニソロン、プレドニソン、またはそれらの任意の組合せが含まれる。免疫抑制治療剤は、ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与の日に先立って、ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与と同じ日に、またはｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与の後の任意の日に、投与してよい。

【0128】

診断または処置の「対象」は、細胞または哺乳動物等の動物、またはヒトである。対象は特定の種に限定されず、限定なしに類人猿、ネズミ、ラット、イヌ、またはウサギ種を含む、診断または処置の対象となる非ヒト動物、および感染または動物のモデルの対象となるもの、ならびにその他の家畜、スポーツ動物、またはペットを含む。一部の態様では、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」は本明細書では交換可能に使用される。

【0129】

本明細書で使用される場合、対象における疾患「を処置すること」またはその「処置」とは、（１）疾患の症状を呈しやすいかもしくはいまだ呈さない対象において、症状もしくは疾患が生ずるのを遅延させること；（２）疾患を阻害すること、もしくはその発症を阻止すること；または（３）疾患もしくは疾患の症状を良化させるか、もしくはその後退を引き起こすことを指す。遅延させること、阻害すること、および良化させることは、本明細書に記載される組成物、単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターが投与されない別の対象（たとえば、同一のタウオパシー（たとえば、ＡＤまたはＦＴＤＰ－１７）に罹患している対象）と比較され得る。阻害することまたは良化させることは、別の対象（たとえば、本明細書に記載される組成物、単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターが投与されないタウオパシー（たとえば、ＡＤまたはＦＴＤＰ－１７）に罹患している対象）、または本明細書に記載される組成物、単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターの初回投与前の処置される対象と比較され得る。

【0130】

当技術で理解されているように、「処置」は、臨床的結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のため、有益なまたは望ましい結果には、検出可能であってもなくても、１つまたは複数の、それだけに限らないが、１つまたは複数の症状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の程度の逓減、状態（疾患を含む）の状況の安定化（即ち、悪化しないこと）、状態（疾患を含む）の遅延または遅らせること、状態（疾患を含む）の進行、改善、または軽減、状況および寛解（部分的であっても全面的であっても）が含まれ得る。

【0131】

一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターの投与によって良化することとなる症状は、タウ、特に高度にリン酸化された線維状タウの脳内蓄積である。タウタンパク質は、たとえば免疫組織化学を含む、当技術分野において公知、または本明細書に記載される任意の適する方法を使用して検出され得る。

【0132】

一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、単離された核酸分子、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターの投与によって良化することとなる症状は認知症である。

【0133】

本明細書で使用される場合、用語「有効量」とは、所望の効果を達成するのに十分な量を意味することを意図している。治療または予防の用途に関しては、有効量は、問題の状態の種類および重症度、ならびに個別の対象の特徴、たとえば一般的健康状態、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する忍容性に依存することになる。遺伝子療法の文脈において、有効量は、対象において欠損している遺伝子について、その機能の正常化または改善を引き起こすのに十分な量であり得る。一部の実施形態では、本明細書に提示される単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、または組成物の有効量は、対象において、たとえば対象の脳幹、皮質、および／または小脳において、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡの発現を引き起こすのに十分な量である。一部の実施形態では、本明細書に提示される単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、または組成物の有効量は、対象においてＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡの発現を引き起こすのに十分な、たとえばタウの発現が上方制御されるような量である。一部の実施形態では、タウの発現は、脳幹、皮質、および／または小脳において上方制御される。当業者であれば、これらのおよびその他の因子に応じて適切な量を決定することができよう。

【0134】

一部の態様では、有効量は、問題の用途の大きさおよび性質に依存することになる。これは標的の対象および使用する方法の性質および感受性に依存することにもなる。当業者であれば、これらのおよびその他の考慮に基づいて有効量を決定することができよう。有効量は、実施形態に応じた組成物の１つまたは複数の投与を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。

【0135】

本明細書で使用される場合、用語「投与する」または「投与」は、ヒトまたは動物等の対象への物質の送達を意味することを意図している。投与は、処置の経過を通して１つの用量で、連続的に、または間欠的に、達成することができる。最も有効な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には既知であり、治療に用いる組成物、治療の目的、ならびに処置される対象の年齢、健康状態、または性別によって変動することになる。単一または多回の投与は、処置する臨床医またはペットおよびその他の動物の場合には処置する獣医によって選択される用量レベルおよびパターンで行なってよい。

【0136】

最も有効な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には既知であり、治療に用いる組成物、治療の目的、ならびに処置される対象によって変動することになる。単一または多回の投与は、処置する臨床医によって選択される用量レベルおよびパターンで行なってよい。投薬量は投与の経路に影響され得ることが注意される。好適な投薬処方および薬剤を投与する方法は当技術で既知である。そのような好適な投薬量の非限定的な例は、投与あたり１０^９ベクターゲノムの低い量から１０^１７ベクターゲノム（または「ウイルス粒子」）の高い量までであってよい。

【0137】

一部の態様では、組成物、医薬組成物中のウイルス粒子の量、または患者に投与されるウイルス粒子の量は、ウイルスゲノムを含むと予測されるウイルス粒子のパーセンテージに基づいて計算することができる。

【0138】

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、静脈内、髄腔内、脳内、大槽内（ＩＣＭ）、脳室内、鼻内、気管内、耳内、眼内または眼周囲、経口、直腸内、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内で対象に導入してよい；そのような導入は、動脈内、心臓内、脳室下、硬膜外、大脳内、側脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、腹腔内、子宮内、神経内、またはそれらの任意の組合せでもあってもよい。一部の態様では、ウイルス粒子は所望の標的組織に、たとえば非限定的な例として、肺、眼、またはＣＮＳに送達される。一部の態様では、ウイルス粒子の送達は全身的である。脳槽内の投与経路には、脳室の脳脊髄液への薬物の直接投与が含まれる。これは、大槽への直接注射または永久的に位置したチューブによって実施し得る。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは髄腔内に投与される。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは大槽内投与される。

