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特表2024-527558間葉系幹細胞、これから分離された細胞外小胞、及びこれらの用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-25
(54)【発明の名称】間葉系幹細胞、これから分離された細胞外小胞、及びこれらの用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240718BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240718BHJP
A61K 35/35 20150101ALI20240718BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240718BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240718BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240718BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240718BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20240718BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240718BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240718BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240718BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N5/10
A61K35/35
A61P1/04
A61P1/16
A61P3/10
A61P17/02
A61P13/10
A61P19/02
A61P37/02
A61P29/00 101
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023580964
(86)(22)【出願日】2022-01-25
(85)【翻訳文提出日】2024-02-26
(86)【国際出願番号】 KR2022001337
(87)【国際公開番号】W WO2023282423
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】10-2021-0088371
(32)【優先日】2021-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0011024
(32)【優先日】2022-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 集会による発表 集会名：ＫＳＳＣＲ ２０２１ Ｗｉｎｔｅｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ 開催日：２０２１年１月２５日 開催場所：ＷＥＢ開催 主催者（Ｋｏｒｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518056140
【氏名又は名称】コングク ユニバーシティ インダストリアル コーオペレーション コーポレーション
(71)【出願人】
【識別番号】524001112
【氏名又は名称】ステメクスワン．，リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】516286604
【氏名又は名称】コングク ユニバーシティ グローカル インダストリー－アカデミック コラボレーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】チョ，サン－グ
(72)【発明者】
【氏名】イム，キョン ミン
(72)【発明者】
【氏名】アブダル デイエム，アーメド
(72)【発明者】
【氏名】イ，ス ビン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ユジン
(72)【発明者】
【氏名】カン，グン－ホ
(72)【発明者】
【氏名】キム，アラム
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BA10
4B065BA21
4B065BB25
4B065BC09
4B065BC11
4B065BC26
4B065BC46
4B065BD15
4B065BD16
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZA66
4C087ZA75
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZA96
4C087ZB07
4C087ZB11
4C087ZB15
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、間葉系幹細胞、これから分離された細胞外小胞、及びこれらの用途に関する。本発明の間葉系幹細胞は、ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量の増加及び／又はＰＴＧＳ２マーカーの発現量の減少特性を示すことによって、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの量を著しく減少させるので、多様な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的である。特に、本発明の間葉系幹細胞、又はこれから分離された幹細胞由来細胞外小胞は、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）動物モデルに投与する場合、ＩＣ／ＢＰＳ誘導過程で崩れた膀胱内壁を回復させ、炎症程度を緩和させるので、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群に対して優れた治療効能を有する。また、本発明の間葉系幹細胞、又はこれから分離された幹細胞由来細胞外小胞は、創傷治癒効果に優れるので、創傷治癒用として有用に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の（Ａ）及び（Ｂ）から選ばれる１種以上の特性を示す間葉系幹細胞：（Ａ）ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量の増加；及び
（Ｂ）ＰＴＧＳ２マーカーの発現量の減少。
【請求項2】
前記間葉系幹細胞は、ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１マーカーの発現量が増加することを特徴とする、請求項１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項3】
前記間葉系幹細胞は、（１）対象体から分離された全分化能幹細胞を培養することによって胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ、ＥＢ）を形成する段階；
（２）前記胚様体を微小重力下の生物反応器で三次元培養することによってスフェロイドを形成する段階；及び
（３）前記スフェロイドを、培養表面に粘着性高分子がコーティングされた培養容器で付着・培養することによって間葉系幹細胞に分化させる段階；を含む方法で製作されたことを特徴とする、請求項１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項4】
前記全分化能幹細胞は、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＥＳＣ）又は誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）であることを特徴とする、請求項３に記載の間葉系幹細胞。
【請求項5】
前記全分化能幹細胞は、誘導万能幹細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の間葉系幹細胞。
【請求項6】
前記段階（１）は、前記全分化能幹細胞をマルチウェル培養容器で三次元培養することによって行われることを特徴とする、請求項３に記載の間葉系幹細胞。
【請求項7】
前記段階（１）は、前記三次元培養時、遠心分離を通じて細胞凝集を誘導する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の間葉系幹細胞。
【請求項8】
前記段階（２）の微小重力は、前記生物反応器を回転させることによって、前記生物反応器に加えられる重力を相殺する微小重力シミュレーターによって誘導されることを特徴とする、請求項３に記載の間葉系幹細胞。
【請求項9】
前記段階（２）は、前記微小重力シミュレーターを１５ｒｐｍ乃至８０ｒｐｍで回転させながら３日乃至８日間培養することによって行われることを特徴とする、請求項８に記載の間葉系幹細胞。
【請求項10】
前記段階（２）は、前記微小重力シミュレーターを、４０ｒｐｍ乃至６０ｒｐｍから始め、毎日３ｒｐｍ乃至７ｒｐｍずつ増加させながら回転させることによって行われることを特徴とする、請求項９に記載の間葉系幹細胞。
【請求項11】
前記粘着性高分子は、ヒアルロン酸、アルギン酸、ヘパリン、フコイダン、セルロース、デキストラン、キトサン、アルブミン、フィブリン、コラーゲン及びゼラチンから選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項３に記載の間葉系幹細胞。
【請求項12】
前記粘着性高分子はゼラチンであることを特徴とする、請求項１１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項13】
請求項１の間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効成分として含む炎症性疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項14】
前記炎症疾患又は自己免疫疾患は、膀胱炎、関節リウマチ、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、大腸炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、レイノー現象、ベーチェット病、川岐病、原発性胆汁性硬化症、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）又はクローン病であることを特徴とする、請求項１３に記載の薬学組成物。
【請求項15】
前記膀胱炎は、間質性膀胱炎、慢性膀胱炎及びケタミン誘発性膀胱炎から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項16】
請求項１の間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効成分として含む創傷治癒用薬学組成物。
【請求項17】
請求項１の間葉系幹細胞の炎症疾患又は自己免疫疾患の治療用途。
【請求項18】
請求項１の間葉系幹細胞を、これを必要とする対象体に投与する段階を含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、間葉系幹細胞、これから分離された細胞外小胞、及びこれらの用途に関する。
本発明は、間葉系幹細胞、これから分離された細胞外小胞、及びこれらの用途に関する。
【0002】
〔背景技術〕
一般に、炎症反応は、生体の細胞や組織に器質的変化をもたらす侵襲による損傷を修復及び再生するための生体防御反応過程であって、この反応過程には、局所の血管、体液の各種の組織細胞及び免疫細胞などが作用する。正常に外部侵入菌によって誘導される炎症反応は、生体を保護するための防御システムである一方で、非正常的に過度な炎症反応が誘導されると多様な疾患が現れるが、これらの疾患を炎症疾患と総称する。前記炎症疾患は、外部刺激によって活性化された標的細胞から分泌される多様な炎症媒介物質が炎症を増幅及び持続させ、人体の生命を脅かす疾患であって、急性炎症、膀胱炎などの膀胱内での疾患、関節リウマチなどの関節内での疾患、乾癬などの形態で現れる皮膚疾患及び気管支喘息などのアレルギー性炎症疾患などを含む。
一般に、炎症反応は、生体の細胞や組織に器質的変化をもたらす侵襲による損傷を修復及び再生するための生体防御反応過程であって、この反応過程には、局所の血管、体液の各種の組織細胞及び免疫細胞などが作用する。正常に外部侵入菌によって誘導される炎症反応は、生体を保護するための防御システムである一方で、非正常的に過度な炎症反応が誘導されると多様な疾患が現れるが、これらの疾患を炎症疾患と総称する。前記炎症疾患は、外部刺激によって活性化された標的細胞から分泌される多様な炎症媒介物質が炎症を増幅及び持続させ、人体の生命を脅かす疾患であって、急性炎症、膀胱炎などの膀胱内での疾患、関節リウマチなどの関節内での疾患、乾癬などの形態で現れる皮膚疾患及び気管支喘息などのアレルギー性炎症疾患などを含む。
【0003】
