特表 2024-527539 ＩＬ１３Ｒα２を標的としたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞及びその製造方法と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-25

(54)【発明の名称】ＩＬ１３Ｒα２を標的としたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞及びその製造方法と使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240718BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240718BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240718BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240718BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240718BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240718BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240718BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240718BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240718BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240718BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240718BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20240718BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N15/113 140Z

C12N15/09 110

C07K19/00

A61K35/17

A61K35/12

A61K35/76

A61K35/761

A61K31/7105

A61K31/713

A61K48/00

A61P35/00

C12N5/0783

C12N15/13

C12N15/12

C07K16/28

C07K14/705

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580404

(86)(22)【出願日】2022-06-30

(85)【翻訳文提出日】2024-02-08

(86)【国際出願番号】 CN2022103037

(87)【国際公開番号】W WO2023274380

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】202110749536.3

(32)【優先日】2021-07-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】522261558

【氏名又は名称】寧波茂行生物医薬科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】尚 小云

(72)【発明者】

【氏名】李 甲▲ルゥ▼

(72)【発明者】

【氏名】蒋 海娟

(72)【発明者】

【氏名】王 丹

(72)【発明者】

【氏名】馬 少文

(72)【発明者】

【氏名】沈 慧

(72)【発明者】

【氏名】徐 凡麗

(72)【発明者】

【氏名】王 世臣

(72)【発明者】

【氏名】陳 偉杰

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA12

4C087CA20

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、修飾された免疫エフェクター細胞に関し、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞におけるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）のＴ細胞における機能が阻害され、且つ上記修飾された免疫エフェクター細胞は、ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。本出願の修飾された免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞表面抗原を認識すると同時に、細胞によって発現されるＴＣＲ及びＨＬＡ－Ａ遺伝子をノックアウトすることで、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を向上させ、細胞の生存時間を延長し、同時に同種異系細胞療法によって引き起こされる免疫拒絶反応の多重効果を低減する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫エフェクター細胞であって、前記免疫エフェクター細胞におけるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ前記免疫エフェクター細胞は、ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、免疫エフェクター細胞。

【請求項2】

前記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は標的部分を含み、前記標的部分は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＶＨは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項3】

前記ＶＨは配列番号１６又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項4】

前記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＨを含む標的部分を含み、前記ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項5】

前記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項6】

前記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４又は５に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項7】

前記ＶＨは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む、請求項４～６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項8】

前記ＶＨは、重鎖フレームワーク領域１（ＨＦＲ１）、重鎖フレームワーク領域２（ＨＦＲ２）、重鎖フレームワーク領域３（ＨＦＲ３）及び重鎖フレームワーク領域４（ＨＦＲ４）を含み、前記ＨＦＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４～７の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項9】

前記ＨＦＲ１は配列番号８又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項10】

前記ＨＦＲ２は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８又は９に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項11】

前記ＨＦＲ２は配列番号９又は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１０の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項12】

前記ＨＦＲ３は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１１の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項13】

前記ＨＦＲ３は配列番号１０又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１２の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項14】

前記ＨＦＲ４は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１３の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項15】

前記ＨＦＲ４は配列番号１１又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８～１４の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項16】

前記ＶＨはＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３及びＨＦＲ４を含み、且つ前記ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３及びＨＦＲ４は、
ｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ２、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ３、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ４、及び
ｉｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ１、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ２、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ３、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ４、から選ばれる、請求項４～１５の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項17】

前記ＶＨは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４～１６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項18】

前記ＶＨは配列番号１６又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４～１７の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項19】

前記標的部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つのＣＤＲを更に含み、前記ＶＬは配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２～１９の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項20】

前記ＶＬは配列番号３４又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項21】

前記標的部分は、ＶＨの少なくとも１つのＣＤＲ及びＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含み、且つ前記ＶＨ及びＶＬは、
ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、及び
ｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、から選ばれる、請求項２０に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項22】

前記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＬを含む標的部分を含み、前記ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４～２１の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項23】

前記ＬＣＤＲ２は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４～２２の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項24】

前記ＬＣＤＲ３は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４～２３の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項25】

前記ＶＬは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、請求項４～２４の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項26】

前記ＶＬは、軽鎖フレームワーク領域１（ＬＦＲ１）、軽鎖フレームワーク領域２（ＬＦＲ２）、軽鎖フレームワーク領域３（ＬＦＲ３）及び軽鎖フレームワーク領域４（ＬＦＲ４）を含み、前記ＬＦＲ１は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４～２５の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項27】

前記ＬＦＲ１は配列番号２６又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項28】

前記ＬＦＲ２は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２６又は２７に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項29】

前記ＬＦＲ２は配列番号２７又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２６～２８の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項30】

前記ＬＦＲ３は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２６～２９の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項31】

前記ＬＦＲ３は配列番号２８又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２６～３０の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項32】

前記ＬＦＲ４は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２６～３１の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項33】

前記ＬＦＲ４は配列番号２９又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２６～３２の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項34】

前記ＶＬはＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３及びＬＦＲ４を含み、且つ前記ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３及びＬＦＲ４は、
ｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ３、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ４、及び
ｉｉ）配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ１、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ２、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ３、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ４、から選ばれる、請求項２２～３３の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項35】

前記ＶＬは配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２～３４の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項36】

前記ＶＬは配列番号３４又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２～３５の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項37】

前記標的部分はＶＨ及びＶＬを含み、そのうち、前記ＶＨは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２～３６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項38】

前記ＶＨ及びＶＬは、
ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、及び
ｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、から選ばれる、請求項３７に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項39】

前記標的部分は、全長抗体、Ｆａｂ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を含む、請求項２～３８の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項40】

前記標的部分はｓｃＦｖを含む、請求項２～３９の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項41】

前記標的部分は、配列番号４１又は配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２～４０の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項42】

前記標的部分は、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２又は配列番号４３に示されるのアミノ酸配列を含む、請求項２～４１の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項43】

前記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は標的部分を含み、前記標的部分は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２～４２の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項44】

前記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＨを含む標的部分を含み、前記ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ３は配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項45】

前記ＨＣＤＲ２は配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項46】

前記ＨＣＤＲ１は配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４４又は４５に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項47】

前記ＶＨは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む、請求項４４～４６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項48】

前記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４４～４７の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項49】

前記標的部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つのＣＤＲを更に含み、前記ＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４３～４８の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項50】

前記標的部分はＶＨの少なくとも１つのＣＤＲ及びＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含み、且つ前記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４３～４９の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項51】

前記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＬを含む標的部分を含み、前記ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、前記ＬＣＤＲ１は配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４４～５０の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項52】

前記ＬＣＤＲ２は配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項53】

前記ＬＣＤＲ３は配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項54】

前記ＶＬは、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２及び配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、請求項５１～５３の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項55】

前記ＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５１～５４の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項56】

前記標的部分はＶＨ及びＶＬを含み、そのうち、前記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４４～５５の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項57】

前記標的部分は、全長抗体、Ｆａｂ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を含む、請求項４３～５６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項58】

前記標的部分はｓｃＦｖを含む、請求項４３～５７の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項59】

前記標的部分は配列番号６１又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４３～５８の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項60】

前記ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε（ＣＤ３ｅ）、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４及びＳＬＡＭからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む、請求項４３～５９の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項61】

前記膜貫通ドメインはＣＤ８Ａに由来する膜貫通ドメインを含む、請求項６０に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項62】

前記膜貫通ドメインは配列番号６９～配列番号１１７の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６０又は６１に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項63】

前記ＣＡＲは、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０及びＭｙＤ８８からなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項６０～６２の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項64】

前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項６３に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項65】

前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは配列番号１１８～配列番号１５０の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６３又は６４に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項66】

前記ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃｅＲＩγ、ＦｃｅＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４Ｎｅｆ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２及び少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項６０～６５の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項67】

前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインを含む、請求項６６に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項68】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１５１～配列番号１６１の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６６又は６７に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項69】

前記ＣＡＲは、標的部分と膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８Ａ、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０及びＬＩＧＨＴからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む、請求項６０～６８の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項70】

前記ヒンジ領域はＣＤ８Ａに由来するヒンジ領域を含む、請求項６９に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項71】

前記ヒンジ領域は配列番号１６２～配列番号１８３の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６９又は７０に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項72】

前記キメラ抗原受容体の非標的部分は、ＣＤ８Ａ分子膜貫通ドメイン、ＣＤ８Ａのヒンジ領域、４－１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項６０～７１の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項73】

前記キメラ抗原受容体の非標的部分は配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項74】

前記キメラ抗原受容体は、Ｃ末端が前記標的部分のＮ末端に連結するシグナルペプチド断片を更に含む、請求項６０～７３の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項75】

前記シグナルペプチド断片はＣＤ８Ａシグナルペプチド断片を含む、請求項７４に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項76】

前記シグナルペプチド断片は配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７４又は７５に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項77】

前記キメラ抗原受容体は、配列番号４５又は配列番号４６の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～７６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項78】

前記免疫エフェクター細胞はヒト細胞を含む、請求項１～７７の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項79】

前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単核細胞、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球及び／又は末梢血単核細胞を含む、請求項１～７８の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項80】

自己又は非自己の免疫エフェクター細胞を含む、請求項１～７９の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項81】

前記免疫エフェクター細胞は、修飾された免疫エフェクター細胞を含み、そのうち、前記修飾は、免疫拒絶に関連する１つ又は複数の遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされることを含む、請求項１～８０の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項82】

前記免疫拒絶に関連する遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡからなる群より選ばれる１つ又は複数の遺伝子である、請求項８１に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項83】

前記修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾されていない対応する細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされる、請求項８１又は８２に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項84】

前記修飾された免疫エフェクター細胞は、前記修飾されていない対応する細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない、請求項８１～８３の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項85】

前記修飾された免疫エフェクター細胞は、前記修飾されていない対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない、請求項８１～８４の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項86】

前記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされる、請求項８１～８５の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項87】

前記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない、請求項８１～８６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項88】

前記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない、請求項８１～８７の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項89】

前記遺伝子の発現レベル及び／又は活性のダウンレギュレーションは、前記遺伝子をコードする核酸分子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーション、及び／又は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質産物の発現及び/又は活性のダウンレギュレーションを含む、請求項８１～８８の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項90】

前記修飾は、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異及び／又は遺伝子サイレンシングを含む、請求項８１～８９の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項91】

前記修飾は、前記免疫エフェクター細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む、請求項８１～９０の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項92】

前記修飾は、前記免疫細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子がノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む、請求項８１～９１の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項93】

前記修飾は、前記免疫細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子エクソンがノックアウトされると共に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソンがノックアウトされることを含む、請求項８１～９２の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項94】

前記修飾は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムからなる群より選ばれる１つ又は複数の物質を前記免疫エフェクター細胞に投与することを含む、請求項８１～９３の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項95】

前記修飾はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを前記免疫エフェクター細胞に投与することを含む、請求項８１～９４の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項96】

前記修飾は、前記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを前記免疫エフェクター細胞に投与することを更に含む、請求項９５に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項97】

前記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１８６～配列番号２００の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項９６に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項98】

前記修飾は、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを前記免疫エフェクター細胞に投与することを含む、請求項９５～９７の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項99】

前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号２０１～配列番号２４１の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項９８に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項100】

前記修飾は、Ｃａｓ酵素を前記細胞に投与することを更に含む、請求項９５～９９の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項101】

Ｃａｓ酵素はＣａｓ９タンパク質を含む、請求項１００に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項102】

前記アンチセンスＲＮＡは配列番号２４２～配列番号２４５の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項９４に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項103】

前記免疫エフェクター細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞である、請求項１～１０２の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項104】

前記ＨＬＡ－Ａホモ接合体は、ＨＬＡ－Ｂ＊４０ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４６ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１３ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５８ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊３５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５５ホモ接合体を含む、請求項１０３に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項105】

前記免疫エフェクター細胞はＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体細胞である、請求項１～１０４の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項106】

前記ＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊１１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊０２／Ａ＊１１ヘテロ接合体又はＨＬＡ－Ａ＊２４ホモ接合体を含む、請求項１０５に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項107】

免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、免疫エフェクター細胞に、請求項１～１０６の何れか１項に記載のＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、又は請求項１～１０６の何れか１項に記載のＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入する前／後に、前記免疫エフェクター細胞が修飾されることを含み、前記修飾は、免疫拒絶に関連する１つ又は複数の遺伝子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む、方法。

【請求項108】

前記ベクターは発現ベクターである、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから選ばれる、請求項１０７又は１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記免疫拒絶に関連する遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡからなる群より選ばれる１つ又は複数の遺伝子である、請求項１０７～１０９の何れか１項に記載の方法。

【請求項111】

前記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、前記免疫エフェクター細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び/又は活性はダウンレギュレーションされる、請求項１０７～１１０の何れか１項に記載の方法。

【請求項112】

前記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない、請求項１０７～１１１の何れか１項に記載の方法。

【請求項113】

前記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない、請求項１０７～１１２の何れか１項に記載の方法。

【請求項114】

対応する野生型細胞と比較して、前記免疫エフェクター細胞のＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされる、請求項１０７～１１３の何れか１項に記載の方法。

【請求項115】

対応する野生型細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない、請求項１０７～１１４の何れか１項に記載の方法。

【請求項116】

対応する野生型細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない、請求項１０７～１１５の何れか１項に記載の方法。

【請求項117】

前記遺伝子の発現レベル及び／又は活性のダウンレギュレーションは、前記遺伝子をコードする核酸分子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーション、及び／又は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質産物の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む、請求項１０７～１１６の何れか１項に記載の方法。

【請求項118】

前記修飾は、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異及び／又は遺伝子サイレンシングを含む、請求項１０７～１１７の何れか１項に記載の方法。

【請求項119】

前記修飾は、前記免疫エフェクター細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされると共に、２つのHLA-A対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む、請求項１０７～１１８の何れか１項に記載の方法。

【請求項120】

前記修飾は、前記免疫細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子がノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む、請求項１０７～１１９の何れか１項に記載の方法。

【請求項121】

前記修飾は、前記免疫細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子エクソンがノックアウトされると共に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソンがノックアウトされることを含む、請求項１０７～１２０の何れか１項に記載の方法。

【請求項122】

前記修飾は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムからなる群より選ばれる１つ又は複数の物質を前記免疫エフェクター細胞に投与することを含む、請求項１０７～１２１の何れか１項に記載の方法。

【請求項123】

前記修飾はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを前記免疫エフェクター細胞に投与することを含む、請求項１０７～１２２の何れか１項に記載の方法。

【請求項124】

前記修飾は、前記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを前記免疫エフェクター細胞に投与することを含む、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１８６～配列番号２００の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

前記修飾は、前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを前記免疫エフェクター細胞に投与することを含む、請求項１２３～１２５の何れか１項に記載の方法。

【請求項127】

前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号２０１～配列番号２４１の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２６に記載の方法。

【請求項128】

前記修飾は、Ｃａｓ酵素を前記細胞に投与することを更に含む、請求項１２３～１２７の何れか１項に記載の方法。

【請求項129】

Ｃａｓ酵素はＣａｓ９タンパク質を含む、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記アンチセンスＲＮＡは配列番号２４２～配列番号２４５の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２２に記載の方法。

【請求項131】

前記免疫エフェクター細胞はヒト細胞を含む、請求項１０７～１３０の何れか１項に記載の方法。

【請求項132】

前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単核細胞、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球及び／又は末梢血単核細胞を含む、請求項１０７～１３１の何れか１項に記載の方法。

【請求項133】

前記免疫エフェクター細胞は自己又は非自己の免疫エフェクター細胞を含む、請求項１０７～１３２の何れか１項に記載の方法。

【請求項134】

前記細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞である、請求項１０７～１３３の何れか１項に記載の方法。

【請求項135】

前記ＨＬＡ－Ｂホモ接合体は、ＨＬＡ－Ｂ＊４０ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４６ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１３ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５８ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊３５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５５ホモ接合体を含む、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

前記細胞はＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体細胞である、請求項１０７～１３５の何れか１項に記載の方法。

【請求項137】

前記ＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊１１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊０２／Ａ＊１１ヘテロ接合体又はＨＬＡ－Ａ＊２４ホモ接合体を含む、請求項１３６に記載の方法。

【請求項138】

請求項１～１０６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造における使用。

【請求項139】

請求項１～１０６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞、及び任意選択に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項140】

ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状の治療における、請求項１～１０６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞及び／又は請求項１３９に記載の医薬組成物の使用。

【請求項141】

前記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む、請求項１４０に記載の使用。

【請求項142】

前記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む、請求項１４０又は１４１に記載の使用。

【請求項143】

前記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む、請求項１４２に記載の使用。

【請求項144】

前記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む、請求項１４３に記載の使用。

【請求項145】

請求項１～１０６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞及び／又は請求項１３９に記載の医薬組成物のＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状の治療用の医薬の製造における使用。

【請求項146】

前記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む、請求項１４５に記載の使用。

【請求項147】

前記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む、請求項１４５又は１４６に記載の使用。

【請求項148】

前記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む、請求項１４７に記載の使用。

【請求項149】

前記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む、請求項１４８に記載の使用。

【請求項150】

ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状を予防又は治療するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１～１０６の何れか１項に記載の免疫エフェクター細胞及び／又は請求項１３９に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【請求項151】

前記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む、請求項１５０に記載の方法。

【請求項152】

前記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む、請求項１５０又は１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む、請求項１５２の何れか１項に記載の方法。

【請求項154】

前記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む、請求項１５３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、生物医学の分野に関し、具体的にはＩＬ１３Ｒα２を標的としたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞及びその製造方法と使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＩＬ－１３Ｒα２は、悪性神経膠腫、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌などの様々なにおいて高度に発現している。このうち、神経膠腫は、神経膠細胞に由来する腫瘍を指し、最も一般的な原発性頭蓋内腫瘍である。過去３０年間、原発性悪性脳腫瘍の発生率は年々増加している。中枢神経系原発悪性腫瘍において、膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ、ＧＢＭ、ＷＨＯＩＶグレード）の発生率が最も高く、４６．１％を占める。神経膠腫では、ＩＬ－１３Ｒα２の発現は神経膠腫の悪性度と正の相関を呈し、高悪性度の神経膠腫ではＩＬ－１３Ｒα２の発現が高く、低悪性度又は正常な脳組織ではＩＬ－１３Ｒα２の発現が低いか又は発現しなく、かつＩＬ－１３Ｒα２の高発現は予後不良と関連する。神経膠腫では、高発現のＩＬ－１３Ｒα２は、神経膠腫細胞の増殖、遊走、浸潤を促進し、この効果はＳＲＣ／ＰＩ３Ｋ／ＡＴＫ／ｍＴＯＲ経路の活性化によって実現される。神経膠腫の治療は、手術による腫瘍切除を主とし、放射線療法、化学療法などの総合的な治療法を組み合わせる。神経膠腫の化学療法は、常に単剤と複数の薬物の併用の方案を用いる。しかしながら、現在の神経膠腫は全体として治療効果が乏しく、成人の高悪性度神経膠腫の１年と５年の生存率はそれぞれ３０％と１３％であり、退形成性神経膠腫とＧＢＭの生存期間中央値はそれぞれ２～３年と１年である。従って、神経膠腫の新たな治療法の確立が臨床上必要とされている。

