特表 2024-527546 グランザイム活性化可能な膜相互作用ペプチド及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-25

(54)【発明の名称】グランザイム活性化可能な膜相互作用ペプチド及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20240718BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240718BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20240718BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 51/08 20060101ALI20240718BHJP

【ＦＩ】

C07K7/08 ZNA

C07K19/00

C12N15/11 Z

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12Q1/37

C12Q1/02

A61K51/08 200

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580524

(86)(22)【出願日】2022-06-30

(85)【翻訳文提出日】2024-02-09

(86)【国際出願番号】 US2022035779

(87)【国際公開番号】W WO2023278737

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/216,890

(32)【優先日】2021-06-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】クレイク、 チャールズ エス．

(72)【発明者】

【氏名】バルディン、 コナー

(72)【発明者】

【氏名】エヴァンス、 マイケル

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ13

4B063QQ79

4B063QR16

4B063QR90

4B063QS39

4B063QX07

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C085HH03

4C085HH11

4C085JJ01

4C085KA27

4C085KA29

4C085KB02

4C085KB03

4C085KB05

4C085KB07

4C085KB08

4C085KB09

4C085KB15

4C085KB18

4C085KB19

4C085KB21

4C085KB56

4C085KB82

4C085LL18

4C085LL20

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA41

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、グランザイム活性化可能かつ検出可能な膜相互作用ペプチドであって、活性化後に、細胞膜などのリン脂質二重層と相互作用することができるペプチドを提供する。本開示はまた、そのようなペプチドの使用方法、並びにそのようなペプチドを含む組成物を提供する。本開示のペプチドは、一般構造Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂを有するものであり、式中、Ａは、部分Ｚからの分離後に、リン脂質二重層と相互作用可能な複数の非極性疎水性アミノ酸残基を有する膜相互作用ペプチド領域であり、Ｚは、部分Ａの活性を阻害することができる阻害ペプチド領域であり、Ｘ^２は、切断されて切断産物を化合物から放出することができるグランザイム切断可能なリンカーであり、Ｘ^１ａ及びＸ^１ｂは、様々なカーゴ部分の化合物へのコンジュゲーションを容易にする任意に存在する化学ハンドルである。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ末端からＣ末端又はＣ末端からＮ末端へ、構造
Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂ
を含む、プロ分子であって、
式中、
Ｘ^１ａ及び／又はＸ^１ｂは、存在してもよいか若しくは存在しなくてもよく、存在する場合、求核性部分を含み、
Ａは、膜相互作用ポリペプチド部分であって、部分Ｚから分離されたときに、リン脂質二重層に挿入可能なアルファ－ヘリカル構造を含む、膜相互作用ポリペプチド部分であり、
Ｚは、ポリペプチドであって、部分Ｘ^２を介して部分Ａに連結されたときに、部分Ａとリン脂質二重層との相互作用を阻害するのに有効である、ポリペプチドであり、
Ｘ^２は、グランザイム切断可能なリンカーであり、ここで、Ｘ^２は、部分Ａを部分Ｚに連結し、かつＸ^２は、生理学的条件下で切断され得る、プロ分子。

【請求項2】

Ｚが、アミノ酸配列ＳＦＬＬ（Ｘ^ｚ）ＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号６）を含むポリペプチドであり、式中、Ｘ^ｚは、Ｒ又はＱである、請求項１に記載のプロ分子。

【請求項3】

Ｚが、アミノ酸配列ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号５５）を含む、請求項２に記載のプロ分子。

【請求項4】

Ｚが、アミノ酸配列ＳＦＬＬＱＤＰＮＤＱＹＥＰＦＷ（配列番号５６）を含む、請求項１に記載のプロ分子。

【請求項5】

Ｚが、アミノ酸配列ＱＤＰＮＤＱＹＥＰＦ（配列番号７）を含む、請求項４に記載のプロ分子。

【請求項6】

部分Ｚが、共有結合した水溶性ポリマーを含む、請求項１に記載のプロ分子。

【請求項7】

Ａが、Ｔｅｍｐｏｒｉｎファミリーからのタンパク質を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項8】

Ａが、アミノ酸配列Ｘ^ａＸ^ｂＸ^ｃＸ^ｄＸ^ｅＸ^ｆＹ^ａＸ^ｇＸ^ｈＹ^ｂＹ^＊Ｘ^ｉＸ^ｊを含み、式中、Ｘ^ａ、Ｘ^ｂ、Ｘ^ｃ、Ｘ^ｄ、Ｘ^ｅ、Ｘ^ｆ、Ｘ^ｇ、Ｘ^ｈ、Ｘ^ｉ、及びＸ^ｊが、疎水性アミノ酸残基であり、Ｙ^ａ及びＹ^ｂが、親水性アミノ酸残基であり、Ｙ^＊が、荷電アミノ酸残基である、請求項７に記載のプロ分子。

【請求項9】

Ａが、アミノ酸配列ＦＬＰ（Ｘ^ｋ）ＩＡＳＬＬ（Ｘ^ｌ）ＫＬＬ（配列番号８）を含み、式中、Ｘ^ｋが、Ｉ又はＬであり、Ｘ^ｌが、Ｓ又はＧである、請求項７に記載のプロ分子。

【請求項10】

Ａが、アミノ酸配列ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＲＩＬ（配列番号１）又はＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫＬＬ（配列番号２）を含む、請求項７に記載のプロ分子。

【請求項11】

Ａが、アミノ酸配列ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫ（配列番号３）を含む、請求項７に記載のプロ分子。

【請求項12】

Ｘ^２が、グランザイムＡ、Ｂ、Ｈ、Ｋ、又はＭによって切断可能なリンカーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項13】

Ｘ^２が、グランザイムＢによって切断可能なリンカーである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項14】

Ｘ^２が、アミノ酸配列Ｘ^ｍＸ^ｎＰＤＸ^ｏＳＸ^ｐＸ^ｑを含み、式中、
Ｘ^ｍは、Ｖ、Ｌ、又はＩであり、
Ｘ^ｎは、Ｅであり、
Ｘ^ｏは、Ｆ、Ｓ、又はＶであり、
Ｘ^ｐは、Ｔ又はＱであり、
Ｘ^ｑは、Ｖである、請求項１３に記載のプロ分子。

【請求項15】

Ｘ^２が、アミノ酸配列ＩＥＰＤＶＳＱＶ（配列番号５７）、ＬＴＹＤＦＷＩＱ（配列番号６５）、ＰＱＶＤＬＹＤＫ（配列番号６６）、ＶＶＱＤＫＨＥＩ（配列番号６７）、ＶＹＡＤＳＳＥＷ（配列番号６８）、ＴＭＡＤＳＱＥＳ（配列番号６９）、ＧＨＩＤＨＭＸＸ（配列番号７０）、ＬＥＱＤＶＷＩＡ（配列番号７１）、ＬＤＰＤＮＦＫＲ（配列番号７２）、ＸＸＰＤＦＹＬＧ（配列番号７３）、ＭＧＰＤＡＦＮＬ（配列番号７４）、ＬＫＤＤＭＧＸＸ（配列番号７５）、ＩＷＦＤＹＴＬＫ（配列番号７６）、ＸＩＧＤＮＶＥＷ（配列番号７７）、ＸＸＸＤＱＶＮＬ（配列番号７８）、ＰＱＡＤＱＷＸＸ（配列番号７９）、ＰＳＶＤＭＸＸＸ（配列番号８０）、ＸＮＶＤＷＴＡＰ（配列番号８１）、ＹＧＹＤＬＱＴＡ（配列番号８２）、ＨＧＦＤＥＡＨＮ（配列番号８３）、ＨＳＨＤＳＷＫＡ（配列番号８４）、ＫＱＤＤＬＭＳＥ（配列番号８５）、ＳＦＧＤＩＭＥＭ（配列番号８６）、ＶＮＤＤＶＫＸＸ（配列番号８７）、ＸＸＸＤＫＱＦＴ（配列番号８８）、又はＮＤＶＤＧＧＸＸ（配列番号８９）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１３に記載のプロ分子。

【請求項16】

Ｘ^２が、グランザイムＫによって切断可能なリンカーである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項17】

Ｘ^２が、アミノ酸配列Ｘ^ｒＸ^ｓＦＲＳＸ^ｔＸ^ｕＸ^ｖを含み、式中、
Ｘ^ｒは、Ｅ又はＷであり、
Ｘ^ｓは、Ｆ、Ｙ、又はＡであり、
Ｘ^ｔは、Ｆ、Ｒ、又はＩであり、
Ｘ^ｕは、Ｙ、Ｐ、又はＴであり、
Ｘ^ｖは、Ｗ又はＨである、請求項１６に記載のプロ分子。

【請求項18】

Ｘ^２が、アミノ酸配列ＷＡＦＲＳＲＹＨ（配列番号５８）を含む、請求項１７に記載のプロ分子。

【請求項19】

Ｘ^１ａ、Ｘ^１ｂ、Ａ、又はＺのうちの１つ以上が、Ｄ－アミノ酸を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項20】

Ｘ^１ａが存在し、かつ求核性部分を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項21】

Ｘ^１ｂが存在し、かつ求核性部分を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項22】

Ｘ^１ａ又はＸ^１ｂの前記求核性部分が、チオール官能基を含む、請求項２０又は２１に記載のプロ分子。

【請求項23】

Ｘ^１ａ又はＸ^１ｂが、前記求核性部分を含むアミノ酸残基を含む、請求項２０又は２１に記載のプロ分子。

【請求項24】

前記アミノ酸残基が、システイン残基である、請求項２３に記載のプロ分子。

【請求項25】

前記アミノ酸残基が、リジン残基である、請求項２３に記載のプロ分子。

【請求項26】

Ｘ^１ａ又はＸ^１ｂが、前記求核性部分に共有結合したカーゴ部分を含む、請求項２０又は２１に記載のプロ分子。

【請求項27】

前記カーゴ部分が、検出可能な部分である、請求項２６に記載のプロ分子。

【請求項28】

前記検出可能な部分が、金属キレート部分である、請求項２７に記載のプロ分子。

【請求項29】

前記金属キレート部分が、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）である、請求項２８に記載のプロ分子。

【請求項30】

前記金属キレート部分が、放射性同位体に結合している、請求項２９に記載のプロ分子。

【請求項31】

前記検出可能な部分が、放射性同位体を含む、請求項２７に記載のプロ分子。

【請求項32】

前記放射性同位体が、アクチニウム－２２５、アスタチン－２１１、ビスマス－２１２、ビスマス－２１３、臭素－７６、臭素－７７、カルシウム－４７、炭素－１１、炭素－１４、クロム－５１、コバルト－５７、コバルト－５８、銅－６４、エルビウム－１６９、フッ素－１８、ガリウム－６７、ガリウム－６８、水素－３、インジウム－１１１、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、鉄－５９、クリプトン－８１ｍ、鉛－２１２、ルテチウム－１７７、窒素－１３、酸素－１５、リン－３２、ラジウム－２２３、ラジウム－２２４、サマリウム－１５３、セレン－７５、ナトリウム－２２、ナトリウム－２４、ストロンチウム－８９、テクネチウム－９９ｍ、タリウム－２０１、トリウム－２２６、トリウム－２２７、キセノン－１３３、又はイットリウム－９である、請求項３０又は３１に記載のプロ分子。

【請求項33】

前記放射性同位体が、銅－６４である、請求項３２に記載のプロ分子。

【請求項34】

前記検出可能な部分が、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって検出可能である、請求項２７～３３のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項35】

前記検出可能な部分が、蛍光部分を含む、請求項２７に記載のプロ分子。

【請求項36】

前記蛍光部分が、水溶性蛍光色素である、請求項３５に記載のプロ分子。

【請求項37】

前記水溶性蛍光色素が、シアニン色素である、請求項３６に記載のプロ分子。

【請求項38】

前記シアニン色素が、Ｃｙ７である、請求項３７に記載のプロ分子。

【請求項39】

前記プロ分子が、前記グランザイムの活性を阻害しない、請求項１～３８のいずれか一項に記載のプロ分子。

【請求項40】

請求項１～３９のいずれか一項に記載のプロ分子をコードする、核酸。

【請求項41】

請求項４０に記載の核酸を含む、発現ベクター。

【請求項42】

請求項４０に記載の核酸、又は請求項４１に記載の発現ベクターを含む、細胞。

【請求項43】

組成物であって、
液体媒体中に存在する請求項１～３９のいずれか一項に記載のプロ分子を含む、組成物。

【請求項44】

組成物であって、
請求項１～３９のいずれか一項に記載のプロ分子と、
薬学的に許容され得る担体と、を含む、組成物。

【請求項45】

前記プロ分子が、請求項２８～３８のいずれか一項において定義される検出可能な部分を含む、請求項４３又は４４に記載の組成物。

【請求項46】

キットであって、
請求項４５に記載の組成物と、
インビトロ、インビボ、又はエクスビボでグランザイム活性を検出するために前記組成物を使用するための説明書と、を含む、キット。

【請求項47】

グランザイム活性の存在下で細胞のリン脂質二重層を検出可能に標識する方法であって、
請求項２７～３９のいずれか一項に記載のプロ分子を、前記グランザイム活性に寄与するグランザイムと接触させることを含み、
前記プロ分子の前記切断可能なリンカーが、前記グランザイムによって切断されて、検出可能な部分及び膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、その結果、前記膜相互作用ポリペプチド部分が、前記細胞の前記リン脂質二重層と相互作用し、前記細胞の前記リン脂質二重層をグランザイム活性の存在下で検出可能に標識する、方法。

【請求項48】

前記接触させることが、インビトロ、インビボ、又はエクスビボである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

細胞サンプルにおけるグランザイム活性を評価するための方法であって、
前記サンプルを、請求項２７～３９のいずれか一項に記載のプロ分子と接触させることであって、前記グランザイム活性の存在下で、前記プロ分子が切断されて、前記検出可能な部分及び前記膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、前記切断産物が、前記グランザイム活性の存在下で、細胞のリン脂質二重層と相互作用する、接触させることと、
前記切断産物の前記検出可能な部分の存在又は非存在について評価することであって、
前記検出可能な部分の前記存在が、前記細胞サンプルにおけるグランザイム活性を示す、評価することと、を含む、方法。

【請求項50】

対象におけるグランザイム活性を評価するための方法であって、
前記対象に、請求項２７～３９のいずれか一項に記載のプロ分子を投与することであって、前記対象におけるグランザイム活性の部位において、前記プロ分子が、前記グランザイム活性に寄与するグランザイムによって切断されて、前記検出可能な部分及び前記膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、前記切断産物が、前記対象における前記グランザイム活性の部位における細胞のリン脂質二重層と相互作用する、投与することと、
前記切断産物で標識された細胞の存在又は非存在について評価することと、を含み、
ここで、前記切断産物で標識された細胞の存在は、対象におけるグランザイム活性を示す、方法。

【請求項51】

対象における免疫細胞の活性化について評価する方法であって、前記免疫細胞が、前記対象において活性化されるとグランザイムを分泌し、前記方法は、
前記対象に、請求項２７～３９のいずれか一項に記載のプロ分子を投与することであって、前記対象における活性化された免疫細胞分泌グランザイムの部位において、前記プロ分子が、前記活性化された免疫細胞分泌グランザイムによって切断されて、前記検出可能な部分及び前記膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、前記切断産物が、前記対象における前記活性化された免疫細胞分泌グランザイムの部位において、細胞のリン脂質二重層と相互作用する、投与することと、
前記切断産物で標識された細胞の存在又は非存在について評価することと、を含み、
ここで、前記切断産物で標識された細胞の存在は、前記対象における前記免疫細胞の活性化を示す、方法。

【請求項52】

前記免疫細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、請求項５１又は５２に記載の方法。

【請求項54】

前記免疫細胞分泌グランザイムが、グランザイムＢである、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記免疫細胞分泌グランザイムが、グランザイムＫである、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記対象における免疫細胞活性化について生物学的レベルで評価することを含む、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記対象の標的領域内での免疫細胞活性化について評価することを含む、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

免疫細胞活性化について評価することが、前記対象における免疫細胞活性化の位置を区別することを含む、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

免疫細胞活性化について評価することが、前記対象への前記プロ分子の投与の４時間以上後に行われる、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

免疫細胞活性化について評価することが、複数の時点での免疫細胞活性化について評価することを含む、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記対象が、免疫調節療法を受けている、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記方法が、治療部位において切断産物で標識された細胞の存在又は不在について評価することによって前記免疫調節療法の進行をモニタリングすることを含み、前記切断産物で標識された細胞の存在が、前記治療部位において前記対象における前記免疫細胞の活性化を示す、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記免疫調節療法が、細胞ベースの療法、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路調節、免疫チェックポイント阻害、化学療法、電離放射線、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６１又は６２に記載の方法。

【請求項64】

前記免疫調節療法が、細胞ベースの療法を含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記細胞ベースの療法が、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ）療法を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記細胞ベースの療法が、キメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞（ＣＡＲ ＮＫ細胞）療法を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

前記細胞ベースの療法が、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞の投与を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項68】

前記免疫調節療法が、前記対象におけるがんを治療するためのものであり、免疫細胞活性化について評価することが、前記免疫調節療法に対する応答性について前記対象における腫瘍を評価することを更に含む、請求項６１～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

免疫細胞活性化について評価することが、Ｔ細胞疲弊の存在又は非存在について評価することを含む、請求項５１～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

免疫細胞活性化について評価することが、前記対象における免疫応答について評価することを含む、請求項５１～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

免疫細胞活性化について評価することが、前記対象における感染に対する免疫応答について評価することを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

免疫細胞活性化について評価することが、前記対象におけるウイルス感染に対する免疫応答について評価することを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ウイルス感染が、肺炎を引き起こす、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

免疫細胞活性化について評価することが、前記対象における細菌感染に対する免疫応答について評価することを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項75】

前記細菌感染が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の感染である、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記細菌感染が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の感染である、請求項７４に記載の方法。

【請求項77】

前記細菌感染が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の感染である、請求項７４に記載の方法。

【請求項78】

前記細菌感染が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染である、請求項７４に記載の方法。

【請求項79】

正常組織における全身性免疫細胞活性化の存在が、前記対象に免疫関連の有害作用を発症する危険性があることを示す、請求項７０に記載の方法。

【請求項80】

前記対象が、ヒトである、請求項５０～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記検出可能な部分が、放射性同位体を含む、請求項４７～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記評価することが、前記検出可能な部分をＰＥＴによって検出することを含む、請求項４７～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

カーゴ部分をリン脂質二重層に送達するのに有用なプロ分子を作製する方法であって、
Ｘ^１ａが存在する、請求項１～３９のいずれか一項に記載のプロ分子を合成することと、
カーゴ部分をＸ^１ａの求核性部分に結合させることと、を含み、
ここで、カーゴ部分のリン脂質二重層への送達に有用なプロ分子が生成される、方法。

【請求項84】

前記合成することが、前記プロ分子をコードする発現構築物を含む組換え宿主細胞を培養することを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記合成することが、化学合成によって行われる、請求項８３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２１６，８９０号の利益を主張するものであり、この出願は全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府の支援に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金Ｒ０１ ＥＢ０２５２０７、Ｒ０１ ＣＡ２５８２９７、及びＲ０１ ＡＩ１６１０２７の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

ヒトグランザイムは、宿主防御に関与するリンパ球、すなわち、ナチュラルキラー（ＮＫ）及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の分泌小胞（すなわち、顆粒）内で主に発現される５つのセリンプロテアーゼ（Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｋ、Ｍ）からなる。これらの細胞型では、グランザイムは、問題のある細胞、例えば、がん細胞又は病原体に感染した細胞に対するプロアポトーシスエフェクターであると最もよく理解されている。細胞傷害性を付与するために、リンパ球は、標的細胞とドッキングした後、顆粒酵素を細胞周囲空間に一過性に放出する。グランザイムと共分泌されるのはパーフォリン分子であり、パーフォリン分子は、標的細胞の形質膜にチャネルを形成して、細胞質へのグランザイム輸送を促進する。その後、グランザイム生化学は、いくつかのメカニズム、例えば、カスパーゼのタンパク質分解活性化又は直接ＤＮＡ損傷（グランザイムＢ）、ＳＥＴ媒介ＤＮＡ切断活性化（グランザイムＡ）を介して細胞死を引き起こす。しかしながら、グランザイムが主に細胞毒性エフェクターであるという定説は、分泌されたグランザイムが細胞外にも存在することで非細胞毒性シグナル伝達機能を果たすという、より複雑な生物学的モデルによって覆されつつある。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、一般に、活性化後に細胞膜などのリン脂質二重層と相互作用することができる、グランザイム活性化可能で検出可能な膜相互作用ペプチドを提供する。本開示はまた、そのような化合物の使用方法を提供する。

【0005】

本開示の化合物は、一般構造Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂであり、式中、Ａは、部分Ｚからの分離後にリン脂質二重層と相互作用することができる複数の非極性疎水性アミノ酸残基を有する膜相互作用ペプチド領域であり、Ｚは、部分Ａの活性を阻害することができる阻害ペプチド領域であり、Ｘ^２は、切断されて切断産物を化合物から放出することができるグランザイム切断可能なリンカーであり、Ｘ^１ａ及びＸ^１ｂは、化合物への様々な部分のコンジュゲーションを容易にする任意に存在する化学ハンドルである。組成物をＸ^２で切断する前に、組成物は、有意な又は検出可能なレベルまでリン脂質二重層と会合しないプロ分子（ｐｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）として機能する。切断可能なリンカーＸ^２での切断後、部分Ａを含む切断産物は、リン脂質二重層（例えば、細胞膜）と自由に相互作用し、したがって、切断促進環境に関連する部位に蓄積する。膜関連切断産物の検出は、Ｘ^１ａ及び／又はＸ^１ｂを介して結合した部分の検出によって達成することができる。そのような組成物は、例えば、対象内のグランザイム活性を直接イメージングする際の使用を含む、様々な方法で使用することができる。