特に、間質性膀胱炎（ＩＣ）は、痛症、例えば、骨盤痛の症候、及び下部尿路症状（ＬＵＴＳ）、例えば、増加した頻尿／尿意切迫感を特徴とする、原因が明らかになっていない慢性膀胱疾患である。より最近の用語は、この複合症候を集合的に開示するために、ＩＣと共に、有痛性膀胱症候群（ＰＢＳ）（［ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ＳＡ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖ Ｕｒｏｌ ２００７；９（１）：９－１６］）又は膀胱痛症候群（ＢＰＳ）（［（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｒｏｌｏｇｙ ５３（２００８）６０－６７］）を含むものであって、すなわち、ＩＣ／ＢＰＳ又はＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳに変化している。
【0004】
ＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳの有病率は、臨床的に確認された疾病を有する１００，０００人の女性当たり６７人乃至２３０人と多様であり、頻繁に、子宮内膜炎、再発性尿路感染、過敏性膀胱又は外陰部痛と誤って診断されたり低く診断されるので、この数値はさらに高いと見込まれる（Ｆｏｒｒｅｓｔ Ｊ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｕｒｉｅｒ ２００６；２４（３）：１－８）。ＩＣは、人生の質に相当な影響を及ぼし、旅行、家族関係及び活動に影響を及ぼし（Ｓｌａｄｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｕｒｏｌ １９９７；４９（５Ａ Ｓｕｐｐｌ）：１０－３）、また、うつ病性症候群と関連している（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ ＮＥ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｕｒｏｌ ２００２；１６７：１７６３－１７６７）。
【0005】
前記ＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳは、単一の病因が確認されておらず、主に痛覚過敏、慢性膀胱痛症及び排尿障害を起こす（Ｆｏｒｒｅｓｔ Ｊ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｕｒｉｅｒ ２００６；２４（３）：１－８）。
【0006】
一方、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）は、間葉系組織系統に分化する能力を有する多分化能前駆細胞である。この細胞は、多様な細胞で適応及び先天性免疫反応を調節し、潜在的な免疫調節効果を媒介し得るので、自己免疫疾患を治療するための新しい代案として浮かび上がっている。また、この細胞は、免疫抑制及び抗炎症効果（ヨーロッパ登録特許第０２２９８８６１号、米国公開特許第２０１２－０２６９７７４号）を有するだけでなく、Ｔ細胞の活性化及び増殖を抑制するものとして知られている（Ｌｉ ＺＪ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ＯＮＥ ８（１０）：７７１５９，２０１３）。
【0007】
しかし、従来は、ＭＳＣの一般的な抗炎症効果のみが公知となっているだけで、炎症関連疾患に対してさらに強力な効果を有するように最適化されたＭＳＣ幹細胞治療剤は、未だに開発が不十分な実情である。したがって、炎症性疾患の予防又は治療に適したＭＳＣ治療剤の開発が切実に要求されている。
【0008】
そこで、本発明者等は、炎症関連疾患に対してさらに強力な効果を有するように最適化されたＭＳＣ幹細胞に対して鋭意研究を繰り返えす中で、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）でＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量が増加し、ＰＴＧＳ２マーカーの発現量が減少すると、間質性膀胱炎を含む多様な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0009】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、間質性膀胱炎を含む多様な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的な間葉系幹細胞を提供することにある。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、間質性膀胱炎を含む多様な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的な間葉系幹細胞を提供することにある。
【0010】
本発明の他の目的は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効成分として含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【0011】
本発明の更に他の目的は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効成分として含む創傷治癒用組成物を提供することにある。
【0012】
〔課題を解決するための手段〕
上記の目的を達成するために、本発明は、（Ａ）ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量の増加；及び（Ｂ）ＰＴＧＳ２マーカーの発現量の減少；から選ばれる１種以上の特性を示す間葉系幹細胞を提供する。
上記の目的を達成するために、本発明は、（Ａ）ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量の増加；及び（Ｂ）ＰＴＧＳ２マーカーの発現量の減少；から選ばれる１種以上の特性を示す間葉系幹細胞を提供する。
【0013】
本発明の好ましい一実施例によると、前記間葉系幹細胞は、ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１マーカーの発現量が増加するものであり得る。
【0014】
本発明の好ましい一実施例によると、前記間葉系幹細胞は、（１）対象体から分離された全分化能幹細胞を培養することによって胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ、ＥＢ）を形成する段階；（２）前記胚様体を微小重力（ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）下の生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）で三次元培養することによってスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成する段階；及び（３）前記スフェロイドを、培養表面に粘着性高分子がコーティングされた培養容器で付着・培養することによって間葉系幹細胞に分化させる段階；を含む方法で製作されたものであり得る。
【0015】
本発明の好ましい一実施例によると、前記全分化能幹細胞は、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＥＳＣ）又は誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）であり得る。
【0016】
本発明の好ましい一実施例によると、前記全分化能幹細胞は、誘導万能幹細胞であり得る。
【0017】
本発明の好ましい一実施例によると、前記段階（１）は、前記全分化能幹細胞をマルチウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器で三次元培養することによって行われ得る。
【0018】
本発明の好ましい一実施例によると、前記段階（１）は、前記三次元培養時、遠心分離を通じて細胞凝集を誘導する段階をさらに含むことができる。
【0019】
本発明の好ましい一実施例によると、前記段階（２）の微小重力は、前記生物反応器を回転させることによって、前記生物反応器に加えられる重力を相殺する微小重力シミュレーターによって誘導され得る。
【0020】
本発明の好ましい一実施例によると、前記段階（２）は、前記微小重力シミュレーターを１５ｒｐｍ乃至８０ｒｐｍで回転させながら３日～８日間培養することによって行われ得る。
【0021】
本発明の好ましい一実施例によると、前記段階（２）は、前記微小重力シミュレーターを、４０ｒｐｍ乃至６０ｒｐｍから始め、毎日５ｒｐｍずつ増加させながら回転させることによって行われ得る。
【0022】
本発明の好ましい一実施例によると、前記粘着性高分子は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、フィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）及びゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）から選ばれるいずれか一つであり得る。
【0023】
本発明の好ましい一実施例によると、前記粘着性高分子はゼラチンであり得る。
【0024】
また、本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効成分として含む炎症性疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0025】
本発明の好ましい一実施例によると、前記炎症疾患又は自己免疫疾患は、膀胱炎、関節リウマチ、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、大腸炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、川岐病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｏｌｉｔｉｓ）、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）又はクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）であり得る。
【0026】
本発明の好ましい一実施例によると、前記膀胱炎は、間質性膀胱炎（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、慢性膀胱炎及びケタミン誘発性膀胱炎から選ばれる１種以上であり得る。
【0027】
また、本発明の更に他の目的を達成するために、本発明は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効成分として含む創傷治癒用薬学組成物を提供する。
【0028】
〔発明の効果〕
本発明の間葉系幹細胞は、ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量の増加及び／又はＰＴＧＳ２マーカーの発現量の減少特性を示すことによって、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの量を著しく減少させるので、多様な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的である。
本発明の間葉系幹細胞は、ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量の増加及び／又はＰＴＧＳ２マーカーの発現量の減少特性を示すことによって、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの量を著しく減少させるので、多様な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的である。
【0029】
特に、本発明の間葉系幹細胞、又はこれから分離された幹細胞由来細胞外小胞は、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）動物モデルに投与する場合、ＩＣ／ＢＰＳ誘導過程で崩れた膀胱内壁を回復させ、炎症程度を緩和させるので、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群に対して優れた治療効能を有する。
【0030】
また、本発明の間葉系幹細胞、又はこれから分離された幹細胞由来細胞外小胞は、創傷治癒効果に優れるので、創傷治癒用として有用に利用され得る。
【0031】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ｉＰＳＣからＭＳＣを分化させる本発明のプロトコルを要約した模式図である。
図１は、ｉＰＳＣからＭＳＣを分化させる本発明のプロトコルを要約した模式図である。
【0032】
図２は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ上で形成された胚様体（ＥＢ）の形態を示す図である。
【0033】
図３は、微小重力生物培養器であるＢＡＭ（Ｂｉｏ Ａｒｒａｙ Ｍａｔｒｉｘ）装置を通じて形成されたスフェロイドの形態（上端）と、ＯＣＴ４及びＤＡＰＩ抗体を用いた染色結果（下端）とを示す図である。
【0034】
図４は、スフェロイドから由来した間葉系幹細胞の外形を示す図であって、継代後、紡錘（ｓｐｉｎｄｌｅ）形態を帯びることを確認した（右側）。
【0035】
図５は、本発明の方法で分化されたｉＭＳＣの各継代での外形を示す図である。
【0036】
図６は、本発明の方法で分化された間葉系幹細胞の累積細胞増殖曲線を示す図であって、各継代別ＣＰＤ（Ｃｕｍｍｕｌａｔｉｖｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ）（図６ａ）、倍加時間（Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）（図６ｂ）、及びＬｏｇ細胞数（図６ｃ）をそれぞれ示す。
