特表 2024-527363 個別化ワクチンの投与

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-24

(54)【発明の名称】個別化ワクチンの投与

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20240717BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 9/00 20060101ALI20240717BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 Z

A61K48/00

A61K38/02

A61K31/711

A61K31/7105

A61P35/00

A61P37/04

A61K9/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500482

(86)(22)【出願日】2022-07-06

(85)【翻訳文提出日】2024-01-09

(86)【国際出願番号】 IB2022056251

(87)【国際公開番号】W WO2023281418

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】63/218,896

(32)【優先日】2021-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】000002901

【氏名又は名称】株式会社ダイセル

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(74)【代理人】

【識別番号】100175651

【弁理士】

【氏名又は名称】迫田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】坂口 奈央樹

(72)【発明者】

【氏名】山下 邦彦

(72)【発明者】

【氏名】寺居 和宏

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076BB11

4C076CC07

4C076CC27

4C076FF68

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA03

4C084BA44

4C084DC50

4C084MA16

4C084MA66

4C084NA10

4C084ZB09

4C084ZB26

4C085AA03

4C085BA01

4C085BB01

4C085EE01

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA10

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA16

4C086MA66

4C086NA10

4C086ZB09

4C086ZB26

(57)【要約】

本明細書では、対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造する方法が提供される。また、個別化ワクチンを対象に投与する方法が提供される。更に、点火器と取り外し可能なカートリッジとを有する注射器が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造する方法であって、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はペプチドを含むワクチンを合成すること、及び
前記ワクチンを、注射器に装填されるように構成されたカートリッジに入れることを含む、方法。

【請求項2】

前記ワクチンが、ネオアンチゲンＤＮＡ、ネオアンチゲンＲＮＡ又はネオアンチゲンペプチドと、緩衝液とからなる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドが裸の核酸分子である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はペプチドが裸のＲＮＡである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ワクチンが、合成後にそのままカートリッジにパッケージングされる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記注射器が点火器を更に備え、前記点火器が点火すると、前記カートリッジの内容物が対象に注入される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

個別化されたワクチンを対象に投与する方法であって、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法に従って、前記対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造すること、前記カートリッジを前記注射器に装填すること、及び前記個別化ワクチンを前記注射器から前記対象に注入することを含む、方法。

【請求項8】

前記注射器が無針である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記注射器が点火器を更に備え、前記点火器が点火すると、前記カートリッジの内容物が対象に注入される、請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

対象における変異に関連する疾患を治療、改善又は予防する方法であって、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法に従って個別化ワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項11】

前記疾患が腫瘍（がん）である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

点火器と取り外し可能なカートリッジとを備える注射器であって、前記取り外し可能なカートリッジが、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドを含むワクチンを収容するように構成されている、注射器。

【請求項13】

前記ワクチンが、ナノ粒子、カチオン性脂質、脂質、アジュバント、免疫賦活遺伝子をコードするＤＮＡ、及びリポソームを含まない、請求項１２に記載の注射器。

【請求項14】

前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はペプチドが、裸の核酸分子である、請求項１２又は１３に記載の注射器。

【請求項15】

前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はペプチドが、裸のＲＮＡである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の注射器。

【請求項16】

請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法に従って個別化ワクチンを対象に投与するための、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の注射器の使用。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

ワクチン学における現在の医療慣行は、禁忌がない限り集団内の全ての人に同じワクチンセットを一様に投与するというものであり、このアプローチはいくつかの前提に基づいている。前提の１つは、原則的には誰もが抗体による防御レベル又は細胞性免疫を獲得し、関係のある副作用はほとんど生じさせずに同様に免疫応答する、というものである。このアプローチの大きな欠点は、疾患リスク、免疫応答における個人差や、反応原性についての何らかの遺伝的傾向、更には免疫形成に必要な投与量の差異を考慮していないことである。その一方で、免疫学、遺伝学、分子生物学、バイオインフォマティクスの進歩により、治療薬の選択と投与における個別化アプローチの価値が実証されてきている。

【0002】

また、ゲノミクス及びプロテオミクスにおける最近の進歩により、患者における疾患関連の変異が注目されている。例えば、腫瘍ミュータノームによって、全ての腫瘍が「ドライバー」変異及び「パッセンジャー」変異の固有のセットを有していることが明らかになっている。これらの観察は、個別化治療にユニークな機会をもたらしている。ネオアンチゲンなどの変異タンパク質を発現する腫瘍細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に対して新しいエピトープを提示する。健常細胞と腫瘍細胞の両方で発現が見られる腫瘍関連抗原とは対照的に、ネオアンチゲンは腫瘍における変異から生じるため、全て腫瘍細胞に限定される。したがって、豊富なゲノムデータ及びプロテオミクスデータを活用して疾患に関連する変異に基づいた個別化戦略を開発する免疫療法は、健常組織を危険に曝すことなく、また免疫寛容メカニズムに制限されることなく、疾患に関与する細胞を高度に特異的に標的とすることを可能にする。

【0003】

過去数十年間で開発され、最適化された、ＤＮＡベースの遺伝子送達システムの報告に代表されるように、非ウイルス性遺伝子送達は、ウイルスベクターをベースとしたワクチンに伴う制限に、有望な解決策を提供する。マウスに、筋肉内経路、皮内経路、又は静脈内経路で裸のＤＮＡプラスミドを直接注射することで、それぞれ筋肉組織、皮膚組織、及び肝臓組織に目的の遺伝子を導入することができるが、裸のＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ導入の効率は、裸のＤＮＡの化学的不安定性、ヌクレアーゼ作用に対する感受性、迅速なクリアランス、局所リンパ節への非効率的な送達によって制限される。リポソームとＤＮＡとの複合体を形成させて導入を増加させるカチオン性脂質は広く使用されており、更に、経皮パッチのような新しいデリバリーシステムは、皮膚に存在する樹状細胞（skin-resident dendritic cells）を標的としたＤＮＡプラスミドの送達を強化することができる。特にｍＲＮＡベースのワクチンでは、依然としてｍＲＮＡの化学的不安定性及び低い導入効率が治療効果の大きな障壁となっており、裸のｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏデリバリーは依然として困難である。

【発明の概要】

【0004】

ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド又はそれらのワクチンにおける不安定性の問題を解決するために、本開示は、一態様において、対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチン（packaged vaccine）を製造する方法であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドを含むワクチンを合成すること、及び注射器に装填されるように構成されたカートリッジにワクチンを入れることを含む、方法を提供する。

【0005】

別の態様において、本開示はまた、本明細書に開示される方法に従って対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造すること、カートリッジを注射器に装填すること、及び個別化ワクチンを注射器から対象に注入することを含む、個別化ワクチンを対象に投与する方法を提供する。

【0006】

別の態様において、本開示は、本明細書に開示される方法に従って個別化ワクチンを対象に投与することを含む、対象における変異に関連する疾患を治療又は改善する方法を更に提供する。

【0007】

別の態様において、本開示は、点火器と取り外し可能なカートリッジとを備える注射器を更に提供する。いくつかの実施形態では、取り外し可能なカートリッジは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドを含むワクチンを収容するように構成されている。別の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法に従って個別化ワクチンを対象に投与するための注射器の使用を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法に従って、対象における腫瘍を治療又は改善するための注射器の使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】例示的な注入圧力の推移を示す図である。

【図1B】例示的な注入圧力の推移を示す図である。

【図2】粉体燃焼に関連する燃焼圧力、密封された投与液にかかる圧力、及び注入圧力のそれぞれの推移を示す図である。

【図3】本明細書に記載の注入による、ＧＦＰをコードする裸のｍＲＮＡの遺伝子発現亢進効果を示す図である。

【図4】本明細書に記載の注入による、Ｌｕｃをコードする裸のｍＲＮＡの遺伝子発現亢進効果を示す図である。

【図5A】第１の変形例の注入圧力の推移を示す図である。

【図5B】第１の変形例の注入圧力の推移を示す図である。

【図6A】第２の変形例の注入圧力の推移を示す図である。

【図6B】第２の変形例の注入圧力の推移を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、本開示の例示的な実施形態を詳細に説明する。ただし、本開示は、以下に開示される実施形態に限定されるものではなく、様々な形態で実施することができる。以下の実施形態は、当業者が本開示の実施形態を具体化し、実施することを可能にするために記載される。

【0010】

定義

【0011】

第１、第２などの用語は、多様な要素を説明するために使用され得るが、これらの要素は、これらの用語によって限定されない。これらの用語は、１つの要素を別の要素から区別するためにのみ使用される。例えば、例示的な実施形態の範囲から逸脱することなく、第１の要素を第２の要素と呼ぶことができ、同様に、第２の要素を第１の要素と呼ぶことができる。「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つ又は複数の任意の及び全ての組み合わせを含む。

【0012】

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、例示的な実施形態を限定することを意図するものではない。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形も含むことが意図されている。

【0013】

上記で使用した用語「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」及び／又は「含んでいる（including）」は、述べられた特徴、整数、工程、動作、要素、構成要素及び／又はそれらの群の存在を指定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、工程、動作、要素、構成要素及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。技術用語及び科学用語を含む、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有することができる。あらかじめ定義されている、一般的に使用される用語は、関連技術の文脈上の意味と同じ又は類似の意味を有することができ、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、理想的な意味又は過度に形式的な意味に解釈されない。

【0014】

本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、例えば、ヌクレオチド配列の長さ、誤差の程度、寸法、組成物中の原材料の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、及び圧力などの値、並びに、それらの範囲を修飾することを意味し、例えば、化合物、組成物、濃縮物又は使用製剤を作製するために使用される典型的な測定手順及び取り扱い手順；これらの手順における不注意による誤り；これらの方法を実施するために使用される出発物質又は原材料の製造、供給源、又は純度における差異；並びに同様の考慮事項によって生じ得る数量の変動を示す。「約」という用語はまた、例えば、特定の初期濃度又は混合物を有する組成物、製剤、又は細胞培養物のエイジングに起因して異なる量、及び特定の初期濃度又は混合物を有する組成物又は製剤の混合又は処理に起因して異なる量を包含する。「約」という用語によって修飾されるかどうかにかかわらず、本明細書に添付される特許請求の範囲は、これらの量の均等物を含む。「約」という用語は、記載された基準値に類似する値の範囲を更に指す場合がある。特定の実施形態では、「約」という用語は、記載された基準値から５０％以下、２５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下の範囲内に含まれる値の幅を指す。

