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特表2024-527480ポリメラーゼ変異体、および３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターとの併用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-25
(54)【発明の名称】ポリメラーゼ変異体、および３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターとの併用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/12 20060101AFI20240718BHJP
C12N 15/00 20060101ALI20240718BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240718BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240718BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240718BHJP
【ＦＩ】
C12N9/12 ZNA
C12N15/00 100Z
C12Q1/6869 Z
C12N15/54
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023576079
(86)(22)【出願日】2021-06-29
(85)【翻訳文提出日】2024-02-09
(86)【国際出願番号】 US2021070785
(87)【国際公開番号】W WO2023277953
(87)【国際公開日】2023-01-05
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】399117121
【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002310
【氏名又は名称】弁理士法人あい特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カユーテ，ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】フォックス，ジェフリー
(72)【発明者】
【氏名】ハンセン，コニー
(72)【発明者】
【氏名】ホグレフ，ホーリー
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ウェイドン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QR66
4B063QS36
(57)【要約】
【課題】可逆的ターミネーターとして機能するように修飾されたヌクレオチドを含む、修飾ヌクレオチドを組み込む機能が改善された、ポリヌクレオチド配列決定および他のバイオテクノロジー用途のためのポリメラーゼを提供する。
【解決手段】３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを含む修飾ヌクレオチドを組み込む能力が改善された変異体ポリメラーゼ。この変異体ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド配列決定、プライマー伸長反応および鋳型非依存性酵素的オリゴヌクレオチド合成などの様々な用途で使用される。
【選択図】図１Ａ
【解決手段】３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを含む修飾ヌクレオチドを組み込む能力が改善された変異体ポリメラーゼ。この変異体ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド配列決定、プライマー伸長反応および鋳型非依存性酵素的オリゴヌクレオチド合成などの様々な用途で使用される。
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターと変異体ポリメラーゼとを含む組成物であって、前記変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、組成物。
【請求項2】
前記変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置にＡ４８６Ｘ変異を含み、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記Ａ４８６Ｘ変異がＡ４８６Ｆ、Ａ４８６Ｙ、Ａ４８６Ｎ、Ａ４８６Ｒ、またはＡ４８６Ｈである、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置にＹ５４６Ｈ変異をさらに含む、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４７７と機能的に等価な位置にＫ４７７Ｗ変異をさらに含む、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｆ４９４と機能的に等価な位置に変異をさらに含む、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記Ｆ４９４変異がＦ４９４Ｃ、Ｆ４９４Ｉ、Ｆ４９４Ｎ、またはＦ４９４Ｔである、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記変異体ポリメラーゼが、パイロコッカスポリメラーゼの誘導体である、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記変異体ポリメラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記変異体ポリメラーゼが、サーモコッカスポリメラーゼの誘導体である、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
核酸を含むプライミング鎖にヌクレオチドを組み込む方法であって、前記方法は、組み込み反応に十分な条件下で前記プライミング鎖とヌクレオチドおよび変異体ポリメラーゼとを接触させることを含み、
前記変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、方法。
【請求項12】
前記ヌクレオチドが３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、（ａ）鋳型とプライミング鎖とを含む二本鎖を形成し、前記鋳型が、配列決定される標的核酸と、前記プライミング鎖の少なくとも一部に相補的なプライマー結合部位と、を含む、形成することと、
（ｂ）前記プライミング鎖と、可逆的ターミネーターヌクレオチドおよび変異体ポリメラーゼとを組み合わせ、前記変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、組み合わせることと、
（ｃ）前記プライミング鎖の３’末端に鋳型依存性反応で前記可逆的ターミネーターを組み込むことと、
（ｄ）前記組み込まれた可逆的ターミネーターヌクレオチドを同定し、それによって前記鋳型の配列を決定する、同定することと、
を含む、方法。
【請求項14】
前記方法が、ステップ（ｃ）および（ｄ）を少なくとも８０回繰り返すことをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
プライミング鎖、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターと変異体ポリメラーゼとを含む組成物であって、前記変異体ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、
前記変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｌ４０９、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置に１つまたは複数の変異をさらに含み、
前記変異体ポリメラーゼが、配列番号１１のＤＮＡポリメラーゼの組み込み活性より少なくとも４倍高い３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターの組み込み活性を有する、組成物。
【請求項16】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも８５％同一である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項18】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項19】
前記変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置２６６、２６７、２６８、２６９、３２９、３３６、３９９、４００、４０３、４０４、４０７、４０８、４１０、４１１、４５０、４５２、４５５、４５６、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４７５、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８５、４８７、４８８、４９１、４９３、４９５、４９６、４９８、４９９、５００、５１５、５２２、５４５、５４６、５７７、５７９、５８０、５８２、５８４、５９１、５９５、６０３、６０６、６０７、６０８、６１２、６１３、６１４、６６４、６６５、６６６、６６８、６６９、６７４、６７５、および６７６と機能的に等価な任意の位置に変異を含まない、請求項１５～請求項１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項20】
前記変異体ポリメラーゼがパイロコッカスポリメラーゼの誘導体である、請求項１５～請求項１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項21】
前記変異体ポリメラーゼがサーモコッカスポリメラーゼの誘導体である、請求項１５～請求項１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項22】
前記組成物が、前記プライミング鎖の少なくとも一部に相補的なプライマー結合部位を含む鋳型をさらに含む、請求項１５～請求項２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項23】
前記組成物が、５４６Ｈ変位および４８６Ｘ変異をさらに含む、請求項１５～請求項２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項24】
前記組成物が、前記プライミング鎖に相補的な鋳型を含まない、請求項１５～請求項２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターをプライミング鎖に組み込む方法であって、前記方法が、組み込み反応に十分な条件下でプライミング鎖と３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターおよび変異体ポリメラーゼとを接触させることであって、前記変異体ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｌ４０９、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置における１つまたは複数の変異とを含む、接触させることと、
前記プライミング鎖の３’末端に前記３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターを組み込むことと、を含む、方法。
【請求項26】
前記３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターが２‐ニトロベンジル修飾ヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターが、Ｃ７‐またはＣ５‐ヒドロキシメチル‐α‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐ニトロベンジル修飾ヌクレオチドおよびそのα‐チオ誘導体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４９２と機能的に等価な位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、前記方法が、前記ターミネーターを選択的に組み込むことを含む、請求項２５～請求項２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記変異がＮ４９２Ｉ、Ｎ４９２Ｖ、またはＮ４９２Ｐから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
シトシン塩基を含む３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターが、前記変異体ポリメラーゼによって選択的に組み込まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターと、配列番号２と少なくとも９６％同一である変異体ポリメラーゼとを含む組成物であって、Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９ＨまたはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組成物。
【請求項32】
前記組成物が、前記プライミング鎖に相補的な鋳型を含まない、請求項３１に記載の組成物。
【請求項33】
前記変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置における１つまたは複数の変異をさらに含む、請求項３１または請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
前記変異体ポリメラーゼが、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項３１または請求項３２に記載の組成物。
【請求項35】
前記変異体ポリメラーゼが、配列番号１１のＤＮＡポリメラーゼの組み込み活性より少なくとも２倍高い組み込み活性を有する、請求項３１～請求項３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項36】
前記変異体ポリメラーゼがパイロコッカスポリメラーゼの誘導体である、請求項３１～請求項３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項37】
前記変異体ポリメラーゼが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３１～請求項３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項38】
前記変異体ポリメラーゼがサーモコッカスポリメラーゼの誘導体である、請求項３１～請求項３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項39】
鋳型非依存性反応でプライミング鎖に単一ヌクレオチドを組み込むための方法であって、前記方法が、プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターおよび変異体ポリメラーゼとを組み合わせることであって、前記変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であり、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９ＨまたはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組み合わせることを含み、
前記ターミネーターの組み込みが、配列番号１１の変異体ＤＮＡポリメラーゼより少なくとも２倍高い、方法。
【請求項40】
鋳型非依存性オリゴヌクレオチドの合成方法であって、プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターと、変異体ＤＮＡポリメラーゼと、を組み合わせることであって、前記変異体ＤＮＡポリメラーゼが、
配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるヒスチジンへのＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９Ｈ、またはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組み合わせることと、
前記３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターを前記プライミング鎖に組み込むことと、を含む、方法。
【請求項41】
前記ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置における１つまたは複数の変異をさらに含む、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターが２‐ニトロベンジル修飾ヌクレオチドである、請求項３９～請求項４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターがＣ７‐またはＣ５‐ヒドロキシメチル‐α‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐ニトロベンジル修飾ヌクレオチドおよびそのα‐チオ誘導体である、請求項３９～請求項４１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変異体ポリメラーゼ、ならびにポリヌクレオチド配列決定、プライマー伸長反応、および他の用途のためのこのような変異体ポリメラーゼの使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリメラーゼは、ゲノムを複製し維持するために生体内に自然に存在する。ポリメラーゼは、バイオテクノロジー分野において、ＰＣＲおよび配列決定を含む様々な用途で利用されてきた。ポリメラーゼは、ヌクレオチド塩基間の相補性を検出し、および／またはオリゴヌクレオチド鎖の構造的特徴を認識し、かつヌクレオチドと鎖の３’末端との間の反応のための酵素として機能することによってＤＮＡまたはＲＮＡの複製を可能にする。ヌクレオチド、特に核酸の重合において可逆的ターミネーターとして機能するように修飾されたヌクレオチドの組み込みが改善された、様々なバイオテクノロジー用途のためのポリメラーゼの必要性が残っている。
【0003】
Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢのサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種９°Ｎ‐７ ＤＮＡポリメラーゼの誘導体である。Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社（マサチューセッツ州イプスウィッチ）から市販されており、その特性および用途については、最近、非特許文献１においてレビューされている。
【0004】
パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（以下、Ｐｆｕ）は、もともと、９０℃～１００℃の温度の地熱で加熱された海洋堆積物から単離された超好熱性古細菌の１種である。パイロコッカス・フリオサスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他のバイオテクノロジー用途で使用されてきたファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを持っている。非特許文献２を参照のこと。
【0005】