【0003】

米国のＫａｔａｒｚｙｎａ Ｃ．Ｐｉｔｕｃｈ研究チームとベイラー医科大学は、共同でＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔを標的とする前臨床研究を展開し、その研究は、インビトロ腫瘍細胞モデル殺傷実験において、ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔは、ＩＬ－１３Ｒα２発現陽性の腫瘍細胞を特異的に殺傷することが発見され、同時に、研究チームは、ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔを投与された担腫瘍マウスの実験群の生存率が他の実験群より明らかに高いことを発見した。また、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｅ．Ｂｒｏｗｎのチームは、ＮＥＪＭ雑誌において、ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ治療を受けた症例を報告した。原発巣が右側頭葉に位置する再発性悪性神経膠腫の患者は、その後研究者の臨床研究に参加し、患者はＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ病巣腔注射を６回連続して受け、全治療は約７．５ヶ月続き、患者の病状が制御され、病巣の進行も再発もなく、治療期間全体において、患者は３グレード以上の有害反応が起こらず、脳脊髄液中の免疫細胞数とサイトカインレベルが顕著に増加し、ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔの良好な安全性および臨床治療への使用の見通しが示された。

【0004】

しかしながら、患者の自己由来T細胞は、体外での増幅が困難であり、又は機能が低下するため、製造されたCAR-T細胞産物の量が不十分であり、又は品質が低くなる。ユニバーサルＣＡＲ Ｔ細胞は健常ドナーから単離されたT細胞であり、製造されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、増幅効率が高く、活性が高いだけでなく、感染陽性率も向上しているが、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は移植物対宿主病（ＧＶＨＤ）及び免疫拒絶の問題も直面している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＴＣＲ欠損及びＨＬＡクラスＩ分子欠損のＴ細胞を産生し、同種異系細胞療法によって引き起こされる免疫拒絶反応を低減するために、最も一般的に使用されている遺伝子編集方法である。従来のＣＡＲ－Ｔ細胞製品と比較して、同種異系ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は製造コストを大幅に削減し、製造周期を短縮する。ユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、抗原の認識範囲を拡大するだけでなく、遺伝子ノックアウトを通じて免疫抑制微小環境を変化させ、悪性血液腫瘍や固形腫瘍の治療にも適用できる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、腫瘍細胞表面抗原を認識すると同時に、細胞によって発現されるＴＣＲ及びＨＬＡ－Ａ遺伝子をノックアウトすることで、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を向上させ、細胞の生存時間を延長し、同時に同種異系細胞療法によって引き起こされる免疫拒絶反応の多重効果を低減する、ＩＬ－１３Ｒα２を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を製造することである。

【0006】

一態様では、本出願は、免疫エフェクター細胞であって、上記免疫エフェクター細胞におけるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、免疫エフェクター細胞を提供する。

【0007】

幾つかの実施形態において、上記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は標的部分を含み、上記標的部分は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、上記ＶＨは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0008】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは配列番号１６又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0009】

幾つかの実施形態において、上記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＨを含む標的部分を含み、上記ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、上記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

幾つかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0011】

幾つかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0012】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む。

【0013】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、重鎖フレームワーク領域１（ＨＦＲ１）、重鎖フレームワーク領域２（ＨＦＲ２）、重鎖フレームワーク領域３（ＨＦＲ３）及び重鎖フレームワーク領域４（ＨＦＲ４）を含み、上記ＨＦＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0014】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ１は配列番号８又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0015】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ２は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0016】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ２は配列番号９又は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0017】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ３は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0018】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ３は配列番号１０又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0019】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ４は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0020】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ４は配列番号１１又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0021】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨはＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３及びＨＦＲ４を含み、且つ上記ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３及びＨＦＲ４は、
ｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ２、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ３、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ４、及び
ｉｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ１、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ２、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ３、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＨＦＲ４、から選ばれる。

【0022】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0023】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは配列番号１６又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0024】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つのＣＤＲを更に含み、上記ＶＬは配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0025】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは配列番号３４又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0026】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は、ＶＨの少なくとも１つのＣＤＲ及びＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含み、且つ上記ＶＨ及びＶＬは、
ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、及び
ｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、から選ばれる。

【0027】

幾つかの実施形態において、上記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＬを含む標的部分を含み、上記ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、上記ＬＣＤＲ１は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む。

【0028】

幾つかの実施形態において、上記ＬＣＤＲ２は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0029】

幾つかの実施形態において、上記ＬＣＤＲ３は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0030】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む。

【0031】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、軽鎖フレームワーク領域１（ＬＦＲ１）、軽鎖フレームワーク領域２（ＬＦＲ２）、軽鎖フレームワーク領域３（ＬＦＲ３）及び軽鎖フレームワーク領域４（ＬＦＲ４）を含み、上記ＬＦＲ１は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0032】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ１は配列番号２６又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0033】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ２は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0034】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ２は配列番号２７又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む。

【0035】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ３は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0036】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ３は配列番号２８又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0037】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ４は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0038】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ４は配列番号２９又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0039】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬはＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３及びＬＦＲ４を含み、且つ上記ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３及びＬＦＲ４は、
ｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ３、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ４、及び
ｉｉ）配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ１、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ２、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ３、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＬＦＲ４、から選ばれる。

【0040】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0041】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは配列番号３４又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0042】

幾つかの実施形態において、上記標的部分はＶＨ及びＶＬを含み、そのうち、上記ＶＨは配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＶＬは配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0043】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨ及びＶＬは、
ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、及び
ｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、から選ばれる。

【0044】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記標的部分は、全長抗体、Ｆａｂ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を含む。

【0045】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記標的部分はｓｃＦｖを含む。

【0046】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は、配列番号４１又は配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0047】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２又は配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0048】

幾つかの実施形態において、上記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は標的部分を含み、上記標的部分は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、上記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0049】

幾つかの実施形態において、上記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＨを含む標的部分を含み、上記ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、上記ＨＣＤＲ３は配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0050】

幾つかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ２は配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0051】

幾つかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ１は配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0052】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む。

【0053】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0054】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つのＣＤＲを更に含み、上記ＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0055】

幾つかの実施形態において、上記標的部分はＶＨの少なくとも１つのＣＤＲ及びＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含み、且つ上記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0056】

幾つかの実施形態において、上記のＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＬを含む標的部分を含み、上記ＶＬは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、上記ＬＣＤＲ１は配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0057】

幾つかの実施形態において、上記ＬＣＤＲ２は配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0058】

幾つかの実施形態において、上記ＬＣＤＲ３は配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む。

【0059】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２及び配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む。

【0060】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0061】

幾つかの実施形態において、上記標的部分はＶＨ及びＶＬを含み、そのうち、上記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＶＬは配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。

【0062】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記標的部分は、全長抗体、Ｆａｂ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を含む。

【0063】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記標的部分はｓｃＦｖを含む。

【0064】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は配列番号６１又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含む。

【0065】

幾つかの実施形態において、上記ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε（ＣＤ３ｅ）、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４及びＳＬＡＭからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む。

【0066】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記膜貫通ドメインはＣＤ８Ａに由来する膜貫通ドメインを含む。

【0067】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記膜貫通ドメインは配列番号６９～配列番号１１７の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む。

【0068】

幾つかの実施形態において、上記ＣＡＲは、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含み、上記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０及びＭｙＤ８８からなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0069】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインである。

【0070】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは配列番号１１８～配列番号１５０の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む。

【0071】

幾つかの実施形態において、上記ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃｅＲＩγ、ＦｃｅＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４Ｎｅｆ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２及び少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0072】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインを含む。

【0073】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１５１～配列番号１６１の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む。

【0074】

幾つかの実施形態において、上記ＣＡＲは、標的部分と膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を含み、上記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８Ａ、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０及びＬＩＧＨＴからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む。

【0075】

幾つかの実施形態において、上記ヒンジ領域はＣＤ８Ａに由来するヒンジ領域を含む。

【0076】

幾つかの実施形態において、上記ヒンジ領域は配列番号１６２～配列番号１８３の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む。

【0077】

幾つかの実施形態において、上記キメラ抗原受容体の非標的部分は、ＣＤ８Ａ分子膜貫通ドメイン、ＣＤ８Ａのヒンジ領域、４－１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0078】

幾つかの実施形態において、上記キメラ抗原受容体の非標的部分は配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0079】

幾つかの実施形態において、Ｃ末端が上記標的部分のＮ末端に連結するシグナルペプチド断片を更に含む。

【0080】

幾つかの実施形態において、上記シグナルペプチド断片はＣＤ８Ａシグナルペプチド断片を含む。

【0081】

幾つかの実施形態において、上記シグナルペプチド断片は配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0082】

幾つかの実施形態において、上記キメラ抗原受容体は、配列番号４５又は配列番号４６の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含む。

【0083】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞はヒト細胞を含む。

【0084】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単核細胞、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球及び／又は末梢血単核細胞を含む。

【0085】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は自己又は非自己の免疫エフェクター細胞を含む。

【0086】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は、修飾された免疫エフェクター細胞を含み、そのうち、上記修飾は、免疫拒絶に関連する１つ又は複数の遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされることを含む。

【0087】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫拒絶に関連する遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡからなる群より選ばれる１つ又は複数の遺伝子である。

【0088】

幾つかの実施形態において、上記修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾されていない対応する細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされる。

【0089】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は、上記修飾されていない対応する細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない。

【0090】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は、上記修飾されていない対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない。

【0091】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされる。

【0092】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない。

【0093】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない。

【0094】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記遺伝子の発現レベル及び／又は活性のダウンレギュレーションは、上記遺伝子をコードする核酸分子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーション、及び／又は、上記遺伝子によってコードされるタンパク質産物の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む。

【0095】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異及び／又は遺伝子サイレンシングを含む。

【0096】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫エフェクター細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む。

【0097】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子がノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む。

【0098】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子エクソンがノックアウトされると共に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソンがノックアウトされることを含む。

【0099】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムからなる群より選ばれる１つ又は複数の物質を上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0100】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0101】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、上記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを上記免疫エフェクター細胞に投与することを更に含む。

【0102】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とする上記ｓｇＲＮＡは、配列番号１８６～配列番号２００の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0103】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、上記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0104】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とする上記ｓｇＲＮＡは、配列番号２０１～配列番号２４１の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0105】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、Ｃａｓ酵素を上記細胞に投与することを更に含む。

【0106】

幾つかの実施形態において、そのうち、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９タンパク質を含む。

【0107】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記アンチセンスＲＮＡは配列番号２４２～配列番号２４５の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0108】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫エフェクター細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞である。

【0109】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ｂホモ接合体は、ＨＬＡ－Ｂ＊４０ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４６ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１３ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５８ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊３５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５５ホモ接合体を含む。

【0110】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫エフェクター細胞はＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体細胞である。

【0111】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊１１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊０２／Ａ＊１１ヘテロ接合体又はＨＬＡ－Ａ＊２４ホモ接合体を含む。

【0112】

別の態様において、本発明は、前述の免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、免疫エフェクター細胞に、前述のＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、又は前述のＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入する前／後に、上記免疫エフェクター細胞が修飾されることを含み、上記修飾は、免疫拒絶に関連する１つ又は複数の遺伝子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む、方法を提供する。

【0113】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ベクターは発現ベクターである。

【0114】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから選ばれる。

【0115】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫拒絶に関連する遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡからなる群より選ばれる１つ又は複数の遺伝子である。

【0116】

幾つかの実施形態において、上記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、上記免疫エフェクター細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされる。

【0117】

幾つかの実施形態において、上記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない。

【0118】

幾つかの実施形態において、上記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない。

【0119】

幾つかの実施形態において、対応する野生型細胞と比較して、上記免疫エフェクター細胞のＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされる。

【0120】

幾つかの実施形態において、対応する野生型細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない。

【0121】

幾つかの実施形態において、対応する野生型細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない。

【0122】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記遺伝子の発現レベル及び／又は活性のダウンレギュレーションは、上記遺伝子をコードする核酸分子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーション、及び／又は、上記遺伝子によってコードされるタンパク質産物の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む。

【0123】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異及び／又は遺伝子サイレンシングを含む。

【0124】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫エフェクター細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む。

【0125】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子がノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む。

【0126】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子エクソンがノックアウトされると共に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソンがノックアウトされることを含む。

【0127】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムからなる群より選ばれる１つ又は複数の物質を上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0128】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0129】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、上記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0130】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とする上記ｓｇＲＮＡは、配列番号１８６～配列番号２００の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0131】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、上記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0132】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とする上記ｓｇＲＮＡは、配列番号２０１～配列番号２４１の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0133】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、Ｃａｓ酵素を上記細胞に投与することを更に含む。

【0134】

幾つかの実施形態において、そのうち、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９タンパク質を含む。

【0135】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記アンチセンスＲＮＡは配列番号２４２～配列番号２４５の何れか１項に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0136】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫エフェクター細胞はヒト細胞を含む。

【0137】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単核細胞、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球及び／又は末梢血単核細胞を含む。

【0138】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は自己又は非自己の免疫エフェクター細胞を含む。

【0139】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞である。

【0140】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ｂホモ接合体は、ＨＬＡ－Ｂ＊４０ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４６ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１３ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５８ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊３５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５５ホモ接合体を含む。

【0141】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞はＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体細胞である。

【0142】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊１１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊０２／Ａ＊１１ヘテロ接合体又はＨＬＡ－Ａ＊２４ホモ接合体を含む。

【0143】

別の態様において、本出願は、前述の免疫エフェクター細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造における使用を更に提供する。

【0144】

別の態様において、本出願は、前述の免疫エフェクター細胞、及び任意選択に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を更に提供する。

【0145】

別の態様において、本出願は、ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状の治療における、前述の免疫エフェクター細胞及び／又は前述の医薬組成物の使用を更に提供する。

【0146】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む。

【0147】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む。

【0148】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む。

【0149】

幾つかの実施態様において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む。

【0150】

別の態様において、本出願は、前述の免疫エフェクター細胞及び／又は前述の医薬組成物のＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状の治療用の医薬の製造における使用を更に提供する。

【0151】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む。

【0152】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む。

【0153】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む。

【0154】

幾つかの実施態様において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む。

【0155】

別の態様において、本出願は、それを必要とする対象に有効量の前述の免疫エフェクター細胞及び／又は前述の医薬組成物を投与することを含む、ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状を予防又は治療するための方法を更に提供する。

【0156】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む。

【0157】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む。

【0158】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む。

【0159】

幾つかの実施態様において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む。

【0160】

当業者は、以下の詳細な説明から本出願の他の態様及び利点を容易に洞察することができる。以下の詳細な説明には、本出願の例示的な実施形態のみが示され、説明される。当業者に明らかなように、本出願の内容により、当業者は、本出願にかかる発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態を変更することができる。対応的には、本出願の図面及び明細書における説明は、限定的なものではなく、単に例示的なものである。

【図面の簡単な説明】

【0161】

本願にかかる発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。以下に詳細に説明する例示的な実施形態及び図面を参照することで、本出願にかかる発明の特徴及び利点をよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は以下の通りである。

【図1】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲの概略構造図を示す。

【図2】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞の構築戦略を示す。

【図3A-3C】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（マウス由来）の表現型検出結果を示す。

【図4】本出願に記載の標的細胞に対するａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（マウス由来）の殺傷結果を示す。

【図5A-5C】本出願に記載のＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（マウス由来）と標的細胞の共培養によるサイトカイン分泌の検出結果を示す。

【図6】本出願に記載の本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（マウス由来）の体内抗腫瘍効果を示す。

【図7】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ半減期検出結果を示す。

【図8】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロＧＶＨＤの結果を示す。

【図9】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ拒絶反応の結果を示す。

【図10A-10D】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボＧＶＨＤの結果を示す。

【図11-12】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ拒絶反応の結果を示す。

【図13】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のオフターゲット分析を示す。

【図14】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞の染色体転座分析を示す。

【図15】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞の核型分析を示す。

【図16】本出願に記載のａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞のＣａｓ９残基分析を示す。

【図17】本出願におけるＳｇ９ＲＮＡ編集後のＴＲＡＣ遺伝子のＳａｎｇｅｒシークエンシングの結果を示す。

【図18】本出願におけるＳｇ９ＲＮＡ編集後のＴＲＡＣ遺伝子のＴＡクローン検出の結果を示す。

【図19】本出願におけるＳｇ９ＲＮＡ編集後のＴＲＡＣ遺伝子のフローサイトメトリー検出の結果を示す。

【図20】本出願におけるＳｇ２ＲＮＡ編集後のＨＬＡ－Ａ０２遺伝子のＳａｎｇｅｒシークエンシングの結果を示す。

【図21】本出願におけるＳｇ５ＲＮＡ編集後のＨＬＡ－Ａ０２遺伝子のＳａｎｇｅｒシークエンシングの結果を示す。

【図22】本出願におけるＳｇ２１ＲＮＡ編集後のＨＬＡ－Ａ１１遺伝子のＳａｎｇｅｒシークエンシングの結果を示す。

【図23】本出願におけるＲｓｇ２ＲＮＡ編集後のＨＬＡ－Ａ１１遺伝子のＳａｎｇｅｒシークエンシングの結果を示す。

【図24A-24B】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞におけるＨＬＡ－Ａ０２及びＴＲＡＣの同時ノックアウトの結果を示す。

【図25A-25B】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞におけるＨＬＡ－Ａ０２及びＴＲＡＣのタンパク質レベルを示す。

【図26】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞におけるＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのｍＲＮＡレベルを示す。

【図27A-27B】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞におけるＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのタンパク質レベルを示す。

【図28A-28D】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞におけるＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのタンパク質レベルを示す。

【図29A-29B】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞におけるＴＲＡＣ及びＨＬＡ－Ａ ｍＲＮＡレベルのノックアウト状況を示す。

【図30A-30B】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞におけるＣＤ６９及びＣＤ１３７のタンパク質レベルを示す。

【図31】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞とＮＫ細胞の共培養の状況を示す。

【図32】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞によるＩＦＮ－γの発現レベルを示す。

【図33A-33D】本願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞におけるＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのタンパク質レベルを示す。

【図34】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞のＣＡＲに対する感染効率を示す。

【図35】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞の増幅倍率を示す。

【図36】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞のＣＤ１９陽性標的細胞に対する殺傷効果を示す。

【図37】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞を投与する投与計画を示す。

【図38】本出願にかかる修飾された免疫エフェクター細胞のマウス体内腫瘍に対する殺傷効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0162】

以下、特定の具体的な実施例により、本出願の発明の実施形態を説明し、当業者は、本明細書に開示された内容から本出願の発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。

【0163】

用語の定義
本出願において、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は通常、一連のポリペプチドを指し、最も簡単な実施形態において通常２種類があり、免疫エフェクター細胞にある場合、標的細胞（通常は癌細胞である）に対する細胞の特異性を提供し、細胞内シグナルを生成する。幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ又はその一部）、膜貫通ドメイン、並びに以下に定義する刺激分子及び／又は共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書において、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む。幾つかの実施形態において、当該一連のポリペプチドは同じポリペプチド鎖にある（例えば、キメラ融合タンパク質を含む）。幾つかの実施形態において、当該一連のポリペプチドは互いに連続せず、例えば異なるポリペプチド鎖にある。幾つかの態様において、当該一連のポリペプチドは二量体化スイッチを含み、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いに結合させることができ、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させることができる。一態様において、ＣＡＲの刺激分子はＴ細胞受容体複合体に関連するζ鎖である。一態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ζの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義する少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ又は複数の機能性シグナル伝達ドメインを更に含む。一態様において、共刺激分子は、４－１ＢＢ（即ち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ及び／又はＣＤ２８から選ばれてもよい。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよいキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよいキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに１つ又は複数の共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよいキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに１つ又は複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよいキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）における任意選択のリーダー配列を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端におけるリーダー配列を更に含み、そのうち、リーダー配列は任意選択に細胞加工プロセスにおいて抗原認識ドメイン（例えばＶＨＨ）から除去され、且つＣＡＲを細胞膜に局在化させる。