【0015】

概要

【0016】

添付図面を参照して、本開示の例示的な実施形態について以下に詳細に説明する。本開示の理解を助けるために、図の説明全体にわたって同様の参照数字は同様の要素を指し、同じ要素の説明は繰り返さない。

【0017】

一態様において、本開示は、対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造する方法であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドを含むワクチンを合成すること、及び注射器に装填されるように構成されたカートリッジにワクチンを入れることを含む、方法を提供する。

【0018】

「ワクチン」という用語は、特定の疾患に対する免疫を誘導又は向上させる生物学的製剤を意味する。典型的には、ワクチンは、本発明の組成物が懸濁又は溶解されている従来の生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含む。この形態において、本発明の組成物は、感染症などの疾患又は障害を予防、改善、又は他の方法で治療するために好都合に使用することができる。宿主に導入されると、ワクチンは、抗体及び／若しくはサイトカインの産生、並びに／又はＣＤ８＋Ｔ細胞、抗原提示細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び／若しくは樹状細胞の活性化、並びに／又は他の細胞応答を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。

【0019】

特定の実施形態では、パッケージ化ワクチンとは、ワクチンが容器に入っていることを意味してもよく、容器は、ワクチンを対象に注射する注射器に後で接続することができる密封カートリッジであってもよい。特定の実施形態では、本明細書における「個別化」とは、ワクチンが特定の対象に適合化されて（tailored）おり、カートリッジ内のワクチンを当該特定の対象にデリバリーできるようにカートリッジにラベルが付されているか、又は構成されていることを意味する場合がある。「カートリッジ」という用語は、注射器に取り外し可能に取り付けられるように構成された注射器の要素を意味する。特定の実施形態では、注射器の可動部の機械的な動きは、カートリッジの外側、すなわち外部でカートリッジの動作を制御する。更なる実施形態では、カートリッジは、バルブの直線的な配置を備えており、このバルブは、針をカートリッジの膜分離要素に貫通させるか、又は気密接続を介するかのいずれかにより、注射器の別の部分を取り付けることができる開口形状を伴っている。バルブは、注射器の対応する可動ハンドルと嵌合する雄－雄部品接続を有してもよい。ハンドルの外部回転により、カートリッジが注射器に取り付けられたときにバルブの開閉を制御することができる。

【0020】

特定の実施形態では、本明細書のパッケージ化ワクチンは、密封され、投与時にのみ開封されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、合成後にそのままカートリッジにパッケージングされる。いくつかの実施形態では、カートリッジは減圧されている。

【0021】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるワクチン中のＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドはＤＮＡである。特定の実施形態では、本明細書に記載されるワクチンはＤＮＡを含まず、ワクチンはＤＮＡ溶液ではない。

【0022】

ＤＮＡはデオキシリボ核酸の通常の略語である。ＤＮＡは、核酸分子、すなわちヌクレオチドからなるポリマーである。ヌクレオチドは、通常、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸及びデオキシシチジン一リン酸のモノマーであり、これらのモノマー自体は糖部分（デオキシリボース）、塩基部分及びリン酸部分から構成され、重合して特徴的な骨格構造を形成する。骨格構造は、典型的には、第１のヌクレオチドの糖部分、すなわちデオキシリボースと、第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの具体的な順序、すなわち、糖／リン酸骨格に連結されている塩基の順序が、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。二本鎖形態では、第１の鎖のヌクレオチドは、典型的には、例えばＡ／Ｔ塩基対合及びＧ／Ｃ塩基対合によって、第２の鎖のヌクレオチドとハイブリダイズする。

【0023】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドは、ＲＮＡである。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー－基質ＲＮＡ（Dicer－substrate RNA、ｄｓＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及びこれらの混合物からなる群から選択されてもよい。

【0024】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドは、ペプチドである。ペプチド又はポリペプチドは、典型的には、アミノ酸モノマーがペプチド結合によって連結したポリマーである。ペプチドは、典型的には５０未満のモノマー単位を含有する。しかしながら、ペプチドという用語は、５０を超えるモノマー単位を有する分子を否定するものではない。長いペプチドはポリペプチドとも呼ばれ、典型的には５０～６００のモノマー単位を有する。

【0025】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドは、ＲＮＡである。ＲＮＡは、リボ核酸の通常の略語である。ＲＮＡは、核酸分子、すなわちヌクレオチドからなるポリマーである。ＲＮＡのヌクレオチドは、通常、アデノシン一リン酸モノマー、ウリジン一リン酸モノマー、グアノシン一リン酸モノマー及びシチジン一リン酸モノマーであり、いわゆる骨格においてこれらのヌクレオチドが互いに連結されている。骨格は、第１の糖、すなわちリボースと、隣接する第２のモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の並びは、ＲＮＡ配列と呼ばれる。通常、ＲＮＡは、例えば細胞内でのＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞では、転写は典型的には核又はミトコンドリア内で行われる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＤＮＡの転写により、通常、いわゆる未成熟ＲＮＡが生成され、この未成熟ＲＮＡがプロセシングを受けて、通常、ｍＲＮＡと略されるいわゆるメッセンジャーＲＮＡになる。例えば真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’キャップの形成、及びポリアデニル化などの様々な異なる転写後修飾、核又はミトコンドリアからの輸送などを含む。これらのプロセスは、合わせて、ＲＮＡの成熟とも参照される。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列へと翻訳され得るヌクレオチド配列をもたらす。典型的には、成熟ｍＲＮＡは、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’－ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡとは別に、転写及び／又は翻訳の調節に関与し得るノンコーディングＲＮＡがいくつか存在する。

【0026】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドは、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、天然若しくは非天然に存在する、あるいは修飾された、任意のペプチドなどの、目的の任意のペプチドをコードし得る。ｍＲＮＡがコードするペプチドは、任意のサイズであってもよく、任意の二次構造又は活性を有していてもよい。更なる実施形態では、ｍＲＮＡがコードするペプチドは、細胞内で発現したときに治療効果を有する場合がある。本明細書に記載されるＲＮＡ又はｍＲＮＡは、目的のペプチドをコードしているヌクレオシドが連結した第１の領域（例えば、コード領域）、第１の領域の５’末端に位置する第１のフランキング領域（例えば、５’－ＵＴＲ）、第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域（例えば、３’－ＵＴＲ）、少なくとも１つの５’キャップ領域、及び３’－安定化領域を含み得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ又はｍＲＮＡは、ポリ－Ａ領域又はコザック配列を（例えば、５’－ＵＴＲに）更に含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ又はｍＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド（chain terminating nucleotide）、ステムループ、ポリＡ配列、及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡ又はｍＲＮＡの領域のいずれか１つは、１つ以上の代替成分（例えば、代替ヌクレオシド）を含んでもよい。例えば、３’－安定化領域は、Ｌ－ヌクレオシド、反転チミジン、若しくは２’－Ｏ－メチルヌクレオシドなどの代替ヌクレオシドを含有してもよく、かつ／又はコード領域、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、若しくはキャップ領域は、５－置換ウリジン（例えば、５－メトキシウリジン）、１－置換プソイドウリジン（例えば、１－メチル－プソイドウリジン若しくは１－エチル－プソイドウリジン）、及び／若しくは５－置換シチジン（例えば、５－メチル－シチジン）などの代替ヌクレオシドを含んでもよい。

【0027】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドは、裸の核酸分子である。「裸の」核酸分子とは、タンパク質、脂質、又は任意の他の、核酸分子を保護するのに役立つ分子、を伴わない核酸分子を指す。裸の核酸分子は、遺伝子工学に使用するために、又は遺伝子工学の結果として、実験室において産生され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドは、裸のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、カートリッジ中の裸のｍＲＮＡの量は、約０．１μｇ以上、約０．２μｇ以上、約０．３μｇ以上、約０．４μｇ以上、約０．５μｇ以上、約０．６μｇ以上、約０．７μｇ以上、約０．８μｇ以上、約０．９μｇ以上、約１μｇ以上、約５μｇ以上、約１０μｇ以上、約２０μｇ以上、約３０μｇ以上、約４０μｇ以上、約５０μｇ以上又は約６０μｇ以上である。更なる実施形態では、カートリッジ中の裸のｍＲＮＡの量は、約２００μｇ以下、約１９０μｇ以下、約１８０μｇ以下、約１７０μｇ以下、約１６０μｇ以下、約１５０μｇ以下、約１４０μｇ以下、約１３０μｇ以下、約１２０μｇ以下、約１１０μｇ以下、約１００μｇ以下、約９０μｇ以下、約８０μｇ以下、約７０μｇ以下、約６０μｇ以下、約５０μｇ以下、約４０μｇ以下、約３０μｇ以下、約２０μｇ以下、約１０μｇ以下、約９μｇ以下、約８μｇ以下、約７μｇ以下、約６μｇ以下、約５μｇ以下、約４μｇ以下、約３μｇ以下、約２μｇ以下、約１μｇ以下である。更なる実施形態では、カートリッジ中の裸のｍＲＮＡの量は、約０．２μｇ～１５０μｇ、約５０μｇ～１００μｇ、約１０μｇ～１５０μｇ、約３０μｇ～１００μｇ又は約２０μｇ～１１０μｇである。