多くの野生型および変異体ＤＮＡポリメラーゼは、特に修飾ヌクレオチドを組み込む機能を有する場合、様々なバイオテクノロジー用途で使用されるか、または使用できる可能性がある。このようなＤＮＡポリメラーゼは、ポリヌクレオチド配列決定、クローニング、ＰＣＲまたは他の増幅、一塩基多型（ＳＮＰ）検出、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、合成生物学、分子診断、および他の用途に有用な可能性がある。
【0006】
ＤＮＡポリメラーゼの潜在的用途の１つは、酵素を介したオリゴヌクレオチド合成（鋳型非依存性酵素オリゴ合成；ＴｉＥＯＳ：Ｔｅｍｐｌａｔｅ‐Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｏｌｉｇｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）用である。ＴｉＥＯＳは、天然および修飾ヌクレオチドの両方から長い核酸ポリマーを生成するアプローチである。非特許文献３を参照のこと。
【0007】
現在のアプローチは、鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼと可逆的修飾ターミネーターとを組み合わせて、１サイクルあたり１塩基付加にオリゴヌクレオチドの伸長を制御することである。ＴｉＥＯＳに好ましい酵素は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である。ファミリーＸ ＤＮＡポリメラーゼとして分類されるＴｄＴは、哺乳動物における抗原受容体の多様性を高めるために、ｉｎ ｖｉｖｏで鋳型非依存性にヌクレオチドを付加する。ＴｄＴは、１００％未満の効率で可逆的ターミネーターを組み込むため、得られる合成オリゴヌクレオチドの長さおよび忠実度が制限される。今日までに酵素的に合成された最も長いオリゴは、操作されたファミリーＸ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ Ｓｃｒｉｐｔ社が報告したものである（段階的収率９９．４％で２８０ｍｅｒ）。非特許文献４を参照のこと。
【0008】
さらに、合成による配列決定に使用するために開発された可逆的ターミネーターの多くは、ヌクレオチドの糖（３’‐ＯＨブロック）または塩基（３’‐ＯＨ非ブロック）から終端基が除去された後に傷（ｓｃａｒ）または修飾を残す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国特許出願公開第２００３／０２２８６１６号明細書
【特許文献2】米国特許第５，７８９，１６６号明細書
【特許文献3】米国特許第５，９３２，４１９号明細書
【特許文献4】米国特許第５，９４８，６６３号明細書
【特許文献5】米国特許第６，１８３，９９７号明細書
【特許文献6】米国特許第６，３９１，５４８号明細書
【特許文献7】米国特許第６，４４４，４２８号明細書
【特許文献8】米国特許第６，７３４，２９３号明細書
【特許文献9】米国特許第７，１３２，２６５号明細書
【特許文献10】米国特許第７，１７６，００４号明細書
【特許文献11】米国特許第８，９６９，５３５号明細書
【特許文献12】米国特許第９，２００，３１９号明細書
【特許文献13】米国特許第１０，０４１，１１５号明細書
【特許文献14】米国特許第９，２７３，３５２号明細書
【特許文献15】米国特許第９，６７７，０５７号明細書
【特許文献16】米国特許第９，７６５，３０９号明細書
【特許文献17】米国特許出願公開第２０１６／００３２３７７号明細書
【特許文献18】米国特許出願公開第２０２０／０２１６８４１号明細書
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｇａｒｄｎｅｒら、「Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，２０１９年４月２４日（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｍｏｌｂ．２０１９．０００２８）
【非特許文献2】ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｇ０、著作権者Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．２０１５年、２０２０年、Ｅｌｓｈａｗａｄｆｙら、「ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｈｙｂｒｉｄｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ‐Ｂ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４年５月２７日、第５巻、２２４ページ．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１４．００２２４
【非特許文献3】Ｊｅｎｓｅｎら、「Ｔｅｍｐｌａｔｅ‐Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＴｉＥＯＳ）：Ｉｔｓ Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」、（２０１８年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５７巻、１８２１～３２ページ
【非特許文献4】Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ（２０２０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３８巻、１１１３～１１１５ページ、および米国特許第１０，７５２，８８７号
【非特許文献5】Ｗｅｉｄｏｎｇ Ｗｕら、「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｎ６‐ａｌｋｙｌａｔｅｄ，ｎｏｔ ３′‐Ｏ‐ａｌｋｙｌａｔｅｄ，ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ ２′‐ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３５巻、第１９号、２００７年１０月１日、６３３９～６３４９ページ
【非特許文献6】Ｖｌａｄｉｓｌａｖ Ａ．Ｌｉｔｏｓｈら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ３′‐ＯＨ ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ２‐ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ａｌｋｙｌａｔｅｄ ＨＯＭｅｄＵ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３９巻、第６号、２０１１年３月１日、ｅ３９ページ
【非特許文献7】Ｂｒｉａｎ Ｐ．Ｓｔｕｐｉら、「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂｅｎｚｙｌｉｃ Ｃａｒｂｏｎ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ２‐Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ Ｇｒｏｕｐｓ ａｓ Ｋｅｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ Ｆａｓｔ‐Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２０１２年（編）、第５１巻、１７２４～１７２７ページ
【非特許文献8】Ａｎｄｒｅｗ Ｆ．Ｇａｒｄｎｅｒら、「Ｒａｐｉｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ３′‐ＯＨ ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４０巻、第１５号、２０１２年４月１日、７４０４～７４１５ページ
【非特許文献9】Ｈａｎｓｅｎら（２０１１年）ＮＡＲ 第３９巻、１８０１～１８１０ページ
【非特許文献10】Ｈｅｒｔｚｏｇ Ｄら、「Ａ ｈｉｇｈ‐ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ｌｏｗ‐ｃｏｓｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、ＢｉｏＯｐｔｉｃｓ Ｗｏｒｌｄ、２０１１年、２０１１年１１月／１２月号
【非特許文献11】Ｒａｍｓａｙ，Ｎ．ら（２０１０年）ＣｙＤＮＡ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｙ‐Ｄｙｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ＤＮＡ ｂｙ ａｎ Ｅｖｏｌｖｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．２０１０年、第１３２巻、５０９６～５１０４ページ。
【非特許文献12】Ｃｏｚｅｎｓら（２０１２年）Ａ ｓｈｏｒｔ ａｄａｐｔｉｖｅ ｐａｔｈ ｆｒｏｍ ＤＮＡ ｔｏ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第１０９巻、８０６７～７２ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
可逆的ターミネーターとして機能するように修飾されたヌクレオチドを含む、修飾ヌクレオチドを組み込む機能が改善された、ポリヌクレオチド配列決定および他のバイオテクノロジー用途のためのポリメラーゼが必要とされている。また、高い組み込み効率および終結効率で鋳型非依存的に無傷の（ｓｃａｒｌｅｓｓ）可逆的ターミネーターを組み込む酵素も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明の一態様として、変異体ポリメラーゼが提供される。変異体ポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、さらに、本明細書で同定されるＰｆｕポリメラーゼのアミノ酸位置と機能的に等価な１つまたは複数の位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【0013】
いくつかの実施の形態では、ポリメラーゼは、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置に変異を含み、および／またはＰｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置に変異を含み、および／またはＰｆｕポリメラーゼの位置４７７と機能的に等価な位置に変異を含む。例示的な変異体ポリメラーゼは、配列番号２、配列番号９、配列番号１０、配列番号４、または配列番号５のアミノ酸配列を含むものを含む。
【0014】
本発明の別の態様として、本明細書に記載の可逆的ターミネーターと変異体ポリメラーゼとを含む組成物が提供される。いくつかの実施の形態では、可逆的ターミネーターは３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーター（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒなど）である。たとえば、非特許文献５、非特許文献６、および非特許文献７、非特許文献８を参照のこと。
【0015】
別の態様として、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターと変異体ポリメラーゼとを含む組成物が提供される。変異体ポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む。
【0016】
別の態様として、核酸を含むプライミング鎖にヌクレオチドを組み込むための方法が提供される。この方法は、組み込み反応に十分な条件下でプライミング鎖とヌクレオチドおよび変異体ポリメラーゼとを接触させる工程を含む。変異体ポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む。
【0017】
本発明の別の態様は、ポリヌクレオチドを配列決定する方法に係るものである。この方法は、（ａ）鋳型とプライミング鎖とを含む二本鎖を形成する工程であって、鋳型が、配列決定される標的核酸と、プライミング鎖の少なくとも一部に相補的なプライマー結合部位と、を含む、形成する工程と、（ｂ）プライミング鎖と、可逆的ターミネーターヌクレオチドおよび変異体ポリメラーゼとを組み合わせる工程であって、変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、組み合わせる工程と、（ｃ）プライミング鎖の３’末端に鋳型依存性反応で可逆的ターミネーターを組み込む工程と、（ｄ）組み込まれた可逆的ターミネーターヌクレオチドを同定し、それによって鋳型の配列を決定する、同定する工程と、を含む。
【0018】
本発明の別の態様として、プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターと、変異体ポリメラーゼと、を含む組成物が提供される。変異体ポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％、あるいは、少なくとも８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。変異体ポリメラーゼは、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｌ４０９、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７、およびＥ５８１と機能的に等価な位置に１つまたは複数の変異をさらに含む。変異体ポリメラーゼは、配列番号１１のＤＮＡポリメラーゼの組み込み活性より少なくとも４倍高い組み込み活性を有する。
【0019】
さらに他の態様として、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターをプライミング鎖に組み込む方法が提供される。この方法は、組み込み反応に十分な条件下でプライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターおよび変異体ポリメラーゼとを接触させる工程を含む。変異体ポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｌ４０９、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７、およびＥ５８１と機能的に等価な位置における１つまたは複数の変異と、を含む。この方法はまた、プライミング鎖の３’末端に３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターを組み込む工程を含む。
【0020】
別の態様として、プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターと、変異体ポリメラーゼと、を含む組成物が提供される。変異体ポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも９６％同一であり、Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるＹ５４６Ｈ変異と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９ＨまたはＬ４０９Ｆ変異と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、を含む。
【0021】
本発明の別の態様として、鋳型非依存性反応でプライミング鎖に単一ヌクレオチドを組み込むための方法が提供される。この方法は、プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターおよび変異体ポリメラーゼと、を組み合わせる工程を含む。変異体ポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも９６％同一であり、かつ、Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるＹ５４６Ｈ変異と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９ＨまたはＬ４０９Ｆ変異と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、を含む。ターミネーターの組み込みは、配列番号１１の変異体ＤＮＡポリメラーゼより少なくとも２倍（あるいは、４倍または１０倍）高い。
【0022】
別の態様として、３’‐ＯＨ鋳型非依存性オリゴヌクレオチド合成のための方法が提供される。この方法は、プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターと、変異体ＤＮＡポリメラーゼと、を組み合わせる工程を含む。変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるヒスチジンへのＹ５４６Ｈ変異と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９Ｈ、またはＬ４０９Ｆ変異と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、を含む。この方法はまた、３’‐ＯＨ非ブロック非修飾可逆的ターミネーターをプライミング鎖に組み込む工程を含む。
【0023】
本方法および組成物のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲とあわせて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1E】図１Ｅは、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを使用するＴｉＥＯＳに使用される可逆的ｄＡＴＰターミネーターを示す図である。図１Ｅ（「ＬＴＡ‐１」）は、アデノシンのＮ６位がニトロベンジル部分で修飾されている。
【図1F】図１Ｆは、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを使用するＴｉＥＯＳに使用される可逆的ｄＡＴＰターミネーターを示す図である。図１Ｆ（「ＬＴＡ‐２」）は、７‐ヒドロキシルメチル‐７‐デアザ‐デオキシアデノシンがα‐ｔｅｒｔ‐ブチルニトロベンジル部分で修飾されており、任意選択で三リン酸部分にα‐チオ修飾を有する。
【図2】図２は、実施例４における、変異体キメラポリメラーゼを用いた配列決定からの配列決定メトリクスを示す図である。Ｐｆｕ Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈ ＤＮＡポリメラーゼ（「対照」；Ｐｆｕ ２）の以下のドメインを、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼからの対応するセグメント：Ａ‐１～９９；Ｂ‐１００～１９９；Ｃ‐４００～４４９；Ｄ‐（５００～５９９にまたがる２０～４０アミノ酸の４セグメント）で置換した。ドメインＤについては、ＡＲＬおよびＬ＋Ｌは、４サブキメラポリメラーゼによって示された平均値で示している。
【図10A】図１０Ａは、実施例８における、市販のＴｄＴ調製物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および様々な変異体ポリメラーゼによる、プライミング鎖への可逆的ターミネーターの鋳型非依存性組み込みの測定値を示す図である。
【図10B】図１０Ｂは、実施例８における、市販のＴｄＴ調製物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および様々な変異体ポリメラーゼによる、プライミング鎖への可逆的ターミネーターの鋳型非依存性組み込みの測定値を示す図である。