【0139】

本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、または医薬組成物の投与は、処置の経過を通して１つの用量で、連続的に、または間欠的に、達成することができる。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、または医薬組成物は、注射、注入、または移植によって非経口的に投与される。

【0140】

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、脳および頸椎に増進された向性を示す。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。

【0141】

製造方法
本開示のｒＡＡＶウイルスベクターを産生するために種々のアプローチを用い得る。一部の態様では、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を用いることによって、パッケージングが達成される。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、ウイルスベクターの産生を容易にするエレメントおよび配列を含んでいる。別の態様では、ヘルパープラスミドはパッケージング細胞株のゲノムの中に安定に組み込まれ、それによりパッケージング細胞株はヘルパープラスミドによるさらなるトランスフェクションを必要としない。

【0142】

一部の態様では、細胞はパッケージング細胞株またはヘルパー細胞株である。一部の態様では、ヘルパー細胞株は真核細胞、たとえばＨＥＫ２９３細胞または２９３Ｔ細胞である。一部の態様では、ヘルパー細胞は酵母細胞または昆虫細胞である。

【0143】

一部の態様では、細胞はテトラサイクリンアクチベータータンパク質をコードする核酸、およびテトラサイクリンアクチベータータンパク質の発現を制御するプロモーターを含む。一部の態様では、テトラサイクリンアクチベータータンパク質の発現を制御するプロモーターは、構造的プロモーターである。一部の態様では、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはＣＭＶプロモーターである。

【0144】

ヘルパープラスミドはたとえば、複製能のあるＡＡＶを産生せず、複製能のないＡＡＶをパッケージングするためおよび複製能のないＡＡＶをパッケージングすることができるビリオンタンパク質を高いタイターで産生するために必要なトランスオールビリオンタンパク質をコードする複製能のないウイルスゲノムから誘導された少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含み得る。

【0145】

ＡＡＶをパッケージングするためのヘルパープラスミドは当技術で既知であり、たとえば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０２３５１７４Ａ１号を参照されたい。そこで述べられているように、ＡＡＶヘルパープラスミドはヘルパーウイルスとしてＤＮＡ配列、非限定的な例としてそれぞれの元のプロモーターまたは異種プロモーターによって制御されるＡｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含み得る。ＡＡＶヘルパープラスミドは、所望の標的細胞のトランスフェクションの単純な検出を可能にするために、蛍光タンパク質等のマーカータンパク質の発現のための発現カセットをさらに含んでよい。

【0146】

本開示は、パッケージング細胞株を本明細書で開示したＡＡＶヘルパープラスミドのいずれか１つおよび本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのいずれか１つでトランスフェクトすることを含む、ｒＡＡＶウイルスベクターを産生する方法を提供する。一部の態様では、ＡＡＶヘルパープラスミドとｒＡＡＶベクターはパッケージング細胞株に共トランスフェクトされる。一部の態様では、細胞株は哺乳動物細胞株、たとえばヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞株である。本開示は、本明細書で開示したｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つを含む細胞を提供する。

【0147】

本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関連する用語「ヘルパー」は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれか１つの複製およびパッケージングのために必要なさらなる成分を提供するために用いられるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる成分は、ビリオンのアセンブリー、カプシド封入、ゲノムの複製、および／またはパッケージングのために必要な任意の遺伝子を含み得る。たとえば、ヘルパーウイルスまたはプラスミドは、ウイルスゲノムの複製のための必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物と共に用いるために好適なヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例には、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）が含まれる。一部の態様では、ｐＨＥＬＰプラスミドはｐＨＥＬＰＫプラスミドであってよく、この場合はアンピシリン発現カセットがカナマイシン発現カセットに交換される。

【0148】

本明細書で使用される場合、パッケージング細胞（またはヘルパー細胞）は、ウイルスベクターを産生するために用いられる細胞である。組換えＡＡＶウイルスベクター（ｒＡＡＶウイルスベクター）の産生には、トランスで提供されるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、ならびにＡＡＶの複製を助けるアデノウイルス由来の遺伝子配列が必要である。一部の態様では、パッケージング／ヘルパー細胞がプラスミドを含み、細胞のゲノムの中に安定に組み込まれる。他の態様では、パッケージング細胞は一過的にトランスフェクトされ得る。典型的には、パッケージング細胞は真核細胞、たとえば哺乳動物細胞または昆虫細胞である。

【0149】

キット
本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物は、治療、診断、または研究の用途におけるその使用を容易にするために、医薬用または診断用または研究用のキットにアセンブルしてよい。一部の態様では、本開示のキットは、本明細書に記載したように、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、医薬組成物、宿主細胞、単離された組織のいずれか１つを含む。

【0150】

一部の態様では、キットは使用説明書をさらに含む。具体的には、そのようなキットは、本明細書に記載した１つまたは複数の薬剤を、これらの薬剤の意図された用途および正しい使用を記載した説明書と共に含んでよい。一部の態様では、キットは、キットの１つもしくは複数の成分を混合し、および／または試料を単離し混合して対象に適用するための説明書を含んでよい。一部の態様では、キット中の薬剤は医薬製剤中にあり、特定の用途および薬剤の投与の方法に適した投薬量である。研究目的用のキットは、種々の実験を行なうために適切な濃度または量で成分を含み得る。

