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特表2024-527408記憶ナチュラルキラー細胞の拡大

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-24

(54)【発明の名称】記憶ナチュラルキラー細胞の拡大

(51)【国際特許分類】

C12N 5/0783 20100101AFI20240717BHJP

A61K 35/17 20150101ALI20240717BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240717BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20240717BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240717BHJP

C12N 15/62 20060101ALI20240717BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20240717BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20240717BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

A61K35/17 ZNA

A61P35/00

A61P35/02

C12N5/10

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024502087

(86)(22)【出願日】2022-07-14

(85)【翻訳文提出日】2024-03-08

(86)【国際出願番号】 US2022037178

(87)【国際公開番号】W WO2023288007

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】63/222,306

(32)【優先日】2021-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524016541

【氏名又は名称】ウーゲン，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤和彦

(72)【発明者】

【氏名】サリバン，ライアンパトリック

(72)【発明者】

【氏名】クロバク，ケネスエム．

(72)【発明者】

【氏名】クーパー，マシュー

(72)【発明者】

【氏名】マティアー，メアリーエリザベス

(72)【発明者】

【氏名】ゴヴェロ，ジェニファーエル．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BB19

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087AA04

4C087BB37

4C087CA04

4C087DA18

4C087DA32

4C087NA20

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本開示は、概して、とりわけ、記憶様及びサイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を含めたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、それを作成し及び例えば癌の治療に使用する方法、ＮＫ細胞の抗腫瘍特性を増加させる方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

順次、
ａ）精製されたＮＫ細胞を拡大すること；及び
ｂ）前記ＮＫ細胞をプライミングすること
によって作製される精製された記憶ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団。

【請求項2】

精製されたＮＫ細胞を同時にプライミング及び拡大することによって作製される精製された記憶ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団。

【請求項3】

前記ＮＫ細胞が、新鮮な又は凍結された白血球アフェレーシス産物又は供血から濃縮される、請求項１又は２に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項4】

前記ＮＫ細胞が、リンパ球前駆細胞から分化する、請求項１又は２に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項5】

前記ＮＫ細胞が、ネガティブ又はポジティブ選択、又はこれらの組み合わせによって精製される、請求項１又は２に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項6】

前記ＮＫ細胞が、
・ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、及びＩＬ－３５のうちの１つ以上；
・ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上；及び
・ＩＬ－１８、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、及びＩＬ－３６ｇのうちの１つ以上；
又はその機能性断片、及び／又はその機能性断片を含む融合タンパク質、又は前述のいずれかの組み合わせ
への曝露によってプライミングされる、請求項１又は２に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項7】

前記ＮＫ細胞が、１８ｔ１５－１２ｓへの曝露によってプライミングされる、請求項６に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項8】

前記ＮＫ細胞が、１分～２４時間にわたってプライミングされる、請求項１～７のいずれか一項に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項9】

前記ＮＫ細胞が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８への曝露によってプライミングされる、請求項６に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項10】

前記ＮＫ細胞が、１分～２４時間にわたってプライミングされる、請求項９に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項11】

前記ＮＫ細胞が、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１への曝露によって拡大される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項12】

前記ＮＫ細胞が、１～４０日間にわたって拡大される、請求項１１に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項13】

前記記憶ＮＫ表現型が、未処理のＮＫ細胞と比較したときのＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＮＫＧ２Ａ発現の増加、並びにＣＤ１６発現の維持によって指示される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項14】

前記記憶ＮＫ細胞に、未処理のＮＫ細胞と比較して、
・癌細胞に対する細胞傷害性の改善；
・持続性の改善；
・抗腫瘍活性の改善；及び／又は
・サイトカイン産生の増加；
のうちの１つ以上が見られる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項15】

前記癌細胞が、Ｋ５６２細胞である、請求項１４に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項16】

前記産生されるサイトカインが、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１４に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項17】

持続性が、免疫不全マウスにおいて１～１４日間にわたって測定されるとおりである、請求項１４に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項18】

前記マウスが、ＮＳＧマウスである、請求項１７に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項19】

抗腫瘍活性が、免疫不全マウスにおける癌細胞の腫瘍成長の低減として測定される、請求項１４に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項20】

前記ＮＫ細胞が、サイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項21】

ａ）標的細胞上の抗原を標的化する少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）ヒンジドメイン；
ｃ）膜貫通ドメイン；
ｄ）任意選択で、１つ以上の共刺激ドメイン；及び
ｅ）細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を加えて含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の記憶ＮＫ細胞。

【請求項22】

ａ）濃縮したＮＫ細胞集団を精製すること；
ｂ）前記ＮＫ細胞を拡大すること；及び
ｃ）前記ＮＫ細胞をプライミングすること
を含む記憶ＮＫ細胞を作成する方法。

【請求項23】

ａ）濃縮したＮＫ細胞集団を精製すること；及び
ｂ）前記ＮＫ細胞を同時にプライミング及び拡大すること
を含む記憶ＮＫ細胞を作成する方法。

【請求項24】

前記ＮＫ細胞が、新鮮な又は凍結された白血球アフェレーシス産物又は供血から濃縮される、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ＮＫ細胞が、リンパ球前駆細胞から分化する、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項26】

前記ＮＫ細胞が、ネガティブ又はポジティブ選択、又はこれらの組み合わせによって精製される、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項27】

【請求項28】

前記ＮＫ細胞が、１８ｔ１５－１２ｓへの曝露によってプライミングされる、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＮＫ細胞が、１分～２４時間にわたってプライミングされる、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＮＫ細胞が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８への曝露によってプライミングされる、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

前記ＮＫ細胞が、２～４０日間にわたってプライミングされる、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記ＮＫ細胞が、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１への曝露によって拡大される、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項33】

前記ＮＫ細胞が、１～４０日間にわたって拡大される、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項34】

前記記憶ＮＫ表現型が、未処理のＮＫ細胞と比較したときのＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＮＫＧ２Ａ発現の増加、並びにＣＤ１６発現の維持によって指示される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記記憶ＮＫ細胞に、未処理のＮＫ細胞と比較して、
・癌細胞に対する細胞傷害性の改善；
・持続性の改善；
・抗腫瘍活性の改善；及び／又は
・サイトカイン産生の増加；
のうちの１つ以上が見られる、請求項２２～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記癌細胞が、Ｋ５６２細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記産生されるサイトカインが、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

持続性が、免疫不全マウスにおいて１～１４日間にわたって測定されるとおりである、請求項３５に記載の方法。

【請求項39】

前記マウスが、ＮＳＧマウスである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記抗腫瘍活性の改善が、免疫不全マウスにおける癌細胞の腫瘍成長の低減である、請求項３５に記載の方法。

【請求項41】

前記細胞が、サイトカイン誘導性ＭＬ（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

増殖性悪性腫瘍を治療する方法であって、請求項１～２１のいずれか一項に記載の記憶ＮＫ細胞、又は請求項２２～４１のいずれか一項に記載の方法により作成されるとおりの記憶ＮＫ細胞の、それを必要としている患者への投与を含む方法。

【請求項43】

前記細胞が、新鮮なまま患者に投与される、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記増殖性悪性腫瘍が、癌である、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記癌が、血液癌である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記血液癌が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群から選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記血液癌が、Ｂ細胞リンパ腫である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記Ｂ細胞リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）から選択される、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記血液癌が、Ｔ細胞リンパ腫である、請求項４６に記載の方法。

【請求項50】

前記Ｔ細胞リンパ腫が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｔ－ＣＬＬ）、及びセザリー症候群から選択される、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記血液癌が、白血病である、請求項４６に記載の方法。

【請求項52】

前記白血病が、急性骨髄（又は骨髄性）白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄（又は骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性（又はリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及びヘアリー細胞白血病から選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記血液癌が、形質細胞悪性腫瘍である、請求項４６に記載の方法。

【請求項54】

前記形質細胞悪性腫瘍が、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫から選択される、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記癌が、固形腫瘍である、請求項４４に記載の方法。

【請求項56】

前記固形腫瘍が、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、又は癌腫から選択される、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記固形腫瘍が、脳、頭部、頸部、乳房、肺（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、生殖器系（例えば、卵巣）、上部消化管、膵臓、肝臓、腎系（例えば、腎臓）、膀胱、前立腺又は結腸直腸の腫瘍である、請求項５５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０２１年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２２２，３０６号の優先権の利益を主張するものであり、この開示は、その全体が本明細書に書かれたものとして参照により援用される。

【0002】

本開示は、概して、とりわけ、記憶／記憶様及びサイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を含めた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、それを作成し及び例えば癌の治療に使用する方法、及びＮＫ細胞の抗腫瘍特性を増加させる方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、グランザイム及びパーフォリンを標的に向けて放出することによって抗体依存性細胞毒性を呈する細胞傷害性リンパ球として特徴付けられることの多い一群の自然免疫細胞を構成する。ほとんどのＮＫ細胞は、様々な活性化型及び抑制型受容体の集まりに加え、特異的な細胞表面マーカープロファイル（例えば、ＣＤ３、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ５７＋、ＣＤ８＋）を有する。最近になってＮＫ細胞は、ある種の癌治療の重要な構成要素になりつつあるが、全血中のＮＫ細胞の割合は比較的低いため、多量のＮＫ細胞の生成が大きな障害となっている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

当該技術分野においては、記憶ＮＫ細胞を生成する様々な方法が公知であり、その全て又はほぼ全てが、低収率、フィーダー細胞の使用、及び高価な試薬など、様々な欠点を抱えている。結果的に、記憶ＮＫ細胞を多量に生み出す改良されたシステム及び方法を提供することが必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書には、概念的に単純且つ効率的なやり方で記憶／記憶様ＮＫ細胞の生成及び拡大を可能にする組成物及び方法が開示される。記憶ＮＫ細胞は、記憶ＮＫ細胞を形成するためのＮＫ細胞のプライミングと、所望の分量への拡大とを同時に行うプロセスで生成することができる。或いは、ＮＫ細胞を所望の分量に拡大し、次にプライミングすることにより、記憶ＮＫ細胞が形成される。

【0006】

配列の簡単な説明
表４及び表５の配列番号１～４８は、キメラ抗原受容体の様々な構成要素の配列である。

【0007】

配列番号４９～５０は、ＥＦＰ７ｔ１５－２１ｓを作り上げる例示的な拡大融合タンパク質（ＥＦＰ）鎖の配列である。

【0008】

配列番号５１～７０は、例示的な架橋剤抗組織因子抗体ＡＴＦ１の配列である。

【0009】

配列番号７１～７２は、ＰＦＰ１８ｔ１５－１２ｓを作り上げる例示的なプライミング融合タンパク質（ＰＦＰ）鎖の配列である。

【図面の簡単な説明】

【0010】

図面の簡単な説明

【図1】拡大剤とプライミング剤との所与の組み合わせ（７ｔ１５－２１ｓ＋ＡＴＦ１、１８ｔ１５－１２ｓ）によって作製した記憶ＮＫ細胞についての、所与のエフェクター対標的細胞比での、記憶ＮＫ細胞による６／７日目のインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図2】拡大剤とプライミング剤との所与の組み合わせ（７ｔ１５－２１ｓ＋ＡＴＦ１、１８ｔ１５－１２ｓ）によって作製した記憶ＮＫ細胞についての、所与のエフェクター対標的細胞比での、記憶ＮＫ細胞による１３日目のインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図3】拡大剤とプライミング剤との所与の組み合わせ（７ｔ１５－２１ｓ＋ＡＴＦ１、１８ｔ１５－１２ｓ）によって作製した記憶ＮＫ細胞についての、所与のエフェクター対標的細胞比での、記憶ＮＫ細胞による１７日目のインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図4】拡大剤とプライミング剤との所与の組み合わせ（７ｔ１５－２１ｓ＋ＡＴＦ１、１８ｔ１５－１２ｓ）によって作製した記憶ＮＫ細胞による癌細胞（Ｋ５６２）殺傷の細胞比のＥＣ５０を示す。

【図5】所与の細胞密度における培養下で所与の日数にわたって刺激したＮＫ細胞の数の累積変化倍数を示す。

【図6】２５０ｎＭのプライミング剤で所与の時間長さにわたってプライミングした拡大後の細胞についての所与のエフェクター：標的比でのインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図7】２５０ｎＭプライミング剤１８ｔ１５－１２ｓで所与の時間長さにわたってプライミングした拡大後の細胞についての、２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６日目における、２０：１のエフェクター：標的比でのインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図8】２５０ｎＭプライミング剤１８ｔ１５－１２ｓで所与の時間長さにわたってプライミングした拡大後の細胞についての、２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６日目における、４：１のエフェクター：標的比でのインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図9】２５０ｎＭプライミング剤１８ｔ１５－１２ｓで所与の時間長さにわたってプライミングした拡大後の細胞についての、２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６日目における、０．８：１のエフェクター：標的比でのインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図10】２５０ｎＭプライミング剤１８ｔ１５－１２ｓで所与の継続期間にわたってプライミングした拡大後の細胞についての、２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６日目における、０．１６：１のエフェクター：標的比でのインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図11】単独又はＫ５６２標的細胞の存在下のいずれかで２４時間培養した後の細胞培養物（Ｋ５６２のみ、拡大したＮＫ細胞、及び拡大し且つ２５０ｎＭプライミング剤１８ｔ１５－１２ｓで所与の継続期間にわたってプライミングしたＮＫ細胞）におけるＩＦＮｇ産生を示す。

【図12】拡大のみ、プライミング後に拡大、及び拡大後にプライミングによって作製したＮＫ細胞の拡大倍数を示す。

【図13】単離後、３時間プライミング、一晩プライミング、一晩プライミング後に拡大、拡大後に３時間プライミング、拡大後に一晩プライミング、又は拡大のみとしたＮＫ細胞についての所与のエフェクター：標的比でのインビトロ癌細胞（Ｋ５６２）殺傷率を示す。

【図14】単離後、３時間プライミング、一晩プライミング、一晩プライミング後に拡大、拡大後に３時間プライミング、拡大後に一晩プライミング、又は拡大のみとしたＮＫ細胞の細胞Ｋ５６２殺傷ＥＣ_５０を示す。

【図15】単離後、３時間プライミング、一晩プライミング、一晩プライミング後に拡大、拡大後に３時間プライミング、拡大後に一晩プライミング、又は拡大のみとしたＮＫ細胞からの細胞培養物（ＮＫ細胞単独、又はＫ５６２細胞有り）におけるＩＦＮｇ産生を示す。

【図16】免疫不全ＮＳＧマウスの血中における、３時間プライミング、一晩プライミング、一晩プライミング後に拡大、拡大のみ、又は拡大後に３時間プライミングとしたことによって作製したＮＫ細胞の数の、ｔ＝０での注射後７日目におけるバックグラウンドと比べた変化倍数を示す。

【図17】拡大した、及び拡大後にプライミングしたＮＫ細胞による１４日目のＫ５６２－Ｌｕｃ殺傷を示す。

【図18】拡大した、及び拡大後にプライミングしたＮＫ細胞によるＫ５６２－Ｌｕｃ殺傷のＥＣ５０を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