【0037】
図７は、本発明の方法で分化された間葉系幹細胞の細胞表面マーカー発現をＦＡＣＳ分析で確認した結果を示す図である。
【0038】
図８は、免疫細胞化学染色を用いて本発明の方法を通じて誘導万能幹細胞が全能性を失い、間葉系幹細胞のマーカーを発現する細胞に分化されたことを確認した結果を示す図である。
【0039】
図９は、ＬＰＳを用いた炎症誘導細胞において、本発明の方法で分化された幹細胞の炎症制御効果を確認した実験手順を示す模式図である。
【0040】
図１０は、ＲＴ－ＰＣＲを通じて炎症マーカーの発現を確認した結果を示す図である。
【0041】
図１１は、免疫細胞化学染色を用いてＬＰＳ処理によって炎症が誘導された細胞をＴＲＡＰ染色した結果（左側）と、前記ＴＲＡＰ染色された細胞を計数した結果（右側）とを示す図である。
【0042】
図１２は、本発明の間葉系幹細胞から分離したエクソソームの大きさ（左側）及び濃度（右側）を測定した結果を示す図である。
【0043】
図１３ａは、本発明の間葉系幹細胞から分離したエクソソームをスクラッチ（Ｓｃｒａｃｈ）したＮＨＤＦ細胞に処理した後、時間の経過による細胞移動程度を示す写真で、図１３ｂは、前記細胞移動程度を数値化して示したグラフである。
【0044】
図１４ａは、本発明の間葉系幹細胞に含有されたそれぞれの上向き調節遺伝子のタンパク質間相互作用（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を確認するために、データベース基盤のストリング（Ｓｔｒｉｎｇ）－ｄｂツール（ｔｏｏｌ）を用いてネットワーク分析した結果を示し、図１４ｂは、各下向き調節遺伝子をネットワーク分析した結果を示す図である。
【0045】
【0046】
【0047】
図１７ａは、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルにおいて、本発明の間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）の投与後、膀胱組織の形態及び炎症程度を確認した図である。図１７ａは、ＩＣ／ＢＰＳマウスモデルの膀胱組織をそれぞれＨ＆Ｅ染色、マッソン・トリクローム（ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｏｍｅ）染色及びトルイジンブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）染色した結果を示し、図１７ｂは、前記染色を通じて線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の程度（％）とマスト細胞（Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）の浸透を確認した結果を示したグラフである。
【0048】
図１８は、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルにおいて、本発明の間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）の投与後、抽出された膀胱組織からｍＲＮＡを抽出し、炎症関連サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ６）の発現量（図１８ａ）、尿路上皮マーカー（ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２）の発現量（図１８ｂ）、及びＩＣ／ＢＰＳで発現する遺伝子（ＫＬＲＢ１、ＰＳＭＢ９、ＩＴＧＡＬ）の発現量（図１８ｃ）を確認した結果を示す図である。
【0049】
〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0050】
本発明の一側面は、（Ａ）ＳＰＰ１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ １；Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、ＰＬＡＵ（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ、Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ＩＴＧＡ６（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ ６）、ＣＥＮＰＩ（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉ）、及びＢＵＢ１（Ｂｕｄｄｉｎｇ Ｕｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄ Ｂｙ Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ １ Ｈｏｍｏｌｏｇ；Ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）から選ばれる１種以上のマーカーの発現量の増加；及び（Ｂ）ＰＴＧＳ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ－Ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ２、ｏｒ ＣＯＸ２；）マーカーの発現量の減少；から選ばれる１種以上の特性を有する間葉系幹細胞に関する。
【0051】
本発明において、「発現量の増加」又は「発現量の減少」という用語は、従来の間葉系幹細胞、好ましくは、一般のウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ）由来間葉系幹細胞（ｈＷＪ－ＭＳＣ）と比較して、間葉系幹細胞が発現する特定のマーカーの発現量が測定可能な程度に有意に増加又は減少したことを意味し、具体的には、発現量が４０％以上増加又は減少したことを意味し、より具体的には５０％以上増加又は減少したことを意味し、より具体的には６０％以上増加又は減少したことを意味し、さらに具体的には８０％以上増加又は減少したことを意味し、最も具体的には１００％以上増加又は減少したことを意味する。
【0052】
本発明において、「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という用語は、組織を構成する各細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）される前の段階の未分化細胞であって、特定の分化刺激（環境）下で特定の細胞に分化できる能力を有する各細胞を総称する。幹細胞は、細胞分裂が停止した分化された細胞とは異なり、細胞分裂によって自分と同一の細胞を生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）することができ、分化刺激が加えられると、刺激の性格によって多様な細胞に分化され得る、分化の柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有していることを特徴とする。
【0053】
本発明において、「間葉系幹細胞」という用語は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞、心筋細胞への分化が可能な多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞を意味する。間葉系幹細胞は、渦巻き形態と基本的な細胞表面マーカーＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ３４（－）、ＣＤ４５（－）の発現程度を通じて識別可能であり、多分化能と共に免疫反応を調節する機能も有する。
【0054】
本発明の間葉系幹細胞は、ＳＰＰ１に対して、従来の間葉系幹細胞、好ましくは、一般のｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）に比べて少なくとも３倍以上、具体的には３．０倍乃至４．０倍、さらに具体的には３．５０倍乃至４．００倍、さらに具体的には３．８０倍乃至３．９０倍の重量に発現量を上向き調節又は増加させ得る。
【0055】
また、本発明の間葉系幹細胞は、ＰＬＡＵに対して、従来の間葉系幹細胞、好ましくは、一般のｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）に比べて少なくとも１．５倍以上、具体的には１．５倍乃至２．２倍、具体的には１．８０倍乃至２．１０倍、さらに具体的には１．９０倍乃至２．００倍の重量に発現量を上向き調節又は増加させ得る。
【0056】
また、本発明の間葉系幹細胞は、ＩＴＧＡ６に対して、従来の間葉系幹細胞、好ましくは、一般のｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）に比べて少なくとも２．１倍以上、具体的には２．１倍乃至３．０倍、具体的には２．３０倍乃至２．６０倍、さらに具体的には２．４０倍乃至２．５０倍の重量に発現量を上向き調節又は増加させ得る。
【0057】
また、本発明の間葉系幹細胞は、ＣＥＮＰＩに対して、従来の間葉系幹細胞、好ましくは、一般のｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）に比べて少なくとも１．５倍以上、具体的には１．５倍乃至２．０倍、具体的には１．６０倍乃至１．９０倍、さらに具体的には１．７０倍乃至１．８０倍の重量に発現量を上向き調節又は増加させ得る。
【0058】
また、本発明の間葉系幹細胞は、ＢＵＢ１に対して、従来の間葉系幹細胞、好ましくは、一般のｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）に比べて少なくとも１．４倍以上、具体的には１．４倍乃至２．１倍、具体的には１．５０倍乃至１．９０倍、さらに具体的には１．６５倍乃至１．７５倍の重量に発現量を上向き調節又は増加させ得る。
【0059】
また、本発明の間葉系幹細胞は、ＰＴＧＳ２に対して、従来の間葉系幹細胞、好ましくは、一般のｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）に比べて少なくとも２．０倍以上、具体的には２．０倍乃至３．０倍、具体的には２．３０倍乃至２．９０倍、さらに具体的には２．５０倍乃至２．７０倍の重量に発現量を下向き調節又は減少させ得る。
【0060】
本発明の間葉系幹細胞は、前記ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量の増加；及び／又は前記ＰＴＧＳ２マーカーの発現量の減少特性を有することによって、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの量を著しく減少させ、多様な炎症疾患、好ましくは、膀胱炎、特に間質性膀胱炎を予防、緩和、改善又は治療することができる。また、本発明の間葉系幹細胞は、細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を著しく増加させ、創傷治癒効果に非常に優れる。
【0061】
一具現例において、本発明の間葉系幹細胞は、ＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１マーカーの発現量が増加するものであり得る。
【0062】
一具現例において、本発明の間葉系幹細胞は、（１）対象体から分離された全分化能幹細胞を培養することによって胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ、ＥＢ）を形成する段階；（２）前記胚様体を微小重力下の生物反応器で三次元培養することによってスフェロイドを形成する段階；及び（３）前記スフェロイドを、培養表面に粘着性高分子がコーティングされた培養容器で付着・培養することによって間葉系幹細胞に分化させる段階；を含む方法で製作されたものであり得る。
【0063】
本発明において、「全能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という用語は、受精卵より発生が進められた状態の細胞であって、内胚葉、間葉及び外胚葉を構成する細胞に全て分化できる幹細胞を意味する。本発明の具体的な具現例によると、本発明で用いられる全能性幹細胞は、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＥＳＣ）、胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ）、胚性癌腫細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌ）又は誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）で、より具体的には胚性幹細胞又は誘導万能幹細胞で、最も具体的には誘導万能幹細胞である。
【0064】
本発明において、「誘導万能幹細胞」という用語は、非全分化能細胞（例えば、体細胞）に未分化又は全分化能表現型と関連した特定の遺伝子を挿入し、人工的に由来した全分化能幹細胞の一つである。誘導万能幹細胞は、幹細胞遺伝子及びタンパク質発現、染色体メチル化、倍加時間、胚様体形成、テラトーマ形成、生存性キメラ形成、交雑性及び分化性を有する点で、当業界では胚性幹細胞などの天然の全分化能幹細胞と同一の表現型、生理学的特性及び発生学的特性を有するものとして見なされている。
【0065】
本発明において、「幹細胞の分化」という用語は、未分化状態の幹細胞から特定の細胞に完全に分化が誘導された場合のみならず、幹細胞から特定の細胞に完全に分化される前の中間段階で形成される前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞の形成も含むものである。
