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特表2024-527524上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）阻害剤およびＷＮＴ阻害剤の併用癌治療法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-25
(54)【発明の名称】上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）阻害剤およびＷＮＴ阻害剤の併用癌治療法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/06 20060101AFI20240718BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240718BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20240718BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240718BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240718BHJP
【ＦＩ】
A61K45/06 ZNA
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/02
A61K31/497
C07K16/18
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579193
(86)(22)【出願日】2022-06-24
(85)【翻訳文提出日】2024-02-16
(86)【国際出願番号】 US2022034885
(87)【国際公開番号】W WO2022272050
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】63/215,036
(32)【優先日】2021-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ノニデット
２．トライトン
(71)【出願人】
【識別番号】596118493
【氏名又は名称】アカデミア シニカ
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ハン－チュン
(72)【発明者】
【氏名】パンダ，スシュリー シャンカル
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA20
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB271
4C084ZC022
4C084ZC751
4C085AA13
4C085BB11
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC48
4C086GA07
4C086GA08
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤およびWntシグナル伝達阻害剤を用いた癌の併用療法に関する。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤は、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。この併用療法は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌幹細胞性、腫瘍進行および／または転移を阻害し、および／または癌患者の生存を延長するのに有効である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
(i) 上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）シグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤；および(ii) Wntシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤
を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置するための方法。
【請求項2】
第１の阻害剤が、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）の産生（または放出）を減少させ、および／またはＥｐＥＸのWnt受容体への結合を阻止する、請求項１記載の方法。
【請求項3】
第２の阻害剤が、WntリガンドのWnt受容体タンパク質への結合を阻止する、請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
WntリガンドがＥｐＥＸではない、請求項３記載の方法。
【請求項5】
第１の阻害剤が、ＥｐＥＸに対する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項6】
抗体が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインＩおよびＩＩに特異的に結合する、請求項５記載の方法。
【請求項7】
ＥＧＦ様ドメインＩに位置するＣＶＣＥＮＹＫＬＡＶＮ（ａａ ２７～３７）（配列番号２０）およびＥＧＦ様ドメインＩＩに位置するＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤ（ａａ ８３～１００）（配列番号１９）の配列内のエピトープに対して特異的な結合親和性を有する、請求項５記載の方法。
【請求項8】
抗体または抗原結合フラグメントが、(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
(b) 配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む、請求項５から７のいずれか一項記載の方法、
【請求項9】
第１の阻害剤が、β－カテニンシグナル伝達を阻害するのに有効である、請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項10】
第２の阻害剤が、ポルクピン阻害剤である、請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項11】
癌細胞のアポトーシスを誘導するのに有効である、請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項12】
癌幹細胞性、腫瘍進行および／または転移を阻害するのに有効である、請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項13】
対象の生存を延長するのに有効である、請求項１から１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項14】
癌が、肺癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌および精巣癌からなる群より選択される、請求項１から１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項15】
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する第１の阻害剤；および(ii) Wntシグナル伝達の活性化を阻害する第２の阻害剤
を含む、キットまたは医薬組成物。
【請求項16】
第１の阻害剤が、請求項１、２および５から９のいずれか一項記載のものであり、かつ／または第２の阻害剤が、請求項３、４または１０に記載のものである、請求項１５記載のキットまたは医薬組成物。
【請求項17】
癌を処置するための薬剤またはキットを製造するための、(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する第１の阻害剤、および(ii) Wntシグナル伝達の活性化を阻害する第２の阻害剤、の組合せの使用。
【請求項18】
第１の阻害剤が、請求項１、２および５から９のいずれか一項記載のものであり、かつ／または第２の阻害剤が、請求項３、４または１０に記載のものである、請求項１５記載の使用。
【請求項19】
薬剤またはキットが癌細胞のアポトーシスを誘導するのに有効である、請求項１７または１８記載の使用。
【請求項20】
薬剤またはキットが、癌幹細胞性、腫瘍進行および／または転移を阻害するのに有効である、請求項１７から１９のいずれか一項記載の使用。
【請求項21】
薬剤またはキットが、対象の生存を延長するのに有効である、請求項１７から２０のいずれか一項記載の使用。
【請求項22】
癌が、肺癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、および精巣癌からなる群より選択される、請求項１７から２１のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条に基づいて２０２１年６月２５日に提出された米国仮出願番号６３／２１５，０３６号について優先権の利益を主張し、その内容全体は引用により本明細書に包含させる。
本出願は、米国特許法第１１９条に基づいて２０２１年６月２５日に提出された米国仮出願番号６３／２１５，０３６号について優先権の利益を主張し、その内容全体は引用により本明細書に包含させる。
【0002】
技術分野
本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤およびWnt阻害剤を用いた癌の併用療法に関する。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤は、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。この併用療法は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌の幹細胞性を抑制し、腫瘍の進行および／または転移を抑制し、および／または癌患者の生存期間を延長させるのに有効である。
本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤およびWnt阻害剤を用いた癌の併用療法に関する。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤は、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。この併用療法は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌の幹細胞性を抑制し、腫瘍の進行および／または転移を抑制し、および／または癌患者の生存期間を延長させるのに有効である。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
上皮細胞接着分子（Epithelial cell adhesion molecule；ＥｐＣＡＭ、別名ＣＤ３２６）は、大腸癌（ＣＲＣ）を含む多くの癌種で高度に発現されている。健康な上皮細胞における細胞接着機能とは異なり、このタンパク質は細胞膜での切断によって活性化され、細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）および細胞内ドメイン（ＥｐＩＣＤ）を放出し、増殖、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、幹細胞化および分化に関与して腫瘍の進行を促進する（Chen et al、2020; Gires et al., 2009; Gires et al., 2020; Liang et al., 2018; Lin et al., 2012; Maetzel et al., 2009; Sankpal et al., 2017）。この点に関して、ＥｐＥＸはＥＧＦＲに直接結合し、ＥＧＦＲのリン酸化およびＰＤ－Ｌ１の安定化を含むその下流のシグナル伝達を刺激することが報告されている（Chen et al., 2020;Liang et al., 2018; Pan et al., 2018）。重要なことは、ＥｐＣＡＭが強力な癌幹細胞（ＣＳＣ）抗原であることが示されていることである。しかしながら、その正確な役割はよくわかっていない（Gires et al., 2009; Gires et al., 2020; Lin et al., 2012）。本明細書中、ＣＳＣの病態生物学において中心的な役割を果たすことが知られている経路のひとつがWnt－β－カテニンシグナル伝達であり、このシグナル伝達は、腫瘍形成能、腫瘍の可塑性および薬剤耐性など、いくつかの悪性腫瘍に関連する特徴の促進に関与しているため、この経路は癌における興味深い治療標的となる（Kahn, 2014; Nusse and Clevers, 2017）。ＣＳＣ集団を標的とすることが有益な治療戦略となる可能性が示唆されているが、ＣＳＣ集団の決定的な同定は依然として大きな課題となっている（Batlle and Clevers, 2017)。癌治療においてＣＳＣを標的とするために、ＣＳＣにシグナルを送る腫瘍微小環境の因子を標的とすることで、Wnt経路の活性化を阻止することが可能であり得る（Batlle and Clevers, 2017; Nusse and Clevers, 2017; Zhan et al., 2017)。
上皮細胞接着分子（Epithelial cell adhesion molecule；ＥｐＣＡＭ、別名ＣＤ３２６）は、大腸癌（ＣＲＣ）を含む多くの癌種で高度に発現されている。健康な上皮細胞における細胞接着機能とは異なり、このタンパク質は細胞膜での切断によって活性化され、細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）および細胞内ドメイン（ＥｐＩＣＤ）を放出し、増殖、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、幹細胞化および分化に関与して腫瘍の進行を促進する（Chen et al、2020; Gires et al., 2009; Gires et al., 2020; Liang et al., 2018; Lin et al., 2012; Maetzel et al., 2009; Sankpal et al., 2017）。この点に関して、ＥｐＥＸはＥＧＦＲに直接結合し、ＥＧＦＲのリン酸化およびＰＤ－Ｌ１の安定化を含むその下流のシグナル伝達を刺激することが報告されている（Chen et al., 2020;Liang et al., 2018; Pan et al., 2018）。重要なことは、ＥｐＣＡＭが強力な癌幹細胞（ＣＳＣ）抗原であることが示されていることである。しかしながら、その正確な役割はよくわかっていない（Gires et al., 2009; Gires et al., 2020; Lin et al., 2012）。本明細書中、ＣＳＣの病態生物学において中心的な役割を果たすことが知られている経路のひとつがWnt－β－カテニンシグナル伝達であり、このシグナル伝達は、腫瘍形成能、腫瘍の可塑性および薬剤耐性など、いくつかの悪性腫瘍に関連する特徴の促進に関与しているため、この経路は癌における興味深い治療標的となる（Kahn, 2014; Nusse and Clevers, 2017）。ＣＳＣ集団を標的とすることが有益な治療戦略となる可能性が示唆されているが、ＣＳＣ集団の決定的な同定は依然として大きな課題となっている（Batlle and Clevers, 2017)。癌治療においてＣＳＣを標的とするために、ＣＳＣにシグナルを送る腫瘍微小環境の因子を標的とすることで、Wnt経路の活性化を阻止することが可能であり得る（Batlle and Clevers, 2017; Nusse and Clevers, 2017; Zhan et al., 2017)。
【0004】
ＥｐＩＣＤは、細胞の運動性、増殖、生存および転移を促進するよく研究された因子であるため、ＥｐＣＡＭはＣＳＣにおけるWntシグナル伝達のそのようなメディエーターの１つであり得る（Gires et al., 2009; Gires et al., 2020; Liang et al., 2018; Lin et al., 2012; Park et al., 2016）。さらに重要なことに、可溶性ＥｐＩＣＤは、β－カテニンおよびFour and one-half LIM ドメインタンパク質２（ＦＨＬ２）と呼ばれる足場タンパク質と複数タンパク質の核錯体を形成し、核に移行し、Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）またはリンパ系エンハンサー因子１（ＬＥＦ－１）と結合してWnt標的遺伝子を転写し得ることが知られている（Maetzel et al., 2009; Park et al., 2016; Ralhan et al., 2010）。しかしながら、ＥｐＥＸがWnt経路と何らかの形で協調しているかどうかは不明である。
【0005】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者では、ＥｐＣＡＭの高発現は予後不良を示唆しており、これはＣＲＣ細胞の機能におけるＥｐＩＣＤの重要な関与が知られていることと一致している（Chen et al., 2020; Kim et al., 2016; Liang et al., 2018; Lin et al., 2012; Seeber et al., 2016; Wang et al., 2016）。さらに、ＥｐＣＡＭは、親腫瘍形成細胞の生殖および表現型の異質性を刺激することにより、ＣＲＣ幹細胞の発癌能を増強する。マウスモデルでは、ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ／ＣＤ４４＋細胞は高い腫瘍形成性を示しただけでなく、幹細胞性を示すいくつかの亜集団への分化にも成功した（Boesch et al., 2018; Dalelba et al., 2007）。実際、ＥｐＩＣＤ－β－カテニン複合体の核移行は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃなどのリプログラミング遺伝子の転写を上方制御し、ＣＲＣ細胞に自己再生能力を付与するとともに、スネイル、スラグ、ツイストなどのＥＭＴ誘導遺伝子の活性化をもたらすことが知られている（Lin et al., 2012）。したがって、ＥｐＣＡＭの機能的レパートリーをさらに理解することで、ＣＲＣ幹細胞を標的とする方法が明らかになり得る。
【0006】
癌では、ＥｐＩＣＤがβ－カテニンと複合して機能するため、Wntシグナル伝達はＥｐＣＡＭ活性に関与している可能性がある（Liang et al., 2018; Maetzel et al., 2009; Park et al., 2016; Ralhan et al., 2010）。特に、Wntシグナル伝達成分はＣＲＣに豊富に存在し、異常に調節されており、Wnt関連タンパク質は癌細胞の幹細胞性、自己再生および異質性に大きな影響を及ぼす（Batlle and Clevers, 2017; de Sousa e Melo et al., 2017; Kozar et al., 2013; Nusse and Clevers, 2017; Schepers et al., 2012）。さらに、全大腸腫瘍のほぼ８０％が大腸腺腫（ＡＰＣ）遺伝子の機能喪失型変異を保有しており、ＣＲＣ腫瘍の約５％がβ－カテニンの活性化変異を有している（Cancer Genome Atlas, 2012; Morin et al., 1997）。このような変異を有するＣＲＣ細胞がシグナル伝達を駆動するために外因性Wntリガンドを必要とするかどうかは依然として議論の余地があるが、Voloshanenkoらは、Wnt活性化変異にかかわらず、Wnt分泌およびその受容体との相互作用が高レベルのWnt活性を駆動し維持するために必要であることを報告した（Voloshanenko et al., 2013）。同様に、Ｓ３３、Ｓ３７およびＴ４１におけるβ－カテニンのリン酸化が、プライミングリン酸化部位であるＳ４５に変異を有する細胞で起こり、細胞をWntリガンドに感作させることができることも決定的に示された（Wang et al., 2003）。したがって、Wnt経路を標的とする１つの方法は、Wntタンパク質のパルミトイル化に必要なｏ－アシル－トランスフェラーゼであるポルクピン（porcupine）を阻害することによってWnt活性化を阻害することである可能性がある（Nusse and Clevers, 2017）。加えて、Wnt活性は腫瘍微小環境における外因性信号（cue）によって支配されているため、ＡＰＣまたはβ－カテニン変異とは無関係にＣＲＣ細胞の幹細胞性を機能的に決定することが見出された（Vermeulen et al., 2010）。したがって、ＣＲＣ腫瘍を最もよく標的とするためには、必須の細胞内シグナル伝達イベントおよび微小環境からＣＲＣ幹細胞への外因性信号を標的とすることによって幹細胞性特性を阻害することが有益である可能性がある（Batlle and Clevers, 2017; Nusse and Clevers, 2017; Vermeulen et al., 2010)。
【発明の概要】
【0007】
発明の概要
本明細書では、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤およびWntシグナル阻害剤を併用した癌治療法を記載している。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤はＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。併用療法は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌の幹細胞性を抑制し、腫瘍の進行および／または転移を抑制し、および／または癌患者の生存期間を延長するのに有効である。
本明細書では、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤およびWntシグナル阻害剤を併用した癌治療法を記載している。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤はＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。併用療法は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌の幹細胞性を抑制し、腫瘍の進行および／または転移を抑制し、および／または癌患者の生存期間を延長するのに有効である。
【0008】
一局面において、本発明は、癌を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤；および
(ii) Wntシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤
を投与することを含む方法を提供する。
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤；および
(ii) Wntシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤
を投与することを含む方法を提供する。
【0009】
ある態様において、第１の阻害剤は、ＥｐＥＸの産生（または放出）を減少させ、および／またはＥｐＥＸのWnt受容体への結合を阻害する。
【0010】
ある態様において、第２の阻害剤は、WntリガンドとWnt受容体タンパク質との結合を阻害する。具体的には、WntリガンドはＥｐＥＸではない。
【0011】
ある態様において、第１の阻害剤は、ＥｐＥＸに対する抗体（抗ＥｐＥＸ抗体）またはその抗原結合フラグメントである。
【0012】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＥｐＥＸ抗体は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインＩおよびＩＩに特異的に結合する。特定の例では、本明細書に記載の抗ＥｐＥＸ抗体は、ＥＧＦ様ドメインＩに位置するＣＶＣＥＮＹＫＬＡＶＮ（ａａ ２７～３７）（配列番号２０）、およびＥＧＦ様ドメインＩＩに位置するＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤ（ａａ ８３～１００）（配列番号１９）の配列内のエピトープに特異的結合親和性を有する。
【0013】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに、
(b) 配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに、
(b) 配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
【0014】