詳細な説明
本明細書には、概念的に単純且つ効率的なやり方で記憶／記憶様ＮＫ細胞の生成及び拡大を可能にする組成物及び方法が提供される。記憶ＮＫ細胞は、記憶ＮＫ細胞を形成するためのＮＫ細胞のプライミングと、所望の分量への拡大とを同時に行うプロセスで生成することができる。或いは、ＮＫ細胞を所望の分量に拡大し、次にプライミングすることにより、記憶ＮＫ細胞が形成される。

【0012】

このように、本明細書には、順次、
ａ）精製されたＮＫ細胞の集団を拡大すること；及び
ｂ）ＮＫ細胞をプライミングすること
によって作製される記憶ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が提供される。

【0013】

また、本明細書には、精製されたＮＫ細胞の集団を同時にプライミング及び拡大することによって作製される精製された記憶ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞も提供される。

【0014】

また、本明細書には、順次、
ａ）ＮＫ細胞の集団を精製すること；
ｂ）ＮＫ細胞を拡大すること；及び
ｃ）ＮＫ細胞をプライミングすること
によって作製される記憶ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞も提供される。

【0015】

また、本明細書には、
ａ）ＮＫ細胞の集団を精製すること；及び
ｂ）ＮＫ細胞を同時にプライミング及び拡大すること
によって作製される記憶ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞も提供される。

【0016】

更に本明細書には、
ａ）精製されたＮＫ細胞集団を拡大すること；及び次に
ｂ）ＮＫ細胞をプライミングすること
を含む記憶ＮＫ細胞を作成する方法が開示される。

【0017】

更に本明細書には、精製されたＮＫ細胞集団を同時にプライミング及び拡大することを含む記憶ＮＫ細胞を作成する方法が開示される。

【0018】

更に本明細書には、
ａ）ＮＫ細胞の集団を精製すること；
ｂ）ＮＫ細胞を拡大すること；及び次に
ｃ）ＮＫ細胞をプライミングすること
を含む記憶ＮＫ細胞を作成する方法が開示される。

【0019】

更に本明細書には、
ａ）ＮＫ細胞の集団を精製すること；及び
ｂ）ＮＫ細胞を同時にプライミング及び拡大すること
を含む記憶ＮＫ細胞を作成する方法が開示される。

【0020】

また、以下の実施形態も提供される。

【0021】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞集団は、供血、又は新鮮な若しくは予め凍結保存されていた白血球アフェレーシス産物から出発して精製される。一部の実施形態において、精製は、ポジティブ選択（例えば、Miltenyi CliniMACS Prodigyにて）を経て実施される。一部の実施形態において、精製は、ネガティブ選択（例えば、StemCell EasySepのＮＫ細胞濃縮キット）を経て実施される。一部の実施形態において、精製は、ポジティブ選択とネガティブ選択との組み合わせを用いて実施される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、リンパ球前駆細胞から分化させる。

【0022】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、サイトカインの組み合わせ、又はその機能性断片、及び／又はその機能性断片を含む融合タンパク質、又は前述のいずれかの組み合わせと、任意選択で架橋剤とを含む拡大剤への曝露によって拡大される。

【0023】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、
・ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上、又はその機能性断片；又は
・ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上の機能性断片を含む融合タンパク質；
及び任意選択で架橋剤；又は
・ＮＫ細胞架橋抗体及び拡大サイトカインで機能化したマイクロスフェア；
又は前述のいずれかの組み合わせ
を含む拡大剤への曝露によって拡大される。

【0024】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、及びＩＬ－１５の組み合わせ、又はその機能性断片、及び／又はその機能性断片を含む融合タンパク質、又は前述のいずれかの組み合わせを含む拡大剤への曝露によって拡大される。

【0025】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、及びＩＬ－１５の機能性断片を含む融合タンパク質を含む拡大剤への曝露によって拡大される。

【0026】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、７ｔ１５－２１ｓを含む拡大剤への曝露によって拡大される。

【0027】

一部の実施形態において、拡大剤は架橋剤を含む。一部の実施形態において、架橋剤は架橋抗体である。一部の実施形態において、架橋抗体はＡＴＦ１である。

【0028】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、７ｔ１５－２１ｓとＡＴＦ１とを含む拡大剤への曝露によって拡大される。

【0029】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞架橋抗体及び拡大サイトカインで機能化したマイクロスフェアを含む拡大剤への曝露によって拡大される。

【0030】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１日～４０日間にわたる拡大剤への曝露によって拡大される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、７日～２１日間にわたる拡大剤への曝露によって拡大される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、約１４日間にわたる拡大剤への曝露によって拡大される。

【0031】

一部の実施形態において、拡大剤は７ｔ１５－２１ｓとＡＴＦ１とを含む。一部の実施形態において、拡大剤は、０．１～３００ｎｍの濃度の７ｔ１５－２１ｓと、０．０１～２００ｎｍの濃度のＡＴＦ１とを含む。一部の実施形態において、拡大剤は、０．２～２００ｎｍの濃度の７ｔ１５－２１ｓと、０．０１～１００ｎｍの濃度のＡＴＦ１とを含む。一部の実施形態において、拡大剤は、約５０ｎｍの濃度の７ｔ１５－２１ｓと、約２５ｎｍの濃度のＡＴＦ１とを含む。

【0032】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、約１４日間にわたる７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１への曝露によって拡大される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、約１４日間にわたる約５０ｎｍの濃度の７ｔ１５－２１ｓ及び約２５ｎｍの濃度のＡＴＦ１への曝露によって拡大される。

【0033】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、例えば、サイトカインの組み合わせ、又はその機能性断片、及び／又はその機能性断片を含む融合タンパク質、又は前述のいずれかの組み合わせから選択されるプライミング剤への曝露によってプライミングされる。

【0034】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、
・ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、及びＩＬ－３５のうちの１つ以上；
・ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上；及び
・ＩＬ－１８、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、及びＩＬ－３６ｇのうちの１つ以上；
又はその機能性断片、及び／又はその機能性断片を含む融合タンパク質、又は前述のいずれかの組み合わせ
を含むプライミング剤への曝露によってプライミングされる。

【0035】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の組み合わせを含むプライミング剤への曝露によってプライミングされる。

【0036】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の機能性断片を含む融合タンパク質を含むプライミング剤への曝露によってプライミングされる。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、融合タンパク質１８ｔ１５－１２ｓを含むプライミング剤への曝露によってプライミングされる。

【0037】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、２００～３００ｎＭの濃度の１８ｔ１５－１２ｓでプライミングされる。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、２５０ｎｍの濃度の１８ｔ１５－１２ｓでプライミングされる。

【0038】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１分～２４時間にわたってプライミングされる。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、０．５～１６時間にわたってプライミングされる。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１～３時間にわたってプライミングされる。

【0039】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は凍結保存される。

【0040】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は初めに拡大され、次にプライミングされる。

【0041】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、出発数の１０倍超に拡大される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、出発数の１００倍超に拡大される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、出発数の１０００倍超に拡大される。

【0042】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、同時に拡大及びプライミングされる。

【0043】

一部の実施形態において、細胞は、記憶様（ＭＬ）ＮＫ表現型を有する。

【0044】

一部の実施形態において、記憶様表現型は、細胞表面ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１６、及び／又はＮＫＧ２Ａの発現レベルによって指示される。

【0045】

一部の実施形態において、記憶ＮＫ細胞には、プライミングされていないＮＫ細胞と比較して、
ａ）癌細胞に対する細胞傷害性の改善；
ｂ）持続性の改善；
ｃ）抗腫瘍活性の改善；及び／又は
ｄ）サイトカイン産生の増加；
のうちの１つ以上が見られる。

【0046】

一部の実施形態において、癌細胞は、Ｋ５６２細胞である。

【0047】

一部の実施形態において、産生されるサイトカインは、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びこれらの組み合わせから選択される。

【0048】

一部の実施形態において、持続性は、免疫不全マウスにおいて１～１４日間にわたって測定されるとおりである。

【0049】

一部の実施形態において、マウスは、ＮＳＧマウスである。

【0050】

一部の実施形態において、抗腫瘍活性は、免疫不全マウスにおけるＫ５６２細胞の腫瘍成長の低減として測定される。

【0051】

一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、サイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である。

【0052】

一部の実施形態において、記憶ＮＫ細胞は、加えて、
ａ）標的細胞上の抗原を標的化する少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ）ヒンジドメイン；
ｃ）膜貫通ドメイン；
ｄ）任意選択で、１つ以上の共刺激ドメイン；及び
ｅ）細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0053】

また、本明細書には、増殖性悪性腫瘍を治療する方法であって、上記の実施形態に係る記憶ＮＫ細胞、又は上記の実施形態の方法によって作成されるとおりの細胞の、それを必要としている患者への投与を含む方法も提供される。

【0054】

一部の実施形態において、細胞は、新鮮なまま患者に投与される。

【0055】

一部の実施形態において、増殖性悪性腫瘍は、癌である。

【0056】

一部の実施形態において、癌は、血液癌である。

【0057】

一部の実施形態において、血液癌は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群から選択される。

【0058】

一部の実施形態において、血液癌は、Ｂ細胞リンパ腫である。

【0059】

一部の実施形態において、Ｂ細胞リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）から選択される。

【0060】

一部の実施形態において、血液癌は、Ｔ細胞リンパ腫である。

【0061】

一部の実施形態において、Ｔ細胞リンパ腫は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｔ－ＣＬＬ）、及びセザリー症候群から選択される。

【0062】

一部の実施形態において、血液癌は、白血病である。

【0063】

一部の実施形態において、白血病は、急性骨髄（又は骨髄性）白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄（又は骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性（又はリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及びヘアリー細胞白血病から選択される。

【0064】

一部の実施形態において、血液癌は、形質細胞悪性腫瘍である。

【0065】

一部の実施形態において、形質細胞悪性腫瘍は、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫から選択される。

【0066】

一部の実施形態において、癌は、固形腫瘍である。

【0067】

一部の実施形態において、固形腫瘍は、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、又は癌腫から選択される。

【0068】

一部の実施形態において、固形腫瘍は、脳、頭部、頸部、乳房、肺（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、生殖器系（例えば、卵巣）、上部消化管、膵臓、肝臓、腎系（例えば、腎臓）、膀胱、前立腺又は結腸直腸の腫瘍である。

【0069】

列挙される実施形態
本明細書にはまた、以下の実施形態も提供される：

【0070】

実施形態１．順次、
ａ）精製されたＮＫ細胞を拡大すること；及び
ｂ）ＮＫ細胞をプライミングすること
によって作製される精製された記憶ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団。

【0071】

実施形態２．精製されたＮＫ細胞を同時にプライミング及び拡大することによって作製される精製された記憶ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団。

【0072】

実施形態３．ＮＫ細胞が、新鮮な又は凍結された白血球アフェレーシス産物又は供血から濃縮される、実施形態１又は２に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0073】

実施形態４．ＮＫ細胞がリンパ球前駆細胞から分化する、実施形態１又は２に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0074】

実施形態５．ＮＫ細胞が、ネガティブ又はポジティブ選択、又はこれらの組み合わせによって精製される、実施形態１又は２に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0075】

実施形態６．ＮＫ細胞が、
・ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、及びＩＬ－３５のうちの１つ以上；
・ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上；及び
・ＩＬ－１８、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、及びＩＬ－３６ｇのうちの１つ以上；
又はその機能性断片、及び／又はその機能性断片を含む融合タンパク質、又は前述のいずれかの組み合わせ
への曝露によってプライミングされる、実施形態１又は２に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0076】

実施形態７．ＮＫ細胞が、１８ｔ１５－１２ｓへの曝露によってプライミングされる、実施形態６に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0077】

実施形態８．ＮＫ細胞が、１分～２４時間にわたってプライミングされる、実施形態１～７のいずれか一つに記載の記憶ＮＫ細胞。

【0078】

実施形態９．ＮＫ細胞が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８への曝露によってプライミングされる、実施形態６に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0079】

実施形態１０．ＮＫ細胞が、１分～２４時間にわたってプライミングされる、実施形態９に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0080】

実施形態１１．ＮＫ細胞が、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１への曝露によって拡大される、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の記憶ＮＫ細胞。

【0081】

実施形態１２．ＮＫ細胞が、１～４０日間にわたって拡大される、実施形態１１に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0082】

実施形態１３．記憶ＮＫ表現型が、未処理のＮＫ細胞と比較したときの、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＮＫＧ２Ａ発現の増加、並びにＣＤ１６発現の維持によって指示される、実施形態１～１２のいずれか一つに記載の記憶ＮＫ細胞。

【0083】

実施形態１４．未処理のＮＫ細胞と比較して、記憶ＮＫ細胞に、
・癌細胞に対する細胞傷害性の改善；
・持続性の改善；
・抗腫瘍活性の改善；及び／又は
・サイトカイン産生の増加
のうちの１つ以上が見られる、実施形態１～１３のいずれか一つに記載の記憶ＮＫ細胞。

【0084】

実施形態１５．癌細胞がＫ５６２細胞である、実施形態１４に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0085】

実施形態１６．産生されるサイトカインが、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びこれらの組み合わせから選択される、実施形態１４に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0086】

実施形態１７．持続性が、免疫不全マウスにおいて１～１４日間にわたって測定されるとおりである、実施形態１４に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0087】

実施形態１８．マウスがＮＳＧマウスである、実施形態１７に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0088】

実施形態１９．抗腫瘍活性が、免疫不全マウスにおける癌細胞の腫瘍成長の低減として測定される、実施形態１４に記載の記憶ＮＫ細胞。

【0089】

実施形態２０．ＮＫ細胞が、サイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の記憶ＮＫ細胞。

【0090】

実施形態２１．加えて、
ａ．標的細胞上の抗原を標的化する少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメイン；
ｂ．ヒンジドメイン；
ｃ．膜貫通ドメイン；
ｄ．任意選択で、１つ以上の共刺激ドメイン；及び
ｅ．細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、実施形態１～２０のいずれか一つに記載の記憶ＮＫ細胞。

【0091】

実施形態２２．記憶ＮＫ細胞を作成する方法であって、
ａ）濃縮したＮＫ細胞集団を精製すること；
ｂ）ＮＫ細胞を拡大すること；及び
ｃ）ＮＫ細胞をプライミングすること
を含む方法。

【0092】

実施形態２３．記憶ＮＫ細胞を作成する方法であって、
ａ）濃縮したＮＫ細胞集団を精製すること；及び
ｂ）ＮＫ細胞を同時にプライミング及び拡大すること
を含む方法。

【0093】

実施形態２４．ＮＫ細胞が、新鮮な又は凍結された白血球アフェレーシス産物又は供血から濃縮される、実施形態２２又は２３に記載の方法。

【0094】

実施形態２５．ＮＫ細胞が、リンパ球前駆細胞から分化する、実施形態２２又は２３に記載の方法。

【0095】

実施形態２６．ＮＫ細胞が、ネガティブ又はポジティブ選択、又はこれらの組み合わせによって精製される、実施形態２２又は２３に記載の方法。

【0096】

実施形態２７．ＮＫ細胞が、
・ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、及びＩＬ－３５のうちの１つ以上；
・ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上；及び
・ＩＬ－１８、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、及びＩＬ－３６ｇのうちの１つ以上；
又はその機能性断片、及び／又はその機能性断片を含む融合タンパク質、又は前述のいずれかの組み合わせ
への曝露によってプライミングされる、実施形態２２又は２３に記載の方法。