【0028】

最近のワクチンデリバリーシステムの進歩にもかかわらず、ワクチンのｉｎ ｖｉｖｏデリバリーは依然として困難である。例えば、ｍＲＮＡワクチンの場合、ＲＮＡのリボース（糖）骨格は、ＤＮＡ中のデオキシリボース（糖）骨格とは異なり、加水分解されやすいため、循環血中におけるＲＮＡ分子の安定性は低下する。哺乳動物のｍＲＮＡは、平均して約２，０００ヌクレオチド長であり、ｍＲＮＡの骨格中に加水分解が１回生じるだけで、翻訳が妨げられる可能性がある。更に、体内に遍在するリボヌクレアーゼは、ＲＮＡの安定性を低下させ、また治療有効性を低下させる。しかしながら、本明細書に記載されるカートリッジを使用することにより、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはペプチド、又はワクチン組成物に改変を加えなくても、個別化ワクチンが有効な（viable）状態で維持される可能性がある。いくつかの実施形態では、ワクチンはナノ粒子を含まない。いくつかの実施形態では、ワクチンはカチオン性脂質を含まない。いくつかの実施形態では、ワクチンはＰＥＧ脂質を含まない。いくつかの実施形態では、ワクチンはリン脂質を含まない。いくつかの実施形態では、ワクチンは脂質を含まない。いくつかの実施形態では、ワクチンはアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはアジュバントを含まない。特定の実施形態では、アジュバントはポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ．Ｃ））であってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、免疫賦活遺伝子をコードするＤＮＡを含まない。いくつかの実施形態では、ワクチンはリポソームを含まない。いくつかの実施形態では、ワクチンは非ウイルス性である。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドと、緩衝液とからなる。更なる実施形態では、緩衝液は生理食塩水であってもよい。

【0029】

特定の実施形態では、対象は、変異に関連する疾患を有する。本明細書における疾患は、遺伝子変異によって引き起こされる障害を含み得る。更なる実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドは、変異を含む。

【0030】

本明細書に記載されるワクチンは、抗原ＤＮＡ、抗原ＲＮＡ又は抗原ペプチドを含む、治療ワクチンであってもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗原ＤＮＡ又は抗原ＲＮＡは、抗原を発現する。本発明に関連して、「抗原」は、典型的には、免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識され得、例えば、適応免疫応答の一部としての抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞の形成による抗原特異的免疫応答を誘導することができる物質を指す。典型的には、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得る、ペプチド若しくはタンパク質であってもよく、又はペプチド若しくはタンパク質を含んでもよい。本発明の意味では、抗原は、本明細書で定義されるようにもたらされた核酸分子の翻訳産物であってもよい。これに関連して、少なくとも１つのエピトープを含むペプチド及びタンパク質の断片、多様体、及び誘導体も抗原として理解される。特定の実施形態では、本明細書に記載される裸の核酸分子は、病原性抗原、腫瘍抗原、アレルゲン性抗原及び自己免疫抗原からなる群から選択される抗原を発現する。抗原は、感染症に関連する病原体由来であってもよい。抗原は、細菌、ウイルス、真菌及び原虫病原体からなる群から選択されてもよい。ワクチンは、例えば、国際公開第２０２２１１２４９８号、国際公開第２０２２０４９０９３号又は米国特許第１５／３０４７０１号に開示されている方法に従って作製することができ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0031】

いくつかの実施形態では、対象は腫瘍を有する。更なる実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドは、腫瘍特異的変異を含む。

【0032】

特定の実施形態では、抗原ＤＮＡ、抗原ＲＮＡ又は抗原ペプチドは、ネオアンチゲンＤＮＡ、ネオアンチゲンＲＮＡ又はネオアンチゲンペプチドであってもよい。腫瘍細胞の遺伝的不安定性により変異が発生する場合もあり、非同義変異が発現すると、ネオアンチゲンと呼ばれる腫瘍特異的抗原が産生される場合もある。ネオアンチゲンは正常組織では発現しないため、免疫原性が高い。ネオアンチゲンは、免疫応答を生じさせるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化能を有しており、腫瘍免疫療法の新たな標的として有望である。バイオインフォマティクス技術の発展により、ネオアンチゲンの同定が加速しており、様々なネオアンチゲンが同定されている。Castle, J. C. et al. Exploiting the Mutanome for Tumor Vaccination, Cancer Res. 72, 1081－1091 （2012）; Yadav, M. et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing, Nature 515, 572－576 （2014）; Gubin, M. M. et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour－specific mutant antigens, Nature 515, 577－581 （2014）; Kreiter, S. et al. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer, Nature 520, 692－696 （2015）; Ott, P. A. et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma, Nature 547, 217－221 （2017）; Sahin, U. et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly－specific therapeutic immunity against cancer, Nature 547, 222－226 （2017）; Keskin, D. B. et al. Neoantigen vaccine generates intratumoral T cell responses in phase Ib glioblastoma trial, Nature 565, 234－239 （2019）; Hilf, N. et al. Actively personalized vaccination trial for newly diagnosed glioblastoma, Nature 565, 240－245 (2019)。いくつかの実施形態では、抗原ＤＮＡ、抗原ｍＲＮＡ又は抗原ペプチドは、ネオアンチゲンｍＲＮＡであってもよい。

【0033】

特定の実施形態では、抗原ＤＮＡ、抗原ＲＮＡ又は抗原ペプチドは、ネオアンチゲンＤＮＡ、ネオアンチゲンＲＮＡ又はネオアンチゲンペプチドであってもよく、カートリッジは、患者由来樹状細胞（ＤＣ）又は合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）を含む追加のワクチンを更に収容してもよい。いくつかの実施形態では、抗原ＤＮＡ、抗原ＲＮＡ又は抗原ペプチドは、ネオアンチゲンｍＲＮＡであってもよい。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に暴露した患者由来ＤＣ（例えば、末梢血単球のｅｘ ｖｉｖｏ分化から得られる）に基づく細胞療法では、該患者に該ＤＣを注入して戻すことで、Ｔ細胞の活性化及び腫瘍細胞の殺傷を強化することができる。いくつかの実施形態では、カートリッジは、免疫チェックポイントタンパク質に特異的な遮断抗体を更に含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ－４）及び／又はプログラム細胞死受容体－１（ＰＤ－１）を含む。ＣＴＬＡ－４経路及びＰＤ－１経路が介在する免疫抑制からＴ細胞を開放するよう設計されているこれらの抗体は、Ｔ細胞の強力かつ持続的（durable）な応答を促進することで腫瘍を排除し、がんを退縮させることができる。

【0034】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造する方法は、対象から採取された試料から変異を検出することを更に含む。更なる実施形態では、検出は、対象のゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡの全エクソームシーケンシングを含んでもよい。更なる実施形態では、検出は、対象のゲノム配列を、体細胞ゲノムの参照配列と比較することを含んでもよい。また更なる実施形態では、検出は、対象の腫瘍のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの全エクソームシーケンシングを含んでもよい。また更なる実施形態では、検出は、対象の腫瘍のゲノム配列を、体細胞ゲノムの参照配列と比較することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、試料は腫瘍生検試料である。

【0035】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造する方法は、対象から採取された試料で検出された変異に基づいて、疾患に関連するＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドを同定することを更に含む。更なる実施形態では、同定は、プロテアソームによるプロセシングを予測することを含む。更なる実施形態では、同定は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子への結合親和性を予測することを含む。更なる実施形態では、同定は、免疫沈降させたペプチドの質量分析を含む。いくつかの実施形態では、試料は腫瘍生検試料である。

【0036】

例示的な検出及び同定方法は、Ott, P. A. et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma, Nature 547, 217－221 (2017)、及び本明細書に引用される他の参考文献に記載されている。

【0037】

特定の実施形態では、対象は、感染症に対するワクチンを必要としている。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｓａｒｓ－ＣｏＶ２を含むがこれに限定されないコロナウイルスに対する抗原特異的免疫応答を誘導する。特定の実施形態では、ワクチンは、例えば、John, S. et al. Multi－antigenic human cytomegalovirus mRNA vaccines that elicit potent humoral and cell－mediated immunity, Vaccine 36（12）, 1689－1699 (2018)に記載されるｍＲＮＡを含むが、これらに限定されないサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンである。

【0038】

特定の実施形態では、パッケージ化ワクチンは室温で保管される。更なる実施形態では、パッケージ化ワクチンは、２℃～８℃の温度で保管される。更なる実施形態では、パッケージ化ワクチンは、－１０℃以下、－２０℃以下、－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－６０℃以下、又は－７０℃以下の温度で保管される。特定の実施形態では、パッケージ化ワクチンは、保管前又は保管後に、対象に投与される前に希釈されてもよい。

【0039】

一態様では、本開示は、本明細書に開示される方法に従って対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造すること、カートリッジを注射器に装填すること、及び個別化ワクチンを注射器から対象に注入することを含む、個別化ワクチンを対象に投与する方法を提供する。

【0040】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される注射器は、カートリッジ及び点火器を備えてもよく、点火器が点火すると、カートリッジの内容物が対象に注入される。

【0041】

いくつかの実施形態では、注射器は無針である。特定の実施形態では、注射器は、無針注射器であってもよく、該無針注射器は、本明細書に記載されるカートリッジと、点火直後の燃焼時にはプラズマを発生させ、その後常温となり燃焼生成物が凝縮すると燃焼生成物に気体成分が含まれない、又は凝縮前と比べて燃焼生成物に含まれる気体成分量が減少することで発生圧力が低下する圧力特性を示す点火剤を含む点火器と、点火器での点火剤の燃焼により加圧されたワクチンが流れ、該ワクチンが注入対象領域に対して吐出される吐出口を有するノズル部と、を備える。更なる実施形態では、加圧時の燃焼生成物の温度は、ワクチンを吐出するための加圧プロセスにおいて、点火剤の燃焼によってワクチンに掛かる圧力が最初のピーク吐出力を迎えてから２０ｍｓｅｃ以内に、常温近傍まで変化する。更なる実施形態では、加圧時の燃焼生成物の温度は、点火剤の燃焼によってＤＮＡ溶液に掛かる圧力が最初のピーク吐出力を迎えてから１０ｍｓｅｃ以内に、常温近傍まで変化する。特定の実施形態では、注射器は、注射器本体から、所定の構造物が注入対象内に挿入された状態での所定の構造物を介した注入を行うことなく、ワクチンを注入対象に注入する注射器であってもよい。更なる実施形態では、注射器は、カートリッジと、生体分子含有溶液が流れて注入対象に注入される注入口を含むノズル部とを備え、溶液は、点火器における点火薬の燃焼によって加圧される。更なる実施形態では、生体分子含有溶液の注入開始時間から０．２０ｍｓの時間までの生体分子含有溶液の最大注入速度は、７５ｍ／ｓ～１５０ｍ／ｓであり、７５ｍ／ｓ～１５０ｍ／ｓの生体分子含有溶液の注入速度は、０．１１ｍｓ以上持続する。