いくつかの態様において、ＶＨは配列番号１５のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【0015】
いくつかの態様において、β－カテニンシグナル伝達を阻害するのに有効である。
【0016】
いくつかの態様において、第２の阻害剤はポルクピン（porcupine）阻害剤である。
【0017】
いくつかの態様において、本発明の方法は、癌細胞のアポトーシスを誘導するのに有効である。
【0018】
いくつかの態様において、本発明の方法は、癌幹細胞性（cancer stemness properties）、腫瘍進行および／または転移を阻害するのに有効である。
【0019】
いくつかの態様において、本発明の方法は、対象の生存期間の延長に有効である。
【0020】
いくつかの態様において、処置される癌は、肺癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌および精巣癌からなる群より選択される。
【0021】
別の態様において、本発明は、
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する第１の阻害剤；および
(ii) Wntシグナル伝達の活性化を阻害する第２の阻害剤、
を含む医薬組成物のキットを提供する。
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する第１の阻害剤；および
(ii) Wntシグナル伝達の活性化を阻害する第２の阻害剤、
を含む医薬組成物のキットを提供する。
【0022】
また、本発明では、癌を処置するための医薬品またはキットを製造するための、(i) ＥｐＣＡＭシグナルの活性化を阻害する第１の阻害剤；および、(ii) Wntシグナルの活性化を阻害する第２の阻害剤、の組合せの使用も提供する。
【0023】
本発明の１以上の態様の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下のいくつかの態様の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲から明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【0024】
図面の簡単な説明
上記のまとめおよび以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と合わせて読むと、よりよく理解され得る。本発明を説明するために、現時点で好ましい態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、図示された正確な配置性および機能性に限定されるものではないことを理解されたい。
上記のまとめおよび以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と合わせて読むと、よりよく理解され得る。本発明を説明するために、現時点で好ましい態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、図示された正確な配置性および機能性に限定されるものではないことを理解されたい。
【図1】図１Ａから１Ｄ。ＣＲＣ患者サンプルにおいて、ＥｐＣＡＭは活性型β－カテニンと相関している。（図１Ａ）ＣＲＣの種々の病期におけるＥｐＣＡＭおよび活性型β－カテニンのＩＨＣ染色（スケールバー:１００μｍ）。（図１Ｂ）ＥｐＣＡＭおよび（図１Ｃ）活性型β－カテニン発現について、１２０名の患者からのサンプルにおける発現強度を定量した。（図１Ｄ）１２０名の患者サンプルにおけるＥｐＣＡＭと活性型β－カテニンとの相関は、ピアソン相関係数ｒを示した。データは一元配置分散分析（one-way ANOVA）後にボンフェローニ補正（Bonferroni correction）を行い、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ ＜０．０００１。
【図2】図２Ａから２Ｋ。ＥｐＥＸはβ－カテニンの核内転位と関連する生物学的機能を促進する。（図２Ａ）ＩＦＳは、指示された処理による核β－カテニンを示す；各群の５０細胞からの核β－カテニンの定量が含まれる（スケールバー：１０μｍ）。（図２Ｂ）ウェスタンブロット分析は、指示された処理による種々の細胞分画における活性β－カテニン発現を示し、（図２Ｃ）ＨＣＴ１１６細胞において示されるような対応するＴＣＦ活性（％）を示す。指示された処理は、ＳＷ６２０細胞におけるＴＣＦ活性（％）（図２Ｄ）、ＨＴ２９細胞におけるＡｘｉｎ２発現を示すウェスタンブロット分析（図２Ｅ）、およびＨＴ２９細胞におけるｍＲＮＡ発現に対応するウェスタンブロット分析（図２Ｆ）を示す。（図２Ｇ）指示された処理による核β－カテニンを示すＩＦＳ。各群５０細胞からの核β－カテニンの定量（スケールバー：１０μｍ）および対応するＨＣＴ１１６細胞における核β－カテニンレベルを確認するウェスタンブロット（図２Ｈ）（３回の独立した実験からのバンド強度の定量）、（図２Ｉ）Ｃｏｌｏ２０５細胞におけるＴＣＦ活性（％）（図２Ｊ）Ａｘｉｎ２発現を示すウェスタンブロット分析、および（図２Ｋ）Ｃｏｌｏ２０５細胞における相対的ｍＲＮＡ発現。データは一元配置分散分析または二元配置分散分析（Ｃ）を用いて分析し、ボンフェローニ補正を行い、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図3】図３Ａから３Ｇ。ＥｐＥＸはＥｐＩＣＤとは無関係にβ－カテニンの核内転座を刺激する。（図３Ａ）ＥｐＣＡＭノックダウンＨＣＴ１１６細胞における核内β－カテニンを示すウェスタンブロット分析；３つの独立した実験からのバンド強度の定量化。（図３Ｂ）免疫蛍光および（図３Ｃ）ウェスタンブロット分析であり、ＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞およびＥｐＥＸ処理による核内β－カテニンを示す。（図３Ｄ）免疫蛍光および（図３Ｅ）ウェスタンブロット分析であり、ＨＣＴ１１６細胞における指示された処理による核内β－カテニンを示す。（図３Ｆ、図３Ｇ）ＨＣＴ１１６細胞における指示された処理に対応するＴＣＦ（％）活性。(すべて共焦点画像：スケールバー１０μｍ、各群３０細胞の核内β－カテニンの定量）。統計は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、ボンフェローニ補正を用いて行い、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照、ＫＯ：ノックアウト。
【図4】図４Ａから４Ｅ。ＥｐＥＸおよびWntタンパク質は、β－カテニンの核内移行と関連する生物学的機能を協調的に制御している。指示された処理を行ったＨＣＴ１１６細胞における、（図４Ａ）ＩＦＳ（スケールバー１０μｍおよび各群３０細胞の核内β－カテニンの定量）、（図４Ｂ）核内β－カテニンを示すウェスタンブロット分析、（図４Ｃ）対応するＴＣＦ（％）活性、（図４Ｄ）Wnt標的Ａｘｉｎ２発現、および（図４Ｅ）相対的Ａｘｉｎ２ ｍＲＮＡ発現。統計は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、ボンフェローニ補正を用いて行い、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図5】図５Ａから図５Ｃ。ＥｐＣＡＭシグナルおよびWntシグナルの組合せ阻害は、Wnt関連機能を消失させる。指示された処理によるＨＣＴ１１６細胞における、（図５Ａ）対応するＴＣＦ活性（％）、（図５Ｂ）Wnt標的Ａｘｉｎ２発現、（図５Ｃ）Ａｘｉｎ２ ｍＲＮＡ相対発現。統計は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、ボンフェローニ補正を用いて行い、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図6】図６Ａから６Ｈ。ｈＥｐＡｂ２－６はβ－カテニンの核内転座を抑制し、癌の幹細胞性を制限し、アポトーシスを誘導する。（図６Ａ）免疫蛍光は、示された抗体または阻害剤処理を伴うＨＴ２９細胞における核β－カテニンを示す；各群３０細胞からの核β－カテニンの定量（スケールバー：１０μｍ）。（図６Ｂ）ウェスタンブロット分析は、ＨＴ２９細胞における、示された抗体または阻害剤処理後の核および全β－カテニンを示す；（図６Ｃ）ＴＣＦ活性を示す。（図６Ｄ）腫瘍球およびコロニー形成アッセイ、（図６Ｅ）球数および（図６Ｆ）コロニー密度（各ケースとも５×１０３細胞を播種）。（Ｇ－Ｈ） 示された処理を用いたアネキシンＶアポトーシスアッセイ；ＨＣＴ１１６細胞における３つの独立した試験からのアポトーシス細胞の定量。統計は一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用い、ボンフェローニ補正を行った；エラーバーは平均値±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図7】図７Ａから図７Ｅ。ＥｐＣＡＭおよびWntシグナルを標的とすることで、ＣＲＣの幹細胞化が抑制される。（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ）ウェスタン法およびｑＰＣＲ法により、示した細胞株におけるＥｐＣＡＭのノックアウト（ＫＯ）または強制発現（ＯＥ）を示した。（図７Ｄ）ＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＴ２９細胞における増殖曲線の比較。（図７Ｅ）ＨＴ２９細胞における指示された処理による腫瘍球形成。データは一元配置分散分析または二元配置分散分析（Ｄ）を用いて分析し、ボンフェローニ補正を行い、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図8】図８Ａから図８Ｎ。ＥｐＥＸ／ＥｐＣＡＭおよびWntシグナルは協調的に癌の幹細胞性を制御する。（図８Ａ）表示されたＨＣＴ１１６細胞における増殖曲線の比較および（図８Ｂ）ＣＴ２６細胞における増殖曲線の比較。（図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ）インビボでの腫瘍の大きさおよび進行の比較；１０３ 対照およびＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞をＮＳＧマウスに皮下移植した（各細胞株についてｎ＝６）。（図８Ｇ）対照およびＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＴ２９細胞を用いたインビトロ再生アッセイ。ＨＣＴ１１６細胞における腫瘍スフェア（sphere）形成（図８Ｈ）およびスフェア数（図８Ｉ）。ＨＴ２９細胞における指示された処理によるコロニー形成（図８Ｊ）および密度（播種した５×１０３細胞）（図８Ｋ）。ＳＷ６２０細胞（両方のアッセイのために播種された１×１０３細胞）における示された処理による、（図８Ｌ） スフェアおよびコロニー形成、（図８Ｍ）コロニー密度、および（図８Ｎ）スフェア数。データは、一元配置ＡＮＯＶＡまたは二元配置ＡＮＯＶＡ（図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｄ）を用いてデータを分析した後、ボンフェローニ補正を行い、エラーバーは平均値の±ＳＤを表した。＊ｐ ＜０．０５、＊＊ｐ ＜０．０１、＊＊＊ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照、ＫＯ：ＥｐＣＡＭ－ノックアウト、ＯＥ：ＥｐＣＡＭ強制発現。
【図9】図９Ａから図９Ｉ。ＥｐＥＸはWnt受容体と相互作用し、Wntシグナルを誘導する。（図９Ａ、図９Ｂ）アフィニティー架橋したＥｐＥＸ／Wnt受容体タンパク質の共免疫沈降（Ｃｏ－ＩＰ）により、ＨＣＴ１１６細胞で複合体が得られた。精製されたWnt受容体－ＧＳＴ融合タンパク質をコートしたプレートに結合する示した抗体複合体とインキュベートした、（図９Ｃ）ＥｐＥＸ単独、または（図９Ｄ）ＥｐＥＸのいずれかを示すＥＬＩＳＡ。（図９Ｅ）ＨＣＴ１１６細胞における示された処理によるＬＲＰ５／６のリン酸化を示すウェスタンブロット分析、３つの独立した試験からの定量されたバンド強化。（図９Ｆ）ＨＥＫ２９３細胞にＥＧＦドメイン（Ｉ／ＩＩ）欠失変異型ＥｐＣＡＭ－Ｖ５プラスミドをトランスフェクトした。アフィニティー架橋した変異型ＥｐＣＡＭ－Ｖ５／Wnt受容体タンパク質のＩＰは、それぞれの受容体抗体でブロッティングした複合体をもたらした。ＨＴ２９細胞をＥＧＦドメイン（Ｉ／ＩＩ）欠失変異型ＥｐＥＸタンパク質で処理したところ、（図９Ｇ）ＬＲＰ５／６のリン酸化を示すウェスタンブロットと、少なくとも３回の独立した試験から定量化したバンド強度、および（図９Ｈ）変異型ＥｐＥＸ処理したＨＣＴ１１６細胞における核内転位β－カテニンを示すＩＦＳ;各群50細胞の核内β-カテニンの定量（スケールバー１０μＭ）。（図９Ｉ）ＳＷ６２０細胞を用いた３つの独立した試験から、ＬＲＰ５／６のリン酸化阻害を示すウェスタンブロッティング、および定量化したバンド強度。データは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）、ボンフェローニ補正を用いて分析し、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ ＜０．０５、＊＊ｐ ＜０．０１、＊＊＊ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照、ＧＳＴ：グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ｐＡｂ：ポリクローナル抗体。
【図10】図１０Ａから図１０Ｇ。ＥｐＥＸおよびWntタンパク質はＴＡＣＥおよびγセクレターゼ酵素を活性化する。示された処理後の、（図１０Ａ）ＨＣＴ１１６細胞および（図１０Ｂ）Ｈ２９細胞におけるＴＡＣＥ活性、ならびに（図１０Ｃ）ＨＣＴ１１６細胞および（図１０Ｄ）Ｈ２９細胞におけるγセクレターゼ活性。（図１０Ｅ）示された処理後のＨＣＴ１１６細胞におけるリン酸化ＴＡＣＥおよびＰＳ２のレベルを示す、ウェスタンブロット分析。リン酸化ＴＡＣＥおよびＰＳ２に対する、（図１０Ｆ）ＢＩＯおよび（図１０Ｇ）ＰＦ－６７０４６２処理の効果；少なくとも３つの独立した試験からのバンド強度を定量した。データは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）と、それに続くボンフェローニ多重比較（Bonferroni multiple comparisons）を用いて分析した。エラーバーは平均値の±ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図11】図１１Ａから図１１Ｍ。ＥｐＩＣＤはWnt受容体タンパク質および幹性因子（stemness factor）の転写を上方制御する。（図１１Ａ）ＥｐＣＡＭノックダウンＨ２９細胞におけるWnt受容体タンパク質発現および（図１１Ｂ）相対的ｍＲＮＡ発現。（図１１Ｃ）ＥｐＣＡＭ－ＫＯおよびＥｐＣＡＭプラスミドをトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞におけるWnt受容体タンパク質発現を示すウェスタンブロット分析、および３つの独立した試験から定量化したバンド強度、および（図１１Ｄ）対応する相対ｍＲＮＡ発現。（図１１Ｅ）一晩ＤＡＰＴ処理したＨＴ２９細胞におけるWnt受容体タンパク質発現と、３つの独立した試験から定量化したバンド強度、および対応する（図１１Ｆ）相対ｍＲＮＡ発現。（図１１Ｇ）ＨＣＴ１１６細胞、（図１１Ｈ）ＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＴ２９細胞、および（図１１Ｉ）ＳＷ６２０細胞における、ＥｐＣＡＭプラスミドのトランスフェクションおよびＤＡＰＴ処理後のWnt受容体プロモーター活性。（図１１Ｊ）ＨＣＴ１１６細胞における示された処理後のWnt受容体発現を示すウェスタンブロット分析、および３つの独立した試験から定量化したバンド強度（図１１Ｋ）相対的ｍＲＮＡ発現。（図１１Ｌ）ウェスタンブロット解析により、ＨＴ２９細胞における指示された処理による幹細胞性因子の発現を示し、３つの独立した試験からバンド強度を定量した;（図１１Ｍ）相対的ｍＲＮＡ発現。データは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）、ボンフェローニ補正（Bonferroni correction）を用いて分析し、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ ＜０．０１、＊＊＊ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ:対照、Ｔｒａｎｓ:トランスフェクション。
【図12】図１２Ａから１２Ｆ。ＥｐＩＣＤはWnt受容体の転写を促進する。（図１２Ａ）ＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞におけるWnt受容体タンパク質の発現および（図１２Ｂ）対応するｍＲＮＡの発現。（図１２Ｃ）ＥｐＣＡＭプラスミドを導入したＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞と導入していないＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞の細胞形態の比較。（図１２Ｄ）ＨＣＴ１１６細胞におけるＤＡＰＴ処理によるWnt受容体タンパク質の発現を示すウェスタンブロット分析。（図１２Ｅ）ルシフェラーゼレポーターを有するWnt受容体プロモータープラスミド構築。（図１２Ｆ）ＥｐＣＡＭ－ＫＯ ＨＣＴ１１６細胞にＥｐＣＡＭプラスミドをトランスフェクションし、一晩ＤＡＰＴ処理した後のWnt受容体プロモーター活性。データは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）、ボンフェローニ補正を用いて分析し、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ ＜０．０５、＊＊ｐ ＜０．０１、＊＊＊ｐ ＜０．００１。Ｃｔｒｌ：対照；ＫＯ：ノックアウト；ＰＭ：プロモーター；ＬＵＣ：ルシフェラーゼ。
【図13】図１３Ａから１３Ｆ。ＥｐＥＸおよびWntタンパク質は共同でWnt受容体および幹性因子の発現を促進する。（図１３Ａ）ＨＣＴ１１６細胞における示された処理によるWnt受容体タンパク質発現を示すウェスタンブロット分析、および（図１３Ｂ）相対的ｍＲＮＡ発現。（図１３Ｃ）ＥｐＣＡＭノックダウンＨＣＴ１１６細胞における、示された幹細胞因子発現を示すウェスタンブロット分析；（図１３Ｄ）相対的ｍＲＮＡ発現。（図１３Ｅ）示された処理により幹細胞因子発現を示すＨＴ２９細胞のウェスタンブロット分析、（図１３Ｆ）相対的ｍＲＮＡ発現。データは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）、ボンフェローニ補正を用いて分析し、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図14】図１４Ａから図１４Ｆ。ＥｐＡｂ２－６およびＬＧＫ９７４は協調的に腫瘍の進行を抑制する。（図１４Ａ）ＳＷ６２０細胞における示された処理によるアネキシンＶアポトーシスアッセイ、（図１４Ｂ）３つの独立した試験によるアポトーシス細胞数の定量。（図１４Ｃ）カプランマイヤー生存率プロットは、示された処理後の転移モデルの動物生存率を示す。（図１４Ｄ）同所性動物モデルにおける腫瘍の進行を示す生物発光（０日目＝移植後７２時間）（図１４Ｅ）発光の定量、（図１４Ｆ）同所性モデルにおける動物の生存期間を示すカプランマイヤー生存期間プロット。データは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）または二元配置分散分析（way-way ANOVA）を用いて分析し（図１４Ｅ）、その後ボンフェローニ補正を行い、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ ＜０．０００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図15】図１５Ａから１５Ｅ。ＥｐＣＡＭおよびWntシグナルは協同して腫瘍の進行に関与するため、これらの阻害は癌細胞のアポトーシスを誘導し、転移を阻止する。（図１５Ａ、図１５Ｂ）示された処理によるアネキシンＶアポトーシスアッセイ；ＨＣＴ１１６細胞における３つの独立した試験からのアポトーシス細胞の定量。（図１５Ｃ）転移性ＣＲＣモデル動物および同所性ＣＲＣモデル動物（ＨＣＴ１１６細胞）の両方の治療スケジュール。（図１５Ｄ）転移モデルにおける示された処理後の動物の体重比較（図１５Ｅ）剖検の結果、転移モデルにおけるマウスの死亡は、腫瘍が様々な臓器に転移したためであった。（Ｆ）同所性動物モデルにおけるマウスの体重比較。データは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）、ボンフェローニ補正を用いて分析し、エラーバーは平均値の±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｃｔｒｌ：対照。
【図16】図１６。まとめると、ＥｐＣＡＭはＣＲＣの幹細胞化を促進するWntシグナルを誘導することから、ＥｐＡｂ２－６およびポルクピン阻害剤による複合阻害は、癌の幹細胞化を抑制し、ＣＲＣ処置を改善し得る。
【図17】図１７Ａから１７Ｂ。ヒトＥｐＣＡＭの配列の特徴およびドメイン。（図１７Ａ）３１４アミノ酸残基を含むヒトＥｐＣＡＭの全長（配列番号１７）。（図１７Ｂ）ＥｐＥＸドメインが、ＶＧＡＱＮＴＶＩＣ（ａａ５１～５９、配列番号１８）を含むＥＧＦ Ｉドメイン（ａａ ２７～５９）と、ＬＹＤモチーフ（ａａ ９４～９６）を含むＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤ（ａａ８３～１００、配列番号１９）を含むＥＧＦ ＩＩドメイン（ａａ ６６－１３５）とを含む、ＥｐＣＡＭのドメインの同定。
【図18】図１８Ａから１８Ｇ。ＥｐＡｂ２－６はＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメインＩおよびＩＩの両方に結合する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に全長またはＥＧＦ様ドメイン欠失変異型ＥｐＣＡＭ－Ｖ５をトランスフェクトした。抗体結合を、（図１８Ａ）ウェスタンブロッティング、（図１８Ｂ）フローサイトメトリー、および（図１８Ｃ）免疫蛍光法で評価した。（図１８Ｄ）ＥＧＦ－Ｉ（Ｙ３２Ａ）およびＥＧＦ－ＩＩ（Ｌ９４Ａ、Ｙ９５ＡまたはＤ９６Ａ）ドメインのアミノ酸を置換したＥｐＣＡＭ変異体を構築した。ＥｐＣＡＭ野生型および変異型タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。ＭＴ２０１、ＥｐＡｂ２－６およびＥｐＡｂ２３－１のＥｐＣＡＭ野生型および変異体への結合を、（図１８Ｅ）免疫蛍光法、（図１８Ｆ）フローサイトメトリー、および（図１８Ｇ）細胞ＥＬＩＳＡで評価した。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。＊, ｐ＜０．０５； ＊＊, ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【0025】
発明の詳細な説明
以下の説明は、単に本発明の種々の態様を説明するためのものである。そのため、本明細書で説明する特定の態様または改変は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更または均等態様等が実施され得ることは理解し得る。
以下の説明は、単に本発明の種々の態様を説明するためのものである。そのため、本明細書で説明する特定の態様または改変は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更または均等態様等が実施され得ることは理解し得る。
【0026】
本発明を明確かつ容易に理解するために、まず特定の用語を定義する。その他の定義は、詳細な説明の中に記載されている。別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0027】
本明細書で用いる、単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、文脈で別段の明確な記載がない限り、複数の対象を含む。よって、例えば、“構成要素（a component）”への言及には、複数のそのような構成要素および当業者に既知のそれらの均等物が含まれる。
【0028】
用語“含む（comprise）”または“含むこと（comprising）”とは、一般的に、１以上の特徴、成分または構成要素の存在を許容することを意味する、含む（include）／含むこと（including）という意味で用いられる。用語“含む”または“含むこと”は、用語“～からなる（consist）”または“～からなる（consisting of）”を包含する。
【0029】