【0097】

実施形態２８．ＮＫ細胞が、１８ｔ１５－１２ｓへの曝露によってプライミングされる、実施形態２７に記載の方法。

【0098】

実施形態２９．ＮＫ細胞が、１分～２４時間にわたってプライミングされる、実施形態２８に記載の方法。

【0099】

実施形態３０．ＮＫ細胞が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８への曝露によってプライミングされる、実施形態２７に記載の方法。

【0100】

実施形態３１．ＮＫ細胞が、２～４０日間にわたってプライミングされる、実施形態２８に記載の方法。

【0101】

実施形態３２．ＮＫ細胞が、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１への曝露によって拡大される、実施形態２２又は２３に記載の方法。

【0102】

実施形態３３．ＮＫ細胞が、１～４０日間にわたって拡大される、実施形態２２又は２３に記載の方法。

【0103】

実施形態３４．記憶ＮＫ表現型が、未処理のＮＫ細胞と比較した、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＮＫＧ２Ａ発現の増加、並びにＣＤ１６発現の維持によって指示される、実施形態１～３３のいずれか一つに記載の方法。

【0104】

実施形態３５．未処理のＮＫ細胞と比較して、記憶ＮＫ細胞に、
・癌細胞に対する細胞傷害性の改善；
・持続性の改善；
・抗腫瘍活性の改善；及び／又は
・サイトカイン産生の増加
のうちの１つ以上が見られる、実施形態２２～３４のいずれか一つに記載の方法。

【0105】

実施形態３６．癌細胞がＫ５６２細胞である、実施形態３５に記載の方法。

【0106】

実施形態３７．産生されるサイトカインが、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びこれらの組み合わせから選択される、実施形態３５に記載の方法。

【0107】

実施形態３８．持続性が、免疫不全マウスにおいて１～１４日間にわたって測定されるとおりである、実施形態３５に記載の方法。

【0108】

実施形態３９．マウスが、ＮＳＧマウスである、実施形態３８に記載の方法。

【0109】

実施形態４０．抗腫瘍活性の改善が、免疫不全マウスにおける癌細胞の腫瘍成長の低減である、実施形態３５に記載の方法。

【0110】

実施形態４１．細胞が、サイトカイン誘導性ＭＬ（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞である、実施形態１～４０のいずれか一つに記載の方法。

【0111】

実施形態４２．増殖性悪性腫瘍を治療する方法であって、実施形態１～２１のいずれか一つに記載の記憶ＮＫ細胞、又は実施形態２２～４１のいずれか一つに記載の方法によって作成されるとおりの記憶ＮＫ細胞の、それを必要としている患者への投与を含む方法。

【0112】

実施形態４３．細胞が、新鮮なまま患者に投与される、実施形態４２に記載の方法。

【0113】

実施形態４４．増殖性悪性腫瘍が、癌である、実施形態４２に記載の方法。

【0114】

実施形態４５．癌が、血液癌である、実施形態４４に記載の方法。

【0115】

実施形態４６．血液癌が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群から選択される、実施形態４４に記載の方法。

【0116】

実施形態４７．血液癌が、Ｂ細胞リンパ腫である、実施形態４６に記載の方法。

【0117】

実施形態４８．Ｂ細胞リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）から選択される、実施形態４７に記載の方法。

【0118】

実施形態４９．血液癌が、Ｔ細胞リンパ腫である、実施形態４６に記載の方法。

【0119】

実施形態５０．Ｔ細胞リンパ腫が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｔ－ＣＬＬ）、及びセザリー症候群から選択される、実施形態４９に記載の方法。

【0120】

実施形態５１．血液癌が、白血病である、実施形態４６に記載の方法。

【0121】

実施形態５２．白血病が、急性骨髄（又は骨髄性）白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄（又は骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性（又はリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及びヘアリー細胞白血病から選択される、実施形態５１に記載の方法。

【0122】

実施形態５３．血液癌が、形質細胞悪性腫瘍である、実施形態４６に記載の方法。

【0123】

実施形態５４．形質細胞悪性腫瘍が、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫から選択される、実施形態５３に記載の方法。

【0124】

実施形態５５．癌が、固形腫瘍である、実施形態４４に記載の方法。

【0125】

実施形態５６．固形腫瘍が、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、肉腫、又は癌腫から選択される、実施形態５５に記載の方法。

【0126】

実施形態５７．固形腫瘍が、脳、頭部、頸部、乳房、肺（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、生殖器系（例えば、卵巣）、上部消化管、膵臓、肝臓、腎系（例えば、腎臓）、膀胱、前立腺又は結腸直腸の腫瘍である、実施形態５５に記載の方法。

【0127】

免疫エフェクター細胞の拡大及びプライミング方法
ＮＫ細胞のインビトロ拡大は、サイトカイン、又は、好ましくは、サイトカインの機能性断片を含む拡大融合タンパク質、及びその多連鎖複合体を含む拡大剤を使用する濃縮プロセスで実施し得る。例えば、拡大剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上、又はこれらの組み合わせ、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、及びＩＬ－１５のカクテルを、所望の分量又は拡大倍数のＮＫ細胞を生じさせるのに十分な量で含み得る。かかるサイトカインは、市販品が入手されてもよく、又は当該技術分野において公知の方法により作成されてもよい。又は、例えば、拡大剤は、１つ以上の拡大融合タンパク質、例えば、国際公開第２０２００４７２９９号、国際公開第２０２０４７４７３号、又は国際公開第２０２０２５７６３９号に開示される多連鎖融合タンパク質複合体の中から選択されてもよい、例えば７ｔ１５－２１ｓを、ＮＫ細胞を拡大するのに十分な量で含み得る。７ｔ１５－２１ｓの配列を表１に開示する。

【0128】

【表1】

【0129】

拡大は、加えて、上記に開示される融合タンパク質の連結ドメインを標的化する抗体、例えば抗組織因子抗体など、架橋剤の使用によって容易になる。抗組織因子抗体の例は、当該技術分野において公知である。国際公開第２０２０４７４７３号及び国際公開第２０２０２５７６３９号は、使用されるａ－ＴＦＡｂを開示している。また、米国特許第８，００７，７９５号及び国際公開第２００３０３７９１１号、詳細には、Ｈ３６ハイブリドーマのＣＤＲ及びヒト化フレームワーク領域ＬＣ－０８（図１２）及びＨＣ－０９（図１３）を取り込むＩｇＧ１ヒト化抗体も参照のこと。以下の表Ｘは、ＷＯ’４７３号及びＷＯ’６３９号において使用されるものと思われる、ＵＳ’７９５号及びＷＯ’９１１号に開示される、ＨＣＷＢｉｏｌｏｇｉｃｓから入手される、及び特に指定されない限り以下の実験で使用され、本明細書においてＡＴＦ１と称されるａ－ＴＦＡｂの配列を開示する。ＡＴＦ１ＨＣＤＲ２は、以下の２つの配列のうちの一方である。このように、本明細書に開示されるとおりの拡大剤は、上記に開示されるとおりの１つ以上のサイトカインの組み合わせ又はＥＦＰを、ＡＴＦ１などの架橋剤（その１つ又は複数の配列を表２に開示する）と一緒に含み得る。

【0130】

【表2】

【0131】

【表3】

【0132】

当該技術分野においては代替的な架橋結合方法が公知であり、機能化したマイクロパーティクル（ビーズ）、フィーダー細胞及び細胞膜粒子が挙げられる。多くの場合にフィーダー不要のシステムが好ましい。例えば、抗ＣＤ２及び抗ＮＫｐ４６抗体で機能化された溶解可能なアルギン酸ナトリウムマイクロスフェアを利用するR&D SystemsのCloudzヒトＮＫ細胞拡大キットを本明細書に開示されるとおりの拡大サイトカイン（又はその断片、又はそれを含む融合タンパク質）及びこれらの組み合わせと共に、拡大後にマイクロパーティクルを速やかに溶解させて細胞の回収を容易にするための放出緩衝液に加えて使用し得る。

【0133】

記憶様の性質を獲得するためのプライミングは、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、及びＩＬ－３５のうちの１つ以上；ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上；及びＩＬ－１８、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、及びＩＬ－３６ｇのうちの１つ以上など、刺激性サイトカインの組み合わせを含むプライミング剤で実施される。或いは、プライミング剤は、サイトカインの機能性断片を含むプライミング融合タンパク質、及びその多連鎖複合体を含み得る。例えば、融合タンパク質は、国際公開第２０２００４７２９９号、国際公開第２０２０４７４７３号、又は国際公開第２０２０２５７６３９号に開示される多連鎖融合タンパク質複合体、例えば１８ｔ１５－１２ｓ（ＨＣＷ－９２０１）の中から選択されてもよく、その配列を表３に開示する。

【0134】

【表4】

【0135】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＣＡＲを担持する免疫エフェクター細胞
本明細書にはまた、本明細書に開示されるとおりのポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びそれを発現する免疫エフェクター細胞も提供される。ＣＡＲは、１）細胞外リガンド結合ドメイン、即ち、抗原認識ドメイン、２）ヒンジドメイン、３）膜貫通ドメイン、及び４）細胞質シグナル伝達ドメイン、５）及び任意選択で、共刺激ドメインを典型的に含む組換え融合タンパク質である。

【0136】

ＣＡＲの設計、送達及び発現方法、及びＣＡＲを発現する臨床級の細胞集団の製造方法については、当該技術分野において公知である。ＣＡＲの設計は、概して各細胞型に合わせて調整される。

【0137】

キメラ抗原受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、抗原、典型的には悪性細胞の表面発現抗原を認識して、それに特異的に結合する。細胞外リガンド結合ドメインは、例えば、それが約０．１ｐＭ～約１０μＭ、又は約０．１ｐＭ～約１μＭ、又は約０．１ｐＭ～約１００ｎＭの親和性定数又は相互作用の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合するとき、抗原に特異的に結合する。相互作用の親和性を決定する方法は、当該技術分野において公知である。細胞外リガンド結合ドメインはまた、抗原の第１の多型変異体に対し、それが同じ抗原の第２の多型変異体と比べてそれに選択的に結合するときにも、特異的に結合すると言うことができる。

【0138】

ＣＡＲにおける使用に好適な細胞外リガンド結合ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであってよく、幅広い種類のそれが当該技術分野において公知である。一部の例では、細胞外リガンド結合ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体ベースの認識ドメイン（ｃＡｂＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化バージョン、ｌｇＮＡＲＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化バージョン、ｓｄＡｂＶＨ（シングルドメイン抗体可変ドメイン）及び「ラクダ化」抗体可変ドメインが、使用に好適である。一部の例では、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを持つ単鎖２ドメインＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメインもまた、使用に好適である。一部の実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、標的抗原に対する天然の結合パートナー、又はその機能性断片から構築される。例えば、一般にＣＡＲは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及び膜貫通活性化因子・ＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）のリガンドを標的化してＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの両方を有効に共標的化する多発性骨髄腫の治療のためのＡＰＲＩＬタンパク質の一部分で構築され得る。

【0139】

ＣＡＲがその細胞外リガンド結合ドメインを介して結合する、標的化される抗原は、悪性骨髄（ＡＭＬ）細胞、Ｔ細胞又は他の細胞に発現する抗原であり得る。悪性骨髄（ＡＭＬ）細胞に発現する抗原としては、ＣＤ３３、ＦＬＴ３、ＣＤ１２３、及びＣＬＬ－１が挙げられる。Ｔ細胞に発現する抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲα（ＴＲＡＣ）、及びＴＣＲβが挙げられる。悪性形質細胞に発現する抗原としては、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３８、及びＣＤ１９が挙げられる。悪性Ｂ細胞に発現する抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、及びＣＤ４５が挙げられる。

【0140】

典型的には、細胞外リガンド結合ドメインは、膜貫通（ＴＭ）ドメインによってキメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結される。ペプチドヒンジが細胞外リガンド結合ドメインを膜貫通ドメインに結び付ける。膜貫通ドメインは細胞膜を横断し、ＣＡＲをＴ細胞表面にアンカリングし、及び細胞外リガンド結合ドメインを細胞質シグナル伝達ドメインに結び付け、ひいてはＴ細胞表面上のＣＡＲの発現に影響を与える。

【0141】

膜貫通ドメインは、天然の供給源又は合成の供給源のいずれにも由来し得る。供給源が天然である場合、このドメインは、任意の膜結合型又は膜貫通型タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、及びＰＡＧ／Ｃｂｐに由来し得る（即ち、少なくともこれらの１つ又は複数の膜貫通領域を含む）。或いは、膜貫通ドメインは合成であって、主に疎水性のアミノ酸残基（例えば、ロイシン及びバリン）を含んでもよい。場合によっては、合成膜貫通ドメインの各末端に、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが見られることになる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖アイソフォーム１前駆体（ＮＰ＿００１１３９３４５．１）又はＣＤ２８に由来する。２～１０アミノ酸長など、低分子オリゴペプチド又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと内質ドメインとの間の連結を形成し得る。一部の実施形態において、ＣＡＲは２つ以上の膜貫通ドメインを有し、それらは同じ膜貫通ドメインの繰り返しであってもよく、又は異なる膜貫通ドメインであってもよい。

【0142】

ＮＫ細胞は、幾つもの膜貫通（ＴＭ）アダプターを発現し、これらは、活性化型受容体との会合によって惹起されて活性化シグナルを送る。それが、活性化型受容体からのＴＭドメインの操作を介したＮＫ細胞特異的シグナルの亢進をもたらし、それによって内因性アダプターが付加される。ＴＭアダプターは、活性化シグナルを送る能力のある任意の内因性ＴＭアダプターであってよい。一部の実施形態において、ＴＭアダプターは、ＦｃｅＲ１γ（ＩＴＡＭｘ１）、ＣＤ３ζ（ＩＴＡＭｘ３）、ＤＡＰ１２（ＩＴＡＭｘ１）、又はＤＡＰ１０（ＹｘｘＭ／ＹＩＮＭ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８α、及びＩＬ１５Ｒｂから選択され得る。

【0143】

ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を更に含み得る。用語「ヒンジ領域」（等しく、「ヒンジ」又は「スペーサー」）は、概して、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結する機能を持つ任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。詳細には、ヒンジ領域は、より可動性が高く、且つ接触し易い細胞外リガンド結合ドメインを提供するために使用され、効率的なＣＡＲ発現及び活性のため安定性を付与することができる。ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸及び最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ζ、Ｔ細胞受容体α鎖又はβ鎖、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４など、天然に存在する分子の全て若しくは一部又は抗体定常領域の全て若しくは一部に由来し得る。一部の実施形態において、例えば、ヒンジ配列は、ＣＤ８ａ分子又はＣＤ２８分子に由来する。或いは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、又はヒンジ領域は、完全に合成のヒンジ配列であってもよい。一実施形態において、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８α（配列番号２）、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、又はＩｇＧｌの一部を含み、それと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の配列同一性を有する。