【0066】
一具現例において、前記各段階で使用される細胞培養液は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、無機質などのように、細胞の成長及び増殖に必須的な要素を含む、インビトロにおける細胞の成長及び増殖のための混合物である。細胞培養用培地に追加的に含まれ得る成分は、例えば、グリセリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－システイン塩酸塩一水和物、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ－リシン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アスパラギン一水和物、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン２ＨＣｌ、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩二水和物、ｉ－イノシトール、チアミン塩酸塩、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、リボフラビン、ビタミンＢ１２、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、リン酸水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏ）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４－５Ｈ２Ｏ）、硫酸第二鉄七水和物（ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４－７Ｈ２Ｏ）、Ｄ－グルコース（デキストロース）、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチンＮａ、リノレン酸、リポ酸、プトレシン２ＨＣｌ及びチミジンを含むが、これに制限されるものではない。
【0067】
一具現例において、前記細胞培養用培地は、人為的に製造して使用したり、或いは商業的に市販されるものを購入して使用することができる。商業的に市販されている培養用培地の例は、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、α－ＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｆ１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）を含むが、これに制限されるものではない。
【0068】
一具現例において、前記段階（１）は、前記全分化能幹細胞をマルチウェル培養容器で三次元培養することによって行われ得る。
【0069】
本発明において、「三次元培養（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語は、二次元培養に相対する概念であって、培養対象細胞を基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）などに固定せずに培養液内で浮遊（ｆｌｏａｔｉｎｇ）する状態で培養することを言う。したがって、「三次元培養」という用語は、「浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）」と同一の意味で使用される。付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）依存性の幹細胞は、浮遊培養時に細胞凝集を起こし、このような凝集に含まれず、単独で浮遊する細胞は細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発して死滅するので、細胞の付着特性に合う環境が造成されなければならない。本発明によると、複数のウェルを有するマルチウェルで全能性幹細胞を浮遊培養することによって、ウェルの大きさに応じた直径の全能性幹細胞凝集体、すなわち、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ、ＥＢ）がウェルの数に比例して形成される。したがって、本発明の段階（１）では、同一の大きさ及び形状を有する規格化された胚様体を大量に収得することができる。
【0070】
一具現例において、前記マルチウェル培養容器は、１ウェル当たりに３５０μｍ×３５０μｍ乃至４５０μｍ×４５０μｍの大きさを有するマイクロウェルプレートであり得る。
【0071】
一具現例において、前記浮遊培養は、前記マルチウェル培養容器内の１ウェル当たりに０．５×１０５個乃至１．５×１０５個、好ましくは０．７×１０５個乃至１．３×１０５個、さらに好ましくは約０．９×１０５個乃至１．１×１０５個の細胞を分注することによって行われ得る。
【0072】
一具現例において、前記段階（１）は、前記浮遊培養時、遠心分離を通じて細胞凝集を誘導する段階をさらに含むことができる。
【0073】
本発明において、「細胞凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）」という用語は、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）ではなく、三次元的成長が許容された浮遊培養などの環境で培養された細胞が自己集合（ｓｅｌｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）をしながら三次元構造の細胞凝集塊を形成することを意味する。三次元培養の結果として作られた細胞凝集体は、幹細胞から由来した生体内組織と類似する環境を提供し、大きさ及び自己集合された細胞の数によって球形（ｓｐｈｅｒｅ）であってもよく、球形以外の形態であってもよい。
【0074】
一具現例において、前記段階（２）の微小重力は、前記生物反応器を回転させることによって、前記生物反応器に加えられる重力を相殺する微小重力シミュレーターによって誘導され得る。
【0075】
本発明において、「微小重力（ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）」という用語は、重力が存在しないか、測定可能なレベル未満でのみ存在したり、又は、重力による生物学的及び生理学的影響が観測されない程度でのみ存在することを意味し、具体的には１×１０６ｇ以下の環境を意味する。したがって、「微小重力」という用語は、「無重力」とも表現され得る。
【0076】
本発明において、「微小重力シミュレーター（ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ ｓｉｍｕｌａｔｏｒ）」という用語は、正常重力環境又は有意な重力が存在する環境内で人為的に重力を相殺することによって微小重力環境を誘導する装置を意味する。このような微小重力シミュレーターとしては、例えば、クリノスタット（Ｃｌｉｎｏｓｔａｔ）、ＲＰＭ（Ｒａｎｄｏｍ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ）、ＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ ｗａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ）などがあるが、これに制限されなく、適切な外力の付加を通じて本発明の生物反応器内の培養環境で指定された時間だけ重力を相殺できる装置であれば制限なく使用され得る。
【0077】
一具現例において、前記微小重力シミュレーターはクリノスタットである。クリノスタットは、生物反応器などの培養容器に結合され、ランダムに或いは指示（入力）されたパターンに従って継続的に方向を変えながら回転し、絶えず三次元姿勢を変えることによって重力方向の継続的な変動をもたらし、これを通じて重力を相殺する装置である。
【0078】
一具現例において、前記段階（２）は、前記微小重力シミュレーターを１５ｒｐｍ乃至８０ｒｐｍ、好ましくは４０ｒｐｍ乃至８０ｒｐｍで回転させながら３日乃至８日間培養することによって行われ得、より好ましくは４日乃至７日間、さらに好ましくは５日間培養することができる。
【0079】
好ましくは、前記段階（２）は、前記微小重力シミュレーターを、４０ｒｐｍ乃至６０ｒｐｍから始め、毎日５ｒｐｍずつ増加させながら回転させることによって行われ得る。さらに好ましくは、５０ｒｐｍから始め、毎日５ｒｐｍずつ増加させながら５日間培養することができる。
【0080】
本発明において、「生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）」という用語は、生物学的な活性を有する培養環境を造成するための培養空間と、これと連動して作動する一連の機械装置とを含む生物学的試料の培養装置又はシステムを意味する。
【0081】
前記段階（２）では、段階（１）で生成された胚様体を微小重力（ｍｉｃｒｏ－ｇｒａｖｉｔｙ）下の生物反応器で三次元培養することによってスフェロイドを形成する。スフェロイドは、球形の細胞凝集体を意味するが、幾何学的に完全な球形である必要はない。
【0082】
前記段階（１）及び段階（２）で２回にわたって三次元浮遊培養を進行した後、これを通じて形成されたスフェロイドを、粘着性高分子がコーティングされた培養容器で付着・培養することによって間葉系幹細胞に分化させることができる。
【0083】
本発明において、「高分子」という用語は、同じ又は異なる種類のモノマーが連続的に結合された合成又は天然ポリマー化合物を称する。よって、高分子は、ホモポリマー（一種類のモノマーが重合化されたポリマー）と、少なくとも２種の異なるモノマーとの重合によって製造されたハイブリッドポリマーを含み、ハイブリッドポリマーは、コポリマー（二種の異なるモノマーから製造されたポリマー）と、２種超過の異なるモノマーから製造されたポリマーの両方を含む。
【0084】
本発明において、「粘着性高分子」という用語は、培養表面と細胞又はその凝集体（例えば、スフェロイド）との間の共有又は非共有結合を通じた架橋を形成し、細胞又はその凝集体が培養容器の底又は側面から離脱せずに付着した状態で培養が進行されることを可能にする天然又は人工高分子を意味する。
【0085】
一具現例において、前記粘着性高分子は、ヒアルロン酸、アルギン酸、ヘパリン、フコイダン、セルロース、デキストラン、キトサン、アルブミン、フィブリン、コラーゲン及びゼラチンから選ばれるいずれか一つであり得、好ましくはゼラチンであり得る。
【0086】
本発明の具体的な一実施例によると、本発明の間葉系幹細胞は、従来の間葉系幹細胞の小胞体、特に、一般のｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）と比較して遺伝子マーカー発現特性において明確な差を示す。下記の実施例で確認できるように、本発明の間葉系幹細胞は、一般のｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）に比べてＳＰＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＴＧＡ６、ＣＥＮＰＩ及びＢＵＢ１から選ばれる１種以上のマーカーの発現量が有意に増加し、前記ＰＴＧＳ２マーカーの発現量が有意に減少する。
【0087】
また、本発明の他の側面は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効成分として含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療用組成物に関する。
【0088】
本発明の間葉系幹細胞に対しては既に説明したので、過度な重複を避けるために、これについての記載は省略する。
【0089】
本発明において、「細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）」という用語は、多様な細胞において多胞体と原形質膜との融合を通じて細胞外環境に分泌される３０ｎｍ～１，０００ｎｍ範囲の直径を有する脂質二重膜構造の小胞を意味する。
【0090】
一具現例において、本発明の細胞外小胞は、前記間葉系幹細胞の培養液から複数回の遠心分離を通じて分離されたものであり得る。
【0091】
一具現例において、本発明の細胞外小胞は、１００ｎｍ～２５０ｎｍの平均直径を有し、より具体的には１５０ｎｍ～２２０ｎｍ、さらに具体的には１８０ｎｍ～２００ｎｍ、さらに具体的には１８５ｎｍ～１９５ｎｍの平均直径を有する。このような範囲の微細直径を有する細胞外小胞をエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）という。
【0092】
本発明において、「予防」という用語は、疾患又は疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患又は疾病にかかる可能性がある対象体における疾患又は疾病の発生を抑制することを意味する。
【0093】
本発明において、「治療」という用語は、（ａ）疾患、疾病又は症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病又は症状の軽減；又は（ｃ）疾患、疾病又は症状を除去することを意味する。本発明の組成物は、Ｔ細胞媒介免疫活性を効率的に抑制することによって、過度な又は所望でない免疫反応を原因とする多様な炎症又は自己免疫疾患の症状の発展を抑制したり、これを除去又は軽減させる役割をする。よって、本発明の組成物は、それ自体でこれらの疾患治療の組成物になることもあり、或いは、炎症又は自己免疫疾患に対する治療効果を有する他の薬理成分と共に投与され、前記疾患に対する治療補助剤として適用されることもある。したがって、本明細書における「治療」又は「治療剤」という用語は、「治療補助」又は「治療補助剤」の意味を含む。