【0006】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端又はＣ末端からＮ末端へ、構造Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂを含む、分子であって、式中、Ｘ^１ａ及び／又はＸ^１ｂは、存在してもよいか若しくは存在しなくてもよく、存在する場合、求核性部分を含み、Ａは、膜相互作用ポリペプチド部分であって、部分Ｚから分離されたときに、リン脂質二重層に挿入可能なアルファ－ヘリカル構造を含む、膜相互作用ポリペプチド部分であり、Ｚは、ポリペプチドであって、部分Ｘ^２を介して部分Ａに連結されたときに、部分Ａとリン脂質二重層との相互作用を阻害するのに有効である、ポリペプチドであり、Ｘ^２は、切断可能なリンカーであり、ここで、Ｘ^２は、部分Ａを部分Ｚに連結し、かつＸ^２は、生理学的条件下で切断され得る、分子である。いくつかの実施形態では、部分Ａは、約５～約３０個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、部分Ａは、Ｘ^ａＸ^ｂＸ^ｃＸ^ｄＸ^ｅＸ^ｆＹ^ａＸ^ｇＸ^ｈＹ^ｂＹ^＊Ｘ^ｉＸ^ｊを含み、式中、Ｘ^ａ、Ｘ^ｂ、Ｘ^ｃ、Ｘ^ｄ、Ｘ^ｅ、Ｘ^ｆ、Ｘ^ｇ、Ｘ^ｈ、Ｘ^ｉ、及びＸ^ｊは、疎水性アミノ酸残基であり、Ｙ^ａ及びＹ^ｂは、親水性アミノ酸残基であり、Ｙ^＊は、荷電アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、部分Ａは、アミノ酸配列ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＲＩＬ（配列番号１）、又はその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、部分Ａは、アミノ酸配列ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫＬＬ（配列番号２）、又はその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、部分Ａは、アミノ酸配列ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫ（配列番号３）、又はその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、部分Ａは、アミノ酸配列ＦＦＱＷＦＳＫＦＬＧＫ（配列番号４）、又はその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、部分Ａは、アミノ酸配列ＩＬＧＴＩＬＧＬＬＫＧＬ（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態では、部分Ａは、ジャポニシン－１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、部分Ａは、５個未満の塩基性アミノ酸残基を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、グランザイムによって切断可能である。いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、グランザイムＢによって切断可能である。いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、グランザイムＫによって切断可能である。いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、酵素的に切断可能なリンカーであり、Ｚは、Ｘ^２を切断可能なグランザイムのエキソサイト認識配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、部分Ｚは、共有結合した水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｚは、アミノ酸配列ＳＦＬＬ（Ｘ^ａ）ＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号６）を含み、式中、Ｘ^ａは、Ｒ又はＱである。いくつかの実施形態では、Ｚは、アミノ酸配列ＱＤＰＮＤＱＹＥＰＦ（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは、グランザイムのエキソサイト認識配列のアミノ酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、Ｘ^１ａ、Ｘ^１ｂ、Ａ、又はＺのうちの１つ以上は、Ｄ－アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ^１ａが存在し、かつ求核性部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ^１ｂが存在し、かつ求核性部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ^１ａ又はＸ^１ｂの求核性部分は、チオール官能基を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ^１ａ又はＸ^１ｂは、求核性部分を含むアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、システイン残基である。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、リジン残基である。

【0010】

いくつかの実施形態では、Ｘ^１ａ又はＸ^１ｂは、求核性部分に共有結合したカーゴ部分を含む。いくつかの実施形態では、カーゴ部分は、検出可能な部分である。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、蛍光部分を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、放射性同位体を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記の分子をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、上記の分子と、薬学的に許容され得る担体と、を含む、組成物を提供する。

【0011】

いくつかの実施形態では、本開示は、グランザイム活性の存在下でリン脂質二重層を検出可能に標識する方法であって、上記のような分子を、グランザイム活性に寄与するグランザイムと接触させることを含み、ここで、接触させることが、切断可能なリンカーのグランザイム切断に適した条件下にあるとき、分子が切断されて、リン脂質二重層との相互作用のために膜相互作用ポリペプチド部分を放出し、リン脂質二重層を検出可能に標識する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。

【0012】

いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるグランザイム活性を評価するための方法であって、上記のような分子を対象に投与することであって、上記式中、Ｘ^２がグランザイムによって切断可能であり、グランザイム活性の存在下で、分子が切断されて、検出可能な部分及び膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、切断産物が、グランザイム酵素活性の領域においてリン脂質二重層と相互作用する、投与することと、切断産物の検出可能な標識の存在又は非存在を検出することと、を含み、ここで、検出可能な標識の存在が、グランザイム酵素活性の領域を示す、方法を提供する。いくつかの実施形態では、評価することは、定性的及び／又は定量的であってもよい。

【0013】

いくつかの実施形態では、本開示は、対象における免疫細胞活性化を評価するための方法であって、免疫細胞は、活性化されるとグランザイムを分泌し、該方法は、上記のような分子を対象に投与することであって、上記式中、Ｘ^２は、グランザイムによって切断可能であり、活性化されたグランザイム分泌免疫細胞の存在下で、分子が切断されて、検出可能な部分及び膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、切断産物が、グランザイム分泌免疫細胞活性化の領域においてリン脂質二重層と相互作用する、投与することと、切断産物の検出可能な標識の存在又は不在を検出することと、を含み、ここで、検出可能な標識の存在が、グランザイム分泌免疫細胞活性化の領域を示す、方法を提供する。

【0014】

いくつかの実施形態では、本開示は、カーゴ部分をリン脂質二重層に送達するのに有用な分子を作製する方法であって、上記のような分子を合成することであって、上記式中、Ｘ^１ａが存在する、合成することと、カーゴ部分をＸ^１ａの求核性部分に結合することと、を含み、ここで、カーゴ部分をリン脂質二重層に送達するのに有用な分子が産生される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、合成することは、分子をコードする発現構築物を含む組換え宿主細胞を培養することを伴う。いくつかの実施形態では、合成することは、化学合成によるものである。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A-1F】イメージングを用いてインビボでＧＺＭＢタンパク質分解を測定するための制限付き相互作用ペプチドであるＧＲＩＰ Ｂの開発及びインビトロ特性評価。（Ａ）制限付き相互作用ペプチドの一般化された構造、及びインビボの作用機序を示す概略図。専用のエンドプロテアーゼによる全長プロフォームの切断は、近傍のリン脂質膜と不可逆的に相互作用する、タグ付き（例えば、放射性標識された）抗菌ペプチドを遊離する。したがって、注入後の延長された時点でのペプチドの安定した蓄積（すなわち、秒ではなく時間）は、関心領域における酵素活性の相対的な単位を反映することができる。（Ｂ）ＧＺＭＢ切断配列を同定するためのＭＳＰ－ＭＳ研究のワークフローを示す略図。ＧＺＭＢ活性からのタンパク質分解産物を、２２８個のテトラデカ－ペプチドの物理化学的に多様なライブラリーとともに酵素をインキュベートすることによって産生した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチドシーケンシングは、ＧＺＭＢが生成した切断の決定を可能にした。（Ｃ）ヒトＧＺＭＢに対するＰ４～Ｐ４’基質選好性のＭＳＰ－ＭＳ分析の統合結果を示すｉｃｅＬｏｇｏ。（Ｄ）ＩＥＰＤＶＳＶＱ（配列番号６４）ペプチドのヒトグランザイムＢタンパク質分解のミカエリス・メンテン動態を示すプロット。ＧＺＭＢの非プライム部位及びプライム部位のカバレッジにより、ＩＥＰＤ単独と比較して触媒回転数が約２倍改善された最適化された基質が得られた。（Ｅ）ＧＲＩＰ Ｂの最終アミノ酸配列。膜結合ドメイン（配列番号３）、グランザイムＢ特異的基質（配列番号５７）、ペプチドマスキングドメイン（配列番号７）。（Ｆ）トロンビン、カスパーゼ３、カスパーゼ８、グランザイムＫ、ＭＭＰ９、及びＣ１Ｓと比較した、グランザイムＢに対する基質ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫ（配列番号３）の高い特異性を示すデータ。

【図2A-2D】インビトロ作用機序の研究及び^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの合成。（Ａ）ＧＺＭＢの存在又は非存在下での５ＦＡＭ－ＧＲＩＰ Ｂによる細胞標識の程度を示す平均蛍光強度データ。データを、三連でＭＣ２８細胞を使用して回収した。＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）、全長ＧＲＩＰ Ｂプロペプチド、及びタンパク質分解的に活性化された切断ペプチドでの処理による赤血球溶解の程度を表す棒グラフ。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘは陽性対照として含まれている。（Ｃ）ＤＯＴＡ－ＧＲＩＰ Ｂ前駆体の放射性トレース（青色）とＵＶトレースとのオーバーレイを示すＨＰＬＣトレース。トレースは、反応開始の３０分後に回収した。（Ｄ）４００ｎＭの組換えヒトＧＺＭＢで３０分間インキュベートした後、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂが１つの主要産物に変換されることを示す放射性ＨＰＬＣトレース。

【図3A-3E】 ^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂは、免疫チェックポイント阻害によって誘発されるインビボでのＴ細胞活性化を検出する。（Ａ）皮下ＣＴ２６腫瘍を有する雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおける^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腎クリアランスを示す時間活性曲線。（Ｂ）抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ４ ＣＰＩに曝露したＣＴ２６腫瘍における^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの経時的な蓄積を示す代表的な経軸ＣＴ及びＰＥＴ／ＣＴ画像。また、ビヒクルで処理した腫瘍保有マウスにおける^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの取り込みも示されている。（Ｃ）ビヒクル又はＣＰＩで処置したマウス由来のＣＴ２６腫瘍における^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みを示す、動的ＰＥＴ取得からの時間活性曲線。（Ｄ）処置したマウス対未処置のマウスにおける臓器当たりの^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ取り込みの％変化を示すプロット。（Ｅ）ビヒクル又はＣＰＩに曝露したマウスからのＣＴ２６腫瘍スライス内のＧＺＭＢ及びＴ細胞との^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの共局在を示すデジタルオートラジオグラフィー及び免疫蛍光。

【図4A-4F】インビボで^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ生体内分布は、ＧＺＭＢタンパク質分解活性に依存する。（Ａ）ＧＺＭＢ切断部位にＤ－アミノ酸を有する切断不能な陰性対照トレーサーである^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ（又は^６４Ｃｕ－Ｌ－ＧＲＩＰ Ｂ）及び^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みに対する処置後の効果を要約する棒グラフ。皮下ＣＴ２６、ＭＣ３８、又はＥＭＴ６マウスを有するマウスの３つのコホートを研究した。ＣＴ２６及びＭＣ３８を雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスに移植し、ＥＭＴ６を雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）ビヒクル又はＣＰＩで処置したマウスにおける^６４Ｃｕ－Ｌ－ＧＲＩＰ Ｂ及び^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みを示す、ＭＣ３８コホートからの代表的な経軸ＰＥＴ／ＣＴ及びＣＴ画像。（Ｃ）ビヒクル対ＣＰＩで処置したマウスにおける^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ及び^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂの脾臓取り込みに対する処置後の効果を示す棒グラフ。これらのデータは、ＣＴ２６コホートから取得され、他のマウスコホートで同様の傾向が観察された。＊Ｐ＜０．０１（Ｄ）脾臓切片における^６４Ｃｕ－Ｌ－ＧＲＩＰ Ｂ及び^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂ取り込みの相対強度を示すオートラジオグラフィー及びＨ＆Ｅ。（Ｅ）ビヒクル又はＣＰＩで処置した生殖細胞系ＧＺＭＢ－／－における^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍及び脾臓取り込みに対する処置後の効果をまとめた棒グラフ。この研究のために、ＧＺＭＢ－／－にＣＴ２６腫瘍を接種した。

【図5A-5B】 ^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みにおける処置後の変化は、野生型マウスではＣＰＩに対する体積腫瘍応答の大きさと相関するが、ＧＺＭＢ－／－マウスでは相関しない。（Ａ）１１日目から０日目までの腫瘍体積の倍率変化と^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ腫瘍取り込み（左）又は腫瘍対血液比（右）との間の相関を示す散布図。データを、ＣＴ２６腫瘍を有する野生型マウスの２つのコホートから回収した。（Ｂ）１１日目から０日目までの腫瘍体積の倍率変化と^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ腫瘍取り込み（左）又は腫瘍対血液比（右）との間の相関を示す散布図。データを、ＣＴ２６腫瘍を有するＧＺＭＢ－／－マウスの２つのコホートから回収した。

【図6A-6E】 ^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴは、エンドトキシン媒介炎症応答によって誘発される分泌ＧＺＭＢを検出する。（Ａ）０．１ｍｇ／ｋｇ又は３．０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳで処置したマウスの肺における放射性トレーサー蓄積が、シャム投与したマウスと比較して高いことを示す、代表的な^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴ／ＣＴ研究。（Ｂ）右肺葉の関心領域分析では、ＬＰＳで処置したマウスの放射性トレーサー取り込みが、シャム処置したマウスに比べて有意に高いことが示される（ｎ＝３／アーム）。＊Ｐ＜０．０１（Ｃ）右肺葉のオートラジオグラフィー、免疫蛍光、及びＨ＆Ｅは、処置した肺におけるより高いトレーサー蓄積、並びにより高いＧＺＭＢ及びＣＤ３染色を示す。（Ｄ）ＬＰＳ対シャム処置マウス（ｎ＝４／アーム）の間の臓器当たりの放射性トレーサー取り込みのパーセント変化を示す棒グラフ。全ての変化は、統計的に有意であると決定され、Ｐ＜０．０５であった。（Ｅ）３．０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳによる処置に起因するトレーサー生体内分布のシステム全体の変化を示す代表的な最大強度予測。

【図7A-7B】 ^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴ／ＣＴは、皮下ＲＡＪＩ腫瘍を有するマウスにおける細胞ベースの療法で使用される活性化ＣＡＲ Ｔ細胞から分泌されるグランザイムを検出する。描写されるデータは、注入から４時間後に集められた画像及び関心領域（ＲＯＩ）分析を示す。

【図8A-8C】 ^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴ／ＣＴは、肝臓に同所性ＲＡＪＩ腫瘍を有するマウスにおける細胞ベースの療法において使用される活性化ＣＡＲ Ｔ細胞から分泌されるグランザイムを検出する。描写されるデータは、注入から４時間後に集められた画像及び関心領域分析を示す。ＲＯＩ及び死後線量測定は、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔが、腫瘍を有する肝臓において^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ取り込みを誘導することを示す。

【図9A-9C】 ^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴは、肺炎モデルにおける生産的な免疫応答を検出することができる。（Ａ）及び（Ｂ）マウスは、ウイルス又はシャムの鼻腔内滴下を受け、感染から１０日後（肺へのＴ細胞のリクルートメントがピークに達する時点）に６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂでイメージングした。感染した肺における放射性トレーサー取り込みは非常に高く、放射性トレーサー注入から６時間後の健康な肺とは有意に異なる。（Ｃ）臓器当たりの相対的な放射性トレーサー取り込みは、生体分布研究において、ウイルス感染が、脾臓、肝臓、及び血液プールを含む多数の組織においてより高い放射性トレーサー取り込みを誘導することを示した（＊Ｐ＜０．０１）。

【図10A-10B】 ^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂは、細菌感染と闘おうとする活性化免疫細胞から分泌されるグランザイムＢを検出することができる。

【図11A-11B】生殖細胞系ＧＺＭＢノックアウトマウスにおけるイメージング研究は、Ｅ．Ｃｏｌｉ膿瘍における放射性トレーサー取り込みがグランザイムＢによるものであることを実証する。

【図12A-12B】生きたＥ．ｃｏｌｉ膿瘍は、より大きな放射性トレーサー取り込みを誘導し、エンドトキシンＬＰＳのボーラスよりも有意に免疫刺激性が高い。

【図13A-13B】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に応答する^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの蓄積は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染で観察されたものと類似している。放射性トレーサー取り込みは、注射後０～６時間から急速に上昇し、６～２４時間からプラトーになり、生菌膿瘍における取り込みは、加熱死菌膿瘍における取り込みよりも有意に高かった。

【図14A-14F】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを用いて行った筋炎研究は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ．ａｕｒｅｕｓ感染と同様の所見を示した。

【図15A-15D】Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ及びＬ．ｍｏｎｏｃｔｙｏｇｅｎｅｓは、加熱死菌対照と比較して、生菌膿瘍において^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ取り込みを誘導しない。

【0016】

定義
本明細書において互換的に使用される「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、遺伝的にコードされたアミノ酸及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、並びに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基の有無にかかわらず、異種及び相同のリーダー配列を有する融合タンパク質、免疫学的にタグ付けされたタンパク質などを含むが、これらに限定されない、融合タンパク質を含む。

【0017】

「膜相互作用ペプチド」という用語は、複数の非極性疎水性アミノ酸残基を有するペプチド分子を指し、本明細書に記載の部分Ｚによる拘束を受けない場合、細胞膜などのリン脂質二重層と相互作用可能なアルファ－ヘリカル構造を含む。そのような二次構造は、膜相互作用ペプチドのリン脂質二重層への挿入前、挿入中、又は挿入後に現れ得る。本明細書に記載の膜相互作用ペプチドの組成物は、非極性疎水性アミノ酸残基に厳密に限定されず、そのようなペプチドは、異なるタイプのアミノ酸残基、例えば、極性非荷電アミノ酸残基、極性塩基性アミノ酸残基、又は極性酸性アミノ酸残基も含み得る。

【0018】

「抗菌ポリペプチド」という用語は、細胞膜と相互作用する能力に基づいて、その天然の形態で抗菌活性を示す天然に存在するペプチドに由来する、膜相互作用ペプチドのタイプを指す。本明細書で使用される「抗菌ポリペプチド」という用語は、そのように記載されているポリペプチドが抗菌活性を有することを必要としたり、暗示したりするものではないことが理解される。リン脂質膜と自発的に相互作用し、リン脂質膜に挿入する可能性があることを示した任意のペプチドが、このカテゴリーに含まれる。例えば、天然に存在する膜貫通タンパク質から膜相互作用ペプチドを自発的に挿入することが適用され得る。抗菌ポリペプチドは、当該技術分野で周知であり、例えば、タンパク質のｔｅｍｐｏｒｉｎ（テンポリン）ファミリー内のポリペプチドを含む。

【0019】

本明細書で使用される「プロ分子」という用語は、分子の個々の部分が一緒に連結されているため、その活性が制限され、したがって、個々の部分が互いに連結されていないときに有することができる活性を制限又は限定する分子を指す。プロ分子の個々の部分の活性は、個々の部分を一緒に保持している結合の切断又は破壊時に解放される。本開示のプロ分子は、グランザイムの活性を阻害しない。

【0020】

「酵素活性化」という用語は、その挙動が酵素によって修飾される分子を指す。多くの活性化酵素は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）において、ヒドラーゼＥＣ３．１～ＥＣ３．１３又はペプチダーゼＥＣ３．４～３．９９のクラスに該当する。例示的な酵素活性としては、エーテル、ペプチド、炭素－窒素、酸無水物、炭素－炭素、ハロゲン化物、リン－窒素、硫黄－窒素、炭素－リン、硫黄－硫黄、炭素－硫黄型の結合に作用するものが挙げられる。

【0021】

「非標準アミノ酸」という用語は、ポリペプチド内の天然に存在するアミノ酸残基の代わりにポリペプチドのペプチド骨格に組み込むことができる天然に存在するアミノ酸分子以外の任意の分子を意味する。そのような非標準アミノ酸の非限定的な例としては、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、又は他のものが挙げられる。

【0022】

「修飾アミノ酸」という用語は、翻訳後修飾などの化学的又は生化学的修飾を受けた任意の天然に存在するアミノ酸を意味する。修飾アミノ酸の非限定的な例としては、メチル化アミノ酸、（例えば、メチルヒスチジン、メチル化リジン）アセチル化アミノ酸、アミド化アミノ酸、ホルミル化アミノ酸、ヒドロキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は他のものが挙げられる。

【0023】

本明細書で使用される場合、「ホモログ」又は「バリアント」は、それらのアミノ酸配列に基づいて類似しているタンパク質配列を指す。ホモログ及びバリアントには、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって天然に存在する配列と異なるタンパク質が含まれる。

【0024】

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の化学特性を有する別のアミノ酸残基に対するアミノ酸残基の置換を意味する。

【0025】

本明細書で使用される「治療」という用語は、対象を苦しめている疾患又は症状に関連する症候が少なくとも改善されることを意味し、その場合、改善とは、治療されている疾患又は症状に関連するパラメーター、例えば、症候の大きさの少なくとも軽減を指す。したがって、治療には、症状、又は少なくともそれに関連する症候が軽減又は回避される状況が含まれる。

【0026】

本開示全体を通して、一文字又は三文字のコードに従ったアミノ酸への言及がなされることが理解されよう。読者の便宜のために、一文字及び三文字のアミノ酸コードを以下に提供する。加えて、以下に提供するアミノ酸残基は、それらの化学特性に基づいてカテゴリーに分けられる。以下の表に示される見出し（非極性、疎水性；極性、非荷電性；極性、酸性；及び極性、塩基性）は、特定された化学的性質を有するアミノ酸残基を一般に指すために使用される。

【表1】

【0027】

「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はそれらのアナログを指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直鎖状及び環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、及びプライマーが挙げられる。

【0028】

「異種」という用語は、異なる供給源に由来し得る構造によって定義される２つの成分を指す。例えば、「異種」がポリペプチドの文脈で使用される場合、該ポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来し得る作動可能に連結されたアミノ酸配列（例えば、第１のポリペプチドからの第１のアミノ酸配列及び第２のポリペプチドからの第２のアミノ酸配列）を含む。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈における「異種」には、異なる遺伝子に由来し得る作動可能に連結された核酸配列（例えば、本明細書に開示される実施形態によるペプチドの第１の部分をコードする核酸からの第１の成分及び本明細書に開示されるペプチドの第２の部分をコードする核酸からの第２の成分）が含まれる。

【0029】

アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列（例えば、抗菌ペプチドに由来するポリペプチド）の文脈における「由来」とは、ポリペプチド又は核酸が参照ポリペプチド又は核酸の配列に基づく配列を有することを示すことを意味し、タンパク質又は核酸が作製される供給源又は方法に関して限定することを意味しない。

【0030】

「作動可能に連結された」という用語は、所望の機能を提供するための分子間の機能的連結を指す。例えば、ポリペプチドの文脈における「作動可能に連結された」とは、ポリペプチドの記載された活性を提供するための（例えば、異なるドメインの）アミノ酸配列間の機能的連結を指す。核酸の文脈における「作動可能に連結された」とは、転写、翻訳などの所望の機能を提供するための核酸間の機能的連結、例えば、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、シグナル配列、又は転写因子結合部位のアレイ）と第２のポリヌクレオチドとの間の機能的連結であって、発現制御配列が第２のポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳に影響を与える、機能的連結を指す。

【0031】

ポリペプチドの構造の文脈において本明細書で使用される場合、「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」は、それぞれ、ポリペプチドの末端のアミノ末端及びカルボキシル末端を指し、一方、「Ｎ末端方向」及び「Ｃ末端方向」は、それぞれ、ポリペプチドのアミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端に向かう相対的な位置を指し、それぞれ、Ｎ末端及びＣ末端の残基を含み得る。「隣接Ｎ末端」又は「隣接Ｃ末端」は、第１及び第２のアミノ酸残基が共有結合して連続したアミノ酸配列を提供する、第２のアミノ酸残基に対する第１のアミノ酸残基の位置を指す。

【0032】

「単離された」とは、天然に存在する場合、それが天然に存在し得る環境とは異なる環境にある、目的のタンパク質（例えば、膜相互作用ペプチド）を指す。「単離された」とは、目的のタンパク質が実質的に濃縮されている、かつ／又は目的のタンパク質が部分的若しくは実質的に精製されているサンプル内のタンパク質を含むことを意味する。タンパク質が天然に存在しない場合、「単離された」とは、タンパク質が、合成又は組換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されたことを示す。