【0151】

キットは、本明細書に記載した方法の使用を容易にするように設計され、多くの形態を取ることができる。キットの成分のそれぞれは、適用できる場合には、液体形態（たとえば溶液中）または固体形態（たとえば乾燥粉末）で提供され得る。ある特定の例では、組成物のいくつかは、たとえば、キットと共に提供されてもよく提供されなくてもよい好適な溶媒または他の種（たとえば、水または細胞培養培地）によって再構成または他の方法で処理（たとえば活性形に）することができる。一部の態様では、組成物は保存溶液（たとえば凍結保存溶液）中で提供され得る。保存溶液の非限定的な例には、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒド、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）が含まれる。一部の態様では、保存溶液はある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含む。

【0152】

一部の態様では、キットは、本明細書に記載した成分のいずれか１つまたは複数を、１つまたは複数の容器中に含む。即ち、一部の態様では、キットは、本明細書に記載した薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は液体、ゲル、または固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は無菌的に調製され、シリンジに包装され、冷蔵で出荷され得る。あるいは、保存のために薬剤をバイアルまたはその他の容器中に収容してもよい。第２の容器が無菌的に調製された他の薬剤を有してもよい。あるいは、キットは、事前に混合され、シリンジ、バイアル、チューブ、またはその他の容器中で出荷された活性薬剤を含んでよい。キットは、対象に薬剤を投与するために必要な部品、たとえばシリンジ、局所適用デバイス、またはＩＶニードルチューブおよびバッグの１つもしくは複数または全てを有してよい。

【0153】

さらなる定義
文脈によって他が指示されない限り、本明細書に記載した本発明の種々の特徴は任意の組合せで用いることができることが特に意図されている。さらに、本開示は、一部の態様で、本明細書で説明した任意の特徴または特徴の組合せを除外または削除してよいことも意図している。説明のため、複合体が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと明細書で述べている場合には、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを、単独でまたは任意の組合せで削除または放棄してよいことが特に意図されている。

【0154】

他に明示的に示さない限り、全ての特定した態様、実施形態、特徴、および用語は、引用した態様、実施形態、特徴、または用語と、その生物学的等価物の両方を含むことが意図されている。

【0155】

本技術の実施には、他に指示がない限り、当技術の技能の範囲内にある有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の手法が採用されることになる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）），ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＲＩ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８７））を参照されたい。

【0156】

本明細書で使用される場合、用語「含む」は、組成物および方法が引用した要素を含むが、他を排除しないことを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、移行句「実質的に～からなる」（および文法的変形）は、引用した材料またはステップ、および引用した実施形態の基礎的かつ新規な特徴に実質的に影響しない材料またはステップを包含すると解釈すべきである。即ち、本明細書で使用される用語「実質的に～からなる」は、「含む」と等価であると解釈するべきではない。「からなる」は、他の成分および本明細書で開示した組成物を投与するための実質的な方法ステップの微量を超える要素を排除することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。本明細書におけるそれぞれの例において、用語「含む」、「実質的に～からなる」、および「からなる」のいずれも、それらの元の意味を保持したままで他の２つの句によって置き換えることができる。

【0157】

全ての数値指定、たとえば範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて１．０または０．１の増分で、あるいは±１５％、１０％、５％、２％の変動で、（＋）または（－）に変動する近似である。常に明示的に述べてはいないが、全ての数値指定には、用語「約」が先行していることを理解されたい。常に明示的に述べてはいないが、本明細書に記載した試薬は単に例示的なものであり、その等価物が当技術で既知であることも理解されたい。量または濃度その他の測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される用語「約」は、特定した量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または０．１％でさえもの変動を包含することを意味している。

【0158】

用語「許容される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示した任意の成分、範囲、用量形態、その他の選択を記載するために使用される場合には、前記の成分、範囲、用量形態、その他が開示した目的に適していることを意図している。

【0159】

また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙した項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組合せ、ならびに選択肢（「または」）で説明される場合には組合せの欠如を指し、包含する。

【0160】

具体的に引用しない限り、用語「宿主細胞」は、たとえば真菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主細胞を含む。真核生物宿主細胞の非限定的な例には、類人猿、ウシ、ブタ、ネズミ、ラット、鳥類、爬虫類、およびヒト、たとえばＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞が含まれる。

【0161】

本明細書で使用される用語「単離された」は、実質的に他の材料を含まない分子または生物製剤または細胞材料を指す。

【0162】

本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は相互交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである任意の長さのヌクレオチドのポリマーの形態を指す。即ち、この用語には、それだけに限らないが、一本鎖、二本鎖、もしくは多数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基またはその他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導されたヌクレオチド塩基を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなるポリマーが含まれる。

【0163】

「遺伝子」は、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」あるいは「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写され翻訳された際に生成するアミノ酸配列（たとえばペプチドまたはポリペプチド）を指す。

【0164】

本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される２ステップのプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合には、発現は真核細胞内におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0165】

「転写の制御下」は当技術でよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与するか、または転写を促進するエレメントに作動可能に連結されていることに依存していることを示す。「作動可能に連結されている」は、ポリヌクレオチドが細胞中において機能することを可能にする様式で配置されていることを意図している。一態様では、プロモーターは下流配列に作動可能に連結されていてよい。

