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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-24
(54)【発明の名称】ドープシリコン粒子を含む組成物、及び関連する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/04 20060101AFI20240717BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240717BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20240717BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240717BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240717BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240717BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240717BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240717BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240717BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240717BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240717BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240717BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240717BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240717BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240717BHJP
【ＦＩ】
A61K47/04
A61K39/00 A
A61K39/02
A61K48/00
A61K31/7088
A61K31/713
A61K31/7105
A61P31/04
A61P37/04
A61P43/00 105
A61K9/14
A61K9/10
A61K47/18
A61K47/26
A61K47/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024527874
(86)(22)【出願日】2022-07-22
(85)【翻訳文提出日】2024-03-25
(86)【国際出願番号】 GB2022051937
(87)【国際公開番号】W WO2023002222
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】2110644.8
(32)【優先日】2021-07-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524030765
【氏名又は名称】シサフ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サフィー－シーバート、ロギー スザンヌ
(72)【発明者】
【氏名】アーメド、ムフタル
(72)【発明者】
【氏名】ステーラ、フラヴィア
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA22
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC06
4C076DD21
4C076DD38
4C076DD51
4C076DD63
4C084AA13
4C084MA05
4C084MA16
4C084MA41
4C084NA13
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB321
4C084ZB322
4C085AA03
4C085BA07
4C085EE05
4C086AA01
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA16
4C086MA41
4C086MA66
4C086NA13
4C086ZB09
4C086ZB21
4C086ZB32
(57)【要約】
加水分解性ドープシリコンと、原薬と複合体化した１以上の脂質と、を含む粒子を含む医薬組成物であって、前記粒子が、１ｃｍ３当たり１×１０１６個以上の量のドーパント原子でドープされている、医薬組成物。また、関連する製品、方法、及び医療用途。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
加水分解性ドープシリコンと、原薬と複合体化した１以上の脂質と、を含む粒子を含む医薬組成物であって、前記粒子が、１ｃｍ３当たり１×１０１６個以上の量のドーパント原子でドープされている、医薬組成物。
【請求項2】
前記加水分解性ドープシリコン粒子が、１ｃｍ３当たり最大１×１０２０個の量のドーパント原子でドープされている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記原薬が、核酸である、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記核酸が、ＲＮＡである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記核酸が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記核酸が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ｍＲＮＡが、病原菌のタンパク質をコードする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記医薬組成物が、ワクチン組成物である、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記医薬組成物が、アミノ酸を更に含む、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記医薬組成物が、トレハロースなどの非還元性二糖を更に含む、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ドープシリコン粒子が、ホウ素ドープシリコンを含む、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記ドープシリコン粒子が、リンドープシリコンを含む、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記ドープシリコン粒子が、核酸結合特性を調節する目的で不純物を意図的に導入するためにドープされている、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記ドープシリコン粒子が、脂質結合特性を調節する目的で不純物を意図的に導入するためにドープされている、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記１以上の脂質が、イオン化性脂質を含む、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記１以上の脂質が、カチオン性脂質を含む、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記１以上の脂質が、ＤＯＴＡＰを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記１以上の脂質が、ラセミ混合物中にＤＯＴＡＰを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記１以上の脂質が、ＤＯＴＡＰをＳ鏡像異性形態で含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項20】
前記１以上の脂質が、ＤＯＴＡＰをＲ鏡像異性形態で含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項21】
前記１以上の脂質が、１以上の脂質付加オリゴペプチドを含み、好ましくは前記１以上の脂質付加オリゴペプチドが、各々、３～２０個のアミノ酸残基を有するオリゴペプチド部分及び１２～１８個の炭素原子を有する脂肪酸鎖を含有し、好ましくは前記アミノ酸残基の少なくとも１つが、ｐＨ７．４で正帯電している、請求項１～請求項２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項22】
原薬を含む医薬組成物の有効性を増強するための、加水分解性ドープシリコン（任意選択的に（optionally）加水分解性ホウ素ドープシリコン）を含む粒子の使用であって、前記粒子が、１ｃｍ３当たり１×１０１６個以上の量のドーパント原子でドープされている、使用。
【請求項23】
前記医薬組成物が、請求項１～請求項２１のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記原薬が、請求項３～請求項７のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項２２又は請求項２３に記載の使用。
【請求項25】
前記医薬組成物の前記有効性が、前記原薬の室温での安定性を増大させる前記粒子によって増強される、請求項２２～請求項２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項26】
前記医薬組成物の前記有効性が、前記原薬の細胞内安定性を増大させる前記粒子によって増強される、請求項２２～請求項２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項27】
前記医薬組成物の前記有効性が、分解、例えば酵素的分解から前記原薬を保護する前記粒子によって増強される、請求項２２～請求項２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項28】
前記医薬組成物の前記有効性が、標的細胞又は標的組織による前記原薬の取り込みを増強する前記粒子によって増強される、請求項２２～請求項２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項29】
医薬品として使用される、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項30】
前記医薬品が、ワクチンである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項31】
医薬品（例えばワクチン）の製造における、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項32】
疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象へ、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記疾患又は前記障害を治療又は予防する方法。
【請求項33】
ワクチンを必要とする対象へ、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むワクチンを提供する方法。
【請求項34】
核酸を加水分解性ドープシリコン粒子及び１以上の脂質と接触させることを含む、原薬（例えば核酸、例えばｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）の貯蔵安定性を増大させる方法であって、前記加水分解性ドープシリコン粒子が、１ｃｍ３当たり最大１×１０１６個の量のドーパント原子でドープされる、方法。
【請求項35】
前記核酸が、請求項４～請求項６のいずれか一項に定義されるとおりであり、及び／又は、前記加水分解性ドープシリコン粒子が、加水分解性ホウ素ドープシリコン粒子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記接触させることが、アミノ酸の存在下及び／又はトレハロースなどの非還元性二糖の存在下で追加的に行われる、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
原薬を細胞又は組織へと標的化する際に使用するための、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項38】
原薬の細胞又は組織への前記標的化のための医薬品の製造で使用するための、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項39】
原薬を細胞又は組織へ標的化する方法であって、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を必要とする対象へ投与することを含む、方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸及び／又は他の薬学的に活性な化合物を含む組成物に使用するための改善された粒子、並びに関連する生成及び方法に関する。そのような方法、製品及び組成物は、遺伝子療法及びワクチン組成物における核酸の送達に特に有用であるが、これに限定されない。本発明の粒子は、１以上の更なる元素でドープされているケイ素を含む。本発明はまた、本発明の粒子を含む医薬組成物、並びに関連する方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
活性医薬剤のための送達ベクター及びビヒクルの改善が必要とされている。これは、生物医学研究の進歩が、効果的で安全かつ費用効果の高い治療へと完全に翻訳されるために必要とされる。
【0003】
例示的な例として、ＲＮＡなどの核酸が治療剤として提案されている。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子療法における使用が提案されている。治療法又は他の目的のための遺伝子送達は、特に嚢胞性線維症及びある特定のがんなどの疾患の治療のために周知であり、ｍＲＮＡは、最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効なワクチンに使用されている。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、何らかの欠損を矯正するための遺伝子又は遺伝子の一部の細胞への送達を指す。本明細書では、「核酸療法」という用語はまた、標的細胞への核酸材料の任意の導入を指すために使用され、かつ遺伝子ワクチン接種を含む。また、「核酸送達」という用語は、いわゆる細胞工場における商業的に有用なタンパク質のインビトロ生成を包含し得る。
【0004】
核酸を細胞へと送達するためのデリバリーシステムであって、３つの広範なクラス、すなわち、ネイキッド核酸の直接注射に関与するクラスと、ウイルス又は遺伝子修飾ウイルスを使用させるクラスと、非ウイルス送達剤を使用させるクラスと、へと送達するためのデリバリーシステム。各々に利点及び欠点がある。送達剤としてのウイルスは、高効率及び高い細胞選択性という利点を有するが、しかし毒性、炎症性応答の生成、及び大きな核酸断片の送達の困難という欠点を有する。したがって、ｍＲＮＡワクチンは、注射可能なネイキッドｍＲＮＡ又は非ウイルスデリバリーシステム、例えば脂質ナノ粒子ベクターなどを含み得る。残念なことに、非ウイルスデリバリーシステムではトランスフェクション効率が低いことが認められている。ｍＲＮＡにはまた、周知の安定性の問題もある。
【0005】
非ウイルス遺伝子デリバリーシステムは、核酸の負帯電したホスフェート（phosphate）骨格と、カチオン性脂質と、任意選択的に（optionally）ペプチド又は他の化合物と、の間の静電相互作用によるナノメートル粒子への遺伝子材料の圧縮に基づく（Ｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９，６，１３８－１４５）。脂質ナノ粒子非ウイルスベクターによるペイロード送達の機構は、核酸と脂質との間に形成された複合体が細胞表面に結合し、次いで、エンドサイトーシスによって細胞に入るインタクトな複合体のエンドサイトーシスに関与するものと提案されている。次いで、複合体は、しばらくの間小胞又はエンドソーム内に局在したままであり、核酸構成成分はその後細胞質へと放出される。次いで、核酸によってコードされるタンパク質の生成、次いで別の遺伝子修飾の発現が起こり得る。
【0006】
非ウイルスデリバリーシステムの構成成分は、静電的に会合してベクター複合体を形成する。脂質構成成分は、核酸と、ある程度、任意のペプチド構成成分（複数可）との両方を、分解、エンドソーム、又はその他から遮蔽する。そのような使用のためのカチオン性脂質は、１９８０年代後半にＦｅｌｇｎｅｒによって開発され、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７４１３－７４１７，１９８７、及び米国特許第５，２６４，６１８号に報告される。Ｆｅｌｇｎｅｒは、商標「Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ」によって公知の現在市販されているカチオン性リポソームを開発した。「Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ」リポソームは、カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（２，３－ジオレイルオキシプロピル－１－トリメチルアンモニウム）と中性リン脂質ＤＯＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）とが１：１の比率で脂質二重層を有する、球状の小胞である。それ以来、様々な他のカチオン性リポソーム製剤が考案されており、そのほとんどは合成カチオン性脂質と中性脂質とを組み合わせたものである。ＤＯＴＭＡ類似体に加えて、複合体アルキルアミン／アルキルアミド、コレステロール誘導体、例えばＤＣ－コレステロールなど、並びにジパルミトール、ホスファチジルエタノールアミン、グルタメート、イミダゾール、及びホスホネートの合成誘導体に言及してもよい。しかしながら、カチオン性ベクターシステムは、血清の存在下におけるそれらのトランスフェクション効率が非常に異なり、これは、インビボ遺伝子療法及びワクチン接種のためのそれらの潜在的な使用に明らかに影響を及ぼす。正電荷された脂質などのイオン化性脂質は、それらの正電荷が、負電荷された核酸との複合体化を可能にする傾向があるので、有用なトランスフェクション剤である。異なる脂質は異なる量（level）の正電荷を有することが理解される。残念なことに、例えば長期間の貯蔵の最中に、核酸を分解から適切に保護するのに充分な核酸の複合体化を可能にするには充分に正帯電していない、多くの脂質が存在する。逆に、非常に高い正電荷を有する脂質は、核酸を結合するのに非常に効率的であり得、したがって、長期貯蔵の最中に核酸を保護するのに使用するための有望な候補であり得るが、その臨床使用を妨げる毒性の問題を有し得る。例えば、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ：ＰＥＩ）は、高度にカチオン性であり、かつ効率的なインビトロトランスフェクション脂質として使用される。しかしながら、それらは毒性であり、臨床治療におけるそれらの使用を妨げる。脂質トランスフェクション剤はまた、貯蔵中に分解（又は「エイジング」）されることがあり、これは、それらが複合体化している核酸を保護する能力を低下させ、かつ予想される活性の損失を経時的に緩和するために過剰量の脂質の使用を必要とし得る。
【0007】
許容される毒性プロファイルの両方を有し、かつ効率的なトランスフェクションを引き起こす、臨床的使用に好適で承認された、驚くほど少数の脂質トランスフェクション剤が存在する。１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、現在、多くの用途（ＰｆｉｚｅｒのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチンを含む）で好まれているトランスフェクション試薬であるが、供給上の問題があり、かつ利用可能な代替物はほとんどない。
【0008】
上記で言及した非ウイルスデリバリーシステムの所望によるペプチド構成成分に目を向けると、トランスフェクション複合体において脂質と一緒に任意選択的に（optionally）使用するためのペプチドは、典型的には、２つの官能基：細胞表面受容体（例えば、インテグリン－）認識配列を含有する「頭部基」、及び核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に非共有結合的に結合することができる「尾部」を有する。そのようなペプチド構成成分は、ある程度、細胞型特異的又は細胞表面受容体特異的であるように設計され得る。特異性は細胞表面受容体への標的化から生じる。インテグリン特異性の程度は、例えば、複合体にある程度の細胞特異性を付与することができる。いくつかのアデノウイルスベクターに匹敵するトランスフェクション有効性を達成することができる（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７，３９３－４００，２０００）。しかしながら、そのようなペプチドに依存することなく、特定の細胞又は特定の組織を標的化する能力を有する組成物が依然として必要とされている。
【0009】
本発明は、以下の利点のうち１つ以上を達成するために、原薬、特に脂質トランスフェクション剤を送達するための医薬組成物の効率を増大させることを試みる：
（１）貯蔵中に核酸を分解から保護する脂質の能力の有効性の増加；
（２）トランスフェクション有効性の増加；
（３）貯蔵中に核酸を分解から保護するために使用される脂質の安定性の増加；
（４）妥当なトランスフェクション能力及び／又は良好な貯蔵安定性を依然として維持しながら、トランスフェクション組成物中において、より低量（level）の脂質、特により低量のＤＯＴＭＡ又はＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質を使用する能力；