【0033】

「濃縮された」とは、サンプルが（例えば、実験者若しくは臨床医によって）非自然的に操作されていることであって、目的のタンパク質が、生物学的サンプル（例えば、そのタンパク質が天然に存在するか、若しくはそれが投与後に存在するサンプル）、又はそのタンパク質が作製されたサンプル（例えば、細菌タンパク質など）などの出発サンプル中のタンパク質の濃度よりも高い濃度で存在することを意味する。

【0034】

「実質的に純粋な」とは、ある実体が組成物の全含有量（例えば、組成物の全タンパク質）の約５０％超、又は全タンパク質含有量の約６０％超を占めることを示す。例えば、「実質的に純粋な」ペプチドとは、全組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又はそれ以上が、全タンパク質の目的の実体（例えば、９５％、９８％、９９％、９９％超）である組成物を指す。タンパク質は、組成物中の全タンパク質の約９０％超、又は約９５％超を占めることができる。

【0035】

「結合」という用語は、塩橋及び水橋などの相互作用を含む、共有結合、静電結合、疎水結合、及びイオン結合及び／又は水素結合相互作用による、２つの分子間の直接会合を指す。

【0036】

本明細書で使用される「求核性部分」という用語は、求核性反応性基を含む官能基を指す。求核性反応性基は、求電子剤と反応することができる少なくとも１対の自由電子を含む。求核性部分の例としては、硫黄求核剤、例えばチオール、チオレートアニオン、チオールカルボキシレートのアニオン、ジチオカーボネートのアニオン、及びジチオカルバメートのアニオン；酸素求核剤、例えば水酸化物アニオン、アルコール、アルコキシドアニオン、及びカルボキシレートアニオン；窒素求核剤、例えばアミン、アジド、及び硝酸塩、並びに炭素求核剤、アルキル金属ハロゲン化物及びエノールが挙げられる。

【0037】

本明細書で互換的に使用される「患者」又は「対象」という用語は、ヒト又は非ヒト動物、例えば、ヒト、霊長類、家畜及び農場動物、並びに動物園、スポーツ、実験室、又はペット動物、例えばウマ、ウシ、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含む哺乳動物を指すことができる。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本開示の本開示をより詳細に説明する前に、方法及び組成物は、記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、当然、そのようなものは変化し得ることを理解されたい。また、方法及び組成物の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。

【0039】

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値、及びこの記載の範囲内の任意の他の記載される値又は中間値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、個別により小さい範囲に含まれてもよく、記載の範囲において任意の具体的に除外された限界に従って、同様に本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。

【0040】

本明細書では、数値の前に「約」という用語が付けられて、特定の範囲が提示される。本明細書では、「約」という用語は、それが先行する正確な数、並びにその用語が先行する数に近い、又は近似する数について文字通りの支持を提供するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近いか、又は近似するかどうかを判定するとき、その近い又は近似する列挙されない数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙されている数の実質的な等価物を提供する数であり得る。

【0041】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の発明と類似又は同等の任意の発明も、本発明の実施又は試験に使用され得るが、代表的な例示的な方法及び材料が、以下に記載される。

【0042】

本明細書で引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用する材料及び／又は方法に関連して開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの刊行物の引用も、出願日以前のその開示に対するものであり、提示された刊行物の日付は、別個に確認する必要があり得る実際の公開日と異なる可能性があるため、本発明がそのような刊行物に先立する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0043】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、あらゆる任意選択的要素を除外するように起草され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求要素の列挙に関連した「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」及び「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語の使用のための、又は「消極的な」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。

【0044】

明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態では組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に又は任意の適切なサブコンビネーションで提供され得る。実施形態の全ての組み合わせが本開示によって具体的に包含され、そのような組み合わせが操作可能なプロセス及び／又は組成物を包含する限り、各々及び全ての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、そのような可変部を説明する実施形態に列挙されている全てのサブコンビネーションもまた、本発明によって具体的に包含され、各々及び全てのそのようなサブコンビネーションが本明細書に個別にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。

【0045】

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明及び例証される個々の実施形態の各々は、本方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、又は組み合わせられ得る個別の要素及び特徴を有する。任意の列記された方法は、記載されたイベントの順序で、又は論理的に可能な他の順序で実施され得る。

【0046】

概要
本開示は、一般に、特定の生物学的活性、例えばタンパク質分解に関連する対象の領域を同定するために使用することができる活性化可能で検出可能な膜相互作用ペプチドを提供する。活性化後、本開示のプロ分子は、細胞膜などのリン脂質二重層と相互作用し、リン脂質二重層に挿入するアルファ－ヘリカル構造を形成することができる。本開示はまた、そのような化合物の使用方法を提供する。

【0047】

本開示の化合物は、例えば、グランザイム活性の評価に関する方法で使用される。例えば、酵素グランザイムによって切断可能な部分Ｘ^２を有する活性化可能な膜相互作用ペプチドを対象に投与することができる。この例では、この分子を対象のグランザイム活性領域に曝露すると、Ｘ^２での切断が起こり、部分Ａを含有する切断産物を生成し、この切断産物はグランザイム活性領域でリン脂質二重層に挿入可能である。リン脂質二重層におけるこの切断産物の検出は、部分Ｘ^１ａを介して部分Ａに結合した検出可能な部分をイメージングするために、グランザイム活性に関連していると疑われる組織をイメージングすることによって達成することができる。対象におけるグランザイム活性の存在はまた、部分Ｘ^１ｂとして結合した部分によって促進され得る部分Ｚを含有する切断産物の検出によって、定性的及び／又は定量的に評価することができる。

【0048】

本開示の組成物は、例えば、対象内の活性凝固、感染、又は悪性腫瘍の直接イメージングする際の使用を含む、様々な方法において使用され得る。

【0049】

制限付き相互作用ペプチド
本開示のプロ分子は、Ｎ末端からＣ末端又はＣ末端からＮ末端へ、一般構造
Ａ－Ｘ^２－Ｚ
を有し、
式中、
Ａは、複数の非極性疎水性アミノ酸残基を有する膜相互作用ペプチド領域であって、組成物からの切断後に、リン脂質二重層と相互作用可能なアルファ－ヘリカル構造を含む、膜相互作用ペプチド領域であり、
Ｚは、阻害ペプチド領域であって、部分Ａの活性を阻害することができ、いくつかの実施形態では、プロ分子と特定の酵素との標的相互作用を促進することができる、阻害ペプチド領域であり、
Ｘ^２は、グランザイム切断可能なリンカーであって、化合物から切断産物を放出するために切断することができる、グランザイム切断可能なリンカーである。

【0050】

Ｘ^２における組成物のグランザイム媒介切断の前に、組成物は、リン脂質二重層と有意に又は検出可能に会合しないプロ分子として機能する。Ｘ^２のグランザイム媒介切断は、部分Ａを含む切断産物及び部分Ｚを含む切断産物の形成をもたらす。Ｘ^２のグランザイム媒介切断の後、部分Ａを含む切断産物は、今や部分Ｚによって拘束されず、リン脂質二重層（例えば、細胞膜）と自由に相互作用し、したがって、切断促進環境に関連する部位に蓄積する（図１のパネルＡ）。

【0051】

いくつかの実施形態では、本開示のプロ分子は、Ｎ末端からＣ末端又はＣ末端からＮ末端へ、一般構造
Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂ
を有し、
式中、
Ａ、Ｘ^２、及びＺは、上記のとおりであり、
Ｘ^１ａ及びＸ^１ｂは、様々な部分の化合物へのコンジュゲーションを容易にする任意に存在する化学ハンドルである。

【0052】

部分Ａ又は部分Ｚを含む切断産物の検出は、化学ハンドルＸ^１ａ又はＸ^１ｂを介して結合した検出可能な部分の検出によって、又は他の方法、例えば、切断産物のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を使用した検出によって達成することができる。

【0053】

本開示の化合物及び方法の様々な特徴を以下により詳細に説明する。

【0054】

インタクト構造Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂの全長は、所与の分子を組み立てるために使用される個々の部分のサイズに基づいて変化し得る。いくつかの実施形態では、インタクト構造の全体のサイズは、長さが最大約１５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、インタクト構造の全長は、長さが、最大約２０個、最大約３０個、最大約４０個、最大約５０個、最大約６０個、最大約７０個、最大約８０個、最大約９０個、最大約１００個、又は最大約１１０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、インタクト構造の全長は、長さが約１５～約２０個、約２０～約３０個、約３０～約４０個、約４０～約５０個、約５０～約６０個、約６０～約７０個、約７０～約８０個、約８０～約９０個、約９０～約１００個、又は約１００～約１１０個のアミノ酸であり得る。インタクト構造の全長は、約１１５個以下のアミノ酸の長さである。

【0055】

インタクト構造Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂは、本明細書では「プロ分子」と称されてもよい。プロ分子の部分Ａは、プロ分子中に部分Ｚが存在するため、リン脂質二重層と有意に相互作用しない。理論に縛られることなく、部分Ｚは、部分Ａと部分Ｚが部分Ｘ^２によって一緒に連結されるときに、部分Ａがアルファ－ヘリカル構造を形成するのを防ぐことによって、部分Ａのリン脂質二重層相互作用特性を阻害する。Ｘ^２の切断後、部分Ｚは部分Ａから分離され、部分Ａを含む切断産物が、少なくとも部分Ａがアルファ－ヘリカル構造のような規則的な構造を形成することができるようなコンフォーメーション変化を受けることを可能にする。アルファ－ヘリカル構造では、部分Ａは、例えば、リン脂質二重層に挿入することによって、リン脂質二重層と自発的に相互作用する。

【0056】

当業者であれば、本開示のプロ分子は、例えば、切断を提供する条件が異なるグランザイム切断可能なリンカーを提供することによって、様々な設定での使用に適合させることができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、プロ分子は、Ｎ末端からＣ末端又はＣ末端からＮ末端の構造であるＡ－Ｘ^２－Ｚを有する。いくつかの実施形態では、プロ分子は、Ｎ末端からＣ末端又はＣ末端からＮ末端の構造であるＸ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚを有する。いくつかの実施形態では、プロ分子は、Ｎ末端からＣ末端又はＣ末端からＮ末端の構造であるＡ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂを有する。いくつかの実施形態では、プロ分子は、Ｎ末端からＣ末端又はＣ末端からＮ末端の構造であるＸ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂを有する。本明細書に開示されるように、部分Ｘ^１ａ、Ａ、Ｘ^２、Ｚ、及びＸ^１ｂの様々な実施形態は、上記の特徴のうちのいずれかを有する分子を形成するために自由に交換され得る。いくつかの実施形態では、検出感度又は薬理学的特性を増強するために、Ｘ^１ａ又はＸ^１ｂの複数のコピーを組み込んでもよい。

【0057】

制限付き相互作用ペプチドの特性
上記のように、本開示のプロ分子は、一般構造Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^１ｂを有する。膜相互作用部分（部分Ａ）が活性化前に細胞膜と相互作用するのを防止するために、プロ分子は、７以下の等電点（ｐＩ）を有するように設計される。等電点とは、ペプチド分子上の正味電荷がゼロであるｐＨである。本開示の全長プロ分子のｐＩは、プロ分子を構成する個々の部分Ｘ^１ａ、Ａ、Ｘ^２、Ｚ、若しくはＸ^１ｂのうちの１つ以上のｐＩを調整することによって、又は化合物のいずれか若しくは全ての部分を化学修飾することによって（例えば、リン酸化若しくは硫酸化により追加の負電荷を付与することによって）調節され得る。

【0058】

ペプチドのｐＩは、ペプチドの全体の正味電荷を変化させるために、アミノ酸残基を置換、排除、又は導入することによって調節することができる。ペプチドの正味電荷を減少させると、そのｐＩ値が低下する。例えば、１つ以上の正に荷電したアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｒ、若しくはＨ）を除去したり、又はそのような残基を荷電していない若しくは負に荷電した残基で置き換えたりすると、ペプチドのｐＩ値が低下する。

【0059】

所与のペプチドのｐＩは、ｐＩ推定用のコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用することによって容易に決定することができる。そのようなコンピュータアルゴリズムは、インターネットを介して一般に容易に利用可能であり、そのアミノ酸配列に基づいてペプチドの理論的なｐＩ値を決定することができる。本開示のプロ分子は、７以下の理論上のｐＩ値を有するように設計される。

【0060】

本開示のプロ分子は、一般に、好ましくは、約ゼロ以下の全体の正味電荷を有するように設計される。これは、例えば、部分Ａ若しくは部分Ｚのポリペプチド配列中の種々のアミノ酸残基を置換、除去、若しくは導入することによって、又は部分Ｚに荷電部分を導入することによって、プロ分子の全体の電荷を中和することによって達成され得る。他のアミノ酸残基又は化学的部分の電荷を中和するために導入される荷電アミノ酸残基又は部分は、電荷相殺効果を最大にするために、可能な限り互いに近接して、例えば、約４０オングストローム以下の距離で配置される。いくつかの実施形態では、本開示のプロ分子は、例えば、リン脂質膜に膜相互作用セグメントが自発的に挿入する傾向が制限されている場合、全体の電荷が約ゼロ以下である必要はない。

【0061】

本開示のプロ分子に任意選択でコンジュゲートされたカーゴ部分は荷電されていてもよく、したがって、プロ分子のｐＩ値及び全体の正味電荷に影響を及ぼし、したがって膜相互作用活性の制限に影響を及ぼすことができる。プロ分子に添加された特定のカーゴ部分上の電荷は、一般に、それがコンジュゲートされるプロ分子の全体の正味電荷を相殺又は中和し、全体のｐＩを７以下の値に低下させる。例えば、＋１の全体の正味電荷を有するプロ分子は、－１の電荷を有する検出可能な部分にコンジュゲートして、ゼロの全体的な正味電荷を有する分子を生成することができる。Ｃｙ３、Ｃｙ５、及びＣｙ７を含むシアニン色素ファミリーのものなどの水溶性蛍光色素は、２つの負に荷電した硫酸基及び第３級アミン基からの両性イオン性の性質であるために、この点で特に有用である。放射性同位体のガリウム－６８又はテクネチウム－９９ｍに結合することができる１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）又はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などの金属キレート部分もまた両性イオンであり、複数の正及び負に荷電した部分を有する。ＤＯＴＡ又はＤＴＰＡへの金属結合は、アミン基を通して生じ、したがって、これらの実体は最大－４の電荷を付与することを可能にする。

【0062】

部分Ａがリン脂質二重層と相互作用するのを阻害又は防止する部分Ｚの能力は、部分Ｚの全長を変更することによって調節することもできる。これは、例えば、部分Ｚにアミノ酸残基を付加することによって、又は部分Ｚに水溶性ポリマーなどの分子をコンジュゲートすることによって行うことができる。いくつかの実施形態では、負に荷電したアミノ酸又はリン酸塩若しくは硫酸塩部分などの類似の化学的修飾が部分Ｚに添加される。いくつかの実施形態では、部分Ｚの長さを増加させ、活性化前に部分Ａが細胞膜と相互作用するのを阻害する能力を増強するために、ポリエチレングリコールが部分Ｚにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、全タンパク質（例えば、アルブミン）が、部分Ｚにコンジュゲートされてもよい。ある特定の実施形態では、部分Ｚにコンジュゲートされるポリマー又はタンパク質は、プロ分子の循環半減期を増加させ得る。いくつかの実施形態では、本開示のプロ分子は、分岐、デンドリマー、又はそうでなければ多価アーキテクチャを有するポリマーにコンジュゲートされ得る。

【0063】

部分Ａ－膜相互作用ペプチド
本開示の膜相互作用ペプチドは、例えば、水よりも低い誘電率を有する環境に接触すると、アルファ－ヘリカル構造を形成することができるアミノ酸配列を含む。Ｘ^２のグランザイム媒介切断後、部分Ａを含む切断産物は、切断促進環境の近傍でリン脂質二重層に挿入可能なアルファ－ヘリカル構造を含む。理論に縛られることなく、部分Ａのアルファ－ヘリカル構造は、切断前に分子中に存在し得るが、部分Ｚによる制約のために、リン脂質二重層に挿入することができない。部分Ａ及び／又は部分Ｚの存在は、部分Ａが、リン脂質二重層への有意な又は検出可能な挿入を可能にするのに十分なアルファ－ヘリカル構造を形成しないように、部分Ａを拘束する。

【0064】

アルファヘリックスは、タンパク質の二次構造における共通のモチーフであり、一般に、水素結合によって安定化される右利きのコイル状又はらせん状の立体構造を含み、この場合、第１のアミノ酸残基のＮ－Ｈ基が、ポリペプチド鎖内の４残基離れた場所に位置するアミノ酸残基のＣ＝Ｏ基と水素結合を形成する。典型的なアルファヘリックスは、ヘリックス１ターン当たり約３．６個のアミノ酸残基を含み、密集した構造をしている。アルファヘリックスを構成するアミノ酸残基の側鎖は、ヘリックスの外側を向いている。異なるアミノ酸配列は、アミノ酸側鎖の異なる化学特性に一部起因して、アルファヘリックスを形成するための異なる傾向を有する。

【0065】

上記のように、本開示のプロ分子は、一般に、膜相互作用ペプチド部分Ａを含む。部分Ａは、天然に存在するポリペプチドに由来し得るか、又は天然に存在するポリペプチドのバリアントであり得る。部分Ａの全長は、例えば、約５～約１０個のアミノ酸であり得るか、又は最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個、又は最大約３０個のアミノ酸であり得る。部分Ａのサイズは、長さが約５～約１０個のアミノ酸の範囲であり得るか、長さが約１０～約１５個、約１５～約２０個、約２０～約２５個、又は約２５～約３０個のアミノ酸であり得る。部分Ａの長さは約３５個以下のアミノ酸残基である。

【0066】

膜相互作用ペプチドは、一般に、複数の非極性疎水性アミノ酸残基（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、又はプロリン）を含むが、極性非荷電性、極性酸性、及び／又は極性塩基性アミノ酸残基などの他のタイプのアミノ酸も含み得る。一般に、本開示の膜相互作用ペプチドは、５個未満の極性塩基性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、部分Ａのアミノ酸配列は、１～２個の連続した極性非荷電性、極性酸性、又は極性塩基性残基の領域が点在する２～３個の連続した非極性疎水性アミノ酸残基の複数の領域を含む。Ｘ^２の切断後、部分Ａは立体構造変化を受け、典型的には、細胞膜（例えば、真核生物、原核生物若しくは古細菌生物の細胞内に存在する膜、又は合成ポリマーを含む様々な組成の界面活性剤ミセル若しくはリポソームの人工膜）と容易に相互作用するアルファ－ヘリカル構造を形成する。

【0067】

抗菌ペプチド
膜相互作用を介してその効果を誘発する抗菌ペプチドは、当該技術分野で周知であり、ヨーロッパアカガエル（Ｒａｎａ ｔｅｍｐｏｒａｒｉａ）種に属するカエルの皮膚から天然に得ることができるタンパク質のｔｅｍｐｏｒｉｎファミリーなどの例を含む。抗菌ペプチドは、一般に、約３０未満のアミノ酸残基を含み、生理学的条件下で、細胞膜のリン脂質二重層との相互作用を促進する非極性疎水性アミノ酸残基を有するアルファ－ヘリカル構造を含む。そのような相互作用は、一般に、構造化された樽板孔から広範に定義された洗剤様挙動に及ぶタイプを含み得る。本開示のいくつかの実施形態では、天然に存在する抗菌ペプチドのアミノ酸配列が、膜相互作用ペプチドとして利用される。他の実施形態では、天然に存在する抗菌ペプチドに対する修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸残基の除去、導入、若しくは置換、ジスルフィド結合などの化学修飾の付加、又は他の化学修飾（例えば、アミド化）を含む膜相互作用ペプチドが、膜相互作用ペプチドとして利用される。他の実施形態では、ペプチド配列は、自発的な膜相互作用及び／又は挿入が可能であるが、膜破壊活性とは関連していない。

【0068】

抗菌ペプチドの例が以下に提供される。

【0069】

膜相互作用ペプチドへの修飾
抗菌ペプチド又はその一部は、それらの天然に存在する形態で本開示の化合物に組み込まれてもよく、又はそれらの化学特性を変化させ、そのようなものを所望の用途に適合させるために修飾されてもよい。例えば、抗菌ペプチドの膜相互作用能は、例えば、タンパク質配列中の特定のアミノ酸残基を付加、除去、又は置換することによって、強化又は弱化され得る。そのような付加、除去、又は置換は、例えば、荷電アミノ酸残基を導入するため、荷電アミノ酸残基を排除するため、疎水性アミノ酸残基を導入するため、疎水性アミノ酸残基を除去するためなどに行うことができる。

【0070】

いくつかの実施形態では、抗菌ペプチド配列は、ジスルフィド結合又は他の化学修飾（例えば、アミド化）でペプチドを化学的に修飾することによって変更され得る。多くの抗菌ペプチドは、リン脂質膜との相互作用の効力及びタンパク質分解に対する耐性を改善するために、そのような修飾を伴って天然に産生される。

【0071】

Ｔｅｍｐｏｒｉｎ
いくつかの実施形態では、部分Ａは、Ｔｅｍｐｏｒｉｎファミリー由来のタンパク質を含む。Ｔｅｍｐｏｒｉｎファミリーにおけるタンパク質は、一般に、長さが約１０個～約１４個のアミノ酸の範囲である。各位置に見出される最も豊富なアミノ酸を示すタンパク質のＴｅｍｐｏｒｉｎファミリーのコンセンサス配列は、ＦＬＰ（Ｉ／Ｌ）ＩＡＳＬＬ（Ｓ／Ｇ）ＫＬＬ（配列番号８）である。各位置に見出される一般的なアミノ酸タイプを示すタンパク質のＴｅｍｐｏｒｉｎファミリーのコンセンサス配列は、Ｘ^ａＸ^ｂＸ^ｃＸ^ｄＸ^ｅＸ^ｆＹ^ａＸ^ｇＸ^ｈＹ^ｂＹ^＊Ｘ^ｉＸ^ｊであり、式中、Ｘ^ａ、Ｘ^ｂ、Ｘ^ｃ、Ｘ^ｄ、Ｘ^ｅ、Ｘ^ｆ、Ｘ^ｇ、Ｘ^ｈ、Ｘ^ｉ、及びＸ^ｊが、疎水性アミノ酸残基であり、Ｙ^ａ及びＹ^ｂが、親水性アミノ酸残基であり、Ｙ^＊が、荷電アミノ酸残基である。以下の表は、本開示のプロ分子及び方法に有用ないくつかのＴｅｍｐｏｒｉｎ及びＴｅｍｐｏｒｉｎ様ペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0072】

