特表 2024-527392 タンパク質産生を最適化する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-24

(54)【発明の名称】タンパク質産生を最適化する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240717BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240717BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240717BHJP

   C07K 2/00 20060101ALI20240717BHJP

   G16B 30/00 20190101ALI20240717BHJP

   C12N 15/70 20060101ALN20240717BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z

C12N15/113 Z

C12N1/21

C07K2/00

G16B30/00

C12N15/70 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024501657

(86)(22)【出願日】2022-07-14

(85)【翻訳文提出日】2024-03-04

(86)【国際出願番号】 EP2022069744

(87)【国際公開番号】W WO2023285596

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】2110137.3

(32)【優先日】2021-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518160355

【氏名又は名称】ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーション

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】ダンケルマン ダニエル エル．

(72)【発明者】

【氏名】オーム セバスチャン ビー．

(72)【発明者】

【氏名】ビーティー アダム ティー．

(72)【発明者】

【氏名】チン ジェイソン ダブリュー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、タンパク質産生を最適化する新規の方法に関する。これらの方法は、直交性ｍＲＮＡを最適化する方法、外因性ｔＲＮＡを含む最適なオペロンを設計及び産生する方法、並びに外因性遺伝子、例えば直交性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ－ａａＲＳ）をコードする外因性遺伝子を含む最適なオペロンを設計及び産生する方法を含む。本発明はまた、前記方法の産物に関する。本発明の部分として提供されるのはまた、これらの革新技術の産物を含む宿主細胞、前記細胞を使用する方法、及びその産物である。本発明の宿主細胞は、遺伝学的に組み込まれた非標準アミノ酸を含むタンパク質及びポリペプチドの産生の向上のために使用されてもよい。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

直交性リボソーム（Ｏ－リボソーム）による翻訳に好適な直交性メッセンジャーＲＮＡ（Ｏ－ｍＲＮＡ）であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を設計する方法であって、前記ｍＲＮＡが５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、前記方法が、
（ａ）前記ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態と前記ｍＲＮＡの前記Ｏ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）前記５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に前記改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って前記改変を許容又は拒絶するステップ；及び
（ｅ）前記許容された改変を含む前記５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ；
を含む、前記方法。

【請求項2】

ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、前記ｍＲＮＡがＯ－リボソームに結合して、Ｏ－リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{ｏ－ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

Ｏ－リボソームが直交性１６Ｓ ｒＲＮＡを含み、ｍＲＮＡがシャインダルガルノ配列を含み、ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－Ｏ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
に従って予測され；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－Ｏ－ｒＲＮＡ}が、前記直交性１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及び前記ｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}が、ＯＲＦの開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}が、前記シャインダルガルノ配列と前記開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}が、前記シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}が、前記ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである；
請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布が、

【数1】

であり、Ｔ_ＳＡがシミュレートされたアニーリング温度である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

Ｔ_ＳＡが、５～２０％の許容率を維持するように調整される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

第２のリボソーム（２^ｎｄ－リボソーム）も含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計するための、請求項１～６のいずれかに記載の方法であって、
ステップ（ａ）が、前記ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態と前記ｍＲＮＡの前記２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測することを含み；
ステップ（ｃ）が、改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測することを含み；
ステップ（ｄ）が、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負であり、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に前記改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って前記改変を許容又は拒絶することを含む；
前記方法。

【請求項8】

第２のリボソーム（２^ｎｄ－リボソーム）も含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、前記ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、前記方法が、
（ａ）前記ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態と前記Ｏ－ｍＲＮＡの前記Ｏ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、前記ｍＲＮＡの前記自由にフォールディングした状態と前記ｍＲＮＡの前記２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）前記５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負であり、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に前記改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って前記改変を許容又は拒絶するステップ；及び
（ｅ）前記許容された改変を含む前記５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ；
を含む、前記方法。

【請求項9】

ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、前記ｍＲＮＡが２^ｎｄ－リボソームに結合して、２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{２ｎｄ ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和である、請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

２^ｎｄ－リボソームが１６Ｓ ｒＲＮＡを含み、ｍＲＮＡがシャインダルガルノ配列を含み、ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－２ｎｄ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
に従って予測され；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－２ｎｄ－ｒＲＮＡ}が、前記１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及び前記ｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}が、ＯＲＦの開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}が、前記シャインダルガルノ配列と前記開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}が、前記シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}が、前記ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである；
請求項９に記載の方法。

【請求項11】

ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正であるか、又はΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が、先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、請求項７～１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

ステップ（ａ）が、式：
ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）
に従ってΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）を算出することを含み；
ステップ（ｃ）が、式：
ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）
に従ってΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）を算出することを含み；
ステップ（ｄ）が、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に確率分布に従って前記改変を許容又は拒絶すること
を含み；
Ｘが０．１～２であるか、又はＸが０．５である；
請求項７～１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布が、

【数2】

であり、Ｔ_ＳＡがシミュレートされたアニーリング温度である、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

Ｔ_ＳＡが、５～２０％の許容率を維持するように調整される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

改変が、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

ステップ（ｂ）が、５’ＵＴＲ中に改変を導入すること、又はＯＲＦ内のコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換することを含み；
ステップ（ｅ）が、許容された改変を含む前記５’ＵＴＲ及び前記ＯＲＦを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成することを含む；
請求項１～１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

ステップ（ｂ）が、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失を含む改変を５’ＵＴＲ中に導入すること、又はＯＲＦ内のコドン２～１２のいずれか１つを同義コドンと交換することを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ステップ（ｂ）～（ｄ）が、少なくとも２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、又は１００００回反復される、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。

【請求項20】

ステップ（ｂ）～（ｄ）が、少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復される、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。

【請求項21】

ステップ（ｂ）～（ｄ）が、少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）又はより正のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復される、請求項７～１８のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

ステップ（ｂ）～（ｄ）が、少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）につながらなくなるまで反復される、請求項１２～１８のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

ステップ（ａ）の５’ＵＴＲが、３５ヌクレオチド長であるか；又は改変が、開始コドンに最も近接した５’ＵＴＲの３５ヌクレオチドのいずれかにある；
請求項１～２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

ステップ（ａ）の５’ＵＴＲが、ランダムに生成された核酸の配列によるものである、請求項１～２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

ステップ（ａ）の５’ＵＴＲが、野生型シャインダルガルノ配列を含む、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

Ｏ－リボソームが、直交性アンチシャインダルガルノ配列を含み、ステップ（ａ）の５’ＵＴＲが、前記直交性アンチシャインダルガルノ配列に完全に相補的であることが予測される直交性シャインダルガルノ配列（Ｏ－ＳＤ）を含む、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

ステップ（ｂ）が、Ｏ－ＳＤの５ヌクレオチドコア中に改変を導入することを含まない、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

シャインダルガルノ配列が、ＯＲＦの開始コドンからの５ヌクレオチドである、請求項２５～２７のいずれかに記載の方法。

【請求項29】

２^ｎｄリボソームが野生型リボソームである、請求項１～２８のいずれかに記載の方法。

【請求項30】

２^ｎｄリボソームが、第１のＯ－リボソームとは異なるＯ－リボソームである、請求項１～２８のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

コンピューター上で実行される、請求項１～３０のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

Ｏ－リボソームによる翻訳のための外因性タンパク質をコードする核酸配列を産生する方法であって、Ｏ－ｍＲＮＡの配列が、請求項１～３１のいずれかに記載の方法に従って設計され、次に、前記配列をコードする核酸分子が産生される、前記方法。

【請求項33】

直交性リボソーム（Ｏ－リボソーム）による翻訳のための直交性メッセンジャーＲＮＡ（Ｏ－ｍＲＮＡ）を設計するためのシステムであって、
プロセッサー；及び
請求項１～３１のいずれかに記載の方法を実施するための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体；
を含む、前記システム。

【請求項34】

コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、前記コンピューターシステムが請求項１～３１のいずれかに記載の方法を実行させるプログラムコードを記憶する非一時的な機械可読媒体を含む、コンピュータープログラム製品。

【請求項35】

内因性ｔＲＮＡをコードする内因性ゲノムを含む宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法であって、
（ｉ）前記少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの配置の並べ替えを生成するステップ；
（ii）前記内因性ゲノム内で、前記少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの各々の並べ替え内の外因性ｔＲＮＡの各々の隣接するペアに対して最も高いレベルの配列同一性を有する内因性ｔＲＮＡの隣接するペアを同定するステップ；
（iii）内因性ｔＲＮＡの前記同定された隣接するペアの各々の間の前記内因性ゲノム中の遺伝子間領域を同定するステップ；
（iv）前記少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの各々の並べ替えをコードし、前記外因性ｔＲＮＡの各々の関連付けられた隣接するペアの間に位置付けられる前記同定された遺伝子間領域を含む複数の配列を生成するステップ；及び
（ｖ）前記少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードする前記オペロン中に含めるための前記複数の配列からの配列を選択するステップ；
を含む、前記方法。

【請求項36】

ステップ（ｖ）の選択が、複数の配列の順位付けされたリストから行われ、前記順位付けされたリストが、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡと、遺伝子間領域を定義するために使用された対応する内因性ｔＲＮＡとの間の配列同一性の和に基づいて前記複数の配列の各々を順位付けすることにより作出される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

ステップ（ii）の配列同一性が、内因性ｔＲＮＡのアクセプターステム配列を外因性ｔＲＮＡのアクセプターステム配列と比較することにより算出される、請求項３５又は３６に記載の方法。

【請求項38】

ｔＲＮＡの最初の７ヌクレオチドと、ＣＣＡ末端を含まない最後の８ヌクレオチドとが比較される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

考慮される最小遺伝子間領域が、５、１０、１５、２０、又は２５塩基対であり、最大遺伝子間領域が、５０、７５、１００、１２５、又は１５０塩基対である、請求項３５～３８のいずれかに記載の方法。

【請求項40】

考慮される最小遺伝子間領域が１０塩基対であり、最大遺伝子間領域が１００塩基対である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計するための方法である、請求項３５～４０のいずれかに記載の方法。

【請求項42】

コンピューター上で実行される、請求項３５～４１のいずれかに記載の方法。

【請求項43】

少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡを含むオペロンをコードする核酸配列を産生する方法であって、前記核酸の前記配列が、請求項３５～４２のいずれかに記載の方法に従って設計され、次に、前記配列をコードする核酸が産生される、前記方法。

【請求項44】

少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡを含むオペロンを設計するためのシステムであって、
プロセッサー；及び
請求項３５～４２のいずれかに記載の方法を実施するための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体；
を含む、前記システム。

【請求項45】

コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、前記コンピューターシステムが請求項３５～４２のいずれかに記載の方法を実行させるプログラムコードを記憶する非一時的な機械可読媒体を含む、コンピュータープログラム製品。

【請求項46】

請求項４３に記載の方法により得られた又は得ることができるオペロンを含む、核酸。

【請求項47】

内因性ゲノムを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡを含むオペロンをコードする核酸を含み、外因性ｔＲＮＡの各々のペアの間の核酸配列が、内因性ゲノムに由来する遺伝子間配列である、前記宿主細胞。

【請求項48】

オペロンが、請求項４３に記載の方法により得られた又は得ることができる、請求項４７に記載の宿主細胞。

【請求項49】

宿主細胞が原核細胞である、請求項３５～４３のいずれかに記載の方法又は請求項４７若しくは４８に記載の宿主細胞。

【請求項50】

原核細胞が細菌細胞である、請求項４９に記載の方法又は宿主細胞。

【請求項51】

細菌細胞が大腸菌であり、内因性ゲノムが大腸菌ゲノムである、請求項５０に記載の方法又は宿主細胞。

【請求項52】

宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法であって、
（ｉ）前記少なくとも２つの外因性ＯＲＦの各々のための複数の５’ＵＴＲ配列を生成するステップであって、各々の５’ＵＴＲ配列が、前記５’ＵＴＲ配列及び前記外因性ＯＲＦを含むｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態と、前記ｍＲＮＡのリボソームに結合した開始適格状態との間の負の予測される自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ））について最適化されている、ステップ；
（ii）前記５’ＵＴＲが最適化された前記外因性ＯＲＦに対して５’に位置付けられ、前記少なくとも２つの外因性ＯＲＦの残りの各々の外因性ＯＲＦに対して３’に位置付けられた場合の前記５’ＵＴＲ配列の各々についてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を予測するステップ；並びに
（iii）前記５’ＵＴＲ配列及び前記少なくとも２つの外因性ＯＲＦの配置を選択するステップ；
を含む、前記方法。

【請求項53】

ステップ（iii）が、５’ＵＴＲ配列及び少なくとも２つの外因性ＯＲＦの配置を選択することを含む、請求項５２に記載の方法であって、
すべての５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアについてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）の和が最も負であり；及び／又は
すべての５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアについての前記ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）の平均値が最も負であり；及び／又は
各々の５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアが、標的ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも負のΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を有する；
前記方法。

【請求項54】

ステップ（ｉ）が、少なくとも２つの外因性ＯＲＦの各々のための２、３、４、５、又は６以上の５’ＵＴＲ配列を生成することを含む、請求項５２又は５３に記載の方法。

【請求項55】

少なくとも２つの外因性ＯＲＦの少なくとも１つ又はすべてがアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼである、請求項５２～５４のいずれかに記載の方法。

【請求項56】

少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの外因性ＯＲＦをコードするオペロンを設計するための方法である、請求項５２～５５のいずれかに記載の方法。

【請求項57】

ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）が、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、前記ｍＲＮＡがリボソームに結合して、前記リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和である、請求項５２～５６のいずれかに記載の方法。

【請求項58】

５’ＵＴＲがシャインダルガルノ配列を含み、ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）が、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
に従って予測され；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}が、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及びｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}が、外因性ＯＲＦをコードする配列の開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}が、前記シャインダルガルノ配列と前記外因性ＯＲＦをコードする前記配列の前記開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}が、前記シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}が、前記ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである；
請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

ステップ（ｉ）が、
（ａ）５’ＵＴＲ中に改変を導入すること；
（ｂ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ））を予測すること；
（ｃ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が、先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも負である場合に前記改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が、前記先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って前記改変を許容又は拒絶すること；及び
（ｄ）前記許容された改変を含む５’ＵＴＲ配列を生成すること；
を含む、請求項５２～５８のいずれかに記載の方法。

【請求項60】

ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）、が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも正である場合、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布が、

【数3】

であり、Ｔ_ＳＡがシミュレートされたアニーリング温度である、請求項５９又は６０に記載の方法。

【請求項62】

Ｔ_ＳＡが、５～２０％の許容率を維持するように調整される、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

改変が、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む、請求項５９～６２のいずれかに記載の方法。

【請求項64】

ステップ（ａ）が、５’ＵＴＲ中に改変を導入すること、又は外因性ＯＲＦをコードする配列内でコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換することを含み；
ステップ（ｄ）が、許容された改変を含む前記５’ＵＴＲ及び前記ＯＲＦを含む配列を生成することを含む；
請求項５９～６３のいずれかに記載の方法。

【請求項65】

ステップ（ａ）が、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失を含む改変を５’ＵＴＲ中に導入すること、又はＯＲＦ内のコドン２～１２のいずれか１つを同義コドンと交換することを含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

ステップ（ａ）～（ｃ）が、少なくとも２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、又は１００００回反復される、請求項５９～６５のいずれかに記載の方法。

【請求項67】

ステップ（ａ）～（ｃ）が、少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復される、請求項５９～６５のいずれかに記載の方法。

【請求項68】

コンピューター上で実行される、請求項５２～６７のいずれかに記載の方法。

【請求項69】

少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むポリシストロン性オペロンをコードする核酸配列を産生する方法であって、前記核酸の前記配列が、請求項５２～６８のいずれかに記載の方法に従って設計され、次に、前記配列に従って核酸が産生される、前記方法。

【請求項70】

少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むポリシストロン性オペロンを設計するためのシステムであって、
プロセッサー；及び
請求項５２～６８のいずれかに記載の方法を実施するための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体；
を含む、前記システム。

【請求項71】

コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、前記コンピューターシステムが請求項５２～６８のいずれかに記載の方法を実行させるプログラムコードを記憶する非一時的な機械可読媒体を含む、コンピュータープログラム製品。

【請求項72】

請求項６９に記載の方法により得られた又は得ることができるオペロンを含む、核酸。

【請求項73】

請求項６９に記載の方法により得られた又は得ることができるオペロンをコードする核酸を含む、宿主細胞。

【請求項74】

宿主細胞が原核細胞である、請求項５２～６９のいずれかに記載の方法又は請求項７３に記載の宿主細胞。

【請求項75】

原核細胞が細菌細胞である、請求項７４に記載の方法又は宿主細胞。

【請求項76】

細菌細胞が大腸菌であり、内因性ゲノムが大腸菌ゲノムである、請求項７５に記載の方法又は宿主細胞。

【請求項77】

外因性タンパク質をコードするＯ－ｍＲＮＡをコードする核酸配列であって、前記Ｏ－ｍＲＮＡが、請求項３２に記載の方法により得られた又は得ることができるものであり、前記Ｏ－ｍＲＮＡが少なくとも２つのタイプの直交性コドンを含む、核酸配列；
少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡをコードするＯ－ｔＲＮＡオペロンを含む核酸配列であって、前記少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡが、前記少なくとも２つのタイプの直交性コドンをデコードする能力を有し、前記オペロンが、請求項４３に記載の方法により得られた又は得ることができる、核酸配列；
少なくとも２つのＯ－ａａＲＳをコードする直交性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ－ａａＲＳ）を含む核酸配列であって、前記少なくとも２つのＯ－ａａＲＳが、前記少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡとＯ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを形成し、前記オペロンが、請求項６９に記載の方法により得られた又は得ることができる、核酸配列；及び
直交性リボソーム；
を含む、宿主細胞。

【請求項78】

Ｏ－ｍＲＮＡが少なくとも３つのタイプの直交性コドンを含み；
Ｏ－ｔＲＮＡオペロンが、前記少なくとも３つの直交性コドンをデコードする能力を有する少なくとも３つの直交性ｔＲＮＡをコードし；
Ｏ－ａａＲＳオペロンが、前記少なくとも３つの直交性ｔＲＮＡとＯ－ａａＲＳ－Ｏ－ｔＲＮＡペアを形成する少なくとも３つのＯ－ａａＲＳをコードする；
請求項７７に記載の宿主細胞。

【請求項79】

Ｏ－ｍＲＮＡが少なくとも４つのタイプの直交性コドンを含み；
Ｏ－ｔＲＮＡオペロンが、前記少なくとも４つの直交性コドンをデコードする能力を有する少なくとも４つの直交性ｔＲＮＡをコードし；
Ｏ－ａａＲＳオペロンが、前記少なくとも４つの直交性ｔＲＮＡとＯ－ａａＲＳ－Ｏ－ｔＲＮＡペアを形成する少なくとも４つのＯ－ａａＲＳをコードする；
請求項７７に記載の宿主細胞。

【請求項80】

原核細胞である、請求項７７～７９のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項81】

原核細胞が細菌細胞である、請求項８０に記載の宿主細胞。

【請求項82】

細菌細胞が大腸菌である、請求項８１に記載の宿主細胞。

【請求項83】

ポリペプチドを産生する方法であって、
請求項７７～８２のいずれかに記載の宿主細胞を用意するステップ；
第１の非標準アミノ酸の存在下で前記宿主細胞をインキュベートするステップであって、前記第１の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；及び
前記宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを介する前記ポリペプチド中への前記第１の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ；
を含む、前記方法。

【請求項84】

第２の非標準アミノ酸の存在下で宿主細胞をインキュベートするステップであって、前記第２の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；及び
前記宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ－Ｏ－ｔＲＮＡペアを介するポリペプチド中への前記第２の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ；
を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

第３の非標準アミノ酸の存在下で宿主細胞をインキュベートするステップであって、前記第３の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；及び
前記宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを介するポリペプチド中への前記第３の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ；
を含む、請求項７８に従属する請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項86】

第４の非標準アミノ酸の存在下で宿主細胞をインキュベートするステップであって、前記第４の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；及び
前記宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ－Ｏ－ｔＲＮＡペアを介するポリペプチド中への前記第４の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ；
を含む、請求項７９に従属する請求項８３～８５のいずれかに記載の方法。

【請求項87】

請求項８６に記載の方法により得られた又は得ることができるポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質産生を最適化する新規の方法に関する。これらの方法は、直交性（orthogonal）ｍＲＮＡを最適化する方法、外因性ｔＲＮＡを含む最適なオペロンを設計及び産生する方法、並びに外因性遺伝子、例えば直交性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ－ａａＲＳ、orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase）をコードする外因性遺伝子を含む最適なオペロンを設計及び産生する方法を含む。本発明はまた、前記方法の産物に関する。本発明の部分として提供されるのはまた、これらの革新技術の産物を含む宿主細胞、前記細胞を使用する方法、及びその産物である。本発明の宿主細胞は、遺伝学的に組み込まれた非標準アミノ酸を含むタンパク質及びポリペプチドの産生の向上のために使用されてもよい。

【背景技術】

【0002】

タンパク質中への複数の別個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ、non-canonical amino acid）の組込みを遺伝学的にコードする能力は、タンパク質機能の操作及び指向性進化のための新たな機会を提供し、生物学的発見及び生物学的プロセスの理解のための新たな戦略を可能にし、非標準バイオポリマーのコードされた細胞合成のための基礎を提供する（Chin, J.W. Expanding and reprogramming the genetic code. Nature 550, 53-60 (2017)、de la Torre, D. & Chin, J.W. Reprogramming the genetic code. Nat. Rev. Genet., 1-16 (2020)）。細胞中で合成されるタンパク質中に複数の別個のｎｃＡＡをコードすることは、同じ細胞中での天然タンパク質合成をコードするために使用されるコドン以外に、直交性コドンを要求し；これらは、クアドルプレットコドン（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Wang, K. et al. Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. Nat. Chem. 6, 393-403 (2014)、Anderson, J.C. et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7566-7571 (2004)）、センスコドン圧縮から生じるコドン（Fredens, J. et al. Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514- 518 (2019)、Wang, K. et al. Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding. Nature 539, 59-64 (2016)）、及び非標準塩基を組み込むコドン（Malyshev, D.A. et al. A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet. Nature509, 385-388 (2014)、Zhang, Y. et al. A semi-synthetic organism that stores and retrieves increased genetic information. Nature 551, 644-647 (2017)、Zhang, Y. et al. A semisynthetic organism engineered for the stable expansion of the genetic alphabet. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, 1317-1322 (2017)、Fischer, E.C. et al. New codons for efficient production of unnatural proteins in a semisynthetic organism. Nat. Chem. Biol. 16, 570-576 (2020)）を含む。直交性コドンは、操作された相互に直交性のアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）／ｔＲＮＡペアを使用してｎｃＡＡに割り当てられなければならない。これらのペアは、天然の翻訳のために宿主生物により使用されるシンテターゼ及びｔＲＮＡに関して、並びに同じ細胞中でｎｃＡＡを方向付けるために使用される他の直交性ａａＲＳ及びｔＲＮＡに関してそれらのアミノアシル化特異性において直交性であるべきであり；さらに、それらは、別個のｎｃＡＡ単量体を特異的に認識し、別個の直交性コドンをデコードするべきである（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Neumann, H., Slusarczyk, A.L. & Chin, J.W. De Novo Generation of Mutually Orthogonal Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. J. Am. Chem. Soc. 132, 2142-2144 (2010)、Chatterjee, A., Sun, S.B., Furman, J.L., Xiao, H. & Schultz, P.G. A Versatile Platform for Single- and Multiple-Unnatural Amino Acid Mutagenesis in Escherichia coli. Biochemistry 52, 1828-1837 (2013)、Willis, J.C.W. & Chin, J.W. Mutually orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs. Nat. Chem. 10, 831-837 (2018)、Dunkelmann, D.L., Willis, J.C.W., Beattie, A.T. & Chin, J.W. Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non canonical amino acids. Nat. Chem. 12, 535-544 (2020)、Cervettini, D. et al. Rapid discovery and evolution of orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase-tRNA pairs. Nat. Biotechnol. 38, 989-999 (2020)、Zhang, M.S. et al. Biosynthesis and genetic encoding of phosphothreonine through parallel selection and deep sequencing. Nat. Methods 14, 729-736 (2017)、Italia, J. et al. Mutually Orthogonal Nonsense-Suppression Systems and Conjugation Chemistries for Precise Protein Labeling at up to Three Distinct Sites. J. Am. Chem. Soc. 141, 6204-6212 (2019)）。

【0003】

直交性リボソーム（Ｏ－リボソーム）は、大腸菌（Escherichia coli、Ｅ． ｃｏｌｉ）において野生型（ｗｔ）リボソームの基質ではない、直交性ｍＲＮＡ（Ｏ－ｍＲＮＡ）に対して方向付けられた非天然リボソームである。これらのリボソームは天然リボソームと並行して作動するが、直交性メッセージの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内のＯ－リボソーム結合部位（Ｏ－ＲＢＳ）にそれらを方向付ける変更をそれらのリボソームＲＮＡ中に含有する（Rackham, O. & Chin, J.W. A network of orthogonal ribosome・mRNA pairs. Nat. Chem. Biol. 1, 159-166 (2005)）。Ｏ－リボソームはプロテオームの合成に関与しないので、それらは、新たなデコーディング及び新たな内因性重合機能を含む、天然リボソームによりアクセスされない新たな機能を行うために操作され得る（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770-777 (2007)、Schmied, W.H. et al. Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)）。Ｏ－ｒｉｂｏＱ１（進化型Ｏ－リボソーム）は、コグネイトｔＲＮＡを使用して、Ｏ－ｍＲＮＡ上のアンバーコドン及びクアドルプレットコドンを効率的にデコードし、そのため、直交性メッセージ上で選択的にデコードされる直交性コドンを提供する（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770-777 (2007)）。

【0004】

別個のｎｃＡＡを認識し、別個のコドンをデコードする、操作された相互に直交性のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアが、タンパク質中に２又は３つの別個のｎｃＡＡを組み込むために使用されている（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Wang, K. et al. Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. Nat. Chem. 6, 393-403 (2014)、Willis, J.C.W. & Chin, J.W. Mutually orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs. Nat. Chem. 10, 831-837 (2018)、Dunkelmann, D.L., Willis, J.C.W., Beattie, A.T. & Chin, J.W. Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non canonical amino acids. Nat. Chem. 12, 535-544 (2020)、Italia, J. et al. Mutually Orthogonal Nonsense-Suppression Systems and Conjugation Chemistries for Precise Protein Labeling at up to Three Distinct Sites. J. Am. Chem. Soc. 141, 6204-6212 (2019)、Venkat, S. et al. Genetically Incorporating Two Distinct Post-translational Modifications into One Protein Simultaneously. ACS Synth. Biol. 7, 689-695 (2018)）。相同的なメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei、Ｍｍ）又はメタノサルシナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri、Ｍｂ）ピロリシル－ｔＲＮＡは、遺伝コード拡張のための広く使用される直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアである（de la Torre, D. & Chin, J.W. Reprogramming the genetic code. Nat. Rev. Genet., 1-16 (2020)、Chin, J.W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014)）。本発明者らは最近、多様な生物からのＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌペアを調べ、天然のＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌ配列は別個の特異性を有する複数のサブクラスにクラスター化することを発見し；この洞察により、本発明者らは、別個のｎｃＡＡを認識し、別個のコドンをデコードする二重及び三重に直交性のＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌペアを操作することが可能となった（Willis, J.C.W. & Chin, J.W. Mutually orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs. Nat. Chem. 10, 831-837 (2018)、Dunkelmann, D.L., Willis, J.C.W., Beattie, A.T. & Chin, J.W. Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non canonical amino acids. Nat. Chem. 12, 535-544 (2020)）。

