特表 2024-527334 抗ＯＸ４０モノクローナル抗体及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-24

(54)【発明の名称】抗ＯＸ４０モノクローナル抗体及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240717BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240717BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240717BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240717BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240717BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12P21/08

C12Q1/02

A61K47/68

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P35/02

A61P35/04

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61P43/00 107

A61P37/04

A61P43/00 121

A61K45/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580855

(86)(22)【出願日】2022-06-28

(85)【翻訳文提出日】2024-02-28

(86)【国際出願番号】 IB2022000372

(87)【国際公開番号】W WO2023275616

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/216,189

(32)【優先日】2021-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522256668

【氏名又は名称】ハイファイバイオ（ホンコン）リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】アドリアン，フランシスコ

(72)【発明者】

【氏名】シュワイツァー，リャング

(72)【発明者】

【氏名】チャン，キアン

(72)【発明者】

【氏名】ルー，ユン－ユエ

(72)【発明者】

【氏名】ラウエ，アンドレアス

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QR48

4B063QS40

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA11

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB31

4C076CC07

4C076CC26

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA13

4C084MA17

4C084MA44

4C084MA52

4C084MA56

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZB221

4C084ZB222

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC021

4C084ZC022

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG04

4C085GG08

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

抗ＯＸ４０抗体の組成物を含む新規な抗ＯＸ４０抗体、当該抗ＯＸ４０抗体をコードするポリヌクレオチド、当該抗ＯＸ４０抗体を調製する方法、及び当該抗ＯＸ４０抗体を使用する方法が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＯＸ４０アゴニストとして、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）と、配列番号３４を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるエピトープにおいて特異的に結合し、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ相互作用／結合に実質的に影響を及ぼさない、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

ＯＸ４０Ｌの存在下または非存在下でＮＦ－ｋＢ媒介性ＯＸ４０シグナル伝達を誘導する、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

（内因性）ＯＸ４０Ｌ誘導性ＯＸ４０シグナル伝達（例えば、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達）を阻害しないかまたは増強する、請求項１または２に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

ＯＸ４０Ｌが少なくとも約５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭまたはそれ以上である、請求項３に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

活性化された初代（ヒトまたはカニクイザル）ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞に、約０．０１～５ｎＭ、０．１～０．３ｎＭ、または０．５～１．５ｎＭ（例えば、０．６５または１．３６ｎＭ）のＥＣ５０値で結合する、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

活性な（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激された）末梢ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞上の総表面レベルＯＸ４０発現量を用量依存的に増加させる（例えば、最大のＯＸ４０発現は、約１ｎＭの前記抗体またはそのフラグメントによって刺激される）、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

Ｔ細胞活性化を用量依存的に増強する、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

活性化されたヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２）産生を増加させ、場合により、前記ヒトＰＢＭＣは、１または１０ｎｇ／ｍＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ腸毒素Ａ（ＳＥＡ）によって刺激される、請求項６に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

ＯＸ－４０発現標的細胞の存在下で、例えば、１２：１～１：１のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で約０．３～１．２ｎＭのＥＣ５０で、エフェクター細胞にＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣを用量依存的に誘導する、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項10】

３００μｇ／ｍＬ以下では初代ＰＢＭＣに有意なサイトカイン放出を誘導しない、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項11】

少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇの最大耐用量でマウスに有意な毒性を誘導しない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項12】

ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
ｂ）配列番号９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項13】

ａ）前記ＶＨが、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、かつ、
ｂ）前記ＶＬが、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、
請求項１２に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項14】

重鎖定常領域（ＣＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）をさらに含む、請求項１２または１３に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項15】

１）前記ＣＨが、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、及び／または、
２）前記ＣＬが、配列番号１３のアミノ酸配列、または配列番号１３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、
請求項１４に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項16】

前記ＶＨに対してＮ末端に重鎖シグナル配列を、及び／または前記ＶＬに対してＮ末端に軽鎖シグナル配列をさらに含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項17】

１）前記重鎖シグナル配列が、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、及び／または、
２）前記軽鎖シグナル配列が、配列番号１４のアミノ酸配列、または配列番号１４と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、
請求項１６に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項18】

前記抗体が、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１である、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項19】

前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはｓｄＡｂである、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

【請求項20】

請求項１～１７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、治療部分と、を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であって、場合により、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、タンパク質である前記治療部分に融合される、前記抗体薬物複合体。

【請求項21】

請求項１～１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。

【請求項22】

配列番号２０のポリヌクレオチド配列を有する重鎖可変領域のコード配列、及び／または配列番号２８のポリヌクレオチド配列を有する軽鎖可変領域のコード配列を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

配列番号２１のポリヌクレオチド配列を有する重鎖定常領域のコード配列、及び／または配列番号２９のポリヌクレオチド配列を有する軽鎖定常領域のコード配列をさらに含む、請求項２１または２２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

請求項２１～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、哺乳動物発現用の発現ベクター）。

【請求項25】

請求項２１～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項２４に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項26】

請求項１～１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する方法であって、請求項２５に記載の宿主細胞を前記宿主細胞内での抗体発現に適した条件下で培地中で培養することを含み、場合により、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記培地から収穫、回収、単離または精製することをさらに含む、前記方法。

【請求項27】

請求項１～１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項２０に記載のＡＤＣ、請求項２１～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項２４に記載のベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項28】

第２の治療剤をさらに含むか、または第２の治療剤と共に投与するための、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項29】

がんの治療を必要とする患者のがんを治療する方法であって、治療有効量のＯＸ４０アゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントを前記患者に投与することを含み、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＯＸ４０アゴニストとして、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）と、配列番号３４を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるエピトープにおいて特異的に結合し、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ相互作用／結合に実質的に影響を及ぼさない、前記方法。

【請求項30】

がんの治療を必要とする患者のがんを治療する方法であって、請求項１～１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項２０に記載のＡＤＣ、請求項２１～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクター、または請求項２７または２８に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、前記方法。

【請求項31】

がんを治療するための医薬の製造における、請求項１～１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項２０に記載のＡＤＣ、請求項２１～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２４に記載のベクター、または請求項２７または２８に記載の医薬組成物の使用。

【請求項32】

前記がんが、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（消化管癌、及び消化管間質癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するものなど）及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常血管増殖、脳腫瘍及び脳癌、頭頸部癌、及び関連する転移からなる群から選択される、請求項２９または３０に記載の方法、または請求項３１に記載の使用。

【請求項33】

Ｔｒｅｇ機能の阻害（例えば、Ｔｒｅｇの抑制的機能の阻害）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高いレベルのＯＸ４０を発現する細胞）の殺滅、エフェクターＴ細胞機能の増大及び／またはメモリーＴ細胞機能の増大、腫瘍免疫の低下、Ｔ細胞機能の増強及び／またはＯＸ４０発現細胞の枯渇のうちの１つ以上に使用される、請求項１～１９に記載の抗ＯＸ４０モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項２０に記載の抗体薬物複合体、または請求項２７または２８に記載の医薬組成物のいずれか１つの使用。

【請求項34】

Ｔｒｅｇ機能の阻害（例えば、Ｔｒｅｇの抑制的機能の阻害）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高いレベルのＯＸ４０を発現する細胞）の殺滅、エフェクターＴ細胞機能の増大及び／またはメモリーＴ細胞機能の増大、腫瘍免疫の低下、Ｔ細胞機能の増強及び／またはＯＸ４０発現細胞の枯渇のうちの１つ以上を行うための医薬の製造における、請求項１～１９に記載の抗ＯＸ４０モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項２０に記載の抗体薬物複合体、または請求項２７または２８に記載の医薬組成物のいずれか１つの使用。

【請求項35】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項２０に記載の抗体薬物複合体、または請求項２７または２８に記載の医薬組成物を含み、好ましくは投与装置をさらに含む、キット。

【請求項36】

Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を活性化するか、Ｔｒｅｇ細胞を阻害するか、ＯＸ４０発現標的細胞を殺滅するか、エフェクターもしくはメモリーＴ細胞機能を増強するか、または腫瘍誘導性免疫抑制を低減する方法であって、前記Ｔ細胞、前記Ｔｒｅｇ細胞、前記ＯＸ４０発現標的細胞、前記エフェクターまたはメモリーＴ細胞を、それぞれ、請求項１～１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのようなＯＸ４０アゴニスト抗体と接触させることを含み、前記アゴニスト抗体が、配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるヒトＯＸ４０エピトープに結合する、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２１６，１８９号の出願日に対する優先権及びその利益を主張するものであり、その全図面及び配列表を含むその全容を、あらゆる言語において、参照によって本明細書に援用するものである。

【0002】

本発明は、抗ＯＸ４０抗体の組成物を含む新規な抗ＯＸ４０抗体、当該抗ＯＸ４０抗体をコードするポリヌクレオチド、当該抗ＯＸ４０抗体を調製する方法、及び疾患の治療に当該抗ＯＸ４０抗体を使用する方法に関する。

【0003】

配列表の参照
本出願は、電子的に提出された配列表を含み、その全容を参照によって本明細書に援用するものである。２０２２年６月２８日に作成された配列表のコピーは、１３１２０６－００９２０＿ＳＬのファイル名で、そのサイズは３３，７３９バイトである。

【背景技術】

【0004】

生物製剤の使用によって、固形腫瘍を有する患者における抗腫瘍免疫応答は改善されてきている。例えば、米国及び欧州では、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））及びペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））の２種類の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体が、切除不能の転移性黒色腫、及び転移性非小細胞肺癌などの疾患の治療に承認されている。従来、これらの薬剤の抗腫瘍応答は、患者の無増悪生存期間及び／または全生存期間の改善によって評価されている。健康管理の基準及び期待がより高まるにつれ、より効果的な抗癌製品及び戦略が新たに必要とされている。

【0005】

ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞活性化のプロセスにおいて免疫抑制効果を発揮し、それにより腫瘍細胞に対するＴ細胞の免疫機能を阻害する。モノクローナル抗体は、これら２つの免疫抑制標的をブロックすることにより、Ｔ細胞の抗腫瘍免疫応答を回復することができる。上記の免疫抑制チェックポイントの阻害に加えて、刺激性チェックポイントの活性化は、新しい薬物の開発の標的となる。

【0006】

刺激性免疫チェックポイント分子とは、主に、Ｔ細胞活性化に対する刺激効果を発揮するリガンドと受容体のペアを指す。これらの分子には、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーに属し、Ｔ細胞増殖、活性化、及び分化に役割を果たすＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、及びＧＩＴＲが含まれるが、これらに限定されない。

【0007】

ＯＸ４０受容体は、ＣＤ１３４及びＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４）としても知られ、ＴＮＦＲスーパーファミリー受容体のメンバーである。ＣＤ２８のような他の構成的Ｔ細胞共刺激受容体とは異なり、ＯＸ４０はナイーブＴ細胞では発現されない。ＯＸ４０は、活性化の２４～７２時間後に活性化Ｔ細胞で主に発現する二次的共刺激免疫チェックポイント分子である。同様に、ＯＸ４０のリガンドであるＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２またはＴＮＦＳＦ４）は、休止状態の抗原提示細胞では発現しないが、活性化後に発現される。ＯＸ４０の発現は、Ｔ細胞の完全活性化に依存する。

【0008】

ＯＸ４０は、そのリガンドであるＯＸ４０Ｌに結合し、細胞内領域にＴＮＦＲ分子を動員してＩＫＫα－ＩＫＫβ及びＰＩ３ｋ－ＰＫＢ（Ａｋｔ）シグナル伝達複合体を形成させることにより、共刺激シグナルを活性化する。ＯＸ４０及びＴＣＲは、未知の機構を通じて細胞内Ｃａ^２＋レベルを増加させ、核因子活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）の核侵入を導くことによって、ＮＦＡＴシグナルを活性化するうえで相乗効果を有する。ＯＸ４０はまた、ＰＩ３ｋ／ＰＫＢ及びＮＦＡＴ経路、古典的ＮＦ－κＢ１経路、または非標準的ＮＦ－κＢ２経路の活性化を介してＴ細胞の活性化、増強、増殖、及び生存に中心的な役割を果たす。さらに、ＯＸ４０は、ＣＴＬＡ－４及びＦｏｘｐ３の発現を減少させる。

【0009】

免疫応答の増強におけるＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ複合体の機構には二通りある。第一に、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ複合体は、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞の生存率及び増殖を増強することによって、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γなどのサイトカインの分泌を増加させる。第二に、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ複合体は、調節性Ｔ細胞の免疫抑制活性を減少させることによってＴ細胞活性化を増加させる。腫瘍微小環境において、免疫系の活性化は、ＯＸ４０の発現を増加させ、エフェクターＴ細胞の活性化及び増殖を増強し、調節性Ｔ細胞を阻害し、これらは共に、複雑な抗腫瘍免疫応答に寄与する。現在、がん治療における抗ＯＸ４０抗体の多くの臨床試験が、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓのウェブサイトで入手可能である。

【0010】

しかしながら、新たながん治療を開発するためのより多くの新規の抗ＯＸ４０抗体が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、がん治療のための、ＯＸ４０に特異的に結合してこれを活性化する新規な抗ＯＸ４０抗体を提供する。

【0012】

一実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲ１ドメイン（配列番号１）、重鎖ＣＤＲ２ドメイン（配列番号２）、及び重鎖ＣＤＲ３ドメイン（配列番号３）を有する重鎖可変領域と、軽鎖ＣＤＲ１ドメイン（配列番号９）、軽鎖ＣＤＲ２ドメイン（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３ドメイン（配列番号１１）を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0013】

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントと、さらなる治療剤とを含む抗体薬物複合体を提供し、好ましくは、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、リンカーによってさらなる治療剤と連結される。

【0014】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0015】

別の態様では、本発明は、配列表に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

【0016】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0017】

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するための方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を抗体またはその抗原結合フラグメントの発現に適した条件下で培養することと、発現された抗体または抗原結合フラグメントを培地から回収することと、を含む、方法を提供する。

【0018】

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、本明細書に記載のポリヌクレオチド、または本明細書に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。

【0019】

一態様では、本発明は、がんの治療に使用される、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を提供する。

【0020】

別の態様では、本発明は、がんを治療するための方法であって、治療を必要とする個体に、治療有効量の本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0021】

別の態様では、本発明は、がんを治療するための薬剤の製造における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物の使用を提供する。

【0022】

別の態様では、本発明は、がんを治療するための薬物の製造における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物の使用を提供する。

【0023】

一実施形態では、本発明は、以下のうちの１つ以上、すなわち、Ｔｒｅｇ機能の阻害（例えば、Ｔｒｅｇの抑制的機能の阻害）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高いレベルのＯＸ４０を発現する細胞）の殺滅、エフェクターＴ細胞機能の増大及び／またはメモリーＴ細胞機能の増大、腫瘍免疫の低下、Ｔ細胞機能の増強及び／またはＯＸ４０発現細胞の枯渇のうちの１つ以上に使用される、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を提供する。

【0024】

別の実施形態では、本発明は、以下の治療機序、すなわち、Ｔｒｅｇ機能の阻害（例えば、Ｔｒｅｇの抑制的機能の阻害）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高いレベルのＯＸ４０を発現する細胞）の殺滅、エフェクターＴ細胞機能の増大及び／またはメモリーＴ細胞機能の増大、腫瘍免疫の低下、ならびにＴ細胞機能の増強及び／またはＯＸ４０発現細胞の枯渇のうちの１つまたは組み合わせを有する薬剤の製造に使用される、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を提供する。

【0025】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物と、１つ以上のさらなる治療剤と、を含む医薬組成物を提供する。

【0026】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を含み、好ましくは投与装置をさらに含む、キットを提供する。

【0027】

特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の開発可能性を改善するように設計された、そのアミノ酸配列の１つ以上の点変異を含む。好ましい実施形態では、１つ以上の点変異は、宿主細胞での発現、調製及び／または製剤化における精製、及び／または個体への投与のプロセスにおいて抗体をより安定化させる。別の好ましい実施形態では、１つ以上の点変異は、調製及び／または製剤化のプロセスにおいて抗体を凝集しにくくする。いくつかの他の実施形態では、本発明は、例えば、それらの配列の１つ以上の（例えば、それらのＣＤＲの１つ以上の）アミノ酸を置き換えて疎水性を除去または低減し、及び／または電荷を最適化することによって、開発可能性の問題を最小化または低減した治療抗体を提供する。

【0028】

本発明の一実施形態は、配列番号３３のアミノ酸残基５６～７４（配列番号３４：ＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮ）に対応するＯＸ４０のエピトープに特異的に結合することができる、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0029】

本発明の別の実施形態は、ＯＸ４０に特異的に結合することができるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＯＸ４０とＯＸ４０リガンドとの結合を妨げない、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0030】

本発明の別の実施形態は、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が、三量体または多量体凝集状態でＯＸ４０とＯＸ４０リガンドとの結合を妨げない、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0031】

本発明の別の実施形態は、ＯＸ４０に特異的に結合することができるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＯＸ４０及び内因性ＯＸ４０リガンドへの抗体の結合がともに刺激性シグナル伝達経路を活性化する、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0032】

本発明の別の実施形態は、ＯＸ４０が、ヒトＯＸ４０である、上記の実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0033】

本発明の別の実施形態は、エピトープが配列番号２を含む、上記実施形態のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0034】

本発明の別の実施形態は、約１ｎＭ～約１０ｎＭのＫ_ＤでＯＸ４０に結合する、上記実施形態のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0035】

本発明の別の実施形態は、ＯＸ４０に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が、ＯＸ４０の発現を減少させず、または細胞表面に存在するＯＸ４０の量を減少させない、上記実施形態に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0036】

本発明の別の実施形態は、前記モノクローナル抗体を用いてがんを治療する方法であって、がんが、固形腫瘍、非固形腫瘍、または腫瘍浸潤Ｔ細胞の細胞表面上にＯＸ４０発現がみられる種類のがんである、方法である。

【0037】

本発明の別の実施形態は、ＯＸ４０とモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントとの結合によって試料中のＯＸ４０を検出するための方法である。

【0038】

本発明の別の実施形態は、対象におけるＯＸ４０のレベルを決定するための方法であって、
ａ）前記対象から試料を得ることと、
ｂ）試料を本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと混合することと、
ｃ）対象におけるＯＸ４０のレベルを決定することと、を含み、
試料が、組織試料、血液試料、または腫瘍／がん試料である、方法である。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1A】ＯＸ４０タンパク質へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ８０は、０．７１ｎＭである。

【図1B】２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたヒトＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。ＥＣ５０は２ｎＭである（平均蛍光強度（ＭＦＩ））。

【図1C】２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたカニクイザルＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。ＥＣ５０は２．９ｎＭ（ＭＦＩ）である。

【図1D】２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたマウスＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたマウスＯＸ４０タンパク質には結合しない（ＭＦＩ）。

【図1E】２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０タンパク質には結合しない（ＭＦＩ）。

【図1F】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、参照例１、参照例２、参照例３、及び参照例４のそれぞれに対する、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたヒトＯＸ４０タンパク質の結合を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．０２ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例１のＥＣ５０は２．６７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例２のＥＣ５０は４．１７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例３のＥＣ５０は１．９２ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例４のＥＣ５０は２．１１ｎＭ（ＭＦＩ）である。

【図1G】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、参照例１、参照例２、参照例３、及び参照例４のそれぞれに対する、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたカニクイザルＯＸ４０タンパク質の結合を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．９４ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例１のＥＣ５０は２．９１ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例２のＥＣ５０は６．１３ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例３のＥＣ５０は２．５７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例４のＥＣ５０は３．５４ｎＭ（ＭＦＩ）である。

【図2A】Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を示す。抗ヒトＩｇＧと架橋される場合、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は、２．９ｎＭ（ＧＦＰのＭＦＩ）である。

【図2B】Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は、抗ヒトＩｇＧと架橋していない場合に大幅に高い。抗ヒトＩｇＧとの架橋がない場合、三量体ＯＸ４０Ｌ組換えタンパク質単独は、ＥＣ５０が４５ｎＭに等しい場合にＮＦ－ｋｂシグナル伝達経路を活性化することができる。ＭＦＩ：蛍光（ＧＦＰ）強度の尺度。

【図2C】抗ヒトＩｇＧとの架橋におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とＯＸ４０Ｌの相乗的なアゴニスト作用を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とＯＸ４０Ｌとは共に、個々の成分が単独で作用する場合の効果と比較して、ＧＦＰのＭＦＩを増加させた。

【図2D】初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を示す。初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性をＩＬ－２分泌のレベルにより測定したところ、得られたＥＣ５０は０．２ｎＭであった。

【図2E】初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とＯＸ４０Ｌとは共に、初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＬ－２分泌を刺激する際に相乗的なアゴニスト作用を有する。

【図3】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の薬物動態試験を示す。ＩｇＧのレベルは、処理後１００時間で１００μｇ／ｍＬ超から１０μｇ／ｍＬ未満に減少した。

【図4A】インビボでのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の抗腫瘍効果を示す。ＰＢＳコントロールと比較して、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は腫瘍サイズを有意に減少させた。

【図4B】インビボでのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の抗腫瘍効果を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、マウスに有意な体重減少を引き起こす望ましくない副作用を示さなかった。

【図4C】０．１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、１ｍｇ／ｋｇの参照例１、及び１０ｍｇ／ｋｇのコントロールのインビボ抗腫瘍効果（腫瘍サイズ）を示す。１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理は、測定した１５日間にわたって腫瘍サイズを抑制するうえで最も効果的であった。

【図4D】０．１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、１ｍｇ／ｋｇの参照例１、及び１０ｍｇ／ｋｇのコントロールのインビボ抗腫瘍効果（体重）を示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、マウスに有意な体重減少を引き起こす望ましくない副作用を示さなかった。

【図5A】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の安定性に対する温度の影響を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果によって示唆されるように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は異なる温度で良好な安定性を有する。

【図5B】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の安定性に対するｐＨの影響を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果によって示唆されるように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は異なるｐＨ条件下で良好な安定性を有する。

【図5C】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の酸化ストレス試験を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果によって示唆されるように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は異なる酸化ストレス条件下で良好な安定性を有する。

【図5D】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の安定性に対する凍結／解凍の影響を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果によって示唆されるように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、異なる凍結／解凍条件下で良好な安定性を有する。

【図6A】３匹の異なるサルから単離された活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。各曲線は、４パラメータモデルを用いた非線形曲線当てはめを表す。曲線上の各ドットは実際のデータポイントを表す。＃２００１０７の陽性細胞の割合を示す。

【図6B】３匹の異なるサルから単離された活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。各曲線は、４パラメータモデルを用いた非線形曲線当てはめを表す。曲線上の各ドットは実際のデータポイントを表す。＃２００１０７のＭＦＩを示す。

【図6C】３匹の異なるサルから単離された活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。各曲線は、４パラメータモデルを用いた非線形曲線当てはめを表す。曲線上の各ドットは実際のデータポイントを表す。＃Ｍ２０Ｚ０１３００９の陽性細胞の割合を示す。

【図6D】３匹の異なるサルから単離された活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。各曲線は、４パラメータモデルを用いた非線形曲線当てはめを表す。曲線上の各ドットは実際のデータポイントを表す。＃Ｍ２０Ｚ０１３００９のＭＦＩを示す。

【図6E】３匹の異なるサルから単離された活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。各曲線は、４パラメータモデルを用いた非線形曲線当てはめを表す。曲線上の各ドットは実際のデータポイントを表す。＃Ｍ２０Ｚ０２５００８の陽性細胞の割合を示す。

