特表 2024-527370 膵臓がんに対する循環マイクロＲＮＡシグネチャ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-24

(54)【発明の名称】膵臓がんに対する循環マイクロＲＮＡシグネチャ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20240717BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20240717BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20240717BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240717BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20240717BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20240717BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240717BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20240717BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240717BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240717BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6837 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6876 C

A61K31/337

A61K45/00

A61P35/00

A61P1/18

G01N33/50 P

C12Q1/6876 Z

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500606

(86)(22)【出願日】2022-07-09

(85)【翻訳文提出日】2024-03-05

(86)【国際出願番号】 US2022036608

(87)【国際公開番号】W WO2023283476

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】63/220,195

(32)【優先日】2021-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511071555

【氏名又は名称】ダナ－ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】524008258

【氏名又は名称】メディカル ユニバーシティ オブ ウッチ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100103182

【弁理士】

【氏名又は名称】日野 真美

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(72)【発明者】

【氏名】チャウドリー，ディパンジャン

(72)【発明者】

【氏名】フェンドラー，ヴォイチェフ

(72)【発明者】

【氏名】スタウィスキ，コンラッド

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB26

2G045DA13

2G045DA14

2G045FB02

2G045JA01

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4C084AA17

4C084NA20

4C084ZA66

4C084ZB26

4C086AA01

4C086BA02

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA20

4C086ZA66

4C086ZB26

(57)【要約】

本明細書では、対象から回収した試料中の特定のマイクロＲＮＡバイオマーカーの量を測定するための方法およびキットが提供される。マイクロＲＮＡバイオマーカーは膵臓がんと関連付けられる。また、特定のマイクロＲＮＡバイオマーカーの量について対象をスクリーニングする方法、ならびに膵臓がんを有することが疑われる対象を診断し、処置し、またはモニタリングする方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における膵臓がんを診断するための方法であって、
（ａ）前記対象から回収した試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ（配列番号１６）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）からなる群から選択される１種以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された前記試験マイクロＲＮＡの量を統計モデルと比較するステップと
を含み、それによって前記対象における膵臓がんを診断する、前記方法。

【請求項2】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップからなる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）を検出および定量化するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

ステップ（ｂ）が、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）；または
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）
のいずれかを検出および定量化するステップを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）を検出および定量化するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）を検出および定量化するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ステップｂ）が、前記試験マイクロＲＮＡの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種を検出および定量化するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

（ｄ）前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）からなる群から選択される１種以上の正規化マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において定量化された前記正規化マイクロＲＮＡの量を用いて前記試験マイクロＲＮＡの量を正規化するステップと
をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ステップ（ｄ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）を検出および定量化するステップを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ステップ（ｄ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）を検出および定量化するステップを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

ステップ（ｄ）が、前記正規化マイクロＲＮＡの少なくとも２または３種を検出および定量化するステップを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、前記マイクロＲＮＡの各々またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブへの前記試料の結合を検出することによって行われる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、核酸検出アッセイを用いて行われ、場合により、前記アッセイがマイクロアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、およびＲＴ－ｑＰＣＲからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）がＲＴ－ｑＰＣＲを用いて行われる、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記プローブの少なくとも１つが検出可能な標識を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記プローブの各々が検出可能な標識を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、
前記試料中の前記マイクロＲＮＡ分子を逆転写し、それによってｃＤＮＡ試料を得るステップ；および
前記ｃＤＮＡ試料を配列決定するステップ
によって行われる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、前記ｃＤＮＡ試料を配列決定する前に、前記ｃＤＮＡ試料中の前記ＤＮＡ分子を増幅するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）がｍｉＲＮＡ－ｓｅｑを用いて行われる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ（配列番号１６）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）からなる群から選択されるマイクロＲＮＡ、またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの試験プローブを含むキット。

【請求項24】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、および
ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブ
を含む、請求項２３に記載のキット。

【請求項25】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、および
ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブ
を含む、請求項２３に記載のキット。

【請求項26】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、および
ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブ
を含む、請求項２５に記載のキット。

【請求項27】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、および
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブ
を含む、請求項２３に記載のキット。

【請求項28】

ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、もしくは
ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブ
をさらに含む、請求項２７に記載のキット。

【請求項29】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、および
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブ
を含む、請求項２３に記載のキット。

【請求項30】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）に特異的にハイブリダイズする試験プローブ、および
ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブ
を含む、請求項２３に記載のキット。

【請求項31】

少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の試験プローブを含む、請求項２３に記載のキット。

【請求項32】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）からなる群から選択されるマイクロＲＮＡ、またはそれらのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの正規化プローブをさらに含む、請求項２３～３１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項33】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）に特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）に特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号３）に特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、および
ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ
をさらに含む、請求項２３～３１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項34】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）に特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）に特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、および
ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ
をさらに含む、請求項２３～３１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項35】

少なくとも２または３種の正規化プローブを含む、請求項２３に記載のキット。

【請求項36】

正規化プローブを含まない、請求項２３～３１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項37】

前記プローブの少なくとも１つが検出可能な標識を含む、請求項２３～３６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項38】

前記プローブの各々が検出可能な標識を含む、請求項３７に記載のキット。

【請求項39】

マイクロＲＮＡ分子の逆転写用の試薬をさらに含む、請求項２３～３８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項40】

膵臓がんを有することが疑われる対象を処置するための方法であって、
（ａ）前記対象から回収した試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ（配列番号１６）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）からなる群から選択される１種以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された前記試験マイクロＲＮＡの量を統計モデルと比較するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記比較に基づいて膵臓がんのより侵襲的な試験および／または調査のために対象を選択し、場合により、膵臓がんの対象に処置を施すステップと
を含む、前記方法。

【請求項41】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップからなる、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）を検出および定量化するステップを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項45】

（ｂ）が、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）；または
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）
のいずれかを検出および定量化するステップを含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）を検出および定量化するステップを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項47】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）を検出および定量化するステップを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項48】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項49】

ステップｂ）が、前記試験マイクロＲＮＡの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種を検出および定量化するステップを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項50】

（ｄ）前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）からなる群から選択される１種以上の正規化マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において定量化された前記正規化マイクロＲＮＡの量を用いて前記試験マイクロＲＮＡの量を正規化するステップと
をさらに含む、請求項４０～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

ステップ（ｄ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）を検出および定量化するステップを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

ステップ（ｄ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）を検出および定量化するステップを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項53】

ステップ（ｄ）が、前記正規化マイクロＲＮＡの少なくとも２または３種を検出および定量化するステップを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項54】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、前記マイクロＲＮＡの各々またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブへの前記試料の結合を検出することによって行われる、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、核酸検出アッセイを用いて行われ、場合により、前記アッセイがマイクロアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、およびＲＴ－ｑＰＣＲからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）がＲＴ－ｑＰＣＲを用いて行われる、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記プローブの少なくとも１つが検出可能な標識を含む、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記プローブの各々が検出可能な標識を含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、前記試料中の前記マイクロＲＮＡ分子を逆転写し、それによってｃＤＮＡ試料を得るステップ、および前記ｃＤＮＡ試料を配列決定するステップによって行われる、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、前記ｃＤＮＡ試料を配列決定する前に、前記ｃＤＮＡ試料中の前記ＤＮＡ分子を増幅するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）がｍｉＲＮＡ－ｓｅｑを用いて行われる、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記より侵襲的な試験が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、Ｘ線、陽電子断層撮影およびコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャン、内視鏡検査、超音波検査、核スキャン、および生検からなる群から選択される、請求項４０～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記より侵襲的な試験がＭＲＩである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

膵臓がんの前記調査が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、Ｘ線、陽電子断層撮影とコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャン、内視鏡検査、超音波検査、および核スキャンからなる群から選択される定期的な画像試験を含む、請求項４０～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記定期的な撮像が、３、６、または１２カ月ごとに行われる、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記対象が、膵臓がんのための処置を施される、請求項４０～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

施される前記処置が、手術、化学療法、免疫療法、および放射線療法からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記処置が化学療法を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記化学療法が、タキサン、代謝拮抗薬、白金化学療法、アルキル化剤、ＤＮＡ複製を阻害する薬剤、ＰＡＲＰ阻害剤、および抗腫瘍性化学療法からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記化学療法が、パクリタキセル、ドセタキセル、およびアルブミン結合パクリタキセルからなる群から選択されるタキサンを含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記化学療法が、ゲムシタビン塩酸塩、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、およびカペシタビンからなる群から選択される代謝拮抗薬を含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

前記化学療法が、前記プラチナ化学療法オキサリプラチンを含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項73】

前記化学療法が、前記アルキル化剤シスプラチンを含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項74】

前記化学療法が、イリノテカンおよびリポソーム性イリノテカンからなる群から選択される、ＤＮＡ複製を阻害する薬剤を含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項75】

前記化学療法が、ＰＡＲＰ阻害剤オラパリブを含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項76】

前記化学療法が、エベロリムス、エルロチニブ塩酸塩、スニチニブ、およびマイトマイシンからなる群から選択される抗腫瘍性化学療法を含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項77】

前記処置が、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、およびオキサリプラチン）、ＧＥＭＣＩＴＡＢＩＮＥ－ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ（ゲムシタビン塩酸塩およびシスプラチン）、ＧＥＭＣＩＴＡＢＩＮＥ－ＯＸＡＬＩＰＬＡＴＩＮ（ゲムシタビン塩酸塩およびオキサリプラチン）、およびＯＦＦ（オキサリプラチン、フルオロウラシル、およびフォリン酸）からなる群から選択される薬物併用を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項78】

前記処置が、前記免疫療法ペンブロリズマブを含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項79】

前記処置が手術を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項80】

前記処置が化学療法および免疫療法を含む、請求項６６～７６または７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記処置が化学療法および放射線を含む、請求項６６～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記処置が手術をさらに含む、請求項６８～７８または８０～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

対象における膵臓がんを診断するための分析方法であって、
ｃ）前記対象由来の前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ（配列番号１６）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）からなる群から選択される１種以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、
ｄ）ニューラルネットワークにおいて、ステップａ）で定量化された前記１種以上の試験マイクロＲＮＡの量を分析して、前記対象が膵臓がんを有する確率を決定するステップと、
ｅ）ステップｂ）の前記分析に基づき、膵臓がんを有する可能性が高いものとして前記対象を割り当てるステップと
を含む、前記対象における膵臓がんを診断するための分析方法。