【0005】

Ｏ（ｔｒａｎｓ）－ｓｔｒｅｐＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ又は１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６（Ｏ－リボソーム結合部位（Ｏ（ｔｒａｎｓ））を含有し、２つのクアドルプレットコドン（ＡＧＧＡ及びＡＧＴＡ）並びにアンバーコドン（ＴＡＧ）を含有する以前に記載された５’ＵＴＲから翻訳される_{Ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のためのＯ－ｍＲＮＡ）のＯ－ｒｉｂｏＱ１媒介性翻訳を、操作された三重に直交性のＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｐｙｌペアと組み合わせることにより、本発明者らは、組換えＳｔｒｅｐＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６中への３つのｎｃＡＡの組込みを実証した（Dunkelmann, D.L., Willis, J.C.W., Beattie, A.T. & Chin, J.W. Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non canonical amino acids. Nat. Chem. 12, 535-544 (2020)）。しかしながら、本発明者らが気付いたように（Willis, J.C.W. & Chin, J.W. Mutually orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs. Nat. Chem. 10, 831-837 (2018)、Dunkelmann, D.L., Willis, J.C.W., Beattie, A.T. & Chin, J.W. Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non canonical amino acids. Nat. Chem. 12, 535-544 (2020)）、この発現システムからのタンパク質の収率は低く、最適化されていない。Ｏ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６及びｗｔ ＲＢＳを含有する５’ＵＴＲを有する_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６オープンリーディングフレームを用いた追加の実験は、Ｏ－リボソームによるＯ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６の翻訳は、ｗｔリボソームにより産生されるよりも３１倍低い_{Ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６タンパク質につながることを実証した。さらに、Ｏ（ｔｒａｎｓ）５’ＵＴＲを他のＯＲＦに移すこともまた、タンパク質合成のレベルの実質的な減少につながる（図１及び補足図１）。Ｏ（ｔｒａｎｓ）５’ＵＴＲ配列は、ＧＳＴ融合タンパク質を産生するためのコンストラクトに由来し、該コンストラクトにおいて、Ｏ（ｔｒａｎｓ）５’ＵＴＲ配列は、ｗｔ ＲＢＳを含有する５’ＵＴＲからのＯ－リボソーム非依存的翻訳と同等のレベルでのＯ－リボソーム依存的翻訳を指令した（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770-777 (2007)）。これらの観察は、Ｏ（ｔｒａｎｓ）配列は一部のＯＲＦについて効率的な直交翻訳を指令するが、ＯＲＦの効率的な翻訳のための一般的な解決策を提供しないことを実証した。

【0006】

そのため、直交翻訳においてタンパク質収率を最大化するＯ－ｍＲＮＡの作出のための一般的な解決策が要求されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Chin, J.W. Expanding and reprogramming the genetic code. Nature 550, 53-60 (2017)

【非特許文献2】de la Torre, D. & Chin, J.W. Reprogramming the genetic code. Nat. Rev. Genet., 1-16 (2020)

【非特許文献3】Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)

【非特許文献4】Wang, K. et al. Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. Nat. Chem. 6, 393-403 (2014)

【非特許文献5】Anderson, J.C. et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7566-7571 (2004)

【非特許文献6】Fredens, J. et al. Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514- 518 (2019)

【非特許文献7】Wang, K. et al. Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding. Nature 539, 59-64 (2016)

【非特許文献8】Malyshev, D.A. et al. A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet. Nature509, 385-388 (2014)

【非特許文献9】Zhang, Y. et al. A semi-synthetic organism that stores and retrieves increased genetic information. Nature 551, 644-647 (2017)

【非特許文献10】Zhang, Y. et al. A semisynthetic organism engineered for the stable expansion of the genetic alphabet. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, 1317-1322 (2017)

【非特許文献11】Fischer, E.C. et al. New codons for efficient production of unnatural proteins in a semisynthetic organism. Nat. Chem. Biol. 16, 570-576 (2020)

【非特許文献12】Neumann, H., Slusarczyk, A.L. & Chin, J.W. De Novo Generation of Mutually Orthogonal Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. J. Am. Chem. Soc. 132, 2142-2144 (2010)

【非特許文献13】Chatterjee, A., Sun, S.B., Furman, J.L., Xiao, H. & Schultz, P.G. A Versatile Platform for Single- and Multiple-Unnatural Amino Acid Mutagenesis in Escherichia coli. Biochemistry 52, 1828-1837 (2013)

【非特許文献14】Willis, J.C.W. & Chin, J.W. Mutually orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs. Nat. Chem. 10, 831-837 (2018)

【非特許文献15】Dunkelmann, D.L., Willis, J.C.W., Beattie, A.T. & Chin, J.W. Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non canonical amino acids. Nat. Chem. 12, 535-544 (2020)

【非特許文献16】Cervettini, D. et al. Rapid discovery and evolution of orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase-tRNA pairs. Nat. Biotechnol. 38, 989-999 (2020)

【非特許文献17】Zhang, M.S. et al. Biosynthesis and genetic encoding of phosphothreonine through parallel selection and deep sequencing. Nat. Methods 14, 729-736 (2017)

【非特許文献18】Italia, J. et al. Mutually Orthogonal Nonsense-Suppression Systems and Conjugation Chemistries for Precise Protein Labeling at up to Three Distinct Sites. J. Am. Chem. Soc. 141, 6204-6212 (2019)

【非特許文献19】Rackham, O. & Chin, J.W. A network of orthogonal ribosome・mRNA pairs. Nat. Chem. Biol. 1, 159-166 (2005)

【非特許文献20】Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770-777 (2007)

【非特許文献21】Schmied, W.H. et al. Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)

【非特許文献22】Venkat, S. et al. Genetically Incorporating Two Distinct Post-translational Modifications into One Protein Simultaneously. ACS Synth. Biol. 7, 689-695 (2018)

【非特許文献23】Chin, J.W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明者らは、タンパク質産生を最適化する高度に有効な方法を本明細書において提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の態様において、直交性リボソーム（Ｏ－リボソーム）による翻訳に好適な直交性メッセンジャーＲＮＡ（Ｏ－ｍＲＮＡ）であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧｔｏｔｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧｔｏｔｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧｔｏｔｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；及び
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法が提供される。

【0010】

ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）は、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、ｍＲＮＡがＯ－リボソームに結合して、Ｏ－リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{ｏ－ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和であってもよい。

【0011】

Ｏ－リボソームは直交性１６Ｓ ｒＲＮＡを含んでもよく、ｍＲＮＡはシャインダルガルノ配列を含んでもよく、ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）は、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－Ｏ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
に従って予測されてもよく；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－Ｏ－ｒＲＮＡ}は、直交性１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及びｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}は、ＯＲＦの開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}は、シャインダルガルノ配列と開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}は、シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}は、ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである。

【0012】

ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間の差異の規模は許容の確率を決定してもよく、より小さい規模は、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる。

【0013】

改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布は、

【数1】

であってもよく、Ｔ_ＳＡはシミュレートされたアニーリング温度である。

【0014】

Ｔ_ＳＡは、５～２０％の許容率を維持するように調整されてもよい。

【0015】

実施形態において、方法は、第２のリボソーム（２^ｎｄ－リボソーム）も含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計するための方法であり、
ステップ（ａ）は、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測することを含み；
ステップ（ｃ）は、改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測することを含み；
ステップ（ｄ）は、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負であり、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶することである。

【0016】

特定の実施形態において、第２のリボソーム（２^ｎｄ－リボソーム）も含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とＯ－ｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負であり、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；並びに
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法が提供される。

【0017】

ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）は、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、ｍＲＮＡが２^ｎｄ－リボソームに結合して、２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{２ｎｄ ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和であってもよい。

【0018】

２^ｎｄ－リボソームは１６Ｓ ｒＲＮＡを含んでもよく、ｍＲＮＡはシャインダルガルノ配列を含んでもよく、ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）は、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－２ｎｄ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
に従って予測されてもよく；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－２ｎｄ－ｒＲＮＡ}は、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及びｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}は、ＯＲＦの開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}は、シャインダルガルノ配列と開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}は、シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}は、ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである。

【0019】

実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正であるか、又はΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）との間の差異の規模は許容の確率を決定し、より小さい規模は、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる。

【0020】

実施形態において、
ステップ（ａ）は、式：ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）を算出することを含み；
ステップ（ｃ）は、式：ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）を算出することを含み；
ステップ（ｄ）は、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶することであり；
Ｘは０．１～２であるか、又はＸは０．５である。

【0021】

実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）との間の差異の規模は許容の確率を決定し、より小さい規模は、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる。

【0022】

改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布は、

【数2】

であってもよく、Ｔ_ＳＡはシミュレートされたアニーリング温度である。

【0023】

Ｔ_ＳＡは、５～２０％の許容率を維持するように調整されてもよい。

【0024】

改変は、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であってもよいか又はそれを含んでもよい。

【0025】

実施形態において、ステップ（ｂ）は、５’ＵＴＲ中に改変を導入すること、又はＯＲＦ内のコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換することを含み；ステップ（ｅ）は、許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成することを含む。

【0026】

実施形態において、ステップ（ｂ）は、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失を含む改変を５’ＵＴＲ中に導入すること、又はＯＲＦ内のコドン２～１２のいずれか１つを同義コドンと交換することを含む。

【0027】

実施形態において、ステップ（ｂ）～（ｄ）は、少なくとも２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、若しくは１００００回反復されるか；又はステップ（ｂ）～（ｄ）は、少なくとも１０、５０、１００、２５０、若しくは５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復されるか；又はステップ（ｂ）～（ｄ）は、少なくとも１０、５０、１００、２５０、若しくは５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）若しくはより正のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復されるか；又はステップ（ｂ）～（ｄ）は、少なくとも１０、５０、１００、２５０、若しくは５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）につながらなくなるまで反復される。

【0028】

実施形態において、ステップ（ａ）の５’ＵＴＲは３５ヌクレオチド長であるか；又は改変は、開始コドンに最も近接した５’ＵＴＲの３５ヌクレオチドのいずれかにある。ステップ（ａ）の５’ＵＴＲは、ランダムに生成された核酸の配列によるものであってもよい。ステップ（ａ）の５’ＵＴＲは野生型シャインダルガルノ配列を含んでもよい。

【0029】

Ｏ－リボソームは直交性アンチシャインダルガルノ配列を含んでもよく、ステップ（ａ）の５’ＵＴＲは、直交性アンチシャインダルガルノ配列に完全に相補的であることが予測される直交性シャインダルガルノ配列（Ｏ－ＳＤ）を含んでもよい。

【0030】

一部の実施形態において、ステップ（ｂ）は、Ｏ－ＳＤの５ヌクレオチドコア中に改変を導入することを含まない。

【0031】

シャインダルガルノ配列はＯＲＦの開始コドンからの５ヌクレオチドであってもよい。

【0032】

実施形態において、２^ｎｄリボソームは野生型リボソームであるか、又は２^ｎｄリボソームは、第１のＯ－リボソームとは異なるＯ－リボソームである。

【0033】

Ｏ－ｍＲＮＡを設計する方法はコンピューター上で実行されてもよい。

【0034】

本発明の態様において、Ｏ－リボソームによる翻訳のための外因性タンパク質をコードする核酸配列を産生する方法であって、Ｏ－ｍＲＮＡの配列が、本明細書に開示されるＯ－ｍＲＮＡを設計する任意の方法に従って設計され、次に前記配列をコードする核酸分子が産生される、方法が提供される。

【0035】

本発明の態様において、直交性リボソーム（Ｏ－リボソーム）による翻訳のための直交性メッセンジャーＲＮＡ（Ｏ－ｍＲＮＡ）を設計するためのシステムであって、
プロセッサー；及び
本明細書に開示されるＯ－ｍＲＮＡを設計する任意の方法を実施するための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体
を含む、システムが提供される。

【0036】

本発明の態様において、コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、コンピューターシステムが本明細書に開示されるＯ－ｍＲＮＡを設計する任意の方法を実行させるプログラムコードを保存する非一時的な機械可読媒体を含むコンピュータープログラム製品が提供される。

【0037】

本発明の別の態様において、内因性ｔＲＮＡをコードする内因性ゲノムを含む宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法であって、
（ｉ）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの配置の並べ替えを生成するステップ；
（ii）内因性ゲノム内で、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの各々の並べ替え内の外因性ｔＲＮＡの各々の隣接するペアに対して最も高いレベルの配列同一性を有する内因性ｔＲＮＡの隣接するペアを同定するステップ；
（iii）内因性ｔＲＮＡの同定された隣接するペアの各々の間の内因性ゲノム中の遺伝子間領域を同定するステップ；
（iv）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの各々の並べ替えをコードし、外因性ｔＲＮＡの各々の関連付けられた隣接するペアの間に位置付けられる同定された遺伝子間領域を含む複数の配列を生成するステップ；及び
（ｖ）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロン中に含めるための前記複数の配列からの配列を選択するステップ
を含む、方法が提供される。

【0038】

ステップ（ｖ）の選択は、複数の配列の順位付けされたリストからなされてもよく、順位付けされたリストは、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡと、遺伝子間領域を定義するために使用された対応する内因性ｔＲＮＡとの間の配列同一性の和に基づいて複数の配列の各々を順位付けすることにより作出される。

【0039】

ステップ（ii）の配列同一性は、内因性ｔＲＮＡのアクセプターステム配列を外因性ｔＲＮＡのアクセプターステム配列と比較することにより算出されてもよい。ｔＲＮＡの最初の７ヌクレオチド、及びＣＣＡ末端を含まない最後の８ヌクレオチドが比較されてもよい。

【0040】

考慮される最小遺伝子間領域は、５、１０、１５、２０、又は２５塩基対であってもよく、最大遺伝子間領域は、５０、７５、１００、１２５、又は１５０塩基対であってもよい。実施形態において、考慮される最小遺伝子間領域は１０塩基対であり、最大は１００塩基対である。

【0041】

方法は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計するための方法であってもよい。

【0042】

少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法のいずれも、コンピューター上で実行されてもよい。

【0043】

本発明の態様において、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡを含むオペロンをコードする核酸配列を産生する方法であって、核酸の配列が、本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法のいずれかに従って設計され、次に、前記配列をコードする核酸が産生される、方法が提供される。

【0044】

本発明の態様において、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡを含むオペロンを設計するためのシステムであって、
プロセッサー；及び
本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法のいずれかを行うための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体
を含む、システムが提供される。

【0045】

本発明の態様において、コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、コンピューターシステムが本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法のいずれかを実行させるプログラムコードを保存する非一時的な機械可読媒体を含む、コンピュータープログラム製品が提供される。

【0046】

本発明の態様において、本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法のいずれかにより得られるか又は得ることが可能であるオペロンを含む、核酸が提供される。

【0047】

本発明の態様において、内因性ゲノムを含む宿主細胞であって、宿主細胞が、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡを含むオペロンをコードする核酸を含み、外因性ｔＲＮＡの各々のペアの間の核酸配列が、内因性ゲノムに由来する遺伝子間配列である、宿主細胞が提供される。

【0048】

宿主細胞は、本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法のいずれかにより得られるか又は得ることが可能であるオペロンを含んでもよい。

【0049】

宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞であってもよい。細菌細胞は大腸菌であってもよく、内因性ゲノムは大腸菌ゲノムであってもよい。

【0050】

本発明の別の態様において、宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法であって、
（ｉ）少なくとも２つの外因性ＯＲＦの各々のための複数の５’ＵＴＲ配列を生成するステップであって、各々の５’ＵＴＲ配列が、前記５’ＵＴＲ配列及び外因性ＯＲＦを含むｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態と、前記ｍＲＮＡのリボソームに結合した開始適格状態との間の負の予測される自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ））について最適化されている、ステップ；
（ii）前記５’ＵＴＲが最適化された外因性ＯＲＦに対して５’に位置付けられ、少なくとも２つの外因性ＯＲＦの残りの各々の外因性ＯＲＦに対して３’に位置付けられた場合の５’ＵＴＲ配列の各々についてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を予測するステップ；並びに
（iii）５’ＵＴＲ配列及び少なくとも２つの外因性ＯＲＦの配置を選択するステップ
を含む、方法が提供される。

【0051】

ステップ（iii）は、５’ＵＴＲ配列及び少なくとも２つの外因性ＯＲＦの配置を選択することを含んでもよく、
すべての５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアについてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）の和は最も負であり；及び／又は
すべての５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアについてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）の平均値は最も負であり；及び／又は
各々の５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアは、標的ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも負のΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を有する。

【0052】

ステップ（ｉ）は、少なくとも２つの外因性ＯＲＦの各々のための２、３、４、５、又は６以上の５’ＵＴＲ配列を生成することを含んでもよい。

【0053】

実施形態において、少なくとも２つの外因性ＯＲＦの少なくとも１つ又はすべてはアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼである。

【0054】

方法は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの外因性ＯＲＦをコードするオペロンを設計するための方法であってもよい。

【0055】

ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）は、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、ｍＲＮＡがリボソームに結合して、リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和であってもよい。

【0056】

ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）は、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
に従って予測されてもよく；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}は、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及びｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}は、外因性ＯＲＦをコードする配列の開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}は、シャインダルガルノ配列と外因性ＯＲＦをコードする配列の開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}は、シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}は、ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである。

【0057】

実施形態において、ステップ（ｉ）は、
（ａ）５’ＵＴＲ中に改変を導入すること；
（ｂ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ））を予測すること；
（ｃ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶すること；及び
（ｄ）許容された改変を含む５’ＵＴＲ配列を生成すること
を含む。

【0058】

実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも正である場合、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）との間の差異の規模は許容の確率を決定し、より小さい規模は、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる。

【0059】

改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布は、

【数3】

であってもよく、Ｔ_ＳＡはシミュレートされたアニーリング温度である。

【0060】

Ｔ_ＳＡは、５～２０％の許容率を維持するように調整されてもよい。

【0061】

改変は、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であってもよいか又はそれを含んでもよい。実施形態において、ステップ（ａ）は、５’ＵＴＲ中に改変を導入すること、又は外因性ＯＲＦをコードする配列内でコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換することを含み；ステップ（ｄ）は、許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含む配列を生成することを含む。特定の実施形態において、ステップ（ａ）は、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失を含む改変を５’ＵＴＲ中に導入すること、又はＯＲＦ内のコドン２～１２のいずれか１つを同義コドンと交換することを含む。

【0062】

ステップ（ａ）～（ｃ）は、少なくとも２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、又は１００００回反復されてもよい。代替的に、ステップ（ａ）～（ｃ）は、少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復されてもよい。

【0063】

本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法のいずれも、コンピューター上で実行されてもよい。

【0064】

本発明の態様において、少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むポリシストロン性オペロンをコードする核酸配列を産生する方法であって、核酸の配列が、本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法のいずれかに従って設計され、次に、前記配列に従って核酸が産生される、方法が提供される。

【0065】

本発明の態様において、少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むポリシストロン性オペロンを設計するためのシステムであって、
プロセッサー；及び
本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法のいずれかを行うための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体
を含む、システムが提供される。

【0066】

本発明の態様において、コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、コンピューターシステムが本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法のいずれかを実行させるプログラムコードを保存する非一時的な機械可読媒体を含む、コンピュータープログラム製品が提供される。

【0067】

本発明の態様において、本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法のいずれかにより得られるか又は得ることが可能であるオペロンを含む、核酸が提供される。

【0068】

本発明の態様において、本明細書に開示される少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法のいずれかにより得られるか又は得ることが可能であるオペロンをコードする核酸を含む、宿主細胞が提供される。

【0069】

宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞であってもよい。細菌細胞は大腸菌であってもよく、内因性ゲノムは大腸菌ゲノムであってもよい。

【0070】

本発明の態様において、
外因性タンパク質をコードするＯ－ｍＲＮＡをコードする核酸配列であって、Ｏ－ｍＲＮＡが、本明細書に開示されるＯ－ｍＲＮＡを設計する方法のいずれかにより得られるか又は得ることが可能であり、Ｏ－ｍＲＮＡが少なくとも２つのタイプの直交性コドンを含む、核酸配列；
少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡをコードするＯ－ｔＲＮＡオペロンを含む核酸配列であって、少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡが、前記少なくとも２つのタイプの直交性コドンをデコードする能力を有し、オペロンが、本明細書に開示されるＯ－ｔＲＮＡオペロンを設計する方法のいずれかにより得られるか又は得ることが可能である、核酸配列；
少なくとも２つのＯ－ａａＲＳオペロンをコードする直交性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ－ａａＲＳ）を含む核酸配列であって、少なくとも２つのＯ－ａａＲＳが、少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡとＯ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを形成し、オペロンが、本明細書に開示される少なくとも２つの外因性遺伝子をコードするオペロンを設計する方法のいずれかにより得られるか又は得ることが可能である、核酸配列；及び
直交性リボソーム
を含む、宿主細胞が提供される。

【0071】

実施形態において、
Ｏ－ｍＲＮＡは少なくとも３つのタイプの直交性コドンを含み；
Ｏ－ｔＲＮＡオペロンは、前記少なくとも３つの直交性コドンをデコードする能力を有する少なくとも３つの直交性ｔＲＮＡをコードし；
Ｏ－ａａＲＳオペロンは、少なくとも３つの直交性ｔＲＮＡとＯ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを形成する少なくとも３つのＯ－ａａＲＳをコードする。

【0072】

実施形態において、
Ｏ－ｍＲＮＡは少なくとも４つのタイプの直交性コドンを含み；
Ｏ－ｔＲＮＡオペロンは、前記少なくとも４つの直交性コドンをデコードする能力を有する少なくとも４つの直交性ｔＲＮＡをコードし；
Ｏ－ａａＲＳオペロンは、少なくとも４つの直交性ｔＲＮＡとＯ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを形成する少なくとも４つのＯ－ａａＲＳをコードする。

【0073】

宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞であってもよい。細菌細胞は大腸菌であってもよく、内因性ゲノムは大腸菌ゲノムであってもよい。

【0074】

本発明の態様において、ポリペプチドを産生する方法であって、
本明細書に開示されているＯ－リボソーム、Ｏ－ｔＲＮＡオペロン、及びＯ－ａａＲＳオペロンを含む宿主細胞を用意するステップ；
第１の非標準アミノ酸の存在下で宿主細胞をインキュベートするステップであって、第１の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；並びに
宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを介するポリペプチド中への第１の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ
を含む、方法が提供される。

【0075】

実施形態において、方法は、
第２の非標準アミノ酸の存在下で宿主細胞をインキュベートするステップであって、第２の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；及び
宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを介するポリペプチド中への第２の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ
を含む。

【0076】

実施形態において、方法は、
第３の非標準アミノ酸の存在下で宿主細胞をインキュベートするステップであって、第３の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；及び
宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを介するポリペプチド中への第３の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ
を含む。

【0077】

実施形態において、方法は、
第４の非標準アミノ酸の存在下で宿主細胞をインキュベートするステップであって、第４の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；及び
宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを介するポリペプチド中への第４の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ
を含む。

【0078】

本発明の別の態様において、本明細書に開示されるポリペプチドを産生する任意の方法により得られた又は得ることができるポリペプチドが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0079】

【図1-1】～

【図1-2】Ｏ－リボソームにより特異的かつ効率的に翻訳されるＯ－ｍＲＮＡ配列の自動化された発見。 ａ、ｍＲＮＡ上のｗｔ及びＯ－リボソームによるタンパク質合成の開始についての熱力学的モデル。開始複合体の形成のための自由エネルギー（ΔＧ_ｔｏｔ）は、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、ｍＲＮＡがリボソーム３０Ｓサブユニット及びｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ _ＣＡＵ（黒色の三叉槍及び黄色の星）への結合を通じて開始複合体を形成する場合に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和である。Ｏ－リボソームの３０Ｓサブユニット（薄茶色）はＯ－１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端において直交性アンチシャインダルガルノ（Ｏ－ａＳＤ）を含有し、ｗｔリボソームの３０Ｓサブユニット（暗褐色）はその１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端においてｗｔアンチシャインダルガルノ（ｗｔ ａＳＤ）を含有する。ｗｔ及び直交性３０ＳとのアンフォールディングしたｍＲＮＡからの開始複合体の形成で放出される自由エネルギーは、それぞれΔＧ_{ｗｔ ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}及びΔＧ_{Ｏ－ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}である。算出に関する詳細は方法において提供される。ＯＲＦオープンリーディングフレーム（橙色）、開始コドン（紫色）、ＳＤ／Ｏ－ＳＤ それぞれシャインダルガルノ配列又は直交バージョン（緑色）、ＳＤ／Ｏ－ＳＤと開始コドンとの間のスペーシング（青色）。５’ＵＴＲの残りの部分は灰色で示される。 ｂ、Ｏ－リボソームにより効率的かつ特異的に翻訳されるＯ－ｍＲＮＡ配列を予測するために開発されたアルゴリズム。アルゴリズムｖｏｌ １は、ｗｔ ＳＤ配列を含有するランダムな３５ヌクレオチド５’ＵＴＲを生成し、そのΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）を予測する。反復処理において、変異が５’ＵＴＲ中に導入される（単一のヌクレオチドの変化、挿入、又は欠失）。アルゴリズムは次に、新たな直交性ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）を予測する。ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）がΔＧｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合、変化は許容され；変異がより正のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）につながる場合、変化は、何らかの条件付き確率と共に拒絶される（方法を参照）。アルゴリズムは１０，０００回の反復後に終了される。アルゴリズムｖｏｌ ２は、開始コドンからの最適な５ヌクレオチドスペーシングにおいてＯ－ＳＤ配列を含有するランダムな３５ヌクレオチド５’ＵＴＲを生成し、そのΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）及びΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）を予測する。反復処理において、変異が５’ＵＴＲ中に導入される（単一のヌクレオチドの変化、挿入、又は欠失）。アルゴリズムは次に、新たな予測される値、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｗｔ ｒｉｂｏ）及びΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）を算出する。ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｗｔ ｒｉｂｏ）がΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）よりも正であり、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）がΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合、変化は許容され；さもなければ、変異は、何らかの条件付き確率と共に拒絶される（方法を参照）。５００回の連続する反復がΔＧ_ｔｏｔ値の向上をもたらさない場合（収束基準）、アルゴリズムは配列及びその予測されるΔＧ_ｔｏｔ値を出力する。アルゴリズムｖｏｌ ３はｖｏｌ ２に基づくが、２つの顕著な差異を有する：（１）Ｖｏｌ ３はまた、コドン２～１２が同義コドンとランダムに交換されたＯＲＦと共に開始し、その結果、コードされるアミノ酸配列は保存される。（２）反復処理において、５’ＵＴＲ中の単一のヌクレオチドの変化、挿入又は欠失に加えて、ＯＲＦ中の同義コドン置換は、許容される変異機序である。 ｃ、アルゴリズムは、Ｏリボソームにより特異的かつ効率的に翻訳されるＯ－ｍＲＮＡ配列を発見する。ｙ軸は、Ｏ－リボソームによるＯ－ｍＲＮＡからの_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６の産生を示し；データは、ｗｔメッセージからｗｔリボソームにより産生される_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６のパーセンテージとして示される。ｘ軸はＯ－ｍＲＮＡの直交性を示し；これは、Ｏ－リボソームの存在下でＯ－ｍＲＮＡから産生される_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６を、ｗｔリボソームの存在下でＯ－ｍＲＮＡから産生される_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６で割ることで算出される。タンパク質産生レベルはＧＦＰ吸収及び蛍光データから算出され；我々のシステムにおいて、ｗｔシステムは３０．６±１．６ｍｇ／ｍＬの_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６を生成する。各々のドットは１つのＯ－ｍＲＮＡを表す。トランス（黒色ドット）はＯ（ｔｒａｎｓ）－ｓｔｒｅｐＧＦＰＨｉｓ６である。有色のドットは、アルゴリズムの指し示されるボリューム（ｖｏｌｕｍｅ）からの配列を表す。ｄ、ｅはｃと同じであるが、それぞれＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎ（ｄ）及びｍＣｈｅｒｒｙ（ｅ）について行ったものである。