上記のように、抗菌ペプチド配列は、アミノ酸残基のうちの１つ以上を除去又は置換することによって変更され得る。例えば、いくつかの実施形態では、膜相互作用ペプチドは、アミノ酸配列がＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＲＩＬ（配列番号１）であるＴｅｍｐｏｒｉｎ－Ｌを含む。他の実施形態では、膜相互作用ペプチドは、アミノ酸配列ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫＬＬ（配列番号２）を有するＴｅｍｐｏｒｉｎ－Ｌの誘導体を含み、ここで、Ｔｅｍｐｏｒｉｎ－Ｌ配列の１１位及び１２位のアミノ酸残基Ｒ及びＩは、それぞれ、アミノ酸残基Ｋ及びＬで置換されている。いくつかの実施形態では、膜相互作用ペプチドは、アミノ酸配列ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫ（配列番号３）を有するＴｅｍｐｏｒｉｎ－Ｌの誘導体を含み、ここで、Ｔｅｍｐｏｒｉｎ－Ｌ配列の１１位のアミノ酸残基Ｒは、アミノ酸残基Ｋで置換されており、Ｔｅｍｐｏｒｉｎ－Ｌ配列の１２位及び１３位のアミノ酸残基Ｉ及びＬは存在しない。

【表2-1】

【表2-2】

【0073】

本開示のいくつかの実施形態では、膜相互作用ペプチドは、表１に列挙されるＴｅｍｐｏｒｉｎ若しくはＴｅｍｐｏｒｉｎ様ペプチド、又はその保存的アミノ酸置換を含む。本開示のいくつかの実施形態では、膜相互作用ペプチドは、Ｔｅｍｐｏｒｉｎ－Ｌ（ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＲＩＬ；配列番号１）の配列、又はその保存的アミノ酸置換を含む。

【0074】

Ｐｒｏｔｏｎｅｃｔｉｎ（プロトネクチン）
本開示のいくつかの実施形態では、膜相互作用ペプチドは、アミノ酸配列ＩＬＧＴＩＬＧＬＬＫＧＬ（配列番号５）を有するＰｒｏｔｏｎｅｃｔｉｎ、又はその保存的アミノ酸置換を含む。

【0075】

Ｊａｐｏｎｉｃｉｎ（ジャポニシン）
いくつかの実施形態では、膜相互作用ペプチドは、表２に列挙されるＪａｐｏｎｉｃｉｎ若しくはＪａｐｏｎｉｃｉｎ様ペプチド、又はその保存的アミノ酸置換を含み得る。本開示のいくつかの実施形態では、膜相互作用ペプチドは、Ｊａｐｏｎｉｃｉｎ－１（ＦＦＰＩＧＶＦＣＫＩＦＫＴＣ；配列番号３８）の配列、又はその保存的アミノ酸置換を含む。Ｊａｐｏｎｉｃｉｎは、ニホンアカガエル（Ｒａｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の皮膚から天然に取得することができ、長さは約１４～約２１個のアミノ酸残基に及ぶ。以下の表は、本開示のプロ分子及び方法に有用ないくつかのＪａｐｏｎｉｃｉｎ及びＪａｐｏｎｉｃｉｎ様ペプチドのアミノ酸配列を示す。

【表3】

【0076】

本開示のいくつかの実施形態では、膜相互作用ペプチドは、表２に列挙されるＪａｐｏｎｉｃｉｎ若しくはＪａｐｏｎｉｃｉｎ様ペプチド、又はその保存的アミノ酸置換を含む。

【0077】

追加のペプチド
上記のペプチドに加えて、本開示のプロ分子は、以下の表に列挙される膜相互作用ペプチド、又はその保存的アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、以下の表に列挙されるペプチドは、それらの活性を調節し得るＮ末端及び／又はＣ末端修飾を含む。

【表4】

【0078】

部分Ｚ－膜相互作用阻害ペプチド
本開示の化合物は、概して、部分Ｚを含み、これは、部分Ｘ^２を介して部分Ａに連結されたときに、部分Ａがリン脂質二重層と相互作用することを阻害又は防止する。いくつかの実施形態では、部分Ｚはまた、プロ分子と標的酵素との相互作用を促進する。

【0079】

部分Ｚは、一般に、長さが約２～約１５個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、部分Ｚは、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個、最大約３０個、最大約３５個、最大約４０個、最大約４５個、又は最大約５０個のアミノ酸の長さである。いくつかの実施形態では、部分Ｚは、長さが約２～約５個、約５～約１０個、約１０～約１５個、約１５～約２０個、約２０～約２５個、約２５～約３０個、約３０～約３５個、約３５～約４０個、約４０～約４５個、又は約４５～約５０個のアミノ酸の範囲である。部分Ｚは、長さが約５５個以下のアミノ酸である。

【0080】

部分Ｚは、任意のタイプのアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、部分Ｚは、任意選択で、Ｘ^２の切断後の部分Ｚの検出を容易にするために、検出可能な部分を含んでもよい。

【0081】

認識ドメイン
部分Ｚは、Ｘ^２の切断及びその後の部分Ａの活性化の調節を補助するように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、部分Ｚは、Ｘ^２を切断するグランザイムによって結合され得るアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、部分Ｚにおける特定のアミノ酸配列の認識は、グランザイムがＸ^２を切断し、プロ分子を活性化できるようになる前に必要とされ得る。部分Ｚにおけるアミノ酸残基のいくつかは、部分Ｚと標的グランザイムとの間の相互作用の特異性を変えることなく、プロ分子の活性を調節するように調整され得る。

【0082】

いくつかの実施形態では、部分Ｚは、酵素的グランザイムアクチベーターの天然に存在する生理学的基質に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、部分Ｚは、酵素的グランザイムアクチベーターの生理学的基質と類似性を共有してもしなくてもよいコンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングの分析に由来するアミノ酸配列を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、部分Ｚは、アミノ酸配列ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号５５）を有するプロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ－１）の配列、又はその保存的アミノ酸置換を含む。他の実施形態では、部分Ｚは、アミノ酸配列ＳＦＬＬＱＤＰＮＤＱＹＥＰＦＷ（配列番号５６）、又はその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、部分Ｚは、アミノ酸配列ＱＤＰＮＤＱＹＥＰＦ（配列番号７）、又はその保存的アミノ酸置換を含む。

【0084】

Ｘ^２－切断可能なリンカー
本開示のプロ分子では、部分Ａは、切断可能なリンカーＸ^２を介して部分Ｚに連結される。いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、単一の化学結合で部分Ａを部分Ｚに連結するリンカーを含む。他の実施形態では、Ｘ^２は、２つ以上の異なる化学結合を介して部分Ａを部分Ｚに連結するキメラリンカーを含む。

【0085】

Ｘ^２の切断は、部分Ａを含有する第１の切断産物と部分Ｚを含有する第２の切断産物との２つの切断産物を生成する。一般に、Ｘ^２は、予め選択された生理学的条件下で切断可能である。Ｘ^２は、診断又は検出される症状に関連する環境に曝露されたときにプロ分子が選択的に切断されるように選択することができる。

【0086】

Ｘ^２は、細胞の表面上に見出されるプロテアーゼ若しくは他の酵素によって切断に供されるか、又は診断若しくは検出されるべき症状、そのような免疫系活性化若しくは調節不全、又は他の症状若しくは因子を有する細胞の近くで放出される化学結合を含み得る。

【0087】

Ｘ^２は、アミノ酸又はペプチドを含み得る。Ｘ^２がペプチドを含む場合、ペプチドは、例えば、長さが約２～約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個、又は最大約３０個のアミノ酸残基などの任意の適切な長さであり得る。いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、長さが約２～約５個、約５～約１０個、約１０～約１５個、約１５～約２０個、約２０～約２５個、又は約２５～約３０個のアミノ酸である。Ｘ^２は、長さが約３５個以下のアミノ酸である。切断可能なペプチドは、プロテアーゼによって認識及び切断されるアミノ酸配列を含んでもよく、その結果、プロテアーゼのタンパク質分解作用がＸ^２を切断する。

【0088】

酵素的に切断可能なリンカー
グランザイム活性の存在などの特定の条件による切断のためのＸ^２の設計は、そのような条件が見出される特定の位置へのプロ分子活性化の標的化を可能にする。したがって、本開示の化合物がグランザイム活性領域又はグランザイム分泌免疫細胞の活性化領域に特異的標的化を提供する１つの方法は、グランザイムによって切断されるリンカー部分Ｘ^２の設計によるものである。Ｘ^２のグランザイム媒介切断後、切断産物Ａ及びＺが形成され、部分Ａは、活性化の近傍で、細胞膜などのリン脂質二重層と自由に相互作用する。

【0089】

Ｘ^２は、グランザイム切断可能なペプチドである。Ｘ^２は、目的の任意のグランザイムによって切断可能であり得る。ペプチドが切断可能であり得るグランザイムの非限定的な例としては、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、及びグランザイムＭが挙げられる。ある特定の実施形態では、グランザイムは、グランザイムＢ、例えば、ヒトグランザイムＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｊ３ＫＰＫ２）、マウスグランザイムＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１８７）などである。いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、アミノ酸配列ＩＥＰＤＶＳＱＶ（配列番号５７）を有するヒトグランザイムＢ切断可能なペプチドである。このアミノ酸配列は、ヒト酵素グランザイムＢによって特異的に切断される。ある特定の実施形態では、グランザイムは、グランザイムＫ、例えば、ヒトグランザイムＫ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４９８６３）、マウスグランザイムＫ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ３５２０５）などである。いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、アミノ酸配列ＷＡＦＲＳＲＹＨ（配列番号５８）を有するグランザイムＫ切断可能なペプチドである。このアミノ酸配列は、ヒト酵素グランザイムＫによって特異的に切断される。ある特定の実施形態では、グランザイムは、グランザイムＡ、例えば、ヒトグランザイムＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１２５４４）、マウスグランザイムＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１１０３２）などである。ある特定の実施形態では、グランザイムは、グランザイムＨ、例えば、ヒトグランザイムＨ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２０７１８）、ブタグランザイムＨ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｂ８ＸＴＲ８）などである。ある特定の実施形態では、グランザイムは、グランザイムＭ、例えば、ヒトグランザイムＭ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１１２４）、マウスグランザイムＭ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ０８６４３）などである。

【0090】

グランザイムによって切断可能なリンカー
いくつかの実施形態では、Ｘ^２リンカーは、免疫応答に関与する酵素である酵素グランザイムによる切断を受けやすい。グランザイムは、宿主防御に関与するリンパ球（例えば、ナチュラルキラー細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球）の分泌小胞（すなわち、顆粒）内で主に発現される。リンパ球が標的細胞とドッキングした後、リンパ球は脱顆粒化し、顆粒酵素を細胞周囲空間に放出する。したがって、グランザイムを使用して、本開示のプロ分子を使用して、Ｘ^２リンカーを切断し、グランザイム活性の検出又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫細胞の活性化を標的化することができる。目的のグランザイムが存在する領域では、Ｘ^２が切断され、部分Ａが部分Ｚから放出され、部分Ａが近傍の細胞膜と相互作用することを可能にする。

【0091】

いくつかの実施形態では、Ｘ^２リンカーは、グランザイムＢによって切断可能である。Ｘ^２リンカーがグランザイムＢによって切断可能である場合、いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列Ｘ^ｍＸ^ｎＰＤＸ^ｏＳＸ^ｐＸ^ｑを含み、式中、Ｘ^ｍは、Ｖ、Ｌ、又はＩであり、Ｘ^ｎは、Ｅであり、Ｘ^ｏは、Ｆ、Ｓ、又はＶであり、Ｘ^ｐは、Ｔ又はＱであり、Ｘ^ｑは、Ｖである。いくつかの実施形態によれば、Ｘ^２リンカーがグランザイムＢによって切断可能である場合、リンカーは、アミノ酸配列ＩＥＰＤＶＳＱＶ（配列番号５７）、ＬＴＹＤＦＷＩＱ（配列番号６５）、ＰＱＶＤＬＹＤＫ（配列番号６６）、ＶＶＱＤＫＨＥＩ（配列番号６７）、ＶＹＡＤＳＳＥＷ（配列番号６８）、ＴＭＡＤＳＱＥＳ（配列番号６９）、ＧＨＩＤＨＭＸＸ（配列番号７０）、ＬＥＱＤＶＷＩＡ（配列番号７１）、ＬＤＰＤＮＦＫＲ（配列番号７２）、ＸＸＰＤＦＹＬＧ（配列番号７３）、ＭＧＰＤＡＦＮＬ（配列番号７４）、ＬＫＤＤＭＧＸＸ（配列番号７５）、ＩＷＦＤＹＴＬＫ（配列番号７６）、ＸＩＧＤＮＶＥＷ（配列番号７７）、ＸＸＸＤＱＶＮＬ（配列番号７８）、ＰＱＡＤＱＷＸＸ（配列番号７９）、ＰＳＶＤＭＸＸＸ（配列番号８０）、ＸＮＶＤＷＴＡＰ（配列番号８１）、ＹＧＹＤＬＱＴＡ（配列番号８２）、ＨＧＦＤＥＡＨＮ（配列番号８３）、ＨＳＨＤＳＷＫＡ（配列番号８４）、ＫＱＤＤＬＭＳＥ（配列番号８５）、ＳＦＧＤＩＭＥＭ（配列番号８６）、ＶＮＤＤＶＫＸＸ（配列番号８７）、ＸＸＸＤＫＱＦＴ（配列番号８８）、又はＮＤＶＤＧＧＸＸ（配列番号８９）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。１つの非限定的な例では、グランザイムＢ切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＩＥＰＤＶＳＱＶ（配列番号５７）を含む。本開示のプロ分子の切断可能なリンカーに含まれ得るグランザイムＢ切断可能な配列には、ＭＥＲＯＰＳデータベースに提供されるものが含まれる。ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｅｒｏｐｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌを参照のこと。Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４６，Ｄ６２４－Ｄ６３２も参照のこと。

【0092】

いくつかの実施形態では、Ｘ^２リンカーは、グランザイムＫによって切断可能である。Ｘ^２リンカーがグランザイムＫによって切断可能である場合、いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列Ｘ^ｒＸ^ｓＦＲＳＸ^ｔＸ^ｕＸ^ｖを有し、式中、Ｘ^ｒは、Ｅ又はＷであり、Ｘ^ｓは、Ｆ、Ｙ、又はＡであり、Ｘ^ｔは、Ｆ、Ｒ、又はＩであり、Ｘ^ｕは、Ｙ、Ｐ、又はＴであり、Ｘ^ｖは、Ｗ又はＨである。１つの非限定的な例では、グランザイムＫ切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＷＡＦＲＳＲＹＨ（配列番号５８）を含む。本開示のプロ分子の切断可能なリンカーに含まれ得るグランザイムＫ切断可能な配列には、ＭＥＲＯＰＳデータベースに提供されるものが含まれる。ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｅｒｏｐｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌを参照のこと。Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４６，Ｄ６２４－Ｄ６３２も参照のこと。

【0093】

いくつかの実施形態では、Ｘ^２リンカーは、他のグランザイムによって切断され得る。１つの非限定的な例では、Ｘ^２リンカーがグランザイムＡによって切断可能である場合、リンカーは、アミノ酸配列ＡＳＰＲＡＧＧＫ（配列番号５９）を含む。別の非限定的な例では、Ｘ^２リンカーがグランザイムＭによって切断可能である場合、リンカーは、アミノ酸配列ＫＥＰＬＳＡＥＡ（配列番号６０）を含む。本開示のプロ分子の切断可能なリンカーに含まれ得る追加のグランザイム切断可能な配列には、ＭＥＲＯＰＳデータベースに提供されるものが含まれる。ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｅｒｏｐｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌを参照。Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４６，Ｄ６２４－Ｄ６３２も参照のこと。

【0094】

複数のリンカーの組み合わせ
いくつかの実施形態では、Ｘ^２は、（例えば、酵素による）切断を受けやすい２つ以上の部位を提供するアミノ酸配列を含み、これらの部位のうちの少なくとも１つは、グランザイムによる切断を受けやすい。本開示の特徴を有する分子が、複数の切断部位を含むＸ^２リンカーを含む場合、部分Ａの部分Ｚからの分離は、Ｘ^２リンカー内の複数の結合の切断を必要とし得、これは、同時に又は連続して行われ得る。そのようなＸ^２リンカーは、異なる化学特性又は切断特異性を有する結合を含み得、そのため、部分Ａの部分Ｚからの分離は、活性化が行われる前に、分子が２つ以上の条件又は環境（「細胞外シグナル」）に遭遇することを必要とする。切断部位は、同じであっても異なっていてもよく、異なっている場合は、本明細書では「キメラ」リンカーと称されてもよい。したがって、キメラＸ^２リンカーの切断は、そのような細胞外シグナルの組み合わせの検出器として役立てられる。

【0095】

キメラＸ^２リンカーは、所望の細胞、組織、又は領域に対する部分Ａの標的化を更に調節するために使用され得る。細胞外シグナルのブールの組み合わせを使用して、Ｘ^２の切断が起こる条件を広げたり狭めたりすることができる。キメラＸ^２リンカーが部分Ａを部分Ｚに連結するために使用される場合、キメラリンカー内の異なる化学結合は、並列又は直列に配置され得る。並列に配置された場合、部分Ａが部分Ｚから分離し得る前に各結合が切断されなければならないため、切断条件は狭くなる。キメラリンカー内の化学結合が直列に配置されている場合、化学結合のいずれか１つの切断が部分Ａと部分Ｚとの分離をもたらすため、切断条件は広がる。

【0096】

いくつかの実施形態では、キメラＸ^２リンカーは、グランザイムによる切断を受けやすい部位と、第２のプロテアーゼ又は酵素による切断を受けやすい部位と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の酵素は、同じ又は異なるグランザイムである。

【0097】

いくつかの実施形態では、キメラＸ^２リンカーは、グランザイムによる切断を受けやすい部位と、還元条件下で切断を受けやすい部位と、を含む。還元条件は、酸素濃度が低下した領域（すなわち、低酸素）、例えば、がん細胞及びがん組織を取り囲む領域、梗塞領域、及び他の低酸素領域において見出され得る。低酸素条件下で切断を受けやすい部位の例としては、ジスルフィド結合を含有する部位が挙げられる。低酸素環境では、遊離チオール及び他の還元剤が細胞外で利用可能になり、一方、通常は細胞外環境を酸化状態に維持する酸素が枯渇する。酸化還元バランスのこのシフトは、Ｘ^２リンカー内のジスルフィド結合の還元及び切断を促進する。チオール－ジスルフィド平衡を利用するジスルフィド結合に加えて、還元環境において切断するように設計されたＸ^２リンカーには、ヒドロキノンに還元されたときに切断されるキノンを含む結合を使用してもよい。

【0098】

いくつかの実施形態では、キメラＸ^２リンカーは、グランザイムによる切断を受けやすい部位と、酸性環境下で切断を受けやすい部位と、を含む。酸性環境は、損傷組織又は低酸素組織の近くの部位に見出され得る。酸性環境で切断されやすい部位を利用して、本開示のプロ分子の酸性領域への活性化を標的化することができる。そのような標的化は、酸不安定性リンカーで達成することができる（例えば、Ｘ^２にアセタール若しくはビニルエーテル結合、又は酸性条件下で切断される別の結合を含めることによって）。

【0099】

例えば、グランザイム又は低酸素の存在を検出するために（すなわち、グランザイム活性又は低酸素のいずれかの存在下でＸ^２を切断するために）、キメラＸ^２リンカーは、いずれかの結合の切断が部分Ａを部分Ｚから分離するのに十分であるように、グランザイム感受性及び還元感受性化学結合を直列に設計される。

【0100】

代替的に、グランザイム活性及び低酸素の両方の存在を検出するために（すなわち、グランザイム活性及び低酸素の存在下でＸ^２を切断するが、これらの条件のうちの１つのみの存在下では切断しない）、二重Ｘ^２リンカー、例えば、キメラリンカーは、互いにジスルフィド結合されている少なくとも１対のシステインの間にグランザイム感受性結合を配置するように設計され得る（すなわち、キメラＸ^２リンカー内の化学結合は、並列に配置される）。この場合、部分Ａ及びＺの分離を可能にするために、グランザイム切断及びジスルフィド還元の両方が必要である。

【0101】

ある特定の実施形態では、本開示のプロ分子は、以下の式（Ｉ）を有し得、式中、部分Ｘ^２はデュアルリンカーを含み、これはキメラリンカーであってもよく、かつ環状構造を有する。

【化1】

式中、Ｘ^１ａ、Ａ、Ｚ、及びＸ^１ｂは、本明細書に記載のとおりである。上記式（Ｉ）中、Ｘ^２ａ及びＸ^２ｂは、Ｘ^２のアミノ酸であり、Ｘ^２ａ及びＸ^２ｂは、独立して、任意のアミノ酸から選択されてもよく、Ｘ^２ｃ及びＸ^２ｄは、切断可能なリンカー（例えば、酵素的に切断可能なリンカー）を提供するアミノ酸を含み、ｎは、１つ又は２つであり、ｍ及びｏは、少なくとも１つであり、１～３０の範囲の整数から独立して選択されてもよく、ｐ及びｑは、各々少なくとも２であり、かつ２～３０の範囲の整数から独立して選択されてもよく、Ｘ^２ｃ及びＸ^２ｄによって提供される切断部位は、同じであっても異なっていてもよく、同じ又は異なる条件（例えば、同じ又は異なる酵素）による切断を受けやすくてもよく、例えば、本明細書に記載の切断可能なリンカーのいずれかから独立して選択されてもよい。Ｘ^２ｃ及びＸ^２ｄは、各々、異なる条件下（例えば、異なる酵素）で切断を受けやすい切断可能なリンカーを定義するが、この分子は、キメラリンカーを含むものとして説明することができる。そのような組み合わせは、同じ又は異なるクラスの酵素を含み得る。

【0102】

式（Ｉ）の分子の合成は、標準的なペプチドカップリング化学を用いて行うことができる。例えば、式（Ｉ）の化合物の前駆体として、標準ペプチドカップリング化学を使用して、以下の式（ＩＩ）の化合物を作製することができ、式中、Ｘ^２は、アスパラギン酸又はグルタミン酸及びリジン残基を含む。

【化2】

【0103】

ペプチドカップリング反応は、典型的には、従来のペプチドカップリング試薬を採用し、かつ典型的には、エチルジイソプロピルアミン又はジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）などのトリアルキルアミンの存在下で、従来のカップリング反応条件下で行われる。使用に適したカップリング試薬としては、カルボジイミド、例えば、エチル－３－（３－ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）など、及び他の周知のカップリング試薬、例えばＮ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）が挙げられる。任意選択で、周知のカップリングプロモーター、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などを、この反応に採用することができる。典型的には、このカップリング反応は、ＴＨＦ又はＤＭＦなどの不活性希釈剤中で約１～約７２時間、約０℃～約６０℃の範囲の温度で行われる。