【請求項84】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項86】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップからなる、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）を検出および定量化するステップを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項88】

ステップ（ｂ）が、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ（配列番号７）；または
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ（配列番号６）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）
のいずれかを検出および定量化するステップを含む、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ（配列番号１５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ（配列番号１６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ（配列番号１１）を検出および定量化するステップを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項90】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）の量を決定するステップを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項91】

ステップ（ｂ）が、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ（配列番号５）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ（配列番号１３）、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ（配列番号８）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ（配列番号１２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ（配列番号１４）を検出および定量化するステップを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項92】

ステップ（ｂ）が、前記試験マイクロＲＮＡの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種を検出および定量化するステップを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項93】

ステップ（ａ）が、前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）からなる群から選択される１種以上の正規化マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップをさらに含み；
ステップ（ｂ）が、前記正規化マイクロＲＮＡの量を用いて前記試験マイクロＲＮＡの量を正規化するステップをさらに含む、請求項８３～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

ステップ（ａ）が、正規化ｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ（配列番号３）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）を検出および定量化するステップを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

ステップ（ａ）が、正規化ｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ（配列番号２）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号４）を検出および定量化するステップを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項96】

ステップ（ａ）が、前記正規化マイクロＲＮＡの少なくとも２または３種を検出および定量化するステップを含む、請求項９３に記載の方法。

【請求項97】

ステップ（ａ）が、前記マイクロＲＮＡの各々またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブへの前記試料の結合を検出することによって行われる、請求項８３～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

ステップ（ａ）が、核酸検出アッセイを用いて行われ、場合により、前記アッセイがマイクロアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、およびＲＴ－ｑＰＣＲからなる群から選択される、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

ステップ（ａ）がＲＴ－ｑＰＣＲを用いて行われる、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

前記プローブの少なくとも１つが検出可能な標識を含む、請求項９７～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記プローブの各々が検出可能な標識を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

ステップ（ａ）が、前記試料中の前記マイクロＲＮＡ分子を逆転写し、それによって前記ｃＤＮＡ試料を得るステップ、および前記ｃＤＮＡ試料を配列決定するステップによって行われる、請求項８３～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

ステップ（ａ）が、前記ｃＤＮＡ試料を配列決定する前に、前記ｃＤＮＡ試料中の前記ＤＮＡ分子を増幅するステップをさらに含む、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

ステップ（ａ）がｍｉＲＮＡ－ｓｅｑを用いて行われる、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

膵臓がんを有する可能性が高いものとしての前記対象の割り当てが、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える精度率を有する、請求項８３～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記精度率が８０％を超える、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

膵臓がんを有する可能性が高いものとしての前記対象の割り当てが、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える特異度率を有する、請求項８３～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

特異度率が８０％を超える、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

膵臓がんを有する可能性が高いものとしての前記対象の割り当てが、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える感度率を有する、請求項８３～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

前記感度率が８０％を超える、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記試料が血液試料または膵臓試料である、請求項１～２２または４０～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記血液試料が、血漿、血清、および全血からなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記対象がヒト対象である、請求項１～２２または４０～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記対象が膵臓がんを発症するリスクがより高い、請求項１～２２または４０～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記対象が糖尿病を有する、請求項１～２２または４０～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記対象が膵炎を有する、請求項１～２２または４０～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記対象が膵臓がんまたは膵炎の家族歴を有する、請求項１～２２または４０～１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記対象が、遺伝子突然変異による膵臓がんを発症するリスクがより高い、請求項１～２２または４０～１１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記対象が、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＴＰ５３、ＭＬＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＡＴＭからなる群から選択される遺伝子における突然変異を有する、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記統計モデルが、線形判別分析、ロジスティック回帰、多変量適応回帰スプライン、ナイーブベイズ、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、決定木、Ｋ近傍法、機能木、最小絶対偏差（ＬＡＤ）木、ベイジアンネットワーク、エラスティックネット回帰、およびランダムフォレストからなる群から選択される１種以上のモデルを含む、請求項１～２２または４０～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記統計モデルがニューラルネットワークを含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記統計モデルがロジスティック回帰を含む、請求項１２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦支援研究開発に関する陳述
関連出願
本出願は、２０２１年７月９日出願の米国仮特許出願第６３／２２０，１９５号の優先権を主張する。この出願の全開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

膵臓がんの生存率は、診断時の腫瘍の大きさおよび転移の程度に依存する。膵臓がんの処置が早ければ早いほど予後は良好である。残念なことに、膵臓がんは通常、進行して転移するまで症状がほとんどかまたはまったく現れない。症例の最大８０％が後期に診断され、処置がより困難である（Pancreatic Cancer Prognosis, John Hopkins Medicine:https://www.hopkinsmedicine.org/health/conditions-and-diseases/pancreatic-cancer/pancreatic-cancer-prognosisで利用可能）。他のがんと比較して、膵臓がんの５年生存率はわずか５～１０％と非常に低く、これは、がんが転移したときにステージＩＶで診断される人の割合が高いためである。

【0003】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡサイレンシングおよび転写後調節により遺伝子発現を制御する低分子調節ＲＮＡ分子である。これらは組織特異的であることが多く、多数のがんにおいて調節障害である。マイクロＲＮＡは二本鎖ヘアピン構造を有し、メッセンジャーＲＮＡよりも安定である。一部のｍｉＲＮＡは血液中で検出され、その量は数年間または数十年にわたって血液試料中で安定したままであり、非浸潤性がん診断のためのバイオマーカーとしてそれらを使用する実施可能性を提供する。しかしながら、ほとんどの研究は、血液試料ではなく腫瘍試料中に異常に発現するｍｉＲＮＡに焦点を当てている。

【0004】

早期膵臓がんの正確であり、確実な診断を目的として、循環ｍｉＲＮＡを同定することが当該技術分野において必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、対象（例えば、ヒト対象）由来の試料（例えば、血液試料）中のマイクロＲＮＡの存在もしくは不存在および／または量を決定する方法、ならびにｍｉＲＮＡに対するプローブを含むキットを提供する。本開示はまた、対象を処置する方法、ならびに特定のｍｉＲＮＡの存在または不存在について対象の血液試料をスクリーニングする方法を記載する。

【0006】

本開示は、一態様では、対象における膵臓がんを診断するための方法であって、
（ａ）対象から回収した試料を得るステップと、
（ｂ）試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐからなる群から選択される１種以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された試験マイクロＲＮＡの量を統計モデルと比較するステップと
を含み、それによって対象における膵臓がんを診断する、方法を提供する。

【0007】

一部の実施形態では、本方法は、（ｄ）試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐからなる群から選択される１つ以上の正規化マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において定量化された正規化マイクロＲＮＡの量を用いて試験マイクロＲＮＡの量を正規化するステップとをさらに含む。

【0008】

一部の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0009】

例示的な実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐを検出および定量化するステップからなる方法が提供される。

【0010】

他の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0011】

さらに他の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ；またはｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐのいずれかを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0012】

一部の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、およびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0013】

他の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐおよびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0014】

さらに他の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0015】

一部の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0016】

他の実施形態では、参照マイクロＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0017】

さらなる実施形態では、参照マイクロＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0018】

さらに他の実施形態では、少なくとも２または３種の正規化マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。

【0019】

他の実施形態では、マイクロＲＮＡの各々またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプローブへの試料の結合を検出することによって、マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、プローブの少なくとも１つは、検出可能な標識を含む。他の実施形態では、プローブの各々は、検出可能な標識を含む。

【0020】

さらなる実施形態では、核酸検出アッセイによるマイクロＲＮＡを検出および定量化するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、アッセイは、マイクロアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、およびＲＴ－ｑＰＣＲからなる群から選択される。

【0021】

追加の実施形態では、試料中のマイクロＲＮＡ分子を逆転写し、それによってｃＤＮＡ試料を得ることによってマイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、ｃＤＮＡ試料を配列決定するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、ｃＤＮＡ試料を配列決定する前に、ｃＤＮＡ試料中のＤＮＡ分子を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡを検出および定量化する方法は、ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑを用いて行われる。

【0022】

さらに別の態様では、本開示は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ、またはそれらのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの試験プローブを含むキットを提供する。

【0023】

一部の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、またはそれらのマイクロＲＮＡのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブを含むキットが提供される。

【0024】

他の実施形態では、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、またはそれらのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブを含むキットが提供される。

【0025】

一部の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブからなるキットが提供される。

【0026】

追加の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、またはそれらのマイクロＲＮＡのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブを含むキットが提供される。

【0027】

さらなる実施形態では、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、もしくはｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、またはそのマイクロＲＮＡのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブを含むキットが提供される。

【0028】

一部の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、またはそれらのマイクロＲＮＡのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブを含むキットが提供される。

【0029】

さらなる実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐに特異的にハイブリダイズする試験プローブ、またはそれらのマイクロＲＮＡのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする試験プローブを含むキットが提供される。

【0030】

一部の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の試験プローブを含むキットが提供される。

【0031】

さらなる実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ、またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの正規化プローブを含むキットが提供される。

【0032】

一部の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、またはそれらのマイクロＲＮＡのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブを含むキットが提供される。

【0033】

追加の実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブ、またはそれらのマイクロＲＮＡのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる正規化プローブを含むキットが提供される。

【0034】

他の実施形態では、少なくとも２または３種の正規化プローブを含むキットが提供される。

【0035】

追加の実施形態では、正規化プローブを含まないキットが提供される。

【0036】

さらなる実施形態では、検出可能な標識を含む少なくとも１つのプローブを含むキットが提供される。一部の実施形態では、プローブの各々は、検出可能な標識を含む。

【0037】

一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ分子の逆転写のための試薬を含むキットが提供される。

【0038】

さらに別の態様では、本開示は、膵臓がんを有することが疑われる対象を処置するための方法であって、
（ａ）対象から回収した試料を得るステップと、
（ｂ）試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐからなる群から選択される１つ以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された試験マイクロＲＮＡの量を統計モデルと比較するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の比較に基づいて膵臓がんのより侵襲的な試験および／または調査のために対象を選択し、場合により、膵臓がんの対象に処置を施すステップと
を含む、方法を提供する。