（５）妥当なトランスフェクション能力及び／又は良好な貯蔵安定性を依然として維持しながら、トランスフェクション組成物中に広範囲の脂質を使用する能力；並びに、
（６）特定の種類の組織又は特定の種類の細胞への、核酸などの活性な原薬のより標的化された送達。
（１）貯蔵中に核酸を分解から保護する脂質の能力の有効性の増加；
（２）トランスフェクション有効性の増加；
（３）貯蔵中に核酸を分解から保護するために使用される脂質の安定性の増加；
（４）妥当なトランスフェクション能力及び／又は良好な貯蔵安定性を依然として維持しながら、トランスフェクション組成物中において、より低量（level）の脂質、特により低量のＤＯＴＭＡ又はＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質を使用する能力；
（５）妥当なトランスフェクション能力及び／又は良好な貯蔵安定性を依然として維持しながら、トランスフェクション組成物中に広範囲の脂質を使用する能力；並びに、
（６）特定の種類の組織又は特定の種類の細胞への、核酸などの活性な原薬のより標的化された送達。
【0010】
これまでのところ、細胞へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の非ウイルス送達は、効率的なベクターの欠如によって特に問題があり、かつ制限されていた。公知の非ウイルスビヒクルを用いてｍＲＮＡを送達しようとすると、例えば、特定の組織又は特定の細胞へのｍＲＮＡの標的化が不充分であることに起因して、最適以下の量（level）のタンパク質発現がもたらされ得る。更に、公知の非ウイルス性ビヒクルは、ｍＲＮＡと共に包装した場合、貯蔵安定性が乏しい。細胞へとＲＮＡを送達するための脂質二重層の克服は、ＲＮＡ治療学の広範な開発にとって大きな障害のままであった。
【0011】
したがって、任意選択的に（optionally）特定の種類の組織又は特定の種類の細胞に特異的な高量（level）のｍＲＮＡを細胞に送達し、かつ良好な量のタンパク質発現をもたらすｍＲＮＡの送達に、特異的に合わせて調整されたベクターが必要とされている。貯蔵の際に良好な安定性を有するｍＲＮＡの送達に合わせて調整された組成物、特に中程度の温度での貯蔵時にそれらの構造及び機能性を保持するｍＲＮＡ送達複合体もまた、必要とされている。ｓｉＲＮＡ治療薬の送達にも同様の考察が当てはまる。
【0012】
Ｐｆｉｚｅｒ ＢｉｏＮＴｅｃｈワクチンＢＮＴ１６２ｂ２（「Ｃｏｍｉｒｎａｔｙ」）及びＭｏｄｅｒｎａ ＣＸ－０２４４１４ワクチンを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するいくつかのｍＲＮＡワクチンは、ウルトラ・コールド・チェーン貯蔵及び輸送を必要とする。これにより、低所得国ではワクチンへのアクセスが制限され、全ての市場でコスト及び物流の複雑さが増す。ワクチンを貯蔵し、標準的な冷蔵庫温度（約－４℃）又は室温（約２０℃）で輸送することができる場合、有利であろう。ワクチンは、貯蔵のために、又は輸送及び流通の最中に少なくとも短期的に、より高い温度（例えば、３０℃、４０℃、又は５０℃）に耐えることができる場合もまた有益であろう。具体的には、ｍＲＮＡ及び脂質を含む既存のｍＲＮＡワクチン製剤を修飾して、それらのトランスフェクション有効性を高めることができれば有用であろう。これは、より低い用量の使用を可能にし、潜在的に副作用を低減し、かつ利用可能な用量の総数を増加させるという利点を有する。ｍＲＮＡ及び脂質を含む既存のｍＲＮＡワクチン製剤を、それらの貯蔵安定性を改善するように修飾し、それによってより高い温度及び／又はより長い期間での分布及び貯蔵を可能にすることができる場合もまた有用であろう。特定の脂質、特にＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質の利用可能性に対する圧力を低下させるために、既存のｍＲＮＡワクチン製剤を、より低量の脂質（特に、ＤＯＴＡＰなどのより低量のカチオン性脂質）を必要とするように、及び／又はより広範囲の脂質と共に機能するように、修飾することができる場合もまた有用であろう。
【0013】
低温によって注射可能な組成物、例えばｍＲＮＡワクチン組成物中でｍＲＮＡ安定性を維持すること、並びに物流上の課題をもたらすことにはまた、ｍＲＮＡを注射前に解凍しなければならないという技術的限界、及び注射後に充分な生物学的活性を示すのに充分な時間にわたって高温な体内で安定なままでなければならないという技術的限界がある。これは、身体周囲への移行中、及び／又はエンドソーム区画からの脱出中に安定性を維持することを必要とし得る。インビボでの安定性はまた、タンパク質への充分な翻訳が起こるのに充分な長さにわたって維持されなければならない。
【0014】
ｍＲＮＡは酵素分解及び化学分解に脆弱である。ｍＲＮＡなどのＲＮＡを分解することができる酵素は、ｍＲＮＡを生成するために使用される生物学的培養システムに存在し、かつ完全に除去することは困難である。酵素活性は、低温及び／又はＲＮＡの凍結乾燥によって減速され得るが、これらの溶液の各々には欠点がある。
【0015】
脂質によるカプセル化は、ＲＮＡ（例えば、遺伝子療法又はワクチン接種のためのｍＲＮＡ）を分解から保護するために先行技術において使用されている。このアプローチは有効であり得るが、高価及び／又は供給不足であり得る比較的大量の特定の脂質を使用し、脂質自体が経時的に分解し、したがってその保護品質を失うという問題を提示する。核酸及び脂質を含む組成物の複数の構成成分の安定性を高めるための、改善された賦形剤もまた必要とされている。
【0016】
本発明の組成物及び方法は、現在、核酸及び脂質を含む医薬組成物の改善において最も有望であるものと考えられているが、それらはまた、小さな有機化合物及びペプチド（例えば、ペプチド抗原）を含む非核酸活性成分の安定化及び分解からの保護にもまた好適である。
【発明の概要】
【0017】
本発明は、ドープされた、特に１×１０１５個以上の量、特に１×１０１６個以上の量のドーパント原子／ｃｍ３、特にホウ素でドープされた元素ケイ素が、１以上の脂質を含むトランスフェクション組成物などの組成物内の原薬、特に核酸を安定化するのに有用であるという認識に基づいている。そのような組成物は、トランスフェクション有効性の増強、組織又は細胞標的化能力の増強、カチオン性脂質への依存性の減少、及び／又は貯蔵安定性の増強を示す。ドープシリコンは、原薬（特に、核酸）自体を両方とも安定化することができ、１以上の脂質を安定化することもまたでき、その結果、１以上の脂質は、原薬、特に核酸を保護することを可能にする特性を長期間保持することができる。脂質及び／又は核酸の安定化は、核酸（例えば、室温又は４℃で）であるが加水分解性ドープシリコン粒子を含まない原薬を有する従来の組成物で可能であったよりも、長い間及び／又はより高い温度で、問題のある分解なしに組成物を貯蔵することを可能にすることができる。脂質及び／又は核酸の安定化はまた、組成物が、例えば特定の組織型及び／又は特定の細胞型に対する改善された標的作用を提供することによって、細胞のトランスフェクションにおいてより効率的であり、その後、原薬、特に核酸による１以上の治療効果の提供においてより効率的であり得る。安定性及び効率的な送達の課題のいくつかは、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）治療薬に関して特に急性であるが、加水分解性ドープシリコン粒子及び１以上の脂質を含む組成物の安定化特性及び保護特性は、ペプチド、タンパク質、及び小分子などの他の非核酸原薬に適用可能であることが更に見出された。加水分解性シリコンのドーピングは、様々な官能基を有する異なる両親媒性分子を、加水分解性シリコン材料のマトリックス結晶構造に合わせることを可能にし得る；したがって、加水分解性ドープシリコンは、脂質などの有機分子の不安定性を打ち消すだけでなく、原薬、特に核酸（例えば、ｍＲＮＡ）分子の安定性もまた増強する。本発明の利点は、例えば加水分解性ドープシリコン粒子の細孔内で起こり得る、有機化合物の結合又はローディングだけに由来するものと考えられるが、１以上の脂質などの有機材料の二次結合のための構造骨格の一部として使用され得る、意図的に導入された不純物（ドーパント）もまた含む。
【0018】
本発明の第１の態様によれば、加水分解性ドープシリコンと、原薬と複合体化した少なくとも１つの脂質とを含む、粒子を含む医薬組成物が提供される。任意選択的に（optionally）、粒子は、１ｃｍ３当たり１×１０１６個以上の量のドーパント原子でドープされる。
【0019】
本発明の第２の態様によれば、原薬を含む医薬組成物の有効性を増強するための、加水分解性ドープシリコン（任意選択的に（optionally）加水分解性ホウ素ドープシリコン）を含む粒子の使用が提供される。再び、任意選択的に（optionally）、粒子は、１ｃｍ３当たり１×１０１６個以上の量のドーパント原子でドープされる。
【0020】
本発明の第３の態様によれば、医薬品として使用するための、本発明の第１の態様による医薬組成物が提供される。
【0021】
本発明の第４の態様によれば、医薬品の製造における本発明の第１の態様による医薬組成物、例えばワクチンの使用が提供される。
【0022】
本発明の第５の態様によれば、対象における疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、疾患又は障害を治療又は予防する方法を必要とする対象へ、本発明の第１の態様による医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【0023】
本発明の第６の態様によれば、ワクチンを必要とする対象へワクチンを提供する方法であって、当該対象へ、本発明の第１の態様による医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【0024】
本発明の第７の態様によれば、原薬（例えば核酸、例えばｍＲＮＡ又はｓａＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）の貯蔵安定性を増大させる方法であって、核酸を加水分解性ドープシリコン粒子及び１以上の脂質と接触させることを含む、方法が提供される。
【0025】
本発明の第８の態様によれば、原薬を細胞又は組織に標的化する際に使用するための、本発明の第１の態様による医薬組成物が提供される。
【0026】
本発明の第９の態様によれば、原薬を細胞又は組織の標的化のための医薬品の製造で使用するための、本発明の第１の態様による医薬組成物が提供される。
【0027】
本発明の第１０の態様によれば、細胞又は組織に対する原薬を標的化する方法であって、本発明の第１の態様による医薬組成物を、細胞又は組織に対する原薬を標的化する方法を必要とする対象へ投与することを含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図12】図１２は、異なる濃度及び体積比でＳＩＳ００１２にロードした、パン酵母由来のＲＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドＲＮＡを対照として使用した。画像の最初の３つのカラムでは、いくつかのローディングウェルの周りのボックスは対照試料を示す。画像の最後のカラムでは、レーン２、レーン３、レーン４は、１０倍希釈、Ｖ／Ｖ：２．５でＳＩＳ０１１３を含有し、レーン５、レーン６、レーン７は、５倍希釈、Ｖ／Ｖ：２．５でＳＩＳ０１１３を含有し、レーン８、レーン９、レーン１０は、５倍希釈、Ｖ／Ｖ：５でＳＩＳ０１１３を含有する。
【図13】図１３は、異なる温度（室温（ＲＴ）、４℃及び－２０℃）での貯蔵後の異なる時点（０～５時間）における選択された濃度及び体積比でＳＩＳ００１２にロードしたニシン精子由来のＤＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドＤＮＡを対照として使用した。左上の画像において、いくつかのローディングウェルの周りのボックスは対照試料を示す。他の全ての画像において、レーン２、レーン３、レーン４は室温で貯蔵された試料を保持し、レーン５、レーン６、レーン７は４℃で貯蔵された試料を保持し、レーン８、レーン９、レーン１０は２０℃で貯蔵された試料を保持する。
【図14】図１４は、異なる温度（室温（ＲＴ）、４℃及び－２０℃）での貯蔵後の異なる時点（２４～７２時間）における選択された濃度及び体積比でＳＩＳ００１２にロードしたニシン精子由来のＤＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドＤＮＡを対照として使用した。画像の左カラム及び中央カラムにおいて、レーン２、レーン３、レーン４は室温で貯蔵された試料を保持し、レーン５、レーン６、レーン７は４℃で貯蔵された試料を保持し、レーン８、レーン９、レーン１０は２０℃で貯蔵された試料を保持する。最も右側の２つの画像では、レーン２、レーン３、レーン４は室温で貯蔵された試料を保持し、レーン５、レーン６、レーン７は４℃で貯蔵された試料を保持し、レーン８、レーン９は２０℃で貯蔵された試料を保持し、レーン１０対照は２０℃で貯蔵された試料を保持する。
【図15】図１５は、異なる温度（室温（ＲＴ）、４℃及び－２０℃）での貯蔵後の異なる時点（０～６時間）における選択された濃度及び体積比でＳＩＳ００１２にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドｓｉＲＮＡを対照として使用した（全ての画像においてレーン１）。全ての画像において、レーン２、レーン３、レーン４は室温で貯蔵された試料を保持し、レーン５、レーン６、レーン７は４℃で貯蔵された試料を保持し、レーン８、レーン９、レーン１０は２０℃で貯蔵された試料を保持する。
【図16】図１６は、異なる温度（室温（ＲＴ）、４℃及び－２０℃）での貯蔵後の異なる時点（２４～１２０時間）における選択された濃度及び体積比でＳＩＳ００１２にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドｓｉＲＮＡを対照として使用した（全ての画像においてレーン１）。全ての画像において、レーン２、レーン３、レーン４は室温で貯蔵された試料を保持し、レーン５、レーン６、レーン７は４℃で貯蔵された試料を保持し、レーン８、レーン９、レーン１０は２０℃で貯蔵された試料を保持する。
【図17】図１７は、異なる温度（室温（ＲＴ）及び４℃）での貯蔵後の異なる時点（０～６時間）における選択された濃度及び体積比でシリコンナノ粒子を含まないＳＩＳ００１２にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドｓｉＲＮＡを対照として使用した。６つの右端の画像において、レーン５、レーン６、レーン７は室温で貯蔵された試料を保持し、レーン８、レーン９、レーン１０は４℃で貯蔵された試料を保持する。
【図18】図１８は、室温（ＲＴ）又は４℃での貯蔵後の異なる時点（２４～１２０時間）における選択された濃度及び体積比で、シリコンナノ粒子なしでＳＩＳ００１２にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドｓｉＲＮＡを対照として使用した（全ての画像においてレーン１）。全ての画像において、レーン５、レーン６、レーン７は室温で貯蔵された試料を保持し、レーン８、レーン９、レーン１０は４℃で貯蔵された試料を保持する。
【図19】図１９は、室温での貯蔵後の異なる時点（０～６時間）における選択された濃度及び体積比で、ＳＩＳ００１３にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドｓｉＲＮＡを対照として使用した。
【図20】図２０は、室温での貯蔵後の異なる時点（２４～１２０時間）における選択された濃度及び体積比で、ＳＩＳ００１３にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドｓｉＲＮＡを対照として使用した。
【図21】図２１は、４℃での貯蔵後の異なる時点（２～１２０時間）における選択された濃度及び体積比で、ＳＩＳ００１３にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイを示す。ネイキッドｓｉＲＮＡを対照として使用した。右端の２つの画像では、レーン２、レーン３、レーン４に「７２時間」のラベルが付けられる。それらのすぐ左の画像では、レーン２、レーン３、レーン４は「２４時間」とラベル付けされ、レーン５、レーン６、レーン７は「４８時間」とラベル付けされる。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明の全ての態様の組成物の粒子は、加水分解性ドープシリコンを含む。シリコンはドープされており；有利には、粒子は、１ｃｍ３当たり１×１０１５個以上、特に１×１０１６個以上の量のドーパント原子でドープされる（例えば、１ｃｍ３当たり１×１０１７個以上、１×１０１８個以上、１×１０１９個以上、又は１×１０２０個以上のドーパント原子）。シリコンは、ｎドープ又はｐドープされてもよい。本発明の全態様は、シリコンが、Ｍｇ、Ｐ、Ｃｕ、Ｇａ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｂｉ、Ｇｅ、Ｌｉ、Ｘｅ、Ｎ、Ａｕ、Ｐｔから選択される１以上の元素でドープされる、実施形態を含む。
【0030】
最も好ましくは、ドーパントはｐ型ドーパントである；好ましくは、ドーパントはホウ素を含む。したがって、最も好ましくは、ドーパントは、ホウ素である。Ｐドープシリコンは、負帯電した核酸及び他の負帯電した薬学的に活性な成分を安定化するのに特に好適であり得る。このようにして、任意選択的に（optionally）、本発明の全ての態様による加水分解性シリコン粒子のドーピングは、妥当なトランスフェクション能力（例えば、良好な組織標的化能若しくは良好な細胞標的化能）及び／又は良好な貯蔵安定性を依然として維持しながら、加水分解性ドープシリコンを含まない従来のトランスフェクション組成物と比較して、ＤＯＴＭＡ又はＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質のより少ない使用を可能にし、かつ潜在的に使用しないことができる。
【0031】
Ｎドープシリコンは、正帯電した薬学的活性薬学的に活性な成分を安定化することにおいて、また、脂質、例えば正帯電した脂質を分解から保護することにおいて特に有用であってもよく、これは、原薬、例えば核酸の安定化及び保護を間接的に増加させる。
【0032】
原薬が核酸である本発明の様々な態様の実施形態では、医薬組成物は、任意選択的に（optionally）、ポリカチオン性核酸結合構成成分を更に含む。「ポリカチオン性核酸結合構成成分」という用語は当技術分野で周知であり、少なくとも３個の繰り返しカチオン性アミノ酸残基又は正帯電した基を保有する他のカチオン性単位を有するポリマーを指し、そのようなポリマーは、生理学的条件下において核酸と顔貌（ｃｏｍｐｌｅｘｉｏｎ）を形成することができる。核酸結合ポリカチオン性分子の例は、１以上のカチオン性アミノ酸を含むオリゴペプチドである。そのようなオリゴペプチドは、例えば、オリゴリジン分子、オリゴヒスチジン分子、オリゴアルギニン分子、オリゴオルニチン分子、オリゴジアミノプロピオン酸分子若しくはオリゴジアミノ酪酸分子、又はヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチンジアミノプロピオン酸、及びジアミノ酪酸残基の任意の組合せを含む若しくはこれらからなる複合オリゴマーであり得る。ポリカチオン性構成成分の更なる例としては、デンドリマー及びポリエチレンイミンが挙げられる。
【0033】
加水分解性シリコンを含む粒子
本発明の全ての態様によれば、ドープシリコン粒子は、純粋なドープシリコン、又は別の加水分解性ドープシリコン含有材料であり得る。この粒子が純粋なドープシリコンでない場合、それらは少なくとも５０重量％のシリコンを含有し、すなわち、それらは粒子中の原子の総質量に基づいて少なくとも５０重量％のシリコン原子を含む。例えば、シリコン粒子は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のシリコンを含有し得る。シリコン粒子は、好ましくは、例えば室温のＰＢＳ緩衝液中で、同じ寸法の純粋なシリコン粒子の加水分解速度の少なくとも１０％の加水分解速度を示す。シリコン含有材料の加水分解のためのアッセイは当技術分野で広く知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／００１４５６号を参照されたい）。本発明の粒子はいくらかのシリカを含有し得るが、シリカは、加水分解性シリコンではなく、かつ粒子中のシリコン原子の少なくとも半分は、元素シリコン（又はドープ元素シリコン）の形態である。
本発明の全ての態様によれば、ドープシリコン粒子は、純粋なドープシリコン、又は別の加水分解性ドープシリコン含有材料であり得る。この粒子が純粋なドープシリコンでない場合、それらは少なくとも５０重量％のシリコンを含有し、すなわち、それらは粒子中の原子の総質量に基づいて少なくとも５０重量％のシリコン原子を含む。例えば、シリコン粒子は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のシリコンを含有し得る。シリコン粒子は、好ましくは、例えば室温のＰＢＳ緩衝液中で、同じ寸法の純粋なシリコン粒子の加水分解速度の少なくとも１０％の加水分解速度を示す。シリコン含有材料の加水分解のためのアッセイは当技術分野で広く知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／００１４５６号を参照されたい）。本発明の粒子はいくらかのシリカを含有し得るが、シリカは、加水分解性シリコンではなく、かつ粒子中のシリコン原子の少なくとも半分は、元素シリコン（又はドープ元素シリコン）の形態である。
【0034】