【図6F】３匹の異なるサルから単離された活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。各曲線は、４パラメータモデルを用いた非線形曲線当てはめを表す。曲線上の各ドットは実際のデータポイントを表す。＃Ｍ２０Ｚ０２５００８のＭＦＩの割合を示す。

【図7】野生型（ＷＴ）マウスにおけるＢｍｋ１（１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）及びＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１（１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）の時間に対する平均抗体濃度プロファイルを示す。記号：各データポイントの平均値。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１投与は、測定した両方の用量でＢｍｋ１よりも高い抗体濃度を生じた。

【図8】ｈＯＸ４０－ＫＩマウスにおけるＢｍｋ１及びＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の時間に対する平均抗体濃度プロファイルを示す。記号：各データポイントの平均値。１０ｍｇ／ｋｇでのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の投与は、Ｂｍｋ１（投与の約７０時間後に０．１μｇ／ｍＬ未満）と比較して長時間にわたって持続する効果を有する（投与の２００時間後に１μｇ／ｍＬよりも高い）。

【図9】腫瘍組織のＣＤ４５^＋細胞中のＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を示す。

【図10】腫瘍組織のＣＤ４^＋Ｔ細胞中のＴｒｅｇの割合を示す。

【図11】腫瘍組織のＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＫｉ６７の発現を示す。

【図12】腫瘍組織のＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現を示す。

【図13】ＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌ複合体の３Ｄ結晶構造に対してマッピングした、抗ＯＸ４０抗体のエピトープとしてのＨＦＢ３０１００１を示す。

【図14】細胞ベースの生物発光アッセイを用いて測定されたＯＸ４０リガンドのアゴニスト活性を示す。Ａは、ＯＸ４０リガンド単独のレポーター遺伝子活性を示し、Ｂは、抗ＯＸ４０抗体であるＨＦＢ３０１００１、ベンチマーク１またはベンチマーク２の存在下でのＯＸ４０リガンドのレポーター遺伝子活性を示す。Ｙ軸は相対発光量を示す。

【図15】抗体処理後のＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現のレベルを示す。Ａは、フローサイトメトリーによって測定した、異なる濃度の抗ＯＸ４０抗体で処理した後のヒトＰＢＭＣから単離されたＯＸ４０陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を示す。ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックインＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルにおいて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現量を１０ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０抗体による３回目の処理の２４時間後に測定した（Ｂ）。ＭＦＩは平均蛍光強度を表す。

【図16】アイソタイプコントロール（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１（１ｍｇ／ｋｇ）、または抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１（０．１ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ）による処理後のｈＯＸ４０ノックインＭＣ－３８マウス腫瘍モデルにおける腫瘍サイズを示す。矢印は処理時点を示し、エラーバーは標準誤差を示す。有意性は、最後の時点で一元配置ＡＮＯＶＡによって計算される（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。

【図17】抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１（１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ）、抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１（１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）、コントロール（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による処理後のＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルにおけるヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックインマウスの生存率（％）を示す。有意性は、ログランク検定によって計算した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。

【図18A】コントロール（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、または抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１による処理後のｈＯＸ４０ノックインＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルの腫瘍微小環境における特異的免疫細胞集団の割合を示す。ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋生細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｋｉ６７^＋Ｔ細胞の割合を示す。

【図18B】コントロール（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、または抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１による処理後のｈＯＸ４０ノックインＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルの腫瘍微小環境における特異的免疫細胞集団の割合を示す。ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋生細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｋｉ６７^＋Ｔ細胞の割合を示す。

【図18C】コントロール（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、または抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１による処理後のｈＯＸ４０ノックインＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルの腫瘍微小環境における特異的免疫細胞集団の割合を示す。ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋生細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＰＤ－１^＋Ｔ細胞の割合を示す。

【図18D】コントロール（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、または抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１による処理後のｈＯＸ４０ノックインＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルの腫瘍微小環境における特異的免疫細胞集団の割合を示す。ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋生細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＰＤ－１^＋Ｔ細胞の割合を示す。

【図18E】コントロール（ＩｇＧ１）、ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、または抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１による処理後のｈＯＸ４０ノックインＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルの腫瘍微小環境における特異的免疫細胞集団の割合を示す。ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋生細胞中のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ^３＋細胞の割合を示す。

【図19】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、ベンチマーク１（Ｂｍｋ１）、またはベンチマーク２（Ｂｍｋ２）抗体とのインキュベーション後のＯＸ４０シグナル伝達レポーターであるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＮＦ－ｋＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０レポーターＪｕｒｋａｔ細胞）からのルシフェラーゼシグナルを示す。

【図20A】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１抗体の存在下でＯＸ４０リガンド（ＯＸＬ４０）によって刺激したＯＸ４０レポーター細胞（ＮＦ－ｋＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０レポーターＪｕｒｋａｔ細胞）からのルシフェラーゼシグナルを示す。

【図20B】アイソタイプコントロール抗体の存在下でＯＸ４０リガンド（ＯＸＬ４０）によって刺激したＯＸ４０レポーター細胞（ＮＦ－ｋＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０レポーターＪｕｒｋａｔ細胞）からのルシフェラーゼシグナルを示す。

【図20C】ベンチマーク１抗体の存在下でＯＸ４０リガンド（ＯＸＬ４０）によって刺激したＯＸ４０レポーター細胞（ＮＦ－ｋＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０レポーターＪｕｒｋａｔ細胞）からのルシフェラーゼシグナルを示す。

【図20D】ベンチマーク２抗体の存在下でＯＸ４０リガンド（ＯＸＬ４０）によって刺激したＯＸ４０レポーター細胞（ＮＦ－ｋＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０レポーターＪｕｒｋａｔ細胞）からのルシフェラーゼシグナルを示す。

【図21】活性化ヒトＣＤ４^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を示す。Ｔ細胞を、＃１９００５５（Ａ：陽性細胞の割合、Ｂ：ＭＦＩ）及び＃１９００６１（Ｃ：陽性細胞の割合、Ｄ：ＭＦＩ）の２人のドナーから単離した。アイソタイプコントロール及びベンチマーク１抗体（Ｂｍｋ１）もこの実験で試験される。

【図22】ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１による処理後の初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＯＸ４０の発現量を示す。Ｔ細胞を、＃１９１２２３－Ｂ（Ａ）及び＃１９００６１（Ｂ）の２人の異なるドナーから単離した。Ｔ細胞上のＯＸ４０発現量を、抗ＯＸ４０抗体で染色することによって決定した。

【図23】ヒトＰＢＭＣをＳＥＡと、抗ＯＸ４０抗体、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１及びベンチマーク１（Ｂｍｋ１）とで刺激した後のＩＬ－２レベルを示す。ヒトＩＬ－２を、７０時間の刺激後に培養上清中で定量した。ＰＢＭＣを、１０ｎｇ／ｍＬ（Ａ）または１ｎｇ／ｍＬ（Ｂ）ＳＥＡのいずれかで刺激した。各実験条件を２連で試験した。記号は平均を示し、エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。

【発明を実施するための形態】

【0040】

一実施形態では、本発明は、重鎖ＣＤＲ１ドメイン（配列番号１）、重鎖ＣＤＲ２ドメイン（配列番号２）、及び重鎖ＣＤＲ３ドメイン（配列番号３）を有する重鎖可変領域と、軽鎖ＣＤＲ１ドメイン（配列番号９）、軽鎖ＣＤＲ２ドメイン（配列番号１０）、及び軽鎖ＣＤＲ３ドメイン（配列番号１１）を有する軽鎖可変領域と、を含む、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0041】

別の実施形態では、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示す重鎖可変領域、または配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号１２に示す軽鎖可変領域、または配列番号１２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する軽鎖可変領域と、を含む。

【0042】

別の実施形態では、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、重鎖定常領域は、配列番号５であるか、または配列番号５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有し、及び／または好ましくは、軽鎖定常領域は、配列番号１３であるか、または配列番号１３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。

【0043】

別の実施形態では、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域に連結された重鎖シグナルペプチド及び／または軽鎖可変領域に連結された軽鎖シグナルペプチドをさらに含み、好ましくは、重鎖シグナルペプチドは、配列番号６であるか、または配列番号６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有し、及び／または好ましくは、軽鎖シグナルペプチドは、配列番号１４であるか、または配列番号１４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。

【0044】

別の実施形態では、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメント、または好ましくはＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0045】

別の好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである。

【0046】

別の実施形態では、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはｓｄＡｂである。

【0047】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０アゴニストとして、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）と、配列番号３４を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるエピトープにおいて特異的に結合し、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ相互作用／結合に実質的に影響を及ぼさない。

【0048】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０Ｌの存在下または非存在下でＮＦ－ｋＢ媒介性ＯＸ４０シグナル伝達を誘導する。

【0049】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、（内因性の）ＯＸ４０Ｌにより誘導されるＯＸ４０シグナル伝達（例えば、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達）を阻害せず、または増強し、場合により、ＯＸ４０シグナル伝達は、少なくとも約５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ以上の濃度のＯＸ４０Ｌによって誘導される。

【0050】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、活性化された初代（ヒトまたはカニクイザル）ＣＤ４^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞に、約０．０１～５ｎＭ、０．１～０．３ｎＭ、または０．５～１．５ｎＭ（例えば、０．６５または１．３６ｎＭ）のＥＣ５０値で結合する。

【0051】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、活性な（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激された）末梢ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞上の総表面レベルＯＸ４０発現量を用量依存的に増加させる（例えば、最大のＯＸ４０発現は、約１ｎＭの前記抗体またはそのフラグメントによって刺激される）。

【0052】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、用量依存的にＴ細胞活性化を増強する。

【0053】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、活性化されたヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２）産生を増加させる。場合により、前記ヒトＰＢＭＣは、１または１０ｎｇ／ｍＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ腸毒素Ａ（ＳＥＡ）によって刺激される。

【0054】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＯＸ－４０発現標的細胞の存在下で、例えば、１２：１～１：１のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で、約０．３～１．２ｎＭのＥＣ５０で、エフェクター細胞にＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣを用量依存的に誘導する。

【0055】

特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、３００μｇ／ｍＬ以下では初代ＰＢＭＣに有意なサイトカイン放出を誘導しない。

【0056】

特定の態様では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇの最大耐用量でマウスに有意な毒性を誘導しない。

【0057】

一態様では、本発明は、本明細書に記載のＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントといくつかのさらなる治療剤とを含む抗体薬物複合体に関し、好ましくは、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、リンカーによってさらなる治療剤に連結される。

【0058】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0059】

一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、配列番号２０の重鎖可変領域ポリヌクレオチドコード配列及び／または配列番号２８の軽鎖可変領域ポリヌクレオチドコード配列を含み、好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号２１の重鎖定常領域ポリヌクレオチドコード配列及び／または配列番号２９の軽鎖定常領域ポリヌクレオチドコード配列をさらに含む。

【0060】

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。

【0061】

別の実施形態では、本発明は、本発明に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0062】

一態様では、本発明は、本発明に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するための方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を抗体またはその抗原結合フラグメントの発現に適した条件下で培養することと、発現された抗体または抗原結合フラグメントを培地から回収することと、を含む、方法を提供する。

【0063】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、本明細書に記載のポリヌクレオチド、または本明細書に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。

【0064】

別の態様では、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物はがんの治療に使用される。一実施形態では、がんは、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（消化管癌、及び消化管間質癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するものなど）及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常血管増殖、脳腫瘍及び脳癌、頭頸部癌、及び関連する転移からなる群から選択される。

【0065】

別の態様では、本発明は、がんを有する対象を治療する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含み、それにより前記対象を治療する、方法を提供する。一実施形態では、がんは、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（消化管癌、及び消化管間質癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するものなど）及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常血管増殖、脳腫瘍及び脳癌、頭頸部癌、及び関連する転移からなる群から選択される。

【0066】

一態様では、本発明は、がんを治療するための別の医薬組成物の製造における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物の使用を提供する。一実施形態では、がんは、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（消化管癌、及び消化管間質癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓腫瘍、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（例えば、脳腫瘍に関連するものなど）及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常血管増殖、脳腫瘍及び脳癌、頭頸部癌、及び関連する転移からなる群から選択される。

【0067】

一態様では、本発明は、以下のうちの１つ以上、すなわち、Ｔｒｅｇ機能の阻害（例えば、Ｔｒｅｇの抑制的機能の阻害）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高いレベルのＯＸ４０を発現する細胞）の殺滅、エフェクターＴ細胞機能の増大及び／またはメモリーＴ細胞機能の増大、腫瘍免疫の低下、ならびにＴ細胞機能の増強及び／またはＯＸ４０発現細胞の枯渇のうちの１つ以上に使用される、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物に関する。

【0068】

一態様では、本発明は、以下のうちの１つ以上、すなわち、Ｔｒｅｇ機能の阻害（例えば、Ｔｒｅｇの抑制的機能の阻害）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高いレベルのＯＸ４０を発現する細胞）の殺滅、エフェクターＴ細胞機能の増大及び／またはメモリーＴ細胞機能の増大、腫瘍免疫の低減、Ｔ細胞機能の増強及び／またはＯＸ４０発現細胞の枯渇、のうちの１つ以上の処置のための別の医薬組成物の製造における、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物の使用を提供する。

【0069】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物と、１つ以上のさらなる治療剤と、を含む医薬組み合わせを提供する。

【0070】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に記載の抗体薬物複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を含み、好ましくは投与装置をさらに含む、キットを提供する。

【0071】

本発明の特定の実施形態は、固有のＯＸ４０エピトープに特異的であり、したがって、他のＯＸ４０アゴニスト抗体と比較して、ＯＸ－４０受容体の下方制御をほとんどまたはまったくもたらさないＯＸ４０アゴニスト抗体に関する。市場における他の公知のアゴニスト抗体と比較して、開示されるアゴニスト抗体は、より良好な結合反応速度を示し得る。

【0072】

開示される発明または関連する応用例は、当業者が、本発明に開示される情報の１つ、一部、または全部を理解し、組み合わせることを可能ならしめるものである。以下の開示に、本発明の詳細な説明及びその関連する応用例を示す。

【0073】

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、アラインメントが完全に一致する場合に同じである場合に「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウインドウにわたって配列同士を比較して、いくつかの局所領域にわたって配列類似性を特定し、比較することによって行われる。本明細書で使用する場合、「比較ウインドウ」とは、１つの配列を同じ数の連続位置の参照配列と、２つの配列同士を最適にアラインした後で比較することができる、少なくとも約２０個の連続位置、通常は３０～約７５個、または４０～約５０個のセグメントのことを指す。

【0074】

完全な配列アラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムのデフォルトのパラメータを用いて行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアラインメントスキームを実現するものである：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，１９７８，Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐ．３，ｐｐ．３４５－３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ｐｐ．６２６－６４５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１ １：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６－４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６－７３０。

【0075】

いくつかの実施形態では、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０個の連続した核酸またはアミノ酸残基にわたる完全な配列アラインメントの比較によって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下、通常は５～１５％、または１０～１２％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、一致した位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。

【0076】

あるいは、バリアントは、天然の遺伝子またはその一部もしくは相補体と実質的に相同であってもよい。そのようなポリヌクレオチドバリアントは、適度にストリンジェントな条件下で、天然の抗体（または相補配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができる。

【0077】

「適度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄、５０℃～６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーションの後、０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣによる、６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。

【0078】

本明細書で使用する場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、（１）洗浄に低いイオン強度及び高温を用いるもの、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いるもの、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤を用いるもの、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドと、５０％の７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で用いるもの、または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０Ｍｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を４２℃で用い、４２℃の０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５５℃の５０％ホルムアミド中での洗浄後、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣによる５５℃での高ストリンジェンシー洗浄を行うものである。当業者であれば、プローブ長などの変数に適合させるために必要に応じて温度及びイオン強度などの実験条件を最適化することができる。

【0079】

遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者には認識されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの使用の差異に起因して異なるポリヌクレオチドは、本開示によって具体的に想到される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルは、本開示の範囲内である。アレルは、例えばヌクレオチドの欠失、付加及び／または置換などの１つ以上の変異の結果として変化する内因性遺伝子である。得られるｍＲＮＡ及びタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、必ずしもそうとは限らない。アレルは、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅及び／またはデータベースの配列比較）を用いて同定することができる。

【0080】

本開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成法は当該技術分野では周知のものであり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書に提供される配列及び市販のＤＮＡ合成装置を使用して所望のＤＮＡ配列を生成することができる。

【0081】

組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するには、本明細書にさらに記載するように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入し、このベクターを複製及び増幅に適した宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは当該技術分野で周知のいずれの手段によって宿主細胞に挿入してもよい。宿主細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合、またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。外因性ポリヌクレオチドは、導入されると、非組み込み型ベクター（プラスミドなど）として細胞内で維持されるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。そのようにして増幅されたポリヌクレオチドは、当該技術分野では周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい。

【0082】

あるいは、ＰＣＲによればＤＮＡ配列の再生産が可能である。

【0083】

ＲＮＡは、単離されたＤＮＡを適切なベクター中で使用し、これを適当な宿主細胞に挿入することによって得ることができる。細胞が複製してＤＮＡがＲＮＡに転写される際、当業者には周知の方法を用いてＲＮＡを単離することができる。

【0084】

適当なクローニング及び発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、及び他の転写調節配列などのさまざまな構成要素を含むことができる。異なるベクターへの抗体可変ドメインのその後のクローニングを可能にするようなベクターを構築することもできる。

【0085】

適当なクローニングベクターは、標準的技術に従って構築することができ、あるいは当該技術分野において入手可能な多くのクローニングベクターから選択してもよい。選択されるクローニングベクターは、使用される宿主細胞に応じて異なり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に自己複製能を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの標的を１つ有することができ、及び／またはベクターを含むクローンの選択に用いることができる遺伝子マーカーを保有し得る。適当な例としては、プラスミド及び細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）及びその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３及びｐＡＴ２８などのシャトルベクターが挙げられる。これら及び他の多くのクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的供給元から販売されている。

【0086】

発現ベクターをさらに提供する。発現ベクターは、一般に、本開示によるポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチドコンストラクトである。いわゆる発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一体部分として、宿主細胞中で複製できなければならない。適当な発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、及びＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示される発現ベクターが挙げられる。ベクター構成要素としては、これらに限定されるものではないが、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、適当な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及びターミネーターなど）のうちの１つ以上が挙げられる。発現（すなわち、翻訳）には、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、及び終止コドンなどの１つ以上の翻訳制御エレメントも通常は必要とされる。

【0087】

目的のポリヌクレオチドを含むベクター及び／またはポリヌクレオチド自体を、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、またはパーティクルガンのような他の物質を用いたトランスフェクション；リポフェクション；及び感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスのような感染因子である場合）を含む任意の適当な手段によって宿主細胞に導入することができる。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、しばしば宿主細胞の特徴によって決まる。

【0088】

本発明の抗体は、組換え方法によって調製、発現、産生、または単離されたヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（以下のセクションＩＩでさらに記載する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体（以下のセクションＩＩＩでさらに記載する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、（Ｔａｙｌｏｒ，ＬＤ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５）を含むか、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の方法によって調製、発現、産生または単離された抗体に関する。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する（Ｋａｂａｔ，ＥＡ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照）。

【0089】

本発明の抗体または抗体部分は、宿主細胞中で免疫グロブリン軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子を組換え法により発現させることによって調製することができる。抗体を組換え法により発現させるには、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを有する１つ以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることにより、軽鎖及び重鎖が宿主細胞内で発現され、好ましくは、宿主細胞が培養される培地中に分泌され、そこから抗体を回収することができる。標準的な組換えＤＮＡ法を用いて、抗体重鎖遺伝子及び抗体軽鎖遺伝子を得て、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに導入し、次いでベクターを宿主細胞に導入する。標準的な方法としては、例えば、以下の文献に記載の方法がある：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭ，ｅｔｃ． （ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及びＢｏｓｓ Ｅｔ ａｌ．米国特許第４，８１６，３９７号。

【0090】

抗体またはその抗原結合フラグメントは、適当な宿主細胞を用いて組換え法により作製することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、次いでこれを、ベクターなしでは免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）に導入することで、組換え宿主細胞中で抗体を合成させることができる。好ましい宿主細胞としては、当該技術分野では周知の多くの細胞の中でも、ＣＨＯ細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞、またはＳｐ２．０細胞が挙げられる。

【0091】

抗体フラグメントは、完全長抗体のタンパク質分解または他の分解、組換え法、または化学合成によって生成することができる。抗体のポリペプチドフラグメント、特にアミノ酸約５０個以下のより短いポリペプチドは、化学合成によって簡単に作製することができる。タンパク質及びペプチドの化学合成法は当該技術分野では周知のものであり、市販されている。

【0092】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、親和性成熟させることができる。例えば、親和性成熟抗体は、当該技術分野では周知の方法によって生成することができる（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ，１６９：１４７－１５５；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１９９４－２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３３１０－９；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６；及びＷＯ２００４／０５８１８４）。

【0093】

抗体バリアント
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが想到される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。かかる改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列中の残基の欠失、アミノ酸配列中への残基の挿入、及び／またはアミノ酸配列中の残基の置換が含まれる。最終的なコンストラクトが、所望の特性、例えば、抗原結合性を有するものである限り、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って最終的なコンストラクトとすることができる。

【0094】

特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の開発可能性を改善するように設計された、そのアミノ酸配列の１つ以上の点変異を含む。例えば、Ｒａｙｂｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｉｖｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，”ＰＮＡＳ，Ｍａｒｃｈ ５，２０１９，１１６（１０）４０２５－４０３０は、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌ（治療抗体分析ツール）（ＴＡＰ）について記載しているが、これは、５つの開発可能性ガイドラインに対して試験され、配列ライアビリティーの可能性及びカノニカル型の報告である、可変ドメイン配列のダウンロード可能な相同性モデルについて確立された計算ツールである。著者はさらに、ｏｐｉｇ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｓａｂｄａｂ－ｓａｂｐｒｅｄ／ＴＡＰ．ｐｈｐで無償で入手可能なＴＡＰを提供している。抗原に対する所望の親和性を得ることに加えて、治療用モノクローナル抗体の開発には、自然免疫原性、化学的及びコンフォメーション不安定性、自己会合、高粘度、多重特異性、及び発現の低さをはじめとする、多くの障壁がある。例えば、高い疎水性（特に、可変性の高い相補性決定領域（ＣＤＲ）における）は、凝集、粘度、及び多重特異性への関与が繰り返し指摘されている。重鎖及び軽鎖可変ドメインの正味電荷の非対称性も、高濃度での自己会合及び粘度に関係している。ＣＤＲ内の正及び負に帯電したパッチは、高いクリアランス速度及び低い発現レベルに関係している。生成物の不均一性（例えば、酸化、異性化、またはグリコシル化による）は、通常、翻訳後または翻訳時修飾を受けやすい特定の配列モチーフによって引き起こされる。計算ツールを使用して、配列ライアビリティーを容易に特定することができる。Ｗａｒｓｚａｗｓｋｉもまた、可変軽鎖－重鎖界面の自動設計によって抗体の親和性及び安定性を最適化するための方法について記載している。Ｗａｒｓｚａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９） Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ－ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １５（８）：ｅ１００７２０７， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００７２０７。他の方法を使用して、候補抗体の潜在的な開発可能性における問題を特定することもでき、本発明の好ましい実施形態では、１つ以上の点変異を従来の方法によって候補抗体に導入してこうした問題を解決し、それによって本発明の最適化された治療抗体を得ることができる。