【0039】

一部の実施形態では、より侵襲的な試験は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、Ｘ線、陽電子断層撮影とコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャン、内視鏡検査、超音波検査、核スキャン、および生検からなる群から選択される。

【0040】

他の実施形態では、膵臓がんの調査は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、Ｘ線、陽電子断層撮影とコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャン、内視鏡検査、超音波検査、および核スキャンからなる群から選択される定期的な画像試験を含む。一部の実施形態では、定期的な撮像は、３、６、または１２カ月ごとに行われる。

【0041】

さらに他の実施形態では、対象は、膵臓がんのための処置を施される。一部の実施形態では、施される処置は、手術、化学療法、免疫療法、および放射線療法からなる群から選択される。一部の実施形態では、処置は免疫療法ペンブロリズマブを含む。一部の実施形態では、処置は手術を含む。一部の実施形態では、処置は化学療法および免疫療法を含む。一部の実施形態では、処置は化学療法および放射線を含む。

【0042】

追加の実施形態では、対象は、膵臓がんのための化学療法処置を施される。一部の実施形態では、化学療法は、タキサン、代謝拮抗薬、白金化学療法、アルキル化剤、ＤＮＡ複製を阻害する薬剤、ＰＡＲＰ阻害剤、および抗腫瘍性化学療法からなる群から選択される。一部の実施形態では、化学療法は、パクリタキセル、ドセタキセル、およびアルブミン結合パクリタキセルからなる群から選択されるタキサンを含む。一部の実施形態では、化学療法は、ゲムシタビン塩酸塩、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、およびカペシタビンからなる群から選択される代謝拮抗薬を含む。一部の実施形態では、化学療法は、プラチナ化学療法オキサリプラチンを含む。一部の実施形態では、化学療法は、アルキル化剤シスプラチンを含む。一部の実施形態では、化学療法は、イリノテカンおよびリポソーム性イリノテカンからなる群から選択される、ＤＮＡ複製を阻害する薬剤を含む。一部の実施形態では、化学療法は、ＰＡＲＰ阻害剤オラパリブを含む。一部の実施形態では、化学療法は、エベロリムス、エルロチニブ塩酸塩、スニチニブ、およびマイトマイシンからなる群から選択される抗腫瘍性化学療法を含む。

【0043】

さらなる実施形態では、対象は、膵臓がんのための薬物併用処置を施される。一部の実施形態では、薬物併用は、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、およびオキサリプラチン）、ＧＥＭＣＩＴＡＢＩＮＥ－ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ（ゲムシタビン塩酸塩およびシスプラチン）、ＧＥＭＣＩＴＡＢＩＮＥ－ＯＸＡＬＩＰＬＡＴＩＮ（ゲムシタビン塩酸塩およびオキサリプラチン）、およびＯＦＦ（オキサリプラチン、フルオロウラシル、およびフォリン酸）からなる群から選択される。

【0044】

追加の態様では、本開示は、対象における膵臓がんを診断するための分析方法であって、
ａ）上記対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐからなる群から選択される１種以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、
ｂ）ニューラルネットワークにおいて、ステップａ）で定量化された１種以上の試験マイクロＲＮＡの量を分析して、対象が膵臓がんを有する確率を決定するステップと、
ｃ）ステップｂ）の分析に基づいて、膵臓がんを有する可能性が高いものとして対象を割り当てるステップと
を含む、方法を提供する。

【0045】

一部の実施形態では、膵臓がんを有する可能性が高いものとしての対象の割り当ては、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える精度率を有する。一部の実施形態では、膵臓がんを有する可能性が高いものとしての対象の割り当ては、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える特異度率を有する。一部の実施形態では、膵臓がんを有する可能性が高いものとしての対象の割り当ては、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超える感度率を有する。

【0046】

さらなる実施形態では、本方法は、試料を得るステップを含む。一部の実施形態では、試料は、血液試料または膵臓試料である。一部の実施形態では、血液試料は、血漿、血清、および全血からなる群から選択される。

【0047】

さらに他の実施形態では、本方法は、対象から回収した試料を得るステップを含む。一部の実施形態では、対象はヒト対象である。一部の実施形態では、対象は、膵臓がんを発症するリスクがより高い。一部の実施形態では、対象は糖尿病を有する。一部の実施形態では、対象は膵炎を有する。一部の実施形態では、対象は、膵臓がんまたは膵炎の家族歴を有する。一部の実施形態では、対象は、遺伝子突然変異による膵臓がんを発症するリスクがより高い。一部の実施形態では、対象は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＴＰ５３、ＭＬＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＡＴＭからなる群から選択される遺伝子における突然変異を有する。

【0048】

さらなる実施形態では、本方法は、統計モデルの使用を含む。一部の実施形態では、統計モデルは、線形判別分析、ロジスティック回帰、多変量適応回帰スプライン、ナイーブベイズ、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、決定木、Ｋ近傍法、機能木、最小絶対偏差（ＬＡＤ）木、ベイジアンネットワーク、エラスティックネット回帰、およびランダムフォレストからなる群から選択される１種以上のモデルを含む。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】患者の２つの独立したコホートを用いてヒト血清から循環ｍｉＲＮＡシグネチャを生成するための実施例１の研究デザインの概略図を示す。模式図はまた、患者がどのようにトレーニングセット、試験セット、および検証セットに割り当てられたかを示す。また、この概略図は、アルゴリズムを作成するために一連の統計ツールを使用し、ｍｉＲＮＡの最終セットを作成し、モデルを較正し、ｑＰＣＲを使用してモデルを検証するステップも示している。

【図2】実施例１のトレーニングセットの変数選択研究を示す図である。１０種のｍｉＲＮＡを、ファミリーワイズエラー率（ＦＷＥＲ）ｐ値＜０．０５（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整されたｐ値を有する）を有するものとして選択した。ボルカノプロット（図２Ａ）および結果の表（図２Ｂ）は、これら１０種のｍｉＲＮＡについて、３種が上方制御され、７種が下方制御されたことを示す。

【図3-1】後退段階的ロジスティック回帰によりさらに精緻化されたロジスティック回帰性能を用いた、実施例１における分類モデルの開発を示す図である。図３Ａは、試験されたｍｉＲＮＡモデルについての特異度対感度のプロットを示す。図３Ｂは、最終モデルで使用された４種のｍｉＲＮＡの計算値を示す。これらの結果は、モデルがＨｏｓｍｅｒ Ｌｅｍｅｓｈｏｗ値＝４．４９２７およびｐ値＝０．８１０１６１でトレーニングおよび試験セットに非常によく適合することを示す。図３Ｃは、がん陽性試料対対照におけるがんの検出での感度および特異度を示す。４種のｍｉＲＮＡの最終ロジスティック回帰モデルは、７９．３％の感度と８４．１％の特異度を示した。

【図3-2】（上記の通り。）

【図4】分析におけるｍｉＲＮＡの数を減少させるために使用される感度分析を伴う人工ニューラルネットワークを使用する、実施例１における分類モデルの開発を示す図である。図４Ａは、試験されたモデルｍｉＲＮＡモデルについての特異度対感度のプロットを示す。人工ニューラルネットワークは、以下の８種のｍｉＲＮＡを必要とする：ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ。図４Ｂは、がん陽性試料対対照におけるがんの検出での感度および特異度を示す。最終人工ニューラルネットワークは、７１．４％の感度と９０．９％の特異度を示した。

【図5】ロジスティック回帰、生データセット上の人工ニューラルネットワーク、およびＳＭＯＴＥ均衡型データセット上の人工ニューラルネットワークを使用して診断モデルを作成するために、実施例１からのデータセットをトレーニングセット、試験セット、および検証セットに分割することを示す図である。図５Ａに示されるように、ポーランド試料の２つのグループのデータセットは、モデリングのために分割された。図５Ｂは、トレーニングセットから均衡型データセットを作成するためのＳＭＯＴＥ技術の使用を示す。

【図6】試験データセットと検証データセットの両方の性能を評価するための２つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐおよびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ）モデルのロジスティック回帰の実施例１における使用を示す図である。図６Ｂは、このモデルが、観察されたがんを有する試料対対照におけるがんの予測において、６６％の感度率と７４％の特異度率を有することを示す。

【図7-1】実施例１における古典的（非ＳＭＯＴＥ修飾された）データのニューラルネットワークモデルの結果を示す図である。これらの結果は、年齢および性別を含む臨床データ、ならびに全１０種のｍｉＲＮＡを用いて作成した。以下のｍｉＲＮＡは、正規化のために使用された：ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ。図７Ａは、トレーニングセットのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）が０．８４７５であることを示す。図７Ｂは、トレーニングデータセットおよび試験データセットについて、８２．５７％の精度、５９．７２％の感度、および９３．８４％の特異度の値を提供する。図７Ｂは、検証データセットについて、精度について８３．０２％、感度について６４．７１％、および特異度について９１．６７％の値を提供する。

【図7-2】（上記の通り。）

【図8-2】実施例１におけるＳＭＯＴＥ均衡型データセット上のニューラルネットワークモデルの結果を示す図である。これらの結果は、臨床データセット、ならびにｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐを含むトリミングされたｍｉＲＮＡセットを用いて生成された。以下のｍｉＲＮＡは、正規化のために使用された：ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ。図８Ａは、データセットのＡＵＣが０．８９７１であることを示す。図８Ｂは、トレーニングデータセットおよび試験データセットについて、８４．８６％の精度、７９．１７％の感度、および８７．６７％の特異度の値を提供する。図８Ｂは、検証データセットについて、８６．７９％の精度、７６．４７％の感度、および９１．６７％の特異度の値を提供する。

【図8-2】（上記の通り。）

【発明を実施するための形態】

【0050】

本開示は、対象から回収した試料中の特定のｍｉＲＮＡバイオマーカーの量を測定するための方法およびキットを提供する。ｍｉＲＮＡバイオマーカーはがん（例、膵臓がん）と関連付けられる。具体的には、統計的に関連する方法で、対象ががん（例えば、膵臓がん）を有する確率の増加を予測するために使用される、ｍｉＲＮＡの試験および正規化の固有の組み合わせが記載される。これらのｍｉＲＮＡの組み合わせの使用は、疾患に対する個人の感受性をモニタリングするために有用である非侵襲的ながん検出方法を提供する。検出方法は、単独で、または他の公知の診断方法と組み合わせて使用することができる。本明細書に記載される方法は、膵臓がんを検出または診断するために特に有用である。例えば、これらの方法は、最も一般的な鑑別診断である、膵臓がんと膵炎の鑑別に有効である。また、本明細書では、がん（例えば、膵臓がん）と診断された対象を調査し、処置する方法が提供される。