本発明の全ての態様によれば、加水分解性ドープシリコンを含む粒子は、ナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、５～４００ｎｍ、例えば５０～３５０ｎｍ、例えば８０～３１０ｎｍ、例えば１００～２５０ｎｍ、例えば１２０～２４０ｎｍ、例えば１５０～２２０ｎｍ、例えば約２００ｎｍの公称直径を有する。ナノ粒子は、純粋なシリコン又は加水分解性ドープシリコン含有材料のいずれかで作製され得る。それらは、好ましくは多孔質、より好ましくはメソポーラスである。上記の公称直径は平均直径を指してもよく、粒子の試料中の粒子の総質量の少なくとも９０％は、指定されたサイズ範囲内に入り得る。加水分解性ドープシリコンを含む粒子は、粒子をフッ化水素酸（ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｃ ａｃｉｄ：ＨＦ）／エタノール混合物と接触させ、電流を印加するなどの標準的な技術によって、多孔質にすることができる。ＨＦ濃度並びに電流密度及び曝露時間を変化させることによって、細孔の密度及びそれらのサイズを制御することができ、かつ走査型電子顕微鏡写真及び／又は窒素吸着脱着体積等温測定によって監視することができる。
【0035】
本発明の全ての態様において、粒子は多孔質であることが好ましい。粒子が多孔質である場合、それらの多孔度のおかげで、それらの総表面積が増加する。例えば、表面積は、対応する非多孔質粒子の表面積にわたって少なくとも５０％又は少なくとも１００％増加し得る。多くの状況において、本発明の全ての態様による多孔質粒子は、実際には、それらの多孔度のために総表面積がはるかに大きく増加する。好ましくは、粒子はメソポーラスである。
【0036】
特定の実施形態によれば、多孔度は、少なくとも３０％、４０％、５０％、又は６０％である。これは、粒子体積のそれぞれ３０％、４０％、５０％、又は６０％が、細孔空間にあることを意味する。好ましい細孔径は、１ｎｍ～５０ｎｍ、例えば５ｎｍ～２５ｎｍの範囲にわたる。
【0037】
ドーピング
本発明の全ての態様は、ドープシリコン含有材料に関する。ドープシリコンの製造は、半導体産業においてよく理解されており、かつイオン注入及び拡散法を含む。したがって、ドープシリコンは容易に入手可能である。あるいは、シリコン中に存在するドーパントの量を増加させるために拡散法を用いることによって、シリコンをドープすることができる。拡散法の一例として、シリコン粉末及びドーピング試薬（例えば、ホウ素ドーピング用のＢ２Ｏ３）をボウル中に入れ、これを混合してＮ２雰囲気下に置き、１０５０℃～１１７５℃の温度で数分間かけてドーパント（例えば、ホウ素）をシリコン中に拡散させる。図１及び図２は、この方法によって生成されたホウ素ドープシリコンを示す。
本発明の全ての態様は、ドープシリコン含有材料に関する。ドープシリコンの製造は、半導体産業においてよく理解されており、かつイオン注入及び拡散法を含む。したがって、ドープシリコンは容易に入手可能である。あるいは、シリコン中に存在するドーパントの量を増加させるために拡散法を用いることによって、シリコンをドープすることができる。拡散法の一例として、シリコン粉末及びドーピング試薬（例えば、ホウ素ドーピング用のＢ２Ｏ３）をボウル中に入れ、これを混合してＮ２雰囲気下に置き、１０５０℃～１１７５℃の温度で数分間かけてドーパント（例えば、ホウ素）をシリコン中に拡散させる。図１及び図２は、この方法によって生成されたホウ素ドープシリコンを示す。
【0038】
ある特定の実施形態では、シリコンのドーピングは、高濃度ドーピングであり、これは、少なくとも１×１０１５個のドーパント原子／ｃｍ３のドーピングを意味するものと理解される。いくつかの好ましい実施形態では、ドーパントは、１×１０１６ドーパント原子／ｃｍ３以上の量で存在する。したがって、特に好ましい実施形態では、ホウ素は、１×１０１６ホウ素原子／ｃｍ３以上の量で存在する。
【0039】
例えば、１×１０１７個以上のドーパント原子／ｃｍ３、１×１０１８個以上のドーパント原子／ｃｍ３、又は１×１０１９個以上のドーパント原子／ｃｍ３が存在し得る。
【0040】
任意選択的に（optionally）、最大１×１０２０個のドーパント原子／ｃｍ３が存在し得る。例えば、１×１０１６個以上のホウ素原子／ｃｍ３及び最大１×１０２０ホウ素原子／ｃｍ３のレベルで存在するホウ素が存在し得る。
【0041】
ホウ素がドーパントとして使用される場合、１×１０１５個のドーパント原子／ｃｍ３、及び１×１０２０個のドーパント原子／ｃｍ３のドーピング量は、それぞれ、抵抗率１３．６ｏｈｍ－ｃｍ及び１．３ｍｏｈｍ－ｃｍに対応することが好ましい。ホウ素が好ましいドーパントである本発明の様々な態様は、ホウ素でドープされる、例えば高濃度にドープされることに加えて、他の元素でもまたドープされるシリコンを除外しない。本発明の全ての態様の好ましい実施形態によれば、大部分のドーパントは、ホウ素である。
【0042】
脂質
本技術分野における脂質は、概して、脂肪酸及び脂肪酸誘導体、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、及びポリケチドを含むものと理解される。
本技術分野における脂質は、概して、脂肪酸及び脂肪酸誘導体、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、及びポリケチドを含むものと理解される。
【0043】
本出願で使用される場合、「脂質」という用語はまた、短いペプチド配列（例えば、３～２０個のアミノ酸残基、例えば５～１５個のアミノ酸残基など、特に３個、４個、又は５個のアミノ酸残基、最も特には５個のアミノ酸残基を有するペプチド配列など）が、１以上の脂肪酸鎖（特に、１０～２４の炭素鎖長、好ましくは１２～１８の炭素鎖長を有する脂肪酸鎖；例えば、１４、１５、又は１６の炭素鎖長；例としては、ペプチド部分は、パルミトイル、セチル、又はミリストイル部分で任意選択的に（optionally）脂質化されていてもよい）にコンジュゲートされている、脂質付加オリゴペプチド（リポペプチドという用語と本明細書では互換的に使用される用語）を包含し得る。
【0044】
脂質付加オリゴペプチドは、任選択的に（optionally）、脂質付加テトラペプチド、脂質付加ペンタペプチド、又は脂質付加ヘキサペプチドであり得る。好ましくは、アミノ酸残基は、リジン又はアルギニンなどの７．４のｐＨ（生理学的ｐＨ）でカチオン性である、少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、２アミノ酸残基又は３アミノ酸残基）を含む。例えば、脂質付加オリゴペプチドは、１以上（例えば、２つ）のリジン残基を含み得る。したがって、特定の例は、パルミトイル－ペンタペプチド－４（ＣＡＳ番号２１４０４７－００－４；ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳと略す）である。
パルミトイルペンタペプチド－４
【化1】
パルミトイルペンタペプチド－４
【0045】
したがって、本発明の全ての態様による特定の好ましい実施形態では、１以上の脂質は、１以上の脂質付加オリゴペプチド、特にｐＨ７．４（生理学的ｐＨ；例としては、リジン及びアルギニンが挙げられる）でカチオン性である、１以上のアミノ酸残基を有するものであるか又は１以上のアミノ酸残基を有するものを含む。
【0046】
脂質付加オリゴペプチドは、ＤＯＰＥ又はＤＰＰＣなどの１以上のリン脂質と組み合わせて使用され得る。リポペプチドのアルキル鎖はリン脂質二重層中で有利に同化され得るが、一方で二重層の表面は、ペプチド部分で装飾されているものと考えられる。このようにして、ペプチドは、組織及び／又は細胞標的化を提供し得ると考えられ、例えば、ペプチドが生理学的ｐＨでカチオン性電荷を保有する場合、ｍＲＮＡなどの核酸などの負帯電したＡＰＩを安定化し得る。
【0047】
本発明の全ての態様によれば、医薬組成物中に１以上の脂質が存在する。好ましくは、当該１以上の脂質は、本発明の加水分解性ドープシリコン粒子と関連して提供される。
【0048】
ある特定の実施形態によれば、脂質は、少なくとも１つのカチオン性脂質；ヘルパー脂質、例えばリン脂質；構造脂質、例えばコレステロール系脂質；及び／又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質であるか、又はこれらを含む。
【0049】
脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、水素化ＰＣ、ステアリルアミン（ＳＡ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステリル３β－Ｎ－（ジメチルアミノエチル）カルバメート塩酸塩（ＤＣ）－コレステロール、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、及びそれらの誘導体のうちの１以上を含み得る。ある特定の実施形態では、脂質は、ＤＯＴＡＰを含むか、又はＤＯＴＡＰからなる。脂質で粒子を表面処理することは、核酸又は他の薬学的に活性な薬剤の放出速度を制御するのに役立つことが判明している。シリコン含有粒子の表面を処理するために使用される脂質の種類は、その放出速度に影響を及ぼし得る。特に、加水分解性ドープシリコン粒子を脂質で表面処理することは、粒子の表面電荷に有益な効果をもたらし、これは、低分子干渉ＲＮＡ、又は低分子活性化ＲＮＡ、又は低分子ヘアピンＲＮＡ、又はメッセンジャーＲＮＡのロードを改善するのに必要なゼータ電位を提供し、かつ標的部位でのそれらの放出速度を制御する。少なくとも１つの脂質の存在はまた、ドープシリコンが不溶性ポリマー加水分解生成物ではなく生体利用可能なオルトケイ酸（ＯＳＡ）分解生成物へと加水分解するように、ドープシリコンの加水分解速度が制御されることを可能にし得る。ドープシリコンの加水分解速度を制御することは、ドープシリコンに関連した核酸又は他の原薬が放出される速度に影響を及ぼす。放出速度の制御は、原薬の保護が持続される期間に影響を及ぼす。
【0050】
それにもかかわらず、本明細書で使用されるドープシリコンは、原薬を含むが加水分解性ドープシリコン粒子を含まない従来の組成物、特に核酸を含む従来のトランスフェクション組成物よりも少ない脂質（特に、ＤＯＴＡＰなどのより低量のカチオン性脂質）を使用する能力、及び／又はそのような組成物が、依然としてトランスフェクション有効性、貯蔵安定性、及び／又は特定の種類の組織若しくは特定の種類の細胞への標的化送達を提供しながら、より広い範囲の脂質と共に製剤化される能力を提供する。したがって、特定の脂質、特にＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質への依存を低減する方法が提供される。したがって、本発明の全ての態様のある特定の実施形態では、１以上の脂質は、カチオン性脂質；ヘルパー脂質、例えばリン脂質；構造脂質、例えばコレステロール系脂質；及び／又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質からなる群から選択される。そのような実施形態では、任意選択的に（optionally）、１以上の脂質のいずれも、ＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質ではない。
【0051】
本発明の全ての態様のある特定の実施形態では、脂質はＤＯＴＡＰであるか、又は製剤中に存在する脂質はＤＯＴＡＰを含む。ＤＯＴＡＰは、Ｓ鏡像異性形態及びＲ鏡像異性形態として存在し、本発明の全態様によれば、Ｓ形態、Ｒ形態として、又はラセミ体として存在し得る。本発明の組成物中に存在する全ＤＯＴＡＰのある特定の実施形態によれば、Ｒ形態及びＳ形態は、およそ等量（すなわち、いずれかの形態の６０％以下）であり得る。他の実施形態では、全ＤＯＴＡＰの少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、Ｒ形態である。他の実施形態では、全ＤＯＴＡＰの少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、Ｓ形態である。１以上の脂質が、ＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質か又はＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質を含む場合、本発明の全態様によるシリコン粒子のドーピングは、好ましくは、加水分解性ドープシリコン粒子を含まない、核酸などの原薬の送達のための医薬組成物よりも少ないＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質の使用を可能にする。
【0052】
本発明の全ての態様によれば、脂質（単数）又は脂質（複数）は、５００～１０００などの範囲内の平均分子量を有し得る。
【0053】
好ましくは、本発明の全態様（例えば、脂質が、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質のうちの１以上を含有する場合、又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上から選択される場合）によれば、任意の更なる処理（すなわち、濾過プロセス又は滅菌プロセスによって）の前にドープされる脂質（すなわち、全脂質構成成分）の比率は、１：１～４５：１、例えば、１：１～２０：１、１：１～１６：１、１：１～１２：１、１：１～１１：１、１：１～１０：１、１：１～９：１、１：１～８：１、１：１～１３：１、２：１～１２：１、２：１～１１：１、２：１～１０：１、２：１～９：１、２：１～８：１、例えば、１：１～７：１、２：１～７：１、３：１～６：１、４：１～５：１である。０．８：１～２０：１の脂質構成成分とケイ素モルとの比率は、例えば１６：１、１２：１、８：１、又は２．５：１が特に有利であることが分かった。
【0054】
有利には、この脂質とドープシリコンとの比率は、加水分解性ドープシリコンの粒子と接触した原薬（例えば、核酸）の放出を制御、及びこの原薬を安定化し、シリコンの生体利用可能な分解生成物であるＯＳＡの制御された放出を促進することができる、多層小胞システムを提供し得る。
【0055】
有利には、脂質化合物は、ドープシリコンナノ粒子の表面電荷に有意な効果を及ぼすことができる。ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＰＥ）、及びレシチンで処理した加水分解性純粋シリコンを含む粒子は、ゼータ電位分析を行った場合に負の表面電荷を実証する（シリコン：脂質の様々な好ましい比である、－６０～－２０ｍＶの範囲にわたる）。ステアリルアミン又はＤＯＴＡＰで処理した粒子表面は、正のゼータ電位（０ｍＶ～＋４０ｍＶの範囲にわたり、シリコン：脂質の様々な好ましい比を有する）を実証する。シリコンのドーピングは表面電荷を変化させる。ホウ素（本発明の多くの実施形態ではその様々な態様の全てにおいて好ましい）などのｐドーパントの使用は、ゼータ電位をより正にする（すなわち、負の値がより小さい）。純粋なシリコンの典型的な値である－４０ｍＶは、シリコンがホウ素でドープされた場合、約－２５ｍＶになる。したがって、ホウ素ドープシリコンは、カチオン性脂質で処理した場合、より容易に、正のゼータ電位を達成することができる。例えば、ステアリルアミン又はＤＯＴＡＰによる処理は、約＋２０ｍＶ～＋６０ｍＶの値を達成することができる。これは、より少量のカチオン性脂質を用いて、又はより広範囲のカチオン性脂質（ステアリルアミン及びＤＯＴＡＰよりもカチオン性が低いものを含む）を用いて、正の表面ゼータ電位が達成され得ることを意味する。これはまた、カチオン性脂質が貯蔵中に分解（「老化」）することで、脂質の正電荷の部分的損失をもたらしたとしても、粒子の表面ゼータ電位がより快適に長時間正のままであることを意味する。
【0056】
０．８：１～２０：１の脂質構成成分とケイ素モルとの比率は、例えば１６：１、１２：１、８：１、又は２．５：１が特に有利であることが分かった。
【0057】
脂質又は脂質構成成分は、いくつかの実施形態では、リン脂質であり得るか、又はリン脂質を含み得る。「リン脂質」という用語は、脂肪酸鎖及びホスフェート（phosphate）基を含む脂質を指す。リン脂質は、それらが正帯電したカチオン性脂質とは異なり、全体的な電荷を有しないか、又は負電荷を保有し得るという点で、典型的には中性分子である。リン脂質は、典型的には、正帯電及び負帯電した構成成分の両方を含むが、全体的な電荷を含まない双性イオン化合物である。したがって、リン脂質は、典型的には中性脂質として分類される。特に好適なリン脂質はグリセロリン脂質である。特に好適なリン脂質は、極性頭部基が第四級アンモニウム部分、例えばホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ：ＰＣ）又は水素付加ホスファチジルコリンなどに結合されているリン脂質である。リン脂質の別の例は、ＤＯＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）である。脂質の種類は製剤の性質に応じて選択されてもよく、中性又は負帯電したリン脂質は、非プロトン性製剤に好ましいが、一方で正帯電したカチオン性脂質及び小さなＣＨ３鎖脂質がプロトン性製剤に好ましい。リン脂質は、レシチンであってもよく、又はレシチンに由来してもよい。
【0058】
好ましくは、リン脂質の側鎖（複数可）は、１５個以上の炭素原子を有する脂肪族側鎖（複数可）、又は６個以上の繰り返しエーテル単位を有するエーテル側鎖、例えばポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール鎖などである。エーテル側鎖を有する脂質は、「ＰＥＧ脂質」又は「ＰＥＧ化」脂質と称され得る。したがって、本出願で使用される場合、「脂質」という用語は、したがってＰＥＧ脂質を網羅し得る。したがって、ある特定の実施形態によれば、脂質は、１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質であるか、又は１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含む。
【0059】
脂質又は脂質構成成分は、いくつかの実施形態では、カチオン性脂質であり得るか、又はカチオン性脂質を含み得る。「カチオン性脂質」という用語は、いくらかのスペーサを介して疎水性尾部に結合したカチオン性頭部基を有する正帯電した分子を指す。例としては、ＤＴＤＴＭＡ（ジテトラデシルトリメチルアンモニウム）、ＤＯＴＭＡ（２，３－ジオレイルオキシプロピル－１－トリメンチルアンモニウム）、ＤＨＤＴＭＡ（ジヘキサデシルトリメチルアンモニウム）、及びステアリルアミン（ＳＡ）が挙げられる。正電荷は、典型的には、負の対イオンによって安定化される。好ましい実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰであるか、又はＤＯＴＡＰを含む。本明細書に記載されるように、本発明の全態様によるシリコンのドーピングは、加水分解性ドープシリコンなしで製剤化されたトランスフェクション組成物などの従来の組成物と比較して、ＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質のより低い量を使用する能力を提供し得るが、しかし、本明細書で提供される加水分解性ドープシリコンを含む組成物は、妥当なトランスフェクション能力（例えば、良好な組織標的化能又は良好な細胞標的化能）及び／又は良好な貯蔵安定性を維持する。
【0060】
ある特定の実施形態では、脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ステアリルアミン（ＳＡ）、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【0061】
ある特定の実施形態では、脂質は、ホスファチジルコリン、水素付加ホスファチジルコリン、ステアリルアミン、又はそれらの組合せから実質的になり得る。
【0062】
ある特定の実施形態では、脂質は、粒子の総重量に基づいて、少なくとも５重量％の水素化ホスファチジルコリン、例えば少なくとも２０重量％、典型的には少なくとも３０重量％、特に少なくとも５０重量％の水素化ホスファチジルコリンからなり得る。０．８：１～５：１の水素化ホスファチジルコリン対ドープシリコンのモル比は、例えば１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、又は４．５：１が特に有利であることが分かった。
【0063】
ある特定の実施形態では、脂質は、粒子の総重量に基づいて、少なくとも５重量％のホスファチジルコリン、例えば少なくとも２０重量％、典型的には少なくとも３０重量％、特に少なくとも５０重量％のホスファチジルコリンからなり得る。０．８：１～５：１のホスファチジルコリン対ドープシリコンのモル比は、例えば１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、又は４．５：１が特に有利であることが分かった。
【0064】
ある特定の実施形態では、脂質は、粒子の総重量に基づいて、少なくとも５重量％のステアリルアミン、例えば少なくとも２０重量％、典型的には少なくとも３０重量％、特に少なくとも５０重量％のステアリルアミンからなり得る。０．８：１～５：１のステアリルアミン対ドープシリコンのモル比は、例えば１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、又は４．５：１が特に有利であることが分かった。
【0065】
ある特定の実施形態では、脂質は、ＰＣ及びＳＡからなってもよく、好ましくは、ＰＣ：ＳＡの重量比は、１：１～２０：１、より好ましくは７：１～１０：１であり得、例えばＰＣ：ＳＡの重量比が７２：８などであり得る。
【0066】
ある特定の実施形態では、脂質は、ＤＯＰＥ、ＳＡ、及びＤＣ－コレステロールからなり得る。ＤＯＰＥ：ＳＡの重量比は、１：１～１０：１、例えば４：１～８：１の範囲内であり得る。ＤＯＰＥ：ＤＣ－コレステロールの重量比は、１：１～５：１、例えば１：１～３：１の範囲内であり得る。ＳＡ：ＤＣ－コレステロールの重量比は、１：１～１：５、例えば１：２～１：４の範囲内であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＯＰＥ：ＳＡ：ＤＣ－コレステロールの重量比は、４８：８：２４であり得る。
【0067】
ある特定の好ましい実施形態では、脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、及びＰＥＧ脂質（ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥなど）からなり得る。ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥの重量比は、１：２～２：１、例えばおよそ１：１であり得る。ＤＯＴＡＰ：ＰＥＧ脂質及びＤＯＰＥ：ＰＥＧ脂質の比率は、１０：１～５：１、例えばおよそ７：１であり得る。全脂質対シリコンの総重量比は、２０：１～１０：１、例えばおよそ１６：１であり得る。