【図2-1】～

【図2-2】３つの別個のｎｃＡＡを含有するタンパク質の効率的な産生が、新たなＯ－ｍＲＮＡにより可能になる。 ａ、この研究において使用されたアミノ酸の構造。Ｎ^６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン（ＢｏｃＫ） １；Ｎ^π－メチル－Ｌ－ヒスチジン（ＮｍＨ） ２；Ｎ^６－（（ベンジルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＣｂｚＫ） ３；Ｎ^６－（（アリルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｌｌｏｃＫ） ４；（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヨードフェニル）プロパン酸（ＰｈｅＩ） ５。 ｂ、２つの異なる直交性メッセージを使用する３つの別個のｎｃＡＡの組込みのための操作された三重に直交性のピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼｔＲＮＡペア。１つのメッセージは、我々のアルゴリズムのｖｏｌ １により生成されるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６ ５’ＵＴＲを含有し、他のメッセージはＯ－（ｔｒａｎｓ）５’ＵＴＲを使用した。 ｃ、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－又はＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ－_Ｈｉｓ６ ５’ＵＴＲを有する_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ ＡＧＧＡ及び１５０ ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６コンストラクトを含有する大腸菌細胞からの_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６の産生。細胞はまた、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１及びａａＲＳ３／ｔＲＮＡ３オペロン（ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＵＡ、ＭｌｕｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）／ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵ及びＭ１ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵをコードする）を含有した。ｎｃＡＡ ＢｏｃＫ １、ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３を細胞に加えた。 ｄ、（ｂ）において記載される細胞から精製されたニッケル－ＮＴＡ精製_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６のポジティブエレクトロスプレーＴＯＦ－ＭＳの結果。_{Ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０Ｃｂｚ）_Ｈｉｓ６の予測された質量：２９３１４．５、実測された質量：２９３１２．０。

【図3】４つの直交性クアドルプレットコドンをデコードする４つの直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、ａａＲＳオペロン及びコンピューターにより生成されたｔＲＮＡオペロンから発現され、それらのアミノアシル化特異性において相互に直交性であり、別個のｎｃＡＡを認識し、別個の直交性コドンをデコードする。 ａ～ｄ、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６を含有する細胞からの蛍光であり、ＸＸＸＸはｓｆＧＦＰ中の４０位におけるコドン：ＴＡＧＡ、ＣＴＡＧ、ＡＧＧＡ又はＡＧＴＡである。大腸菌はまた、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１並びにａａＲＳ及びｔＲＮＡオペロン（ａａＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ））を含有し；これらのオペロンは、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＵＣＵＡ、ＭｒｕｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）／ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵ、ＡｆＴｙｒＲＳ（ＰｈｅＩ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡＧ及びＭｇ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵを発現した。指し示されるｎｃＡＡ：Ｎ^π－メチル－Ｌ－ヒスチジン（ＮｍＨ） ２、Ｎ^６－（（ベンジルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＣｂｚＫ） ３、Ｎ^６－（（アリルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｌｌｏｃＫ） ４、（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヨードフェニル）プロパン酸（ＰｈｅＩ） ５を細胞に加えたか、又は省略した（－）。各々のコドンは、それぞれのクアドルプレットコドンに割り当てられたａａＲＳ／ｔＲＮＡペアのコグネイトｎｃＡＡの存在下でのみ効率的にデコードされた：（ａ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＵＣＵＡによりデコードされるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＴＡＧＡ）_Ｈｉｓ６、（ｂ）ＭｒｕｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）／ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵによりデコードされるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＡＧＧＡ）_Ｈｉｓ６、（ｃ）Ｍｇ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵによりデコードされるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、及び（ｄ）ＡｆＴｙｒＲＳ（ＰｈｅＩ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡＧによりデコードされるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＣＴＡＧ）_Ｈｉｓ６。 ｅ～ｈ、ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＡｌｌｏｃＫ ４、ＰｈｅＩ ５の存在下での、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６から発現されるニッケル－ＮＴＡ精製_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６のポジティブエレクトロスプレーＴＯＦ－ＭＳであり、ＸＸＸＸは、ＴＡＧＡ（ｅ）、ＡＧＧＡ（ｆ）、ＡＧＴＡ（ｇ）又はＣＴＡＧ（ｈ）のいずれかである。細胞はまたＯ－ｒｉｂｏＱ１及びオペロンａａＲＳ４＿２－１／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）を含有した。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＡｌｌｏｃＫ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９１１３．２、実測された質量２９１１４．８。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＮｍＨ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９０５２．１、実測された質量２９０５２．５。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９１６３．３、実測された質量２９１６４．２。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９１７４．０３、実測された質量２９１７４．２。

【図4-1】～

【図4-2】２４個のアミノ酸、６８個のコドン遺伝コードを使用してタンパク質中に４つの別個のｎｃＡＡを遺伝学的にコードする。 ａ、４つの直交性クアドルプレットコドンに応答した４つの別個のｎｃＡＡの組込みのために使用される４つの相互に直交性のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアの図式的な表現。 ｂ、全長_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ、５０ＡｌｌｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６の効率的な産生は、４つすべてのｎｃＡＡ（Ｎ^π－メチル－Ｌ－ヒスチジン（ＮｍＨ） ２、Ｎ^６－（（ベンジルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＣｂｚＫ） ３、Ｎ^６－（（アリルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｌｌｏｃＫ） ４、（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヨードフェニル）プロパン酸（ＰｈｅＩ） ５）の追加に依存的であった。ＮｍＨ（２）、ＣｂｚＫ（３）、ＡｌｌｏｃＫ（４）、ＰｈｅＩ（５）の組合せの存在又は非存在下でのＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＣＴＡＧ、５０ＴＡＧＡ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１、オペロンａａＲＳ４／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）（ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅＰｙｌｔＲＮＡ_ＵＣＵＡ、ＭｒｕｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）／ＭｉｎｔＰｙｌｔＲＮＡ（^Ａ１７，^ＶＣ１０）_ＵＣＣＵ、ＡｆＴｙｒＲＳ／ＡｆｔＲＮＡ_ＣＵＡＧ及びＭｇ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＭａｌｖＰｙｌｔＲＮＡ（８）_ＵＡＣＵをコードする）を含有する細胞からの蛍光。 ｃ、指し示されるｎｃＡＡの存在下でのＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＣＴＡＧ、５０ＴＡＧＡ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１及びａａＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）を含有する細胞からのニッケル－ＮＴＡ精製_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ、５０ＡｌｌｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６のポジティブエレクトロスプレーＴＯＦ－ＭＳ。予測された質量２９４７０．４、実測された質量２９４６８．２。

【図5-1】～

【図5-2】（補足図１） 指し示されるアルゴリズムにより生成されたＯ－ｍＲＮＡからのレポータータンパク質産生の蛍光測定。我々は、標準化されたｐ１５Ａレポーターコンストラクト中に配列（_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６のためのＯ１－Ｏ１２ _{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６（ａ及びｂ）、Ｅ２ＣｒｉｍｓｏｎのためのＯ１－Ｏ８ Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ（ｃ）の他に、ｍＣｈｅｒｒｙのためのＯ１－Ｏ８ ｍＣｈｅｒｒｙ（ｄ））をクローニングし、Ｏ－リボソーム又はｗｔリボソームの追加のコピーのいずれかをコードするプラスミドの存在下でタンパク質を産生した。対照実験では、我々の研究室において一般的に使用される５’ＵＴＲ及びＲＢＳを有するコンストラクト（ｗｔ）、並びに高度に効率的なＯ－ＧＳＴ－ＣａＭ産生のために以前に使用されたＯ（ｔｒａｎｓ）５’ＵＴＲを有するコンストラクト（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770-777 (2007)）を使用した。バーは、３つの生物学的複製物の平均値±標準偏差を表す。ドットは個々の実験を表す。

【図6-1】～

【図6-3】（補足図２） _{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６のトリプシン消化後に得られたｎｃＡＡ含有ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル。前駆体イオンはｎｃＡＡの組込みを裏付けている。各々のペプチドの断片化は、ｂイオンのシリーズ（青色）及びｙイオンのシリーズ（赤色）の他に、断片化処理におけるリジン保護基の喪失に対応するイオンをもたらすことが予測される（ａ及びｃ）。イオンピークを手動で割り当てたところ；前駆体イオン質量と共に、これらはその予想される位置における各々のｎｃＡＡの組込みを裏付けた。質量分析を３回行ったところ、類似した結果であった。ａ、４０位におけるＢｏｃＫ １組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。ｂ、１３６位におけるＮｍＨ ２組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。ｃ、１５０位におけるＣｂｚＫ ３組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。

【図7】（補足図３） ４つの相互に直交性のａａＲＳ（ＡｆＴｙｒＲＳ（ＰｈｅＩ）、ＭｒｕｍＰｙｌＲＳ（ＮｍＨ）、Ｍｇ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）及びＭｍＰｙｌＲＳ）のための遺伝子を含有するポリシストロン性オペロンの生成のためのアセンブリーパイプライン。各々のシンテターゼのために、最大ΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）について最適化されたオンラインのＲＢＳ計算機（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)、Salis, H.M. in Methods in Enzymology, Vol. 498 19-42 (Academic Press, Cambridge, MA, USA; 2011)、Espah Borujeni, A., Channarasappa, A.S. & Salis, H.M. Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites. Nucleic Acids Res. 42, 2646-2659 (2014)、Espah Borujeni, A. & Salis, H.M. Translation Initiation is Controlled by RNA Folding Kinetics via a Ribosome Drafting Mechanism. J. Am. Chem. Soc. 138, 7016-7023 (2016)、Espah Borujeni, A. et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Res. 45, 5437-5448 (2017)）（参照により本明細書に組み込まれる）を使用して５つの５’ＵＴＲ配列を生成した。次に、形態ａａＲＳＸ－５’＿ＵＴＲ（Ｙ１－Ｙ５）－ａａＲＳＹ（Ｘ及びＹは、４つのシンテターゼのうちの２つの任意の組合せを指す）の各々のアライメントについてのΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）をオンラインツール（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)、Salis, H.M. in Methods in Enzymology, Vol. 498 19-42 (Academic Press, Cambridge, MA, USA; 2011)、Espah Borujeni, A., Channarasappa, A.S. & Salis, H.M. Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites. Nucleic Acids Res. 42, 2646-2659 (2014)、Espah Borujeni, A. & Salis, H.M. Translation Initiation is Controlled by RNA Folding Kinetics via a Ribosome Drafting Mechanism. J. Am. Chem. Soc. 138, 7016-7023 (2016)、Espah Borujeni, A. et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Res. 45, 5437-5448 (2017)）を使用して算出した。最後に、４つすべてのシンテターゼを、各々のシンテターゼについて高いΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）を保証するように手動でアライメントした。２つの独立した解法は類似した結果をもたらした。実験的検証後に、１つのシンテターゼの好都合な配列コンテキストを他のオペロンにコピーして最終コンストラクトを得た（すべての５’ＵＴＲ配列及びΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）を補足表３に与えている）。

【図8】（補足図４） Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６を含有する細胞からの蛍光であり、ＸＸＸＸは、ＴＡＧ、ＣＴＡＧ、ＡＧＧＡ又はＡＧＴＡのいずれかである。大腸菌はまた、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１及びＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅＰｙｌｔＲＮＡ_ＣＵＡＧ、ＭｒｕｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）／ＭｉｎｔＰｙｌｔＲＮＡ（^Ａ１７，^ＶＣ１０）_ＵＣＣＵ、ＡｆＴｙｒＲＳ／ＡｆＲＮＡ_ＣＵＡ及びＭｇ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＭａｌｖＰｙｌｔＲＮＡ（８）_ＵＡＣＵ及びｎｃＡＡ：ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＢｏｃＫ １又はＰｈｅＩ ５のうちの１つを含有した。シンテターゼを最初に、オペロンＲＳ４＿１／ｔＲＮＡ４又はＲＳ４＿２／ｔＲＮＡ４のいずれかに配置した（補足図３及び補足表３を参照）。ＲＳ４＿１／ｔＲＮＡ４（ａ）は、ＴＡＧ、ＣＴＡＧ及びＡＧＴＡの抑制についてより良好な結果をもたらしたが；ＡＧＧＡは、ＲＳ４＿２／ｔＲＮＡ４（ｂ）における効率の半分でのみ抑制された。したがって、ＭｒｕｍＰｙｌＲＳの上流の１５０ｎｔ領域をＲＳ４＿１／ｔＲＮＡ４にコピーして、ＭｒｕｍＰｙｌＲＳよりも２．６高い活性につながるオペロン１ ＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｃ）を得た。

【図9-1】～

【図9-2】（補足図５） _{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ、５０ＡｌｌｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６のトリプシン消化後に得られたｎｃＡＡ含有ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル。前駆体イオンはｎｃＡＡの組込みを裏付けている。各々のペプチドの断片化は、ｂイオンのシリーズ（青色）及びｙイオンのシリーズ（赤色）の他に、断片化処理におけるリジン保護基の喪失に対応するイオンをもたらすことが予測される（ｄ）。イオンピークを手動で割り当てたところ；前駆体イオン質量と共に、これらはその予想される位置における各々のｎｃＡＡの組込みを裏付けた。質量分析を３回行ったところ、類似した結果であった。ａ、４０位におけるＰｈｅＩ ５組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。ｂ、５０位におけるＡｌｌｏｃＫ ４組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。ｃ、１３６位におけるＮｍＨ ２組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。ｄ、１５０位におけるＣｂｚＫ ３組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。

【図10】（補足図６） １つのアンバーコドン及び３つの直交性クアドルプレットコドンをデコードする４つの直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、ａａＲＳオペロン及びコンピューターにより生成されたｔＲＮＡオペロンから発現され、それらのアミノアシル化特異性において相互に直交性であり、別個のｎｃＡＡを認識し、別個の直交性コドンをデコードする。ａ～ｄ、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６を含有する細胞からの蛍光であり、ＸＸＸＸは、ｓｆＧＦＰ中の４０位におけるコドン：ＴＡＧ、ＣＴＡＧ、ＡＧＧＡ又はＡＧＴＡである。大腸菌はまた、ｒｉｂｏ－Ｑ１並びにａａＲＳ及びｔＲＮＡオペロン（ａａＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４）を含有し；これらのオペロンは、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＣＵＡＧ、ＭｒｕｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）／ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵ、ＡｆＴｙｒＲＳ（ＰｈｅＩ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡ及びＭｇ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵを発現した。指し示されるｎｃＡＡ：Ｎ^π－メチル－Ｌ－ヒスチジン（ＮｍＨ） ２、Ｎ^６－（（ベンジルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＣｂｚＫ） ３、Ｎ^６－（ｔｅｒｔブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン（ＢｏｃＫ） １、（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヨードフェニル）プロパン酸（ＰｈｅＩ） ５を細胞に加えたか、又は省略した（－）。各々のコドンは、それぞれのクアドルプレットコドンに割り当てられたａａＲＳ／ｔＲＮＡペアのコグネイトｎｃＡＡの存在下でのみ効率的にデコードされた：（ａ）ＡｆＴｙｒＲＳ（ＰｈｅＩ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡによりデコードされるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＴＡＧ）_Ｈｉｓ６、（ｂ）ＭｒｕｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）／ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵによりデコードされるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＡＧＧＡ）_Ｈｉｓ６、（ｃ）Ｍｇ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵによりデコードされるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、及び（ｄ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＣＵＡＧによりデコードされるＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＣＴＡＧ）_Ｈｉｓ６。 ｅ～ｈ、ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＢｏｃＫ １、ＰｈｅＩ ５の存在下での、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６から発現されたニッケル－ＮＴＡ精製_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６のポジティブエレクトロスプレーＴＯＦ－ＭＳであり、ＸＸＸＸは、ＴＡＧ（ｅ）、ＡＧＧＡ（ｆ）、ＡＧＴＡ（ｇ）又はＣＴＡＧ（ｈ）のいずれかである。細胞はまた、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１及びオペロンａａＲＳ４＿２－１／ｔＲＮＡ４を含有した。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９１７４．０３、実測された質量２９１７４．２。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９１２９．４、実測された質量２９１２９．０。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＮｍＨ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９０５２．１、実測された質量２９０５２．５。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９１６３．３、実測された質量２９１６４．２。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ）_Ｈｉｓ６の予測された質量２９１２９．４、実測された質量２９１２９．０。

【図11】（補足図７） アンバーコドン及び３つの別個のクアドルプレットコドンに応答してタンパク質中に４つの別個のｎｃＡＡを遺伝学的にコードする。 ａ、アンバーコドン及び３つの別個のクアドルプレットコドンに応答した４つの別個のｎｃＡＡの組込みのために使用される４つの相互に直交性のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアの図式的な表現。 ｂ、全長_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ、５０ＡｌｌｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６の効率的な産生は、４つすべてのｎｃＡＡ（ＢｏｃＫ １、ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３及びＰｈｅＩ ５）の追加に依存的であった。ＢｏｃＫ １、ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＰｈｅＩ ５の組合せの存在又は非存在下でのＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、５０ＣＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１、オペロンａａＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＣＵＡＧ、ＭｒｕｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）／ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵ、ＡｆＴｙｒＲＳ（ＰｈｅＩ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡ及びＭｇ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵをコードする）を含有する細胞からの蛍光。 ｃ、８ｍＭのＢｏｃＫ １、４ｍＭのＮｍＨ ２、２ｍＭのＰｈｅＩ ５及び２ｍＭのＣｂｚＫ ３の存在下でのＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、５０ＣＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１及びオペロンＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４を含有する細胞から精製された精製_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ、５０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６のＴＯＦ－ＭＳ ＥＳ＋。予測された質量２９４８２．０、実測された質量２９４８３．０。

【図12-1】～

【図12-2】（補足図８） _{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ、５０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６のトリプシン消化後に得られたｎｃＡＡ含有ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル。前駆体イオンはｎｃＡＡの組込みを裏付けている。各々のペプチドの断片化は、ｂイオンのシリーズ（青色）及びｙイオンのシリーズ（赤色）の他に、断片化処理におけるリジン保護基の喪失に対応するイオンをもたらすことが予測される（ｂ及びｄ）。イオンピークを手動で割り当てたところ；前駆体イオン質量と共に、これらはその予想される位置における各々のｎｃＡＡの組込みを裏付けた。質量分析を３回行ったところ、類似した結果であった。ａ、４０位におけるＰｈｅＩ ５組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。ｂ、５０位におけるＢｏｃＫ １組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。ｃ、１３６位におけるＮｍＨ ２組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。ｄ、１５０位におけるＣｂｚＫ ３組込みを裏付けるＭＳ／ＭＳスペクトル。

【発明を実施するための形態】

【0080】

外因性タンパク質、特には非天然アミノ酸を含む外因性タンパク質を産生するための細胞ベースタンパク質発現システムの使用は、複数の理由のために困難であり得る。１つの課題は、細胞は、生存のために必須の内因性タンパク質も生成できなければならないということである。例えば、タンパク質発現システムが、外因性タンパク質中への非天然アミノ酸の組込みを可能とするために改変されている場合、内因性タンパク質中への非天然アミノ酸の組込みを回避することが所望され得る。これを克服するための１つのアプローチは、２つのリボソーム：宿主細胞にとって内因性のタンパク質の産生のための野生型リボソーム及び外因性タンパク質をコードする直交性ｍＲＮＡを翻訳することが可能である直交性リボソームを含むシステムを使用することである。

【0081】

細胞ベースタンパク質発現システムは、他の理由のためにＯ－リボソームを含んでもよい。内因性リボソームに対する変異は毒性であり得、一部のリボソーム変異は、内因性リボソームのほんの一部のコピー中に存在する場合であっても細胞にとって致死的であり得る（すなわち変異は優性致死的であり得る）ことが見出されている。しかしながら、Ｏ－リボソームはこれらのリボソーム変異を許容することができ、その理由は、本明細書において議論されるように、それらは宿主細胞の他の機能から切り離されているからである。そのため、Ｏ－リボソームは、新たな所望される機能のために操作され得る。例えば、Ｏ－リボソームは、新たな直交性コドン（クアドルプレットコドン、（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)））又は新たな内因性重合機能（Schmied, W.H. et al. Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)）をデコードするために進化され得る。

【0082】

しかしながら、背景技術のセクションにおいて議論されるように、Ｏ－リボソームを含む発現システムからのタンパク質の収率は、低くかつ最適化されていないものであり得る。特に、収率は、異なる外因性タンパク質について測定される場合に一貫していない。

【0083】

天然の翻訳についてのタンパク質収率を決定する要因の理解は不完全であり、実験研究の設計は、観察されるタンパク質収率における変動の半分のみが既知のパラメーターにより説明され得ることを示唆する（Cambray, G., Guimaraes, J.C. & Arkin, A.P. Evaluation of 244,000 synthetic sequences reveals design principles to optimize translation in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 36, 1005-1015 (2018)）。それにもかかわらず、本発明者らは、タンパク質合成の開始は一般的に翻訳の律速ステップであり（Plotkin, J.B. & Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nat. Rev. Genet. 12, 32-42 (2011)）、多数の研究は、５’ＵＴＲ及びコーディング配列の最初の３０ｎｔ中のＲＮＡ二次構造は翻訳開始及びタンパク質収率の鍵となる決定因子であることを示唆する（Cambray, G., Guimaraes, J.C. & Arkin, A.P. Evaluation of 244,000 synthetic sequences reveals design principles to optimize translation in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 36, 1005-1015 (2018)、Tuller, T. & Zur, H. Multiple roles of the coding sequence 5′ end in gene expression regulation. Nucleic Acids Res. 43, 13-28 (2015)）ことに気付いた。実際に、自由にフォールディングしたｍＲＮＡから最終の「開始適格」状態への全自由エネルギー変化（ΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ））を予測する熱力学的モデルを使用して、天然の翻訳についての相対的なタンパク質収率を予測することができる（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)、Na, D., Lee, S. & Lee, D. Mathematical modeling of translation initiation for the estimation of its efficiency to computationally design mRNA sequences with desired expression levels in prokaryotes. BMC Syst. Biol. 4, 1-16 (2010)、Seo, S.W. et al. Predictive design of mRNA translation initiation region to control prokaryotic translation efficiency. Metab. Eng. 15, 67-74 (2013)）（参照により本明細書に組み込まれる）。開始コドンの直ちに上流の５’ＵＴＲにおける異なる３５ｎｔでの先行する研究は、所与のＯＲＦについてのタンパク質収率（翻訳開始の速度を反映するとして解釈される）は、フォールディングしたｍＲＮＡからの開始適格状態の形成についての平衡定数に比例している（すなわち、ΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）のｌｏｇに比例している）ことを指し示す（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)、Salis, H.M. in Methods in Enzymology, Vol. 498 19-42 (Academic Press, Cambridge, MA, USA; 2011)、Espah Borujeni, A., Channarasappa, A.S. & Salis, H.M. Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites. Nucleic Acids Res. 42, 2646-2659 (2014)、Espah Borujeni, A. & Salis, H.M. Translation Initiation is Controlled by RNA Folding Kinetics via a Ribosome Drafting Mechanism. J. Am. Chem. Soc. 138, 7016-7023 (2016)、Espah Borujeni, A. et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Res. 45, 5437-5448 (2017)）（参照により本明細書に組み込まれる）。ΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）は、ｍＲＮＡアンフォールディング（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）、並びに、ｍＲＮＡへの、正確な位置における塩基対合を通じた、ｗｔ－リボソーム及びｔＲＮＡ^ｆＭｅｔ _ＣＡＵの結合（ΔＧ_{ｗｔ ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）に分解され得る（図１ａ）。

【0084】

ここで、本発明者らは、開始の熱力学的モデル及びシミュレートされたアニーリング最適化アルゴリズム（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)）を使用して、ＯＲＦの直交翻訳のための５’ＵＴＲ配列の発見を自動化している。本発明者らはまた、Ｏ－リボソームに結合するが、他のリボソームに結合しないメッセージを明示的に選択するためのアルゴリズムを開発し、５’ＵＴＲ及びＯＲＦのアミノ酸、例えばアミノ酸２～１２をコードする同義コドンの両方におけるバリエーションを探索することにより検索における自由度を増加させている。Ｏ－ｍＲＮＡの発見を自動化することは、先行するＯ－ｍＲＮＡよりも、最大４０倍多くのタンパク質を提供し、最大５０倍直交性である配列につながり；新たなＯ－ｍＲＮＡからのタンパク質収率は、ＷＴ ｍＲＮＡからの場合に匹敵するか、又はそれを上回る。これらの進歩は、操作された三重に直交性のＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｐｙｌペアを使用してアンバーコドン及び２つのクアドルプレットコドンに応答して３つの別個のｎｃＡＡを組み込むための収率における３３倍の増加に直接的に翻訳される。