【0144】

抗原認識後、細胞質シグナル伝達ドメインが免疫エフェクター細胞にシグナルを伝達すると、免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つが活性化する。ＮＫ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。通常は細胞質シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合に鎖全体を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインのトランケートされた一部分が使用される点で、それがエフェクター機能を伝達する限りは、かかるトランケートされた一部分をインタクトな鎖の代わりに使用し得る

【0145】

刺激する形で作用する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを持つものであり得る。細胞質シグナル伝達配列を持つＩＴＡＭの例としては、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＩγ、ＦｃεＲＩβ（ＦＣＥＲＩＢ）、及びＦｃεＲＩγ（ＦＣＥＲＩＧ）に由来するものが挙げられる。

【0146】

第１世代のＣＡＲは典型的には、内因性ＴＣＲからのシグナルの一次的な伝達を担うものであるＣＤ３鎖からの細胞質シグナル伝達ドメインを有する。第２世代のＣＡＲは、様々な共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ）からの細胞質シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメインに付加することにより、細胞に追加的なシグナルを提供する。

【0147】

「共刺激ドメイン」は、インビボでのサイトカイン産生、増殖、細胞傷害性、及び／又は持続性を亢進させる共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。前臨床研究では、第２世代のＣＡＲの設計によって抗腫瘍活性が向上することが指し示されている。最近では、第３世代、及び更に後続の世代のＣＡＲにおいて、複数の共刺激ドメインを組み合わせることにより効力が更に増強されている。これらのＣＡＲがグラフトされた細胞では、共刺激受容体／リガンド相互作用と関係なしに、拡大、活性化、持続性、及び腫瘍根絶効率が向上することが実証されている。

【0148】

例えば、ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）それ自体を含むように設計することができ、又はＣＡＲの文脈で有用な任意の他の１つ又は複数の所望の細胞質ドメインと組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）鎖部分と共刺激シグナル伝達領域とを含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。かかる分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤ８、ＣＤ４、ｂ２ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭｙＤ８８、ＢＴＮＬ３、及びＮＫＧ２Ｄが挙げられる。

【0149】

一部の実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインである。一部の実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢの細胞質ドメイン、又はこれらの組み合わせを含む。場合によっては、共刺激シグナル伝達領域は、１つ以上の細胞内シグナル伝達及び／又は共刺激分子の細胞質ドメインを１、２、３、又は４つ持つ。

【0150】

１つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢの細胞質ドメインに、シグナル伝達を亢進させる１つ以上の突然変異を持っていてもよい。一部の実施形態において、開示されるＣＡＲは、Ｙ２０６及び／又はＹ２１８のリン酸化が改変されているＣＤ２８の突然変異形態の細胞質ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。一部の実施形態において、開示されるＣＡＲは、Ｙ２０６に減弱性の突然変異を含み、これはＣＡＲの活性を低減することになる。一部の実施形態において、開示されるＣＡＲは、Ｙ２１８に減弱型の突然変異を含み、これはＣＡＲの発現を低減することになる。減弱を実現するため、アラニン又はフェニルアラニンなど、任意のアミノ酸残基をチロシンに代えて置換することができる。一部の実施形態において、Ｙ２０６及び／又はＹ２１８のチロシンがリン酸化模倣残基に置換される。一部の実施形態において、開示されるＣＡＲのリン酸化模倣残基によるＹ２０６の置換、これはＣＡＲの活性を増加させることになる。一部の実施形態において、開示されるＣＡＲは、リン酸化模倣残基によるＹ２１８の置換を含み、これはＣＡＲの発現を増加させることになる。例えば、リン酸化模倣残基は、ホスホチロシンであってもよい。一部の実施形態において、ＣＡＲは、リン酸化模倣アミノ酸と、同じＣＡＲの異なる残基におけるリン酸化可能でないアミノ酸による１つ又は複数の置換との組み合わせを含み得る。例えば、ＣＡＲは、Ｙ２０９及び／又はＹ１９１にアラニン又はフェニルアラニン置換を含み、加えてＹ２０６及び／又はＹ２１８にリン酸化模倣置換を含み得る。

【0151】

一部の実施形態において、開示されるＣＡＲは、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、又はこれらの任意の組み合わせなど、特異的ＴＲＡＦタンパク質への結合を亢進させる突然変異を持つ１つ以上の４－１ＢＢドメインを含む。場合によっては、４１ＢＢ突然変異は、例えば、ＮＦ－ｋＢを通じて、Ｔ細胞のＴＲＡＦ１依存的及び／又はＴＲＡＦ２依存的増殖及び生存を亢進させる。場合によっては、４－１ＢＢ突然変異は、例えば、ＩＲＦ７／ＩＮＦβを通じて、ＴＲＡＦ３依存的抗腫瘍有効性を亢進させる。従って、開示されるＣＡＲは、ＴＲＡＦ結合を亢進させる、及び／又はＮＦκＢシグナル伝達を亢進させるこれらの強調した配列中に少なくとも１つの突然変異を有する４－１ＢＢの１つ又は複数の細胞質ドメインを含み得る。

【0152】

また本明細書に開示されるとおり、ＴＲＡＦタンパク質は、場合によっては、ＮＦκＢ及び４－１ＢＢとは関係なくＣＡＲＴ細胞機能を亢進させることもできる。例えば、ＴＲＡＦタンパク質は、場合によっては、Ｔ細胞におけるＣＤ２８共刺激を亢進させることができる。従って、本明細書にはまた、ＣＡＲを、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、又はこれらの任意の組み合わせなど、１つ以上のＴＲＡＦタンパク質と共発現する免疫エフェクター細胞も開示される。場合によっては、ＣＡＲは、腫瘍抗原を標的化する任意のＣＡＲである。例えば、第１世代のＣＡＲは、典型的にはＣＤ３鎖からの細胞内ドメインを有した一方、第２世代のＣＡＲは、様々な共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ）からの細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメインに付加することにより、Ｔ細胞に追加的なシグナルを提供した。場合によっては、ＣＡＲは、４－１ＢＢ活性化が亢進した開示されるＣＡＲである。

【0153】

ＣＡＲを発現する細胞の種類に応じて、ＣＡＲ構成要素の変異が有利であり得る。

【0154】

例えば、ＮＫ細胞では、一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＣＤ８αに関連する配列であり得る。特定の実施形態において、ＮＫ細胞はＭＬ－ＮＫ又はＣＩＭＬ－ＮＫ細胞であり、ＴＭドメインはＣＤ８αである。ＮＫ細胞で上手く機能しないある種のＴＭドメインが、概してサブセットでは機能し得る；ＣＤ８αは、例えば、ＭＬ－ＮＫでは機能するが、ＮＫ細胞では概して機能しない。

【0155】

同様に、ＮＫ細胞では、一部の実施形態において、１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７／４１ＢＢ（ＴＲＡＦ、ＮＦｋＢ）、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ２７８／ＩＣＯＳ、ＤＮＡＭ－１（Ｙ－モチーフ）、ＮＫｐ８０（Ｙ－モチーフ）、２Ｂ４（ＳＬＡＭＦ）：：ＩＴＳＭ、ＣＲＡＣＣ（ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７）：：ＩＴＳＭ、ＣＤ２（Ｙ－モチーフ、ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ）、ＣＤ２７（ＴＲＡＦ、ＮＦｋＢ）、又はインテグリン（例えば、複数のインテグリン）など、ＮＫ細胞で機能する能力を有する任意の１つ又は複数の共活性化型受容体であり得る。

【0156】

同様に、ＮＫ細胞では、一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞において機能する能力を有するサイトカイン受容体であり得る。例えば、サイトカイン受容体は、ＩＬ－２／１５Ｒｂｙｃ：：Ｊａｋ１／３、ＳＴＡＴ３／５、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫなど、持続性、生存、又は代謝に関連するサイトカイン受容体であり得る。別の例として、サイトカイン受容体は、ＩＬ－１８Ｒ：：ＮＦｋＢなど、活性化に関連するサイトカイン受容体であり得る。別の例として、サイトカイン受容体は、ＩＬ－１２Ｒ：：ＳＴＡＴ４など、ＩＦＮ－γ産生に関連するサイトカイン受容体であり得る。別の例として、サイトカイン受容体は、ＩＬ－２１Ｒ：：Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２、又はＳＴＡＴ３など、細胞傷害性又は持続性に関連するサイトカイン受容体であり得る。別の例として、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃｅＲ１γ（ＩＴＡＭｘ１）、ＣＤ３ζ（ＩＴＡＭｘ３）、ＤＡＰ１２（ＩＴＡＭｘ１）、又はＤＡＰ１０（ＹｘｘＭ／ＹＩＮＭ）など、ＴＭアダプターであり得る。別の例として、ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメインとしても知られる）は、ＣＤ２８ファミリー（ＣＤ２８及びＩＣＯＳなど）又は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）遺伝子ファミリー（４－１ＢＢ、ＯＸ４０、又はＣＤ２７など）からの共刺激分子に由来し得る。ＴＮＦＲファミリーメンバーは、ＴＲＡＦタンパク質の動員を通じてシグナルを送り、細胞活性化、分化及び生存に関連する。概してあらゆるＮＫ細胞で上手く機能するわけではないこともあるある種のシグナル伝達ドメインが、サブセットでは機能し得る；ＣＤ２８又は４－１ＢＢは、例えば、ＭＬ－ＮＫで機能する。

【0157】

ＣＡＲの任意のドメインがまた、ＣＡＲの鍵となるシグナル伝達及び抗原認識モジュールを分割することを目的として、ヘテロ二量化ドメインも含み得る。

【0158】

ＣＡＲは、本明細書に記載されるとおりの上述のドメインの任意の一部分又はパートを機能性のＣＡＲをもたらす任意の組み合わせで含むように設計されてもよい。

【0159】

ＣＡＲ及びＣＡＲ担持細胞の作成方法
キメラ受容体をコードするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトは、従来の方法で調製することができる。大体において天然配列が利用されるため、様々な構成要素を適切につなぎ合わせることが可能となるように、必要に応じて天然の遺伝子が単離及び操作される（例えば、ＩＩ型受容体を利用するとき、免疫シグナル伝達受容体成分を反転させなければならないこともある）。従って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用することにより、遺伝子の望ましくない部分の欠失を生じさせる適切なプライマーを使用して、キメラ受容体のＮ末端及びＣ末端タンパク質をコードする核酸配列を単離し得る。或いは、クローン化遺伝子の制限消化を用いてキメラコンストラクトを生成することもできる。いずれの場合にも、配列は、平滑末端化された、又は相補的なオーバーラップのある制限部位が提供されるように選択することができる。

【0160】

キメラコンストラクトを調製するための様々な操作はインビトロで行うことができ、詳細な実施形態では、キメラコンストラクトは、標準的な形質転換又はトランスフェクション方法を用いて、適切な宿主にあるクローニング及び発現用のベクターに導入される。従って、毎回の操作後に、ＤＮＡ配列をつなぎ合わせることにより得られたコンストラクトをクローニングし、ベクターを単離し、及びその配列をスクリーニングして、配列が所望のキメラ受容体をコードすることを確実にする。配列は、制限分析、シーケンシングなどによってスクリーニングすることができる。

【0161】

キメラコンストラクトは、免疫エフェクター細胞にネイキッドＤＮＡとして導入するか、又は好適なベクターに導入することができる。ネイキッドＤＮＡを使用して電気穿孔により免疫エフェクター細胞を安定にトランスフェクトする方法は、当該技術分野において公知である。ネイキッドＤＮＡとは、概して、プラスミド発現ベクターに発現に適切な向きで含まれるキメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。

【0162】

或いは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター）を使用してキメラコンストラクトを免疫細胞、例えば、Ｔ細胞に導入することができる。好適なベクターは、対象の免疫エフェクター細胞において非複製性である。ウイルスをベースとする多数のベクターが公知であり、ここで細胞において維持されるウイルスのコピー数は、細胞の生存能を維持するのに十分な低さである。例示的ベクターとしては、ｐＦＢ－ｎｅｏベクター（STRATAGENE（商標））並びにＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ又はＢＰＶをベースとするベクターが挙げられる。トランスフェクトされた、又は形質導入された免疫エフェクター細胞が、所望の調節を備えた、且つ所望のレベルの表面膜タンパク質として発現する能力がキメラ受容体にあることが確立されると、そのキメラ受容体が宿主細胞において機能性であって、所望のシグナル誘導（例えば、適切なリガンドによる刺激時のランテス、１－α、ＧＭ－ＣＳＦの産生）を提供するかどうかを決定することができる。

【0163】

操作したＣＡＲは、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を標的細胞ゲノムに効率的且つ安定に組み込むレトロウイルスを使用してＣＡＲ担持免疫エフェクター細胞に導入してもよい。当該技術分野において公知の他の方法としては、限定はされないが、レンチウイルス形質導入、トランスポゾンベースのシステム、直接のＲＮＡトランスフェクション、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１Ｏｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６等などの好適なＣａｓタンパク質を使用するＩ型、ＩＩ型、又はＩｌｌ型システム）が挙げられる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）もまた使用し得る。例えば、Shearer RF and Saunders DN, “Experimental design for stable genetic manipulation in mammalian cell lines: lentivirus and alternatives,” Genes Cells 2015 January; 20(1):1-10を参照のこと。Ｃａｓ－ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む塩基編集ＣＲＩＳＰＲシステムをデアミナーゼなどの塩基編集タンパク質に融合したもの（例えば、Beam Therapeuticsからのもの）もまた使用し得る。

【0164】

ＣＡＲの構築に使用し得る選択された構成要素のアミノ酸配列を以下の表４及び表５に開示する。

【0165】

【表5】

【0166】

【表6】

【0167】

以下の表５は、記載される抗原を標的化するＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインの配列を開示する。これらの配列は、表４からの又は本明細書に開示されるとおりのエレメントと共にＣＡＲに組み込まれてもよい。

【0168】

【表7】

【0169】

【表8】

【0170】

【表9】

【0171】

細胞特異的変異
上記に開示されるＣＡＲの構成要素及び構築方法は、概してＴ細胞及び他の免疫エフェクター細胞における使用に好適であるが、限定されるわけではない。細胞サブセットでは、ある種の変異が有用であってもよく、それらは当該技術分野において公知である。

【0172】

例えば、ＮＫ細胞では、ＴＭドメインは、ＮＫＧ２Ｄ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ａｃｔＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＣＤ８αから選択し、又は適合させてもよい。ＮＫ細胞はまた、活性化型受容体との会合によって惹起される、それによってＮＫ細胞特異的シグナルの亢進を提供する幾つもの膜貫通アダプターも発現する。例えば、ＴＭアダプターは、ＦｃｅＲ１γ（ＩＴＡＭｘ１）、ＣＤ３ζ（ＩＴＡＭｘ３）、ＤＡＰ１２（ＩＴＡＭｘ１）、又はＤＡＰ１０（ＹｘｘＭ／ＹＩＮＭ）から選択し、又は適合させることができる。特定の実施形態において、ＴＭドメイン及びアダプターは、例えば：ＮＫＧ２ＤとＤＡＰ１０、ＦｃγＲＩＩＩａとＣＤ３ζ又はＦｃｅＲ１γ、ＮＫｐ４４とＤＡＰ１２、ＮＫｐ３０とＣＤ３ζ又はＦｃｅＲ１γ、ＮＫｐ４６とＣＤ３ζ又はＦｃｅＲ１γ、ａｃｔＫＩＲとＤＡＰ１２、及びＮＫＧ２ＣとＤＡＰ１２のように対にしてもよい。