【0042】

特定の実施形態では、例示的な注射器、及び該注射器を使用する方法は、米国特許出願公開第２０１８／０１６８７８９号、同第２０１８／０３６９４８４号、及び／又は同第２０２１／００２３３０２号に記載されるものであってもよく、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。

【0043】

特定の実施形態では、本明細書に記載される対象はヒトである。特定の実施形態では、本明細書に記載される対象はヒトではない。特定の実施形態では、本明細書に記載される対象はげっ歯類である。特定の実施形態では、本明細書に記載される対象は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類、両生類、又は無脊椎動物である。

【0044】

本明細書に記載されるように、ワクチンの不安定性は、対象においてワクチンのＤＮＡ又はＲＮＡを発現させる際の課題である。ワクチンを注入する方法により、対象への注入時にＤＮＡ又はＲＮＡの発現を増加させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される注入は、２段階注入プロファイルを示す。本明細書における「２段階注入プロファイル」とは、注入時に、注入圧力の少なくとも２つの段階が経時的に測定されることを意味する。「２段階注入プロファイルの第１段階」は、測定された第１段階を指し、「２段階注入プロファイルの第２段階」は、第１段階の直後に測定された第２段階を指す。

【0045】

２段階注入プロファイルは、例えば、異なる圧力源によって得られてもよく、例示的な２段階注入プロファイルは、図１Ａ及び図１Ｂに示される通りである。

【0046】

図１Ａ及び図１Ｂは、本明細書に記載されるワクチンに加えることができる圧力（以下、単に「注入圧力」という）の例示的な推移を示す注入プロファイルである。図１Ａ及び図１Ｂにおいて、横軸は経過時間をミリ秒（ｍｓｅｃ）で表し、縦軸は注入圧力をＭＰａで表している。また、注入圧力は、従来技術を使用して測定することができる。例えば、特開２００５－２１６４０号に記載された測定方法と同様に、ノズルの下流側に配置されたロードセルのダイアフラムに注入力を分散して加え、ロードセルからの出力を、検出アンプを介してデータサンプリング装置でサンプリングし、サンプリングした出力を、単位時間当たりの注入力（Ｎ）として記憶する方法により、注入力を測定することができる。このようにして測定された注入力を注射器の注入口の面積で割ることにより、注入圧力が算出される。

【0047】

特定の実施形態では、注入圧力の推移、したがって注入プロファイルは、点火器内に異なる点火薬材料を採用することによって変えることができる。例えば、点火薬材料としては、ジルコニウムと過塩素酸カリウムとを含有する火薬（ＺＰＰ）、水素化チタンと過塩素酸カリウムとを含有する火薬（ＴＨＰＰ）、チタンと過塩素酸カリウムとを含有する火薬（ＴｉＰＰ）、アルミニウムと過塩素酸カリウムとを含有する火薬（ＡＰＰ）、アルミニウムと酸化ビスマスとを含有する火薬（ＡＢＯ）、アルミニウムと酸化モリブデンとを含有する火薬（ＡＭＯ）、アルミニウムと酸化銅とを含有する火薬（ＡＣＯ）、アルミニウムと酸化鉄とを含有する火薬（ＡＦＯ）、及びこれらの火薬のうち複数の組み合わせからなる火薬、を挙げることができる。これらの火薬は、点火直後の燃焼時には高温高圧のプラズマを発生させ、かつ燃焼生成物が常温に達して凝縮すると、該燃焼生成物はガス成分を有しないので、発生した圧力が直ちに低下するという特性を示し得る。適切な投与が可能であれば、上記以外の火薬を点火薬材料として使用してもよい。

【0048】

特定の実施形態では、点火器により燃焼生成物へと燃焼して気体を発生する、様々な気体発生剤を採用することで、注入圧力ひいては注入プロファイルの推移を調整することもできる。ガス発生剤は、点火器からの燃焼生成物に曝されてもよい。点火器の内部に配置されるガス発生剤は、国際公開第２００１／０３１２８２号や特開２００３－２５９５０号に開示されているように、既に公知である。また、ガス発生剤の例としては、ニトロセルロース９８質量％、ジフェニルアミン０．８質量％、硫酸カリウム１．２質量％からなるシングルベース無煙火薬が挙げられる。更に、エアバッグ用ガス発生器やシートベルトプリテンショナ用ガス発生器に使用されている各種ガス発生剤を用いることも可能である。ガス発生剤を配置する際に、ガス発生剤の寸法や大きさ、形状、特に表面プロファイルを調整することにより、ガス発生剤の燃焼完了時間を変化させることができ、これにより、投与液にかかる圧力推移を調整して、投与液の所望の注入圧力推移を実現することができる。

【0049】

本明細書に記載される２段階注入プロファイルは、点火によって生成される注入圧力プロファイルに限定されない。本明細書に記載される２段階注入プロファイルは、他の方法によって、例えば、ワクチンにかかるガス体積及び／又は速度を制御することによって達成され得る。

【0050】

例えば、図１Ａ及び図２Ｂに示される注入プロファイルは、点火薬材料の最初の点火に基づく第１段階と、上述のガス発生剤に基づく１つのピークを有する第２段階とを示す。本実施例における第１段階は、４つの振動要素（vibration element）（すなわち、Ｓ１～Ｓ４）を含み、各振動要素は、振動ピークの前後に２つの極小値を有する。１つの振動要素は、振動ピーク後にある、後方の極小値で終了する。

【0051】

いくつかの実施形態では、２段階注入プロファイルは、注入から約１５ｍｓｅｃ以内、約１４ｍｓｅｃ以内、約１３ｍｓｅｃ以内、約１２ｍｓｅｃ以内、約１１ｍｓｅｃ以内、約１０ｍｓｅｃ以内、約９ｍｓｅｃ以内、約８ｍｓｅｃ以内、約７ｍｓｅｃ以内、約６ｍｓｅｃ以内、約５ｍｓｅｃ以内、約４．５ｍｓｅｃ以内、約４ｍｓｅｃ以内、約３．５ｍｓｅｃ以内、約３ｍｓｅｃ以内、約２．５ｍｓｅｃ以内、約２ｍｓｅｃ以内、約１．５ｍｓｅｃ以内、約１ｍｓｅｃ以内又は約０．５ｍｓｅｃ以内に少なくとも２つのピークを有する。本明細書における「注入から」という用語は、ワクチンに圧力を加え始めた時点から、及び／又はワクチンに対する圧力の増加が検出された時点から開始することを意味し得る。特定の実施形態では、２段階注入プロファイルは、注入から約５ｍｓｅｃ以内、約４ｍｓｅｃ以内、約３ｍｓｅｃ以内、約２ｍｓｅｃ以内、約１ｍｓｅｃ以内、約０．９ｍｓｅｃ以内、約０．８ｍｓｅｃ以内、約０．７ｍｓｅｃ以内、約０．６ｍｓｅｃ以内、約０．５ｍｓｅｃ以内、約０．４ｍｓｅｃ以内、約０．３ｍｓｅｃ以内、約０．２ｍｓｅｃ以内又は約０．１ｍｓｅｃ以内に第１のピークを有する。

【0052】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される２段階注入プロファイルは、複数の振動要素を含む第１段階を含んでもよく、各振動要素は、振動ピーク、及び振動ピークの前後における２つの極小値を有する。いくつかの実施形態では、振動要素の全振幅は時間とともに減少する。いくつかの実施形態では、上述の少なくとも２つのピークは振動ピークである。いくつかの実施形態では、上述の２段階注入プロファイルの第１のピークは、振動ピークである。

【0053】

図１Ａは、注射器のスタートボタンが押された時点での燃焼開始から約４０ｍｓｅｃの間の注入圧力の推移を示す例示的な注入プロファイルを示し、図１Ｂは、図１Ａに示す圧力推移のうち最初（原点から約１０ｍｓｅｃ）の注入圧力の推移を拡大して示している。また、注入圧力の立ち上がりは原点ではなく、５ｍｓｅｃ付近で発生している。これは、点火薬材料が燃焼し、点火薬の燃焼エネルギーによってピストンが押し出され、ワクチンが加圧されるのに一定の時間が必要なためである。図１Ａ及び図１Ｂに示される例示的な注入圧力の推移では、立ち上がりタイミングＴ０からその後約２ｍｓｅｃまでの所定の時間Δｔに複数の圧力振動要素Ｓ１～Ｓ４が存在し、所定の時間Δｔが経過すると圧力振動は概ね収束する。また、本実施形態では、圧力振動における注入圧力の上昇と下降の１サイクルを１つの圧力振動要素として扱うこととする。

【0054】

特定の実施形態では、２段階注入プロファイルは、約１５ｍｓｅｃ以内、約１４ｍｓｅｃ以内、約１３ｍｓｅｃ以内、約１２ｍｓｅｃ以内、約１１ｍｓｅｃ以内、約１０ｍｓｅｃ以内、約９ｍｓｅｃ以内、約８ｍｓｅｃ以内、約７ｍｓｅｃ以内、約６ｍｓｅｃ以内、約５ｍｓｅｃ以内、約４ｍｓｅｃ以内、約３ｍｓｅｃ以内、約２ｍｓｅｃ以内、約１．９ｍｓｅｃ以内、約１．８ｍｓｅｃ以内、約１．７ｍｓｅｃ以内、約１．６ｍｓｅｃ以内、約１．５ｍｓｅｃ以内、約１．４ｍｓｅｃ以内、約１．３ｍｓｅｃ以内、約１．２ｍｓｅｃ以内、約１．１ｍｓｅｃ以内、約１．０ｍｓｅｃ以内、約０．９ｍｓｅｃ以内、約０．８ｍｓｅｃ以内、約０．７ｍｓｅｃ以内、約０．６ｍｓｅｃ以内、約０．５ｍｓｅｃ以内、約０．４ｍｓｅｃ以内、約０．３ｍｓｅｃ以内、約０．２ｍｓｅｃ以内又は約０．１ｍｓｅｃ以内に第１段階を完了する（例えば、第１段階は、例えば、最後の振動要素の後の極小値において、及び／又は第２段階の開始時に完了する）。