【0094】
本発明において、「投与」という用語は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接投与することによって、対象体の体内で同じ量が形成されるようにすることを言い、「移植」又は「注入」と同じ意味を有する。
【0095】
本発明において、「治療的有効量」という用語は、本発明の組成物を投与しようとする個体に治療的又は予防的効果を提供するのに十分な程度に含有された組成物の含量を意味し、よって、「予防的有効量」を含む意味である。
【0096】
本発明において、「対象体」という用語は、制限なしに、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒ又はアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体はヒトである。
【0097】
一具現例において、本発明の組成物は、多様な炎症疾患に対して予防又は治療効果を有する。本発明の薬学組成物を適用できる炎症疾患は、当業界で炎症疾患として公知となったものであればよく、特に制限されない。本発明の薬学組成物で予防又は治療される自己免疫疾患又は炎症性疾患は、例えば、関節リウマチ、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、大腸炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、レイノー現象、ベーチェット病、川岐病、原発性胆汁性硬化症、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）及びクローン病を含むが、これに制限されるものではなく、好ましくは膀胱炎であり得る。
【0098】
一具現例において、本発明の薬学組成物で予防又は治療される膀胱炎は、間質性膀胱炎、慢性膀胱炎及びケタミン誘発性膀胱炎から選ばれる１種以上であり得、好ましくは間質性膀胱炎であり得る。
【0099】
本発明の一実施例では、抗炎症細胞モデルに、本発明の間葉系幹細胞又はその培養液、又はこれから分離された細胞外小胞を投与する場合、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６の濃度が著しく減少するので、抗炎症治療効果に優れることを具体的に確認した。
【0100】
また、本発明の一実施例では、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）動物モデルに本発明の間葉系幹細胞を投与する場合、ＩＣ／ＢＰＳ誘導過程で崩れた膀胱内壁が回復され、炎症程度が緩和されるなど、間質性膀胱炎／膀胱痛症候群に対して優れた治療効能を示すことを具体的に確認した。
【0101】
一具現例において、本発明の薬学組成物は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を単独で含むか、又は、一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。
【0102】
薬学的に許容される担体としては、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体をさらに含むことができる。経口投与用担体は、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などを含むことができる。また、非経口投与用担体は、水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含むことができ、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸などの抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル又はプロピルパラベン及びクロロブタノールがある。本発明の薬学的組成物は、前記各成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤などをさらに含むことができる。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考にすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。
【0103】
本発明の組成物は、ヒトを始めとした哺乳動物に如何なる方法でも投与することができ、例えば、経口的又は非経口的に投与することができる。非経口的な投与方法は、これに限定されないが、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、骨髓内投与、硬膜内投与、脈絡膜上腔注入（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、腸管投与、局所投与、舌下投与又は直腸内投与であり得、好ましくは静脈内投与であり得る。
【0104】
本発明の薬学的組成物は、上述した投与経路によって経口投与用又は非経口投与用製剤に剤形化することができる。
【0105】
経口投与用製剤の場合、本発明の組成物は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液などとして当業界に公知となった方法を用いて剤形化され得る。例えば、経口用製剤は、活性成分を固体賦形剤と配合した後、これを粉砕し、適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することによって錠剤又は糖衣錠剤を収得することができる。適切な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトールなどを含む糖類と、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン及びジャガイモデンプンなどを含むデンプン類と、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含むセルロース類と、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどの充填剤とが含まれ得る。また、場合によって、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルギネートなどを崩壊剤として添加することができる。さらに、本発明の薬学的組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含むことができる。
【0106】
非経口投与用製剤の場合は、注射剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、オイル剤、ゲル剤、エアロゾル及び鼻腔吸入剤の形態で当業界に公知となった方法を用いて剤形化することができる。これらの剤形は、全ての製薬化学に一般的に公知となった処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。
【0107】
好ましくは、本発明の前記薬学的組成物は、経口剤、注射剤、及び軟膏剤で構成された群から選ばれるいずれか一つの形態で製造されるものであり得、さらに好ましくは注射剤であり得る。
【0108】
本発明の薬学組成物は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効量で含むとき、好ましい炎症疾患の予防、改善又は治療効果を提供することができる。本明細書において、「有効量」とは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量を言い、好ましくは、炎症疾患、特に間質性膀胱炎を改善又は治療するのに十分な量を言う。
【0109】
前記間葉系幹細胞は、薬学組成物の総含量に対して５×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ乃至２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ、好ましくは７．５×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ乃至１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ、さらに好ましくは８×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ乃至１．２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌで含まれ得る。このとき、前記間葉系幹細胞の含量が前記下限値未満である場合は、細胞生存率には優れるが、炎症疾患の改善又は治療効果が所望の程度に現れないおそれがある。その一方で、前記上限値を超える場合は、濃度が増加する分だけ、炎症疾患の改善又は治療効果が増加しないか又は毒性があり得る。一方、インビトロ実験の結果、本発明の間葉系幹細胞の濃度が前記範囲である場合は、炎症疾患の改善又は治療に対して有意な効果が現れると共に、細胞毒性などの副作用が現れなかった。
【0110】
また、本発明の間葉系幹細胞から分離された細胞外小胞は、５×１０８ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ乃至５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ、好ましくは５×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ乃至５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ、さらに好ましくは１×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ乃至２×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌで含まれ得る。このとき、前記幹細胞由来細胞外小胞の含量が前記下限値未満である場合は、細胞生存率には優れるが、炎症疾患の改善又は治療効果が所望の程度に現れないおそれがある。その一方で、前記上限値を超える場合は、濃度が増加する分だけ、炎症疾患の改善又は治療効果が増加しないか又は毒性があり得る。一方、インビトロ実験の結果、本発明の幹細胞由来細胞外小胞の濃度が前記範囲である場合は、炎症疾患の改善又は治療に対して有意な効果が現れると共に、細胞毒性などの副作用が現れなかった。
【0111】
本発明の薬学組成物に含まれる間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞の有効量は、組成物が製剤化される形態などによって変わり得る。
【0112】
本発明の薬学的組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されてもよい。本発明の薬学組成物は、疾患の程度によって有効成分の含量を異ならせることができる。
【0113】
前記薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの各要因によって多様に処方され得る。本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、成人を基準にして０．００１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【0114】
また、本発明の更に他の側面は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を有効成分として含む創傷治癒用組成物に関する。
【0115】
本発明の間葉系幹細胞、これから分離された細胞外小胞、薬学組成物及び有効量に対しては既に説明したので、過度な重複を避けるために、これについての記載は省略する。
【0116】
【0117】
本発明の間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞は、細胞の移動を著しく増加させ、創傷治癒効果に優れるので、創傷治癒用として有用に利用され得る。
【0118】
また、本発明の更に他の側面は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞の治療用途（ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に関する。
【0119】
本発明の間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞に対しては既に説明したので、過度な重複を避けるために、これについての記載は省略する。
【0120】
前記治療用途は、炎症疾患又は自己免疫疾患、好ましくは炎症疾患の治療用途であり得る。
【0121】
前記炎症疾患又は自己免疫疾患は、膀胱炎、関節リウマチ、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身性強皮症、大腸炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、レイノー現象、ベーチェット病、川岐病、原発性胆汁性硬化症、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）又はクローン病であり得る。
【0122】
前記膀胱炎は、間質性膀胱炎、慢性膀胱炎及びケタミン誘発性膀胱炎から選ばれる１種以上であり得る。
【0123】