【0085】

そのため、本発明の態様において、Ｏ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；及び
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法が提供される。

【0086】

「Ｏ－リボソーム」は、本明細書において使用される場合、内因性リボソームと比較して特定の宿主細胞にとって内因性のｍＲＮＡを翻訳する能力が低いか、又は翻訳する能力を有さず；内因性ｍＲＮＡとは異なるｍＲＮＡ（すなわちＯ－ｍＲＮＡ）を翻訳する能力を有するリボソームである。

【0087】

「Ｏ－ｍＲＮＡ」は、本明細書において使用される場合、内因性ｍＲＮＡの翻訳と比較して特定の宿主細胞にとって内因性のリボソームによってより低い効率で翻訳され；内因性リボソームとは異なるリボソーム（すなわちＯ－リボソーム）により翻訳される能力を有するメッセンジャーＲＮＡである。

【0088】

形容詞「直交性の」は、本明細書において使用される場合、Ｏ－リボソーム及びＯ－ｍＲＮＡに関連するが内因性のリボソームにもｍＲＮＡにも関連しない構成要素又は特色を記載する。例えば、直交性シャインダルガルノ配列は、Ｏ－リボソームの直交性アンチシャインダルガルノ配列と相互作用する能力を有するとしてＯ－ｍＲＮＡと関連付けられる。直交性シャインダルガルノ配列は内因性リボソームに対する低減された結合のみを可能とし、直交性アンチシャインダルガルノ配列は内因性ｍＲＮＡに対する低減された結合のみを可能とする。

【0089】

本明細書において使用される場合、Ｏ－リボソーム及びＯ－ｍＲＮＡは一緒になって機能する。そのため、Ｏ－リボソームは、Ｏ－ｍＲＮＡを翻訳する能力を有する。

【0090】

１つより多くのＯ－リボソームを特色とする実施形態において、Ｏ－ｍＲＮＡの第１のセットはＯ－リボソームのうちの１つにのみ適用可能であり得、Ｏ－ｍＲＮＡの第２のセットは他のＯ－リボソームに適用可能であり得る。

【0091】

例において、Ｏ－リボソームは、野生型リボソームとは異なる人工的に変更又は改変されたリボソームであってもよい。Ｏ－ｍＲＮＡは、野生型リボソームの基質ではないｍＲＮＡであってもよい。

【0092】

Ｏ－リボソームは、変更された１６Ｓ ｒＲＮＡを含んでもよい。特に、１６ ｒＲＮＡは、ｍＲＮＡのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）への結合に影響する方式において変更されてもよい。Ｏ－リボソームは、野生型シャインダルガルノ配列に結合する能力を有しないか、又は該能力が最小である変更されたアンチシャインダルガルノ配列を含んでもよい。そのような事例において、Ｏ－ｍＲＮＡは、Ｏ－リボソームに結合する能力を有する変更されたＲＢＳ、例えば変更されたシャインダルガルノ配列を含む。

【0093】

実施形態において、宿主細胞の文脈において、Ｏ－リボソームは、内因性プロテオームを合成しないか、又は最小に合成する。そのような実施形態において、Ｏ－ｍＲＮＡは、内因性リボソームにより翻訳されないか、又は最小に翻訳される。宿主細胞は、特に制限されず、任意の宿主細胞、特には異種タンパク質産生に好適な任意の宿主細胞であってもよい。一部の例において、宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞である。特に、宿主細胞は大腸菌細胞であってもよい。

【0094】

一部の例において、Ｏ－リボソームはＯ－ｒｉｂｏＱ１であってもよい。追加的に、Ｏ－リボソームは、国際公開第２００８／０６５３９８Ａ１号パンフレットにおいて開示されるか、又は国際公開第２００８／０６５３９８Ａ１号パンフレットにおいて開示される方法により得ることが可能である任意のＯ－リボソームであってもよい。追加的に、Ｏ－リボソームは、国際公開第２０１１／０７７０７５Ａ１号パンフレットにおいて開示されるか、又は国際公開第２０１１／０７７０７５Ａ１号パンフレットにおいて開示される方法により得ることが可能である任意のＯ－リボソームであってもよい。国際公開第２００８／０６５３９８Ａ号パンフレット及び国際公開第２０１１／０７７０７５Ａ１号パンフレットの両方は参照により本明細書に組み込まれる。Ｏ－リボソームは、（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)；Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770-777 (2007)；又はSchmied, W.H. et al. Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)）（これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）のいずれかにおいて開示されるか又は開示される方法により得ることが可能である任意のＯ－リボソームであってもよい。

【0095】

用語「５’ＵＴＲ」は、当分野におけるその普通の意味に従って本明細書において使用される。簡潔に述べれば、５’ＵＴＲは、ポリペプチドに翻訳されず、ＯＲＦの５’にあり、リボソームによる認識に関与するｍＲＮＡの領域である。

【0096】

用語「ＯＲＦ」は、当分野におけるその普通の意味に従って本明細書において使用される。簡潔に述べれば、ＯＲＦは、コードされるタンパク質に翻訳される能力を有するｍＲＮＡの部分である。

【0097】

ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態は、ｍＲＮＡがリボソームに結合しておらず、二次構造を自由に形成する場合に存在する状態である。

【0098】

ｍＲＮＡのリボソームに結合した開始適格状態は、ｍＲＮＡがリボソームに結合しており、開始ｔＲＮＡが結合しており、翻訳の開始が始まり得る場合に存在する状態である。

【0099】

実施形態において、改変は、５’ＵＴＲ中に導入された単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む。

【0100】

本発明の方法の間に、改変は、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に許容される。「先行する」ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）は、改変がなされる前のｍＲＮＡ配列について予測されたΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）である。本明細書において議論されるように、本発明の方法は反復されてもよく、そのため、先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）は、先行する反復の間に算出されたΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）であってもよい。

【0101】

本発明の方法の間の改変の許容は、改変により導入された配列変更が、方法の次の反復のために維持されるか、又は、方法のさらなる反復がない場合、方法の出力であるＯ－ｍＲＮＡの配列において維持されることを意味する。

【0102】

本発明の方法の間に、改変は、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って許容又は拒絶される。「先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）」は上記に議論される通りである。確率分布は、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）とΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間の差異が増加するにつれて許容の可能性が減少する条件付き確率に基づいてもよい。確率はモンテ－カルロ最適化であってもよい。

【0103】

実施形態において、改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布は、

【数4】

であり、Ｔ_ＳＡはシミュレートされたアニーリング温度である。

【0104】

特定の実施形態において、Ｔ_ＳＡは、少なくとも０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の許容率を維持するように調整される。特に、Ｔ_ＳＡは、少なくとも５％の許容率を維持するように調整されてもよい。

【0105】

特定の実施形態において、Ｔ_ＳＡは、７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、若しくは１０％よりも低いか、又は７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、若しくは１０％に等しい許容率を維持するように調整される。特に、Ｔ_ＳＡは、２０％よりも低いか、又は２０％に等しい許容率を維持するように調整されてもよい。

【0106】

特定の実施形態において、Ｔ_ＳＡは、０．１％～７５％、１％～５０％、２％～４０％、３％～３０％、４％～２５％、又は、特に、５～２０％の許容率を維持するように調整される。

【0107】

Ｔ_ＳＡの調整は、許容率がある特定の回数の反復について上述の値の外側に入る場合に、Ｔ_ＳＡが、補償するために増加又は減少されることを意味し得る。例えば、許容率が、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、又は５００回の反復について下方閾値を下回るか、又は上方閾値を上回る場合に、許容率が訂正されるようにＴ_ＳＡは低下又は上昇されてもよい。特定の実施形態において、許容率は、５０回の反復について考慮される。特定の実施形態において、Ｔ_ＳＡは、値を２倍又は半分にすることにより調整される。

【0108】

本発明の方法の間の改変の拒絶は、改変により導入された配列変更が元に戻され、そのため方法の次の反復のために維持されないか、又は出力配列において維持されないことを意味する。

【0109】

一部の実施形態において、改変は、特定の配列制約が破られた場合に拒絶されてもよい。例えば、改変された配列が、基礎となる熱力学的モデルの仮定のうちの１つを無効にする場合に、改変は拒絶されてもよい。本明細書に開示されるＯ－ｍＲＮＡを設計する方法の任意のステップ（ｄ）は、これらの制約に基づく改変の拒絶を含んでもよく、これは、本明細書に開示されている確率分布に基づく許容又は拒絶に加えて含まれてもよい。配列制約は、（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)）（参照により組み込まれる）において開示されるようないずれかであってもよい。

【0110】

そのような制約の例として、実施形態において、ｍＲＮＡ配列上の１６Ｓ ｒＲＮＡ結合部位をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーが特定の閾値を上回る、例えば６ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える場合に、改変は拒絶される。代替的に又は追加的に、ロングレンジヌクレオチド相互作用の存在が定量化されてもよく、特定の条件が満たされない場合に改変は拒絶されてもよい。例えば、溶液中で塩基対を形成するヌクレオチドｉ及びｊの平衡確率がＰ＝｜ｉ－ｊ｜^{－１．４４}に比例していると考えられ、配列Ｓ中の各々の塩基対についてＰが算出される場合に、最小ｐが６×１０^－３未満である場合に改変は拒絶されてもよい。他の制約のいずれかの代替又は追加として含まれてもよい、制約の別の例として、リボソーム結合配列内の新たなＡＵＧ又はＧＵＧ開始コドンの作出は拒否されてもよく、そのため、前記コドンを導入する任意の改変は拒絶されてもよい。

【0111】

改変が確率分布に従って許容又は拒絶される本明細書に開示されるすべての実施形態において、代替として改変は単純に拒絶されてもよい。そのため、実施形態において、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変は拒絶される。これはまた、本明細書に開示されるさらなる実施形態に適用可能である。

【0112】

Ｏ－ｍＲＮＡ配列の生成は、最終配列が、許容された改変のすべての累積的な効果を含む出力であることを意味する。

【0113】

実施形態において、本発明の方法の第１のラウンドは、ランダムに生成された５’ＵＴＲを有する潜在的なｍＲＮＡ配列に対して行われる。５’ＵＴＲの長さは特に限定されない。方法の間に、５’ＵＴＲの長さは、挿入又は欠失改変に起因して増加又は減少されてもよい。特定の実施形態において、初期５’ＵＴＲは、３０～４０ヌクレオチド長、又は特に３５ヌクレオチドである。代替的に、５’ＵＴＲはより長くてもよいが、３０～４０、又は特に３５ヌクレオチドウィンドウが改変のために本発明の方法により考慮される。３５ヌクレオチドウィンドウは、開始コドンに最も近接した５’ＵＴＲの３５ヌクレオチドであってもよい。他の実施形態において、初期５’ＵＴＲは、より短い、例えば１５、２０、若しくは２５ヌクレオチドの５’ＵＴＲ、又はより長い、例えば少なくとも４０、５０、若しくは５１以上のヌクレオチドであってもよい。特定の長さの５’ＵＴＲを生成することが望ましいことがあり、その場合、出力配列の特定の長さが達成され得るように１５、２０、２５、３０、３５、４５、５０ヌクレオチドウィンドウが考慮されてもよい。

【0114】

ステップ（ａ）が適用される５’ＵＴＲは、野生型シャインダルガルノ配列、又は野生型シャインダルガルノ配列の５ヌクレオチドコアを含んでもよい。他の実施形態において、ステップ（ａ）が適用される５’ＵＴＲは、本明細書において議論されるように、直交性シャインダルガルノ配列を含んでもよい。５’ＵＴＲは、シャインダルガルノ配列以外はランダムな配列であってもよい。シャインダルガルノ配列は、最適なスペーシングであることが予測される、ＯＲＦの開始コドンからの５ヌクレオチドであってもよい。

【0115】

本発明の方法はΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）の予測を要求する。この値の予測方法は実施例セクションにおいて詳細に記載される。実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）は、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、ｍＲＮＡがＯ－リボソームに結合して、Ｏ－リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{ｏ－ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和である。

【0116】

実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）は、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－Ｏ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
のように算出されてもよく；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－Ｏ－ｒＲＮＡ}は、直交性１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及びｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}は、ＯＲＦの開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}は、シャインダルガルノ配列と開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}は、シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}は、ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである。

【0117】

特定の実施形態において、上記の値は、（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)）（参照により組み込まれる）において開示されるように算出される。例えば、ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}は、この刊行物の補足的方法のセクション３において開示されるように算出されてもよい。

【0118】

本発明の方法は反復されてもよく、その結果、複数の改変が許容又は拒絶のために考慮され、最終出力配列は、前記許容された改変のすべての累積的な効果を含む。特に、本発明の方法のステップ（ｂ）～（ｄ）は反復されてもよい。実施形態において、方法は、少なくとも２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、又は、特に、１００００回反復される。他の実施形態において、方法は、本明細書に開示されるように、連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復されてもよい。

【0119】

特定の実施形態において、Ｏ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップであって、５’ＵＴＲが野生型シャインダルガルノ配列を含む、ステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む改変を５’ＵＴＲ中に導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップであって；前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、ステップ；及び
（ｅ）ステップ（ｂ）～（ｄ）を少なくとも５００、１０００、５０００、又は、特に、１００００回反復し、次に
許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法が提供される。

【0120】

特定の実施形態において、Ｏ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップであって、５’ＵＴＲが野生型シャインダルガルノ配列を含む、ステップ；
（ｂ）ＯＲＦに最も近接した５’ＵＴＲの３５ヌクレオチドのいずれか１つにおいて単一のヌクレオチドの変化、挿入、又は欠失を含む改変を導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に

【数5】

に従って改変を許容又は拒絶するステップ；及び
（ｅ）ステップ（ｂ）～（ｄ）を少なくとも５００、１０００、５０００、又は、特に、１００００回反復し、次に
許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法が提供される。

【0121】

一部の実施形態において、本発明の方法は、Ｏ－リボソームによる翻訳の効率が増加され、第２のリボソーム（２^ｎｄ－リボソーム）による翻訳の効率が減少されるようにＯ－ｍＲＮＡを最適化することを含んでもよい。

【0122】

そのため、追加の実施形態において、本発明の方法は、第２のリボソーム（２^ｎｄ－リボソーム）も含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とＯ－ｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負であり、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；並びに
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法である。

【0123】

ステップ（ａ）の５’ＵＴＲ配列は、Ｏ－ｍＲＮＡの増加された翻訳が最適化されているＯ－リボソームのアンチシャインダルガルノ配列に完全に相補的であることが予測されるシャインダルガルノ配列を含んでもよい。このシャインダルガルノ配列は直交性シャインダルガルノ配列（Ｏ－ＳＤ）として参照される。ステップ（ａ）の５’ＵＴＲ配列はＯ－ＳＤの５ヌクレオチドコアを含んでもよい。実施形態において、Ｏ－ＳＤはＯＲＦの開始コドンからの５ヌクレオチドである。実施形態において、改変はＯ－ＳＤの５ヌクレオチドコア中に導入されない。例えば、Ｏ－ＳＤはＴＡＡＴＣＣＣＡＴであってもよく、改変はＴＣＣＣＡ中に導入されない。一部の実施形態において、改変はＯ－ＳＤ中に導入されない。他の実施形態において、５’ＵＴＲ配列は野生型シャインダルガルノ配列を含んでもよい。

【0124】

本発明の方法の第１のラウンドは、ランダムに生成された５’ＵＴＲを有する潜在的なｍＲＮＡ配列に対して行われてもよい。初期の長さ、最終の長さ、又は考慮されるヌクレオチドのウィンドウの長さは、本明細書に開示されるいずれかであってもよい。５’ＵＴＲは、シャインダルガルノ配列以外はランダムな配列であってもよい。シャインダルガルノ配列は、最適なスペーシングであることが予測される、ＯＲＦの開始コドンからの５ヌクレオチドであってもよい。

【0125】

２^ｎｄ－リボソームは野生型リボソーム（「ＷＴ－リボソーム）であってもよい。「ＷＴ－リボソーム」は、本明細書において使用される場合、対象となる宿主細胞内の内因性ｍＲＮＡを翻訳する能力を有し、Ｏ－ｍＲＮＡを翻訳する能力がより低いか、又は該能力を有しないリボソームである。例えば、ＷＴ－リボソームは、ｍＲＮＡのＲＢＳと相互作用するための野生型領域を含んでもよい。ＷＴ－リボソームの１６Ｓ ｒＲＮＡ（野生型１６Ｓ ｒＲＮＡとして参照される）は野生型配列を含んでもよい。特に、ＷＴ－リボソームは野生型アンチシャインダルガルノ配列を含んでもよい。特定の例において、ＷＴ－リボソームのすべての構成要素は野生型であってもよい。

【0126】

代替的に、２^ｎｄ－リボソームは別のＯ－リボソームであってもよい。例えば、２^ｎｄ－リボソームは、第１のリボソーム（すなわち、ｍＲＮＡの増加された翻訳が最適化されているリボソーム）の直交性アンチシャインダルガルノ配列とは異なる第２の直交性アンチシャインダルガルノ配列を含むＯ－リボソームであってもよい。第２のＯ－リボソームは、第１のリボソームにより効率的に翻訳されるＯ－ｍＲＮＡとは異なるＯ－ｍＲＮＡのセットを効率的に翻訳してもよい。

【0127】

ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）値の予測方法は、実施例セクションにおいて詳細に記載される。実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）は、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、ｍＲＮＡが２^ｎｄ－リボソームに結合して、２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{２ｎｄ－ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和である。

【0128】

実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）は、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－２ｎｄ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
のように算出されてもよく；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－２ｎｄ－ｒＲＮＡ}は、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及びｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}は、ＯＲＦの開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}は、シャインダルガルノ配列と開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}は、シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}は、ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである。

【0129】

上記の算出は、ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）について議論されたように行われてもよい。

【0130】

実施形態において、改変は、５’ＵＴＲ中に導入された単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む。

【0131】

改変は、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って許容又は拒絶される。「先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）」は上記に議論される通りであり、「先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）」は同じ方式において解釈されるべきである。確率分布は、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）とΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間の差異が増加するか、又はΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）とΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）との間の差異が増加するにつれて許容の可能性が減少する条件付き確率に基づいてもよい。確率はモンテ－カルロ最適化であってもよい。

【0132】

本発明の方法は反復されてもよく、その結果、複数の改変が許容又は拒絶のために考慮され、最終出力配列は、前記許容された改変のすべての累積的な効果を含む。特に、本発明の方法のステップ（ｂ）～（ｄ）は反復されてもよい。方法は、少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、又は１００００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）又はより正のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復されてもよい。代替的に、方法は、本明細書に開示されるように、設定された回数だけ反復されてもよい。

【0133】

特定の実施形態において、本発明の方法は、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とＯ－ｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測するステップであって、５’ＵＴＲがＯ－ＳＤを含む、ステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む改変を５’ＵＴＲ中に導入するステップであって、改変がＯ－ＳＤ ５ヌクレオチドコア中に導入されない、ステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負であり、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップであって；前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、ステップ；並びに
（ｅ）少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は、特に、５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）又はより正のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）につながらなくなるまでステップ（ｂ）～（ｄ）を反復し；
許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法である。

【0134】

特定の実施形態において、本発明の方法は、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）を算出するステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、又は欠失を含む改変を５’ＵＴＲ中に導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）を算出するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法である。

【0135】

一部の実施形態において、Ｘは、０．１～２の数、特に０．５である。他の例において、Ｘは、０．１～２、０．１５～１．５、０．２～１、０．２５～０．９、０．３～０．８、０．３５～０．７、０．４～０．６、０．４５～０．５５、又は０．５の数であってもよい。当業者が理解するように、重み付けが同じ結果のためにΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）に対して適用されてもよく、これは上記の式により包含される。重み付けは、特定の特性を優先させるように調整されてもよく、例えば、より高いＸは２^ｎｄ－リボソームによる翻訳の最小化を優先させる一方、より低いＸは第１のリボソーム（すなわち、Ｏ－ｍＲＮＡがそのために対象となるＯ－リボソーム）による翻訳の最大化を優先させる。

【0136】

改変は、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に許容される。「先行する」ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）は、改変がなされる前のｍＲＮＡ配列について予測されたΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）である。本明細書において議論されるように、本発明の方法は反復されてもよく、そのため、先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）は、先行する反復の間に算出されたΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）であってもよい。

【0137】

改変は、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に確率分布に従って許容又は拒絶される。「先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）」は上記に議論される通りである。確率分布は、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）とΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）との間の差異が増加するにつれて許容の可能性が減少する条件付き確率に基づいてもよい。確率はモンテ－カルロ最適化であってもよい。

【0138】

実施形態において、改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布は、以下である：

【数6】

【0139】

Ｔ_ＳＡは、本明細書に開示されている任意の方式において調整されてもよい。特定の実施形態において、Ｔ_ＳＡは、５～２０％の許容率を維持するように調整される。

【0140】

一部の実施形態において、改変は、本明細書において議論されるように、特定の配列制約が破られた場合に拒絶されてもよい。既に議論された制約に追加して、又はその代替として、改変は、第２のＯ－ＳＤ又は第２のＯ－ＳＤコアが配列中に導入された場合に拒絶されてもよい。これは、誤った部位からの開始を予防するためである。例えば、配列「ＴＣＣＣＡ」（Ｏ－ＳＤコアの例）が導入された場合、改変は拒絶されてもよい。

【0141】

本発明の方法は反復されてもよく、その結果、複数の改変が許容又は拒絶のために考慮され、最終出力配列は、前記許容された改変のすべての累積的な効果を含む。特に、本発明の方法のステップ（ｂ）～（ｄ）は反復されてもよい。方法は、少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、又は１００００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）につながらなくなるまで反復されてもよい。他の実施形態において、方法は、本明細書において議論されるように、設定された回数だけ反復されてもよい。

【0142】

特定の実施形態において、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）を算出するステップであって；５’ＵＴＲがＯ－ＳＤを含む、ステップ；
（ｂ）５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップであって、改変がＯ－ＳＤ ５ヌクレオチドコア中に導入されない、ステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）を算出するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップであって；前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、ステップ；並びに
（ｅ）少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は、特に、５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）につながらなくなるまでステップ（ｂ）～（ｄ）を反復し、次に
許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含み；
Ｘが、０．１～２の数、特に０．５である、方法が提供される。

【0143】

特定の実施形態において、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）を算出するステップであって；５’ＵＴＲがＯ－ＳＤを含む、ステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、又は欠失である改変を５’ＵＴＲ中に導入するステップであって、改変がＯ－ＳＤ ５ヌクレオチドコア中に導入されない、ステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）を算出するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に

【数7】

に従って改変を許容又は拒絶するステップ；
（ｅ）少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は、特に、５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）につながらなくなるまでステップ（ｂ）～（ｄ）を反復し、次に
許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含み；
Ｘが、０．１～２の数、特に０．５である、
方法が提供される。

【0144】

Ｏ－ｍＲＮＡを設計する方法は、第１のＯ－リボソームによる翻訳の効率が増加され、第２のＯ－リボソーム及びＷＴ－リボソームによる翻訳の効率が減少されるようにＯ－ｍＲＮＡを最適化することを含んでもよい。

【0145】

そのような方法は上記に開示される通りであり、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とリボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差は、リボソームの各々について予測される。議論されるように、この予測は、ｍＲＮＡ配列への改変の導入の前及び後になされる。２つより多くのリボソームを含む実施形態において、改変は、ΔＧ_ｔｏｔが、第１のリボソーム（すなわち、翻訳効率がそのために増加されるリボソーム）についてより負となり、他のリボソームについてより正となる場合に許容されてもよい。ΔＧ_ｔｏｔ値がすべて好都合に変更されない場合、改変は、本明細書に開示されるように確率分布に従って許容又は拒絶されてもよい。ΔＧ_ｔｏｔ値は、許容又は拒絶のために考慮される単一の値を形成するために組み合わせられてもよい。例えば、ΔＧ_ｔｏｔ値は、以下の式ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（１^ｓｔ－Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｙ＊ΔＧ_ｔｏｔ（ＷＴ－ｒｉｂｏ）－Ｚ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－Ｏ－ｒｉｂｏ）に従って組み合わせられてもよく、Ｘ、Ｙ、及びＺは重み付けである。これらの重み付けは、特定の特性（例えば、第１のＯ－リボソームによる翻訳の最適化又は第２のＯ－リボソームによる翻訳における減少）を優先させるように調整されてもよい。ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）は、本明細書に開示されるように許容又は拒絶のために考慮されてもよい。

【0146】

当業者に明らかなように、上記は、第１のＯ－リボソームによる翻訳の効率が増加され、２、３、４、又は５以上の他のリボソームによる翻訳の効率が減少されるように適合されてもよい。同じ又は異なる重み付けが、翻訳の効率がそのために減少されるリボソームの各々についてのΔＧ_ｔｏｔ値と関連付けられてもよい。ΔＧ_ｔｏｔ（１^ｓｔ－Ｏ－ｒｉｂｏ）もまた、重み付けと関連付けられてもよい。

【0147】

ＯＲＦ内のコドンを同義コドンで置き換えることは、Ｏ－ｍＲＮＡの向上につながり得ることを本発明者らはさらに同定した。同義コドンは、同じアミノ酸をコードするコドンであり、それゆえ、シノニムでのセンスコドンの置換えは、コードされるタンパク質の配列を変更しない。そのため、実施形態において、ステップ（ｂ）の改変は、ＯＲＦ内のコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、又は２～５のいずれか１つを同義コドンと交換することを含んでもよい。特定の実施形態において、ステップ（ｂ）の改変は、ＯＲＦ内のコドン２～１２のいずれか１つを同義コドンと交換することを含んでもよい。

【0148】

シノニムへのコドンの交換は、５’ＵＴＲ中への単一のヌクレオチドの変化、挿入、又は欠失の導入の代替であり得る。そのため、ステップ（ｂ）は、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失である改変を５’ＵＴＲ中に導入すること、又はＯＲＦ内のコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つ（特に２～１２）を同義コドンと交換することを含んでもよい。

【0149】

そのような実施形態において、生成されるＯ－ｍＲＮＡ配列は、許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含む。

【0150】

そのため、追加の実施形態において、本発明の方法は、Ｏ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とＯ－ｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む改変を５’ＵＴＲ中に導入するか、又はＯＲＦ内のコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；並びに
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法である。

【0151】

追加の実施形態において、本発明の方法は、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とＯ－ｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む改変を５’ＵＴＲ中に導入するか、又はＯＲＦ内のコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負であり、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；並びに
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法である。