【0164】

本出願において、「インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒα２）」という用語（ＣＤ２１３Ａ２、２１３Ａ２分化クラスタとも呼ばれる）は、通常及び常規の意味を有し、例えば、ヒトにおいてＩＬ－１３ＲＡ２遺伝子によってコードされる膜結合タンパク質を含み得るが、これらに限定されない。ＩＬ－１３Ｒα２は、インターロイキン－１３受容体複合体のサブユニットであるＩＬ－１３Ｒα１と密接に関連している。ＩＬ－１３Ｒα２は通常、高い親和性でＩＬ－１３に結合するが、任意の明らかな細胞質ドメインを欠いており、シグナルメディエーターとして作用しないようである。しかしながら、それが後者に直接結合できないが、ＩＬ－１３とＩＬ－４の両方の効果を調節することができる。また、ＩＬ－１３の内在化にも関与していることが報告されている。

【0165】

本出願において、「抗体」という用語は通常、最も広い意味で使用され、所望の生物活性を示す限り、具体的にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を包含する（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１７０：４８５４－４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ抗体、又は他の種に由来するものであってもよい。

【0166】

全長抗体は、典型的には２つの「全長抗体重鎖」及び２つの「全長抗体軽鎖」からなる抗体を指す。「全長抗体重鎖」は通常、Ｎ末端からＣ末端への方向に抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなり、ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略称されるポリペプチドであり、ＩｇＥサブクラス抗体の場合、任意選択に抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を更に含む。幾つかの実施形態において、「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端への方向にＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３からなるポリペプチドである。「全長抗体軽鎖」は通常、Ｎ末端からＣ末端への方向に抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ－ＣＬと略称される。上記抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（ｋａｐｐａ）又はλ（ｌａｍｂｄａ）であってもよい。２つの全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間のポリペプチド間ジスルフィド結合、及び全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合によって連結される。典型的な全長抗体の実例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥなどの天然抗体である。

【0167】

本出願において、「抗原結合断片」（本明細書において「標的部分」又は「抗原結合部分」とも呼ばれる）という用語は通常、抗体と抗原との間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。抗体によって特異的に認識され、結合される抗原の部分は、上記のように「エピトープ」と呼ばれる。抗原結合ドメインは、典型的に抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでもよいが、必ずしも両方を含む必要とは限らない。Ｆｄ断片は、例えば２つのＶＨ領域を有し、通常、完全な抗原結合ドメインの抗原結合機能の一部を保持する。抗体の抗原結合断片の実例は、以下のものを含む：（１）Ｆａｂ断片であって、ＶＬ、ＶＨ、定常軽鎖（ＣＬ）及びＣＨ１ドメインを有する一価断片、（２）Ｆ（ａｂ’）_２断片であって、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を有する二価断片、（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、（４）抗体単一アームを有するＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、「Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、」Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６（１９８９）、その全体が参照により本出願に組み込まれる）、（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、（７）例えばｓｃＦｖ－ライブラリーに由来する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であって、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、独立した遺伝子によってコードされるが、組換え方法を使用してリンカーの合成によって接合することができ、リンカーの合成によりＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖として製造され（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる）（例えばＨｕｓｔｏｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ Ａｎｔｉ－Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３（１９８８）を参照することができる）、並びに（８）ＶＨＨであって、「ＶＨＨ」はラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカなど）重鎖抗体に由来する可変抗原結合ドメインに関する（Ｎｇｕｙｅｎ Ｖ．Ｋ．ら、２０００、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９、９２１－９３０；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、２００１、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４、２７７－３０２及びレビュー論文であるＶａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ Ｐ．ら、２０１１、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ９２、３８９－４０７を参照）。ＶＨＨは、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（Ｎｂ）及び／又は単一ドメイン抗体とも呼ばれ得る。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、且つ完全抗体と同じ方式で上記断片の機能を評価する。ＩＬ１３Ｒα２を標的とする抗原結合断片はまた、国際特許出願公開ＷＯ２０１４０７２８８８Ａ１およびＷＯ２０２１０４１７２５Ａ１に記載されており、その中のそれぞれは、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。

【0168】

本出願において、「単一ドメイン抗体」又は「VHH」という用語は通常、抗体軽鎖を欠失するが、重鎖可変領域のみを有する抗体のクラスを指す。幾つかの場合において、単一ドメイン抗体は、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ラマ、コモリザメ、ホシザメ又はエイに由来することができる（例えば、バイオテクノロジー学術誌、２０１８、３４（１２）：１９７４－１９８４を参照）。例えば、単一ドメイン抗体はアルパカに由来することができる。単一ドメイン抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）で構成することができる。「重鎖可変領域」という用語は通常、抗原結合断片の重鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高可変領域に更に区別されてもよく、それらはフレームワーク領域（ＦＲ）となるより保存的領域に散在する。各重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ領域で構成され、それらは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順に配列されてもよい。重鎖可変領域は、抗原が相互作用する結合ドメインを含む。

【0169】

本出願において、「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、その通常及び常規の意味を有し、例えば、短いリンカーペプチドで互いに連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）可変領域及び軽鎖（ＶＬ）可変領域を含む融合タンパク質を含み得るが、これらに限定されない。限定されるものではないが、リンカーはグリシン（柔軟性のため）及び親水性アミノ酸（例えば、セリン又はトレオニン）（溶解性のため）を含み得る。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結してもよいし、ＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に連結してもよい。幾つかの代替形態において、ＣＡＲ上に存在するリガンド結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。本出願のＣＡＲは、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ構成に構築することができ、リンカー、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又は伝導ドメインに変異を持ち、当該ＣＡＲは依然としてその効果を維持する。幾つかの実施形態において、ＣＡＲ上に存在するｓｃＦｖドメインは、腫瘍細胞上に存在するＩＬ－１３α２受容体（ＩＬ１３Ｒα２）に対して特異的である。

【0170】

本出願のＣＡＲは、分子の適切な間隔及び立体配座のために個々のドメイン間に付加されるリンカー残基、例えば、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を維持するように、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結し、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供するアミノ酸配列を含むリンカーを含み得る。本出願のＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以上のリンカーを含み得る。特定の実施形態において、リンカーは、約１～約２５アミノ酸長、約５～約２０アミノ酸長、又は約１０～約２０アミノ酸長、又は任意の介在長さのアミノ酸長である。リンカーの例示的な実例は、グリシンポリマー、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、ウィットロー（Ｗｈｉｔｌｏｗ）リンカーなどの当分野で公知の他の柔軟なリンカーを含む。グリシン及びグリシン－セリンポリマーは比較的非構造化であり、従って、融合タンパク質のドメイン（例えば、本出願のＣＡＲ）間の中性テザーとして作用することができる。

【0171】

本出願において、「相補性決定領域」（ＣＡＲ）という用語は通常、抗原結合断片の可変領域内の相補性決定領域を指す。本出願において、上記重鎖可変領域には、可変領域毎にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と命名される３つのＣＤＲｓが存在する。これらのＣＤＲｓの正確な境界は、異なるシステムに応じて異なるように定義されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）と（１９９１））により記載されるシステムは、抗原結合断片の任意の可変領域に適用できる明確な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲｓを限定する正確な残基境界を更に提供する。これらのＣＤＲｓは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲｓと呼ばれ得る。Ｃｈｏｔｈｉａと同僚（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３（１９８９））は、アミノ酸配列レベルでの大きな多様性にもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤＲｓ内の特定のサブ部分は、ほぼ同一のペプチド主鎖立体配座を採用することが発見された。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と命名され、そのうち、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域及び重鎖領域を指す。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲｓと重複する境界を有するＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲｓと呼ばれ得る。Ｋａｂａｔ ＣＤＲｓと重複するＣＤＲｓを限定する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢＪ．９：１３３－１３９（１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２６２（５）：７３２－４５（１９９６））により記載されている。また、他のＣＤＲ境界の定義は、上記システムの１つに厳密に従っていない可能性があり、特定の残基若しくは残基のセット、又はひいてはＣＤＲｓ全体が抗原結合に顕著な影響を及ぼさないという予測又は実験結果に従って、それらが短縮又は延長されられるが、依然としてＫａｂａｔ ＣＤＲｓと重複する。本出願において、ＩＭＧＴ番号付けシステムが使用される。

【0172】

本出願において、「ＦＲ」という用語は通常、フレームワーク領域と呼ばれる、抗体可変ドメインのより高度な保存的部分を指す。例えば、天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域、即ちＶＨにおける４つ（Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３及びＨ－ＦＲ４）、及びＶＬにおける４つ（Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３及びＬ－ＦＲ４）を含んでもよい。「フレームワーク領域」は通常、分岐性のより高い（即ち超可変）ＣＤＲの間に存在する、当分野で認識される抗体可変領域の部分を指す。そのようなフレームワーク領域は、典型的にフレームワーク１～４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と呼ばれ、且つ３次元空間において６つのＣＤＲ（重鎖から３つ、且つ軽鎖から３つ）を提示するための骨格を提供することにより、抗原結合表面を形成する。

【0173】

本出願において、「相同性」という用語は通常、配列「同一性」と同等であってもよい。相同配列は、対象配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％同一であることができるアミノ酸配列を含んでもよい。通常、相同体は、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は、類似性（即ち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）によって考慮されてもよいが、配列同一性の観点から相同性を発現してもよい。本出願において、言及されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の配列番号のうちの何れか１項に対するパーセント同一性を有する配列とは、言及された配列番号の全長にわたって、上記パーセント同一性を有する配列を指す。

【0174】

配列同一性を決定するために、配列アラインメントを行うことができ、それは、当業者に知られている様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを用いて行うことができる。当業者は、比較される全長配列において最適なアラインメントを達成するために必要とする任意のアルゴリズムを含む、アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。

【0175】

本出願において、「ＫＤ」という用語は、「ＫＤ」と互換的に使用されてもよく、通常、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数をＭ（ｍｏｌ／Ｌ）の単位で指す。ＫＤは、物質ＡＢと、その解離によって得られた物質Ａ及び物質Ｂの濃度から、ＫＤ＝ｃ（Ａ）＊ｃ（Ｂ）／ｃ（ＡＢ）として計算することができる。この式から、ＫＤ値が大きいほど、解離が多く、物質Ａ、Ｂ間の親和性が弱いことを示し、逆にＫＤ値が小さいほど、解離が少なく、物質Ａ、Ｂ間の親和性が強いことを示す。

【0176】

本出願において、「単離された核酸分子」という用語は通常、天然環境から単離されるか、又は人工的に合成される、任意の長さの単離形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチド、或いはそれらの類似体を指す。

【0177】

本出願において、「ベクター」という用語は通常、挿入される核酸分子を宿主細胞内及び／又は宿主細胞間に転移させる、適切な宿主において自己複製できる核酸分子を指す。上記ベクターは、主にＤＮＡ又はＲＮＡを細胞内に挿入するためのベクター、主にＤＮＡ又はＲＮＡを複製するためのベクター、及び主にＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳を発現するためのベクターを含んでもよい。上記ベクターは、複数種の上記機能を有するベクターを更に含んでもよい。上記ベクターは、適切な宿主細胞に導入された場合に、ポリペプチドに転写と翻訳できるポリヌクレオチドであってもよい。一般的に、上記ベクターを含む適切な宿主細胞を培養することにより、上記ベクターは所望の発現産物を産生することができる。

【0178】

本出願において、「ウイルスベクター」という用語は、核酸分子（例えば、転移プラスミド）又は核酸転移を介在するウイルス粒子を指すために広く使用され、核酸分子は、核酸分子の転移又は細胞ゲノムへの組み込みを通常促進するウイルス由来の核酸要素を含む。ウイルス粒子は通常、様々なウイルス成分を含み、核酸以外の宿主細胞成分を更に含む場合もある。ウイルスベクターは、核酸を細胞内に転移することができるウイルス若しくはウイルス粒子、又は転移される核酸自体を指してもよい。

【0179】

本出願において、「レンチウイルス」という用語は通常、複雑なレトロウイルスの群（又は属）を指す。例示的レンチウイルスは、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含むヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ－マエディウイルス（ｖｉｓｎａ－ｍａｅｄｉｖｉｒｕｓ、ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶに基づくベクター骨格（即ち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。特別な実施形態において、レンチウイルスは、ＣＡＲを含むポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。

【0180】

本出願において、「宿主細胞」若しくは「細胞」という用語は通常、本出願に記載の単離された核酸分子を含むベクターを含んでもよいか又は既に含んだ、或いは、本出願に記載の単離された抗原結合断片を発現することができる個体細胞、細胞株又は細胞培養物を指す。上記宿主細胞は、単一の宿主細胞の娘細胞を含んでもよい。天然、予想外又は意図的な変異により、娘細胞は、元の親細胞と形態又はゲノムにおいて必ずしも完全に同じであるとは限らないが、本出願に記載の単離された抗原結合断片を発現することができればよい。上記宿主細胞は、本出願に記載のベクターを利用してインビトロで細胞をトランスフェクトすることにより得ることができる。上記宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌）であってもよく、真核細胞（例えば酵母細胞、例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳ０細胞又は骨髄腫細胞）であってもよい。例えば、上記宿主細胞は大腸菌細胞であってもよい。例えば、上記宿主細胞は酵母細胞であってもよい。例えば、上記宿主細胞は哺乳動物細胞であってもよい。例えば、上記哺乳動物細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞であってもよい。

【0181】

本出願において、「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」という用語は、任意のＴ細胞、例えば培養T細胞、例えば初代Ｔ細胞、又はＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴＩ等のような培養Ｔ細胞株由来のT細胞、或いは哺乳動物（好ましくはサル、イヌ又はヒトを含む種の霊長類）から得られるＴ細胞であってもよい。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは流体を含むがこれらに限定されない、様々な供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、濃縮されてもよく、又は、精製されてもよい。Ｔ細胞は、インビトロ又はインビボで造血幹細胞をＴ細胞に成熟させることによって得ることができる。例示的な態様において、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。例示的な態様において、Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞を含む任意の種類のT細胞であってよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞などのＣＤＡ＋ヘルパーT細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、記憶Ｔ細胞、未処理Ｔ細胞などを含むが、これらに限定されない、任意の発生段階のものであってもよい。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞である。幾つかの代替形態において、Ｔ細胞は、受容細胞又は受容すべき細胞（例えば、治療組成物の形態にある上記細胞）を有する受容対象と同種異系（同じ種からの異なるドナー）であり、幾つかの代替形態において、Ｔ細胞は自己由来であり（ドナー及びレシピエントは同じであり）、幾つかの代替形態において、Ｔ細胞は、同質遺伝子型（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）である（ドナー及びレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）。

【0182】

本出願において、「免疫エフェクター細胞」という用語は通常、免疫応答に関与し、エフェクター機能を果たす免疫細胞を指す。例えば、エフェクター機能を果たすことは、異物抗原の除去又は免疫エフェクター応答の促進などを含んでもよい。免疫エフェクター細胞は、形質細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マスト細胞及び骨髄由来食細胞を含んでもよい。

【0183】

本出願の免疫エフェクター細胞は、自己／自体的（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ／ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）（「独自的」）又は非自己的（「非独自的」、例えば同種異系、同質遺伝子型又は異種遺伝子型）であってもよい。本出願において、「自己的」という用語は通常、同じ対象からの細胞を指す。「同種異系」は通常、それと比較して同じ種であるが遺伝的に異なる細胞を指す。「同質遺伝子型」は通常、比較される細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。「異種遺伝子型」は通常、比較される細胞と異なる種の細胞を指す。幾つかの実施形態において、本出願の細胞は、自己的又は同種異系である。

【0184】

本出願において、「修飾」という用語は通常、細胞の状態若しくは構造を変えること、及び／又は、細胞の状態若しくは構造の改変を指す。上記改変は通常、上記修飾されていない対応する細胞の状態若しくは構造と比較して、上記改変が内因性遺伝子発現レベル又は機能の変化、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム遺伝子編集などを含んでもよい遺伝子工学的手段による細胞の内因性遺伝子発現レベルのダウンレギュレーション、アップレギュレーション又は非発現を含んでもよく、上記改変は、細胞タンパク質発現、構造又は機能の変化、例えば、上記内因性遺伝子発現レベル又は機能の変化によって達成される対応するタンパク質発現の変化、構造又は機能の変化、例えば、タンパク質翻訳、翻訳後修飾の調節によって達成されるタンパク質発現の変化、構造又は機能の変化を更に含んでもよく、上記改変は、外来遺伝子の導入、外来タンパク質の発現などを含んでもよい。

【0185】

本出願において、「ＴＲＡＣ」という用語は通常、Ｔ細胞受容体α鎖定常領域（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｏｎ－ｓｔａｎｔ）を指す。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は通常、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合する抗原を認識することができる、T細胞の表面に位置する特異的受容体を指す。ＴＣＲは通常、２つの異なるタンパク質鎖（即ち、ヘテロ二量体）からなる。ヒトにおいて、多くのＴ細胞におけるＴＣＲは、１本のα鎖と１本のβ鎖（それぞれＴＲＡ及びＴＲＢによってコードされる）からなり、かかるＴ細胞はαβ Ｔ細胞と呼ばれ、少数のＴ細胞におけるＴＣＲはγ鎖とδ鎖（それぞれＴＲＧ及びＴＲＤによってコードされる）からなり、かかるＴ細胞はγδ Ｔ細胞と呼ばれる。一般的には、αβ Ｔ細胞はＴ細胞の総数の約９５％を占め、γδ Ｔ細胞はＴ細胞の総数の約５％を占め、当該比率は個体の発生過程及び疾患状態（例えば、白血病）で変化し、種によっても異なっている。ＴＣＲを構成する各鎖は何れも、可変領域及び定常領域を有し、ヒトにおいて、α鎖をコードする遺伝子（ＴＲＡ、例えばＨＧＮＣ：１２０２７に示される情報）は１４番染色体に位置し、可変セグメント（Ｖ）、連結セグメント（Ｊ）及び定常領域（Ｃ）を含む多遺伝子断片から構成され、ＴＲＡＣ遺伝子は通常、１４番染色体（１４ｑ１１．２、１４：２２、５４７、５０５－２２、５５２、１３１）に位置する、Ｔ細胞受容体のα鎖定常領域（Ｃ）をコードする遺伝子配列（例えば、ＨＧＮＣ：１２０２９に示される情報）を指す。通常、Ｎセグメントの抗原認識ドメインをコードする可変セグメント（Ｖ）遺伝子の１つが、連結セグメント（Ｊ）のうちの１つと再配列されて機能的Ｖ領域エクソンを生成し、当該エクソンが転写され、且つ定常領域（Ｃ）にスプライシングによって連結され、これによりＴ細胞受容体α鎖コード配列を形成する。