本明細書で用いる用語“ポリペプチド”とは、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸残基からなるポリマーを意味する。用語“タンパク質”とは、通常、比較的大きなポリペプチドを意味する。用語“ペプチド”とは、通常、比較的短いポリペプチド（例えば、最大１００アミノ酸残基、９０アミノ酸残基、７０アミノ酸残基、５０アミノ酸残基、３０アミノ酸残基、２０アミノ酸残基または１０アミノ酸残基を含む）を意味する。
【0030】
本明細書で用いる用語“約（approximately）”または“約（about）”は、当業者に理解され得る許容可能な逸脱の程度を意味し、それが用いられる文脈によってある程度変化し得る。具体的には、“約”とは、指示される数値の±１０％または±５％または±３％の範囲を有する数値を意味し得る。
【0031】
本明細書で用いる用語“実質的に同一”とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性（homology）を有する２つの配列を意味する。
【0032】
本明細書で用いる用語“抗体”（複数形が互換的に用いられる）は、特定の標的抗原性分子に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いる用語“抗体”には、インタクトな（すなわち全長の）抗体分子だけでなく、抗原結合能を保持するその抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖも含まれる。かかるフラグメントも当技術分野ではよく知られており、インビトロでもインビボでも常用されている。用語“抗体”には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のその他の修飾構成（抗体のアミノ酸配列変異体、抗体のグリコシル化変異体、および共有結合的に修飾された抗体を含む）も含まれる。
【0033】
インタクトなまたは完全な抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。各重鎖は可変領域（ＶＨ）および第１、第２および第３の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、各軽鎖は可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を含む。抗体は“Ｙ”字型をしており、Ｙの軸はジスルフィド結合を介して結合した２本の重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙの各アームは、１本の軽鎖の可変領域および定常領域に結合した１本の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域が抗原結合を担っている。両鎖の可変領域は、一般的に、抗原結合を担っており、各々３つの高度に可変の領域、すなわち、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３を含む重（Ｈ）鎖ＣＤＲ、ならびにＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３を含む軽（Ｌ）鎖ＣＤＲを含む。３つのＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に隣接しており、これらの領域はＣＤＲよりも高度に保存されており、超可変領域を支える足場を形成している。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合には関与していないが、種々のエフェクター機能に関与している。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類される。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要なクラスがある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。
【0034】
本明細書では、用語“抗原結合フラグメント”または“抗原結合ドメイン”とは、抗原結合を担うインタクトな抗体分子の一部または領域を意味する。抗原結合フラグメントは、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合できる。抗原結合フラグメントの例としては、(i) ＶＨ－ＣＨ１鎖およびＶＬ－ＣＬ鎖からなる一価フラグメントであり得るＦａｂフラグメント；(ii) ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントからなる二価フラグメントであり得るＦ（ａｂ’）２フラグメント；(iii) 抗体分子のＶＨドメインおよびＶＬドメインが非共有結合で結合したＦｖフラグメント；(iv) ペプチドリンカーを介してＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される一本鎖ポリペプチド鎖であり得る単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；(v) ペプチドリンカーによって連結された２つのＶＨドメインおよびジスルフィド橋を介して２つのＶＨドメインと結合している２つのＶＬドメインを含み得る（ｓｃＦｖ）２、が挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
本明細書で用いる用語“キメラ抗体”とは、異なる供給源、例えば異なる種由来のポリペプチドを含む抗体を意味する。ある態様において、キメラ抗体において、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、ある種の哺乳動物（例えば、マウス、ウサギおよびラットなどの非ヒト哺乳動物）由来の抗体の可変領域を模倣し得るが、一方で定常領域は、ヒトなどの別の哺乳動物由来の抗体の配列と相同であってもよい。
【0036】
本明細書で用いる用語“ヒト化抗体”とは、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および非ヒト（通常はマウスまたはラット）免疫グロブリン由来の１以上のＣＤＲを含む抗体を意味する。
【0037】
本明細書で用いる用語“ヒト抗体”とは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖および重鎖の配列の本質的に全体がヒト遺伝子由来の抗体を意味する。ある場合には、ヒト抗体は、例えば、可能性のある免疫原性を減少させ、親和性を増加させ、望ましくない折り畳み（フォールディング）を引き起こし得るシステインを除去するなどのために、１以上のＣＤＲ、または１以上のＦＲに変異を加えるなどして、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされていない１以上のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【0038】
本明細書で用いる用語“特異的に結合する（specific binds, specifically binding）”とは、標的抗原のエピトープへの抗体の結合など、２分子間の非ランダムな結合反応を意味する。標的抗原またはエピトープに“特異的に結合する”抗体は、当技術分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的結合を決定する方法も当技術分野でよく知られている。抗体が標的抗原と“特異的に結合”するのは、他の物質と結合するよりも高い親和性／結合力（avidity）で、より容易に、および／またはより長時間結合するときである。換言すれば、この定義を読めば、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的または優先的に結合しても、または結合しなくてもよいことも理解される。そのため、“特異的結合”または“優先的結合”は、必ずしも排他的結合を必要としない（含めることはできる）。一般的に、結合の親和性は解離定数（ＫＤ）で定義され得る。一般的には、抗体に関して用いられるとき、特異的に結合するとは、約１０７Ｍ未満、約１０８Ｍ未満、約１０９Ｍ未満、約１０１０Ｍ未満、約１０１１Ｍ未満、約１０１２Ｍ未満、またはそれ以下などのＫＤ値でその標的に特異的に結合（認識）し、かつ非特異的抗原（ＢＳＡまたはカゼインなど）への結合に対する親和性よりも少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低い、または少なくとも１０，０００倍低いＫＤに対応する親和性で特異的標的に結合する抗体を意味し得る。
【0039】
本明細書で用いる用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”とは、ヌクレオチド単位からなるポリマーを意味し得る。ポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（“ＤＮＡ”）およびリボ核酸（“ＲＮＡ”）のような天然核酸、ならびに天然に存在しないヌクレオチドを有する核酸類縁体が含まれる。ポリヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いて合成できる。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表されるとき、“Ｕ”が“Ｔ”に置き換わるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含まれることが理解され得る。用語“ｃＤＮＡ”とは、一本鎖または二本鎖の形態で、ｍＲＮＡと相補的または同一のＤＮＡを意味する。
【0040】
本明細書で用いる用語“相補的”とは、２つのポリヌクレオチドの相互作用する表面の位相的な互換性または一致を意味する。第１のポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一であるとき、第２のポリヌクレオチドと相補的である。したがって、配列が５’－ＡＴＡＴＣ－３’であるポリヌクレオチドは、配列が５’－ＧＡＴＡＴ－３’であるポリヌクレオチドと相補的である。
【0041】
本明細書で用いる用語“をコードする”とは、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）中のヌクレオチドの特定の配列が、ＲＮＡ転写物（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡである）の所定の配列またはアミノ酸の所定の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する天然特性、およびそこから生じる生物学的特性を意味する。したがって、遺伝子は、その遺伝子によって産生されたｍＲＮＡの転写および翻訳によって、細胞またはその他の生物学的システムでタンパク質が産生されるとき、タンパク質をコードしている。遺伝子コードの縮重の結果、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者に理解される。また、当業者は、常套技術を用いて、ポリペプチドが発現される特定の宿主生物のコドン利用を反映させるために、そこに記載されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行ってもよいことが理解される。したがって、別段の定めがない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”とは、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を包含する。
【0042】
本明細書で用いる用語“組換え核酸”とは、天然には互いに結合していない配列を有するポリヌクレオチドまたは核酸を意味する。組換え核酸はベクターの形態で存在してもよい。“ベクター”は、目的のヌクレオチド配列および調節配列を含み得る。ベクターは、所定のヌクレオチド配列を発現させるため（発現ベクター）、または所定のヌクレオチド配列を複製、操作または異なる場所間（例えば、異なる生物間）で移動させるために維持するために使用できる。ベクターは、上記の目的のために適当な宿主細胞に導入できる。“組換え細胞”とは、組換え核酸が導入された宿主細胞を意味する。“形質転換された細胞”とは、組換えＤＮＡ技術によって、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ分子が導入された細胞を意味する。
【0043】
ベクターは、プラスミド、コスミド、エピソーム、フォスミド、人工染色体、ファージ、ウイルスベクターなどを含む種々のタイプのものであってよい。一般的には、ベクターにおいて、所定のヌクレオチド配列は、ベクターが宿主細胞に導入されるとき、所定のヌクレオチド配列が調節配列の制御下で宿主細胞において発現され得るように、調節配列に作動可能に連結されている。調節配列としては、例えば、これらに限定されないが、プロモーター配列（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、Ｔ７プロモーターおよびアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）プロモーター）、開始コドン、複製起点、エンハンサー、分泌シグナル配列（例えば、α－交配因子（mating factor）シグナル)、停止コドン、および他の制御配列（例えば、シャイン・ダルガーノ配列、終止配列）が挙げられ得る。好ましくは、ベクターは、その後のスクリーニング／選択手順のためのマーカー配列（例えば、抗生物質耐性マーカー配列）をさらに含み得る。タンパク質産生の目的のために、ベクターでは、目的の所定のヌクレオチド配列は、融合ポリペプチドが産生され、その後の精製手順に有益となるように、上記の調節配列以外の別のヌクレオチド配列に連結され得る。前記融合ポリペプチドは、精製を目的としたタグ、例えばＨｉｓタグを含む。
【0044】
本明細書で用いる用語“処置”とは、障害、障害の症状もしくは状態、または障害の進行をケア、治癒、緩和、寛解、変更、救済、軽減、改善または影響を及ぼす目的で、前記障害に罹患している、障害の症状もしくは状態、障害によって誘発される障害、または障害の進行を有する対象への１以上の活性薬剤の適用または投与を意味する。
【0045】
本発明は、少なくとも部分的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびWntシグナル伝達阻害剤を用いた併用癌治療法の開発に基づく。
【0046】
ＥｐＥＸは腫瘍微小環境に寄与し、ＥｐＩＣＤは細胞運動性、増殖、生存および転移のよく研究された促進因子であるため、ＥｐＣＡＭは多くの癌種でＣＳＣマーカーとして知られている（Gires et al.2009; Lin et al., 2012; Park et al., 2016; Yu et al., 2017; Liang et al., 2018; Herreros-Pomares et al, 2018; Gires et al., 2020; Chen et al., 2020）。さらに重要なことに、可溶性ＥｐＩＣＤは、β－カテニンおよびFour and one-half LIMドメインタンパク質２（ＦＨＬ２）と称される足場タンパク質と多重タンパク質－核複合体を形成することが知られている。このタンパク質複合体は核内に移動し、そこでＴ細胞因子（ＴＣＦ）またはリンパ系エンハンサー因子１（ＬＥＦ－１）およびＤＮＡと、正統なWntシグナル伝達経路を思わせる方法で結合する（Maetzel et al., 2009; Ralhan et al, 2010; Park et al.2016; Yu et al., 2017)。しかしながら、ＥｐＥＸがWnt経路と何らかの形で協調しているかどうかは不明である。そこで本発明者らは、ＥｐＥＸがWntシグナル伝達に機能的に関与しているかどうかを調べ、ＥｐＥＸを標的として、造血幹細胞におけるＥｐＩＣＤおよびβ－カテニンの細胞内シグナル伝達を調節できるのではないかと予期した。
【0047】
本発明において、驚くべきことに、ＥｐＥＸはWnt受容体であるＦＺＤ６／７およびＬＲＰ５／６と相互作用し、β－カテニンの核内移行を促進すること、またＥｐＩＣＤはWnt受容体および幹細胞性（stemness）因子の転写を促進することが見出された。また、WntリガンドおよびＥｐＥＸは、正のフィードバックとしてＥｐＣＡＭ切断酵素ＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼを活性化し、ＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤの産生を増強することも見出されている。これらの機序は癌幹細胞性を誘導し、ＥｐＥＸを標的とするＥｐＣＡＭ阻害剤（例えば、抗ＥｐＣＡＭ中和抗体、例えばＥｐＡｂ２－６）およびWnt阻害剤（例えば、ポルクピン阻害剤、例えばＬＧＫ９７４）を利用することは、ＣＳＣのアポトーシスを誘導することが見出されている。この組合せは、潜在的な治療戦略を提供し、特に、腫瘍の進行および／または転移を減少させること、および／または癌患者の生存を延長させることにおいて優れた効果を与える。
【0048】
本明細書で用いる“併用療法”とは、２以上の治療薬またはアプローチを組み合わせた治療を意味する。“併用”とは、２以上の治療薬または治療アプローチが、同じ対象に、同時にまたは順番に投与されることを意味する。好ましくは、併用療法は相乗効果をもたらす。
【0049】
本明細書で用いる用語“相乗効果”とは、２以上の活性物質の組合せにおいて、２以上の活性物質の組み合わせ活性が各活性物質単独の活性の合計を超えるような組み合わせ作用を意味し、またそれを含む。また、用語“相乗効果”とは、２以上の活性物質を併用したとき、単一物質を用いたときと比較して、同等の活性または増強された活性を達成するために、それぞれのより低用量を用い得るような併用活性を提供することも意味し得る。
【0050】
したがって、本発明は、癌を処置するための併用療法であって、（i）ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤（ＥｐＣＡＭ阻害剤）；および、（ii）Wntシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤（Wnt阻害剤）を含む組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む、併用療法を提供する。
【0051】
ある態様において、第１の阻害剤（ＥｐＣＡＭ阻害剤）は、ＥｐＥＸの産生（または放出）を減少させ、および／またはＥｐＥＸのWnt受容体への結合を阻止する。ある場合には、第１の阻害剤は、ＥｐＥＸに対する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【0052】
いくつかの態様において、本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体は、ＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメインＩ（ＥｐＣＡＭのａａ２７～５９）およびＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメインＩＩ（ＥｐＣＡＭのａａ６６～１３５）に特異的に結合する。具体的には、本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体は、ＥＧＦ様ドメインＩに位置するＣＶＣＥＮＹＫＬＡＶＮ（ａａ２７～３７）（配列番号２０）、およびＥＧＦ様ドメインＩＩに位置するＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤ（ａａ ８３～１００）（配列番号１９）の配列内のエピトープに特異的結合親和性を有する。より具体的には、本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体は、ＥｐＣＡＭのドメインＩ内のＮＹＫモチーフ（ａａ ３１－３３）およびドメインＩＩ内のＬＹＤモチーフ（ａａ ９４－９６）を認識する。対照的に、他の多くの抗体（例えば、ＭＴ２０１、Ｍ９７、３２３／Ａ３およびエドレコロマブ）は、ＥｐＣＡＭのよく知られているＥＧＦ Ｉドメインのみを標的としている。本発明の抗ＥｐＥＸ抗体の、他の抗体とは異なる特徴を以下に述べる。
【0053】
本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体の１つは、以下の実施例に示すＥｐＡｂ２－６である。ＥｐＡｂ２－６の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにそれらの相補性決定領域（ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３）（ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を、以下の表１に示す。本発明の抗ＥｐＥＸ抗体には、ＥｐＡｂ２－６およびその機能変異体が含まれる。
【0054】
【表1】
【0055】
いくつかの態様において、本発明の抗ＥｐＥＸ抗体は、(a) 配列番号２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４のＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号６のＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに、(b) 配列番号９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣ ＣＤＲ２、および配列番号１３のＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬを含むことを特徴とするＥｐＡｂ２－６の機能的変異体、またはその抗原結合フラグメントである。
【0056】
いくつかの態様において、(a) 配列番号２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４のＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号６のＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに、(b) 配列番号９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣ ＣＤＲ２、および配列番号１３のＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬを有する、本発明の抗ＥｐＥＸ抗体は、配列番号１５またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み得る。具体的には、本発明の抗ＥｐＥＸ抗体、配列番号１５と少なくとも８０％（例えば、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６と少なくとも８０％（例えば、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。本発明の抗ＥｐＥＸ抗体には、本明細書に記載の関連するＶＨまたはＶＬアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列によってコードされる、遺伝子組換え（engineered）由来の抗体も含まれる。
【0057】
用語“実質的に同一”とは、変異体の関連アミノ酸配列（例えば、ＦＲ、ＣＤＲ、ＶＨ、またはＶＬにおいて）が参照（reference）抗体と比較して実質的に差異がなく、変異体が参照抗体に対して実質的に同等の結合活性（例えば、親和性、特異性またはその両方）および生物活性を有することを意味し得る。このような変異体には、わずかなアミノ酸の変化が含まれ得る。ポリペプチドは、その活性または機能とは無関係に、ポリペプチドのある部分内でなされ得る限られた数の変化または修飾を有していてもよく、それでもなお、同等または類似の生物学的活性または機能の許容可能なレベルを有する変異体が得られることが理解され得る。いくつかの例では、アミノ酸残基の変化は保存的アミノ酸置換であり、これは別のアミノ酸残基と類似の化学構造のアミノ酸残基を意味し、ポリペプチドの機能、活性または特性に対する他の生物学的影響は小さいか、実質的に影響しない。通常、ＦＲ領域では、ＣＤＲ領域とは対照的に、抗体の結合機能および生物活性に悪影響を与えない限り（例えば、元の抗体と比較して結合親和性を５０％以上低下させるなど）、比較的多くの置換を行うことができる。ある態様において、配列同一性は、参照抗体と変異体との間で、約８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、または９９％、またはそれ以上であり得る。変異体は、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、例えば、そのような方法をまとめた文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されている。例えば、アミノ酸の保存的置換には、以下のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ｉ）Ａ、Ｇ；（ｉｉ）Ｓ、Ｔ；（ｉｉｉ）Ｑ、Ｎ；（ｉｖ）Ｅ、Ｄ；（ｖ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｖｉ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；および、（ｖｉｉ）Ｋ、Ｒ、Ｈ。