【0104】

化合物の調製のためのプロセスのいずれかの間に、関係する分子のいずれかの感受性基又は反応性基を保護することが必要であり、かつ／又は望ましい場合がある。これは、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２００６などの標準的な著作物に記載されているように、従来の保護基によって達成することができる。保護基は、当該技術分野で知られている方法を使用して、都合のよい後の段階で除去することができる。例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びリジン残基は、合成プロセス中に様々な保護基で保護することができる。使用される保護基の種類に応じて、脱保護における選択性を合成プロセス中に有利に使用することができる。当業者であれば、合成スキームに適切な保護基の種類を選択することができるであろう。

【0105】

環状構造を有する上記のデュアルリンカーは、アスパラギン酸又はグルタミン酸のカルボキシル側鎖をペプチド骨格のカルボキシルハンドルとして使用し、リジンのアミノ側鎖をペプチド骨格のアミノハンドルとして使用することによって合成することができる。式（Ｉ）の合成は、標準的なペプチドカップリング化学を使用して行うことができる。ペプチドカップリング反応は、典型的には、従来のペプチドカップリング試薬を採用し、上記のような従来のカップリング反応条件下で実施される。

【0106】

部分Ｘ^１Ａ及びＸ^１Ｂ
本開示のプロ分子は、存在する場合、求核性部分を含み、プロ分子への１つ以上のカーゴ部分の結合を促進する任意選択の部分Ｘ^１ａ及びＸ^１ｂを含み得る。部分Ｘ^１ａ及びＸ^１ｂの求核性部分は、一般に、求電子剤と反応可能な少なくとも１つの自由電子対を含む求核性反応性基を含む。求核性部分の例としては、硫黄求核剤、例えばチオール、チオレートアニオン、チオールカルボキシレートのアニオン、ジチオカーボネートのアニオン、及びジチオカルバメートのアニオン；酸素求核剤、例えば水酸化物アニオン、アルコール、アルコキシドアニオン、及びカルボキシレートアニオン；窒素求核剤、例えばアミン、アジド、及び硝酸塩、並びに炭素求核剤、アルキル金属ハロゲン化物及びエノールが挙げられる。

【0107】

カーゴ部分は、例えば、様々なイメージングモダリティを介してプロ分子の検出を容易にし得る検出可能な部分であってもよく、又は例えば、疾患若しくは症状の治療を容易にし得る治療剤であってもよい。

【0108】

検出可能な部分の非限定的な例としては、蛍光色素及び放射性同位体が挙げられる。いくつかの実施形態では、２つ以上のカーゴ部分は、同じプロ分子（例えば、蛍光色素及び同じプロ分子に結合した放射性同位体）に結合してもよい。異なるカーゴ部分は、複数のモダリティを使用して同時に検出するために対合され得る。例えば、核イメージング剤を使用した非侵襲的検出を蛍光と組み合わせることで、強化された更に侵襲的（例えば、外科的）な検出のための追跡研究を可能にすることができる。

【0109】

いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、蛍光色素を含み得る。本開示のプロ分子にコンジュゲートされ得る蛍光色素の非限定的な例としては、シアニン色素、例えばフルオレセイン、テトラメトキシルローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、若しくはＣｙ７、ＩＲｄｙｅ８００ｃｗ、又はＡＴＴＯ－ＴＥＣ（商標）染料、例えばＡＴＴＯ６８０が挙げられる。適切なカーゴ部分はまた、近赤外線領域においてより長い波長を有する蛍光色素を含む。そのような色素は当該技術分野で知られており、かつ本開示の化合物に容易に組み込むことができる。

【0110】

いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、金属キレート部分を含み得る。金属キレート部分の非限定的な例としては、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４－ビス（カルボキシメチル）－６－［ビス（カルボキシメチル）］アミノ－６－メチル－ペルヒドロ－１，４－ジアゼピン（ＡＡＺＴＡ）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、３，４，３－（ＬＩ－１，２－ＨＯＰＯ）（ＨＯＰＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、４，１１－ビス－（カルボキシメチル）－１，４，８，１１－テトラアザビシクロ［６．６．２］－ヘキサデカン（ＣＢ－ＴＥ２Ａ）、Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシベンジル）－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸（ＨＢＥＤ）が挙げられる。

【0111】

いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、放射性同位体、例えば、金属結合部分を介してキレート化された放射性同位体を含み得る。放射性同位体の非限定的な例としては、アクチニウム－２２５、アスタチン－２１１、ビスマス－２１２、ビスマス－２１３、臭素－７６、臭素－７７、カルシウム－４７、炭素－１１、炭素－１４、クロム－５１、コバルト－５７、コバルト－５８、銅－６４、エルビウム－１６９、フッ素－１８、ガリウム－６７、ガリウム－６８、水素－３、インジウム－１１１、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、鉄－５９、クリプトン－８１ｍ、鉛－２１２、ルテチウム－１７７、窒素－１３、酸素－１５、リン－３２、ラジウム－２２３、ラジウム－２２４、サマリウム－１５３、セレン－７５、ナトリウム－２２、ナトリウム－２４、ストロンチウム－８９、テクネチウム－９９ｍ、タリウム－２０１、トリウム－２２６、トリウム－２２７、キセノン－１３３、又はイットリウム－９が挙げられる。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、銅－６４である。

【0112】

いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、金属キレート部分ＤＯＴＡにコンジュゲートされた放射性同位体の銅－６４である。

【0113】

いくつかの実施形態では、カーゴ部分は、放射性同位体である。そのような実施形態では、カーゴ部分は、Ｘ線、蛍光透視法、血管造影法、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、又は単一陽電子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用して検出され得、ここで、細胞、組織、又は対象全体が、イメージングモダリティのフィールドに配置され、可視化される。

【0114】

いくつかの実施形態では、切断産物の検出は、生物レベルで行われる。いくつかの実施形態では、検出は、標的領域内で実行される。いくつかの実施形態では、検出は、注射から０．５～２４時間後など、投与後の延長された時点（例えば、静脈内投与後などの注射後）で行われる。いくつかの実施形態では、検出は、投与後、例えば、注射後の複数の時点で行われる。

【0115】

いくつかの実施形態では、本開示の特徴を有する単一のプロ分子は、２つ以上のカーゴ部分を含んでもよく、その結果、部分Ａは、複数の検出可能な部分に連結されてもよく、又は検出可能な部分と治療剤との両方に連結されてもよく、又は複数の治療剤に連結されてもよい。そのような複数の検出可能な部分は、異なるタイプのマーカーを含み、例えば、放射性同位体及び造影剤又は蛍光色素の両方の付着を可能にし、異なるモダリティによるイメージングを可能にし得る。

【0116】

部分Ｘ^１ａ又はＸ^１ｂを介してコンジュゲートされた検出可能な部分を含むプロ分子は、ある特定の条件を有する細胞又は特定の条件を示す領域内の細胞の可視化又は同定に使用することができる。例えば、グランザイム活性又はグランザイムを分泌する免疫細胞の活性化は、部分Ａを含む切断産物が、グランザイム活性又は免疫細胞活性化の近傍の細胞膜と相互作用するように、グランザイムＢなどの目的のグランザイムによって切断されるＸ^２リンカーを設計することによって可視化され得る。部分Ａと細胞膜との相互作用は、領域に放射性同位体又は他のマーカーを送達する。したがって、放射性同位体は、Ｘ^２の切断時に、特定の領域内の標的細胞膜又はリン脂質二重層構造に送達され得るカーゴ部分の一例である。

【0117】

本開示のプロ分子にコンジュゲートすることができる治療剤の非限定的な例としては、アクチニウム－２２５、アスタチン－２１１、ビスマス－２１２、ビスマス－２１３、臭素－７６、臭素－７７、カルシウム－４７、炭素－１１、炭素－１４、クロム－５１、コバルト－５７、コバルト－５８、銅－６４、エルビウム－１６９、フッ素－１８、ガリウム－６７、ガリウム－６８、水素－３、インジウム－１１１、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、鉄－５９、クリプトン－８１ｍ、鉛－２１２、ルテチウム－１７７、窒素－１３、酸素－１５、リン－３２、ラジウム－２２３、ラジウム－２２４、サマリウム－１５３、セレン－７５、ナトリウム－２２、ナトリウム－２４、ストロンチウム－８９、テクネチウム－９９ｍ、タリウム－２０１、トリウム－２２６、トリウム－２２７、キセノン－１３３、又はイットリウム－９などの放射性同位体が挙げられる。

【0118】

いくつかの実施形態では、特定の部分は、検出可能な部分と治療剤の両方として機能し得る。

【0119】

作製方法
本開示のプロ分子は、組換え及び非組換え（例えば、化学合成）方法を含むが、これらに限定されない、任意の適切な方法によって作製され得る。カーゴ部分は、求核性付加反応を含むが、これに限定されない、任意の適切な方法によってプロ分子にコンジュゲートされ得る。

【0120】

プロ分子の産生
本開示のプロ分子は、組換え及び非組換え方法（例えば、化学合成）を含む任意の適切な方法によって産生され得る。

【0121】

ポリペプチドが化学合成される場合、合成は、液相又は固相を介して進行し得る。固相合成（ＳＰＰＳ）は、非天然アミノ酸、ペプチド／タンパク質骨格修飾の組み込みを可能にする。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃなどの様々な形態のＳＰＰＳは、本開示のペプチドを合成するために利用可能である。化学合成の詳細は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ Ａ．２００６ Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８）。簡潔に述べると、小さい不溶性の多孔質ビーズは、ペプチド鎖が構築される機能単位で処理される。カップリング／脱保護のサイクルを繰り返した後、固相に結合したペプチド又はアミノ酸の遊離Ｎ末端アミンは、単一のＮ－保護アミノ酸単位にカップリングされる。次いで、この単位は脱保護され、新たなＮ末端アミンが現れ、そこに更なるアミノ酸が結合してもよい。ペプチドは、固相に固定化されたままであり、切断される前に濾過プロセスを受ける。

【0122】

ポリペプチドが組換え技術を使用して産生される場合、タンパク質は、任意の適切な構築物及び任意の適切な宿主細胞を使用して、細胞内タンパク質として又は分泌タンパク質として産生され得、この宿主細胞は、それぞれ、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）又は酵母宿主細胞などの原核又は真核細胞であり得る。

【0123】

宿主細胞として使用することができる真核細胞の他の例としては、昆虫細胞、哺乳動物細胞、及び／又は植物細胞が挙げられる。哺乳動物宿主細胞が使用される場合、細胞は、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞）、マウス細胞（例えば、Ｘ３、ＮＩＨ３Ｔ３、膵管腺がん２．１、Ｌ細胞、及びＣ１２７細胞）、霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１）、並びにハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）のうちの１つ以上を含み得る。

【0124】

対象のポリペプチドの発現に適した広範囲の宿主ベクター系を、当該技術分野で知られている標準的な手順に従って採用してもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓを参照のこと。宿主細胞への遺伝物質の導入方法としては、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法などが挙げられる。導入されたポリペプチドをコードする核酸の安定な発現を提供するように、移入方法を選択することができる。ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性エピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供され得るか、又はゲノム的に組み込まれ得る。目的のポリペプチドの産生で使用するための様々な適切なベクターが市販されている。

【0125】

ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供することができるか、又は宿主細胞ゲノムへの組み込みを提供することができる。発現ベクターは、転写及び翻訳調節配列を提供し、かつ誘導性又は構成的発現を提供し得、ここで、コード領域は、転写開始領域、並びに転写及び翻訳終結領域の転写制御下で作動可能に連結される。一般に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定されない。プロモーターは、構成的又は誘導的のいずれかあり得、強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７など）であり得る。発現構築物は、一般に、目的のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主に作用する選択マーカーは、ベクターを含有する細胞の選択を容易にするために存在し得る。加えて、発現構築物は、追加の要素を含み得る。例えば、発現ベクターは、１つ又は２つの複製系を有してもよく、したがって、例えば、発現のために哺乳動物又は昆虫細胞において、並びにクローニング及び増幅のために原核生物宿主において、生物中でそれを維持することが可能になる。加えて、発現構築物は、形質転換宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含有し得る。選択可能な遺伝子は、当該技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変化する。

【0126】

タンパク質及び／又は抗体の単離及び精製は、当該技術分野で知られている方法に従って達成することができる。例えば、タンパク質は、一般に、サンプルを抗タンパク質抗体と接触させ、洗浄して非特異的に結合した物質を除去し、特異的に結合したタンパク質を溶出することを伴う、免疫親和性精製によって、タンパク質を構成的に及び／又は誘導時にタンパク質を発現するように遺伝的に修飾された細胞の溶解物から、又は合成反応混合物から単離することができる。単離されたタンパク質は、透析及びタンパク質精製方法で通常採用される他の方法によって更に精製することができる。一実施形態では、タンパク質は、金属キレートクロマトグラフィー法を使用して単離され得る。本開示のタンパク質は、単離を容易にするための修飾を含有してもよい。

【0127】

主題ポリペプチドは、実質的に純粋な形態又は単離された形態で調製され得る（例えば、他のポリペプチドを含まない）。タンパク質は、存在し得る他の成分（例えば、他のポリペプチド又は他の宿主細胞成分）と比較して、ポリペプチドが濃縮された組成物中に存在し得る。精製されたタンパク質は、タンパク質が他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物、例えば、組成物の９８％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、６０％未満、又は５０％未満が他の発現タンパク質で構成される組成物中に存在するように提供されてもよい。

【0128】

カーゴ部分のポリペプチドへのコンジュゲーション
カーゴ部分は、求核性部分を利用する求核性付加反応を含むが、これに限定されない、任意の適切な技術を使用して、本開示のプロ分子にコンジュゲートされ得る。そのような反応の非限定的な例としては、硫黄求核剤、酸素求核剤、炭素求核剤、又は窒素求核剤と、適切な求電子剤との共有結合を形成する反応が挙げられる。

【0129】

任意選択の修飾
本開示のプロ分子は、一般に、例えば、より長い循環半減期、特定の解剖学的区画へのプロ分子の制限（例えば、心臓血管系への制限）、非特異的分解からの保護、及び／又は特定のイメージングモダリティに対する増強された感度を提供するように更に修飾され得る。

【0130】

いくつかの実施形態では、２つ以上のプロ分子は、当該技術分野で知られている技術を使用して、中心分子、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に連結されて、デンドリマーを形成してもよい。適切なＰＥＧ分子は、最大約１，０００、最大約５，０００、最大約１０，０００、最大約２０，０００、最大約３０，０００、又は最大約４０，０００ダルトンの分子量を有し得る。２つ以上のプロ分子の中心ＰＥＧ分子へのコンジュゲーションは、例えば、１つ以上の末端で官能基を有するＰＥＧ分子を活性化し、次いで、活性化されたＰＥＧ分子を本開示の１つ以上のプロ分子と反応させることによって達成することができる。官能基の選択は、Ｎ末端アミン、Ｃ末端カルボン酸、又はリジン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、若しくは他の特定の反応部位などの残基などの、プロ分子上で利用可能な反応性基に依存する。直鎖状の単一アームＰＥＧ構造だけでなく、分岐状ＰＥＧ構造も、そのような技術を使用して作製され得る。

【0131】

いくつかの実施形態では、一般式：Ｘ^１ａ－Ａ－Ｘ^２－Ｚ－Ｘ^３（式中、Ｘ^３は、ＰＥＧ分子であり、Ｘ^１ａ、Ａ、Ｘ^２、及びＺは、上記のとおりである）を有する直鎖状の単一アームＰＥＧ構造が形成される。他の実施形態では、分岐状ＰＥＧデンドリマーは、当該技術分野で知られている技術を使用して形成され、ここで、本開示の２つ以上のプロ分子は、分岐状ＰＥＧデンドリマーにコンジュゲートされて、多価ＰＥＧ構造を形成する。

【0132】

組成物
本開示のプロ分子のいずれかを含む組成物も提供される。この組成物は、本明細書の上記及び以下の実験セクションに記載されるプロ分子のいずれかを含む、本開示のプロ分子のいずれかを含み得る。

【0133】

ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、液体媒体中に存在する本開示のプロ分子のいずれかを含む。液体媒体は、水、緩衝溶液などの水性液体媒体であってもよい。塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス￥［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、可溶化剤、洗剤（例えば、非イオン性洗剤、例えばＴｗｅｅｎ－２０など）、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などの１つ以上の添加剤が、そのような組成物中に存在してもよい。

【0134】

本開示の態様は、医薬組成物を更に含む。本開示のプロ分子は、対象への投与に適切な（例えば、所望の経路による）様々な医薬組成物中に製剤化され得る。本開示のプロ分子を含む組成物は、薬学的に許容され得る医薬品添加剤を含み得、その多様性は、当該技術分野で知られており、本明細書で詳細に論じる必要はない。

【0135】

いくつかの実施形態では、本開示のプロ分子は、対象への非経口投与、例えば、静脈内投与のために製剤化される。薬学的に許容され得る医薬品添加剤は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ Ｅｄ．（１９９５）、又は最新版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ ７ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃを含む、多様な刊行物に十分に記載されている。

【0136】

場合によっては、主題医薬組成物は、対象への注射に適しており、例えば、無菌である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、例えば、組成物が無菌であり、検出可能なパイロジェン及び／又は他の毒素を含まない場合、ヒト対象への注射に適している。

【0137】

主題医薬組成物は、他の成分、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩などを含み得る。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要な薬学的に許容され得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、塩酸塩、硫酸塩、溶媒和物（例えば、混合イオン塩、水、有機物）、水和物（例えば、水）などを含み得る。

【0138】

本開示のプロ分子は、所定量の本明細書に開示されるプロ分子を含有する単位剤形に製剤化され得る。注射又は静脈内投与に適した単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、又は別の薬学的に許容され得る担体中の溶液として、組成物中に本開示のプロ分子を含み得る。

【0139】

本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象の単位用量として適切な物理的に離散した単位を指し、各単位は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体又はビヒクルと関連して所望の効果を生じるのに十分な量で計算される所定量の本開示のプロ分子を含む。本開示の単位剤形の仕様は、採用される特定のプロ分子及び達成される効果、並びに対象における各プロ分子に関連する薬力学に依存する。

【0140】

ビヒクル、アジュバント、担体、又は希釈剤などの薬学的に許容され得る医薬品添加剤は、一般に容易に入手可能である。更に、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容され得る補助物質は、公に容易に入手可能である。

【0141】

本開示のプロ分子もまた、患者への経口投与のために製剤化され得る。経口製剤については、プロ分子を単独で、又は適切な添加剤と組み合わせて使用して、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン又はジャガイモデンプンなどの従来の添加剤と、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン又はゼラチンなどの結合剤と、トウモロコシデンプン、ジャガイモロコシデンプン又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と、かつ必要に応じて希釈剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、及び香味剤と、錠剤を作製することができる。

【0142】

本開示のプロ分子は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤で利用され得るか、又はジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容され得る加圧推進剤に製剤化され得る。

【0143】

更に、本開示のプロ分子は、乳化塩基又は水溶性塩基などの様々な塩基と混合することによって座薬に作製され得る。本発明のプロ分子は、坐剤を介して直腸投与することができる。坐剤には、体温で融解するが、室温で固化するカカオバター、カルボワックス、及びポリエチレングリコールなどのビヒクルが含まれ得る。

【0144】

シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤などの経口又は直腸投与のための単位剤形が提供され得、ここで、各投与単位、例えば、小さじ量、大さじ量の錠剤又は坐剤は、所定量の本開示のプロ分子を含有する。同様に、注射又は静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、又は別の薬学的に許容され得る担体中の溶液として、組成物中に１つ以上のプロ分子を含み得る。

【0145】

いくつかの実施形態では、本開示のプロ分子は、対象への、例えば、所望の作用部位において、又はその付近での局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、本開示のプロ分子は、特定の期間、所定の速度でプロ分子を所定の速度で放出するように設計された持続放出剤形に製剤化される。

【0146】

本開示のプロ分子はまた、対象に投与されたときにプロ分子の薬物動態プロファイルに影響を与える薬剤とともに製剤化されてもよい。そのような薬剤としては、ベラパミル又は他の等価物が挙げられる。

【0147】

投与経路
本開示の方法を実施する際に、投与経路は、送達されるプロ分子の特性、診断、検出、又は治療される症状のタイプ（例えば、凝固の検出）などの様々な要因のいずれかに従って選択され得る。本開示のプロ分子は、血流（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、及び／又は皮下投与などの非経口投与によって）又は特定の組織若しくは臓器（例えば、筋肉組織、心臓組織、血管組織など）へのプロ分子の送達を提供する投与経路によって送達され得る。注射は、非経口投与を達成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、プロ分子は、例えば、標的組織又は臓器への直接注射によって、罹患組織へのプロ分子の直接的な送達を提供する投与経路によって送達される。

【0148】

本開示のプロ分子は、気道を介して投与されてもよい。そのような剤形は、喫煙具、乾燥粉末吸入器、加圧式定量吸入器、ネブライザー、気化器などであり得る。

【0149】

本開示のプロ分子は、対象に、錠剤、粉末、顆粒、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などの適切な嚥下させることによって経口投与され得る。本開示のプロ分子もまた、坐剤の形態で直腸投与され得る。

【0150】

本開示のプロ分子は、皮内、皮下、静脈内、心臓内、筋肉内、骨内、若しくは腹腔内注射を含む、標的組織への、又は血流への直接注射によって投与され得る。本開示のプロ分子は、海綿体内又は硝子体内送達によって臓器若しくは組織に投与され得るか、又は脳内、髄腔内、若しくは硬膜外送達によって中枢神経系の組織に投与され得る。

【0151】

本開示のプロ分子は、局所又は局部投与されてもよい。そのような投与は、適切な製剤を標的組織に直接局所適用することによって達成され得る。前述の投与経路、製剤及び剤形は、単なる例示であり、決して限定するものではない。

【0152】

投薬量
本開示の方法では、所望の診断、検出、又は治療を達成するのに有効なプロ分子の量が、対象に投与される。

【0153】

投与量は、投与の目的、治療される個体の健康及び身体状態、年齢、所望の分解能の程度、主題組成物の製剤、採用される主題組成物の活性、治療する臨床医の医学的状況の評価、対象の症状、対象の体重、並びに診断、検出、及び／又は治療される疾患、障害、若しくは症状の重症度、並びに他の関連因子に応じて異なる。用量のサイズは、特定の組成物の投与に伴う可能性のある有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定されることになる。

【0154】

その量は、日常的な試験によって決定することができる比較的広い範囲に収まることが予想される。例えば、対象におけるグランザイム活性又はグランザイム分泌免疫細胞の活性化を検出するために採用される本開示のプロ分子の量は、さもなければ対象に対して不可逆的に毒性であり得る量（すなわち、最大耐容量）程度以下である。他の場合には、その量は、毒性閾値の前後、又はそれよりもはるかに低いが、それでも有効濃度範囲内にあり、又は閾値用量と同じくらい低い。いくつかの実施形態では、１～２００μｇ、５０～１５０μｇ、又は７５～１２５μｇ（例えば、約１００μｇ）の用量を対象に投与して、グランザイム活性化又はグランザイム分泌免疫細胞の活性化が検出される。