【0055】

図１Ａ及び図１Ｂにおいて、立ち上がりタイミングＴ０から所定の時間Δｔの間に、最初に圧力振動要素Ｓ１（以下、「第１の振動要素Ｓ１」という）が発生し得る。第１の振動要素Ｓ１は、立ち上がりタイミングＴ０における注入圧力（本実施例では、約０ＭＰａ）から開始して次の極小値が到来するまでの、ピーク値Ｐｘ１（本実施例では、約４５ＭＰａ）を含む期間の注入圧力推移である。また、第１の振動要素Ｓ１の全振幅は、本実施例では約４５ＭＰａである。第１の振動要素Ｓ１の後には、更に第２の振動要素Ｓ２、第３の振動要素Ｓ３、第４の振動要素Ｓ４が続く。立ち上がりタイミングＴ０から振動要素の最後の極小値（例えば、最後の振動要素終了時にある、後方の極小値）が到達するまでを「第１段階」と呼ぶ。第２の振動要素Ｓ２は、第１の振動要素Ｓ１が終了したタイミングから次の極小値が到来するまでの、ピーク値Ｐｘ２（本実施例では約３７ＭＰａ）を含む期間の注入圧力推移である。第１の振動要素終了時の極小値の最後から次の極小値が到来するまでの、ピーク値Ｐｘ２を含む期間を「第２の振動要素」と呼ぶ。また、第２の振動要素Ｓ２の最小の極小値から第２の要素のピークまでの全振幅は、本実施例では約１０ＭＰａである。第３の振動要素Ｓ３及び第４の振動要素Ｓ４についても、各振動要素を画定する期間及び各振動要素の全振幅は第２の振動要素Ｓ２と同様であり、その詳細な説明は省略するが、第３の振動要素Ｓ３の全振幅及び第４の振動要素Ｓ４の全振幅は、時間の経過とともに減少している。すなわち、所定の時間Δｔの間は、圧力推移は時間の経過とともに減衰振動となり、所定の時間Δｔの経過後は、圧力推移は振動が多少収束した状態となる。

【0056】

いくつかの実施形態では、２段階注入プロファイルの少なくとも１つの段階における振動要素の全振幅は、経時的に減少する。いくつかの実施形態では、２段階注入プロファイルにおける第１段階の振動要素の全振幅は、経時的に減少する。

【0057】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される２段階注入プロファイルの第１のピークは、約０．５ＭＰａ以上、約１ＭＰａ以上、約２ＭＰａ以上、約３ＭＰａ以上、約４ＭＰａ以上、約５ＭＰａ以上、約６ＭＰａ以上、約７ＭＰａ以上、約８ＭＰａ以上、約９ＭＰａ以上、約１０ＭＰａ以上、約１１ＭＰａ以上、約１２ＭＰａ以上、約１３ＭＰａ以上、約１４ＭＰａ以上、約１５ＭＰａ以上又は約１６ＭＰａ以上である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される２段階注入プロファイルの第１のピークは、約５０ＭＰａ未満、約４９ＭＰａ未満、約４８ＭＰａ未満、約４７ＭＰａ未満、約４６ＭＰａ未満、約４５ＭＰａ未満、約４４ＭＰａ未満、約４３ＭＰａ未満、約４２ＭＰａ未満、約４１ＭＰａ未満、約４０ＭＰａ未満、約３９ＭＰａ未満、約３８ＭＰａ未満、約３７ＭＰａ未満、約３６ＭＰａ未満、又は約３５ＭＰａ未満である。

【0058】

２段階注入プロファイルの第１のピークは、２段階注入の第１段階における最も高いピークであってもよい。２段階注入プロファイルの第１のピークは、２段階注入の第１段階における最も高い振動ピークであってもよく、第１段階の後の振動要素は、例えば、図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、高さがより低いピークを有してもよい。２段階プロファイルにおける第１段階の最も高いピークの高さ及び／又は第１のピークの高さは、ワクチンが投与される対象組織に応じてあらかじめ決定又は調整することができる。臓器及び脆弱病変への直接投与の場合、例えば、２段階注入プロファイルにおいて、第１段階の最も高いピーク及び／又は第１のピークは約０．５ＭＰａ以上、約１ＭＰａ以上、約２ＭＰａ以上、約３ＭＰａ以上、約４ＭＰａ以上又は約５ＭＰａ以上であってもよい。更なる実施形態では、２段階注入プロファイルにおいて、第１段階の最も高いピーク及び／又は第１のピークは約２０ＭＰａ未満、１９ＭＰａ未満、１８ＭＰａ未満、１７ＭＰａ未満、１６ＭＰａ未満、１５ＭＰａ未満、１４ＭＰａ未満、１３ＭＰａ未満、１２ＭＰａ未満、１１ＭＰａ未満、１０ＭＰａ未満、９ＭＰａ未満、８ＭＰａ未満、７ＭＰａ未満、６ＭＰａ未満、又は５ＭＰａ未満である。更なる実施形態では、２段階注入プロファイルにおいて、第１段階の最も高いピーク及び／また第１のピークは０．５ＭＰａ～２０ＭＰａ、０．５ＭＰａ～１５ＭＰａ、又は０．５ＭＰａ～５ＭＰａである。経皮注射の場合、例えば、２段階注入プロファイルにおいて、最も高いピーク及び／又は第１のピークは約１５ＭＰａ以上、約１６ＭＰａ以上、約１７ＭＰａ以上、約１８ＭＰａ以上、約１９ＭＰａ以上、約２０ＭＰａ以上、約２１ＭＰａ以上、約２２ＭＰａ以上、約２３ＭＰａ以上、約２４ＭＰａ以上、約２５ＭＰａ以上、約２６ＭＰａ以上、約２７ＭＰａ以上、約２８ＭＰａ以上、約２９ＭＰａ以上、約３０ＭＰａ以上、約３１ＭＰａ以上、約３２ＭＰａ以上、約３３ＭＰａ以上、約３４ＭＰａ以上、約３５ＭＰａ以上、約３６ＭＰａ以上、約３７ＭＰａ以上、約３８ＭＰａ以上、約３９ＭＰａ以上、約４０ＭＰａ以上、約４１ＭＰａ以上、約４２ＭＰａ以上、約４３ＭＰａ以上、約４４ＭＰａ以上又は約４５ＭＰａ以上である。更なる実施形態では、２段階注入プロファイルにおいて、第１段階の最も高いピーク及び／又は第１のピークは約５０ＭＰａ未満、約４９ＭＰａ未満、約４８ＭＰａ未満、約４７ＭＰａ未満、約４６ＭＰａ未満、約４５ＭＰａ未満、約４４ＭＰａ未満、約４３ＭＰａ未満、約４２ＭＰａ未満、約４１ＭＰａ未満、約４０ＭＰａ未満、約３９ＭＰａ未満、約３８ＭＰａ未満、約３７ＭＰａ未満、約３６ＭＰａ未満、又は約３５ＭＰａ未満である。更なる実施形態では、２段階注入プロファイルにおいて、第１段階の最も高いピーク及び／又は第１のピークは、１５ＭＰａ～５０ＭＰａ、３０ＭＰａ～３６ＭＰａ、又は２０ＭＰａ～３６ＭＰａである。

【0059】

代替的に、図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、２段階注入プロファイルにおける最も高いピークは、２段階注入の第２段階にあってもよい。２段階プロファイルにおける第１段階及び第２段階の最も高いピークの高さは、ワクチンが投与される対象組織に応じてあらかじめ決定又は調整することができる。例えば、２段階注入プロファイルにおいて、第１段階の最も高いピークは、約０．５ＭＰａ以上、約１ＭＰａ以上、約２ＭＰａ以上、約３ＭＰａ以上、約４ＭＰａ以上、約５ＭＰａ以上、約６ＭＰａ以上、約７ＭＰａ以上、約８ＭＰａ以上、約９ＭＰａ以上、約１０ＭＰａ以上、約１１ＭＰａ以上、約１２ＭＰａ以上、約１２ＭＰａ以上、約１４ＭＰａ以上、又は約１５ＭＰａ以上であってもよい。また、第１段階の最も高いピークは、５０ＭＰａ未満、４５ＭＰａ未満、４０ＭＰａ未満、３９ＭＰａ未満、３８ＭＰａ未満、３７ＭＰａ未満、３６ＭＰａ未満、又は３５ＭＰａ未満であってもよい。更に、２段階注入プロファイルにおいて、第２段階の最も高いピークは、約１０ＭＰａ以上、約１２ＭＰａ以上、約１４ＭＰａ以上、約１６ＭＰａ以上、約２０ＭＰａ以上、約２１ＭＰａ以上、約２２ＭＰａ以上、約２３ＭＰａ以上、約２４ＭＰａ以上、約２５ＭＰａ以上、約２６ＭＰａ以上、又は約２７ＭＰａ以上であってもよい。また、第１段階の最も高いピークは、８０ＭＰａ未満、７５ＭＰａ未満、７０ＭＰａ未満、６８ＭＰａ未満、６６ＭＰａ未満、６５ＭＰａ未満、６４ＭＰａ未満、６３ＭＰａ未満、６２ＭＰａ未満、６１ＭＰａ未満、又は６０ＭＰａ未満であってもよい。

