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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-24
(54)【発明の名称】抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体及その応用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240717BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240717BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240717BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240717BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240717BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240717BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240717BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240717BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240717BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240717BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240717BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240717BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240717BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C12Q1/04
A61P35/00
A61K47/68
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K39/395 E
A61K39/395 T
G01N33/574 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500425
(86)(22)【出願日】2022-06-30
(85)【翻訳文提出日】2024-03-04
(86)【国際出願番号】 CN2022102842
(87)【国際公開番号】W WO2023274365
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】202110750848.6
(32)【優先日】2021-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524004836
【氏名又は名称】ナノマブ テクノロジー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＭＡＢ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】９／Ｆ Ｔｕｎｇ Ｎｉｎｇ Ｂｌｄ， ２４９－２５３ Ｄｅｓ Ｖｏｅｕｘ Ｒｏａｄ， Ｃｅｎｔｒａｌ， Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウォン，チュン リム
(72)【発明者】
【氏名】ティン，ホン ホイ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QR51
4B063QS33
4B063QX02
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA05
4B064DA14
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF68
4C085AA13
4C085AA19
4C085AA26
4C085AA27
4C085BB11
4C085CC21
4C085DD23
4C085DD31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA72
4H045DA83
4H045EA28
4H045EA51
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
抗体医薬の技術分野に関し、ＴＲＯＰ２に対する特異的単一ドメイン抗体コード配列およびその応用を提供する。提供される抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２抗原に効果的に結合することができ、核種カップリング薬、抗体薬物コンジュゲートおよび多重特異性抗体薬等のＴＲＯＰ２を標的とする薬物を開発するために基礎を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～２３に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４～２９に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０～３５に示されるＣＤＲ３を含むことを特徴とする、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【請求項2】
前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、以下：【表1】
請求項１に記載のＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【請求項3】
抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖であって、前記ＶＨＨ鎖は、フレームワーク領域（ＦＲ）および請求項１に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴とする、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖。
【請求項4】
抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体であって、前記単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２タンパク質に対する単一ドメイン抗体であり、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有することを特徴とする、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体。
【請求項5】
ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、請求項１に記載のＣＤＲ、請求項３に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または請求項４に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体からなる群から選択されるタンパク質をコードすることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
【請求項6】
発現ベクターであって、前記発現ベクターは、請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記発現ベクター。
【請求項7】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項６に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノムに請求項５に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項8】
抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を産生する方法であって、（ａ）単一ドメイン抗体を産生するのに適した条件下で、請求項７に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を含む培養物を得る段階、および
（ｂ）前記培養物から前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を分離または回収する段階
を含むことを特徴とする、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を産生する方法。
【請求項9】
免疫コンジュゲートであって、当該免疫コンジュゲートは、
（ａ）請求項３に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または請求項４に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分
を含むことを特徴とする、前記免疫コンジュゲート。
【請求項10】
請求項３に記載のＶＨＨ鎖、請求項４に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、または請求項９に記載の免疫コンジュゲートの使用であって、（ａ）ＴＲＯＰ２分子を検出するための試薬、（ｂ）腫瘍を治療するための薬物の調製に用いられることを特徴とする、前記請求項３に記載のＶＨＨ鎖、請求項４に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、または請求項９に記載の免疫コンジュゲートの使用。
【請求項11】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、（ｉ）請求項４に記載の単一ドメイン抗体または請求項９に記載の免疫コンジュゲート、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項12】
サンプル中のＴＲＯＰ２タンパク質のインビトロ（診断的および非診断的）検出のための方法であって、（１）サンプルを請求項４に記載の単一ドメイン抗体と接触させる段階と、
（２）抗原－抗体複合体が形成されているかどうかを検出する段階であって、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＴＲＯＰ２タンパク質が存在することを示す段階と
を含むことを特徴とする、前記サンプル中のＴＲＯＰ２タンパク質のインビトロ（診断的および非診断的）検出のための方法。
【請求項13】
腫瘍を治療する方法であって、必要とする対象に請求項４に記載の単一ドメイン抗体、請求項９に記載の免疫コンジュゲート、または請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項14】