【0068】
アミノ酸
本発明の全ての態様は、１以上のアミノ酸の追加的な所望による存在又は使用を含み得る。
本発明の全ての態様は、１以上のアミノ酸の追加的な所望による存在又は使用を含み得る。
【0069】
その最も広い意味では、「アミノ酸」という用語は、アミン（－ＮＨ２）及びカルボキシル（－ＣＯＯＨ）官能基を含有する任意の人工有機化合物又は天然に存在する有機化合物を包含する。「アミノ酸」という用語は、αアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、及びδアミノ酸を含む。「アミノ酸」という用語は、任意のキラル配置のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば（例えば、本発明のドープシリコン粒子が、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１以上と製剤化される場合）、アミノ酸は、好ましくは天然に存在するαアミノ酸である。それは、タンパク新生アミノ酸又は非タンパク新生アミノ酸（カルニチン、レボチロキシン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、又はシトルリンなど）であり得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、若しくはグリシン、又はアルギニンとグリシンとの混合物を含む。特に好ましい実施形態では、アミノ酸は、グリシンを含む。そのようなアミノ酸は、貯蔵中及びインビボでの両方にて、ドープシリコン粒子を安定化し、かつドープシリコンの加水分解を制御するように機能し得る。
【0070】
上記のアミノ酸に加えて、全ての態様は、粒子にある程度の細胞特異性を付与する細胞表面受容体、例えばインテグリン認識配列を含有するペプチドが含まれ得る。ペプチドは、細胞表面受容体認識配列を含有する「頭部基」と、活性医薬剤、例えば核酸に非共有結合的に結合することができ、及び／又はドープシリコンに結合する追加的な「尾部」と、を有し得る。
【0071】
活性医薬剤－粒子会合
好ましい実施形態（例えば、加水分解性ホウ素ドープシリコンを含む粒子が、１以上のアミノ酸、例えばアルギニン、グリシン、及びヒスチジン、及び／又は、１以上の脂質、例えばＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体、又は他のイオン性若しくはカチオン性脂質と製剤化される場合）によれば、本発明の全態様の製品中に存在する活性医薬剤（例えば、核酸、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡ）の少なくとも７０重量％、例えば少なくとも８０重量％、例えば少なくとも９０重量％が、粒子と会合している。これにより、活性医薬剤がドープシリコンと非共有結合していることを意味する。理論に束縛されることを望むものではないが、これが起こる場合、核酸などの活性医薬剤のランダムなブラウン運動が減少し得、医薬組成物の効率が増強されるものと仮定される。例えば、例えば、製剤中に存在する分解酵素によってそれが分解される機会が減少する。また、理論に束縛されることを望むものではないが、活性医薬剤（例えば、核酸及び特にｍＲＮＡ）との酵素触媒反応に利用可能な水分子の数の減少があり得るものと考えられる。例えば、水分子は、水と加水分解性ドープシリコンとの反応によって除去され得る。
好ましい実施形態（例えば、加水分解性ホウ素ドープシリコンを含む粒子が、１以上のアミノ酸、例えばアルギニン、グリシン、及びヒスチジン、及び／又は、１以上の脂質、例えばＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体、又は他のイオン性若しくはカチオン性脂質と製剤化される場合）によれば、本発明の全態様の製品中に存在する活性医薬剤（例えば、核酸、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡ）の少なくとも７０重量％、例えば少なくとも８０重量％、例えば少なくとも９０重量％が、粒子と会合している。これにより、活性医薬剤がドープシリコンと非共有結合していることを意味する。理論に束縛されることを望むものではないが、これが起こる場合、核酸などの活性医薬剤のランダムなブラウン運動が減少し得、医薬組成物の効率が増強されるものと仮定される。例えば、例えば、製剤中に存在する分解酵素によってそれが分解される機会が減少する。また、理論に束縛されることを望むものではないが、活性医薬剤（例えば、核酸及び特にｍＲＮＡ）との酵素触媒反応に利用可能な水分子の数の減少があり得るものと考えられる。例えば、水分子は、水と加水分解性ドープシリコンとの反応によって除去され得る。
【0072】
粒子の分解速度、及び分解から生じる活性医薬剤との会合の終わりは、粒子中のドープシリコンの加水分解によって支配される。この速度を制御することができるので、活性医薬剤が生物学的に利用可能になる速度もまた、用量ダンピングを回避するために、及び／又は好適な長期間にわたって漸進的な放出を確実にするために、制御され得る。
【0073】
活性医薬剤が核酸である場合、脂質処理されたホウ素ドープシリコン粒子（例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上で処理されたナノ粒子）を、アミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、及びヒスチジンのうち１以上、好ましくはグリシン）で処理した場合、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ）などの核酸に対して有益な安定化効果が得られることが判明した。特に、脂質処理粒子をアミノ酸で処理すると、生体体液中、例えば眼組織又は血漿中のＲＮＡなどの核酸が安定化することが示されている。この様式にてアミノ酸で製剤化された脂質処理粒子は、身体への送達、例えば経皮注射、硝子体内注射による送達に特に好適であり得る。
【0074】
ドープシリコンに対するアミノ酸（複数可）の比率
好ましくは（例えば、本発明の粒子が、１以上のアミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうちの１以上のアミノ酸；及び／又は、１以上の脂質、例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうちの１以上により製剤化される場合）、アミノ酸（例えばグリシン、又はグリシンとリジンとの混合物）は、シリコンに対する重量比で、少なくとも５００：１、少なくとも５０：１、少なくとも５：１、少なくとも２．５：１、少なくとも１：１、又は少なくとも０．５：１若しくは０．０５：１で任意選択的に（optionally）存在していてもよい。好ましくは、アミノ酸はグリシンであり、これは所望により、シリコンに対する重量比で、少なくとも５００：１、少なくとも５０：１、少なくとも５：１、少なくとも２．５：１、少なくとも１：１、又は少なくとも０．５：１、又は０．０５：１で存在する。
好ましくは（例えば、本発明の粒子が、１以上のアミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうちの１以上のアミノ酸；及び／又は、１以上の脂質、例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうちの１以上により製剤化される場合）、アミノ酸（例えばグリシン、又はグリシンとリジンとの混合物）は、シリコンに対する重量比で、少なくとも５００：１、少なくとも５０：１、少なくとも５：１、少なくとも２．５：１、少なくとも１：１、又は少なくとも０．５：１若しくは０．０５：１で任意選択的に（optionally）存在していてもよい。好ましくは、アミノ酸はグリシンであり、これは所望により、シリコンに対する重量比で、少なくとも５００：１、少なくとも５０：１、少なくとも５：１、少なくとも２．５：１、少なくとも１：１、又は少なくとも０．５：１、又は０．０５：１で存在する。
【0075】
有利には、アミノ酸とドープシリコンとのこの比率は、粒子に関連したＲＮＡ分子などの活性医薬剤の放出速度に更に影響を与え、かつ安定化する。
【0076】
本発明の全ての態様によれば、粒子は、脂質（例えば、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上）、並びにアミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、及びヒスチジンのうち１以上、例えばグリシン、又はグリシンとアルギニンとの混合物など）で処理され得る。アミノ酸は任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、アミノ酸は、アルギニン、又はグリシン、又はグリシンとアルギニンとの組合せである。脂質は任意の脂質であり得る。好ましくは、脂質は、リン脂質である。任意選択的に（optionally）、脂質はカチオン性脂質を更に含む。より好ましくは、脂質（単数）又は脂質（複数）は、水素化ＰＣ、ＰＣ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、レシチン、ステアリルアミン、及びそれらの誘導体のうち１以上から選択される。任意選択的に（optionally）、脂質は、ＤＯＴＡＰ及び／又はその誘導体を含む。
【0077】
好ましくは、アミノ酸対ドープシリコンの比率は、０．０５：１～０．４：１、例えば０．０８：１～０．３５：１、特に０．０９：１～０．３２：１である。いくつかの実施形態（例えば、脂質が、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上から選択される場合）では、アミノ酸は、アルギニンとグリシンとの組合せであり、ここで、Ａｒｇ：Ｇｌｙの比率は、１：０．６～３：１、例えば１：０．８～２．５：１、例えば１：１～２：１である。
【0078】
本発明の全ての態様の他の実施形態によれば、粒子は、アルギニンと共に製剤化される。好ましくは、アルギニン対ホウ素ドープシリコンの比率は、０．０５：１～０．４：１、例えば０．０８：１～０．３５：１、特に０．０９：１～０．３２：１である。
【0079】
本発明の全ての態様の他の実施形態によれば、粒子は、グリシンと共に製剤化される。好ましくは、グリシン対ホウ素ドープシリコンの比率は、０．０５：１～０．５：１、例えば０．０８：１～０．４５：１、特に０．０９：１～０．４２：１である。
【0080】
本発明の全ての態様で使用するための好ましいアミノ酸には、アルギニン、グリシン、プロリン、リジン、及びヒスチジン、並びにそれらの２つ以上の混合物が含まれる。
【0081】
活性医薬剤
本発明の全ての態様によれば、活性医薬剤（原薬ともまた称される）は、任意の薬学的に活性な化合物であり得る。いくつかの実施形態では、活性医薬剤は、プロドラッグであり得る。本発明の全ての態様の好ましい実施形態では、活性医薬剤は、核酸である。
本発明の全ての態様によれば、活性医薬剤（原薬ともまた称される）は、任意の薬学的に活性な化合物であり得る。いくつかの実施形態では、活性医薬剤は、プロドラッグであり得る。本発明の全ての態様の好ましい実施形態では、活性医薬剤は、核酸である。
【0082】
本発明に従って使用するためのＲＮＡなどの核酸には、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、並びにＰＮＡ（ペプチド核酸）又はＲＮＡ若しくはＤＮＡ間のハイブリッドが含まれる。この用語はまた、公知の種類の修飾、例えば、当技術分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、類似体による天然に存在するヌクレオチドの１以上の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、負帯電した結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、及び正帯電した結合を有するもの（例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）など、ペンダント部分を含有するもの、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなどを含む）など、干渉物質を有するもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を含有するもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、並びにポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの非修飾形態も含む。
【0083】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリン塩基及びピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基もまた含有する部分を含むことが理解されよう。そのような修飾としては、メチル化プリン若しくはメチル化ピリミジン、アシル化プリン若しくはアシル化ピリミジン、又は他の複素環が挙げられる。修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、例えば、ヒドロキシル基の１以上が、ハロゲン、脂肪族基で置き換えられているか、又はエーテル、アミンなどとして官能化されている、糖部分に対する修飾も含む。ヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対する他の修飾は、水素結合をそれぞれの相補的ピリミジン又は相補的プリンへと形成するプリン塩基又はピリミジン塩基上の官能基、例えば、イソグアニン、イソシステインなどを、再配列、付加、置換、又は他の方法で変化させることに関与する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド及び／又はプローブは、少なくとも１個、２個、３個、又は４個の修飾ヌクレオチドを含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡなどの核酸は、１以上のユニバーサル塩基を含む。本明細書で使用される場合、「ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）」という用語は、Ａ、Ｕ／Ｔ、Ｃ、及びＧから選択される２つ以上のヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、ヌクレオチド類似体を指す。いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、６－ニトロインドール、５－ニトロインドールからなる群から選択され得る。
【0085】
本発明の全ての態様の好ましい実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。好ましい実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。ＲＮＡは、本発明の全ての態様の様々な実施形態において、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡを含む。好ましくは、核酸は、ｍＲＮＡである。好ましい実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡワクチンのｍＲＮＡであり得る。
【0086】
その最も広い意味では、ｓａＲＮＡという用語は、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）経路内で作動する、５～５０塩基対長の二本鎖ＲＮＡ分子を含む、低分子活性化ＲＮＡを包含する。例えば、ｓａＲＮＡは、長さが１０～４５塩基対、１５～４０塩基対、２０～３０塩基対、特に２０～２５塩基対であり得る。
【0087】
その最も広い意味では、ｓｈＲＮＡという用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作動する、塩基対合を有し、かつ１０～１００塩基長を有する一本鎖ＲＮＡ分子を包含する。例えば、ｓｈＲＮＡは、長さが１５～９５塩基対、２０～８０塩基対、又は２５～７５塩基対、特に３０～７０塩基対であり得る。
【0088】
その最も広い意味では、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、低分子干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとして知られることもある、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を包含し、これは、５～５０塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子を含み、かつＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作動する。例えば、ｓｉＲＮＡは、長さが１０～４５塩基対、１５～４０塩基対、２０～３０塩基対、特に２０～２５塩基対であり得る。
【0089】
「ｍＲＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡを包含し、かつ５プライムキャップ及び／又はポリアデニル化末端を含むｍＲＮＡを任意選択的に（optionally）含み得る。あるいは、これらの特徴の一方又は両方が存在しなくてもよい。ｍＲＮＡは、ある特定の実施形態では、少なくとも１００塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも５００塩基対、又は少なくとも１０００塩基対の長さであり得る。
【0090】
本発明の全ての態様の好ましい実施形態によるＲＮＡ（例えば、本発明の粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又は、ＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上を用いて製剤化される場合）は、それらの治療特性、例えば活性の増強、血清安定性の増加、オフターゲティングの減少、及び免疫学的活性の低下などを増強するために、天然に存在し得るか、又は化学的に修飾され得る。ＲＮＡに対する化学修飾は、当技術分野で一般的に知られている任意の修飾を含み得る。
【0091】
いくつかの実施形態（例えば、本発明の粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）によれば、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。いくつかの他の実施形態（例えば、本発明の粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）によれば、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
【0092】
他の実施形態によれば、ｍＲＮＡは抗原をコードし、それによって、ワクチンである医薬組成物を提供する。抗原は、ウイルス抗原、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に由来する抗原であり得る。
【0093】
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、複数のタンパク質をコードし得る。例えば、ｍＲＮＡは、ウイルス抗原及び補助タンパク質（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、以上のウイルス抗原をコードし得る。他の実施形態では、アジュバントは、活性医薬剤に加えて、医薬組成物の追加的な構成成分として代替的又は追加的に提供されてもよい。
【0094】
活性医薬剤に対するドープシリコンの比率
好ましくは（例えば、本発明の粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１以上を用いて製剤化される場合）、ドープされた（例えば、ホウ素ドープされた）シリコンと、核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）などの活性医薬剤との比率は、１：１～８：１、例えば１：１～６：１、１：１～５：１、１：１～４：１、又は１：１～３：１である。好ましくは、ドープされた（例えば、ホウ素ドープされた）シリコンと、核酸などの活性医薬剤との比率は、１：１～３：１である。有利には、ドープされた（例えば、ホウ素ドープされた）シリコンと、核酸などの医薬品とのこの比率は、粒子によって運ばれる活性医薬剤、例えば核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍＲＮＡ分子）の放出速度に更に影響を与え、かつ安定化する。
好ましくは（例えば、本発明の粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンの１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体の１以上を用いて製剤化される場合）、ドープされた（例えば、ホウ素ドープされた）シリコンと、核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡなど）などの活性医薬剤との比率は、１：１～８：１、例えば１：１～６：１、１：１～５：１、１：１～４：１、又は１：１～３：１である。好ましくは、ドープされた（例えば、ホウ素ドープされた）シリコンと、核酸などの活性医薬剤との比率は、１：１～３：１である。有利には、ドープされた（例えば、ホウ素ドープされた）シリコンと、核酸などの医薬品とのこの比率は、粒子によって運ばれる活性医薬剤、例えば核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍＲＮＡ分子）の放出速度に更に影響を与え、かつ安定化する。
【0095】
これらの比率の全て（及び本明細書全体の他の比率）において、比率は重量比であり、「シリコン」に帰属される比率は、加水分解性ドープシリコン含有粒子の総重量であり、かつ後続の比率を変更し得る滅菌プロセス又は濾過プロセスなどの任意の追加的なの調製工程の前に測定されることに留意されたい。