【0060】

特定の実施形態では、第１の振動要素Ｓ１のピーク値から第２の振動要素Ｓ２のピーク値までの算出された期間は、約１ｍｓｅｃ以内、約０．９ｍｓｅｃ以内、約０．８ｍｓｅｃ以内、約０．７ｍｓｅｃ以内、約０．６ｍｓｅｃ以内、約０．５ｍｓｅｃ以内、約０．４ｍｓｅｃ以内、又は約０．３ｍｓｅｃ以内である。特定の実施形態では、第２の振動要素Ｓ２のピーク値から第３の振動要素Ｓ３のピーク値までの算出された期間は、約１．１ｍｓｅｃ以内、約１ｍｓｅｃ以内、約０．９ｍｓｅｃ以内、約０．８ｍｓｅｃ以内、約０．７ｍｓｅｃ以内、約０．６ｍｓｅｃ以内、約０．５ｍｓｅｃ以内、約０．４ｍｓｅｃ以内、又は約０．３ｍｓｅｃ以内である。収束状態に達する直前の周期は若干短くてもよいが、注入圧力の推移は、所定の時間Δｔ内において概ね一定の周期で起こり得る。特定の実施形態では、所定の時間Δｔにおける注入圧力の推移は、約２２００Ｈｚ以下、約２１００Ｈｚ以下、約２０００Ｈｚ以下、約１９００Ｈｚ以下、約１８００Ｈｚ以下又は約１７００Ｈｚ以下の周波数の圧力振動であってもよい。特定の実施形態では、圧力振動は、約１５００Ｈｚ以上、約１６００Ｈｚ以上、約１７００Ｈｚ以上、約１８００Ｈｚ以上、約１９００Ｈｚ以上、又は約２０００Ｈｚ以上の周波数の振動であってもよい。２段階注入プロファイルの第２段階が第１段階よりも高い場合、２段階プロファイルの第１段階中に注入圧力の振動がある必要はない場合がある。例えば、第２段階の最も高いピークにおける圧力が、第１段階の最も高いピークにおける圧力の２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、又は７倍である場合、ワクチンの注射に第１段階の振動は必要ない。同様に、第１段階が第２段階よりも高いピークを有する場合、２段階注入プロファイルの第１段階中に注入圧力の振動がある必要はない場合がある。

【0061】

特定の実施形態では、所定の時間Δｔにおける圧力変動は、本明細書に記載される点火器の点火薬材料の燃焼に起因し得る。また、所定の時間Δｔが経過したタイミング付近では、点火薬材料の燃焼生成物によって注射器内のガス発生剤の燃焼が開始し、その燃焼エネルギーが更にワクチンに作用し始める場合がある。その結果、図１Ａに示す例では、所定の時間Δｔ経過後に注入圧力が再び上昇し、約１８ｍｓｅｃのタイミングで「第２段階の最も高いピーク」と呼ばれるピーク値Ｐｖが到来する。また、その後、注入圧力は時間の経過とともに徐々に低下する。ガス発生剤の燃焼速度は、点火薬材料の燃焼速度よりも遅い場合があるため、ガス発生剤の燃焼による注入圧力の上昇速度も相対的に遅くなる場合がある。特定の実施形態では、ガス発生剤の燃焼は、注入から約８ｍｓｅｃ前、約７．５ｍｓｅｃ前、約７ｍｓｅｃ前、約６．５ｍｓｅｃ前、約６ｍｓｅｃ前、約５．５ｍｓｅｃ前、約５ｍｓｅｃ前、約４．５ｍｓｅｃ前、約３ｍｓｅｃ前、約３．５ｍｓｅｃ前、約３ｍｓｅｃ前、約２．５ｍｓｅｃ前、約２ｍｓｅｃ前、約１．５ｍｓｅｃ前又は約１ｍｓｅｃ前に開始してもよい。特定の実施形態では、ガス発生剤の燃焼のピークＰｙ又は第２段階の最も高いピークは、注入から約３０ｍｓｅｃ前、約２９ｍｓｅｃ前、約２８ｍｓｅｃ前、約２７ｍｓｅｃ前、約２６ｍｓｅｃ前、約２５ｍｓｅｃ前、約２４ｍｓｅｃ前、約２３ｍｓｅｃ前、約２２ｍｓｅｃ前、約２１ｍｓｅｃ前、約２０ｍｓｅｃ前、約１９ｍｓｅｃ前、約１８ｍｓｅｃ前、約１７ｍｓｅｃ前、約１６ｍｓｅｃ前、約１５ｍｓｅｃ前、約１４ｍｓｅｃ前、約１３ｍｓｅｃ前、約１２ｍｓｅｃ前、約１１ｍｓｅｃ前、又は約１０ｍｓｅｃ前に現れてもよい。特定の実施形態では、ガス発生剤の燃焼のピークＰｙ又は第２段階の最も高いピークは、注入から約７ｍｓｅｃ後、約８ｍｓｅｃ後、約９ｍｓｅｃ後、約１０ｍｓｅｃ後、約１１ｍｓｅｃ後、約１２ｍｓｅｃ後、約１３ｍｓｅｃ後、約１４ｍｓｅｃ後、約１５ｍｓｅｃ後、約１６ｍｓｅｃ後、約１７ｍｓｅｃ後、約１８ｍｓｅｃ後、約１９ｍｓｅｃ後又は約２０ｍｓｅｃ後に現れてもよい。特定の実施形態では、２段階注入プロファイルは、注入から約３０ｍｓｅｃ前、約２９ｍｓｅｃ前、約２８ｍｓｅｃ前、約２７ｍｓｅｃ前、約２６ｍｓｅｃ前、約２５ｍｓｅｃ前、約２４ｍｓｅｃ前、約２３ｍｓｅｃ前、約２２ｍｓｅｃ前、約２１ｍｓｅｃ前、約２０ｍｓｅｃ前、約１９ｍｓｅｃ前、約１８ｍｓｅｃ前、約１７ｍｓｅｃ前、約１６ｍｓｅｃ前、約１５ｍｓｅｃ前、約１４ｍｓｅｃ前、約１３ｍｓｅｃ前、約１２ｍｓｅｃ前、約１１ｍｓｅｃ前、約１０ｍｓｅｃ前、約９ｍｓｅｃ前、約８ｍｓｅｃ前、約７ｍｓｅｃ前、約６ｍｓｅｃ前、約５ｍｓｅｃ前又は約４ｍｓｅｃ前に第２段階の少なくとも１つのピークを有する。特定の実施形態では、２段階注入プロファイルは、注入から約７ｍｓｅｃ後、約８ｍｓｅｃ後、約９ｍｓｅｃ後、約１０ｍｓｅｃ後、約１１ｍｓｅｃ後、約１２ｍｓｅｃ後、約１３ｍｓｅｃ後、約１４ｍｓｅｃ後、約１５ｍｓｅｃ後、約１６ｍｓｅｃ後、約１７ｍｓｅｃ後、約１８ｍｓｅｃ後、約１９ｍｓｅｃ後又は約２０ｍｓｅｃ後に第２段階の少なくとも１つのピークを有する。

【0062】

いくつかの実施形態では、２段階注入プロファイルは、１つのピークのみを有する第２段階を含んでもよい。

【0063】

２段階プロファイルの第２段階の最も高いピークの高さは、ワクチンが投与される対象組織に応じてあらかじめ決定又は調整することができる。特定の実施形態では、臓器及び脆弱病変への直接投与の場合、２段階注入プロファイルにおいて、第２段階の最も高いピークは、約０．１ＭＰａ以上、約０．２ＭＰａ以上、約０．３ＭＰａ以上、約０．４ＭＰａ以上、約０．５ＭＰａ以上、約０．６ＭＰａ以上、約０．７ＭＰａ以上、約０．８ＭＰａ以上、約０．９ＭＰａ以上、約１ＭＰａ以上、約２ＭＰａ以上、約３ＭＰａ以上、約４ＭＰａ以上、約５ＭＰａ以上、約６ＭＰａ以上、約７ＭＰａ以上、約８ＭＰａ以上、約９ＭＰａ以上、又は約１０ＭＰａ以上である。更なる実施形態では、２段階注入プロファイルにおいて、第２段階の最も高いピークは、約１５ＭＰａ未満、約１４ＭＰａ未満、約１３ＭＰａ未満、約１２ＭＰａ未満、約１１ＭＰａ未満、約１０ＭＰａ未満、約９ＭＰａ未満、約８ＭＰａ未満、約７ＭＰａ未満、約６ＭＰａ未満、約５ＭＰａ未満、約４ＭＰａ未満、約３ＭＰａ未満、２ＭＰａ未満又は約１ＭＰａ未満である。更なる実施形態では、２段階注入プロファイルにおいて、第２のピークは、約０．１ＭＰａ～約１５ＭＰａ、約１ＭＰａ～約１０ＭＰａ、又は約３ＭＰａ～約６ＭＰａである。特定の実施形態では、経皮注射の場合、２段階注入プロファイルにおいて、第２段階の最も高いピークは、約２０ＭＰａ以上、約２１ＭＰａ以上、約２２ＭＰａ以上、約２３ＭＰａ以上、約２４ＭＰａ以上、約２５ＭＰａ以上、約２６ＭＰａ以上、約２７ＭＰａ以上、約２８ＭＰａ以上、約２９ＭＰａ以上、約３０ＭＰａ以上、約３１ＭＰａ以上、約３２ＭＰａ以上、約３３ＭＰａ以上、約３４ＭＰａ以上又は約３５ＭＰａ以上である。更なる実施形態では、２段階注入プロファイルにおいて、第２段階の最も高いピークは、約４５ＭＰａ未満、約４４ＭＰａ未満、約４３ＭＰａ未満、約４２ＭＰａ未満、約４１ＭＰａ未満、約４０ＭＰａ未満、約３９ＭＰａ未満、約３８ＭＰａ未満、約３７ＭＰａ未満、約３６ＭＰａ未満、約３５ＭＰａ未満、約３４ＭＰａ未満、約３３ＭＰａ未満、約３２ＭＰａ未満、約３１ＭＰａ未満、約３０ＭＰａ未満又は約２９ＭＰａ未満である。更なる実施形態では、２段階注入プロファイルにおいて、第２段階の最も高いピークは、３０ＭＰａ～４０ＭＰａ、３０ＭＰａ～３６ＭＰａ、又は２０ＭＰａ～３６ＭＰａである。更なる実施形態では、第１段階の最も高いピークは、１０．０ＭＰａ～３８．０ＭＰａの範囲であってもよく、第２段階の最も高いピークは、２５．０ＭＰａ～６４．０ＭＰａの範囲であってもよい。