【0186】

本出願において、「主要組織適合性複合体抗原」（「ＭＨＣ」、ヒトの場合では、「ヒト白血球抗原」（「ＨＬＡ」）とも呼ばれる）という用語は通常、細胞表面に発現された、細胞に独自の抗原性を付与するタンパク質を指す。ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって、免疫エフェクター細胞と同じの造血幹細胞の供給源（「自己」）に由来するものとして認識されるか、又は別の造血再構築細胞の供給源（「非自己」）に由来するものとして認識される標的分子である。ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩというＨＬＡ抗原の２つの主要なクラスが認識される。ＨＬＡクラスＩ抗原（ヒトにおけるＡ、Ｂ、Ｃ）は、各細胞を「自己」として認識できるが、ＨＬＡクラスＩＩ抗原（ヒトにおけるＤＲ、ＤＰ及びＤＱ）は、リンパ球と抗原提示細胞との反応に関与する。両者とも移植臓器の拒絶に関与している。ＨＬＡ遺伝子系の重要な態様は、その多型である。ＭＨＣクラスＩ（Ａ、ＢとＣ）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＱとＤＲ）の各遺伝子は、異なる対立遺伝子を有する。ＨＬＡ対立遺伝子は、数字及び下付き文字によって表される。例えば、２つの非相関な個体はそれぞれ、ＨＬＡ－ＢクラスＩ遺伝子Ｂ５及びＢｗ４１を保有する可能性がある。対立遺伝子産物は、α及び／又はβドメインの１つ又は複数のアミノ酸において異なる。大量の特異的抗体又は核酸試薬は、クラスＩ及びクラスＩＩ分子を発現する白血球を用いて個体のＨＬＡハプロタイプ型を決定するために使用される。通常ＨＬＡ型決定に使用される遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの６つのタンパク質、即ちＨＬＡ－Ａであり、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－ＤＲは、それぞれ２つの対立遺伝子を有する。ＨＬＡ遺伝子は、染色体６ｐ２１位に存在する「スーパー遺伝子座」にクラスター化され、上記「スーパー遺伝子座」は、免疫系及び幾つかの他の基本的な分子と細胞プロセスの調節において重要な役割を有する６つの古典的な移植ＨＬＡ遺伝子と少なくとも１３２個のタンパク質コード遺伝子をコードする。完全な遺伝子座の大まかな測定は、３．６Ｍｂであり、少なくとも２２４個の遺伝子座を有する。このクラスター化の効果は「ハプロタイプ」であり、即ち、単一の染色体上に存在し、１つの親から受け継がれ、セットとして受け継がれる傾向にある。各親から受け継がれた対立遺伝子のセットはハプロタイプを形成し、そのうち、一部の対立遺伝子は互いに結合する傾向にある。一部の対立遺伝子及びハプロタイプが他の対立遺伝子及びハプロタイプよりも一般的であり、そして、それらが異なる種及び民族において異なる頻度で分布するため、患者のハプロタイプを同定することは、マッチドナーが見つかる確率を予測することを助けると共に、検索戦略を策定することを助けることもできる。

【0187】

本出願において、「ＨＬＡ－Ａ」は通常、ヒト染色体６ｐ２１．３に位置するＨＬＡ－Ａ遺伝子（例えば、ＨＧＮＣ：４９３１に示される情報）によってコードされる、ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）ポリペプチド鎖のクラスを指す。ＨＬＡ－Ａは、ヒト細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子を構成する３つの主要なポリペプチドタイプの１つであり、他にはＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃも含まれる。ＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされるα鎖及びＢ２Ｍ遺伝子によってコードされるβ鎖（β２－ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体は、ＨＬＡ－ＡクラスＭＨＣ Ｉ分子である。上記のＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされるα鎖は、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含んでもよく、そのうち、α１ドメイン、α２ドメインはペプチドセグメントに結合することができるため、ＭＨＣ Ｉ分子（例えばＨＬＡ－Ａクラス）によって上記ペプチドセグメントが免疫系細胞に提示される。ヒトにおいて、ほとんどの哺乳動物と類似するように、ＭＨＣ Ｉ分子のα鎖は多型であり、一次構造が多くの変化があり、２０１３年１２月までに、１７４０個の活性タンパク質及び１１７個の不活性タンパク質をコードする、合計２４３２個のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子が知られている。本出願において、ＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース３．３８．０バージョン（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）に格納され、ＷＨＯ ＨＬＡ因子命名委員会によって命名された異なるＨＬＡ－Ａ対立遺伝子の配列情報を含んでもよい。

【0188】

本出願において、「ＨＬＡ－Ｂ」という用語は通常、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体の遺伝子ファミリーの一部を指す。ＨＬＡは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のヒトバージョンであり、ＭＨＣは、多くの種に存在する遺伝子ファミリーである。この複雑な遺伝子は、クラスＩ、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩという３つの基本的な群に分類される。ヒトにおいて、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子及びＨＬＡ－ＡとＨＬＡ－Ｃという関連する２つの遺伝子はＭＨＣクラスＩの主要な遺伝子である。ＨＬＡ－Ｂ遺伝子は、６番染色体の短い（ｐ）アームの細胞帯２１．３の、塩基対３１，３５３，８７１から３１，３５７，２１１までに位置する。ＨＬＡ－Ｂは、ドナーとレシピエントとの間でマッチすべき３つの主要なＨＬＡの１つである。これらは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ（両方ともＭＨＣクラスＩ）及びＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）である。この２つの組織には、この３つのＨＬＡをコードする同じ遺伝子がある場合、拒絶の可能性及び重症度は最小限となる。ＨＬＡ－Ｂは数百のバージョン（対立遺伝子）が知られており、各バージョンは特定の番号（例えば、ＨＬＡ－Ｂ２７）を有する。密接に関連した対立遺伝子は一緒に分類されており、例えば、少なくとも２８個の非常に類似した対立遺伝子がＨＬＡ－Ｂ２７のアイソフォームである。これらのアイソフォームは、ＨＬＡ－Ｂ＊２７０１～ＨＬＡ－Ｂ＊２７２８と指定される。

【0189】

本出願において、「ＨＬＡがマッチする」という用語は、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ抗原にマッチしないドナー－レシピエント対がないことを指し、上記ドナーは、例えば造血幹細胞移植療法を必要とするレシピエントに造血幹細胞移植物を提供するドナーである。ＨＬＡがマッチした（即ち、そのうちの６つの対立遺伝子の全てがマッチした）ドナー－レシピエント対は、移植物を拒絶するリスクが低減し、その理由は、内因性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が、侵入した移植物を外来として認識する可能性が低く、且つ、そのため移植物に対する免疫応答を生じる可能性が低いである。

【0190】

本出願において、「ＨＬＡがマッチしない」という用語は、ドナーとレシピエントとの間の少なくとも１つのＨＬＡ抗原（特に、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－ＤＲの場合）がマッチしないドナー－レシピエント対であることを指し、上記ドナーは、例えば造血幹細胞移植療法を必要とするレシピエントに造血幹細胞移植物を提供するドナーである。幾つかの実施形態において、一方のハプロタイプはマッチし、他方はマッチしない。ＨＬＡがマッチしないドナー－レシピエント対はＨＬＡがマッチしたドナー－レシピエント対と比較して、ＨＬＡがマッチしないドナー－レシピエント対の場合、内因性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が、侵入した移植物を外来として認識する可能性が高く、そして、そのようなＴ細胞及びＮＫ細胞が移植物に対する免疫応答を生じる可能性が高いため、移植物を拒絶するリスクが増加する可能性がある。

【0191】

本出願において、「Ｂ２Ｍ」という用語は通常、ＭＨＣクラスＩ分子の構成要素の１つであるβ２ミクログロブリン（β２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を指す。β２ミクログロブリン（β鎖とも呼ばれる）は、ＨＬＡによってコードされたα鎖と共にＭＨＣクラスＩ分子を構成することができる。Ｂ２Ｍは通常、全ての有核細胞において発現される。ヒトにおいて、β２ミクログロブリンは、１５ｑ２１．１に位置するＢ２Ｍ遺伝子（例えば、ＨＧＮＣ：９１４に示される情報）によってコードされる。

【0192】

本出願において、「ＣＩＩＴＡ」という用語は通常、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）のトランス活性化因子を指す。上記トランス活性化因子は、酸性転写活性化ドメイン、４つのＬＲＲ（ロイシンに富化した反復配列）及びＧＴＰ結合ドメインを有するタンパク質であってもよい。上記タンパク質は、細胞核内に位置し、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）遺伝子転写のための正の調節因子として、これらの遺伝子を発現する「主制御因子」と呼ばれる。当該タンパク質はまた、ＧＴＰに結合すると共に、ＧＴＰへの結合を利用してそれ自体を細胞核に輸送することができ、細胞核において、通常、コアクチベーターのような方法でアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴ）活性によって作用する。ヒトにおいて、上記タンパク質は、１６ｐ１３．１３に位置する遺伝子（例えば、ＨＧＮＣ：７０６７に示される情報）によってコードされ、異なるアイソフォームをコードする幾つかの転写産物変異体を産生することができる。

【0193】

本出願において、「野生型細胞」という用語は通常、自然に存在するか又は自然に由来する細胞を指す。

【0194】

本出願において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は通常、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びその単鎖形態又は二本鎖形態のポリマーを指す。特に限定されない限り、当該用語は、天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸を含んでもよく、上記核酸は、参照核酸（例えば、配列情報を示すもの）と類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似する方式で代謝される。特に明記しない限り、核酸の配列は、その保存的に修飾された変異体、例えば、縮重コドン置換、対立遺伝子、直接相同体、ＳＮＰと相補配列、及び明示的に示された配列を含んでもよい。

【0195】

本出願において、「発現」という用語は通常、特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。

【0196】

本出願において、「遺伝子変異」という用語は通常、遺伝子の構造上で生じる塩基対の構成又は配列順序の変化を指す。例えば、単一塩基の変化による点変異、又は複数の塩基の欠失、重複及び挿入などである。

【0197】

本出願において、「遺伝子サイレンシング」という用語は通常、調節メカニズムによる特定の遺伝子の発現を抑制することを指す。主に、ＤＮＡメチル化、ヘテロクロマチン化及び位置効果などの要因によって引き起こされる転写レベルでの遺伝子サイレンシング（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ、ＴＧＳ）、及び遺伝子転写後レベルでの標的ＲＮＡへの特異的介入による遺伝子発現に影響を与える転写後遺伝子サイレンシング（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ、ＰＴＧＳ）の２つを含んでもよい。通常の場合、遺伝子がサイレンシングされると、対応する遺伝子発現は、ダウンレギュレーション／減少される。一方、遺伝子がノックアウトされる場合、通常発現しないようになり、例えば細胞において、ある特定の遺伝子の対立遺伝子が全てノックアウトされると、その遺伝子の発現がなくなるように現れる。遺伝子サイレンシングは通常、遺伝子ノックダウンメカニズムであると考えられており、遺伝子をサイレンシングするために一般的に使用される方法は例えばＲＮＡｉなどであってもよい。

【0198】

本出願において、「内因性」という用語は、生物、細胞、組織又はシステムから生じるか、又はその内部で生成される任意の物質を指す。

【0199】

本出願において、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織又はシステムの外部から導入されるか、又はその外部で生成される任意の物質を指す。

【0200】

本出願において、「アンチセンスＲＮＡ」という用語は通常、転写産物ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）に相補的な単鎖RNAを指す。アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡとの結合により遺伝子の発現を阻害することができる。例えば、アンチセンスＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合すると、当該二本鎖ＲＮＡ分子のＲＮＡ酵素ＩＩＩに対する感受性が増加して、分解される。例えば、アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡの上流の非コード領域に結合することにより、標的ｍＲＮＡの翻訳を直接阻害する。

【0201】

本出願において、「ｓｉＲＮＡ」という用語は通常、Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）又はｓｈｏｒｔ ｉｎ－ｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（短分子干渉ＲＮＡ）の略称を指す。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡとの相補的結合によりｍＲＮＡを分解して特定の遺伝子の発現を妨害することができる、長さが約１８～２８塩基対の二本鎖非コードＲＮＡ分子のクラスである。幾つかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素で処理された長い二本鎖ＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの産物であってもよい。幾つかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、細胞に入り、他のタンパク質とＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成し、センス鎖は分解され、アンチセンス鎖は相補的標的配列に結合することにより、遺伝子サイレンシングを達成することができる。

【0202】

本出願において、「ｓｈＲＮＡ」という用語は通常、ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡの略称、即ち「短いヘアピンＲＮＡ」を指す。ｓｈＲＮＡは通常、２つの短い逆方向反復配列を含み、その間にループ（ｌｏｏｐ）配列によって分離され、ヘアピン構造を形成する。通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写終結因子として、５個～６個のＴ塩基を含んでもよい。幾つかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ウイルスベクター又はプラスミドを介して細胞に入り、ポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩの作用下で転写され、転写産物は細胞核から輸出された後（通常Ｅｘｐｏｒｔｉｎ５を介して）、Ｄｉｃｅｒ処理後にＲＩＳＣに輸送され、センス鎖は分解され、アンチセンス鎖は相補的標的配列に結合して遺伝子サイレンシングを達成することができる。

【0203】

本出願において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」という用語は通常、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子及びｇＲＮＡ分子を含む一連の分子を指し、上記分子は、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子が標的配列で核酸を修飾するように引導して修飾することを可能にする、例えば標的配列の分解を引き起こすことができる。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質を含む。Ｃａｓ９又はその機能的変異体を含むシステムは、本出願において「Ｃａｓ９システム」又は「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」と呼ばれる。幾つかの実施形態において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ分子は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するように、複合体化することができる。

【0204】

本出願において、「ｇＲＮＡ分子」又は「ガイドＲＮＡ」、「指向ＲＮＡ」、「引導ＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ分子」、「ｇＲＮＡ」は互換的に使用され、通常、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子（通常、ｇＲＮＡ分子と複合する）の標的配列への特異的誘導を促進する核酸分子を指す。幾つかの実施形態において、ｇＲＮＡの一部のＤＮＡへのハイブリダイゼーション（例えば、ｇＲＮＡガイドドメインを介して）、及びｇＲＮＡ分子の一部のＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子への結合（例えば、少なくともｇＲＮＡｔｒａｃｒを介して）によって上記誘導を達成する。幾つかの実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、単一の連続したポリヌクレオチド分子からなり、本明細書において「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」など呼ばれる。他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、それ自体が会合（通常、ハイブリダイゼーションによって）可能である複数（例えば、２つ）のポリヌクレオチド分子からなり、本明細書において「二重ガイドＲＮＡ」又は「ｄｇＲＮＡ」など呼ばれる。

【0205】

本出願において、「Ｃａｓタンパク質」という用語は通常、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおいてＤＮＡ切断を担う酵素を指す。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来の酵素を含んでもよい。例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０である。

【0206】

本出願において、「Ｃａｓ９タンパク質」という用語は通常、ＤＮＡ切断を担う細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来の酵素を指す。Ｃａｓ９は、野生型タンパク質及びその機能的変異体を含んでもよい。

【0207】

本出願において、「対立遺伝子」という用語は通常、遺伝子座における遺伝子配列が持つ可能性のある異なる変化形態を指す。遺伝子座は、遺伝子部位又は部位とも呼ばれ、染色体上の固定位置、例えばある遺伝子の位置を指す。ゲノム内の遺伝子座の配置位置は、遺伝子マップ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ）と呼ばれる。

【0208】

本出願において、「ホモ接合体」という用語は通常、相同染色体の同一遺伝子座における２つの対立遺伝子が同一である遺伝子型個体を指す。一対の相対する遺伝子には、ＡＡ及びａａという２つの遺伝子型を有する個体が存在する可能性がある。

【0209】

本出願において、「ヘテロ接合体」という用語は通常、二倍体中の相同染色体の同一部位における２つの対立遺伝子が同一でない遺伝子型個体、例えばＡａを指す。ヘテロ接合遺伝子型は通常、ホモ接合優性遺伝子型又はホモ接合劣性遺伝子型の何れよりも適合性が高く、この現象はヘテロ接合優位性と呼ばれる。

【0210】

本出願において、「腫瘍」及び「癌」という用語は互換的に使用されてもよく、通常、異常細胞の急速且つ無秩序な増殖を特徴とする疾患を指す。癌細胞は、局所的に、又は血流及びリンパ系を通じて身体の他の部分に拡散することができる。本明細書において、様々な癌の例を記載しているが、それらには、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが含まれるが、これらに限定されない。「癌」又は「腫瘍」という用語は、前悪性及び悪性の癌並びに腫瘍を含み、固形腫瘍及び非固形腫瘍を更に包含する。

【0211】

高レベルのインターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒα２）は、多くの癌細胞で（膵臓癌、乳癌及び卵巣癌、又は膠芽腫などの悪性神経膠腫を含む）発見される。ＩＬ－１３Ｒα２はまた、高悪性度星状細胞腫を有するヒト患者の大部分において過剰発現される（ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１３Ｏｃｔ１６；８（１０）：ｅ７７７１９を参照し、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる）。また、癌細胞におけるＩＬ１３ＲＡ２発現量の減少により、モデルにおける腫瘍増殖が顕著に遅らせることができる（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５；１７（１）、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる）。ＩＬ１３Ｒα２を発現する正常組織の種類はほとんどなく、そのような場合、低レベルでしか発現しないことが予想される。多形性膠芽腫（ＧＢＭ）の場合、ＩＬ１３Ｒα２の高発現は、腫瘍の進行と患者の生存率低下の予後マーカーとなる可能性がある。

【0212】

本出願において、「薬学的に許容される」という用語は通常、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー応答又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、合理的な医学的判断の範囲内でヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。

【0213】

本出願において、「薬学的に許容される担体」という用語は通常、従来使用される担体の何れか１つを指し、物理化学的考慮要因（溶解性及び活性結合剤との反応性の欠如など）によってのみ制限され、投与経路によって制限される。本明細書に記載される薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤及び希釈剤は、当業者に周知であり、容易に入手可能である。一態様において、薬学的に許容される担体は、医薬組成物の活性成分に対して化学的不活性を有する担体であり、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有しない担体である。幾つかの実施形態において、担体は、動物又はヒトに投与される場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の不適切な反応を生じない。幾つかの態様において、医薬組成物は、発熱性物質及びヒト又は動物に有害である他の不純物を含まない。薬学的に許容される担体は、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み、その用途は当該分野で周知である。

【0214】

許容される担体、賦形剤又は安定剤は、レシピエントに毒性がなく、且つ好ましくは、使用される用量及び濃度で不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩又は他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、及び／又はＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0215】

本出願において、「有効量」又は「有効用量」という用語は通常、所望の効果を達成するのに、又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。薬物又は治療剤の「治療有効量」又は「治療有効用量」は通常、単独で又は別の治療剤と組み合わせて使用される場合に、疾患の退行を促進する（疾患症状の重症度の低下、疾患無症候期間の頻度及び持続期間の増加、又は疾患に罹患していることにより引き起こされる損傷若しくは障害の予防によって証明される）薬物の任意の量である。

【0216】

抗ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の「治療有効量」又は「有効量」は、治療上有益な効果が、ＣＲＳなどの抗ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の任意の毒性又は有害作用を上回る量又は用量でもある。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量を含む。一実施例において、治療有効用量は、対象における多発性骨髄腫を治療するための抗ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の最小有効用量（ＭＥＤ）である。一実施例において、治療有効用量は、対象がＣＲＳを治療できない状態にならない、抗ＩＬ－１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の最大許容用量（ＭＴＤ）である。

【0217】

本発明において、「発現のアップレギュレーション」という用語は通常、核酸ｍＲＮＡレベルの発現の増加又はポリペプチドレベルの発現の増加を指す。この用語は、例えば、糖部分の付加、リン酸化など、ポリペプチドの活性及び／又は機能の増加に必要な翻訳後修飾にも関係し得る。

【0218】

本出願において、「含む」という用語は通常、包含すること、まとめること、含有すること又は網羅の意味を指す。幾つかの場合において、「である」、「……からなる」の意味も表す。

【0219】

本出願において、「約」という用語は通常、指定値の０．５％～１０％の以上又は以下の範囲内の変化、例えば、指定値の０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、又は１０％の以上又は以下の範囲内の変化を指す。