【0152】

特定の実施形態において、本発明の方法は、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とＯ－ｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか若しくはそれを含む改変を５’ＵＴＲ中に導入するか、又はＯＲＦ内のコドン２～１２のいずれか１つを同義コドンと交換するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負であり、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップであって；前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）との間又は前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、ステップ；並びに
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法である。

【0153】

別の実施形態において、本発明の方法は、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）を算出するステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか若しくはそれを含む改変を５’ＵＴＲ中に導入するか、又はＯＲＦ内のコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）を算出するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法である。任意に、Ｘは本明細書に開示されている数である。例えば０．１～２又は、特に、０．５である。

【0154】

別の実施形態において、本発明の方法は、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）を算出するステップであって、５’ＵＴＲがＯ－ＳＤを含む、ステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失である改変を５’ＵＴＲ中に導入するステップであって、改変がＯ－ＳＤ ５ヌクレオチドコア中に導入されない、ステップ、又はＯＲＦ内のコドン２～１２のいずれか１つを同義コドンと交換するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）を算出するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップであって；前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）と前記ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）との間の差異の規模が許容の確率を決定し、より小さい規模が、より大きい規模と比較して許容のより高い可能性と関連付けられる、ステップ；並びに
（ｅ）少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は、特に、５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）につながらなくなるまでステップ（ｂ）～（ｄ）を反復し、次に
許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法である。任意に、Ｘは本明細書に開示されている数である。例えば０．１～２又は、特に、０．５である。

【0155】

さらに別の実施形態において、２^ｎｄ－リボソームも含む細胞中でのＯ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計する方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測し、ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡの２^ｎｄ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ））を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）を算出するステップであって、５’ＵＴＲがＯ－ＳＤを含む、ステップ；
（ｂ）単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失である改変を５’ＵＴＲ中に導入するステップであって、改変がＯ－ＳＤ ５ヌクレオチドコア中に導入されない、ステップ、又はＯＲＦ内のコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））及び新たなΔＧ_ｔｏｔ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）を予測し、式：ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－Ｘ＊ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（２^ｎｄ－ｒｉｂｏ）に従ってΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）を算出するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも正である場合に

【数8】

に従って改変を許容又は拒絶するステップ；
（ｅ）少なくとも１０、５０、１００、２５０、又は、特に、５００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）につながらなくなるまでステップ（ｂ）～（ｄ）を反復し、次に
許容された改変を含む５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を含む、方法が提供される。任意に、Ｘは本明細書に開示されている数である。例えば０．１～２又は、特に、０．５である。

【0156】

Ｏ－ｍＲＮＡを設計する方法のいずれも、増強された速度でＯ－リボソームにより翻訳されるようにＯ－ｍＲＮＡを最適化するため及び／又はより直交性となるようにＯ－ｍＲＮＡを最適化するために使用されてもよい。最適化された直交性は、Ｏ－リボソームによるＯ－ｍＲＮＡの翻訳効率と２^ｎｄ－リボソーム（例えばＷＴ－リボソーム又は第２のＯ－リボソーム）によるＯ－ｍＲＮＡの翻訳効率との間の差異が増加されるようなものであってもよい。これは、Ｏ－リボソームの存在下でＯ－ｍＲＮＡから産生されるタンパク質の収率を測定すること、及びそれを、２^ｎｄ－リボソームの存在下でＯ－ｍＲＮＡから産生されるタンパク質の収率で割ることにより算出されてもよい。

【0157】

Ｏ－ｍＲＮＡがＯ－リボソームの存在下にある場合に得られる収率は、最適化されていない配列からの産生と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、又は４０倍増加されてもよい。

【0158】

Ｏ－ｍＲＮＡの直交性は、最適化されていない配列の直交性と比較して少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、又は５０倍増加されてもよい。

【0159】

Ｏ－ｍＲＮＡを設計する方法のいずれも、前記Ｏ－ｍＲＮＡをコードする核酸分子を産生するステップをさらに含んでもよい。核酸はＤＮＡ配列であってもよく、対象となる宿主細胞への送達に好適なベクター中に含まれてもよい。そのため、前記Ｏ－ｍＲＮＡをコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。

【0160】

Ｏ－ｍＲＮＡを設計する方法のいずれも、Ｏ－ｍＲＮＡを実験的に検証するステップをさらに含んでもよい。そのような実施形態において、Ｏ－ｍＲＮＡからのコードされるタンパク質の収率は、最適化されていないｍＲＮＡ配列からのタンパク質の収率、又はＷＴ－ｍＲＮＡによりコードされＷＴ－リボソームにより翻訳される場合のタンパク質の収率と比較されてもよい。追加的に、又は代替的に、実験的検証は、本明細書において議論されるように、Ｏ－ｍＲＮＡの直交性を測定すること、及び任意に、それを最適化されていないｍＲＮＡの直交性と比較することを含んでもよい。

【0161】

Ｏ－ｍＲＮＡを設計する方法は、コンピューター上で行われてもよい。そのため、プロセッサー；及び本発明の方法を行うための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体を含む、システムが提供される。追加的に、コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、コンピューターシステムが本発明の方法を実行させるプログラムコードを保存する非一時的な機械可読媒体を含む、コンピュータープログラム製品もまた提供される。

【0162】

例えば、実施形態において、Ｏ－リボソームによる翻訳に好適なＯ－ｍＲＮＡであるｍＲＮＡを設計するコンピューターにより実行される方法であって、ｍＲＮＡが５’ＵＴＲ及びＯＲＦを含み、方法が、１又は２以上のプロセッサー上でプログラムコードを実行して、以下のステップ：
（ａ）ｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態とｍＲＮＡのＯ－リボソームに結合した開始適格状態との間の自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｂ）５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップ；
（ｃ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｄ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；及び
（ｅ）許容された改変を含む５’ＵＴＲを含むＯ－ｍＲＮＡ配列を生成するステップ
を実行することを含む、方法が提供される。この方法は、本明細書に開示される他の特色又は限定のいずれかを含んでもよい。

【0163】

上記に加えて、本発明者らは、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡを含むオペロンを設計する驚くべきほどに有効な方法をさらに提供する。本発明者らは、直交性ｔＲＮＡであってもよい別個のｔＲＮＡのコンパクトな、拡張可能な発現のためのオペロンの作出を自動化した。例として、本発明者らは、操作された三重に直交性のＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｐｙｌペア及びアルカエオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）チロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｆＴｙｒＲＳ）／ｔＲＮＡ^Ｔｙｒ由来ペアを発現するコンパクトなオペロンを開発し、オペロンは非常に有効であることを実証する。

【0164】

そのため、本発明の態様において、内因性ｔＲＮＡをコードする内因性ゲノムを含む宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計する方法であって、
（ｉ）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの配置の並べ替えを生成するステップ；
（ii）内因性ゲノム内で、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの各々の並べ替え内の外因性ｔＲＮＡの各々の隣接するペアに対して最も高いレベルの配列同一性を有する内因性ｔＲＮＡの隣接するペアを同定するステップ；
（iii）内因性ｔＲＮＡの同定された隣接するペアの各々の間の内因性ゲノム中の遺伝子間領域を同定するステップ；
（iv）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの各々の並べ替えをコードし、外因性ｔＲＮＡの各々の関連付けられた隣接するペアの間に位置付けられる同定された遺伝子間領域を含む複数の配列を生成するステップ；及び
（ｖ）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロン中に含めるための前記複数の配列からの配列を選択するステップ
を含む、方法が提供される。

【0165】

方法は、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、又は７以上の外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計するための方法であってもよい。しかしながら、外因性ｔＲＮＡの数は、本発明の方法が応用可能であるために特定の上限を有しない。

【0166】

結果的なオペロンは、第１及び第２の外因性ｔＲＮＡを含んでもよく、そのため、ステップ（ｉ）は、配置：ａ）第１及び次に第２のｔＲＮＡ並びにｂ）第２及び次に第１のｔＲＮＡを生成することを含んでもよい。他の実施形態は、第１、第２、及び第３の外因性ｔＲＮＡを含んでもよく、そのため、ステップ（ｉ）は、配置：ａ）第１、次に第２、次に第３のｔＲＮＡ、ｂ）第１、次に第３、次に第２のｔＲＮＡ、ｃ）第２、次に第１、次に第３のｔＲＮＡなどを生成することを含んでもよい。一部の実施形態において、すべての可能な並べ替えが生成される。

【0167】

上記の並べ替えの各々について、方法は次に、並べ替え内の外因性ｔＲＮＡの各々のペアを、オペロンがそのために対象となる宿主細胞の内因性ゲノム内の内因性ｔＲＮＡのペアと関連付けることを含む。関連付けは、隣接する外因性ｔＲＮＡペアに対して最も高いレベルの配列同一性を有する内因性ゲノム内の隣接するｔＲＮＡペアを同定することに基づいてなされる。例えば、並べ替えが「第１、次に第３、次に第２のｔＲＮＡ」である場合、第１及び第３のｔＲＮＡに対して最も高いレベルの配列同一性を有する内因性の隣接するｔＲＮＡペアが同定され、第３及び第２のｔＲＮＡに対して最も高いレベルの配列同一性を有する内因性の隣接するｔＲＮＡペアが同定される。

【0168】

配列同一性は、内因性ｔＲＮＡのアクセプターステム配列を外因性ｔＲＮＡのアクセプターステム配列と比較することにより決定されてもよい。特に、ｔＲＮＡの最初の７ヌクレオチド、及びＣＣＡ末端を含まない最後の８ヌクレオチドが比較されてもよい。

【0169】

ｔＲＮＡの内因性ペアの間の遺伝子間領域が同定される場合、方法は、考慮される最小及び／又は最大遺伝子間領域に関する限度を任意に設定してもよい。例えば、考慮される最小遺伝子間領域は、５、１０、１５、２０、又は２５塩基対であってもよい。特定の実施形態において、考慮される最小遺伝子間領域は１０塩基対である。考慮される最大遺伝子間領域は、５０、７５、１００、１２５、又は１５０塩基対であってもよい。特定の実施形態において、考慮される最大遺伝子間領域は１００塩基対である。１つの実施形態において、考慮される最小遺伝子間領域は１０塩基対であり、最大は１００塩基対である。

【0170】

外因性ｔＲＮＡの並べ替え及び遺伝子間配列をコードする複数の配列が次に生成されてもよい。例えば、配列の１つは、先行する例「第１、次に第３、次に第２のｔＲＮＡ」をコードすることができ、第１のｔＲＮＡと第３のｔＲＮＡとの間に、第１及び第３のｔＲＮＡに最も類似した内因性ｔＲＮＡのペアと関連付けられる遺伝子間配列があり、第３のｔＲＮＡと第２のｔＲＮＡとの間に、第３及び第２のｔＲＮＡに最も類似した内因性ｔＲＮＡのペアと関連付けられる遺伝子間配列がある。

【0171】

配列は次に、外因性ｔＲＮＡをコードするオペロン中に含めるために複数の配列から選択されてもよい。一部の実施形態において、複数の配列は、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡと、遺伝子間領域を定義するために使用される対応する内因性ｔＲＮＡとの間の配列同一性の和に基づいて順位付けされる。選択は次に、順位付けされたリストからなされてもよく、例えば、最も高い同一性の配列が選択されてもよい。

【0172】

ｔＲＮＡオペロンを設計する方法のステップが、先行するステップの出力に対して行われる場合を除いて、ステップの順序は限定されない。例えば、内因性ゲノム内の内因性ｔＲＮＡの隣接するペア及び遺伝子間領域は、本発明の方法が開始される前又は前記方法の間に同定されてもよい。内因性ゲノム内の内因性ｔＲＮＡの隣接するペア及び遺伝子間領域のリストは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に予め用意されてもよい。

【0173】

ｔＲＮＡオペロンを設計する方法は、第１のｔＲＮＡをコードする第１の配列及び第２のｔＲＮＡをコードする第２の配列、並びに対象となる宿主細胞に由来する遺伝子間配列を少なくとも含むオペロンを結果としてもたらす。

【0174】

一部の実施形態において、オペロンは他のＯＲＦを含んでもよい。ｔＲＮＡは、複数のｍＲＮＡが１つのプロモーターから生成され得るように他のＯＲＦを置くために使用されてもよい。そのような実施形態において、ｔＲＮＡオペロンを設計する方法は、これらのｔＲＮＡの隣接領域を最適化するために使用されてもよい。

【0175】

ｔＲＮＡオペロンを設計する方法のいずれも、前記ｔＲＮＡオペロンをコードする核酸分子を産生するステップをさらに含んでもよい。核酸はＤＮＡ配列であってもよく、対象となる宿主細胞への送達に好適なベクター中に含まれてもよい。そのため、前記ｔＲＮＡオペロンをコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。

【0176】

ｔＲＮＡオペロンを設計する方法のいずれも、ｔＲＮＡオペロンを実験的に検証するステップをさらに含んでもよい。そのような実施形態において、コードされるｔＲＮＡの収率は、オペロンが好適な宿主細胞中に挿入された場合に測定されてもよい。

【0177】

本発明の態様において、内因性ゲノムを含む宿主細胞であって、宿主細胞が、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡを含むオペロンをコードする核酸を含み、外因性ｔＲＮＡの各々のペアの間の核酸配列が、内因性ゲノムに由来する遺伝子間配列である、宿主細胞が提供される。オペロンは、本発明のｔＲＮＡオペロンを設計する方法により得られた又は得ることができるものであってもよい。そのため、遺伝子間配列は、外因性ｔＲＮＡに対して最も高い同一性を有する内因性ｔＲＮＡのペアの間からの遺伝子間配列である。宿主細胞はまた、遺伝子間配列が由来した内因性ｔＲＮＡを含んでもよい。他の実施形態において、１又は２以上の内因性ｔＲＮＡが宿主細胞から欠失する。

【0178】

ｔＲＮＡオペロンを設計する方法はコンピューター上で実行されてもよい。そのため、プロセッサー；及び本発明の方法を行うための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体を含む、システムが提供される。選択ステップは、手動で行われてもよいか、又は自動化されてもよい。追加的に、コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、コンピューターシステムが本発明の方法を実行させるプログラムコードを保存する非一時的な機械可読媒体を含む、コンピュータープログラム製品もまた提供される。

【0179】

そのため、内因性ｔＲＮＡをコードする内因性ゲノムを含む宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロンを設計するコンピューターにより実行される方法であって、１又は２以上のプロセッサー上でプログラムコードを実行して、以下のステップ：
（ｉ）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの配置の並べ替えを生成するステップ；
（ii）内因性ゲノム内で、少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの各々の並べ替え内の外因性ｔＲＮＡの各々の隣接するペアに対して最も高いレベルの配列同一性を有する内因性ｔＲＮＡの隣接するペアを同定するステップ；
（iii）内因性ｔＲＮＡの同定された隣接するペアの各々の間の内因性ゲノム中の遺伝子間領域を同定するステップ；及び
（iv）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡの各々の並べ替えをコードし、外因性ｔＲＮＡの各々の関連付けられた隣接するペアの間に位置付けられる同定された遺伝子間領域を含む複数の配列を生成するステップ；及び任意に
（ｖ）少なくとも２つの外因性ｔＲＮＡをコードするオペロン中に含めるための前記複数の配列からの配列を選択するステップ
を実行することを含む、方法が提供される。この方法は、本明細書に開示される他の特色又は限定のいずれかを含んでもよい。

【0180】

本発明者らは、宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性遺伝子をコードするポリシストロン性オペロンを設計する驚くべきほどに有効な方法をさらに提供する。本発明者らは、本明細書に記載される方法が、宿主細胞中での４つの外因性ａａＲＳの高発現を達成するために使用され得ることを実証する実験データを本明細書において提供する。

【0181】

そのため、本発明の態様において、宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法であって、
（ｉ）少なくとも２つの外因性ＯＲＦの各々のための複数の５’ＵＴＲ配列を生成するステップであって、各々の５’ＵＴＲ配列が、前記５’ＵＴＲ配列及び外因性ＯＲＦを含むｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態と、前記ｍＲＮＡのリボソームに結合した開始適格状態との間の負の予測される自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ））について最適化されている、ステップ；
（ii）前記５’ＵＴＲが最適化された外因性ＯＲＦに対して５’に位置付けられ、少なくとも２つの外因性ＯＲＦの残りの各々の外因性ＯＲＦに対して３’に位置付けられた場合の５’ＵＴＲ配列の各々についてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を予測するステップ；並びに
（iii）５’ＵＴＲ配列及び少なくとも２つの外因性ＯＲＦの配置を選択するステップ
を含む、方法が提供される。

【0182】

ステップ（ｉ）は、少なくとも２つの外因性ＯＲＦの各々のための２、３、４、５、又は６以上の５’ＵＴＲ配列を生成することを含んでもよい。一部の例において、６、７、８、９、１０、１５、２０又は２１以上の５’ＵＴＲ配列が生成される。特定の実施形態において、５つの５’ＵＴＲ配列が各々の外因性ＯＲＦのために生成される。例えば、オペロンが３つの外因性ＯＲＦを含む場合、各々の外因性ＯＲＦのための５つのセットである１５個の５’ＵＴＲ配列が生成されてもよい。

【0183】

各々の５’ＵＴＲ配列は、前記５’ＵＴＲ配列及び外因性ＯＲＦを含むｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態と、前記ｍＲＮＡのリボソームに結合した開始適格状態との間の負の予測される自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ））について最適化される。そのため、各々の５’ＵＴＲは、リボソームによる効率的な翻訳について最適化される。

【0184】

ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）の予測方法は実施例セクションにおいて詳細に記載される。実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）は、ｍＲＮＡをアンフォールディングさせるために要求される自由エネルギー（ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}）と、ｍＲＮＡがリボソームに結合して、リボソームに結合した開始適格状態を形成する際に放出される自由エネルギー（ΔＧ_{ｒｉｂｏ ｂｉｎｄｉｎｇ}）との和である。

【0185】

実施形態において、ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）は、以下：
ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）＝（ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}）＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}
に従って予測され；
ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}は、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ヌクレオチド及びｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}は、外因性ＯＲＦをコードする配列の開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}は、シャインダルガルノ配列と外因性ＯＲＦをコードする配列の開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーであり；
ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}は、シャインダルガルノ配列の上流の４ヌクレオチドを隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーであり；
ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}は、ｍＲＮＡ中の二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである。

【0186】

さらなる情報がＯ－ｍＲＮＡ最適化に関して提供される。

【0187】

リボソームによる効率的な翻訳のために５’ＵＴＲを最適化する方法は、
（ａ）５’ＵＴＲ中に改変を導入するステップ；
（ｂ）改変後の新たなΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）（ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ））を予測するステップ；
（ｃ）前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変を許容し、
前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って改変を許容又は拒絶するステップ；及び
（ｄ）許容された改変を含む５’ＵＴＲ配列を生成するステップ
を含んでもよい。

【0188】

方法は、Ｏ－ｍＲＮＡ最適化に関して記載される通りであってもよい。

【0189】

本発明の方法の間に、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも負である場合に改変は許容される。「先行する」ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）は、改変がなされる前に予測されたΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）である。本明細書において議論されるように、本発明の方法は反復されてもよく、そのため、先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）は、先行する反復の間に算出されたΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）であってもよい。

【0190】

本発明の方法の間の改変の許容は、改変により導入された配列変更が、方法の次の反復のために維持されるか、又は、方法のさらなる反復がない場合、方法の出力である配列において維持されることを意味する。

【0191】

本発明の方法の間に、改変は、前記ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）が先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも正である場合に確率分布に従って許容又は拒絶される。「先行するΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）」は上記に議論される通りである。確率分布は、ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）とΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）との間の差異が増加するにつれて許容の可能性が減少する条件付き確率に基づいてもよい。確率はモンテ－カルロ最適化であってもよい。

【0192】

実施形態において、改変がそれに従って許容又は拒絶される確率分布は、

【数9】

であり、Ｔ_ＳＡはシミュレートされたアニーリング温度である。

【0193】

Ｔ_ＳＡは、本明細書に開示されている任意の方式において調整されてもよい。特定の実施形態において、Ｔ_ＳＡは、５～２０％の許容率を維持するように調整される。

【0194】

本発明の方法の間の改変の拒絶は、改変により導入された配列変更が、元に戻され、そのため方法の次の反復のために維持されないか、又は出力配列において維持されないことを意味する。

【0195】

実施形態において、改変は、単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失であるか又はそれを含む。別の実施形態において、改変は、５’ＵＴＲ中に導入されるか、又は外因性ＯＲＦをコードする配列内でコドン２～２０、２～１５、２～１２、２～１０、若しくは２～５のいずれか１つを同義コドンと交換することである。特定の実施形態において、改変は、５’ＵＴＲ中への単一のヌクレオチドの変化、挿入、若しくは欠失、又はＯＲＦ内のコドン２～１２のいずれか１つを同義コドンと交換することを含む。

【0196】

少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法は反復されてもよく、その結果、複数の改変が許容又は拒絶のために考慮され、最終出力配列は、前記許容された改変のすべての累積的な効果を含む。反復は、本明細書に開示されているいずれかであってもよい。特に、本発明の方法のステップ（ａ）～（ｃ）は反復されてもよい。実施形態において、方法は、少なくとも２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、又は、特に、１００００回反復される。他の実施形態において、方法は、本明細書に開示されるように、連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復されてもよい。例えば、ステップ（ａ）～（ｃ）は、少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、又は１００００回の連続する反復がより負のΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｒｉｂｏ）につながらなくなるまで反復されてもよい。

【0197】

最適化のために考慮される初期５’ＵＴＲは、Ｏ－ｍＲＮＡ最適化に関して記載されるような長さ及び特性を有してもよい。特に、初期５’ＵＴＲは、３０～４０ヌクレオチド長、又は特に３５ヌクレオチドであってもよい。代替的に、５’ＵＴＲはより長くてもよいが、３０～４０、又は特に３５ヌクレオチドウィンドウが改変のために本発明の方法により考慮される。３５ヌクレオチドウィンドウは、開始コドンに最も近接した５’ＵＴＲの３５ヌクレオチドであってもよい。他の実施形態において、初期５’ＵＴＲは、より短い、例えば１５、２０、若しくは２５ヌクレオチドの５’ＵＴＲ、又はより長い、例えば少なくとも４０、５０、若しくは５１以上のヌクレオチドであってもよい。特定の長さの５’ＵＴＲを生成することが望ましいことがあり、その場合、出力配列の特定の長さが達成され得るように１５、２０、２５、３０、３５、４５、５０ヌクレオチドウィンドウが考慮されてもよい。ステップ（ａ）が適用される５’ＵＴＲは、野生型シャインダルガルノ配列、又は野生型シャインダルガルノ配列の５ヌクレオチドコアを含んでもよい。５’ＵＴＲは、シャインダルガルノ配列以外はランダムな配列であってもよい。シャインダルガルノ配列は、最適なスペーシングであることが予測される、ＯＲＦの開始コドンからの５ヌクレオチドであってもよい。

【0198】

少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法は、外因性ＯＲＦの特有の数に限定されない。例えば、方法は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計するために使用されてもよい。

【0199】

少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法は、外因性ＯＲＦの特定のタイプとの使用に限定されない。本明細書において提供される実験データは、ａａＲＳをコードする複数の配列を含むオペロンのための原理の証明を提供する。そのため、実施形態において、外因性ＯＲＦのうちの少なくとも１つはａａＲＳをコードする。別の実施形態において、方法は、少なくとも２、３、４、５、又は６つのａａＲＳをコードするポリシストロン性オペロンを設計するための方法であってもよい。

【0200】

ポリシストロン性オペロンを設計する方法のステップ（ii）は、前記５’ＵＴＲが最適化された外因性ＯＲＦに対して５’に位置付けられ、少なくとも２つの外因性ＯＲＦの残りの各々の外因性ＯＲＦに対して３’に位置付けられた場合の５’ＵＴＲ配列の各々についてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を予測することを含む（図７、補足図３を参照）。そのため、外因性ＯＲＦのうちの１つの翻訳について最適化された５’ＵＴＲは次に、他の外因性ＯＲＦのうちの１つの３’に位置付けられている文脈において考慮され、翻訳効率が再び測定される。これは、他の外因性ＯＲＦの各々について行われる。例えば、オペロンが３つの外因性ＯＲＦを有する実施形態において、第１の外因性ＯＲＦについて最適化された特定の５’ＵＴＲは、第２の外因性ＯＲＦの３’に配置されている場合に、及び別々に、第３の外因性ＯＲＦの３’に配置されている場合に考慮される。

【0201】

ポリシストロン性オペロンを設計する方法のステップ（iii）は、５’ＵＴＲ配列及び少なくとも２つの外因性ＯＲＦの配置の選択を含む。選択される配置は、各々の外因性ＯＲＦが高いレベルで翻訳されることが予測されるように選択されてもよい。例えば、オペロン内の各々の５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアについてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）が予測され、加えられてもよく、最も負の累積的なΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を有する配置が選択されてもよい。他の実施形態において、オペロン内のすべての５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアについての最も負の平均ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を有する配置が選択されてもよい。平均は平均値（mean）であってもよい。追加的に、各々の５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアが標的ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも負のΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を有する配置が選択されてもよい。標的は、宿主細胞内での各々の外因性ＯＲＦの産物の特定の収率を確実にするために選択されてもよい。例えば、標的は、タンパク質生成物がその機能を達成するために十分なレベルで外因性ＯＲＦが翻訳されることを確実にするレベルであってもよい。例えば、外因性ＯＲＦがａａＲＳをコードする場合、標的ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）は、十分なａａＲＳタンパク質が、所望される宿主細胞中で産生されて、ａａＲＳがタンパク質合成の間にそのコグネイトｔＲＮＡと共に機能することを確実にするようなものであってもよい。

【0202】

特定の実施形態において、ステップ（iii）は、オペロン内のすべての５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアについての最も負の平均ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を有する配置の選択を含み、各々の５’ＵＴＲ／外因性ＯＲＦペアは、標的ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）よりも負のΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を有する。

【0203】

外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計する方法のいずれも、前記オペロンをコードする核酸分子を産生するステップをさらに含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ配列であってもよく、対象となる宿主細胞への送達に好適なベクター中に含まれてもよい。

【0204】

外因性ＯＲＦをコードするオペロンを設計する方法のいずれも、オペロンを実験的に検証するステップをさらに含んでもよい。そのような実施形態において、コードされるタンパク質の収率は、オペロンが好適な宿主細胞中に挿入された場合に測定されてもよい。実験的検証は、５’ＵＴＲ配列及び少なくとも２つの外因性ＯＲＦの配置を選択することの部分を形成してもよい。

【0205】

本発明の態様において、少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンをコードする核酸を含む、宿主細胞であって、オペロンが、本明細書に開示されるオペロンを設計する方法により得られた又は得ることができる、宿主細胞が提供される。