【0064】

いくつかの実施形態では、２段階プロファイルの第２段階の最も高いピークは、２段階プロファイルの第１段階の最も高いピークよりも低い。特定の実施形態において、２段階プロファイルの第２段階の最も高いピークは、２段階プロファイルの第１段階の第１のピークよりも低い。いくつかの実施形態では、２段階プロファイルの第１段階の最も高いピークは、２段階プロファイルの第２段階の最も高いピークよりも低い。特定の実施形態において、２段階プロファイルの第２段階の最も高いピークは、２段階プロファイルの第１段階の第１のピークよりも高い。

【0065】

特定の実施形態では、注射は、注入から約４００ｍｓｅｃ以内、約４５０ｍｓｅｃ以内、約３００ｍｓｅｃ以内、約２５０ｍｓｅｃ以内、約２００ｍｓｅｃ以内、約１５０ｍｓｅｃ以内、又は約１００ｍｓｅｃ以内に完了する。

【0066】

いくつかの実施形態では、注射は経皮注射である。いくつかの実施形態では、注入は経皮注射を含まない。

【0067】

いくつかの実施形態では、注射は筋肉注射である。いくつかの実施形態では、注射は皮下注射である。いくつかの実施形態では、注射は皮内注射である。いくつかの実施形態では、注射は病巣内注射である。特定の実施形態では、ワクチンは、例えば手術中に、目的の特定の臓器に注射され得る。いくつかの実施形態では、注射は腫瘍内注射である。いくつかの実施形態では、注射は節内注射である。いくつかの実施形態は、節内注射を含まない。いくつかの実施形態では、注射はリンパ内注射である。

【0068】

いくつかの実施形態では、対象に注射される個別化ワクチン中のｍＲＮＡの量は、約０．１μｇ以上、約０．２μｇ以上、約０．３μｇ、約０．４μｇ以上、約０．５μｇ以上、約０．６μｇ以上、約０．７μｇ以上、約０．８μｇ以上、約０．９μｇ以上、約１μｇ以上、約５μｇ以上、約１０μｇ以上、約２０μｇ以上、約３０μｇ以上、約４０μｇ以上、約５０μｇ以上又は約６０μｇ以上である。更なる実施形態では、対象に注射される個別化ワクチン中のｍＲＮＡの量は、約２００μｇ以下、約１９０μｇ以下、約１８０μｇ以下、約１７０μｇ以下、約１６０μｇ以下、約１５０μｇ以下、約１４０μｇ以下、約１３０μｇ以下、約１２０μｇ以下、約１１０μｇ以下、約１００μｇ以下、約９０μｇ以下、約８０μｇ以下、約７０μｇ以下、約６０μｇ以下、約５０μｇ以下、約４０μｇ以下、約３０μｇ以下、約２０μｇ以下、約１０μｇ以下、約９μｇ以下、約８μｇ以下、約７μｇ以下、約６μｇ以下、約５μｇ以下、約４μｇ以下、約３μｇ以下、約２μｇ以下、約１μｇ以下である。更なる実施形態では、対象に注射される個別化ワクチン中のｍＲＮＡの量は、約０．２μｇ～約１５０μｇ、約５０μｇ～約１００μｇ、約１０μｇ～約１５０μｇ、約３０μｇ～約１００μｇ、又は約２０μｇ～約１１０μｇである。

【0069】

一態様において、本開示は、本明細書に開示される方法に従って対象に個別化ワクチンを投与することを含む、対象における変異に関連する疾患を治療又は改善する方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、疾患は腫瘍（がん）である。

【0070】

一態様において、本開示は、点火器と取り外し可能なカートリッジとを備える注射器を更に提供する。注射器は、上述の注射器であってもよい。いくつかの実施形態では、取り外し可能なカートリッジは、本明細書に記載されるワクチン、又はＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはペプチドを収容するように構成されている。いくつかの実施形態では、注射器は針を備えない。いくつかの実施形態では、注射器はばねを備えない。いくつかの実施形態では、注射器は細胞内への運搬用に構成される。

【0071】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法に従って個別化ワクチンを対象に投与するための該注射器の使用を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に記載される方法に従って、対象における腫瘍を治療又は改善するための注射器の使用を提供する。

【実施例】

【0072】

材料
ダルベッコ－リン酸緩衝水溶液（ナカライテスク社製、Ｄ－ＰＢＳ）
ＴＥ緩衝液ｐＨ８．０（ナカライテスク社製）
ＰＢＳ－Ｔａｂｌｅｔ（タカラバイオ社製）
水（ナカライテスク社製）
裸のｍＲＮＡ ＧＦＰ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＴｒｉＬｉｎｋ社製）
裸のｍＲＮＡ＿Ｌｕｃ（ＴｒｉＬｉｎｋ社製、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ）
裸のｍＲＮＡ＿Ｕ修飾＿Ｌｕｃ（ＴｒｉＬｉｎｋ社製、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ（５ ＭｏＵ））
Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）
ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ルシフェラーゼアッセイシステム）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｌａｉｒｅ Ｊａｐａｎから購入した。

【0073】

使用した機器
冷却遠心機（Ｔｏｍｙ社製ＭＤＸ－３００）
オートクレーブ（Ｔｏｍｙ社製、ＬＳＸ－７００）
８ｍｍ生検トレパン（ｂｉｏｐｓｙ ｐｏｕｃｈ）（カイインダストリーズ社製、８ｍｍ生検トレパン）
ルミノメーター（キッコーマン社製、Ｃ－１００Ｎ）

【0074】

まず、本発明のデバイス（the device）を用いてｍＲＮＡを生体に投与して、投与したｍＲＮＡの遺伝子発現が亢進するか否かを、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡ（裸のｍＲＮＡ ＧＦＰ）により評価した。投与には１０週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、投与６時間後に安楽死させデータ収集を行った。投与には、ノズル径０．１ｍｍの容器にＺＰＰ点火材３０ｍｇ、ＧＧガス発生材３０ｍｇを入れたデバイスを使用した。１回の投与量は２０μＬとし、ｍＲＮＡは０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬ（０．２～１０μｇ／ショット）とした。投与部位の皮膚を松浪硝子工業製ガラスボトムディッシュに貼り付け、ＫＥＹＥＮＣＥ社製蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０により遺伝子発現を観察した。

【0075】

その結果、３０Ｇの注射針を用いて投与した場合、いずれのｍＲＮＡの量においても、わずかな量の遺伝子発現しか得られなかった。一方、デバイスを用いて投与した場合には、０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬのいずれのｍＲＮＡ量においても、投与皮膚において遺伝子発現が確認された（図３）。使用したｍＲＮＡの量に応じて、遺伝子発現レベルに対応する蛍光強度が増加し、投与したｍＲＮＡが遺伝子発現していることが確認された。デバイスでは、わずか０．０１ｍｇ／ｍＬという少量でも裸のｍＲＮＡの遺伝子発現が確認されたことから、デバイスを用いた効率的なｍＲＮＡ細胞質導入とその後の遺伝子発現が得られた。

【0076】

３０Ｇの注射針とデバイスとでＧＦＰの蛍光強度を比較すると、デバイスを用いたものは、０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬのいずれのｍＲＮＡ量においても明らかに強い蛍光を示した（図３）。これらの結果から、デバイスは、裸のｍＲＮＡの遺伝子発現を注射針よりも誘導しやすいことが確認され、デバイスを用いた遺伝子発現亢進効果が確認された。

【0077】

（２）ＬｕｃをコードするｍＲＮＡに対する、デバイスによる遺伝子発現亢進効果

【0078】

異なるタンパク質であるＬｕｃをコードするｍＲＮＡ（裸のｍＲＮＡ Ｌｕｃ）について、デバイスによる遺伝子発現亢進効果を評価した。投与には１０週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、投与６時間後に安楽死させデータ収集を行った。投与には、ノズル径０．１ｍｍの容器にＺＰＰ点火材３０ｍｇ、ＧＧガス発生材３０ｍｇを入れたデバイスを使用した。１回の投与量は２０μＬとし、ｍＲＮＡは０．０１～０．１ｍｇ／ｍＬ（０．２～２μｇ／ショット）とした。遺伝子発現のために、８ｍｍ生検トレパンを使用して投与部位の皮膚をサンプリングし、５倍希釈したＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ５Ｘを使用してライセートを調製した。次いで、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ルシフェラーゼアッセイシステムとキッコーマン社製ルミノメーターＣ－１００Ｎを用いて、１０秒間に発光したルシフェラーゼ量を測定し、遺伝子発現を評価した。

【0079】

その結果、ＧＦＰの場合と同様、３０Ｇの注射針を用いて投与した場合、いずれのｍＲＮＡ量においても、わずかな量の遺伝子発現しか得られなかった。一方、デバイスを用いて投与したものでは、高い遺伝子発現が確認された（図４）。デバイスによる遺伝子発現亢進効果を評価するために、３０Ｇの注射針とデバイスとで遺伝子発現レベルを比較したところ、０．０１ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡではデバイスの方が約２，３００倍、０．１ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡではデバイスの方が約３００倍高かった（図４）。ＬｕｃをコードするｍＲＮＡにおいても、デバイスを用いることによる遺伝子発現亢進効果が確認された。

【0080】

このように、ＧＦＰやＬｕｃなどの複数のレポータータンパク質においてデバイスによる遺伝子発現亢進効果が確認されたことから、デバイスによる遺伝子発現はｍＲＮＡにコードされている遺伝子配列に依存しないことが明らかになった。このことから、任意の遺伝子をコードするｍＲＮＡで、デバイスによる遺伝子発現亢進効果を得ることができると考えられる。