【0220】

本出願において、「対象」という用語は通常、ヒト又は非ヒト動物を指し、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット又はサルなどを含むが、これらに限定されない。

【0221】

発明の詳細な説明
本明細書で提供される方法及び組成物の幾つかの実施形態は、インターロイキン１３受容体サブユニットα２（ＩＬ－１３Ｒα２）に特異的に結合することができ、又はインターロイキン１３受容体サブユニットα２（ＩＬ－１３Ｒα２）に特異的に結合するように構成されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。幾つかの実施形態において、そのようなＣＡＲをコードする核酸、そのようなＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞、並びに例えば、それを必要とする対象に、例えば、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒα２）によって媒介される疾患又は病状、例えば、癌（例えば、神経膠腫及び膠芽腫を含むＩＬ－１３Ｒα２陽性悪性腫瘍）を治療又はは阻害するための薬物として、そのような細胞を提供することによって、そのようなＣＡＲを有する免疫エフェクター細胞を利用する治療方法を含む。

【0222】

免疫エフェクター細胞
一態様では、本出願は、免疫エフェクター細胞であって、上記免疫エフェクター細胞におけるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、免疫エフェクター細胞を提供する。

【0223】

幾つかの実施態様において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む標的部分を含み、上記ＶＨは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0224】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号１６又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＶＨは配列番号１６又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0225】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＨを含む標的部分を含み、上記ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、上記ＨＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0226】

幾つかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0227】

幾つかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0228】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、を含む。

【0229】

例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、上記ＶＨは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含んでもよい。

【0230】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、重鎖フレームワーク領域１（ＨＦＲ１）、重鎖フレームワーク領域２（ＨＦＲ２）、重鎖フレームワーク領域３（ＨＦＲ３）及び重鎖フレームワーク領域４（ＨＦＲ４）を含み、上記ＨＦＲ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0231】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ１は、配列番号８又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0232】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ２は、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0233】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ２は、配列番号９又は配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0234】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ３は、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0235】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ３は、配列番号１０又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0236】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ４は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0237】

幾つかの実施形態において、上記ＨＦＲ４は、配列番号１１又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0238】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨはＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３及びＨＦＲ４を含み、且つ上記ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３及びＨＦＲ４は、
ｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＦＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＦＲ２、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＦＲ３、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＦＲ４、及び
ｉｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＦＲ１、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＦＲ２、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＦＲ３、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＦＲ４、から選ばれる。

【0239】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0240】

例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、上記ＶＨは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0241】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号１６又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0242】

幾つかの実施態様において、上記標的部分は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つのＣＤＲを更に含み、上記ＶＬは、配列番号３６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0243】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号３４又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0244】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は、ＶＨの少なくとも１つのＣＤＲ及びＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含み、且つ上記ＶＨ及びＶＬは、
ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、及び
ｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ、から選ばれる。

【0245】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶLを含む標的部分を含み、上記ＶLは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、上記ＬＣＤＲ１は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＬＣＤＲ１は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0246】

幾つかの実施形態において、上記ＬＣＤＲ２は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＬＣＤＲ２は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0247】

幾つかの実施形態において、上記ＬＣＤＲ３は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＬＣＤＲ３は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0248】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、を含む。

【0249】

例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、上記ＶＨは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含んでもよく、上記ＶＬは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含んでもよい。

【0250】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、軽鎖フレームワーク領域１（ＬＦＲ１）、軽鎖フレームワーク領域２（ＬＦＲ２）、軽鎖フレームワーク領域３（ＬＦＲ３）及び軽鎖フレームワーク領域４（ＬＦＲ４）を含み、上記ＬＦＲ１は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0251】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ１は、配列番号２６又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0252】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ２は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0253】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ２は、配列番号２７又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0254】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ３は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0255】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ３は、配列番号２８又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0256】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ４は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0257】

幾つかの実施形態において、上記ＬＦＲ４は、配列番号２９又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0258】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬはＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３及びＬＦＲ４を含み、且つ上記ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３及びＬＦＲ４は、
ｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＦＲ１、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＦＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＦＲ３、配列番号２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＦＲ４、及び
ｉｉ）配列番号３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＦＲ１、配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＦＲ２、配列番号３２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＦＲ３、配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＦＲ４、から選ばれる。

【0259】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号３６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0260】

例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、上記ＶＨは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、上記ＶＬは、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0261】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号３４又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0262】

幾つかの実施態様において、上記標的部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、そのうち、上記ＶＨは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬは、配列番号３６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0263】

例えば、上記ＶＨ及びＶＬは、
ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、及び
ｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、から選ばれ得る。

【0264】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記標的部分は、全長抗体、Ｆａｂ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を含む。例えば、上記標的部分はｓｃＦｖを含む。

【0265】

幾つかの実施態様において、上記標的部分は、ＶＨとＶＬとの間に位置するリンカーポリペプチドを含む。

【0266】

幾つかの実施形態において、上記リンカーポリペプチドは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号３７）、ウィットロー（Ｗｈｉｔｌｏｗ）リンカー（配列番号３８）、及び配列番号３７又は配列番号３８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーから選ばれる。

【0267】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は、配列番号４１又は配列番号４４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0268】

例えば、そのうち、上記標的部分は配列番号４１又は配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0269】

また例えば、そのうち、上記標的部分は配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２又は配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0270】

更に例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分は、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２又は配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0271】

幾つかの実施態様において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む標的部分を含み、上記ＶＨは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0272】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶＨを含む標的部分を含み、上記ＶＨは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、上記ＨＣＤＲ３は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＨＣＤＲ３は配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0273】

幾つかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ２は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＨＣＤＲ２は配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0274】

幾つかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ１は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＨＣＤＲ１は配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0275】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、を含む。

【0276】

例えば、上記ＶＨは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、を含んでもよい。

【0277】

幾つかの実施形態において、上記ＶＨは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＶＨは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0278】

また例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分はＶＨを含み、上記ＶＨは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0279】

幾つかの実施態様において、上記標的部分は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つのＣＤＲを更に含み、上記ＶＬは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0280】

幾つかの実施態様において、上記標的部分は、ＶＨの少なくとも１つのＣＤＲ及びＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含み、且つ上記ＶＨは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0281】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＶLを含む標的部分を含み、上記ＶLは、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、上記ＬＣＤＲ１は、配列番号５７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＬＣＤＲ１は配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む。

【0282】

幾つかの実施形態において、上記ＬＣＤＲ２は、配列番号５８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＬＣＤＲ２は配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む。

【0283】

幾つかの実施形態において、上記ＬＣＤＲ３は、配列番号５９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記ＬＣＤＲ３は配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む。

【0284】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号５７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号５９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、を含む。

【0285】

例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、上記ＶＨは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含んでもよく、上記ＶＬは、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含んでもよい。

【0286】

幾つかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0287】

幾つかの実施態様において、上記標的部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、そのうち、上記ＶＨは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0288】

例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、上記ＶＨは、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含んでもよく、上記ＶＬは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0289】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記標的部分は、全長抗体、Ｆａｂ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を含む。

【0290】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記標的部分はｓｃＦｖを含む。

【0291】

幾つかの実施態様において、上記標的部分は、ＶＨとＶＬとの間に位置するリンカーポリペプチドを含む。

【0292】

幾つかの実施形態において、上記リンカーポリペプチドは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号３７）、ウィットロー（Ｗｈｉｔｌｏｗ）リンカー（配列番号３８）、及び配列番号３７又は配列番号３８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーから選ばれる。

【0293】

幾つかの実施形態において、上記標的部分は、配列番号６１又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0294】

また例えば、上記免疫エフェクター細胞内のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）の細胞における機能が阻害され、且つ上記免疫エフェクター細胞は、標的部分を有するＩＬ１３Ｒα２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、上記標的部分は、配列番号６１又は配列番号６２に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0295】

幾つかの実施形態において、上記ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε（ＣＤ３ｅ）、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＣＤ２４４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２、ＮＫＧ２Ｃ、ＬＩＧＨＴ、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ１、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４及びＳＬＡＭからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する膜貫通ドメインを含む。

【0296】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記膜貫通ドメインはＣＤ８Ａに由来する膜貫通ドメインを含む。例えば、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ８Ａに由来する膜貫通ドメインを含んでもよい。

【0297】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記膜貫通ドメインは、配列番号６９～配列番号１１７の何れか１項に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記膜貫通ドメインは配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0298】

幾つかの実施形態において、上記ＣＡＲは、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含み、上記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＯＸ４０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ１、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４、ＣＤ１００、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０及びＭｙＤ８８からなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0299】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインである。

【0300】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１１８～配列番号１５０の何れか１項に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0301】

幾つかの実施形態において、上記ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃｅＲＩγ、ＦｃｅＲＩβ、ＦｃγＲＩＩａ、ウシ白血病ウイルスｇｐ３０、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＬＭＰ２Ａ、サル免疫不全ウイルスＰＢｊ１４Ｎｅｆ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ－１２及び少なくとも１つのＩＴＡＭを含むドメインからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0302】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインを含む。

【0303】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１５１～配列番号１６１の何れか１項に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１５１に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0304】

幾つかの実施形態において、上記ＣＡＲは、標的部分と膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を含み、上記ヒンジ領域は、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、４－１ＢＢ、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ７、ＣＤ８Ａ、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＦｃεＲＩγ、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＤＡＰ１０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ３０及びＬＩＧＨＴからなる群より選ばれる１つ又は複数のタンパク質に由来するヒンジ領域を含む。

【0305】

幾つかの実施形態において、上記ヒンジ領域はＣＤ８Ａに由来するヒンジ領域を含む。

【0306】

幾つかの実施形態において、上記ヒンジ領域は、配列番号１６２～配列番号１８３の何れか１項に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。例えば、ヒンジ領域は、配列番号１７０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0307】

幾つかの実施形態において、上記キメラ抗原受容体の非標的部分は、ＣＤ８Ａ分子膜貫通ドメイン、ＣＤ８Ａのヒンジ領域、４－１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0308】

幾つかの実施形態において、上記キメラ抗原受容体の非標的部分は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記キメラ抗原受容体の非標的部分は配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0309】

幾つかの実施形態において、Ｃ末端が上記標的部分のＮ末端に連結するシグナルペプチド断片を更に含む。例えば、上記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチド、抗ＩＬ１３Ｒα２ ｓｃＦｖ、ＣＤ８Ａヒンジドメイン、ＣＤ８Ａ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ主シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含んでもよい。

【0310】

幾つかの実施形態において、上記シグナルペプチド断片はＣＤ８Ａシグナルペプチド断片を含む。

【0311】

幾つかの実施形態において、上記シグナルペプチド断片は、配列番号１８４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記シグナルペプチド断片は配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0312】

幾つかの実施形態において、上記キメラ抗原受容体は、配列番号４５又は配列番号４６の何れか１項に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、上記キメラ抗原受容体は、配列番号４５又は配列番号４６の何れか１項に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0313】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞はヒト細胞を含む。

【0314】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単核細胞、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球及び／又は末梢血単核細胞を含む。例えば、上記免疫エフェクター細胞は、ヒトＴ細胞などのＴ細胞であってもよい。

【0315】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は自己又は非自己の免疫エフェクター細胞を含む。例えば、上記免疫エフェクター細胞は、非自己のヒトＴ細胞であってもよい。

【0316】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は、修飾された免疫エフェクター細胞を含み、そのうち、上記修飾は、免疫拒絶に関連する１つ又は複数の遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされることを含む。

【0317】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫拒絶に関連する遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡからなる群より選ばれる１つ又は複数の遺伝子である。

【0318】

幾つかの実施形態において、上記修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾されていない対応する細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされる。

【0319】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は、上記修飾されていない対応する細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない。

【0320】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は、上記修飾されていない対応する細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない。

【0321】

例えば、上記修飾された免疫エフェクター細胞は、上記修飾されていない対応する細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされ、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされなくてもよい。

【0322】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされる。

【0323】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない。

【0324】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされていない。

【0325】

例えば、上記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされてもよく、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子の及び／又は活性がダウンレギュレーションされなくてもよい。

【0326】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記遺伝子の発現レベル及び／又は活性のダウンレギュレーションは、上記遺伝子をコードする核酸分子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーション、及び／又は、上記遺伝子によってコードされるタンパク質産物の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む。

【0327】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異及び／又は遺伝子サイレンシングを含む。

【0328】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫エフェクター細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む。

【0329】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子がノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む。

【0330】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子エクソンがノックアウトされると共に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソンがノックアウトされることを含む。

【0331】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムからなる群より選ばれる１つ又は複数の物質を上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0332】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0333】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、上記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを上記免疫エフェクター細胞に投与することを更に含む。

【0334】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とする上記ｓｇＲＮＡは、配列番号１８６～配列番号２００の何れか１項に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0335】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、上記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0336】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とする上記ｓｇＲＮＡは、配列番号２０１～配列番号２４１の何れか１項に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0337】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、Ｃａｓ酵素を上記細胞に投与することを更に含む。

【0338】

幾つかの実施形態において、そのうち、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９タンパク質を含む。

【0339】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記アンチセンスＲＮＡは、配列番号２４２～配列番号２４５の何れか１項に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0340】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫エフェクター細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞である。

【0341】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ｂホモ接合体は、ＨＬＡ－Ｂ＊４０ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４６ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１３ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５８ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊３５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５５ホモ接合体を含む。

【0342】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫エフェクター細胞はＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体細胞である。

【0343】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊１１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊０２／Ａ＊１１ヘテロ接合体又はＨＬＡ－Ａ＊２４ホモ接合体を含む。

【0344】

例えば、免疫エフェクター細胞はヒトＴ細胞であってもよく、且つ上記ヒトＴ細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞であってもよい。

【0345】

免疫エフェクター細胞の製造方法
別の態様において、本発明は、前述の免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、免疫エフェクター細胞に、前述のＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、又は前述のＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入する前／後に、上記免疫エフェクター細胞が修飾されることを含み、上記修飾は、免疫拒絶に関連する１つ又は複数の遺伝子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む、方法を提供する。

【0346】

例えば、上記免疫エフェクター細胞を製造する方法は、
（１）前述の核酸分子又は前述のベクターを免疫エフェクター細胞に導入することと、
（２）上記免疫エフェクター細胞を修飾することと、を含んでもよく、上記修飾は免疫拒絶に関連する１つ又は複数の遺伝子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む。

【0347】

例えば、上記免疫エフェクター細胞を製造する方法は、
（１）健常者の末梢血を採取し、ＰＢＭＣ単離を行い、比率に従ってＣＤ３磁気ビーズを加えてインキュベートし、ＣＤ３＋Ｔ細胞の選別を行い、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体結合磁気ビーズを均一に混合し、計算された量に応じて適切な量の磁気ビーズ懸濁液を取ってＴ細胞培養系に添加し、Ｔ細胞を活性化し、一晩培養することと、
（２）ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲウイルスの力価に従ってＴ細胞を感染させることと、
（３）ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を同時にノックアウトすることと、
（４）比率に応じてＣＤ３磁気ビーズを加え、ＣＤ３－Ｔ細胞（磁気ビーズに結合していない細胞）を収集するように、ＣＤ３陰性Ｔ細胞を選別することと、を含んでもよい。

【0348】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ベクターは発現ベクターである。

【0349】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから選ばれる。

【0350】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ベクターはＥＦ－１αプロモーターを更に含む。

【0351】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を更に含む。

【0352】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫拒絶に関連する遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡからなる群より選ばれる１つ又は複数の遺伝子である。例えば、上記免疫拒絶に関連する遺伝子は、ＴＲＡＣ及び／又はＨＬＡ－Ａを含んでもよい。

【0353】

幾つかの実施形態において、上記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、上記免疫エフェクター細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされる。

【0354】

幾つかの実施形態において、上記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない。

【0355】

幾つかの実施形態において、上記修飾されていない対応する細胞における対応する遺伝子の発現及び／又は活性と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない。

【0356】

例えば、上記修飾された免疫エフェクター細胞は、上記修飾されていない対応する細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされ、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされなくてもよい。

【0357】

幾つかの実施形態において、対応する野生型細胞と比較して、上記免疫エフェクター細胞のＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされる。

【0358】

幾つかの実施形態において、対応する野生型細胞と比較して、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない。

【0359】

幾つかの実施形態において、対応する野生型細胞と比較して、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現及び／又は活性はダウンレギュレーションされていない。

【0360】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記遺伝子の発現レベル及び／又は活性のダウンレギュレーションは、上記遺伝子をコードする核酸分子の発現及び／又は活性のダウンレギュレーション、及び／又は、上記遺伝子によってコードされるタンパク質産物の発現及び／又は活性のダウンレギュレーションを含む。

【0361】

例えば、上記修飾された免疫エフェクター細胞は対応する野生型細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現及び／又は活性がダウンレギュレーションされてもよく、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子の及び／又は活性がダウンレギュレーションされなくてもよい。

【0362】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異及び／又は遺伝子サイレンシングを含む。

【0363】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫エフェクター細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む。

【0364】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫細胞における２つのＴＲＡＣ対立遺伝子がノックアウトされると共に、２つのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうちの何れか１つがノックアウトされることを含む。

【0365】

幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子エクソンがノックアウトされると共に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソンがノックアウトされることを含む。

【0366】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムからなる群より選ばれる１つ又は複数の物質を上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0367】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0368】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、上記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0369】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＴＲＡＣ遺伝子エクソン部分を標的とする上記ｓｇＲＮＡは、配列番号１８６～配列番号２００の何れか１項に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0370】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、上記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とするｓｇＲＮＡを上記免疫エフェクター細胞に投与することを含む。

【0371】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ａ遺伝子エクソン部分を標的とする上記ｓｇＲＮＡは、配列番号２０１～配列番号２４１の何れか１項に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0372】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記修飾は、Ｃａｓ酵素を上記細胞に投与することを更に含む。

【0373】

幾つかの実施形態において、そのうち、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９タンパク質を含む。

【0374】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記アンチセンスＲＮＡは、配列番号２４２～配列番号２４５の何れか１項に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0375】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記免疫エフェクター細胞はヒト細胞を含む。

【0376】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、単核細胞、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球及び／又は末梢血単核細胞を含む。例えば、上記免疫エフェクター細胞は、ヒトＴ細胞などのＴ細胞であってもよい。

【0377】

幾つかの実施形態において、上記免疫エフェクター細胞は自己又は非自己の免疫エフェクター細胞を含む。

【0378】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞である。例えば、上記免疫エフェクター細胞はヒト細胞であってもよく、且つ上記ヒト細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞であってもよい。また例えば、上記免疫エフェクター細胞はヒト細胞であってもよく、且つ上記ヒト細胞はＨＬＡ－Ｂホモ接合体細胞であってもよい。

【0379】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ｂホモ接合体は、ＨＬＡ－Ｂ＊４０ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４６ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊１３ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５８ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊０７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊３５ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊４４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５７ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５４ホモ接合体、ＨＬＡ－Ｂ＊５５ホモ接合体を含む。

【0380】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記細胞はＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体細胞である。

【0381】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＨＬＡ－Ａホモ接合体又はヘテロ接合体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊１１ホモ接合体、ＨＬＡ－Ａ＊０２／Ａ＊１１ヘテロ接合体又はＨＬＡ－Ａ＊２４ホモ接合体を含む。

【0382】

用途、医薬組成物、治療方法
別の態様において、本出願は、前述の免疫エフェクター細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞の製造における使用を更に提供する。

【0383】

別の態様において、本出願は、前述の免疫エフェクター細胞、及び任意選択に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を更に提供する。