【0095】

ａ）置換、挿入、及び欠失バリアント
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発の目的となる部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換は、表Ａの「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表Ａの「例示的な置換」の見出しの下に示され、アミノ酸側鎖クラスに関して以下にさらに記載する。アミノ酸置換を目的の抗体中に導入し、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについて産物をスクリーニングしてもよい。

【表1】

【0096】

アミノ酸は、以下の共通する側鎖特性に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0097】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスとの交換を伴う。

【0098】

置換バリアントの１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される、結果として生じるバリアント（複数可）は、親抗体と比べて、特定の生物学的特性における改変（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、低減された免疫原性）を有し、及び／または親抗体の実質的に保持された特定の生物学的特性を有する。例となる置換型バリアントは、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟法を使用して適宜作製することができる親和性成熟抗体である。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0099】

改変（例えば、置換）をＨＶＲに行って、例えば、抗体親和性を改善することができる。かかる改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を生じるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）、及び／または抗原と接触する残基で行われ得、結果として得られるバリアントＶＨまたはＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリを構築及び再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．によるＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔ，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）．）に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、さまざまな方法（エラーを起こしやすくしたＰＣＲ、チェーンシャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発など）により、成熟させるために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが作成される。次いで、このライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有するすべての抗体変異型を同定する。多様性を導入するための別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、１回に４～６個の残基）が無作為化される、ＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に同定することができる。特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が、しばしば標的とされる。

【0100】

特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲに行われてもよい。かかる改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側に行われてもよい。上記に示されるバリアントＶＨ配列及びＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＨＶＲは、改変されないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。

【0101】

突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基または領域を特定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１－１０８５に記載される、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれるものである。この方法では、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置き換えられて、抗体抗原相互作用が影響されたか否かが判定される。さらなる置換が、初期の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の場所に導入されてもよい。あるいは、または加えて、抗原抗体複合体の結晶構造を用いて抗体と抗原との接触点を特定するもできる。かかる接触残基及び隣接する残基は、置換の候補として標的とされるかまたは除外されてもよい。バリアントをスクリーニングして所望の特性を有するかどうかを判定することもできる。

【0102】

アミノ酸配列の挿入としては、長さが残基１個～１００個以上の残基を含むポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合体、ならびに１個または複数のアミノ酸残基からなる配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型バリアントとしては、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ）またはポリペプチドの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合体が含まれる。

【0103】

ｂ）グリコシル化バリアント
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が生成されるか、または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、簡便に行うことができる。

【0104】

抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物を改変することができる。哺乳類細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照）。オリゴ糖類には、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖類構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体中におけるオリゴ糖の修飾は、特定の特性の改善を有する抗体バリアントを作製するために行われ得る。

【0105】

一実施形態では、提供される抗体バリアントは、Ｆｃ領域への直接的または間接的なフコース結合能力を欠いた炭水化物構造を有する。例えば、かかる抗体内のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、または２０％～４０％の範囲とであってよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対する、糖鎖内のＡｓｎ２９７のフコースの平均量の比によって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小規模な配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位～３００位の間にも位置する。かかるフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照。「脱フコース化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する公開公報の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｄ３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ ２００３／０１５７１０８Ａ１号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ）、及びα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照）が挙げられる。

【0106】

二分されたオリゴ糖類を有する、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖類がＧｌｃＮＡｃによって二分される、抗体バリアントがさらに提供される。かかる抗体変異体は、低減されたフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体変異体の例は、例えばＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。かかる抗体バリアントは改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。

【0107】

ｃ）Ｆｃ領域バリアント
特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾を本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入することにより、Ｆｃ領域バリアントを作製することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含むことができる。

【0108】

特定の実施形態では、本発明では、すべてではないが一部のエフェクター機能を保有する抗体バリアントであって、インビボでの抗体の半減期が重要であるが特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要または有害となるような用途における望ましい候補となる抗体バリアントが想到される。インビトロ及び／またはインビボの細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）、同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７））に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。上記に代えるかまたは加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌＰｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルで評価することもできる。Ｃｌｑ結合アッセイを行って、抗体がＣｌｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣｌｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で既知の方法を使用して行うこともできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照）。

【0109】

エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上での置換を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0110】

ＦｃＲへの結合能が改善または低減された特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照）。

【0111】

特定の実施形態では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有する、Ｆｃ領域を含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の改変（改善または減少のいずれか）をもたらす改変が、Ｆｃ領域に行われる。

【0113】

半減期が増加し、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。ＦｃＲｎは、母体のＩｇＧの胎児への移行を担っている（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。これらの抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合能を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものが含まれる。

【0114】

また、Ｆｃ領域バリアントの例に関して、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０ （１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。

【0115】

ｄ）システイン操作された抗体バリアント
特定の実施形態では、抗体の１個以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製ことが望ましい場合がある。一実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位にある。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、これらのチオール基を用いて、抗体を他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー－薬物部分に結合させて、本明細書にさらに記載される免疫結合体を作製することができる。別の実施形態では、次の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換されてもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号の記載に従って作製することもできる。

【0116】

ｅ）抗体誘導体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野では周知のものであり、かつ容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を有するようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性があるため、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐していても非分岐であってもよい。本抗体に結合したポリマーの数は異なる場合があり、２つ以上のポリマーが結合しているとき、それらは、同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善対象の抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で療法において使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない考慮に基づいて、決定することができる。

【0117】

一実施形態では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱することができる非タンパク質性部分との結合体が提供される。別の実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブ（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００－１１６０５（２００５））である。放射線は、任意の波長のものであってよく、正常細胞に損傷を与えないが、抗体－非タンパク質性部分の温度を、抗体－非タンパク質性部分の近くの細胞が死滅する温度にまで加熱する波長が含まれる（ただし、これに限定されない）。

【0118】

アッセイ
本明細書で提供される抗ＯＸ４０抗体は、当該技術分野では周知のさまざまなアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性について同定、スクリーニング、または特性評価することができる。

【0119】

１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本明細書に記載される抗体の抗原結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの既知の方法によって測定される。ＯＸ４０の結合能は、当該技術分野では周知の方法を使用して決定することができ、例示的な方法を本明細書に開示する。一実施形態では、例示的なラジオイムノアッセイが、抗原抗体結合の測定に使用される。ＯＸ４０抗体をヨウ素化し、一定濃度のヨウ素化抗体と減少する濃度の連続希釈された非標識ＯＺ Ｘ４０抗体とを含む競合反応混合物を調製する。ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、ヒトＯＸ４０で安定的にトランスフェクトされたＢＴ４７４細胞）を反応混合物に加える。インキュベーション後、遊離ヨウ素化ＯＸ４０抗体を洗い流す。例えば、細胞にともなう放射能を計数することによって、細胞に結合したヨウ素化ＯＸ４０抗体細胞を測定し、標準的な方法を用いて結合親和性を決定する。別の実施形態では、フローサイトメトリーを使用して、ＯＸ４０を表面に発現する細胞（例えば、Ｔ細胞のサブセット）に対するＯＸ４０抗体の結合能を評価する。（例えば、ヒト、カニクイザル、ラット、またはマウスから）末梢白血球を得て、細胞を血清でブロッキングする。標識したＯＸ４０抗体を連続希釈物に加え、Ｔ細胞のサブセットを特定するために（当該技術分野では周知の方法を使用して）Ｔ細胞をさらに染色する。インキュベーション及び洗浄の後、細胞をフローサイトメトリーで選別し、データを当該技術分野では周知の方法を用いて分析する。別の実施形態では、ＯＸ４０の結合能を、表面プラズモン共鳴を用いて分析することができる。例示的な表面プラズモン共鳴法を例示する。

【0120】

別の態様では、競合アッセイを使用して、本明細書に開示される抗ＯＸ４０抗体のいずれかと競合するＯＸ４０結合抗体を同定することができる。特定の実施形態では、かかる競合抗体は、本明細書に開示される抗ＯＸ４０抗体と同じエピトープ（例えば、線状またはコンフォメーションエピトープ）に結合する。抗体結合エピトープマッピングの詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に示されている。競合アッセイは例示する。

【0121】

例示的な競合アッセイでは、固定化されたＯＸ４０を、ＯＸ４０に結合する第１の標識抗体（例えば、ｍａｂ１Ａ７．ｇｒ．１、ｍａｂ３Ｃ８．ｇｒ５）と第１の抗ＯＸ４０抗体と競合する能力について試験される第２の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化されたＯＸ４０を、第１の標識抗ＯＸ４０抗体を含むが第２の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。ＯＸ４０への第１の標識抗ＯＸ４０抗体の結合を可能とする条件下でインキュベートした後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化されたＯＸ４０にともなうシグナルの量を測定する。検出されたシグナルが試験試料でコントロールよりも有意に低い場合、第２の抗体が、固定化されたＯＸ４０との結合について第１の抗体と競合することを示唆する。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照。

【0122】

２．活性アッセイ
一実施形態では、生物学的活性を有する抗ＯＸ４０抗体を検出するための方法が提供される。生物学的活性には、例えば、ＯＸ４０への結合（例えば、ヒト及び／またはカニクイザルＯＸ４０への結合）、ＯＸ４０媒介シグナル伝達の増加（例えば、ＮＦｋＢ媒介転写の増加）、ヒトＯＸ４０を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の枯渇、ＡＤＣＣ及び／または食作用によるヒトＯＸ４０を発現する細胞の枯渇、例えば、エフェクターＴ細胞の増殖を増加させる、及び／またはエフェクターＴ細胞のサイトカイン産生（例えば、γインターフェロン）を増加させることによる、Ｔエフェクター細胞機能（例えば、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞）の増強、例えば、メモリーＴ細胞の増殖を増加させる、及び／またはメモリーＴ細胞によるサイトカイン産生（例えば、γインターフェロン）を増加させることによる、メモリーＴ細胞機能（例えば、ＣＤ４^＋メモリーＴ細胞）の増強、例えば、エフェクターＴ細胞機能（例えば、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞の機能）のＴｒｅｇ抑制を減少させることによる、制御性Ｔ細胞機能の阻害、ならびにヒトエフェクター細胞への結合が含まれ得る。かかる生物学的活性をインビボ及び／またはインビトロでの両方で有する抗体も本明細書で提供される。

【0123】

特定の実施形態では、本発明の抗体は、かかる生物学的活性について試験される。

【0124】

Ｔ細胞共刺激の測定のための当該技術分野では周知の方法を本明細書に例示する。例えば、Ｔ細胞（例えば、メモリーＴ細胞またはエフェクターＴ細胞）は、（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を使用してヒト全血から単離された）末梢白血球から得ることができる。メモリーＴ細胞（例えば、ＣＤ４^＋メモリーＴ細胞）またはエフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ４^＋Ｔｅｆｆ細胞）は、当該技術分野では周知の方法を用いてＰＢＭＣから単離することができる。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ４^＋メモリーＴ細胞単離キットまたはＭｉｌｔｅｎｙｉナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キットを使用することができる。単離されたＴ細胞は、抗原提示細胞（例えば、ＣＤ３２及びＣＤ８０を発現する照射Ｌ細胞）の存在下で培養し、ＯＸ４０アゴニスト抗体の存在下または非存在下で抗ＣＤ３抗体の添加によって活性化させる。Ｔ細胞増殖に対するアゴニストＯＸ４０抗体の効果を、当該技術分野では周知の方法を用いて測定することができる。例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、マルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で結果を読み取ることができる。あるいは、Ｔ細胞機能に対するアゴニストＯＸ４０抗体の効果は、Ｔ細胞によって産生されたサイトカインの分析によって決定することもできる。一実施形態では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるインターフェロンγの産生は、例えば、細胞培養上清中のインターフェロンγの測定によって決定される。インターフェロンγを測定する方法は、当該技術分野では周知のものである。

【0125】

Ｔｒｅｇ細胞機能の測定のための当該技術分野では周知の方法を本明細書に例示する。一例において、ＴｒｅｇのエフェクターＴ細胞増殖を抑制する能力がアッセイされる。Ｔ細胞は当該技術分野では周知の方法（例えば、メモリーＴ細胞またはナイーブＴ細胞を単離すること）を用いてヒト全血から単離される。精製ＣＤ４^＋ナイーブＴ細胞を（例えば、ＣＦＳＥで）標識し、精製Ｔｒｅｇ細胞を異なる試薬で標識する。放射線照射した抗原提示細胞（例えば、ＣＤ３２及びＣＤ８０を発現するＬ細胞）を、標識した精製ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞及び精製Ｔｒｅｇと共培養する。抗ＣＤ３抗体を使用して共培養物を活性化させ、アゴニストＭＯ抗体の存在下または非存在下で試験する。適当な時間（例えば、６日間の共培養）の後、ＣＤ４^＋ナイーブＴ細胞増殖のレベルを、ＦＡＣＳ分析を使用して低減した標識染色（例えば、低減したＣＦＳＥ標識染色）における色素希釈によって追跡する。

【0126】

ＯＸ４０シグナル伝達の測定のための当該技術分野では周知の方法を本明細書に例示する。一実施形態では、ＯＸ４０及びそのレポーター遺伝子（レポーター遺伝子（例えば、ベータルシフェラーゼ）に融合されたＮＦｋＢプロモータータンパク質を含む）を発現するトランスジェニック細胞が作製される。ＯＸ４０アゴニスト抗体の増加によってもたらされるＮＦｋＢ転写の増加は、レポーター遺伝子アッセイを用いて測定することができる。

【0127】

食作用は、例えば、単球由来のマクロファージ、またはＵ９３７細胞（成熟マクロファージの形態及び特性を有するヒト組織球性リンパ腫細胞株）を使用して測定することができる。ＯＸ４０発現細胞を、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体の存在下または非存在下で、単球由来のマクロファージまたはＵ９３７細胞に加える。これらの細胞を適当な期間培養した後、ＯＸ４０発現マーカー（例えば、ＧＦＰ）を有する細胞の総数に対する（１）マクロファージまたはＵ９３７細胞と、（２）ＯＸ４０発現細胞の二重染色マーカーを有する細胞の数の比によって食作用の割合が決定される。分析は、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡のいずれかによって行うことができる。

【0128】

ＡＤＣＣの測定のための方法は当該技術分野では周知のものであり、定義のセクションに例示している。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０発現細胞中のＯＸ４０のレベルは、ＡＤＣＣアッセイによって特徴付けられる。細胞を標識抗ＯＸ４０抗体（ＰＥ標識された）で染色した後、フローサイトメトリーを使用して蛍光レベルを決定することができ、結果は平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示される。別の実施形態では、ＡＤＣＣをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイキットにより分析してもよく、細胞生存率／細胞傷害性を化学発光によって決定することができる。

【0129】

さまざまな抗体のＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８及びＶ１５８）に対する結合親和性を、それぞれの組換えＦｃγ受容体を使用したＥＬＩＳＡに基づくリガンド結合アッセイによって測定することができる。精製されたヒトＦｃγ受容体を、Ｃ末端にＧｌｙ／６ｘＨｉｓ／グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ポリペプチドタグを結合した受容体γ鎖の細胞外ドメインを含む融合タンパク質として発現させる。これらのヒトＦｃγ受容体に対する抗体の結合親和性を、以下のように評価する。低親和性受容体、すなわち、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、及びＦｅγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ならびにＦｅγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）の２つのアロタイプであるＦ－１５８及びＶ－１５８の場合、抗体は、ヤギ抗ヒトカッパ鎖のＦ（ａｂ’）２フラグメント（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）により、抗体：架橋Ｆ（ａｂ’）２＝１：３の適切なモル比で架橋することにより、多量体として試験することができる。プレートを、抗ＧＳＴ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）でコーティングし、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングする。ＥＬｘ４０５（商標）プレートウォッシャー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、Ｆｃγ受容体を２５ｎｇ／ウェルでプレートに加え、室温で１時間、インキュベートする。洗浄後、各試験抗体の連続希釈物を多量体複合体として加え、プレートを室温で２時間インキュベートする。プレートを洗浄して非結合抗体を除去した後、Ｆｃγ受容体に結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２のＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて検出し、次いで、基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えた。各プレートを、試験されるＦｃγ受容体に応じて５～２０分間、室温でインキュベートして発色させた。反応を１Ｍ Ｈ３Ｐ０４で停止させ、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で測定した。２連の抗体希釈物の吸光度の平均値を抗体濃度に対してプロットすることにより用量反応結合曲線を作成する。Ｆｃγ受容体結合に対する半数効果濃度（ＥＣ５０）を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して結合曲線を４パラメータの式に当てはめた後に決定する。

【0130】

コントロールと比較して、細胞死を誘導する抗体を、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みによって測定される、細胞膜の完全性の喪失によって選択した。ＰＩ取り込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で行うことができる。ＯＸ４０発現細胞を、培地のみ、または例えば約１０μｇ／ｍｌの適切なモノクローナル抗体を含有する培地でインキュベートした。細胞を、一定期間（例えば、１または３日間）インキュベートした。各処理に続いて、細胞を洗浄し、分取した。いくつかの実施形態では、細胞を、３５ｍｍ径のストレーナでキャップされた１２×７５本のチューブ（チューブ１本当たり１ｍｌ、各処理群ごとに３本のチューブ）に分取して細胞集塊を除去した。ＰＩ溶液を１０μｇ／ｍｌで各チューブに加えた。試料は、ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）フローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析することができる。

【0131】

上記のインビトロアッセイのいずれかで使用するための細胞としては、ＯＸ４０を天然に発現するか、またはＯＸ４０を発現するように操作された細胞または細胞株が挙げられる。かかる細胞としては、ＯＸ４０を天然に発現する活性化Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、及び活性化メモリーＴ細胞が挙げられる。かかる細胞としては、ＯＸ４０を発現する細胞株、及びＯＸ４０を通常は発現しないがＯＸ４０をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞株も挙げられる。上記のインビトロアッセイのいずれかで使用するための本明細書で提供される例示的な細胞株としては、ヒトＯＸ４０を発現するトランスジェニックＢＴ４７４細胞（ヒト乳がん細胞株）が挙げられる。

【0132】

本発明の免疫複合体を抗ＯＸ４０抗体の代わりにまたはそれに加えて使用して上述のアッセイのいずれかを行うことができる点は理解されよう。

【0133】

上記のアッセイのいずれにおいても、抗ＯＸ４０抗体及び何らかの他の治療剤を使用することができる点は理解されよう。

【0134】

製剤及び使用
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）をさらに含んでもよい。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、特定の用量及び濃度では投与対象に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド（約１０残基未満）；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。薬学的に許容される賦形剤は本明細書にさらに記載される。

【0135】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、さまざまな治療または診断目的に使用することができる。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、親和性精製剤（例えば、インビトロ精製のための）及び診断剤（例えば、特定の細胞、組織、または血清中での発現を検出するための）として使用することができる。

【0136】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの例示的な治療用途には、がんの治療が含まれる。本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、疾患の予防に使用することもできる。

【0137】

治療用途では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、従来の方法、例えば、静脈内（ボーラスとして、または一定期間にわたる連続注入によって）、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、洞内、髄腔内、経口、局所、または吸入によって、哺乳動物、特にヒトに投与することができる。本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周囲の経路によって投与することもできる。

【0138】

特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、皮下投与される。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、静脈内投与される。

【0139】

医薬組成物は、必要とする対象に疾患の重症度によって異なる頻度で投与することができる。予防療法の場合、頻度は、対象の疾患に対する感受性または素因に依存して異なり得る。

【0140】

組成物は、必要とする患者に、ボーラスとして、または連続注入によって投与することができる。例えば、Ｆａｂフラグメントとして与えられる抗体のボーラス投与は、０．００２５～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、０．０２５～０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１０～０．５０ｍｇ／ｋｇの量とすることができる。連続注入の場合、Ｆａｂフラグメントとして与えられる抗体は、１～２４時間、１～１２時間、２～１２時間、６～１２時間、２～８時間、または１～２時間にわたって、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／分、０．０１２５～１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０～０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０～１．０ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０～０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で投与することができる。

【0141】

（完全な定常領域を含む）完全長抗体の場合、投与用量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ以上、約２ｍｇ／ｋｇ以上、約３ｍｇ／ｋｇ以上、約４ｍｇ／ｋｇ以上、約５ｍｇ／ｋｇ以上、約６ｍｇ／ｋｇ以上、約７ｍｇ／ｋｇ以上、約８ｍｇ／ｋｇ以上、約９ｍｇ／ｋｇ以上、約１０ｍｇ／ｋｇ以上、約１１ｍｇ／ｋｇ以上、約１２ｍｇ／ｋｇ以上、約１３ｍｇ／ｋｇ以上、約１４ｍｇ／ｋｇ以上、約１５ｍｇ／ｋｇ以上、約１６ｍｇ／ｋｇ以上、約１７ｍｇ／ｋｇ以上、約１９ｍｇ／ｋｇ以上、または約２０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲とすることができる。状態の重症度によって、投与頻度は、週３回～２週または３週に１回の範囲とすることができる。

【0142】

さらに、組成物は、皮下投与されてもよい。例えば、１～１００ｍｇの用量の抗ＯＸ４０抗体を、週２回、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回、６週に１回、７週に１回、８週に１回、９週に１回、１０週に１回、月２回、月１回、２ヶ月に１回、または３ヶ月に１回、対象に皮下または静脈内投与することができる。

【0143】

特定の実施形態では、ヒトにおける抗ＯＸ４０抗体の半減期は、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約５日～約４０日、約５日～約３５日、約５日～約３０日、約５日～約２５日、約１０日～約４０日、約１０日～約３５日、約１０日～約３０日、約１０日～約２５日、約１５日～約４０日、約１５日～約３５日、約１５日～約３０日、または約１５日～約２５日である。

【0144】

特定の実施形態では、医薬組成物は、２～６週間ごとに、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下または静脈内投与される。

【0145】

一実施形態では、医薬組成物は、２～６週間ごとに約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下または静脈内投与される。別の実施形態では、医薬組成物は、２～６週間ごとに約２．０ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下または静脈内投与される。

【0146】

１つの例示的な実施形態では、医薬組成物は、２週間ごとに皮下投与される。

【0147】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、単独で、またはがんの治療用の他の療法と併用することができる。

【0148】

定義
本明細書において特に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、本明細書で特に指定されない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連する用語及び技術は周知のものであり、当業者に一般的に使用されるものである。

【0149】

本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」もしくは「抗体フラグメント」）という用語は、抗原と特異的に結合する能力（好ましくは、ほぼ同じ結合親和性で）を保持した完全長抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗原結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｄｓＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体及びイントラボディが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬとＶＨは２個の異なる遺伝子によってコードされるが、これらのドメインは、組み換え法を用いて、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対合して一価の分子（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成した単一のタンパク質鎖としてこれらを産生することを可能とする合成リンカーによって連結することができる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）を参照されたい。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現される二価の二重特異性抗体であるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用し、それによってこれらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させて２個の抗原結合部位を生成するようなものである（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３）。

【0150】

本明細書で使用する場合、抗体の「可変ドメイン」という用語は、抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ）または抗体重鎖の可変領域（ＶＨ）を、単独でまたは組み合わせて指す。当該技術分野では周知であるように、重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）によって連結されている。

【0151】

可変ドメイン中の残基は、抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けスキームであるＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされる。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照されたい。この番号付けシステムを使用した場合、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸またはさらなるアミノ酸を含み得る。ある特定の抗体では、残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準」Ｋａｂａｔ配列とその抗体とのアラインメントによる１つ以上の相同領域によって決定することができる。Ｋａｂａｔ番号付けを割り当てるためのさまざまなアルゴリズムが利用可能である。特に明記しない限り、本明細書で使用されるアルゴリズムは、Ａｂｙｓｉｓ（ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）の２０１２年リリース版である。