【0058】
本明細書に記載の抗体は、動物抗体（例えば、マウス由来抗体）、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。本明細書に記載の抗体は、抗原結合フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２も含み得る。抗体またはその抗原結合フラグメントは、当技術分野で公知の方法により調製できる。
【0059】
本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体の詳細は、米国特許第９，１８７，５５８号に記載されている通りであり、それぞれの関連する記載は、本明細書で言及される目的または主題について、引用により本明細書に包含させる。
【0060】
抗体またはその抗原結合フラグメントを得るためには、この技術分野で従来から用いられている数多くの方法が利用可能である。
【0061】
ある態様において、本明細書で提供される抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって作製できる。一般に、標的抗原、例えば腫瘍抗原を、要すれば担体タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ、および／またはアジュバント、例えば完全フロイントアジュバントと混合し、その抗原に結合する抗体を生成するために宿主動物を免疫するために使用できる。モノクローナル抗体を分泌するリンパ球を採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製する。このようにして形成されたハイブリドーマクローンをスクリーニングし、目的のモノクローナル抗体を分泌するものを同定し選択する。
【0062】
ある態様において、本明細書で提供される抗体は組換え技術によって調製できる。関連する局面において、開示されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸もまた、そのような核酸を含むベクターおよびその核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞とともに、提供される。
【0063】
例えば、このような抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、常套技術により発現ベクター（例えば、大腸菌ベクターのような細菌ベクター、酵母ベクター、ウイルスベクター、または哺乳動物ベクター）にクローニングでき、抗体の発現のために、いずれかのベクターを適切な細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞）に導入できる。本明細書に記載の抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列の例を表１に示す。哺乳動物宿主細胞株の例としては、ヒト胚性腎臓株（２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ細胞）、およびヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２細胞）が挙げられる。本明細書に記載の抗体を発現させるための組換えベクターは、通常、構成性または誘導性のいずれかのプロモーターに作動可能に連結された抗体アミノ酸配列をコードする核酸を含む。一般的なベクターは、抗体をコードする核酸の発現制御に有用な転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列ならびにプロモーターを含む。ベクターは、要すれば、原核生物系および真核生物系の両方の選択マーカーを含み得る。いくつかの例では、重鎖および軽鎖の両方のコーディング配列が同じ発現ベクターに含まれている。他の例では、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれを個別のベクターにクローニングし、別々に作製した後、抗体の組み立てに適した条件下でインキュベートできる。
【0064】
本明細書に記載の抗体を発現させるための組換えベクターは、通常、構成性または誘導性のいずれかのプロモーターに作動可能に連結された抗体アミノ酸配列をコードする核酸を含む。組換え抗体は、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞などの原核生物または真核生物の発現系で生産できる。一般的なベクターは、抗体をコードする核酸の発現制御に有用な転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列ならびにプロモーターを含む。ベクターは、要すれば、原核生物系と真核生物系の両方の選択マーカーを含み得る。産生された抗体タンパク質は、さらに単離または精製して、さらなるアッセイおよび適用のために実質的に均質な調製物を得ることができる。適切な精製手順としては、例えば、免疫親和性カラムまたはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、硫酸アンモニウム沈殿、およびゲルろ過が挙げられる。
【0065】
完全長抗体が望まれるとき、本明細書に記載のＶＨ鎖およびＶＬ鎖の何れかのコーディング配列を免疫グロブリンのＦｃ領域のコーディング配列に連結でき、完全長抗体重鎖および軽鎖をコードする得られた遺伝子を適当な宿主細胞、例えば植物細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、または昆虫細胞で発現させ、組み立てることができる。
【0066】
抗原結合フラグメントは常套法で調製できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは全長抗体分子のペプシン消化によって生成でき、ＦａｂフラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって作製することができる。あるいは、このようなフラグメントは、適切な宿主細胞で重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを発現させ、インビボまたはインビトロのいずれかで所望の抗原結合フラグメントを形成するように集合させることにより、組換え技術によって調製することもできる。１本鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することにより、組換え技術によって調製できる。好ましくは、フレキシブルリンカーが２つの可変領域の間に組み込まれている。
【0067】
抗体のＮ末端および／またはＣ末端に、別のタンパク質および／または薬物もしくは担体など、１以上の追加の要素を結合させるために、１つの抗体をさらに修飾できる。好ましくは、追加の要素を結合させた抗体は、所望の結合特異性および治療効果を保持する一方で、例えば、溶解性、保存または他の取り扱い特性、細胞透過性、半減期、過敏症の軽減、送達および／または分布の制御を補助する追加の要素に起因する追加の特性を提供する。他の態様には、アッセイ、検出、追跡などのための色素または蛍光色素などの標識の結合が含まれる。ある態様では、抗体をペプチド、色素、フルオロフォア、炭水化物、抗癌剤、脂質などの追加の要素に結合させ得る。さらに、抗体は、例えば、免疫リポソームを形成するために、Ｆｃ領域を介してリポソームの表面に直接結合させることができる。
【0068】
ある態様において、第２の阻害剤（Wnt阻害剤）は、WntリガンドのWnt受容体タンパク質への結合を阻止する。具体的には、WntリガンドはＥｐＥＸではない。
【0069】
ある態様において、第２の阻害剤（Wnt阻害剤）は、ポルクピン阻害剤である。ポルクピン（ＰＯＲＣＮ）は、Wntの分泌および生物活性に必要とされるWntファミリータンパク質のパルミトイル化を仲介する膜結合Ｏ－アシルトランスフェラーゼである。したがって、ポルクピン阻害剤は、Wntシグナル伝達を阻害することができる。低分子ＰＯＲＣＮ阻害化合物としては、例えば、ＬＧＫ－９７４、ＥＴＣ－１５９およびWnt－Ｃ５９が挙げられる。表２は、低分子ＰＯＲＣＮ阻害化合物のいくつかの例を示す。
【0070】
【表2】
【0071】
本明細書で用いる用語“低分子ポルクピン（ＰＯＲＣＮ）阻害化合物”または“低分子ＰＯＲＣＮ阻害剤”としては、ポルクピンを阻害する、またはポルクピンに結合する低分子化合物が含まれる。別段に他の記載がない限り、本明細書において低分子ＰＯＲＣＮ阻害剤に言及する場合、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物および複合体、ならびにその薬学的に許容される塩（その多形、立体異性体、同位体標識体を含む）の溶媒和物、水和物および複合体への言及を含む。
【0072】
本明細書で用いる用語“薬学的に許容される塩”には酸付加塩が含まれる。“薬学的に許容される酸付加塩”とは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸を用いて形成される、遊離塩基の生物学的効果および特性を保持する塩を意味する。用語“薬学的に許容される塩”には塩基塩も含まれる。適切な塩基性塩は、無毒性の塩を形成する塩基から形成される。例えば、アルミニウム塩、アルギニン塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジオラミン塩、グリシン塩、リジン塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、オラミン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩、亜鉛塩などが挙げられる。
【0073】
本明細書で用いる用語“有効量”とは、処置された対象または細胞に所望の生物学的効果を付与するための有効成分の量を意味する。有効量は、投与経路および投与頻度、当該医薬を投与される個体の体重および種類、投与目的などの種々の理由により変化し得る。当業者は、本明細書の記載、確立された方法、および自身の経験に基づいて、それぞれの場合の投与量を決定できる。
【0074】
本明細書に記載の処置方法によって処置される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。哺乳類動物には、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長動物、馬、犬、猫、マウス、ラットなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0075】
本明細書で用いる“薬学的に許容される担体”とは、担体が組成物中の有効成分と適合性があり、好ましくは当該有効成分を安定化させることができ、受容する個体に対して安全であることを意味する。前記担体は、有効成分に対する希釈剤、ビークル、賦形剤またはマトリックスであってもよい。一般に、ＥｐＣＡＭ阻害剤、Wnt阻害剤、またはそれらの組合せを含む組成物は、水溶液、例えば生理食塩水のような溶液の形態で製剤化することもでき、粉末の形態で提供することもできる。適切な賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルボース、マンノース、デンプン、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤および緩衝剤をさらに含んでいてもよい。組成物の形態は、錠剤、丸薬、粉末、ロゼンジ、分包、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、ローション、溶液、シロップ、ソフトおよびハードゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、および包装粉末であり得る。本発明の組成物は、経口法、経腸法（筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内など）、経皮法、座薬法、経鼻法など、生理学的に許容される何れかの経路で送達できる。特定の態様において、本発明の組成物は、即時使用可能な剤形として、または再構成可能な安定粉末として提供され得る液体注射剤形として投与される。
【0076】
いくつかの態様において、本発明で用いる２つの活性成分、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびWnt阻害剤は、対象への同時投与、個別投与または逐次投与のために、混合物として、または独立して、キットの形態で製剤化できる。各成分は、適切な投与経路のために、適切な薬学的に許容される担体と共に製剤化できる。ある態様において、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびWnt阻害剤は、ＥｐＣＡＭ阻害剤またはそれを含む組成物およびWnt阻害剤またはそれを含む組成物が別個の包装単位内に存在する適切な包装単位で提供され得る。
【0077】
本発明によれば、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびWnt阻害剤の併用は、ＥｐＣＡＭ阻害剤またはWnt阻害剤単独と比較して、癌の治療、特に癌細胞のアポトーシス誘導、腫瘍進行の低減または抑制、癌肝細胞性および／または転移の低減または抑制、および／または癌患者の生存期間の延長において相乗効果をもたらす。特に、実施例（例えば、実施例２．７）に示す、転移性モデルにおいて、ＥｐＣＡＭ阻害剤としてのＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）またはＥｐＣＡＭ阻害剤としてのＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）とＥｐＣＡＭ阻害剤（ＬＧＫ９７４）との組合せの何れかによる処置は、対照ＩｇＧまたはＥｐＣＡＭ阻害剤（ＬＧＫ９７４）処置群のほとんどの動物が明確な転移および全生存期間の低下を示す一方で、生存期間を延長することができ、同様に、同所性モデルにおいて、対照ＩｇＧまたはＥｐＣＡＭ阻害剤（ＬＧＫ９７４）処置群の動物は有意な腫瘍を発症し、低い生存期間中央値を示す一方で、ＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）処置群はより遅い腫瘍進行およびより高い生存期間中央値を示し、驚くべきことに、ＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）およびＥｐＣＡＭ阻害剤（ＬＧＫ９７４）を用いた併用療法は、腫瘍進行の減少において相乗的に顕著な効果をもたらし（約６０％（４/６）の動物が腫瘍を完全に含まないことが見出される）、全生存期間が延長される。
【0078】
いくつかの態様において、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびWnt阻害剤は、相乗的な抗癌作用または抗転移効果を提供するために、同時に、別個にまたは逐次的に投与され、特に、癌は相乗的な組み合わせに対して感受性である。
【0079】
いくつかの態様において、癌は、肺癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌および精巣癌からなる群より選択される。
【0080】
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定ではなく実証の目的で提供される。当業者であれば、本明細書の記載に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、記載されている特定の態様に多くの変更を加えても、同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【0081】
実施例
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、多面発現性（pleiotropic type）１型膜貫通糖タンパク質であり、既知の癌幹細胞マーカーであるが、癌幹細胞性への関与の機序は依然として不明である。本発明において、本発明者らは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）モデル系を用いて、癌幹細胞性を促進するＥｐＣＡＭとWntシグナル伝達との相互作用を明らかにし、定義した。ＥｐＣＡＭ（ＥｐＥＸ）の細胞外ドメインが、シグナル伝達を誘導するWnt受容体タンパク質ｆｒｉｚｚｌｅｄ６／７およびＬＲＰ５／６のリガンドとして機能することを実証する。さらに、細胞内ドメイン（ＥｐＩＣＤ）は、このようなWnt受容体および重要な幹細胞性因子をコードする遺伝子の転写を上方制御する。興味深いことに、ＥｐＥＸ誘導性Wntシグナル伝達は、ＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤの脱落を増強するＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼ酵素を活性化し、正のフィードバックループを確立する。このメカニズムに沿って、本発明者らのＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）およびポルクピン阻害薬（ＬＧＫ９７４）はそれぞれ、癌幹細胞性を部分的に減弱させることができるが、それらの組合せはこの現象を消失させ、ＣＲＣ細胞にアポトーシスを誘導する。この併用療法はまた、ヒトＣＲＣの転移性および同所性動物モデルにおける腫瘍進行を顕著に阻害し、実質的に生存期間を延長させる。ＥｐＣＡＭ活性化はWntシグナル伝達を刺激して癌幹細胞性を促進すると結論付ける。このように、ＥｐＡｂ２－６およびポルクピン阻害剤の組合せは、癌幹細胞性を効果的に抑制し、薬物耐性を克服し、かつＣＲＣ処置を改善し得る。
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、多面発現性（pleiotropic type）１型膜貫通糖タンパク質であり、既知の癌幹細胞マーカーであるが、癌幹細胞性への関与の機序は依然として不明である。本発明において、本発明者らは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）モデル系を用いて、癌幹細胞性を促進するＥｐＣＡＭとWntシグナル伝達との相互作用を明らかにし、定義した。ＥｐＣＡＭ（ＥｐＥＸ）の細胞外ドメインが、シグナル伝達を誘導するWnt受容体タンパク質ｆｒｉｚｚｌｅｄ６／７およびＬＲＰ５／６のリガンドとして機能することを実証する。さらに、細胞内ドメイン（ＥｐＩＣＤ）は、このようなWnt受容体および重要な幹細胞性因子をコードする遺伝子の転写を上方制御する。興味深いことに、ＥｐＥＸ誘導性Wntシグナル伝達は、ＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤの脱落を増強するＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼ酵素を活性化し、正のフィードバックループを確立する。このメカニズムに沿って、本発明者らのＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）およびポルクピン阻害薬（ＬＧＫ９７４）はそれぞれ、癌幹細胞性を部分的に減弱させることができるが、それらの組合せはこの現象を消失させ、ＣＲＣ細胞にアポトーシスを誘導する。この併用療法はまた、ヒトＣＲＣの転移性および同所性動物モデルにおける腫瘍進行を顕著に阻害し、実質的に生存期間を延長させる。ＥｐＣＡＭ活性化はWntシグナル伝達を刺激して癌幹細胞性を促進すると結論付ける。このように、ＥｐＡｂ２－６およびポルクピン阻害剤の組合せは、癌幹細胞性を効果的に抑制し、薬物耐性を克服し、かつＣＲＣ処置を改善し得る。
【0082】
１．材料および方法
１．１ 細胞培養
ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＣＴ２６、ＳＷ６２０、ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞株を用いて試験を行った。ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＨＥＫ２９３Ｔはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco）中で培養し、ＣＴ２６細胞およびＳＷ６２０細胞はそれぞれＲＰＭＩ１６４０（Gibco）およびＬ－１５（Gibco）培地で培養した。培地には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Gibco）、１％Ｌ－グルタミン（Gibco）および１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Gibco）を添加した。ＳＷ６２０を除くすべての細胞を５％ＣＯ２中３７℃で増殖させた。ＳＷ６２０細胞を０％ＣＯ２中３７℃で増殖させた。
１．１ 細胞培養
ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＣＴ２６、ＳＷ６２０、ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞株を用いて試験を行った。ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＨＥＫ２９３Ｔはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco）中で培養し、ＣＴ２６細胞およびＳＷ６２０細胞はそれぞれＲＰＭＩ１６４０（Gibco）およびＬ－１５（Gibco）培地で培養した。培地には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Gibco）、１％Ｌ－グルタミン（Gibco）および１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Gibco）を添加した。ＳＷ６２０を除くすべての細胞を５％ＣＯ２中３７℃で増殖させた。ＳＷ６２０細胞を０％ＣＯ２中３７℃で増殖させた。
【0083】
増殖曲線については、各細胞株について６ウェルプレートを用いて１０４個の細胞をトリプレットに播種した。各トリプレットを血球計を用いて計数し、その計数を１日目から８日目まで毎日平均した。データセット全体を収集した後、点をプロットして増殖曲線を分析し、細胞倍加時間を計算した。
【0084】
１．２ 細胞分画
細胞（１×１０６）を一晩播種し、さらに無血清条件下で増殖させた。次いで、細胞をさらに２０μｇ／ｍＬ ｍＥｐＡｂ２－６またはｈＥｐＡｂ２－６またはＭＴ２０１で６時間、または４００ｎｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）で９時間、または指示された組合せで処理した。製造業者のプロトコルに従って、核／サイトゾル分画キット（Biovision）を用いて、サンプルをサイトゾルおよび核抽出物に分画した。次いで、画分をウェスタンブロット分析に供した。
細胞（１×１０６）を一晩播種し、さらに無血清条件下で増殖させた。次いで、細胞をさらに２０μｇ／ｍＬ ｍＥｐＡｂ２－６またはｈＥｐＡｂ２－６またはＭＴ２０１で６時間、または４００ｎｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）で９時間、または指示された組合せで処理した。製造業者のプロトコルに従って、核／サイトゾル分画キット（Biovision）を用いて、サンプルをサイトゾルおよび核抽出物に分画した。次いで、画分をウェスタンブロット分析に供した。
【0085】
１．３ ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングのために、ホスファターゼ阻害剤（Roche）およびプロテアーゼ阻害剤（Roche）カクテルを含む放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液［（０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１％ノニデットＰ－４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ）］を用いて細胞を抽出した。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＴＢＳＴ中の３％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）でブロックし、ブロッキング溶液中で必要な一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜をブロッキング溶液中のＨＲＰ結合二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、タンパク質発現を検出した。用いた抗体：抗α－チューブリン（Sigma）、抗ＥｐＣＡＭ（abcam）、抗活性β－カテニン（Millipore）、抗総β－カテニン（abcam）、抗Frizzled 6（CST）、抗Frizzled 7（Santa Cruz Biotech）、抗ＬＲＰ５（abcam）、抗ホスホ－ＬＲＰ５（abcam）、抗ホスホ－ＬＲＰ ６（CST）、抗ＬＲＰ６（CST）および抗ＥｐＥＸ抗体ＥｐＡｂ３－５（実験室で作製）、抗ＡＤＡＭ１７（abcam）、抗ホスホＡＤＡＭ１７（abcam）、抗プレセニリン２（abcam）、抗リン酸化プレセニリン２（Ｓ３２７）（abcam）、抗リン酸化プレセニリン２（Ｓ３３０）（abcam）および抗Ａｘｉｎ２（CST）。