【0173】

特定の実施形態において、ＮＫ細胞では、ヒンジドメインは、例えば、ＮＫＧ２、ＴＭα、又はＣＤ８から選択し、又は適合させてもよい。

【0174】

特定の実施形態において、ＮＫ細胞では、細胞内シグナル伝達及び／又は共刺激ドメインは、ＣＤ１３７／４１ＢＢ（ＴＲＡＦ、ＮＦｋＢ）、ＤＮＡＭ－１（Ｙ－モチーフ）、ＮＫｐ８０（Ｙ－モチーフ）、２Ｂ４（ＳＬＡＭＦ）：：ＩＴＳＭ、ＣＲＡＣＣ（ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７）：：ＩＴＳＭ、ＣＤ２（Ｙ－モチーフ、ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ）、ＣＤ２７（ＴＲＡＦ、ＮＦｋＢ）；１つ以上のインテグリン（例えば、複数のインテグリン）；ＩＬ－２／１５Ｒｂｙｃ：：Ｊａｋ１／３、ＳＴＡＴ３／５、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ、及びＭＡＰＫ／ＥＲＫなど、持続性、生存、又は代謝に関連するサイトカイン受容体；ＩＬ－１８Ｒ：：ＮＦｋＢなど、活性化に関連するサイトカイン受容体、ＩＬ－１２Ｒ：：ＳＴＡＴ４など、ＩＦＮ－γ産生に関連するサイトカイン受容体；ＩＬ－２１Ｒ：：Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２、又はＳＴＡＴ３など、細胞傷害性又は持続性に関連するサイトカイン受容体；及び上記に開示されるとおりのＴＭアダプターのうちの１つ以上を含み得る。一部の実施形態において、ＮＫ細胞ＣＡＲは、３つのシグナル伝達ドメイン、ＴＭドメイン、及び任意選択で、ＴＭアダプターを含む。

【0175】

共刺激ドメインの選択はまた、ＮＫ細胞の表現型又はサブタイプにも依存し得る；例えば、一部の実験では、４－１ＢＢは記憶様（ＭＬ）ＮＫ細胞（ＣＩＭＬを含む）において共刺激ドメインとして有効であり得るが、ＮＫ細胞では効果が低くなる。加えて、ＭＬＮＫ細胞でより選択的に発現するシグナル伝達ドメインを利用してもよく、それらとしては、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ１３７、及びＣＤ２が挙げられる。

【0176】

免疫エフェクター細胞
本明細書に開示されるとおりの免疫エフェクター細胞には、記憶ＮＫ細胞、記憶様（ＭＬ）ＮＫ細胞、及びサイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞など、ＮＫ細胞及びそのサブタイプ、並びにこれらの変異体が含まれ、そのいずれも、末梢血又は臍帯血細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びＮＫ－９２細胞などの不死化ＮＫ細胞を含めた様々な供給源に由来し得る。

【0177】

ＮＫ細胞
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、従来、異常な又はストレスを受けている細胞を抗原認識又は事前感作によるのでなく、活性化型及び抑制型受容体からのシグナルの組み込みを通じて標的化し、排除することにより病原体に対する宿主防御及び抗腫瘍免疫応答を媒介する自然免疫エフェクターリンパ球と考えられている。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、それが大きな毒性なく安全に投与されており、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさず、天然で悪性細胞を認識して排除し、及び細胞工学的操作に適しているため、同種異系細胞免疫療法のＴ細胞に代わるものである。

【0178】

記憶、記憶様、及びＣＩＭＬＮＫ細胞
その自然の細胞傷害及び免疫刺激活性に加えて、ＮＫ細胞は、場合によっては記憶様又はサイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞とも呼ばれる、持続性のある記憶ＮＫ集団を含めた、ロバストなリコール反応を生じる異種細胞及び万能細胞サブセットを構成する。記憶ＮＫ細胞は、自然の刺激、又は人工的な刺激（「プライミング」）のいずれであれ、炎症誘発性サイトカイン又は活性化型受容体経路による刺激によって作製することができる。サイトカイン活性化によって作製される記憶ＮＫ細胞は、白血病免疫療法のセッティングで臨床的に使用されている。

【0179】

ＣＤ５６、Ｋｉ－６７、ＮＫＧ２Ａの増加、及び活性化型受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、及びＮＫｐ４４の増加が、インビボで分化した記憶ＮＫ細胞において観察されている。加えて、インビボ分化では、ＣＤ１６及びＣＤ１１ｂの発現中央値の僅かな低下が示された。ＭＬＮＫ細胞では、ＡＣＴ及びＢＬＮＫ細胞の両方と比べてＴＲＡＩＬ、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＮＫＧ２Ａ、及びＮＫｐ３０陽性ＮＫ細胞の頻度の増加が観察された一方、ＣＤ２７＋及びＣＤ１２７＋ＮＫ細胞の頻度は減少した。最後に、インビトロで分化したＭＬＮＫ細胞と異なり、インビボで分化したＭＬＮＫ細胞は、ＣＤ２５を発現しなかった。

【0180】

サイトカイン誘導性記憶様ナチュラルキラー細胞（ＣＩＭＬ－ＮＫ）
例えば、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８など、サイトカインの組み合わせによるプライミング（事前の活性化）により、ＮＫ細胞を誘導して記憶様表現型を獲得することができる。これらのサイトカイン誘導性記憶様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞（ＣＩＭＬ－ＮＫ又はＣＩＭＬ）は、サイトカインでの再刺激時又は活性化型受容体による惹起時に反応の亢進を呈する。ＣＩＭＬＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８などのサイトカイン及び／又はその近縁のファミリーメンバー、又はその機能性断片、又はその機能性断片を含む融合タンパク質による活性化により作製し得る。

【0181】

記憶ＮＫ細胞は典型的には、従来のＮＫ細胞と比較したとき、細胞表面タンパク質発現パターンについて差を呈する。かかる発現パターンは当該技術分野において公知であり、例えば、ＣＩＭＬＮＫ細胞におけるＣＤ５６、ＣＤ５６サブセットＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ５６サブセットＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ１６、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６の（対照ＮＫ細胞と比較した）増加を含み得る（例えば、Romee et al. Sci Transl Med. 2016 Sep 21;8(357):357を参照のこと）。記憶ＮＫ細胞はまた、異種ＮＫ細胞集団と比較したときの、細胞傷害性などのエフェクター機能の亢進、持続性の改善、ＩＦＮ－γ産生の増加など、観察されるインビトロ及びインビボ特性によって同定されてもよい。

【0182】

医薬組成物
また、薬学的に許容可能な担体中に開示の分子を含む医薬組成物も開示される。医薬担体については当業者に公知である。それは最も典型的には、生理的ｐＨの滅菌水、生理食塩水、及び緩衝溶液などの溶液を含め、ヒトへの薬物の投与に標準的な担体となるであろう。典型的には、製剤中には、製剤を等張性にするのに適切な量の薬学的に許容可能な塩が使用される。薬学的に許容可能な担体の例としては、限定はされないが、生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８、及びより好ましくは約７～約７．５である。溶液は、ＲＮアーゼフリーでなければならない。更なる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、有形の物品、例えば、フィルム、リポソーム又はマイクロパーティクルの形態であるマトリックスなど、徐放製剤が挙げられる。当業者には、例えば、投与される組成物の投与経路及び濃度に応じて、ある種の担体がより好ましいものであり得ることは明らかであろう。

【0183】

医薬組成物は、選択の分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、表面活性剤などを含み得る。医薬組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔薬などの１つ以上の活性成分も含み得る。

【0184】

非経口投与用の製剤には、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル類である。水性担体としては、水、アルコール溶液／水溶液、エマルション又は懸濁液が、生理食塩水及び緩衝媒体を含め、挙げられる。非経口溶媒としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油が挙げられる。静脈内溶媒としては、体液及び栄養補充液、電解質補充液（リンゲルのデキストロースをベースとするものなど）などが挙げられる。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどもまた存在し得る。

【0185】

治療適用
本明細書に開示されるＮＫ細胞は、癌及び骨髄異形成症候群などの増殖性疾患の進行の治療又は予防に使用することができる。癌は、血液学的悪性腫瘍又は固形腫瘍であり得る。血液学的悪性腫瘍には、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及びこれらの亜型が含まれる。リンパ腫は、様々な方法で、多くの場合に根底にある悪性細胞の種類に基づいて分類することができ、ホジキンリンパ腫（多くの場合にリード・シュテルンベルク細胞の癌であるが、時にまたＢ細胞で発生することもある；他の全てのリンパ腫は、非ホジキンリンパ腫である）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、並びに本明細書に定義し及び当該技術分野において公知であるとおりの他のものが挙げられる。骨髄異形成症候群は、未成熟白血球及び／又は造血幹細胞（ＨＳＣ）が冒される一群の疾患を含む；ＭＤＳはＡＭＬに進行し得る。

【0186】

Ｂ細胞リンパ腫としては、限定はされないが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、並びに本明細書に定義し及び当該技術分野において公知であるとおりの他のものが挙げられる。

【0187】

Ｔ細胞リンパ腫としては、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｔ－ＣＬＬ）、セザリー症候群、並びに本明細書に定義し及び当該技術分野において公知であるとおりの他のものが挙げられる。

【0188】

白血病としては、急性骨髄（又は骨髄性）白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄（又は骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性（又はリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）ヘアリー細胞白血病（時にリンパ腫として分類される）、並びに本明細書に定義し及び当該技術分野において公知であるとおりの他のものが挙げられる。

【0189】

形質細胞悪性腫瘍としては、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞腫、及び多発性骨髄腫が挙げられる。

【0190】

固形腫瘍としては、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫又は癌腫であって、脳、頭頸部、乳房、肺（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、生殖器系（例えば、卵巣）、上部消化管、膵臓、肝臓、腎系（例えば、腎臓）、膀胱、前立腺及び結腸直腸の腫瘍などが挙げられる。

【0191】

本明細書に記載される方法は、概してそれを必要としている対象に対して実施される。本明細書に記載される治療方法を必要としている対象は、癌を有するか、それと診断されているか、それを有する疑いがあるか、又はそれを発症するリスクがあるか、又はその後期へと進行するリスクがある対象であり得る。治療の必要性の決定は、典型的には、問題となっている疾患又は病態に整合する病歴、理学的診察、又は診断検査によって判定されることになる。本明細書に記載される方法によって治療可能な様々な病態の診断は、当該分野の技能の範囲内にある。対象は、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、サル、ハムスター、モルモット、及びヒトなどの哺乳類、又はニワトリなどの他の動物を含め、動物対象であってもよい。例えば、対象はヒト対象であってもよい。

【0192】

概して、ある療法、例えば、抗体又はその機能性の抗原結合断片、ＣＡＲ担持免疫エフェクター細胞、又は抗体－薬物コンジュゲートの安全で有効な量は、例えば、望ましくない副作用を最小限に抑えながらも、対象に所望の治療効果を生じさせるであろう量である。

【0193】

本明細書に記載される方法によれば、投与は、非経口、肺内、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内、髄腔内、頭蓋内、脳室内、皮下、鼻腔内、硬膜上、眼内、頬側、又は直腸投与であってもよい。製剤が、例えば、生物製剤又は細胞療法である場合、投与様式は、注射又は注入によることになる可能性が高いであろう。

【0194】

標準ケア及び免疫療法に向けたコンディショニングレジメン
ＡＭＬなどの癌の標準ケア治療には、化学療法及びターゲット療法を含めた抗癌医薬療法が関わり得る。

【0195】

例えば、シタラビン（シトシンアラビノシド又はａｒａ－Ｃ）とダウノルビシン（ダウノマイシン）又はイダルビシンなどのアントラサイクリンとの組み合わせは、ＡＭＬに対する第一選択の化学療法である。ＡＭＬの治療に使用し得る他の化学療法薬としては、クラドリビン（ロイスタチン（Leustatin）、２－ＣｄＡ）、フルダラビン（フルダラ（Fludara））、ミトキサントロン、エトポシド（ＶＰ－１６）、６－チオグアニン（６－ＴＧ）、ヒドロキシウレア、プレドニゾン又はデキサメタゾンなどのコルチコステロイド類、メトトレキサート（ＭＴＸ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、アザシチジン（ビダーザ（Vidaza））、及びデシタビン（ダコジェン（Dacogen））が挙げられる。加えて、ターゲット療法が、ＦＬＴ－３突然変異を持つ患者におけるミドスタウリン（リダプト（Rydapt））又はギルテリチニブ（ゾスパタ（Xospata））；ＣＤ３３陽性ＡＭＬにおけるゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（Mylotarg））；ベネトクラクス（ベネクレクスタ（Venclexta））などのＢＣＬ－２阻害薬；イボシデニブ（チブソボ（Tibsovo））又はエナシデニブ（イドヒファ（Idhifa））などのＩＤＨ阻害薬；及びグラスデギブ（ダウリスモ（Daurismo））などのヘッジホッグ経路阻害薬など、適切な患者において使用されてもよい。完全寛解率は初期導入化学療法後に８０％もの高さに上り得るが、大多数のＡＭＬ患者は最終的には再発又は難治性（ＲＲ）疾患へと進行することになり、５年生存率は６０歳未満の人で約３５％及び６０歳を超える人で１０％である。Walter RB et al., “Resistance prediction in AML: analysis of 4601 patients from MRC/NCRI, HOVON/SAKK, SWOG and MD Anderson Cancer Center,” Leukemia 29(2):312-20 (2015)及びDoehner, Het al., “Acute Myeloid Leukemia, ” NEJM 373 (12): 1136-52 (2015)を参照されたい。

【0196】

癌の治療においては、コンディショニングレジメンを伴っても、又は伴わなくても、いずれであってもよい養子細胞移入（ＡＣＴ）療法が可能である。典型的には、悪性障害を有する患者でＨＳＣＴなどのＡＣＴが実施されるとき、免疫アブレーションを引き起こして移植片拒絶反応を予防するため、及び腫瘍量を低減するため、手順の一環として、前処置又はコンディショニングレジメンが投与される。従来、これらの目標は、本来超致死量である全身照射法（ＴＢＩ）及び毒性に重複のない化学療法剤、いわゆる「高強度」ＡＣＴ前コンディショニングを用いることにより達成されていた。しかしながら、ＡＣＴの有効性には、悪性宿主細胞に対するドナー細胞の免疫学的反応（即ち、移植片対腫瘍効果）が実質的に寄与していることが認められたため、低強度の骨髄非破壊的コンディショニングレジメンが開発されており、高齢の患者及び医学的に虚弱な患者を含め、より幅広い患者に対するＡＣＴ適用が可能になっている。