また、本発明の更に他の側面は、前記間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞を、これを必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階；を含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防、改善又は治療方法に関する。
【0124】
本発明の間葉系幹細胞、又はこれから分離された細胞外小胞に対しては既に説明したので、過度な重複を避けるために、これについての記載は省略する。
【0125】
前記「対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、予防、改善、治療、観察又は実験の対象である哺乳動物を言い、好ましくは、炎症疾患又は自己免疫疾患の予防、改善及び／又は治療を必要とするヒト又は哺乳動物であり得る。
【0126】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、次の実施例によって本発明が限定されることはない。
【0127】
＜実施例＞
実験方法
単一コロニーの培養
誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）を、マトリゲル（３５４２３４、ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）がコーティングされた９６ウェルプレートに単一細胞として付着させたｉＰＳＣ培地で１週間培養し、単一コロニーを生成した。生成された各コロニーは、マトリゲルがコーティングされた２４ウェルディッシュ、６ウェルディッシュに順に継代した後、１×１０５程度に細胞数が増加すると、スフェロイド実験に使用した（図１）。
実験方法
単一コロニーの培養
誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）を、マトリゲル（３５４２３４、ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）がコーティングされた９６ウェルプレートに単一細胞として付着させたｉＰＳＣ培地で１週間培養し、単一コロニーを生成した。生成された各コロニーは、マトリゲルがコーティングされた２４ウェルディッシュ、６ウェルディッシュに順に継代した後、１×１０５程度に細胞数が増加すると、スフェロイド実験に使用した（図１）。
【0128】
ＢＡＭシステムを用いたスフェロイドの生成
ｉＰＳＣをＡｇｇｒｅｗｅｌｌプレート（３４４６０、ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カナダ）に１×１０５程度にシーディングし、３００ｇで５分間遠心分離することによって細胞を凝集させた後、５％ＣＯ２培養器下で２４時間培養し、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ、ＥＢ）を生成した。２４時間後に生成されたＥＢは、生物反応器（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ、ＣｅｌＶｉｖｏ、デンマーク）内に注意深く移し、生物反応器を微小重力装置であるＢＡＭシステム（ＣｅｌＶｉｖｏ、デンマーク）に装着してから５日間回転した。回転時、最初は５０ｒｐｍから始め、毎日５ｒｐｍずつ増加させた（図１）。
ｉＰＳＣをＡｇｇｒｅｗｅｌｌプレート（３４４６０、ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カナダ）に１×１０５程度にシーディングし、３００ｇで５分間遠心分離することによって細胞を凝集させた後、５％ＣＯ２培養器下で２４時間培養し、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ、ＥＢ）を生成した。２４時間後に生成されたＥＢは、生物反応器（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ、ＣｅｌＶｉｖｏ、デンマーク）内に注意深く移し、生物反応器を微小重力装置であるＢＡＭシステム（ＣｅｌＶｉｖｏ、デンマーク）に装着してから５日間回転した。回転時、最初は５０ｒｐｍから始め、毎日５ｒｐｍずつ増加させた（図１）。
【0129】
誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞（ｉＰＳＣ－ＭＳＣ）の生成
ＢＡＭシステムで育てたスフェロイドを、０．１％ゼラチンコーティングされた６－ウェル培養皿に移し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に１０％ＦＢＳと１％Ｐ／Ｓを添加した培地で培養し、２日～３日ごとに培地を交換した。コーティングされた底に付着したスフェロイドから細胞が出た後、７０％～８０％コンフルエントになると、Ｔｒｙｐｌｅを用いて継代した。最初の継代をＰ０と命名し、細胞の形状が均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）するまで継代した。
ＢＡＭシステムで育てたスフェロイドを、０．１％ゼラチンコーティングされた６－ウェル培養皿に移し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に１０％ＦＢＳと１％Ｐ／Ｓを添加した培地で培養し、２日～３日ごとに培地を交換した。コーティングされた底に付着したスフェロイドから細胞が出た後、７０％～８０％コンフルエントになると、Ｔｒｙｐｌｅを用いて継代した。最初の継代をＰ０と命名し、細胞の形状が均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）するまで継代した。
【0130】
免疫細胞化学（ＩＣＣ）染色を用いた万能性及び間葉系幹細胞の確認
ｉＰＳＣ段階で生成されたスフェロイドは、生物反応器から一部取り出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。ｉＰＳＣのスフェロイドで作られたｉＰＳＣＭＳＣは、共焦点ディッシュ（１０１３５０、ＳＰＬ、韓国）に１×１０５の濃度でシーディングした後、６０％～７０％コンフルエントになると４％ＰＦＡで固定した。固定されたスフェロイド及びｉＰＳＣ－ＭＳＣは、ＤＰＢＳで５分間３回水洗した後、抗体が良好に透過できるように０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で表面を透過させた。その後、ＤＰＢＳで５分間３回水洗した。水洗されたスフェロイドは、ブロッキングのために３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間にわたって室温で培養した。１時間後に３％ＢＳＡ／ＰＳＢを除去し、一次抗体（１：２００）であるＡｎｔｉ－ＯＣＴ４、Ａｎｔｉ－ＳＳＥＡ４、Ａｎｔｉ－ＰＤＧＦＲβを入れた後、冷蔵庫で１２時間にわたって反応させた。１２時間後に室温で取り出し、ＤＰＢＳで５分ずつ３回水洗した。
ｉＰＳＣ段階で生成されたスフェロイドは、生物反応器から一部取り出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。ｉＰＳＣのスフェロイドで作られたｉＰＳＣＭＳＣは、共焦点ディッシュ（１０１３５０、ＳＰＬ、韓国）に１×１０５の濃度でシーディングした後、６０％～７０％コンフルエントになると４％ＰＦＡで固定した。固定されたスフェロイド及びｉＰＳＣ－ＭＳＣは、ＤＰＢＳで５分間３回水洗した後、抗体が良好に透過できるように０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で表面を透過させた。その後、ＤＰＢＳで５分間３回水洗した。水洗されたスフェロイドは、ブロッキングのために３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間にわたって室温で培養した。１時間後に３％ＢＳＡ／ＰＳＢを除去し、一次抗体（１：２００）であるＡｎｔｉ－ＯＣＴ４、Ａｎｔｉ－ＳＳＥＡ４、Ａｎｔｉ－ＰＤＧＦＲβを入れた後、冷蔵庫で１２時間にわたって反応させた。１２時間後に室温で取り出し、ＤＰＢＳで５分ずつ３回水洗した。
【0131】
水洗後、二次抗体（１：２００）であるヤギ抗－マウス４８８と共に１時間にわたって室温で培養した。１時間後に二次抗体を除去し、核を染色するＤＡＰＩ又はＴｏｐｒｏ３で２０分間染色した後、ＤＰＢＳで５分ずつ３回水洗した。水洗した試料に対しては、Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ－１０００、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、イギリス）を用いて蛍光の消失を防止した。
【0132】
ｉＰＳＣ－ＭＳＣ継代及び細胞増殖曲線
ｉＰＳＣ－ＭＳＣの形状が均質化した継代から細胞形態を記録し、細胞数を計算しながら増殖曲線を描いた。Ｐ５からｉＰＳＣ－ＭＳＣを６０ｍｍの培養皿に２×１０５の細胞数でシーディングした後、５日間培養し、５日間１回培地を交換した。細胞増殖は３つの増殖曲線で示した。まず、細胞成長率（Ｃｕｍｍｕｌａｔｉｖｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ：ＣＰＤ）の細胞数は、「ＣＰＤ＝ｌｏｇ（後の細胞数／最初の細胞数）／ｌｏｇ（２）」として計算した。次に、細胞が２倍に増殖する時間である倍加時間は、「倍加時間＝培養日数×ｌｏｇ（２）／（ｌｏｇ（後の細胞数）－ｌｏｇ（最初の細胞数））」として計算した。その後、継代時の細胞数を計算し、ｌｏｇを取った値である細胞数は、「細胞数＝ｌｏｇ（細胞数）」として計算した。計算された数値は線グラフで示し、対照群としてＡＤ－ＭＳＣ（間葉系幹細胞）及びｈＷＪ－ＭＳＣ（ヒトウォートンゼリー由来間葉系幹細胞）を使用した。
ｉＰＳＣ－ＭＳＣの形状が均質化した継代から細胞形態を記録し、細胞数を計算しながら増殖曲線を描いた。Ｐ５からｉＰＳＣ－ＭＳＣを６０ｍｍの培養皿に２×１０５の細胞数でシーディングした後、５日間培養し、５日間１回培地を交換した。細胞増殖は３つの増殖曲線で示した。まず、細胞成長率（Ｃｕｍｍｕｌａｔｉｖｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ：ＣＰＤ）の細胞数は、「ＣＰＤ＝ｌｏｇ（後の細胞数／最初の細胞数）／ｌｏｇ（２）」として計算した。次に、細胞が２倍に増殖する時間である倍加時間は、「倍加時間＝培養日数×ｌｏｇ（２）／（ｌｏｇ（後の細胞数）－ｌｏｇ（最初の細胞数））」として計算した。その後、継代時の細胞数を計算し、ｌｏｇを取った値である細胞数は、「細胞数＝ｌｏｇ（細胞数）」として計算した。計算された数値は線グラフで示し、対照群としてＡＤ－ＭＳＣ（間葉系幹細胞）及びｈＷＪ－ＭＳＣ（ヒトウォートンゼリー由来間葉系幹細胞）を使用した。
【0133】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を用いた免疫表現型の検査
培養中の細胞をＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ（１０６２４０１３、ｇｉｂｃｏ、米国）を用いて分離し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清液を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳが含まれたＤ－ＰＢＳ）に浮遊させた後、マウス抗－ＣＤ３４、マウス抗－ＣＤ４５、マウス抗－ＣＤ７３、ヒツジ抗－ＣＤ９０に一次反応した。これらの一次抗体を１：５００に希釈し、細胞に２００μｌずつ加えた後、４℃で３０分間培養した。次に、Ｄ－ＰＢＳで洗浄し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清液を除去し、１：５００に希釈した二次抗体であるウサギ抗－マウス４８８又はドンキー抗－ヒツジＰＥを２００μｌずつ添加し、４℃で２０分間培養した。その後、染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液５００μＬに浮遊させ、フローサイトメトリー分析機（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）でフローサイトメトリー分析を行い、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。
培養中の細胞をＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ（１０６２４０１３、ｇｉｂｃｏ、米国）を用いて分離し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清液を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳが含まれたＤ－ＰＢＳ）に浮遊させた後、マウス抗－ＣＤ３４、マウス抗－ＣＤ４５、マウス抗－ＣＤ７３、ヒツジ抗－ＣＤ９０に一次反応した。これらの一次抗体を１：５００に希釈し、細胞に２００μｌずつ加えた後、４℃で３０分間培養した。次に、Ｄ－ＰＢＳで洗浄し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清液を除去し、１：５００に希釈した二次抗体であるウサギ抗－マウス４８８又はドンキー抗－ヒツジＰＥを２００μｌずつ添加し、４℃で２０分間培養した。その後、染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液５００μＬに浮遊させ、フローサイトメトリー分析機（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）でフローサイトメトリー分析を行い、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ｐｒｏソフトウェアを用いて分析した。