【0051】

この開示に記載される方法は、本明細書に開示される特定の方法および実験条件に限定されるものではなく、このような方法および条件は変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、限定することを意図しないことも理解されるべきである。

【0052】

さらに、本明細書に記載される実験は、特に断らない限り、当業者に慣用的な分子細胞生物学的および免疫学的技術を使用する。このような技術は、当業者に周知であり、文献で完全に説明されている。例えば、Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008)（すべての補遺を含む）, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) by MR Green and J. Sambrook and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition)を参照されたい。

【0053】

本明細書に別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。任意の潜在的な曖昧さがある場合、本明細書に提供される定義は、辞書または外来的な定義に優先する。文脈上別段の要求がない限り、単数語は複数を含み、複数語は単数語を含むものとする。「または」の使用は、特に断らない限り、「および／または」を意味する。用語「含んでいる」の使用、ならびに「含む」および「含まれる」などの他の形態は、限定するものではない。

【0054】

一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されている。本明細書に提供される方法および技術は、一般的に、当該技術分野において周知である慣用的な方法に従って行われ、特に断らない限り、本明細書全体を通して引用および検討されている種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載されているものである。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に達成されるか、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学の実験手法および技術に関連して使用される命名法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置に標準的な技術が使用される。

【0055】

ＲＮＡおよびＤＮＡの検出方法
本開示は、がんの診断および処置のための組成物および方法を提供する。例示的な実施形態では、本明細書では、高感度かつ特異的な膵臓がんのための診断試験が提供される。この診断試験は、核酸の検出および定量に依存する。具体的には、マイクロＲＮＡの検出および定量に依存する診断試験が提供される。

【0056】

本明細書では、核酸の定量および検出のための方法が提供される。本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、相補的核酸とハイブリダイズすることができる２つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体（例えば、リボース環の２’－Ｏと４’－Ｃ原子間のメチレン架橋を有するリボ核酸）のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語には、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、およびＰＮＡが含まれる。

【0057】

具体的には、本明細書では、マイクロＲＮＡの検出および定量のための方法が提供される。本明細書で使用される用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」とは、ヘアピン二次構造を形成する１９～２６ヌクレオチドの長さの小さな非コードリボ核酸（ＲＮＡ）遺伝子産物を指す。本明細書に記載されるマイクロＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれるAmbros et al., RNA. 2003 Mar;9(3):277-9に記載される命名法を用いて命名され、配列はmirbase.orgで見出すことができる。

【0058】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、試験マイクロＲＮＡの使用を含む。本明細書で使用される場合、用語「試験マイクロＲＮＡ」とは、その存在もしくは非存在および／または量が、例えば診断目的で（例えば、アルゴリズムを使用して）決定されるマイクロＲＮＡを指す。一部の実施形態では、１つ以上の試験マイクロＲＮＡの存在もしくは不存在および／または量は、正規化目的のために追加的に使用することができる。

【0059】

本明細書で使用される語句「１つ以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化する」とは、マイクロＲＮＡの濃度、絶対値または存在を測定するために使用され得る任意の方法を包含する。マイクロＲＮＡの量を決定するための例示的な方法には、配列決定（例えば、ギルバート配列決定、サンガー配列決定、ＳＭＲＴ配列決定または次世代シークエンシング）、マイクロアレイ検出、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ、およびリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲが含まれる。

【0060】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、正規化を用いて行われる。本明細書で使用される場合、用語「正規化する」または「正規化」とは、第２の測定値（例えば、ハウスキーピング遺伝子のレベル）に対して第１の測定値（例えば、目的とする遺伝子のレベル）を調整することを指し、第１および第２の測定値は、同じ試料（例えば、同じ均質試料の異なる部分）から測定され、第２の測定値は、試料の量および／または質に相関する。正規化により、個々の試料調製物で異なり得る試料の量および／または質に影響されない第１の値の相対量を得ることができる。本明細書で使用される場合、用語「正規化マイクロＲＮＡ」または「参照マイクロＲＮＡ」とは、試料（例えば、血液試料）中に安定な量を有することが公知であり、試料中の試験マイクロＲＮＡの測定値を正規化するために使用されるマイクロＲＮＡを指す。単一の正規化マイクロＲＮＡを使用して、試料中の標的マイクロＲＮＡの測定量を正規化することができるか、または複数のマイクロＲＮＡの平均値を正規化するために使用することができる。特定の実施形態では、正規化は、増幅サイクルの数（正規化因子マイクロＲＮＡの平均）－増幅サイクルの数（目的とするｍｉＲ）によって計算され得る。

【0061】

例示的な実施形態では、表１および２のｍｉＲＮＡの１つ以上の、または様々な組み合わせは、本明細書に開示される方法を用いて定量化される。表１は、結果を正規化するための参照ｍｉＲＮＡを提供する。表２は、がん（例えば、膵臓がん）のバイオマーカーとして役立つ試験ｍｉＲＮＡを提供する。

【0062】

【表1】

【0063】

【表2】

【0064】

一部の実施形態では、表２における試験ｍｉＲＮＡの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種のレベルが検出され、定量化される。例示的な実施形態では、表２における試験ｍｉＲＮＡの７種のレベルが検出され、定量化される。

【0065】

一部の実施形態では、表１における参照ｍｉＲＮＡの１、２、３、または４種のレベルが検出され、定量化される。例示的な実施形態では、表１における参照ｍｉＲＮＡの全４種のレベルが検出され、定量化される。追加の例示的な実施形態では、表１における参照ｍｉＲＮＡの４種および表２における試験ｍｉＲＮＡの７種のレベルが検出され、定量化される。

【0066】

例示的な実施形態では、検出および定量化されるｍｉＲＮＡは、対象由来の試料から得られる。本明細書で使用される用語「対象」とは、哺乳動物、例えば、ヒト、飼育動物または家畜、例えば、ネコ、イヌ、ウシ、もしくはウマを指す。本明細書で使用される場合、用語「試料」とは、組織または体液などの対象に由来する材料の生物学的標本を指す。

【0067】

本明細書で使用される場合、「対象から回収した試料を得ること」は、本明細書に開示される任意の適切な手段、ならびに対象から生物学的標本を取り出すためのルーチンの臨床方法を包含する。試料は、対象から直接採取することができるか、または第三者から得ることができる。試料回収は、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医師、歯科医師、カイロプラクター、救急医師、皮膚科医師、腫瘍医師、消化器科医師、または外科医師などの医療提供者によって行うことができる。試料には、限定されないが、血液、粘膜（例えば唾液）、リンパ液、尿、糞便、および固形組織試料が含まれる。例示的な実施形態では、体液試料は、対象から回収される。対象から体液試料を得るための手法は、全血およびリンパ液を回収および処理するための手法を含めて周知である。

【0068】

例示的な実施形態では、対象から得られる試料は、血液試料である。本明細書で使用される場合、用語「血液試料」とは、全血などの対象から採取されたある量の血液、または全血中に正常に含有される細胞（例えば、赤血球、白血球、および血小板）を欠く、血漿などの対象から採取された血液の成分部分、またはフィブリノーゲンおよび一部の凝固因子を欠く血漿である血清を指す。一部の実施形態では、試料は、組織試料である。組織試料は、生検によって得ることができる。一部の実施形態では、試料は、組織生検（例えば、針生検、ＣＴガイド下針生検、吸引生検、内視鏡生検、気管支鏡生検、気管支洗浄液、切開生検、切除生検、パンチ生検、スライス生検、皮膚生検、骨髄生検、または電気化学的ループ切除）である。

【0069】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、核酸間の結合のステップまたは複数のステップを含む。本明細書で使用される場合、用語「結合する」または「結合すること」は、２つの分子間、例えば２つの相補的核酸間の非共有結合または共有結合の相互作用を指す。

【0070】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、核酸間のハイブリダイゼーションのステップまたは複数のステップを含む。本明細書で使用される用語「ハイブリダイズする」とは、第１の一本鎖核酸を第２の相補的一本鎖核酸にアニーリングさせることを指し、第１の核酸と第２の核酸の相補的ヌクレオチドは水素結合によって対を形成する。本明細書で使用される場合、用語「特異的にハイブリダイズすること」は、第１の核酸分子（例えば、特定のヌクレオチド配列を有する核酸プローブ）と第２の核酸分子（例えば、核酸プローブのそれと相補的なヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡ）の間の非共有結合の相互作用を指す。ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において報告されており、当業者に公知である。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するための条件は、核酸検出アッセイ（例えば、マイクロアレイ、ＲＴ－ＰＣＲ、またはＲＴ－ｑＰＣＲ）の適切な条件である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションの可能性は、２つの核酸間で相補的なヌクレオチド配列と相関する。オリゴヌクレオチドが生理学的条件下で、３７℃を超える、４５℃を超える、好ましくは少なくとも５０℃、および典型的には６０℃～８０℃またはそれ以上のＴｍで標的にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」。オリゴヌクレオチドの「Ｔｍ」は、５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、例えば、Miyada et al., Methods Enzymol. 154:94-107 (1987)に記載されるように、生理食塩水中の標準条件下で決定される。

【0071】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、相補的核酸の相互作用のステップを含む。ポリヌクレオチドは、２つの一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平行配置でハイブリダイゼーションが起こる場合、互いに「相補的」として記載される。相補性（あるポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に受け入れられている塩基対形成の規則に従って、互いに水素結合を形成することが予想される対立する鎖中の塩基の割合によって定量化できる。

【0072】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、ＰＣＲによって行われる。本明細書で使用される用語「ＰＣＲ」とは、ある量の標的ＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を指す。ＰＣＲは、ＤＮＡ変性、アニーリングおよび増幅されたＤＮＡの酵素的伸長のための反応の繰り返される加熱および冷却のサイクルからなる熱サイクルに依存する。第１に、ＤＮＡの鎖は、高温でＤＮＡの融解または変性と呼ばれるプロセスにおいて分離される。次に、温度を下げ、プライマーおよび標的ＤＮＡの鎖が選択的に結合またはアニールすることを可能にし、ＤＮＡポリメラーゼが標的ＤＮＡを増幅するための鋳型を作製する。次に、ＤＮＡポリメラーゼの作動温度で、鋳型依存性のＤＮＡ合成が起こる。これらのステップが繰り返されて、標的ＤＮＡのコピーが多数つくられる。