【0096】
好ましい組合せ
本発明の全ての態様によれば、特に好ましい実施形態は、ホウ素ドーピング（特に、上で定義したような高度ホウ素ドーピング）であるドーピング、及び核酸（特にｍＲＮＡ、及び特にｍＲＮＡワクチンの抗原をコードするｍＲＮＡ）である活性成分に関する。任意選択的に（optionally）、脂質は、ＤＯＴＡＰであるか、又はＤＯＴＡＰを含む。しかしながら、本明細書中下記の実施例、特に実施例６に示されるように、ＤＯＴＡＰは、本製剤に必ずしも必要ではないことが見出された。したがって、実施例によれば、特に好ましい実施形態では、１以上の脂質は、リン脂質（ＤＰＰＣ及び／又はＤＯＰＥなど）並びにｐＨ７．４でカチオン性である１以上のアミノ酸残基を有する脂質付加オリゴペプチド（生理学的ｐＨ；例としては、リジン及びアルギニンが挙げられる）のうち１以上であるか、又は１以上を含む。任意選択的に（optionally）、１以上の糖（特に、トレハロース）及び／又は１以上のアミノ酸（特に、グリシン）もまた存在する。
本発明の全ての態様によれば、特に好ましい実施形態は、ホウ素ドーピング（特に、上で定義したような高度ホウ素ドーピング）であるドーピング、及び核酸（特にｍＲＮＡ、及び特にｍＲＮＡワクチンの抗原をコードするｍＲＮＡ）である活性成分に関する。任意選択的に（optionally）、脂質は、ＤＯＴＡＰであるか、又はＤＯＴＡＰを含む。しかしながら、本明細書中下記の実施例、特に実施例６に示されるように、ＤＯＴＡＰは、本製剤に必ずしも必要ではないことが見出された。したがって、実施例によれば、特に好ましい実施形態では、１以上の脂質は、リン脂質（ＤＰＰＣ及び／又はＤＯＰＥなど）並びにｐＨ７．４でカチオン性である１以上のアミノ酸残基を有する脂質付加オリゴペプチド（生理学的ｐＨ；例としては、リジン及びアルギニンが挙げられる）のうち１以上であるか、又は１以上を含む。任意選択的に（optionally）、１以上の糖（特に、トレハロース）及び／又は１以上のアミノ酸（特に、グリシン）もまた存在する。
【0097】
あるいは、他の好ましい実施形態では、１つ以上の脂質は、１以上のリン脂質（ＤＰＰＣ及び／又はＤＯＰＥなど）であるか、又は１以上のリン脂質を含み、かつ１以上の補酵素（例えば、ＮＡＤ）；１以上のフラバノール（例えば、ケルセチン）、及び／又は１以上のアミノ酸（例えば、チロシン）と製剤化される。任意選択的に（optionally）、１以上の糖（特に、トレハロース）及び／又は１以上のアミノ酸（特に、グリシン）もまた存在する。
【0098】
医薬組成物の有効性の増強
いくつかの態様では、本発明は、加水分解性ドープ（例えば、ホウ素ドープ）シリコンを含む粒子が、原薬を含む医薬組成物の有効性を増強するのに有効であり得るという認識に関する。
いくつかの態様では、本発明は、加水分解性ドープ（例えば、ホウ素ドープ）シリコンを含む粒子が、原薬を含む医薬組成物の有効性を増強するのに有効であり得るという認識に関する。
【0099】
したがって、本発明は、第７の態様において、原薬を含む医薬組成物の有効性を増強するための、加水分解性ドープシリコン、任意選択的に（optionally）加水分解性ホウ素ドープシリコンを含む粒子の使用と、同様に、加水分解性ドープシリコンを含む粒子を医薬組成物に組み込むことによって、原薬を含む医薬組成物の有効性を増強する方法と、を提供する。医薬組成物の有効性有効性は、加水分解性ドープシリコンを含む粒子が組織又は細胞標的化能を増強するので、粒子によって原薬の室温（又は４℃）での安定性を高めることによって増強され得、及び／又は粒子によって標的細胞若しくは組織による原薬の取り込みを増強することによって、増強され得る。医薬組成物の有効性はまた、又は代替的に、粒子によって原薬の細胞内安定性を高めることによって、及び／又は粒子によって原薬を分解、例えば酵素的分解から保護することによって、増強されてもよい。医薬組成物は、任意選択的に（optionally）、本発明の全ての態様を参照して本明細書で定義されるとおりである。このようにして、任意選択的に（optionally）、妥当なトランスフェクション能力（例えば、良好な組織標的化能若しくは良好な細胞標的化能）及び／又は良好な貯蔵安定性を依然として維持しながら、加水分解性ドープシリコンを含まないトランスフェクション組成物などの従来のトランスフェクション組成物と比較して、より低量のカチオン性脂質、例えばＤＯＴＭＡ又はＤＯＴＡＰを使用する能力が提供され得る。
【0100】
更なる構成成分及び特徴
本発明の全ての態様の好ましい実施形態によれば、活性医薬剤は、核酸であり、追加的なトランスフェクション試薬を含む１以上の更なる構成成分が追加的に存在し得る。
本発明の全ての態様の好ましい実施形態によれば、活性医薬剤は、核酸であり、追加的なトランスフェクション試薬を含む１以上の更なる構成成分が追加的に存在し得る。
【0101】
その最も広い意味で、「トランスフェクション試薬」とは、ネイキッド核酸又は精製された核酸の真核生物細胞への導入を促進する薬剤である。例えば、いくつかのトランスフェクション試薬は、真核生物細胞へのｍＲＮＡの誘導を促進する薬剤である。
【0102】
本発明の全ての態様の他の実施形態（例えば、本発明のホウ素ドープシリコンナノ粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）によれば、トランスフェクション試薬は、リポフェクション（リポソームトランスフェクション）によれば、トランスフェクション試薬は、リポフェクション（リポソームトランスフェクション）試薬、デンドリマー、塩化カルシウム溶液と合わせたホスフェート（phosphate）イオンを含有するＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨｅＢＳ）、又はジエチルアミノエチル－デキストラン（ＤＥＡＥデキストラン）若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーであり得る。
【0103】
好ましい実施形態（例えば、本発明のホウ素ドープシリコン粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）によれば、トランスフェクション試薬は、リポフェクタミンなどのリポフェクション試薬である。
【0104】
本発明の全ての態様の好ましい実施形態による核酸、例えば本発明の様々な態様で使用するためのＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍＲＮＡなど）は、様々な形態で提供され得る。例えば、いくつかの実施形態（例えば、本発明の粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）では、ＲＮＡなどの核酸は、溶液中で（単独で、又は様々な他の核酸と組み合わせてのいずれかで）、例えば緩衝液中で提供される。いくつかの実施形態（例えば、本発明のホウ素ドープシリコンナノ粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）では、ＲＮＡなどの核酸は、単独で、又は他の単離された核酸と組み合わせてのいずれかで、塩として提供される。いくつかの実施形態（例えば、本発明のホウ素ドープシリコンナノ粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）では、ＲＮＡなどの核酸は、再構成され得る凍結乾燥形態で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡなどの核酸は、凍結乾燥ペレット単独で、又は他の単離された核酸と共に凍結乾燥ペレットで提供され得る。いくつかの実施形態（例えば、本発明の粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）では、ＲＮＡなどの核酸は、例えば、ビーズ、膜などの固体物質に付着して提供される。いくつかの実施形態（例えば、本発明の粒子が、アルギニン、ヒスチジン、及びグリシンのうち１以上、及び／又はＰＣ、水素化ＰＣ、ＳＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－コレステロール、及びそれらの誘導体のうち１以上と製剤化される場合）では、ＲＮＡなどの核酸は、宿主細胞、例えばプラスミドを保有する細胞株の宿主細胞、又は安定に組み込まれた配列を保有する細胞株の宿主細胞に提供される。
【0105】
本発明の医薬組成物は、保存剤、凍結保護剤、及びアジュバントを含むが、これらに限定されない賦形剤を更に含み得る。
【0106】
ｓｉＲＮＡを含有する本発明の医薬組成物には、生物システム外で化学合成により合成的に製造されたｓｉＲＮＡが任意選択的に（optionally）含まれ得る。このようなｓｉＲＮＡは、核酸分解酵素を含まずに製造され得る。
【0107】
しかしながら、（例えば、ワクチン製剤に使用するための）ｍＲＮＡなどのより長い核酸を製造する好ましい方法は、生物システムの使用に関与する。ｍＲＮＡは、典型的には、分解酵素（例えば、リボ核酸ヌクレチダーゼ（ＲＮａｓｅ））の量を低下させるために、その生物システムから精製される。全ての分解酵素を完全に排除することは困難な場合がある。これは、通常、酵素活性を最小限に抑えるために低温での貯蔵を必要とする。更に、体内への移行及び／又はエンドソーム区画からの脱出の間、核酸は、典型的には分解酵素との接触を含む生理学的条件及び細胞内条件へと曝露される。
【0108】
しかしながら、核酸（ｍＲＮＡなど）を、その様々な態様において、本発明による加水分解性ホウ素ドープシリコン及びオーム又はそれを超える（ｏｍｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）脂質（及び、任意選択的に（optionally）非還元性二糖）を含む粒子で製剤化することにより、製剤中のｍＲＮＡの貯蔵寿命を延ばすことができ、これは、低温貯蔵の必要性を無効にするか、軽減するか、若しくは減少させる可能性があること；及び／又は、体内への移行最中及び／又はエンドソーム区画からの脱出最中にｍＲＮＡを安定化することが見出された。
【0109】
したがって、本発明の方法は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）である原薬を、核酸調製物中に存在する酵素に起因する分解から保護する方法を含む。本発明の態様の生成物はまた、核酸が、核酸含有組成物中に存在する酵素に起因する分解から保護されるようなものであり得る。
【0110】
好ましくは、室温（２０℃）での酵素的分解は、加水分解性ドープ（例えば、ホウ素ドープ）シリコン含有材料の粒子を含まない同等の組成物と比較して、少なくとも半分、より好ましくは一倍、又は少なくとも５倍、１０倍、３５倍、５０倍、１００倍、５００倍、若しくは１０００倍低減される。好ましくは、組成物中の核酸（ｍＲＮＡなど）は、４℃にて、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１２ヶ月の半減期を有する。
【0111】
本発明の第１の態様及び他の態様による医薬組成物のある特定の実施形態は、生物源からの活性医薬剤としての核酸（ｍＲＮＡなど）、及びその生物源に由来する低い量だが測定可能な量の分解酵素を含有する。例えば、ｐＨ７．４及び温度２５℃にて、核酸基質上で少なくとも１μｍｏｌ分－１の活性を有する１以上の酵素を含む、１以上の分解酵素が存在し得る。
【0112】
提案された作用機構
理論に束縛されることを望むものではないが、「シリカ化（ｅｎｓｉｌｉｃａｔｉｏｎ）」のプロセスは、ホウ素ドープシリコンがｍＲＮＡの貯蔵寿命を延長させることができる理由の説明の一部であり得ることが提案される。
理論に束縛されることを望むものではないが、「シリカ化（ｅｎｓｉｌｉｃａｔｉｏｎ）」のプロセスは、ホウ素ドープシリコンがｍＲＮＡの貯蔵寿命を延長させることができる理由の説明の一部であり得ることが提案される。
【0113】
シリカ化とは、ｍＲＮＡの周りに保護的かつ耐性のシリカ「ケージ」を形成することからなり、このシリカケージは、ドープシリコン粒子の部分加水分解の生成物である。シリカ化は、凍結又は冷蔵を必要とせずに、温度によって引き起こされる構造及び機能の損失に対する保護を付与し得る。シリカ化プロセスでは、負帯電したシラノール基は、薬学的に活性な薬剤との、又は組成物中の脂質とのいずれかとの直接的な非共有結合相互作用に関与することができる。
【0114】
得られた組合せは、核酸又は他の薬剤の熱変性を物理的に防止することができる。
【0115】
シリカ化プロセスの更なる特定の改善を得るために、シリカ材料のいくつかの特性は、保護される化合物に合わせて調整され得る。特に、ホウ素ドープシリコンの使用は、核酸と静電相互作用を形成することができる永久カチオン性部位の作製を可能にし、したがって核酸を分解から保護することを可能にする。
【0116】
ホウ素とシリコンクラスタとの相互作用は、シリカケージ形成を担う。３つのホウ素原子は、シリコン原子の数が増加するにつれて、Ｓｉｎケージにカプセル化されたＢ３三角形を形成する傾向がある。
【0117】
シリコンマトリックス内にホウ素をドーピングすると、結晶構造内に正電荷が生じ、シリコン自体の結晶構造内の核酸の結合が可能になる。これは、脂質の分解又は「エイジング」によって引き起こされる現在の問題を軽減し、したがって、核酸複合体化デリバリーシステムの寿命を延ばす。
【0118】
ドープされた加水分解性シリコンを含む粒子の調製
【0119】
本発明の粒子は、当技術分野で従来の技術によって、例えば製粉プロセスによって、又は粒径を小さくするための他の既知の技術によって、都合よく調製され得る。ドープシリコン含有粒子は、ケイ酸ナトリウム粒子、シリカのマグネシウム還元、コロイダルシリカ、又はシリコンウェハ材料から作製され得る。マクロスケール又はマイクロスケールの粒子は、ボールミル、遊星ボールミル、又は他のサイズ削減機序で粉砕され得る。得られた粒子をふるい分け又は空気分級して粒子を回収してもよい。粒子の生成のためにプラズマ法及びレーザアブレーションを使用することもまた可能である。
【0120】
多孔質粒子は、本明細書に記載の方法を含む、当技術分野にて従来の方法によって調製され得る。
【0121】
本発明に従って使用するためのホウ素ドープシリコンの例示的な仕様は、以下のとおりである：
片面研磨ウェハ、ＣＺ
直径：１５０±０．２ｍｍ
配向：（１００）±１°
種類：ｐ／ホウ素
抵抗率：０．０１４±２５％Ｏｈｍ ｃｍ。５×１０１８原子／ｃｍ３に近い。
一次フラット：５７．５０±２．５ｍｍ
一次フラット１位置：Ｄ＜１００＞～｛１１０｝
厚さ：６７５±１５μｍ
梱包：Ｕｌｔｒａｐａｋ Ｓｈｉｐｐｉｎｇ Ｃａｓｅｔｔｅ
ＴＴＶ：≦１８μｍ
ＴＩＲ：≦５μｍ
片面研磨ウェハ、ＣＺ
直径：１５０±０．２ｍｍ
配向：（１００）±１°
種類：ｐ／ホウ素
抵抗率：０．０１４±２５％Ｏｈｍ ｃｍ。５×１０１８原子／ｃｍ３に近い。
一次フラット：５７．５０±２．５ｍｍ
一次フラット１位置：Ｄ＜１００＞～｛１１０｝
厚さ：６７５±１５μｍ
梱包：Ｕｌｔｒａｐａｋ Ｓｈｉｐｐｉｎｇ Ｃａｓｅｔｔｅ
ＴＴＶ：≦１８μｍ
ＴＩＲ：≦５μｍ
【0122】
このようなホウ素ドープシリコンは、例えば、Ｎａｎｏｇｒａｆｉ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ ｏｒ Ｓｉ－Ｍａｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている。
【0123】
以下の非限定的な例を参照して、本発明の様々な態様及び実施形態を説明する。実施例が非ドープシリコンを使用する場合、それらは本発明のいくつかの態様の範囲外であり得るが、比較例として含まれる。
【実施例】
【0124】
＜実施例１：ホウ素ドープシリコン粒子の調製＞
片面研磨ホウ素ドープシリコンウェハは、Ｓｉ－Ｍａｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。全ての浄化試薬及びエッチング試薬は、クリーンルームグレードであった。エッチングされたシリコンウェハは、純エタノールと１０％ＨＦ酸水溶液との１：１（ｖ／ｖ）混合物中において、Ｓｉを、２～１０分間にわたり８０ｍＡ／ｃｍ２のアノード電流密度でアノードエッチングすることによって調製した。エッチング後、試料を、純エタノールですすぎ、使用前に乾燥高純度窒素の流れの下で乾燥させた。エッチングはまた、最大１：３溶媒～５０％ＨＦの混合物中で行われ得る。典型的な溶媒はエタノール及びイソプロピルアルコールであるが、ＤＭＳＯ又はシクロペンタノンのような他のアプリオティック（ａｐｒｉｏｔｉｃ）溶媒もまた、所望の粒子形態を達成するために使用され得る。
片面研磨ホウ素ドープシリコンウェハは、Ｓｉ－Ｍａｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。全ての浄化試薬及びエッチング試薬は、クリーンルームグレードであった。エッチングされたシリコンウェハは、純エタノールと１０％ＨＦ酸水溶液との１：１（ｖ／ｖ）混合物中において、Ｓｉを、２～１０分間にわたり８０ｍＡ／ｃｍ２のアノード電流密度でアノードエッチングすることによって調製した。エッチング後、試料を、純エタノールですすぎ、使用前に乾燥高純度窒素の流れの下で乾燥させた。エッチングはまた、最大１：３溶媒～５０％ＨＦの混合物中で行われ得る。典型的な溶媒はエタノール及びイソプロピルアルコールであるが、ＤＭＳＯ又はシクロペンタノンのような他のアプリオティック（ａｐｒｉｏｔｉｃ）溶媒もまた、所望の粒子形態を達成するために使用され得る。
【0125】
エッチングされたシリコンウェハを、製粉ボール、及び／又は、乳棒及び乳鉢を用いて破砕した。微粉末を、３８μｍゲージであるＲｅｔｓｃｈ（商標）ふるいシェーカＡＳ ２００を用いてふるい分けした。ふるいの開口サイズによって、均一な粒径選択（２０～１００μｍ）が達成された。粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅシステム及びＰＣＳによって測定した。更なる使用まで、試料を密閉容器内に保った。
【0126】
ナノシリコン粉末はまた、Ｓｉｇｍａ及びＨｅｆｅｉ Ｋａｉｅｒ，Ｃｈｉｎａからも得た。ロード及びエッチングに供する前に、粒径をＰＣＳによって測定し、粒子のサイズを記録した（２０～１００ｎｍの範囲にわたったサイズ）。
【0127】
直径１００ｎｍの多孔質シリコンナノ粒子５００ｍｇを、エタノール２５０ｍＬと混合し、マグネットバーを用いて３０分間にわたりかき混ぜた。次いで、溶液を３０００ｒｐｍで３０分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ナノ粒子を５ｍＬの蒸留水で洗浄し、丸底フラスコへと移した。フラスコの内容物を凍結させた（－２５℃で２時間）。凍結したナノ粒子を、凍結乾燥機を用いて一晩凍結乾燥した。得られた乾燥粉末は、シリコンナノ粒子を活性化する。
【0128】
＜実施例２：ホウ素ドープシリコン粒子の調製＞
ホウ素ドープシリコンのウェハは、以下の仕様で調製されたＢＳシリコンから得られた：
片面研磨ウェハ、ＣＺ
直径：１５０±０．２ｍｍ
配向：（１００）±１°
種類：ｐ／ホウ素
抵抗率：０．０１４±２５％Ｏｈｍｃｍ。５×１０１８ホウ素原子／ｃｍ３に近い。
一次フラット：５７．５０±２．５ｍｍ
一次フラット１位置：Ｄ＜１００＞～｛１１０｝
厚さ：６７５±１５μｍ
梱包：Ｕｌｔｒａｐａｋ Ｓｈｉｐｐｉｎｇ Ｃａｓｅｔｔｅ
ＴＴＶ：≦１８μｍ
ＴＩＲ：≦５μｍ
ホウ素ドープシリコンのウェハは、以下の仕様で調製されたＢＳシリコンから得られた：
片面研磨ウェハ、ＣＺ
直径：１５０±０．２ｍｍ
配向：（１００）±１°
種類：ｐ／ホウ素
抵抗率：０．０１４±２５％Ｏｈｍｃｍ。５×１０１８ホウ素原子／ｃｍ３に近い。
一次フラット：５７．５０±２．５ｍｍ
一次フラット１位置：Ｄ＜１００＞～｛１１０｝
厚さ：６７５±１５μｍ
梱包：Ｕｌｔｒａｐａｋ Ｓｈｉｐｐｉｎｇ Ｃａｓｅｔｔｅ
ＴＴＶ：≦１８μｍ
ＴＩＲ：≦５μｍ
【0129】
アンドープシリコンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）から入手した。
【0130】
シリコンウェハを（実施例１のように）電気的にエッチングして、少なくとも４０％の多孔度を達成し、次いで、製粉ボール、及び／又は、乳棒及び乳鉢を用いて破砕した。微粉末を、３８μｍゲージであるＲｅｔｓｃｈ（商標）ふるいシェーカＡＳ ２００を用いてふるい分けした。２０μｍ～１００μｍの大きさが均一な粒子）をふるいによって選択した。
【0131】
次いで、粉末を、メタノール（５ｍＬ中５０ｍｇ）で処理することによって活性化し、ドラフトの下に残し、次いでゆっくりと蒸発プロセスをさせた。得られた粉末を、非還元性二糖（トレハロース）及びアミノ酸（グリシン）の存在下において、１ｍｇ／ｍＬの濃度でヌクレアーゼフリー水中に分散させた。
【0132】
ＤＯＴＡＰ溶液：ＤＯＴＡＰを、５ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに可溶化した。特に、５０ｍｇのＤＯＴＡＰを、１０ｍＬのメタノールに可溶化し、完全に可溶化するまで超音波処理した。
【0133】
ＤＯＰＥ溶液：ＤＯＰＥを、５ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに可溶化した。特に、６０ｍｇのＤＯＰＥを、１２ｍＬのメタノールに可溶化し、完全に可溶化するまで超音波処理した。
【0134】
ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ溶液：ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを、メタノールに５ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶化した。特に、４０ｍｇのｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを、８ｍＬのメタノールに可溶化し、完全に可溶化するまで超音波処理した。
【0135】
トレハロースはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって提供されるように使用した。
【0136】
グリシンはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって提供されるように使用した。
【0137】
活性化シリコン粒子を、ヌクレアーゼフリー水中でグリシン及びトレハロースと共に懸濁した。特に、５０ｍｇの活性化シリコン粒子、５０ｍｇのトレハロース、及び２５ｍｇのグリシンを、５０ｍＬのヌクレアーゼフリー水中に懸濁し、６０分間超音波処理した。