【0166】

用語「をコードする」とは、ポリヌクレオチド配列および／または核酸配列に適用されるとき、その天然の状態において、ポリヌクレオチド配列および／または核酸配列が生物学的に活性であるｓｈＲＮＡ分子の配列に対応する場合、ＲＮＡ分子（たとえば、ｓｈＲＮＡ分子）「をコードする」と言えるポリヌクレオチド配列および／または核酸配列を指す。アンチセンス鎖はそのようなポリヌクレオチド配列および／または核酸配列の相補体であり、コードする配列はそれから推測することができる。

【0167】

用語「等価」または「生物学的等価」は、特定の分子、生物学的材料、または細胞材料に言及する場合には、相互交換可能に使用され、最小の相同性を有しながらそれでも所望の構造または機能性を維持している特定の分子、生物学的材料、または細胞材料を意図している。等価のポリペプチドの非限定的な例には、参照ポリペプチド（たとえば野生型ポリペプチド）と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチド、または参照ポリヌクレオチド（たとえば野生型ポリヌクレオチド）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドが含まれる。

【0168】

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間、または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。同一性パーセントは、比較の目的でアラインさせたそれぞれの配列において位置を比較することによって決定することができる。比較した配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合には、それらの分子はその位置において同一である。配列の間の同一性の程度は、それらの配列によって共有される一致した位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同性」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、２５％未満の同一性を共有している。アラインメントおよび配列同一性パーセントは、前記核酸またはアミノ酸の配列をＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ－ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能）にインポートし、これを用いることによって、本明細書で提供した核酸またはアミノ酸の配列について決定することができる。たとえば、本明細書で見出したタンパク質配列アラインメントを実施するために用いたＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、Ｇｏｎｎｅｔ（タンパク質について）重みマトリックスを用いて生成した。一部の態様では、本明細書で見出した核酸配列を用いて核酸配列アラインメントを実施するために用いたＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡについて）重みマトリックスを用いて生成される。

【0169】

本明細書で開示したポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて細胞または組織に送達することができる。本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子移送」、「形質導入」等は、導入のために用いられる方法に関わらず、外因性ポリヌクレオチド（時には「トランスジーン」と称される）の宿主細胞への導入を指す用語である。そのような方法には、種々の公知の手法、たとえばベクター媒介遺伝子移送（たとえばウイルス感染／トランスフェクション、またはその他の種々のタンパク質系もしくは脂質系の遺伝子送達複合体による）、ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする手法（たとえばエレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために用いられる他の種々の手法）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、安定的または一過的に宿主細胞中に維持され得る。安定的な維持には、典型的には導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製の起点を含むか、または宿主細胞のレプリコン、たとえば染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）、または核もしくはミトコンドリアの染色体に統合されることが必要である。当技術において既知で本明細書に記載しているように、いくつかのベクターが遺伝子の哺乳動物細胞への移送を媒介することができることが知られている。

【0170】

「プラスミド」は、典型的には染色体ＤＮＡとは離れていて独立にこれを複製することができるＤＮＡ分子である。多くの例で、これは環状で二本鎖である。プラスミドは微生物の集団の中で水平的遺伝子移送のための機構を提供し、典型的には所与の環境状況の下で選択的な利点を提供する。プラスミドは競争的な環境的地位において天然産生の抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を運搬し、あるいは産生されたタンパク質が同様の状況の下で毒素として作用し得る。プラスミドベクターは染色体外環状ＤＮＡ分子として存在することが多い一方、プラスミドベクターはランダムにまたは標的とされた様式で宿主染色体中に安定的に統合されるようにも設計され、そのような統合は環状プラスミドまたは宿主細胞への導入の前に線状化されたプラスミドを用いて達成できることが当技術で知られている。

【0171】

遺伝子操作で用いられる「プラスミド」は「プラスミドベクター」と呼ばれる。そのような使用のために多くのプラスミドが市販されている。複製されるべき遺伝子は、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子を含むプラスミドのコピー、およびいくつかの一般に用いられる制限部位を含み、この位置におけるＤＮＡ断片の挿入を容易にする短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳまたはポリリンカー）の中に挿入される。プラスミドの別の主要な用途は、大量のタンパク質を作成することである。この場合には、目的の遺伝子を有するプラスミドを含む細菌または真核細胞が研究者によって増殖され、これらは、挿入された遺伝子から大量のタンパク質が産生されるように誘起することができる。

【0172】

遺伝子移送がアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のＤＮＡウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその部分、およびトランスジーン／外因性ポリヌクレオチド配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるポリヌクレオチドを指す。

【0173】

用語「組織」は、生きているもしくは死亡した生命体の組織または生きているもしくは死亡した生命体から誘導されもしくはこれを模倣するように設計された任意の組織を指すために本明細書において使用される。組織は健康であっても、疾患を有していても、および／または遺伝的変異を有していてもよい。生物学的組織は、任意の単一の組織（たとえば相互に連結されていてもよい細胞の集合）または生命体の身体の器官もしくは部分もしくは領域を構成する組織の群を含み得る。組織は、均一な細胞材料を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよく、またはたとえば肺組織、骨格組織、および／または筋肉組織を含み得る胸部を含む身体の領域において見出されるようなコンポジット構造であってもよい。例示的な組織には、それだけに限らないが、肝、肺、甲状腺、皮膚、膵、血管、膀胱、腎、脳、胆道系、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓、および腸から誘導された組織が含まれ、それらの任意の組合せが含まれ得る。