前記腫瘍は、ＴＲＯＰ２の高発現上皮腫瘍であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記腫瘍は、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、乳頭状漿液性子宮内膜がん、またはその組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体の分野に関し、具体的には、ＴＲＯＰ２に対する特異的単一ドメイン抗体およびそのコード配列、ならびに疾患の診断および治療におけるその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）は、表皮糖タンパク質１（ＥＧＰ－１）、消化管腫瘍関連抗原（ＧＡ７３３－１）、表面マーカー１（Ｍ１Ｓ１）、腫瘍関連カルシウムイオンシグナルトランスデューサー２（ＴＡＣＳＴＤ２）としても知られている。ＴＲＯＰ２は、３５ｋＤａの１回膜貫通型糖タンパク質であり、当該ドメインは、一つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、一つのチロシングロブリン１型ドメイン（ＴＹ－１）および一つのシステインプアドメイン（ＣＰＤ）を含む。ＴＲＯＰ２は、主にカルシウムイオンシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、細胞周期タンパク質の発現を調節し、フィブロネクチン接着効果を低下させることにより、腫瘍細胞の成長、増殖および転移を促進する。
【0003】
研究により、ＴＲＯＰ２は、乳がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、前立腺がん、結腸がん等を含む様々な上皮がんで高度に発現し、その過剰発現は、予後不良および転移リスクの増加に関連することが示される。ＴＲＯＰ２は、正常な組織での発現が限定され、潜在的な治療毒性を効果的に軽減できるため、標的化治療の自然な候補標的となっている。抗体、抗体コンジュゲートおよび併用薬等のＴＲＯＰ２を標的とする様々な形態の薬物が臨床研究開発中である（Ｚａｍａｎ、２０１９）。ここで、ヒト化抗体ｈＲＳ７を標的化ベクターとして使用し、イリノテカン活性代謝生成物ＳＮ３８とカップリングして形成された新規抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であるトロデルヴイ（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ）（サシツズマブ ゴビテカン）が、転移性トリプルネガティブ乳がんおよび転移性尿路上皮細胞がんに対する応用がＦＤＡによって承認された。ここで、第３相ＡＳＣＥＮＴ研究のデータは、トロデルヴイが疾患の悪化または死亡のリスク（無増悪生存期間（ＰＦＳ））を５７％効果的に低下させ、中央値ＰＦＳを化学治療後の１．７か月から４．８か月に延長したことを証明した（ＨＲ：０．４３。９５％信頼区間：０．３５～０．５４、ｐ＜０．０００１）。さらに、死亡リスクを４９％低下させ、中央値の全生存期間（ＯＳ）が６．９か月から１１．８か月に延長される（ＨＲ：０．５１、９５％信頼区間：０．４１～０．６２、ｐ＜０．０００１）（Ｂａｒｄｉａ、２０２１）。さらに、ＴＲＯＰ２ベクター標識放射性同位体Ｌｕ１７７を標的としてＲＳ７抗体または抗体断片を使用する放射線免疫療法は、様々な腫瘍細胞株（Ｃａｌｕ－３およびＢｘＰＣ－３）の異種移植モデルにおいて顕著な特異的抗がん効果を有する（Ｖａｎ Ｒｉｊ、２０１４）。
【0004】
これまでのところ、ＴＲＯＰ２標的に対する単一ドメイン抗体薬は市場に存在せず、単一ドメイン抗体、即ちラクダ重鎖単一ドメイン抗体ＶＨＨ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、完全に機能し、安定し、抗原に結合できる現在入手可能な最小単位である。単一ドメイン抗体の分子量は、従来の抗体の１／１０であり、高い安定性、良好な水溶性、簡単なヒト化、高い標的化、強力な浸透性等という特徴を有する。単一ドメイン抗体は、放射性同位体を標的とするベクターとして、腫瘍組織に迅速かつ特異的に浸透して標的に結合できるが、結合していない抗体は、血液から迅速に除去され、体の放射能の線量を低下させることができるため、、放射線免疫イメージングおよび放射線免疫療法の開発においては、従来の抗体と比較して多くの明らかな利点を有する（Ｄ’Ｈｕｙｖｅｔｔｅｒ、２０１４）。
【0005】
従って、当技術分野では、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、特にＴＲＯＰ２に単一かつ効果的に結合できる特異的単一ドメイン抗体を開発し、新世代の放射線免疫イメージングおよび放射線免疫療法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、良好なＴＲＯＰ２抗原結合特性を有する抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の第１の態様は、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供し、前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～２３に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４～２９に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０～３５に示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～２３に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４～２９に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０～３５に示されるＣＤＲ３を含む。
【0008】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＶＨＨ鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４によって隔離される。
【0009】
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＣＤＲ３を含む。
【0010】
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＣＤＲ３を含む。
【0011】
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＣＤＲ３を含む。
【0012】
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、以下からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【表1】
【0013】
本発明の第２の態様は、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖を提供し、前記ＶＨＨ鎖は、フレームワーク領域（ＦＲ）および本発明の第１の態様に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【0014】
別の好ましい例において、前記フレームワーク領域は、（Ｚ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＦＲ４で構成される。
【0015】
別の好ましい例において、前記フレームワーク領域は、（Ｚ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＦＲ４で構成される。
【0016】
別の好ましい例において、前記フレームワーク領域は、（Ｚ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＦＲ４で構成される。
【0017】
別の好ましい例において、前記フレームワーク領域は、以下からなる群から選択されるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４で構成される。
【表2】
【0018】
別の好ましい例において、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【0019】
別の好ましい例において、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【0020】
本発明の第３の態様は、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を提供し、前記単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２タンパク質に対する単一ドメイン抗体であり、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する。
【0021】
別の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する。
別の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する。
別の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する。
別の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する。
別の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する。
【0022】
本発明の第４の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様に記載のＣＤＲ領域、本発明の第２の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または本発明の第３の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体からなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【0023】
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９～１６のいずれか１つに示されるようなヌクレオチド配列を有する。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【0024】
本発明の第５の態様は、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、本発明の第４の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
別の好ましい例において、前記発現ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、例えばアデノウイルス等の哺乳動物細胞ウイルス、レトロウイルス、または他のベクターを含む。
別の好ましい例において、前記発現ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、例えばアデノウイルス等の哺乳動物細胞ウイルス、レトロウイルス、または他のベクターを含む。
【0025】
本発明の第６の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第５の態様に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノムには本発明の第４の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている。
【0026】