【0138】
次いで、ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒに特異的なｓｉＲＮＡ（詳細については、Ｃａｐｕｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐ．４，ｅ２４８を参照されたい）を、トランスフェクションビヒクルにロードした。
【0139】
インビボ研究－遺伝子療法のための製剤において実施例２で調製した、ホウ素ドープ及びアンドープシリコン粒子を用いたヘッド・トゥー・ヘッド（ｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ）トランスフェクション比較。
【0140】
ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒに特異的なｓｉＲＮＡを、細胞に首尾よくトランスフェクトした場合、そのｓｉＲＮＡで処置することができるＡＤＯ２突然変異マウスを用いて、２型大理石骨病をモデル化する。したがって、このモデルを使用して、トランスフェクション有効性を評価することができる。
【0141】
本発明によるホウ素ドープ粒子又は対照の非ドープ粒子、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ、グリシン、トレハロース、及びヌクレアーゼフリー水を用いて、トランスフェクションビヒクルを調製した。ビヒクルを、空で投与するか、又はＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒに特異的なｓｉＲＮＡ共にか、のいずれかで投与した。
【0142】
試料を以下のようにコードした：
ＡＤＯ２＋ＳＩＳ００１２－空－アンドープＳｉ含有ビヒクル
ＡＤＯ２＋ＳＩＳ００１２－ｓｉＲＮＡ－ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒに特異的なｓｉＲＮＡを有する、アンドープＳｉ含有ビヒクル
ＡＤＯ２＋ＳＩＳ００１３－空－ホウ素ドープＳｉ含有ビヒクル
ＡＤＯ２＋ＳＩＳ００１３－ｓｉＲＮＡ－ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒに特異的なｓｉＲＮＡを有する、ホウ素ドープＳｉ含有ビヒクル
ＡＤＯ２＋ＳＩＳ００１２－空－アンドープＳｉ含有ビヒクル
ＡＤＯ２＋ＳＩＳ００１２－ｓｉＲＮＡ－ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒに特異的なｓｉＲＮＡを有する、アンドープＳｉ含有ビヒクル
ＡＤＯ２＋ＳＩＳ００１３－空－ホウ素ドープＳｉ含有ビヒクル
ＡＤＯ２＋ＳＩＳ００１３－ｓｉＲＮＡ－ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒに特異的なｓｉＲＮＡを有する、ホウ素ドープＳｉ含有ビヒクル
【0143】
１０日齢のＡＤＯ２マウスに、これら３つの構築物のうち１つを、２週間にわたって週に３回、腹腔内注射した（１群当たりｎ＝５匹のマウス）。
【0144】
結果
マウスＰＭＢＣにおけるＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒ発現を、各処置群についてアッセイし、結果を図３に提示する。図４は、ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒの骨発現を示し、図５は、ＣＴＸ－血液試験結果を示す（ＣＴＸは、骨代謝回転のマーカである）。
マウスＰＭＢＣにおけるＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒ発現を、各処置群についてアッセイし、結果を図３に提示する。図４は、ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒの骨発現を示し、図５は、ＣＴＸ－血液試験結果を示す（ＣＴＸは、骨代謝回転のマーカである）。
【0145】
ＡＤＯ２ＳＩＳ００１２－ｓｉＲＮＡ複合体は、標的器官（大腿骨、ｐ＜０．０５）においてその関連する対照群（ＡＤＯ２ＳＩＳ００１２空、ＳｉＲＮＡ投与なし）と比較した場合、関連遺伝子（ＣｌＣｎ７Ｇ２１３Ｒ）の発現を有意に下方制御することができた。くわえて、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ、ＡＤＯ２ＳＩＳ００１２－ｓｉＲＮＡ複合体をＡＤＯ２ＳＩＳ００１２空、ＳｉＲＮＡなしと比較した場合、ｐ＜０．００５）における同じ遺伝子の有意な下方制御が観察された。分析された期間及び提案された投与レジメン（２週間の処置のみ）では、骨吸収もまたわずかに上昇し、より長い期間にわたってその変化はより実質的であるものと予想される。
【0146】
標的器官ＡＤＯ２ＳＩＳ００１３でのＡＤＯ２ＳＩＳ００１２－ｓｉＲＮＡ複合体（アンドープ多孔質シリコン粒子で作製）の性能を、ＡＤＯ２ＳＩＳ００１３－ｓｉＲＮＡ複合体（ホウ素ドープシリコン粒子で作製された）と比較した場合、両方の組成物はかなりの効果を提供した（図４、ｐ＜０．０２）。ホウ素ドープシリコンの使用は、非ドープ多孔質シリコン（図５、ＣＴＸ評価）の性能と比較した場合、より速い骨代謝回転をもたらした。したがって、ホウ素によりドープされたシリコンを用いることによって提供される優れた貯蔵特性は、ｓｉＲＮＡ製剤のトランスフェクション有効性又は治療効果を損なうものではないと言えよう。
【0147】
＜実施例３：生物学的ｐＤＮＡ含有製剤の調製＞
製剤１型（「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ」製剤と称する）を、表２の成分に従ってシリコン（多孔質、活性化、平均粒径＜１００ｎｍ、実施例２のようにドープ及びアンドープ）を用いて調製した。
製剤１型（「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ」製剤と称する）を、表２の成分に従ってシリコン（多孔質、活性化、平均粒径＜１００ｎｍ、実施例２のようにドープ及びアンドープ）を用いて調製した。
【0148】
表２：Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ１型の組成
【表1】
【0149】
脂質フィルム調製
上記の表２に列挙した脂質を、清浄なガラス丸底フラスコに移し、溶媒中で混合し、これを４０℃及び真空下における水浴中でロータリエバポレータを用いて蒸発させた。
上記の表２に列挙した脂質を、清浄なガラス丸底フラスコに移し、溶媒中で混合し、これを４０℃及び真空下における水浴中でロータリエバポレータを用いて蒸発させた。
【0150】
脂質フィルムの再水和
溶液中のシリコン粒子、グリシン、及びトレハロースを、脂質フィルムに添加し、必要に応じて、ヌクレアーゼフリー水を用いて最終体積を１０ｍＬに調整した。フラスコをパラフィルムで覆い、水浴（６０℃）中で５分間にわたり撹拌した。１ｍＬのアリコートを、冷蔵庫内のＲＮＡ非含有エッペンチューブに貯蔵した。使用前に、懸濁液は、０．４μｍ及び０．１μｍの孔径の膜フィルタを、６０℃で、０．４μｍを１０回通過させ、次いで０．１μｍを１０回通過させた。
溶液中のシリコン粒子、グリシン、及びトレハロースを、脂質フィルムに添加し、必要に応じて、ヌクレアーゼフリー水を用いて最終体積を１０ｍＬに調整した。フラスコをパラフィルムで覆い、水浴（６０℃）中で５分間にわたり撹拌した。１ｍＬのアリコートを、冷蔵庫内のＲＮＡ非含有エッペンチューブに貯蔵した。使用前に、懸濁液は、０．４μｍ及び０．１μｍの孔径の膜フィルタを、６０℃で、０．４μｍを１０回通過させ、次いで０．１μｍを１０回通過させた。
【0151】
ｐＤＮＡをビヒクルにロードする
６７６８ｂｐサイズの凍結ｐＤＮＡ試料を－４０℃から室温まで解凍した。
６７６８ｂｐサイズの凍結ｐＤＮＡ試料を－４０℃から室温まで解凍した。
【0152】
ビヒクル及びｐＤＮＡを滅菌エッペンチューブ中に一緒に入れ、１５秒間にわたり穏やかにボルテックスし、次いで室温で３０分間にわたり放置し、次いで使用するまで冷蔵庫に貯蔵した。
【0153】
＜実施例４：ｐＤＮＡを用いた貯蔵安定性研究＞
目的
ドープシリコン及びアンドープシリコンの両方を用いて、アガロースゲル電気泳動によって、実施例２に記載されるように生成された異なる製剤の貯蔵安定性を評価すること。
目的
ドープシリコン及びアンドープシリコンの両方を用いて、アガロースゲル電気泳動によって、実施例２に記載されるように生成された異なる製剤の貯蔵安定性を評価すること。
【0154】
使用した製剤
「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１２」－ｐＤＮＡがロードされるアンドープシリコン粒子を含有する形成
「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１２」－ｐＤＮＡがロードされるアンドープシリコン粒子を含有する形成
【0155】
「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１３」－ｐＤＮＡがロードされるホウ素ドープシリコン粒子を含有する形成
【0156】
「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＭＶ１００１０」－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１２と同じであるが、しかし委託製造業者によって作製された異なるバッチからのもの。
【0157】
方法
Ａ．ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体の調製
ｐＤＮＡ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、７．２の脂質／ＤＮＡ比を有するＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒと混合することによって、ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤を調製した。混合物中のＤＮＡの最終濃度は０．２７５ｍｇ／ｍＬであった。混合物を、室温で３０分間にわたりインキュベートして完全な複合体化を可能にし、次いで、室温又は４℃のいずれかで貯蔵した。試料を、各測定時点について２０μＬアリコートで調製し、貯蔵及び分析の際の相互汚染のリスクを最小限に抑えるために別々に貯蔵した。
Ａ．ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体の調製
ｐＤＮＡ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を、７．２の脂質／ＤＮＡ比を有するＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒと混合することによって、ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤を調製した。混合物中のＤＮＡの最終濃度は０．２７５ｍｇ／ｍＬであった。混合物を、室温で３０分間にわたりインキュベートして完全な複合体化を可能にし、次いで、室温又は４℃のいずれかで貯蔵した。試料を、各測定時点について２０μＬアリコートで調製し、貯蔵及び分析の際の相互汚染のリスクを最小限に抑えるために別々に貯蔵した。
【0158】
Ｂ．アガロースゲル電気泳動
ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体を、指定された時点（０時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び８日間）で、アガロースゲル電気泳動によって分析した。同様の条件で貯蔵したネイキッドｐＤＮＡを全ての場合において対照として使用した。試料を、Ｅ－Ｇｅｌ（商標）Ｐｏｗｅｒ Ｓｎａｐ電気泳動デバイス内のＥ－Ｇｅｌ（商標）アガロースゲル（１％）にロードした。各試料の量、及び異なる時点でゲル上にロードされたｐＤＮＡの総含有量を、以下の表に提示する。各時点でゲル上にロードされたネイキッドｐＤＮＡの総量もまた、ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体と同じであった。ゲルを、透過照射（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ）し、Ｅ－Ｇｅｌ（商標）Ｐｏｗｅｒ Ｓｎａｐ電気泳動カメラを用いて３分及び７分で画像化した。
ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体を、指定された時点（０時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び８日間）で、アガロースゲル電気泳動によって分析した。同様の条件で貯蔵したネイキッドｐＤＮＡを全ての場合において対照として使用した。試料を、Ｅ－Ｇｅｌ（商標）Ｐｏｗｅｒ Ｓｎａｐ電気泳動デバイス内のＥ－Ｇｅｌ（商標）アガロースゲル（１％）にロードした。各試料の量、及び異なる時点でゲル上にロードされたｐＤＮＡの総含有量を、以下の表に提示する。各時点でゲル上にロードされたネイキッドｐＤＮＡの総量もまた、ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体と同じであった。ゲルを、透過照射（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ）し、Ｅ－Ｇｅｌ（商標）Ｐｏｗｅｒ Ｓｎａｐ電気泳動カメラを用いて３分及び７分で画像化した。
【0159】
異なる測定時点における、アガロースゲルにロードされたｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体の量、及びウェル当たりのｐＤＮＡの総量を示す表。
【表2】
【0160】
結果
試験１．室温でのｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体の安定性。
調製直後及び室温で８日間にわたり貯蔵した後のｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤のアガロースゲル電気泳動画像を、図６～図８に提示する。それらの液体形態である全３つのＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤は、ゲルウェル内にｐＤＮＡを完全に保持し、完全な複合体化を示した。しかしながら、凍結乾燥形態では、少量のｐＤＮＡがゲルを通過し、いくらかの非結合ＤＮＡの存在を示した。ＭＶＩ００１０と比較して、ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３のバンドの強度が高いことは、非結合ＤＮＡの量が多いことを示す。それにもかかわらず、Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤のバンドの強度を、Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒにロードされたものと同じ総量のＤＮＡを含有するネイキッドｐＤＮＡからのバンドと比較すると、Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ上にロードされた全ＤＮＡのごくわずかな割合が非結合であることが示され、これは、高い結合有効性を実証する。室温で６時間貯蔵した後、凍結乾燥製剤からゲル中へと放出された非結合ｐＤＮＡの量は、少なく、室温でのｐＤＮＡの分解に起因する可能性があった。凍結乾燥製剤を含むゲルを通じた非結合ｐＤＮＡの移動を２４時間まで続けた。しかしながら、４８時間以降、ｐＤＮＡについて有意なシグナルは観察されず、これは、ゲルを通るＤＮＡ移動の欠如を示した。これらのデータから、凍結乾燥製剤は、ロードされたｐＤＮＡと完全には複合体化しないが、Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒにロードされた多量のＤＮＡと比較して、ゲルを通過する無視可能な量のＤＮＡによって実証されるように、それらの結合有効性は依然として非常に高かったものと推測され得る。また、ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体は、解離を示していたであろう時間中にはｐＤＮＡがゲル中へともはや放出されなかったので、室温で８日間にわたり安定であった。
試験１．室温でのｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体の安定性。
調製直後及び室温で８日間にわたり貯蔵した後のｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤のアガロースゲル電気泳動画像を、図６～図８に提示する。それらの液体形態である全３つのＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤は、ゲルウェル内にｐＤＮＡを完全に保持し、完全な複合体化を示した。しかしながら、凍結乾燥形態では、少量のｐＤＮＡがゲルを通過し、いくらかの非結合ＤＮＡの存在を示した。ＭＶＩ００１０と比較して、ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３のバンドの強度が高いことは、非結合ＤＮＡの量が多いことを示す。それにもかかわらず、Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤のバンドの強度を、Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒにロードされたものと同じ総量のＤＮＡを含有するネイキッドｐＤＮＡからのバンドと比較すると、Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ上にロードされた全ＤＮＡのごくわずかな割合が非結合であることが示され、これは、高い結合有効性を実証する。室温で６時間貯蔵した後、凍結乾燥製剤からゲル中へと放出された非結合ｐＤＮＡの量は、少なく、室温でのｐＤＮＡの分解に起因する可能性があった。凍結乾燥製剤を含むゲルを通じた非結合ｐＤＮＡの移動を２４時間まで続けた。しかしながら、４８時間以降、ｐＤＮＡについて有意なシグナルは観察されず、これは、ゲルを通るＤＮＡ移動の欠如を示した。これらのデータから、凍結乾燥製剤は、ロードされたｐＤＮＡと完全には複合体化しないが、Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒにロードされた多量のＤＮＡと比較して、ゲルを通過する無視可能な量のＤＮＡによって実証されるように、それらの結合有効性は依然として非常に高かったものと推測され得る。また、ｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体は、解離を示していたであろう時間中にはｐＤＮＡがゲル中へともはや放出されなかったので、室温で８日間にわたり安定であった。
【0161】
試験２．４℃でのｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体の安定性。
調製直後及び４℃で８日間にわたり貯蔵した後のｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤のアガロースゲル電気泳動画像を、図９～図１１に提示する。観察されたように、４℃での貯蔵の６時間後、少量のｐＤＮＡのみが、ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３の凍結乾燥形態を有するゲルを通過した。しかしながら、ゲルを通過する非結合ｐＤＮＡの量は、ＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒにロードされたｐＤＮＡの総量と比較して低く、高い結合有効性を示した。製剤の液体形態、及びＭＶＩ００１０の凍結乾燥形態はまた、ゲル中へとｐＤＮＡを一切放出せず、ロードされたｐＤＮＡの完全な複合体化を示した。ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３の凍結乾燥形態のゲルを通過するｐＤＮＡの量は、２４時間後に減少し、これは、ｐＤＮＡのある程度の微量の分解を示した。４８時間以降、凍結乾燥したＳＩＳ００１２ではｐＤＮＡは一切観察されなかったが、一方で凍結乾燥したＳＩＳ００１３では、ゲルを通過するいくらかの微量のｐＤＮＡが依然として存在し、これは８日間まで続いた。これは、実験の開始時から存在していたのと同じ非結合ｐＤＮＡであってもよいか、又は複合体から解離した新規ｐＤＮＡであってもよいかのいずれかである。しかしながら、ＤＮＡの量が非常に少ないことに起因して、ｐＤＮＡの大部分が複合体と会合したままであることに留意する以外に、その供給源について確実にコメントすることは困難である。全ての製剤の液体形態は、この貯蔵条件において完全な結合及び安定性を示す、８日間までウェルに全てのロードされたｐＤＮＡを保持することができた。
調製直後及び４℃で８日間にわたり貯蔵した後のｐＤＮＡ－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤のアガロースゲル電気泳動画像を、図９～図１１に提示する。観察されたように、４℃での貯蔵の６時間後、少量のｐＤＮＡのみが、ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３の凍結乾燥形態を有するゲルを通過した。しかしながら、ゲルを通過する非結合ｐＤＮＡの量は、ＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒにロードされたｐＤＮＡの総量と比較して低く、高い結合有効性を示した。製剤の液体形態、及びＭＶＩ００１０の凍結乾燥形態はまた、ゲル中へとｐＤＮＡを一切放出せず、ロードされたｐＤＮＡの完全な複合体化を示した。ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３の凍結乾燥形態のゲルを通過するｐＤＮＡの量は、２４時間後に減少し、これは、ｐＤＮＡのある程度の微量の分解を示した。４８時間以降、凍結乾燥したＳＩＳ００１２ではｐＤＮＡは一切観察されなかったが、一方で凍結乾燥したＳＩＳ００１３では、ゲルを通過するいくらかの微量のｐＤＮＡが依然として存在し、これは８日間まで続いた。これは、実験の開始時から存在していたのと同じ非結合ｐＤＮＡであってもよいか、又は複合体から解離した新規ｐＤＮＡであってもよいかのいずれかである。しかしながら、ＤＮＡの量が非常に少ないことに起因して、ｐＤＮＡの大部分が複合体と会合したままであることに留意する以外に、その供給源について確実にコメントすることは困難である。全ての製剤の液体形態は、この貯蔵条件において完全な結合及び安定性を示す、８日間までウェルに全てのロードされたｐＤＮＡを保持することができた。