【0152】

抗体の特定の具体的なアミノ酸残基（パラトープ残基など）の位置も、Ｋａｂａｔ番号付けによって決定される。

【0153】

「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、周知のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの集積、ＡｂＭ、接触点及び／またはコンフォメーションの定義、またはＣＤＲ測定のための任意の方法の定義によって同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．（超可変領域）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３（構造的ループ構造）を参照されたい。ＣＤＲのＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの妥協の産物であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））の使用である。ＣＤＲの「接触点」定義は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２－７４５に記載される、観察された抗原接触点に基づく。ＣＤＲの「コンフォメーション」定義は、抗原結合に対するエンタルピー寄与を与える残基に基づく（例えば、Ｍａｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１ １５６－１ １６６を参照）。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のアプローチの１つに厳密に従わないものもあろうが、それでもなお、ＫａｂａｔのＣＤＲ定義の少なくとも一部と重複するであろう。これらの領域は、特定の残基または残基群またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に大きく影響しない場合、予測または実験的知見に基づいて短かくも長くもなり得る。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、異なるアプローチの組み合わせを含む、当該技術分野では周知のいずれの定義方法に基づいたものであってもよい。

【0154】

「エピトープ」という用語は、抗体が特異的に結合する抗原（Ａｇ）の部分または領域（例えば、抗体（Ａｂ）と相互作用するアミノ酸残基を含む部分または領域）を指す。エピトープは、直鎖状または非直鎖状（例えば、コンフォメーションを有する）であり得る。

【0155】

ある抗体またはその抗原結合フラグメントは、別の抗体またはその抗原結合フラグメントの同じエピトープに、対応する抗体またはその抗原結合フラグメントの結合が互いに排他的である場合、実質的に結合する。すなわち、１つの抗体またはその抗原結合フラグメントの結合は、他の抗体またはその抗原結合フラグメントの同時または順次の結合を排除する。エピトープは、抗原が両方の対応する抗体またはその抗原結合フラグメントに同時に結合することができる場合、固有であるか、または実質的に同じではない。

【0156】

「パラトープ」という用語は、上記の「エピトープ」の定義から導出され、抗原が結合する抗体の部分または領域（例えば、抗原と相互作用する残基を含む部分または領域）を指す。パラトープは、直鎖状であるかまたはコンフォメーションを有し得る（ＣＤＲ中の不連続残基など）。

【0157】

ある特定の抗体／抗原の結合ペアにおけるエピトープ／パラトープは、さまざまな実験及び計算エピトープマッピング法を用いて、異なる詳細さのレベルで定義及び特徴付けすることができる。これらの方法としては、変異誘発法、Ｘ線結晶解析法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素／重水素交換質量分析法（ＨＸ－ＭＳ）及びさまざまな競合的結合法が挙げられる。これらの方法はそれぞれ、固有の抗体－抗原結合に依存するため、エピトープの記述はエピトープが決定された方法に密接に関連する。したがって、ある特定の抗体／抗原ペアのエピトープ／パラトープは、使用されるマッピング法に応じて異なる定義がなされる。

【0158】

その最も詳細なレベルにおいて、抗体（Ａｂ）と抗原（Ａｇ）との相互作用に関するエピトープ／パラトープは、Ａｇ－Ａｂ結合時の原子間相互作用の空間座標、ならびに結合の熱力学に対するそれらの相対的寄与度に関する情報に基づいて定義することができる。１つのレベルでは、エピトープ／パラトープ残基は、ＡｇとＡｂとの原子間相互作用の空間座標によって特徴付けることができる。一態様では、エピトープ／パラトープ残基は、特定の基準、例えば、ＡｂとＡｇとの間の原子距離（例えば、同族抗体の重原子と抗原の重原子との間の距離以下の距離）によって定義することができる。別の態様では、エピトープ／パラトープ残基は、水素結合と同族抗体／抗原または同族抗体／抗原にやはり水素結合（水媒介性水素結合）している水分子との間の相互作用へのその関与に基づいて特徴付けることができる。別の態様では、エピトープ／パラトープ残基は、同族抗体／抗原の残基と塩橋を形成することを特徴とし得る。さらに別の態様では、エピトープ／パラトープ残基は、同族抗体／抗原との相互作用のために、埋め込み表面積（ＢＳＡ）にゼロでない変化を有する残基として特徴付けることができる。それほど詳細でないレベルでは、エピトープ／パラトープは、その機能に基づいて、例えば、他のＡｂとの競合的結合によって特徴付けることができる。エピトープ／パラトープはまた、別のアミノ酸によるその置換がＡｂとＡｇとの間の相互作用の特性を変化させるようなアミノ酸残基（例えば、アラニンスキャニング）を含むものとしてより一般的に定義することができる。

【0159】

エピトープの記述及び定義は、エピトープマッピングに用いられる方法及び異なる詳細さのレベルの情報に依存することから、異なるＡｂに対する同じＡｇ上のエピトープ同士の比較を、異なる詳細さのレベルで同様に行うことができる。例えば、アミノ酸レベルでは、Ｘ線構造から決定される、同じアミノ酸の残基のセットを有するエピトープ同士は、同一であると言われる。

【0160】

競合的結合を特徴とするエピトープ同士は、対応する抗体の結合が相互に排他的である場合、すなわち、１つの抗体の結合が別の抗体の同時または順次の結合を排除する場合、重複している、と言われ、エピトープ同士は、抗原が両方の対応する抗体に同時に結合することができる場合、別個（固有）であると言われる。

【0161】

ある特定の抗体／抗原ペアにおけるエピトープ及びパラトープは、特定の常法によって同定することができる。例えば、あるエピトープの一般的な位置は、本明細書の他の箇所により詳しく記載しているように、異なるフラグメントまたは変異体ポリペプチドに結合する抗体の能力を評価することによって決定することができる。抗体内の他の特定の残基と接触するＯＸ４０内の特定の残基も、常法を用いて決定することができる。例えば、抗体／抗原複合体は結晶化させることができる。結晶構造を決定して、抗体と抗原との間の特異的相互作用部位を同定するために使用することができる。

【0162】

「特異的に結合する」及び「特異的結合」という用語、ならびにかかる特異的結合を測定する方法は、当該技術分野では周知のものである。ある分子は、別の細胞または物質に対するよりも、より高い頻度で、より迅速に、より長時間及び／またはより高い親和性で特定の細胞または物質と反応または結合する場合に、「特異的結合」を示すと言われる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、他の物質に対するよりも、より高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／またはより長時間で結合する場合に、標的と「特異的に結合する」。

【0163】

例えば、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、他の抗原との結合よりも、より高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／またはより長時間でその同族抗原と結合するものである。より具体的には、抗ＯＸ４０抗体は、標準的な結合アッセイ条件下でヒトＯＸ４０に特異的に結合し得るが、試料中の他の分子は実質的に認識しないかまたはこれと結合しない。第１の標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の標的に特異的に結合する場合も、しない場合もある点は理解されよう。したがって、「特異的結合」は必ずしも排他的な結合を必要としない（ただしそれを含み得る）。一般に、必ずしもではないが、「結合」と言った場合には、特異的結合を意味する。

【0164】

さまざまな方法を使用して、目的の分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを選択することができる。抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを同定するために使用され得る多くの方法の中に、例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、免疫沈降法、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＫｉｎＥｘＡ、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）及びウエスタンブロット分析がある。通常、特異的結合は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、より多くの場合、バックグラウンドの少なくとも１０倍、バックグラウンドの少なくとも５０倍、バックグラウンドの少なくとも１００倍、バックグラウンドの少なくとも５００倍、バックグラウンドの少なくとも１０００倍、またはバックグラウンドの少なくとも１万倍のシグナルを生成する。

【0165】

抗体結合の特異性は、抗体とＯＸ４０との特異的結合のＫ_Ｄ値を、コントロールがＯＸ４０に結合しないことが分かっている、ＯＸ４０とコントロールとの結合のＫ_Ｄ値と比較することによって評価することができる。一般に、抗体は、Ｋ_Ｄが約×１０^－５Ｍ以下である場合に抗原に「特異的に結合する」と言われる。

【0166】

抗体またはその抗原結合フラグメントは、他の抗原に対する結合よりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／またはより長時間で抗原に結合しない場合、抗原に「実質的に結合しない」。通常、結合は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの２倍以下のシグナルを生成する。一般に、それは、１×１０^－４Ｍ以上、１×１０^－３Ｍ以上、１×１０^－２Ｍ以上、または１×１０^－１Ｍ以上のＫ_Ｄで抗原に結合する。

【0167】

抗体に関して本明細書で使用する場合、「競合する」という用語は、抗原への第１の抗体またはその抗原結合部分の結合が、同じ抗原の第２の抗体またはその抗原結合部分へのその後の結合を減少させることを意味する。一般に、第１の抗体の結合は、立体障害、コンフォメーション変化を生じさせるか、または共通のエピトープ（またはその一部）に対する第２の抗体の結合を減少させる。標準的な競合結合アッセイを用いて、２つの抗体が互いに競合するか否かを判定することができる。

【0168】

抗体競合分析のための１つの適切なアッセイでは、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を使用するが、この技術は、一般的にはバイオセンサシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなど）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して相互作用の程度を測定することができる。例えば、ＳＰＲをインビトロ競合結合阻害アッセイで使用することで、１つの抗体が第２の抗体の結合を阻害する能力を測定することができる。ＥＬＩＳＡ法に基づいた別の抗体競合の測定法もある。さらに、抗体競合に基づいて抗体を「ビニング」するための高スループット法がＷＯ２００３／４８７３１に記載されている。１つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、別の抗体またはその抗原結合フラグメントのＯＸ４０への結合を減少させる場合、競合が存在する。例えば、逐次結合競合アッセイは、異なる抗体を逐次的に加えることによって使用することができる。具体的には、第１の抗体は、結合飽和状態に近いレベルまで加えることができる。次いで、第２の抗体を加える。ＯＸ４０に対する第２の抗体の結合が、第１の抗体の非存在下での平行アッセイ（この値を１００％として設定することができる）と比較して、検出可能でないかまたは有意に減少している（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の減少）場合、２つの抗体は、互いに競合すると考えられる。

【0169】

抗原に対する抗体の結合を、その標的の別の結合パートナー（例えば、別の抗体または他の形で標的に結合する可溶性受容体）による標的の結合と比較する競合結合アッセイを行うこともできる。５０％阻害が生じる濃度は、Ｋ_ｉとして知られる。理想条件下では、Ｋ_ｉは、Ｋ_Ｄと等価である。したがって、一般に、Ｋ_ｉの測定値を、Ｋ_Ｄの上限値を与えるために便宜上置き換えることができる。異なる分子相互作用に関連する結合親和性、例えば、特定の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較を、個々の抗体／抗原複合体のＫ_Ｄ値の比較によって評価することができる。抗体または他の結合パートナーのＫ_Ｄ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。

【0170】

「Ｆｃ融合」タンパク質という用語は、１つ以上のポリペプチドがＦｃポリペプチドと機能的に連結されたタンパク質である。Ｆｃ融合体は、免疫グロブリンのＦｃ領域を融合パートナーと組み合わせたものである。「Ｆｃ領域」は、Ｆｃ領域の天然配列またはＦｃ領域のバリアントであってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、２２６位のＣｙｓまたは２３０位のＰｒｏのアミノ酸残基からそのカルボキシル末端にわたるものとして定義される。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載されるＥＵインデックスのものである。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、ＣＨ_２及びＣＨ_３の２つの定常ドメインを含んでいる。当該技術分野では周知であるように、Ｆｃ領域は、ダイマーまたはモノマーのいずれかの形で存在し得る。

【0171】

「治療有効量」という用語は、意図される目的を達成するのに十分な量の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、またはかかる抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組み合わせの量を意味する。正確な量は、治療組成物の成分及び物理的特性、意図される患者集団、個々の患者の詳細などを含むがこれらに限定されない多くの要因に依存し、当業者によって決定され得る。

【0172】

「治療」という用語は、予防的及び／または治療的処置を含む。疾患、障害、または状態のあらゆる臨床徴候または症状の発現の前に投与される場合、処置は予防的であると考えられる。治療的処置には、例えば、疾患、障害、もしくは状態を改善するまたはその重症度を低減すること、または疾患、障害、もしくは状態の長さを短縮することが含まれる。

【0173】

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、ある値の±１０％を指す。

【0174】

治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗ヒトＯＸ４０抗体はいずれも、特定の治療方法に使用することができる。

【0175】

一態様では、本明細書で提供される抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は医薬組成物に使用される。別の態様では、本明細書で提供される抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体はがんの治療に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は治療方法として使用される。他の実施形態では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、対象に治療有効量の抗ヒトアゴニストＯＸ４０抗体を投与することを含む、方法を提供する。１つのかかる実施形態において、方法は、対象に、例えば下記に記載されるような、治療有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む。

【0176】

一態様では、治療有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体の免疫機能を増強（例えば、細胞媒介性免疫応答の増加によって）するのに使用される抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。別の態様では、治療有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体のＴ細胞機能を増強するのに使用される抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。別の態様では、治療有効量の抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体を個体に投与することを含む、ヒトＯＸ４０発現細胞（例えば、ＯＸ４０発現Ｔ細胞、例えば、ＯＸ４０発現Ｔｒｅｇ）を枯渇させるのに使用される抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。いくつかの実施形態では、枯渇はＡＤＣＣにより実現される。他の実施形態では、枯渇は食作用により実現される。腫瘍免疫を有する個体を治療するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。

【0177】

さらなる態様では、感染症（例えば、細菌またはウイルスまたは他の病原体によって引き起こされる感染症）を治療するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本発明は、感染症を有する対象を治療するための方法であって、治療有効量の抗ヒトアゴニストＯＸ４０抗体を個体に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、感染症は、ウイルス及び／または細菌によって引き起こされる。別の実施形態では、感染症は、他の病原体によって引き起こされる。

【0178】

別の実施形態において、本発明は、抗ＯＸ４０抗体の製造または調製を含む医薬組成物の使用を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、がんを治療するためのものである。別の実施形態では、本発明は、がんを有する対象を治療するための方法であって、治療有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法を提供する。１つのかかる実施形態において、方法は、個体に、例えば下記に記載されるような、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む。

【0179】

一態様では、医薬組成物は、がんを有する個体の免疫機能を増強させる（例えば、細胞媒介性免疫応答を増加させることによって）ために使用され、治療有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む。別の態様では、医薬組成物は、がんを有する個体のＴ細胞機能を増強するために使用するためのものであって、治療有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞機能不全疾患はがんである。一態様では、医薬組成物は、ヒトＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞、例えば、ＯＸ４０発現Ｔ細胞）を枯渇させるために使用するためのものであって、治療有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む。一実施形態では、枯渇はＡＤＣＣにより実現される。別の実施形態では、枯渇は食作用により実現される。別の態様では、医薬組成物は、腫瘍免疫を有する個体を治療するためのものである。

【0180】

さらなる態様では、感染症（例えば、細菌、ウイルス、または他の病原体によって引き起こされる感染症）の治療に使用される医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、医薬組成物は、感染症を有する個体を治療するために使用され、治療有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む。一実施形態では、感染症は、ウイルス及び／または細菌によって引き起こされる。別の実施形態では、感染症は、他のいくつかの病原体によって引き起こされる。

【0181】

さらなる態様では、本発明はがんを治療するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、がんを有する個体に治療有効量の抗ＯＸ４０抗体を投与することを含む。１つのかかる実施形態において、方法は、個体に、下記に記載されるような、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤を投与することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかに記載される「個体」とは、ヒトであり得る。

【0182】

一態様では、がんを有する個体の免疫機能を増強する（例えば、細胞媒介性免疫応答を増加させることによって）ための方法であって、治療有効量の抗ヒトアゴニストＯＸ４０抗体を個体に投与することを含む、方法が提供される。一態様では、がんを有する個体のＴ細胞機能を増強するための方法であって、治療有効量の抗ヒトアゴニストＯＸ４０抗体を個体に投与することを含む、方法が提供される。別の態様では、ヒトＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞、例えば、ＯＸ４０発現Ｔ細胞）を枯渇させるための方法であって、治療有効量の抗ヒトアゴニストＯＸ４０抗体を個体に投与することを含む、方法が提供される。一実施形態では、枯渇はＡＤＣＣにより実現される。別の実施形態では、枯渇は食作用により実現される。別の実施形態では、腫瘍免疫を有する個体を治療するための抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が提供される。

【0183】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるがんとしては、これらに限定されるものではないが、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（例えば脳腫瘍に関連するもの）、Ｂ細胞増殖性疾患、及びＭｅｉｇｓ症候群に関連する異常血管増殖がさらに挙げられる。より具体的な例としては、これらに限定されるものではないが、再発性または難治性ＮＨＬ、フロントライン低悪性度ＮＨＬ、第ＩＩＩ／ＩＶ病期ＮＨＬ、化学療法耐性ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病及び／またはリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病及び／または前リンパ球性白血病及び／または小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫及び／またはリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、結節外辺縁帯－ＭＡＬＴリンパ腫、結節性辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞腫及び／または形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心リンパ腫（濾胞性）、中悪性度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、侵攻性ＮＨＬ（侵攻性フロントラインＮＨＬ及び侵攻性再発性ＮＨＬを含む）、自家幹細胞移植後に再発するまたはそれに対して不応性のＮＨＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体（末梢）大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び／またはセザリー症候群、皮膚（ｓｋｉｎ（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ））リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、及び血管中心性リンパ腫が挙げられる。

【0184】

他の実施形態では、がんの例としては、これらに限定されるものではないが、Ｂ細胞増殖性疾患が挙げられ、Ｂ細胞増殖性疾患としては、これらに限定されるものではないが、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病がさらに挙げられる。かかるリンパ腫及びリンパ性白血病としては、例えば、ａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（地域性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、及び非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（結節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、及び脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞型リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫－肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）、ｆ）有毛細胞性リンパ腫、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ｈ）急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞腫瘍、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、及び／またはｊ）ホジキン病が挙げられる。

【0185】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、がんは、Ｂ細胞増殖性疾患である。他の実施形態では、Ｂ細胞増殖性疾患は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、侵襲性ＮＨＬ、再発性侵襲性ＮＨＬ、再発性緩慢性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性緩慢性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、またはマントル細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞増殖性疾患は、緩慢性ＮＨＬ及び／または侵襲性ＮＨＬなどのＮＨＬである。別の実施形態では、Ｂ細胞増殖性疾患は、緩慢性濾胞性リンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。

【0186】

さらなる態様において、本発明は、上記の治療方法のいずれかに記載されるいずれかの抗ＯＸ４０抗体を含むいくつかの医薬製剤を提供する。一実施形態では、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む。別の実施形態では、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体のうちのいずれかと、例えば下記に記載されるような、少なくとも１つのさらなる治療剤と、を含む。

【0187】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｔｒｅｇの機能を阻害することにより（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害することにより）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を殺滅することにより、ならびにエフェクターＴ細胞機能を増加させる、及び／またはメモリーＴ細胞機能を増加させることにより、腫瘍免疫を阻害する。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｔｒｅｇの機能を阻害することにより（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害することにより）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を殺滅することにより、ならびにエフェクターＴ細胞機能を増加させる、及び／またはメモリーＴ細胞機能を増加させることにより、がんを治療する。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｔｒｅｇの機能を阻害することにより（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害することにより）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を殺滅することにより、ならびにエフェクターＴ細胞機能を増加させる、及び／またはメモリーＴ細胞機能を増加させることにより、免疫機能を増強する。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｔｒｅｇの機能を阻害することにより（例えば、Ｔｒｅｇの抑制機能を阻害することにより）、ＯＸ４０発現細胞（例えば、高レベルのＯＸ４０を発現する細胞）を殺滅することにより、ならびにエフェクターＴ細胞機能を増加させる、及び／またはメモリーＴ細胞機能を増加させることにより、Ｔ細胞機能を増強する。

【0188】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、阻害性抗ヒトアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体による治療は、細胞の枯渇（例えば、ＯＸ４０発現細胞または高レベルのＯＸ４０を発現する細胞の枯渇）をもたらす。一実施形態では、枯渇はＡＤＣＣにより実現される。別の実施形態では、枯渇は食作用により実現される。

【0189】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、エフェクター及び／またはメモリーＴ細胞機能（いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞及び／またはメモリーＴ細胞の増殖及び／またはサイトカイン分泌）のＴｒｅｇ抑制を阻害することによって、Ｔｒｅｇ機能を阻害する。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、エフェクターＴ細胞の増殖を増加させる。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、メモリーＴ細胞の増殖を増加させる。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、エフェクターＴ細胞のサイトカイン産生（例えば、インターフェロンγの産生）を増加させる。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、メモリーＴ細胞のサイトカイン産生（例えば、インターフェロンγの産生）を増加させる。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞の増殖及び／またはＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の増殖を増加させる。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、メモリーＴ細胞の増殖（例えば、ＣＤ４^＋メモリーＴ細胞の増殖）を増加させる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、個体のＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞の増殖、サイトカイン分泌及び／または細胞溶解活性を増強する。

【0190】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞の数は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前の数と比較して上昇する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞のサイトカイン分泌は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のレベルと比較して上昇する。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、個体のＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の増殖、サイトカイン分泌及び／または細胞溶解活性を増強する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の数は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前の数と比較して上昇する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞のサイトカイン分泌は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のレベルと比較して上昇する。

【0191】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ヒトエフェクター細胞に結合し、例えば、ヒトエフェクター細胞で発現するＦｃγＲに結合する。一実施形態では、ヒトエフェクター細胞は、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。別の実施形態では、ヒトエフェクター細胞は、食作用エフェクター機能を行う。

【0192】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、ＩｇＧ１Ｆｃポリペプチドバリアント（例えば、ヒトエフェクター細胞へのその結合を消失させる変異（例えば、ＤＡＮＡまたはＮ２９７Ｇ変異））を含む抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域の天然配列を有する抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体と比較して低下した活性（例えば、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞機能、例えば、増殖）を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドバリアント（例えば、ヒトエフェクター細胞へのその結合を消失させる変異（例えば、ＤＡＮＡまたはＮ２９７Ｇ変異））を含む抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、実質的な活性（例えば、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞機能、例えば、増殖）を有しない。

【0193】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体が機能するうえで抗体架橋が必要とされる。いくつかの実施形態では、機能は、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞増殖の刺激である。いくつかの実施形態では、抗体架橋能力は、固体表面（例えば、細胞培養プレート）上に接着した抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の量を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、抗体架橋能力は、抗体のＩｇＧ１ Ｆｃ領域に変異（例えば、ＤＡＮＡ変異またはＮ２９７Ｓ変異）を導入し、変異抗体の機能を試験することによって決定される。

【0194】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、個体におけるメモリーＴ細胞の増殖及び／またはサイトカイン分泌を増加させた。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、メモリーＴ細胞の数を増加させた。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、メモリーＴ細胞のサイトカイン分泌（レベル）を増加させた。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、個体におけるエフェクターＴ細胞のＴｒｅｇ抑制（例えば、増殖及び／またはサイトカイン分泌）を減少させた。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞の数は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前の数と比較して上昇する。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞のサイトカイン分泌（レベル）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のレベルと比較して上昇する。

【0195】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、腫瘍組織内（浸潤性）ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞の総数、または例えば、ＣＤ４５^＋細胞中のＣＤ４^＋細胞の割合）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前の数と比較して増加した。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、インターフェロンγ－を発現する腫瘍組織内（浸潤性）ＣＤ４^＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、インターフェロンγ－発現ＣＤ４^＋細胞の総数、または例えば、総ＣＤ４^＋細胞中のインターフェロンγ－発現ＣＤ４^＋細胞の割合）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前のそれらのレベルと比較して上昇した。