【0134】
抗炎症細胞モデル
本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣの抗炎症能力を評価するために、炎症細胞モデルに使用する大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であるＲａｗ ２６４．７細胞を用いた。Ｒａｗ ２６４．７細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓが含有されたα－ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地で育てた。まず、培養容器でｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）又はｉＰＳＣ－ＭＳＣ（本発明）を培養した後、５０％満ちると、新しい培地を供給した後で４８時間培養する。４８時間後にコンディション培地を集め、０．２０μｍの注射器フィルターを用いてろ過した後、４℃冷蔵庫に保管した。
本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣの抗炎症能力を評価するために、炎症細胞モデルに使用する大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であるＲａｗ ２６４．７細胞を用いた。Ｒａｗ ２６４．７細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓが含有されたα－ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地で育てた。まず、培養容器でｈＷＪ－ＭＳＣ（対照群）又はｉＰＳＣ－ＭＳＣ（本発明）を培養した後、５０％満ちると、新しい培地を供給した後で４８時間培養する。４８時間後にコンディション培地を集め、０．２０μｍの注射器フィルターを用いてろ過した後、４℃冷蔵庫に保管した。
【0135】
Ｒａｗ ２６４．７細胞を、１ウェル当たり３．７５×１０５の細胞数で６ウェル培養皿に分けて接種した。１２時間後に細胞が付着すると、準備したコンディション培地１００％と交換した。再度１２時間後、図９に示したように、対照群を除いて、コンディション培地群を含む全ての群にＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ、米国）２００ｎｇ／ｍｌを処理した。陽性対照群として、ＤＥＸ（Ｄｅｘａｍａｔｈａｓｏｎｅ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国）１μＭを処理した。７時間後に画像を記録し、ＰＦＡ ４％で細胞を固定した後、免疫細胞化学染色を実施した。
【0136】
トータルＲＮＡ分離、ＲＴ－ＰＣＲ
Ｌａｂｏ Ｐａｓｓ Ｋｉｔ、ＴＲＩｚｏｌ（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を使用し、製造業者のマニュアルに従ってＲａｗ２６４．７細胞のトータルＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ１０００）分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ，ＵＳＡ）で測定した。トータルＲＮＡ ２μｇ及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、製造業者のマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、終了後に２％アガロースゲルで分析した。使用したプライマーの配列は表１に羅列した：
Ｌａｂｏ Ｐａｓｓ Ｋｉｔ、ＴＲＩｚｏｌ（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を使用し、製造業者のマニュアルに従ってＲａｗ２６４．７細胞のトータルＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ１０００）分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ，ＵＳＡ）で測定した。トータルＲＮＡ ２μｇ及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、製造業者のマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、終了後に２％アガロースゲルで分析した。使用したプライマーの配列は表１に羅列した：
【0137】
【表1】
【0138】
免疫細胞化学染色
前記固定された細胞は、２回ＰＢＳで洗浄した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用し、１０分間細胞の核内への浸透を実施し、ＰＢＳで洗浄した後、非特異的抗体結合を遮断するために、１０％正常ヤギ血清と共に１時間にわたって室温で静置した。細胞を一次抗体であるＴＲＡＰマウスモノクローナル（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ．米国）と４℃で１２時間にわたって反応させた後、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体であるＡｌｅｘａ－４８８接合ヤギ抗マウス抗体と共に室温で１時間にわたって反応させた。１時間後、ＤＰＢＳに静置し、細胞核は、染色するためにＴｏＰｒｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で１５分間室温で反応させた。１５分後にＤＰＢＳで３回水洗した後、Ａｎｔｉｆａｄｅマウンティング溶液（Ｈ－１０００、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、イギリス）を用いてマウンティングした。
前記固定された細胞は、２回ＰＢＳで洗浄した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用し、１０分間細胞の核内への浸透を実施し、ＰＢＳで洗浄した後、非特異的抗体結合を遮断するために、１０％正常ヤギ血清と共に１時間にわたって室温で静置した。細胞を一次抗体であるＴＲＡＰマウスモノクローナル（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ．米国）と４℃で１２時間にわたって反応させた後、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体であるＡｌｅｘａ－４８８接合ヤギ抗マウス抗体と共に室温で１時間にわたって反応させた。１時間後、ＤＰＢＳに静置し、細胞核は、染色するためにＴｏＰｒｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で１５分間室温で反応させた。１５分後にＤＰＢＳで３回水洗した後、Ａｎｔｉｆａｄｅマウンティング溶液（Ｈ－１０００、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、イギリス）を用いてマウンティングした。
【0139】
エクソソームの分離及びＮＴＡ分析
本発明に係るｉＭＳＣを５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でシーディングし、培養した後、７０％～８０％程度満ちると、新しいＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｄ８４３７、Ｓｉｇｍａ）（ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ＦＢＳ １０％とＰ／Ｓ １％を含む）と交換した。４８時間後にコンディション培地を５０ｍｌチューブに集め、３００ｇで３分間遠心分離した。遠心分離後に新しい５０ｍｌチューブ（５００５０、ＳＰＬ）に移し、４℃で２，０００ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離後に新しい５０ｍｌチューブに移し、４℃で１０，０００ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、新しい５０ｍｌチューブに移した。超遠心用チューブ（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）（３４４０５８、Ｂｅｃｋｍａｎ）に３２ｍｌ～３６ｍｌのコンディション培地を移した後、４℃で３２，０００ｒｐｍ（１８７，０００ｇ、Ｂｅｃｋｍａｎ、ＳＷ ３２Ｔｉ ｒｏｔｏｒ）で２時間にわたって遠心分離した。遠心分離後、１個の超遠心用チューブに２００μｌの０．２μｍろ過（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（Ｓ６５３４－ＦＭＯＳＫ、Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）１Ｘ ＰＢＳ（１００１０－０３１、ｇｉｂｃｏ）でエクソソームを収集した。
本発明に係るｉＭＳＣを５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でシーディングし、培養した後、７０％～８０％程度満ちると、新しいＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｄ８４３７、Ｓｉｇｍａ）（ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ＦＢＳ １０％とＰ／Ｓ １％を含む）と交換した。４８時間後にコンディション培地を５０ｍｌチューブに集め、３００ｇで３分間遠心分離した。遠心分離後に新しい５０ｍｌチューブ（５００５０、ＳＰＬ）に移し、４℃で２，０００ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離後に新しい５０ｍｌチューブに移し、４℃で１０，０００ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、新しい５０ｍｌチューブに移した。超遠心用チューブ（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）（３４４０５８、Ｂｅｃｋｍａｎ）に３２ｍｌ～３６ｍｌのコンディション培地を移した後、４℃で３２，０００ｒｐｍ（１８７，０００ｇ、Ｂｅｃｋｍａｎ、ＳＷ ３２Ｔｉ ｒｏｔｏｒ）で２時間にわたって遠心分離した。遠心分離後、１個の超遠心用チューブに２００μｌの０．２μｍろ過（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（Ｓ６５３４－ＦＭＯＳＫ、Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）１Ｘ ＰＢＳ（１００１０－０３１、ｇｉｂｃｏ）でエクソソームを収集した。
【0140】
上記で収得したエクソソームを、それぞれ０．２μｍろ過１ｘ ＰＢＳで５００倍乃至２０００倍に希釈した後、ＮＴＡ装備（Ｚｅｔａｖｉｅｗ）を用いてエクソソームの大きさ及び濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ）を測定した。
【0141】
創傷治癒能分析
対照群の細胞外小胞（Ｃｏｎｔ ＥＶ）と本発明の間葉系幹細胞由来細胞外小胞（ｉＭＳＣＥＶ）のＮＨＤＦ細胞に対する移動効果を確認するために、６ウェルプレート（３０００６、ＳＰＬ）にＮＨＤＦ細胞を２．５Ｅ＋０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでシーディングし、約１００％のコンフルエントになるようにインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。細胞のコンフルエントが満ちると、ＤＭＥＭ高グルコース（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｄ６４２９、ｓｉｇｍａ）に１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（１５１４－１６３、ｇｉｂｃｏ）を入れたＳＦＭ（Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）にマイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ（Ｍ４２８７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０μｇ／ｍｌに希釈した後、１ｍｌ／ｗｅｌｌで処理した。２時間にわたってインキュベートし、ＤＰＢＳで洗浄した後、１０００μｌのピペットチップ（ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いてウェルの縦に細胞を掻いた。ＤＰＢＳで洗浄し、細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、ＤＭＥＭ高ＳＦＭに各細胞外小胞を１Ｅ＋０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｗｅｌｌで処理した。前記処理後、０時間、１２時間、２４時間、４８時間ごとに一定の位置で写真を撮ることによって細胞の移動程度を確認した。移動程度の分析は、ＴＳｃｒａｔｃｈソフトウェアを用いて比較した。