【0073】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、プライマーの使用を含む。本明細書で使用される「プライマー」とは、標的ＤＮＡ配列に選択的に結合し、３’末端でＤＮＡポリメラーゼによる新規デオキシリボヌクレオチドの付加を可能にする、短い一本鎖ＤＮＡ配列を指す。特定の実施形態によれば、フォワードプライマーは、長さが１８～３５、１９～３２または２１～３１ヌクレオチドである。フォワードプライマーのヌクレオチド配列は、それが標的部位の一部または全部と特異的にハイブリダイズし、そのＴｍ値が５０℃～７２℃の範囲内であり得、特に５８℃～６１℃の範囲内であり得、５９℃～６０℃の範囲内であり得る限り、限定されない。プライマーのヌクレオチド配列は、プライマーＴｍ予測ツールを用いてＴｍ値を確認するように手動で設計され得る。プライマーヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体および／または修飾されたヌクレオチド、例えばＬＮＡまたはＰＮＡを含み得る。

【0074】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、ＲＴ－ＰＣＲを用いて行われる。本明細書で使用される場合、用語「ＲＴ－ＰＣＲ」とは、ＲＮＡを増幅するためのプロセスである逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指す。ＲＮＡ分子は、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、次にＰＣＲを用いて、得られたｃＤＮＡを増幅する。

【0075】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて行われる。本明細書で使用される場合、用語「ＲＴ－ｑＰＣＲ」とは、逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応、ＲＴ－ＰＣＲプロセス中のｃＤＮＡの増幅が増幅された標的ＤＮＡを検出するプローブを用いてリアルタイムで定量的に検出されるＲＴ－ＰＣＲのバリアントを指す。例えば、一部の実施形態では、自己消光核酸プローブを反応混合物に添加する。自己消光核酸プローブは、標的配列に結合した場合にのみ蛍光を発する。ＰＣＲの各サイクルが完了すると、自己消光プローブは、増幅されたＤＮＡに結合し、消光せず、光励起源に曝露されて蛍光を発する。ＤＮＡが増幅されると、プローブおよび標的結合の増加は、自己消光核酸プローブの増加した蛍光をもたらす。各増幅サイクル後の蛍光プローブの検出は、増幅された標的ＤＮＡと結合し、蛍光を発する核酸プローブの量を増加させるため、増幅プロセスのリアルタイム測定を可能にする。一部の実施形態では、インターカレーティング色素プローブは、二本鎖核酸との相互作用の際に蛍光を発する反応混合物に添加される。増幅プロセス中の色素蛍光の増加は、増幅される標的ＤＮＡの量が増加するに従って色素プローブ挿入の量が増加するため、リアルタイムでのＤＮＡ増幅の測定を可能にする。

【0076】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、プローブの使用を伴う。本明細書で使用される場合、用語「プローブ」とは、試料（例えば、血液試料）中のマイクロＲＮＡの存在もしくは非存在および／または量を決定するために使用される分子または複合体を指す。特定の実施形態では、プローブは、マイクロＲＮＡまたはその相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることができる核酸部分（例えば、ＤＮＡ、修飾されたＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡ）を含む。特定の実施形態では、プローブは、マイクロＲＮＡと同一または相補的な少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続するヌクレオチドの配列を含む。特定の実施形態では、プローブは、核酸部分に共有結合的または非共有結合的にコンジュゲートされる検出可能な標識をさらに含む。例示的な検出可能な標識としては、限定されないが、フルオロフォア、小分子（例えば、アビジンファミリーの小分子）、酵素、抗体もしくは抗体断片、またはマイクロＲＮＡに連結される形態で対象中に存在しない核酸配列（例えば、バーコード配列）が挙げられる。したがって、プローブは、マイクロＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有するフルオロフォア標識された核酸であり得る。

【0077】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、正規化プローブの使用を含む。本明細書で使用される場合、用語「正規化プローブ」とは、試料（例えば、血液試料）中の正規化マイクロＲＮＡの存在もしくは非存在および／または量を決定するために使用されるプローブを指す。特定の実施形態では、正規化プローブは、正規化マイクロＲＮＡまたはその相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることができる核酸部分（例えば、ＤＮＡ、修飾されたＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡ）を含む。

【0078】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、試験プローブの使用を含む。本明細書で使用される場合、用語「試験プローブ」とは、試料（例えば、血液試料）中の試験マイクロＲＮＡの存在もしくは非存在および／または量を決定するために使用されるプローブを指す。特定の実施形態では、試験プローブは、試験マイクロＲＮＡまたはその相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることができる核酸部分（例えば、ＤＮＡ、修飾されたＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡ）を含む。

【0079】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、ＤＮＡ配列の増幅のための試薬の使用を含む。語句「ＤＮＡ配列の増幅のための試薬」には、限定されないが、（１）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；（２）デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）；（３）ＤＮＡポリメラーゼの最適な活性、結合動力学、および安定性のための適切な化学的環境を提供する緩衝液；（４）マグネシウムまたはマンガンイオンなどの二価陽イオン；および（５）カリウムイオンなどの一価陽イオンが含まれる。試薬は、溶液、濃縮溶液、または粉末の形態で提供することができる。

【0080】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、ＲＮＡ分子の逆転写のための試薬の使用を含む。語句「ＲＮＡ分子の逆転写のための試薬」は、限定されないが、逆転写酵素；ＲＮａｓｅ阻害剤；核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）にハイブリダイズするプライマー；アデノシンオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー；および逆転写酵素の最適な活性、結合動力学、および安定性のための適切な化学的環境を提供する緩衝液を包含する。試薬は、溶液、濃縮溶液、または粉末の形態で提供することができる。

【0081】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、次世代シークエンシングを用いて行われる（preform）。本明細書で使用される場合、用語「次世代シークエンシング」とは、スライドまたはビーズに付着した一本鎖核酸の短い断片のハイスループット並行配列決定、例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、ＲＯＣＨＥ（４５４シークエンシング）、またはＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ、ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲによる技術を指す。個々のヌクレオチドの一本鎖核酸への取り込みは、光学的に（取り込まれたヌクレオチドの蛍光を介して）、またはヌクレオチドの取り込み中に放出された水素イオンの検出（例えば、イオン半導体配列決定）によって検出することができる。

【0082】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、マイクロアレイ検出を用いて行われる（preform）。本明細書で使用される場合、用語「マイクロアレイ検出」とは、固体表面の別個の領域（例えば、スライド上のスポットまたはマイクロウェル中のビーズ）に付着した一本鎖核酸プローブを使用して標的核酸を検出する方法を指す。特定の核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションは、光学的検出（例えば、フルオロフォア、化学発光分子）または放射線学的検出を用いるなどの種々の方法によって検出することができる。

【0083】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの検出および定量は、非天然標識の使用を含む。本明細書で使用される場合、用語「非天然標識」は、限定されないが、生物学的分子（例えば、生体によって産生される核酸、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、脂質、一次／二次代謝物、または化学生成物）と結合する、それに付着する、またはそれと会合することが可能であり、生物学的分子と会合した場合に分子の検出を許容する１つ以上の標識分子を包含する；非天然標識は、通常、生物学的分子と関連しない。例示的な非天然標識には、限定されないが、抗原性タグ（例えば、ジゴキシゲニン）；放射性同位元素（例えば、^３２Ｐ）；化学発光または比色化学反応を触媒する酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）；核酸色素（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、ＤＡＰＩ、臭化エチジウム）；有機フルオロフォア（例えば、６－カルボキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、フルオレセイン、ローダミン、またはシアニン）；フルオロフォアクエンチャ（例えば、テトラメチルローダミン、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲＳ、またはＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ色素）；タンパク質フルオロフォア（例えば、緑色蛍光タンパク質）；蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナーおよびアクセプターフルオロフォア（例えば、フルオレセインとテトラメチルローダミン、またはＮｏｗＧＦＰとｍＯｒａｎｇｅ）；量子ドットフルオロフォア（例えば、金属カルコゲニド、コアシェル半導体ナノ結晶、または合金半導体量子ドット）；ならびに本明細書に記載される非天然標識に結合した、付着した、または会合した免疫系に基づく分子（例えば、フルオロフォアまたは触媒酵素で標識された抗体または抗体断片）が含まれる。

【0084】

診断のための統計モデル
本開示は、がんの診断および処置のための組成物および方法を提供する。例示的な実施形態では、本出願人は、高感度かつ特異的ながん（例えば、膵臓がん）の診断試験を提供している。この診断試験は、統計モデルの使用に依存する。例示的な実施形態では、表１および２のｍｉＲＮＡの１つ以上の、または様々な組み合わせは、本明細書に開示される方法を用いて定量化され、次に、診断を決定するために統計モデルを用いてさらに分析される。本明細書で使用される場合、用語「診断」とは、個体ががん（例えば、膵臓がん）などの特定の疾患を有し得ることを同定または認識することを指す。

【0085】

例示的な実施形態では、本開示の診断方法は、統計モデルを使用して行われる。本明細書で使用される場合、用語「統計モデル」とは、観察されたデータの数学的表現を指す。本明細書に開示される方法において使用される統計モデルは、当該技術分野において公知である任意の統計モデルであり得る。例示的な統計モデルは、線形判別分析、ロジスティック回帰、多変量適応回帰スプライン、ナイーブベイズ、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、決定木、Ｋ近傍法分類子、機能木、最小絶対偏差（ＬＡＤ）木、ベイジアンネットワーク、エラスティックネット回帰、およびランダムフォレストからなる群から選択される１種以上のモデルを含む。