【0197】

コンディショニングレジメンは、当該技術分野において公知である。例えば、Gyurkocza and Sandmaier BM, “Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all ,” Blood 124(3): 344-353 (2014)を参照のこと。コンディショニングレジメンは、２００６年のBone Marrow Transplantation Tandem Meetingの間にCenter for International Blood and Marrow Transplant Research（ＣＩＢＭＴＲ）によって開催された低強度コンディショニングレジメンワークショップ（Reduced-Intensity Conditioning Regimen Workshop）に従い、高用量（骨髄破壊的）、低強度、及び骨髄非破壊的に分類し得る。

【0198】

定義
特に定義しない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。更に、文脈上特に必要でない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、且つ複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、及びそれらの技法は、当該技術分野で周知の、一般的に使用されているものである。

【0199】

本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、特異的結合を付与するのに十分な標準的な免疫グロブリン配列エレメントを含むか、又は例えば、ある特定の標的抗原に免疫反応を示す及び／又はそれに向けられるポリペプチドを指す。当該技術分野において公知のとおり、自然界で産生されるとおりのインタクトな抗体は、２つの同一の重鎖ポリペプチド（各約５０ｋＤ）及び２つの同一の軽鎖ポリペプチド（各約２５ｋＤ）が互いに会合して、一般に「Ｙ字型」構造と称されるものとなることで構成される約１５０ｋＤの四量体薬剤である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各約１１０アミノ酸長）－アミノ末端可変（Ｖ_Ｈ）ドメインと、続く３つの定常ドメイン：Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びカルボキシ末端Ｃ_Ｈ３で構成される。「スイッチ」として公知の短い領域が、重鎖可変領域と定常領域とを結び付けている。「ヒンジ」がＣ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメインを抗体の残りの部分に結び付ける。インタクトな抗体では、このヒンジ領域における２つのジスルフィド結合が２つの重鎖ポリペプチドを互いに結び付けている。各軽鎖は、別の「スイッチ」によって互いに隔てられている２つのドメイン－アミノ末端可変（Ｖ_Ｌ）ドメインと、続くカルボキシ末端定常（Ｃ_Ｌ）ドメインで構成される。インタクトな抗体四量体は、２つの重鎖－軽鎖二量体で構成され、ここでは重鎖及び軽鎖が単一のジスルフィド結合によって互いに連結されている；２つの他のジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに結び付けているため、これらの二量体が互いに結び付けられることになり、四量体が形成される。天然で産生される抗体はまた、典型的にはＣ_Ｈ２ドメイン上で、グリコシル化されている。天然抗体の各ドメインは、扁平な逆平行βバレルに互いに詰め合わされた２つのβシート（例えば、３本鎖、４本鎖、又は５本鎖シート）で形成される「免疫グロブリンフォールド」によって特徴付けられる構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」として知られる３つの超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）と、４つの幾らかインバリアントな「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）とを持つ。自然抗体が折り畳まれると、ＦＲ領域がβシートを形成して、それらがドメインの構造的フレームワークを提供し、重鎖及び軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域が三次元空間で一体になることにより、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位が生み出される。天然に存在する抗体のＦｃ領域は補体系のエレメントに結合し、また、例えば細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞を含め、エフェクター細胞上の受容体にも結合する。

【0200】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の幾つかの例としては、限定はされないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、線状抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び抗体断片で形成される多重特異性抗体が挙げられる。一部の実施形態において、抗体断片は抗原結合断片である。

【0201】

現在の抗体工学及び改良方法のレビューについては、R. Kontermann and S. Dubel, (2010) Antibody Engineering Vols.1 and 2, Springer Protocols, 2nd Edition and W. Strohl and L. Strohl (2012) Therapeutic antibody engineering: Current and future advances driving the strongest growth area in the pharmaceutical industry, Woodhead Publishingを参照することができる。抗体及び抗原結合断片の作製及び精製方法は当該技術分野において周知であり、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 5-8 and 15を参照することができる。

【0202】

用語「抗原」は、可溶性であり得るか、又は細胞膜結合型であり得る分子実体、詳細には、限定はされないが、抗体又はＴＣＲを含むがこれらに限定されない適応免疫系、又はトランスジェニックＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ｓｃＦｖ又はその多量体、Ｆａｂ断片又はその多量体、抗体又はその多量体、単鎖抗体又はその多量体、又は構造への結合を高親和性で果たすことのできる任意の他の分子を含むがこれらに限定されない操作された分子による認識を受けることのできる分子実体を指す。

【0203】

「抗原結合ドメイン」は、本明細書で使用されるとき、ＣＡＲの文脈では、ＣＡＲの中で抗原に特異的に結合する（及びそれによって抗原を持つ細胞を標的化することが可能な）領域を指す。ＣＡＲは、抗原結合ドメインを１つ以上含み得る。概して、ＣＡＲのターゲティング領域は細胞外である。抗原結合ドメインは、抗体又はその抗原結合断片を含み得る。抗原結合ドメインは、例えば、完全長重鎖、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二価単鎖抗体又はダイアボディを含み得る。アフィボディ又は天然に存在する受容体からのリガンド結合ドメインなど、所与の抗原に特異的に結合する任意の分子を抗原結合ドメインとして使用し得る。多くの場合に抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。通常、ｓｃＦｖでは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変部分が可動性リンカーによって融合されてｓｃＦｖを形成する。かかるリンカーは、例えば（ＧＧＧＧ_４Ｓ）_３であり得る。一部の例では、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが使用されることになる種と同じ種に由来することが有益である。例えば、それをヒトで治療的に使用することが計画されるとき、ＣＡＲの抗原結合ドメインがヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合断片を含むことが有益であり得る。ヒト又はヒト化抗体又はその断片は、当該技術分野において周知の種々の方法によって作成することができる。

【0204】

本明細書で使用されるとき、用語「結合親和性」は、ある一つの分子が、その分子上のある部位で別の分子に結合する強度を指す。ある特定の分子が別の特定の分子に結合する又は特異的に会合することになる場合、それらの２つの分子は互いに結合親和性を呈すると言われる。結合親和性は、一対の分子についての会合定数及び解離定数に関係するが、これらの定数を測定又は決定することは、本明細書の方法にとって重要でない。むしろ、親和性は、記載される方法の分子間の相互作用を記載するために本明細書で使用されるとき、概して実証的研究で観察される見かけの親和性であり（特に指定されない限り）、これを使用すると、１つの分子（例えば、抗体又は他の特異的結合パートナー）が２つの他の分子（例えば、あるペプチドの２つのバージョン又は変異体）に結合するであろう相対強度を比較することができる。結合親和性、会合定数、及び解離定数の概念は周知である。

【0205】

用語「癌」は、医学的には悪性新生物として公知である。癌は、制御されない細胞成長が関わる幅広い一群の疾患である。癌では、細胞（癌性細胞）が無制御に分裂及び成長して悪性腫瘍を形成し、身体の近接した部位に浸潤する。癌はまた、身体の遠隔の部位にもリンパ系又は血流を通じて広がり得る。ヒトに発症する異なる公知の癌は２００種を超える。

【0206】

用語「化学療法」は、標準化されたレジメンの一環としての１つ以上の細胞傷害性抗新生物薬（「化学療法剤」又は「化学療法薬」）による癌（癌性細胞）の治療を指す。化学療法は治癒目的で与えられてもよく、又はそれは寿命を延ばすこと若しくは症状を緩和することを目標としてもよい。これは多くの場合に、放射線療法、手術、及び／又はハイパーサーミア療法など、他の癌治療と併せて用いられる。従来の化学療法剤は、ほとんどの癌細胞の主な特性の一つである、急速に分裂する細胞を殺傷することによって働く。これはつまり、化学療法が、骨髄、消化管、及び毛包の細胞など、正常な状況下で急速に分裂する細胞にもまた害を及ぼすということを意味する。その結果、骨髄抑制（血液細胞の産生低下、ひいてはまた免疫抑制も）、粘膜炎（消化管の内膜の炎症）、及び脱毛症（抜け毛）など、化学療法で最もよく見られる副作用が生じる。

【0207】

用語「キメラ抗原受容体」、省略形「ＣＡＲ」は、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に抗原特異性をグラフトする操作された受容体を指す。本明細書に開示されるＣＡＲは、抗原ターゲティング領域としても知られる抗原結合ドメイン（典型的には、抗体重鎖及び軽鎖可変領域で構成される単鎖可変領域）、細胞外スペーサー／リンカードメイン又はヒンジ領域、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み；これは、任意選択で、少なくとも１つの共刺激ドメインなど、他のエレメントを含み得る。細胞外ドメインはまた、シグナルペプチドも含み得る。抗原特異的領域が対応する抗原に結合すると、シグナル伝達ドメインが宿主細胞においてエフェクター細胞機能を媒介する。

【0208】

用語「組み合わせ免疫療法」は、２つの療法アプローチ、例えば、当該技術分野において癌などの疾患の治療に公知の療法アプローチの協奏的な適用を指す。用語「組み合わせ免疫療法」はまた、抗原認識受容体による治療などの免疫療法と、造血細胞、例えば、抗原認識受容体による認識に抵抗性の造血細胞の移植などの別の療法との協奏的な適用も指し得る。細胞上での抗原の発現とは、抗原が細胞の細胞表面上に十分に存在するため、抗原認識受容体がそれを検出、結合及び／又は認識できることを意味する。

【0209】

「共刺激シグナル伝達領域」（等しく、共刺激又は「コスティム（co-stim）」ドメイン）とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、免疫エフェクター細胞が効率的に反応するのに必要な、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子の例については、上記で考察され、及び当該技術分野において公知である。典型的には２～１０アミノ酸長である低分子オリゴペプチド又はポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達ドメインのエレメント間の連結を形成し得る。顕著なリンカーは、グリシン－セリンのダブレットである。

【0210】

用語「サイトカイン誘導性記憶様」、又は、等しく「ＣＩＭＬ」は、ＮＫ細胞との関連では、「記憶」又は「記憶様」表現型を有することを意味し、プライミング剤を使用して作製される。

【0211】

用語「細胞傷害性」は、本明細書において記憶ＮＫ細胞との関連で使用されるとき、細胞が罹患細胞を標的化して殺傷する能力を指す。

【0212】

「罹患細胞」は、細胞、組織又は生物についての正常又は健常な状態から逸脱した、病原体、毒性物質、照射、又は細胞内部調節解除の影響によって生じ得る状態を指す。「罹患細胞」はまた、病原性ウイルスに感染した細胞も指し得る。更に用語「罹患細胞」は、個体の癌を構成し又はそれを生じさせるものであり得る悪性細胞又は新生物細胞を指し得る。

【0213】

用語「操作された細胞」及び「遺伝子修飾された細胞」は、本明細書で使用されるとき、同義的に使用することができる。これらの用語は、外来性遺伝子又は核酸配列を持っている、及び／又はそれを発現すること、又はその天然の形態又は機能から外れるように遺伝子修飾されていて（例えば欠失している又はノックアウトされている遺伝子）、次にはそれが細胞又はその子孫の遺伝子型又は表現型を修飾する遺伝子を持っていることを意味する。細胞は、自然状態ではそうした細胞で発現しないペプチド又はタンパク質を安定に又は一過性に発現するように、当該技術分野において周知の組換え方法により修飾することができる。細胞の遺伝子修飾方法としては、限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、形質導入であって、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非組込み型レトロウイルス又はレンチウイルスベクター、トランスポゾン、デザイナーヌクレアーゼであって、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを含めたものを用いる形質導入が挙げられる。

【0214】

用語「濃縮する」は、本明細書においてＮＫ細胞との関連で使用されるとき、更なる分析又は使用のために高濃度化し、精製し、又は単離することを意味する。濃縮及び精製された細胞集団は、大多数の所望の細胞と、無視できる割合の他の細胞とを含む。

【0215】

用語「倍数選択的」は、本明細書で使用されるとき、ある一つの標的に対して持つ親和性が、別の標的に対するその親和性の少なくともｘ倍高いことを意味し、ここでｘは少なくとも２であり、及びそれより大きい、例えば、１０、２０、５０、１００、又は１０００であってもよい。好ましい実施形態において、倍数選択性は治療的に有意味であり、即ち、ある一つの標的を発現する細胞が殺傷され、且つ他の標的を担持する細胞が生き残ることを可能にするのに十分である。

【0216】

用語「遺伝子修飾」又は遺伝子修飾された」は、限定はされないが細胞のゲノムＤＮＡを含め、核酸内容の改変を指す。これには、限定はされないが、核酸配列の単一のヌクレオチド又は断片の交換又は欠失の導入による細胞ゲノムＤＮＡ配列の改変が含まれる。この用語はまた、それによって細胞ゲノムＤＮＡ配列の直接的又は間接的な改変につながるか否かに関係なく、細胞への核酸の任意の導入も指す。

【0217】

用語「造血細胞」は、限定はされないが、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞（即ち、増殖し、且つ赤血球系細胞、リンパ球、及び骨髄球を含めた異なる血液細胞型を少なくとも部分的に再構成する能力を有する）を含めた、造血能力を有する造血系の細胞の集団を指す。用語「造血細胞」にはまた、本明細書で使用されるとき、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞から分化して血液細胞（即ち、赤血球系細胞、リンパ球、及び骨髄球を含めた血液細胞型）を形成する細胞も含まれる。

【0218】

抗原認識受容体による抗原の認識に抵抗性のドナー造血細胞とは、その細胞が、抗原に特異的な抗原認識受容体による検出、結合及び／又は認識をそれほど容易には受けることができないこと、又は検出、結合及び／又は認識が損なわれているため、免疫療法の間にその細胞が殺傷されないことを意味する。

【0219】

用語「免疫細胞」又は「免疫エフェクター細胞」は、αβＴ細胞、ＮＫ細胞（記憶ＮＫ、ＭＬ－ＮＫ、及びＣＩＭＬ－ＮＫを含む）、ＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞を含む）、Ｂ細胞、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、γδＴ細胞、間葉系幹細胞又は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、単球及びマクロファージなど、免疫系の一部であってよい、特定のエフェクター機能を果たす細胞を指す。好ましい免疫細胞は、αβＴ細胞、ＮＫ細胞（記憶ＮＫ、ＭＬ－ＮＫ、及びＣＩＭＬ－ＮＫを含む）、ＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞を含む）、ＩＬＣ、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞又はγδＴ細胞など、細胞傷害性エフェクター機能のある細胞である。「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を意味し、例えば、ＮＫ細胞では、エフェクター機能は細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。

【0220】

用語「免疫療法」は、「免疫応答の誘導、亢進、又は抑制による疾患の治療」として定義される医学用語である。免疫応答を引き出し又は増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法に分類され、一方、低減し又は抑制する免疫療法は、抑制免疫療法に分類される。活性化型免疫療法としての癌免疫療法は、免疫系を刺激することにより腫瘍を拒絶し及び破壊しようと試みる。養子細胞移入は、細胞ベースの細胞傷害性反応を用いて癌細胞を攻撃する。患者の癌に対して天然の又は遺伝子操作された反応性を有するＴ細胞などの免疫細胞がインビトロで生成され、次に癌患者に移し戻される。