【図10C】図１０Ｃは、実施例８における、市販のＴｄＴ調製物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および様々な変異体ポリメラーゼによる、プライミング鎖への可逆的ターミネーターの鋳型非依存性組み込みの測定値を示す図である。
【図10D】図１０Ｄは、実施例８における、市販のＴｄＴ調製物（Ｐｒｏｍｅｇａ社）および様々な変異体ポリメラーゼによる、プライミング鎖への可逆的ターミネーターの鋳型非依存性組み込みの測定値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本開示は、添付の図面とともに読めば、以下の詳細な説明から最もよく理解される。特徴は、必ずしも縮尺通りに描かれていない。
【0026】
本開示は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒなどの３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターヌクレオチドの組み込みの改善のための変異体ポリメラーゼを提供する。本発明者らは、驚くべきことに、可逆的ターミネーターの組み込みの改善を示し、配列決定性能の改善およびＤＮＡ結合親和性の低下などの複数の他の関連する利点を有する特定の変異体ポリメラーゼを同定した。
【0027】
本開示はまた、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼをコードする核酸分子を提供する。このような核酸分子は、コドンとアミノ酸との公知の対応に基づき、本明細書に開示されているアミノ酸配列に基づいて容易に想定することができる。本開示はまた、このような核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示はまた、このような発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0028】
本開示はまた、ヌクレオチドの組み込み部位として機能し、その３’末端から伸長することが可能なプライミング鎖に１つまたは複数の可逆的ターミネーターヌクレオチドを組み込むための方法を提供する。この方法は、以下の成分を相互作用させることを含む：（ｉ）本明細書に記載の変異体ポリメラーゼ、（ｉｉ）プライミング鎖、および（ｉｉｉ）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒなどの可逆的ターミネーターを含むヌクレオチド溶液。
【0029】
本開示はまた、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼおよびヌクレオチド溶液を含む、ヌクレオチド組み込み反応を実施するためのキットを提供する。いくつかの実施の形態では、ヌクレオチド溶液は３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを含む。
【0030】
本明細書に記載の変異体ポリメラーゼは、修飾ヌクレオチド、特に３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターの組み込みのために改善されている。本発明者らは、可逆的ターミネーターの組み込みの改善を示し、かつＤＮＡ結合親和性の低下と、合成による配列決定反応における配列決定メトリクスの改善とを含む複数の他の関連する利点を有する特定の変異体ポリメラーゼを同定した。結合親和性の低下によって、変異体ポリメラーゼは、伸長した一次鎖と伸長していない一次鎖との間で迅速に循環することが可能となり、より高い親和性を有するポリメラーゼと比較してより高い組み込み効率をもたらすことが期待される。
【0031】
より詳細に以下で説明するように、ポリメラーゼにおける１つまたは複数の残基に対する１つまたは複数の変異は、ターンオーバー速度の大幅増加および加ピロリン酸分解の減少をもたらすことが見いだされた。これらの変異体ポリメラーゼは、ＤＮＡ合成による配列決定（ＳＢＳ）における性能の改善を示し、合成による配列決定反応におけるフェージングおよび／またはプレフェージングの減少および全体的な品質メトリクスの改善をもたらす。「フェージング」とは、配列決定サイクル中に、ＳＢＳ中のクラスター内の一部の鎖におけるヌクレオチドの組み込みの失敗によるそのクラスター内の同期性の喪失を指す。「プレフェージング」とは、有効な３’ターミネーターを持たないヌクレオチドが一部の鎖に組み込まれた場合にクラスターの結果よりも１サイクル先に進む、ＳＢＳクラスターの状態を指す。
【0032】
いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、この組換えＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の特定の位置と機能的に等価な１つまたは複数の位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。野生型Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。
【0033】
いくつかの実施の形態では、本変異体ポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、さらに、Ｐｆｕポリメラーゼの４０９、４７７、４８６または５４６の残基のアミノ酸位置と機能的に等価な１つまたは複数の位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施の形態では、ポリメラーゼは、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置に変異を含み、かつ、Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置に変異を含んでもよく、さらに、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４７７と機能的に等価な位置に変異を含んでいてもよい。いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、配列番号２と少なくとも９６％同一であり、変異Ａ４８６Ｘであって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸である可能性のある変異Ａ４８６Ｘを含む。たとえば、変異体ポリメラーゼは、変異Ｙ５４６Ｈ、Ｋ４７７ＷおよびＡ４８６Ｘを有する配列番号１のアミノ酸配列であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸である可能性のあるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、さらに、変異Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３Ａを含む。
【0034】
いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、Ｐｆｕポリメラーゼの位置２７０、３３０、３３２、３３３、４０９、４５１、４５３、４５７、４７６、４８９、４９０、４９２、４９４、４９７および５８１と機能的に等価な位置に１つまたは複数の変異をさらに含む。いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、Ｐｆｕポリメラーゼの位置２６６、２６７、２６８、２６９、３２９、３３６、３９９、４００、４０３、４０４、４０７、４０８、４１０、４１１、４５０、４５２、４５５、４５６、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４７５、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８５、４８７、４８８、４９１、４９３、４９５、４９６、４９８、４９９、５００、５１５、５２２、５４５、５４６、５７７、５７９、５８０、５８２、５８４、５９１、５９５、６０３、６０６、６０７、６０８、６１２、６１３、６１４、６６４、６６５、６６６、６６８、６６９、６７４、６７５、および６７６と機能的に等価な位置に変異を含まない。
【0035】
上記の変異体ポリメラーゼは、３’ブロックヌクレオチドの存在下で、および／またはＤＮＡ配列決定用途において、ポリメラーゼ活性の１つまたは複数の態様を増強させることが知られているさらなる変異を含むことができる。
【0036】
いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼと比較して低下したエキソヌクレアーゼ活性を含む。たとえば、変異体ポリメラーゼは、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のＡｓｐ１４１および／またはＧｌｕ１４３と機能的に等価な位置に変異を含んでいてもよい。
【0037】
いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、内部メチオニンを除去するために、さらなる変異を含むことができる。たとえば、いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、Ｐｆｕおよび９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列のＭｅｔ１２９と機能的に等価な位置に、異なるアミノ酸への変異を含む。いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、Ｐｆｕおよび９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のＭｅｔ１２９Ａｌａと機能的に等価な変異を含む。
【0038】
いくつかの実施の形態では、変異は、非極性側鎖を有する残基への変異を含む。非極性側鎖を有するアミノ酸は当分野で周知であり、たとえばアラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む。
【0039】
いくつかの実施の形態では、変異は、極性側鎖を有する残基への変異を含む。極性側鎖を有するアミノ酸は当分野で周知であり、たとえばアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリンおよびスレオニンを含む。
【0040】
いくつかの実施の形態では、変異は、疎水性側鎖を有する残基への変異を含む。疎水性側鎖を有するアミノ酸は当分野で周知であり、たとえばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンを含む。
【0041】
いくつかの実施の形態では、変異は、非荷電側鎖を有する残基への変異を含む。非荷電側鎖を有するアミノ酸は当分野で周知であり、たとえばグリシン、セリン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシンおよびスレオニンを含む。
【0042】
いくつかの実施の形態では、変異体ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼの誘導体である。いくつかの実施の形態では、ＤＮＡポリメラーゼは古細菌ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施の形態では、ＤＮＡポリメラーゼはファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼである。ファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｒｅｚｉらの開示（特許文献１）で例示されるように、当技術分野で公知である。いくつかの実施の形態では、古細菌ＤＮＡポリメラーゼは超好熱性古細菌由来であり、このことは、そのポリメラーゼがしばしば耐熱性であることを意味する。したがって、さらに好ましい実施の形態では、変異体ポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、９°ＮおよびＰｆｕポリメラーゼから選択されるＤＮＡポリメラーゼに由来する。ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔは、それぞれ超好熱性古細菌サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）およびパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＧＢ‐Ｄから単離されたファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼに用いられている商品名である。９°Ｎポリメラーゼは、ユニークなサーモコッカス種（Ｔ．種９°Ｎ）からも単離された。上記のように、Ｐｆｕポリメラーゼはパイロコッカス・フリオサスから単離された。いくつかの実施の形態では、本変異体ポリメラーゼはパイロコッカスポリメラーゼまたはサーモコッカスポリメラーゼの誘導体である。
【0043】
いくつかの実施の形態では、ファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、たとえばサーモコッカス属、パイロコッカス属またはメタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属などの属由来である。サーモコッカス属のメンバーは、限定されるものではないが、サーモコッカス４５５７、サーモコッカス・バロフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモコッカス・ガンマトレランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）、サーモコッカス・オンヌリネウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ）、サーモコッカス・シビリカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）を含む。パイロコッカス属のメンバーは、限定されるものではないが、パイロコッカスＮＡ２、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、パイロコッカス・ヤヤノシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｙａｙａｎｏｓｉｉ）、パイロコッカス・エンデボリ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｄｅａｖｏｒｉ）、パイロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）、パイロコッカス・ウォーセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）を含む。メタノコッカス属のメンバーは、限定されるものではないが、メタノコッカス・エオリカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノコッカス・バンニエリイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ）、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）およびメタノコックス・ジャナスシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）を含む。
【0044】
たとえば、ポリメラーゼはＶｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、９°ＮおよびＰｆｕポリメラーゼからなる群から選択することができる。いくつかの実施の形態では、ファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼはＰｆｕポリメラーゼである。Ｐｆｕポリメラーゼに関する追加情報は、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、および特許文献１０で得てもよい。株ＧＢ‐Ｄ株由来の「Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ」（Ｑ５１３３４）およびＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼなどのパイロコッカス株由来の他のポリメラーゼも使用してもよい。
【0045】
＜用語＞
本明細書で用いられる用語は、特定の実施の形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。定義された用語は、本開示の技術分野において一般に理解され認められている定義された用語の技術的および科学的意味に追加されるものである。
本明細書で用いられる用語は、特定の実施の形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。定義された用語は、本開示の技術分野において一般に理解され認められている定義された用語の技術的および科学的意味に追加されるものである。
【0046】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では、たとえばＷａｔｓｏｎ‐Ｃｒｉｃｋ塩基対形成相互作用に関与することができる天然に存在する２つの核酸と同様に、天然に存在する核酸と配列特異的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド、たとえばデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、または合成的に生成された化合物で構成されるたとえば約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１０００塩基超、約１０，０００塩基以上までの任意の長さのポリマーを説明するために、同義で使用される。天然に存在するヌクレオチドは、グアニン、シトシン、アデニン、チミンおよびウラシル（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、ＴおよびＵ）を含む。
【0047】
本明細書で定義される「ヌクレオシド」という用語は、１’位または等価な位置で、糖または糖代替物、たとえば炭素環式または非環式リンカーに連結されたプリン、デアザプリン、またはピリミジン塩基を含む化合物であり、２’‐デオキシおよび２’‐ヒドロキシル体、２’，３’‐ジデオキシ体、ならびに他の置換を含む。
【0048】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオシドポリリン酸」という用語は、２つ以上のリン酸基を有するヌクレオシドのリン酸エステルを指す。デオキシアデノシン三リン酸はヌクレオシドポリリン酸の例である。ヌクレオシドポリリン酸は、末端リン酸または内部リン酸に結合した化学基を含んでいてもよい。たとえば、ヌクレオシドポリリン酸は、ポリリン酸鎖の末端リン酸または内部リン酸に結合した電気化学的標識、質量タグ、電荷遮断標識、または発色標識、化学発光標識、蛍光色素、または蛍光消光標識を有する分子を含んでいてもよい。標識として使用してもよい化学基のさらなる例は、発色団、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、燐光基、放射性物質、散乱または蛍光ナノ粒子、ラマン信号発生部位および電気化学的検出部位を含む。さらに、本明細書で用いる場合、「ヌクレオシドポリリン酸」という用語は、リン酸鎖に硫黄原子、イミド基または他の修飾を含んでいてもよいヌクレオシドのリン酸エステルを指す。
【0049】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステルを指し、そのエステル化部位は、通常、五炭糖または糖代替物のＣ‐５位に結合したヒドロキシル基に対応する。場合によっては、ヌクレオチドはヌクレオシドポリリン酸を含む。しかしながら、「付加ヌクレオチド」、「組み込まれたヌクレオチド」、「付加されたヌクレオチド」および「組み込み後のヌクレオチド」という用語はすべて、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖の一部であるヌクレオチド残基を指す。