ウェスタンブロッティングのために、ホスファターゼ阻害剤（Roche）およびプロテアーゼ阻害剤（Roche）カクテルを含む放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液［（０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１％ノニデットＰ－４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ）］を用いて細胞を抽出した。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＴＢＳＴ中の３％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）でブロックし、ブロッキング溶液中で必要な一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜をブロッキング溶液中のＨＲＰ結合二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、タンパク質発現を検出した。用いた抗体：抗α－チューブリン（Sigma）、抗ＥｐＣＡＭ（abcam）、抗活性β－カテニン（Millipore）、抗総β－カテニン（abcam）、抗Frizzled 6（CST）、抗Frizzled 7（Santa Cruz Biotech）、抗ＬＲＰ５（abcam）、抗ホスホ－ＬＲＰ５（abcam）、抗ホスホ－ＬＲＰ ６（CST）、抗ＬＲＰ６（CST）および抗ＥｐＥＸ抗体ＥｐＡｂ３－５（実験室で作製）、抗ＡＤＡＭ１７（abcam）、抗ホスホＡＤＡＭ１７（abcam）、抗プレセニリン２（abcam）、抗リン酸化プレセニリン２（Ｓ３２７）（abcam）、抗リン酸化プレセニリン２（Ｓ３３０）（abcam）および抗Ａｘｉｎ２（CST）。
【0086】
１．４ ＴＣＦ活性
細胞を５×１０３細胞／ウェルで播種し、１２ウェルプレートで一晩増殖させた。次いで、細胞を、ポリジェットトランスフェクション剤（SignaGen）を用いて、TOP-Flash TCFレポータープラスミド（Millipore）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、２０μｇ／ｍＬ抗ＥｐＣＡＭ ＥｐＡｂ２－６（実験室内製造）またはＭＴ２０１（実験室内製造）で６時間、または４００ｎｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）で９時間、または指示された組合せで処理した。さらに、細胞を、ＥｐＥＸ（Ｅｘｐｉ２９３発現システムによって実験室内製造）または組換えWnt３Ａ（Ｒ＆Ｄシステム）またはその組合せで８時間処理した。最後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼアッセイを実施した。
細胞を５×１０３細胞／ウェルで播種し、１２ウェルプレートで一晩増殖させた。次いで、細胞を、ポリジェットトランスフェクション剤（SignaGen）を用いて、TOP-Flash TCFレポータープラスミド（Millipore）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、２０μｇ／ｍＬ抗ＥｐＣＡＭ ＥｐＡｂ２－６（実験室内製造）またはＭＴ２０１（実験室内製造）で６時間、または４００ｎｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）で９時間、または指示された組合せで処理した。さらに、細胞を、ＥｐＥＸ（Ｅｘｐｉ２９３発現システムによって実験室内製造）または組換えWnt３Ａ（Ｒ＆Ｄシステム）またはその組合せで８時間処理した。最後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼアッセイを実施した。
【0087】
１．５ 免疫組織化学的染色
ヒト結腸癌組織アレイをBiomaxから購入した。切片をキシレン中で脱脂し、アルコール濃度を低下させた一連の溶液で再水和した。抗原回収を、Trilogy TM（Cell Marque）で同時に行った。ペルオキシダーゼブロッキングのために、切片をＨ２Ｏ２（３％）を含むメタノール中、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。切片をさらにＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に、室温で３０分間インキュベートして、非特異的結合をブロックした。一次抗体に続いて、抗活性β－カテニン（Millipore）および抗ＥｐＥＸ抗体ＥｐＡｂ３－５（実験室内製造）を適用し、サンプルを４℃で一晩インキュベートした。次に、切片を０．１％Tween 20（ＰＢＳＴ０．１）（Thermo）を含むＰＢＳで洗浄し、スーパーセンシティブスーパーエンハンサー（Super Sensitive Super Enhancer）試薬を用いて室温で２０分間処理した。次いで、サンプルをＰＢＳＴ０．１で３回濯いだ。その後、切片をポリマー－ＨＲＰ試薬を用いて室温で３０分間処理し、次いで、ＰＢＳＴ０．１で３回濯いだ。次に、ペルオキシダーゼ活性を可視化するために、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を色素原として用いた。タンパク質強度の定量は、Ｆｉｊｉ－Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて行った。
ヒト結腸癌組織アレイをBiomaxから購入した。切片をキシレン中で脱脂し、アルコール濃度を低下させた一連の溶液で再水和した。抗原回収を、Trilogy TM（Cell Marque）で同時に行った。ペルオキシダーゼブロッキングのために、切片をＨ２Ｏ２（３％）を含むメタノール中、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。切片をさらにＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に、室温で３０分間インキュベートして、非特異的結合をブロックした。一次抗体に続いて、抗活性β－カテニン（Millipore）および抗ＥｐＥＸ抗体ＥｐＡｂ３－５（実験室内製造）を適用し、サンプルを４℃で一晩インキュベートした。次に、切片を０．１％Tween 20（ＰＢＳＴ０．１）（Thermo）を含むＰＢＳで洗浄し、スーパーセンシティブスーパーエンハンサー（Super Sensitive Super Enhancer）試薬を用いて室温で２０分間処理した。次いで、サンプルをＰＢＳＴ０．１で３回濯いだ。その後、切片をポリマー－ＨＲＰ試薬を用いて室温で３０分間処理し、次いで、ＰＢＳＴ０．１で３回濯いだ。次に、ペルオキシダーゼ活性を可視化するために、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を色素原として用いた。タンパク質強度の定量は、Ｆｉｊｉ－Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて行った。
【0088】
１．６ 免疫蛍光染色
スライドグラスを２４穴プレートに用いて、０．１%ゼラチンでコーティングした。さらに、３×１０４個の細胞を無血清培地に一晩播種した。細胞を２０μｇ／ｍＬ ＥｐＡｂ２－６で６時間、または４００ｎｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）で９時間、またはその組合せで処理した。細胞を氷冷ＰＢＳを用いて洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。さらに、細胞をＰＢＳ中の０．１％トライトン－Ｘを用いて２０分間透過処理し、次いでＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＢＳ中３％ＢＳＡで室温にて１時間ブロッキングした。次に、細胞を一次抗体抗活性β－カテニン（Millipore）で一晩処理した。次いで、細胞を洗浄し、ＰＢＳおよびＤＡＰＩを含む３％ＢＳＡ中の二次抗体で室温にて１時間処理した。次いで、サンプルをＰＢＳで５回洗浄し、顕微鏡用にマウントした。核β－カテニン強度を、ＩＭＡＲＩＳ（Oxford Instruments）ソフトウェアを用いて計算した。
スライドグラスを２４穴プレートに用いて、０．１%ゼラチンでコーティングした。さらに、３×１０４個の細胞を無血清培地に一晩播種した。細胞を２０μｇ／ｍＬ ＥｐＡｂ２－６で６時間、または４００ｎｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）で９時間、またはその組合せで処理した。細胞を氷冷ＰＢＳを用いて洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。さらに、細胞をＰＢＳ中の０．１％トライトン－Ｘを用いて２０分間透過処理し、次いでＰＢＳで洗浄した。細胞をＰＢＳ中３％ＢＳＡで室温にて１時間ブロッキングした。次に、細胞を一次抗体抗活性β－カテニン（Millipore）で一晩処理した。次いで、細胞を洗浄し、ＰＢＳおよびＤＡＰＩを含む３％ＢＳＡ中の二次抗体で室温にて１時間処理した。次いで、サンプルをＰＢＳで５回洗浄し、顕微鏡用にマウントした。核β－カテニン強度を、ＩＭＡＲＩＳ（Oxford Instruments）ソフトウェアを用いて計算した。
【0089】
１．７ 定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＴＲＩ試薬を用いて全ＲＮＡを抽出し、５μｇの全ＲＮＡを逆転写酵素を用いてオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてさらに逆転写した。Light Cycler 480 SYBR Green-I MasterキットおよびLightCycler480 Systemを用いて、ｃＤＮＡに対して定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。各サンプルの遺伝子発現レベルを、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）またはβ－アクチンの発現レベルに対して標準化した。ｑＰＣＲで用いたプライマーを表３に列挙する。
ＴＲＩ試薬を用いて全ＲＮＡを抽出し、５μｇの全ＲＮＡを逆転写酵素を用いてオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてさらに逆転写した。Light Cycler 480 SYBR Green-I MasterキットおよびLightCycler480 Systemを用いて、ｃＤＮＡに対して定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。各サンプルの遺伝子発現レベルを、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）またはβ－アクチンの発現レベルに対して標準化した。ｑＰＣＲで用いたプライマーを表３に列挙する。
【0090】
【表3】
【0091】
１．８ ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞を、Ｐｏｌｙ ＪＥＴトランスフェクションキットを用いて、パッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ－ΔＲ８．９１）と、エンベロープ（ｐＭＤＧ）およびｓｈＲＮＡ（ｓｈＥｐＣＡＭ＃１およびｓｈＥｐＣＡＭ＃２）含有プラスミドとを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ウイルス含有上清を回収し、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を含有する新鮮培地と混合し、標的細胞と共にさらに４８時間インキュベートした。形質導入された細胞を必要な抗生物質で選択し、単一クローンを選択して安定なクローンに増殖させた。
ＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞を、Ｐｏｌｙ ＪＥＴトランスフェクションキットを用いて、パッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ－ΔＲ８．９１）と、エンベロープ（ｐＭＤＧ）およびｓｈＲＮＡ（ｓｈＥｐＣＡＭ＃１およびｓｈＥｐＣＡＭ＃２）含有プラスミドとを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ウイルス含有上清を回収し、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）を含有する新鮮培地と混合し、標的細胞と共にさらに４８時間インキュベートした。形質導入された細胞を必要な抗生物質で選択し、単一クローンを選択して安定なクローンに増殖させた。
【0092】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＥｐＣＡＭノックアウトについては、ＥＰＣＡＭ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（標的配列：ＧＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡＣ（配列番号４１）、ベクター：ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２）をGenScriptから購入し、上記の手順に従ってレンチウイルスの産生およびクローン選択を行った。
【0093】
１．９ 腫瘍スフェアアッセイ
細胞を、超低接着性６ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）または２４ウェルプレート（１×１０３細胞／ウェル）に播種し、Ｂ２７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２中で維持した。さらに、細胞を２０μｇ／ｍＬ ｍＥｐＡｂ２－６、ｈＥｐＡｂ２－６またはＭＴ２０１（実験室内製造）、または４００ｎｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）、またはその組合せで、培養培地への直接添加によって処理した。処理成分を含む全培養培地を１日おきに交換した。細胞を１０日間培養し、１０日目にスフェアを計数し、顕微鏡下で写真撮影した。
細胞を、超低接着性６ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）または２４ウェルプレート（１×１０３細胞／ウェル）に播種し、Ｂ２７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２中で維持した。さらに、細胞を２０μｇ／ｍＬ ｍＥｐＡｂ２－６、ｈＥｐＡｂ２－６またはＭＴ２０１（実験室内製造）、または４００ｎｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）、またはその組合せで、培養培地への直接添加によって処理した。処理成分を含む全培養培地を１日おきに交換した。細胞を１０日間培養し、１０日目にスフェアを計数し、顕微鏡下で写真撮影した。
【0094】
１．１０ コロニー形成アッセイ
細胞を１２ウェルプレートに播種し（５×１０３細胞／ウェル）、２０μｇ／ｍＬのｍＥｐＡｂ２－６、ｈＥｐＡｂ２－６またはＭＴ２０１（実験室内製造）、４００ｎｇ／ｍＬのＬＧＫ９７４（MedChemExpress）、または指示された組合せで処理し、この場合、各要素は培地に直接添加した。処理成分と共に培地を隔日で交換し、細胞を１０日間増殖させた。１０日目に、細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらに１％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。コロニーをＰＢＳで３回洗浄し、画像を撮影した。さらに、コロニー密度を測定するために、ウェルを０．５％ＳＤＳと共に室温で２時間振盪しながらインキュベートした。上清を回収し、マイクロプレートリーダーを用いて溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。
細胞を１２ウェルプレートに播種し（５×１０３細胞／ウェル）、２０μｇ／ｍＬのｍＥｐＡｂ２－６、ｈＥｐＡｂ２－６またはＭＴ２０１（実験室内製造）、４００ｎｇ／ｍＬのＬＧＫ９７４（MedChemExpress）、または指示された組合せで処理し、この場合、各要素は培地に直接添加した。処理成分と共に培地を隔日で交換し、細胞を１０日間増殖させた。１０日目に、細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらに１％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。コロニーをＰＢＳで３回洗浄し、画像を撮影した。さらに、コロニー密度を測定するために、ウェルを０．５％ＳＤＳと共に室温で２時間振盪しながらインキュベートした。上清を回収し、マイクロプレートリーダーを用いて溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。
【0095】
１．１１ インビトロ再生アッセイ
対照およびＥｐＣＡＭノックアウト細胞（５×１０３細胞／ウェル）の両方を、上記のプロトコルに従って、１２ウェルプレート中の腫瘍スフェアアッセイに供した。播種後７日目に、プレートを画像化し、スフェアを計数した。さらに、スフェアを単一細胞内にトリプシン処理し、細胞塊を避けるために細胞ストレーナー（BD Falcon）に通し、計数し、腫瘍スフェアアッセイ（５×１０３細胞／ウェル）に供し、さらに７日間増殖させた。この手順を３回繰り返した。最後の再生後、プレートを画像化し、スフェアを計数した。
対照およびＥｐＣＡＭノックアウト細胞（５×１０３細胞／ウェル）の両方を、上記のプロトコルに従って、１２ウェルプレート中の腫瘍スフェアアッセイに供した。播種後７日目に、プレートを画像化し、スフェアを計数した。さらに、スフェアを単一細胞内にトリプシン処理し、細胞塊を避けるために細胞ストレーナー（BD Falcon）に通し、計数し、腫瘍スフェアアッセイ（５×１０３細胞／ウェル）に供し、さらに７日間増殖させた。この手順を３回繰り返した。最後の再生後、プレートを画像化し、スフェアを計数した。
【0096】
１．１２ ＥｐＥＸとWnt受容体の相互作用
細胞を一晩播種し、ＰＢＳ中の１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収した後、ＥｐＥＸとWnt受容体タンパク質間の相互作用を安定化させるために２ｍＭ ＤＴＳＳＰ（Thermo）架橋剤と共にインキュベートした。次に、トリス（ｐＨ７．５）を２０ｍＭの終濃度まで添加して架橋反応を停止させた。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加したＮＰ４０緩衝液（１容量％ＮＰ－４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を用いて細胞を溶解した。ＥｐＥＸ－Wnt受容体複合体を沈降させるためにプロテインＧダイナビーズを用い、ウェスタンブロッティングによる共免疫沈降を行った。
細胞を一晩播種し、ＰＢＳ中の１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収した後、ＥｐＥＸとWnt受容体タンパク質間の相互作用を安定化させるために２ｍＭ ＤＴＳＳＰ（Thermo）架橋剤と共にインキュベートした。次に、トリス（ｐＨ７．５）を２０ｍＭの終濃度まで添加して架橋反応を停止させた。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加したＮＰ４０緩衝液（１容量％ＮＰ－４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を用いて細胞を溶解した。ＥｐＥＸ－Wnt受容体複合体を沈降させるためにプロテインＧダイナビーズを用い、ウェスタンブロッティングによる共免疫沈降を行った。
【0097】
１．１３ 共免疫沈降（Ｃｏ－ＩＰ）およびその後のウェスタンブロッティング
Pierce 磁性プロテインＧ ダイナビーズ（Thermo）を用いて、製造者の指示書に従って共免疫沈降を実施した。すなわち、プロテアーゼカクテル阻害剤を添加したＮＰ４０緩衝液を用いて細胞を溶解した。５００μｇ～１ｍｇのタンパク質を含む細胞溶解液を、免疫沈降用の抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、生成物をプロテインＧ ダイナビーズと共に４℃で４時間インキュベートした。ビーズを磁石を用いて沈降させ、３回洗浄した後、サンプル緩衝液をタンパク質結合ビーズに添加し、１００℃で１０分間加熱した。最終生成物を上記のようにウェスタンブロット分析に供した。沈降およびウェスタンブロット分析に用いた抗体には、Frizzled 6(CST)、Frizzled 7(Santa Cruz Biotech)、LRP5(abcam)、LRP6(CST)およびEpEX(EpAb3-5)(実験室内製造)が含まれた。
Pierce 磁性プロテインＧ ダイナビーズ（Thermo）を用いて、製造者の指示書に従って共免疫沈降を実施した。すなわち、プロテアーゼカクテル阻害剤を添加したＮＰ４０緩衝液を用いて細胞を溶解した。５００μｇ～１ｍｇのタンパク質を含む細胞溶解液を、免疫沈降用の抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、生成物をプロテインＧ ダイナビーズと共に４℃で４時間インキュベートした。ビーズを磁石を用いて沈降させ、３回洗浄した後、サンプル緩衝液をタンパク質結合ビーズに添加し、１００℃で１０分間加熱した。最終生成物を上記のようにウェスタンブロット分析に供した。沈降およびウェスタンブロット分析に用いた抗体には、Frizzled 6(CST)、Frizzled 7(Santa Cruz Biotech)、LRP5(abcam)、LRP6(CST)およびEpEX(EpAb3-5)(実験室内製造)が含まれた。
【0098】
１．１４ 酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡ用に、ウェル（１タンパクあたり少なくとも６ウェル）を組換えＦＺＤ６（Proteintech）、組換えＦＺＤ７（Proteintech）、組換えＬＲＰ５（Proteintech）、組換えＬＲＰ６（Proteintech）で４℃で一晩コーティングした。次に、ウェルを１％ＢＳＡでブロッキングし、ＥｐＥＸ－ｈｉｓ（Expi293 Expression System）で２時間処理した。他に、ＥｐＥＸ－ｈｉｓをＥｐＡｂ ２－６と共に一晩インキュベートし、この複合体を用いてタンパク質コーティングプレートを２時間処理した。さらに抗Ｈｉｓ抗体（abcam）を用い、ＴＭＢを実施して４５０ｎｍで光学密度を記録した。
ＥＬＩＳＡ用に、ウェル（１タンパクあたり少なくとも６ウェル）を組換えＦＺＤ６（Proteintech）、組換えＦＺＤ７（Proteintech）、組換えＬＲＰ５（Proteintech）、組換えＬＲＰ６（Proteintech）で４℃で一晩コーティングした。次に、ウェルを１％ＢＳＡでブロッキングし、ＥｐＥＸ－ｈｉｓ（Expi293 Expression System）で２時間処理した。他に、ＥｐＥＸ－ｈｉｓをＥｐＡｂ ２－６と共に一晩インキュベートし、この複合体を用いてタンパク質コーティングプレートを２時間処理した。さらに抗Ｈｉｓ抗体（abcam）を用い、ＴＭＢを実施して４５０ｎｍで光学密度を記録した。
【0099】
１．１５ アポトーシスアッセイ
細胞を２４ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）に一晩播種した後、２０μｇ／ｍＬ ｍＥｐＡｂ２－６、ｈＥｐＡｂ２－６もしくはＭＴ２０１、または２μｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）もしくはその組合せで２４時間処理した。細胞ペレットを回収し、アネキシン－Ｖ／ＰＩアポトーシスキット（BD Biosciences）を用いてアポトーシスアッセイを実施した。結果をフローサイトメトリー分析によって読み取り、アポトーシス細胞の割合を計算した。