【0384】

別の態様において、本出願は、ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状の治療における、前述の免疫エフェクター細胞及び／又は前述の医薬組成物の使用を更に提供する。

【0385】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む。

【0386】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む。

【0387】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む。

【0388】

幾つかの実施態様において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む。

【0389】

別の態様において、本出願は、前述の免疫エフェクター細胞及び／又は前述の医薬組成物のＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状の治療用の医薬の製造における使用を更に提供する。

【0390】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む。

【0391】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む。

【0392】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む。

【0393】

幾つかの実施態様において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む。

【0394】

別の態様において、本出願は、それを必要とする対象に有効量の前述の免疫エフェクター細胞及び／又は前述の医薬組成物を投与することを含む、ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状を予防又は治療するための方法を更に提供する。

【0395】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は、ＩＬ１３Ｒα２の発現アップレギュレーションに関連する疾患又は病状を含む。

【0396】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα２の発現に関連する疾患又は病状は癌を含む。

【0397】

幾つかの実施形態において、そのうち、上記癌はＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍を含む。

【0398】

幾つかの実施態様において、そのうち、上記ＩＬ１３Ｒα陽性腫瘍は、悪性神経膠腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、卵巣癌、乳癌、副腎皮質癌、胸腺腫、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌又は胃癌を含む。

【0399】

何れの理論にも限定されることなく、以下の実施例は、本出願にかかるキメラ抗原受容体、免疫エフェクター細胞、製造方法及び使用などを解釈するためのものに過ぎず、本出願の発明の範囲を限定するものではない。

【0400】

実施例
実施例１
１．１ 抗ＩＬ１３Ｒα２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の設計
図１に示すように、抗ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲ ＶＬＶＨ（マウス由来）の構造は、一個のＩＬ１３Ｒα２抗原結合領域（抗ＩＬ１３Ｒα２マウスモノクローナル抗体Ｓｃｆｖに由来する）、一個のＣＤ８Ａ細胞外ヒンジ領域、一個のＣＤ８Ａ膜貫通領域、一個の４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメイン及び一個のＣＤ３ζ活性化シグナルドメインを含み、そのＤＮＡ配列は配列番号５１に示され、アミノ酸配列は配列番号４５に示された。

【0401】

抗ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲ ＶＨＶＬ（ヒト由来）の構造は、一個のＩＬ１３Ｒα２抗原結合領域（抗ＩＬ１３Ｒα２ヒト由来モノクローナル抗体Ｓｃｆｖに由来する）、一個のＣＤ８Ａ細胞外ヒンジ領域、一個のＣＤ８Ａ膜貫通領域、一個の４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメイン及び一個のＣＤ３ζ活性化シグナルドメインを含み、そのＤＮＡ配列は配列番号５２に示され、アミノ酸配列は配列番号４６に示された。

【0402】

１．２ ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲのレンチウイルスベクターの構築
ＩＬ１３Ｒα２配列情報及びＣＡＲベクターの構造に従って、ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲレンチウイルス発現ベクターを構築した（ベクターの模式図は図１を参照）。最適化は、市販のレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰを骨格として選択し、このベクターに基づいて要素を改造した。まず、ベクターにカナマイシン耐性を持たせるように、ベクターのアンピシリン耐性遺伝子であるβ－ラクタマーゼをＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼで置換した。次に、体内での適用において潜在的脅威を有するＣＭＶプロモーター及びその隣接する下流のポリクローナル部位を削除した。最後に、プロトベクターからＥＦ１プロモーターにより発現を開始したｃｏｐＧＦＰ遺伝子を削除し、ＳａｌＩ切断部位を保持し、且つＳａｌＩ ５’末端にベクター構築用ＳｍａＩ切断部位を付加して目的とする最終ベクターを形成した。添加したＳｍａＩ切断部位は、目的とする最終ベクターの単一切断部位であり、ベクターの他の配列部分は、当該切断部位を有しなかった。キメラ抗原受容体レンチウイルス発現ベクターを最適化した後に構築し、ｓａｎｇｅｒシークエンシングにより配列が誤らないことを確認した後、レンチウイルスのパッケージングを行った。

【0403】

１．３ ガイドＲＮＡの設計
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／というウェブサイトを通して、対応する遺伝子配列を検索してダウンロードし、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを用いて遺伝子配列を開くことによって、目的遺伝子の異なるエクソン上にｓｇＲＮＡを設計することができた。本実施例で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｓｇＲＮＡ非限定的な設計原理は、５’－ＮＮＮ（２０）－ＮＧＧ－３’であり、ＮＧＧはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれ、そのうち、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧを表した。ｓｇＲＮＡは同じエキソン上により多く設計され得、且つ２０ヌクレオチド配列からなるｓｇＲＮＡがゲノム内で繰り返し出現する可能性があるので、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅというウェブサイトを用いてｓｇＲＮＡを設計して評価し、そのウェブサイトにエキソン配列を貼り付け、ウェブサイトでｓｇＲＮＡを設計し、予測して評価し、評価のスコアが高いほど編集効率が高く、オフターゲットリスクが低い可能性があることを示し、より高いスコアのｓｇＲＮＡを選択して試験した。ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１８６～配列番号２００に示され、ＨＬＡ－Ａ０２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号２０１～配列番号２２２に示され、ＨＬＡ－Ａ１１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号２２３～配列番号２３３に示され、ＨＬＡ－Ａ２４遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号２３４～配列番号２４１に示され、ジェンスクリプトバイオテクノロジー社により合成された。

【0404】

実施例２
２．１ ドナーのスクリーニング
受容体のＨＬＡ－Ｂ型決定に基づいて、受容体のＨＬＡ－Ｂ型決定とマッチするＨＬＡ－Ｂホモ接合体を選択した。

【0405】

まず、ドナーの供給源は集団内のＨＬＡ－Ｂホモ接合体に基づき、患者のＨＬＡ－Ｂの１つの対立遺伝子はドナーのＨＬＡ－Ｂホモ接合体と一致し、これらのドナー由来の細胞は、多数の患者集団をカバーすることができた。ＨＬＡ－Ｂアイソフォームの不一致による拒絶反応が低減された。ＨＬＡ－Ｂは主に、集団における頻度の高いＢ＊４０ホモ接合体、Ｂ＊１５ホモ接合体、Ｂ＊４６ホモ接合体、Ｂ＊１３ホモ接合体、Ｂ＊５１ホモ接合体、Ｂ＊５８ホモ接合体、Ｂ＊０７ホモ接合体、Ｂ＊３５ホモ接合体、Ｂ＊４４ホモ接合体、Ｂ＊５２ホモ接合体、Ｂ＊５７ホモ接合体、Ｂ＊５４ホモ接合体、Ｂ＊５５ホモ接合体が選択された。ＨＬＡ－Ａは、集団における頻度の比較的高いＡ＊０２ホモ接合体、Ａ＊１１ホモ接合体及びＡ＊０２／Ａ１１ヘテロ接合体が選択された。

【0406】

２．２ ＣＤ３＋Ｔ細胞の製造
（１）末梢血からのＰＢＭＣの分離
健常ドナーから末梢血を採取し、ＰＢＳ緩衝液で１：１に末梢血を希釈した。新しい５０ｍＬの遠心分離管に、まず希釈された血液量１／３の細胞分離液（Ｆｉｃｏｌｌ）を加え、次に血球希釈液を管壁に沿って非常にゆっくりと加え、８００ｇで常温で２０ｍｉｎ遠心分離した（遠心分離機は、上昇速度を１、下降速度を０に設定した）。遠心分離後の遠心分離管内の液体は上から下へ、ＰＢＳと血清層、白血球層、リンパ球分離液、赤血球層に分けられた。ＰＢＳ及び血清層を除去し、白血球層を新しい５０ｍＬの遠心分離管に移し、ＰＢＳを４０ｍＬになるまで加えて細胞を洗浄し、４５０ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離後に上清を捨てると、末梢血単核細胞が得られた。細胞を再懸濁した後に細胞をカウントした。

【0407】

（２）凍結保存された健常者ＰＢＭＣの蘇生
凍結保存された健常者ＰＢＭＣ細胞を３７℃の水浴釜で蘇生させ、完全に融解した後に１０％のＦＢＳを含むＸ－ＶＩＶＯ１５培地（ＬＯＮＺＡから購入）１０ｍＬを含有する１５ｍＬの遠心分離管に細胞を吸引し、４００ｇで８ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（１０％のＦＢＳ及び最終濃度１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉを含む）２ｍＬを添加し、室温で１５ｍｉｎインキュベートし、インキュベートプロセスにおいて振動を続け、インキュベート終了後の溶液を４０μｍのフィルターでろ過し、ＰＢＳ緩衝液１０ｍＬを吸い取って底の細胞を再懸濁して再びフィルターに加え、ろ過後に４００ｇで８ｍｉｎ遠心分離し、遠心分離後に上清を捨て、細胞を再懸濁した後に細胞をカウントした。

【0408】

（３）ＣＤ３^＋Ｔ細胞の選別
ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ヒトＴ細胞選別試薬キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入、カタログ番号は１７９５１）を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＴ細胞を抽出した。ＰＢＭＣ密度を５×１０＾７細胞／ｍＬに調整し、ＰＢＳ緩衝液を０．２５ｍＬ～２ｍＬの範囲で添加し、まずｃｏｃｋｔａｉｌを加えて均一に混合し、次に５０μＬ／ｍＬでｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌを加え、均一に混合した後に室温で５ｍｉｎ放置し、ボルテックスシェーカーでＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓを３０ｓボルテックスした後、細胞に４０μＬ／ｍＬで加えて均一に混合し、２．５ｍＬの倍数まで緩衝液を追加し、上下に２～３回軽く吹き飛ばし、各チューブ２．５ｍＬで冷凍保存管にそれぞれ加え、該冷凍保存管を磁気ホルダーに設置し、室温で３ｍｉｎ放置し、冷凍保存蓋を軽く開き、磁石ホルダーを両端で注意深く持ち、逆転して２ｓ～３ｓ保持し、細胞液を新しい遠心分離管に一度に注入し、１０ｍＬ～２０ｍＬの緩衝液で（細胞量に応じた）細胞を再懸濁した後、３００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＣＤ３^＋Ｔ細胞が得られた。

【0409】

（４）Ｔ細胞の活性化
活性化試薬は、体積比が培地：Ｔｒａｎｓａｃｔ＝９９：１で設定され、培地はＸ－ＶＩＶＯ１５培地（５％のＦＢＳ、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ７及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５を含む）であり、Ｔｒａｎｓａｃｔはミルテニーから購入した。Ｔ細胞を１×１０＾６細胞当たり１ｍＬの活性化試薬（１０μＬのＴｒａｎｓａｃｔを含有する）で十分に再懸濁した後、３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーターに置いて１日間インキュベートした。

【0410】

実施例３
図１に示すように、ａｎｔｉ－ＩＬ１３ＲＡ２ ＵＣＡＲ－Ｔは、遺伝子編集技術によりＴ細胞ＴＣＲとＨＬＡ－Ａをノックアウトし、レンチウイルスのトランスフェクションによりＴ細胞にａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲ分子を発現させる。

【0411】

３．１ ウイルスのトランスフェクション
実施例２の方法でＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｄ０日）を得て、且つＣＤ３／ＣＤ２８抗体磁気ビーズで活性化し、活性化後、Ｄ１日にレンチウイルスベクター（実施例１で製造したＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲレンチウイルス発現ベクター）をトランスフェクトし、Ｄ２日にレンチウイルスベクターを洗い流し、Ｄ３日にエレクトロトランスフェクトした。

【0412】

３．２ 遺伝子ノックアウト
エレクトロトランスフェクション試薬キット（ＬＯＮＺＡから購入、カタログ番号はＶ４ＸＸＰ－３０２４）を用いてエレクトロトランスフェクションによって、ＲＮＰ複合体を、３．１で製造した活性化後Ｔ細胞（Ｄ３日のＣＡＲ－Ｔ細胞を初期細胞として採取した）にトランスフェクトした。サンプリング及びカウント後、細胞を収集して遠心分離し、細胞沈殿物をＰＢＳで再懸濁した。３０ｍｉｎ前にウェルプレート内で培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地＋１０％のＦＢＳ＋ＩＬ２（２００Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ７（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ１５（５ｎｇ／ｍＬ））を予熱した。エレクトロトランスフェクション緩衝液の準備：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを８２：１８で製造し、各エレクトロトランスフェクションシステムに応じて１×１０^７の細胞を用いてＲＮＰ複合体（Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ＝２：１）を配分し、まず１０μｇのｓｇＲＮＡをＰＣＲチューブ（ＲＮＡ酵素なし）に加え、更に２０μｇのＣａｓ９タンパク質（ｔｈｅｒｍｏから購入、カタログ番号はＡ３６４９９）を加え、均一に軽く混合した後、室温で１２ｍｉｎインキュベートした。上記細胞をカウントし、３００ｇで８ｍｉｎ遠心分離して上清を捨て、ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、１Ｅ７個の細胞を吸引して３００ｇで８ｍｉｎ再度遠心分離し、上清を捨てた後、１００μＬの製造されたエレクトロトランスフェクション緩衝液で細胞を再懸濁した。上記細胞懸濁液に、インキュベートしたＲＮＰ複合体を加え、均一に軽く混合し、次に混合物を電気回転カップに静かに移した。電気回転カップをＬｏｎｚａ－４Ｄ電気回転計に置き、ＥＯ－１１５電気回転プログラムを用いてエレクトロトランスフェクションさせた。予熱した培地を電気回転カップに加え、次にセットのピペットを用いて細胞をウェルプレート内の予熱した培地に移し、次いで３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターに４８時間置いた後に細胞を収集し、ｓａｎｇｅｒシークエンシングにより編集効率を検出し、同時に細胞を収集してノックアウト効率を検出した。

【0413】

そのうち、ｓｇＲＮＡ配列は、ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ：ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ（配列番号１８６）、Ａ０２ ｓｇＲＮＡ：ＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧ（配列番号２０３）、Ａ１１ ｓｇＲＮＡ：ＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＡＴＣＣＡ（配列番号２３３）であった。

【0414】

３．３ ＣＤ３陰性Ｔ細胞の選別
ＣＤ３陰性Ｔ細胞の選別を行い、細胞をカウントした後に遠心分離し、上清を捨て、細胞をｂｕｆｆｅｒで再懸濁して均一に混合し、ＣＤ３磁気ビーズ／１０^７の細胞２０μＬにＣＤ３磁気ビーズを加え、均一に混合した後に４℃の冷蔵庫でインキュベートし、ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を洗浄して遠心分離した後に磁気ビーズを分離し、まずｃｏｌｕｍｎを磁極に置き、次に対応する遠心分離管を置き、ｂｕｆｆｅｒでｃｏｌｕｍｎ（ＬＤ）を浸潤し、泡が生じないように細胞をｃｏｌｕｍｎに加え、ｂｕｆｆｅｒでｃｏｌｕｍｎを２回洗浄し、洗浄後の液体（ＣＤ３－Ｔ）を１５ｍＬの遠心分離管に収集し、細胞の一部を取って細胞をカウントした。

【0415】

３．４ 細胞の培養
細胞の状態を顕微鏡下で観察し、細胞を希釈してカウントし、完全培地を補充して細胞密度を３×１０＾５個／ｍＬ～１×１０＾６個／ｍＬに維持し、中間液を補充／交換し、３７℃、５％のＣＯ_２で培養した。細胞の収集：遠心分離管に収集して遠心分離した後に上清を捨て、生理食塩水で細胞を再度洗浄し、遠心分離して凍結保存液を製造し、遠心分離後の細胞を凍結保存液に再懸濁し、注射器で最終製品用細胞凍結保存バッグに細胞懸濁液を吸い取って、細胞凍結保存バッグにラベルを貼付し、次の凍結保存を行った。

【0416】

３．５ 遺伝子ノックアウト効率の検出
（１）Ｓａｎｇｅｒシークエンシングの検出
細胞をカウントし、３～５×１０^４の細胞を採取し、２０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、できる限り上清を除去し、次に各チューブに２０μＬのＤＥ溶解液を加え、細胞溶解後にＰＣＲチューブに加え、一過性遠心分離後にＰＣＲ装置にセットし、マシン設定条件：６５℃で３０ｍｉｎ、４℃で３０ｓ、９５℃で２ｍｉｎ、１６℃で無限であった。プライマー対ＴＲＡＣ－Ｆｏｒ／ＴＲＡＣ－Ｒｅｖ、又はＨＬＡ－Ａ Ｆｏｒ／ＨＬＡ－Ａ Ｒｅｖを用いて、溶解産物をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をＧＥＮＥＷＩＺに送ってＳａｎｇｅｒシークエンシングを行った。ｓａｎｇｅｒシークエンシングの結果を得た後、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｒｉａｒｉｔｙｌａｂ．ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｉｏ／ｅｄｉｔｒ＿ｖ１０／というウェブサイトのＥｄｉｔＲエディタを用いて、編集が起こる位置及び編集効率を予測した。

【0417】

（２）フローサイトメトリーによる細胞カウント
１０Ｅ５～１０Ｅ８細胞を採取し、２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、次に各チューブに１００μＬのＰＢＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、更にａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＡＢ ＴＣＲ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）抗体５μＬ、ＨＬＡ－Ａ０２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＢ７．２）、ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｎｃｅ（登録商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）抗体５μＬを添加し、均一に混合した後に室温で１０ｍｉｎインキュベートした。２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、更にＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を再懸濁してＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーターにより測定したところ、細胞表面ＴＣＲ、ＨＬＡ－Ａ０２発現陽性率が得られた。ノックアウト効率＝（Ａ－Ｂ）／Ａ×１００％、Ａは対照群の発現陽性率であり、Ｂはノックアウト群の発現陽性率であった。

【0418】

結果は、図３Ａ～図３Ｃに示すように、ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞ＣＡＲ陽性率は４５％以上に達し（図３Ａ）、ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞中心記憶比率は４３％程度に達し（図３Ｂ）、ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞ダブルノックアウト効率は９４％以上に高かった（図３Ｃ）。

【0419】

実施例４ ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲマウス由来）のインビトロ細胞毒性分析
４．１ ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の殺傷
（１）ＩＬ１３Ｒα２標的細胞：Ｕ２５１－ＬＧ、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＋ＧＦＰ、標的細胞状態を対数増殖期になるように調整し、実験を行う前に連続的に２回継代を必要とした。

【0420】

（２）ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞及び対照群ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ、Ｔ細胞を製造し、フローサイトメトリーによりノックアウト効率、トランスフェクション効率、ＣＤ３－Ｔ選別効率及び記憶Ｔ細胞の比率を検出し、増幅倍率を統計した。

【0421】

（３）製造した細胞の幾つかの群を各群６×１０＾６細胞で遠心分離により収集した。

【0422】

（４）標的細胞を１６４０＋１０％のＦＢＳに再懸濁し、各標的部位に２４ウェルプレート３枚を採取し、標的細胞を２×１０＾５／ウェルの量で接種した。（標的細胞及びエフェクター細胞の両方が、２×１０＾６／ｍＬの密度で接種した）。次にＥ／Ｔ比（エフェクター標的比、エフェクター細胞：標的細胞）でエフェクター細胞を添加した。各ウェルに最大体積（例えば６００μＬ）まで液体を補充した。対照は、エフェクター細胞（６００μＬ）を添加せず、同じ数の標的細胞を接種した。ウェルプレートを５％のＣＯ_２、３７℃のインキュベーターに入れ、２４時間培養した。Ｅ／Ｔ：１：２、１：１、２：１、５：１、１０：１で３回繰り返しプレーティングした。