【0050】
「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「デオキシヌクレオシド」および「デオキシヌクレオチド」という用語は、公知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環式塩基も含む部分を含むことを意図している。このような修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環を含む。さらに、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「デオキシヌクレオシド」および「デオキシヌクレオチド」は、通常のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含む部分を含む。修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドまたはデオキシヌクレオチドは、糖部分の修飾、たとえば、１つまたは複数のヒドロキシル基がハロゲン原子または脂肪族基に置換されている修飾、またはエーテル、アミンなどとして官能化されている修飾も含む。
【0051】
天然に存在するヌクレオチドまたはヌクレオシドは、本明細書において、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）およびウリジン（Ｕ）として定義される。これらのヌクレオチドまたはヌクレオシドの特定の修飾が自然界に存在することは認識されている。しかしながら、水素結合による塩基対形成に影響を与える、自然界に存在するＡ、Ｔ、ＧおよびＣの修飾は天然には起こらないと考えられている。たとえば、２‐アミノアデノシンは自然界に見られるが、本明細書で用いられる用語としての「天然に存在する」ヌクレオチドまたはヌクレオシドではない。塩基対形成に影響を与えず、天然に存在すると考えられる自然界に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの他の非限定的な例は、５‐メチルシトシン、３‐メチルアデニン、Ｏ（６）‐メチルグアニンおよび８‐オキソグアニンなどである。ヌクレオチドは、天然に存在するものであれ合成のものであれ、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む。
【0052】
「相補的」、「相補鎖」または「相補的な核酸配列」という用語は、Ｗａｔｓｏｎ‐Ｃｒｉｃｋ塩基対形成則による別の核酸鎖の塩基配列に関連している核酸鎖を指す。一般に、一方の配列が、逆平行センス（ａｎｔｉ‐ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｎｓｅ）にある他方の配列にハイブリダイズすることができる場合、２つの配列は相補的であり、各配列の３’末端は、他方の配列の５’末端にハイブリダイズし、したがって１方の配列の各Ａ、Ｔ、ＧおよびＣは、それぞれ他の配列のＴ、Ａ、ＣおよびＧとアラインする。
【0053】
「二本鎖」という用語は、全部または一部が相補的な少なくとも２つの配列が、そのヌクレオチドのすべて、あるいはそのほとんどの間でＷａｔｓｏｎ‐Ｃｒｉｃｋ型塩基対形成が起こり、安定な複合体を形成することを意味する。「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、安定な二本鎖の形成を意味するために同義で使用される。
【0054】
「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリッド形成」という用語は、ヌクレオチド配列の文脈において本明細書では同義で使用される。２つのヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズする能力は、２つのヌクレオチド配列の相補性の程度に基づいており、一方それはマッチした相補的ヌクレオチド対の割合に基づいている。所与の配列において、他の配列に相補的なヌクレオチドが多ければ多いほど、ハイブリダイゼーションの条件はよりストリンジェントになり、２つの配列のハイブリダイゼーションはより特異的になる。ストリンジェンシーの上昇は、温度を高めること、共溶媒の比率を高めること、塩濃度を低くすることなどによって実現することができる。
【0055】
「プライミング鎖」という用語は、ヌクレオチドの組み込み部位として機能し、その３’末端から伸長することが可能な、酵素的に作製された核酸または合成核酸を意味する。いくつかの実施の形態では、プライミング鎖は、鋳型と二本鎖を形成するプライマーであり、鋳型に相補的なヌクレオチドの組み込みによって、鋳型に沿ってその３’末端から伸長され、伸長プロセス中に付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。いくつかの実施の形態では、プライミング鎖は、一塩基伸長反応、一塩基伸長アッセイ、または鋳型非依存性オリゴヌクレオチド合成のための組み込み部位として機能することが可能な核酸である。プライミング鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のいずれかによって触媒されるヌクレオチド組み込みの開始部位として機能する。プライミング鎖は、長さ２～１０００塩基以上であってもよく、たとえば１０～５００塩基であってもよい。
【0056】
「鋳型」という用語は、Ｗａｔｓｏｎ‐Ｃｒｉｃｋ塩基対形成則に従って鋳型に相補的な核酸分子の合成を指示するために核酸ポリメラーゼが使用することができる核酸分子を意味する。たとえば、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを利用して、鋳型ＤＮＡの鎖に相補的な配列を有する別のＤＮＡ分子を合成する。ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型としてＤＮＡを利用して、ＤＮＡ鋳型の鎖に相補的な配列を有するＲＮＡの合成を指示する。ＤＮＡ逆転写酵素は、ＲＮＡを利用して、ＲＮＡ鋳型の鎖に相補的な配列を有するＤＮＡの合成を指示する。
【0057】
「プライマー伸長条件」という語句は、鋳型として鋳型鎖を用いてプライマー分子の末端にヌクレオチドを付加することによってポリメラーゼ媒介プライマー伸長を可能にする条件を意味する。
【0058】
「一塩基伸長」という語句は、単一の可逆的ターミネーターヌクレオチドがプライミング鎖に組み込まれる手順を指す。本方法および組成物は、核酸に沿った特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するために用いることができる一塩基伸長アッセイに採用することができる。たとえば、一塩基伸長アッセイは、一塩基多型（ＳＮＰ）を同定するために、またはＤＮＡメチル化レベルを測定するために用いることができる。
【0059】
プライマーが特定の核酸鋳型「に対応する」か、または特定の核酸鋳型「用」である場合、そのプライマーはその核酸鋳型と塩基対を形成する（すなわち特異的にハイブリダイズする）。より詳細に以下で説明するように、特定の核酸鋳型用のプライマー、および特定の核酸鋳型またはその相補鎖は、通常、配列が同一である連続ヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含む。
【0060】
「ターミネーター」および「ターミネーターヌクレオチド」という用語は同義で使用され、ポリメラーゼによるヌクレオチド付加の基質として機能できないか、または伸長を阻害するヌクレオチドを指す。ジデオキシヌクレオチドである３’アジドヌクレオチドおよび３’アミノヌクレオチドはターミネーターヌクレオチドの例であるが、他の多くの例が公知である。他の非限定的な例は、３’‐リン酸標識ヌクレオチド、または仮想ターミネーターヌクレオチドを含む。
【0061】
「可逆的ターミネーター」という用語は、ヌクレオチド付加の基質として機能することができないことを、または伸長に対する阻害を回復させるように構成されているターミネーターヌクレオチドを指す。たとえば、可逆的ターミネーターは、そのヌクレオチドがポリメラーゼの基質として利用可能になるように除去することができるブロック部位を有していてもよい。場合によっては、ブロック部位はヌクレオチドの糖の３’‐ＯＨ位にあり、そのヌクレオチドは「３’‐ＯＨブロックヌクレオチド」と呼ばれ、このブロック部位の除去によって３’‐ＯＨが得られる。
【0062】
あるいは、可逆的ターミネーターによっては、糖の３’‐ＯＨ位にブロック部位を有さず、このようなターミネーターは、本明細書では３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターと呼ぶ。Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒは、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターの例であり、このヌクレオチドは、リボース部位の遊離３’‐ＯＨとプリン（Ｃ７）またはピリミジン（Ｃ５）塩基に結合した光分解性ブロック基とを特徴とする。図１Ａ、図１Ｅおよび図１Ｆは、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒの例を示す図である。いくつかの実施の形態では、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターは光分解性ブロック基を含む。これらの可逆的ターミネーターは、鎖に組み込むことができるが、期間中、伸長からブロックされる。ブロック解除後、これらの可逆的ターミネーターはプライマー伸長反応で伸長することができるようになる。光分解性ブロック基を含む３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターは、紫外線への暴露または他の光切断技術によって非ブロック化され、活性化されるまで、ＰＣＲ増幅に関して実質的に不活性である。特許文献１１、特許文献１２、および特許文献１３に記載されているような、様々な光分解性ブロック基を後段のプライマー（ｌａｔｅｒ ｓｔａｇｅ ｐｒｉｍｅｒ）に含むことができる。いくつかの実施の形態では、光分解性ブロック基は約９０％～約１００％のブロック効率を有する。
【0063】
光分解性ブロック基は、ＤＮＡ合成を可逆的にブロックして終結させ、次いで紫外線への暴露によって効率的に切断され、それによってプライマーを作動させるように設計される。いくつかの実施の形態では、光分解性ブロック基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル塩基、またはそれらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体、たとえば７‐ヒドロキシル‐７‐デアザ‐アデニン／グアニンなどを含むヌクレオチド化合物の形態である。他の実施の形態では、分解性基は、色素などのレポーターを含むように誘導体化することができる。いくつかの実施の形態では、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル塩基、またはそれらの修飾ピリミジンおよびプリン誘導体は、２‐ニトロベンジル基などの光分解性保護基に共有結合させることができる。いくつかの実施の形態では、２‐ニトロベンジル基は、ＤＮＡ合成の終結を促進するために誘導体化される。２‐ニトロベンジル基などの光分解性保護基も、いくつかの実施の形態では、光分解性保護基への共有結合によって蛍光色素で誘導体化することができる。
【0064】
いくつかの実施の形態では、光分解性ブロック基は、２‐ニトロベンジル基と共有結合したヌクレオシド塩基を含み、２‐ニトロベンジル基のα炭素位は、アルキル基またはアリール基の１つで置換されていてもよい。他の実施の形態では、２‐ニトロベンジル基は、終結特性、ブロック特性および光触媒による脱保護速度を促進するために官能化される。他の実施の形態では、塩基に結合した２‐ニトロベンジル基およびα炭素置換２‐ニトロベンジル基の終結特性およびブロック特性は、リボース糖の３’‐ＯＨ基がブロックされていない場合にも生じる。いくつかの実施の形態では、α炭素置換２‐ニトロベンジル基も、選択された蛍光色素または他のレポーターを含むように誘導体化することができる。
【0065】
「レポーター」という用語は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じることができる化学部分を指す。レポーターの例は、蛍光色素基、放射性標識、または化学発光もしくは生物発光手段によって信号を生成する基を含む。蛍光色素基の例は、キサンテン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ３５０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４０５、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４３０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４８８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５１４、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５３２、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５４６、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５５５、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５６８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５６８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５９４、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６１０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６３３、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６４７、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６６０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６８０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ７００、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ７５０、およびスクアライン染料を含む。レポーターとして使用してもよい放射性標識の例は、本発明のいくつかの実施の形態では、当分野で周知の３５Ｓ、３Ｈ、３２Ｐ、または３３Ｐなどである。
【0066】
「プライマー伸長試薬」という用語は、ポリヌクレオチド標的などのポリヌクレオチド分子にプライマー伸長反応（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など）を行うのに必要または適した任意の試薬を指す。プライマー伸長試薬は、一般に、プライマー、耐熱性ポリメラーゼまたは逆転写酵素、およびヌクレオチドを、トリス‐ＨＣｌまたは他の緩衝液などの適切な緩衝液との混合物中に含む。いくつかの実施の形態では、プライマー伸長試薬は、塩またはイオン、界面活性剤、有機溶媒、ポリマーおよび／または他の添加剤も含むことができる。たとえば、プライマー伸長試薬は、イオン（たとえば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋もしくはＫ＋）またはその塩、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、またはＮＰ４０などの界面活性剤、血清、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清タンパク質成分、グリセロール、マンニトールまたはソルビトールなどのポリオール、および／または還元剤（たとえば，ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））を含んでいてもよい。ｃＤＮＡ合成は、ＲＮＡ転写物の３’ポリＡテール（オリゴ（ｄＴ））、またはＲＮＡ内の複数の配列特異的部位（ランダマー、標的特異的プライマー）にアニーリングされたリバースプライマーによってプライミングされる。
【0067】
２つ以上のポリメラーゼを比較する文脈において、「機能的に等価」という用語は、ポリメラーゼにおいて、同じ機能的役割を有する他のポリメラーゼのアミノ酸位置に存在すると考えられるアミノ酸を含むポリメラーゼを意味する。例として、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼの位置４１２のチロシンからバリンへの変異（Ｙ４１２Ｖ）は、９°Ｎポリメラーゼの位置４０９のチロシンからバリンへの置換（Ｙ４０９Ｖ）と機能的に等価である。一般に、２つ以上の異なるポリメラーゼにおける機能的に等価な変異は、ポリメラーゼのアミノ酸配列の相同なアミノ酸位置に生じる。したがって、「機能的に等価」という用語の本明細書における使用は、変異したアミノ酸の特定の機能が知られているか否かにかかわらず、所与の変異に対して「位置的に等価」または「相同」な変異も含む。配列アラインメントおよび／または分子モデリングに基づいて２つ以上の異なるポリメラーゼのアミノ酸配列における位置的に等価なまたは相同なアミノ酸残基を同定することは可能である。
【0068】
「同一」または「同一性パーセント」という用語は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、適切な配列比較アルゴリズムの使用または目視検査による測定により比較して最大一致に関してアラインメントしたときに、同じであるか、または同じ指定された割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。
【0069】
２つの核酸またはポリペプチド（たとえば、ポリメラーゼをコードするＤＮＡ、またはポリメラーゼのアミノ酸配列）の文脈において、「実質的に同一な」という語句は、配列比較アルゴリズムの使用または目視検査による測定により比較して最大一致に関してアラインメントしたとき、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。このような「実質的に同一な」配列は、通常、実際の祖先を参照することなく、「相同」（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）であるとみなされる。好ましくは、「実質的同一性」は、少なくとも長さ約５０残基の配列の領域にわたって存在し、より好ましくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたって、または比較される２つの配列の全長にわたって実質的に同一である。
【0070】
ポリメラーゼおよび／またはアミノ酸配列などのポリペプチドは、それらが共通の祖先タンパク質またはタンパク質配列から天然または人工的に誘導された場合、「相同」である。同様に、ポリヌクレオチドおよび／または核酸配列は、共通の祖先核酸または核酸配列から天然または人工的に誘導された場合、相同である。相同性は、一般に、２つ以上の核酸またはタンパク質（またはその配列）間の配列類似性から推定される。相同性を確認するのに有用な配列間の類似性の正確な割合は、問題となっている核酸およびタンパク質によって異なるが、相同性を確認するために、５０、１００、１５０またはそれ以上の残基にわたるわずか２５％の配列類似性が日常的に使用されている。より高いレベルの配列類似性、たとえば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上もまた、相同性を確認するために使用することができる。配列類似性の割合を決定するための方法は容易に入手できる。配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアベースのインターフェースは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公開されている。