【0196】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、腫瘍組織内（浸潤性）ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の総数、または例えば、ＣＤ４５^＋細胞中のＣＤ８^＋の割合）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前の数と比較して増加した。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、インターフェロンγ－を発現する腫瘍組織内（浸潤性）ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、総ＣＤ８^＋細胞中のインターフェロンγ－を発現するＣＤ８^＋細胞の割合）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前の数と比較して増加した。

【0197】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、腫瘍組織内（浸潤性）Ｔｒｅｇの数（例えば、Ｔｒｅｇの総数、または例えば、ＣＤ４^＋細胞中のＦｏｘ３ｐ＋細胞の割合）は、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与前の数と比較して減少した。

【0198】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体の投与は、腫瘍抗原の投与と組み合わせて行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、核酸を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞である。

【0199】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、がんは、ヒトエフェクター細胞を保有する（例えば、ヒトエフェクター細胞によって浸潤されている）。ヒトエフェクター細胞を検出するための方法は、当該技術分野では周知のものであり、例えば、ＩＨＣが含まれる。いくつかの実施形態では、がんは、高いレベルのヒトエフェクター細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、ヒトエフェクター細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、及び単球のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、がんは、本明細書に記載のいずれかのがんである。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経芽腫、黒色腫、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、または肝細胞癌である。

【0200】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、がんは、ＦｃＲを発現する細胞を保有している（例えば、ＦｃＲを発現する細胞によって浸潤されている）。ＦｃＲを検出するための方法は、当該技術分野では周知のものであり、例えば、ＩＨＣが含まれる。いくつかの実施形態では、がんは、高いレベルのＦｃＲ発現細胞を保有している。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＦｃγＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、活性ＦｃγＲである。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、神経芽腫、黒色腫、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、または肝細胞癌である。

【0201】

上記の実施形態のいずれかによる「個体」または「対象」は、好ましくはヒトである。

【0202】

本発明の抗体は、単独で、または他の治療剤と併用して、使用することができる。例えば、本明細書に記載の抗体は、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与することができる。

【0203】

上記に記載のかかる併用療法には、併用投与（同じまたは別々の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個投与の両方が含まれ、本明細書に記載の抗体の投与を、１乃至複数のさらなる治療剤の投与の前、同時、及び／またはその後に行うことができる。一実施形態では、抗ＯＸ４０抗体の投与とさらなる治療剤の投与とは、互いの約１ヶ月以内、または約１、２、もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５、もしくは６日以内に行われる。本発明の抗体は、放射線療法と併用することもできる。

【0204】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、化学療法または化学療法剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、放射線療法または放射線療法剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、標的療法または標的療法剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、免疫療法または免疫療法剤、例えば、モノクローナル抗体と組み合わせて投与することができる。

【0205】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、オラパラニブ、ルカパリブ、ニラパリブ、セジラニブ、ＢＭＮ６７３、ベリパリブ）、トラベクテジン、ナブパクリタキセル（アルブミン結合パクリタキセル、ＡＢＲＡＸＡＮＥ）、トレバナニブ、パゾパニブ、セジラニブ、パルボシクリブ、エベロリムス、フルオロピリミジン（例えば、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ）、ＩＦＬ、レゴラフェニブ、レオリジン、アリムタ、ジカディア、スーテント、トーリセル（テムシロリムス）、インライタ（アキシチニブ、Ｐｆｉｚｅｒ）、アフィニトール（エベロリムス、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ネクサバール（ソラフェニブ、Ｏｎｙｘ／Ｂａｙｅｒ）、ヴォトリエント、パゾパニブ、アキシチニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ、ビンフルニン、Ｈｓｐ９０阻害剤（例えば、アパトルシン）、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ（ＣＴ－００７０）、テマゾロミド、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、サロミド、ダカルバジン、シクロホスファミド、レナリドマイド、アザシチジン、レナリドマイド、ボルテゾミド（ＶＥＬＣＡＤＥ）、アムルビシン、カルフィルゾミブ、プララトレキサート、及び／またはエンザスタウリンと組み合わせて投与することができる。

【0206】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＰＤ－１結合アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、及びＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストを含むがこれらに限定されないＰＤ－１軸結合アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。「ＰＤ－１」の別名としては、ＣＤ２７９及びＳＬＥＢ２がある。「ＰＤ－Ｌ１」の別名としては、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－４、ＣＤ２７４、及びＢ７－Ｈがある。ＰＤ－Ｌ２の別名としては、Ｂ７－ＤＣ、Ｂｔｄｃ、及びＣＤ２７３がある。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２は、ヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、リガンド結合パートナーへのＰＤ－１の結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２である。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、結合パートナーへのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ１リガンド結合パートナーは、ＰＤ－１及び／またはＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニストは、結合パートナーへのＰＤ－Ｌ２の結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ、ＯＰＤＩＶＯ）、Ｍｅｒｃｋ３４７５（ＭＫ－３４７５、ペムブロリズマブ）、及びＫＥＹＴＲＵＤＡＷＰＣＴ－０１１（ピジリズマブ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の細胞外またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、及びＭＤＸ－１１０５から選択される。ＭＤＸ－１１０５、別名ＢＭＳ－９３６５５９は、ＷＯ２００７／００５８７４に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、ＷＯ２０１０／０７７６３４Ａ１に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＭＤＸ－１１０６、別名ＭＤＸ－１１０６－０４、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、またはニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載される抗ＰＤ－１抗体である。Ｍｅｒｃｋ３４７５、別名ＭＫ－３４７５、ＳＣＨ－９００４７５、またはペムブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載される抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１、別名ｈＢＡＴ、ｈＢＡＴ－１、またはピジリズマブは、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載される抗ＰＤ－１抗体である。ＡＭＰ－２２４、別名Ｂ７－ＤＣＩｇは、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されるＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ－１１０６である。「ＭＤＸ－１１０６」の別名としては、ＭＤＸ－１ １０６－０４、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びニボルマブがある。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４）である。

【0207】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、活性化共刺激分子を標的とするアゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、活性化共刺激分子には、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、またはＣＤ１２７が含まれ得る。いくつかの実施形態では、活性化共刺激分子により標的とされるアゴニストは、ＣＤ４０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、またはＣＤ１２７に結合するアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、阻害性共刺激分子を標的とするアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、阻害性共刺激分子には、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２としても知られる）、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、またはアルギナーゼが含まれ得る。いくつかの実施形態では、阻害性共刺激分子により標的とされるアンタゴニストは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３（例えば、ＬＡＧ－３－ＩｇＧ融合タンパク質（ＩＭＰ３２１））、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＩＧＩＴ、ＭＩＣＡ／Ｂ、またはアルギナーゼに結合するアンタゴニスト抗体である。

【0208】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＴＬＡ－４（別名、ＣＤ１５２）を標的とするアンタゴニスト、例えば、遮断抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イピリムマブ（別名ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、またはヤーボイ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、トレメリムマブ（別名チシリムマブまたはＣＰ－６７５，２０６）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｂ７－Ｈ３（別名、ＣＤ２７６）を標的とするアンタゴニスト、例えば、遮断抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＧＡ２７１と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＴＧＦＰを標的とするアンタゴニスト、例えば、メテリムマブ（別名、ＣＡＴ－１９２）、フレソリムマブ（別名、ＧＣ１００８）、またはＬＹ２１５７２９９と組み合わせて投与することができる。

【0209】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＴＬ）の養子移入を含む治療と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＵＣＡＲＴ１９と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＷＴ１２８ｚと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＫＴＥ－Ｃ１９（Ｋｉｔｅ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ドミナントネガティブＴＧＦベータ受容体、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦベータＩＩ型受容体を含むＴ細胞の養子移入を含む治療と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＨＥＲＣＲＥＥＭ試験を含む治療と組み合わせて投与することができる（例えば、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号：ＮＣＴ００８８９９５４を参照）。

【0210】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ１９を標的とするアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｍ０Ｒ００２０８と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ３８に対するアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ダラツムマブと組み合わせて投与することができる。

【0211】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ１３７（別名、ＴＮＦＲＳＦ９、４－１ＢＢ、またはＩＬＡ）を標的とするアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ウレルマブ（別名、ＢＭＳ－６６３５１３）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ４０を標的とするアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＰ－８７０８９３と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＯＸ４０（別名、ＣＤ１３４）を標的とするアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、異なる抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＡｇｏｎＯＸ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ２７を標的とするアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤＸ－１１２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を標的とするアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、ＩＤＯアンタゴニストは、１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴとしても知られる）である。

【0212】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ１３７（別名、ＴＮＦＲＳＦ９、４－１ＢＢ、またはＩＬＡ）を標的とするアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ウレルマブ（別名、ＢＭＳ－６６３５１３）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ４０を標的とするアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＰ－８７０８９３またはＲＯ７００９７８９と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アゴニストの組み合わせＯＸ４０（別名、ＣＤ１３４）、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ２７を標的とするアゴニスト、例えば、活性化抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤＸ－１１２７（別名、バルリルマブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を標的とするアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。一実施形態では、ＩＤＯアンタゴニストは、１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴとしても知られる）である。別の実施形態では、ＩＤＯアンタゴニストは、ＷＯ２０１０／００５９５８（その内容を本明細書に記録により明示的に援用する）に記載されるものである。別の実施形態では、ＩＤＯアンタゴニストは、４－（｛２－［（アミノスルホニル）アミノ］エチル｝アミノ）－Ｎ－（３－ブロモ－４－フルオロフェニル）－Ｎ’－ヒドロキシ－１，２，５－オキサジアゾール－３－カルボキシイミドアミド（例えば、本明細書に記載のＷＯ２０１０／００５９５８の実施例２３に記載されるように）である。いくつかの実施形態では、ＩＤＯアンタゴニストは以下である。

【化1】

【0213】

いくつかの実施形態では、ＩＤＯアンタゴニストは、ＩＮＣＢ２４３６０である。いくつかの実施形態では、ＩＤＯアンタゴニストは、インドキシモド（１－メチル－トリプトファンのＤ異性体）である。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗体薬物複合体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗体薬物複合体は、メルタンシンまたはモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＮａＰｉ２ｂ抗体－ＭＭＡＥ複合体（別名、ＤＮＩＢ０６００Ａ、ＲＧ７５９９、またはリファスツズマブベドチン）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、トラスツズマブエムタンシン（別名、Ｔ－ＤＭ１、アド－トラスツズマブエムタンシン、またはＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＭＵＣ１６抗体－ＭＭＡＥ複合体であるＤＭＵＣ５７５４Ａと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＭＵＣ１６抗体－ＭＭＡＥ複合体であるＤＭＵＣ４０６４Ａと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エンドセリンＢ受容体（ＥＤＮＢＲ）を標的とする抗体薬物複合体、例えば、ＭＭＡＥと結合されたＥＤＮＢＲを標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、リンパ球抗原６複合体Ｅ遺伝子座（Ｌｙ６Ｅ）を標的とする抗体薬物複合体、例えば、ＭＭＡＥと結合されたＬｙ６Ｅを標的とする抗体（別名、ＤＬＹＥ５９５３Ａ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ポラツズマブベドチンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ３０を標的とする抗体薬物複合体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（別名、ブレンツキシマブベドチン）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ポラツズマブベドチンと組み合わせて投与することができる。

【0214】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、血管新生阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ－Ａを標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ（別名、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アンジオポエチン２（別名、Ａｎｇ２）を標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＥＤＩ３６１７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ラムシルマブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アフリベルセプトと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ｚｉｖ－アフリベルセプト（別名、ＶＥＧＦトラップまたはＺａｌｔｒａｐ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＲＧ７２２１（別名、バヌシズマブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、血管新生阻害剤、及びＰＤ－１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１結合アンタゴニスト、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、及び抗ＰＤ－Ｌ２抗体などのＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ、及びＰＤ－１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１結合アンタゴニスト、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、及び抗ＰＤ－Ｌ２抗体などのＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ及びＭＤＸ－１１０６（ニボルマブ、ＯＰＤＩＶＯ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ及びＭｅｒｃｋ３４７５（ＭＫ－３４７５、ペンブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ及びＣＴ－０１１（ピジリズマブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ及びＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ及びＭＰＤＬ３２８０Ａと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ及びＭＥＤＩ４７３６と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベバシズマブ及びＭＤＸ－１１０５と組み合わせて投与することができる。

【0215】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＳＦ－１Ｒ（別名、Ｍ－ＣＳＦＲまたはＣＤ１１５）を標的とする薬剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体（別名、ＩＭＣ－ＣＳ４またはＬＹ３０２２８５５）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であるＲＧ７１５５（別名、ＲＯ５５０９５５４またはエマクツズマブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、インターフェロン、例えば、インターフェロンαまたはインターフェロンγと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ（別名、組換えインターフェロンα－２ａ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＭ－ＣＳＦ（別名、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム、またはＬｅｕｋｉｎｅ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－２（別名、アルデスロイキンまたはＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１２と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１５と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＬＴ－８０３と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ２０を標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０を標的とする抗体は、オビヌツズマブ（別名、ＧＡ１０１またはＧａｚｙｖａ（登録商標））またはリツキシマブである。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＩＴＲを標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、ＧＩＴＲを標的とする抗体は、ＴＲＸ５１８である。いくつかの実施形態では、ＧＩＴＲを標的とする抗体は、ＭＫ０４１６６（Ｍｅｒｃｋ）である。

【0216】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イブルチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）及び／またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＧ－１２０（Ａｇｉｏｓ）と組み合わせて投与することができる。

【0217】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、オビヌツズマブ、及びＰＤ－１軸結合アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１結合アンタゴニスト、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などのＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト、及び抗ＰＤ－Ｌ２抗体などのＰＤ－Ｌ２結合アンタゴニスト）と組み合わせて投与することができる。

【0218】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、がんワクチンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、ペプチドがんワクチンである。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、個別化がんワクチンである。いくつかの実施形態では、ペプチドがんワクチンは、多価長ペプチド、マルチペプチド、ペプチドカクテル、ハイブリッドペプチド、またはペプチドパルス樹状細胞ワクチンである（例えば、Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，１０４：１４－２１，２０１３を参照）。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アジュバントと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＴＬＲアゴニスト、例えば、Ｐｏｌｙ－ＩＣＬＣ（別名、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、ＬＰＳ、ＭＰＬ、またはＣｐＧ ＯＤＮを含む治療薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＨＭＧＢ１と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１０アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－４アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１３アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ－１７アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＨＶＥＭアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＣＯＳアゴニスト、例えば、ＩＣＯＳ－Ｌ、またはＩＣＯＳを標的とするアゴニスト抗体の投与と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＸ３ＣＬ１を標的とする治療薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＸＣＬ９を標的とする治療薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＸＣＬ１０を標的とする治療薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＣＬ５を標的とする治療薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＬＦＡ－１またはＩＣＡＭ１アゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、セレクチンアゴニストと組み合わせて投与することができる。

【0219】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベムラフェニブ（別名、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ダブラフェニブ（別名、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）と組み合わせて投与することができる。

【0220】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エルロチニブ（別名、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ゲフィチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、アファチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、セツキシマブ（別名、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、パニツムマブ（別名、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ロシレチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＺＤ９２９１と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＥＫ１（別名、ＭＡＰ２Ｋ１）及び／またはＭＥＫ２（別名、ＭＡＰ２Ｋ２）などのＭＥＫ阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、コビメチニブ（別名、ＣＤＣ－０９７３またはＸＬ－５１８）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、トラメチニブ（別名、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ビニメチニブと組み合わせて投与することができる。

【0221】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）及びＭＥＫ阻害剤（例えば、ＭＥＫ１及び／またはＭＥＫ２（例えば、コビメチニブまたはトラメチニブ））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＲＫの阻害剤（例えば、ＥＲＫ１／２）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＤＣ－０９９４と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、及びＥＲＫ１／２の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＧＦＲの阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、及びＥＲＫ１／２の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、１つ以上のＭＡＰキナーゼ経路阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＫ１２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｋ－Ｒａｓの阻害剤と組み合わせて投与することができる。

【0222】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、オナルツズマブ（別名、ＭｅｔＭＡｂ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＦ８０２（別名、ＣＨ５４２４８０２またはアレクチニブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、クリゾチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、セリチニブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ブパルリシブ（ＢＫＭ－１２０）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ピクチリシブ（別名、ＧＤＣ－０９４１）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ブパルリシブ（別名、ＢＫＭ－１２０）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ペリホシン（別名、ＫＲＸ－０４０１）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のδ選択的阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イデラリシブ（別名、ＧＳ－１１０１またはＣＡＬ－１０１）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、タセリシブ（ｔａｓｅｌｉｓｉｂ）（別名、ＧＤＣ－００３２）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＢＹＬ－７１９と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ａｋｔの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＫ２２０６と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＳＫ６９０６９３と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イパタセルチブ（別名、ＣＤＣ－００６８）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ｍＴＯＲの阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、シロリムス（別名、ラパマイシン）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、テムシロリムス（別名、ＣＣＩ－７７９またはＴｏｒｉｓｅｌ（登録商標））と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エベロリムス（別名、ＲＡＤ００１）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、リダフォロリムス（別名、ＡＰ－２３５７３、ＭＫ－８６６９、またはデフォロリムス）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＯＳＩ－０２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＡＺＤ８０５５と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＮＫ１２８と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、二重ＰＢＫ／ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＸＬ７６５と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＤＣ－０９８０と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＢＥＺ２３５（別名、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＢＧＴ２２６と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＳＫ２１２６４５８と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＰＦ－０４６９１５０２と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＰＦ－０５２１２３８４（別名、ＰＫＩ－５８７）と組み合わせて投与することができる。

【0223】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、エストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＧＤＣ－０９２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＨＥＲ３の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ドゥリゴツズマブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＬＳＤ１の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＤＭ２の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＢＣＬ２の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ベネトクラクスと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＨＫ１の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤＣ－０５７５と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、活性化ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＥＲＩＶＥＤＧＥと組み合わせて投与することができる。

【0224】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、放射線療法と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ゲムシタビンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ｎａｂ－パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、トラスツズマブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＴＶＥＣと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＩＬ２７と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、シクロホスファミドと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、腫瘍にＴ細胞を動員する薬剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、リリルマブ（ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ－９８６０１５）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、イデラリシブと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ３及びＣＤ２０を標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＲＥＧＮ１９７９と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＣＤ３及びＣＤ１９を標的とする抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ブリナツモマブと組み合わせて投与することができる。

【0225】

いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、カルボプラチン及びｎａｂ－パクリタキセルと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、カルボプラチン及びパクリタキセルと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、シスプラチン及びペメトレキセドと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、シスプラチン及びゲムシタビンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＦＯＬＦＯＸと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＦＯＬＦＩＲＩと組み合わせて投与することができる。

【0226】

上記に述べた併用療法は、併用投与（同じまたは別々の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる場合）及び別個投与の両方が含まれ、本明細書に記載の抗体の投与を、さらなる治療剤及び／またはアジュバントの投与の前、同時、及び／またはその後に行うことができる。本発明の抗体は、放射線療法と併用することもできる。

【0227】

本発明の抗体（及び任意のさらなる治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所治療が望ましい場合には病変内投与を含む、任意の適当な手段によって投与することができる。非経口投与としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が一時的であるかまたは長期的であるかに一部基づいて、例えば静脈内または皮下注射などの注射によるなど、任意の適当な投与経路によって行うことができる。本明細書で提供されるさまざまな投薬スケジュールとしては、これらに限定されるものではないが、異なる時点にわたった単回または複数回投与（例えば、ボーラス投与）及びパルス点滴が挙げられる。

【0228】

本発明の抗体は、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）に沿った形で、製剤化、投薬、投与される。この関連での考慮事項の要因としては、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、疾患の原因、医薬組成物の送達部位、投与方法、投与のスケジュール管理、及び医療従事者に周知の他の要因が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、対象とする疾患を予防または治療するために現時点で用いられている１つ以上の薬剤とともに製剤化することができる。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害及び治療の種類、及び上記に記載した他の要因に依存する。これらの他の薬剤は、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量で、本明細書に記載される投与経路により、または本明細書に記載される投薬量の約１％～９９％で、または適切であると経験的／臨床的にみなされる任意の投薬量及び投与経路を用いて使用される。

【0229】

疾患の予防または治療に関して、本明細書に記載される抗体の適切な投薬量は（単独で、または１つ以上の他のさらなる治療剤と併用される場合）、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるかまたは治療目的で投与されるか、以前の療法、患者の病歴、及び抗体への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、１回または一連の投与で患者に投与され得る。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、患者への１回以上の別個の投与によるものであれ、連続注入によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇの抗体を、初期候補投薬量とすることができる。一般的な１日の投薬量は、上記に述べた要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲とすることができる。病態に応じて数日間またはより長い日数にわたる反復投与の場合、治療は、一般に、所望の転帰、例えば疾患進行の抑制が得られるまで持続される。医薬組成物は、断続的に、例えば、毎週または３週間毎に（例えば、患者に抗体の約２～約２０回、または例えば、約６回用量が投与されるように）投与することができる。最初のより高い負荷用量を投与した後、１つ以上のより低い用量を投与してもよい。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。治療の進行は、従来の技術及び方法によって容易に監視される。

【0230】

上の製剤または治療方法のうちのいずれも、抗ＯＸ４０抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫複合体を使用して行われ得ることが理解される。

【0231】

特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＯＸ４０抗体の静脈内（ＩＶ）注入は、３、４、５、６、７、または８週毎に患者に投与される。患者１人当たりの抗ＯＸ４０抗体の用量は、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、または５００ｍｇとすることができる。特定の実施形態では、患者は、腎細胞癌、肝細胞癌、または頭頸部扁平上皮癌を有し得る。

【0232】

特定の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、患者の血液及び腫瘍微小環境中の免疫細胞に対する以下の望ましい変化の１つ以上を実現するために所定の用量及び投与レジメンで患者に投与される：
・フローサイトメトリーによって測定される、患者の末梢血由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞上の増殖（例えば、Ｋｉ６７）及び活性化（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５）マーカーの割合の増加、
・フローサイトメトリーによって測定される、患者の末梢血由来のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞上の抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０受容体レベル及び占有率レベル、及び
・患者由来のマッチさせた治療前及び治療後の腫瘍生検組織に対する多重免疫組織化学法（ｍＩＨＣ）または多重免疫蛍光法（ｍＩＦ）によって測定される、標的の関与（例えば、ＯＸ４０の下方制御）、ＣＤ８^＋、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖（例えば、Ｋｉ６７の上方制御）。

【0233】

特定の実施形態では、本明細書における抗ＯＸ４０抗体の用量及び投与頻度は、患者への反復投与の際に十分なピーク対トラフ比及び最小蓄積量を有する曝露プロファイルが得られるように選択または決定され、それによって、長期の受容体飽和及びその後のＴ細胞枯渇を防止することで患者の持続的な免疫媒介抗腫瘍活性が実現される。

【0234】

他の実施形態では、本明細書における抗ＯＸ４０抗体の用量及び／または投与頻度は、曝露プロファイルと、上記に述べたような患者の免疫細胞及び／またはＴＭＥにおける所望の変化などの薬力学（ＰＤ）所見とを併せて選択または決定される。