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞からなる群から選択される。
【0027】
本発明の第７の態様は、
（ａ）単一ドメイン抗体を産生するのに適した条件下で、本発明の第６の態様に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を含む培養物を得る段階と、および（ｂ）前記培養物から前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を分離または回収する段階とを含む、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を産生する方法を提供する。
（ａ）単一ドメイン抗体を産生するのに適した条件下で、本発明の第６の態様に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を含む培養物を得る段階と、および（ｂ）前記培養物から前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を分離または回収する段階とを含む、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を産生する方法を提供する。
【0028】
別の好ましい例において、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有する。
【0029】
本発明の第８の態様は、免疫コンジュゲートを提供し、当該免疫コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第２の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または本発明の第３の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、および（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分を含む。
（ａ）本発明の第２の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または本発明の第３の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、および（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分を含む。
【0030】
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、薬物または毒素である。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、検出可能なマーカーである。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、検出可能なマーカーである。
【0031】
別の好ましい例において、前記コンジュゲートは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２等）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学治療剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等から選択される。
【0032】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、多価（例えば、二価）の、本発明の第２の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖および本発明の第３の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を含む。
【0033】
別の好ましい例において、前記多価とは、前記免疫コンジュゲートのアミノ酸配列が、複数の反復する、本発明の第２の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖および本発明の第３の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を含むことを指す。
【0034】
本発明の第９の態様は、（ａ）ＴＲＯＰ２分子を検出するための試薬、（ｂ）腫瘍を治療するための薬物の調製に使用される、本発明の第２の態様に記載のＶＨＨ鎖、本発明の第３の態様に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供する。
【0035】
別の好ましい例において、前記検出は、フローサイトメトリー検出、細胞免疫蛍光検出を含む。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、ＴＲＯＰ２の高発現上皮腫瘍である。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、ＴＲＯＰ２の高発現上皮腫瘍である。
【0036】
別の好ましい例において、前記腫瘍は、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、乳頭状漿液性子宮内膜がん、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0037】
本発明の第１０の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、（ｉ）本発明の第３の態様に記載の単一ドメイン抗体または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートと、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む。
【0038】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、注射剤形である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍を治療するための薬物の調製に使用され、前記腫瘍は、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、乳頭状漿液性子宮内膜がん、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍を治療するための薬物の調製に使用され、前記腫瘍は、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、乳頭状漿液性子宮内膜がん、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0039】
本発明の第１１の態様は、サンプル中のＴＲＯＰ２タンパク質のインビトロ（診断的および非診断的）検出のための方法を提供し、
（１）サンプルと本発明の第３の態様に記載の単一ドメイン抗体または本発明の第８態様に記載の免疫コンジュゲートとを接触させる段階と、
（２）抗原－抗体複合体が形成されているかどうかを検出する段階であって、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＴＲＯＰ２タンパク質が存在することを示す段階とを含む。
（１）サンプルと本発明の第３の態様に記載の単一ドメイン抗体または本発明の第８態様に記載の免疫コンジュゲートとを接触させる段階と、
（２）抗原－抗体複合体が形成されているかどうかを検出する段階であって、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＴＲＯＰ２タンパク質が存在することを示す段階とを含む。
【0040】
本発明の第１２の態様は、必要とする対象に本発明の第３の態様に記載の単一ドメイン抗体、本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲート、または本発明の第十態様に記載の医薬組成物を投与することを含む、腫瘍を治療する方法を提供する。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、ＴＲＯＰ２の高発現上皮腫瘍である。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、ＴＲＯＰ２の高発現上皮腫瘍である。
【0041】
別の好ましい例において、前記腫瘍は、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、乳頭状漿液性子宮内膜がん、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む。
別の好ましい例において、前記対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む。
【発明の効果】
【0042】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【図1】ヒトＴＲＯＰ２－Ｆｃタンパク質抗原の検出結果である。結果は、当該タンパク質の純度がＳＤＳ－ＰＡＧＥで９０％以上に達することを示す。
【図2】二つの抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーの構築および品質検出の結果である。図２のＡは、二つのライブラリーの１番目および２番目のＰＣＲ増幅生成物のＰＣＲ同定図であり、結果は、最終的に約４００ｂｐの大きさのＶＨＨ遺伝子断片が得られることを示し、図２のＢは、二つのライブラリーのライブラリー容量検出図であり、結果は、二つのライブラリーのライブラリー容量がそれぞれ７．１ｘ１０８および５．０ｘ１０８ＣＦＵであり、図２のＣは、二つのライブラリーの挿入率検出図であり、結果は、二つのライブラリーのＶＨＨ挿入率がそれぞれ９６％および８８％であることを示し、図２のＤは、二つのライブラリーの濃縮検出図であり、結果は、３ラウンドのスクリーニング後に二つのライブラリーの特異的ファージがそれぞれ２４倍および１５０倍の濃縮に達することを示す。
【図3】抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＴＲＯＰ２陽性発現ＢｘＰｃ３細胞に対する結合活性をフローサイトメトリーで検出した結果を示す。結果は、八つの単一ドメイン抗体すべてがＢｘＰｃ３細胞表面のＴＲＯＰ２タンパク質に効果的に結合できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0044】
本発明者らは、広範囲かつ綿密な研究および大量のスクリーニング後、初めて抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を開発することに成功した。実験結果は、本発明で得られた八つのＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体すべてが、ヒトまたはサルのＴＲＯＰ２タンパク質に高親和性で特異的に結合できることを示す。また、本発明の単一ドメイン抗体は、より広い範囲をカバーする異なるＴＲＯＰ２ドメインに結合することができる。
【0045】
具体的には、本発明は、ヒトＴＲＯＰ２細胞外セグメント抗原タンパク質を使用してラクダを免疫し、高品質の免疫単一ドメイン抗体遺伝子ライブラリーを取得する。次いでＴＲＯＰ２タンパク質分子をマイクロプレートにカップリングし、ＴＲＯＰ２タンパク質の正確な空間構造を表示し、この形態の抗原で、ファージディスプレイ技術を使用して免疫単一ドメイン抗体遺伝子ライブラリー（ラクダ重鎖抗体ファージディスプレイ遺伝子ライブラリー）をスクリーニングし、それによってＴＲＯＰ２特異的単一ドメイン抗体遺伝子を取得する。この遺伝子を大腸菌に導入し、それにより大腸菌で効率的に発現できる特異性の高い単一ドメイン抗体株を取得する。