【0071】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、また、通常の意味に加えて、「実質的な」または「実質的に」という用語は、当業者に許容される限界または程度の範囲内であることを意味する。たとえば、「実質的にキャンセルされる」とは、当業者が、キャンセルが許容されると考えていることを意味する。
【0072】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、また、その通常の意味に加えて、「およそ」および「約」という用語は、当業者に許容される限界または量の範囲内であることを意味する。「約」という用語は、一般に、示された数値の±１５％を指す。たとえば、「約１０」は、８．５～１１．５の範囲を示す場合がある。たとえば、「ほぼ同じ」は、当業者が、比較される品目が同じであると考えることを意味する。
【0073】
本開示では、数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。化学構造および化学式は、例示の目的で引き延ばされたり拡大されたりすることがあることを認識すべきである。
【0074】
別途定義しない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本開示が属する分野で働く人々によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【0075】
本明細書で用いられる用語は、特定の実施の形態を説明するためだけのものであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。
【0076】
本明細書に開示されているように、多くの値の範囲が提供されている。文脈により明確に否定されない限りは、その範囲の上限と下限の間に、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されていることは理解されよう。
【0077】
別途定義しない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験に使用することができるが、次にいくつかの例示的な方法および材料を説明する。
【0078】
本明細書で参照されるすべての特許および刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。
【0079】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈により明確に否定されない限りは、単数および複数の両方の指示対象を含む。したがって、たとえば、「ある（ａ）部位」は、１つの部位と複数の部位を含む。
【0080】
＜使用方法および用途＞
本明細書に提示される変異体ポリメラーゼは、合成による配列決定（ＳＢＳ）技術などのポリヌクレオチド配列決定に用いることができる。簡潔に言えば、ＳＢＳは、相補ストランドの合成のための鋳型として標的核酸を用いることによって行うことができる。プライマーは鋳型に結合し、ＤＮＡポリメラーゼの活性によって１つまたは複数の標識ヌクレオチドで伸長される。一次鎖（すなわち、鋳型にハイブリダイズしたプライマー）は、鋳型として標的核酸を用いて伸長され、検出することができる標識ヌクレオチドを組み込む。任意選択で、標識ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、それ以上のプライマー伸長を終結させる可逆的ターミネーターにすることができる。たとえば、可逆的ターミネーターは、終結を回復させるために脱保護剤が送達されるまでその後の伸長が起こらないように、プライマーに付加することができる。したがって、可逆的ターミネーターを用いる実施の形態のために、（標識の検出を行う前または後に）脱保護試薬を配列決定装置に送達することができる。
本明細書に提示される変異体ポリメラーゼは、合成による配列決定（ＳＢＳ）技術などのポリヌクレオチド配列決定に用いることができる。簡潔に言えば、ＳＢＳは、相補ストランドの合成のための鋳型として標的核酸を用いることによって行うことができる。プライマーは鋳型に結合し、ＤＮＡポリメラーゼの活性によって１つまたは複数の標識ヌクレオチドで伸長される。一次鎖（すなわち、鋳型にハイブリダイズしたプライマー）は、鋳型として標的核酸を用いて伸長され、検出することができる標識ヌクレオチドを組み込む。任意選択で、標識ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、それ以上のプライマー伸長を終結させる可逆的ターミネーターにすることができる。たとえば、可逆的ターミネーターは、終結を回復させるために脱保護剤が送達されるまでその後の伸長が起こらないように、プライマーに付加することができる。したがって、可逆的ターミネーターを用いる実施の形態のために、（標識の検出を行う前または後に）脱保護試薬を配列決定装置に送達することができる。
【0081】
可逆的ターミネーター（たとえば、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）には、ＤＮＡ合成を終結させるだけでなく迅速に切断するように設計された光分解性ブロック基を有するものがある。Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒは、たとえば、鋳型にアニーリングされた鎖の一塩基伸長によって、あるいは末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）による、鋳型に依存しない一次鎖の一塩基伸長によって、一次鎖の３’末端に結合され、組み込まれる、
いくつかの実施の形態では、本変異体ポリメラーゼは、鋳型非依存性酵素的オリゴ合成（ＴｉＥＯＳ）に使用される。いくつかの実施の形態では、本方法は、プライミング鎖と、変異体ポリメラーゼ（Ｐｆｕ２６またはＰｆｕ４８など）および１つまたは複数の３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターとを接触させることを含む。本方法は、１サイクルあたり一塩基付加でプライミング鎖の３’末端を伸長させることを含むことができる。いくつかの実施の形態では、本変異体ポリメラーゼは、高い組み込み効率および終結効率で鋳型非依存的にプライミング鎖に可逆的ターミネーターを組み込む。
いくつかの実施の形態では、本変異体ポリメラーゼは、鋳型非依存性酵素的オリゴ合成（ＴｉＥＯＳ）に使用される。いくつかの実施の形態では、本方法は、プライミング鎖と、変異体ポリメラーゼ（Ｐｆｕ２６またはＰｆｕ４８など）および１つまたは複数の３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターとを接触させることを含む。本方法は、１サイクルあたり一塩基付加でプライミング鎖の３’末端を伸長させることを含むことができる。いくつかの実施の形態では、本変異体ポリメラーゼは、高い組み込み効率および終結効率で鋳型非依存的にプライミング鎖に可逆的ターミネーターを組み込む。
【0082】
＜変異体ポリメラーゼをコードする核酸＞
さらに、本明細書では、本明細書に提示される変異体ポリメラーゼ酵素をコードする核酸を提示する。本開示によって開示または教示される所与の変異体ポリメラーゼについて、分子生物学の公知の原理に従って変異体ポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。したがって、本開示は、変異体ポリメラーゼそれ自体だけでなく、変異体ポリメラーゼをコードする核酸に関する説明も提供する。
さらに、本明細書では、本明細書に提示される変異体ポリメラーゼ酵素をコードする核酸を提示する。本開示によって開示または教示される所与の変異体ポリメラーゼについて、分子生物学の公知の原理に従って変異体ポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。したがって、本開示は、変異体ポリメラーゼそれ自体だけでなく、変異体ポリメラーゼをコードする核酸に関する説明も提供する。
【0083】
本明細書に開示されている組換えポリメラーゼをコードする核酸もまた、本明細書に提示される実施の形態の特徴である。特定のアミノ酸は、複数のコドンによってコードすることができ、特定の翻訳系（たとえば原核細胞または真核細胞）は、しばしばコドンバイアスを示し、たとえば異なる生物は、しばしば、同じアミノ酸をコードするいくつかの同義コドンのうちの１つを好む。このように、本明細書に提示される核酸は任意で「コドン最適化」されており、これは、ポリメラーゼの発現に用いられる特定の翻訳系に好ましいコドンを含むように核酸が合成されることを意味する。たとえば、ポリメラーゼを細菌細胞（またはさらに特定の菌株）中で発現させることが望ましい場合、ポリメラーゼの効率的な発現のために、その細菌細胞のゲノムにおいて最も頻繁に検出されるコドンを含むように核酸を合成することができる。ポリメラーゼを真核細胞で発現することが望ましい場合、同様な戦略を用いることができ、たとえば、核酸は、その真核細胞が好むコドンを含むことができる。
【0084】
様々なタンパク質単離法および検出法が公知であり、たとえば、本明細書に提示される組換えポリメラーゼを発現する細胞の組換え培養物からポリメラーゼを単離するためにそれらを使用することができる。
【0085】
９°Ｎポリメラーゼをコードする野生型のヌクレオチド配列が公知であることを考慮すれば、標準的な遺伝コードを用いて、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する９°Ｎの所与の変異バージョンをコードするヌクレオチド配列を導き出すことが可能である。同様に、たとえばＶｅｎｔ、Ｐｆｕ、Ｔ．種ＪＤＦ‐３、Ｔａｑなどの他のポリメラーゼの変異バージョンについて、ヌクレオチド配列を容易に導き出すことができる。次いで、当技術分野で公知の標準的な分子生物学的技術を用いて、必要なヌクレオチド配列を有する核酸分子を構築してもよい。
【0086】
本明細書に提示される実施の形態によれば、定義された核酸は、同一の核酸だけでなく、特に、保存的アミノ酸置換における縮重コードによる同義コドン（同じアミノ酸残基を指定する異なるコドン）をもたらす場合の置換を含む任意のマイナーな塩基変異も含む。「核酸配列」という用語は、塩基変異に関して与えられた任意の一本鎖配列に対する相補配列も含む。
【0087】
本明細書に記載の核酸分子は、有利には、適切な宿主においてそれからコードされるポリメラーゼタンパク質を発現する、適切な発現ベクター中に含まれてもよい。その後の該細胞の形質転換およびその後の形質転換細胞の選択のための適切な発現ベクターへのクローン化ＤＮＡの組み込みは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）（その全体が参照により組み込まれる）に示されているように、当業者に周知である。
【0088】
このような発現ベクターは、該ＤＮＡ断片の発現をもたらすことが可能なプロモーター領域などの調節配列に作動可能に連結された、本明細書に提示される実施の形態による核酸を有するベクターを含む。「作動可能に連結された」という用語は、記載された成分が、意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。このようなベクターは、本明細書に提示される実施の形態によるタンパク質の発現を提供するために、適切な宿主細胞に形質転換されてもよい。
【0089】
核酸分子は、成熟タンパク質をコードしてもよいし、宿主細胞によって切断されて成熟タンパク質を形成するプレタンパク質のリーダー配列をコードする配列を含むプロ配列を有するタンパク質をコードしてもよい。ベクターは、たとえば、複製起点と、任意で該ヌクレオチドの発現のためのプロモーターと、任意でプロモーターのレギュレーターとを備えたプラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってもよい。ベクターは、たとえば抗生物質耐性遺伝子などの１つまたは複数の選択マーカーを含んでもよい。
【0090】
発現に必要な調節因子は、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、適切なレベルの転写開始を指示するプロモーター配列と、リボソーム結合のための翻訳開始配列とを含む。たとえば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーターと、翻訳開始のためのシャイン・ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧとを含んでいてもよい。同様に、真核発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの異種または相同プロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの解離のための終止コドンを含んでいてもよい。このようなベクターは、商業的に入手してもよく、また当分野で周知の方法で、記載された配列から組み立ててもよい。
【0091】
高等真核生物によるポリメラーゼをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を含めることによって最適化してもよい。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写レベルを増加させるＤＮＡのシス作用性エレメントである。ベクターは、一般に、選択マーカーに加えて複製起点も含む。
【0092】
本開示に照らして、本開示に従って様々な方法を実施することが可能である。さらに、様々な成分、材料、構造およびパラメータは、例として、かつ例としてのみ含まれ、いかなる限定的な意味においても含まれない。本開示に照らして、本開示は、他の用途において実施することができ、これらの用途を実施するための成分、材料、構造および装置は、添付の特許請求の範囲内に留まりながら決定することができる。
【0093】
＜実施例＞
実施例の一般的方法および条件
本実施例で使用される実験手順および条件を以下に一般的に述べる。
実施例の一般的方法および条件
本実施例で使用される実験手順および条件を以下に一般的に述べる。
【0094】
Ａ．変異体ポリメラーゼの作製および産生
このセクションでは、変異体遺伝子配列を作製して本変異体ポリメラーゼを作製し、変異体遺伝子を発現させて、以下の実施例で用いられる様々な変異体ポリメラーゼを得る方法について一般的に説明する。変異体ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｇｉｌｅｎｔ社製 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔの試薬およびプロトコルを用いて製造した。変異体プラスミドを配列決定し、次いで発現宿主ＢＬ２１‐Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に形質転換した。細胞を指数期（ＯＤ６００～０．４）まで増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。非特許文献９に記載されているように、熱処理した細菌溶解物および精製されたＰｆｕ変異体を調製した。
このセクションでは、変異体遺伝子配列を作製して本変異体ポリメラーゼを作製し、変異体遺伝子を発現させて、以下の実施例で用いられる様々な変異体ポリメラーゼを得る方法について一般的に説明する。変異体ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｇｉｌｅｎｔ社製 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔの試薬およびプロトコルを用いて製造した。変異体プラスミドを配列決定し、次いで発現宿主ＢＬ２１‐Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に形質転換した。細胞を指数期（ＯＤ６００～０．４）まで増殖させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。非特許文献９に記載されているように、熱処理した細菌溶解物および精製されたＰｆｕ変異体を調製した。
【0095】
Ｂ．変異体ポリメラーゼを用いた配列決定および配列決定メトリクス
このセクションでは、一般に、どのように本変異体ポリメラーゼを合成による配列決定に使用し、どのように配列決定における本変異体ポリメラーゼの性能を測定したかについて説明する。配列決定は、本質的に、非特許文献１０に説明されているように，ブレッドボード機器を使用して行われた。
このセクションでは、一般に、どのように本変異体ポリメラーゼを合成による配列決定に使用し、どのように配列決定における本変異体ポリメラーゼの性能を測定したかについて説明する。配列決定は、本質的に、非特許文献１０に説明されているように，ブレッドボード機器を使用して行われた。
【0096】
＜実施例１＞
本実施例では、３’‐ＯＨ非ブロックターミネーターを用いる配列決定能力を改善するために、配列番号１２のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ）に変異を導入した。サーモコッカス種９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼに対するこのような変異は、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７に開示されている。以下の表は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いた配列決定メトリクスの要約である。
本実施例では、３’‐ＯＨ非ブロックターミネーターを用いる配列決定能力を改善するために、配列番号１２のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ）に変異を導入した。サーモコッカス種９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼに対するこのような変異は、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７に開示されている。以下の表は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いた配列決定メトリクスの要約である。
【0097】
【表1】
【0098】
本実施例およびそれに続く実施例で用いる場合、「リード＋ラグ（Ｌｅａｄ＋Ｌａｇ）」とは、合成による配列決定技術における、現在の塩基シグナルに対して、次の塩基シグナルを読み取ること（リード（ｌｅａｄ））または前の塩基シグナルを読み取ること（ラグ（ｌａｇ））によって生じるデフェージング誤差（ｄｅｐｈａｓｉｎｇ ｅｒｒｏｒ）を指す。このような誤差は、ポリメラーゼによる可逆的ターミネーターの不完全なインコーポレーションによって生じる可能性がある。ポリメラーゼに対するこれらの変異は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ組み込みに関して、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒに対する平均読み取り長（ＡＲＬ）の増加が見られないという点で、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼによる配列決定性能の改善に効果がないことが判明した。これらの結果は、塩基修飾された可逆的ターミネーターの代替ポリメラーゼおよび／または変異の同定における困難さと予測不可能性を示している。
【0099】
＜実施例２＞