【0162】
結論
全てのＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤の液体形態は、ｐＤＮＡと完全に複合体を形成し、室温及び４℃の両方で最大８日間にわたり安定であった。しかしながら、凍結乾燥製剤は、高い結合有効性を有するにもかかわらず、これらの試料では、全てのロードされたｐＤＮＡ及び少量の過剰／非結合ｐＤＮＡと完全に複合体化することができなかったことが見出された。液体対応物と比較して凍結乾燥製剤の結合有効性は低いにもかかわらず、それらは、室温及び４℃の両方で最大８日間にわたり安定であった。
全てのＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤の液体形態は、ｐＤＮＡと完全に複合体を形成し、室温及び４℃の両方で最大８日間にわたり安定であった。しかしながら、凍結乾燥製剤は、高い結合有効性を有するにもかかわらず、これらの試料では、全てのロードされたｐＤＮＡ及び少量の過剰／非結合ｐＤＮＡと完全に複合体化することができなかったことが見出された。液体対応物と比較して凍結乾燥製剤の結合有効性は低いにもかかわらず、それらは、室温及び４℃の両方で最大８日間にわたり安定であった。
【0163】
＜実施例４：ＤＮＡ又はＲＮＡを用いた貯蔵安定性研究＞
目的
アガロースゲル電気泳動を用いて評価するための、異なる温度で貯蔵したＤＮＡ又はｓｉＲＮＡをロードしたＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤の安定性。
目的
アガロースゲル電気泳動を用いて評価するための、異なる温度で貯蔵したＤＮＡ又はｓｉＲＮＡをロードしたＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤の安定性。
【0164】
使用した製剤
以下の製剤（上に詳述したように調製）に、上記のようにＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡをロードした。
「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１２」－アンドープシリコン粒子を含有する形成
「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１３」－ホウ素ドープシリコン粒子を含有する形成
以下の製剤（上に詳述したように調製）に、上記のようにＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡをロードした。
「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１２」－アンドープシリコン粒子を含有する形成
「Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１３」－ホウ素ドープシリコン粒子を含有する形成
【0165】
方法
Ａ．核酸－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体の調製
以下の表に従って、ｍＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ粉末をヌクレアーゼフリー水中に溶解することによって、核酸原液を調製した：
Ａ．核酸－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体の調製
以下の表に従って、ｍＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ粉末をヌクレアーゼフリー水中に溶解することによって、核酸原液を調製した：
【0166】
【表3】
【0167】
次いで、原液を、ヌクレアーゼフリー水を用いて希釈して、以下の表に従って必要な濃度まで到達させた：
【0168】
【表4】
【0169】
Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ原液をまた、ヌクレアーゼフリー水で希釈して、複合体化アッセイに必要な濃度を得た。以下の表に列挙した核酸作業溶液及びＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ作業溶液の必要量を混合することによって、核酸－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体を作製し、次いで、室温で４０分間にわたりインキュベートして、完全な複合体化を確実にした：
【表5】
【0170】
次いで、調製した核酸－Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ複合体を、ゲル電気泳動による分析へ供した。
【0171】
Ｂ．アガロースゲル電気泳動
これらの実験に使用されるゲル電気泳動システムは、ゲル電気泳動デバイス、プレキャスト・アガロース・ゲル（ゲル内に埋め込まれた電気泳動緩衝液及び電極を有する）、及びカメラからなる。試料、対照（ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ）、及びＤＮＡラダーを、必要量の添加液と混合して、上の表に従って総体積を２０μＬにしてからゲルにロードした。続いて、ゲル（１％）をデバイスチャンバへと挿入し、試料、対照、及びＤＮＡラダーをロードし、７～８分間にわたり実行した。ゲルを透過照射し、カメラを用いて３分及び７分で画像化した（カメラは、カメラ及びデバイスで利用可能なドッキングポートを通してデバイスにマウントした）。ＤＮＡ－ＳＩＳ００１２、ｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１２、及びｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１３を、異なる貯蔵条件（室温（２０℃）、４℃、及び－２０℃）において貯蔵した後、指定された時点（上記の表に示す）で同じ手順を繰り返した。
これらの実験に使用されるゲル電気泳動システムは、ゲル電気泳動デバイス、プレキャスト・アガロース・ゲル（ゲル内に埋め込まれた電気泳動緩衝液及び電極を有する）、及びカメラからなる。試料、対照（ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ）、及びＤＮＡラダーを、必要量の添加液と混合して、上の表に従って総体積を２０μＬにしてからゲルにロードした。続いて、ゲル（１％）をデバイスチャンバへと挿入し、試料、対照、及びＤＮＡラダーをロードし、７～８分間にわたり実行した。ゲルを透過照射し、カメラを用いて３分及び７分で画像化した（カメラは、カメラ及びデバイスで利用可能なドッキングポートを通してデバイスにマウントした）。ＤＮＡ－ＳＩＳ００１２、ｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１２、及びｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１３を、異なる貯蔵条件（室温（２０℃）、４℃、及び－２０℃）において貯蔵した後、指定された時点（上記の表に示す）で同じ手順を繰り返した。
【0172】
結果
図１２は、異なる濃度のＲＮＡ、異なる濃度のＳＩＳ００１２製剤、及び異なる体積比で、ＳＩＳ００１２上へロードしたパン酵母からのＲＮＡのゲル遅延度アッセイからの結果を示す。製造業者によってこの種類のゲルに推奨された１００ｎｇ／ウェルのＲＮＡはＲＮＡの非常に弱い発光をもたらしたが、一方でＲＮＡの量を２００ｎｇ／ウェルに増加させた場合、より強いシグナルが得られたことが観察された。したがって、核酸の量は、将来の全ての実験について２００ｎｇ／ウェルに固定した。ＳＩＳ００１２製剤を、原液からの異なる希釈度及び異なる混合比（ｖ／ｖ）でＲＮＡと混合して、ＳＩＳ００１２溶液の最小濃度と、ＲＮＡと複合体を形成し、ゲルを通るその移動を阻害することができる最低混合比とを見出した。２．５の混合比でのＳＩＳ００１２原液からの１０倍希釈は、対照として使用したネイキッドＲＮＡと比較して発光の強度（バンドの輝度）が低下したため、ゲルを通るＲＮＡの移動を部分的にブロックし、かつ５倍希釈したＳＩＳ００１２溶液を２．５又は４の比でＲＮＡと混合した場合、ＲＮＡ移動の完全なブロックが得られることが観察された。より低い濃度のＳＩＳ００１２製剤又はより低い混合比は、ＲＮＡに効率的に結合することができず、かつゲルを通るその移動を阻害することができなかった。これらの知見に基づいて、５倍希釈ＳＩＳ００１２溶液及び２．５（Ｖ／Ｖ）の混合比を、将来の実験のために選択した。これらの実験に使用されたＲＮＡは、複合体化アッセイの概念実証を提供することができたが、ＲＮＡについて観察されたバンドが鋭くなく、かつＤＮＡラダーほど強くないので、試料の純度は低いようであった。更に、ＲＮＡ断片のサイズは、非常に小さい（１００ｂｐであるＤＮＡラダーの最小断片よりも小さい）ことが判明し、全長ｍＲＮＡではなくオリゴマーの存在を示した。
図１２は、異なる濃度のＲＮＡ、異なる濃度のＳＩＳ００１２製剤、及び異なる体積比で、ＳＩＳ００１２上へロードしたパン酵母からのＲＮＡのゲル遅延度アッセイからの結果を示す。製造業者によってこの種類のゲルに推奨された１００ｎｇ／ウェルのＲＮＡはＲＮＡの非常に弱い発光をもたらしたが、一方でＲＮＡの量を２００ｎｇ／ウェルに増加させた場合、より強いシグナルが得られたことが観察された。したがって、核酸の量は、将来の全ての実験について２００ｎｇ／ウェルに固定した。ＳＩＳ００１２製剤を、原液からの異なる希釈度及び異なる混合比（ｖ／ｖ）でＲＮＡと混合して、ＳＩＳ００１２溶液の最小濃度と、ＲＮＡと複合体を形成し、ゲルを通るその移動を阻害することができる最低混合比とを見出した。２．５の混合比でのＳＩＳ００１２原液からの１０倍希釈は、対照として使用したネイキッドＲＮＡと比較して発光の強度（バンドの輝度）が低下したため、ゲルを通るＲＮＡの移動を部分的にブロックし、かつ５倍希釈したＳＩＳ００１２溶液を２．５又は４の比でＲＮＡと混合した場合、ＲＮＡ移動の完全なブロックが得られることが観察された。より低い濃度のＳＩＳ００１２製剤又はより低い混合比は、ＲＮＡに効率的に結合することができず、かつゲルを通るその移動を阻害することができなかった。これらの知見に基づいて、５倍希釈ＳＩＳ００１２溶液及び２．５（Ｖ／Ｖ）の混合比を、将来の実験のために選択した。これらの実験に使用されたＲＮＡは、複合体化アッセイの概念実証を提供することができたが、ＲＮＡについて観察されたバンドが鋭くなく、かつＤＮＡラダーほど強くないので、試料の純度は低いようであった。更に、ＲＮＡ断片のサイズは、非常に小さい（１００ｂｐであるＤＮＡラダーの最小断片よりも小さい）ことが判明し、全長ｍＲＮＡではなくオリゴマーの存在を示した。
【0173】
ＳＩＳ００１２ Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ上にロードしたニシン精子からのＤＮＡの複合体化有効性及び安定性を評価する試験
【0174】
図１３は、複合体化直後及び５時間までの、以前の試験に基づく選択された濃度及び混合比でＳＩＳ００１２製剤上にロードしたニシン精子からの、ＤＮＡのアガロースゲル遅延度アッセイからの画像を示す。ＤＮＡ－ＳＩＳ００１２複合体を、３つの異なる条件：室温、４℃、及び－２０℃で貯蔵した。担体が、ＤＮＡを効率的に捕捉し、かつゲルを通るその移動を阻害したことを観察することができた（図１３Ａ）。ＤＮＡからのシグナルはゲルのいずれにおいても観察されず、これは、最初の５時間以内に３つの製剤（異なる温度で貯蔵）のいずれによってもＤＮＡが放出されなかったことを示す。したがって、実験を更に継続して、ＤＮＡ－ＳＩＳ００１２複合体の安定性をより長期間にわたって研究した。ＤＮＡ対照（ネイキッドＤＮＡ）が、特定のサイズの分解バンドを与えず、むしろ異なるサイズのＤＮＡ断片の混合物を示したことは注目に値する。それにもかかわらず、これらの実験は、ＤＮＡと担体との複合体形成及び対応する複合体の安定性を評価することを単に目的としていたので、これらの実験の目的のために、ＤＮＡ断片の完全な分離を得る、又は複合体形成実験にＤＮＡを用いる前に超音波処理によってＤＮＡを更に処理することによって達成することができた特定のサイズの単一バンドを得る必要はない。
【0175】
図１４は、異なる温度で最大７２時間にわたり貯蔵したＤＮＡ－ＳＩＳ００１２複合体のゲル遅延度アッセイの結果を示す。３つの試料のいずれからもＤＮＡ放出の証拠は存在しなかった。したがって、これらの観察から、ＤＮＡ－ＳＩＳ００１２複合体は、３つの異なる貯蔵条件全てで７２時間にわたり安定であったものと推測することができた。
【0176】
Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ－ＳＩＳ００１２上にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡの複合体化有効性及び安定性を評価する試験
ＤＮＡ－ＳＩＳ００１２実験からの有望な結果に従って、同じ方法（同じ濃度及び混合比）によって生成され、かつ同じ条件（室温、４℃及び－２０℃）で貯蔵されたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１２複合体の安定性を試験した。結果を図１５及び図１６に提示する。これらの図から明らかなように、ＳＩＳ００１２製剤は、最大１２０時間までの３つ全ての貯蔵条件におけるｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１２複合体の安定性を示す貯蔵条件にかかわらず、全ての測定時点において、ｓｉＲＮＡを効率的に捕捉し、ゲルを通るその移動をブロックすることができた。
ＤＮＡ－ＳＩＳ００１２実験からの有望な結果に従って、同じ方法（同じ濃度及び混合比）によって生成され、かつ同じ条件（室温、４℃及び－２０℃）で貯蔵されたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１２複合体の安定性を試験した。結果を図１５及び図１６に提示する。これらの図から明らかなように、ＳＩＳ００１２製剤は、最大１２０時間までの３つ全ての貯蔵条件におけるｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１２複合体の安定性を示す貯蔵条件にかかわらず、全ての測定時点において、ｓｉＲＮＡを効率的に捕捉し、ゲルを通るその移動をブロックすることができた。
【0177】
シリコンナノ粒子を有しないＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ－ＳＩＳ００１２上にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡの複合体化有効性及び安定性を評価する試験
図１７及び図１８は、シリコンナノ粒子を有しないＳＩＳ００１２製剤上にロードしたＡＤＯ ｓｉＲＮＡのゲル遅延度アッセイ結果を示す。Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒは、ｓｉＲＮＡと複合体を形成し、かつゲルを通るその移動をブロックすることができた。室温で貯蔵した試料も４℃で貯蔵した試料も、ｓｉＲＮＡのバンドが観察されなかったため、６時間までの測定時点のいずれにおいても、会合したｓｉＲＮＡのいかなる量も放出しなかった。しかしながら、２４時間後、ゲル中にいくらかの微量のｓｉＲＮＡが検出され、これは、１２０時間で増強された非常に弱いシグナル（少量のｓｉＲＮＡを示す）を生じた。それにもかかわらず、７２時間及び１２０時間の試料は、ゲル添加液なしで実行し、かつ任意のゲル上にロードする前に水で希釈しただけであったことに留意されたい。したがって、観察されるシグナルの強度は、ゲル添加液を用いて試料を希釈した場合、観察されるシグナルよりも小さいであろう。注目すべき別の観察は、ｓｉＲＮＡの分解を示す対照ｓｉＲＮＡの２つのバンドの存在である。これらの実験で対照として使用したｓｉＲＮＡ溶液（６６μｇ／ｍＬ）を、－２０℃で貯蔵し、各回の実験を開始する前に解凍した。したがって、ｓｉＲＮＡの分解は、短期間の凍結解凍サイクルを繰り返した結果である可能性が高いものと考えられる。
図１７及び図１８は、シリコンナノ粒子を有しないＳＩＳ００１２製剤上にロードしたＡＤＯ ｓｉＲＮＡのゲル遅延度アッセイ結果を示す。Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒは、ｓｉＲＮＡと複合体を形成し、かつゲルを通るその移動をブロックすることができた。室温で貯蔵した試料も４℃で貯蔵した試料も、ｓｉＲＮＡのバンドが観察されなかったため、６時間までの測定時点のいずれにおいても、会合したｓｉＲＮＡのいかなる量も放出しなかった。しかしながら、２４時間後、ゲル中にいくらかの微量のｓｉＲＮＡが検出され、これは、１２０時間で増強された非常に弱いシグナル（少量のｓｉＲＮＡを示す）を生じた。それにもかかわらず、７２時間及び１２０時間の試料は、ゲル添加液なしで実行し、かつ任意のゲル上にロードする前に水で希釈しただけであったことに留意されたい。したがって、観察されるシグナルの強度は、ゲル添加液を用いて試料を希釈した場合、観察されるシグナルよりも小さいであろう。注目すべき別の観察は、ｓｉＲＮＡの分解を示す対照ｓｉＲＮＡの２つのバンドの存在である。これらの実験で対照として使用したｓｉＲＮＡ溶液（６６μｇ／ｍＬ）を、－２０℃で貯蔵し、各回の実験を開始する前に解凍した。したがって、ｓｉＲＮＡの分解は、短期間の凍結解凍サイクルを繰り返した結果である可能性が高いものと考えられる。
【0178】
Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒｓ－ＳＩＳ００１３上にロードしたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡの複合体化有効性及び安定性を評価する試験
図１９及び図２０は、複合体化の直後及び室温での貯蔵の６時間後までに、ＳＩＳ００１３製剤にロードされたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡに対して行われたゲル遅延度アッセイを示す。ＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒｓはｓｉＲＮＡを捕捉することができ、かつ実験の開始時からゲル全体にわたっていくらかの微量のｓｉＲＮＡを観察することができたが、シグナルは、１２０時間前に有意ではなかった。貯蔵後１２０時間で、シグナルはより強く、複合体からのｓｉＲＮＡの放出の増加を示した。しかしながら、この時点でさえ、シグナルはネイキッドｓｉＲＮＡからのシグナルと比較して著しく弱く、ゲルを通過するｓｉＲＮＡの量が非常に少ないことを示した。また、７２時間及び１２０時間の試料は、ゲル添加液なしで実行し、かつ任意のゲル上にロードする前に水で希釈しただけであったことに留意されたい。したがって、観察されるシグナルの強度は、ゲル添加液を用いて試料を希釈した場合、観察されるシグナルよりも小さいであろう。図１６に示すものと同様に、ネイキッドｓｉＲＮＡは、複数の凍結解凍サイクルに起因するｓｉＲＮＡの分解を示す２つのバンドを呈した。
図１９及び図２０は、複合体化の直後及び室温での貯蔵の６時間後までに、ＳＩＳ００１３製剤にロードされたＡＤＯ－ｓｉＲＮＡに対して行われたゲル遅延度アッセイを示す。ＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒｓはｓｉＲＮＡを捕捉することができ、かつ実験の開始時からゲル全体にわたっていくらかの微量のｓｉＲＮＡを観察することができたが、シグナルは、１２０時間前に有意ではなかった。貯蔵後１２０時間で、シグナルはより強く、複合体からのｓｉＲＮＡの放出の増加を示した。しかしながら、この時点でさえ、シグナルはネイキッドｓｉＲＮＡからのシグナルと比較して著しく弱く、ゲルを通過するｓｉＲＮＡの量が非常に少ないことを示した。また、７２時間及び１２０時間の試料は、ゲル添加液なしで実行し、かつ任意のゲル上にロードする前に水で希釈しただけであったことに留意されたい。したがって、観察されるシグナルの強度は、ゲル添加液を用いて試料を希釈した場合、観察されるシグナルよりも小さいであろう。図１６に示すものと同様に、ネイキッドｓｉＲＮＡは、複数の凍結解凍サイクルに起因するｓｉＲＮＡの分解を示す２つのバンドを呈した。
【0179】
室温での貯蔵とは異なり、４℃で貯蔵されたｓｉＲＮＡ－ＳＩＳ００１３複合体は、ゲルを通るｓｉＲＮＡ移動の欠如によって示されるように、最大１２０時間まで安定なままであった（図２１）。
【0180】
結論
報告された実験パラメータを用いて開発されたゲル遅延度アッセイは、核酸とＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒとの複合体形成を検出するのに有効であり、かつ非常に少量（２～３μＬ／ウェル）及び低濃度（１００ｎｇ／μＬ）の核酸を用いて形成された複合体の安定性を経時的に試験するのに有効である。これは、異なるタイプの核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）に適用することができた。核酸及びＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒの最適な複合体化条件は、５倍希釈したＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ溶液と、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）又はｓｉＲＮＡ（６６．５μｇ／ｍＬ）との混合比２．５Ｖ／Ｖであることが判明した。Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤ＳＩＳ００１２は、会合したｓｉＲＮＡを最大１２０時間まで保持することができたが、一方でシリコンナノ粒子を有しないＳＩＳ００１２製剤は、２４時間後及び１２０時間後にｓｉＲＮＡの放出を開始し、ゲルを通して放出されたｓｉＲＮＡの量は有意であった。ＳＩＳ００１３製剤は、開始点でも少量のｓｉＲＮＡをゲルへと放出したことから、ＳＩＳ００１２と比較して捕捉効率が低く、かつ１２０時間後にゲルを通過するｓｉＲＮＡの量が有意になったことが示唆された。しかしながら、ＳＩＳ００１３－ｓｉＲＮＡ複合体は４℃で最大１２０時間安定であり、シリコン粒子がホウ素ドープシリコンを含む場合、優れた貯蔵安定性を実証した。