【0086】

本明細書では、がん（例えば、膵臓がん）の診断を高めるために、個別に、およびグループまたはサブセットで用いることができるｍｉＲＮＡのグループが開示される。本明細書に開示される診断方法において有用であるｍｉＲＮＡの一例を表２に示す。表２に提示される試験ｍｉＲＮＡは、個人ががん（例えば、膵臓がん）を有する可能性を予測するためのバイオマーカーとして用いることができる。一部の実施形態では、表２における試験ｍｉＲＮＡの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種のレベルを決定し、統計モデルと比較する。例示的な実施形態では、表２における試験ｍｉＲＮＡの７種のレベルを決定し、統計モデルと比較する。例示的な実施形態では、表２からの１つ以上の試験ｍｉＲＮＡのレベルは正規化される。正規化には、試験ｍｉＲＮＡの相対的定量を決定するためのベースラインとして役立つ参照ｍｉＲＮＡの使用が伴う。例示的な実施形態では、試験ｍｉＲＮＡは表２の１つ以上のｍｉＲＮＡを含み、参照ｍｉＲＮＡは表１の１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、表１の参照ｍｉＲＮＡの１、２、３、または４種を使用し、試験ｍｉＲＮＡの正規化された量を統計モデルと比較する。例示的な実施形態では、表１の参照ｍｉＲＮＡの４種を使用し、試験ｍｉＲＮＡの正規化された量を統計モデルと比較する。

【0087】

例示的な実施形態では、本明細書では、対象における膵臓がんを診断するための方法であって、（ａ）対象から回収した試料を得るステップと、（ｂ）試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐからなる群から選択される１種以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された試験マイクロＲＮＡの量を統計モデルと比較するステップとを含み、それによって対象における膵臓がんを診断する、方法が提供され。

【0088】

例示的な実施形態では、使用される統計モデルはロジスティック回帰である。本明細書で使用される場合、用語「ロジスティック回帰」は、独立変数が二値従属変数に影響を及ぼすかどうかを決定するために使用される統計モデルである。ロジスティック回帰は、データを記載し、１つの従属二値変数と１つ以上の名目、順序、間隔または比レベルの独立変数の間の関係を説明するために使用される。

【0089】

例示的な実施形態では、使用される統計モデルはニューラルネットワークである。本明細書で使用される場合、用語「人工ニューラルネットワーク」または「ニューラルネットワーク」とは、脳の単純な数学モデルを緩やかにモデル化する、シリコでの神経単位のリンクされた集合に基づく予測モデルを指す。人工ニューラルネットワークは、その応答変数とその予測変数の間の複雑な非線形関係の同定を可能にする。人工ニューラルネットワークは、１つ以上の隠れた層を有することができ、各層は、２つ以上の変数を与えられた予測を生成するために相互作用する１つ以上のニューロンを含む。

【0090】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの量は、対象ががん（例えば、膵臓がん）を有する確率を計算するために統計モデルと比較される。例示的な実施形態では、ニューラルネットワークは、対象ががん（例えば、膵臓がん）を有する確率を計算するために使用される。本明細書では、がん（例えば、膵臓がん）を診断するための分析方法が開示され、統計モデルにおいて、対象ががん（例えば、膵臓がん）を有する確率の計算に基づいて、対象ががんを有する可能性が高いものとして割り当てられる。本明細書で使用される場合、「がんを有する可能性が高い」とは、一般集団におけるがんの統計的発生よりも、対象ががんを有する可能性が高いことを意味する。一部の実施形態では、対象ががんを有する可能性が少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％であると計算される場合、対象はがんを有する可能性が高いものとして割り当てられる。本明細書で使用される場合、「膵臓がんを有する可能性が高い」とは、一般集団における膵臓がんの統計的発生よりも、対象が膵臓がんを有する可能性が高いことを意味する。一部の実施形態では、対象が膵臓がんを有する可能性が少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％であると計算される場合、対象は膵臓がんを有する可能性が高いものとして割り当てられる。例示的な実施形態では、対象が膵臓がんを有する可能性が少なくとも約５０％であると計算される場合、対象は膵臓がんを有する可能性が高いものとして割り当てられる。

【0091】

本明細書に開示される方法は、高い精度で対象ががんを有するかどうかを対象由来の試料から決定することができる。一部の実施形態では、がんの診断の精度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。一部の実施形態では、膵臓がんの診断の精度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。例示的な実施形態では、膵臓がんの診断の精度は、少なくとも約８０％である。

【0092】

本明細書に開示される方法は、対象が高程度の特異度でがんを有するかどうかを、対象由来の試料から決定することができる。換言すれば、本開示の方法は、高程度の精度でがん対一般的な鑑別診断を検出することができる。一部の実施形態では、がんの診断の特異度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。一部の実施形態では、膵臓がんの診断の特異度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。例示的な実施形態では、膵臓がんの診断の特異度は、少なくとも８０％である。

【0093】

本明細書に開示される方法は、対象が高程度の感度でがんを有するかどうかを、対象由来の試料から決定することができる。一部の実施形態では、がんの診断の感度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。一部の実施形態では、膵臓がんの診断の感度は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。例示的な実施形態では、膵臓がんの診断の感度は、少なくとも８０％である。

【0094】

例示的な実施形態では、本明細書では、対象における膵臓がんを診断するための分析方法であって、（ａ）上記対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐからなる群から選択される１種以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、（ｂ）ニューラルネットワークにおいて、ステップａ）で定量化された１種以上のマイクロＲＮＡの量を分析して、対象が膵臓がんを有する確率を決定するステップと、（ｃ）ステップｂ）の分析に基づいて、膵臓がんを有する可能性が高いものとして対象を割り当てるステップとを含む、方法が提供される。

【0095】

がんの診断および処置
本明細書に開示される方法は、単独で、またはがんの診断および処置のための他の方法と組み合わせて使用することができる。

【0096】

本明細書に開示される方法を用いて診断することができるがんは、限定されないが、固形腫瘍、血液学的がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫）、および転移性病変を含む。一実施形態では、がんは固形腫瘍である。固形腫瘍の例としては、悪性腫瘍、例えば、肉腫および癌腫、例えば、種々の臓器系の腺がん、例えば、肺、乳房、卵巣、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、肛門、生殖器および泌尿生殖器（例えば、腎臓、尿路上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（例えば、脳、神経またはグリア細胞）、頭部および頸部、皮膚（例えば、黒色腫）、および膵臓に影響を与えるもの、ならびに、例えば、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がんまたは小細胞肺がん）、小腸がんおよび食道がんなどの悪性腫瘍を含む腺がんが挙げられる。がんは、早期、中間期、後期、または転移がんであり得る。

【0097】

例示的な実施形態では、がんは膵臓がんである。本明細書で使用される用語「膵臓がん」とは、膵臓に影響を与える悪性腫瘍のグループを指す。膵臓の腺がんは、膵臓がんの中で最も多く見られるタイプで、外分泌細胞のがん増殖から始まる。膵神経内分泌腫瘍、または内分泌細胞から始まる膵島細胞腫瘍はあまり見られない。膵外分泌がんの約９５％は腺がんであり、通常は膵管から始まる（膵臓がんについて、米国がん協会：https://www.cancer.org/cancer/pancreatic-cancer/about/what-is-pancreatic-cancer.htmlで入手可能）。まれに、膵酵素を作る細胞からがんが発生することもあり、腺房細胞癌腫として公知である。他のまれなタイプの外分泌がんには、腺扁平上皮癌腫、扁平上皮癌腫、印環細胞癌腫、未分化癌腫、および巨細胞を伴う未分化癌腫が含まれる。（同上）

【0098】

すべての膵臓がんは、原発腫瘍、リンパ節の状態、および転移性疾患の存在の評価に基づいたＴＮＭ病期分類システムに従って分類される（Ansari et al. Pancreatic Cancer: Yesterday, Today, and Tomorrow, Future Oncology 2016 Aug;12(16):1929-46）。ＴＮＭ病期分類システムでは、０期、ＩＡ期、ＩＢ期、ＩＩＡ期、ＩＩＢ期、ＩＩＩ期、およびＩＶ期の膵臓がんに分類される。０期は、原発腫瘍が上皮内癌であり、所属リンパ節転移がなく、遠隔転移がないことを示す。ＩＡ期は、原発腫瘍が膵臓に限局し、２ｃｍ未満またはそれに等しく（Ｔ１）、所属リンパ節転移がなく（Ｎ０）、遠隔転移がない（Ｍ０）ことを示す。ＩＢ期は、原発腫瘍が膵臓に限局し、２ｃｍを超え（Ｔ２）、所属リンパ節転移がなく（Ｎ０）、遠隔転移がない（Ｍ０）ことを示す。ＩＩＡ期は、原発腫瘍が膵臓を超えて進展しているが、腹腔動脈または上腸間膜動脈への浸潤がなく（Ｔ３）、所属リンパ節転移がなく（Ｎ０）、遠隔転移がない（Ｍ０）ことを示す。ＩＩＢ期は、いずれかのレベルの原発腫瘍の進行（Ｔ１～Ｔ３）、所属リンパ節転移（Ｎ１）、および遠隔転移なし（Ｍ０）を示す。ＩＩＩ期は、腹腔動脈または上腸間膜動脈に浸潤する原発腫瘍（切除不能な原発腫瘍）（Ｔ４）、いずれかのレベルのリンパ節転移（Ｎ０～Ｎ１）、および遠隔転移なし（Ｍ０）を示す。ＩＶ期は、いずれかのレベルの原発腫瘍（Ｔ０～Ｔ４）、いずれかのレベルのリンパ節転移（Ｎ０～Ｎ１）、および遠隔転移（Ｍ１）を示す。

【0099】

本明細書で使用される場合、「膵臓がんを発症するリスクがより高い」とは、遺伝学、年齢、併存疾患などを含む可能性のある因子により、一般集団より膵臓がんを発症する素因があるか、または統計学的に発症する可能性が高い対象を指す。一部の実施形態では、個体は、糖尿病を有するため、膵臓がんを発症するリスクがより高い。本明細書で使用される用語「糖尿病」とは、血糖値の上昇したレベルによって特徴付けられる慢性の代謝性疾患を指す。糖尿病は１型または２型のいずれかに分類することができる。１型糖尿病、またはインスリン依存性糖尿病は、膵臓がインスリンをほとんどか、またはまったく産生しない慢性状態である。２型糖尿病は、体がインスリンに抵抗性を示すようになったか、またはインスリンが十分に生成されなくなったときに生じる。一部の実施形態では、個体は、膵炎を有するため、膵臓がんを発症するリスクがより高い。他の実施形態では、個体は、膵臓がんまたは膵炎の家族歴のために、膵臓がんを発症するリスクがより高い。