本実施例では、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒに存在する特定の変異（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８５Ｌ）を導入して変異体ポリメラーゼを作製した。この３つの変異は、ＪＤＦ３（サーモコッカス種ＪＤＦ３）およびＰｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼの等価位置に導入した。これらの新しい変異体ポリメラーゼは、次に、上記のようにＬｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いる配列決定においてそれらの性能を評価した。表２は、配列決定メトリクスに対する自然変異の影響を示す結果の要約である。得られたＡＲＬはＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒと比較して２０ｂｐを超えて低く、異なるポリメラーゼ間の変位が、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを用いる配列決定に大きな影響を与える可能性があることを示している。
本実施例では、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒに存在する特定の変異（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８５Ｌ）を導入して変異体ポリメラーゼを作製した。この３つの変異は、ＪＤＦ３（サーモコッカス種ＪＤＦ３）およびＰｆｕ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼの等価位置に導入した。これらの新しい変異体ポリメラーゼは、次に、上記のようにＬｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いる配列決定においてそれらの性能を評価した。表２は、配列決定メトリクスに対する自然変異の影響を示す結果の要約である。得られたＡＲＬはＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒと比較して２０ｂｐを超えて低く、異なるポリメラーゼ間の変位が、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを用いる配列決定に大きな影響を与える可能性があることを示している。
【0100】
さらに、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを用いる配列決定に影響する９°Ｎ、ＪＤＦ３、およびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ間のアミノ酸の違いを同定するために、一連のキメラポリメラーゼおよび単一点変異体を構築した。以下の表は、これらのポリメラーゼに加えた変異と、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いた配列決定で得られた配列決定メトリクスを示す。配列決定における変異体ポリメラーゼの評価結果も図２に示す。
【0101】
【表2】
【0102】
これら３つのポリメラーゼの４９４および５４６（Ｐｆｕのナンバリング）における自然変異は、配列決定メトリクスに大きな影響を有することが判明した。フェニルアラニン（Ｆ；９°ＮおよびＰｆｕに天然に存在する）をＰｆｕの４９４と等価な位置にＪＤＦ３に導入すると、ＡＲＬは１７ｂｐ改善した（ＪＤＦ３ Ａ４８５Ｌ／Ｙ４９３Ｆ；実験番号２‐３）。ヒスチジン（Ｈ；９°ＮおよびＪＤＦ３に天然に存在する）をＰｆｕのコドン５４６に導入すると、さらに大きな改善が示された（実験番号２‐５）。実際、Ｐｆｕ Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈ（実験番号２‐５）を用いた配列決定メトリクスは、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒとほぼ同じであったが、Ｐｆｕ Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈは、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒと比較して、リーディング値（ｌｅａｄｉｎｇ ｖａｌｕｅ）が低く、ラギング値（ｌａｇｇｉｎｇ ｖａｌｕｅ）が高かった（下表に示す）。
【0103】
＜実施例３＞
本実施例では、古細菌ポリメラーゼについて同定された様々な変異を加えることによって、Ｐｆｕポリメラーゼから変異体ＤＮＡポリメラーゼを誘導した。変異は、研究文献および特許文献に記載されている変異から選択した（以下に示す）。変異は、変異Ａ４８６ＬおよびＹ５４６Ｈも持つＰｆｕポリメラーゼに導入した。変異は、様々なポリメラーゼについてそのような変異が議論されている文献とともに以下の表に示す。
本実施例では、古細菌ポリメラーゼについて同定された様々な変異を加えることによって、Ｐｆｕポリメラーゼから変異体ＤＮＡポリメラーゼを誘導した。変異は、研究文献および特許文献に記載されている変異から選択した（以下に示す）。変異は、変異Ａ４８６ＬおよびＹ５４６Ｈも持つＰｆｕポリメラーゼに導入した。変異は、様々なポリメラーゼについてそのような変異が議論されている文献とともに以下の表に示す。
【0104】
【表3】
【0105】
変異体ポリメラーゼは、上記のように配列決定に用いた。Ｐｆｕポリメラーゼに付加されたこれらの変異のうちで、Ｋ４７７Ｗのみが配列メトリクスに大きな影響を与え、特に全長リードの割合が高くなった（実験番号２‐６）。この変異体（Ｐｆｕ Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ｋ４７７Ｗ／Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈ）には、Ｐｆｕ１０という任意の名称が付けられた。Ｐｆｕ１０のアミノ酸配列を配列番号２に示す。本実施例は、Ｐｆｕ１０が、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを用いる合成による配列決定に使用するための改善された配列決定酵素であることを示している。
【0106】
【表4】
【0107】
本実施例および他の実施例で用いる場合、「ＦｒａｃＱ３０」は、全配列決定リード中のＱスコア３０（Ｑ３０）を有する配列決定塩基リードの割合を指す。Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒの等価な変異は、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒが、Ｐｆｕ１０の位置４８６、４９４、および５４６と等価な位置にそれぞれＬ、Ｆ、およびＨを含むにもかかわらず、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒによる配列決定（実験番号１‐８；Ｋ４７６Ｗ参照）を改善することができなかったため、Ｋ４７７ＷがＰｆｕを改善するという発見は予想外であった。これらの結果は、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターでは、Ｋ４７７Ｗの利点は、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒよりもＰｆｕに近縁な配列決定ポリメラーゼによって実現される可能性があることを示唆している。ＢＬＡＳＴＰアラインメントは、Ｐｆｕ１０と９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒの親）とのアミノ酸配列同一性パーセントは７９．９％であることを示している。
【0108】
＜実施例４＞
本実施例では、許容される同一性の減少の程度を調べ、Ｌ４８６、Ｆ４９４、Ｈ５４６、およびＷ４７７を含む他の変異体Ｐｆｕポリメラーゼを同定するために、複数部位変異誘発によってＰｆｕ１０に、またはドメイン置換によってＰｆｕ Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈに、様々な変異を導入した。配列番号３は、古細菌ＤＮＡポリメラーゼに現れる１５の保存的変異に加え、潜在的翻訳開始部位を除去するＭ１２９Ａ置換を有するＰｆｕ１０変異株（「ＰＦＵ１０‐Ｎ１２」と呼ぶ）のアミノ酸配列を示す（Ｐｆｕ１０に対する９７．９％の同一性）。Ｐｆｕ１０およびＰｆｕ１０‐Ｎ１２は、上記のように、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いた配列決定における性能について評価された。
本実施例では、許容される同一性の減少の程度を調べ、Ｌ４８６、Ｆ４９４、Ｈ５４６、およびＷ４７７を含む他の変異体Ｐｆｕポリメラーゼを同定するために、複数部位変異誘発によってＰｆｕ１０に、またはドメイン置換によってＰｆｕ Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈに、様々な変異を導入した。配列番号３は、古細菌ＤＮＡポリメラーゼに現れる１５の保存的変異に加え、潜在的翻訳開始部位を除去するＭ１２９Ａ置換を有するＰｆｕ１０変異株（「ＰＦＵ１０‐Ｎ１２」と呼ぶ）のアミノ酸配列を示す（Ｐｆｕ１０に対する９７．９％の同一性）。Ｐｆｕ１０およびＰｆｕ１０‐Ｎ１２は、上記のように、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いた配列決定における性能について評価された。
【0109】
以下の表は、Ｐｆｕ１０変異株の配列決定性能を示す結果の要約である。この変異株（Ｐｆｕ１０‐Ｎ１２）は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いた配列決定において、Ｐｆｕ１０よりわずかによいか、わずかによいとまではいかなくとも同等の性能を示した。
【0110】
【表5】
【0111】
さらに、任意のドメイン置換を使用して、所望の活性レベルを維持しながら多様性を高めることができる。配列決定メトリクスに対するドメイン置換の影響を図２に示す。たとえば、Ｐｆｕ Ｌ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈのアミノ酸セグメント１～９９、１００～１９９、４００～４４９、および５００～５９９をＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒの対応するポリペプチド配列で置換した場合、配列決定メトリクスに対する影響は最小限であり、これは、Ｐｆｕ１０が、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターを組み込む能力を損なうことなく、少なくとも１６～２９のさらなる変異（９６．３～９７．９％の変位）を受け入れることができることを示している。
【0112】
＜実施例５＞
本実施例では、Ｐｆｕ Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの位置４８６および４９４における飽和変異誘発を用いてさらなる変異体ポリメラーゼを作製した。Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ‐Ａ（ＬＴＡ）を用いるプレートベースの一塩基伸長アッセイで細菌抽出物をスクリーニングした。最も高い蛍光シグナルを発する陽性クローンを配列決定し、アミノ酸置換を同定した。
本実施例では、Ｐｆｕ Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの位置４８６および４９４における飽和変異誘発を用いてさらなる変異体ポリメラーゼを作製した。Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ‐Ａ（ＬＴＡ）を用いるプレートベースの一塩基伸長アッセイで細菌抽出物をスクリーニングした。最も高い蛍光シグナルを発する陽性クローンを配列決定し、アミノ酸置換を同定した。
【0113】
図３および図４に示すように、Ａ４８６およびＦ４９４は非常に変異しやすく、Ａ４８６Ｆ、Ａ４８６Ｙ、Ａ４８６Ｎ、Ａ４８６Ｒ、Ａ４８６Ｈ、Ｆ４９４Ｃ、Ｆ４９４Ｉ、Ｆ４９４Ｎ、およびＦ４９４Ｔを含む複数の置換が、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒの組み込みを改善した。スクリーニング結果に基づいて選択された溶解物が配列決定に供され、選択に基づいてアミノ酸の同定が行なわれた。
【0114】
図３は、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６の飽和を示す。縮重ＮＤＴコドンプライマーとともにＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットを用いてＰｆｕ Ａ４８６変異体のライブラリーを作成した。ＮＤＴコドンは、第１位置にＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ、第２位置にＡ、Ｇ、またはＴ、第３位置にＴを含み、それによってプライマーに変動性を導入する。可能性のある１２個のＮＤＴコドンは、１２個のアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙ）を表す。無作為に選択された３２のコロニーから加熱清澄抽出物を調製した。抽出物は、固定化ｄｓＤＮＡ基質を用いたマイクロタイタープレートアッセイでＬＴＡの組み込みについてスクリーニングした。「Ａ」変異体の蛍光シグナルは、野生型Ｐｆｕ（コドン４８６の野生型アラニン）のバックグラウンドに相当する。
【0115】
図４Ａおよび図４Ｂは、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４９４の飽和を示す。２プールの縮重コドンプライマー（Ａ、Ｂ）とともにＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットを用いて、Ｐｆｕ Ｆ４９４変異体のライブラリーを作成した。無作為に選択された３２のコロニーから加熱清澄抽出物を調製した。抽出物は、固定化ＤＮＡ基質を用いたマイクロタイタープレートアッセイでＬＴＡの組み込みについてスクリーニングした。「Ｆ」変異体の蛍光シグナルは、野生型Ｐｆｕ（位置４９４の野生型フェニルアラニン）のバックグラウンドに相当する。
【0116】
＜実施例６＞
本実施例では、さらなる変異体ポリメラーゼをＰｆｕポリメラーゼから誘導した。変異体を作製するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、および「ＮＤＴ」コドンを含むオリゴヌクレオチドを用いてＰｆｕ ｐｏｌ Ｂ遺伝子の８７個のコドンを飽和させ、等しい頻度でＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、およびＶ置換を作製した。場合によっては、ＮＤＴライブラリーから欠落した変異体を、残りの変異（Ａ、Ｔ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｗ）をコードする変異原性オリゴの等モル混合物を用いて、別のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応で調製した。各ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅライブラリー（生成した形質転換細胞がより少なかったＴ２６７、Ｙ４０３、Ｙ４１０、Ｉ４７５、Ｇ４９９およびＫ６７５ライブラリー以外）から３２個のクローンを無作為に選択した。細菌溶解物を調製し、固定化プライマー‐鋳型を用いたプレートベースアッセイを用いてＬＴＡおよびＬＴＣの組み込みについてスクリーニングした。限られた数の変異体を、ＬＴＧおよびＬＴＵの利用についてもスクリーニングした（同様な傾向；データは示さず）。洗浄し、ＵＶ切断（色素の消光効果を最小限に抑えるため）した後、プレートを読み取り、蛍光シグナルをＰｆｕ対照と比較した。以下の表は、対照となった４つの変異体Ｐｆｕポリメラーゼを同定したものであり、Ｐｆｕ１０（上記）とともに、Ｐｆｕ５、Ｐｆｕ１、およびＰｆｕ２という任意の名称が与えられた。
本実施例では、さらなる変異体ポリメラーゼをＰｆｕポリメラーゼから誘導した。変異体を作製するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、および「ＮＤＴ」コドンを含むオリゴヌクレオチドを用いてＰｆｕ ｐｏｌ Ｂ遺伝子の８７個のコドンを飽和させ、等しい頻度でＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、およびＶ置換を作製した。場合によっては、ＮＤＴライブラリーから欠落した変異体を、残りの変異（Ａ、Ｔ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｗ）をコードする変異原性オリゴの等モル混合物を用いて、別のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応で調製した。各ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅライブラリー（生成した形質転換細胞がより少なかったＴ２６７、Ｙ４０３、Ｙ４１０、Ｉ４７５、Ｇ４９９およびＫ６７５ライブラリー以外）から３２個のクローンを無作為に選択した。細菌溶解物を調製し、固定化プライマー‐鋳型を用いたプレートベースアッセイを用いてＬＴＡおよびＬＴＣの組み込みについてスクリーニングした。限られた数の変異体を、ＬＴＧおよびＬＴＵの利用についてもスクリーニングした（同様な傾向；データは示さず）。洗浄し、ＵＶ切断（色素の消光効果を最小限に抑えるため）した後、プレートを読み取り、蛍光シグナルをＰｆｕ対照と比較した。以下の表は、対照となった４つの変異体Ｐｆｕポリメラーゼを同定したものであり、Ｐｆｕ１０（上記）とともに、Ｐｆｕ５、Ｐｆｕ１、およびＰｆｕ２という任意の名称が与えられた。
【0117】
【表6】
【0118】
スクリーニング結果に基づいて選択された溶解物を配列決定に供し、選択に基づいてアミノ酸同定を行った。対照抽出物は天然ヌクレオチドで同様な活性（Ｕ／ｕｌ）を示すが（図５）、Ａ４８６Ｌを含む変異体ポリメラーゼ（Ｐｆｕ１、Ｐｆｕ２、Ｐｆｕ１０）のみがＬｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを利用することができた（図６）。Ｙ５４６Ｈ単独では、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒの組み込みができない（図７Ａ～図７Ｂ）。しかしながら、Ａ４８６ＬとＹ５４６Ｈとの組み合わせ（Ｐｆｕ２およびＰｆｕ１０における）は、ＬＴＣの組み込みを最大化することが見出され（図６）、これによって、チロシンをヒスチジンに置換することで克服できる、ＬＴＣとＹ５４６との間の好ましくない相互作用が示唆された。実施例３に示すように、Ｋ４７７Ｗは、全長リードの割合を増加させることによって配列決定に役立つ。しかしながら、（Ｐｆｕ１０における）Ｋ４７７Ｗは、ＬＴＡおよびＬＴＵの組み込みに悪影響があるため、あるいは結合されたフルオロフォアのトリプトファン（Ｗ）消光に起因する最終的な蛍光に対する悪影響があるため、この機構は組み込み効率とは無関係とみられる。
【0119】
以下のコドンが飽和の対象となった：２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、３２９、３３０、３３２、３３３、３３６、３９９、４００、４０３、４０４、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４５０、４５１、４５２、４５３、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５１５、５２２、５４５、５４６、５７７、５７９、５８０、５８１、５８２、５８４、５９１、５９５、６０３、６０６、６０７、６０８、６１２、６１３、６１４、６６４、６６５、６６６、６６８、６６９、６７４、６７５、６７６。スクリーニングした８７の位置のうち１６を、ＬＴＡおよび／またはＬＴＣの組み込みにおいて有意な（野生型Ｐｆｕの４倍を超える）改善をもたらすように変異させることができた。以下の表は、ＬＴＡおよびＬＴＣの組み込みを改善する変異を示す。４つの位置（Ｌ４０９、Ａ４８６、Ｆ４９４、Ｙ４９７）は高度に置換可能であり、特定のアミノ酸置換（Ｌ４０９Ｈ、Ｌ４０９Ｆ、Ａ４８６Ｙ、Ａ４８６Ｒ、Ａ４８６Ｈ、Ａ４８６Ｎ、Ｆ４９４Ｃ、Ｆ４９４Ｎ、Ｆ４９４Ｉ、Ｆ４９４Ｔ）は、Ｐｆｕ Ａ４８６Ｌ対照（Ｐｆｕ１０）と比較して高い組み込みシグナルを生じる。