【0046】
用語
本明細書で使用されるように、「本発明の単一ドメイン抗体」、「本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体」、「本発明のＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体」という用語は、交換可能に使用され、すべてがＴＲＯＰ２（ヒトＴＲＯＰ２を含む）を特異的に識別および結合する単一ドメイン抗体を指す。特に好ましくは、ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１、４、８に示されるよう単一ドメイン抗体であり、最も好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるようなＶＨＨ鎖を有する単一ドメイン抗体である。
本明細書で使用されるように、「本発明の単一ドメイン抗体」、「本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体」、「本発明のＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体」という用語は、交換可能に使用され、すべてがＴＲＯＰ２（ヒトＴＲＯＰ２を含む）を特異的に識別および結合する単一ドメイン抗体を指す。特に好ましくは、ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１、４、８に示されるよう単一ドメイン抗体であり、最も好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるようなＶＨＨ鎖を有する単一ドメイン抗体である。
【0047】
本明細書で使用されるように、「単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨ」、「ナノボディ」（ｎａｎｏｂｏｄｙ）という用語は、同じ意味を有し、且つ交換可能に使用され、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、完全に機能する最小の抗原結合断片である一つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築することを指す。通常、軽鎖および重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を自然に欠如した抗体を取得した後、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築することを指す。
【0048】
本明細書で使用されるように、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖は、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域が続く。各軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）を有し、別の端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域に対向し、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域に対向する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖との可変領域間で界面を形成する。
【0049】
本明細書で使用されるように、「可変」という用語は、抗体中の可変領域の特定の部分の配列が異なることを表し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均等に分散されていない。これは、軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中する。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらは、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続された大抵β－フォールディング構成にあり、場合によっては部分的なβフォールディング構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に近接され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９ページ（１９９１）を参照する）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与するが、それらは、抗体の抗体依存性細胞毒性に関与する等、様々なエフェクター機能を示す。
【0050】
本明細書で使用されるように、「重鎖可変領域」および「ＶＨ」という用語は、交換可能に使用される。
本明細書で使用されるように、「可変領域」および「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」という用語は、交換可能に使用される。
本明細書で使用されるように、「可変領域」および「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」という用語は、交換可能に使用される。
【0051】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、三つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
【0052】
本発明において、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチド等の、すべてがＴＲＯＰ２タンパク質に特異的に結合するポリペプチドを指す。それらは、出発メチオニンを含むか、または含まないことができる。
【0053】
本発明は、本発明の抗体を有する他のタンパク質または融合発現生成物をさらに提供する。具体的には、本発明は、当該可変領域が本発明の抗体の重鎖可変領域と同一であるか、または少なくとも９０％同一性、好ましくは少なくとも９５％同一性である限り、可変領域を含む重鎖の任意のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現生成物（即ち、免疫コンジュゲートおよび融合発現生成物）を含む。
【0054】
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎖可変領域に位置する三つの特定の領域によって説明でき、当該セクションを四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割され、四つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的に保存され、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは、環状構造を形成し、その間のＦＲによって形成されたβフォールディングは、空間構造的に近接し、重鎖のＣＤＲおよびそれに対応する軽鎖のＣＤＲは、抗体の抗原結合部位を構成する。同種の抗体のアミノ酸配列を比較することにより、ＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するアミノ酸を決定することができる。
【0055】
本発明の抗体の重鎖可変領域は、その少なくとも一部が抗原との結合に関与しているため、特に興味深い。従って、本発明は、そのＣＤＲが本明細書で同定されるＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）を有する相同性がある限り、ＣＤＲを有する抗体重鎖可変領域を有する分子を含む。
【0056】
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫学的活性を有する抗体のフラグメントまたは抗体および他の配列によって形成された融合タンパク質も含む。従って、本発明は、前記抗体のフラグメント、誘導体および類似体をさらに含む。
【0057】
本明細書に使用されるように、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の抗体と基本的に同じ生物学機能または活性を保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体または類似体は、（ｉ）一つまたは複数の保存的または非保存性的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド（このように置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってエンコードされる場合とされない場合であり得る）、または（ｉｉ）一つのまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチドまたは（ｉｖ）追加のアミノ酸配列がポリペプチド配列に融合されることによって形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質配列または６Ｈｉｓタグと形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書の教示によると、これらのフラグメント、誘導体および類似体は、当業者の周知の範囲内である。
【0058】
本発明の抗体とは、ＴＲＯＰ２タンパク質に対する結合活性を有し、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドを指す。当該用語は、本発明の抗体と同じ機能を有し、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異形態をさらに含む。これらの変異形態は、一つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、およびＣ末端および／またはＮ末端での一つまたはいくつかのアミノ酸の添加を含む（これらに限定されない）。例えば、当技術分野では、類似または同様の特性を有するアミノ酸によって置換される場合、通常、タンパク質の機能を変化させない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端に一つまたはいくつかのアミノ酸を添加しても、通常はタンパク質の機能を変化させない。当該用語は、本発明の抗体の活性断片および活性誘導体をさらに含む。
【0059】
当該ポリペプチドの変異形態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低いストリンジェンシー条件下で本発明の抗体のコーティングＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡによってコードされるタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を使用することによって得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
【0060】