報告された実験パラメータを用いて開発されたゲル遅延度アッセイは、核酸とＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒとの複合体形成を検出するのに有効であり、かつ非常に少量（２～３μＬ／ウェル）及び低濃度（１００ｎｇ／μＬ）の核酸を用いて形成された複合体の安定性を経時的に試験するのに有効である。これは、異なるタイプの核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）に適用することができた。核酸及びＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒの最適な複合体化条件は、５倍希釈したＢｉｏｃｏｕｒｉｅｒ溶液と、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）又はｓｉＲＮＡ（６６．５μｇ／ｍＬ）との混合比２．５Ｖ／Ｖであることが判明した。Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ製剤ＳＩＳ００１２は、会合したｓｉＲＮＡを最大１２０時間まで保持することができたが、一方でシリコンナノ粒子を有しないＳＩＳ００１２製剤は、２４時間後及び１２０時間後にｓｉＲＮＡの放出を開始し、ゲルを通して放出されたｓｉＲＮＡの量は有意であった。ＳＩＳ００１３製剤は、開始点でも少量のｓｉＲＮＡをゲルへと放出したことから、ＳＩＳ００１２と比較して捕捉効率が低く、かつ１２０時間後にゲルを通過するｓｉＲＮＡの量が有意になったことが示唆された。しかしながら、ＳＩＳ００１３－ｓｉＲＮＡ複合体は４℃で最大１２０時間安定であり、シリコン粒子がホウ素ドープシリコンを含む場合、優れた貯蔵安定性を実証した。
【0181】
＜実施例５：ＳＩＳ００１２（アンドープＳｉ）対ＳＩＳ００１３（ホウ素ドープＳｉ；５×１０１８ホウ素原子／ｃｍ３）によるアルカリホスファターゼの安定化＞
アルカリホスファターゼは、様々な形態で存在し、様々なタンパク質の分解を触媒し、かつ人体の全ての組織に見られ得る酵素である。アルカリホスファターゼは、主に骨、腎臓、肝臓、腸、及び胎盤に濃縮されている。アルカリホスファターゼは、とりわけ、細菌；消化機能；脂肪及びビタミンＢの分解；並びに、骨形成に対する腸管の保護に寄与する。アルカリホスファターゼは、低ｐＨ及び高温で活性の喪失を呈する。
アルカリホスファターゼは、様々な形態で存在し、様々なタンパク質の分解を触媒し、かつ人体の全ての組織に見られ得る酵素である。アルカリホスファターゼは、主に骨、腎臓、肝臓、腸、及び胎盤に濃縮されている。アルカリホスファターゼは、とりわけ、細菌；消化機能；脂肪及びビタミンＢの分解；並びに、骨形成に対する腸管の保護に寄与する。アルカリホスファターゼは、低ｐＨ及び高温で活性の喪失を呈する。
【0182】
アルカリホスファターゼ活性は、インビトロアッセイにおいて、その基質又は生成物の１以上の、ＵＶ－Ｖｉｓ吸光度がプロキシである濃度の変化を測定することによって監視され得る。例えば、その構造が以下に示される基質４－ニトロフェニルホスファターゼ（ＰＮＰＰ）の濃度を監視して、以下の反応を追跡してもよい。
【化2】
【0183】
材料、方法、及び結果
ウシの腸から単離され、酵母であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現される５６ｋＤの組換え酵素として供給されるアルカリホスファターゼを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｍｅｒｃｋ（Ｔｈｅ Ｏｌｄ Ｂｒｉｃｋｙａｒｄ，Ｎｅｗ Ｒｄ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＳＰ８ ４ＸＴ）から入手した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のストック水性原液を、１Ｕ／ｍＬの濃度で調製した。１Ｕ（μｍｏｌ／分）は、３７℃及びｐＨ７．４で毎分１マイクロモルのＰＮＰＰの変換を触媒するＡＬＰの量として定義される。
ウシの腸から単離され、酵母であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現される５６ｋＤの組換え酵素として供給されるアルカリホスファターゼを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｍｅｒｃｋ（Ｔｈｅ Ｏｌｄ Ｂｒｉｃｋｙａｒｄ，Ｎｅｗ Ｒｄ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＳＰ８ ４ＸＴ）から入手した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のストック水性原液を、１Ｕ／ｍＬの濃度で調製した。１Ｕ（μｍｏｌ／分）は、３７℃及びｐＨ７．４で毎分１マイクロモルのＰＮＰＰの変換を触媒するＡＬＰの量として定義される。
【0184】
４－ニトロフェニルホスファターゼ（ＰＮＰＰ）の２０ｍＭ溶液を、ｐＨ７．４のトリス緩衝液（１００ｍＭ／Ｌ）を用いて調製した。
【0185】
実施例２のプロトコルに従って、ＳＩＳ００１２（アンドープＳｉ）及びＳＩＳ００１３（ホウ素ドープＳｉ；５×１０１８ホウ素原子／ｃｍ３）試料を提供した。
【0186】
ＡＬＰ溶液を以下の濃度で調製した：
【0187】
０．１、０．５、１、５、１０、５０、及び１００ｍＵ／ｍＬ
【0188】
１５ｍＬ試験管中の１Ｕ／ｍＬ原液由来。
【0189】
次いで、これらをエッペンチューブ内で、調製したＰＮＰＰトリス緩衝液の２０ｍＭ溶液と混合した。
【0190】
チューブを３７℃の水浴中で３０分間にわたりインキュベートし、その後、ＵＶ－Ｖｉｓ吸光度測定を、図２２に示すように４０５ｎｍで行った。
【0191】
以下のようにして、ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３にＡＬＰをロードした。
【0192】
８本のエッペンチューブを１．３セット準備した：
【0193】
Ａ 各々５０μＬのＡＬＰ（５０ｍＵ／ｍＬ）及び５００μＬのＳＩＳ００１２（アンドープＳｉ）を含有する、８本のエッペンチューブを調製した。これらの構成成分をチューブに添加した後、これらを混合し、ボルテックスし、一晩冷蔵した。
【0194】
Ｂ 各々５０μＬのＡＬＰ（５０ｍＵ／ｍＬ）及び５００μＬのＳＩＳ００１３（ホウ素ドープＳｉ）を含有する、８本のエッペンチューブを調製した。これらの構成成分をチューブに添加した後、これらを混合し、ボルテックスし、一晩冷蔵した。
【0195】
Ｃ 各々５０μＬのＡＬＰ（５０ｍＵ／ｍＬ）及び５００μＬのトリス緩衝液を含有する、８本のエッペンチューブを調製した。これらの構成成分をチューブに添加した後、これらを混合し、ボルテックスし、一晩冷蔵した。
【0196】
２．これらの調製後、全てのエッペンチューブを、５０℃の水浴に入れた。３組のチューブＡ～チューブＣの各々における８本のチューブの各々を、１分、２分、５分、１０分、２０分、４０分、又は６０分後に水浴から取り出した。
【0197】
次いで、３．３００μＬのＰＮＰＰを、全てのセットＡ～セットＣの全てのエッペンチューブに添加した。チューブを混合し、ボルテックスした。次いで、それらを３７℃の水浴に３０分間入れ、その間にＰＮＰＰの脱リン酸化が起こった。
【0198】
４．これに続いて、全てのセットＡ～セットＣの全ての試料に対してＵＶ－Ｖｉｓ分析を行った（４０５ｎｍ）。結果を図２３に示す。
【0199】
考察
驚くべきことに、ＳＩＳ００１３（ホウ素ドープＳｉ）にロードされたＡＬＰの活性は、ＳＩＳ００１２にロードされたＡＬＰの活性よりもおよそ２０～３０％高かった。これは、ドープされたＳｉによるＡＬＰの保護が改善した事に起因すると考えられる。
驚くべきことに、ＳＩＳ００１３（ホウ素ドープＳｉ）にロードされたＡＬＰの活性は、ＳＩＳ００１２にロードされたＡＬＰの活性よりもおよそ２０～３０％高かった。これは、ドープされたＳｉによるＡＬＰの保護が改善した事に起因すると考えられる。
【0200】
遊離ＡＬＰは、ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３の両方と比較して有意な分解を示した。遊離ＡＬＰの活性は、５０℃でのインキュベーション時間の増加と共に減少した。一方で、ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３にロードされたＡＬＰの活性は、インキュベーション時間にかかわらず比較的一定のままであった。遊離ＡＬＰは５０℃で経時的に変性するものと考えられるが、一方でＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３、特にＳＩＳ００１３にロードされたＡＬＰは、変性から保護され、かつ安定したままである。
【0201】
＜実施例６：ｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡとの更なるシリコン含有製剤の複合体化＞
ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３で使用されるＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質を置き換えるための代替物を調査した。
ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３で使用されるＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質を置き換えるための代替物を調査した。
【0202】
そのような代替物の１つはリポペプチドである。これらは、ペプチド配列（概して、３～２０個のアミノ酸残基）にコンジュゲートした脂質鎖（一般に、１２～１８個の炭素原子長）からなる両親媒性物質である。そのようなリポペプチドの特定の例は、パルミトイルペンタペプチド－４（ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳと略す）である。
パルミトイルペンタペプチド－４
【化3】
パルミトイルペンタペプチド－４
【0203】
ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳは、負帯電したＲＮＡへの結合を助けるそのカチオン性リジン残基に起因して、カチオン性脂質の代替物の良好な候補であるものと考えられている。
【0204】
ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３で調査された他の候補としては、ＮＡＤ、チロシン（ＴＹＲ）、及びケルセチン（ＱＵＥ）が挙げられる。これらのリガンドにより、ＲＮＡの器官特異的取り込みが増強され得、細胞の内在化及び標的化が改善され得るものと考えられる。更に、これらのリガンドは、負帯電したＲＮＡの結合のための正帯電した環境を提供するのを助けることができる。
【0205】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＮＡＤ）は補酵素である。酸化形態ＮＡＤ＋では、以下の構造を有する。
ＮＡＤ＋
【化4】
ＮＡＤ＋
【0206】
チロシンは、天然に存在するアミノ酸であり、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）で以下の構造を有する。
生理学的ｐＨでのチロシン
【化5】
生理学的ｐＨでのチロシン
【0207】
ケルセチンは、以下の構造を有するフラバノールである。
ケルセチン
【化6】
ケルセチン
【0208】
ＮＡＤ、ＴＹＲ、及びＱＵＥ－ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３におけるＤＯＴＡＰの追加又は置換えの調査
【0209】
修飾ＳＩＳ００１２及び修飾ＳＩＳ００１３組成物は、上記した通常の組成物に０．２ｍｇのＮＡＤ、ＴＹＲ、及びＱＵＥを添加することによって（すなわち、ＤＯＴＡＰに加えて）調製した。次いで、ｓｉＲＮＡとの複合体化を評価した。図２４は、ｓｉＲＮＡがこれらの製剤中で首尾よく完全に結合したことを示す、ゲル電気泳動結果を示す。
【0210】
以下の表に示すように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能）を用いて動的光散乱測定をまた行い、ｓｉＲＮＡ複合体の形成前後の両方で、サイズ及び電荷を評価した。表が示すように、サイズの増加が、表面電荷の１０～１５ｍＶの低下と共に、ｓｉＲＮＡ複合体化後に観察された。
【0211】
【表6】
【0212】
次いで、（ＮＡＤ、ＴＹＲ、又はＱＵＥをＤＯＴＡＰ含有組成物へと単に添加するのではなく）ＮＡＤ、ＴＹＲ、又はＱＵＥによるＤＯＴＡＰの置換えを調査した。
【0213】
この研究では、ＤＰＰＣ及びＤＯＰＥは、中性ｐＨで表面電荷に有意な役割を果たさない双性イオン脂質であるので、ＤＰＰＣ及びＤＯＰＥを、ＮＡＤ、ＴＹＲ、又はＱＵＥと共に使用するために選択した。
【0214】
したがって、ＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ製剤を、（ｉ）０．２ｍｇ及び（ｉｉ）１ｍｇのＮＡＤ、ＴＹＲ、及びＱＵＥを用いて調製した。製剤を以下の表に示す。
【0215】
表：ベータニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）で官能化されたＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ ＬＮＰ Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒの組成
【表7】
【0216】
表：ケルセチン（ＱＵＥ）で官能化されたＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ ＬＮＰ Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒの組成。
【表8】
【0217】
表：チロシン（ＴＹＲ）で官能化されたＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ ＬＮＰ Ｂｉｏｃｏｕｒｉｅｒ ＳＩＳ００１２の組成
【表9】
【0218】
以下の表に示すように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ測定値が得られ、ＮＡＤ、ＴＹＲ、又はＱＵＥの量に関係なく、全ての製剤にわたって負のゼータ電位が明らかになった。
【0219】
表：０．２ｍｇ及び１ｍｇのＮＡＤ、ＴＹＲ、及びＱＵＥで官能化されたＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ ＬＮＰ。
【表10】
【0220】
リポペプチド－ＳＩＳ００１２及びＳＩＳ００１３におけるＤＯＴＡＰの置換えの調査
ペプチド両親媒性物質（ｐｅｐｔｉｄｅ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ：ＰＡ）としてもまた知られているリポペプチドを、ＤＯＴＡＰの別の代替物として調べた。
ペプチド両親媒性物質（ｐｅｐｔｉｄｅ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ：ＰＡ）としてもまた知られているリポペプチドを、ＤＯＴＡＰの別の代替物として調べた。
【0221】
リポペプチドは、トランスフェクション組成物中におけるＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質を置換又はその量を減少させるという問題に対する解決策を提供し得ると考えられる。リポペプチドは、ペプチド配列にコンジュゲートしたアルキル鎖からなる。それらのアルキル鎖は脂質二重層に同化され得るが、一方で二重層の表面はペプチド部分で装飾されているものと考えられる。
【0222】
例示的なＰＡは、分子パルミトイルペンタペプチド－４（ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳと略記、上記参照）である。２つのカチオン性リジン残基は、負帯電したＲＮＡとの静電相互作用を呈するＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質と同様の機能を果たし得る。
【0223】
中性脂質としてＤＰＰＣ及びＤＯＰＥを選択し、ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳを製剤化した。様々な製剤を、異なるシリコンナノ粒子を用いて、又はシリコンを全く用いずに；及び、（ｐＨの影響を調査するために）ｐＨ４緩衝液を用いて調製した。
【0224】
ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＰＡＬ－ＫＴＴＫＳ含有製剤の完全な詳細を以下の表に提示する。
【0225】
表－シリコンナノ粒子、ホウ素ドープシリコン、及びホウ酸／シリコンナノ粒子を含む、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＰａｌ－ＫＴＴＫＳの様々な製剤組成。シリコンナノ粒子を含まない製剤対応物もまた対照として製剤化した。全ての製剤を最大１０ｍｌの最終体積まで調製した。
【0226】
【表11】
【0227】
全８つの製剤は、正帯電した表面を有し、ゼータ電位（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能なＺｅｔａｓｉｚｅｒで測定）を以下の表に提示した。
【0228】
これらの結果に基づいて、脂質フィルムの集合の最中に、ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳは、ペプチド部分がナノ粒子表面に曝露した状態で脂質二重層に自身を配置するものと考えられる。更に、その表面上のリジン残基は、正帯電した製剤へ寄与する。
【0229】
表：全８種のＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ／ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳ製剤のゼータ電位測定。
【表12】
【0230】
全ての製剤を、ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡへと静電的に結合するそれらの能力について評価した。
【0231】
ゲル電気泳動分析を行った。ｓｉＲＮＡについては完全な複合体化は観察されなかった。しかしながら、ｍＲＮＡについて完全な複合体化が観察された。図２５はｓｉＲＮＡのゲル電気泳動結果を示し、図２６はｍＲＮＡのゲル電気泳動結果を示す。
【0232】
ｓｉＲＮＡとＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ／ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳとの部分複合体化に対処するために、代替的なロード方法を採用した。図２７は、代替ロード方法を使用した後の複合体のゲル電気泳動を示し、これは、ｓｉＲＮＡの完全な複合体化の成功を示している。（図２７のレーン３の明るい点は、画像化デバイスの人工産物である。）
【0233】
代替的なロード方法では、本明細書中上記のプロトコルと比較して、以下の工程が採用された：
【0234】
１．ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＰａｌ－ＫＴＴＫＳをメタノール中に溶解し、ロータリエバポレータを用いて蒸発させることによって、薄い脂質フィルムを調製した。
【0235】
２．脂質フィルムを、トレハロース及びグリシン、並びにｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡのいずれかを伴う、活性化シリコン（ＳＩＳ００１２）又は活性化ホウ素ドープシリコン（ＳＩＳ００１３）を含有する懸濁液で再水和した。丸底ロータリエバポレータフラスコの壁上に脂質－シリコンフィルムが残存しないことを確実にするために、レイドレーション（Ｒｅｙｄｒａｔｉｏｎ）を４０℃で１０分間行った。
【0236】
リポペプチドは非常に汎用性の高い分子であり、リポペプチドは、それらのアルキル鎖及び／又はそれらのペプチド配列を変更することによって微調整され得る。ペプチドのカスタマイズは、細胞及び／又は組織の標的化を増強し得るものと考えられる。遺伝子療法の分野では、ペプチドのカスタマイズは、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡなどの核酸との静電相互作用を生じさせ得る。一例として、ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳは、ＤＰＰＣ及びＤＯＰＥと製剤化した場合、ゼータ電位によって確認されるように、正帯電した表面をもたらした。
【0237】
両親媒性分子であるリポペプチドは、自己集合してミセルを形成することができる界面活性剤と、非常に類似した特性を有する。これは、ペプチド配列が分子間水素結合を形成することができる一方で、アルキル鎖が疎水性相互作用に適していることに少なくとも部分的に起因するものと考えられる。ＤＰＰＣ及びＤＯＰＥなどのリン脂質もまた、リポソームに自己集合することができる。したがって、ＰＡＬ－ＫＴＴＫＳが代表例であるＰＡを組み込む場合（他のリポペプチドを使用してもよいが）、アルキル鎖は、ＤＰＰＣ及びＤＯＰＥと疎水性相互作用を形成してリポソーム構造を得ることができる。
【0238】
一方で、シリコンナノ粒子は、複合体全体としての構造安定性を提供し、かつ脂質及び他のリガンド、例えばリポペプチド、ＮＡＤ、ＱＵＥ、又はＴＹＲなどと、非共有結合（静電）相互作用を介して相互作用することができ、したがって、核酸の長期安定性及び結合を促進する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【国際調査報告】