【0155】

ある特定の実施形態では、プロ分子は、ＰＥＴ微量投与試験のためにＦＤＡによって定義された質量用量制限内で静脈内投与される。いくつかの実施形態によれば、制限は、最小薬理学的活性用量の１／１００又は１００μｇ未満である。いくつかの例では、ヒトに適用される用量は、動物（例えば、マウス）線量測定データによって決定される。ある特定の実施形態では、プロ分子は、１ｍＣｉ／注射～２０ｍＣｉ／注射、例えば、５ｍＣｉ／注射～１５ｍＣｉ／注射の用量で投与される。有効量のプロ分子は、１回以上の投与、例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、又は５回以上の投与で投与され得る。

【0156】

使用方法
本開示は、活性化可能で検出可能な膜相互作用ペプチドを、タンパク質分解などの局在化した生物学的プロセスを一般的に伴う疾患又は症状の診断及び／又は治療のために使用する方法を提供する。例えば、ある特定の場合において、本開示のプロ分子は、療法（例えば、細胞ベースの療法、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法などの免疫調節療法）を誘導及び／又はモニタリングする際の診断ツールとして使用される。そのような方法は、一般に、特定の疾患、症状及び／又は免疫応答に関連付けられ得る、タンパク質分解などの生物学的プロセスの検出を伴う。本開示のプロ分子はまた、特定の疾患又は症状の治療、及び患者内の特定の部位又は場所への治療剤の送達を伴う方法にも使用される。

【0157】

一般に、本開示の方法は、診断、検出、又は治療されるべき疾患又は症状に関連する条件下でグランザイムによって切断される切断可能なリンカーＸ^２を含有するプロ分子を選択すること、及び切断促進状態の検出を容易にするか、又は切断促進状態に関連する疾患／症状の治療を容易にするのに十分な量でプロ分子を対象に投与することを含む。投与は、任意の適切な経路によって行うことができ、プロ分子は、診断又は治療される疾患又は症状に従って選択することができる。例えば、対象内のグランザイム活性の検出又はグランザイム分泌免疫細胞の活性化の場合、投与は静脈内であり得る。

【0158】

プロ分子が対象内でグランザイム切断促進条件（例えば、活性化されたグランザイム分泌免疫細胞によるグランザイムの放出）に遭遇すると、プロ分子はグランザイムによって切断され、膜相互作用ペプチドを含有する切断産物は、切断促進環境の近傍の膜に挿入し、検出可能に標識される。この切断産物の検出は、標識された領域内のグランザイム活性の存在を同定する。診断用途及び方法では、グランザイム切断促進状態が存在する対象内の領域の同定は、疾患又は症状の診断を容易にし、次いで、適切な療法を投与及び／又はモニタリングするためのガイダンスを提供し得る。治療用途及び方法では、患者内の標的部位への治療剤の送達が、疾患又は症状の治療を促進する。

【0159】

いくつかの実施形態によれば、本開示は、グランザイム活性の存在下で細胞のリン脂質二重層を検出可能に標識する方法を提供する。そのような方法は、本開示のプロ分子を、グランザイム活性に寄与するグランザイムと接触させることであって、分子の切断可能なリンカーは、グランザイムによって切断されて、検出可能な部分及び膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、その結果、膜相互作用ポリペプチド部分が、細胞のリン脂質二重層と相互作用し、細胞のリン脂質二重層をグランザイム活性の存在下で検出可能に標識する、接触させることを含む。いくつかの実施形態では、接触させることは、インビトロ、インビボ、又はエクスビボである。

【0160】

いくつかの実施形態によれば、本開示は、細胞サンプル中のグランザイム活性を評価する方法を提供する。そのような方法は、サンプルを本開示のプロ分子と接触させることであって、グランザイム活性の存在下で、プロ分子が切断されて、検出可能な部分及び膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、切断産物が、グランザイム活性の存在下で、細胞のリン脂質二重層と相互作用する、接触させることを含む。そのような方法は、切断産物の検出可能な部分の存在又は非存在について評価することを更に含み、検出可能な部分の存在は、細胞サンプル中のグランザイム活性を示す。

【0161】

診断用途及び方法
本開示の方法は、一般に、タンパク質分解などの局在化した生物学的プロセスを伴う疾患又は症状の診断及び検出に関する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、特定の症状に関連する１つ以上のグランザイムの活性から生じるタンパク質分解の検出に関する。そのようなグランザイムは、例えば、特定の組織又は臓器に位置する細胞に結合してもよく、又はそれと会合してもよく、そのような細胞の同定は、療法の指導及び／又はモニタリングに有用であり得る。例えば、酵素グランザイムは、グランザイム分泌免疫細胞の活性化に関連しており、そのような部位の同定は、免疫調節療法後の免疫細胞活性化部位を決定するのに有用であり得る。

【0162】

本開示の方法は、療法をモニタリングする方法を提供するように適合され得る。例えば、本開示のプロ分子は、療法前、療法中（例えば、投与間）、及び／又は療法後に対象に投与され得、プロ分子に関連するシグナルは、治療される症状に対する療法の効果を促進するために検出され得る。本開示の非限定的な例示的な方法が以下に提供される。

【0163】

対象におけるグランザイム活性の評価
いくつかの実施形態によれば、本開示は、対象におけるグランザイム活性を評価する方法を提供する。そのような方法は、本開示のプロ分子を投与することであって、対象におけるグランザイム活性の部位において、プロ分子が、グランザイム活性に寄与するグランザイムによって切断され、検出可能な部分及び膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、切断産物が、対象におけるグランザイム活性の部位における細胞のリン脂質二重層と相互作用する、投与することを含む。そのような方法は、切断産物で標識された細胞の存在又は非存在について評価することを更に含み、切断産物で標識された細胞の存在は、対象におけるグランザイム活性を示す。

【0164】

いくつかの実施形態では、プロ分子を対象に投与して、対象におけるグランザイム活性を評価する。例えば、グランザイム切断可能なＸ^２リンカーを有し、それにコンジュゲートされた放射性同位体部分を有するプロ分子を、対象に静脈内投与する。プロ分子が対象におけるグランザイム活性の部位においてグランザイムと接触すると、Ｘ^２は切断され、部分Ａ及びＺを含む切断産物を形成する。部分Ａの膜相互作用ペプチドは、次いで、立体構造変化を受けて、グランザイム活性の領域内の細胞膜に挿入するアルファ－ヘリカル構造を形成する。いくつかの実施形態では、プロ分子に結合したカーゴ部分は、放射性同位体である。上記のように、切断産物含有部分Ａが、グランザイム活性の領域内の細胞の形質膜に挿入されると、放射性同位体は、適切なイメージングモダリティ、例えば、蛍光透視法、Ｘ線法、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴法（ＭＲ）又は陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を使用して検出され、グランザイム活性が生じている対象の組織を同定する。いくつかの実施形態では、対象におけるグランザイム活性を評価することは、グランザイム活性が生じる対象の領域を同定することを含む。

【0165】

対象におけるグランザイム分泌免疫細胞活性化の評価
いくつかの実施形態によれば、本開示は、対象における免疫細胞の活性化について評価する方法であって、免疫細胞は、対象において活性化されるとグランザイムを分泌する、方法を提供する。そのような方法は、本開示のプロ分子を対象に投与することをであって、対象における活性化された免疫細胞分泌グランザイムの部位において、分子が、活性化された免疫細胞分泌グランザイムによって切断されて、検出可能な部分及び膜相互作用ポリペプチド部分を含む切断産物を放出し、切断産物が、対象における活性化された免疫細胞分泌グランザイムの部位において細胞のリン脂質二重層と相互作用する、投与することを含む。そのような方法は、切断産物で標識された細胞の存在又は不在について評価することを更に含み、切断産物で標識された細胞の存在は、対象における免疫細胞の活性化を示す。

【0166】

ある特定の実施形態では、プロ分子を対象に投与して、グランザイム分泌免疫細胞活性化を評価する。いくつかの実施形態では、グランザイム分泌免疫細胞は、ＮＫ細胞又はＣＴＬである。いくつかの実施形態では、ＣＴＬによって分泌されるグランザイムは、グランザイムＢ又はグランザイムＫである。

【0167】

例えば、グランザイム切断可能なＸ^２リンカーを有し、それにコンジュゲートされた放射性同位体部分を有するプロ分子を、対象に静脈内投与する。プロ分子が活性化された免疫細胞によるグランザイム分泌の部位においてグランザイムと接触すると、Ｘ^２は切断され、部分Ａ及びＺを含む切断産物を形成する。部分Ａの膜相互作用ペプチドは、次いで、立体構造変化を受けて、グランザイム分泌免疫細胞活性化の領域において細胞膜に挿入するアルファ－ヘリカル構造を形成する。

【0168】

いくつかの実施形態によれば、プロ分子に結合したカーゴ部分は、放射性同位体である。上記のように、切断産物含有部分Ａが、グランザイム活性領域内の細胞の形質膜に挿入されると、放射性同位体は、適切なイメージングモダリティ、例えば、蛍光透視法、Ｘ線法、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴法（ＭＲ）又は陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を使用して検出され、グランザイム分泌免疫細胞活性化が行われている対象における位置及び／又は組織を区別する。

【0169】

ある特定の実施形態では、グランザイム分泌免疫細胞活性化について評価することは、生物レベルで行われる。いくつかの実施形態では、評価することは、標的領域内で行われる。いくつかの実施形態では、検出は、注射から０．５～２４時間後など、投与後の延長された時点（例えば、静脈内投与後などの注射後）で行われる。いくつかの実施形態では、検出は、投与後、例えば、注射後の複数の時点で生じる。

【0170】

いくつかの実施形態によれば、グランザイム分泌免疫細胞活性化について評価することは、病原体に対する免疫応答の一部として活性化された免疫細胞について評価することを含む。ある特定の実施形態では、病原体は、対象において疾患を引き起こすことができる微生物である。いくつかの実施形態によれば、対象は、病原体感染を有するか、又はその疑いがある。

【0171】

いくつかの実施形態では、グランザイム分泌免疫細胞活性化について評価することは、ウイルス感染に対する免疫応答の一部として活性化された免疫細胞について評価することを含む。そのようなウイルス感染の例としては、アデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）、アレナウイルス科（例えば、マチュポウイルス）、ブニヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス又はリフトバレー熱ウイルス）、コロナウイルス科、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス及びマールブルグウイルス）、フラビウイルス科（例えば、日本脳炎ウイルス及び黄熱ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス）、パポウイルス科（例えば、乳頭腫ウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプサウイルス、又はパラインフルエンウイルス）、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、バリオラウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）、並びにトガウイルス科（例えば、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、及び風疹ウイルス）による感染が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ウイルスが肺炎を引き起こす。

【0172】

いくつかの実施形態によれば、グランザイム分泌免疫細胞活性化について評価することは、細菌感染に対する免疫応答の一部として活性化された免疫細胞について評価することを含む。そのような細菌感染の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（例えば、Ｅ．ｐｅｓｔｉｓ又はＥ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（例えば、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、又はＢ．ｓｕｉｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ又はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（例えば、Ｂ．ｍａｌｌｅｉ又はＢ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（例えば、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ（例えば、Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、又はＲ．ｔｙｐｈｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ（例えば、Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ）による感染が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、又はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。いくつかの実施形態によれば、細菌はＥ．ｃｏｌｉである。ある特定の実施形態では、細菌はＳ．ａｕｒｅｕｓである。ある特定の実施形態では、細菌はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。いくつかの実施形態によれば、細菌はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。

【0173】

いくつかの実施形態では、グランザイム分泌免疫細胞活性化について評価することは、対象におけるＴ細胞疲弊の存在又は非存在について評価することを含む。Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞の機能（例えば、グランザイム分泌）の劣化及び喪失によって特徴付けられ、Ｔ細胞の喪失に至る。例えば、Ｔ細胞疲弊の存在又は非存在を経時的にグランザイム分泌免疫細胞の活性化の変化について評価することによって同定するために、本開示のプロ分子を１つ以上の時点（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上の時点）で対象に投与してもよい。上記のように、グランザイムによって切断され、かつ蛍光カーゴ部分又はそれにコンジュゲートされた放射性同位体カーゴ部分を有する切断可能なＸ^２リンカーを有するプロ分子を、対象に静脈内投与する。グランザイム分泌免疫細胞活性化が存在する場合、プロ分子はグランザイムによって切断され、部分Ａは立体構造変化を受けてアルファ－ヘリカル構造を形成し、グランザイム分泌免疫細胞活性化の近傍の細胞膜に挿入し、グランザイム分泌免疫細胞の活性化の位置は、蛍光部分又は放射性同位体を可視化することによって検出され得る。複数の時点でのプロ分子の投与及びグランザイム分泌免疫細胞活性化の可視化に続いて、経時的にグランザイム分泌免疫細胞活性化の程度の変化を定性的及び／又は定量的に評価することができる。グランザイム分泌免疫細胞の活性化が存在しないか、又は減少している場合、それぞれ、シグナルは検出されないか、又は減少したシグナルが検出されることになる。グランザイム分泌免疫細胞活性化の程度の減少は、Ｔ細胞機能の減少及びＴ細胞疲弊の存在を示す。

【0174】

いくつかの実施形態では、グランザイム分泌免疫細胞活性化について評価することは、対象における免疫応答について評価することを含む。更なる実施形態では、免疫応答について評価することは、対象が免疫関連の有害作用を発症するリスクを抱えているかどうかを評価することを含む。例えば、本開示のプロ分子は、グランザイム分泌免疫細胞活性化の位置を決定するために、対象に投与される。上記のように、グランザイムによって切断され、かつ蛍光カーゴ部分又はそれにコンジュゲートされた放射性同位体カーゴ部分を有する切断可能なＸ^２リンカーを有するプロ分子を、対象に静脈内投与する。グランザイム分泌免疫細胞活性化が存在する場合、プロ分子はグランザイムによって切断され、部分Ａは立体構造変化を受けてアルファ－ヘリカル構造を形成し、グランザイム分泌免疫細胞活性化領域の細胞膜に挿入し、グランザイム分泌免疫細胞活性化領域は、蛍光部分又は放射性同位体を可視化することによって検出され得る。本開示の方法による、正常（例えば、非腫瘍）組織における全身性グランザイム分泌免疫細胞活性化の検出は、免疫関連の有害作用を発症するリスクを抱える対象を同定するのに役立ち得る。

【0175】

対象におけるモニタリング療法
いくつかの実施形態では、本開示のプロ分子は、療法の進行をモニタリングするために、療法中又は療法後に対象に投与される。例えば、免疫調節療法が対象に行われた後、グランザイム分泌免疫細胞の活性化が生じたかどうかと、前述の活性化された免疫細胞の位置を決定するために、本開示のプロ分子を対象に投与してもよい。上記のように、グランザイムによって切断され、かつ蛍光カーゴ部分又はそれにコンジュゲートされた放射性同位体カーゴ部分を有する切断可能なＸ^２リンカーを有するプロ分子を、対象に静脈内投与する。グランザイム分泌免疫細胞の活性化が存在する場合、プロ分子は、免疫細胞活性化の部位においてグランザイムによって切断され、部分Ａは立体構造変化を受けてアルファ－ヘリカル構造を形成し、近傍の細胞膜に挿入し、グランザイム分泌免疫細胞の活性化は、蛍光部分又は放射性同位体を可視化することによって検出され得る。グランザイム分泌免疫細胞の活性化が存在しないか、又は減少している場合、それぞれ、治療の部位においてシグナルは検出されないか、又は減少したシグナルが検出されることになる。次いで、この情報は、治療する医師によって、治療努力の進行をモニタリングするために使用され得る。

【0176】

いくつかの実施形態では、療法の進行をモニタリングすることは、対象における免疫調節療法の進行をモニタリングすることを含む。いくつかの実施形態では、免疫調節療法は、細胞ベースの療法（すなわち、医療目的のための対象への自系若しくは同種異系細胞物質の移入）、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路調節、免疫チェックポイント阻害、化学療法、電離放射線、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、免疫調節療法は、細胞ベースの療法を含む。いくつかの実施形態では、細胞ベースの療法は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）療法、又は操作されたＴ細胞受容体を含むＴ細胞の投与を含む。いくつかの実施形態では、免疫調節療法は、対象のがんを治療するために使用される。

【0177】

特定の実施形態では、細胞ベースの療法は、受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は組換えＴＣＲなどのＴ細胞受容体（ＴＣＲ））を発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）を投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、細胞がその表面で受容体を発現するように操作される場合、受容体の細胞外結合ドメインは、がん細胞の表面で発現される腫瘍抗原に特異的に結合する。受容体の細胞外結合ドメインが特異的に結合し得る腫瘍抗原の非限定的な例としては、５Ｔ４、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ｃ－ＭＥＴ、Ｃ４．４ａ、炭酸脱水酵素６（ＣＡ６）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、カドヘリン－６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、がん胎児性（ＣＥＡ）、ｃＫｉｔ、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、ＣＳ１、デルタ様カノニカルノッチリガンド３（ＤＬＬ３）、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）、エフリンＡ４（ＥＦＮＡ４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エクトヌクレオチドピロファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ＧＤ２ガングリオシド、糖タンパク質非転移性Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンアルファ、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ－１）、ルイスＹ、ＬＩＶ－１、ロイシンリッチリピート含有１５（ＬＲＲＣ１５）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン－４、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ｐ－カドヘリン（ｐ－ＣＡＤ）、プログラム細胞死受容体リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死受容体リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ＳＬＩＴ様ファミリーメンバー６（ＳＬＩＴＲＫ６）、ＳＴＥＡＰファミリーメンバー１（ＳＴＥＡＰ１）、組織因子（ＴＦ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質－１（ＴＩＭ－１）、Ｔｎ抗原、トロホブラスト細胞表面抗原（ＴＲＯＰ－２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、及びＶＥＧＦ－Ａが挙げられる。

【0178】

いくつかの実施形態では、がんを治療するための免疫調節療法の進行をモニタリングすることは、免疫調節療法に対する応答性について対象の腫瘍を評価することを含む。例えば、対象ががんの免疫調節療法を受けている間、グランザイム分泌免疫細胞の活性化が腫瘍の近傍で発生したかどうかを決定するために、本開示のプロ分子が対象に投与される。上記のように、グランザイムによって切断され、かつ蛍光カーゴ部分又はそれにコンジュゲートされた放射性同位体カーゴ部分を有する切断可能なＸ^２リンカーを有するプロ分子を、対象に静脈内投与する。腫瘍の近傍にグランザイム分泌免疫細胞活性化が存在する場合、プロ分子はグランザイムによって切断され、部分Ａは立体構造変化を受けてアルファ－ヘリカル構造を形成し、腫瘍の近傍の細胞膜に挿入し、腫瘍の近傍のグランザイム分泌免疫細胞の活性化の位置は、蛍光部分又は放射性同位体を可視化することによって検出され得る。

【0179】

いくつかの実施形態では、免疫調節療法の進行をモニタリングすることは、上記のように、対象におけるＴ細胞疲弊の存在又は非存在について評価することを含む。例えば、対象が、治療用Ｔ細胞の対象への投与を含む免疫調節療法を受けている間、１つ若しくは複数の時点でのグランザイム分泌治療用Ｔ細胞の活性化について評価する（例えば、Ｔ細胞疲弊の存在若しくは不在、又は程度を同定する）ことによってＴ細胞疲弊を評価するために、本開示のプロ分子を１つ若しくは複数の時点で対象に投与してもよい。グランザイム分泌免疫細胞活性化の程度の減少は、Ｔ細胞機能の減少及びＴ細胞疲弊の存在を示す。

【0180】

いくつかの実施形態では、免疫調節療法の進行をモニタリングすることは、上記のように、対象における免疫応答をモニタリングすることを含む。更なる実施形態では、免疫応答のモニタリングは、上記のように、対象が免疫関連有害作用を発症するリスクを抱えるかどうかを評価することを含む。例えば、本開示のプロ分子は、上記のように、グランザイム分泌免疫細胞活性化の位置を決定するために、対象に投与される。正常組織（例えば、非腫瘍組織）における全身性グランザイム分泌免疫細胞活性化の検出は、対象が免疫関連有害作用を発症するリスクを抱えることを示す。

【0181】

診断用途における切断産物Ａ及びＺの検出方法
切断産物Ａ及びＺは、蛍光顕微鏡法、Ｘ線法、蛍光透視法、血管造影法、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）などを含むがこれらに限定されない、様々なイメージング及び検出モダリティにより検出され得る。検出は、切断産物が位置する細胞又は組織を直接イメージングすることによって、又は切断産物が位置する細胞又は組織を抗体などの二次分子又は試薬と接触させ、続いて二次分子又は試薬をイメージング又は検出することによって達成することができる。

【0182】

いくつかの実施形態では、切断産物のうちの１つ以上は、検出を容易にするカーゴ部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、カーゴ部分は、蛍光色素である。そのような実施形態では、カーゴ部分は、蛍光顕微鏡を使用して直接検出され得、細胞、組織、又は対象全体が蛍光顕微鏡のフィールドに配置され、直接可視化される。

【0183】

いくつかの実施形態では、カーゴ部分は、放射性同位体である。そのような実施形態では、カーゴ部分は、Ｘ線法、蛍光透視法、血管造影法、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、又は単一陽電子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用して検出され得、細胞、組織、又は対象全体が、イメージングモダリティのフィールドに配置され、可視化される。

【0184】

いくつかの実施形態では、切断産物は、切断産物に特異的に結合するか、又は切断産物と相互作用する二次分子若しくは試薬、例えば抗体、例えば、切断産物中のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を使用して検出される。そのような実施形態では、切断産物を含有する細胞又は組織を二次分子又は試薬と接触させ、続いて二次分子又は試薬をイメージング又は検出する。

【0185】

いくつかの実施形態では、切断産物の存在の検出及びそれについての評価は、生物レベルで行われる。いくつかの実施形態では、検出及び評価は、標的領域内で実行される。いくつかの実施形態では、検出は、注射から０．５～２４時間後など、投与後の延長された時点（例えば、静脈内投与後などの注射後）で行われる。いくつかの実施形態では、検出は、投与後、例えば、注射後の複数の時点で行われる。

【0186】

スクリーニング方法
本開示のプロ分子は、スクリーニング方法、例えば、所望の活性のための候補薬剤のインビトロ又はインビボスクリーニングに使用される。いくつかの実施形態では、本開示は、インビトロで細胞をスクリーニングするための方法、例えば、細胞によって発現されるグランザイムの活性を評価するため、又は細胞内のグランザイム活性を調節する候補薬剤についてスクリーニングするための方法に関する。他の実施形態では、本開示は、例えば、疾患のトランスジェニック動物モデルにおける所望のグランザイム活性について候補薬剤をスクリーニングするために使用することができるインビボスクリーニング方法に関する。