本発明は、単一ドメイン抗体またはその断片を含む融合タンパク質等の、他のポリペプチドをさらに提供する。ほぼ全長ポリペプチドに加えて、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体の断片をさらに含む。通常、当該断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続したアミノ酸を有する。
【0061】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大で１０個、好ましくは、最大で８個、より好ましくは、最大で５個、最も好ましくは、最大で３個のアミノ酸が同様または類似の性質を有するアミノ酸の置換によって形成されたポリペプチドを指す。これらの保存性変異体ポリペプチドは、表Ａに従って、アミノ酸置換を行うことにより生成されるのが最もよい。
【表3】
【0062】
本発明は、前記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
【0063】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の追加のコード配列）および非コード配列を含む。
【0064】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。
【0065】
本発明は、前記配列とハイブリダイズし、二つの配列間で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、特に、ストリンジェント条件下で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェント条件」とは、（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃等のより低いイオン強度およびより高い温度でのハイブリダイズおよび溶出、または（２）ハイブリダイズ中に、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２℃等の変性剤の添加、または（３）二つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは、９５％以上である場合にのみおこるハイブリダイズを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【0066】
本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得ることができる。特にフラグメントの長さが短い場合、実行可能な方法は、人工合成法を使用して関連する配列を合成することである。一般に、最初に複数の小さなフラグメントを合成した後、接続して非常に長い配列のフラグメントを獲得する。さらに、重鎖のコード配列および発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合させて、融合タンパク質を形成することができる。
【0067】
関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。通常、これは、それをベクターにクローニングし、次に細胞に形質転換し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。
【0068】
現在、完全に化学的合成によって本発明のタンパク質（またはそのフラグメントまたはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって突然変異を本発明のタンパク質配列に導入することができる。
【0069】
本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。
【0070】
宿主細胞は、例えば、細菌細胞等の原核細胞、または例えば、酵母細胞等の下等真核細胞、または例えば、哺乳動物細胞等の上等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７および２９３細胞の動物細胞等を含む。
【0071】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡ吸収することができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後にＣａＣｌ２法で処理されることによって獲得され、使用される段階は、当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションの方法によって、形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法，マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション等の従来の機械的方法、リポソームパッケージ等のようなＤＮＡトランスフェクション方法を選択することができる。
【0072】
得られた形質転換体を従来の方法で培養して、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）を使用して選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間さらに培養する。
【0073】
前記方法における組換えポリペプチドは、細胞内、または細胞膜で発現されるか、または細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、物理的、化学的およびその他の特性を使用して、様々な単離方法で組換えされたタンパク質を単離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0074】
本発明の抗体は、単独で使用することができ、検出可能なマーカー（診断目的のために）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分または任意のこれらの物質の組み合わせと結合またはカップリングすることができる。
【0075】
診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピュータ断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。
【0076】
本発明の抗体と結合またはカップリングすることができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物学的毒性、３．ＩＬ－２等のサイトカイン、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．ナノ磁性粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、９．治療薬（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
【0077】
医薬組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（これらに限定されない）。
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（これらに限定されない）。
【0078】
本発明の医薬組成物は、ＴＲＯＰ２タンパク質分子に結合するために直接使用されることができ、従って、腫瘍を治療するために使用されることができる。さらに、他の治療剤を同時に使用することもできる。
【0079】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記単一ドメイン抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療剤とともに使用することもできる。
【0080】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。
【0081】
標識された単一ドメイン抗体
本発明の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体は、検出可能なマーカーを有する。より好ましくは、前記マーカーは、同位体、金コロイドマーカー、着色マーカーまたは蛍光マーカーからなる群から選択される。
本発明の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体は、検出可能なマーカーを有する。より好ましくは、前記マーカーは、同位体、金コロイドマーカー、着色マーカーまたは蛍光マーカーからなる群から選択される。
【0082】
金コロイド標識は、当業者に知られている方法を使用して行われることができる。本発明の好ましい実施形態において、抗ＴＲＯＰ２の単一ドメイン抗体は、金コロイドで標識して、金コロイド標識の単一ドメイン抗体を得る。本発明の別の好ましい実施形態において、抗ＴＲＯＰ２の単一ドメイン抗体は、放射性同位体で標識して、同位体標識の単一ドメイン抗体を得る。
本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、良好な特異性、および高い力価を有する。
本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、良好な特異性、および高い力価を有する。
【0083】
検出方法
本発明は、ＴＲＯＰ２タンパク質を検出する方法にも関する。当該方法の段階は、次のとおりである。細胞および／または組織サンプルを取得し、サンプルを媒体に溶解し、前記溶解したサンプルでＴＲＯＰ２タンパク質のレベルを検出する。
本発明の検出方法において、使用されたサンプルは、特に限定されず、代表的な例としては、細胞保存液に存在する細胞含有サンプルが挙げられる。
本発明は、ＴＲＯＰ２タンパク質を検出する方法にも関する。当該方法の段階は、次のとおりである。細胞および／または組織サンプルを取得し、サンプルを媒体に溶解し、前記溶解したサンプルでＴＲＯＰ２タンパク質のレベルを検出する。
本発明の検出方法において、使用されたサンプルは、特に限定されず、代表的な例としては、細胞保存液に存在する細胞含有サンプルが挙げられる。
【0084】
キット
本発明は、本発明の抗体（または其断片）または検出プレートを含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝剤等をさらに含む。
本発明は、ＴＲＯＰ２レベルを検出するための検出キットをさらに提供し、当該キットは、ＴＲＯＰ２タンパク質を識別する抗体、サンプルを溶解するための溶解媒体、例えば様々な緩衝液、検出標識、検出基質等の、検出に必要な一般的な試薬および緩衝液を含む。当該検出キットは、インビトロ診断装置であり得る。
本発明は、本発明の抗体（または其断片）または検出プレートを含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝剤等をさらに含む。
本発明は、ＴＲＯＰ２レベルを検出するための検出キットをさらに提供し、当該キットは、ＴＲＯＰ２タンパク質を識別する抗体、サンプルを溶解するための溶解媒体、例えば様々な緩衝液、検出標識、検出基質等の、検出に必要な一般的な試薬および緩衝液を含む。当該検出キットは、インビトロ診断装置であり得る。
【0085】
応用
上述のように、本発明の単一ドメイン抗体は、広範囲な生物学的応用価値および臨床応用価値を有し、その応用は、ＴＲＯＰ２関連疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学研究等の複数の分野に関する。好ましい応用は、ＴＲＯＰ２に対する臨床診断および標的治療である。