【0174】

本明細書で引用された全ての参考資料は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0175】

本セクションに記載されている実施例は例証目的に限定して提供され、またいかなる場合においても、本発明に制限を設けるようには意図されない。

【0176】

実施例１：ヒトまたはマウスＭＡＰＴを標的とするｍｉＲＮＡのスクリーニング
タウオパシーに対する新規治療アプローチとして、人工的ｍｉＲＮＡシャトルのＡＡＶ送達を、ＭＡＰＴ遺伝子によりコードされるタウｍＲＮＡを標的とするのに使用した。ｍｉＲＮＡのアンチセンスガイドストランドは、配列の２２ｎｔストレッチにわたりタウｍＲＮＡと完全な相補性を備え、これにより転写物に対してＲＮＡｉ分解経路に向かうように指令を発する。図１は、ｍｉＲＮＡを使用するタウ標的化の概略を示す。エビデンスは、ｍｉＲＮＡシャトルはｓｈＲＮＡよりも予想可能に処理され、効果的かつ安全であること（Ｂｏｕｄｒｅａｕら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７，１６９～１７５頁，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００８．２３１（２００９）；Ｇｒｉｍｍら，Ｎａｔｕｒｅ ４４１，５３７～５４１頁，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０４７９１（２００６））、およびＤＮＡに基づく送達システム、たとえばウイルスベクター等からｉｎ ｖｉｖｏで発現され得ることを裏付ける。

【0177】

ｍｉｒ－３０に基づく人工的ｍｉＲＮＡシャトルのパネルを、全てのタウ脳アイソフォームに共通する配列に対して特異的であるように設計した。タウまたはマウス特異的ｍｉＲＮＡシャトルに対する参照配列を、ＡｐｐｌｅＳｃｒｉｐｔプログラム（ユーザーによりインプットされた標的遺伝子に基づき、ｍｉＲＮＡシャトル配列を予測するための公表された制約条件を使用する）を使用して生成した。分解させるために、成熟したガイドストランドを、ヒトタウ（ｈＴａｕｉ）、マウスタウ（ｍＴａｕｉ）のみを特異的に標的とするか、またはヒトおよびマウスタウ（ｈｍＴａｕｉ）ｍＲＮＡの両方を標的とするように設計した。プログラムにより生成されたリストから、有望な候補を、種特異性および潜在的オフターゲット遺伝子のスクリーニングに基づき選択した。Ｂｏｕｄｒｅａｕら（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ（Ｓ．Ｑ．Ｈａｒｐｅｒ編）Ｃｈ．２，１７３（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１１））からの公表されたプロトコールを使用しながら、ｍｉＲＮＡシャトル配列を合成し、そしてＵ６Ｔ６プラスミド中にクローニングした。

【0178】

標的会合についてスクリーニングするために、種特異的ライブラリーそれぞれに由来する１０～２０候補をＰｓｉＣｈｅｃｋ２プラスミド中にクローニングし、そしてデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＤＬＲＡ）を標準実践法に従って実施した。表２に示すように、テストしたコンストラクトをコードするシャトルＤＮＡ配列は配列番号４１～８９で表され、対応するＲＮＡ配列は配列番号９０～１３８で表され、そしてＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡ配列は配列番号１３９～１８７で表される。

【0179】

【表2】

【0180】

ヒトタウを標的とするｍｉＲＮＡの一次スクリーニングの結果を図２に示し、そしてマウスタウを標的とするｍｉＲＮＡの一次スクリーニングの結果を図５に示す。ヒトおよびマウスタウの両方を標的とするｍｉＲＮＡの一次スクリーニングの結果を図７Ａおよび図７Ｂに示す。

【0181】

この一次スクリーニングから、トップ３の候補を次に二次スクリーニング（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ｍｉＲＮＡシャトルプラスミドをヒトまたはマウスｃＤＮＡを発現するプラスミドと共に同時トランスフェクトした）においてテストした。ヒトタウを標的とするｍｉＲＮＡの二次スクリーニングの結果を図３Ａ～図３Ｄに示し、そしてマウスタウを標的とするｍｉＲＮＡの二次スクリーニングの結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す。

【0182】

二次スクリーニングからのトップ候補を、次にウイルス送達用としてＡＡＶベクター中にクローニングした。第１世代タウｍｉＲＮＡシャトルベクターは、同一カセット内のＧＦＰレポーター導入遺伝子の上流にｈＴａｕｉまたはｍＴａｕｉシャトルを有する。この設計は、形質導入細胞内でのＧＦＰタンパク質の発現を可能にし、ウイルス生体内分布のアセスメントを可能にする。図４Ａおよび図４Ｂは、Ｐ３０１Ｓタウマウスにおけるベクター発現、およびＡＡＶ９／ｈタウｉ－ＧＦＰの標的会合を示す。第２世代タウｍｉＲＮＡシャトルでは、ＧＦＰコーディング配列は、ヒトでの使用を可能にするために除去された。