【0187】

いくつかの実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、細胞をインビトロで、グランザイムによって切断されるように設計されたＸ^２リンカーを有するプロ分子と接触させることを含む。グランザイム分泌免疫細胞が活性化される場合、プロ分子は切断され、膜相互作用ペプチドを含有する切断産物は立体構造変化を受け、典型的には細胞の近傍のリン脂質二重層と相互作用するアルファ－ヘリカル構造を形成し、それによってグランザイム分泌免疫細胞活性化の近傍の領域を標識する。次いで、膜相互作用ペプチドを含む切断産物にコンジュゲートされた検出可能な部分を検出することができ、これは、グランザイム分泌免疫細胞活性化のスクリーニングを容易にする。したがって、所与の場所又は位置に蓄積する切断産物の量を使用して、所望のグランザイム活性についてスクリーニングすることができる。

【0188】

本開示の方法はまた、所望の活性を有する候補薬剤又は試験化合物、例えば、グランザイム活性又はグランザイム分泌免疫細胞の活性化を調節する候補薬剤を同定するために使用することができるスクリーニング方法に関する。いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、インビトロで細胞を培養し、細胞を候補薬剤又は試験化合物と接触させることを含む。次いで、培養細胞を、目的のグランザイムによって切断される切断可能なリンカーを含む本開示のプロ分子と接触させる。培養細胞内で所望のグランザイム活性を誘発する候補薬剤又は試験化合物は、Ｘ^２の切断をもたらす切断促進条件の産生を促進する。Ｘ^２の切断後、膜相互作用ペプチドを含む切断産物は、立体構造変化を受けて、近くのリン脂質二重層に挿入して標識するアルファ－ヘリカル構造を形成する。候補薬剤又は試験化合物の存在下での標識レベルの増加は、候補薬剤又は試験化合物の非存在下での標識レベルと比較して、候補薬剤又は試験化合物が所望の活性を有することを示す。

【0189】

本開示の方法はまた、インビボで細胞をスクリーニングする方法、例えば、所望の活性を有する候補薬剤又は試験化合物、例えば、グランザイム活性又はグランザイム分泌免疫細胞の活性化を調節する候補薬剤を同定する方法に関する。例えば、上述のスクリーニング方法は、目的の特定のグランザイムを発現する（若しくは発現しない）目的の細胞若しくは組織を同定するために、又は候補薬剤若しくは試験化合物に応答してグランザイム発現若しくは活性を調節する細胞若しくは組織を同定するために、動物モデル、例えば、疾患のトランスジェニック動物モデルにおいてインビボで実施され得る。

【0190】

キット
また、本開示によって提供されるのは、本明細書に開示されるプロ分子を使用するための、及び上記の方法を実施するためのキットである。このキットは、疾患又は症状が診断される対象にプロ分子を投与するために提供され得る。本キットは、本明細書に開示されるプロ分子及び／又はカーゴ部分のうちの１つ以上を含み得、これは無菌容器内に提供されてもよく、かつ対象に投与するための適切な薬学的に許容され得る医薬品添加剤とともに製剤で提供されてもよい。プロ分子は、そのまま使用する準備ができている製剤で提供され得るか、又は所望の濃度を有するように再構成され得る。プロ分子がユーザによって再構成されるように提供される場合、キットはまた、対象のプロ分子とは別個にパッケージされた緩衝液、薬学的に許容され得る医薬品添加剤などを提供し得る。

【0191】

上述の構成要素に加えて、キットは、本開示の方法を実践するためにキットの構成要素を使用するための説明書を更に含み得る。主題の方法を実践するための説明書は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基材上に印刷され得る。したがって、説明書は、添付文書として、キットの容器又はその構成要素のラベンリング（すなわち、包装又はサブ包装に関連付けられる）などにおいてキットに存在し得る。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。更に他の実施形態では、実際の説明書はキットに存在しないが、例えば、インターネットを介してリモートソースから説明書を入手する手段が提供される。この実施形態の例は、説明書を閲覧することができる、及び／又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、これは、説明書を得るための手段が適切な基材上に記録されることを意味する。

【実施例】

【0192】

以下の実施例は、例示として提示されるものであって、限定として提示されるものではない。

【0193】

実験
実施例１－グランザイム切断可能な制限付き相互作用ペプチド（ＧＲＩＰ）の設計及び合成
組換えヒトＧＺＭＢに対する質量分析（ＭＳＰ－ＭＳ）を使用したマルチプレックス基質プロファイリングを行って、ＧＺＭＢを標的とするＲＩＰに組み込む最適な切断配列を同定した。ＭＳＰ－ＭＳライブラリーには２２８－１４量体ペプチドが含まれており、物理化学的に多様で、配列多様性が最大となるように合理的に設計された基質の集団である（図１のパネルＢ）。ほとんどのプロテアーゼは、基質の認識及び切断のために２つの最適に位置決めされたアミノ酸を必要とするという観察に基づいて、全ての隣接（ＸＹ）及び近接（Ｘ＊Ｙ、Ｘ＊＊Ｙ）アミノ酸ペアリングを組み込むことによって、ペプチドライブラリー内に物理化学的多様性を生成した。様々な時点での天然ＧＺＭＢのインキュベーション時に、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣＭＳ－ＭＳ）を介したペプチドシーケンシングによって切断を同定した。続いて、ペプチドライブラリー内の切断位置及び非切断位置の両方を考慮する統計分析を行い、グランザイムＢ Ｐ４～Ｐ４’部位にまたがる好ましい基質配列のｉｃｅＬｏｇｏ表現を構築した（図１のパネルＣ）。

【0194】

ｉｃｅＬｏｇｏの結果は、Ｐ２＝Ｐ、Ｐ１＝Ｄ、及びＰ２’＝Ｓ（すなわち、ＸＸＰＤＸＳＸＸ）の保存された部位を有する４つの配列が等しく特異的で効率的なＧＺＭＢ基質であることを示唆した。配列ＩＥＰＤＶＳＱＶ（配列番号５７）が２つの理由により候補に挙げられた。第一に、Ｐ４～Ｐ１配列は、直交アプローチ、すなわち、位置走査合成コンビナトリアルライブラリーを使用して、ＧＺＭＢに特異的であることが以前に発見され、この配列は、他のヒトグランザイムと比較して、ＧＺＭＢにより特異的に認識されることが示された。第二に、ＩＥＰＤテトラペプチドは、ＧＺＭＢを標的とする共有結合性可逆性アルデヒド放射性トレーサーの一部としてインビボで研究されており、テトラペプチド－アルデヒドは、ＧＺＭＢの標識に有効であり、インビボで安定しているように見えた。

【0195】

ＧＺＭＢによるＩＥＰＤＶＳＱＶ（配列番号５７）切断の動態を、蛍光消光ペプチド基質を使用してインビトロでアッセイし、Ｐ１’～Ｐ４’配列ＶＳＶＱを組み込むことで、ＩＥＰＤ単独で以前に報告された値と比較して、ｋｃａｔ／Ｋｍが有意に改善された（約８０００Ｍ^－１秒^－１対約３３００Ｍ^－１秒^－１、図１のパネルＤを参照のこと）。全長グランザイムＢ切断可能な制限付き相互作用ペプチド（ＧＲＩＰ Ｂ）プローブを生成するために、この配列を、膜相互作用ドメインとしてＴｅｍｐｏｒｉｎ Ｌ（ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫ；配列番号３）、及びマスキングドメインとしてＰＡＲ１（ＱＤＰＮＤＱＹＥＰＦ；配列番号７）ペプチドを使用して隣接させた（図１のパネルＥを参照のこと）。重要なことに、全長ＧＲＩＰ Ｂは、組換えヒトＧＺＭＢによって効率的に切断され、Ｔｅｍｐｏｒｉｎ Ｌもマスキングドメインもタンパク質分解を妨げないことが示された。

【0196】

基質配列ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫ（配列番号３）を、トロンビン、カスパーゼ３、カスパーゼ８、グランザイムＫ、ＭＭＰ９、及びＣ１Ｓと比較したグランザイムＢに対する特異性について、基質を６０μＭ、３７℃、ＰＢＳ、１ｍＭ ＤＴＴ、及びｐＨ７．４の緩衝液とした５ｎＭ濃度で評価した。図１のパネルＦに示されるように、基質配列は、試験した他のプロテアーゼと比較して、グランザイムＢに対して非常に特異的である。

【0197】

実施例２－^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂのインビトロ機構及び放射性合成
ＧＲＩＰ Ｂのタンパク質分解的に切断されたバージョンは、膜に効果的に結合することを確認した。Ｎ末端に５ＦＡＭタグ付きバージョンのＧＲＩＰ Ｂを合成し、細胞及び組換えヒトグランザイムＢ又はビヒクルとインキュベートした。フローサイトメトリーは、インタクトなＧＲＩＰ Ｂが細胞膜との相互作用が低いことを示したが、ＧＲＩＰ Ｂを細胞及び２０ｎＭの組換えＧＺＭＢと共インキュベートすると、蛍光標識された細胞膜が得られた（図２のパネルＡを参照のこと）。切断されたＧＲＩＰ Ｂペプチドの脂質ミセルへの挿入は、トリプトファン蛍光を測定することによって更に確認した。最後に、全長又はタンパク質分解的に切断されたＧＲＩＰ Ｂは、インビトロでヒト赤血球に対する毒性を示さないことが示された（図２のパネルＢ）。

【0198】

ＧＲＩＰ Ｂを、放射性標識のためのキレート剤にカップリングするために、ペプチドを、固体支持体上で１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ酢酸モノ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＯＴＡ－ＮＨＳ－エステル）と反応させ、これを、Ｎ末端フェニルアラニン上のアミノ基にライゲーションした。続いて、ＤＯＴＡ－ＧＲＩＰ Ｂを脱保護し、樹脂から切断し、セミ分取ＨＰＬＣで精製した。

【0199】

ＤＯＴＡ－ＧＲＩＰ Ｂは、その半減期（ｔ_１／２～１３時間）が、注入後の長い時間ウィンドウで研究を行い、イメージングに最適な時点を同定できるため、次に銅－６４で放射性標識した。^６４ＣｕＣｌ_２を、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＤＯＴＡ－ＧＲＩＰ Ｂとともに室温で３０分間インキュベートした。反応を、本発明の薄層クロマトグラフィーを介して完全性についてモニタリングし、ＨＰＬＣを使用して精製した（図２のパネルＣ）。崩壊補正収率は一貫して＞９５％であり、純度は＞９９％であった。比放射能は、３回の放射性合成で約０．４Ｃｉ／μｍｏｌであった。^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ ＢをリコンビナントヒトＧＺＭＢとインキュベートすると、３０分以内に１つの放射性標識産物に変換され、ＨＰＬＣで低温で切断されたＤＯＴＡ－ペプチド断片と一致した（図２のパネルＤ）。最後に、血清安定性をマウス血清中でインビトロ試験した。ｉＴＬＣでは、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂは、３７℃で４時間にわたって＞９８％安定であることが観察された。

【0200】

実施例３－免疫調節療法はマウス腫瘍モデルにおける^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの生体内分布における全身の変化を誘導する
トレーサーの薬物動態及び正常組織の生体内分布を理解するために、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂを最初にＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに静脈内注射し、続いて６０分間の動的ＰＥＴ取得を行った（図３のパネルＡ）。関心領域分析は、プローブがｔ_１／２～８分で血液プールからクリアランスされたことを示した。クリアランスの優勢なモードは腎臓であり、腎臓の外側の唯一の実質的な放射性トレーサーの蓄積が肝臓で観察された。注射後２４時間までの正常組織における放射性トレーサーの分布を評価するために、生体内分布研究を行った。生体内分布データは、腎臓及び肝臓における組織関連活性の最高レベルを示す画像所見を裏付けるものであった。

【0201】

次に、免疫調節療法に応答するマウス結腸直腸がん細胞株である皮下ＣＴ２６腫瘍を有するマウスにおいて、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ生体内分布に及ぼす免疫調節療法の効果を評価した。マウスを、ビヒクル又は抗ＰＤ１＋抗ＣＴＬＡ４ ＣＰＩの３回の腹腔内注入で１１日間処理した。放射性トレーサーを１４日目に注射し、ＰＥＴに注射してから２４時間後まで、腫瘍取り込みを数時間にわたってモニタリングした。静的ＰＥＴ／ＣＴ画像のＲＯＩ分析は、処置した腫瘍における^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの取り込みが、注射後０．５時間から２～４時間に着実に上昇したことを示した（図３のパネルＢ）。注目すべきことに、放射能は腫瘍に注射後２４時間まで持続しており、これは腫瘍に不可逆的な放射性トレーサーが捕捉されるメカニズムと一致している。更に、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みは、注射後２時間で、ビヒクル処置群と比較して、ＣＰＩにおいて有意に高かった。動的ＰＥＴ取得に由来する時間活性曲線は、ＣＰＩ処置マウスにおける^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍蓄積が急速であり、注射後１０分以内に約５％ＩＤ／ｃｃのレベルに達したことを示した（図３のパネルＣ）。更に、コンパートメントモデリングにより、ｋ_３＞＞ｋ_４、及びｋ_４～０が示され、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂが、予想どおり腫瘍内で切断され捕捉されることを示唆した。比較すると、ビヒクル腫瘍における放射性トレーサー取り込みは有意に低く、経時的に変化しなかった。

【0202】

注射から２時間後に生体内分布研究を行って、ビヒクル内の組織と、処置した群との間のトレーサー取り込みの相対的変化を決定した。これらのデータは、対照マウスと比較して、処置したマウスからの腫瘍における約５０％の放射性トレーサー取り込みの誘導を示した（図３のパネルＤ）。脾臓内のトレーサー取り込みの顕著な増加が観察されたが、これは、我々及び他の者が記録してきた全身性免疫チェックポイント阻害剤によるＴ細胞の刺激と一致している。デジタルオートラジオグラフィー（ＤＡＲ）は、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂが、処置した腫瘍において対照腫瘍と比較して有意に高く、放射性トレーサー結合の領域が、ＧＺＭＢ及びＴ細胞マーカーＣＤ３の発現と一致したことを示した（図３のパネルＥ）。

【0203】

実施例４－^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの処置後変化は、ＧＺＭＢタンパク質分解活性に起因する
ＧＺＭＢプロテアーゼ部位（ＩＥＰｄＶＳＱＶ；配列番号６１）内にＤ－アスパラギン酸を保有し、ＧＺＭＢによるタンパク質分解を防止するプローブである^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂを調製して、処置後の「フレア効果」が^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂのタンパク質分解を必要とするかどうかを試験した。プローブは、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの合成と同様のアプローチを使用して、ＤＯＴＡで機能化され、Ｃｕ－６４で放射性標識された。生体内分布研究は、ＣＰＩ処置が対照と比較して^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みの増加を引き起こさなかったことを示した（図４のパネルＡ）。

【0204】

次に、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ及び^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂの生体内分布を、ＭＣ３８（マウス結腸直腸がん）又はＥＭＴ６（マウス乳房がん）異種移植片を有するマウスで比較した。マウスを、ビヒクル又は抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ４ ＣＰＩで、ＣＴ２６コホートに使用したスキーマに従って処置した。生体内分布データは、両方のコホートにおける^６４Ｃｕ－Ｌ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みの顕著な増加を示したが、^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂは、予想どおり対照と比較して腫瘍において誘導されなかった（図４のパネルＡ）。更に、処置した腫瘍における^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂ取り込みの絶対レベルは低く、未処置の腫瘍における^６４Ｃｕ－Ｌ－ＧＲＩＰ Ｂのベースライン取り込みと同等であった（図４のパネルＢ）。脾臓における基礎的な^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂの取り込みも低く、免疫チェックポイント阻害剤による処置の影響を受けなかった（図４のパネルＣ及びＤ）。

【0205】

最後に、ＧＺＭＢが^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ生体内分布における処置後の変化に関与していることを確認するために、生殖細胞系ホモ接合体ＧＺＭＢノックアウトマウスにＣＴ２６腫瘍を接種し、マウスにおける^６４Ｃｕ－Ｌ－ＧＲＩＰ Ｂの相対的な生体内分布を、ビヒクル又はＣＰＩによる処置後に評価した。腫瘍及び脾臓曝露ＣＰＩにおいて、ビヒクルと比較して、放射性トレーサー取り込みにおける処置後の有意な変化は観察されなかった（図４のパネルＥ及びＦ）。

【0206】

実施例５－^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みにおける処置後の変化は、腫瘍体積の変化と相関する
比較的高いレベルのＧＺＭＢ活性で濃縮された腫瘍は、ＧＺＭＢ不良腫瘍と比較して、より有意にデバルクすると予想され得る。これを確認するために、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みにおける処置後の変化を、抗腫瘍効果との相関について評価した。１１日目の^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みは、０日目と比較して、１１日目の腫瘍体積の変化率と有意に相関していた（図５のパネルＡ）。^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ腫瘍対１１日目の血液比もまた、腫瘍体積の変化率と有意に相関した（図５のパネルＢ）。対照的に、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの腫瘍取り込みも腫瘍対血液比も、ＧＺＭＢノックアウトマウスバックグラウンドにおける腫瘍体積の変化率と相関しなかった（図５のパネルＣ及びＤ）。

【0207】

実施例６－^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴを用いた研究は、肺炎における分泌型ＧＺＭＢの役割を示唆する
明確には定義されていないが、分泌型ＧＺＭＢに対する非細胞傷害性機能は、いくつかの生理学的過程、例えば、炎症において提案されている。^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂが炎症による分泌ＧＺＭＢの病原性リザーバを潜在的に局在化できるかどうかを試験するために、リポ多糖（ＬＰＳ）を気管内滴下した野生型マウスで^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴ／ＣＴを行った。肺へのＴ細胞のリクルートメントが起こる時点である滴下４日後にＰＥＴ／ＣＴを行った。ＲＯＩ分析は、ビヒクルと比較して、低（０．１ｍｇ／ｋｇ）及び高（３ｍｇ／ｋｇ）用量のＬＰＳで処置したマウスの肺における有意に高い放射性トレーサーの蓄積を示した（図６のパネルＡ及びＢ）。肺のオートラジオグラフィー及び免疫蛍光は、予想どおり、ＬＰＳ処置した肺において視覚的により高い放射性トレーサー結合を示し、これはまたＧＺＭＢ及びＣＤ３染色と共局在した（図６のパネルＣ）。３ｍｇ／ｋｇのＬＰＳが全身的なＴ細胞活性化を引き起こす可能性があるため、より多くのマウス臓器で放射性トレーサー取り込みを調べた。エクスビボ生体内分布研究は、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂが、いずれの用量でも、脾臓及び胸腺などのリンパ系器官を含む多くの組織において、ビヒクルマウスと比べてＬＰＳ処置マウスで有利に高かったことを示した（図６のパネルＤ）。顕著なことに、ＬＰＳの気管内滴下に起因するＴ細胞活性化に対する全身的な影響も、処置アーム間の最大強度投影を比較することによって視覚的に明らかであった（図６のパネルＥ）。

【0208】

実施例７－^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴ／ＣＴによる活性化ＣＡＲ Ｔ細胞から分泌されるグランザイムの検出
皮下ＲＡＪＩ異種移植片を有するマウス及び投与された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴ／ＣＴを使用してイメージングした。末梢血単核細胞を正常な血液ドナーの白血球減少フィルター（Ｖｉｔａｌａｎｔ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）から得た。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気ビーズ選択により単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、検証済みの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物でレンチウイルス形質導入し、ＩＬ－２でインビトロ増殖させた。並行して、マウスの右脇腹に１ｅ６ Ｒａｊｉ細胞を皮下注射した。約４００ｍｍ３の腫瘍サイズで、５ｅ６ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を各マウスにＩＶ移植した。マウスは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞又は空のＣＡＲ Ｔが投与された。６日後、マウスに^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ（約３００ｕＣｉ／マウス）を投与し、注射から０～４時間後にイメージングした。図７に示されるデータは、注射から４時間後に集められた画像及び関心領域分析を示す。

【0209】

更に、同所性ＲＡＪＩ異種移植片を有し、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞ベースの療法で処置したマウスを、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴ／ＣＴを使用してイメージングした。Ｒａｊｉ細胞（１ｅ５）を、尾静脈注射を介して同所性投与して、腹部組織における播種を促した。このモデルは、皮下Ｒａｊｉ腫瘍が本質的に免疫抑制性であることが知られているため評価した。

【0210】

末梢血単核細胞を正常な血液ドナーの白血球減少フィルター（Ｖｉｔａｌａｎｔ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）から得た。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気ビーズ選択により単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、検証済みの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物（Ｗｉｉｔａ ｌａｎ、ＵＣＳＦ）でレンチウイルス形質導入し、ＩＬ－２でインビトロ増殖させた。Ｒａｊｉ細胞を皮下移植した１週間後、５ｅ６ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を各マウスにＩＶ移植した。マウスは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞又は空のＣＡＲ Ｔが投与された。２又は６日後、マウスに^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ（約３００ｕＣｉ／マウス）を投与し、注射から０～４時間後にイメージングした。図８に示されるデータは、注射から４時間後に集められた画像及び関心領域分析を示す。図８のパネルＣは、死後肝臓線量測定を示す。まとめると、これらのデータは、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂが活性化ＣＡＲ Ｔ細胞からグランザイムＢの産生を検出することができることを示す。

【0211】

実施例８－^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴによる肺炎モデルにおける生産的な免疫応答の検出
次に、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴが肺炎モデルで生産的な免疫応答を検出できるかどうかを評価した。ＵＣＳＦのＬｏｏｎｅｙ研究室と共同で、マウスにウイルス又はシャムの鼻腔内滴下を受けさせ、感染から１０日後（Ｔ細胞の肺へのリクルートメントが達する時点）に^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂでイメージングした。図９に示されるように、感染した肺における放射性トレーサー取り込みは非常に高く、放射性トレーサーの注射から６時間後の健康な肺とは有意に異なる。更に、他の臓器、例えば、肝臓におけるＰＥＴには、高いトレーサー取り込みが認められた（＊Ｐ＜０．０１）。この予期せぬ発見は、肺及び他の臓器における生体内研究につながった。臓器当たりの相対的な放射性トレーサー取り込みを比較すると、ウイルス感染は、脾臓、肝臓、及び血液プールを含む多くの組織でより高い放射性トレーサー取り込みを誘導することが示された（＊Ｐ＜０．０１）。現在、これらの組織におけるグランザイムＢの発現は、オートラジオグラフィーとＩＦを使用して確認されており、病原体によるトレーサーの生体内分布の変化がグランザイムＢによるものであることを確認するための対照研究（Ｄ－アミノ酸プローブ、生殖細胞系列グランザイムＢノックアウトマウスにおけるイメージング）が行われている。