上述のように、本発明の単一ドメイン抗体は、広範囲な生物学的応用価値および臨床応用価値を有し、その応用は、ＴＲＯＰ２関連疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学研究等の複数の分野に関する。好ましい応用は、ＴＲＯＰ２に対する臨床診断および標的治療である。
【0086】
本発明は、腫瘍の診断および治療における抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体の応用を提供し、前記腫瘍は、ＴＲＯＰ２の発現が異常に高い（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを含む）上皮腫瘍であり、具体的には、前記腫瘍は、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、乳頭状漿液性子宮内膜がん等を含むが、これらに限定されない。
【0087】
本発明の主な利点は、次のとおりである。
（ａ）本発明は、ＴＲＯＰ２標的に対する単一ドメイン抗体を初めて開発した。
（ｂ）本発明の単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２タンパク質に対して高い結合親和性を有する。
（ｃ）本発明の単一ドメイン抗体は、異なる標的に結合でき、且つ三つの異なるＴＲＯＰ２ドメインに結合できる。
（ｄ）本発明の単一ドメイン抗体は、良好な特異性を有し、ヒトおよびアカゲザルのＴＲＯＰにのみ結合する。
（ｅ）本発明の単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２高発現腫瘍モデルに効果的に集積することができ、ＴＲＯＰ２を標的とする癌の診断および有効性評価に適用することができ、同時に、新世代の新世代のＴＲＯＰ２標的治療方の開発に使用されることができ、
（ｆ）本発明の単一ドメイン抗体の調製方法は、簡単であり、大量生産が容易である。
（ａ）本発明は、ＴＲＯＰ２標的に対する単一ドメイン抗体を初めて開発した。
（ｂ）本発明の単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２タンパク質に対して高い結合親和性を有する。
（ｃ）本発明の単一ドメイン抗体は、異なる標的に結合でき、且つ三つの異なるＴＲＯＰ２ドメインに結合できる。
（ｄ）本発明の単一ドメイン抗体は、良好な特異性を有し、ヒトおよびアカゲザルのＴＲＯＰにのみ結合する。
（ｅ）本発明の単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２高発現腫瘍モデルに効果的に集積することができ、ＴＲＯＰ２を標的とする癌の診断および有効性評価に適用することができ、同時に、新世代の新世代のＴＲＯＰ２標的治療方の開発に使用されることができ、
（ｆ）本発明の単一ドメイン抗体の調製方法は、簡単であり、大量生産が容易である。
【0088】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに詳細に説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、詳細な条件を示さない実験方法は、通常、例えば、米国Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」（黄培堂翻訳、北京、科学出版社、２００２年）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量によって計算される。以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、特に明記しない限り、市販のチャネルから入手することができる。
【0089】
実施例１：ヒトＴＲＯＰ２－Ｆｃタンパク質抗原の発現
哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｆを使用して、ヒトＴＲＯＰ２細胞外セグメントタンパク質を一時的に発現する。ヒトＴＲＯＰ２細胞外セグメント遺伝子をｐＦＵＳＥ－ＩｇＧ組換えプラスミドにクローニングし、トランスフェクション試薬ＰＥＩ１：３と混合した後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、６％ＣＯ２シェーカーインキュベーターで６日間培養し、その後細胞上清を収集し、室温でプロテインＡビーズと１時間結合させ、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．０でビーズを洗浄した後、０．１Ｍグリシン溶液ｐＨ３．０でタンパク質を溶出し、溶出したタンパク質をＰＢＳ溶液に限外ろ過し、収量を測定した後、サンプルを採取してＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を実施する。
哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｆを使用して、ヒトＴＲＯＰ２細胞外セグメントタンパク質を一時的に発現する。ヒトＴＲＯＰ２細胞外セグメント遺伝子をｐＦＵＳＥ－ＩｇＧ組換えプラスミドにクローニングし、トランスフェクション試薬ＰＥＩ１：３と混合した後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、６％ＣＯ２シェーカーインキュベーターで６日間培養し、その後細胞上清を収集し、室温でプロテインＡビーズと１時間結合させ、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．０でビーズを洗浄した後、０．１Ｍグリシン溶液ｐＨ３．０でタンパク質を溶出し、溶出したタンパク質をＰＢＳ溶液に限外ろ過し、収量を測定した後、サンプルを採取してＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を実施する。
【0090】
検出結果は、図１に示されたとおりであり、ＴＲＯＰ２－Ｆｃタンパク質抗原の純度は、９０％を超え、ラクダ免疫および抗体スクリーニングに使用されることができる。
【0091】
実施例２：ヒトＴＲＯＰ２細胞外セグメントタンパク質免疫ライブラリーの構築およびスクリーニング
精製したＴＲＯＰ２－Ｆｃタンパク質で２頭の新疆フタコブラクダを免疫し、７回の免疫後、ラクダの末梢血から全ＲＮＡを分離し、逆転写およびＰＣＲによりＶＨＨ遺伝子を増幅し（図２のＡ）、ＶＨＨ遺伝子をファージベクターｐＭＥＣＳにクローニングし、ＴＧ１宿主細胞に形質転換してファージディスプレイライブラリーを構築する。二つの構築ライブラリーを段階希釈した後にプレーティングして、ライブラリー容量を測定し、同時に各構築ライブラリーから２４個のクローンをランダムに選択して、コロニーＰＣＲ検出を実行する。
精製したＴＲＯＰ２－Ｆｃタンパク質で２頭の新疆フタコブラクダを免疫し、７回の免疫後、ラクダの末梢血から全ＲＮＡを分離し、逆転写およびＰＣＲによりＶＨＨ遺伝子を増幅し（図２のＡ）、ＶＨＨ遺伝子をファージベクターｐＭＥＣＳにクローニングし、ＴＧ１宿主細胞に形質転換してファージディスプレイライブラリーを構築する。二つの構築ライブラリーを段階希釈した後にプレーティングして、ライブラリー容量を測定し、同時に各構築ライブラリーから２４個のクローンをランダムに選択して、コロニーＰＣＲ検出を実行する。
【0092】
結果は、二つの構築ライブラリーライブラリー容量がそれぞれ７．１×１０８および５．０×１０８ＣＦＵ（図２のＢ）であり、ライブラリー挿入率がそれぞれ９１．６％、９６％および８８％であることを示す（図２のＣ）。
【0093】
その後ファージディスプレイ技術を使用して「吸着－洗浄－濃縮」を３回実施することにより、最終的に二つのライブラリーの特異的ファージがそれぞれ２４培および１５０倍の濃縮に達する（図２のＤ）。上記の濃縮ファージクローンから、ヒトＴＲＯＰ２－Ｆｃに対するＰＥ－ＥＬＩＳＡ同定のために６００個がランダムに選択され、得られた陽性クローン（比率＞３）すべてがシーケンシングされ、同定され、異なる配列を有するすべての単一ドメイン抗体（１０１株）は、候補として検討される。
【0094】
実施例３：抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体の発現および精製
実施例２のシーケンシング分析により得られた抗体クローンから４８株を選択し、各プラスミドを大腸菌ＷＫ６にエレクトロポレーションし、ＬＡ＋葡萄糖的培養平プレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、シングルコロニーを選択し、５ｍＬのアンピシリン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃シェーカーで一晩培養し、１ｍＬの一晩菌種を３３０ｍＬのＴＢ培地に接種し、３７℃シェーカーで培養し、ＯＤ０．６～１に培養したら、ＩＰＴＧを加え、２８℃シェーカーで一晩培養し、遠心分離によって細菌を収集し、浸透法によって粗抗体抽出液を取得し、ニッケルカラムイオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製単一ドメイン抗体を調製する。
実施例２のシーケンシング分析により得られた抗体クローンから４８株を選択し、各プラスミドを大腸菌ＷＫ６にエレクトロポレーションし、ＬＡ＋葡萄糖的培養平プレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、シングルコロニーを選択し、５ｍＬのアンピシリン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃シェーカーで一晩培養し、１ｍＬの一晩菌種を３３０ｍＬのＴＢ培地に接種し、３７℃シェーカーで培養し、ＯＤ０．６～１に培養したら、ＩＰＴＧを加え、２８℃シェーカーで一晩培養し、遠心分離によって細菌を収集し、浸透法によって粗抗体抽出液を取得し、ニッケルカラムイオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製単一ドメイン抗体を調製する。
【0095】
検出により、発現および精製された単一ドメイン抗体の純度が９０％を超え、候補機能活性の研究に使用され、最終的には以下の八つの主要な単一ドメイン抗体を得る。
【表4】
【0096】
八つの単一ドメイン抗体の配列は、以下に示されたとおりであり、三つのＣＤＲ領域は、それぞれ下線が付けられている。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
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【0097】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
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【0101】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
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【0104】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
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【0106】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
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【0107】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