【0423】

（５）２４時間培養し、ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、上清２００μＬを収集した。次にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の検出によって標的細胞に対する組換えＣＡＲ－Ｔ細胞の溶解能を反映した。

【0424】

標的細胞溶解パーセントの計算式：

【数1】

結果分析（図４）：Ａｎｔｉ－ＩＬ１３ＲＡ２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞、Ｔ細胞及び標的細胞Ｕ２５１をそれぞれ共インキュベートしたところ、エフェクター標的比が２：１の場合、９０％以上の殺傷効率が達成された。

【0425】

４．２ ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞との共培養におけるサイトカイン分泌の検出

【0426】

上記共培養系の上清を収集し、サイトカイン分泌レベルを検出した。
結果分析（図５Ａ～図５Ｃ）：ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔが顕著に活性化され、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αサイトカインを多量に分泌した。

【0427】

実施例５ ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲマウス由来）のインビボ抗腫瘍効果
８～１０週齢のＮＳＧマウスに腫瘍細胞Ｕ２５１－ＬＧ（５×１０＾６）を皮下注射し、マウスを各群５匹で３群に分け、腫瘍形成時間は一般的に２～４週間であった。各群のマウス腫瘍にＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞、ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞、遺伝子ノックアウト無しのＴ細胞５Ｅ６を、５０μＬの注射体積でシングルポイント注射した。ルシフェラーゼによってマウス腫瘍退縮をモニターした。

【0428】

結果分析（図６）：ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞及びａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を再注入したマウスは、腫瘍増殖速度が明らかに遅くなった。

【0429】

実施例６ ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲマウス由来）のインビボ半減期検出
ヒト化免疫系マウス（ｈＨＳＣ－ＮＣＧ）１５匹を準備し、３群に分けた。実験群をＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ０２ノックアウト）とし、対照群１をＩＬ１３Ｒα２ ＣＡＲ－Ｔとし、対照群２をＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍノックアウト）とするように細胞を製造し、各マウスに１×１０＾７細胞を注射し、異なる時点Ｄ０、２ｈ、Ｄ３、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８、Ｄ３５、Ｄ４２、Ｄ４９、Ｄ５６、Ｄ６０で採血した。異なる時点での血液サンプルからゲノムを抽出し、ＱＰＣＲ絶対定量法を用いてｃｏｐｙ／ｎｇ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡを計算し、陽性対照は１４日目に採取したＵＣＡＲ－Ｔ細胞を用い、陰性対照はＤＥＰＣ水を用いた。

【0430】

結果分析（図７）：ａｎｔｉ－ＩＬ１３Ｒα２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ０２ノックアウト）は、マウス内で約７０日間の生存期間を有し、ｗｅｅｋ４－ｗｅｅｋ８で２回増幅された。

【0431】

実施例７ ユニバーサルＴ細胞のインビトロ安全性検証
（１）ＧＶＨＤ反応：ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＴ細胞、遺伝子ノックアウト無しのＴ細胞を製造し、同種異系ＰＢＭＣを照射し、製造された２群の細胞をそれぞれ刺激し、ＩＦＮ－γレベルを検出した。

【0432】

結果分析（図８）：ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＴ細胞群のＩＦＮ－γ分泌レベルが非常に低く、ＴＲＡＣノックアウトがＧＶＨＤ反応を低下させることを示した。

【0433】

（２）同種異系反応：同種異系ＰＢＭＣは照射後の２群の細胞を刺激し、ＩＦＮ－γのレベルを検出した。

【0434】

結果分析（図９）は、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＴ細胞群のＩＦＮ－γ分泌レベルが非常に低く、ＨＬＡ－Ａノックアウトが同種異系反応を低下させることを示した。

【0435】

実施例８ ユニバーサルＴ細胞のインビボ安全性検証
（１）ＧＶＨＤ反応：ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＴ細胞、遺伝子ノックアウト無しのＴ細胞を製造した。８～１０週のＮＳＧマウスを取ってそれぞれ１×１０＾７注射し、生存率、毛皮のキメ、皮膚の完全性などの臨床指標により移植物対宿主反応を観察した。サイトカイン検出：末梢血の血清を採取し、ＩＬ６、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γなどのサイトカインのレベルを検出した。採血時点：再注入前、２４ｈ、Ｄ３、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２８、２Ｍ。

【0436】

結果分析（図１０Ａ～図１０Ｄ）：ノックアウト効率が８０％を超える３群のＵＣＡＲ－Ｔ、特にノックアウト効率が９０％を超える２群は、サイトカイン分泌レベルが全て非常に低く、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＴ細胞群は、ＧＶＨＤ反応を大きく減少させることが示された。

【0437】

（２）同種異系反応：ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞を製造し、ＮＳＧマウス体内に、１×１０＾７のＴＣＲ－ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞（放射線照射）及び２×１０＾６の同種異系Ｔ細胞を同時注射した。対照群１：５ｘ１０＾６のＴＣＲ－Ｂ２Ｍ ａｎｔｉ－ＩＬ１３ＲＡ２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞と５ｘ１０＾６の同種異系Ｔ細胞をＮＳＧマウス体内に注射した。対照群２：５ｘ１０＾６のＴＣＲ－ＩＬ１３ＲＡ２ ＵＣＡＲ－Ｔ細胞と５ｘ１０＾６の同種異系Ｔ細胞をＮＳＧマウス体内に注射した。

【0438】

異なる時点で採血し、ＣＡＲコピー数を測定した。２群のＣＡＲコピー数の変化を比較した。時点：Ｄ１、Ｄ５、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４。

【0439】

結論：Ｄ２４日に、２群の対照群のマウスでは、拒絶反応が明らかであり、コピー数は基本的に検出されず、一方、実験群のコピー数は、依然として比較的高いレベルにあり、このことは、拒絶反応が明らかに弱くなり、マウス体内での実験群細胞の生存期間が延長されたことが示された。（図１１～図１２を参照）。

【0440】

実施例９ 遺伝子編集の安全性分析
ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＴ細胞、遺伝子ノックアウト無しのＴ細胞を製造し、ノックアウト効率を検出した後、以下の分析を行った。

【0441】

（１）オフターゲット：
対照群：トランスフェクトＣＡＳ９＋ＯＤＮタグ
実験群：トランスフェクトＣＡＳ９＋ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ）＋ＯＤＮタグ
Ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ－ＷＧＳ：（Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）：遺伝子ノックアウト無しのＴ細胞、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＴ細胞をそれぞれ１×１０＾６採取し、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺバイオテクノロジー有限公司に送って検出した。

【0442】

結果分析：実験群のオフターゲット率が非常に低く、そしてオフターゲットは主に遺伝子間やイントロンに集中し、遺伝子機能への影響は少なかった（図１３を参照）。

【0443】

（２）染色体転座：ｑＰＣＲ法を用いて、ＴＲＡＣ及びＨＬＡ遺伝子座を同時に編集した場合に起こり得る再構成を定量した。２回の転座はＴＲＡＣ：ＨＬＡ、ＨＬＡ：ＴＲＡＣと標識された。合成したテンプレートプラスミド中の陽性参照サンプルを、検出対照として評価した。HLAゲノム標的領域の両側の増幅断片を内部対照とした。ゲノムＤＮＡを抽出してリアルタイム定量ＰＣＲを行い、標準曲線及びＣｑ値からゲノムＤＮＡの遺伝子コピー数を計算した。

【0444】

結果分析：ダブルノックアウトＴ細胞（ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ）は、Ｄ１４（採取）に染色体転座の発生の有無を検出した。検出結果：２つの転座方式の検出値が何れもゼロに近く、遺伝子座が再構成されていないことを示唆した（図１４を参照）。

【0445】

（３）核型の型決定：７０％～８０％の遺伝子ノックアウト無しのＴ細胞、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトＴ細胞をそれぞれ１×１０＾６採取して２個のＴ２５瓶に入れ、培養液で満たし、完全に密封された蓋で覆い、密封フィルムで包み、浙江如耀バイオテクノロジー有限公司に送って検出した。

【0446】

結果分析：対照群と比較して、実験群の核型が正常であった（１５を参照）。

【0447】

（４）Ｃａｓ９タンパク質の残留：細胞を製造する時、ノックアウト前、ノックアウト後及び採取前の３時点でそれぞれ１×１０＾６の細胞を採取して溶解し、続いてタンパク質定量キット（ＮＯＶＡＴＥＩＮＢＩＯ、カタログ番号ＮＢ－Ｅ１３７２ＰＲ）で定量し、各群のサンプルを同じサンプリング量２μｇに調整し、説明書に従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質ＥＬＩＳＡキットで検出した。サンプル中のＣａｓ９タンパク質は試験紙ウェル上にしっかりと安定してスポットされた。次に、検出抗体を用いてバインディングされたＣａｓ９タンパク質を認識し、次に現像剤を用いて現像させた。Ｃａｓ９比は吸光度に正比例し、Ｃａｓ９対照品との比較によってＣａｓ９タンパク質の絶対量を定量した。

【0448】

結果分析：ダブルノックアウトＴ細胞（ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ）は、エレクトロトランスフェクション前（Ｄ３）、エレクトロトランスフェクション後液体交換前（Ｄ５）、Ｄ９、Ｄ１４（採取）の４時点でｓｐＣａｓ９残留をそれぞれ検出したところ、エレクトロトランスフェクション後液体交換前（Ｄ５）に微量な残留を検出することを除いて、残りの３時点で何れも検出されなかった。（図１６を参照）。

【0449】

実施例１０．シングルノックアウトＴ細胞の製造
エレクトロトランスフェクション試薬キット（ＬＯＮＺＡから購入、カタログ番号はＶ４ＸＸＰ－３０２４）を用いてエレクトロトランスフェクションによって、ＲＮＰ複合体を、実施例２で製造した活性化後Ｔ細胞にトランスフェクトした。３０ｍｉｎ前にウェルプレート内で培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地＋１０％のＦＢＳ＋ＩＬ２（２００Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ７（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ１５（５ｎｇ／ｍＬ））を予熱した。エレクトロトランスフェクション緩衝液はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＝８２：１８で調製された。ＲＮＰ複合体の準備：ＴＲＡＣのｓｇＲＮＡ配列はｓｇ９、ＨＬＡ－ＡのｓｇＲＮＡ配列はＨＬＡ－Ａ０２ Ｓｇ２又はＨＬＡ－Ａ０２ Ｓｇ５又はＨＬＡ－Ａ１１ ｓｇ２１又はＨＬＡ－Ａ１１ Ｒｓｇ２であり、まず２０μｇのｓｇＲＮＡをＰＣＲチューブ（ＲＮＡ酵素なし）に加え、更に１０μｇのＣａｓ９タンパク質（ｔｈｅｒｍｏから購入、カタログ番号はＡ３６４９９）を加え、均一に軽く混合した後、室温で１２ｍｉｎインキュベートした。実施例２で培養した活性化後Ｔ細胞をカウントし、３００ｇで８ｍｉｎ遠心分離して上清を捨て、ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、１Ｅ７個の細胞を吸い取って３００ｇで８ｍｉｎ再度遠心分離し、上清を捨てた後、１００μＬの調製したエレクトロトランスフェクション緩衝液で細胞を再懸濁した。上記細胞懸濁液に、インキュベートしたＲＮＰ複合体を加え、均一に軽く混合し、次に混合物を電気回転カップに静かに移した。電気回転カップをＬｏｎｚａ－４Ｄ電気回転計に置き、ＥＯ－１１５電気回転プログラムを用いてエレクトロトランスフェクションさせた。予熱した培地を電気回転カップに加え、次いでセットのピペットを用いて細胞をウェルプレート内の予熱した培地に移し、次いで３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターに置いて培養した。

【0450】

実施例１１．遺伝子ノックアウト効率検出方法の比較
（１）Ｓａｎｇｅｒシークエンシングの検出
細胞をカウントし、３～５×１０４の細胞を採取し、２０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、できる限り上清を除去し、次いで各チューブに２０μＬのＤＥ溶解液を加え、細胞溶解後にＰＣＲチューブに加え、一過性遠心分離後にＰＣＲ装置にセットし、マシン設定条件：６５℃で３０ｍｉｎ、４℃で３０ｓ、９５℃で２ｍｉｎ、１６℃で無限であった。プライマー対ＴＲＡＣ－Ｆｏｒ／ＴＲＡＣ－Ｒｅｖ、又はＨＬＡ－Ａ Ｆｏｒ／ＨＬＡ－Ａ Ｒｅｖを用いて、溶解産物をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をＧＥＮＥＷＩＺに送ってＳａｎｇｅｒシークエンシングを行った。ｓａｎｇｅｒシークエンシングの結果を得た後、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｒｉａｒｉｔｙｌａｂ．ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｉｏ／ｅｄｉｔｒ＿ｖ１０／というウェブサイトのＥｄｉｔＲエディタを用いて、編集が起こる位置及び編集効率を予測した。

【0451】

（２）ＴＡクローンシークエンシングの検出
ＡｘｙＰｒｅｐＴＭ ＰＣＲ産物洗浄試薬キット（ＡＸＹＧＥＮから購入）を用いてＰＣＲ産物を精製し、次いで試薬キット（ＤＮＡ Ａ－Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ、ＴａＫａＲａから購入）を用いて精製後のＰＣＲ産物を接着末端に貼り付け、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（ＴａＫａＲａから購入）を介して産物をＴベクター（ｐＭＤＴＭ１９－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ＴａＫａＲａから購入）に連結し、それをコンピテント細胞（ＤＨ５ ａｌｐｈａ）に形質転換し、次いでアンピシリン耐性を有するＬＢプレートに塗布し、３７℃のインキュベーターで約１２時間培養した後にシングルコロニーを摘出し、シングルコロニー菌液をＧＥＮＥＷＩＺに送ってシークエンシングを行った。ノックアウト効率＝変異クローン数／全クローン数。

【0452】

（３）フローサイトメトリーによる細胞カウント
１０Ｅ５～１０Ｅ８細胞を採取し、２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、次に各チューブに１００μＬのＰＢＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁し、更にａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＡＢ ＴＣＲ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）抗体５μＬ、ＨＬＡ－Ａ０２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＢ７．２）、ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｎｃｅ（登録商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）抗体５μＬを添加し、均一に混合した後に室温で１０ｍｉｎインキュベートした。２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した後、更にＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を再懸濁してＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーターにより測定したところ、細胞表面ＴＣＲ、ＨＬＡ－Ａ０２発現陽性率が得られた。ノックアウト効率＝（Ａ－Ｂ）／Ａ×１００％、Ａは対照群の発現陽性率であり、Ｂはノックアウト群の発現陽性率であった。

【0453】

ＴＲＡＣシングルノックアウトの３つの検出結果は図１７～図１９に示され、ノックアウト効率の計算結果は表１に示され、３つの検出方法は基本的に同じであり、後続の試験ではＳａｎｇｅｒシークエンシング法のみを用いて編集効率を検出した。

【0454】

【0455】

ＨＬＡ－Ａ０２遺伝子編集のためのＳａｎｇｅｒシークエンシング法の結果は図２０～図２１に示され、編集効率は、何れも９０％であり、ＨＬＡ－Ａ１１遺伝子編集のためのＳａｎｇｅｒシークエンシング法の結果は図２２～図２３に示された。

【0456】

実施例１２．ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞の製造
エレクトロトランスフェクション試薬キット（ＬＯＮＺＡから購入、カタログ番号はＶ４ＸＸＰ－３０２４）を用いてエレクトロトランスフェクションによって、ＲＮＰ複合体を、実施例２で製造した活性化後Ｔ細胞にトランスフェクトした。３０ｍｉｎ前にウェルプレート内で培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地＋１０％のＦＢＳ＋ＩＬ２（２００Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ７（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ１５（５ｎｇ／ｍＬ））を予熱した。エレクトロトランスフェクション緩衝液はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＝８２：１８で調製された。ＲＮＰ複合体の準備：２０μｇのＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣ Ｓｇ９）、２０μｇのＨＬＡ－Ａ ｓｇＲＮＡ（ＨＬＡ－Ａ０２ Ｓｇ２又はＨＬＡ－Ａ０２ Ｓｇ５又はＨＬＡ－Ａ１１ ｓｇ２１又はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１：０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１：０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１：０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１：０１：０１若しくはＨＬＡ－Ａ＊２６：０１：０１：０１を標的とするｓｇＲＮＡ）をＰＣＲチューブ（ＲＮＡ無し）にそれぞれ加え、更に１０μｇのＣａｓ９タンパク質（ｔｈｅｒｍｏから購入、カタログ番号はＡ３６４９９）をそれぞれ加え、均一に軽く混合した後、室温で１２ｍｉｎインキュベートした。実施例２で培養した活性化後Ｔ細胞をカウントし、３００ｇで８ｍｉｎ遠心分離して上清を捨て、ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、１Ｅ７個の細胞を吸い取って３００ｇで８ｍｉｎ再度遠心分離し、上清を捨てた後、１００μＬの調製したエレクトロトランスフェクション緩衝液で細胞を再懸濁した。上記細胞懸濁液に、インキュベートしたＴＲＡＣ及びＨＬＡ－ＡのＲＮＰ複合体を加え、均一に軽く混合し、次いで混合物を電気回転カップに静かに移した。電気回転カップをＬｏｎｚａ－４Ｄ電気回転計に置き、ＥＯ－１１５電気回転プログラムを用いてエレクトロトランスフェクションさせた。予熱した培地を電気回転カップに加え、次いでセットのピペットを用いて細胞をウェルプレート内の予熱した培地に移し、次いで３７℃、５％のＣＯ_２のインキュベーターに置いて培養した。

【0457】

シークエンシングにより、ダブルノックアウト効率を検出すると、ダブルノックアウト効率が８０％以上のＴＲＡＣ陰性、ＨＬＡ－Ａ陰性Ｔ細胞が得られた。結果は図２４～図２５に示された。そのうち、図２４Ａは、ＨＬＡ－Ａ０２ Ｓｇ５によるＨＬＡ－Ａ０２ノックアウトの結果を示し、そのうち、前の行は、対照群の結果（即ち、ＨＬＡ－Ａ０２ Ｓｇ５を用いてノックアウトを行わなかった）を示し、次の行は、ＨＬＡ－Ａ０２及びＴＲＡＣの同時ノックアウトの結果を示した。そのうち、図２４Ｂは、ＴＲＡＣ Ｓｇ９によるＴＲＡＣノックアウトの結果を示し、そのうち、前の行は、対照群の結果（即ち、ＴＲＡＣ Ｓｇ９によるノックアウトを行わなかった）を示し、次の行は、ＨＬＡ－Ａ０２及びＴＲＡＣの同時ノックアウトの結果を示した。図２５Ａ～図２５Ｂは、ＨＬＡ－Ａ０２及びＴＲＡＣタンパク質レベルをノックアウトするノックアウト状況を示し、そのうちＮＥＧは陰性対照を指し、ＷＴはノックアウト処理を一切行っていない場合を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトはＨＬＡ－Ａ０２及びＴＲＡＣの同時ノックアウトの結果を指した。

【0458】

実施例１３．ダブルノックアウトＴ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子の発現と、対応する細胞における対応する遺伝子の発現との区別
（１）実施例２で製造した活性化後Ｔ細胞を用いて、２群に分け、一群は対照とし、他群は実施例５の方法に従ってＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞を製造し、実施例４のステップ（１）の方法に従ってＳａｎｇｅｒシークエンシングを行った。シークエンシングの結果により、ＴＲＡＣ及びＨＬＡ－Ａのダブルノックアウト細胞を得た。製造したダブルノックアウトＴ細胞を、対応するＴＲＡＣ及びＨＬＡ－Ａ抗体とインキュベートし、フローサイトメトリー選別又は磁気ビーズ選別によって、ダブルノックアウト細胞株が得られた。