【0221】

本明細書で使用されるとき、用語「個体」は、動物を指す。優先的には、個体は、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、サル又はヒトなどの哺乳類である。より優先的には、個体はヒトである。個体は、癌などの疾患に罹患している個体（患者）であってもよいが、対象はまた、健常な対象であってもよい。

【0222】

ＣＡＲの「細胞内シグナル伝達ドメイン」（等しく、細胞質シグナル伝達ドメイン又はエフェクタードメイン；これらは細胞内ドメイン又はエンドドメインの一部である）は、ＣＡＲが発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を意味し、例えば、ＮＫ細胞では、エフェクター機能は細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、及びＣＡＲを発現する細胞が特殊化した機能を果たすように仕向けるタンパク質の一部を指す。

【0223】

細胞内シグナル伝達ドメインには、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な所与のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全な又はトランケートされた一部が含まれ得る。ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの顕著な例としては、抗原受容体会合後にシグナル伝達を惹起するために協力して働く受容体及び共受容体の細胞質配列が挙げられる。

【0224】

概して、免疫エフェクター細胞のＣＡＲ活性化は２つのクラスの細胞質シグナル伝達配列、第一に、ＣＡＲを通じて抗原依存性一次活性化を惹起するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）及び第二に、抗原非依存的様式で二次又は共刺激シグナルを提供する働きをするもの（二次細胞質シグナル伝達配列、共刺激シグナル伝達ドメイン）によって媒介されることができる。従って、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメインと、任意選択で二次細胞質シグナル伝達ドメイン（即ち、共刺激又は「コスティム（co-stim）」ドメイン）とを含み得る。

【0225】

刺激する形で働く一次細胞質シグナル伝達配列には、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン活性化モチーフシグナル伝達モチーフ）が含まれてもよい。ＣＡＲに使用されることの多いＩＴＡＭを持つ一次細胞質シグナル伝達配列の例は、本明細書に開示され、及び当該技術分野において公知である。

【0226】

用語「悪性」又は「悪性腫瘍」は、新生物を構成するか、新生物に由来するか、又は新しい新生物細胞の起源となり得る細胞、細胞群又は組織を表す。この用語は、組織の正常又は健常な細胞との対照での新生物細胞を表して使用される。悪性腫瘍は、非癌性良性腫瘍と比べると、悪性腫瘍がその成長の点で自己限定性でなく、隣接組織に浸潤する能力を有し、及び遠隔の組織に広がる能力を有し得る点で対照をなす。良性腫瘍は、これらの特性のいずれも有しない。悪性腫瘍は、退形成、侵襲性、及び転移並びにゲノム不安定性によって特徴付けられる。用語「前悪性細胞」は、まだ悪性でないが、悪性になろうとしている細胞又は組織を指す。

【0227】

用語「記憶」又は「記憶様」は、ＮＫ細胞との関連では、ＮＫ細胞の一般集団と比較して細胞傷害性が改善された、且つ長寿命／持続性である活性化された表現型を有することを意味し、典型的には、ＮＫ細胞の一般集団と比較して、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＮＫＧ２Ａの細胞表面発現の増加、並びにＣＤ１６の発現の維持を呈する。

【0228】

用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、本開示に記載される抗体に適用されるとき、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンからの単一コピー又はクローンに由来する化合物であり、それが産生される方法ではない。本開示のｍＡｂは、均一な又は実質的に均一な集団で存在し得る。

【0229】

用語「持続性」は、本明細書において使用されるとき、細胞、特に対象に養子移入された細胞が生存し続ける能力を指す。

【0230】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指して同義的に使用される。これらの用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるようなアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0231】

用語「プライミングする」は、ＮＫ細胞との関連では、記憶／記憶様表現型となるようにプライミング剤を使用して刺激し又は活性化させることを意味する。「プライミング剤」は、刺激サイトカインの組み合わせ、例えば、
・ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、及びＩＬ－３５のうちの１つ以上；
・ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの１つ以上；及び
・ＩＬ－１８、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－３６ａ、ＩＬ－３６ｂ、及びＩＬ－３６ｇのうちの１つ以上、
又はかかるサイトカインの機能性断片を含む１つ以上の「プライミング融合タンパク質」、又はその１つ以上の多連鎖複合体を含む。かかるタンパク質の例は、本明細書に開示される。

【0232】

一般に、用語「受容体」は、可溶性であっても又は細胞表面膜に付着していてもよい生体分子であって、細胞表面膜に付着していても又は可溶性であってもよい定義付けられた構造体に特異的に結合する生体分子を指す。受容体としては、限定はされないが、抗体及び抗体様構造、接着分子、トランスジェニックの又は天然に存在するＴＣＲ又はＣＡＲが挙げられる。具体的には、用語「抗原認識受容体」は、本明細書で使用されるとき、天然ＴＣＲ、トランスジェニックＴＣＲ、ＣＡＲ、ｓｃＦｖ又はその多量体、Ｆａｂ断片又はその多量体、抗体又はその多量体、二重特異性Ｔ細胞エンハンサー（ＢｉＴＥ）、ダイアボディ、又は特異的結合を高親和性で果たすことのできる任意の他の分子など、膜結合型又は可溶性受容体であってもよい。

【0233】

用語「副作用を低減する」とは、抗原を発現する非標的細胞に向けられる毒性など、抗原認識受容体による免疫療法の任意の合併症、望ましくない又は病的なアウトカムの重症度の低下を指す。「副作用を低減する」とはまた、抗原認識受容体による免疫療法の間の患者の痛み、害又は死亡リスクを低下させる又は回避する手段も指す。

【0234】

本明細書で使用されるとき、用語「配列同一性」は、２つ以上の配列を配列の一致が最大となるように、即ち、ギャップ及び挿入を考慮してアラインメントしたときの、それらの配列の対応する位置における同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の割合を意味する。同一性は、公知の方法により容易に計算することができる。同一性を決定する方法は、調べている配列間に最大の一致を与えるように設計される。その上、同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコード化される。比較に最適な配列のアラインメントは、例えば、スミス・ウォーターマン（Smith & Waterman）の局所的相同性アルゴリズムによるか、相同性アラインメントアルゴリズムによるか、類似性検索法によるか、又は、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によるか（Accelrys, Inc.、San Diego、California、米国から入手可能なGCG Wisconsin PackageのGAP、BESTFIT、PASTA、及びTFASTA）、又は目視検査により実行することができる。概略については、Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)及びAltschul et al. Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)を参照のこと。パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムである。

【0235】

「シグナルペプチド」は、本明細書で使用されるとき、ＣＡＲの文脈では、細胞内における、例えばある種の細胞小器官（小胞体など）及び／又は細胞表面へのタンパク質の輸送及び局在化を導くペプチド配列を指す。

【0236】

用語「スペーサー」又は「ヒンジ」は、本明細書で使用されるとき、ＣＡＲの文脈では、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にある親水性領域を指す。本明細書に開示されるＣＡＲは細胞外スペーサードメインを含み得るが、かかるスペーサーは省くこともまた可能である。スペーサーには、抗体のＦｃ断片又はその断片、抗体のヒンジ領域又はその断片、抗体のＣＨ２又はＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列又はこれらの組み合わせが含まれ得る。スペーサーの顕著な例は、ＣＤ８αヒンジである。

【0237】

抗原認識受容体に関連して用語「特異的に結合する」又は「～に特異的」又は「特異的に認識する」は、抗原の特異的多型変異体を認識してそれに結合するが、他の変異体は実質的に認識せず又は結合しない抗原認識受容体の抗原結合ドメインを指す。

【0238】

用語「副作用」は、所望の治療アウトカムに加えて起こる抗原認識受容体による免疫療法の任意の合併症、望ましくない又は病的なアウトカムを指す。用語「副作用」は、優先的には、抗原を発現する非標的細胞であって、しかし本明細書に記載されるとおりの罹患細胞ではない細胞上に標的抗原が存在する場合に免疫療法の間に起こる可能性のあるオンターゲットオフ腫瘍毒性を指す。免疫療法の副作用は、移植片対宿主病の発症であり得る。

【0239】

用語「標的」又は「標的抗原」は、標的細胞の表面上に存在する任意の細胞表面タンパク質、糖タンパク質、糖脂質又は任意の他の構造を指す。この用語はまた、標的細胞上に存在する任意の他の構造、詳細には、限定はされないが、抗体又はＴＣＲを含むがこれらに限定されない適応免疫系、又はトランスジェニックＴＣＲ、ＣＡＲ、ｓｃＦｖ又はその多量体、Ｆａｂ断片又はその多量体、抗体又はその多量体、単鎖抗体又はその多量体、又は構造への結合を高親和性で果たすことのできる任意の他の分子を含むがこれらに限定されない操作された分子による認識を受けることのできる構造も指す。

【0240】

用語「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、個体に適用される又は適用されることになる抗原認識受容体によって認識される細胞を指す。

【0241】

用語「治療有効量」は、治療利益を提供する量を意味する。

【0242】

ＣＡＲの「膜貫通ドメイン」は、かかるドメインの任意の所望の天然又は合成供給源に由来し得る。供給源が天然であるとき、このドメインは、任意の膜結合型又は膜貫通型タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ｄ、又は本明細書に開示される若しくは当該技術分野において公知の他のものに由来し得る。鍵となるシグナル伝達及び抗原認識モジュールが２つの（又は更に多くの）ポリペプチド上にあるとき、ひいてはＣＡＲは２つの（又はそれより多い）膜貫通ドメインを有し得る。鍵となるシグナル伝達及び抗原認識モジュールを分割すると、ＣＡＲの各ポリペプチドにおける小分子依存的ヘテロ二量化ドメインに起因して、ＣＡＲ細胞発現を小分子依存的に力価決定可能且つ可逆的に制御することが可能となる（Wu et al, 2015, Science 350: 293-303）。

【0243】

本明細書で使用されるとき、用語「移植」は、対象にドナー細胞、例えば造血細胞又はＣＡＲ担持免疫エフェクター細胞の集団を投与することを意味する。

【0244】

用語「治療」は、本明細書で使用されるとき、疾患の少なくとも１つの徴候又は症状の頻度又は重症度を低減することを意味する。

【実施例】

【0245】

実施例
以下の例により、本発明が更に例示される。

【0246】

実施例１．拡大のみ、プライミングと同時に拡大、及び拡大後にプライミングのインビトロ培養及び活性
材料及び方法：ＣＤ３枯渇及びＣＤ５６ポジティブ選択を使用して全血からＮＫ細胞を単離した。次に、選択されたＮＫ細胞を９６ウェルプレートにおいてNK MACS培地＋サプリメント＋１０％ＨＩ－ＨＡＢで培養し、以下の条件でプライミング／拡大した（ここで、１×７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１はそれぞれ２００ｎＭ及び１００ｎＭであり、１×１８ｔ１５－１２ｓは２５０ｎＭである；希釈は全て、これらの値から指示されるとおり計算する）。
ａ）拡大のみ：＋７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１、指示される濃度において３７度、５％ＣＯ２で２日間、６日間、又は１０日間のいずれか。その後２日毎に、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を新鮮培地と共に指示される濃度まで補充した。
ｂ）プライミングと同時に拡大：＋１８ｔ１５－１２ｓ、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１、指示される濃度において３７度、５％ＣＯ２で２日間、６日間、又は１０日間のいずれか。その後２日毎に、１８ｔ１５－１２ｓ、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を新鮮培地と共に指示される濃度まで補充した。
ｃ）拡大後にプライミング：＋７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１、指示される濃度において３７度、５％ＣＯ２で２日間、６日間、又は１０日間のいずれか。その後２日毎に、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を新鮮培地と共に指示される濃度まで補充した。指示されるとおり２、６、又は１０日目、１８ｔ１５－１２ｓを指示される濃度で一晩加えた。

【0247】

上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞の表現型を判定するため、適切な時点でＮＫ細胞を回収し、洗浄し、受容体発現に関して、純度及び／又は活性化マーカー、例えば、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ３、Live/Dead Yellow、抗ＮＫＧ２Ａ、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ２５、及び抗ＣＤ１６を含むフローパネルで染色することにより判定した。以下のクローンを使用した：
・抗ＣＤ４５（ＨＩ３０クローン）
・抗ＣＤ５６（ＣＭＳＳＢクローン）
・抗ＣＤ３（ＳＫ７クローン）
・Live/Dead Yellow（Thermo Fisher）
・抗ＮＫＧ２Ａ（ＲＥＡ１１０クローン）
・抗ＣＤ６９（ＦＮ５０クローン）
・抗ＣＤ２５（ＣＤ２５－４Ｅ３クローン）
・抗ＣＤ１６（ｅＢｉｏＣＤ１６クローン）
Attune NXtフローサイトメーターを使用した。次にデータをFlowjo v10.7において、生存ＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞をゲーティングし、上述のマーカーの各々の蛍光強度中央値を判定して分析した。ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＮＫＧ２Ａ発現の増加、並びにＣＤ１６発現の維持が、ＣＩＭＬ－ＮＫ細胞表現型を指し示している。

【0248】

上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞の殺傷活性を判定するため、適切な時点で、培養したＮＫ細胞を回収して洗浄し、次に１０％ヒトＡＢ型血清（Gibco））含有のNK MACS培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに１０，０００個のルシフェラーゼ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｌｕｃ）ヒト腫瘍細胞（ATCC）と共に指示されるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で２４～４８時間、ＩＬ－２（Miltenyi）有り又は無しで加え、その後ルシフェラーゼ活性（生存Ｋ５６２細胞）をルシフェラーゼの読取り（Promega）によって判定した。データは示さず。

【0249】

結果：この例は、上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞のインビトロ活性及びフローサイトメトリー表現型を実証している。

【0250】

結果は、表面タンパク質発現の累積変化倍数、細胞サイズ、及び個々の遺伝子についての蛍光強度中央値を示した表６～表１１に示す。

【0251】

【表10】

【0252】

【表11】

【0253】

【表12】

【0254】

【表13】

【0255】

【表14】

【0256】

【表15】

【0257】

或いは、ｉＰＳＣ細胞などのリンパ球前駆細胞、又は臍帯血ＮＫ細胞を好適な培地で培養し、ＮＫ細胞をプライミング及び／又は拡大することのできる形態に分化させてもよい。

【0258】

実施例２．プライミングを途中又は最後とするインビトロ拡大及びプライミング
材料及び方法：精製されたＮＫ細胞を様々な濃度の拡大剤７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１で２日毎に処理した。６日目及び１４日目、２００ｎＭ及び１００ｎＭの７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１で拡大した細胞を２５０ｎＭの１８ｔ１５－１２ｓで活性化させて、２００ｎＭ及び１００ｎＭの７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１で拡大を継続した。６、１３及び１７日後、次にＮＫを指示された比でＫ５６２－Ｌｕｃ２細胞（ATCC）のプレートのＲＰＭＩ＋１０％熱失活ＦＢＳに加えた。次にプレートを３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。Ｋ５６２細胞の殺傷をルシフェラーゼの読取りによって測定した。ＥＣ：５０が低いほど、より良好な殺傷と考えられる。

【0259】

結果：この例は、大規模な上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞のインビトロ活性及びフローサイトメトリー表現型を実証している。