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【0108】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
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【0109】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
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【0110】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＧＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＧＣＡＧＧＧＴＡＴＴＡＴＣＡＴＡＧＴＧＧＧＧＧＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＧＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＴＴＡＴＣＣＧＴＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
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【0111】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＣＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＧＣＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＧＡＴＡＡＣＧＧＣＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＴＡＧＧＴＡＣＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
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【0112】
実施例４：抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体および異なる種のＴＲＯＰ２の酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）検出
ヒト、マウスおよびアカゲザル種のＴＲＯＰ２－Ｆｃ抗原タンパク質を使用してマイクロプレートを調製し、４℃で一晩保持し、翌日、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１％ＢＳＡを加え、室温で２時間密閉し、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、段階希釈した抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ可溶性基質を加え、室温で１０分間置き、４５０ｎｍ波長での吸収値を読み取り、吸収値に基づいて各単一ドメイン抗体Ｋｄ値を計算する。
ヒト、マウスおよびアカゲザル種のＴＲＯＰ２－Ｆｃ抗原タンパク質を使用してマイクロプレートを調製し、４℃で一晩保持し、翌日、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１％ＢＳＡを加え、室温で２時間密閉し、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、段階希釈した抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ可溶性基質を加え、室温で１０分間置き、４５０ｎｍ波長での吸収値を読み取り、吸収値に基づいて各単一ドメイン抗体Ｋｄ値を計算する。
【0113】
検出結果は、表２に示されたとおりであり、本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、ヒトおよびアカゲザルのＴＲＯＰにのみ結合する。
【表5】
【0114】
実施例５：抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体およびヒトＴＲＯＰ２のタンパク質結合動態（Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ）の検出
カルボキシルアミノ反応を利用して定常期ヒトＴＲＯＰ２－Ｆｃ抗原タンパク質をＣＭ－５センサーチップの表面に固定化し、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体をＨＢＳ緩衝液で異なる濃度に希釈し、３０ｕｌ／分間の流速で抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、９０秒間結合した後に６００秒間解離し、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体と抗原との結合プロセスを観察し、１０ｍＭのグリシン溶液で洗い流してチップを再生させた後、次の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体の測定に進む。
カルボキシルアミノ反応を利用して定常期ヒトＴＲＯＰ２－Ｆｃ抗原タンパク質をＣＭ－５センサーチップの表面に固定化し、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体をＨＢＳ緩衝液で異なる濃度に希釈し、３０ｕｌ／分間の流速で抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、９０秒間結合した後に６００秒間解離し、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体と抗原との結合プロセスを観察し、１０ｍＭのグリシン溶液で洗い流してチップを再生させた後、次の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体の測定に進む。
【0115】
検出結果は、表３に示されたとおりであり、本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＴＲＯＰ２－Ｆｃタンパク質への結合は、すべてｎＭに達することができる。
【表6】
【0116】
実施例６：ヒトＴＲＯＰ２ドメインに結合する抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＥＬＩＳＡ検出
異なるヒトＴＲＯＰ２ドメインのＦｃ抗原タンパク質を使用してマイクロプレートを調製し、４℃で一晩保持し、翌日、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１％ＢＳＡを加え、室温で２時間密閉し、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、段階希釈した抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ可溶性基質を加え、室温で１０分間置き、４５０ｎｍ波長での吸収値を読み取り、吸収値に基づいて各単一ドメイン抗体Ｋｄ値を計算する。検出結果は、表４に示されたとおりであり、本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、異なるＴＲＯＰ２ドメインに結合する。
異なるヒトＴＲＯＰ２ドメインのＦｃ抗原タンパク質を使用してマイクロプレートを調製し、４℃で一晩保持し、翌日、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１％ＢＳＡを加え、室温で２時間密閉し、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、段階希釈した抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、マウス抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ可溶性基質を加え、室温で１０分間置き、４５０ｎｍ波長での吸収値を読み取り、吸収値に基づいて各単一ドメイン抗体Ｋｄ値を計算する。検出結果は、表４に示されたとおりであり、本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、異なるＴＲＯＰ２ドメインに結合する。
【表7】
【0117】
実施例７：抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体およびヒトＴＲＯＰ２エピトープ同定グループのＥＬＩＳＡ検出
異なる抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を使用してマイクロプレートを調製し、４℃で一晩保持し、翌日、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１３％ＢＳＡを加え、室温で１時間密閉し、ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ヒトＴＲＯＰ２－Ｆｃおよび抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、３７℃で１時間置き、抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＴＭＢ可溶性基質を加え、室温で２分間置き、４５０ｎｍ波長での吸収値を読み取り、吸収値に基づいて各単一ドメイン抗体の競合結果を計算する。
異なる抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を使用してマイクロプレートを調製し、４℃で一晩保持し、翌日、ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１３％ＢＳＡを加え、室温で１時間密閉し、ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ヒトＴＲＯＰ２－Ｆｃおよび抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、３７℃で１時間置き、抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ抗体を加え、３７℃で１時間置き、ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄し、ＴＭＢ可溶性基質を加え、室温で２分間置き、４５０ｎｍ波長での吸収値を読み取り、吸収値に基づいて各単一ドメイン抗体の競合結果を計算する。
【0118】
検出結果は、表５に示されたとおりであり、本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、結合エピトープに応じて四つのグループに分けることができ、ここで、ＭＹ１５３０－１－２０、ＭＹ１５３０－１－２６およびＭＹ１５３０－２－５３は、グループ１であり、ＭＹ１５３０－４－２２、ＭＹ１５３０－５－１７およびＭＹ１５３０－５－５４は、グループ２であり、ＭＹ１５３０－４－２８は、グループ３であり、ＭＹ１５３０－６－１は、グループ４である。
【表8】
【0119】