【0183】

実施例２：３月齢Ｐ３０１Ｓタウマウスを対象に、大槽内投与されたときのＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉの有効性を評価する試験
この試験を、疾患経過の早期において、タウオパシーのＰＳ１９マウスモデルを対象に、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉの治療ベネフィットを評価するように設計した。ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉの配列は配列番号１４で表される。ＰＳ１９マウスは、ヒトＰ３０１Ｓ突然変異体タウを、内因性マウスタウよりも７倍高いレベルで過剰発現する。このモデルは、８カ月までに、主に海馬においてニューロン喪失および脳萎縮を発症し、そしてその他の脳領域、たとえば新皮質および嗅内皮質等に拡散する。このようなマウスは、新皮質、海馬、脳幹、および脊髄において広範囲に及ぶ神経原線維濃縮体様封入体を発現する（Ｙｏｓｈｉｙａｍａら，Ｎｅｕｒｏｎ．２００７年２月１日；５３（３）：３３７～５１頁）。組織学的方法により明白なタウ病理が明らかとなる前に、このようなマウスの脳はシーディング活性を示す（タウが、１つの細胞から別の細胞に、およびシナプス的に接続した脳ネットワークに沿って伝播する可能性がある）（Ｈｏｌｍｅｓら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３年８月１３日；１１０（３３）：Ｅ３１３８～４７頁）。脳ホモジネート中に存在するタウ凝集物は、タウのさらなる凝集（１．５月齢において最初に検出される）を誘発するおそれがあることが明らかにされている（Ｈｏｌｍｅｓら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４年１０月１４日；１１１（４１）：Ｅ４３７６～８５頁）。挙動的には、このようなマウスは、９～１０カ月内に麻痺まで進行する運動障害（営巣行動における欠陥および摂食困難と関連する）を発症する。混合遺伝背景系統の場合、ＰＳ１９マウスの５０％超が１２月齢までに早期死亡に至る。この試験では、３月齢において、非トランスジェニックおよびＰ３０１Ｓタウトランスジェニック同腹子に対して、マウス１匹当たり６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰまたは媒体を大槽内（ＩＣＭ）投与した。ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰは、Ｄエレメントが削除された突然変異体ＡＡＶ２末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、Ｕ６プロモーター、ｈＴａｕ５ｉマイクロＲＮＡシャトル配列、Ｔ６終止シグナル、ＣＢｈプロモーター、ＧＦＰ ＤＮＡコーディング配列、ポリアデニル化シグナル、および野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む自己相補性ＡＡＶゲノムと共にパッケージングされたＡＡＶ９カプシドを含む。

【0184】

方法
３月齢において、非トランスジェニック（野生型；ＷＴ）およびＰ３０１Ｓタウトランスジェニックオスおよびメス同腹子に対して、媒体（ＷＴ：ｎ＝７、メス４匹、オス３匹；Ｐ３０１Ｓ：ｎ＝６、メス３匹、オス３匹）、または６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰ（ＷＴ：ｎ＝８、メス４匹、オス４匹；Ｐ３０１Ｓ：ｎ＝７、メス３匹、オス４匹）のいずれかを、その１０ｕＬを用いてＩＣＭ注射した。動物を、投与後の４週間、１週間当たり３回、次に１週間当たり１回、観察および秤量した。処置後の臨床兆候、有害事象、および死亡について、マウスを１週間毎にモニタリングした。投与後３カ月において、脳の組織学および生化学分析のために動物を死後解剖した。生化学分析には、ヒトタウ（ＭＡＰＴ）ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析、タウ５抗体を使用する全タウタンパク質の酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析、および病理学的タウ種の存在を評価するためのシーディングアッセイが含まれた。

【0185】

結果
ＩＣＭ送達された６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰの安全性は、生存データ（計画された投与後３カ月時点よりも前に処置群のいずれにおいても早期死亡が認められなかったことを示す）により裏付けられる（図８）。試験期間全体にわたり毒性の外的兆候は指摘されなかった。動物の全体的な健康を評価するために、注射後の体重変化をモニタリングした。図９Ａおよび図９Ｂは、注射後、同一遺伝子型の媒体処置動物と比較して、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰ処置動物における体重変化に有意差は認められなかったことを示す。それに付加して、媒体処置ＷＴマウスとＰ３０１Ｓマウスとの間で、この年齢において、体重増加に有意差は認められなかった（図９Ａおよび図９Ｂ）。総じて、生存率および体重データは、ＩＣＭ送達された６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰの用量は処置後３カ月まで、ＷＴおよびＰ３０１Ｓタウ同腹子において良好な忍容性を示したことを裏付ける。

【0186】

注射後３カ月において、組織を組織学的および生化学的に評価した。図１０において、ＧＦＰ抗体を使用する免疫組織化学染色の代表的な画像は、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰをＩＣＭ注射すると、その結果脳全体にわたりベクターが分布する一方、媒体処置マウスにおいては陽性が認められないことを示す。図１１に示すように、処置マウスに由来する脳幹組織の定量的ＰＣＲ分析により標的会合が確認されたが、ＩＣＭ送達された６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰの用量は、媒体処置Ｐ３０１Ｓタウマウスと比較して、Ｐ３０１Ｓタウマウスにおいて、ヒトタウｍＲＮＡレベルを有意に低下させた（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた一元配置分散分析、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。予想される通り、ＷＴ同腹子において検出されたヒトタウｍＲＮＡは有意ではなかった（図１１、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた一元配置分散分析、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１２は、脳幹における全タウレベルのＥＬＩＳＡ分析を、マウスタウおよびヒトタウの両方を検出するタウ５抗体を使用して実施したこと示す。ＷＴ同腹子が有した全タウはＰ３０１Ｓタウマウスと比較して有意に少なく、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置した場合不変であったことから、ｈＴａｕ５ｉはマウスタウレベルを減少させないことが確認される（図１２；Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）。対照的に、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いた処置では、送達部位に最も近い脳領域内のＰ３０１Ｓタウマウスにおいて全タウレベルは有意に低下し（図１２；Ｐ３０１Ｓ＋媒体と比較したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた一元配置分散分析）、ヒトタウｍＲＮＡが低下した結果としてタウタンパク質が減少することが確認される。