【0206】

少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むポリシストロン性オペロンを設計する方法はコンピューター上で実行されてもよい。一部の実施形態において、ステップ（iii）は手動で行われてもよい。そのため、プロセッサー；及び本発明の方法を行うための前記プロセッサー上の実行のための命令が記憶された１又は２以上のコンピューター可読ストレージ媒体を含む、システムが提供される。追加的に、コンピューターシステムの１又は２以上のプロセッサーにより実行された場合に、コンピューターシステムが本発明の方法を実行させるプログラムコードを保存する非一時的な機械可読媒体を含む、コンピュータープログラム製品もまた提供される。

【0207】

そのため、宿主細胞中での発現のための少なくとも２つの外因性ＯＲＦを含むオペロンを設計するコンピューターにより実行される方法であって、１又は２以上のプロセッサー上でプログラムコードを実行して、以下のステップ：
（ｉ）少なくとも２つの外因性ＯＲＦの各々のための複数の５’ＵＴＲ配列を生成するステップであって、各々の５’ＵＴＲ配列が、前記５’ＵＴＲ配列及び外因性ＯＲＦを含むｍＲＮＡの自由にフォールディングした状態と、前記ｍＲＮＡのリボソームに結合した開始適格状態との間の負の予測される自由エネルギー差（ΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ））について最適化されている、ステップ；
（ii）前記５’ＵＴＲが最適化された外因性ＯＲＦに対して５’に位置付けられ、少なくとも２つの外因性ＯＲＦの残りの各々の外因性ＯＲＦに対して３’に位置付けられた場合の５’ＵＴＲ配列の各々についてのΔＧ_ｔｏｔ（ｒｉｂｏ）を予測するステップ；並びに任意に
（iii）５’ＵＴＲ配列及び少なくとも２つの外因性ＯＲＦの配置を選択するステップ
を実行することを含む、方法が提供される。この方法は、本明細書に開示される他の特色又は限定のいずれかを含んでもよい。

【0208】

本発明者らは、上記の進歩のすべてを組み合わせて、６８コドン、２４アミノ酸の遺伝コードを作出すること、及び、Ｏ－ｍＲＮＡのＯ－リボソーム媒介性翻訳を介して、４つの別個の直交性コドンに応答して４つの別個のｎｃＡＡを効率的に組み込むことに成功した。実施例セクションにおいて議論されるように、本発明者らは、初めて、２０個の標準アミノ酸及び４個の非標準アミノ酸を含むタンパク質を生成するためにこのシステムを使用する。

【0209】

そのため、本発明の態様において、宿主細胞であって、
外因性タンパク質をコードするＯ－ｍＲＮＡをコードする核酸配列であって、Ｏ－ｍＲＮＡが、本発明のＯ－ｍＲＮＡを設計する任意の方法により得られた又は得ることができ、Ｏ－ｍＲＮＡが少なくとも２つのタイプの直交性コドンを含む、核酸配列；
少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡをコードするＯ－ｔＲＮＡオペロンを含む核酸配列であって、少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡが、前記少なくとも２つのタイプの直交性コドンをデコードする能力を有し、オペロンが、本発明のｔＲＮＡオペロンを設計する任意の方法により得られた又は得ることができる、核酸配列；
少なくとも２つのＯ－ａａＲＳオペロンをコードする直交性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ－ａａＲＳ）を含む核酸配列であって、少なくとも２つのＯ－ａａＲＳが、少なくとも２つの直交性ｔＲＮＡとＯ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを形成し、オペロンが、本発明のｔＲＮＡオペロンを設計する任意の方法により得られた又は得ることができる、核酸配列；及び
直交性リボソーム
を含む、宿主細胞が提供される。

【0210】

実施形態において、Ｏ－ｔＲＮＡ及びＯ－ａａＲＳオペロンは、同じ核酸配列内に存在する。例えば、これらの２つのオペロンは、単一のベクターを介して宿主細胞中に導入されていてもよい。

【0211】

Ｏ－ｍＲＮＡによりコードされる外因性タンパク質は、産生が所望される任意のタンパク質であってもよい。例えば、外因性タンパク質は、治療用タンパク質、例えば抗体又はサイトカインであってもよい。

【0212】

宿主細胞は、少なくとも２つのＯ－ａａＲＳ及び少なくとも２つのＯ－ｔＲＮＡを含む。これらはペアにおいて機能し、すなわち、それらは第１のａａＲＳ／ｔＲＮＡペア及び第２のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアを形成する。１つのペアは、直交性コドンのタイプのうちの１つをデコードする能力を有し、他のペアは、直交性コドンの他のタイプをデコードする能力を有する。両方のペアは、Ｏ－リボソームと共に機能する能力を有する。

【0213】

他の実施形態において、本発明の宿主細胞は、少なくとも第３及び任意に少なくとも第４のＯ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを含む。そのような実施形態において、Ｏ－ｍＲＮＡは、少なくとも第３及び任意に少なくとも第４のタイプの直交性コドンを含んでもよい。第３のａａＲＳ－ｔＲＮＡペアは、第３のタイプの直交性コドンをデコードする能力を有し、第４のａａＲＳ－ｔＲＮＡペアは、第４のタイプの直交性コドンをデコードする能力を有する。Ｏ－ａａＲＳ、Ｏ－ｔＲＮＡ、及び直交性コドンのさらなるセットが含まれてもよい。すべての直交性構成要素は、Ｏ－リボソームと共に機能する能力を有する。

【0214】

Ｏ－ａａＲＳは、内因性ｔＲＮＡを認識せず、細胞に提供される（又は細胞により合成される）非標準アミノ酸を用いて直交性コグネイトｔＲＮＡ（内因性シンテターゼのための効率的な基質ではない）を特異的にアミノアシル化する（Chin, J.W. Expanding and reprogramming the genetic code. Nature 550, 53-60 (2017)）。

【0215】

Ｏ－リボソームは、本明細書に開示されるいずれかであってもよい。特に、Ｏ－リボソームは、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１、国際公開第２００８／０６５３９８Ａ１号パンフレットにおいて開示されているか若しくは該文献において開示されている方法により得ることが可能である任意のＯ－リボソーム、国際公開第２０１１／０７７０７５Ａ１号パンフレットにおいて開示されているか若しくは該文献において開示されている方法により得ることが可能である任意のＯ－リボソーム、又は（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)；Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770-777 (2007)；若しくはSchmied, W.H. et al. Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)）のいずれかにおいて開示されているか若しくは該文献において開示されている方法により得ることが可能である任意のＯ－リボソームであってもよい。

【0216】

本明細書において使用されるアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼは様々であってもよい。特有のｔＲＮＡシンテターゼ配列が実施例において使用されている場合があるが、本発明は、それらの実施例のみに限定されることは意図されない。原理的に、ｔＲＮＡを荷電させる（アミノアシル化）機能を提供し、Ｏ－リボソームと共に機能する任意のアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼが用いられ得る。例えば、ｔＲＮＡシンテターゼは、任意の好適な種、例えば古細菌、例えばメタノサルシナ（Methanosarcina）、例えばメタノサルシナ・バルケリ（Alethanosarcina barkeri）ＭＳ；メタノサルシナ・バルケリＦｕｓａｒｏ株；メタノサルシナ・マゼイＧ０１；メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）Ｃ２Ａ；メタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）；又はメタノコッコイデス（Methanococcoides）、例えばメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）からのものであってもよい。代替的に、ｔＲＮＡシンテターゼは、細菌、例えばデスルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、例えばデスルフィトバクテリウム・ハフニエンセＤＣＢ－２；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンセＹ５１；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンセＰＣＰ１；又はデスルフォトマクラム・アセトキシダンス（Desulfotomaculum acetoxidans）ＤＳＭ ７７１からのものであってもよい。

【0217】

アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼはピロリシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｙｌＲＳ）であってもよい。ＰｙｌＲＳは、野生型又は遺伝子操作されたＰｙｌＲＳであってもよい。遺伝子操作されたＰｙｌＲＳは、例えば、Neumann et al. (Nat Chem Biol 4:232, 2008)及びYanagisawa et al. (Chem Biol 2008, 15:1187)、欧州特許出願公開第２１９２１８５Ａ１号明細書、及び国際公開第２０１６／０６６９９５号パンフレット（各々は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。好適には、非標準アミノ酸の組込み効率を増加させる遺伝子操作されたｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子が選択される。ＰｙｌＲＳはメタノサルシナ・バルケリ（ＭｂＰｙｌＲＳ）又はメタノサルシナ・マゼイ（ＭｍＰｙｌＲＳ）であってもよい。

【0218】

本明細書において使用されるｔＲＮＡは様々であってもよい。特有のｔＲＮＡが実施例において使用されている場合があるが、本発明は、それらの実施例のみに限定されることは意図されない。原理的に、選択されたｔＲＮＡシンテターゼ及びＯ－リボソームと適合性である限り、任意のｔＲＮＡが使用され得る。

【0219】

ｔＲＮＡは、任意の好適な種、例えば古細菌、例えばメタノサルシナ、例えばメタノサルシナ・バルケリＭＳ；メタノサルシナ・バルケリＦｕｓａｒｏ株；メタノサルシナ・マゼイＧ０１；メタノサルシナ・アセチボランスＣ２Ａ；メタノサルシナ・サーモフィラ；又はメタノコッコイデス、例えばメタノコッコイデス・ブルトニイからのものであってもよい。代替的に、ｔＲＮＡは、細菌、例えばデスルフィトバクテリウム、例えばデスルフィトバクテリウム・ハフニエンセＤＣＢ－２；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンセＹ５１；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンセＰＣＰ１；又はデスルフォトマクラム・アセトキシダンスＤＳＭ ７７１からのものであってもよい。

【0220】

ｔＲＮＡ遺伝子は野生型ｔＲＮＡ遺伝子であることができるか、又は変異型ｔＲＮＡ遺伝子であってもよい。好適には、非天然アミノ酸の組込み効率を増加させる変異型ｔＲＮＡ遺伝子が選択される。１つの実施形態において、変異型ｔＲＮＡ遺伝子は、Biochemistry (2013) 52, 10（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＰｙｌＴのＵ２５Ｃバリアントである。

【0221】

１つの実施形態において、変異型ｔＲＮＡ遺伝子は、Fan et al. (Nucleic Acids Research doi:10.1093/nar/gkv800)（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＰｙｌＴのＯｐｔバリアントである。

【0222】

１つの実施形態において、変異型ｔＲＮＡ遺伝子は、ＰｙｌＴのＵ２５Ｃバリアント及びＯｐｔバリアントの両方を有し、すなわちこの実施形態において、ｔＲＮＡ、例えばＰｙｌＴ ｔＲＮＡ_ＣＵＡ遺伝子は、Ｕ２５Ｃ変異及びＯｐｔ変異の両方を含む。

【0223】

１つの実施形態において、ｔＲＮＡをコードする配列は、ｔＲＮＡＰｙｌをコードするメタノサルシナ・マゼイピロリシンからのピロリシンｔＲＮＡ（ＰｙｌＴ）遺伝子である。

【0224】

アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡペアは、（Cervettini, D. et al. Rapid discovery and evolution of orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase-tRNA pairs. Nat. Biotechnol. 38, 989-999 (2020)）又は（Dunkelmann, D.L., Willis, J.C.W., Beattie, A.T. & Chin, J.W. Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non canonical amino acids. Nat. Chem. 12, 535-544 (2020)）において開示されているか、又は開示されているものから適合されたものであってもよい。これらの文献の各々は参照により組み込まれる。

【0225】

ａａＲＳ、ｔＲＮＡ、及びコドンセットは、好ましくは、一緒に機能し、各々の内因性アミノ酸、ａａＲＳ及びイソアクセプターｔＲＮＡの基及びコドンのそれらのコグネイト基に対して直交性である。

【0226】

直交性コドンのうちの少なくとも１つはクアドルプレットコドンであってもよい。直交性コドンのうちの少なくとも１つは、終止コドン、例えばアンバーコドンであってもよい。直交性コドンのうちの少なくとも１つは、ゲノム再コードされた原核細胞における再割り当てされたセンスコドンであってもよい（国際公開第２０２０／２２９５９２号パンフレット；又はRobertson et al.; Sense codon reassignment enables viral resistance and encoded polymer synthesis; Science; 2021; Vol. 372, Issue 6546, pp. 1057-1062を参照）。特定の実施形態において、直交性コドンのすべてはクアドルプレットコドンであってもよい。特定の実施形態において、Ｏ－ｍＲＮＡは、第１、第２、第３、及び第４のタイプの直交性コドンを含み、これらの各々はクアドルプレットコドンである。

【0227】

宿主細胞は原核細胞であってもよい。宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌であってもよい。宿主細胞は、２０個すべての標準アミノ酸及び少なくとも４個の非標準アミノ酸を含むタンパク質を産生する能力を有してもよい。

【0228】

直交性ｔＲＮＡシンテターゼの基質は任意の非標準アミノ酸であってもよい。それゆえ、本発明の細胞は、少なくとも第１の非標準アミノ酸、少なくとも第２の非標準アミノ酸、少なくとも第３の非標準アミノ酸、及び少なくとも第４の非標準アミノ酸を含むポリペプチドを生成するために使用されてもよい。

【0229】

そのため、本発明の別の態様において、ポリペプチドを産生する方法であって、
本発明の宿主細胞を用意するステップ；
第１の非標準アミノ酸の存在下で宿主細胞をインキュベートするステップであって、第１の非標準アミノ酸がＯ－ａａＲＳのうちの１つの基質である、ステップ；及び
宿主細胞をインキュベートして、Ｏ－ａａＲＳ － Ｏ－ｔＲＮＡペアを介するポリペプチド中への第１の非標準アミノ酸の組込みを可能とするステップ
を含む、方法が提供される。

【0230】

議論されるように、宿主細胞は、第１、第２、第３、及び第４の直交性ａａＲＳ－ｔＲＮＡペアを含んでもよい。第１のペアは、第１のタイプのコドンをデコードして第１の非標準アミノ酸を組み込む能力を有し、第２のペアは、第２のタイプのコドンをデコードして第２の非標準アミノ酸を組み込む能力を有し、第３のペアは、第３のタイプのコドンをデコードして第３の非標準アミノ酸を組み込む能力を有し、第４のペアは、第４のタイプのコドンをデコードして第４の非標準アミノ酸を組み込む能力を有する。

【0231】

本明細書において使用される場合、用語「非標準アミノ酸」は、Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－フェニルアラニン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－プロリン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－トリプトファン、及びＬ－チロシンを除く任意のアミノ酸を意味する。

【0232】

非標準アミノ酸は非天然アミノ酸であってもよい。本明細書において使用される場合、「非天然アミノ酸」は、天然にコードされることも遺伝コード中に見出されることもない任意のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は非タンパク質構成性アミノ酸であってもよい。そのため、非天然アミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－フェニルアラニン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－プロリン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－チロシン、Ｌ－ピロリシン、及びＬ－セレノシステインを除く任意のアミノ酸であってもよい。

【0233】

本発明と共に使用するのに好適な非標準アミノ酸は特に限定されない。好適な非標準アミノ酸は当業者に周知であり、例えばNeumann, H., 2012. FEBS letters, 586(15), pp.2057-2064；及びLiu, C.C. and Schultz, P.G., 2010. Annual review of biochemistry, 79, pp.413-444（参照により本明細書に組み込まれる）において開示されているものがある。一部の実施形態において、非標準アミノ酸は、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、フェニルセレノシステイン、セレノシステイン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－アジドフェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、Ｏ－メチルチロシン、ｐ－アミノフェニルアラニン、ｐ－シアノフェニルアラニン、ｍ－シアノフェニルアラニン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、ｐ－ヨードフェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－ニトロフェニルアラニン、Ｌ－ＤＯＰＡ、３－アミノチロシン、３－ヨードチロシン、ｐ－イソプロピルフェニルアラニン、３－（２－ナフチル）アラニン、ビフェニルアラニン、ホモグルタミン、Ｄ－チロシン、ｐ－ヒドロキシフェニル乳酸、２－アミノカプリル酸、ビピリジルアラニン、ＨＱ－アラニン、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン、ｏ－ニトロベンジルシステイン、ｏ－ニトロベンジルセリン、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジルセリン、ｏ－ニトロベンジルリジン、ｏ－ニトロベンジルチロシン、２－ニトロフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ｐ－カルボキシメチルフェニルアラニン、３－ニトロチロシン、スルホチロシン、アセチルリジン、メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、ピロリシン、Ｃｂｚ－リジン、Ｂｏｃ－リジン、アリルオキシカルボニルリジン、Ｎ^ε－（（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＢｏｃＫ）、Ｎε－（カルボベンジルオキシ）－Ｌ－リジン（ＣｂｚＫ）、Ｎ^ε－アリルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ＡｌｌｏｃＫ）、（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヨードフェニル）プロパン酸（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）、ＣｙｐＫ、ＡｌｋＫ、３－ニトロ－Ｔｙｒ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅのうちの１又は２以上から選択される。第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸は、上述の非標準アミノ酸の任意の組合せであってもよい。

【0234】

特定の実施形態において、非標準アミノ酸は、ＢｏｃＫ、ＣｂｚＫ、ＡｌｌｏｃＫ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｙｐＫ、ＡｌｋＫ、３－ニトロ－Ｔｙｒ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅの任意の組合せであってもよい。

【0235】

本発明の宿主細胞は、任意の他の方法では得ることが可能でない産物を生成するために使用され得る。そのため、本発明の態様において、本明細書に開示される方法により得られた又は得ることができる、少なくとも４つの遺伝子的に組み込まれた非標準アミノ酸を含有するポリペプチド又はタンパク質が提供される。

【0236】

配列比較は、容易に利用可能な配列比較プログラムの補助と共に実行され得る。これらの公的に及び商業的に利用可能なコンピュータープログラムは、２又は３以上の配列の間の配列同一性を算出することができる。

【0237】

当業者は、２つの核酸配列の間の同一性パーセンテージを算出する方法を理解する。２つの核酸配列の間の同一性パーセンテージを算出するために、２つの配列のアライメントが最初に用意されなければならず、続いて配列同一性の値が算出される。２つの配列についての同一性パーセンテージは、（ｉ）配列をアライメントするために使用される方法、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）若しくはＳｔｒｅｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）により適用されるもの、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えばＷａｔｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）により適用されるもの））、又はＬＡＬＩＧＮ適用（例えばＭａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）により適用されるもの；並びに（ii）アライメント方法、例えば、局所対大域アライメントにより使用されるパラメーター、使用されるマトリックス、及びギャップに適用されるパラメーターに依存して、異なる値を取ってもよい。

【0238】

アライメントがなされたら、２つの配列の間の同一性パーセンテージを算出する多くの異なる仕方がある。例えば、同一性の数を、（ｉ）最短の配列の長さ；（ii）アライメントの長さ；（iii）配列の平均の長さ；（iv）非ギャップ位置の数；又は（iv）オーバーハングを除く同等の位置の数で割ってもよい。さらには、同一性パーセンテージは強く長さ依存的であることもまた理解される。したがって、配列のペアがより短くなればなるほど、偶然に起こることが予想され得る配列同一性はより高くなる。

【0239】

２つの核酸配列の間の同一性パーセンテージの算出は次に、そのようなアライメントから（Ｎ／Ｔ）＊１００（ここで、Ｎは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除く比較される位置の総数である）として算出されてもよい。

【0240】

配列アライメントはペアワイズの配列アライメントであってもよい。好適なサービスは、Ｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、Ｗａｔｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、Ｍａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、ＬＡＬＩＧＮ、又はＧｅｎｅＷｉｓｅを含む。例において、２つのアミノ酸配列の間の同一性は、デフォルトのパラメーター、例えばマトリックス（ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップオープン（１０）、ギャップ伸長（０．５）、末端ギャップペナルティー（偽）、末端ギャップオープン（１０）、及び末端ギャップ伸長（０．５）に設定されたサービスＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）を使用して算出されてもよい。別の例において、２つのアミノ酸配列の間の同一性は、デフォルトのパラメーター、例えばマトリックス（ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップオープン（１４）、ギャップ伸長（４）、選択的マッチ（１）に設定されたサービスＭａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）を使用して算出されてもよい。例において、２つの核酸配列の間の同一性は、デフォルトのパラメーター、例えばマトリックス（ＤＮＡｆｕｌｌ）、ギャップオープン（１０）、ギャップ伸長（０．５）、末端ギャップペナルティー（偽）、末端ギャップオープン（１０）、及び末端ギャップ伸長（０．５）に設定されたサービスＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）を使用して算出されてもよい。別の例において、２つの核酸配列の間の同一性は、デフォルトのパラメーター、例えばマトリックス（ＤＮＡｆｕｌｌ）、ギャップオープン（１６）、ギャップ伸長（４）、選択的マッチ（１）に設定されたサービスＭａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）を使用して算出されてもよい。

【0241】

本明細書（任意の付随する特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）に記載される特色のすべて、並びに／又はそこで開示される任意の方法若しくはプロセスのステップのすべては、そのような特色及び／又はステップの少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せで上記の態様のいずれかと組み合わせられてもよい。

【0242】

本発明のより良好な理解のために、及びその実施形態がどのように実行され得るのかを示すために、これより実施例が参照され、実施例はいかなるようにも本発明を限定することは意図されない。
［実施例］

【0243】

本発明者らは、自動化された直交性ｍＲＮＡの発見により可能にされる、４つの別個の非標準アミノ酸の組込みのための６８コドン遺伝コードを実証する。

【0244】

Ｏ－ｍＲＮＡの直交性（Ｏ－）リボソーム媒介性翻訳は、大腸菌中でタンパク質への最大３つの別個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）の組込みを可能にする。しかしながら、Ｏ－リボソームによる複数の別個のｎｃＡＡの一般的な及び効率的な組込みは、効率的に及び特異的に翻訳されるＯ－ｍＲＮＡの作出、並びに複数のＯ－アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ－ａａＲＳ）／Ｏ－ｔＲＮＡペアのコンパクトな発現の両方のための拡張可能な戦略を要求する。本発明者らは、先行するＯ－ｍＲＮＡよりも、最大４０倍多くのタンパク質につながり、最大５０倍直交性であるＯ－ｍＲＮＡの発見を自動化し；我々のＯ－ｍＲＮＡからのタンパク質収率は野生型ｍＲＮＡからの場合に匹敵するか又は上回る。これらの進歩は、３つの別個のｎｃＡＡを組み込むための収率における３３倍の増加を可能にする。追加的に、本発明者らは、Ｏ－ｔＲＮＡのためのオペロンの作出を自動化し、Ｏ－ａａＲＳのためのオペロンを開発する。最後に、本発明者らは、これらの進歩を組み合わせて、６８コドン、２４アミノ酸の遺伝コードを作出し、４つの別個のクアドルプレットコドンに応答して４つの別個のｎｃＡＡを効率的に組み込む。

【実施例1】

【0245】

Ｏ－リボソームによる効率的な翻訳のための５’ＵＴＲの発見の自動化
ｗｔ ＲＢＳを含有する５’ＵＴＲ上の我々の_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６ ＯＲＦについて予測されるΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）は－０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。対照的に、熱力学的モデルにおいて使用されるアンチシャインダルガルノ配列（ａＳＤ）をＯ－リボソームのものに変更した場合、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－_{Ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６の直交翻訳のための算出される自由エネルギー変化（ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ））は＋３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。我々は、ｗｔ翻訳のために開発された、シミュレートされたアニーリング最適化アルゴリズム（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)）と組み合わせられた開始の平衡モデルが、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６よりもＯ－リボソームによってより効率的に翻訳されるＯ－ｍＲＮＡ配列を設計するために適合され得るかどうかを試験することを決定した（図１ａ、ｂ）。我々はしたがって、＋１の転写部位と_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６ ＯＲＦとの間の５’ＵＴＲ配列を変更し、このＯＲＦについて非常に好都合なΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）を有する配列を、シミュレートされたアニーリング最適化アルゴリズム（Salis, H.M., Mirsky, E.A. & Voigt, C.A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950 (2009)）を通じて検索した。

【0246】

このアルゴリズム（ｖｏｌ １）を使用して、我々は、Ｏ－リボソームによる_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６タンパク質の産生のための最適化された５’ＵＴＲ領域（Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６～Ｏ４－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６）を有する４つの新たな_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６コンストラクトを同定した。これらのコンストラクトについてのΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）は、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６ －５．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｏ２－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６ －４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｏ３－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６ －５．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｏ４－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６ －６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。そのため、これらのコンストラクトはＯ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６よりも高いタンパク質レベルにつながり得ると我々は予測した。我々は、各々のコンストラクト及びＯ－リボソームを含有する細胞から_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６を産生した。最適化された配列（Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６～Ｏ４－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６）は、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６と比較して直交翻訳を伴うタンパク質産生における大きい（１１～３１倍）増加につながった（図１ｃ及び補足図１）。Ｏ－リボソームによりＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６から産生される_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６タンパク質のレベルは、ｗｔ ＲＢＳを含有し、ｗｔリボソームにより翻訳される元々のコンストラクトからの場合と同等であった。新たな配列についてのΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ－ｒｉｂｏ）（図１ａ）は、すべての場合において＋５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも高かった。そのため、ΔＧ_{ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ}（図１ａ）は、これらのコンストラクトはＯ－リボソームにより選択的に翻訳されることを予測する。この予測と合致して、追加の実験は、各々の新たな５’ＵＴＲからの_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６の翻訳はＯ－リボソーム依存的であり、新たな配列の直交性は、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６の場合よりも１２～１９倍、１４３高いことを実証した（図１ｃ及び補足図１ａ）。

【実施例2】

【0247】

拡張可能、効率的かつ選択的な直交翻訳のための５’ＵＴＲ及びＯＲＦの発見の自動化
ｗｔリボソームによる効率的な翻訳を指令せず、Ｏ－リボソームによる最大のタンパク質産生を指令する５’ＵＴＲの発見を完全に自動化するための努力において、我々は、新たな自動化された検索（ｖｏｌ ２）を設計した（図１ｂ）。我々の新たな検索は、ｗｔリボソームの基質であることが予測され、最適にスペーシングされた標準的なＯ－ＲＢＳ配列を含有する配列に向けてバイアスされた５’ＵＴＲ配列のための明示的なペナルティーを導入した。