【0081】

（３）注射器の代替注入圧力プロファイル－実施例１

【0082】

ノズル径０．５ｍｍの注射器に水１５０μＬを充填し、点火薬燃焼による水への加圧時から注射後までの注射器内注入圧力を評価した。爆薬には、ジルコニウムと過塩素酸カリウムを含有する爆薬（ＺＰＰ）５５ｍｇを使用し、ガス発生剤は、シングルベース無煙爆薬（以下、「ＧＧ」という場合がある）４０ｍｇを使用した。

【0083】

注入圧力の測定は、特開２００５－２１６４０号の測定方法のように、注入力を、ノズルの下流側に配置されたロードセルのダイアフラムに分散して加えるようにし、ロードセルからの出力は、検出増幅器を介してデータ採取表示装置にて採取されて、時間毎の注入力（Ｎ）として表示・記憶する方法を用いて測定し、注入力（Ｎ）をノズルポートの面積で割ることにより、注入圧力を算出した。東京計器研究所製のＣＬＳ－２ＮＡを用いて測定値を得た。合計３０回の測定を行った。

【0084】

３０回の測定のうち、２段階プロファイルの第２段階の最も高いピーク及び最も低いピークが検出された２回の測定を図５Ａ及び図５Ｂに示す。全３０回の測定において第２段階のピークがより高く、第１段階及び第２段階の平均ピーク圧力はそれぞれ４．５７４ＭＰａ及び９．５９８ＭＰａであった。平均して、第１段階及び第２段階のピークは、点火後５．２３０ｍｓｅｃ及び２４．１５０ｍｓｅｃで検出された。

【0085】

（３）注射器の代替注入圧力プロファイル－実施例２

【0086】

ＺＰＰ及びＧＧの量を両方とも５５ｍｇから６５ｍｇに増加させたこと以外は、上記実施例１で使用したのと同じ条件を繰り返した。合計３０回の測定を行い、２段階プロファイルの第２段階の最も高いピーク及び最も低いピークが検出された２回の測定を図６Ａ及び図６Ｂに示す。全３０回の測定において第２段階のピークがより高く、第１段階及び第２段階の平均ピーク圧力はそれぞれ６．１０２ＭＰａ及び１２．５６２ＭＰａであった。平均して、第１段階及び第２段階のピークは、点火後５．２４３ｍｓｅｃ及び２１．９５７ｍｓｅｃで検出された。

【0087】

以下に、本開示のいくつかの例示的な実施形態を示す。
実施形態１ 対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造する方法であって、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドを含むワクチンを合成すること、及び注射器に装填されるように構成されたカートリッジにワクチンを入れることを含む、方法。
実施形態２ 対象が腫瘍を有し、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドが腫瘍特異的変異を含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３ 対象が腫瘍を有し、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドがネオアンチゲンＤＮＡ、ネオアンチゲンｍＲＮＡ又はネオアンチゲンペプチドである、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４ 対象から採取された試料から変異を検出することを更に含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５ 検出が、対象のゲノムＤＮＡ及び／又はゲノムＲＮＡの全エクソームシーケンシングを含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態６ 検出が、対象のゲノム配列を、体細胞ゲノムの参照配列と比較することを含む、実施形態４又は５に記載の方法。
実施形態７ 検出が、対象の腫瘍のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの全エクソームシーケンシングを含む、実施形態４～６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８ 検出が、対象の腫瘍ゲノム配列を、体細胞ゲノムの参照配列と比較することを含む、実施形態４～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９ 対象から採取された試料で検出された変異に基づいて、疾患に関連するＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドを同定することを更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０ 同定が、プロテアソームによるプロセシング並びにＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子への結合親和性を予測することを含む、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１ 同定が、免疫沈降させたペプチドの質量分析を含む、実施形態９又は１０に記載の方法。
実施形態１２ 試料が、腫瘍生検試料である、実施形態３～１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３ ワクチンがナノ粒子を含まない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４ ワクチンがカチオン性脂質を含まない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５ ワクチンが脂質を含まない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６ ワクチンがアジュバントを含まない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７ ワクチンが、免疫賦活遺伝子をコードするＤＮＡを含まない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８ ワクチンがリポソームを含まない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９ ワクチンが非ウイルス性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０ ワクチンが、ネオアンチゲンＤＮＡ、ネオアンチゲンｍＲＮＡ又はネオアンチゲンペプチドと、緩衝液とからなる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１ ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドが裸の核酸分子である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２ ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドが裸のｍＲＮＡである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３ カートリッジ中の裸のｍＲＮＡの量が、少なくとも０．２μｇである、実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４ ワクチンが、合成後にそのままカートリッジにパッケージングされる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５ カートリッジが減圧されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６ ワクチンが、コロナウイルスに対する抗原特異的免疫応答を誘導する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２７ カートリッジが、免疫チェックポイントタンパク質に特異的な遮断抗体を更に含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２８ 免疫チェックポイントタンパク質が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ－４）及び／又はプログラム細胞死受容体－１（ＰＤ－１）を含む、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９ 注射器が点火器を更に備え、点火器が点火すると、カートリッジの内容物が対象に注入される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０ 個別化ワクチンを対象に投与する方法であって、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法に従って、対象に対して個別化されたパッケージ化ワクチンを製造すること、カートリッジを注射器に装填すること、及び個別化ワクチンを注射器から対象に注入することを含む、方法。
実施形態３１ 注入が、第１段階及び第２段階を含む２段階注入プロファイルを示し、第２段階が第１段階の後である、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２ ２段階注入プロファイルが、注入から１５ｍｓｅｃ以内に少なくとも２つのピークを有する、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３ ２段階注入プロファイルが、注入から１．５ｍｓｅｃ以内に少なくとも２つのピークを有する、実施形態３１又は３２に記載の方法。
実施形態３４ ２段階注入プロファイルが、５ｍｓｅｃ以内に第１のピークを有する、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３５ 第１段階が、各々が振動ピークを有する複数の振動要素を含む、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６ 少なくとも２つのピークが、振動要素の振動ピークである、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７ 振動要素の全振幅が経時的に減少する、実施形態３５又は３６に記載の方法。
実施形態３８ 第１のピークが少なくとも２ＭＰａである、実施形態３１～３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９ 第１のピークが少なくとも１５ＭＰａである、実施形態３１～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０ ２段階注入プロファイルの第２段階の最も高いピークが、注入から３０ｍｓｅｃ以内にある、実施形態３１～３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１ ２段階注入プロファイルの第２段階の最も高いピークが、注入から１５ｍｓｅｃ以内にある、実施形態３１～４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２ ２段階注入プロファイルが、１つのピークのみを有する第２段階を含む、実施形態３１～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３ ２段階プロファイルの第２段階の最も高いピークが少なくとも０．１ＭＰａである、実施形態３１～４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４ ２段階プロファイルの第２段階の最も高いピークが少なくとも１０ＭＰａである、実施形態３１～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５ ２段階プロファイルの第２段階の最も高いピークが、２段階プロファイルの第１段階の最も高いピークよりも低い、実施形態３１～４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６ 注射が経皮注射である、実施形態３０～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７ 注入が経皮注射を含まない、実施形態３０～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８ 注射が筋肉注射、皮下注射、又は皮内注射である、実施形態３０～４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９ 注射が病巣内注射である、実施形態３０～４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０ 注射が腫瘍内注射である、実施形態３０～４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１ 注射が節内注射又はリンパ内注射である、実施形態３０～４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２ 注射が節内注射を含まない、実施形態３０～５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３ 対象に注射される個別化ワクチン中のｍＲＮＡの量が少なくとも０．２μｇである、実施形態３０～５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４ 注射器が無針である、実施形態３０～５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５ 注射器が点火器を更に備え、点火器が点火すると、カートリッジの内容物が対象に注入される、実施形態３０～５４に記載の方法。
実施形態５６ 対象における変異に関連する疾患を治療、改善又は予防する方法であって、実施形態３０～５５のいずれか１つに記載の方法に従って個別化ワクチンを対象に投与することを含む、方法。
実施形態５７ 疾患が腫瘍（がん）である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８ 点火器と取り外し可能なカートリッジとを備える注射器であって、取り外し可能なカートリッジが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドを含むワクチンを収容するように構成されている、注射器。
実施形態５９ 注射器が針を備えない、実施形態５８に記載の注射器。
実施形態６０ 注射器がばねを備えない、実施形態５８又は５９に記載の注射器。
実施形態６１ ワクチンがナノ粒子を含まない、実施形態５８～６０のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態６２ ワクチンがカチオン性脂質を含まない、実施形態５８～６１のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態６３ ワクチンが脂質を含まない、実施形態５８～６２のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態６４ ワクチンがアジュバントを含まない、実施形態５８～６３のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態６５ ワクチンが、免疫賦活遺伝子をコードするＤＮＡを含まない、実施形態５８～６４のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態６６ ワクチンがリポソームを含まない、実施形態５８～６５のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態６７ ワクチンが非ウイルス性である、実施形態５８～６６のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態６８ ワクチンが、ネオアンチゲンＤＮＡ、ネオアンチゲンｍＲＮＡ又はネオアンチゲンペプチドと、緩衝液とからなる、実施形態５８～６７のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態６９ ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドが裸の核酸分子である、実施形態５８～６８のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態７０ ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はペプチドが裸のｍＲＮＡである、実施形態５８～６９のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態７１ カートリッジ内の裸のｍＲＮＡの量が少なくとも０．２μｇである、実施形態７０に記載の注射器。
実施形態７２ 注射器が細胞内への運搬用に構成されている、実施形態５８～７１のいずれか１つに記載の注射器。
実施形態７３ 実施形態３０～４５のいずれか１つに記載の方法に従って個別化ワクチンを対象に投与するための、実施形態３０～５５のいずれか１つに記載の注射器の使用。
実施形態７４ 実施形態４６又は４７に記載の方法に従って対象における腫瘍を治療又は改善するための、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の注射器の使用。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【国際調査報告】