【0100】

例示的な実施形態では、個体は、遺伝子突然変異による膵臓がんを発症するリスクがより高い。本明細書で使用される場合、「遺伝子突然変異による膵臓がんを発症するリスクが高い」とは、膵臓がんの発症を一般集団より統計学的に起こりやすくするＤＮＡ突然変異を有する個体を指す。これらの遺伝子突然変異は、がんまたは膵臓がんと特異的に相関することが当該技術分野において公知である任意の突然変異を含むことができる。突然変異が膵臓がんと関連付けられる例示的な遺伝子としては、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＴＰ５３、ＭＬＨ１、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＡＴＭが挙げられる。

【0101】

例示的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、がん診断（例えば、膵臓がん）を確認するために、より侵襲的な試験のために対象を選択するために使用される。本明細書で使用される場合、用語「より侵襲的な試験」とは、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡのレベルを検出することを超えた任意のタイプの試験を指す。一部の実施形態では、「より侵襲的な試験」は、生検または採血などのがんを検出するために対象の試料を回収および分析する試験を含むことができる。一部の実施形態では、「より侵襲的な試験」は、がんを検出するための内視鏡検査または他の探索的手法を含む。一部の実施形態では、「より侵襲的な試験」は、がんを検出するための撮像を含む。例示的な撮像技術には、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、Ｘ線、陽電子断層撮影とコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャン、超音波検査、内視鏡検査、および核スキャンが含まれる。

【0102】

例示的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象ががん（例えば、膵臓がん）を発症するかどうかをモニタリングするために、がんの調査のために対象を選択するために使用される。本明細書で使用される場合、用語「がんの調査」は、定期的に繰り返される、上述の「より侵襲的な試験」方法のいずれかの使用を含むことができる。一部の実施形態では、上記の試験は、以下の時間枠：約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４週間ごとに１回繰り返される。一部の実施形態では、上記の試験は、下の時間枠：約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４カ月ごと１回に繰り返される。

【0103】

例示的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、がん（例えば、膵臓がん）の処置のために対象を選択するために使用される。本明細書で使用される場合、用語「処置すること」または「処置」とは、対象における少なくとも１つの症状を軽減、減少、もしくは緩和すること、または疾患の進行の遅延をもたらすことを指す。例えば、処置は、障害の１つもしくは複数の症状の低減、または障害、例えば、がんの完全な根絶であり得る。本開示の意味において、用語「処置する」はまた、予防される状態、疾患もしくは障害に関連付けられるかまたはそれによって引き起こされる疾患を、停止すること、および／またはそれらが悪化するリスクを低減すること、もしくは少なくとも１つの症状を予防することを意味する。例えば、処置は、がん（例えば、膵臓がん）の少なくとも１つの症状を軽減し、減少し、または緩和し得る。

【0104】

手術は、がん（例えば、膵臓がん）に対する例示的な処置である。膵頭部に局在したがんに対する手術は、ウィップル手法（膵頭十二指腸切除術）と呼ばれる。膵切除術と呼ばれる手術は、膵臓の左側を切除するために行うことができる。膵臓がんに対する別の処置は、膵全摘術と呼ばれる膵臓全体を摘出する手術である。

【0105】

化学療法は、がん（例えば、膵臓がん）に対する例示的な処置である。がん（例えば、膵臓がん）を処置するために、種々の例示的な化学療法剤を使用することができる。タキサンはまた、膵臓がんを処置するために使用することができ、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Taxotere（登録商標））、およびアルブミン結合パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））がある。代謝拮抗薬は、膵臓がんを処置するために使用することができ、例えば、ゲムシタビン塩酸塩（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）またはＩｎｆｕｇｅｍ（登録商標））、５－フルオロウラシル（５－ＦＵまたはＡｄｒｕｃｉｌ（登録商標））、またはカペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））が含まれる。白金化学療法は、膵臓がんを処置するために使用することができ、例えば、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））が含まれる。アルキル化剤は、膵臓がんを処置するために使用することができ、例えば、シスプラチン（ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））が含まれる。ＤＮＡ複製を阻害する薬剤はまた、膵臓がんを処置するために使用することができ、例えば、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））およびリポソーム性イリノテカン（Ｏｎｉｖｙｄｅ（登録商標））が含まれる。ＰＡＲＰ阻害剤はまた、膵臓がんを処置するために使用することができ、例えば、オラパリブ（Ｌｙｎｐａｒｚａ（登録商標））が含まれる。抗腫瘍性化学療法薬はまた、膵臓がんを処置するために使用することができ、例えば、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標））、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））、マイトマイシンが含まれる。

【0106】

薬物併用は、がん（例えば、膵臓がん）に対する例示的な処置である。例示的な薬物併用は、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン塩酸塩、およびオキサリプラチン）である。さらなる例示的な薬物併用は、ＧＥＭＣＩＴＡＢＩＮＥ－ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ（ゲムシタビン塩酸塩およびシスプラチン）である。別の例示的な薬物併用は、ＧＥＭＣＩＴＡＢＩＮＥ－ＯＸＡＬＩＰＬＡＴＩＮ（ゲムシタビン塩酸塩およびオキサリプラチン）である。さらに別の例示的な薬物併用は、ＯＦＦ（オキサリプラチン、フルオロウラシル、およびフォリン酸）である。

【0107】

放射線療法は、がん（例えば、膵臓がん）に対する例示的な処置である。放射線療法では、Ｘ線または陽子などの高エネルギービームを利用してがん細胞を破壊する。使用される放射線療法は、外部ビーム放射線であり得、放射線の外部ビームは機械から生じ、放射線を患者のがんに向ける。あるいは、内照射療法では、固体または液体などの放射線源を患者の体内に注入する。化学療法および放射線を併用することができ、これを化学放射線療法と呼ぶ。

【0108】

免疫療法は、がん（例えば、膵臓がん）に対する例示的な処置である。ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））などの免疫調節剤は、膵臓がんの処置を処置するために使用することができる免疫療法の一種である。

【0109】

例示的な実施形態では、本明細書では、膵臓がんを有することが疑われる対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から回収した試料を得るステップと、（ｂ）試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐからなる群から選択される１種以上の試験マイクロＲＮＡを検出および定量化するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された試験マイクロＲＮＡの量を統計モデルと比較するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の比較に基づいて膵臓がんのより侵襲的な試験および／または調査のために対象を選択し、場合により、膵臓がんの対象に処置を施すステップとを含む、方法が提供される。

【0110】

一部の実施形態では、処置は、本明細書に記載される種々の処置方法の組み合わせである。例示的な処置方法は、化学療法と免疫療法の組み合わせである。別の例示的な処置方法は、化学療法と放射線の組み合わせである。さらに別の例示的な処置方法は、免疫療法と放射線の組み合わせである。さらなる例示的な処置方法は、手術と組み合わせて本明細書に開示される処置方法（例えば、手術と化学療法、手術と免疫療法、手術と放射線など）のいずれかの使用を含む。

【0111】

キット
キットはまた、本明細書に開示される診断方法および処置方法を行うために提供される。キットは、場合により、キットの様々な成分の使用方法に関する説明書をさらに含み得る。

【0112】

例示的な実施形態では、キットは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ、またはそのｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの試験プローブを含む。

【0113】

本発明のキットは、バイアル、試験管、アンプル、ボトルなどの１つ以上の容器を密閉して収容するように区画化された担体を含み得る。このような容器の各々は、本明細書に記載される成分または成分の混合物（プライマー、試験プローブ、正規化プローブ、非天然標識（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）、およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）などの蛍光標識）を有する試験または正規化プローブ、蛍光色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン）、溶媒または緩衝液、ＤＮＡ配列の増幅のための試薬、ＲＮＡ分子の逆転写のための試薬など）を含む。一般的に、キットはまた、１つ以上の緩衝液、対照試料などを含有し得る。

【0114】

特定の実施形態では、キットは、本明細書に開示される試験プローブを含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、試験プローブは、検出可能な標識を含有する。一部の実施形態では、キットは、正規化プローブを含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、正規化プローブは、検出可能な標識を含有する。

【0115】

例示的な実施形態では、キットは、ｍｉＲＮＡ分子の逆転写のための試薬を含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、逆転写酵素を含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、オリゴ－ｄＴプライマーを含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、ｄＮＴＰを含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、ＲＮａｓｅ阻害剤を含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、ＲＮＡにハイブリダイズするプライマーを含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、逆転写酵素のための適切な化学的環境を提供する緩衝溶液を含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子の逆転写のためのすべての試薬は、単一の容器内に含有される。

【0116】

例示的な実施形態では、キットは、ｑＰＣＲのための試薬を含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡポリメラーゼを含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡ結合色素を含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、非天然標識を含有するプローブを含有する１つ以上の容器を含む。一部の実施形態では、キットは、ｄＮＴＰを含有する１つ以上の容器を含む。

【0117】

当業者には、本明細書に記載される方法の他の適切な修飾および適応が、本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、適切な同等物を使用してなされ得ることが容易に明らかになる。ここで、特定の実施形態を詳細に記載したが、以下の実施例を参照することによってより明確に理解され、これらは例示の目的のためにのみ含まれ、限定することを意図するものではない。

【0118】

本明細書で使用される場合、用語「含むこと（comprising）」、「含むこと（including）」、「有すること（having）」、およびそれらの文法的変形は、記載された特徴、整数、ステップまたは成分を特定するものとしてとられるが、１つ以上の追加の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらのグループの追加を排除するものではない。これらの用語は、「からなること」および「から本質的になること」という用語を包含する。

【実施例】

【0119】

[実施例１]
ヒト血清から診断的循環ｍｉＲＮＡシグネチャを生成するニューラルネットワーク
要約：この実施例は、ｍｉＲＮＡ発現に依存する膵臓がん検出のための診断試験の開発、および人工ニューラルネットワークを通して疾患の確率を計算する高度なＡＩに基づくアルゴリズムを記述する。本方法は、ｍｉＲＮＡ配列決定または定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて測定することができる１０種のｍｉＲＮＡのセットを含む。両方法について、ｍｉＲＮＡ発現データの入力を使用し、使用者に膵臓がんを有する患者に由来する試料の確率を提供する適切に重み付けされたアルゴリズムが調製された。このモデルは、ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑを用いてボストンおよびポーランドの１８２個の試料から開発され、再試験されたポーランドの試料およびポーランドの追加の１５０個の試料について検証された。健常な患者と、膵臓がんの最も一般的な鑑別診断である膵炎を有する患者由来の試料を使用して、試験性能を評価した。両方の場合において、試料は分類モデルをトレーニングするために使用されるセットに無作為に分割され、試料の２０％はモデルの性能を評価するための独立した検証セットとして保持された。ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑに基づく試験の結果は、約７１％の感度と約９１％の特異度を示した。ｑＰＣＲに基づくニューラルネットワークは、約７６％の感度と約９２％の特異度でこの性能をわずかに改善した。これらの診断値は、糖尿病と診断された患者など、膵臓がんのリスクが高い患者の反復試験に適したものにする。