【0187】

タウタンパク質レベルを減少させることの潜在的ベネフィット評価するために、タウ「シーディング」アッセイ法（ナイーブ単量体タウのミスフォールディングを誘発する病理学的タウ凝集物の能力を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法）を使用した。シーディングアッセイにおいて、ＨＥＫ２９３細胞は、シアン蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質（この細胞が凝集物形成を誘発する病理学的タウを用いて処置されたときに、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を創出する）と融合したタウの反復ドメインを安定的に発現する。図１３は、媒体またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置されたＷＴマウスから得られた脳ホモジネートをトランスフェクションすると、その結果ＦＲＥＴ陽性封入体はなくなり、そしてＰ３０１Ｓ処置コホートから得られた脳ライセートを添加することで、細胞内ＦＲＥＴ陽性凝集物が誘発されたシーディングアッセイ結果を示す（一元配置分散分析、Ｐ３０１Ｓ＋媒体と比較したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。重要なこととして、３月齢の時点で６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰを用いて処置すると、６月齢の時点で、脳幹、小脳、および皮質において評価したときにタウ凝集物形成が阻止された（図１３、一元配置分散分析、Ｐ３０１Ｓ＋媒体と比較したＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。皮質内で病理学的タウが減少したが、当該脳領域はこの送達経路からではウイルスベクターによる重要な標的対象とはならないことから（図１０および図１２Ｃ）、結合ニューラルネットワーク内でタウレベルが低下した場合、遠位脳領域にとって利益となり得ることが示唆される。総じて、このデータは、疾患プロセスの早期においてｈＴａｕ５ｉマイクロＲＮＡシャトルをＡＡＶ９送達すれば、ヒトタウｍＲＮＡが選択的に減少し、タウタンパク質レベルが減少し、そして脳内病原性タウ形成が阻害され得ることを裏付ける。

【0188】

実施例３:６月齢Ｐ３０１Ｓタウマウスを対象に大槽内投与したときのＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉの有効性を評価する試験
この試験を、中間疾患進行時に投与したときに、タウオパシーのＰＳ１９マウスモデルを対象としてＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉの治療ベネフィットを評価するように設計した。この試験では、６月齢において、非トランスジェニックおよびＰ３０１Ｓタウトランスジェニック同腹子に対して、媒体、またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉもしくはＡＡＶ９／Ｓｃｒを、マウス１匹当たり６Ｅ＋１１ｖｇでＩＣＭ注射を行った。ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉは、Ｄエレメントが削除された突然変異体ＡＡＶ２ ＩＴＲ、Ｕ６プロモーター、ｈＴａｕ５ｉマイクロＲＮＡシャトル配列、Ｔ６終止シグナル、ＣＢｈプロモーター、ポリアデニル化シグナル、および野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む自己相補性ＡＡＶゲノムと共にパッケージングされたＡＡＶ９カプシドを含む。ＡＡＶ９／Ｓｃｒは、Ｄエレメントが削除された突然変異体ＡＡＶ２ ＩＴＲ、Ｕ６プロモーター、スクランブル化／非特異的マイクロＲＮＡシャトル配列、Ｔ６終止シグナル、ＣＢｈプロモーター、ポリアデニル化シグナル、および野生型ＡＡＶ２ＩＴＲを含む自己相補性ＡＡＶゲノムと共にパッケージングされたＡＡＶ９カプシドを含む。この設計の追加の目的は、前臨床試験のために設計されたＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰベクターと、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉベクター（その設計を変更しないで臨床用途に直接転用可能）との間のブリッジング試験を実施することであった。ＡＡＶ９／Ｓｃｒベクターは、ウイルスベクター送達およびマイクロＲＮＡの発現に対する追加のコントロールである。

【0189】

方法
６月齢において、ＷＴおよびＰ３０１Ｓタウトランスジェニックオスおよびメス同腹子に対して、媒体（ＷＴ：ｎ＝１２、メス６匹、オス６匹；Ｐ３０１Ｓ：ｎ＝１１、メス６匹、オス５匹）、６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／Ｓｃｒ（ＷＴ：ｎ＝１２、メス６匹、オス６匹；Ｐ３０１Ｓ：ｎ＝１０、メス５匹、オス５匹）、６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰ（Ｐ３０１Ｓ：ｎ＝１１、メス６匹、オス５匹）、または６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ（Ｐ３０１Ｓ：ｎ＝１１、メス６匹、オス５匹）を、その１０ｕＬを用いてＩＣＭ注射した。動物を、投与後の４週間、１週間当たり３回、次に１週間当たり１回、観察および秤量した。処置後の臨床兆候、有害事象、および死亡について、マウスを１週間毎にモニタリングした。投与後３カ月において、動物を死後解剖した。

【0190】

結果
図１４に示すように、計画された投与後３カ月時点よりも前に、媒体またはＡＡＶ９／Ｓｃｒベクターを注射されたＷＴマウスにおいて早期死亡は認められなかった。Ｐ３０１Ｓマウスにおいて、４つのＰ３０１Ｓ処置群それぞれにおいて早期死亡１例が認められた（図１４）。総じて、生存データは、６月齢において処置された場合、ＡＡＶ９／Ｓｃｒ、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰ、またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉのＩＣＭ送達は、ＷＴマウスまたはＰ３０１Ｓマウスの生存にとって有害ではないことを裏付ける。試験期間全体にわたり毒性の外的兆候は指摘されなかった。動物の全体的な健康を評価するために、注射後の体重変化をモニタリングした。図１５に示すように、この年齢において、ＷＴマウスとＰ３０１Ｓマウスとの間の体重変化に有意差は認められなかった。それに付加して、ＡＡＶ９／Ｓｃｒ、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ、またはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰで処置されたマウスの体重に有意差は認められず、全てのベクターは６月齢のＰ３０１Ｓタウマウスにおいて、処置後３カ月まで良好な忍容性を示したことが実証される（図１５）。シーディングアッセイを、処置マウスに由来する脳幹ライセートを使用して実施した。ＡＡＶ９／Ｓｃｒを用いて処置しても、媒体処置動物と比較して、ＷＴマウス（図１６Ａ）またはＰ３０１Ｓマウス（図１６Ｂ）においてシーディング活性は変化しなかった。図１６Ｃは、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ－ＧＦＰまたはＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いて処置されたＰ３０１Ｓマウスは匹敵するシーディングレベルを有したこと示しており、２つのベクターは類似した活性を有することを裏付ける。６月齢において６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈタウ５を用いて処置すると、ＡＡＶ９／Ｓｃｒを用いて処置されたＰ３０１Ｓマウスと比較して、脳幹におけるタウ凝集物形成が阻止された（図１６Ｄ）、スチューデントの独立ｔ検定。