【0248】

ｖｏｌ ２検索は、Ｏ－１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端において直交性ａＳＤ配列と完全なワトソン－クリック塩基対を形成することが予測される９ｎｔ直交性ＳＤ（Ｏ－ＳＤ）配列を含有する３５ｎｔ ５’ＵＴＲから開始した。Ｏ－ＳＤ配列と開始コドンとの間のスペーシングは５ヌクレオチドに設定し、Ｏ－ＳＤを除いて、５’ＵＴＲの配列をランダム化した。我々は次に、ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）を最大化するがΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）を最小化する配列を検索した。我々は、Ｏ－１６Ｓ ｒＲＮＡと塩基対合するがｗｔ １６Ｓ ｒＲＮＡとは塩基対合しないことが予測され、そのため直交性を決定する、Ｏ－ＳＤ部位の５ヌクレオチドコア（ＴＧＧＧＡ）における変異を許容しなかった。ｖｏｌ ２アルゴリズムを使用して、我々は、_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６のための新たな５’ＵＴＲ（Ｏ５～Ｏ８－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６）を作出した。これらの配列は、ｖｏｌ １に由来する場合（－５．６±０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）よりも高い平均ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）（－７．７±０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有した（補足表１）。これらの配列は、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６よりも最大１８倍多くの_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６タンパク質を提供した（図１１及び補足図１ｂ）。タンパク質産生を増強するためのｖｏｌ ２アルゴリズムの一般性を調べるために、我々は、２つの追加のＯＲＦ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎの直交翻訳を調べた。Ｏ（ｔｒａｎｓ）－ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＯ（ｔｒａｎｓ）－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ（Ｏ（ｔｒａｎｓ）５’ＵＴＲが転写の＋１塩基とＡＴＧ開始コドンとの間に置かれていた）は、低いレベルの直交翻訳につながった。ｖｏｌ ２アルゴリズムの適用は、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－ｍＣｈｅｒｒｙよりもＯ－リボソームと共に最大１０倍高い活性の、また最大８倍高い直交性のｍＣｈｅｒｒｙ発現コンストラクトにつながった（図１ｄ及び補足図１ｃ）。同様に、ｖｏｌ ２アルゴリズムの適用は、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－Ｅ２ＣｒｉｍｓｏｎよりもＯ－リボソームと共に最大１４倍高い活性の、最大９倍高い直交性のＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎ産生コンストラクトにつながり；Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎは、ｗｔリボソームを使用してｗｔ ＲＢＳから産生されたレベルと同等のレベルにおいてＯ１－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ（ｖｏｌ ２アルゴリズムを使用して発見された）からＯ－リボソームにより産生された（図１ｅ及び補足図１ｄ）。

【0249】

ＯＲＦ配列の最初の３５ヌクレオチドはタンパク質収率に実質的に寄与することができる（Cambray, G., Guimaraes, J.C. & Arkin, A.P. Evaluation of 244,000 synthetic sequences reveals design principles to optimize translation in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 36, 1005-1015 (2018)、Tuller, T. & Zur, H. Multiple roles of the coding sequence 5′ end in gene expression regulation. Nucleic Acids Res. 43, 13-28 (2015)、Seo, S.W. et al. Predictive design of mRNA translation initiation region to control prokaryotic translation efficiency. Metab. Eng. 15, 67-74 (2013)）。しかしながら、この配列においてコドンをそれらのシノニムに変化させることが、別個のイソアクセプターｔＲＮＡを用いる異なるシノニムのデコードの結果としてもたらされる効果と対比してｍＲＮＡ二次構造に対する効果を通じて翻訳にどの程度まで影響を及ぼすのかは依然として議論の余地がある（Cambray, G., Guimaraes, J.C. & Arkin, A.P. Evaluation of 244,000 synthetic sequences reveals design principles to optimize translation in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 36, 1005-1015 (2018)、Plotkin, J.B. & Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nat. Rev. Genet. 12, 32-42 (2011)、Tuller, T. & Zur, H. Multiple roles of the coding sequence 5′ end in gene expression regulation. Nucleic Acids Res. 43, 13-28 (2015)、Kudla, G., Murray, A.W., Tollervey, D. & Plotkin, J.B. Coding-Sequence Determinants of Gene Expression in Escherichia coli. Science 324, 255-258 (2009)、Allert, M., Cox, J.C. & Hellinga, H.W. Multifactorial Determinants of Protein Expression in Prokaryotic Open Reading Frames. J. Mol. Biol. 402, 905-918 (2010)、Goodman, D.B., Church, G.M. & Kosuri, S. Causes and Effects of N-Terminal Codon Bias in Bacterial Genes. Science 342, 475-479 (2013)）。ＯＲＦの最初の３５ヌクレオチド内のコドンを同義コドンに変更することは、ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）を最大化するがΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）を最小化するｍＲＮＡのコンピューターによる検索における追加の自由度を提供することを我々は認識した。また、一部の場合において、これは、Ｏ－リボソームによってより効率的に翻訳され、ｗｔリボソームによる翻訳に関してより直交性であるｍＲＮＡを発見することを可能とし得るという仮説を我々は立てた。この仮説を調べるために、我々は、各々のＯＲＦのコドン２～１２をそれらのシノニムに変更した。我々はそれにより、ｖｏｌ ２に基づく第３のアルゴリズム（ｖｏｌ ３）を作出して、ＯＲＦ及び５’ＵＴＲにおける同時のバリエーションを探索した（図１ｂ）。

【0250】

ｖｏｌ ３アルゴリズムは、ｖｏｌ ２（_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６：－７．７±０．４；ｍＣｈｅｒｒｙ：－９．６±０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ；Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ：－８．９±０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に対してΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）における顕著な増加（_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６：－１２．６±０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ；ｍＣｈｅｒｒｙ：－１３．５±０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ；Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ：－１３．２±０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を提供し、ｖｏｌ ２からの最小化されたΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）を維持した。我々は、ｖｏｌ ２アルゴリズムからの場合よりも直交性であり、ｗｔメッセージからｗｔリボソームにより産生される場合よりも高いレベルでタンパク質を産生する_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６及びｍＣｈｅｒｒｙのためのＯ－ｍＲＮＡ配列を発見した（図１ｃ～ｅ及び補足図１ｂ～ｄ）。全体的に、我々のｖｏｌ ２及びｖｏｌ ３アルゴリズムは、Ｏ（ｔｒａｎｓ）５’ＵＴＲが各々のＯＲＦと共に使用された場合よりも４１、３１及び１４倍（それぞれ_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎについて）高いタンパク質収率を提供し、これらの収率は、ｗｔメッセージにおけるｗｔリボソームからの収率に匹敵するか、又はそれを上回る。我々が発見した最良の配列の直交性は、Ｏ（ｔｒａｎｓ）５’ＵＴＲが各々のＯＲＦと共に使用された場合よりも３１、４９及び９倍（それぞれ_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎについて）高い。

【実施例3】

【0251】

最適化された直交性ｍＲＮＡは、３つの別個のｎｃＡＡを含有するタンパク質の収率の増加を可能にする
次に、我々は、最適化されたＯ－ｍＲＮＡからのタンパク質発現収率における増加は、直交翻訳を介して、３つの別個のｎｃＡＡを含有するタンパク質の収率における増加を可能にすることを実証した。この研究は、上記されるアルゴリズム開発と並行して進行したので、我々は、ｖｏｌ １アルゴリズムに由来する、その時点において利用可能な最良の配列、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６を用いて我々の実験を行った（図２ａ）。我々は、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６を作出し、三重に直交性のＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｐｙｌペア（ＭｍＰｙｌＲＳ／メタノサルシナ・スペラエイ（Methanosarcina spelaei）（Ｍｓｐｅ）ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＵＡ（Ｎ^６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン（ＢｏｃＫ） １の組込みを指令する）、メタノマッシリイコッカス・ルミニュエンシス（Methanomassiliicoccus luminyensis）１（Ｍｌｕｍ）ＰｙｌＲＳ（ＮｍＨ）／メタノマッシリイコッカス・インテスティナリス（Methanomassiliicoccus intestinalis）（Ｍｉｎｔ）ｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵ（Ｎπ－メチル－Ｌ－ヒスチジン（ＮｍＨ） ２の組込みを指令する、Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｖミュータント）及びメタノメチロフィラス属菌（Methanomethylophilus sp.）１Ｒ２６（Ｍ１ｒ２６）ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／メタノメチロフィラス・アルバス（Methanomethylophilus alvus）（Ｍａｌｖ）ｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵ（Ｎ^６－（（ベンジルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＣｂｚＫ） ３の組込みを指令する、Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌミュータント）から構成される）を含有する細胞中でＯ－ｒｉｂｏＱ１を用いてこれを翻訳した。全長_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６をＢｏｃＫ １、ＮｍＨ ２及びＣｂｚＫ ３の追加で産生した。このシステムを使用して、我々は２．６±０．４ｍｇ／Ｌの_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＢｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６を合成した。この収率は、Ｏ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ又は１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６からの収率よりも３３倍高く、（図２ｂ及び補足表２）、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ｗｔ）_Ｈｉｓ６から産生される_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ｗｔ）_Ｈｉｓ６の９％、及びｗｔリボソームによりｗｔ ＲＢＳから翻訳される_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ｗｔ）_Ｈｉｓ６から産生される_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ｗｔ）_Ｈｉｓ６の１１％に対応する。観察された収率は、４５％のステップ当たりの平均ｎｃＡＡ組込み効率を示唆する。質量分析により正確なタンパク質の合成が確認された（図２ｃ、補足図２）。

【実施例4】

【0252】

四重に直交性のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアのための機能的なオペロンの設計
次に、我々は、各々のｎｃＡＡが別個のクアドルプレットコドンに応答してコードされる４つの別個のｎｃＡＡの単一のタンパク質への組込みを可能にするために効率的なＯ－ｍＲＮＡの開発に基礎を置くことを試みた。これは、（１）アミノアシル化特異性において相互に直交性であり、（２）４つの相互に直交性の活性部位を有し、（３）４つの相互に直交性のクアドルプレットコドンに割り当てられる、４つの直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアを要求した。我々は、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｐｙｌトリプレット － メタノマッシリイコッカルス目（Methanomassiliicoccales）古細菌ＲｕｍＥｎ Ｍ１（Ｍｒｕｍ）Ｐｙｌ（ＮｍＨ）ＲＳ／ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵ（ＮｍＨ ２の組込みを指令する、Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｖミュータント）、メタン生成古細菌ＩＳＯ４－Ｇ１（Ｍｇ１）Ｐｙｌ（ＣｂｚＫ）ＲＳ／ＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵ（ＣｂｚＫ ３の組込みを指令する、Ｙ１２５Ｇ、Ｍ１２８Ｌミュータント）及びＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＣＵＡＧ（ＢｏｃＫ １又はＮ^６－（（アリルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｌｌｏｃＫ） ４を含む、複数のｎｃＡＡの組込みを指令する） － を我々のアプローチのための出発点として選択した。我々は、ＡｆＴｙｒＲＳ（ＰｈｅＩ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡ（（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヨードフェニル）プロパン酸（ＰｈｅＩ） ５の組込みを指令する、Ｙ３６Ｉ、Ｌ６９Ｍ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、Ｆ２７４Ｖ、Ｌ２９８Ｇ、Ｄ２９９Ｒミュータント）を第４のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアのための出発点として選択し；我々は、このペアは複数のピロリシルシンテターゼ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌに対して直交性であることを以前に示している。複数のｎｃＡＡをコードするための努力は、対応するシンテターゼ及びｔＲＮＡの効率的かつコンパクトな発現のための戦略を要求する。我々はしたがって、４つの外因性ｔＲＮＡの共発現及びそれらのコグネイトシンテターゼの共発現のためのオペロンベースシステムを確立した。

【0253】

大腸菌中で、多くのｔＲＮＡはポリシストロン性オペロンにおいて転写され、成熟ｔＲＮＡの５’及び３’末端は転写後ＲＮａｓｅプロセシングにより生成される（Phizicky, E.M. & Hopper, A.K. tRNA biology charges to the front. Genes Dev. 24, 1832-1860 (2010)、El Yacoubi, B., Bailly, M. & de Crecy-Lagard, V. Biosynthesis and Function of Posttranscriptional Modifications of Transfer RNAs. Annu. Rev. Genet. 46, 69-95 (2012)）。我々は、外因性ｔＲＮＡの間の遺伝子間配列が、外因性ｔＲＮＡに最も類似した大腸菌ｔＲＮＡの間の配列に由来する合成ｔＲＮＡオペロンを自動的に設計するためのプログラムを作出した。プログラムは最初に、外因性ｔＲＮＡのすべての可能な順序化（orderings）を生成した。順序化中の隣接する外因性ｔＲＮＡの各々のペアのために、それは、外因性ペアに対して最も高い配列同一性を有する大腸菌ゲノム中の隣接する天然ｔＲＮＡを同定する。それは次に、これらの天然ｔＲＮＡの間に見出される遺伝子間領域の配列を外因性ｔＲＮＡの間に挿入する。このプロセスは、外因性ｔＲＮＡの各々の順序化のための合成オペロン配列を生成する。プログラムは次に、各々のｔＲＮＡ順序の結果としてもたらされる合成オペロンを比較し、外因性ｔＲＮＡと、オペロン中の遺伝子間領域を定義するために使用される対応する天然ｔＲＮＡとの間の配列同一性の和に基づいてそれらを順位付けする。

【0254】

我々は、ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１}、ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ}、ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０}、及びＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８}を有するｔＲＮＡオペロンを生成するために我々のプログラムを使用した。最上位に順位付けされたオペロンは、ＭｉｎｔｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－Ａ１７ＶＣ１０} _ＵＣＣＵ－ｉｎｔｅｒ（ｇｌｙＸ，ｇｌｙＹ）－ＭａｌｖｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－８} _ＵＡＣＵ－ｉｎｔｅｒ（ｇｌｙＷ－ｃｙｓＴ）－ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＣＵＡＧ－ｉｎｔｅｒ（ａｒｇＹ，ａｒｇＺ）－ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡ（ここで、ｉｎｔｅｒ（ｘ，ｙ）は、大腸菌ｔＲＮＡ ｘとｙとの間の遺伝子間スペーサー配列を表す）であった。４つの別個のクアドルプレットコドンをデコードするｔＲＮＡを発現するためにこのオペロンを適合させるために、我々は、ＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＣＵＡＧをＭｓｐｅｔＲＮＡ^{Ｐｙｌ－ｅｖｏｌ} _ＵＣＵＡ（我々が以前にＭｂｔＲＮＡ^Ｐｙｌにおいて進化させたアンチコドンステムをＭｓｐｅｔＲＮＡ^Ｐｙｌ中に移植することにより作出される）で、及びＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡをＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡＧ（ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ－Ａ０１} _ＣＵＡのアンチコドン変異により作出される）により置き換えた。我々は、結果としてもたらされるｔＲＮＡオペロンをｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）と命名した。

【0255】

４つの外因性ａａＲＳ（ＭｍＰｙｌＲＳ、ＡｆＴｙｒ（ＰｈｅＩ）ＲＳ、Ｍｇ１（ＣｂｚＫ）ＰｙｌＲＳ及びＭｒｕｍ（ＮｍＨ）ＰｙｌＲＳ）の高発現を可能とするオペロンを同定するために、我々は最初に、各々のシンテターゼ遺伝子のための５つの最適化された５’ＵＴＲ領域を生成し、次に他の３つのａａＲＳのいずれかを５’配列コンテキストとして使用して各々の５’ＵＴＲについてのフォールディングしたｍＲＮＡから開始適格翻訳複合体への進行についてのΔＧ_ｔｏｔを予測した。我々は、４つすべてのａａＲＳについて好都合なΔＧ_ｔｏｔを有する２つの配置、ＲＳ４＿１及びＲＳ４＿２を選択した。我々は、ａａＲＳオペロンの各々を、ｔＲＮＡ４をコードするプラスミド中にクローニングして、コンパクトなシンテターゼ及びｔＲＮＡ発現モジュール（ＲＳ４＿１／ｔＲＮＡ４及びＲＳ４＿２／ｔＲＮＡ４）を生成した（補足図３）。我々は、各々のオペロンにおける各々のａａＲＳの活性を試験した（補足図４、補足表３）。これらの実験により我々は、最適化されたキメラａａＲＳオペロンを設計し、該オペロンにおいて、我々は、Ｍｒｕｍ（ＮｍＨ）ＰｙｌＲＳの最適化された５’ＵＴＲの上流の１５０ｎｔをＲＳ４＿２からＲＳ４＿１に移植して、ＲＳ４＿１－２を作出した。このオペロンは、ＲＳ４＿２及びＲＳ４＿１の最良の特性を兼ね備えていた（補足図４ｃ）。

【0256】

我々は、単一のベクター中にＲＳ４＿１－２及びｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）オペロンを組み合わせ（２７９個のＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ））、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６（ここで、ＸＸＸＸは、ＴＡＧＡ、ＡＧＧＡ、ＡＧＴＡ又はＣＴＡＧを表す）から産生されるＧＦＰ蛍光を測定することにより産生された各々のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアの活性及び直交性を体系的に試験した。細胞は、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１を含有し、各々の個々のｎｃＡＡ（ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＡｌｌｏｃＫ ４、ＰｈｅＩ ５）を含有したか又は含有せず、ＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）を含有した（図３ａ～ｄ）。ＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）及び４つすべてのｎｃＡＡ（ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＰｈｅＩ ５、ＡｌｌｏｃＫ ４）の存在下でＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（１５０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６（ここで、ＸＸＸＸは、ＴＡＧＡ、ＡＧＧＡ、ＡＧＴＡ又はＴＡＧＡを表す）からＯ－ｒｉｂｏＱ１により産生される_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０Ｘ）_Ｈｉｓ６（ここで、Ｘは、ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＡｌｌｏｃＫ ４、ＰｈｅＩ ５を表す）のＥＳＩ－ＭＳは、各々のａａＲＳ、ｔＲＮＡ及びコドンは、互いに対して機能的に直交性であることを実証した（図３ｅ～ｈ）。

【実施例5】

【0257】

４つの別個のクアドルプレットコドンを使用して４つの別個のｎｃＡＡを遺伝学的にコードすること
我々は、直交性ペアのためのａａＲＳ／ｔＲＮＡオペロンの生成における我々の進歩を、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１により効率的に読まれる最適化されたＯ－ｍＲＮＡの作出における我々の進歩と組み合わせて、４つの別個のクアドルプレットコドンに応答して単一のタンパク質中に４つの別個のｎｃＡＡを組み込んだ（図４ａ）。我々は、ＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）を含有し、４つすべてのｎｃＡＡ基質（ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＰｈｅＩ ４、ＡｌｌｏｃＫ ５）を提供された細胞中でＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＣＴＡＧ、５０ＴＡＧＡ、１３６ＡＧＧＡ、５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６のＯ－ｒｉｂｏＱ１媒介性翻訳により_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ、５０ＡｌｌｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６を産生した（図４ｂ）。_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＰｈｅＩ、５０ＡｌｌｏｃＫ、１３６ＮｍＨ、１５０ＣｂｚＫ）_Ｈｉｓ６の産生は、４つすべてのｎｃＡＡの追加に依存的であり、０．４１±０．０３ｍｇ／ｍＬのタンパク質が産生された（補足表２）。観察された収率は、３８％のステップ当たりの平均ｎｃＡＡ組込み効率を示唆する。質量分析により、４つの別個のクアドルプレットコドンに応答した４つすべてのｎｃＡＡの組込みが確認された（図４ｃ、補足図５）。追加の実験において、我々はまた、３つのクアドルプレットコドン及びアンバーコドンに応答した４つの別個のｎｃＡＡの組込みを実証した（補足図６～８、補足表２）。

【実施例6】

【0258】

実施例１～５の考察
我々は、Ｏ－リボソームにより効率的かつ選択的に翻訳されるＯ－ｍＲＮＡ配列を設計するためのコンピューターによるアプローチを開発した。新たなＯ－ｍＲＮＡは、所望のＯＲＦの前にＯ－ＲＢＳを含有する以前に使用された５’ＵＴＲを移植することにより作出されるＯ－ｍＲＮＡよりも、最大４０倍多くのタンパク質につながり、最大５０倍直交性である。我々が作出したＯ－ｍＲＮＡは、ｗｔリボソームにより翻訳されるｗｔ ｍＲＮＡからの場合と同等又はそれより高いレベルにおいて直交性タンパク質産生を指令する。Ｏ－ｍＲＮＡ発見のための我々の自動化された、迅速かつ拡張可能な方法は、複数のｎｃＡＡを組み込み、新たな単量体を重合させる直交翻訳システムの設計及び指向性進化（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Rackham, O. & Chin, J.W. A network of orthogonal ribosome・mRNA pairs. Nat. Chem. Biol. 1, 159-166 (2005)、Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat. Biotechnol. 25, 770-777 (2007)、Schmied, W.H. et al. Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)）の他に、直交性遺伝子発現システムの作出及び応用（An, W. & Chin, J.W. Synthesis of orthogonal transcription-translation networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8477-8482 (2009)、Darlington, A.P.S., Kim, J., Jimenez, J.I. & Bates, D.G. Dynamic allocation of orthogonal ribosomes facilitates uncoupling of co-expressed genes. Nat. Commun. 9, 1-12 (2018)）を大きく加速させる。

【0259】

我々のＯ－ｍＲＮＡ最適化戦略は、５’ＵＴＲ及びＯＲＦ配列の直交性及び共最適化のための明示的な選択を含む。我々は、ＯＲＦにおける５’ＵＴＲ及び同義コドン選択の共最適化は、５’ＵＴＲを単純に変更することを通じて得られる場合よりも大きい（より負の）ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）についての予測される値を有するＯ－ｍＲＮＡ配列につながり；これらの配列はまた、ΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）についての大きい（正の）予測される値を有することを見出した。我々は、ＯＲＦ内の５’ＵＴＲ配列及び同義コドンの共最適化は、タンパク質収率を向上させることができることを発見し、４つのクローンの試験は、試験された各々の場合において高いレベルの翻訳につながった。これらの観察は、ｍＲＮＡフォールディングは、既知のパラメーターの中でも、タンパク質収率の主要な予測因子であるという見解（Cambray, G., Guimaraes, J.C. & Arkin, A.P. Evaluation of 244,000 synthetic sequences reveals design principles to optimize translation in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 36, 1005-1015 (2018)）と合致する。コドン適合を含む他のパラメーターがタンパク質収率に影響を及ぼし得ることに我々は気付き、アルゴリズムの将来の反復においてこれらの考慮を含めることでよりいっそう高い予測力につながるかどうかを調べることは興味深い。将来の研究はまた、ｗｔリボソームからの発現困難なタンパク質の産生を向上させるための５’ＵＴＲ配列及びコーディング配列の共最適化を探索する。

【0260】

我々の自動化されたＯ－ｍＲＮＡ設計を、我々の以前に開発された三重に直交性のＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｐｙｌペアと組み合わせることにより、我々は、３つの別個のｎｃＡＡを含有するタンパク質の収率を３３倍増加させた。我々は、多くの外因性ａａＲＳ及びｔＲＮＡの効率的かつコンパクトな共発現のためのパイプラインを確立した。我々は、大腸菌における内因性転写システムを模倣するポリシストロン性ｔＲＮＡオペロンを産生するためのコンピュータープログラムを開発した。我々のアルゴリズムは、１つのプラスミド上の同じプロモーターの下で大腸菌中で複数の別個のｔＲＮＡを産生するための一般的な解決策を提供し、他の生物のために容易に適合され得る。我々はまた、ｔＲＮＡオペロンと並んで４つの相互に直交性のシンテターゼの効率的な発現のためのポリシストロン性ａａＲＳオペロンを開発した。我々は、我々の進歩を組み合わせて、初めてインビボで２４個のアミノ酸、すなわち標準的な２０個のアミノ酸及び４個のｎｃＡＡ、からなるタンパク質を産生した。各々のｎｃＡＡは、Ｏ－ｍＲＮＡ上で選択的に翻訳され、天然の翻訳において使用されないクアドルプレットコドンを使用してコードされ、６８コドン遺伝コードを有する生物が作出される。

【0261】

別個のｎｃＡＡを認識し、別個のクアドルプレットコドンをデコードする相互に直交性のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアの作出における新生の開発がクアドルプレットコードの拡張を可能とし得ることを我々は予期する。クアドルプレットデコーディングの効率は、トリプレットコドンをもはや読まないリボソームを選択することにより、又は、競合性トリプレットデコーディングｔＲＮＡが除去されている圧縮された遺伝コードを有する生物においてクアドルプレットデコーディングを開発することによりさらに向上され得る（Fredens, J. et al. Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514- 518 (2019)、Chatterjee, A., Lajoie, M.J., Xiao, H., Church, G.M. & Schultz, P.G. A Bacterial Strain with a Unique Quadruplet Codon Specifying Non-native Amino Acids. ChemBioChem 15, 1782- 1786 (2014)）。

【0262】

実施例１～６及び図のレジェンド５～１２（補足図１～８）のための参考文献
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【0263】

方法
翻訳開始の熱力学的モデル
熱力学的モデルは以前に記載されている（Chin, J.W. Expanding and reprogramming the genetic code. Nature 550, 53-60 (2017)）。簡潔に述べれば、モデルは、自由にフォールディングしたｍＲＮＡの予測されるエネルギー、ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}、及び開始適格リボソーム結合状態の予測されるエネルギー、ΔＧ_{ｒｉｂｏ＿ｂｉｎｄｉｎｇ}の自由エネルギー差、ΔＧ_ｔｏｔを特定する。
ΔＧ_ｔｏｔ＝ΔＧ_{ｒｉｂｏ＿ｂｉｎｄｉｎｇ}＋ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}

【0264】

ここで、ΔＧ_{ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ}は、ｍＲＮＡ二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである。開始適格状態の形成において放出される自由エネルギー、ΔＧ_{ｒｉｂｏ＿ｂｉｎｄｉｎｇ}は４つの構成要素からなる。
ΔＧ_{ｒｉｂｏ＿ｂｉｎｄｉｎｇ}＝ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}＋ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}＋ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}－ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}

【0265】

ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}は、１６Ｓ ｒＲＮＡの最後の９ｎｔ及びｍＲＮＡの予測される共同フォールディングした二次構造の自由エネルギーであり、主なエネルギー的寄与は、ｍＲＮＡのシャインダルガルノ（ＳＤ）又は直交性シャインダルガルノＯ－ＳＤ配列と１６Ｓ ｒＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションエネルギーから来る。リボソームフットプリントを反映して、ハイブリダイゼーション部位の下流のｍＲＮＡフォールディングは許容されない。ΔＧ_{ｓｔａｒｔ}は、開始コドンへの開始ｔＲＮＡの結合から放出されるエネルギーである。ΔＧ_{ｓｐａｃｉｎｇ}は、ＳＤ部位と開始コドンとの間の最適でないスペーシング長のためのエネルギーペナルティーである。ΔＧ_{ｓｔａｎｄｂｙ}は、ここではＳＤ部位の上流の４ヌクレオチドとして定義されるスタンドバイ部位を隔離する二次構造をアンフォールディングさせるために要求されるエネルギーである。

【0266】

自動化されたＯ－ｍＲＮＡの発見のためのシミュレートされたアニーリング最適化アルゴリズム
ＲＮＡ二次構造予測は、「ｍｆｅ」アルゴリズムを使用してＮｕＰＡＣＫスイートにおいて行われる。算出は、５’ＵＴＲ及びＯＲＦ中の最大で３５ｎｔのウィンドウを考慮し；より長い配列が使用される場合、開始コドンに最も近接した３５ｎｔのみが考慮される。