細胞を２４ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）に一晩播種した後、２０μｇ／ｍＬ ｍＥｐＡｂ２－６、ｈＥｐＡｂ２－６もしくはＭＴ２０１、または２μｇ／ｍＬ ＬＧＫ９７４（MedChemExpress）もしくはその組合せで２４時間処理した。細胞ペレットを回収し、アネキシン－Ｖ／ＰＩアポトーシスキット（BD Biosciences）を用いてアポトーシスアッセイを実施した。結果をフローサイトメトリー分析によって読み取り、アポトーシス細胞の割合を計算した。
【0100】
１．１６ ルシフェラーゼレポーターアッセイ
細胞を２４ウェルプレートに播種し（１×１０４細胞／ウェル）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を新しく替え、細胞をＰｏｌｙＪＥＴ（SignaGen）によりそれぞれのレポータープラスミド（ＴＣＦレポーターまたはWnt受容体プロモーターレポーター）でトランスフェクトした。トランスフェクト効率は、内部対照としてｐＲＬ－ＴＫ（２０ｎｇ）で同時トランスフェクトすることによって標準化した。指示されたとおりに追加治療を実施した。ホタルルシフェラーゼおよびレニラ（Renilla）の発光を、Dual-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて、トランスフェクションの４８時間後に、製造業者の推奨に従って測定した。
細胞を２４ウェルプレートに播種し（１×１０４細胞／ウェル）、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を新しく替え、細胞をＰｏｌｙＪＥＴ（SignaGen）によりそれぞれのレポータープラスミド（ＴＣＦレポーターまたはWnt受容体プロモーターレポーター）でトランスフェクトした。トランスフェクト効率は、内部対照としてｐＲＬ－ＴＫ（２０ｎｇ）で同時トランスフェクトすることによって標準化した。指示されたとおりに追加治療を実施した。ホタルルシフェラーゼおよびレニラ（Renilla）の発光を、Dual-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて、トランスフェクションの４８時間後に、製造業者の推奨に従って測定した。
【0101】
１．１７ インビボでの腫瘍形成能
ＮＳＧマウスを同数の２群に分けた。ＥｐＣＡＭ対照またはＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞を各動物（各群ｎ＝６）の右側腹部に皮下移植した（１０３細胞）。腫瘍を増殖させ、スライドキャリパーを用いて腫瘍の大きさを週２回測定した。試験に用いたいずれかのマウスで腫瘍体積が２０００ｍｍ３（IACUC、Academia Sinicaの定義による）に達した時点で、全動物を殺処分し、腫瘍重量および体積を測定した。除外されたデータはなかった。
ＮＳＧマウスを同数の２群に分けた。ＥｐＣＡＭ対照またはＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞を各動物（各群ｎ＝６）の右側腹部に皮下移植した（１０３細胞）。腫瘍を増殖させ、スライドキャリパーを用いて腫瘍の大きさを週２回測定した。試験に用いたいずれかのマウスで腫瘍体積が２０００ｍｍ３（IACUC、Academia Sinicaの定義による）に達した時点で、全動物を殺処分し、腫瘍重量および体積を測定した。除外されたデータはなかった。
【0102】
１．１８ ＴＡＣＥ活性アッセイ
細胞を２４ウェルプレートに一晩播種し（１×１０５細胞／ウェル）、さらに２５０ｎｇ／ｍＬのＥｐＥＸ－Ｈｉｓまたは１００ｎｇ／ｍＬWnt３Ａ（R＆D Systems）で８時間処理した後、ＩｎｎｏＺｙｍｅ ＴＡＣＥ活性キット（Merck）を用いてＴＡＣＥ活性を測定した。簡単に言えば、細胞溶解物をＲＩＰＡ緩衝液で調製し、ＴＡＣＥ抗体コートプレートに添加し、わずかに振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。さらに、溶解物を除去し、プレートを３回洗浄した。基質を各ウェルに添加し、３７℃で５時間インキュベートした。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて、３２４ｎｍの励起および４０５ｎｍの発光で反応生成物の蛍光シグナルを検出した。
細胞を２４ウェルプレートに一晩播種し（１×１０５細胞／ウェル）、さらに２５０ｎｇ／ｍＬのＥｐＥＸ－Ｈｉｓまたは１００ｎｇ／ｍＬWnt３Ａ（R＆D Systems）で８時間処理した後、ＩｎｎｏＺｙｍｅ ＴＡＣＥ活性キット（Merck）を用いてＴＡＣＥ活性を測定した。簡単に言えば、細胞溶解物をＲＩＰＡ緩衝液で調製し、ＴＡＣＥ抗体コートプレートに添加し、わずかに振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。さらに、溶解物を除去し、プレートを３回洗浄した。基質を各ウェルに添加し、３７℃で５時間インキュベートした。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて、３２４ｎｍの励起および４０５ｎｍの発光で反応生成物の蛍光シグナルを検出した。
【0103】
１．１９ γ－セクレターゼ活性
γ－セクレターゼ活性を、Liaoら（２００４）（Liao et al., 2004）によって記載されたプロトコルを用いて測定した。簡単に言えば、細胞を対照プラスミドおよびルシフェラーゼを保有するテトラサイクリン誘導性γ－セクレターゼプラスミド（Liao et al., 2004）（プラスミドは、Liao、ICOB、Academia SinicaのYung-Feng博士からの寛大な贈り物であった）で一時的にトランスフェクトした。細胞を、２５０ｎｇ／ｍＬのＥｐＥＸ－Ｈｉｓまたは１００ｎｇ／ｍＬ Wnt３Ａ（R＆D Systems）で８時間処理した。さらに、細胞を受動（passive）溶解緩衝液を用いて溶解し、ルシフェラーゼアッセイに供した。
γ－セクレターゼ活性を、Liaoら（２００４）（Liao et al., 2004）によって記載されたプロトコルを用いて測定した。簡単に言えば、細胞を対照プラスミドおよびルシフェラーゼを保有するテトラサイクリン誘導性γ－セクレターゼプラスミド（Liao et al., 2004）（プラスミドは、Liao、ICOB、Academia SinicaのYung-Feng博士からの寛大な贈り物であった）で一時的にトランスフェクトした。細胞を、２５０ｎｇ／ｍＬのＥｐＥＸ－Ｈｉｓまたは１００ｎｇ／ｍＬ Wnt３Ａ（R＆D Systems）で８時間処理した。さらに、細胞を受動（passive）溶解緩衝液を用いて溶解し、ルシフェラーゼアッセイに供した。
【0104】
１．２０ Wnt受容体プロモーターレポータープラスミド構築
ＬＲＰ５（－１１８７～＋２００）、ＬＲＰ６（－１５４３～＋５５）、ＦＺＤ６（－１３８５～＋２０５）およびＦＺＤ７（－１２８５～＋１１６）の推定プロモーター領域をＨｅＬａゲノムＤＮＡからクローニングし、ｐＧＬ４．１８プラスミド（Promega、USA）に融合させた。ゲノムＤＮＡを、Genomic DNA Isolation キット（NovelGene、TW）を用いて、製造業者の推奨に従って抽出した。Wnt受容体プロモーターのＰＣＲ断片を作製するために用いたプライマーを表４に列挙する。
ＬＲＰ５（－１１８７～＋２００）、ＬＲＰ６（－１５４３～＋５５）、ＦＺＤ６（－１３８５～＋２０５）およびＦＺＤ７（－１２８５～＋１１６）の推定プロモーター領域をＨｅＬａゲノムＤＮＡからクローニングし、ｐＧＬ４．１８プラスミド（Promega、USA）に融合させた。ゲノムＤＮＡを、Genomic DNA Isolation キット（NovelGene、TW）を用いて、製造業者の推奨に従って抽出した。Wnt受容体プロモーターのＰＣＲ断片を作製するために用いたプライマーを表４に列挙する。
【0105】
【表4】
【0106】
１．２１ ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のリン酸化に対するＧＳＫ３およびＣＫ１の活性
ＧＳＫ３およびＣＫ１のキナーゼ活性を調べるために、１０６個の細胞を一晩播種し、ＧＳＫ３阻害薬ＢＩＯ（Sigma）またはＣＫ１阻害剤ＰＦ－６７０４６２（selleckchem）で８時間処理した。次いで、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、ウェスタンブロット分析に供して、ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のリン酸化を調べた。他に、細胞をＥｐＥＸ（実験室内製造）または組換えWnt３Ａ（R＆D systems）またはその組合せで８時間処理して、ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のリン酸化を調べた。
ＧＳＫ３およびＣＫ１のキナーゼ活性を調べるために、１０６個の細胞を一晩播種し、ＧＳＫ３阻害薬ＢＩＯ（Sigma）またはＣＫ１阻害剤ＰＦ－６７０４６２（selleckchem）で８時間処理した。次いで、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、ウェスタンブロット分析に供して、ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のリン酸化を調べた。他に、細胞をＥｐＥＸ（実験室内製造）または組換えWnt３Ａ（R＆D systems）またはその組合せで８時間処理して、ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のリン酸化を調べた。
【0107】
１．２２ プラスミドトランスフェクションおよびタンパク質（ＥｐＩＣＤ）送達
すべてのプラスミドトランスフェクション手順は、Polyjet DNAトランスフェクション剤（SignaGen Lab）を用いて指示されたように実施した。プロトコルは製造業者の指示に従って実施した。ＥｐＩＣＤタンパク質（Ｅｘｐｉ２９３発現系により実験室内で製造）の送達は、Pierce タンパク質トランスフェクション試薬キット（Thermo Scientific）を用いて実施した。プロトコルはキットの指示に従って実施した。
すべてのプラスミドトランスフェクション手順は、Polyjet DNAトランスフェクション剤（SignaGen Lab）を用いて指示されたように実施した。プロトコルは製造業者の指示に従って実施した。ＥｐＩＣＤタンパク質（Ｅｘｐｉ２９３発現系により実験室内で製造）の送達は、Pierce タンパク質トランスフェクション試薬キット（Thermo Scientific）を用いて実施した。プロトコルはキットの指示に従って実施した。
【0108】
１．２３ マウスにおける腫瘍移植および治療試験
すべての動物実験は、Academia SinicaのＩＡＣＵＣの規則に従って承認され、実施された。転移モデルにはＨＣＴ１１６細胞（１×１０６）を尾静脈から注射した。他に、ルシフェラーゼを含む２×１０５個のＨＣＴ１１６細胞を同所性モデルの盲腸壁に外科的に移植した。約６～８週齢のオスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを動物実験に用いた（転移モデルおよび同所性モデルの各治療群に対してそれぞれｎ＝５およびｎ＝６）。注射／移植の７２時間後に、マウスを無作為に４つの異なる処置群に分けた。処置のために、動物に２０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６を尾静脈から週２回、４週間注射するか、またはビークル［０．５％メチルセルロース（Sigma-Aldrich）および０．５％トゥイーン８０（Sigma-Aldrich）］またはビークルと共に製剤された５ｍｇ／ｋｇのＬＧＫ９７４（MedChemExpress）を隔日で４週間強制経口投与するか、または動物を阻害剤および抗体の両方の組合せで処置した。転移モデルでは、生存が主要エンドポイントであった。同所性モデルでは、腫瘍の進行を生物発光イメージングを用いてモニターした。腫瘍を画像化するために、Ｄ－ルシフェリン（GOLD BIO）の腹腔内注射を実施し、注射後１０分で画像を撮影した。
すべての動物実験は、Academia SinicaのＩＡＣＵＣの規則に従って承認され、実施された。転移モデルにはＨＣＴ１１６細胞（１×１０６）を尾静脈から注射した。他に、ルシフェラーゼを含む２×１０５個のＨＣＴ１１６細胞を同所性モデルの盲腸壁に外科的に移植した。約６～８週齢のオスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを動物実験に用いた（転移モデルおよび同所性モデルの各治療群に対してそれぞれｎ＝５およびｎ＝６）。注射／移植の７２時間後に、マウスを無作為に４つの異なる処置群に分けた。処置のために、動物に２０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６を尾静脈から週２回、４週間注射するか、またはビークル［０．５％メチルセルロース（Sigma-Aldrich）および０．５％トゥイーン８０（Sigma-Aldrich）］またはビークルと共に製剤された５ｍｇ／ｋｇのＬＧＫ９７４（MedChemExpress）を隔日で４週間強制経口投与するか、または動物を阻害剤および抗体の両方の組合せで処置した。転移モデルでは、生存が主要エンドポイントであった。同所性モデルでは、腫瘍の進行を生物発光イメージングを用いてモニターした。腫瘍を画像化するために、Ｄ－ルシフェリン（GOLD BIO）の腹腔内注射を実施し、注射後１０分で画像を撮影した。
【0109】
１．２４ 統計分析
GraphPad Prism（GraphPad Software）を用いて統計分析を実施した。データは、必要に応じて一元配置ＡＮＯＶＡまたは二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析し、図の凡例に記載した後、ボンフェローニ多重補正を行った。０．０５未満のＰ値は有意であると考えられ、各有意値に割り当てられた星印は図の凡例に示されている。含まれているすべてのデータセットのエラーバーは、平均値の＋ＳＤを表す。すべての実験は少なくとも３回実施された。本試験のデータはいずれも除外されなかった。
GraphPad Prism（GraphPad Software）を用いて統計分析を実施した。データは、必要に応じて一元配置ＡＮＯＶＡまたは二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析し、図の凡例に記載した後、ボンフェローニ多重補正を行った。０．０５未満のＰ値は有意であると考えられ、各有意値に割り当てられた星印は図の凡例に示されている。含まれているすべてのデータセットのエラーバーは、平均値の＋ＳＤを表す。すべての実験は少なくとも３回実施された。本試験のデータはいずれも除外されなかった。
【0110】
２．結果
２．１ ＥｐＣＡＭ発現はβ－カテニン活性と関連している
試験を開始するために、ＥｐＣＡＭ発現がＣＲＣ組織サンプル中の活性β－カテニンと相関しているかどうかを調べた。１２０名の患者組織サンプルに対して免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施したところ、ＥｐＣＡＭおよびβ－カテニンのレベルは、健康な組織サンプルと比較して、疾患サンプルで上昇していることがわかった。さらに、両タンパク質のレベルもまた、ＣＲＣのグレードの増加とともに増加することが見出された（図１Ａ、図１Ｃ）。実際、相関分析は、ＥｐＣＡＭの発現が活性β－カテニンの発現と強く相関していることを示した（ピアソンの相関係数ｒ＝０．７６、ｐ＜０．０００１）（図１Ｄ）。したがって、次に、ＥｐＣＡＭが標準的なWntシグナル伝達に関与しているかどうか、またどのように関与しているかを調べることとした。
２．１ ＥｐＣＡＭ発現はβ－カテニン活性と関連している
試験を開始するために、ＥｐＣＡＭ発現がＣＲＣ組織サンプル中の活性β－カテニンと相関しているかどうかを調べた。１２０名の患者組織サンプルに対して免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施したところ、ＥｐＣＡＭおよびβ－カテニンのレベルは、健康な組織サンプルと比較して、疾患サンプルで上昇していることがわかった。さらに、両タンパク質のレベルもまた、ＣＲＣのグレードの増加とともに増加することが見出された（図１Ａ、図１Ｃ）。実際、相関分析は、ＥｐＣＡＭの発現が活性β－カテニンの発現と強く相関していることを示した（ピアソンの相関係数ｒ＝０．７６、ｐ＜０．０００１）（図１Ｄ）。したがって、次に、ＥｐＣＡＭが標準的なWntシグナル伝達に関与しているかどうか、またどのように関与しているかを調べることとした。
【0111】
２．２ ＥｐＥＸはβ－カテニンの核移行に関与している
本発明者らは、次に、ＥｐＣＡＭがβ－カテニンの核局在を促進するかどうかを試験した。これは古典的なWntシグナル伝達の標準的な読み出しである。ＥｐＣＡＭノックダウン（ｓｈＥｐＣＡＭ）またはＥｐＣＡＭノックアウト（ＫＯ－ＥｐＣＡＭ）結腸癌細胞を活性β－カテニンについて免疫染色した。本発明者らは、ＥｐＣＡＭのノックダウンまたはノックアウトがβ－カテニンの核蓄積を有意に減少させることを見出した（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ）。特に、ＥｐＩＣＤおよびβ－カテニンの複合体は、結合パートナーであるＦＨＬ２とともに、核に移行し、ＴＣＦまたはＬＥＦなどの転写因子の助けを借りてＥｐＣＡＭ標的遺伝子の転写を調節することが知られている（Lin et al., 2012；Maetzel et al., 2009；Park et al., 2016）。しかしながら、ＥｐＩＣＤを含まないβ－カテニンは依然として核に移行し、そのような因子に結合してWnt標的遺伝子を転写し得る（Maetzel et al., 2009；Nusse and Clevers, 2017）。したがって、ＥｐＥＸがＥｐＩＣＤとは独立してタンパク質の核移行を調節できるかどうかを調べるために、ｓｈＥｐＣＡＭ細胞またはＫＯ－ＥｐＣＡＭ細胞を外因性ＥｐＥＸで処理した。この処理はβ－カテニンの核蓄積の有意な増加を刺激した（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ）。さらに、野生型細胞をγ-セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴで処理すると、β－カテニンの核移行は減少したが、細胞をＥｐＥＸおよびＤＡＰＴの両方で処理すると、タンパク質の核蓄積が回復した（図３Ｄ、図３Ｅ）。さらに、ＥｐＥＸ処理したＥｐＣＡＭノックダウンおよびノックアウト細胞において、ルシフェラーゼレポーターを用いてＴＣＦ活性をモニターした（図２Ｃおよび図３Ｆ）。ＩＦＳおよびウェスタンの結果と同様に、ＥｐＣＡＭノックダウンまたはノックアウト細胞は対照細胞と比較してＴＣＦ活性の低下を示し、細胞をＥｐＥＸで処理すると、この現象は有意に回復した。加えて、野生型細胞のＤＡＰＴ処理はＴＣＦ活性をわずかに低下させたが、この現象はＥｐＥＸおよびＤＡＰＴの併用処理で有意に増加した（図３Ｇ）。まとめると、これらの観察は、ＥｐＩＣＤとは独立してβ－カテニンの核移行を刺激するＥｐＥＸの潜在的な働きを示唆している。次に、本発明者らは、野生型細胞におけるβ－カテニンの核移行およびＴＣＦ活性に対するＥｐＥＸタンパク質およびWntタンパク質（組換えWnt３Ａを用いた）の個々の効果および併用効果を調べた（図２Ｄ、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ）。本発明者らは、ＥｐＥＸまたはWnt３Ａのいずれかがβ－カテニンの核移行およびＴＣＦ活性を増加させ得る一方で、両方の組合せがシグナルをさらに増加させることを見出した。さらに、これらの処理がＡｘｉｎ２などのWnt経路の直接標的遺伝子も調節するかどうかを試験したいと考えた（図２Ｅ、図２Ｆ、図４Ｄ、図４Ｅ）。実際、本発明者らは、ＴＣＦ活性の結果と同様に、ＥｐＥＸまたはWnt３ＡのいずれかがＡｘｉｎ２発現を増加させたが、併用療法はそのような活性を増強したことを見出した。まとめると、これらの結果は、ＥｐＥＸがWnt経路を活性化し得る一方で、ＥｐＩＣＤがさらに下流のシグナル伝達に関与することを示唆した。
本発明者らは、次に、ＥｐＣＡＭがβ－カテニンの核局在を促進するかどうかを試験した。これは古典的なWntシグナル伝達の標準的な読み出しである。ＥｐＣＡＭノックダウン（ｓｈＥｐＣＡＭ）またはＥｐＣＡＭノックアウト（ＫＯ－ＥｐＣＡＭ）結腸癌細胞を活性β－カテニンについて免疫染色した。本発明者らは、ＥｐＣＡＭのノックダウンまたはノックアウトがβ－カテニンの核蓄積を有意に減少させることを見出した（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ）。特に、ＥｐＩＣＤおよびβ－カテニンの複合体は、結合パートナーであるＦＨＬ２とともに、核に移行し、ＴＣＦまたはＬＥＦなどの転写因子の助けを借りてＥｐＣＡＭ標的遺伝子の転写を調節することが知られている（Lin et al., 2012；Maetzel et al., 2009；Park et al., 2016）。しかしながら、ＥｐＩＣＤを含まないβ－カテニンは依然として核に移行し、そのような因子に結合してWnt標的遺伝子を転写し得る（Maetzel et al., 2009；Nusse and Clevers, 2017）。したがって、ＥｐＥＸがＥｐＩＣＤとは独立してタンパク質の核移行を調節できるかどうかを調べるために、ｓｈＥｐＣＡＭ細胞またはＫＯ－ＥｐＣＡＭ細胞を外因性ＥｐＥＸで処理した。この処理はβ－カテニンの核蓄積の有意な増加を刺激した（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ）。さらに、野生型細胞をγ-セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴで処理すると、β－カテニンの核移行は減少したが、細胞をＥｐＥＸおよびＤＡＰＴの両方で処理すると、タンパク質の核蓄積が回復した（図３Ｄ、図３Ｅ）。さらに、ＥｐＥＸ処理したＥｐＣＡＭノックダウンおよびノックアウト細胞において、ルシフェラーゼレポーターを用いてＴＣＦ活性をモニターした（図２Ｃおよび図３Ｆ）。ＩＦＳおよびウェスタンの結果と同様に、ＥｐＣＡＭノックダウンまたはノックアウト細胞は対照細胞と比較してＴＣＦ活性の低下を示し、細胞をＥｐＥＸで処理すると、この現象は有意に回復した。加えて、野生型細胞のＤＡＰＴ処理はＴＣＦ活性をわずかに低下させたが、この現象はＥｐＥＸおよびＤＡＰＴの併用処理で有意に増加した（図３Ｇ）。まとめると、これらの観察は、ＥｐＩＣＤとは独立してβ－カテニンの核移行を刺激するＥｐＥＸの潜在的な働きを示唆している。次に、本発明者らは、野生型細胞におけるβ－カテニンの核移行およびＴＣＦ活性に対するＥｐＥＸタンパク質およびWntタンパク質（組換えWnt３Ａを用いた）の個々の効果および併用効果を調べた（図２Ｄ、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ）。本発明者らは、ＥｐＥＸまたはWnt３Ａのいずれかがβ－カテニンの核移行およびＴＣＦ活性を増加させ得る一方で、両方の組合せがシグナルをさらに増加させることを見出した。さらに、これらの処理がＡｘｉｎ２などのWnt経路の直接標的遺伝子も調節するかどうかを試験したいと考えた（図２Ｅ、図２Ｆ、図４Ｄ、図４Ｅ）。実際、本発明者らは、ＴＣＦ活性の結果と同様に、ＥｐＥＸまたはWnt３ＡのいずれかがＡｘｉｎ２発現を増加させたが、併用療法はそのような活性を増強したことを見出した。まとめると、これらの結果は、ＥｐＥＸがWnt経路を活性化し得る一方で、ＥｐＩＣＤがさらに下流のシグナル伝達に関与することを示唆した。
【0112】
次に、野生型細胞におけるWntまたはＥｐＣＡＭシグナル伝達の阻害がβ－カテニンの核移行を妨げるかどうかを検討した。本発明者らは、ＥｐＥＸがWnt関連のシグナル伝達を活性化する能力を維持したいと考えたため、β－カテニン破壊複合体を阻害することによってWntシグナル伝達を阻害しないようにした。代わりに、本発明者らは、Wntリガンドの活性化を制限して受容体結合を阻害するポルクピン阻害剤であるＬＧＫ９７４を用いた（Liu et al., 2013）。ＥｐＣＡＭシグナル伝達を阻害するために、ＥｐＥＸを中和して下流のシグナル伝達を阻害することによって機能する抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体であるＥｐＡｂ２－６を用いた（Liao et al., 2015）。ＬＧＫ９７４で処理すると、核のβ－カテニンは減少したが、核からタンパク質は完全には除去されなかった。同様に、ＥｐＡｂ２－６で処理すると、核のβ－カテニンシグナルも有意に減少した。興味深いことに、ＬＧＫ９７４およびＥｐＡｂ２－６を併用すると、タンパク質の核蓄積をほとんど消失させた（図２Ｇ、図２Ｈ）。これらの結果は、核ＴＣＦ活性およびＡｘｉｎ２発現データと一致しており（図２Ｉ、図２Ｊ、図２Ｋおよび図５）、ＥｐＥＸがWntシグナル伝達を開始し、β－カテニンの核への移行を引き起こすことを示唆している。さらに、ＥｐＡｂ２－６抗体（ｍＥｐＡｂ２－６）はハイブリドーマ技術によってマウスで産生されたため、そのヒト化型（ｈＥｐＡｂ２－６）をさらに試験することにした（Liao et al., 2015）。また、ｈＥｐＡｂ２－６の効果を、臨床治験が行われたヒト抗ＥｐＣＡＭ抗体であるアデカツムマブ（ＭＴ２０１）の効果と比較した。この試験では、ｈＥｐＡｂ２－６はβ－カテニン阻害活性を保持しており、ＴＣＦ活性と関連していることがわかったが、ＭＴ２０１は対照処理細胞と比較して有意な効果を示さなかった（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）。