【0120】
【表7】
【0121】
Ｎ４９２の変位（Ｎ４９２Ｉ／Ｖ／Ｐ）は、ＬＴＣ組み込みのみに利点があることが観察された。さらに、Ｌ４０９（Ｌ４０９Ｄ／Ｃ／Ｖ／Ｈ／Ｆ）、Ａ４８６（Ａ４８６Ｙ／Ｒ／Ｆ／Ｉ／Ｈ／Ｎ）、およびＹ４９７（Ｙ４９７Ｈ／Ｉ）における特定の置換は、ＬＴＡよりもＬＴＣの組み込みに大きな影響を与えるとみられる。これらの結果は、Ｙ５４６およびＮ４９２（ヌクレオチドの三リン酸部分と水素結合を形成する）における置換が、結合ポケットにおけるＬＴＣの向きを、そのユニークな塩基、リンカー、および／または色素部分をよりよく収容するように変化させることを示唆する。
【0122】
図８は、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（５ＯＭＶ）構造における有益な変異の位置を、ｉＣｎ３Ｄウェブベースの構造ビューアを使用して可視化して示す。ＬＴＣのみに利点をもたらす変異は、Ｎ４９２およびＹ５４６に位置する。ＬＴＡよりもＬＴＣを比較的多く組み込む変異は、Ｌ４０９、Ａ４８６およびＹ４９７に位置する。
【0123】
＜実施例７＞
本実施例は、鋳型非依存性酵素的オリゴヌクレオチド合成における本変異体Ｐｆｕポリメラーゼの実施の形態の性能を評価する。本実施例では、ポリメラーゼＴｄＴとＰｆｕ２６（Ｐｆｕ１０＋Ｌ４０９Ｙ）（配列番号４）とＰｆｕ４８（Ａ４８６Ｌの代わりにＡ４８６Ｒを有するＰｆｕ２６）（配列番号５）とを、鋳型非依存性ＤＮＡ合成アッセイで比較した。このアッセイは、ｄＡＴＰ（図１Ｄ）、ＬＴＡ‐１（図１Ｅ）、またはＬＴＡ‐２（図１Ｆ）を用いて実施した。ＬＴＡ‐１およびＬＴＡ‐２は、分子に結合された任意の色素または他のレポーターを含んでいなかった。
本実施例は、鋳型非依存性酵素的オリゴヌクレオチド合成における本変異体Ｐｆｕポリメラーゼの実施の形態の性能を評価する。本実施例では、ポリメラーゼＴｄＴとＰｆｕ２６（Ｐｆｕ１０＋Ｌ４０９Ｙ）（配列番号４）とＰｆｕ４８（Ａ４８６Ｌの代わりにＡ４８６Ｒを有するＰｆｕ２６）（配列番号５）とを、鋳型非依存性ＤＮＡ合成アッセイで比較した。このアッセイは、ｄＡＴＰ（図１Ｄ）、ＬＴＡ‐１（図１Ｅ）、またはＬＴＡ‐２（図１Ｆ）を用いて実施した。ＬＴＡ‐１およびＬＴＡ‐２は、分子に結合された任意の色素または他のレポーターを含んでいなかった。
【0124】
鋳型非依存性ＤＮＡ合成反応は、７．５ＵのＴｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、または１８０ｎＭの（プライマーの３倍を超える）Ｐｆｕ２６（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈ／Ｋ４７７Ｗ／Ｌ４０９Ｙ）またはＰｆｕ４８（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８６Ｒ／Ｙ５４６Ｈ／Ｋ４７７Ｗ／Ｌ４０９Ｙ）を用いた。ＣｏＣｌ２を含む１倍のＴｄＴ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）または１倍のＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ社）を含む２連の反応物中の２μＭ（ＴｄＴ）または６０ｎＭ（Ｐｆｕ）Ｔ７ ＦＯＲプライマー（６’Ｆａｍ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）（配列番号６）に様々な濃度のｄＡＴＰを添加した。反応物を３７℃（ＴｄＴ）または６０℃（Ｐｆｕ）で３０分インキュベートし、次いで加熱（ＴｄＴ；７０℃１０分）またはＥＤＴＡ（５００ｕＭ ＥＤＴＡ １ｕｌ）で不活化した。反応生成物は、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（１５ワット電球、３６５ｎＭ、１０分）を用いてＵＶ照射した。反応物を水で希釈し（ＴｄＴ、１：３３３；Ｐｆｕ、１：１０）、１μｌ（ＴｄＴ）または０．５μｌ（Ｐｆｕ）のアリコートをＨｉＤＩ／ＬＩＺ １２０ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄで１０μｌにした。生成物を９５℃で５分加熱し、氷で２分冷やし、次いでＡＢＩ ３５００キャピラリー電気泳動システム（５０ｃＭキャピラリー、フィルターセット＃５、アッセイ＝ＧＥ５ ＬＩＺ１２０）で分析した。
【0125】
ターミナルトランスフェラーゼ活性は、鋳型非依存性ｄＡＴＰ付加の数によって測定した。結果は、ＴｄＴについて図９Ａ、Ｐｆｕ２６について図９Ｂ、Ｐｆｕ４８について図９Ｃに示す。ターミナルトランスフェラーゼ活性は、ｄＡＴＰまたはプライマー濃度の関数としてそれぞれ増加または減少することが見出された。これらの結果は、Ｌ４０９Ｙを欠くＰｆｕ変異体（たとえばＰｆｕ１０）が非鋳型ｄＡ付加を行うことができないことから、Ｌ４０９Ｙ変異はターミナルトランスフェラーゼ活性を与えることを示している（以下の図１０Ｃ参照）。
【0126】
＜実施例８＞
本実施例では、実施例７に記載されている条件を用い、α‐チオ三リン酸のＲｐ＋Ｓｐラセミ混合物としてＬＴＡ‐２（図１Ｆ）を用いてプライマー伸長法を行った。図１０Ａは、４つの異なる濃度のＬＴＡ‐２（５μＭ、１０μＭ、５０μＭ、および１００μＭ）での結果を示す。図９Ａと図１０Ａとの比較は、最も高い１００μＭの濃度でも、ＴｄＴはｄＡＴＰほど効率的にＬＴＡ‐２ターミネーターを組み込まなかったことを示している。
本実施例では、実施例７に記載されている条件を用い、α‐チオ三リン酸のＲｐ＋Ｓｐラセミ混合物としてＬＴＡ‐２（図１Ｆ）を用いてプライマー伸長法を行った。図１０Ａは、４つの異なる濃度のＬＴＡ‐２（５μＭ、１０μＭ、５０μＭ、および１００μＭ）での結果を示す。図９Ａと図１０Ａとの比較は、最も高い１００μＭの濃度でも、ＴｄＴはｄＡＴＰほど効率的にＬＴＡ‐２ターミネーターを組み込まなかったことを示している。
【0127】
さらなる実験では、２つの一本鎖オリゴヌクレオチドの等モル混合物（各３ｕＭ）を用いて、一塩基伸長反応（１０ｕｌ）を行った：
ＣＥ２：６Ｆａｍ‐ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＣ（配列番号７）
Ｔ７：６Ｆａｍ‐ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号８）
どちらもＦａｍで標識されていたが、キャピラリー電気泳動によってその長さで区別できた。プライマー伸長反応は、１８ｎＭのポリメラーゼ濃度で、以下の３つのＰｆｕ変異体を用いて行った：
Ｐｆｕ１０：Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈ／Ｋ４７７Ｗ変異を有するＰｆｕポリメラーゼ（配列番号２）
Ｐｆｕ２６：Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈ／Ｋ４７７Ｗ／Ｌ４０９Ｙ変異を有するＰｆｕポリメラーゼ（配列番号４）
Ｐｆｕ４８：Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８６Ｒ／Ｙ５４６Ｈ／Ｋ４７７Ｗ／Ｌ４０９Ｙ変異を有するＰｆｕポリメラーゼ（配列番号５）
伸長反応はまた、Ｒｐ＋Ｓｐラセミ混合物中の個々のαＳ修飾ＬＴ（すなわちＬＴＡ‐２、ＬＴＵ‐２、ＬＴＧ‐２およびＬＴＣ‐２）を最終濃度５ｕＭで用いた。ＬＴＵ‐２、ＬＴＧ‐２およびＬＴＣ‐２は、すべて、アデニンの代わりにウラシル、グアニンおよびシトシンを持つ、ＬＴＡ‐２と同様なＣ７またはＣ５‐ヒドロキシメチル‐α‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐ニトロベンジル修飾可逆的ターミネーターである。これらの実験では、可逆的ターミネーターは色素を含まなかった。反応物をインキュベートし、停止し、ＵＶ処理し、実施例７に説明されているように分析した。
ＣＥ２：６Ｆａｍ‐ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＣ（配列番号７）
Ｔ７：６Ｆａｍ‐ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号８）
どちらもＦａｍで標識されていたが、キャピラリー電気泳動によってその長さで区別できた。プライマー伸長反応は、１８ｎＭのポリメラーゼ濃度で、以下の３つのＰｆｕ変異体を用いて行った：
Ｐｆｕ１０：Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈ／Ｋ４７７Ｗ変異を有するＰｆｕポリメラーゼ（配列番号２）
Ｐｆｕ２６：Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８６Ｌ／Ｙ５４６Ｈ／Ｋ４７７Ｗ／Ｌ４０９Ｙ変異を有するＰｆｕポリメラーゼ（配列番号４）
Ｐｆｕ４８：Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ａ４８６Ｒ／Ｙ５４６Ｈ／Ｋ４７７Ｗ／Ｌ４０９Ｙ変異を有するＰｆｕポリメラーゼ（配列番号５）
伸長反応はまた、Ｒｐ＋Ｓｐラセミ混合物中の個々のαＳ修飾ＬＴ（すなわちＬＴＡ‐２、ＬＴＵ‐２、ＬＴＧ‐２およびＬＴＣ‐２）を最終濃度５ｕＭで用いた。ＬＴＵ‐２、ＬＴＧ‐２およびＬＴＣ‐２は、すべて、アデニンの代わりにウラシル、グアニンおよびシトシンを持つ、ＬＴＡ‐２と同様なＣ７またはＣ５‐ヒドロキシメチル‐α‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐ニトロベンジル修飾可逆的ターミネーターである。これらの実験では、可逆的ターミネーターは色素を含まなかった。反応物をインキュベートし、停止し、ＵＶ処理し、実施例７に説明されているように分析した。
【0128】
図１０Ｂは、ポリメラーゼを含まない対照伸長反応をセットアップした結果を示す。図１０Ｃは、Ｐｆｕ１０ポリメラーゼを用いた場合の伸長反応の結果を示し、図１０Ｄおよび１０Ｅは、それぞれＰｆｕ２６ポリメラーゼおよびＰｆｕ４８ポリメラーゼを用いた結果を示す。図１０Ａと、図１０Ｃから図１０Ｅまでの図との比較では、Ｌ４０９Ｙを含むＰｆｕ変異体（Ｐｆｕ２６、Ｐｆｕ４８）は、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターＬＴＡ‐２、ＬＴＵ‐２、ＬＴＧ‐２およびＬＴＣ‐２の組み込みにおいて、子牛胸腺ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）より優れていることを示している。さらに、予備データは、プライマー伸長効率が、プライマー配列（ＣＥ２＞Ｐ７）および塩基（ＬＴＡ、ＬＴＵ＞ＬＴＧ＞ＬＴＣ）の影響を受けることを示している。
【0129】
Ｐｆｕ２６は、特定のオリゴヌクレオチドを直接に末端標識するために使用することもでき（たとえば、特許文献１８に開示されているようなｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用途のため）、これにより５’オーバーハングを有する相補的鋳型の使用（およびその後の除去）が回避される。
【0130】
＜実施例９＞
本実施例では、一本鎖プライミング鎖の３’末端への３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーター（図１Ｅに示すＬＴＡ‐１または図１Ｆに示すＬＴＡ‐２）の付加を試験した。２ｕＭまたは８０ｎＭのプライミング鎖および様々な濃度（１００／５０／１０／５／１μＭ）の可逆的ターミネーターを用いて伸長反応を行った。Ｐｆｕ２６ポリメラーゼの性能をＴｄＴポリメラーゼと比較した。
本実施例では、一本鎖プライミング鎖の３’末端への３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーター（図１Ｅに示すＬＴＡ‐１または図１Ｆに示すＬＴＡ‐２）の付加を試験した。２ｕＭまたは８０ｎＭのプライミング鎖および様々な濃度（１００／５０／１０／５／１μＭ）の可逆的ターミネーターを用いて伸長反応を行った。Ｐｆｕ２６ポリメラーゼの性能をＴｄＴポリメラーゼと比較した。
【0131】
プライマー伸長法は、７．５Ｕの子牛胸腺ＴｄＴ、１倍のＰｒｏｍｅｇａ社のＴｄＴ緩衝液（ＣｏＣｌ２を含む）、様々な濃度のＬＴＡ‐１（１００ｕＭ、５０ｕＭ、１０ｕＭ、５ｕＭ、または１ｕＭ）、および２ｕＭ（図１１Ａ～図１１Ｃ）または８０ｎＭ（図１１Ｄ～図１１Ｆ）のいずれかのプライミング鎖（Ｆａｍ標識Ｔ７ Ｆプライマー（６Ｆａｍ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）、配列番号８）を含む２５ｕｌの２連の反応物中で行った。対照は、ポリメラーゼを加えずに行った。プライマー伸長法は、Ｐｆｕ２６変異体ポリメラーゼ、６０ｎＭのプライミング鎖、および様々な濃度（１０μＭまたは５μＭまたは１μＭ）のＬＴＡ‐１またはＬＴＡ‐２を含む反応物中でも行った。
【0132】
反応物を３７℃で３０分インキュベートし、次いで７０℃で１０分、加熱死滅させた。反応生成物を半分に分け、２分の１を、実施例７に説明されているようにＵＶで処理した。次いで反応物を水で１：３３３（２ｕＭのプライマー）または１：１３（８０ｎＭのプライマー）に希釈し、０．５ｕｌ分を、実施例７で示した条件を用いてキャピラリー電気泳動で分析した。
【0133】
【0134】
ＴｉＥＯＳに「無傷の」ＬＴを使用する可能性は、「チューバック（ｃｈｅｗｂａｃｋ）活性」を除去して切断／終結効率をそれぞれ改善するためにＮＧＳに利用される２‐ニトロベンジル部分のα‐チオ三リン酸およびα‐ｔｅｒｔ‐ブチル修飾を欠く原型可逆的ターミネーターであるＬＴＡ‐１を用いて実証された。図１１Ａ～１１Ｃに示すように、ＴｄＴは、より高度に置換されたＬＴＡ‐２（図１０Ａ）よりもさらに効率的にＬＴＡ‐１を組み込む。しかしながら、終結効率は悪く、１回の合成サイクルで３塩基（２ｕＭのプライマーで）またはそれ以上（８０ｎＭのプライマーで）が組み込まれる。
【0135】
ＴｄＴと比較して、Ｐｆｕ２６は、１、５、および１０ｕＭの濃度で付加された塩基の数に基づいて、ＬＴＡ‐１の組み込みは効率がよくないとみられる（図１１Ｄ～図１１Ｆ 対 図１２Ａ）。しかしながら、ＬＴＡ‐２を組み込むことができなかったＴｄＴとは異なり、Ｐｆｕ２６は、１回のインキュベーションステップで効率的な組み込みおよび終結を行った（図１２Ｂ参照）。この結果は、天然および非同種核酸ポリマーの、酵素を介した合成をそれぞれ実現するために、専用のＰｆｕ変異体と、「無傷の」および修飾された可逆的ターミネーターの両方とを組み合わせて用いることの実現可能性を示している。
【0136】
＜実施例１０＞
本実施例では、Ｐｆｕ２６変異体ポリメラーゼを用いて、一本鎖プライミング鎖の３’末端への３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーター（ＬＴＡ‐２、図１Ｆに示す）の多サイクル付加を試験した。７‐デアザ‐Ｃ７ヒドロキシメチル基に結合したα‐ｔｅｒｔ‐ブチル置換２‐ニトロベンジル終端基を有する修飾ＬＴＡ‐２を有するＰｆｕ２６を用いて、実施例７に説明されているように一塩基伸長アッセイを行った。修飾ＬＴＡ‐２は任意でαＳ三リン酸修飾を含み、ＨＰＬＣ精製してＳｐ異性体を単離した（図１３Ａおよび図１３Ｃ）。各組み込みサイクル（３サイクル‐図１３Ａ＆１３Ｂ；６サイクル‐図１３Ｃ）において１ｕｌを取り出し、ＡＢＩ ３５００分析用に氷上で保存した。各サイクルにおいて、残りの反応容量をＭｙＯｎｅ Ｔ１ビオチン化ビーズを用いて以下のように精製した（３サイクル実験の場合）。ビーズ１２７．５ｕｌを洗浄液１ｍｌで２回洗浄し、洗浄液で元の容量に再懸濁した。スペーサーを含むビオチン化アンチセンスＴ７（ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＧＴ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＡＴ）プライマー（５’‐ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＧＴ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＡＴ Ａ‐ビオチン）を、最終濃度１８０ｎＭで添加した。ビーズとキャプチャーオリゴを室温、３００ｒｐｍで３０分混合し、洗浄液５００ｕｌで２回洗浄し、洗浄液１５０ｕｌに再懸濁した。ビーズ／キャプチャーオリゴミックス１０ｕｌを各組み込み反応物９ｕｌ（２～６サイクル）に添加し、室温、３００ｒｐｍで３０分インキュベートした。次いで、このミックスを室温で洗浄液５００ｕｌで２回洗浄し、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液１０ｕｌに再懸濁した。Ｆａｍ‐Ｔ７オリゴを外すために、反応物を９５℃で５分インキュベートし、速やかに磁石を適用した後、次のラウンドの組み込みのために各溶出液８ｕｌを取り出した。（２～６サイクル）精製後、新鮮な酵素／ＬＴＡミックス２ｕｌを添加し、プライマー伸長法を行い、上記のように分析した。
本実施例では、Ｐｆｕ２６変異体ポリメラーゼを用いて、一本鎖プライミング鎖の３’末端への３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーター（ＬＴＡ‐２、図１Ｆに示す）の多サイクル付加を試験した。７‐デアザ‐Ｃ７ヒドロキシメチル基に結合したα‐ｔｅｒｔ‐ブチル置換２‐ニトロベンジル終端基を有する修飾ＬＴＡ‐２を有するＰｆｕ２６を用いて、実施例７に説明されているように一塩基伸長アッセイを行った。修飾ＬＴＡ‐２は任意でαＳ三リン酸修飾を含み、ＨＰＬＣ精製してＳｐ異性体を単離した（図１３Ａおよび図１３Ｃ）。各組み込みサイクル（３サイクル‐図１３Ａ＆１３Ｂ；６サイクル‐図１３Ｃ）において１ｕｌを取り出し、ＡＢＩ ３５００分析用に氷上で保存した。各サイクルにおいて、残りの反応容量をＭｙＯｎｅ Ｔ１ビオチン化ビーズを用いて以下のように精製した（３サイクル実験の場合）。ビーズ１２７．５ｕｌを洗浄液１ｍｌで２回洗浄し、洗浄液で元の容量に再懸濁した。スペーサーを含むビオチン化アンチセンスＴ７（ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＧＴ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＡＴ）プライマー（５’‐ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＧＴ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＡＴ Ａ‐ビオチン）を、最終濃度１８０ｎＭで添加した。ビーズとキャプチャーオリゴを室温、３００ｒｐｍで３０分混合し、洗浄液５００ｕｌで２回洗浄し、洗浄液１５０ｕｌに再懸濁した。ビーズ／キャプチャーオリゴミックス１０ｕｌを各組み込み反応物９ｕｌ（２～６サイクル）に添加し、室温、３００ｒｐｍで３０分インキュベートした。次いで、このミックスを室温で洗浄液５００ｕｌで２回洗浄し、Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液１０ｕｌに再懸濁した。Ｆａｍ‐Ｔ７オリゴを外すために、反応物を９５℃で５分インキュベートし、速やかに磁石を適用した後、次のラウンドの組み込みのために各溶出液８ｕｌを取り出した。（２～６サイクル）精製後、新鮮な酵素／ＬＴＡミックス２ｕｌを添加し、プライマー伸長法を行い、上記のように分析した。
【0137】