【0212】

実施例９－^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ ＰＥＴによる細菌感染に応答して活性化された免疫細胞から分泌されるグランザイムＢの検出
^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂはまた、細菌感染と闘おうと試みる活性化された免疫細胞から分泌されるグランザイムＢを検出することができるかどうかを調べるために試験された。生きたＥ．ｃｏｌｉ又は加熱死菌Ｅ．ｃｏｌｉを両側三角筋に移植したマウスのコホートを確立し、トレーサー取り込みの動態を試験した（図１０）。急速なトレーサー取り込みが筋炎病変において観察され、これは注射後５時間まで増加し、少なくとも２４時間まで持続した。更に、^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの取り込みは、加熱死菌移植部位と比較して、生きたＥ．ｃｏｌｉ膿瘍において有意に高かった。

【0213】

膿瘍における放射性トレーサー取り込みがグランザイムＢによるものであることを確認するために、生殖細胞系ＧＺＭＢノックアウトマウスにおいてイメージング研究を行った。マウスに生きたＥ．Ｃｏｌｉと加熱死菌Ｅ．Ｃｏｌｉを投与し、野生型マウスと同じプロトコルに従って注射及びイメージングを行った。ＰＥＴ／ＣＴ及び生体内分布データは、ＧＺＭＢノックアウトマウスの感染筋において、野生型と比較して^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ取り込みが低かったことを示した（図１１）。更に、ノックアウト株では、正常筋、生きたＥ．Ｃｏｌｉで処理した筋、加熱死菌Ｅ．Ｃｏｌｉで処置したマウスのトレーサー取り込み量にほとんど差はなかった。

【0214】

次に、生きたＥ．ｃｏｌｉに対するグランザイムＢ応答と、エンドトキシンＬＰＳのボーラスによる処置とを比較した。移植から３～４時間後に、マウスに^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂを投与し、連続的にイメージングした（図１２）。顕著なことに、生きたＥ．ｃｏｌｉ膿瘍はＬＰＳよりも有意に免疫刺激性が高く、注射後６～２４時間で放射性トレーサー取り込みの差が検出された。

【0215】

他の細菌株に対するグランザイムＢ応答も試験している。ＰＥＴによる免疫応答を理解するために、生死を問わずＳ．ａｕｒｅｕｓをマウスの三角筋に移植した。^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの蓄積は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染で観察されたものと類似しており、放射性トレーサー取り込みは、注射後０～６時間で急速に上昇し、６～２４時間からプラトーになることが見出された（図１３）。更に、大腸菌のデータから予想されるように、生菌膿瘍の放射性トレーサー取り込みは加熱死菌膿瘍よりも有意に高かった。興味深いことに、生菌膿瘍では、Ｅ．ｃｏｌｉのそれと比較して、より緩やかなグランザイムＢ応答が検出された。応答の違いの１つの可能性は、グランザイムＢが全ての病原体を攻撃するために均一に使用されるわけではなく、免疫細胞は、病原体の特徴に基づいてそれらのグランザイム応答をカスタマイズしている可能性がある。

【0216】

他の細菌株で追加の筋炎研究を行うと、ＰＥＴ上での予期せぬ多様なグランザイム「応答」が得られた。例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの両方が、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳ．ａｕｒｅｕｓの感染と定性的に類似した所見を示した（図１４）。三角筋の生菌感染における^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの取り込みは、加熱死菌に曝露した対側の三角筋において観察されたものよりも高かった。両方のマウスコホートにおいて、処置した筋肉における放射性トレーサー取り込みは、正常筋よりも高かった。

【0217】

２つの細菌種は、インビボで^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの生体内分布に影響を与えなかった（図１５）。Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ及びＬ．ｍｏｎｏｃｔｙｏｇｅｎｅｓも、加熱死菌対照と比較して、生菌膿瘍において^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂ取り込みを誘導しなかった。正常筋と比較した場合、放射性トレーサー取り込みの有意な増加が観察されたが、これはおそらく、異物に対する炎症反応を反映している可能性が高い。

【0218】

方法
一般的な方法
全ての試薬を商業的供給源から購入し、更に精製することなく使用した。^６４Ｃｕ－塩酸塩は、ウィスコンシン大学マディソン校から購入した。組換えヒトＧＺＭＢは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。マウスがん細胞株ＣＴ２６及びＥＭＴ６は、ＡＴＣＣから購入した。ＭＣ３８は、Ｋｅｒａｆａｓｔから購入した。抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）（ＢＥ０１４６）及び抗マウスＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）（ＢＥ０１６４）はＢｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌから購入し、抗グランザイムＢ（ａｂ４０５９）はＡｂｃａｍから購入し、抗ＣＤ３（ＭＣＡ１４７７）はＢｉｏ－Ｒａｄから購入し、ＡＦ４８８抗ウサギ（Ａ２１２０６）、ＡＦ５４６抗マウス（Ａ１１１０８１）及びＡＦ６３３抗マウス（Ａ２１０５２）二次抗体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＤＡＰＩ（Ｄ１３０６）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。免疫蛍光のための抗体。全ての細胞株を、製造業者の指示に従って培養した。

【0219】

質量分析によるマルチプレックス基質プロファイリング
ヒトＧＺＭＢ（１００ｎＭ）を、２２８個の合成テトラデカペプチド（５００ｎＭ）を含むライブラリーとともにインキュベートした。アリコート（１０μＬ）を３つの時間間隔で取り出し、続いて１０μＬの８Ｍ塩酸グアニジニウムでクエンチした。次いで、全てのタイムポイントが取られるまで、アリコートをフラッシュ凍結した。質量分析の前に、サンプルをＣ１８ ｔｉｐｓ（Ｒａｉｎｉｎ）を使用して脱塩した。次いで、アリコートを、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によるペプチド分離のために、１０，０００ｐｓｉのｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ）に結合したＱｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ）を使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシーケンシングにより分析した。ＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ（商標）イオン源に結合したＴｈｅｒｍｏ ＥＳ９０１ Ｃ１８カラム（内径７５μｍ、長さ５０ｃｍ）でペプチドを分離し、緩衝液Ｂ（アセトニトリル、０．５％ギ酸）中で２～５０％の６５分間の直線勾配で３００ｎＬ／分の流速を適用することによって溶出した。サーベイスキャンは、３２５～１５００ｍ／ｚの範囲で記録され、最大３つの最も強力な前駆体イオン（電荷≧２のＭＳ１特徴）が、ＭＳ／ＭＳについて、ｍ／ｚ２００で３０，０００の分解能で、より高いエネルギー衝突解離（ＨＣＤ）のために選択された［ＣＢ２］。データはＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを使用して取得し、前述のようにして処理した。簡潔に述べると、生の質量分析データは、ＭＳＣｏｎｖｅｒｔを使用してピークリストを生成するために処理された。次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒｖ．６．２．２で、２２８個のテトラデカペプチドライブラリーからの配列を含む独自のデータベースに対してピークリストを検索した。検索では、前駆体イオンでは２０ｐｐｍ、フラグメントイオンでは３０ｐｐｍの質量精度公差を使用した。可変的修飾には、グルタミン又はグルタミン酸からのＮ末端ピログルタミン酸変換、並びにトリプトファン、プロリン、及びチロシンの酸化が含まれた。続いて、検索はＭＳＰ－ｘｔｒａｃｔｏｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒａｉｋｌａｂ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｅｘｔｒａｃｔｏｒ．ｈｔｍｌ）を使用して処理このソフトウェアは、ペプチドの切断部位と対応する切断産物のスペクトルカウントを抽出する。スペクトルカウントを、ペプチド切断産物の相対定量に使用した。ヒトＧＺＭＢサンプルを、各時点につき３つの生物学的複製物として処理し、非酵素対照を各複製物に対して使用して、データ分析から非特異的切断を除去した。

【0220】

Ｆｍｏｃ－固相ペプチド合成
ＮＨ２－Ｋ（ＭＣＡ）ＩＥＰＤＶＳＱＶＫ（ＤＮＰ）－ＣＯＯＨ（配列番号６２）配列を合成したクエンチ蛍光発生ペプチドを、Ｂｉｏｔａｇｅ ＳｙｒｏＩＩペプチド合成機で周囲温度でＦｍｏｃ固相合成によって合成した。合成スケールは１２．５μＭであり、ＤＮＰクエンチャーがリジンのイプシロン窒素に連結されたプリロードされたリジン（２－ジニトロフェニル）Ｗａｎｇ樹脂を使用した。カップリング反応は、５００μＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の４．９当量のＨＣＴＵ（Ｏ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ－ホスフェート）、５当量のＦｍｏｃ－アミノ酸－ＯＨ、及び２０当量のＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）を用いて８分間振盪しながら行った。各アミノ酸位置をダブルカップリングし、その後のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中４０％４－メチルピペラジン５００μＬで１０分間、続いてＤＭＦ５００μＬで３分間、６回洗浄した。最終的なアミノ酸カップリングは、フルオロフォアであるリジン（７－メトキシクマリン－４－酢酸（ＭＣＡ））を含み、ＭＣＡは、リジンのイプシロン窒素に連結されていた。９５％トリフルオロ酢酸、２．５％水、及び２．５％トリイソプロピルシランで構成される５００μＬの溶液振盪しながら１時間かけてＷａｎｇの樹脂から切断した。次いで、粗ペプチド産物を３０ｍＬの冷１：１のジエチルエーテル：ヘキサン中で沈殿させ、次いで、ＤＭＳＯ：水：アセトニトリルの１：１：１の混合物中で溶解した。可溶かした粗製物を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰｒｅｐＳｔａｒ ２１８シリーズ分取ＨＰＬＣでＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｉｔ ５ Ｃ１８カラム（５ｍｍビーズサイズ、１５０×２１．２ｍｍ）を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。移動相Ａ及びＢは、それぞれ、水＋０．１％ＴＦＡ及びアセトニトリル＋０．１％ＴＦＡであった。精製されたペプチド産物は、減圧雰囲気下で溶媒を除去し、最終濃度が１０ｍＭのＤＭＳＯストックに可溶化した。純度を液体クロマトグラフィー－質量分析で確認し、原料を－２０℃で保存した。蛍光標識された５ＦＡＭ－ＧＲＩＰ Ｂを、９５～９８％の純度でＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。

【0221】

ＤＯＴＡ－ＧＲＩＰ Ｂの合成
ＤＯＴＡ－ＧＲＩＰ Ｂ（Ｄｏｔａ－ヘキサン酸－ＦＶＱＷＦＳＫＦＬＧＫＩＥＰＤＶＳＱＶＱＤＰＮＤＱＹＥＰＦ－ＣＯＯＨ；配列番号６３）を、上記の標準固相ペプチド合成条件を使用して最初に合成した。Ｎ末端ヘキサン酸を有する樹脂結合ペプチドを、２当量のｄｏｔａ－ＮＨＳ、５当量のＨＣＴＵ、及び２０当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と１２時間トリプルカップリングした。次いで、ＤＯＴＡ－ＧＲＩＰ Ｂプローブを切断し、精製し、蛍光性ペプチドについて記載したように分析した。

【0222】

インビトロ動態
動態測定は、コーニングブラック３８４ウェルフラットボトムプレートで実施し、ＢｉｏＴｅｋ Ｈ４マルチモードプレートリーダーで読み取った。ＧＺＭＢによるクエンチされた蛍光性ペプチド（ＮＨ２－Ｋ（ＭＣＡ）ＩＥＰＤＶＳＱＶＫ（ＤＮＰ）－ＣＯＯＨ；配列番号６２）のタンパク質分解を、ＰＢＳ中４０ｎＭの最終酵素濃度で行った。動態を３７℃で実施し、活性を１時間モニタリングした。Ｖｏは、ＲＦＵ／秒で１分及び３０分で計算した。次いで、切断された基質の標準曲線を使用して、初期速度をＭ／ｓに変換した。

【0223】

脂質挿入を測定する固有のトリプトファン蛍光分光法
全長及び活性化ＧＲＩＰ Ｂ内のトリプトファンの蛍光を、脂質ミセルの存在下又は非存在下で、ＢｉｏＴｅｋ Ｈ４マルチモードプレートリーダーでモニタリングした。５ｍｇ／ｍＬ^－１ストックとして、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を可溶化した。全長及び活性化ＧＺＭＢ－ＲＩＰを、最終ペプチド：脂質モル比が１：４０で、ＰＢＳ中で最終濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬ^－１になるように可溶化した。ペプチド：脂質懸濁液のトリプトファン放出スペクトルを、２９５ｎｍの励起波長で、３１０～４５０ｎｍのスキャンによって取得した。バンド幅は、励起及び放出の両方について５ｎｍであった。ＳＤＳ脂質の非存在下でのＰＢＳ中のペプチドのスペクトルを、０．０１ｍｇ／ｍＬ^－１の同じ濃度で取得した。

【0224】

ヒト赤血球の溶血を測定する毒性アッセイ
健康な匿名ドナーからの血液を、Ｔｒｉｍａ Ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒｓ（Ｖｉｔａｌａｎｔ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）から採取した。赤血球を、匿名の血液サンプルから単離した。全長ＧＲＩＰ Ｂ及び活性化ＧＲＩＰ Ｂを、健康なヒト赤血球に対するそれらの溶血活性について３連で測定した。ヒト赤血球のアリコートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に懸濁し、ＤＭＳＯ中で最初に可溶化した両ペプチドの連続希釈液とともにインキュベートした。ＤＭＳＯ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００をそれぞれ陰性及び陽性対照として並行してインキュベートした。インキュベーションは、３７℃で１時間であった。インキュベーション後、サンプルを２，０００×ｇで５分間遠心分離し、その上で上清を回収した。ＢｉｏＴｅｋ Ｈ４マルチモードプレートリーダーを使用して、赤血球によるヘモグロビンの放出について上清を測定し、５４０ｎｍの波長で上清の光学密度をモニタリングした。

【0225】

５ＦＡＭ－ＧＲＩＰ Ｂによるフローサイトメトリー
ＭＣ３８細胞（２×１０^５／ウェル）を１２ウェルプレートに播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。５ＦＡＭ－ＧＲＩＰ Ｂ（２００ｎＭ）及びＧＺＭＢ（２０ｎＭ）をＨＢＳＳに溶解させ、３７℃で２時間インキュベートした。ＨＢＳＳ（３００ｍＬ）中の５０ｎｍのＧＺＭＢを含む／含まない２００ｎＭのＲＩＰを、細胞とともにウェルに添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。プローブ溶液を除去し、細胞をＰＢＳで４～５回洗浄した。トリプシン（１００ｍＬ）を添加し、続いて３７℃で３分間インキュベートした。ＰＢＳをウェルに加え、全ての細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳ（３００ｍＬ）で更に希釈し、細胞ストレーナーに通した。実験は、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ細胞分析装置で行った。データを、ＦｌｏｗＪｏ及びＰｒｉｓｍ ８．０を使用して分析した。

【0226】

^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの放射性合成及びインビトロでの特徴付け
１．５ｍＬの反応バイアルに、５ｍＣｉの^６４Ｃｕ－塩化物（水溶液）を添加し、ｐＨをＮａ_２ＣＯ_３（２Ｍ）で７．０に調整した。ＤＯＴＡ－ＧＲＩＰ Ｂ（２０μＬのＤＭＳＯ中に５０μｇ）及び０．１ＭのＮＨ_４ＯＡＣ緩衝液（２００μＬ）の溶液をこの反応バイアルに加えた。反応混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。反応の進行を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｉｔ分析カラム（Ｃ１８、２００Å、４．６ｍｍ×１０ｃｍ、５μｍ）又はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）分析カラム（Ｃ１８、１００Å、４．６ｍｍ×２５０ｃｍ、１０μｍ）（７０：３０ ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ～９５：５ ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ、１０分間）を装備した分析ＨＰＬＣによってモニタリングした。粗反応物を、Ｃ１８ Ｓｅｐ－Ｐａｋカートリッジを使用して精製し、少量のＣＨ_３ＣＮで溶出した。次いで、ＣＨ３ＣＮを５０℃で真空及び穏やかなＮ_２（ｇ）の流れで除去して、純粋な^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂを得た。キレート化有効性は、通常、ＨＰＬＣに基づいて＞９０％である。更なるマウス研究のために、１０％ＤＭＳＯ、１０％ｔｗｅｅｎ８０及び８０％生理食塩水を含む製剤を採用した。５００ｕＬのＰＢＳ中の組換えグランザイムＢ（１０ｎＭ）に放射性トレーサー（約２００Ｃｉ）を添加することによって、グランザイムＢによる^６４Ｃｕ－ＧＲＩＰ Ｂの切断をインビトロで検証した。次いで、バイアルを３７℃でインキュベートした。Ｒａｄ－ＨＰＬＣを使用して、専用の時点での放射性トレーサーの切断をモニタリングした。

【0227】

動物の研究
全ての動物実験は、ＵＣＳＦの施設内動物管理使用委員会によって承認された。４～６週齢の雄又は雌のｂａｌｂ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ６／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、水及び餌に自由にアクセスできるように飼育した。全てのマウスに、５×１０^６個のＣＴ２６、ＭＣ３８、又はＥＭＴ６細胞を、培地及びＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（ｖ／ｖ１：１）の混合物中で左肩に皮下接種した。抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）（ＢＥ０１４６）及び抗マウスＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）（ＢＥ０１６４）をＢｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌから購入し、処置研究中に４℃で保管した。腫瘍接種後５日目、８日目、１１日目に、皮下腫瘍を有するマウスに、抗マウスＣＴＬＡ－４（２００ｕｇ）又は／及び抗マウスＰＤ－１（２００ｕｇ）、並びに併用療法又はＰＢＳをビヒクルとして投与した。マウスを秤量し、処置当日に腫瘍体積をノギスで測定した。１４日目に、全てのマウスをＰＥＴ／ＣＴ又はＢｉｏＤ研究に使用した。

【0228】

小型動物ＰＥＴ／ＣＴ
^６４Ｃｕ－Ｌ－ＧＲＩＰ Ｂ又は^６４Ｃｕ－Ｄ－ＧＲＩＰ Ｂ（約１００μＣｉ／マウス）を生理食塩中１００～１５０μＬの１００％ＤＭＳＯ及び１０％Ｔｗｅｅｎ８０に溶解し、尾静脈を介して注射した。一定期間の取り込み時間の後、マウスをイソフルラン（約２％）で麻酔し、ｍｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴスキャナ（Ｉｎｖｅｏｎ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）でイメージングした。静的イメージングのために、マウスを、ＰＥＴデータ取得のために３０分間、及びＣＴデータ取得のために１０分間スキャンした。動的取得のために、マウスを麻酔し、スキャナベッドに寝かせ、放射性トレーサーを静脈内注射した。動的取得を６０分間スキャンし、続いて１０分間のＣＴ取得を行った。

【0229】

リストモードのＰＥＴデータをヒストグラム化してサイノグラムを作成し、スキャナメーカーによって提供された２Ｄ順序付きサブセット期待値最大化アルゴリズムを使用して再構築した。減衰補正は、ＰＥＴデータ取得直後に取得した共登録ＣＴデータを用いて適用した。ＣＴは、以下の設定を使用して取得した。１２０ステップの２２０度の角度カバレッジ、各角度ステップ露光時間が１７５ｍｓに設定された８０ｋＶｐ及び０．５ｍＡで動作するＸ線管。全ての再構築された３Ｄ ＰＥＴ体積画像ボクセルを、事前に較正された定量化係数を使用してＢｑ／ｍｌに較正した。ＡＭＩＤＥソフトウェアを使用して、ＰＥＴ／ＣＴデータの再構築及び画像分析を行った。

【0230】

生体内研究
放射性トレーサー注射後の専用の時点で、マウスをＣＯ２（ｇ）窒息で安楽死させ、血液を直接心臓穿刺によって採取した。組織を採取し、秤量し、ガンマカウンター（Ｈｉｄｅｘ）で計数した。組織中の放射能量は、既知の放射能基準との比較によって決定した。サンプルを減衰補正し、採取された組織の注入用量／重量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表した。

【0231】

デジタルオートラジオグラフィー
腫瘍又は指定された組織を、ドライアイス中でＯＣＴで瞬間冷凍した。組織をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）で１０～２０ｕｍの厚さのスライスに切片化し、ガラススライド（ＶＷＲ）に直接取り付けた。ＧＥ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｃｒｅｅｎを、放射性組織を有するそのようなスライドに露光した。銅－６４の半減期を１０回行った後、スクリーンをリンイメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００）で現像した。Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して、画像を更に分析した。

【0232】

組織学
Ｈ＆Ｅ染色及びＩＦ染色は、ＵＣＳＦ及びＡｃｅｐｉｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）のＰａｔｈｏｌｏｇｙ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙによって行われた。免疫蛍光研究のために、腫瘍サンプルをアセトン－２０℃で２０分間浸漬し、続いてＭｅＯＨ４℃で１０分間浸漬した。抗原取り出しを、クエン酸緩衝液１０ｍＭ ｐＨ＝６で行い、サンプルをユニバーサルブロッキング緩衝液＋５％ヤギ及びロバ血清でブロックした。一次抗体：抗ＧＺＭＢ（ａｂ４０５９、Ａｂｃａｍ）（１：５０）、抗ＣＤ３（ＭＣＡ１４７７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）（１：１００）をサンプルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。そのような一次抗体を、ＡＦ４８８抗ウサギ（Ａ２１２０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：２００）、ＡＦ５４６ ＡＦ５４６抗マウス（Ａ１１１０８１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：２００）、及びＡＦ６３３抗マウス（Ａ２１０５２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：２００）二次抗体でサンプルとインキュベートすることによって検出した。ＤＡＰＩ核酸染色（Ｄ１３０６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、サンプルとともにインキュベートすることによって核を染色した（室温で１０分）。免疫蛍光結果は、グラッドストーン研究所のＨｉｓｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅによって行われた。全切片の画像は、Ａｎｄｏｒ Ｚｙｌａ ５．５ ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｌｆａｓｔ，ＵＫ）を装備したＶＥＲＳＡ自動スライドスキャナ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得した。個々の画像を、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使用して作成した。

【0233】

統計
ＰＲＩＳＭ ｖ８．０又はＯＲＩＧＩＮソフトウェアを使用して、全ての統計分析を行った。統計的に有意な差は、対応のない両側スチューデントＴ検定によって決定した。９５％信頼レベル（Ｐ＜０．０５）での変化のみを統計的に有意であるとみなした。

【0234】

したがって、上記の説明は単に本開示の原理を例示するに過ぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載又は示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な配置を考案することができることが理解されるであろう。更に、本明細書に列挙される全ての例及び条件付き言語は、主に、読者が本発明の原理及び当該技術を更に進めるために発明者が寄与する概念を理解するのを助けることを意図しており、そのような具体的に列挙される例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態を記載する、本明細書の全ての記述、並びにそれらの具体例は、それらの構造的及び機能的等価物の両方を包含することが意図されている。追加的に、そのような等価物は、構造に関係なく、現在知られている等価物と、将来開発される等価物との両方、すなわち、同じ機能を実行するように開発された任意の要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、説明された例示的な実施形態に限定されることを意図されていない。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【配列表】

2024527546000001.app

【国際調査報告】