【実施例】

【0235】

実施例１：抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の調製
抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の重鎖及び軽鎖のコーディングヌクレオチド配列（配列番号２４及び３２）を合成し（ＪｉｎＷｅｉｚｈｉ Ｃｏｍｐａｎｙ）、それぞれｐＦＵＳＥベクターにクローニングした。重鎖及び軽鎖のヌクレオチドコード配列を含むプラスミドを、ＰＥＩを１：１の比で用いて２９３Ｆ浮遊細胞に一過性に同時トランスフェクトして、完全長抗体を発現させた。１週間のインキュベーション後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ プレパックカラムを用いてＡＫＴＡシステムで抗体を精製した。

【0236】

実施例２ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合特性
実施例２．１ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１及びＯＸ４０タンパク質の結合特性
試験前ＥＬＩＳＡを行うため、参照例１、参照例２、参照例３、参照例４、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、及びアイソタイプコントロールを含む、５μｇ／ｍｌの抗ＯＸ４０抗体で９６ウェルプレートを一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ａ６００３３２－０１００）で３７℃で２時間ブロックし、次いで規定の濃度のビオチン化ＯＸ４０組換えタンパク質を添加した。

【0237】

ビオチン化ＯＸ４０組換えタンパク質の抗ＯＸ４０抗体への結合に基づいてＥＣ８０を測定した。図１Ａに示されるように、参照例１のＥＣ８０は０．０９ｎＭであり、参照例２のＥＣ８０は０．２２ｎＭであり、参照例３のＥＣ８０は０．１６ｎＭであり、参照例４のＥＣ８０は０．２４ｎＭであり、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ８０は０．７１ｎＭであり、ＯＸ４０ＬのＥＣ８０は１．６ｎＭである。

【0238】

実施例２．２：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１と２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたＯＸ４０タンパク質の結合特性
ヒトＯＸ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号ＨＧ１０４８１－ＵＴ）、カニクイザルＯＸ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号ＣＧ９０８４６－ＵＴ）、マウスＯＸ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号ＭＧ５０８０８－ＵＴ）またはヒトＣＤ４０（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号ＨＧ１０７７４－ＵＴ）を含むＯＸ４０を過剰発現させるため、これらの標的をコードしたＤＮＡプラスミドを、Ｌｉｐｕｓｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１５３３８１００）の使用説明書に従って２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。使用する２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。結合親和性を測定するため、回収した細胞を、規定の濃度の一次抗体ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１と４℃で１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９８５９６）と室温で３０分間インキュベートした。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１結合の検出は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターによって行った。

【0239】

図１Ｂに示されるように、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたヒトＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合のＥＣ５０は２ｎＭ（ＭＦＩ）である。

【0240】

図１Ｃに示されるように、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたカニクイザルＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合のＥＣ５０は２．９ｎＭ（ＭＦＩ）である。

【0241】

図１Ｄに示されるように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたマウスＯＸ４０タンパク質には結合しない（ＭＦＩ）。

【0242】

図１Ｅに示されるように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ４０タンパク質には結合しない（ＭＦＩ）。

【0243】

２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたヒトＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、参照例１、参照例２、参照例３、及び参照例４の結合のＥＣ５０を図１Ｆに示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．０２ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例１のＥＣ５０は２．６７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例２のＥＣ５０は４．１７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例３のＥＣ５０は１．９２ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例４のＥＣ５０は２．１１ｎＭ（ＭＦＩ）である。

【0244】

２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたカニクイザルＯＸ４０タンパク質に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、参照例１、参照例２、参照例３、及び参照例４の結合のＥＣ５０を図１Ｇに示す。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は２．９４ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例１のＥＣ５０は２．９１ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例２のＥＣ５０は６．１３ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例３のＥＣ５０は２．５７ｎＭ（ＭＦＩ）であり、参照例４のＥＣ５０は３．５４ｎＭ（ＭＦＩ）である。

【0245】

実施例３ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性
実施例３．１ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性
抗ＯＸ４０抗体は、その作用様式に従って２つのクラスに分けることができる。ＯＸ４０アゴニスト活性の第１のクラスはＦｃ受容体の架橋に依存しないが、他方のクラスは、ＯＸ４０アゴニスト活性を有するためにＦｃ受容体の架橋を必要とする。腫瘍組織及び周囲の流入領域リンパ節は、より多くの既存の腫瘍関連炎症細胞を有し、Ｆｃ受容体ＦｃγＲ２ｂは、腫瘍細胞の周囲でより多くの凝集を有する。したがって、「架橋抗体」アゴニストはより高い組織選択性を有する。これらの抗体アゴニストは、腫瘍微小環境においてのみ明らかなアゴニスト効果を生じ、正常な体組織では低レベルに維持されることから、治療安全性が高くなる。

【0246】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を測定するため、９６ウェルプレートを５μｇ／ｍｌのＦｃ特異的抗ヒトＩｇＧ抗体で一晩コーティングした（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＡＢ３７０１２７５）。ヒトＯＸ４０を構成的に発現する、ＮＦ－ｋｂ応答エレメントの制御下でＧＦＰ遺伝子を発現する組換えＪｕｒｋａｔレポーター細胞を使用した。規定の濃度のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１及び１×１０^５Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を１つのウェルに添加した。別の実験では、協調的効果を調べるために、５０ｎＭ ＯＸ４０Ｌ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＯＸＬ－Ｈ５２Ｑ８）をＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１と共に加えた。２４時間のインキュベーション後、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を回収し、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターを用いてＧＦＰ陽性シグナルにより測定した。

【0247】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性は、抗ヒトＩｇＧ架橋依存性である。図２Ａに示されるように、抗ヒトＩｇＧと架橋される場合、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０は、２．９ｎＭ（ＧＦＰのＭＦＩ）である。図２Ｂに示されるように、抗ヒトＩｇＧとの架橋がない場合、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＥＣ５０ははるかに大きく、三量体ＯＸ４０Ｌ組換えタンパク質単独で、ＮＦ－ｋｂシグナル伝達をＥＣ５０＝４５ｎＭ（ＧＦＰ ＭＦＩ）で活性化することができる。

【0248】

抗ヒトＩｇＧと架橋される場合、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、ＯＸ４０Ｌと相乗的なアゴニスト効果を示した。図２Ｃに示されるように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とＯＸ４０Ｌを互いに組み合わせると、個々の成分が単独で作用する場合と比較して、ＧＦＰのＭＦＩが増加した。

【0249】

実施例３．２ 初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性
初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を測定するため、９６ウェルプレートを０．３μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１６－００３７－８１）及び５μｇ／ｍｌのＦｃ特異的抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＡＢ３７０１２７５）で一晩コーティングした。翌日、初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０４５－１０１）の使用説明書に従って回収した。規定の濃度のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１と２μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１６－０２８９－８１）を１×１０^５初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞と共に１つのウェルに加えた。別の実験では、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とＯＸ４０Ｌとの相乗効果を調べるため、５０ｎＭ ＯＸ４０Ｌ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＯＸＬ－Ｈ５２Ｑ８）をＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１と共に加えた。３日間のインキュベーション後、上清中のＩＬ－２分泌レベルを測定し、ヒトＩＬ－２ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ２０２－０５）の使用説明書に従って初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を評価した。

【0250】

初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性を調べるため、精製ＣＤ４^＋Ｔ細胞を１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体で予め活性化した。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１との架橋を促進するため、プレートを５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧでプレコーティングした。図２Ｄに示されるように、３日間のインキュベーション後、初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のアゴニスト活性をＩＬ－２分泌により測定したところ、得られたＥＣ５０は０．２ｎＭであった。
初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞において、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、ＯＸ４０Ｌと相乗的なアゴニスト効果を示した。図２Ｅに示されるように、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１と５０ｎＭ ＯＸ４０Ｌとのインキュベーションによって、個々の成分が単独で作用する場合と比較して、ＩＬ－２の分泌が増加した。

【0251】

実施例４ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の薬物動態試験
３８４ウェルプレートを、３０μｌ／ウェルＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２（Ｆｃ特異的）ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ、カタログ番号１０９－００６－０９８）で一晩コーティングした。ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、ＰＢＳ中に１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、及び２％ＢＳＡを含むブロッキング緩衝液を用いて３７℃で１時間、プレートをブロッキングした。次いで、１／１５０から開始して、マウス血清試料の３倍連続希釈物を１５μＬ／ウェルで加え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、二次ペルオキシダーゼ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩＲ、カタログ番号１０９－０３５－００３）を１／５０００希釈で加え、３７℃で１／２時間インキュベートした。ＴＭＢ基質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１１０１）を加え、さらに１５分間インキュベートした。最後に、ＥＬＩＳＡ停止液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎｇｇｕｏ Ｃｈａｎｇｓｈｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を加え、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｋｙマイクロプレート分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて４５０ｎｍでプレートを読み取った。

【0252】

ｈＯＸ４０ノックインマウス（１３１、１３２、１３３、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｏｄｅｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒより購入）に１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１を静脈内投与した。マウス血清を、投与の１時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、及び１９６時間後に採取した。図３に示されるように、ｈＯＸ４０－ＫＩマウス血清中のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の半減期は２４時間であると決定された。時間０のデータポイントは、上から下に１３１、１３２、及び１３３である。

【0253】

実施例５ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のインビボでの抗腫瘍効力
ｈＯＸ４０ノックインマウスを、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｏｄｅｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから購入した。５日間の隔離後、各マウスに、１００μｌのＰＢＳ中の８×１０^５個のＭＣ３８腫瘍細胞（Ｎａｎｋａｉ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＺｈａｎｇ Ｈｏｎｇｋａｉ教授より提供されたもの）を皮下接種した。腫瘍サイズが７０～１００ｍｍ^３に達した時点で、１００μｌのＰＢＳ中、１０ｍｇ／ｋｇ及びＱ３Ｄ×５でマウスに抗ＯＸ４０抗体を腹腔内投与することにより抗ＯＸ４０抗体処理を開始した。腫瘍サイズ及びマウスの体重を週２回測定した。各腫瘍の長径及び短径をキャリパーによって測定する。ｍｍ^３単位の腫瘍体積を、次式を用いて計算した：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（ただし、ａ及びｂは、それぞれ、腫瘍の長径及び短径を表す）。

【0254】

７日目：３５匹の８週齢マウスにＭＣ３８腫瘍細胞を接種した
－ＭＣ３８細胞はＺｈａｎｇ Ｈｏｎｇｋａｉ教授より得た
－マウス１匹当たり８×１０^５個のＭＣ３８細胞を接種した
０日目：平均腫瘍サイズは７５ｍｍ^３（４０～１２０ｍｍ^３）であった
－１群当たりマウス５匹の４つの群：
・ＰＢＳ
・参照抗体１
・ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１
・参照抗体２
－１０ｍｇ／ｋｇの抗体をＱ３Ｄ×５で腹腔内投与することにより開始。
１８日目：ＰＢＳコントロール群の腫瘍サイズは２０００ｍｍ^３に達した。マウスを屠殺した。
－組織：血液、ＬＮ、肝臓、脾臓、腫瘍
－表現型分析：Ｔ細胞 ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８；Ｔｒｅｇ ＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３；ＮＫ ＣＤ３／ＣＤ１６／ＣＤ５６

【0255】

図４Ａ及び図４Ｂに示されるように、この実験により、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、体重減少によって特徴付けられる副作用を引き起こすことなく、ＰＢＳコントロールと比較して腫瘍増殖を有意に阻害したことが示された。図４Ａにおいて、最も右側のデータポイントは、上から下に、ＰＢＳ、参照抗体１、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、及び参照抗体２であった。図４Ｂにおいて、左から右に、第２のデータセットは上から下に、ＰＢＳ、参照抗体１、参照抗体２、及びＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１であった。

【0256】

抗体用量反応の有効性を、ｈＯＸ４０ノックインマウスで行った。各処理群の情報は以下の通り：
第１群：ＰＢＳ：Ｑ３Ｄ×５、腹腔内；
第２群：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１：１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、Ｑ３／４Ｄ×５、腹腔内；
第３群：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１：０．１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、Ｑ３／４Ｄ×５、腹腔内；
第４群：参照抗体１：１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、Ｑ３Ｄ×５、腹腔内。
合計２０匹のｈＯＸ４０ノックインマウス、４つの群、１処理群当たりマウス５匹。

【0257】

マウスにＭＣ３８腫瘍細胞を接種した。平均腫瘍サイズが７５ｍｍ^３となった時点から開始して、０日目、３日目、６日目、１０日目、及び１３日目に合計５回の抗体注射を行った。腫瘍サイズ及びマウス体重を、３週間まで、または腫瘍サイズが２０００ｍｍ^３を上回るまで、週２回測定した。

【0258】

異なる用量のＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理下での腫瘍サイズ及び体重記録を図４Ｃ及び図４Ｄに示す。結果は、１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１による処理がインビボで最良の抗腫瘍効果を示すことを示唆した。

【0259】

実施例６ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のインビトロ特性評価
実施例６．１ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の加速安定性評価
抗体試料（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ、ロット番号ＣＰ１８１１３０００４）を、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ５０３０９６）によって１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した（ロット番号ＪＷ２０１８１２０３、ロット番号２０１９０６２４）。適切な量の濃縮抗体をきれいな６００μｌのチューブに移し、２５℃及び４０℃でそれぞれ７、１４及び３０日間インキュベートした。

【0260】

インキュベートした各試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。

【0261】

ＳＥＣ－ＨＰＬＣでは、５０μｇの各処理済み試料を注入し、流速０．７ｍＬ／分、４０分／試験、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ緩衝液中（１０×ＰＢＳ緩衝液（Ｓａｎｇｏｎ、カタログ番号Ｅ６０７０１６）－０５００からＭｉｌｌｉ－Ｑ純水を用いて希釈）で行い、ＵＶ２８０ｎｍの吸光度を検出した（４℃で保存した未処理試料も分析のためにロードした）。結果を表１に示した。２５℃及び４０℃で最大３０日間インキュベートした後、ＳＥＣ曲線でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の凝集または分解ピークの有意な増加は観察されず、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１が処理条件下で良好な安定性を有することを示した。４０℃で３０日間のインキュベーション後に観察されたわずかな分解は、高温での長期のインキュベーションにおける不安定性を示している可能性がある。

【表2】

【0262】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥの非還元条件及び還元条件下で各処理済み試料４μｇを４％～２０％グラジエントゲルにロードした。ゲルをトリス－グリシン緩衝液中１５０Ｖで１時間泳動し、染色溶液（ＴａＫａＲａ、カタログ番号Ｔ９３２０Ａ）中で１時間超染色した。次いで、図５Ａに示されるように、蒸留水中で数回脱色し、白色光プレート上で画像化した（４℃で保存した未処理試料も分析に使用した）。

【0263】

２５℃及び４０℃での３０日間のインキュベーション後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の明らかな凝集または分解バンドは観察されず、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がこのような処理条件下で良好な安定性を有することを示した。４０℃での３０日間のインキュベーション後の非還元ゲル上のわずかな分解バンド及び還元ゲル上の凝集バンドは、高温でのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の長期のインキュベーションの不安定性を示している可能性がある。

【0264】

実施例６．２ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の分解実験
１．低ｐＨストレス試験：
適切な量の抗体（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ）を６００μｌのチューブに移し、次いで、２Ｍ酢酸を１：２０の比（ｖ／ｖ、抗体試料に対する酸、最終ｐＨを約３．５に調整した）で加えた。試料をよく混合し、室温で０、３、または６時間インキュベートした。インキュベーション後、抗体溶液のｐＨを中和緩衝液で７．４に調整した（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０をインキュベーション試料に１３：１００（ｖ／ｖ）の比で加えた）。上記に記載したように試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（加速安定性実験を参照、注：４℃で保存した未処理の試料も分析のためにロードした）。

【0265】

２．高ｐＨストレス試験：
適切な量の抗体（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ）を６００μｌのチューブに移し、次いで、１Ｍ ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌを１：２５の比（ｖ／ｖ、最終ｐＨを約８．５に調整した）で加えた。試料をよく混合し、室温で０または６時間インキュベートした。上記に記載したように、各試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元条件のみの分析）により分析した。

【0266】

ＳＥＣ分析を表２に示す。対応するｐＨ３．５及びｐＨ８．５の溶液中での最大６時間のインキュベーション後、ＳＥＣ曲線でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の凝集または分解ピークの増加は観察されず、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がこのような処理条件下で良好な安定性を有することを示した。

【表3】

【0267】

図５Ｂに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。低ｐＨ及び高ｐＨの緩衝液中で最大６時間インキュベートした後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の変化は観察されず、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がこのような処理条件下で良好な安定性を有することを示した。

【0268】

実施例６．３ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の酸化ストレス実験
適切な量の抗体（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ）を６００μｌのチューブに移し、次いでＨ_２Ｏ_２（それぞれ０．１％及び１％）またはｔ－ＢＨＰ（最終０．１％まで）を加えた。十分に混合し、室温で０または６時間インキュベートした後、各試料を上記に述べたようにＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。

【0269】

注：１）４℃で保存した未処理の試料を分析のためにロードした。２）ＳＥＣランニングバッファーを１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８として調製した。

【0270】

表３にＳＥＣ分析を示した。対応する０．１％Ｈ_２Ｏ_２、１％Ｈ_２Ｏ_２、及び０．１％ｔ－ＢＨＰ（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド）溶液中で６時間インキュベートした後、ＳＥＣ曲線に有意なＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の変化は観察されず、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がこれらの処理条件下で良好な安定性を有することを示している。

【表4】

【0271】

図５ＣにＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。０．１％Ｈ_２Ｏ_２、１％Ｈ_２Ｏ_２、及び０．１％ｔ－ＢＨＰ（ｔ－ブチルヒドロペルオキシド）溶液中で６時間インキュベートした後、非還元ゲルでのわずかな分解を除いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の有意な変化は観察されず、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がこのような処理条件下で良好な安定性を有することを示した。

【0272】

実施例６．４ ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の凍結／解凍実験
抗体試料（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、３．１ｍｇ／ｍＬ、ロット番号ＣＰ１８１１３０００４）を、遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ５０３０９６）によって１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した（ロット番号ＪＷ２０１８１２０３）。適切な量の濃縮された抗体試料をきれいな６００μｌのチューブ（３×チューブ）に移し、試料を液体窒素中で２分間凍結し、室温の水浴中で解凍した。同じ手順を２回または４回、または更に多い回数で繰り返した。

【0273】

各試料を上記で述べたようにＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。注：１）４℃で保存した未処理の試料を分析した。２）ＳＥＣランニングバッファーは、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８で自己調製した。

【0274】

ＤＳＦを用いた熱安定性分析の場合：製造業者の指示に従って、ＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄプレート、カタログ番号ＨＳＰ９６５５；Ｂｉｏ－Ｒａｄメンブレン、カタログ番号ＭＳＢ１００１）でＰｒｏｔｅｏＳｔａｔアッセイキット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＥＮＺ－５１０２７－Ｋ４００）の各２５μｌの反応液に対して３μｇの各処理済み試料を使用した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰＣＲ装置（Ｃ１０００タッチ、ＣＦＸ９６リアルタイムシステム）の加熱プログラムは、以下の通りとした：２５℃で２分間、１０秒ごとに０．５℃ずつ、９５℃まで昇温。蛍光吸光度をＴｅｘａｓ Ｒｅｄモードで読み取った。Ｔｍ値は－ｄＦ／ｄＴの最低点に関連している。

【0275】

表４にＳＥＣ分析を示した。表５にＤＳＦ分析を示した。ＳＥＣ分析は、最大５サイクルの凍結／解凍処理後のＳＥＣ曲線でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の有意な変化が観察されなかったことを示した。ＤＳＦ分析は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＴｍ値が同じ処理後に有意に変化しなかったことを示し、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がこのような処理条件下で良好な安定性を有することを示した。

【表5】

【表6】

【0276】

図５ＤにＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。最大５サイクルの凍結／解凍処理後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の有意な変化は観察されず、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１がこのような処理条件下で良好な安定性を有することを示した。

【0277】

実施例７
アゴニスト抗体とＯＸ－４０との結合は、インビトロ及び臨床試験の両方で受容体の下方制御を引き起こし得ることが示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９）。さらに、最初の注射後に患者で観察された標的発現のその後の喪失は、ＯＸ－４０アゴニスト抗体の臨床試験における応用を制限し得ると仮定されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９）。ＰＢＭＣから単離したエクスビボで活性化させたナイーブＴ細胞を用いることにより、本発明は、従来のアゴニスト抗体による処理と比較して、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１による処理によるＯＸ－４０の減少が少ないことを示した。固有の結合エピトープ及び最適化された結合反応速度によって標的分解が最小に抑えられ、それによって、最初の注射後の標的発現の喪失が回避されることで、患者への連続薬物投与が可能となる。

【0278】

実施例８
ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のヒトＰＫ予測
カニクイザルのＰＫデータを２コンパートメントモデルに当てはめた。当てはめたＰＫプロファイル及び観察されたデータを図６Ａ～６Ｆに示す。当てはめの二乗平均平方根誤差は０．１７であり、Ｒ^２は０．９９であり、観察されたデータに対する良好な当てはめを示している。

【0279】

ヒトの２コンパートメントＰＫパラメータを、対応するサルのパラメータから指数規則（ＲＯＥ）に基づいて予測した（Ｄｏｎｇ ｅｔ．ａｌ，２０１１）。

【0280】

次いで、ヒトＰＫプロファイルを予測されたパラメータを用いてシミュレートした。図７は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内注入の１時間後のヒトＰＫプロファイルの例を示す。

【0281】

ｈＯＸ４０ ＫＩマウスにおけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＰＫデータに基づく最小ヒトＰＡＤ予測
ｈＯＸ４０ ＫＩマウスにおける１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＣ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{（０～７２ｈ）}値は、それぞれ１６０．５μｇ／ｍＬ及び２５９１μｇ／ｍＬ＊ｈであった。線形ＰＫを仮定すると、１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１におけるＣ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{（０～７２ｈ）}値は、それぞれ１６μｇ／ｍＬ及び２５９μｇ／ｍＬ＊ｈである。

【0282】

１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１における予測されたヒトＣ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{（０～７２ｈ）}値は、２３．７μｇ／ｍＬ及び１２１３μｇ／ｍＬ＊ｈである。ヒトにおける線形ＰＫを仮定すると、最小ＰＡＤは、０．６８ｍｇ／ｋｇ（Ｃ_ｍａｘに基づく）または０．２１ｍｇ／ｋｇ（ＡＵＣ_{（０～７２ｈ）}に基づく）であると予測される。ヒト最小ＰＡＤは、保守的とするために、０．２１ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ（標準体重７０ｋｇと仮定する）の固定用量と仮定する。

【0283】

ヒトにおける投薬頻度の考慮
腫瘍微小環境におけるＯＸ４０のアゴニズム及びその後のエフェクターＴ細胞の増殖及び制御性Ｔ細胞の枯渇を最大とするには、ＯＸ４０受容体を長期間にわたって飽和させないように注意を払わなければならない。ＯＸ４０アゴニズム間に十分な時間を置くための１つの手法は、対象とするアゴニストの顕著な蓄積を避けることである。本発明者らは、２週に１回（Ｑ２Ｗ）、３週に１回（Ｑ３Ｗ）または４週に１回（Ｑ４Ｗ）のスケジュールのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＰＫプロファイルをシミュレートした。Ｑ４ＷでのシミュレートされたＰＫプロファイルを図８に示す。