【0459】

（２）対照群と比較したダブルノックアウトＴ細胞のｍＲＮＡ発現レベルの変化を検出した。ＲＮＡ抽出試薬キット（ＱＩＡＧＥＮから購入、カタログ番号は７４００４）を用いてＲＮＡを抽出し、逆転写試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入、カタログ番号は４３６８８１４）を用いてＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得て、ｃＤＮＡをテンプレートとして定量ＰＣＲ検出を行った。

【0460】

（３）対照群と比較したダブルノックアウトＴ細胞のタンパク質発現レベルの変化を検出した。全タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、カタログ番号は８７７８７）を用いてタンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法又はフローサイトメトリーによりタンパク質発現レベルを検出し、使用される抗体は、それぞれＴＲＡＣ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号は１７－９９８６－４２）、ＨＬＡ－Ａ抗体（Ｍｅｒｃｋから購入、カタログ番号は１７－９８７６－４１）、Ｂ２Ｍ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号はＡ１５７７０）及びＣＩＩＴＡ抗体（ＯｒｉＧｅｎｅから購入、カタログ番号はＣＦ８１２２００）であった。

【0461】

Ｓａｎｇｅｒシークエンシングによって、対照群と比較して、ダブルノックアウトＴ細胞におけるＴＲＡＣ及び／又はＨＬＡ－Ａ遺伝子のヌクレオチド配列における変化が検出された。定量ＰＣＲは、ダブルノックアウトＴ細胞におけるＴＲＡＣ及び／又はＨＬＡ－Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量がダウンレギュレーションされる一方、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現量がダウンレギュレーションされていないことが示された。ＦＡＣＳ及びＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔの結果は、ダブルノックアウトＴ細胞におけるタンパク質発現量がダウンレギュレーションされ、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡタンパク質発現量がダウンレギュレーションされていないことが示された。

【0462】

結果は図２７～図２８に示された。そのうち、図２６は、遺伝子発現のｍＲＮＡレベル測定を示し、そのうち、図２６は、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのｍＲＮＡレベルを示し、そのうち、ＷＴはノックアウト処理を一切行っていない場合を指し、ダブルノックアウト群はＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞の結果を指す。図２７は、遺伝子発現のタンパク質レベル測定を示し、そのうち、図２７Ａ～図２７Ｂは、それぞれＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのタンパク質発現レベルを示し、そのうち、ＮＥＧは陰性対照を指し、ＷＴはノックアウト処理を一切行っていない場合を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトはＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞の結果を指す。

【0463】

実施例１４．ＴＲＡＣ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ／Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子のトリプルノックアウトＴ細胞の製造、且つ対応する３つの遺伝子発現変化の検証
（１）実施例１５ステップ（１）の方法に従って、対照群とＴＲＡＣ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ遺伝子とＣＩＩＴＡ遺伝子のトリプルノックアウト細胞、及びＴＲＡＣ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子とＣＩＩＴＡ遺伝子のトリプルノックアウト細胞を準備した。

【0464】

（２）実施例１５ステップ（３）の方法に従って、ＦＡＣＳ及びＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法によりタンパク質発現レベルの変化を検出した。

【0465】

対照群の細胞と比較して、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡのトリプルノックアウトＴ細胞におけるＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のタンパク質発現量がダウンレギュレーションされ、対照群の細胞と比較して、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのトリプルノックアウトＴ細胞におけるＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のタンパク質発現量がダウンレギュレーションされた。

【0466】

（３）ＴＲＡＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、カタログ番号は１７－９９８６－４２）、ＨＬＡ－Ａ（Ｍｅｒｃｋから購入、カタログ番号は１７－９８７６－４１）、Ｂ２Ｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号はＡ１５７７０）抗体を用いてフローサイトメトリーにより実施例１３のダブルノックアウト細胞及び本実施例の２つのトリプルノックアウト細胞のノックアウト効率を検出した結果、単一細胞レベルで多重遺伝子ノックアウト効率を同時に達成し、トリプルノックアウトよりもダブルノックアウトの方が明らかに高いことが示された。

【0467】

結果は図２８Ａ～図２８Ｄに示された。そのうち、図２８Ａ～図２８Ｃは、順にＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＢ２Ｍタンパク質レベルのノックアウト状況であった。そのうち、ＷＴはノックアウト処理を一切行っていない場合を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトはＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞の結果を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡのトリプルノックアウトＴ細胞の結果を指し、そのうち、ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＡＣのトリプルノックアウトＴ細胞の結果を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａノックダウンは実施例１８で製造されたＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子ノックダウンＴ細胞の結果を指す。図２８ＤはＣＩＩＴＡタンパク質レベルのノックアウト状況を示した。

【0468】

図２８の結果は、ＷＴ対照群と比較して、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２Ｍのタンパク質レベルがダウンレギュレーションされることが示された。同時に、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａダブルノックアウトのノックアウト効率は、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウト又はＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトよりも高い。

【0469】

実施例１５ アンチセンスＲＮＡ配列の設計
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／というデータベースによって、対応する遺伝子（ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子）の転写ＲＮＡ配列を得て、以下の原則を参照してｓｉＲＮＡを設計した。

【0470】

開始コドンの下流５０～１００ヌクレオチド及び終止コドンの上流１００ヌクレオチドの配列をできる限り回避し、長さが３０ヌクレオチド未満である配列を選択し、４個以上の連続した同一塩基を回避し、イントロン領域を回避し、反復配列を回避し、一塩基多型（ＳＮＰ）部位を回避し、配列ＧＣの含有量が３０％～６０％の間で、配列パターンＡＡ（Ｎ＜ｓｕｂ＞１９）、ＮＡ（Ｎ＜ｓｕｂ＞２１）又はＮＡＲ（Ｎ＜ｓｕｂ＞１７）ＹＮＮを優先的に選択した。Ａはアデニル酸、Ｔはチミジル酸、Ｒはアデニル酸又はグアニル酸（プリン）、Ｙはチミジル酸又はシチジル酸（ピリミジン）、Ｎはアデニル酸、チミジル酸、グアニル酸又はシチジル酸であった。選択した配列に対して相同性比較分析を実行し、アンチセンスＲＮＡと他の遺伝子又は配列との間に顕著な相同性を有することでオフターゲット効果が生じることを回避した。相同性分析は、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｔｏｏｌ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｎ）、ＵＣＳＣ Ｂｌａｔ ｔｏｏｌ又はＥｎｓｅｍｂｌ Ｂｌａｓｔを使用して行われた。

【0471】

設計して得られたアンチセンスＲＮＡ配列は、ＨＬＡ－Ａ－ｈｏｍｏ－５５１、ＨＬＡ－Ａ－ｈｏｍｏ－ＮＥＧ、ＴＲＡＣ－ｈｏｍｏ－３７５及びＴＲＡＣ－ｈｏｍｏ－ＮＥＧを含んだ。

【0472】

実施例１６ ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子ノックダウンＴ細胞の製造
実施例１７により設計されたアンチセンスＲＮＡを用いてダブルノックダウンを行った。会社がＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のアンチセンスＲＮＡ配列のレンチウイルス（ＧＥＭＭＡ）を製造した。実施例２の方法に従ってＣＤ３^＋Ｔ細胞を製造し（Ｄ０日）、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体磁気ビーズを用いて活性化し、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を担持するアンチセンスＲＮＡ配列のレンチウイルスを活性化されたＴ細胞にトランスフェクトし（Ｄ１日）、Ｄ２にレンチウイルスベクターを洗い流し、Ｄ５日まで培養し続けた。Ｄ５まで培養したＴ細胞を収集し、定量ＰＣＲ又はＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法などによって遺伝子ノックダウン効率を検出した。得られたＴ細胞に対して対応するＴＲＡＣ及びＨＬＡ－Ａ抗体を標識し、フローサイトメトリー選別又は磁気ビーズ選別の方法によりＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子ノックダウンＴ細胞が得られた。結果は、ＴＲＡＣ及びＨＬＡ－Ａ遺伝子ノックダウン群におけるＴＲＡＣ及びＨＬＡ－ＡのｍＲＮＡ及びタンパク質発現レベルが何れもダウンレギュレーションされることが示された。そのうち、図２９Ａ～図２９Ｂは、順にＴＲＡＣ及びＨＬＡ－Ａ ｍＲＮＡレベルのノックアウト状況であった。そのうち、ＷＴはノックアウト処理を一切行っていない場合を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトはＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞の結果を指す。そのうち、ＴＲＡＣ及びＨＬＡ－Ａタンパク質レベルのノックアウトレベルは図２８の結果を参照することができる。

【0473】

実施例１７ 異なるＴ細胞活性の区別
実施例２、１４、１６及び１８の遺伝子ノックアウト無し、ダブルノックアウト、トリプルノックアウト及びダブルノックダウンのＴ細胞を製造し、幾つかのＴ細胞の活性を比較し、各群の細胞をカウントし、１×１０^６細胞をそれぞれ取って２４ウェルプレートに接種し、各ウェルの細胞にＰＨＡ（０．３μｇ／ｍＬ）（イオノマイシン＋）又は５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのｉｏｎｏｍｙｃｉｎを加え、５時間培養し続けた後、ＣＤ６９（初期活性化）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、カタログ番号はＦＮ５０）、ＣＤ１３７（やや後期）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、カタログ番号は４Ｂ４－１）抗体を用いてフローサイトメトリーにより細胞の活性化状態を検出した。結果は、ダブルノックアウト、ダブルノックアウトＴ細胞の活性がトリプルノックアウトＴ細胞より優れることが示された。

【0474】

ＣＤ６９及びＣＤ１３７のタンパク質レベルの発現状態はそれぞれ図３０Ａ～図３０Ｂを参照する。そのうち、ＷＴはノックアウト処理を一切行っていない場合を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトはＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞の結果を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡのトリプルノックアウトＴ細胞の結果を指し、そのうち、ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＡＣのトリプルノックアウトＴ細胞の結果を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａノックダウンは実施例１８で製造されたＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子ノックダウンＴ細胞の結果を指す。

【0475】

実施例１８ 異系ＮＫ細胞に対する異なるＴ細胞の反応性の区別
実施例２、１４、１６及び１８の遺伝子ノックアウト無し、ダブルノックアウト、トリプルノックアウト及びダブルノックアウトのＴ細胞に対してＣＦＳＥ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５４）標識を行い、細胞をカウントし、１×１０^６細胞をそれぞれ取って１：１の比率でＮＫ細胞（ＮＫ９２ＭＩ）と共培養し、２４時間後に共培養した各群の細胞を収集し、フローサイトメトリーにより混合細胞におけるＣＦＳＥ陽性細胞の比率を検出した。

【0476】

結果は、ＮＫ細胞によるダブルノックアウト、ダブルノックアウトＴ細胞の殺傷毒性がトリプルノックアウトＴ細胞よりも低いことが示された。結果は図３１に示された。そのうち、ＮＫ＋ＴはＮＫ細胞をノックアウト処理が一切行っていないＴ細胞と共培養する場合を指し、ＮＫ＋ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡノックダウンはＮＫ細胞を実施例１８で製造されたＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子ノックダウンＴ細胞と共培養する場合を指し、ＮＫ＋ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトはＮＫ細胞をＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞と共培養する場合を指し、ＮＫ＋ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＮＫ細胞をＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡトリプルノックアウトＴ細胞と共培養する場合を指し、ＮＫ＋ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＮＫ細胞をＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＡＣトリプルノックアウトＴ細胞と共培養する場合を指す。

【0477】

実施例１９ 異なるＴ細胞の異系免疫拒絶反応の区別
ドナー１由来の末梢血を用いて実施例２、１４、１６及び１８の遺伝子ノックアウト無し、ダブルノックアウト、トリプルノックアウト及びダブルノックダウンＴ細胞を製造した。ドナー２由来の末梢血を用いてＣＤ３^＋Ｔ細胞を製造した。ドナー１の末梢血を用いて製造した各群の細胞を、ドナー２の末梢血を用いて実施例２により製造したＣＤ３^＋Ｔ細胞と等しい比率で混合し、２４時間後に細胞混合系におけるＩＦＮ－γの発現レベルを検出した。結果は、ダブルノックアウトＴ細胞群ＩＦＮ－γの発現レベルがトリプルノックアウトＴ細胞群よりも低いことが示された。

【0478】

結果は図３２に示され、ＷＴはノックアウト処理を一切行っていない場合を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトはＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＴ細胞の結果を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡトリプルノックアウトＴ細胞の結果を指し、そのうち、ＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＡＣトリプルノックアウトＴ細胞の結果を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａノックダウンは実施例１６で製造されたＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子ノックダウンＴ細胞の結果を指す。

【0479】

実施例２０．ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＲＡＣ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子のトリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞、並びに、ＴＲＡＣ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子ノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の製造
（１）実施例２の方法に従ってＣＤ３^＋Ｔ細胞を得て（Ｄ０日）、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体磁気ビーズを用いて活性化し、活性化後のＤ１日にレンチウイルスベクター（ＣＤ１９－ＣＡＲ、ＣＤ２０－ＣＡＲ又はＢＣＭＡ－ＣＡＲなどのレンチウイルス）のトランスフェクションを行い、Ｄ２日にレンチウイルスベクターを洗い流し、Ｄ３日にＣＡＲ陽性のＴ細胞を選別し、Ｄ５日まで培養し続けた。

【0480】

（２）Ｄ５日のＣＡＲ－Ｔ細胞を初期細胞として、それぞれ実施例１４及び実施例１６の方法に従ってＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウト細胞、ＴＲＡＣ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子のトリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞、並びに、ＴＲＡＣ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子のトリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞を製造した。

【0481】

（３）フローサイトメトリー検出によって、上記ダブルノックアウト及びトリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞が得られることができ、そのうち、ダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の収率がトリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高かった。

【0482】

結果は図３３Ａ～図３３Ｄに示された。そのうち、図３３Ａ～図３３Ｃは、順にＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＢ２Ｍタンパク質レベルのノックアウト状況であった。図３３ＤはＣＩＩＴＡタンパク質レベルのノックアウト状況を示した。そのうち、ＷＴはノックアウト処理を一切行っていない場合を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－ＡダブルノックアウトはＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の結果を指し、ＴＲＡＣ＋ＨＬＡ－Ａ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡトリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の結果を指し、そのうちＴＲＡＣ＋Ｂ２Ｍ＋ＣＩＩＴＡトリプルノックアウトはＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＡＣトリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の結果を指す。

【0483】

そのうち、ＣＤ１９ＣＡＲのトランスフェクション効率は図３４に示された。そのうち、ＣＡＲ３０％＋はＣＤ１９ ＣＡＲのトランスフェクション効率を表した。

【0484】

図３５は、異なる細胞の増幅倍率を示した。そのうち、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトのＣＡＲ－Ｔ細胞は最も高い増幅倍数を示した。

【0485】

実施例２１．ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果
実施例２３のＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞を製造し（ＣＤ１９、ＣＤ２０又はＢＣＭＡを標的とする）、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する標的細胞（Ｒａｊｉ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＭ１Ｓなどの標的遺伝子陽性の白血病又はリンパ腫細胞株）をウェルプレートに接種し、更に異なるエフェクター標的比（１：２．５、１：１、５：１、１０：１）でダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞、トリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞又は遺伝子ノックアウト無しのＴ細胞を加え、２４時間共培養した後に細胞を検出用ウェルプレートに移し、ルシフェラーゼ基質を加え、マイクロプレートリーダーにより蛍光値を検出した。殺傷効率＝１－標的細胞とＴ細胞とを共培養する蛍光値／標的細胞を単独培養する蛍光値。

【0486】

結果は、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞に対する腫瘍細胞の殺傷効果が顕著であることが示された。

【0487】

図３６は、ＣＤ１９標的細胞Ｒａｊｉ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの殺傷効果を示し、そのうちＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果が最も顕著であった。そのうち、各Ｅ／Ｔ比で、左から右へ順にＡ～Ｄの図示に対応する結果であった。

【0488】

実施例２２．ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果
ＮＳＧマウスに腫瘍細胞を静脈注射し、腫瘍が成功に確立した後、マウス体内にＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞、トリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞又は遺伝子ノックアウト無しのＴ細胞を再注入し、マウス腫瘍体積をモニターした。

【0489】

ダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞を再注入したマウスは、腫瘍増殖速度が明らかに遅くなった。

【0490】

結果は図３７～図３８に示された。そのうち、図３７はマウスへの投与方法を示し、ｉ．ｖ．は静脈注射を表し、ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＤ１９ ＣＡＲを発現するダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞、トリプルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞を表した。図３８は、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与後のマウス体内腫瘍の体積を示した。そのうち、図３８は左から右へ、生理食塩水、改変されていないＴ細胞、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＲＡＣ、ＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡトリプルノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＡＣトリプルノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ投与した後のマウス体内腫瘍の体積を順に示した。結果から、ＴＲＡＣ遺伝子及びＨＬＡ－Ａ遺伝子のダブルノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞を再注入したマウスは、腫瘍増殖速度が明らかに遅くなることが分かった。

【0491】

以上のようにして、
１．本出願は、高効率ダブルノックアウトＴＣＲ、ＨＬＡ－ＡのＩＬ１３Ｒα２－ＵＣＡＲ－Ｔ細胞を初めて構築し、安全な棚式即時使用型治療剤を実現し、抗腫瘍効果を向上させ、脳神経膠腫などの腫瘍の治療に用いる。

【0492】

２．本出願は、レンチウイルス発現ベクターを提供する。ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰを骨格として、ベクターにカナマイシン耐性を持たせるように、ベクターのアンピシリン耐性遺伝子であるβ－ラクタマーゼをＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼで置換し、インビボでの適用において潜在的脅威を有するＣＭＶプロモーター及びそれに隣接する下流のポリクローナル部位を削除し、プロトベクターからＥＦ１プロモーターにより発現を開始したｃｏｐＧＦＰ遺伝子を削除し、ＳａｌＩ切断部位を保持し、ＳａｌＩ ５’末端にベクター構築用ＳｍａＩ切断部位を付加して目的とする最終ベクターを形成する。

【0493】

３．本出願は、タンパク質ＲＮＡ複合体のエレクトロトランスフェクション技術を最適化する。初代Ｔ細胞における９０％以上のダブルノックアウト効率を得る。

【0494】

４．本出願において、ドナーは集団において高頻度で出現するＨＬＡ－Ｂホモ接合体に基づくものであり、患者ＨＬＡ－Ｂの対立遺伝子の１つがドナーのホモ接合体と一致すればよく、これらのドナー由来の細胞が多数の患者集団をカバーすることができ、且つＨＬＡ－Ｂにより引き起こされる拒絶反応を低減することができる。

【0495】

５．本出願は、拒絶に高度に関連するＨＬＡ－Ａ分子を選別してノックアウトし、他のＨＬＡ－Ｉクラス分子を保持することで、異系細胞による拒絶を低減するだけでなく、ＨＬＡ分子が完全にノックアウトされ、ＮＫ細胞に除去されることを回避し、同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの半減期を大幅に延長する。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図】

【図10C】

【図10D】

【図】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図28D】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図】

【図31】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図33D】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【配列表】

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【国際調査報告】