実施例８：抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体と腫瘍細胞のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）検出
ＴＲＯＰ２を高発現する腫瘍細胞ＢｘＰｃ３を使用して抗体結合機能を検証する。培養したＢｘＰｃ３細胞をトリプシンで消化し、且つ完全培地で中和した後、ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、次いで細胞を収集し、９６ウェルプレートに均等に分配し、ヒトＦｃブロッキング抗体を加え、４℃で１５分間インキュベートし、遠心分離後にＰＢＳで細胞を１回洗浄し、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体または非標的単一ドメイン抗体（陰性対照）を加え、４℃で３０分間インキュベートし、遠心分離後にＰＢＳで細胞を１回洗浄し、抗ＨＡ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８またはマウスおよびウサギの抗ＴＲＯＰ２－ＦＩＴＣ抗体（陽性対照）を加え、４℃で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨て、２００ｕｌのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによって各サンプルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８シグナルを検出する。
ＴＲＯＰ２を高発現する腫瘍細胞ＢｘＰｃ３を使用して抗体結合機能を検証する。培養したＢｘＰｃ３細胞をトリプシンで消化し、且つ完全培地で中和した後、ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、次いで細胞を収集し、９６ウェルプレートに均等に分配し、ヒトＦｃブロッキング抗体を加え、４℃で１５分間インキュベートし、遠心分離後にＰＢＳで細胞を１回洗浄し、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体または非標的単一ドメイン抗体（陰性対照）を加え、４℃で３０分間インキュベートし、遠心分離後にＰＢＳで細胞を１回洗浄し、抗ＨＡ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８またはマウスおよびウサギの抗ＴＲＯＰ２－ＦＩＴＣ抗体（陽性対照）を加え、４℃で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨て、２００ｕｌのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによって各サンプルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８シグナルを検出する。
【0120】
結果は、図３に示されたとおりであり、本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、腫瘍細胞の表面のＴＲＯＰ２タンパク質に効果的に結合することができる。
【0121】
実施例９：マウス腫瘍異種移植モデルにおける抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング
トリカルボニルキットに過テクネチウム塩を加え、９９℃で２０分間インキュベートし、試薬ボトルを室温に冷却し、塩酸を加え、テクネチウムトリカルボニルをｐＨ７～７．５に中和し、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、薄層クロマトグラフィーを使用して、テクネチウム標識抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体に対して放射純度同定を実行する。
トリカルボニルキットに過テクネチウム塩を加え、９９℃で２０分間インキュベートし、試薬ボトルを室温に冷却し、塩酸を加え、テクネチウムトリカルボニルをｐＨ７～７．５に中和し、抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、薄層クロマトグラフィーを使用して、テクネチウム標識抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体に対して放射純度同定を実行する。
【0122】
ヌードマウスの右背中の皮下に１×１０７個のＴＲＯＰ２高発現（ＢｘＰｃ３）細胞を接種し、正式な実験研究のために腫瘍が１５０～２００ｍｍ３に成長するまで待ち、イソフルランで担癌マウスを麻酔し、テクネチウム標識抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体（～１０ｕｇ、３７ＭＢｑ）を尾静脈内注射し、投与９０分後にスキャンを実行し、採取方法は、静的な１５分間のＳＰＥＣＴと、中解像度の全身ＣＴである。
【0123】
本発明の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２高発現腫瘍モデルに効果的に蓄積することができ、ＴＲＯＰ２を標的とする癌の診断および薬効評価に使用されることができ、同時に新世代のＴＲＯＰ２を標的とした治療法の開発にも使用されることができる。
【0124】
本発明のアミノ酸配列情報
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【0125】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７～２３に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４～２９に示されるＣＤＲ２、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０～３５に示されるＣＤＲ３を含むことを特徴とする、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【請求項2】
前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、以下：【表1】
請求項１に記載のＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【請求項3】
抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖であって、前記ＶＨＨ鎖は、フレームワーク領域（ＦＲ）および請求項１に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴とする、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖。
【請求項4】
抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体であって、前記単一ドメイン抗体は、ＴＲＯＰ２タンパク質に対する単一ドメイン抗体であり、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有することを特徴とする、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体。
【請求項5】
ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、請求項１に記載のＣＤＲ、請求項３に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または請求項４に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体からなる群から選択されるタンパク質をコードすることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
【請求項6】
発現ベクターであって、前記発現ベクターは、請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記発現ベクター。
【請求項7】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項６に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノムに請求項５に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項8】
抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を産生する方法であって、（ａ）単一ドメイン抗体を産生するのに適した条件下で、請求項７に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を含む培養物を得る段階、および
（ｂ）前記培養物から前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を分離または回収する段階
を含むことを特徴とする、前記抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体を産生する方法。
【請求項9】
免疫コンジュゲートであって、当該免疫コンジュゲートは、
（ａ）請求項３に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分
を含むことを特徴とする、前記免疫コンジュゲート。
【請求項10】
免疫コンジュゲートであって、当該免疫コンジュゲートは、
（ａ）請求項４に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分
を含むことを特徴とする、前記免疫コンジュゲート。
【請求項11】
請求項３に記載のＶＨＨ鎖、請求項４に記載の抗ＴＲＯＰ２単一ドメイン抗体、または、請求項９または１０に記載の免疫コンジュゲートの使用であって、（ａ）ＴＲＯＰ２分子を検出するための試薬、または（ｂ）腫瘍を治療するための薬物の調製に用いられることを特徴とする、前記使用。
【請求項12】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、（ｉ）請求項４に記載の単一ドメイン抗体、または、請求項９または１０に記載の免疫コンジュゲート、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項13】
腫瘍を治療するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記腫瘍は、ＴＲＯＰ２の高発現上皮腫瘍であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記腫瘍は、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、乳頭状漿液性子宮内膜がん、またはその組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
サンプル中のＴＲＯＰ２タンパク質のインビトロでの検出のための方法であって、（１）サンプルを請求項４に記載の単一ドメイン抗体と接触させる段階と、
（２）抗原－抗体複合体が形成されているかどうかを検出する段階であって、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＴＲＯＰ２タンパク質が存在することを示す段階と
を含むことを特徴とする、前記サンプル中のＴＲＯＰ２タンパク質のインビトロでの検出のための方法。
【国際調査報告】