【0120】

ヒト血清から診断的循環ｍｉＲＮＡシグネチャを生成するために、２つの独立したコホートからの１８２人の患者を有する処置前対象の研究集団を集めた。図１に示されるように、１つのコホートはＤａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＤＦＣＩ）で米国にあり、２番目のコホートはロッツ医科大学でポーランドにあった。ＤＦＣＩコホートの患者は進行期膵臓がん（ｎ＝３０）であり、年齢および性別を３０人の健常対照者と合致させた。ポーランドの患者は膵臓がん（ｎ＝４４：早期８、進行２７、不明９）、膵炎（ｎ＝２８）、または臨床的に健康であった（ｎ＝５０）。小配列決定（ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用して、卵巣がん（Elias et al. Diagnostic Potential for a Serum miRNA Neural Network for Detection of Ovarian Cancer, Elife. 2017;6:e28932. 2017年10月31日公開．doi:10.7554/eLife.28932）または放射線暴露（Fendler et al. Evolutionarily conserved serum microRNAs predict radiation-induced fatality in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2017;9(379):eaal2408. doi:10.1126/scitranslmed.aal2408）において、先に記載されるすべての公知のおよび予測されるｍｉＲＮＡを検出した。図１に示されるように、その後、患者を以下の３群に無作為に割り当てた：１）変数選択およびモデル開発のためのトレーニングセット、２）分類モデルの診断カットオフの較正のための試験セット、および３）新しいデータ上の診断モデルの性能試験のための検証セット。次に、機械学習アプローチを含む一連の統計ツールを展開して、ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑデータを分析し、膵臓がん患者と膵炎患者および健常対照者を識別するための最良の性能を有するアルゴリズムを作製した。ｍｉＲＮＡの最終セットが確立され、モデル較正が行われると、検証サブグループについてそれらを分析した。利用可能な試料数は限られているにもかかわらず、ニューラルネットワーク分析の性能は８５％の精度を超えた。注目すべきことに、早期がんと進行がんの両方が、ニューラルネットワークアプローチを用いて同様の性能で同定された。

【0121】

表１に示される４種の参照ｍｉＲＮＡをｑＰＣＲ検証の目的で同定した。

【0122】

【表3】

【0123】

表２に示される１０種のｍｉＲＮＡを選択し、膵臓がん診断のためのｍｉＲＮＡシグネチャにおいて使用した。

【0124】

【表4】

【0125】

図２Ａ－Ｂは、上述したトレーニングセットの変数選択プロセスを示す。１０種のｍｉＲＮＡを、ファミリーワイズエラー率（ＦＷＥＲ）ｐ値＜０．０５（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整されたｐ値を有する）を有するものとして選択した。ボルカノプロットおよび結果の表は、これら１０種のｍｉＲＮＡについて、３種が上方制御され、７種が下方制御されたことを示す。

【0126】

１０種のｍｉＲＮＡを用いて、２つの主要な方法ロジスティック回帰（分析におけるｍｉＲＮＡ数を減少させるための後退段階的変数選択を伴う）および人工ニューラルネットワーク（分析におけるｍｉＲＮＡ数を減少させるために使用される感度分析を伴う）を用いた分類モデルを開発した。

【0127】

ロジスティック回帰分析の結果は、図３Ａ－Ｂに示される。図３Ａは、試験されたモデルｍｉＲＮＡモデルについての特異度対感度のプロットを示す。図３Ｂは、最終モデルで使用された４種のｍｉＲＮＡの計算値を示す。結果は、５０％のカットオフ値を有するファミリーワイズエラー率（ＦＷＥＲ）に基づくログを用いて計算された。これらの結果は、モデルがＨｏｓｍｅｒ Ｌｅｍｅｓｈｏｗ値＝４．４９２７およびｐ値＝０．８１０１６１でトレーニングおよび試験セットに非常によく適合することを示した。図３Ｃは、試料対対照におけるがんの検出での感度および特異度を示す。４種のｍｉＲＮＡの最終ロジスティック回帰モデルは、７９．３％の感度と８４．１％の特異度を示した。

【0128】

人工ニューラルネットワークの結果は、図４Ａ－Ｂに示されている。図４Ａは、試験されたモデルｍｉＲＮＡモデルについての特異度対感度のプロットを示す。人工ニューラルネットワークは、以下の８種のｍｉＲＮＡを必要とする：ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ。図４Ｂは、試料対対照におけるがんの検出での感度および特異度を示す。最終人工ニューラルネットワークは、７１．４％の感度と９０．９％の特異度を示した。

【0129】

次に、図１に示されるように、診断モデルのｑＰＣＲ検証を完了した。分類モデルの結果を、ｑＰＣＲを用いて再現した。ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑに使用されたポーランドの試料および下記の表３に示される追加の１５０個の試料において、１０種のｍｉＲＮＡおよび４種の参照ｍｉＲＮＡのセットを定量化した。表２に示される１０種のｍｉＲＮＡを、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正後に有意に異なって発現するように選択したカスタムメイドのアレイを用いて、ＱＰＣＲに基づく検証を行った。次に、表１に示される４種のｍｉＲＮＡを、正規化因子として、ｎｏｒｍｉＲａｚｏｒツール（Grabia et al. NormiRazor: Tool Applying GPU-Accelerated Computing for Determination of Internal References in MicroRNA Transcription Studies. BMC Bioinformatics 21, 425 (2020). https://doi.org/10.1186/s12859-020-03743-8）を用いて選択した。

【0130】

【表5】

【0131】

ｑＰＣＲ分析には、サイクル閾値（Ｃｔ）の前処理が含まれた。元のＣｔ値のための３つの前処理ステップは、１）バックグラウンドフィルタリング（ブランク試料において測定されたＣｔ値を超える値は非検出として処理された）、２）期待最大化（ＥＭ）アルゴリズムを用いた非検出の補完、および３）Ｃｔ値の重複除去（２つの測定値からの平均Ｃｔ値が得られた）を含んだ。最後に、正規化（ｄＣｔ計算）を、以下の式を用いて行った：Ｃｑ＝上位３種の正規化因子（ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ）の平均。

【0132】

次に、３つの異なる技術を使用して最終診断モデルを設計した。これらの技術には、ロジスティック回帰（後退段階的変数選択を伴う）、生データセット上の人工ニューラルネットワーク、およびデータセットを均衡させるための合成少数オーバーサンプリング技術（ＳＭＯＴＥ）を用いた人工ニューラルネットワークが含まれた。この分析では、ｍｉＲＮＡががんを対照から区別することができることが決定されており、最良の可能な分類ツールを作製する目的に沿って、最終モデルの性能を改善するために年齢および性別データを含む臨床データも使用された。データは、人工ニューラルネットワークの構築におけるオーバーフィッティングを評価するためにトレーニング／試験セットと、偏りのない方法でモデル性能を評価するための検証セットにさらに分割される。最後に、ＳＭＯＴＥオーバーサンプリング技術を用いて、設定の均衡をとり、分類モデルの性能を向上させた。

【0133】

図５Ａに示されるように、ポーランド試料の２セットのデータセットは、モデリングのために分割された。予測モデルの開発のために、データセットをトレーニンググループ、試験グループ、および検証グループに分割した。図５Ｂに示されるように、不均衡問題を打ち消すために、トレーニングセットのためのＳＭＯＴＥ技術を用いて均衡型データセットが作成されたが、試験および検証データセットは同じままであった。

【0134】

図６Ａ－Ｂに示されるように、２種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐおよびｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ）モデルのロジスティック回帰を用いて、試験と検証データセットの両方の性能を評価した。図６Ｂは、このモデルが、観察されたがんを有する試料対対照におけるがんの予測において、６６％の感度率および７４％の特異度率を有することを示す。

【0135】

図７Ａ－Ｂに示されるように、古典的（非ＳＭＯＴＥ修飾された）データのニューラルネットワークモデルを、年齢および性別を含む臨床データ、ならびに全１０種のｍｉＲＮＡを用いて試験した。以下のｍｉＲＮＡは、正規化のために使用された：ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ。このニューラルネットワークモデルの結果を図７Ａ－Ｂに示す。図７Ａは、トレーニングセットのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）が０．８４７５であることを示す。図７Ｂは、トレーニングデータセットおよび試験データセットについて、８２．５７％の精度、５９．７２％の感度、および９３．８４％の特異度の値を提供する。図７Ｂは、検証データセットについて、精度について８３．０２％、感度について６４．７１％、および特異度について９１．６７％の値を提供する。

【0136】

図８Ａ－Ｂに示されるように、ＳＭＯＴＥ均衡型データセット上のニューラルネットワークモデルを、臨床データセット、ならびにｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐを含むトリミングされたｍｉＲＮＡセットを用いて試験した。以下のｍｉＲＮＡは、正規化のために使用された：ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ。図８Ａは、データセットのＡＵＣが０．８９７１であることを示す。図８Ｂは、トレーニングおよび試験データセットについて、８４．８６％の精度、７９．１７％の感度、および８７．６７％の特異度の値を提供する。図８Ｂは、検証データセットについて、８６．７９％の精度、７６．４７％の感度、および９１．６７％の特異度の値を提供する。

【0137】

これらの結果は、同定されたｍｉＲＮＡセットを用いて膵臓がんを有する患者を同定し、選択ツールに依存して感度７６～８２％、および特異度８３～９１％で健常対照または膵炎患者と区別できることを示す。人工ネットワークは、膵臓がんの先験的リスクおよび医師がスクリーニング検査または確認試験としてｍｉＲＮＡに基づく試験を使用することを好むかどうかに応じて、併用または別々に使用することができる。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【国際調査報告】