【0284】

次に、本発明者らは、各スケジュールについて、定常状態のＣ_ｍａｘ、Ｃ_ｍｉｎ、及びＣ_ｍａｘ／Ｃ_ｍｉｎ比の蓄積指数を計算した。結果を表２に記載する。

【0285】

計算されたＡＩ及びＣｍａｘ／Ｃｍｉｎ比に基づき、実際の考慮事項に加えて、Ｑ４Ｗスケジュールでの１５ｍｇの初期用量をＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のファーストインヒューマン試験のために選択した。

【0286】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のヒトＰＫは、低いクリアランス速度（ＣＬ、０．０８４ｍＬ／ｈ／ｋｇ）、低い分布容積（Ｖｄｓｓ、０．０８４Ｌ／ｋｇ）、及び典型的なｍＡｂ半減期（Ｔ_１／２、７３１時間、約３０日）を有する典型的なＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と同様であると予測される。

【0287】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の最小ヒトＰＡＤを、カニクイザルＰＫに対応する調整したヒトＰＫ、ｈＯＸ４０ ＫＩマウスにおけるＭＣ３８腫瘍有効性試験で得られた最小有効用量、及びｈＯＸ４０ ＫＩマウスにおけるＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の曝露量データに基づいて予測した。ＫＩマウスにおける曝露量及び有効性の関係に基づいて推定された、ヒトでの最小ＰＡＤは０．２１ｍｇ／ｋｇであった。便宜上、同等の固定用量である１５ｍｇが、ヒトでの開始用量として推奨される。推奨される投与頻度は、異なる投与頻度での予測される定常状態ＰＫプロファイルに基づいて、４週に１回（Ｑ４Ｗ）である。

【0288】

ここで、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて、活性化された初代サルＴ細胞へのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の結合を評価した。

【0289】

ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｂｍｋ１に結合するポジティブコントロールとした。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１は、３人の異なるドナーから単離された活性化ＣＤ３／ＣＤ２８初代サルＴ細胞（ロット番号２００１０７、Ｍ２０Ｚ０１３００９、及びＭ２０Ｚ０２５００８）に結合することが示された。それぞれの結合アッセイについてＭＦＩ用量反応曲線から計算したＥＣ５０値は、それぞれ、０．０９ｎＭ、０．１９ｎＭ、及び０．１７ｎＭであった。

【0290】

ＥＬＩＳＡアッセイの線形検出範囲は、実験Ａでは１２５～１０００ｐｇ／ｍｌであり、実験Ｂでは１２５～２０００ｐｇ／ｍｌであった。ＬＬＯＱは、両方の実験で１８．７５ｎｇ／ｍｌであった。

【0291】

ここで、本発明者らは、Ｂｍｋ１及びＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の薬物動態を、１）１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内投与によるＷＴマウス、及び２）１０ｍｇ／ｋｇでの単回投与によるｈＯＸ４０－ＫＩマウスにおいて評価した。時間に対するＢｍｋ１及びＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の平均濃度を、図７及び８に示されるように半対数プロットにプロットした。

【0292】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１及びＢｍｋ１の全身曝露が、すべての処理マウスで得られた。ＷＴマウス（図７）では、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とＢｍｋ１は、同様の用量依存的な線形クリアランス速度を示した。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１とＢｍｋ１との用量比は１：１０であった。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＣｍａｘ及びＡＵＣ（０～７２ｈ）の比は１：６．８及び１：７．９であり、Ｂｍｋ１のこれらの比はそれぞれ、１：１１．８及び１：８．６であった。

【0293】

１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の血清クリアランス速度は、ＷＴマウスでは０．７１±０．３４及び１．０６±０．７７ｍｌ／ｈ／ｋｇであり、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスでは、１０ｍｇ／ｋｇで３．０９±０．２７ｍｌ／ｈ／ｋｇであった。Ｂｍｋ１ ＰＫでも同様の血清クリアランス速度の差が観察された。１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでのＢｍｋ１の血清クリアランス速度は、野生型マウスで０．４５±０．１３及び０．６２±０．１０ｍｌ／ｈ／ｋｇであり、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスでは１０ｍｇ／ｋｇで７．２４±２．２４ｍｌ／ｈ／ｋｇであった。ｈＯＸ４０はｈＯＸ４０－ＫＩマウスでのみ発現されたことから、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスにおけるより高いＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１クリアランス速度は、おそらく標的介在性の薬物動態（ＴＭＤＤ）によるものと考えられる。

【0294】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでの定常分布容積（Ｖｄｓｓ）値は、ＷＴマウスでは０．２１±０．０３及び０．２６±０．０２Ｌ／ｋｇであり、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスでは１０ｍｇ／ｋｇで０．１４±０．０１Ｌ／ｋｇであった。同様に、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでのＢｍｋ１のＶｄｓｓ値はＷＴマウスでは０．１９±０．０２及び０．２１±０．０１Ｌ／ｋｇであり、ｈＯＸ４０－ＫＩマウスでは１０ｍｇ／ｋｇでのＶｄｓｓ値は０．０８±０．０３Ｌ／ｋｇであった。

【0295】

終末相半減期（Ｔ_１／２）の明らかな差も、両抗体についてＷＴマウスとｈＯＸ４０ ＫＩマウスとの間で観察された。ＷＴマウスでは、１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇでのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＴ_１／２は、それぞれ、２３９．７２±１４０．４８時間及び２７４．５２±１９３．１２時間であり、１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇでのＢｍｋ１の値は、それぞれ、２５２．０４±５１．８２時間及び３２１．０５±７５．８９時間であった。しかしながら、ｈＯＸ４０ ＫＩマウスでは、１０ｍｇ／ｋｇでのＴ_１／２値は大幅に短く、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１について３８．６５±４．８４時間、Ｂｍｋ１については５．４５±１．０９時間であった。

【0296】

実施例９ 薬力学試験
方法：３０匹の雌のヒトＯＸ４０ノックインマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系バックグラウンド）の右脇腹にＭＣ－３８腫瘍細胞を皮下接種して腫瘍を発生させた。腫瘍接種の９日後、７６～２２６ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ１５５ｍｍ^３）の範囲の腫瘍サイズを有する２０匹のマウスを選択し、それらの腫瘍体積に基づいて無作為に４群に割り当てた。各群５匹のマウスとした。各マウスに無作為化を行った日（０日目（Ｄ０）と定義）から４つの処理のうちの１つを投与した。４つの処理は、１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール、０．１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１、及び１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１－１Ｅ１ｈＧ１とした。いずれの処理も、Ｄ０、Ｄ３及びＤ７に腹腔内注射により投与した。腫瘍サイズ及び動物体重を、少なくとも週３回測定した。３回目の注射の６時間後、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析用の腫瘍試料を採取し、受容体占有率（ＲＯ）分析用の血液試料を採取し、さらなる分析を行うために血漿試料をＨｉＦｉＢｉＯ社に送付した。

【0297】

結果：ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１のＰＤ効果を、ＭＣ－３８腫瘍保有ｈＯＸ４０ ＫＩマウスで試験した。血液及び腫瘍微小環境（主に腫瘍）の両方で、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１によって、Ｔ細胞（主にＣＤ４^＋Ｔ細胞）上の陽性割合におけるＯＸ４０発現量及びＭＦＩが減少した。一方、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１はＴｒｅｇ集団も有意に減少させた。腫瘍微小環境では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の減少は、主にＴｒｅｇ（ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋細胞）の減少によって誘導され、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｋｉ６７^＋細胞）の増殖は、ＣＤ６９＋Ｔ細胞の減少にともなって増加した。一方、ＰＤ１発現量は、腫瘍微小環境中のＣＤ８^＋Ｔ細胞で減少した。これらの観察結果はいずれも、各処理群でＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１に用量依存的であった。これらを併せると、これらのデータは、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１による処理がＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化し、有効性試験において腫瘍微小環境で観察された持続的な免疫応答に寄与していることを示唆するものである。

【0298】

血液試料中のＯＸ４０発現量に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の効果を、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１に対して非競合的であるマウス抗ｈＯＸ４０抗体（クローンＡＣＴ３５）を用いて分析した。ＣＤ４^＋、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、及びＣＤ１１ｂ^＋単球上の総ＯＸ４０発現量を測定した（データ示さず）。ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理は、Ｔｒｅｇを含むＣＤ４^＋、及びＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞上のＯＸ４０発現の有意な減少（陽性の割合及びＭＦＩの両方）をもたらした。ＣＤ１１ｂ^＋細胞上のＯＸ４０発現量に変化は観察されなかった。

【0299】

ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理時の標的関与を評価するために、抗ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）をＦＣＭ分析で非競合的Ａｂ ＡＣＴ３５と組み合わせて使用した。ＯＸ４０^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＯＸ４０^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞におけるｈＩｇＧ^＋集団の割合は低かった。しかしながら、Ｔｒｅｇを含むＯＸ４０^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞上のｈＩｇＧ^＋のＭＦＩは、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１に用量依存的な形で有意に増加した。

【0300】

ＯＸ４０^＋ＣＤ１１ｂ^＋細胞では、アイソタイプ及び１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１ＥｈＧ１処理群においてｈＩｇＧ＋シグナルの用量依存的な高レベルが観察され、ｈＩｇＧがＣＤ１１ｂ^＋細胞上のＦｃｇＲによって捕捉されたことを示唆した。

【0301】

腫瘍組織における浸潤性免疫細胞集団をフローサイトメトリー（ＦＣＭ）により分析した。ここに例示するＦＣＭ分析グラフのすべてにおいて、
・Ｇ１：アイソタイプコントロール群、Ｇ２：０．１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群、Ｇ３：１ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群、Ｇ４：１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群。
・各ドットは、個々の動物からのデータを表し、矩形のバーは、群平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。

【0302】

Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、ＣＤ４^＋Ｔ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３＋）の割合を測定し、選択した結果を図９及び１０に示す。ナイーブＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４４^－ＣＤ６２Ｌ^＋）、メモリーＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋）及びエフェクターＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ^－）の割合も測定した（データは示さず）。その結果、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１（Ｇ３及びＧ４、Ｇ２なし）処理は、アイソタイプコントロール（Ｇ１）処理と比較して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ナイーブＴ細胞、及びナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を有意に減少させた。さらに、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理はいずれも、コントロール処理と比較して、メモリーＴ細胞及びメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を有意に減少させた。すべてのＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理群でメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合が減少したが、Ｇ２及びＧ３処理のみが統計的に有意であった。処理群間で、Ｔ細胞（ＣＤ３^＋）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びエフェクターＴ細胞集団に有意な変化は観察されなかった。

【0303】

腫瘍におけるＯＸ４０の発現、異なるＴ細胞サブタイプの活性化及び増殖に対するＨＦＢ１０－１ＥｈＧ１処理の効果を調べた。総ＯＸ４０発現量に対するＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の効果を、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１に対して非競合的であるマウス抗ｈＯＸ４０抗体（クローンＡＣＴ３５）を用いて分析した。ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、及びＴｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋）上のＯＸ４０発現量を測定した（データは示さず）。アイソタイプコントロール群（Ｇ１）と比較して、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理は、ＣＤ３^＋及びＣＤ４^ＣＤＴ細胞上のＯＸ４０発現量を、割合及びＭＦＩの両方で有意に減少させた（左パネルにＯＸ４０発現の陽性割合、及び右パネルにＯＸ４０のＭＦＩ）。また、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理は、ＯＸ４０発現量をＭＦＩで有意に減少させたが、Ｔｒｅｇにおける割合では有意に減少させなかった（データは示さず）。さらに、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１処理は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞における割合でＯＸ４０発現量を有意に減少させたが、ＭＦＩでは有意に減少させなかった。

【0304】

アイソタイプコントロール群（Ｇ１）と比較して、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１の処理（Ｇ３及びＧ４）は、ＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＰＤ－１^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を有意に減少させ（図１２）、増殖（Ｋｉ６７^＋）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を増加させた（図１１）。

【0305】

上記の観察結果は、ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１に用量依存的である。

【0306】

実施例１０ エピトープマッピング
アゴニストモノクローナル抗ＯＸ４０抗体としてＨＦＢ３０１００１が開発されている。表１に、ＨＦＢ３０１００１のＣＤＲ、ＶＨ／ＶＬ及びＨＣ／ＬＣの配列を示す。

【0307】

選択したこれまでに公開されている抗体及びＯＸ４０リガンドの結合エピトープと比較して異なる抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０結合エピトープを探索するための競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いたエピトープビニングによって結合エピトープの特徴付けを行った。簡単に述べると、プレートを１μｇ／ｍｌの抗ＯＸ４０捕捉抗体、ＯＸ４０Ｌ、またはアイソタイプコントロール５０μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴ中１％ＢＳＡで室温にて２時間ブロッキングした。次に、５０μｌ／ウェルのビオチン－ＯＸ４０（ロット番号１６０９２１１１１、ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ；東京、日本）を加えた。ビオチン－ＯＸ４０は、０．５μｇ／ｍＬからの８点希釈を行うために１～３倍の希釈濃度で使用し、３７℃で１時間インキュベートした。ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（１／５０００希釈率、５０ｕｌ／ウェル）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、次いで１００μｌ／ウェルのＴＭＢを加え、室温で１５分間インキュベートした。５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ停止溶液を加えて反応を停止した。ＯＤ値を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ｓｋｙ分光光度計を用いて４５０ｎｍの波長で測定した。

【0308】

結合エピトープのより詳細な分解能は、水素重水素交換質量分析を用いて得た。簡単に述べると、Ｈ／Ｄ交換エピトープマッピングに質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を用いて、ＨＦＢ３０１００１と相互作用するＯＸ４０（組換えヒトＯＸ４０）のアミノ酸残基を決定した。Ｈ／Ｄ交換法の一般的な説明は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；及びＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに記載されている。Ｈｉｓタグ付きＯＸ４０抗原タンパク質は、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（カタログ番号１０４８１－Ｈ０８Ｈ；Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，北京、中国）より購入した。ペプチド質量を測定するため、Ｎｏｖａｂｉｏａｓｓａｙｓ ＬＬＣにより提供される統合型ＨＤＸ／ＭＳプラットフォーム及びＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計でＨＤＸ－ＭＳ実験を行った。４．５μＬの全試料を、７５μＬの重水素酸化物標識緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＤ７．４）と２０℃で３００秒間、６００秒間、１８００秒間、及び３６００秒間インキュベートした。水素／重水素交換反応を、８０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ ＴＣＥＰ緩衝液（最終ｐＨ値２．５）を添加することによってクエンチした。その後、クエンチした各試料にオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化を行った後、ＬＣ－ＭＳ分析を行った。質量スペクトルデータは、ＭＳモードのみで記録した。ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化、ＬＣ－ＭＳ及びデータ分析。ＨＤＸ標識の後、８０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ ＴＣＥＰ緩衝液（最終ｐＨ２．５）を加え、２０℃で３分間インキュベートすることによって各試料を変性させた。次いで、混合物に、内部充填ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ（ｗ／ｗ、１：３）カラムを使用して、オンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化を行った。得られたペプチドを、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）に接続したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣとハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）とから構成されたＵＰＬＣ－ＭＳシステムを用いて分析した。２％～３３％までの溶媒Ｂ（０．２％ギ酸を含むアセトニトリル）の２０．５分の勾配を用いて５０×１ｍｍ Ｃ８カラム上でペプチドを分離した。溶媒Ａは、０．１％ギ酸水溶液とした。注入バルブ、酵素カラム及び関連する接続管を１５℃に保たれた冷却ボックス内に配置した。第２の開閉弁、Ｃ８カラム及び関連する接続ステンレス鋼管継手を、－６℃に保たれた冷蔵リサイクルボックス内に配置した。ペプチド同定は、非特異的酵素消化及びヒトグリコシル化を共通変数として用いた改変Ｂｙｏｎｉｃｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）ソフトウェアを用いて、ＨＦＢ３０１００１配列のＭＳ／ＭＳデータを検索することによって行った。前駆体イオン及び生成物イオンのマストレランスは、それぞれ１０ｐｐｍ及び０．０２Ｄａであった。Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータを分析するため、ＨＤＸ ＷｏｒｋＢｅｎｃｈソフトウェア（バージョン３．３）を使用して生ＭＳデータを処理した（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２，２３（９），１５１２－１５２１）。重水素化ペプチドとその非標識型（ｔ０）との間の平均質量差を用いて重水素吸収レベルを計算した。単一の抗原試料と抗原抗体複合体試料中の同じペプチドの重水素吸収レベルを比較した。５％より大きい相対差は有意とみなした。エピトープ領域は、顕著な重水素吸収を有する複数の重複ペプチドとして定義された。ｈＯＸ４０．ｈｉｓ単独及びｈＯＸ４０－ｈｉｓ－ＨＦＢ３０１００１複合体から、ｈＯＸ４０の７０％の配列カバレッジを表す、ｈＯＸ４０－ｈｉｓ由来の合計４６個のペプチドが同定された（図１３）。５％を超えるＤ吸光度のパーセント差を示したペプチドは、有意に保護されていると定義した。ｈＯＸ４０－ｈｉｓでは、アミノ酸５６～７４：ＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤに対応する領域のポリペプチドは、ＨＦＢ３０１００１によって有意に保護されているエピトープとみなした。図１３に示されるように、エピトープ領域を、Ｃｏｍｐａａｎ ａｎｄ Ｈｙｍｏｗｉｔｚ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００６，１４（８），１３２１－３０を出典とするＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ複合体の３Ｄモデルにマッピングした。ＨＦＢ３０１００１のエピトープは、配列番号３３のアミノ酸５６～７４：ＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤ（配列番号３４）として定義された。

【0309】

実施例１１ ＯＸ４０リガンドのアゴニスト活性
ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）のアゴニスト活性を評価するために、ＯＸ４０バイオアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９７７０４、Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造者の指示に従って使用した。このアッセイでは、ヒトＯＸ４０を発現する遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株（ＯＸ４０エフェクター細胞）及び応答エレメントによって誘導されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用した。簡単に述べると、ＯＸ４０エフェクター細胞をアッセイ緩衝液中で使用前日に培養した。アッセイ当日に、ＯＸ４０Ｌの連続希釈物をプレートに加えた。５時間の誘導後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて生物発光シグナルを定量した。結果は、ＯＸ４０ＬがＯＸ４０エフェクター細胞の生物発光シグナルを用量依存的に誘導したことを示した（図１４Ａ）。

【0310】

ＯＸ４０－Ｌアゴニスト活性に対する抗ＯＸ４０抗体の効果を調べるため、ＯＸ４０エフェクター細胞を、１０ｎＭのＯＸ４０Ｌの存在下で、連続希釈した抗ＯＸ４０抗体（ＨＦＢ３０１００１、ベンチマーク１またはベンチマーク２）とインキュベートした。ベンチマーク１及びベンチマーク２は、これまでに公開されている抗ＯＸ４０抗体であり、抗体エピトープがＯＸ４０の細胞膜から最も遠く離れていることから選択され、他のベンチマークは、ＯＸ４０のリガンド結合ポケットの近くに結合することが記載されている。誘導の５時間後にＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して生体発光シグナルを定量した。ベンチマーク１及びベンチマーク２はいずれもＯＸ４０Ｌのアゴニスト効果を用量依存的に遮断したが、ＨＦＢ３０１００１は遮断しなかった（図１４Ｂ）。結果は、ＨＦＢ３０１００１が、ベンチマーク１及びベンチマーク２と比較してＯＸ４０上の異なる結合部位を認識し、その結合部位がＯＸ４０Ｌのアゴニスト機能を妨げないことを示した。

【0311】

実施例１２ ＯＸ４０受容体調節
ＯＸ４０受容体への抗ＯＸ４０抗体の結合の調節効果を調べるため、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋Ｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号１３０－０９６－５３３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、連続希釈したベンチマーク抗体またはＨＦＢ３０１００１とインキュベートし、０．５μｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８１）及び２μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローンＣＤ２８．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－０２８９－８１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により同時に活性化した。３日間のインキュベーション後、総表面ＯＸ４０発現量を、抗ＯＸ４０抗体による染色によって検出した（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、クローンＡＣＴ３５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１７－１３４７－４２）。アイソタイプコントロールと比較して、ＨＦＢ３０１００１は、細胞表面上の安定なＯＸ４０発現を増加させた（図１５Ａ）。すべてのベンチマーク処理群で、ＯＸ４０の表面発現は、抗体濃度の増加としてＵ字形を示した。すなわち、ＯＸ４０のレベルは、最初に減少し、約１ｎＭでその最低点に達した後、再び増加した。

【0312】

実施例１３ 結合親和性の評価
バイオフィルム層干渉（ＢＬＩ）実験をＯｃｔｅｔ ＱＫｅ装置で行って、ＨＦＢ３０１００１とヒトＯＸ４０タンパク質との間で形成された組換え二量体（ｍＦｃで標識）の結合親和性を決定した。異なる濃度の組換えヒトＯＸ４０タンパク質を、解離期の後、ｐＨ７．４及び２５℃で、センサー捕捉した試験抗体及びアイソタイプコントロールと混合した。結合シグナルの変化を記録し、結合パラメータの動態解析を、物質移動制限を用いた１：１モデルを用いて決定した。ランニングバッファー溶液を、０．１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４で調製した。動力学的結合実験に先立って、抗ヒトＦｃ捕捉センサーをランニングバッファーですすぎ、機器を２５℃に予め温めた。試験抗体及びアイソタイプコントロール抗体を、ランニングバッファーで２００ｎＭに希釈した。ＯＸ４０－ｍＦｃタンパク質をランニングバッファーで２５０、１２５、６２．５、３１．２５、及び１５．１２５ｎＭに希釈した。ＯＸ４０タンパク質とその抗体との結合を、ｐＨ７．４及び２５℃のランニングバッファーを用いて２連で行った。簡単に述べると、最初に、抗ヒトＦｃ捕捉センサーをランニングバッファーに３００秒間浸漬して、第１のベースラインを設定した。次いで、センサーを２００ｎＭの試験抗体溶液と６００秒間混合して抗体をロードした。センサーを再びランニングバッファーに３００秒間浸漬して第２のベースラインを設定した後、異なる濃度のＯＸ４０抗原と９００秒間会合させた。その後、センサーをランニングバッファーにさらに９００秒間浸漬することによって解離を行った。並行して、１つのセンサーを参照用として選択し、ローディング、会合、及び解離のすべての工程をランニングバッファー中で行った。別のセンサーをネガティブコントロール実験として選択し、ＨＦＢ－ＴＴ－ｈＧ１アイソタイプコントロール抗体をローディング工程に使用し、５００ｎＭのＯＸ４０－ｍＦｃタンパク質を会合工程に使用した。センサーグラムを、Ｆｏｒｔｅｂｉｏデータ解析ソフトウェアバージョン８．２（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）によって分析した。最初に、シグナルをネガティブコントロール実験から引いてベースラインと比較した。異なる抗原濃度を有するこれらの特異的センサーグラムを１：１の結合モデルに全体的に当てはめることによって動力学パラメータを得た。解離速度定数と会合速度定数との比に基づいて平衡解離定数（ＫＤ）を計算した（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）。ＨＦＢ３０１００１とヒトＯＸ４０タンパク質との間の相互作用の動力学的結合パラメータを、ＢＬＩ技術を用いて決定した。このアッセイは、特定の濃度範囲のＯＸ４０タンパク質と、捕捉されたＨＦＢ１０－１Ｅ１及び他の抗体との相互作用を２５℃及びｐＨ７．４で測定するものである。以下の結合親和性表に、計算された動力学的結合パラメータをまとめる。ＨＦＢ３０１００１は、組換えヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０．ｍＦｃ）に対して高い親和性を有し、２５℃及びｐＨ７．４のＫＤ値は４．５ｎＭである。他の２つの抗体はより遅い解離速度を示し、ベンチマーク１では０．４９ｎＭ、ベンチマーク２では０．５８ｎＭとより小さいＫＤ値であった。ＨＦＢ３０１００１とヒトＯＸ４０－ｍＦｃとの間の相互作用の動力学的結合パラメータをＢＬＩ技術によって２５℃及びｐＨ７．４で決定した。ＨＦＢ３０１００１は、他の試験抗体と比較して大幅に高い親和性及びより速い解離速度で、組換えヒトＯＸ４０－ｍＦｃタンパク質と特異的に結合した。