【0260】

結果は図１～図４に示す。

【0261】

実施例３．拡大のみ、プライミングと同時に拡大、拡大後にプライミング、及び拡大後にプライミング及び拡大のインビトロ培養及び活性
材料及び方法：ＣＤ３枯渇及びＣＤ５６ポジティブ選択を使用して全血からＮＫ細胞を単離した。次に、選択されたＮＫ細胞を９６ウェルプレートにおいてNK MACS培地＋サプリメント＋１０％ＨＩ－ＨＡＢで培養し、以下の条件でプライミング／拡大した（ここで、１×７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１はそれぞれ２００ｎＭ及び１００ｎＭであり、×／４はそれぞれ５０ｎＭ及び２５ｎＭである）：
ａ）拡大のみ：＋１×又は×／４７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１、３７度、５％ＣＯ２で４日間。培養６日目及びその後２日毎に、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を新鮮培地と共に１×又は×／４まで補充した。
ｂ）プライミングと同時に拡大：２５０ｎＭ／１×、２５０ｎＭ／×／４、６２．５ｎＭ／１×、又は６２．５ｎＭ／×／４の＋１８ｔ１５－１２ｓ、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１、３７度、５％ＣＯ２で６日間。培養６日目及びその後２日毎に、１８ｔ１５－１２ｓ、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を新鮮培地と共に指示される濃度まで補充した。
ｃ）拡大後にプライミング：＋１×又は×／４７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１、３７度、５％ＣＯ２で４日間。培養６日目及びその後２日毎に、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を新鮮培地と共に１×又は×／４まで補充した。指示されるとおり６日目又は１４日目に、１８ｔ１５－１２ｓを２５０ｎＭ又は６２．５ｎＭで３時間加えた。
ｄ）拡大後にプライミング及び拡大３時間：＋１×又は×／４７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１、３７度、５％ＣＯ２で４日間。培養６日目及びその後２日毎に、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を新鮮培地と共に１×又は×／４まで補充した。６日目又は１４日目に、１８ｔ１５－１２ｓ、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を２５０ｎＭ／１×、２５０ｎＭ／×／４、６２．５／１×、又は６２．５／×／４で３時間加えた。
ｅ）拡大後にプライミング及び拡大４８時間：＋１×又は×／４７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１、３７度、５％ＣＯ２で４日間。培養６日目及びその後２日毎に、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を新鮮培地と共に１×又は×／４まで補充した。６日目又は１４日目に、１８ｔ１５－１２ｓ、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を２５０ｎＭ／１×、２５０ｎＭ／×／４、６２．５ｎＭ／１×、又は６２．５ｎＭ／×／４で４８時間加えた。

【0262】

【0263】

【0264】

結果：この例は、上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞のインビトロ活性及びフローサイトメトリー表現型を実証している。

【0265】

結果は、ＮＫ細胞数の累積変化倍数、個々の表面タンパク質発現の蛍光強度中央値、及びＫ５６２－Ｌｕｃ殺傷を示した表１２～表１７に示す。

【0266】

【表16】

【0267】

【表17】

【0268】

【表18】

【0269】

【表19】

【0270】

【表20】

【0271】

【表21】

【0272】

実施例４．拡大のみ及び拡大後にプライミングの大規模インビトロ培養及び活性
材料及び方法：MACS prodigyで凍結leukopakからＣＤ３枯渇及びＣＤ５６ポジティブ選択を使用してＮＫ細胞を単離した。次に、選択されたＮＫ細胞をSt. Gobainバッグ内のNK MACS培地＋サプリメント＋１０％ＨＩ－ＨＡＢ＋２５ｎＭ７ｔ１５－２１ｓ＋５０ｎＭＡＴＦ１で０．２５ｅ６／ｍＬの初期細胞濃度において３７度、５％ＣＯ_２で６日間培養した。培養６日目及びその後２日毎に細胞をカウントし、０．２５ｅ６／ｍＬの濃度に希釈し、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を最終的な培地容積に適切な濃度になるまで補充した。１４日目、細胞を凍結するか（拡大のみ）、又は細胞を５０ｅ６／ｍＬに濃縮するかのいずれかとし、１８ｔ１５－１２を２５０ｎＭの最終濃度となるように加えた（拡大後にプライミング）。このようにプライミングした細胞を３７度、５％ＣＯ２で様々な時間にわたってインキュベートした。指示される時間長さ（３０分、１時間、２時間、３時間、５時間又は一晩）にわたって１８ｔ１５－１２ｓを加えた後、細胞を回収し、ＨＢＳＳ（－／－）、０．５％ＨＳＡで２回洗浄し、凍結緩衝液（９０％ヒト血清、１０％ＤＭＳＯ）に再懸濁した。コントロールレートフリーザーを使用して細胞を２ｅ６細胞／ｍＬ又は２０ｅ６細胞／ｍＬのいずれかで凍結した後、気相の液体窒素に移した。次に細胞を解凍し、洗浄し、カウントし、及び下流アッセイで利用して機能を測定した。

【0273】

【0274】

【0275】

上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞のサイトカイン産生能力を判定するため、ＮＫ細胞を解凍し、次に１０％ヒトＡＢ型血清（Gibco）含有のNK MACS培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに１０，０００個のルシフェラーゼ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｌｕｃ）ヒト腫瘍細胞（ATCC）と共に１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間又は単独で加え、その後上清を回収し、ＩＦＮｇＥＬＩＳＡ（R&D Systems）によりＩＦＮｇ産生を判定した。

【0276】

結果：この例は、上記のプロセスにより大規模で生成されたＮＫ細胞のインビトロ活性及びフローサイトメトリー表現型を実証している。

【0277】

結果は図５～図１１に示す。

【0278】

実施例５．拡大のみ、プライミング後に拡大、及び拡大後にプライミングの大規模インビトロ培養及び活性
材料及び方法：MACS prodigyで凍結leukopakからＣＤ３枯渇及びＣＤ５６ポジティブ選択を使用してＮＫ細胞を単離した。次に、選択されたＮＫ細胞をSt. Gobainバッグ内のNK MACS培地＋サプリメント＋１０％ＨＩ－ＨＡＢ＋２５ｎＭ７ｔ１５－２１ｓ＋５０ｎＭＡＴＦ１で０．２５ｅ６／ｍＬの初期細胞濃度において３７度、５％ＣＯ２で６日間培養した。培養６日目及びその後２日毎に、細胞をカウントし、０．２５ｅ６／ｍＬの濃度に希釈し、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１を最終的な培地容積に適切な濃度になるまで補充した。１４日目、細胞を様々な密度（２ｅ６、５ｅ６、１０ｅ６、２５ｅ６、３５ｅ６又は５０ｅ６／ｍＬ）に濃縮し、１８ｔ１５－１２を２５０ｎＭの最終濃度となるように加えた。細胞を３７度、５％でインキュベートした。指示される時間長さ（３時間又は一晩）にわたって１８ｔ１５－１２を加えた後、細胞を回収し、ＨＢＳＳ（－／－）、０．５％ＨＳＡで２回洗浄し、凍結緩衝液（９０％ヒト血清、１０％ＤＭＳＯ）に再懸濁した。コントロールレートフリーザーを使用して細胞を２ｅ６細胞／ｍＬ又は２０ｅ６細胞／ｍＬのいずれかで凍結した後、気相の液体窒素に移した。次に細胞を解凍し、洗浄し、カウントし、及び下流アッセイで利用して機能を測定した。

【0279】

【0280】

【0281】

上記のプロセスにより生成されたＫ細胞のサイトカイン産生能力を判定するため、ＮＫ細胞を解凍し、次に１０％ヒトＡＢ型血清（Gibco）含有のNK MACS培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに１０，０００個のルシフェラーゼ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｌｕｃ）ヒト腫瘍細胞（ATCC）と共に１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間又は単独で加え、その後上清を回収し、ＩＦＮｇＥＬＩＳＡ（R&D Systems）によりＩＦＮｇ産生を判定した。

【0282】

上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞のインビボ持続性を判定するため、ＮＫ細胞を解凍し、ＨＢＳＳに２０ｅ６／ｍＬで再懸濁した。２ｅ６～５ｅ６個の細胞（例えば、１００ｕＬ中）を免疫不全ＮＳＧマウス（Jackson Laboratories、Bar Harbor Maine）に静脈内注射した。ヒトＩＬ－２（Miltenyi Biotec、５０，０００ＩＵ）を２日毎に投与することによってマウスを支持し、７日目に血液を採取し、以下からなるフローパネルで染色することによりＮＫ細胞数を測定し：
・抗ＣＤ５６（ＣＭＳＳＢクローン）、
・抗ＣＤ３（ＳＫ７クローン）、
・Live/Dead Yellow（Thermo Fisher）、
・抗マウスＣＤ４５（３０－Ｆ１１クローン）、及び
・抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０クローン）
その後固定して赤血球を溶解させた。次にAttune NXtフローサイトメーターでｈｕＣＤ４５＋マウスＣＤ４５－ＣＤ３－生細胞数に関して細胞を分析した。

【0283】

結果：この例は、上記のプロセスにより大規模で生成されたＮＫ細胞のインビトロ活性及びフローサイトメトリー表現型を実証している。

【0284】

結果は図１２～図１６に示す。

【0285】

実施例６．拡大のみ及び拡大後にプライミングのインビトロ培養及び活性
材料及び方法：ＣＤ３枯渇及びＣＤ５６ポジティブ選択を使用して全血からＮＫ細胞を単離した。次に、選択されたＮＫ細胞を組織培養処理済みフラスコで培養し、次に細胞培養バッグのNK MACS培地＋サプリメント＋１０％ＨＩ－ＨＡＢに移し、以下の条件で拡大した：
ａ）拡大のみ：５０ｎＭ７ｔ１５－２１ｓ及び２５ｎＭＡＴＦ１、３７度、５％ＣＯ２で４日間。培養５日目及びその後２、３日毎に、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１をそれぞれ５０ｎＭ及び２５ｎＭまで補充し、細胞を新鮮培地で適切な濃度に希釈した。１４日目に細胞を９０％ＨＡＢ、１０％ＤＭＳＯに凍結した。
ｂ）拡大後にプライミング：５０ｎＭ７ｔ１５－２１ｓ及び２５ｎＭＡＴＦ１、３７度、５％ＣＯ２で４日間。培養５日目及びその後２、３日毎に、７ｔ１５－２１ｓ及びＡＴＦ１をそれぞれ５０ｎＭ及び２５ｎＭまで補充し、細胞を新鮮培地で適切な濃度に希釈した。１４日目、１８ｔ１５－１２ｓを２５０ｎＭで３時間加えた。次に細胞を９０％ＨＡＢ、１０％ＤＭＳＯに凍結した。

【0286】

上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞の表現型を判定するため、凍結した細胞を解凍し、受容体発現に関して、純度及び／又は活性化マーカー、例えば、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ３、Live/Dead Yellow、抗ＮＫＧ２Ａ、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ２５、及び抗ＣＤ１６を含むフローパネルで染色することにより判定した。以下のクローンを使用した：
・抗ＣＤ４５（ＨＩ３０クローン）
・抗ＣＤ５６（ＣＭＳＳＢクローン）
・抗ＣＤ３（ＳＫ７クローン）
・Live/Dead Yellow（Thermo Fisher）
・抗ＮＫＧ２Ａ（ＲＥＡ１１０クローン）
・抗ＣＤ６９（ＦＮ５０クローン）
・抗ＣＤ２５（ＣＤ２５－４Ｅ３クローン）
・抗ＣＤ１６（ｅＢｉｏＣＤ１６クローン）
Attune NXtフローサイトメーターを使用した。次にデータをFlowjo v10.7において、生存ＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞をゲーティングし、上述のマーカーの各々の蛍光強度中央値を判定して分析した。ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＮＫＧ２Ａ発現の増加、並びにＣＤ１６発現の維持が、ＣＩＭＬ－ＮＫ細胞表現型を指し示している。結果は以下の表１８～表２２に示す。

【0287】

【表22】

【0288】

【表23】

【0289】

【表24】

【0290】

【表25】

【0291】

【表26】

【0292】

【0293】

結果：この例は、上記のプロセスにより生成されたＮＫ細胞のインビトロ活性及びフローサイトメトリー表現型を実証している。

【0294】

実施例７．ＣＩＭＬ－ＮＫ細胞のインビボ殺傷活性
インビボでの殺傷有効性を判定するため、ＮＳＧマウスにＫ５６２－Ｌｕｃ（ATCC）腫瘍細胞を移植する。ＮＫ細胞培養の終了時、細胞を回収し、洗浄し、腫瘍担持動物に２－１０ｅ６個のＮＫ細胞を静脈内注射するとともに、一部の対照マウスは注射しないままとする。マウスをヒトＩＬ－２（５０，０００ＩＵ）のｑ２ｄ投与により支持し、毎週腫瘍成長について、マウスにルシフェリンを注射し、及び能力のある器具でルシフェラーゼを読み取ることにより測定する。

【0295】

実施例８．臨床試験プロトコル
上記に開示されるとおりのＮＫ細胞を、凍結保存されている場合には解凍し、癌などの疾患の治療のため、好適な媒体に入れて患者に注入し得る。例えば、急性骨髄性白血病及び骨髄異形成症候群におけるＮＫ細胞の安全性及び有効性に関して試験する例示的方法は、臨床試験プロトコルＮＣＴ０４３５４０２５号、ＮＣＴ０３０６８８１９号、ＮＣＴ０１８９８７９３号、ＮＣＴ０２７８２５４６号及びＮＣＴ０４８９３９１５号に開示されている。これらのプロトコルには、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８のカクテル又はプライミング融合タンパク質複合体のいずれかでプライミングした後に任意選択で拡大した記憶ＮＫ細胞が関わる。同様の臨床試験を、拡大した後にプライミングするか、又は同時に拡大及びプライミングした記憶ＮＫ細胞を使用して行い得る。

【0296】

【表27】

【0297】

【表28】

【0298】

【表29】

【0299】

【表30】

【0300】

【表31】

【0301】

【表32】

【0302】

【表33】

【0303】

【表34】

【0304】

【表35】

【0305】

【表36】

【0306】

【表37】

【0307】

【表38】

【0308】

本明細書に開示される方法に係る、拡大後にプライミングした、又は同時に拡大及びプライミングした記憶ＮＫ細胞は、例えば上記の臨床試験プロトコルに示されるとおり、ＡＭＬ、ＭＤＳ、及び他の疾患の治療において有効であるものと予想される。

【0309】

上記に示した詳細な説明は、当業者が本発明を実施するのに役立つよう提供される。しかしながら、本明細書に記載され及び特許請求される本発明は、本明細書に開示される具体的な実施形態によって範囲が限定されるものでなく、なぜならそれらの実施形態は、本発明の幾つかの態様の例示として意図されるためである。任意の均等な実施形態が、本発明の範囲内にあることが意図される。実際、当業者には、前述の記載から、本発明の発見の趣旨又は範囲から逸脱することのない本発明の様々な変形例が、本明細書に図示され及び記載されるものに加えて明らかになるであろう。かかる変形例もまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

【図1】