その結果（図１３Ａ～図１３Ｃに示す）、７‐デアザ‐７‐ヒドロキシメチル‐α‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐ニトロベンジル修飾ＬＴＡと組み合わせたＰｆｕ２６は、２～３ラウンドのＴｉＥＯＳ後に、１００％の効率で個々の生成物を生成しないことが示された。αＳ修飾（図１３Ｂ）を除去しても、または７‐デアザ‐７‐ヒドロキシメチル‐α‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐ニトロベンジル修飾ＬＴＡのキラル的に純粋なαＳ（Ｓｐ異性体）（図１３Ａ、１３Ｃ）を組み込んでも、二次生成物の問題は克服されなかった。しかしながら、この結果は、長い天然および修飾核ポリマーの酵素的合成を実現するために、本変異体ポリメラーゼの実施の形態と組み合わせて使用することができる「無傷の」非異性体可逆的ターミネーターを設計するための概念実証を示している。
【0138】
＜例示的な実施の形態＞
様々な実施の形態が記載されているが、本開示の教示は、記載された特定の実施の形態に限定されるものではなく、したがって、もちろん変化できることが理解されるべきである。以下、「実施形態」と称して番号を付す。
様々な実施の形態が記載されているが、本開示の教示は、記載された特定の実施の形態に限定されるものではなく、したがって、もちろん変化できることが理解されるべきである。以下、「実施形態」と称して番号を付す。
【0139】
実施形態１． ３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターと変異体ポリメラーゼとを含む組成物であって、変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、組成物。
【0140】
実施形態２． 変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置にＡ４８６Ｘ変異を含み、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸である、実施形態１に記載の組成物。
【0141】
実施形態３． Ａ４８６Ｘ変異がＡ４８６Ｆ、Ａ４８６Ｙ、Ａ４８６Ｎ、Ａ４８６Ｒ、またはＡ４８６Ｈである、実施形態２に記載の組成物。
【0142】
実施形態４． 変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置にＹ５４６Ｈ変異をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【0143】
実施形態５． 変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４７７と機能的に等価な位置にＫ４７７Ｗ変異をさらに含む、実施形態１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【0144】
実施形態６． 変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｆ４９４と機能的に等価な位置に変異をさらに含む、実施形態１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【0145】
実施形態７． Ｆ４９４変異がＦ４９４Ｃ、Ｆ４９４Ｉ、Ｆ４９４Ｎ、またはＦ４９４Ｔである、実施形態６に記載の組成物。
【0146】
実施形態８． 変異体ポリメラーゼが、パイロコッカスポリメラーゼの誘導体である、前述の実施形態のいずれか１項に記載の組成物。
【0147】
実施形態９． 変異体ポリメラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の組成物。
【0148】
実施形態１０． 変異体ポリメラーゼが、サーモコッカスポリメラーゼの誘導体である、実施形態１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【0149】
実施形態１１． 核酸を含むプライミング鎖にヌクレオチドを組み込む方法であって、方法は、
組み込み反応に十分な条件下でプライミング鎖とヌクレオチドおよび変異体ポリメラーゼとを接触させることを含み、
変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、方法。
組み込み反応に十分な条件下でプライミング鎖とヌクレオチドおよび変異体ポリメラーゼとを接触させることを含み、
変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、方法。
【0150】
実施形態１２． ヌクレオチドが３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターである、実施形態１１に記載の方法。
【0151】
実施形態１３． ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）鋳型とプライミング鎖とを含む二本鎖を形成し、鋳型が、配列決定される標的核酸と、プライミング鎖の少なくとも一部に相補的なプライマー結合部位と、を含む、形成することと、
（ｂ）プライミング鎖と、可逆的ターミネーターヌクレオチドおよび変異体ポリメラーゼとを組み合わせ、変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、組み合わせることと、
（ｃ）プライミング鎖の３’末端に鋳型依存性反応で可逆的ターミネーターを組み込むことと、
（ｄ）組み込まれた可逆的ターミネーターヌクレオチドを同定し、それによって鋳型の配列を決定する、同定することと、
を含む、方法。
（ａ）鋳型とプライミング鎖とを含む二本鎖を形成し、鋳型が、配列決定される標的核酸と、プライミング鎖の少なくとも一部に相補的なプライマー結合部位と、を含む、形成することと、
（ｂ）プライミング鎖と、可逆的ターミネーターヌクレオチドおよび変異体ポリメラーゼとを組み合わせ、変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、ＰｆｕポリメラーゼのＫ４７７、Ａ４８６およびＹ５４６のアミノ酸位置と機能的に等価な位置におけるアミノ酸変異と、を含む、組み合わせることと、
（ｃ）プライミング鎖の３’末端に鋳型依存性反応で可逆的ターミネーターを組み込むことと、
（ｄ）組み込まれた可逆的ターミネーターヌクレオチドを同定し、それによって鋳型の配列を決定する、同定することと、
を含む、方法。
【0152】
実施形態１４． 方法が、ステップ（ｃ）および（ｄ）を少なくとも８０回繰り返すことをさらに含む、実施形態１３に記載の方法。
【0153】
実施形態１５． プライミング鎖、３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターと変異体ポリメラーゼとを含む組成物であって、
変異体ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、
変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｌ４０９、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置に１つまたは複数の変異をさらに含み、
変異体ポリメラーゼが、配列番号１１のＤＮＡポリメラーゼの組み込み活性より少なくとも４倍高い３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターの組み込み活性を有する、
組成物。
変異体ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、
変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｌ４０９、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置に１つまたは複数の変異をさらに含み、
変異体ポリメラーゼが、配列番号１１のＤＮＡポリメラーゼの組み込み活性より少なくとも４倍高い３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターの組み込み活性を有する、
組成物。
【0154】
実施形態１６． アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも８５％同一である、実施形態１５に記載の組成物。
【0155】
実施形態１７． アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９０％同一である、実施形態１５に記載の組成物。
【0156】
実施形態１８． アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である、実施形態１５に記載の組成物。
【0157】
実施形態１９． 変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置２６６、２６７、２６８、２６９、３２９、３３６、３９９、４００、４０３、４０４、４０７、４０８、４１０、４１１、４５０、４５２、４５５、４５６、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４７５、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８５、４８７、４８８、４９１、４９３、４９５、４９６、４９８、４９９、５００、５１５、５２２、５４５、５４６、５７７、５７９、５８０、５８２、５８４、５９１、５９５、６０３、６０６、６０７、６０８、６１２、６１３、６１４、６６４、６６５、６６６、６６８、６６９、６７４、６７５、および６７６と機能的に等価な任意の位置に変異を含まない、実施形態１５～１８のいずれか１項に記載の組成物。
【0158】
実施形態２０． 変異体ポリメラーゼがパイロコッカスポリメラーゼの誘導体である、実施形態１５～１９のいずれか１項に記載の組成物。
【0159】
実施形態２１． 変異体ポリメラーゼがサーモコッカスポリメラーゼの誘導体である、実施形態１５～１９のいずれか１項に記載の組成物。
【0160】
実施形態２２． 組成物が、プライミング鎖の少なくとも一部に相補的なプライマー結合部位を含む鋳型をさらに含む、実施形態１５～２１のいずれか１項に記載の組成物。
【0161】
実施形態２３． 組成物が、５４６Ｈ変位および４８６Ｘ変異をさらに含む、実施形態１５～２２のいずれか１項に記載の組成物。
【0162】
実施形態２４． 組成物が、プライミング鎖に相補的な鋳型を含まない、実施形態１５～２３のいずれか１項に記載の組成物。
【0163】
実施形態２５． ３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターをプライミング鎖に組み込む方法であって、方法が、
組み込み反応に十分な条件下でプライミング鎖と３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターおよび変異体ポリメラーゼとを接触させることであって、変異体ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｌ４０９、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置における１つまたは複数の変異とを含む、接触させることと、
プライミング鎖の３’末端に３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターを組み込むことと、
を含む、方法。
組み込み反応に十分な条件下でプライミング鎖と３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターおよび変異体ポリメラーゼとを接触させることであって、変異体ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列と、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｌ４０９、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置における１つまたは複数の変異とを含む、接触させることと、
プライミング鎖の３’末端に３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターを組み込むことと、
を含む、方法。
【0164】
実施形態２６． ３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターが２‐ニトロベンジル修飾ヌクレオチドである、実施形態２５に記載の方法。
【0165】
実施形態２７． ３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターが、Ｃ７‐またはＣ５‐ヒドロキシメチル‐α‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐ニトロベンジル修飾ヌクレオチドおよびそのα‐チオ誘導体である、実施形態２５に記載の方法。
【0166】
実施形態２８． 変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置４９２と機能的に等価な位置に少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、方法が、ターミネーターを選択的に組み込むことを含む、実施形態２５～２７のいずれか１項に記載の方法。
【0167】
実施形態２９． 変異がＮ４９２Ｉ、Ｎ４９２Ｖ、またはＮ４９２Ｐから選択される、実施形態２８に記載の方法。
【0168】
実施形態３０． シトシン塩基を含む３’‐ＯＨ非ブロック可逆的ターミネーターが、変異体ポリメラーゼによって選択的に組み込まれる、実施形態２８に記載の方法。
【0169】
実施形態３１． プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターと、配列番号２と少なくとも９６％同一である変異体ポリメラーゼとを含む組成物であって、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９ＨまたはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組成物。
Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９ＨまたはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組成物。
【0170】
実施形態３２． 組成物が、プライミング鎖に相補的な鋳型を含まない、実施形態３１に記載の組成物。
【0171】
実施形態３３． 変異体ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置における１つまたは複数の変異をさらに含む、実施形態３１または３２に記載の組成物。
【0172】
実施形態３４． 変異体ポリメラーゼが、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態３１または３２に記載の組成物。
【0173】
実施形態３５． 変異体ポリメラーゼが、配列番号１１のＤＮＡポリメラーゼの組み込み活性より少なくとも２倍高い組み込み活性を有する、実施形態３１～３４のいずれか１項に記載の組成物。
【0174】
実施形態３６． 変異体ポリメラーゼがパイロコッカスポリメラーゼの誘導体である、実施形態３１～３５のいずれか１項に記載の組成物。
【0175】
実施形態３７． 変異体ポリメラーゼが配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態３１～３６のいずれか１項に記載の組成物。
【0176】
実施形態３８． 変異体ポリメラーゼがサーモコッカスポリメラーゼの誘導体である、実施形態３１～３５のいずれか１項に記載の組成物。
【0177】
実施形態３９． 鋳型非依存性反応でプライミング鎖に単一ヌクレオチドを組み込むための方法であって、方法が、
プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターおよび変異体ポリメラーゼとを組み合わせることであって、変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であり、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９ＨまたはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組み合わせることを含み、
ターミネーターの組み込みが、配列番号１１の変異体ＤＮＡポリメラーゼより少なくとも２倍高い、方法。
プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターおよび変異体ポリメラーゼとを組み合わせることであって、変異体ポリメラーゼが、配列番号２と少なくとも９６％同一であり、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９ＨまたはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組み合わせることを含み、
ターミネーターの組み込みが、配列番号１１の変異体ＤＮＡポリメラーゼより少なくとも２倍高い、方法。
【0178】
実施形態４０． 鋳型非依存性オリゴヌクレオチドの合成方法であって、
プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターと、変異体ＤＮＡポリメラーゼと、を組み合わせることであって、変異体ＤＮＡポリメラーゼが、
配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるヒスチジンへのＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９Ｈ、またはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組み合わせることと、
３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターをプライミング鎖に組み込むことと、
を含む、方法。
プライミング鎖と、３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターと、変異体ＤＮＡポリメラーゼと、を組み合わせることであって、変異体ＤＮＡポリメラーゼが、
配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置５４６と機能的に等価な位置におけるヒスチジンへのＹ５４６Ｈ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４０９と機能的に等価な位置におけるＬ４０９Ｙ、Ｌ４０９Ｈ、またはＬ４０９Ｆ変異と、
Ｐｆｕポリメラーゼの位置４８６と機能的に等価な位置におけるＡ４８６Ｘ変異であって、Ｘがアラニン以外の任意のアミノ酸であるＡ４８６Ｘ変異と、
を含む、組み合わせることと、
３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターをプライミング鎖に組み込むことと、
を含む、方法。
【0179】
実施形態４１． ポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼの位置Ｌ２７０、Ｅ３３０、Ｑ３３２、Ｌ３３３、Ｐ４５１、Ｌ４５３、Ｌ４５７、Ｅ４７６、Ｌ４８９、Ｌ４９０、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９７およびＥ５８１と機能的に等価な位置における１つまたは複数の変異をさらに含む、実施形態３９または４０に記載の方法。
【0180】
実施形態４２． ３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターが２‐ニトロベンジル修飾ヌクレオチドである、実施形態３９～４１のいずれか１項に記載の方法。
【0181】
実施形態４３． ３’‐ＯＨ非修飾可逆的ターミネーターがＣ７‐またはＣ５‐ヒドロキシメチル‐α‐ｔｅｒｔ‐ブチル‐２‐ニトロベンジル修飾ヌクレオチドおよびそのα‐チオ誘導体である、実施形態３９～４１のいずれか１項に記載の方法。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【配列表】
【国際調査報告】