【0113】
２．３ ＥｐＣＡＭは、癌の幹細胞性および腫瘍形成を促進する
ＥｐＣＡＭはＣＳＣで豊富に発現することが知られているが、本発明者らは、ＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤが、多くの癌タイプにおいて癌幹細胞性に主に関与するWnt関連シグナル伝達に関与している可能性があることを見出した（Batlle and Clevers, 2017;Gires et al., 2020）。したがって、次に、癌細胞増殖および癌幹細胞性の促進におけるＥｐＣＡＭの機能的役割を試験した。そのために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＥｐＣＡＭノックアウト細胞を作製し、通常はＥｐＣＡＭを発現しないＣＴ２６細胞でＥｐＣＡＭを強制発現させた（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ）。対照細胞およびＥｐＣＡＭノックアウト細胞の増殖曲線を比較すると、ＥｐＣＡＭのノックアウトは、細胞増殖が有意に遅くなり、倍加時間が対照細胞の１８±２時間からノックアウトＨＣＴ１１６細胞では５１±２時間に増加した（図８Ａ）。同様に、倍加時間は対照細胞の２３±２時間からノックアウトＨＴ２９細胞では４８±２時間に増加した（図７Ｄ）。さらに、ＣＴ２６細胞でＥｐＣＡＭを強制発現させると、倍加時間が対照細胞の３０±２時間からＥｐＣＡＭ発現細胞では２１±２時間に減少した（図８Ｂ）。インビボでのＥｐＣＡＭの腫瘍形成能を評価するために、わずか１０３個の対照細胞またはＥｐＣＡＭノックアウト細胞をＮＳＧマウスに皮下移植した。ＥｐＣＡＭノックアウト細胞は腫瘍進行の低下を示し、より小さな腫瘍を産生した（図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ）。このような腫瘍形成能は、ＥｐＣＡＭによって示される癌幹細胞性の結果であり得る。そこで、本発明者らは、対照細胞およびＥｐＣＡＭノックアウト細胞を用いてインビトロ再生アッセイを実施した。数回の継代後、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞は腫瘍形成能を失い、より小さな腫瘍スフェアのサイズおよび数を生じた（図８Ｇ）。Wntシグナル伝達も癌幹細胞性を主に支配していることから、ＥｐＣＡＭが癌細胞においてこのような特性を達成するためにWnt経路と交差するかどうかを明らかにしようとした。従って、本発明者らは、何れかのシグナル伝達を遮断するか、またはそれらを共に遮断しながら、腫瘍スフェアおよびコロニー形成アッセイを実施した。ＬＧＫ９７４またはＥｐＡｂ２－６のいずれかによる処理は腫瘍スフェアおよびコロニー形成を減少させたが、併用は腫瘍スフェアおよびコロニーをほぼ完全に除去した（図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋおよび図７Ｅ）。一方で、腫瘍スフェアまたはコロニーの形成能が低下したＥｐＣＡＭノックアウト細胞は、外因性ＥｐＥＸで処理すると野生型レベルに回復し、ＥｐＥＸがWntシグナル伝達を介して幹細胞性を促進できる可能性があることが示唆された。興味深いことに、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞をＬＧＫ９７４で処理すると、スフェアまたはコロニー形成能力が完全に失われたが、ＥｐＥＸをＬＧＫ９７４と共に添加すると、スフェアおよびコロニー形成を部分的に回復することができた（図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋおよび図７Ｅ）。したがって、Wntリガンドが存在しなくても、ＥｐＥＸはある程度の癌幹細胞性を促進することができ、これはWntシグナル伝達への関与により得る。さらに、外因性Wnt３ＡまたはＥｐＥＸの処理は、スフェアおよびコロニー形成能を増強し、この組合せはそのような可能性をさらに増幅した（図８Ｌ、図８Ｍ、図８Ｎ）。次に、本発明者らは、コロニーおよびスフェア形成の阻害能に関してＥｐＡｂ２－６とＭＴ２０１を比較したところ、ＭＴ２０１は癌幹細胞性を調節する活性を示さないことが見出された（図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＥｐＣＡＭおよびWntタンパク質がβ－カテニンシグナル伝達を協調的に刺激し、ＣＲＣにおける癌幹細胞性を促進するという考えを支持している。
ＥｐＣＡＭはＣＳＣで豊富に発現することが知られているが、本発明者らは、ＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤが、多くの癌タイプにおいて癌幹細胞性に主に関与するWnt関連シグナル伝達に関与している可能性があることを見出した（Batlle and Clevers, 2017;Gires et al., 2020）。したがって、次に、癌細胞増殖および癌幹細胞性の促進におけるＥｐＣＡＭの機能的役割を試験した。そのために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＥｐＣＡＭノックアウト細胞を作製し、通常はＥｐＣＡＭを発現しないＣＴ２６細胞でＥｐＣＡＭを強制発現させた（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ）。対照細胞およびＥｐＣＡＭノックアウト細胞の増殖曲線を比較すると、ＥｐＣＡＭのノックアウトは、細胞増殖が有意に遅くなり、倍加時間が対照細胞の１８±２時間からノックアウトＨＣＴ１１６細胞では５１±２時間に増加した（図８Ａ）。同様に、倍加時間は対照細胞の２３±２時間からノックアウトＨＴ２９細胞では４８±２時間に増加した（図７Ｄ）。さらに、ＣＴ２６細胞でＥｐＣＡＭを強制発現させると、倍加時間が対照細胞の３０±２時間からＥｐＣＡＭ発現細胞では２１±２時間に減少した（図８Ｂ）。インビボでのＥｐＣＡＭの腫瘍形成能を評価するために、わずか１０３個の対照細胞またはＥｐＣＡＭノックアウト細胞をＮＳＧマウスに皮下移植した。ＥｐＣＡＭノックアウト細胞は腫瘍進行の低下を示し、より小さな腫瘍を産生した（図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ）。このような腫瘍形成能は、ＥｐＣＡＭによって示される癌幹細胞性の結果であり得る。そこで、本発明者らは、対照細胞およびＥｐＣＡＭノックアウト細胞を用いてインビトロ再生アッセイを実施した。数回の継代後、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞は腫瘍形成能を失い、より小さな腫瘍スフェアのサイズおよび数を生じた（図８Ｇ）。Wntシグナル伝達も癌幹細胞性を主に支配していることから、ＥｐＣＡＭが癌細胞においてこのような特性を達成するためにWnt経路と交差するかどうかを明らかにしようとした。従って、本発明者らは、何れかのシグナル伝達を遮断するか、またはそれらを共に遮断しながら、腫瘍スフェアおよびコロニー形成アッセイを実施した。ＬＧＫ９７４またはＥｐＡｂ２－６のいずれかによる処理は腫瘍スフェアおよびコロニー形成を減少させたが、併用は腫瘍スフェアおよびコロニーをほぼ完全に除去した（図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋおよび図７Ｅ）。一方で、腫瘍スフェアまたはコロニーの形成能が低下したＥｐＣＡＭノックアウト細胞は、外因性ＥｐＥＸで処理すると野生型レベルに回復し、ＥｐＥＸがWntシグナル伝達を介して幹細胞性を促進できる可能性があることが示唆された。興味深いことに、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞をＬＧＫ９７４で処理すると、スフェアまたはコロニー形成能力が完全に失われたが、ＥｐＥＸをＬＧＫ９７４と共に添加すると、スフェアおよびコロニー形成を部分的に回復することができた（図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋおよび図７Ｅ）。したがって、Wntリガンドが存在しなくても、ＥｐＥＸはある程度の癌幹細胞性を促進することができ、これはWntシグナル伝達への関与により得る。さらに、外因性Wnt３ＡまたはＥｐＥＸの処理は、スフェアおよびコロニー形成能を増強し、この組合せはそのような可能性をさらに増幅した（図８Ｌ、図８Ｍ、図８Ｎ）。次に、本発明者らは、コロニーおよびスフェア形成の阻害能に関してＥｐＡｂ２－６とＭＴ２０１を比較したところ、ＭＴ２０１は癌幹細胞性を調節する活性を示さないことが見出された（図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＥｐＣＡＭおよびWntタンパク質がβ－カテニンシグナル伝達を協調的に刺激し、ＣＲＣにおける癌幹細胞性を促進するという考えを支持している。
【0114】
２．４ ＥｐＥＸはWnt受容体と相互作用してβ－カテニンシグナル伝達を促進する
本発明者らは、ＥｐＥＸがWntシグナル伝達を活性化できることを明らかにしたので、ＥｐＥＸとWnt受容体との結合をさらに調べた。本発明者らは、ＥｐＥＸまたはWnt受容体分子であるＦＺＤ６／７およびＬＲＰ５／６を共免疫沈降させ、沈降産物をウェスタンブロット分析に供した。その結果、ＥｐＥＸがWnt受容体タンパク質と複合体を形成することが示された（図９Ａ、図９Ｂ）。ＥｐＥＸのWnt受容体タンパク質への結合を確認するために、精製したＦＺＤ６／７またはＬＲＰ５／６融合タンパク質（ＧＳＴタグ付き）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ＥｐＥＸがタンパク質に結合できるかどうかを試験した（図９Ｃ）。ＥｐＥＸは全ての受容体タンパク質と結合することが見出されたが、ＥｐＥＸを抗ＥｐＣＡＭポリクローナル抗体（ほとんどすべてのエピトープをブロックする）と予めインキュベーションすると、そのような結合は有意に減少した。さらに、ＥｐＥＸをＥｐＡｂ２－６と予めインキュベーションすると、ＦＺＤ７およびＬＲＰ５タンパク質のみへの結合が大幅に減少したことから、ＥｐＥＸ上のＥｐＡｂ２－６エピトープがＦＺＤ７およびＬＲＰ５への結合に関与している可能性が示唆された（図９Ｃ、図９Ｄ）。これに関連して、Wnt経路では、受容体－リガンド相互作用がβ－カテニン破壊複合体を動員することによってシグナル伝達を開始し、β－カテニン破壊複合体が活性化されて核への移行を可能にする。この過程で、ＬＲＰ５／６は、破壊複合体に存在する細胞膜のグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）またはカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）によってリン酸化される（Nusse and Clevers, 2017）。したがって、本発明者らは、ＥｐＥＸとWnt受容体との相互作用がこのようなリン酸化を開始できるかどうかを試験した。実際、外因性ＥｐＥＸまたはWnt３Ａの処理はＬＲＰ５／６リン酸化を増加させ、この組合せは増強効果をもたらした（図９Ｅ）。
本発明者らは、ＥｐＥＸがWntシグナル伝達を活性化できることを明らかにしたので、ＥｐＥＸとWnt受容体との結合をさらに調べた。本発明者らは、ＥｐＥＸまたはWnt受容体分子であるＦＺＤ６／７およびＬＲＰ５／６を共免疫沈降させ、沈降産物をウェスタンブロット分析に供した。その結果、ＥｐＥＸがWnt受容体タンパク質と複合体を形成することが示された（図９Ａ、図９Ｂ）。ＥｐＥＸのWnt受容体タンパク質への結合を確認するために、精製したＦＺＤ６／７またはＬＲＰ５／６融合タンパク質（ＧＳＴタグ付き）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、ＥｐＥＸがタンパク質に結合できるかどうかを試験した（図９Ｃ）。ＥｐＥＸは全ての受容体タンパク質と結合することが見出されたが、ＥｐＥＸを抗ＥｐＣＡＭポリクローナル抗体（ほとんどすべてのエピトープをブロックする）と予めインキュベーションすると、そのような結合は有意に減少した。さらに、ＥｐＥＸをＥｐＡｂ２－６と予めインキュベーションすると、ＦＺＤ７およびＬＲＰ５タンパク質のみへの結合が大幅に減少したことから、ＥｐＥＸ上のＥｐＡｂ２－６エピトープがＦＺＤ７およびＬＲＰ５への結合に関与している可能性が示唆された（図９Ｃ、図９Ｄ）。これに関連して、Wnt経路では、受容体－リガンド相互作用がβ－カテニン破壊複合体を動員することによってシグナル伝達を開始し、β－カテニン破壊複合体が活性化されて核への移行を可能にする。この過程で、ＬＲＰ５／６は、破壊複合体に存在する細胞膜のグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）またはカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）によってリン酸化される（Nusse and Clevers, 2017）。したがって、本発明者らは、ＥｐＥＸとWnt受容体との相互作用がこのようなリン酸化を開始できるかどうかを試験した。実際、外因性ＥｐＥＸまたはWnt３Ａの処理はＬＲＰ５／６リン酸化を増加させ、この組合せは増強効果をもたらした（図９Ｅ）。
【0115】
これらの結果から、ＥｐＥＸのどの特異的ドメインがWnt受容体と相互作用するかを評価することがさらに奨励された。この問題に答えるために、本発明者らは、ＥＧＦ様ドメインＩまたはドメインＩＩを欠失したＥｐＥＸのいずれかの欠失変異体を発現するプラスミドでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、ＥｐＥＸの免疫沈降を行った（図９Ｆ）。結果は、ＥｐＥＸのＥＧＦ様ドメインＩがWnt受容体と直接相互作用することを明らかにした。さらに、以前にＥｐＥＸがＬＲＰ５／６のリン酸化（図９Ｃ）およびβ－カテニンの核移行（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｅおよび図４Ａ、図４Ｂ）を誘導できることを観察したので、ＥｐＥＸのドメインＩがWnt受容体に結合しても同じ効果が誘導できるかどうかを試験した。そこで、細胞をＥＧＦ様ドメイン（Ｉ／ＩＩ）欠損変異ＥｐＥＸタンパク質で処理し、その活性を観察した（図９Ｇ、図９Ｈ）。実際、ＥｐＥＸドメインＩ変異タンパク質処理はＬＲＰ５／６のリン酸化およびβ－カテニンの核移行を誘導するが、ＥｐＥＸドメインＩＩ変異タンパク質処理は同じ効果をもたらさないことを見出した。以前に観察したように、ＥｐＡｂ２－６およびＬＧＫ９７４はβ－カテニンの核移行を減弱させることができた（図２Ｇ、図２Ｈ）ため、次に、このような処理がWntシグナル伝達を遮断するためにＬＲＰ５／６のリン酸化を阻害できるかどうかを試験した。本発明者らは、ＬＧＫ９７４またはＥｐＡｂ２－６処理のいずれかがＬＲＰ５／６リン酸化を低下させることができ、併用処理はこのようなリン酸化を絶対的に阻害することを見出した（図９Ｉ）。これらの結果から、ＥｐＥＸのＥＧＦ様ドメインＩがWnt受容体と直接相互作用してβ－カテニンシグナル伝達を活性化することが確認された。
【0116】
２．５ ＥｐＥＸおよびWntはＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼを活性化する
本発明者らは、ＥｐＥＸがWnt受容体と相互作用することを見出したので、ＥｐＥＸの産生、さらにはＥｐＩＣＤの産生に影響を及ぼす可能性のある因子をさらに調べた。したがって、本発明者らは、ＥｐＥＸ誘導性のWntシグナル伝達が、ＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤをそれぞれ切断するＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼを活性化できるかどうかを調べた。興味深いことに、本発明者らは、外因性ＥｐＥＸまたはWnt３Ａによる処理がＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼ活性を増強し、この組合せがそのような活性化をさらに増強することを見出した（図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ）。上方制御された活性の機序に関して、本発明者らは、Wnt３ＡおよびＥｐＥＸ処理がＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼの活性化サブユニットであるプレセニリン－２（ＰＳ２）のリン酸化を増加させることを見出した（図１０Ｅ）。このプロセスに関与するキナーゼを同定するために、本発明者らは、β－カテニン破壊複合体のＧＳＫ３またはＣＫ１を低分子阻害剤で遮断し、ＴＡＣＥおよびＰＳ２のリン酸化の低下を観察した。このことは、ＧＳＫ３およびＣＫ１がこのプロセスに関与していることを示唆する（図１０Ｆ、図１０Ｇ）。これらの観察は、Wnt経路の活性化によるＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼの活性化の詳細な機序を同定するためのさらなる試験を必要とする。
本発明者らは、ＥｐＥＸがWnt受容体と相互作用することを見出したので、ＥｐＥＸの産生、さらにはＥｐＩＣＤの産生に影響を及ぼす可能性のある因子をさらに調べた。したがって、本発明者らは、ＥｐＥＸ誘導性のWntシグナル伝達が、ＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤをそれぞれ切断するＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼを活性化できるかどうかを調べた。興味深いことに、本発明者らは、外因性ＥｐＥＸまたはWnt３Ａによる処理がＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼ活性を増強し、この組合せがそのような活性化をさらに増強することを見出した（図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ）。上方制御された活性の機序に関して、本発明者らは、Wnt３ＡおよびＥｐＥＸ処理がＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼの活性化サブユニットであるプレセニリン－２（ＰＳ２）のリン酸化を増加させることを見出した（図１０Ｅ）。このプロセスに関与するキナーゼを同定するために、本発明者らは、β－カテニン破壊複合体のＧＳＫ３またはＣＫ１を低分子阻害剤で遮断し、ＴＡＣＥおよびＰＳ２のリン酸化の低下を観察した。このことは、ＧＳＫ３およびＣＫ１がこのプロセスに関与していることを示唆する（図１０Ｆ、図１０Ｇ）。これらの観察は、Wnt経路の活性化によるＴＡＣＥおよびγ－セクレターゼの活性化の詳細な機序を同定するためのさらなる試験を必要とする。
【0117】
２．６ ＥｐＩＣＤはWnt受容体タンパク質発現を上方制御する
高レベルのWnt受容体タンパク質はWnt活性を増加させ（MacDonald and He, 2012）、癌幹細胞性に影響を及ぼし得る。従って、Wnt受容体タンパク質のレベルがＥｐＣＡＭシグナル伝達によって影響されるかどうかを調べた。興味深いことに、ＥｐＣＡＭノックアウトまたはノックダウンがWnt受容体タンパク質レベルを有意に低下させることを見出した（図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１２Ａ、図１２Ｂ）。さらに、ノックアウト細胞を野生型ＥｐＣＡＭプラスミドでトランスフェクトすると、Wnt受容体が回復し、野生型様の細胞形態に変化した（図１１Ｃ、図１１Ｄ、および図１２Ｃ）。さらに、γ－セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴでＥｐＩＣＤの脱落を遮断すると、Wnt受容体の発現低下が観察された（図１１Ｅ、図１１Ｆ、および図１２Ｄ）。これらの結果に基づいて、ＥｐＩＣＤがWnt受容体の発現を促進する転写因子として機能し得る仮定した。この仮説を検証するために、Wnt受容体プロモーターの制御下にルシフェラーゼレポーターを構築した（図１２Ｅ）。予測されたように、細胞にＥｐＣＡＭをトランスフェクトするとプロモーター活性が亢進したが、ＤＡＰＴ処理ではその作用がほぼ完全に遮断された（図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｉ、および図１２Ｆ）。これらのデータは、ＥｐＩＣＤがプロモーターとの直接的な相互作用を介してWnt受容体タンパクの発現レベルを上方制御することを示唆している。これに関連して、ＥｐＥＸの過剰産生（癌細胞におけるように）は、ＥｐＥＸ－ＥＧＦＲ－ＥＲＫ系を介してプレセニリン－２をリン酸化し、ＥｐＩＣＤを切断するγ－セクレターゼを活性化し得る（Chen et al., 2020;Liang et al., 2018)。本試験では、WntおよびＥｐＥＸの両方がγ－セクレターゼを活性化して、より多くのＥｐＩＣＤを産生し得ることにも注目した（図１０）。したがって、本発明者らは、ＥｐＥＸがWnt受容体を上方制御できるかどうかを調べた。実際、ＥｐＥＸおよびWnt３Ａ処理はWnt受容体の発現を上方制御し、この組合せは、タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方における現象をさらに増強した（図１３Ａ、図１３Ｂ）。したがって、ＥｐＡｂ２－６およびＬＧＫ９７４はそれぞれ部分的に減少し、それらの組合せはWnt受容体の発現をほとんどゼロにした（図１１Ｊ、図１１Ｋ）。さらに、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃなどの分化多能性因子は癌の幹細胞性に重要であると考えられており、これらの遺伝子の転写はＥｐＩＣＤによって活性化されることがよく研究されている（Lin et al., 2012）。したがって、本試験では、ＥｐＣＡＭをノックダウンすると、幹細胞性因子のタンパク質および相対的ｍＲＮＡ発現レベルが低下した（図１３Ｃ、図１３Ｄ）。幹細胞性因子はWnt経路の直接の標的であるため、細胞をＥｐＥＸまたはWnt３Ａのいずれかで処理すると、分化多能性因子の発現が誘導されたが、併用処理はその効果をさらに増強させた（図１３Ｅ、図１３Ｆ）。実際、細胞をＬＧＫ９７４またはＥｐＡｂ２－６で処理すると、分化多能性因子の発現が低下し、併用処理はそのような活性を完全に無効にした（図１１Ｌ、図１１Ｍ）。これらの結果は、ＥｐＩＣＤが幹細胞性タンパク質の転写調節因子として機能することを明らかにしたＬｉｎら（Lin et al., 2012）による以前の研究と一致している。したがって、ＥｐＥＸはWnt受容体に結合してシグナル伝達を開始するが、ＥｐＩＣＤは転写因子として機能してWnt受容体タンパク質の産生を促進し、幹細胞性因子は癌幹細胞性を達成し得る。