【0191】

実施例４：９月齢Ｐ３０１Ｓタウマウスを対象として大槽内投与したときのＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉの有効性を評価する試験
この試験を、タウオパシーのＰＳ１９マウスモデルを対象として、疾患進行期間の後期に投与したときのＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉの治療ベネフィットを評価するように設計した。この試験では、９月齢において、非トランスジェニックおよびＰ３０１Ｓタウトランスジェニック同腹子に対して、６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉまたはＡＡＶ９／ＳｃｒのＩＣＭ投与を行った。

【0192】

方法
９月齢において、ＷＴおよびＰ３０１Ｓタウトランスジェニックオスおよびメス同腹子に対して、６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／Ｓｃｒ（ＷＴ：ｎ＝２０、メス１０匹、オス１０匹；Ｐ３０１Ｓ：ｎ＝２３、メス１５匹、オス８匹）、または６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉ（Ｐ３０１Ｓ：ｎ＝１８、メス１１匹、オス７匹）を、その１０μＬを用いてＩＣＭ注射した。動物を、投与後の４週間、１週間当たり３回、次に１週間当たり１回、観察および秤量した。処置後の臨床兆候、有害事象、および死亡について、マウスを１週間毎にモニタリングした。投与後３カ月において、動物を死後解剖した。

【0193】

結果
図１７に示すように、ＡＡＶ９／Ｓｃｒを注射されたＷＴ同腹子と比較して、全ての動物が試験のエンドポイントまで生存し、ＡＡＶ９／Ｓｃｒを注射されたＰ３０１Ｓマウスの生存率は有意により低く、試験のエンドポイントまで生存したのは３９％に過ぎなかった（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。後期年齢での処置にもかかわらず、６Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉをＩＣＭ注射することで、Ｐ３０１Ｓマウスの生存が試験のエンドポイントにおいて７２％まで有意に延長した（図１７、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ、^＊ｐ＜０．０５）。動物の全体的な健康を評価するために、注射後の体重変化をモニタリングした。図１８に示すように、疾患進行のこの後期段階において、ＡＡＶ９／Ｓｃｒ処置されたＰ３０１Ｓオスおよびメスマウスの体重変化は、ＡＡＶ９／ＳｃｒＷＴマウスと比較して有意に低下した（二元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉを用いた処置は、ＡＡＶ９／Ｓｃｒ処置されたＰ３０１Ｓの性別が一致したマウスと比較して、Ｐ３０１Ｓオスにおいて体重の喪失を有意に低速化させ、そしてＰ３０１Ｓメスにおいて体重減少に影響を及ぼさなかった（図１８；二元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、^＊ｐ＜０．０５）。総じて、この生存中のデータは、疾患経過の後期に提供された場合であっても、ＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉのタウオパシーに対する潜在的処置ベネフィットを裏付ける。

【0194】

実施例５：３月齢ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを対象として大槽内投与したときのＡＡＶ９／ｈＴａｕ５ｉの安全性を評価する試験
この試験を、マウスにおいて内因性タウレベルを低下させることの安全性を評価するように設計した。この試験では、３月齢において、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して、媒体、または４．７Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉもしくはＡＡＶ９／ＳｃｒのＩＣＭ投与を行った。

【0195】

方法
３月齢において、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのオスおよびメス同腹子に対して、媒体（ｎ＝３０、メス１５匹、オス５匹）、４．７Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／Ｓｃｒ（ｎ＝３０、メス１５匹、オス１５匹）、または４．７Ｅ＋１１ｖｇ ＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉ（ｎ＝３０、メス１５匹、オス１５匹）について、その１０μＬをＩＣＭ注射した。処置後、臨床兆候、有害事象、および死亡について、マウスを１週間毎にモニタリングした。動物の中間群（ｎ＝１０、１処置群当たりメス５匹、オス５匹）を、臨床血液化学および組織病理分析用として注射後１カ月において採取した。残りの動物は、投与後１カ月において行動試験を受け、試験エンドポイント（投与後の１２カ月）まで加齢することとなる。

【0196】

結果
今日まで、処置群間で臨床兆候または死亡率に差異は見出されなかった。中間群から得られた組織は組織学的に正常であり、図１９に示す通りである。試験のエンドポイントまで加齢した群は、注射後１カ月において、運動の学習および調整（ロータロッド）、一般的活動（オープンフィールド）、および不安（高架式十字迷路）について行動アセスメントを受けた。図２０は、ＡＡＶ９／ｍＴａｕ２ｉ処置群において内因性タウをノックダウンした場合、媒体およびＡＡＶ９／Ｓｃｒ処置マウスと比較して、これら３つの課題において行動に有意な変化は認められないことを示す。総じて、これらのデータは、内因性タウをノックダウンしても、短期間において十分忍容されたことを裏付ける。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【配列表】

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【国際調査報告】