【表7】

【0313】

実施例１４ インビボ腫瘍モデル
ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）ノックイン（ＫＩ）マウスでＭＣ－３８マウス結腸癌モデルを用いた（カタログ番号ＮＭ－ＨＵ－０００４１、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）。ＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルにおけるＨＦＢ３０１００１の薬力学（ＰＤ）効果を評価するため、４５匹の雌性ｈＯＸ４０ ＫＩマウスの右体側にＭＣ－３８腫瘍細胞（マウス１匹当たり８×１０５細胞）を皮下接種して腫瘍を発生させた。腫瘍接種の８日後、１０４～２４３ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ１８１ｍｍ３）の範囲の腫瘍サイズを有する１２匹のマウスを選択し、それらの腫瘍体積に基づいて各群４匹のマウスからなる３つの群に無作為に分けた。各処理群に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１または抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１またはＩｇＧ１アイソタイプコントロールの注射を投与した。すべての処理は、無作為な群分けの当日（Ｄ０）に腹腔内（ｉ．ｐ）投与した。

【0314】

１０ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０抗体の３回目の注射の２４時間後にＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＯＸ４０発現量をフローサイトメトリーによって測定した。ベンチマーク１は、血中のＣＤ４^＋Ｔ細胞上のＯＸ４０発現の有意な減少を誘導したがＨＦＢ３０１００１は誘導しなかった（図１５Ｂ）。

【0315】

ＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルにおけるＨＦＢ３０１００１のインビボ抗腫瘍活性を評価するため、２６匹の雌性ｈＯＸ４０ ＫＩマウスの右体側にＭＣ－３８腫瘍細胞（マウス１匹当たり８×１０^５細胞）を皮下接種して腫瘍を発生させた。腫瘍接種の７日後、１０１～１７５ｍｍ３（平均腫瘍サイズ１３３ｍｍ^３）の範囲の腫瘍サイズを有する２０匹のマウスを選択し、それらの腫瘍体積に基づいて各群５匹のマウスからなる４つの群に無作為に分けた。４つの処理群は以下とした：１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１、１ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、及び１０ｍｇ／ｋｇの用量のＩｇＧ１アイソタイプコントロール。いずれの処理も、Ｄ０、Ｄ３、Ｄ６、Ｄ１０、及びＤ１３に腹腔内に投与した。矢印は処理時点を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表し、有意性レベルは最後の時点で一元配置ＡＮＯＶＡによって計算した（＊：ｐ値＜０．０５、＊＊：ｐ値＜０．０１）。腫瘍直径（幅及び長さ）によって表される腫瘍サイズを、無作為な群分け後のＤ０、Ｄ３、Ｄ６、Ｄ１０、Ｄ１２及びＤ１５にデジタルキャリパーによって測定した。図１６は、コントロールと比較してＨＦＢ３０１００１が腫瘍増殖を有意に阻害し、ベンチマーク１よりも高い抗腫瘍増殖効果を有することを示唆した。

【0316】

ＭＣ－３８マウス結腸直腸癌モデルにおけるＨＦＢ３０１００１のインビボ抗腫瘍活性を評価するため、８０匹のｈＯＸ４０ ＫＩマウスの右体側にＭＣ－３８腫瘍細胞（マウス１匹当たり８×１０^５細胞）を皮下接種して腫瘍を発生させた。腫瘍接種の７日後、４２～１４７ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ８２ｍｍ３）の範囲の腫瘍サイズを有する６５匹のマウスを選択し、それらの腫瘍体積に基づいて各群１０匹のマウスからなる（５匹のみのマウスからなるＰＢＳ群を除く）７つの処理群に無作為に分けた。無作為な群分けの当日（０日目（Ｄ０）と定義）に処理を開始した。７つの処理群は以下とした：１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１、１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＯＸ４０抗体ベンチマーク１、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＩｇＧ１アイソタイプコントロール、及びＰＢＳ。いずれの処理も、Ｄ０、Ｄ３、Ｄ６、Ｄ１０、及びＤ１３に腹腔内に投与した。治療開始から６１日目まで、腫瘍サイズ及び動物の体重を少なくとも週３回測定した。有意水準は、ログランク検定（＊：ｐ値＜０．０５、＊＊：ｐ値＜０．０１）によって計算した。無作為な群分け後の６０日間にわたって生存率をモニターした。１０ｍｇ／ｋｇのＨＦＢ３０１００１で処理したマウスの生存率は、１０ｍｇ／ｋｇのベンチマーク１で処理したマウスの生存率よりも有意に高かった（図１７）。

【0317】

抗ＯＸ４０抗体ＨＦＢ３０１００１の有効性をさらに調べるため、抗ＯＸ４０抗体による３回目の処理の２４時間後に腫瘍Ｔ細胞によって誘導される変化を、フローサイトメトリーによって測定した。腫瘍接種の８日後、１０４～２４３ｍｍ^３（平均腫瘍サイズ１８１ｍｍ^３）の腫瘍サイズを有する１２匹のマウスを選択し、それらの腫瘍体積に基づいて各群４匹のマウスからなる３つの群に無作為に分けた。ＨＦＢ３０１００１処理は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方において、ＫＩ６７^＋細胞を有意に増加させ（図１８Ａ～図１８Ｂ）、ＰＤ－１＋細胞を減少させた（図１８Ｃ～図１８Ｄ）。さらに、ベンチマーク及びＨＦＢ３０１００１処理の両方が、腫瘍Ｔｒｅｇの有意な減少をもたらし、ＨＦＢ３０１００１群における減少がより顕著であった（図１８Ｅ）。

【0318】

実施例１５ ＨＦＢ３０１００１は、ＯＸ４０シグナル伝達を効果的に誘導する
操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＮＦ－ｋＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０レポーターＪｕｒｋａｔ細胞としても知られ、Ｌｕｃ２レポーターが、ＯＸ４０活性化の際にＮＦ－ｋＢ経路によって活性化されるプロモーターの転写制御下にあるもの。実施例３．１参照）をＯＸ４０エフェクター細胞として用い、抗体架橋を与えるためにＦｃγＲＩＩｂを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いた、レポーター細胞ベースの実験において、ＨＦＢ３０１００１（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１）は、一貫した用量依存性のアゴニスト活性を示した。

【0319】

ＨＦＢ３０１００１アゴニスト活性は、ＥＣ５０値に基づいてベンチマーク１よりも効力が低かったが、同様のＥ_ｍａｘ値を有した（図１９参照）。実験をさらに２回繰り返したところ、同様の結果が得られた。データは、ＨＦＢ３０１００１がＯＸ４０シグナル伝達を効果的に誘導したことを示した。

【0320】

実施例１６ ＯＸ４０リガンドに応答したＯＸ４０シグナル伝達に対するＨＦＢ３０１００１の効果
ＦｃγＲＩＩｂ発現細胞の非存在下でのＯＸ４０レポーター細胞（ＮＦ－ｋＢ－Ｌｕｃ２／ＯＸ４０レポーターＪｕｒｋａｔ細胞）を使用して、ＯＸ４０抗体が、ＯＸ４０^＋細胞におけるＯＸ４０Ｌ結合及びシグナル伝達を遮断するかどうかを研究した。簡単に述べると、ＯＸ４０レポーター細胞を、一定の濃度範囲の抗体及びＯＸ４０Ｌとインキュベートし、ルシフェラーゼシグナルをＯＸ４０シグナル伝達の読み取りとした。

【0321】

ベンチマーク１及びベンチマーク２抗体は、異なるＯＸ４０Ｌ濃度でＯＸ４０Ｌ誘導ＯＸ４０シグナル伝達に対する用量依存的な阻害効果を示した（図２０Ｃ及び２０Ｄを参照）。しかしながら、ＨＦＢ３０１００１（ＨＦＢ１０－１Ｅ１ｈＧ１）は、ＯＸ４０レポーター細胞において、特にＯＸ４０Ｌの濃度８０ｎＭでは、ＯＸ４０Ｌによって誘導されるシグナル伝達に対する阻害はわずかであるか、またはまったくみられなかった（図２０Ａ）。

【0322】

この実験は、ＨＦＢ３０１００１が内因性ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を妨げないことを示唆するものである。これらのデータは、結合エピトープデータと一致している。内因性ＯＸ４０Ｌシグナル伝達は、免疫ネットワークの調節において不可欠な役割を果たしているものと考えられ、これをインタクトに保つことは、リガンドをブロックする同様の抗体と比較して、ＨＦＢ３０１００１の利点を表すと考えられる。

【0323】

実施例１７ ヒトＣＤ４^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞へのＨＦＢ３０１００１の結合
ヒトＴ細胞の活性化を、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いて予め活性化された２人のヒトドナーの末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）から単離されたＣＤ３^＋Ｔ細胞を用いて評価した。ＣＤ３／ＣＤ２８により誘導されるＯＸ４０は、主にＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞上で発現した。ＨＦＢ３０１００１は、各ドナー由来の活性化された初代ヒトＣＤ４^＋ＣＤ３^＋Ｔ細胞に、それぞれ０．６５及び１．３６ｎＭのＥＣ５０値で結合した（図２１Ｂ及び２１Ｄを参照）。

【0324】

ＨＦＢ３０１００１は、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いて予め活性化したサルＰＢＭＣから単離した初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対して同様の結合を示し、３つの独立した実験からのＭＦＩ用量反応曲線より計算した結合のＥＣ５０値は、０．０９～０．１９ｎＭの範囲であった（データは示さず）。

【0325】

これらのデータは、ＨＦＢ３０１００１が活性化されたヒトまたはサルＣＤ４^＋Ｔ細胞に結合することを示す。サルＴ細胞に対する結合親和性がより高いということは、サルにおける毒物試験によって、ヒトにおける潜在的な安全性の問題が過小評価されている可能性は低いことを示唆するものである。

【0326】

実施例１８ ＨＦＢ３０１００１による処理後の初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現
活性化されたヒトＴ細胞に対するＯＸ４０モノクローナル抗体の効果を調べた。２人の異なるドナーからＴ細胞を単離した（＃１９１２２３－Ｂ及び＃１９００６１）。Ｔ細胞上のＯＸ４０発現量を、抗ＯＸ４０抗体（クローンＡＣＴ３５）で染色することによって決定した。

【0327】

ＨＦＢ３０１００１は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激末梢ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞上に発現されるＯＸ４０の総表面レベルを用量依存的に増加させ、およそ１ｎＭ濃度でプラトーに達した。これに対して、他の抗ＯＸ４０抗体（いずれも臨床開発段階。Ｂｍｋ１で表される）は、これらのＣＤ４^＋Ｔ細胞上の表面ＯＸ４０レベルの減少を誘導した（図２２Ａ及び２２Ｂ参照）。

【0328】

ＯＸ４０抗体によるＴ細胞上のＯＸ４０レベルの減少は、ＯＸ４０アゴニスト抗体が最適な臨床的ベネフィットに達する可能性を低下させる可能性が高い。この効果はＨＦＢ３０１００１では観察されないことから、より良好な臨床的有効性が予想されると考えられる。

【0329】

実施例１９ Ｔ細胞機能に対するＯＸ４０抗体の効果
ヒトＴ細胞機能に対するＯＸ４０モノクローナル抗体の効果を、抗ＯＸ４０抗体を超抗原Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）の存在下で試験するインビトロでの共刺激活性実験で調べた。ヒトＩＬ－２を、７０時間の刺激後に培養上清中で定量した。

【0330】

特に１ｎｇ／ｍＬ（ＳＥＡ）を使用した場合、ベンチマーク１（Ｂｍｋ１）抗体では明確な用量依存性は認められなかった（図２３Ｂ）。より低いＳＥＡレベルでは、４人のドナー由来のＰＢＭＣのすべてで、Ｂｍｋ１抗体の濃度が高くなるほどＩＬ－２の産生レベルは低くなった。

【0331】

これに対して、ＨＦＢ３０１００１（０．５～５０ｎＭ）は、ＳＥＡ（１または１０ｎｇ／ｍＬ）によって刺激されたヒトＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ－２レベルを用量依存的に増加させた（図２３Ａ及び２３Ｂ）。この実験を、別の４人のドナー由来のＰＢＭＣを用いて１回繰り返したところ、同様の結果が得られた（データは示さず）。

【0332】

いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＨＦＢ３０１００１のより良好な用量依存性は、受容体の下方制御がみられず、内因性リガンドがブロックされないことに少なくとも一部拠るものと考えられる。

【0333】

これらのデータは、ＨＦＢ３０１００１が用量依存的にＴ細胞活性化を増強することを示すものであり、ＨＦＢ３０１００１が、臨床開発段階にある他のＯＸ４０モノクローナル抗体と比較して、臨床現場における最適な有効性を実現する可能性が高いことを示唆するものである。

【0334】

実施例２０ 抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に対するＨＦＢ３０１００１の効果
Ｔ－ｒｅｇの枯渇は、ＯＸ４０アゴニスト抗体による抗腫瘍有効性の潜在的メカニズムの１つであることから、ＣＤ１６－ＮＦ－ＡＴ－ＬｕｃレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、標的細胞（ｈＯＸ４０をトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞）及びＯＸ４０モノクローナル抗体の存在下で使用して、これらの抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の可能性を調べた。

【0335】

ＨＦＢ３０１００１は、ｈＯＸ４０発現標的細胞の存在下で、エフェクター細胞にＣＤ１６シグナル伝達（潜在的なＡＤＣＣ活性を表す）を用量依存的に誘導した。エフェクターと標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）＝１：１、３：１、６：１、及び１２：１で、それぞれ１．２、０．７、０．５、及び０．３ｎＭのＥＣ５０値が得られた（表１）。

【0336】

Ｂｍｋ１も、Ｅ：Ｔ比＝１：１、３：１及び６：１でそれぞれ、２、０．８及び０．５ｎＭのＥＣ５０値で用量依存的にＡＤＣＣ活性を示したが、ＩｇＧ２アイソタイプであるＢｍｋ２は、予想されたような検出可能なＡＤＣＣ活性を示さなかった（表１）。

【0337】

反復実験において、ＣＤ１６－ＮＦ－ＡＴ－ＬｕｃレポーターＪｕｒｋａｔ細胞にＯＸ４０抗体によって誘導される潜在的なＡＤＣＣ活性を、Ｅ：Ｔ比＝３：１及び６：１で試験したところ、同様の結果を得た（データは示さず）。

【0338】

これらのデータは、ＨＦＢ３０１００１がＡＤＣＣエフェクター機能を維持することを示した。

【表8】

【0339】

実施例２１ サイトカイン放出に対するＨＦＢ３０１００１の効果
サイトカイン放出に対するＨＦＢ３０１００１の効果を、６人の異なるドナー由来の新鮮なｈＰＢＭＣを使用し、抗体を可溶性及びプレート結合フォーマットの両方で使用してインビトロで評価した。

【0340】

異なる濃度（３、３０または３００μｇ／ｍｌ）のＨＦＢ３０１００１または培地／コントロール抗体／マイトジェンを、９６ウェルＵ底プレートに４℃で一晩コーティングするか、または新たに加えた。１００μｌの新鮮なＰＢＭＣ懸濁液（２×１０^５細胞／ウェル）を各ウェルに加えた。各プレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で４８時間インキュベートした。上清を各ウェルから回収し、分析前に－８０℃で保存した。培養上清中の異なるサイトカインの濃度を、製造者の指示に従って、ＢＤＴＭ ＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｔ ＩＩ（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦα及びＩＦΝγ）を用いて決定した。

【0341】

可溶性フォーマットで試験した場合、すべてのドナー由来のＰＢＭＣ中のすべての分析物についてネガティブコントロールのブランク（完全培地のみ）またはｈＩｇＧ１アイソタイプコントロールで検出されたシグナルは最小であったのに対して、５μｇ／ｍｌのポジティブコントロールＰＨＡまたは１０μｇ／ｍｌのＬＰＳは、すべてまたはほとんどのドナーのＰＢＭＣ中のＩＬ－２（ＰＨＡのみ）、ＩＬ－４（ＰＨＡのみ）、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦα（ＰＨＡのみ）及びＩＦΝγ（ＰＨＡのみ）の放出の有意な増加を誘導した。ネガティブコントロールと同様、６人のドナーすべてのＰＢＭＣ中、３、３０または３００μｇ／ｍｌの濃度のＨＦＢ３０１００１の存在下で検出されたシグナルは最小であり、可溶性フォーマットのインビトロサイトカイン放出アッセイで試験した濃度でのＨＦＢ３０１００１誘導性サイトカイン放出のリスクが低いことを示唆した。

【0342】

プレート結合フォーマットで試験した場合、ブランクコントロールで検出されたシグナルは最小であった。しかしながら、ｈＩｇＧ１アイソタイプコントロールの存在下では、ＩＬ－４、ＩＬ－６及びＴＮＦαがすべてのドナーのＰＢＭＣで誘導されたが、ＩＬ－２、ＩＬ－１０またはＩＦＮγは誘導されず、これは、ｈＩｇＧ１によるＦｃ受容体が関与していることに起因すると考えられる。２つの抗ｈＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌのＯＫＴ３及び５μｇ／ｍｌのＵＣＨＴ１）をポジティブコントロールとして使用したところ、すべてまたはほとんどのドナーのＰＢＭＣでブランクコントロールと比較して顕著に高いサイトカイン放出が誘導された。３μｇ／ｍｌの濃度のＨＦＢ３０１００１の存在下では、６人のドナーすべてまたはほとんどのＰＢＭＣで検出されたシグナルが最小であったのに対して、３０または３００μｇ／ｍｌのＨＦＢ３０１００１の存在下では用量依存的にＩＬ－４、ＩＬ－６及びＴＮＦαの放出が検出された。重要な点として、３００μｇ／ｍｌのＨＦＢ３０１００１によって誘導されたサイトカイン放出のレベル及びパターンは、同じ濃度のｈＩｇＧ１アイソタイプコントロールと比較して同等またはより低いレベルのサイトカイン放出を示し、プレート結合フォーマットのインビトロサイトカイン放出アッセイにおいてＨＦＢ３０１００１誘導サイトカイン放出のリスクはアイソタイプコントロールｈＩｇＧ１と比較して増加しないことを示唆した。

【0343】

現在の実験条件下では、３～３００μｇ／ｍｌ濃度の可溶性ＨＦＢ３０１００１は、６人のドナーすべてのＰＢＭＣに有意なサイトカイン放出を誘導しなかったが、３００μｇ／ｍｌのプレート結合ＨＦＢ３０１００１は、同じ濃度のｈＩｇＧ１アイソタイプコントロールと比較して同等またはより低いレベルのサイトカイン放出を示した。

【0344】

実施例２２ ＨＦＢ３０１００１の毒物試験
今日までに行われているすべてのマウス試験において、ＨＦＢ３０１００１は、治療関連毒性の徴候を伴うことなく十分に忍容されている。ｈＯＸ４０ノックインマウスにおいて、ＷＴマウスよりも高いＨＦＢ３０１００１のクリアランス及びより短いＴ１／２が観察され、標的介在性の薬物動態の可能性を示唆している。

【0345】

カニクイザルにおける単回用量毒性試験において、ＨＦＢ３０１００１は、すべての用量レベルで十分に忍容され、１００ｍｇ／ｋｇの最も高い用量で明らかな所見は観察されず、１００ｍｇ／ｋｇが最大耐用量（ＭＴＤ）より低いことを示唆した。ＨＦＢ３０１００１への全身曝露では、性別関連の差異は観察されなかった。ＡＵＣ_０～ｔ及びＣ_ｅｎｄ値は、１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲で用量比例的に増加した。ＨＦＢ３０１００１は、典型的なｍＡｂの薬物動態プロファイルを示した。活性化部分トロンボプラスチン時間及びプロトロンビン時間の増加及び総ビリルビン濃度の増加が、投与前と比較して１００ｍｇ／ｋｇで１匹の雌で観察され、総タンパク質濃度のある程度の増加もすべての動物で認められたが、これらの変化は、同時コントロール群が用いられておらず、用量応答関係が観察されなかったことから、試験対象物関連の効果ではない可能性がある。同様に、ＨＦＢ３０１００１によって誘導された低い抗ＫＬＨ免疫グロブリン力価の曖昧な結果は、これまでのコントロール値の下限値以下であり、同時コントロール群が用いられなかったことから試験対象物関連の効果ではない可能性がある。

【0346】

反復投与において、ＧＬＰ毒物試験を、週１回１時間の静脈内注入を４週間投与した後、４週間の回復を行った雄雌のカニクイザルで行った。潜在的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）が、１０ｍｇ／ｋｇの２匹の雄で投薬期間の終了時に検出され、１匹でＨＦＢ３０１００１への曝露の有意な減少が誘導された。投与期間の終了時に他の動物でＡＤＡは検出されなかった。ＨＦＢ３０１００１の週１回投与は、すべての動物で十分に忍容され、毒性の関連する徴候を誘導しなかった。したがって、本試験の実験条件下で、ＨＦＢ３０１００１の無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）は、両方の性別で試験した最高用量である１００ｍｇ／ｋｇと考えられ、投薬期間終了時の雄及び雌の平均ＡＵＣ_ｌａｓｔである３８０５００μｇ・ｈ／ｍＬに相当する。

【0347】

以上をまとめると、ＨＦＢ３０１００１は、１００ｍｇ／ｋｇの最高用量以下の用量ですべてのマウス試験、またはＮＨＰ非ＧＬＰ単回投与及び１ヶ月反復投与ＧＬＰ毒性試験で有意な毒性所見を誘導しなかった。ＨＦＢ３０１００１は、提唱されるＦＩＨ開始用量（５ｍｇの一定の毎月投薬量）で幅広い安全マージン（ＭＯＳ）を有する。

【0348】

参考文献
Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｇａｏ，Ｃ．，Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｍ．，Ｄｉｔｏ，Ｇ．，Ｋａｂｂａｂｅ，Ｄ．，Ｓｈａｏ，Ｘ．，Ｈｉｌｔ，Ｅ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｐａｋ，Ｉ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｍ．，Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ，Ａ．，Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｒ．，Ｏｎｇ，Ｍ．，Ｏｌｓｚａｎｓｋｉ，Ａ．，Ｍｉｌｂｕｒｎ，Ｃ．，Ｔｈｕｄｉｕｍ，Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．，Ｆｅｎｇ，Ｙ．，Ｆｒａｃａｓｓｏ，Ｐ．，Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．，Ａａｎｕｒ，Ｐ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｍ．（２０１９）．Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｉｎｆｏｒｍ Ｏｐｔｉｍａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＸ４０ Ａｇｏｎｉｓｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１９－０５２６．

【0349】

以上、本発明の対象について記載したが、これをさまざまな形で改変または変更することが可能であることは明白であろう。かかる改変及び変更は、本発明の対象の趣旨及び範囲からの逸脱とは見なされず、すべてのかかる改変及び変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【表9-5】

【表9-6】

【表9-7】

【表9-8】

【表9-9】

【表9-10】

【表9-11】

【表9-12】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

2024527334000001.app

【国際調査報告】