高レベルのWnt受容体タンパク質はWnt活性を増加させ（MacDonald and He, 2012）、癌幹細胞性に影響を及ぼし得る。従って、Wnt受容体タンパク質のレベルがＥｐＣＡＭシグナル伝達によって影響されるかどうかを調べた。興味深いことに、ＥｐＣＡＭノックアウトまたはノックダウンがWnt受容体タンパク質レベルを有意に低下させることを見出した（図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１２Ａ、図１２Ｂ）。さらに、ノックアウト細胞を野生型ＥｐＣＡＭプラスミドでトランスフェクトすると、Wnt受容体が回復し、野生型様の細胞形態に変化した（図１１Ｃ、図１１Ｄ、および図１２Ｃ）。さらに、γ－セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴでＥｐＩＣＤの脱落を遮断すると、Wnt受容体の発現低下が観察された（図１１Ｅ、図１１Ｆ、および図１２Ｄ）。これらの結果に基づいて、ＥｐＩＣＤがWnt受容体の発現を促進する転写因子として機能し得る仮定した。この仮説を検証するために、Wnt受容体プロモーターの制御下にルシフェラーゼレポーターを構築した（図１２Ｅ）。予測されたように、細胞にＥｐＣＡＭをトランスフェクトするとプロモーター活性が亢進したが、ＤＡＰＴ処理ではその作用がほぼ完全に遮断された（図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｉ、および図１２Ｆ）。これらのデータは、ＥｐＩＣＤがプロモーターとの直接的な相互作用を介してWnt受容体タンパクの発現レベルを上方制御することを示唆している。これに関連して、ＥｐＥＸの過剰産生（癌細胞におけるように）は、ＥｐＥＸ－ＥＧＦＲ－ＥＲＫ系を介してプレセニリン－２をリン酸化し、ＥｐＩＣＤを切断するγ－セクレターゼを活性化し得る（Chen et al., 2020;Liang et al., 2018)。本試験では、WntおよびＥｐＥＸの両方がγ－セクレターゼを活性化して、より多くのＥｐＩＣＤを産生し得ることにも注目した（図１０）。したがって、本発明者らは、ＥｐＥＸがWnt受容体を上方制御できるかどうかを調べた。実際、ＥｐＥＸおよびWnt３Ａ処理はWnt受容体の発現を上方制御し、この組合せは、タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方における現象をさらに増強した（図１３Ａ、図１３Ｂ）。したがって、ＥｐＡｂ２－６およびＬＧＫ９７４はそれぞれ部分的に減少し、それらの組合せはWnt受容体の発現をほとんどゼロにした（図１１Ｊ、図１１Ｋ）。さらに、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃなどの分化多能性因子は癌の幹細胞性に重要であると考えられており、これらの遺伝子の転写はＥｐＩＣＤによって活性化されることがよく研究されている（Lin et al., 2012）。したがって、本試験では、ＥｐＣＡＭをノックダウンすると、幹細胞性因子のタンパク質および相対的ｍＲＮＡ発現レベルが低下した（図１３Ｃ、図１３Ｄ）。幹細胞性因子はWnt経路の直接の標的であるため、細胞をＥｐＥＸまたはWnt３Ａのいずれかで処理すると、分化多能性因子の発現が誘導されたが、併用処理はその効果をさらに増強させた（図１３Ｅ、図１３Ｆ）。実際、細胞をＬＧＫ９７４またはＥｐＡｂ２－６で処理すると、分化多能性因子の発現が低下し、併用処理はそのような活性を完全に無効にした（図１１Ｌ、図１１Ｍ）。これらの結果は、ＥｐＩＣＤが幹細胞性タンパク質の転写調節因子として機能することを明らかにしたＬｉｎら（Lin et al., 2012）による以前の研究と一致している。したがって、ＥｐＥＸはWnt受容体に結合してシグナル伝達を開始するが、ＥｐＩＣＤは転写因子として機能してWnt受容体タンパク質の産生を促進し、幹細胞性因子は癌幹細胞性を達成し得る。
【0118】
２．７ ＬＧＫ９７４およびＥｐＡｂ２－６は協調的にアポトーシスを誘導し、腫瘍の進行を阻害する
本発明者らのデータから、ＥｐＣＡＭおよびWntタンパク質はWntシグナル伝達を協調的に刺激して幹細胞性を促進することが示唆されたが、これはＥｐＡｂ２－６およびＬＧＫ９７４を用いて両シグナルを同時に遮断することによって阻害され得るため、この組合せの細胞効果を試験した。ＥｐＡｂ２－６単独で処理すると結腸癌細胞にアポトーシスを誘導できたが、ＬＧＫ９７４では誘導できなかったことを見出した。しかし、アポトーシスの誘導は組合せ処理を受けた細胞で増幅された（図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５Ａ、図１５Ｂ）。さらに、このような効果がＭＴ２０１で再現できるかどうかを評価したところ、該抗体はこのような活性を示さず、一方で、ｈＥｐＡｂ２－６はｍＥｐＡｂ２－６と同様の活性を示した（図６Ｇ、図６Ｈ）。これらの結果から、動物モデルを用いてＥｐＡｂ２－６の抗腫瘍効果を試験することが奨励された。これに関連して、ＥｐＣＡＭは、結腸癌の転移を促進するＥＭＴ遺伝子発現を増強することが以前に報告されている（Lin et al., 2012）。したがって、本発明者らは、ＥｐＡｂ２－６およびＬＧＫ９７４の併用効果をヒトの転移動物モデルおよび同所性動物モデルの両方で評価することにした。転移動物モデルでは、ＨＣＴ１１６細胞を尾静脈から注入したが、同所性モデルでは細胞を盲腸壁に外科的に移植した。両モデルとも移植後７２時間で治療を開始した（図１５Ｃ）。転移モデルでは、ＥｐＡｂ２－６または併用のいずれかで処置すると生存期間が延長することが見いだされた。ＥｐＡｂ２－６群では５匹中２匹のみが試験終了時までに死亡し、併用群では５匹中０匹が死亡した。しかしながら、対照ＩｇＧまたはＬＧＫ９７４投与群のほとんどの動物に遠隔転移が認められ、全生存期間の短縮と関連していた（図１４Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅ）。同様に、同所性モデルでは、対照ＩｇＧおよびＬＧＫ９７４群のすべての動物が有意に腫瘍を発症し、低い生存期間中央値を示した（図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｆ）。ＥｐＡｂ２－６投与群では腫瘍の進行がはるかに遅く、対照ＩｇＧまたはＬＧＫ９７４投与群よりも比較的高い生存期間中央値を示した（図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｆ）。腫瘍進行の減少は併用療法群でさらに顕著であり、６匹中４匹で腫瘍が完全に消失し、動物の全生存期間が延長された（図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｆ）。注目すべきことに、これまでの研究では、ＬＧＫ９７４は５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で無毒であると報告されている（Liu et al., 2013）。本発明者らは、ＬＧＫ９７４投与動物および併用投与動物の両方の体重が投与期間中に減少したことを見出した（図１５Ｆ）。しかしながら、投与中止後、併用群は体重が回復したのに対し、ＬＧＫ９７４投与マウスでは腫瘍量のためと考えられる体重減少が続いた。これらのデータをまとめると、ＥｐＣＡＭはＣＲＣにおける癌幹細胞性を確立するためにＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤを介してWnt機序を積極的に組織化しているため、ＥｐＡｂ２－６およびポルクピン阻害剤の併用療法は癌幹細胞性を完全に抑制して治療効果を最大化し得ると結論づける（図１６）。
本発明者らのデータから、ＥｐＣＡＭおよびWntタンパク質はWntシグナル伝達を協調的に刺激して幹細胞性を促進することが示唆されたが、これはＥｐＡｂ２－６およびＬＧＫ９７４を用いて両シグナルを同時に遮断することによって阻害され得るため、この組合せの細胞効果を試験した。ＥｐＡｂ２－６単独で処理すると結腸癌細胞にアポトーシスを誘導できたが、ＬＧＫ９７４では誘導できなかったことを見出した。しかし、アポトーシスの誘導は組合せ処理を受けた細胞で増幅された（図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５Ａ、図１５Ｂ）。さらに、このような効果がＭＴ２０１で再現できるかどうかを評価したところ、該抗体はこのような活性を示さず、一方で、ｈＥｐＡｂ２－６はｍＥｐＡｂ２－６と同様の活性を示した（図６Ｇ、図６Ｈ）。これらの結果から、動物モデルを用いてＥｐＡｂ２－６の抗腫瘍効果を試験することが奨励された。これに関連して、ＥｐＣＡＭは、結腸癌の転移を促進するＥＭＴ遺伝子発現を増強することが以前に報告されている（Lin et al., 2012）。したがって、本発明者らは、ＥｐＡｂ２－６およびＬＧＫ９７４の併用効果をヒトの転移動物モデルおよび同所性動物モデルの両方で評価することにした。転移動物モデルでは、ＨＣＴ１１６細胞を尾静脈から注入したが、同所性モデルでは細胞を盲腸壁に外科的に移植した。両モデルとも移植後７２時間で治療を開始した（図１５Ｃ）。転移モデルでは、ＥｐＡｂ２－６または併用のいずれかで処置すると生存期間が延長することが見いだされた。ＥｐＡｂ２－６群では５匹中２匹のみが試験終了時までに死亡し、併用群では５匹中０匹が死亡した。しかしながら、対照ＩｇＧまたはＬＧＫ９７４投与群のほとんどの動物に遠隔転移が認められ、全生存期間の短縮と関連していた（図１４Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅ）。同様に、同所性モデルでは、対照ＩｇＧおよびＬＧＫ９７４群のすべての動物が有意に腫瘍を発症し、低い生存期間中央値を示した（図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｆ）。ＥｐＡｂ２－６投与群では腫瘍の進行がはるかに遅く、対照ＩｇＧまたはＬＧＫ９７４投与群よりも比較的高い生存期間中央値を示した（図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｆ）。腫瘍進行の減少は併用療法群でさらに顕著であり、６匹中４匹で腫瘍が完全に消失し、動物の全生存期間が延長された（図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｆ）。注目すべきことに、これまでの研究では、ＬＧＫ９７４は５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で無毒であると報告されている（Liu et al., 2013）。本発明者らは、ＬＧＫ９７４投与動物および併用投与動物の両方の体重が投与期間中に減少したことを見出した（図１５Ｆ）。しかしながら、投与中止後、併用群は体重が回復したのに対し、ＬＧＫ９７４投与マウスでは腫瘍量のためと考えられる体重減少が続いた。これらのデータをまとめると、ＥｐＣＡＭはＣＲＣにおける癌幹細胞性を確立するためにＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤを介してWnt機序を積極的に組織化しているため、ＥｐＡｂ２－６およびポルクピン阻害剤の併用療法は癌幹細胞性を完全に抑制して治療効果を最大化し得ると結論づける（図１６）。
【0119】
２．８ ＥｐＡｂ２－６はＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメインＩおよびＩＩに結合する
本発明において、ＥｐＥＸの両方のＥＧＦ様ドメインでＥｐＣＡＭに結合するかどうかを調べた（図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ）。ＥｐＡｂ２－６がＥｐＣＡＭのＬＹＤモチーフを認識することを確認するために、ＥｐＣＡＭの第１のＥＧＦ様リピート（ａａ ２７－５９；ＥＧＦ－Ｉドメイン）および第２のＥＧＦ様リピート（ａａ ６６－１３５；ＥＧＦ－ＩＩ／ＴＹドメイン）をコードするｃＤＮＡ配列を構築した。次に、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発を用いて、各ドメインに変異を導入した（図１８Ｄ）。これらのＥｐＣＡＭ変異体に対するＥｐＡｂ２－６抗体の反応性を、免疫蛍光（図１８Ｅ）、フローサイトメトリー（図１８Ｆ）、および細胞ＥＬＩＳＡ（図１８Ｇ）によって評価した。ＥｐＣＡＭ位置Ｙ３２（ＥＧＦ－Ｉドメイン）またはＹ９５（ＥＧＦ－ＩＩドメイン）のアミノ酸変異は、ＥｐＡｂ２－６結合の顕著な減少を引き起こしたが、ＭＴ２０１結合には影響を及ぼさなかった。したがって、本発明者らは、ＥｐＡｂ２－６が、それぞれアミノ酸残基Ｙ３２およびＹ９５を標的とするＥｐＥＸのＥＧＦ－ＩドメインおよびＥＧＦ－ＩＩドメインに結合すると結論付ける。
本発明において、ＥｐＥＸの両方のＥＧＦ様ドメインでＥｐＣＡＭに結合するかどうかを調べた（図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ）。ＥｐＡｂ２－６がＥｐＣＡＭのＬＹＤモチーフを認識することを確認するために、ＥｐＣＡＭの第１のＥＧＦ様リピート（ａａ ２７－５９；ＥＧＦ－Ｉドメイン）および第２のＥＧＦ様リピート（ａａ ６６－１３５；ＥＧＦ－ＩＩ／ＴＹドメイン）をコードするｃＤＮＡ配列を構築した。次に、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発を用いて、各ドメインに変異を導入した（図１８Ｄ）。これらのＥｐＣＡＭ変異体に対するＥｐＡｂ２－６抗体の反応性を、免疫蛍光（図１８Ｅ）、フローサイトメトリー（図１８Ｆ）、および細胞ＥＬＩＳＡ（図１８Ｇ）によって評価した。ＥｐＣＡＭ位置Ｙ３２（ＥＧＦ－Ｉドメイン）またはＹ９５（ＥＧＦ－ＩＩドメイン）のアミノ酸変異は、ＥｐＡｂ２－６結合の顕著な減少を引き起こしたが、ＭＴ２０１結合には影響を及ぼさなかった。したがって、本発明者らは、ＥｐＡｂ２－６が、それぞれアミノ酸残基Ｙ３２およびＹ９５を標的とするＥｐＥＸのＥＧＦ－ＩドメインおよびＥＧＦ－ＩＩドメインに結合すると結論付ける。
【0120】
３． 考察
ＥｐＣＡＭは強力なＣＳＣ表面抗原であることが知られており、その高発現はＣＲＣの一般的な特徴として報告されている（Boesch et al., 2018;Dalerba et al., 2007;Gires et al., 2009;Gires et al., 2020;Lin et al., 2012）。ＥｐＩＣＤの細胞内効果に加えて、ＥｐＣＡＭは細胞外腫瘍微小環境においてＥｐＥＸを介してシグナルを伝達する。この点に関して、癌細胞の表現型は、自己再生能および高い腫瘍形成能を付与し得る異常かつ不均一な細胞シグナル伝達ネットワークに起因する。さらに、癌細胞の特定の亜集団は、強力な腫瘍形成能を有すると考えられる幹細胞性の特性を示し、メラノーマ中の単一のＣＳＣでさえも完全な不均一腫瘍を形成し得る（Quintana et al., 2008）。この悪性の可能性のために、ＣＳＣを除去することは、癌患者を処置する際に非常に有益であり得る。しかしながら、この目標は、癌細胞の高い可塑性のために依然として困難であり、すなわち、非ＣＳＣは、微小環境によって適切に刺激されたときに脱分化してＣＳＣになり得る。したがって、ＣＳＣの除去には、ＣＳＣ集団の直接標的化だけでなく、微小環境からの特定のシグナルの同時遮断も必要であり得る（Batlle and Clevers, 2017）。特に、ＣＲＣ微小環境は、β－カテニンシグナル伝達を介して幹細胞性を付与することが示されているWntリガンドが豊富であることが多い（Batlle and Clevers, 2017； Vermeulen et al., 2010; Voloshanenko et al., 2013）。実際に、ＣＲＣは、ＣＳＣの状況に応じた機能をサポートするようにモデル化されている（Batlle and Clevers, 2017）。このように、腸幹細胞（ＩＳＣ）の陰窩（crypt）ニッチは、幹細胞の未分化状態を維持するのに役立つWntリガンドで濃縮されている。Wntシグナル伝達に異常に影響する遺伝子変化は、陰窩前駆体表現型をＣＲＣに変換することができ、ＩＳＣがＣＲＣの主要な細胞型の起源であることを示唆している（Barker et al., 2009;van de Wetering et al., 2002）。これらの研究は、Wntシグナル伝達が、幹細胞性を課す因子として、ＣＲＣニッチの機能に中心的に関与していることを示唆している。
ＥｐＣＡＭは強力なＣＳＣ表面抗原であることが知られており、その高発現はＣＲＣの一般的な特徴として報告されている（Boesch et al., 2018;Dalerba et al., 2007;Gires et al., 2009;Gires et al., 2020;Lin et al., 2012）。ＥｐＩＣＤの細胞内効果に加えて、ＥｐＣＡＭは細胞外腫瘍微小環境においてＥｐＥＸを介してシグナルを伝達する。この点に関して、癌細胞の表現型は、自己再生能および高い腫瘍形成能を付与し得る異常かつ不均一な細胞シグナル伝達ネットワークに起因する。さらに、癌細胞の特定の亜集団は、強力な腫瘍形成能を有すると考えられる幹細胞性の特性を示し、メラノーマ中の単一のＣＳＣでさえも完全な不均一腫瘍を形成し得る（Quintana et al., 2008）。この悪性の可能性のために、ＣＳＣを除去することは、癌患者を処置する際に非常に有益であり得る。しかしながら、この目標は、癌細胞の高い可塑性のために依然として困難であり、すなわち、非ＣＳＣは、微小環境によって適切に刺激されたときに脱分化してＣＳＣになり得る。したがって、ＣＳＣの除去には、ＣＳＣ集団の直接標的化だけでなく、微小環境からの特定のシグナルの同時遮断も必要であり得る（Batlle and Clevers, 2017）。特に、ＣＲＣ微小環境は、β－カテニンシグナル伝達を介して幹細胞性を付与することが示されているWntリガンドが豊富であることが多い（Batlle and Clevers, 2017； Vermeulen et al., 2010; Voloshanenko et al., 2013）。実際に、ＣＲＣは、ＣＳＣの状況に応じた機能をサポートするようにモデル化されている（Batlle and Clevers, 2017）。このように、腸幹細胞（ＩＳＣ）の陰窩（crypt）ニッチは、幹細胞の未分化状態を維持するのに役立つWntリガンドで濃縮されている。Wntシグナル伝達に異常に影響する遺伝子変化は、陰窩前駆体表現型をＣＲＣに変換することができ、ＩＳＣがＣＲＣの主要な細胞型の起源であることを示唆している（Barker et al., 2009;van de Wetering et al., 2002）。これらの研究は、Wntシグナル伝達が、幹細胞性を課す因子として、ＣＲＣニッチの機能に中心的に関与していることを示唆している。
【0121】
古典的なWnt経路の特徴であるβ－カテニンの核内蓄積は、Wntリガンドがその受容体に結合すると起こり、破壊複合体を細胞膜に動員し、活性型β－カテニンと呼ばれるβ－カテニンを脱リン酸化する（Nusse and Clevers, 2017）。ここではさらに、ＥｐＥＸがシグナル伝達を活性化するWnt受容体との相互作用を介してβ－カテニンの核内蓄積も誘導できることを示した。したがって、Wntタンパク質またはＥｐＥＸとWnt受容体との相互作用は、β－カテニンを放出してＥｐＩＣＤと複合体を形成し、これは核に移動し、そこでWnt受容体タンパク質および幹細胞性因子などのＥｐＣＡＭ標的遺伝子を転写する（Lin et al., 2012）。WntまたはＥｐＥＸの影響下で、β－カテニンはＥｐＩＣＤとは独立して核に移動し得、ＴＣＦ／ＬＥＦがＥｐＣＡＭ自体およびＡｘｉｎ２などのWnt標的遺伝子の転写因子として機能することを可能にする（Gires et al., 2020；Maetzel et al., 2009；Nusse and Clevers., 2017）。特に、ＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤの過剰産生は、ＥｐＣＡＭシグナル伝達の亢進をもたらす。本発明者らは以前に、ＥｐＥＸ－ＥＧＦＲ軸を介したＥＲＫ１／２シグナル伝達の刺激が、ＴＡＣＥおよびプレセニリン－２のリン酸化を引き起こし、ＣＲＣおよび肺癌におけるＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤ切断を増強する酵素を活性化し得ることを報告した（Chen et al., 2020；Liang et al., 2018）。本発明ではさらに、Wntタンパク質およびＥｐＥＸタンパク質もWntシグナル伝達を介してＴＡＣＥおよびプレセニリン－２を活性化し、ＧＳＫ３およびＣＫ１が正のフィードバックループを確立する必要があることを見出した。したがって、Wnt受容体のリガンドとしてのＥｐＥＸの機能は、ＥｐＩＣＤが潜在的な癌幹細胞性を達成する重要なWnt受容体タンパク質の転写に関与する腫瘍微小環境における外因性の手がかり（cue）として示される。
【0122】
現在、癌の治療戦略は、ほとんどの場合、標準的な抗増殖療法によって癌細胞を排除することによって癌を標的とするように設計されている。しかしながら、そのような戦略はしばしば限られた肯定的な結果に悩まされる。処置を中止すると、癌を再発させ得る一部の残存細胞集団（抗癌剤耐性細胞と呼ばれる）がＣＳＣに濃縮される。癌の再発は、多くの場合、複数の独立した機序を介して薬剤耐性を獲得したＣＳＣに起因する（Borst, 2012；Holohan et al., 2013）。したがって、ＣＳＣが可塑性および静止性を示す固有の能力は、薬剤耐性の強力な促進因子であると考えられている（Borst, 2012)。興味深いことに、ＣＳＣは、細胞外Wnt機構を含む微小環境における外因的な手がかりからこのような特性を獲得している（Batlle and Clevers, 2017;Nusse and Clevers, 2017）。実際、ＣＳＣシグナル伝達を抑制することを目的として、Wnt経路を標的とする試みがなされているが（ポルクピン、ＦＺＤタンパク質および抗ＲＳＰＯ３の阻害剤）、これらの戦略は薬剤耐性およびＣＳＣプールの再生によって阻止されている（Batlle and Clevers, 2017;Kahn, 2014）。さらに、ＣＲＣを含むいくつかの癌タイプはＥｐＣＡＭを豊富に発現しているため（Gires et al., 2020）、ＥｐＥＸは腫瘍微小環境における外因的な手がかりとして機能するように濃縮されている。ＣＳＣ集団およびＣＳＣ誘導の手がかりを標的とするためには、ＥｐＣＡＭおよびWntシグナル伝達の両方を同時に標的とすることが必要であり、これにより薬剤耐性を克服し得る。本発明では、本発明者らの抗ＥｐＣＡＭ抗体であるＥｐＡｂ２－６が、ＬＧＫ９７４と組み合わせて、癌細胞にアポトーシスを誘導し、マウスモデルにおいて腫瘍進行を妨げるために、癌幹細胞性に関連する機序を減弱させ得ることを示す。特に、動物モデルにおいてアポトーシスを誘導または癌進行を阻害するという点で、ＬＧＫ９７４単独の有意な効果は観察されず、これは以前の研究（Cho et al., 2020）と一致している。しかしながら、ＥｐＡｂ２－６と組み合わせた阻害剤は有望な治療効果を示した。したがって、これらの知見は、ＣＳＣ治療のためのより良い戦略の設計に有益であるとともに、薬剤耐性を克服するのに役立ち得る。
【0123】
WntおよびＥｐＣＡＭは両方とも、癌の進行、増殖、ＥＭＴ、転移および幹細胞性における重要な遺伝子の転写を促進する（Gires et al., 2020;Lin et al., 2012）。さらに、両方のシグナル伝達成分は、ＣＲＣにおけるＣＳＣ表現型およびＣＳＣ-微小環境コミュニケーションに寄与する。興味深いことに、本発明者らは、機能的なWntリガンドが存在しない場合（細胞をＬＧＫ９７４で処理したとき）、ＥｐＥＸがβ－カテニンシグナル伝達および癌幹細胞性を維持することを見出した。WntリガンドおよびＥｐＥＸの併用阻害のみが、Wnt経路活性を完全に阻害し、癌幹細胞性を消失させることができた。したがって、ＥｐＡｂ２－６およびポルクピン阻害剤の併用療法は、ＣＳＣを標的とする有効な方法であり得る。ＥｐＣＡＭおよびWnt機構の両方の高発現を示す多くの癌タイプ（特に固形腫瘍）に共通する特徴であり、ＥｐＣＡＭはWntシグナル伝達をさらに刺激し得る。したがって、ＥｐＣＡＭは経路をさらに活性化し、ＣＳＣを維持し、癌の増殖を促進するため、Wntリガンドを遮断してもシグナル伝達は完全には停止しない可能性がある。このような場合、ＥｐＥＸおよびWntリガンドの両方を遮断することは、癌の進行を抑制するために必要であり得る。この癌進行の遮断は、ＣＳＣ表現型に寄与する生存促進細胞内シグナル伝達の欠如、ならびに微小環境と腫瘍細胞との間の情報伝達の阻害に起因し得る。本発明者らの試験から得られた機構的洞察は、既存の治療法を改善したり、新しい抗癌療法を開発したりするのに有用であり得る。
【0124】
文献
Barker, N., Ridgway, R.A., van Es, J.H., van de Wetering, M., Begthel, H., van den Born, M., Danenberg, E., Clarke, A.R., Sansom, O.J., and Clevers, H. (2009). Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature 457, 608-611.
Batlle, E., and Clevers, H. (2017). Cancer stem cells revisited. Nat Med 23, 1124-1134.
Boesch, M., Spizzo, G., and Seeber, A. (2018). Concise Review: Aggressive Colorectal Cancer: Role of Epithelial Cell Adhesion Molecule in Cancer Stem Cells and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Stem Cells Transl Med 7, 495-501.
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【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図8-5】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図9-5】
【図9-6】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図11-5】
【図11-6】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【図18-4】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】