【0267】

ｖｏｌ １アルゴリズムは、以前に記載されたシミュレートされたアニーリング最適化アルゴリズム１に由来するが、ΔＧ_{ｍＲＮＡ－ｒＲＮＡ}の算出のために標準的な配列（ＡＣＣＴＣＣＴＴＡ）の代わりに直交性１６Ｓ ｒＲＮＡの最終９ｎｔ（ＡＴＧＧＧＡＴＴＡ）を使用する。簡潔に述べれば、アルゴリズムは、標準的なＳＤ配列を含有するランダムな５’ＵＴＲ配列から開始する。５’ＵＴＲ及びＯＲＦのΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、熱力学的モデルを使用して評価され、標的関数ΔＧ_{ｔａｒｇｅｔ}と比較される。ΔＧ_{ｔａｒｇｅｔ}は、アルゴリズムの標的が可能な限り負となるように任意に又は無限に負の値に設定されてもよい。反復手順において、変異（単一のヌクレオチドの変化、挿入又は欠失のいずれか）が５’ＵＴＲ中に導入され、新たなΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が算出される。変異した配列が配列制約を破る場合、変異は拒絶される。変異した配列が、ΔＧ_{ｔａｒｇｅｔ}により近いΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）につながる場合、変異は許容される。ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（Ｏ－ｒｉｂｏ）値が元々のΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）よりもΔＧ_{ｔａｒｇｅｔ}から異なる場合、変異は以下の確率と共に許容される：

【数10】

【0268】

ここで、Ｔ_ＳＡはシミュレートされたアニーリング温度であり、これは５～２０％の許容率を維持するように調整される。アルゴリズムは、１０，０００回の反復の後に終了し、５’ＵＴＲ及び予測されるΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）を出力する。

【0269】

ｖｏｌ ２アルゴリズムはｖｏｌ １アルゴリズムに基づく。ランダムな出発５’ＵＴＲは、ＡＴＧ開始コドンから５ヌクレオチドの最適なスペーシングにおいてＯ－１６Ｓ ｒＲＮＡ（ＡＴＧＧＧＡＴＴＡ）に完全に相補的であることが予測される９ヌクレオチドＯ－ＳＤ部位（ＴＡＡＴＣＣＣＡＴ）を含有する。５’ＵＴＲ及びＯＲＦのΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）及びΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）が、熱力学的モデルを使用して評価され、仮説的なΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）がΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）＝ΔＧ_ｔｏｔ（Ｏ－ｒｉｂｏ）－０．５*ΔＧ_ｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）に従って算出される。ｖｏｌ １アルゴリズムとは対照的に、ΔＧ_{ｔａｒｇｅｔ}値は特定されない。反復手順において、変異（単一のヌクレオチドの変化、挿入又は欠失のいずれか）が５’ＵＴＲ中に導入され、新たなΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ値が算出される。変異した配列が配列制約を破るか、又はＯ－ＳＤ配列の５ヌクレオチドコア（ＴＣＣＣＡ）を除去する場合、変異は拒絶される。変異した配列が向上した（より負の）ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）値につながる場合、変異は許容される。ΔＧ_ｔｏｔ ^ｎｅｗ（ｏｐｔ）値が元々のΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）よりも大きい（より正の）場合、変異は以下の確率と共に許容される。

【数11】

【0270】

５００回の連続する反復がΔＧ_ｔｏｔ（ｏｐｔ）における向上をもたらさない場合、アルゴリズムは終了し、５’ＵＴＲ及びΔＧ_ｔｏｔ値を出力する。我々は、典型的には、アルゴリズムを複数回実行し、最も好都合なΔＧ_ｔｏｔ値を有する配列を選択し；我々は、これは、出発配列当たりでより多くの反復のためにアルゴリズムを実行するよりも、高度に翻訳される５’ＵＴＲを同定するために算出的に効率的であることを見出した。この研究において、我々は、２４個の予測される５’ＵＴＲから４個の配列を選択した。

【0271】

ｖｏｌ ３アルゴリズムはｖｏｌ ２アルゴリズムに基づく。ランダムな出発５’ＵＴＲに加えて、２～１２位におけるアミノ酸は、同義コドンのランダムに選択される選択によりコードされる。５’ＵＴＲ中の単一のヌクレオチドの変化、挿入、又は欠失に加えて、ＯＲＦ中の２～１２位における同義コドン変化は、シミュレートされたアニーリング最適化の間の変異機序として許容される。

【0272】

ｔＲＮＡオペロンデザイナー
プログラムは、その遺伝子が互いに隣接しており、同じ鎖上にある宿主生物中のｔＲＮＡのすべてのペアのリストを生成する。それは次に、これらの内因性ｔＲＮＡペアの遺伝子配列の他に、対応する遺伝子間配列を抽出する。任意に、ユーザーは、プログラムにより考慮される遺伝子間配列の最小及び最大の長さを特定してもよい。この研究において使用されたｔＲＮＡオペロンのために、我々は、１０及び１００塩基対のそれぞれ最小及び最大の遺伝子間配列長を有する、大腸菌Ｋ－１２株ＭＧ１６５５亜株ゲノム（バージョンＵ０００９６．３、最終更新日：２０１８年９月２４日）を宿主ゲノムとして使用した。

【0273】

次に、プログラムは、外因性ｔＲＮＡのすべての順序化されたペアを生成する。外因性ｔＲＮＡの各々の順序化されたペアについて、これらのｔＲＮＡのアクセプターステム配列は内因性ｔＲＮＡペアのアクセプターステム配列と比較される。一貫性のために、我々は、標準的な大腸菌ｔＲＮＡアクセプターステム及び識別的な塩基領域を含む、ｔＲＮＡの最初の７ヌクレオチド及び最後の８ヌクレオチド（ＣＣＡ末端を除く）を考慮する。各々の内因性ｔＲＮＡペアは、アクセプターステムの配列同一性として算出される、外因性ｔＲＮＡペアに対する類似性により順位付けされる。外因性ｔＲＮＡペアは次に、最も類似した内因性ｔＲＮＡペアのアクセプターステムの配列同一性として定義されるスコアを割り当てられる。

【0274】

最後に、プログラムは、外因性ｔＲＮＡのすべての順序化、又は並べ替えを生成する。各々の並べ替えに対応する合成ｔＲＮＡオペロンは、並べ替え中の外因性ｔＲＮＡ遺伝子の各々の順序化されたペアの間に内因性ｔＲＮＡ遺伝子間領域を挿入することにより作出される。各々の順序化された外因性ペアについて、最も類似した内因性ｔＲＮＡペアに対応する遺伝子間領域が選択される。各々のオペロンは、並べ替え中のすべての順序化されたペアのスコアの和として算出されるスコアを割り当てられる。

【0275】

オペロンの配列及びスコアは、選択されたｔＲＮＡ及び遺伝子間領域の順序に関する情報と共に、Ｏｆｆｉｃｅ Ｏｐｅｎ ＸＭＬスプレッドシート中のエントリーの順位付けされたリストとして提示される。

【0276】

ａａＲＳオペロンのアセンブリー
オペロンのアセンブリーについての詳細は補足図３において与えられる。アライメントについてのΔＧｔｏｔ（ｗｔ ｒｉｂｏ）と共にすべての予測される５’ＵＴＲを補足表３に与えている。

【0277】

ＤＮＡコンストラクト
レポーター遺伝子（_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎ）をＧｉｂｓｏｎアセンブリーにより、テトラサイクリン耐性カセットを含有するｐ１５Ａプラスミド中にクローニングし、ｌａｃプロモーターから発現させた。最適化された５’ＵＴＲを＋１転写部位とＯＲＦとの間にｑｕｉｃｋ－ｃｈａｎｇｅ ＰＣＲ Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーにより挿入した。最適化された５’ＵＴＲ及びＯＲＦを＋１転写部位とコドン１３との間にｑｕｉｃｋ ｃｈａｎｇｅ ＰＣＲ Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーにより挿入した。Ｏ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６を、以前に記載されたｐ１５Ａプラスミド（de la Torre, D. & Chin, J.W. Reprogramming the genetic code. Nat. Rev. Genet., 1-16 (2020)）から発現させた。Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、５０ＣＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６及びＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＣＴＡＧ、５０ＴＡＧＡ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６をＩＤＴによりｇＢｌｏｃｋ二本鎖ＤＮＡ断片として合成し、標準的なｐ１５Ａレポーター骨格中にＧｉｂｓｏｎアセンブリーによりクローニングした。リボソームを、カナマイシン耐性カセットを含有する以前に記載されたｐＲＳＦプラスミド上にコードさせ、ｔｒｃプロモーターから発現させた（Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J.W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)、Wang, K. et al. Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. Nat. Chem. 6, 393-403 (2014)）。

【0278】

シンテターゼオペロンＲＳ３及びｔＲＮＡオペロンｔＲＮＡ３を、スペクチノマイシン耐性カセットを含有する以前に記載されたｐＭＢ１プラスミド（de la Torre, D. & Chin, J.W. Reprogramming the genetic code. Nat. Rev. Genet., 1-16 (2020)）上にコードさせた。シンテターゼオペロンＲＳ４＿１及びＲＳ４＿２をＩＤＴによりｇＢｌｏｃｋとして合成し、ｇｌｎＳ’のプロモーターの＋１転写部位の後にＧｉｂｓｏｎアセンブリーにより挿入した（de la Torre, D. & Chin, J.W. Reprogramming the genetic code. Nat. Rev. Genet., 1-16 (2020)）。ＲＳ４＿１－２をＲＳ４＿１及びＲＳ４＿２からの断片のＧｉｂｓｏｎクローニングによりアセンブルした。ｔＲＮＡオペロンｔＲＮＡ４をＩＤＴによりｇＢｌｏｃｋとして合成し、同じｐＭＢ１プラスミド中にシンテターゼオペロンとしてＧｉｂｓｏｎクローニングによりｌｐｐプロモーターの制御下でアセンブルした。ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）をｑｕｉｃｋ ｃｈａｎｇｅ ＰＣＲ ＧｉｂｓｏｎアセンブリーによりｔＲＮＡ４からアセンブルした。

【0279】

蛍光レポーターの活性及び直交性の測定
各々の蛍光レポーター（_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥ２Ｃｒｉｍｓｏｎ）の活性及び直交性を測定するために、我々は、蛍光レポーターをコードする０．５μＬのｐ１５Ａプラスミドで、Ｏ－リボソーム又はｗｔリボソームのコピーをコードするｐＲＳＦプラスミドを保有する８μＬの化学コンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。我々は、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおいて１８０μＬのＳＯＣ培地中３７℃及び７５０ｒｐｍで１ｈにわたり形質転換された細胞を回収した。３０μＬのレスキューされた細胞を使用して、１．２ｍＬの９６ウェルプレートフォーマットにおける５００μＬの選択２ｘＹＴ－ｋｔ（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２ｘＹＴ培地）培地への接種を行い、培養物を３７℃及び７５０ｒｐｍで終夜生育した。３０μＬの終夜培養物を使用して、１．２ｍＬの９６ウェルプレートフォーマットにおける５００μＬの２ｘＹＴ－ｋｔ培地への接種を行った。細胞を３７℃及び７５０ｒｐｍで２ｈ増殖させ、蛍光レポーター並びにリボソームの産生を、２ｍＭのＩＰＴＧの最終濃度を与える１０μＬの０．１Ｍ ＩＰＴＧの追加により誘導した。細胞を３７℃及び７５０ｒｐｍで１８ｈ増殖させた。１８０μＬの各々の培養物を９６ウェル平底Costarプレートに移し、PHERAstar FSプレートリーダーを使用して蛍光及び光学密度を測定した。

【0280】

Ｏ１－ _{ｓｔｒｅｐ} ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ） _Ｈｉｓ６ 又はＯ（ｔｒａｎｓ）－ _{ｓｔｒｅｐ} ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ） _Ｈｉｓ６ からの三重の組込みの効率の比較分析
移植又は最適化された直交性５’ＵＴＲを含有するレポーターからの_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６中への３つの別個のｎｃＡＡの組込みの効率を比較するために、我々は、オペロンＲＳ３／ｔＲＮＡ３をコードする０．４μＬのｐＭＢ１プラスミドと共に、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６又はＯ（ｔｒａｎｓ）－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６をコードする０．４μＬのｐ１５Ａプラスミドで、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１のコピーをコードするｐＲＳＦプラスミドを保有する８μＬの化学コンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。我々は、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおける１８０μＬのＳＯＣ培地中３７℃及び７５０ｒｐｍで１ｈにわたり形質転換された細胞を回収した。３０μＬのレスキューされた細胞を使用して、１．２ｍＬの９６ウェルプレートフォーマットにおける５００μＬの２ｘＹＴ－ｋｔｓ培地（２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び３７．５μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有する２ｘＹＴ）への接種を行い、培養物を３７℃及び７５０ｒｐｍで終夜生育した。１００μＬの終夜培養物を使用して、１０ｍＬの２４ウェルプレートフォーマットにおける４ｍＭのＢｏｃＫ １、４ｍＭのＮｍＨ ２及び２ｍＭのＣｂｚＫ ３のいずれかを含有するか又はｎｃＡＡを含有しない４ｍＬの２ｘＹＴ－ｋｔｓ培地への接種を行った。細胞を３７℃及び２２０ｒｐｍで２ｈ増殖させ、ｓｔｒｅｐＧＦＰＨｉｓ６並びにＯ－ｒｉｂｏＱ１の産生を、２ｍＭのＩＰＴＧの最終濃度を与える８μＬの１Ｍ ＩＰＴＧの追加により誘導した。細胞を３７℃及び７５０ｒｐｍで１８ｈ増殖させた。１８０μＬの各々の培養物を９６ウェル平底Costarプレートに移し、PHERAstar FSを使用して蛍光及び光学密度を測定した。培養物の残りを３２００ｒｃｆで１０分間遠心分離し、Roche社製cOmpleteプロテイナーゼ阻害剤を含有するＯＤ６００を調整された量のBugBuster中に採取した。細胞を１ｈにわたり上下回転の下で室温で溶解させた。溶解液を１．５ｍＬのEppendorfチューブに移し、１５０００ｒｃｆで２０分間遠心沈降させた。１８０μＬの清澄化された細胞溶解液を９６ウェル平底Costarプレートに移し、PHERAstar FSを使用して蛍光を測定した。

【0281】

ａａＲＳ／ｔＲＮＡオペロンの活性及び直交性の評価
我々のオペロンにおける各々のａａＲＳ／ｔＲＮＡペアの活性及び直交性を評価するために、我々は、オペロン（ａａＲＳ４＿１／ｔＲＮＡ４、ａａＲＳ４＿２／ｔＲＮＡ４、ａａＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４及びａａＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ（ｑｕａｄ））をコードする０．４μＬのｐＭＢ１プラスミドで、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１のコピーをコードするｐＲＳＦプラスミドの他に、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６（ここで、ＸＸＸＸは、ＴＡＧ（ａａＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）を除くすべてのオペロン）、ＴＡＧＡ（ａａＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）のみ）、ＡＧＧＡ、ＡＧＴＡ又はＣＴＡＧのいずれかを表す）をコードするｐ１５Ａプラスミドを宿す８μＬの化学コンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。我々は、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおける１８０μＬのＳＯＣ培地中３７℃及び７５０ｒｐｍで１ｈにわたり形質転換された細胞を回収した。３０μＬのレスキューされた細胞を使用して、１．２ｍＬの９６ウェルプレートフォーマットにおける５００μＬの選択２ｘＹＴ－ｋｔｓ培地への接種を行い、培養物を３７℃及び７５０ｒｐｍで終夜生育した。３０μＬの終夜培養物を使用して、１．２ｍＬの９６ウェルプレートフォーマットにおける４ｍＭのＢｏｃＫ １、４ｍＭのＮｍＨ ２、２ｍＭのＣｂｚＫ ３、４ｍＭのＡｌｌｏｃＫ ４、２ｍＭのＰｈｅＩ ５のいずれかを含有するか又はｎｃＡＡを含有しない５００μＬの選択２ｘＹＴ－ｋｔｓ培地への接種を行った。細胞を３７℃及び７５０ｒｐｍで２ｈ増殖させ、_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６の他にＯ－ｒｉｂｏＱ１の発現を、２ｍＭのＩＰＴＧの最終濃度を与える１０μＬの０．１Ｍ ＩＰＴＧの追加により誘導した。細胞を３７℃及び７５０ｒｐｍで１８ｈ増殖させた。１８０μＬの各々の培養物を９６ウェル平底Costarプレートに移し、PHERAstar FSを使用して蛍光及び光学密度を測定した。

【0282】

ＭＳ分析のための _{ｓｔｒｅｐ} ＧＦＰ（４０Ｘ） _Ｈｉｓ６ の産生
ａａＲＳ／ｔＲＮＡオペロンの直交性を評価するためにＭＳ分析用のタンパク質を単離するために、オペロンＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４又はＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）をコードする０．４μＬのｐＭＢ１プラスミドを、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６（ここで、ＸＸＸＸは、ＴＡＧ（ＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４のみ）、ＴＡＧＡ（ＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）のみ）、ＡＧＧＡ、ＡＧＴＡ及びＣＴＡＧのいずれかを表す）のいずれかをそれぞれコードする０．４μＬのｐ１５Ａプラスミドと共に、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１のコピーをコードするｐＲＳＦプラスミドを宿す５０μＬの化学コンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に入れた。我々は、１．５ｍＬのEppendorfチューブ中の４００μＬのＳＯＣ培地中で３７℃及び７５０ｒｐｍで１ｈにわたり形質転換された細胞を回収した。１００μＬのレスキューされた細胞を使用して、２５０ｍＬのErlenmeyerフラスコ中５０ｍＬの選択２ｘＹＴ－ｋｔｓ培地への接種を行い、培養物を３７℃及び２２０ｒｐｍで終夜生育した。５ｍＬの終夜培養物を使用して、使用されたコンストラクトに従ってｎｃＡＡ ＢｏｃＫ １、ＮｍＨ ２、ＣｂｚＫ ３、ＡｌｌｏｃＫ ４及びＰｈｅＩ ５の組合せ（１、２、３、５と共にＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４ － ２、３、４、５と共にＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ））を含有する１００ｍＬの選択２ｘＹＴｋｔｓ培地への接種を行った。培養物をＯＤ_６００ ０．５まで３７℃及び２２０ｒｐｍで２～３ｈ生育し、２ｍＭのＩＰＴＧの最終濃度まで２００μＬの１Ｍ ＩＰＴＧで誘導した。細胞を３７℃及び２２０ｒｐｍで１８ｈ増殖させた。細胞を３２００ｒｃｆで１２分間遠心分離し、Roche社製cOmpleteプロテイナーゼ阻害剤を含有する１０ｍＬのBugBuster中に再懸濁し、１．５分間音波処理（４０％の振幅で２秒のオン、２秒のオフ）し、溶解液を４℃、１５０００ｒｃｆで２０分間遠心分離した。溶解液を４０μＬのニッケルＮＴＡビーズに終夜結合させた。ビーズをＰＢＳ中の２４０μＬの２０ｍＭイミダゾールで６回洗浄した。タンパク質を２０μＬの２５０ｍＭイミダゾール中で９回溶出させた。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析のために3kDa Amicon ultra columnを使用して緩衝液を水に交換した。

【0283】

Ｏ１－ _{ｓｔｒｅｐ} ＧＦＰ（４０ＣＴＡＧ、５０ＴＡＧＡ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ） _Ｈｉｓ６ からの４つの別個のクアドルプレットコドンに応答した４つの別個のｎｃＡＡの組込みの直交性及び効率の評価
４つの別個のクアドルプレットコドン中への４つの別個のｎｃＡＡの組込みの効率及び直交性を評価するために、我々は、オペロンＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）をコードする０．４μＬのｐＭＢ１プラスミドと共にＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６又はＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＣＴＡＧ、５０ＴＡＧＡ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６のいずれかをコードする０．４μＬのｐ１５Ａプラスミドで、Ｏ－ｒｉｂｏＱ１のコピーをコードするｐＲＳＦプラスミドを保有する８μＬの化学コンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。我々は、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおける１８０μＬのＳＯＣ培地中３７℃及び７５０ｒｐｍで１ｈにわたり形質転換された細胞を回収した。３０μＬのレスキューされた細胞を使用して、１．２ｍＬの９６ウェルプレートフォーマットにおける５００μＬの選択２ｘＹＴ－ｋｔｓ培地への接種を行い、培養物を３７℃及び７５０ｒｐｍで終夜生育した。１００μＬの終夜培養物を使用して、２４ウェルプレートフォーマットにおける４つのｎｃＡＡ：４ｍＭのＮｍＨ ２、２ｍＭのＣｂｚＫ ３、４ｍＭのＡｌｌｏｃＫ ４及び２ｍＭのＰｈｅＩ ５のうちの３つの各々の組合せのいずれか、若しくはすべてのｎｃＡＡを含有するか、又はいずれも含有しない４ｍＬの選択２ｘＹＴ－ｋｔｓ培地への接種を行った（Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６はすべてのｎｃＡＡの存在下でのみ生育させた）。細胞を３７℃及び２２０ｒｐｍで２ｈ増殖させ、_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６並びにＯ－ｒｉｂｏＱ１の産生を２ｍＭのＩＰＴＧの最終濃度を与える８μＬの１Ｍ ＩＰＴＧの追加により誘導した。細胞を３７℃及び７５０ｒｐｍで１８ｈ増殖させた。１８０μＬの各々の培養物を９６ウェル平底costarプレートに移し、PHERAstar FSを使用して蛍光及び光学密度を測定した。

【0284】

Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、５０ＣＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６中への１つのアンバーコドン及び３つの別個のクアドルプレットコドンに応答した４つの別個のｎｃＡＡの組込みの直交性及び効率評価のために同じ手順を使用した。しかしながら、ＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４をオペロンとして使用し、Ｏ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、５０ＣＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６をクアドルプレット組込み用のレポーターとして使用した。４ｍＭのＢｏｃＫ １を４ｍＭのＡｌｌｏｃＫ ４の代わりに使用した。

【0285】

３及び４つの別個のｎｃＡＡの組込みのＭＳ分析及び単離された収率の決定のための _{ｓｔｒｅｐ} ＧＦＰ（ＸＸＸＸ） _Ｈｉｓ６ の産生
_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（ＸＸＸＸ）_Ｈｉｓ６の質量分析のためと同じタンパク質産生のための手順をレポーター、オペロン及びｎｃＡＡの以下の組合せと共に使用した：ＲＳ３／ｔＲＮＡ３及び４ｍＭのＢｏｃＫ １、４ｍＭのＮｍＨ ２、２ｍＭのＣｂｚＫ ３と共にＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、又はＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４及び４ｍＭのＢｏｃＫ １、４ｍＭのＮｍＨ ２、２ｍＭのＣｂｚＫ ３、２ｍＭのＰｈｅＩ ５と共にＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＴＡＧ、５０ＣＴＡＧ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６、又はＲＳ４＿１－２／ｔＲＮＡ４（ｑｕａｄ）及び４ｍＭのＮｍＨ ２、２ｍＭのＣｂｚＫ ３、４ｍＭのＡｌｌｏｃＫ ４、２ｍＭのＰｈｅＩ ５と共にＯ１－_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ（４０ＣＴＡＧ、５０ＴＡＧＡ、１３６ＡＧＧＡ、１５０ＡＧＴＡ）_Ｈｉｓ６。

【0286】

単離された収率を決定するために、１８０μＬの単離されたタンパク質の蛍光を、PHERAstar FSを使用して測定し、_{ｓｔｒｅｐ}ＧＦＰ_Ｈｉｓ６標準品を用いて生成された標準曲線に基づいてタンパク質濃度を算出した。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析のために3kDa Amicon ultra columnを使用して緩衝液を水に交換した。

【0287】

エレクトロスプレーイオン化質量分析
変性タンパク質試料（約１０μＭ）をＬＣ－ＭＳ分析に供した。簡潔に述べれば、約５０μｌ／分の流量を与えるために改変されたnanoAcquity（Waters社製、ＵＫ）を使用してＣ４ ＢＥＨ １．７μｍ、１．０×１００ｍｍ ＵＰＬＣカラム（Waters社製、ＵＫ）上でタンパク質を分離した。カラムを０．１％ｖ／ｖのギ酸中のアセトニトリルの勾配（２％ｖ／ｖ→８０％ｖ／ｖ）と共に２０分にかけて展開した。分析カラムの出口をエレクトロスプレーイオン化供給源を介してハイブリッド四重極飛行時間質量分光計（Xevo G2、Waters社製、ＵＫ）と直接的に接続した。３０Ｖのコーン電圧と共にポジティブイオンモードにおいて、３００～２０００のｍ／ｚ範囲にかけてデータを取得した。スキャンを手動で足し合わせ、MaxEnt1（Masslynx、Waters社製、ＵＫ）を使用してデコンボリューションした。オンラインツール（http://web.expasy.org/protparam/）を使用して野生型タンパク質の理論的な分子量を最初に計算し、次にｎｃＡＡの理論的な分子量のための補正を手動で行うことによりｎｃＡＡを有するタンパク質の理論的な分子量を算出した。

【0288】

タンデムＭＳ／ＭＳ分析
タンパク質をＭＥＳ緩衝液と共に4-12% NuPAGE Bis-Tris gel（Invitrogen社製）上に流し、InstantBlue（Expedeon社製）を使用して短時間染色した。バンドを切除し、水中に貯蔵した。トリプシン消化及びタンデムＭＳ／ＭＳ分析はMark Skehel（Biological Mass Spectrometry and Proteomics Laboratory、MRC Laboratory of Molecular BIology）により行われた。

【0289】

方法セクションのための参考文献
1. Salis, H. M., Mirsky, E. A. & Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27, 946-950, doi:10.1038/nbt.1568 (2009).
2. Dunkelmann, D. L., Willis, J. C. W., Beattie, A. T. & Chin, J. W. Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non-canonical amino acids. Nat. Chem. 12, 535-544, doi:10.1038/s41557-020-0472-x (2020).
3. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M. & Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444, doi:10.1038/nature08817 (2010).
4. Wang, K. et al. Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. Nat. Chem. 6, 393-403, doi:10.1038/nchem.1919 (2014).

【0290】

【表1】

【0291】

【表2】

【0292】

補足表３及び表４は、刊行物：Daniel L. Dunkelmann1, Sebastian B. Oehm, Adam T. Beattie, Jason W. Chin; 「A 68-codon genetic code to incorporate four distinct non-canonical amino acids enabled by automated orthogonal mRNA discovery」において見出され、その全体が参照により組み込まれる。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【国際調査報告】