対照群の細胞外小胞（Ｃｏｎｔ ＥＶ）と本発明の間葉系幹細胞由来細胞外小胞（ｉＭＳＣＥＶ）のＮＨＤＦ細胞に対する移動効果を確認するために、６ウェルプレート（３０００６、ＳＰＬ）にＮＨＤＦ細胞を２．５Ｅ＋０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでシーディングし、約１００％のコンフルエントになるようにインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。細胞のコンフルエントが満ちると、ＤＭＥＭ高グルコース（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｄ６４２９、ｓｉｇｍａ）に１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（１５１４－１６３、ｇｉｂｃｏ）を入れたＳＦＭ（Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）にマイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ（Ｍ４２８７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０μｇ／ｍｌに希釈した後、１ｍｌ／ｗｅｌｌで処理した。２時間にわたってインキュベートし、ＤＰＢＳで洗浄した後、１０００μｌのピペットチップ（ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いてウェルの縦に細胞を掻いた。ＤＰＢＳで洗浄し、細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、ＤＭＥＭ高ＳＦＭに各細胞外小胞を１Ｅ＋０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｗｅｌｌで処理した。前記処理後、０時間、１２時間、２４時間、４８時間ごとに一定の位置で写真を撮ることによって細胞の移動程度を確認した。移動程度の分析は、ＴＳｃｒａｔｃｈソフトウェアを用いて比較した。
【0142】
ＲＮＡシーケンス分析
ヒトウォートンゼリー由来間葉系幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ＵＣ－ＭＳＣ）（ＡＴＣＣ：ＰＣＳ－５００－０１０）と本発明のｉＭＳＣ細胞をペレット（ｐｅｌｌｅｔ）状態でＬＡＳ（金浦、韓国）に提供することによってＲＮＡを分離し、ＱＣテストを実施した後、マイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析を通じたボルケーノプロット（Ｖｏｃａｎｏ ｐｌｏｔ）資料を受けた。前記ボルケーノプロットを通じて、上向き調節遺伝子が１８３個で、下向き調節遺伝子が３２２個であることを確認した。また、それぞれの遺伝子に対して、ＤＡ ＶＩＤ分析を通じて遺伝子の主要機能（役割）を予測する資料を受けた。分析された資料は、まず、それぞれの遺伝子のタンパク質間相互作用を確認するために、データベース基盤のストリング－ｄｂツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ／）を用いてネットワーク分析したものである。前記ＤＡＶＩＤ分析で予測された遺伝子の主要機能としては、ベンダイアグラム（Ｖｅｎｎ Ｄｉａｇｒａｍ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｇｐ．ｃｎｂ．ｃｓｉｃ．ｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｖｅｎｎｙ／）を用いて互いに重なった遺伝子の機能を探した。
ヒトウォートンゼリー由来間葉系幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ＵＣ－ＭＳＣ）（ＡＴＣＣ：ＰＣＳ－５００－０１０）と本発明のｉＭＳＣ細胞をペレット（ｐｅｌｌｅｔ）状態でＬＡＳ（金浦、韓国）に提供することによってＲＮＡを分離し、ＱＣテストを実施した後、マイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析を通じたボルケーノプロット（Ｖｏｃａｎｏ ｐｌｏｔ）資料を受けた。前記ボルケーノプロットを通じて、上向き調節遺伝子が１８３個で、下向き調節遺伝子が３２２個であることを確認した。また、それぞれの遺伝子に対して、ＤＡ ＶＩＤ分析を通じて遺伝子の主要機能（役割）を予測する資料を受けた。分析された資料は、まず、それぞれの遺伝子のタンパク質間相互作用を確認するために、データベース基盤のストリング－ｄｂツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ／）を用いてネットワーク分析したものである。前記ＤＡＶＩＤ分析で予測された遺伝子の主要機能としては、ベンダイアグラム（Ｖｅｎｎ Ｄｉａｇｒａｍ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｇｐ．ｃｎｂ．ｃｓｉｃ．ｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｖｅｎｎｙ／）を用いて互いに重なった遺伝子の機能を探した。
【0143】
間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデル
８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＯｒｉ雌マウス（Ｆｅｍａｌｅ ｍｏｕｓｅ）を受け、２週間の適応期間を置いた。アルファキサンとロンプンを４：１の比率で混ぜ、９０μｌ／Ｍｏｕｓｅに腹腔注射することによってマウスに麻酔を行った。尿道にカテーテル（３８２４１２、ＢＤ）を挿入することによって膀胱内部の尿を除去し、ＰＢＳ ５０μｌを入れて洗浄した。５ｍｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）（Ｐ３３６９、Ｓｉｇｍａ）を注入し、３０分後にＰＢＳで洗浄した。ＬＰＳ ３０μｇ／ｍｌ（Ｌ４３９１、Ｓｉｇｍａ）を注入し、ＰＢＳで洗浄した。ホットプレート（ｈｏｔ ｐｌａｔｅ）でマウスの回復を確認し、一週間飼育した。この過程を４回繰り返し、マウスＩＣ／ＢＰＳモデルを誘導した。実験５週目には、同一の方法でマウスに麻酔を行った後、下腹部を切開し、膀胱の表面に本発明のｉＭＳＣを１×１０５細胞数でＰＢＳ（１０μｌ）に懸濁して注入した。下腹部を縫合し、麻酔から回復されることを確認した後で飼育した。一週間後、マウスに麻酔を行った後、膀胱を摘出してから実験に使用した。一部の膀胱は、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した後でＲＮＡを抽出し、一部は、組織切開（ｓｅｃｔｉｏｎ）及び染色を通じて膀胱の形態及び炎症程度を確認した。
８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＯｒｉ雌マウス（Ｆｅｍａｌｅ ｍｏｕｓｅ）を受け、２週間の適応期間を置いた。アルファキサンとロンプンを４：１の比率で混ぜ、９０μｌ／Ｍｏｕｓｅに腹腔注射することによってマウスに麻酔を行った。尿道にカテーテル（３８２４１２、ＢＤ）を挿入することによって膀胱内部の尿を除去し、ＰＢＳ ５０μｌを入れて洗浄した。５ｍｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）（Ｐ３３６９、Ｓｉｇｍａ）を注入し、３０分後にＰＢＳで洗浄した。ＬＰＳ ３０μｇ／ｍｌ（Ｌ４３９１、Ｓｉｇｍａ）を注入し、ＰＢＳで洗浄した。ホットプレート（ｈｏｔ ｐｌａｔｅ）でマウスの回復を確認し、一週間飼育した。この過程を４回繰り返し、マウスＩＣ／ＢＰＳモデルを誘導した。実験５週目には、同一の方法でマウスに麻酔を行った後、下腹部を切開し、膀胱の表面に本発明のｉＭＳＣを１×１０５細胞数でＰＢＳ（１０μｌ）に懸濁して注入した。下腹部を縫合し、麻酔から回復されることを確認した後で飼育した。一週間後、マウスに麻酔を行った後、膀胱を摘出してから実験に使用した。一部の膀胱は、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した後でＲＮＡを抽出し、一部は、組織切開（ｓｅｃｔｉｏｎ）及び染色を通じて膀胱の形態及び炎症程度を確認した。
【0144】
ｑＰＣＲ
抽出された膀胱を均質化した後、Ｌａｂｏｚｏｌ試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）（ＣＭＲＺ００１、Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ）に再懸濁した。クロロホルム（Ｃ２４３２、Ｓｉｇｍａ）をｌａｂｏｚｏｌと５：１の比率で混ぜてからボルテックスした。１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＲＮＡが溶けている上清液を新しいチューブにゆっくり移し、同量の２－プロパノール（ｐｒｏｐａｎｏｌ）（６４６０５－０３８０、ｊｕｎｓｅｉ、１：１）を入れた。上清液と２－プロパノールがあるチューブを１回～２回反転（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）させた後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＲＮＡペレットを７５％ＥｔｏＨで洗浄した後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＥＰＣにＲＮＡを再懸濁した。ＲＮＡは、ｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ５ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＥＢＴ－１３１９、ＥＬＰＩＳＢＩＯ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＨｉＰｉ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ）（ＥＢＴ－１８０２、ＥＬＰＩＳＢＩＯ）を用いて遺伝子の発現量を確認した（７５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
抽出された膀胱を均質化した後、Ｌａｂｏｚｏｌ試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）（ＣＭＲＺ００１、Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ）に再懸濁した。クロロホルム（Ｃ２４３２、Ｓｉｇｍａ）をｌａｂｏｚｏｌと５：１の比率で混ぜてからボルテックスした。１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＲＮＡが溶けている上清液を新しいチューブにゆっくり移し、同量の２－プロパノール（ｐｒｏｐａｎｏｌ）（６４６０５－０３８０、ｊｕｎｓｅｉ、１：１）を入れた。上清液と２－プロパノールがあるチューブを１回～２回反転（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）させた後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ＲＮＡペレットを７５％ＥｔｏＨで洗浄した後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＥＰＣにＲＮＡを再懸濁した。ＲＮＡは、ｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ５ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＥＢＴ－１３１９、ＥＬＰＩＳＢＩＯ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＨｉＰｉ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＲＯＸ）（ＥＢＴ－１８０２、ＥＬＰＩＳＢＩＯ）を用いて遺伝子の発現量を確認した（７５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【0145】
【0146】
免疫細胞化学染色によるスフェロイドの万能性細胞の確認
スフェロイドを万能性マーカーであるＯＣＴ４で染色したとき、緑色に染色され、核を染色するＤＡＰＩで染色したとき、特異的に核部位が緑色と青色に染色されることを確認できた。ＯＣＴ４が核で発現することが分かり、ｉＰＳＣ由来のスフェロイドが万能性を維持することが分かった（図３）。
スフェロイドを万能性マーカーであるＯＣＴ４で染色したとき、緑色に染色され、核を染色するＤＡＰＩで染色したとき、特異的に核部位が緑色と青色に染色されることを確認できた。ＯＣＴ４が核で発現することが分かり、ｉＰＳＣ由来のスフェロイドが万能性を維持することが分かった（図３）。
【0147】
ｉＰＳＣ－ＭＳＣの生成
０．１％ゼラチンでコーティングされた培養皿において、スフェロイド（黒い矢印）が底に付着し、細胞が突出して出ること（白い矢印）を観察できた。時間が経過するにつれて突出細胞が増加し、７０％～８０％コンフルエントで継代した。継代を進行するにつれて、細胞の形状は紡錘形（白い点線の矢印）に均質化した（図４）。
０．１％ゼラチンでコーティングされた培養皿において、スフェロイド（黒い矢印）が底に付着し、細胞が突出して出ること（白い矢印）を観察できた。時間が経過するにつれて突出細胞が増加し、７０％～８０％コンフルエントで継代した。継代を進行するにつれて、細胞の形状は紡錘形（白い点線の矢印）に均質化した（図４）。
【0148】
ｉＰＳＣ－ＭＳＣ継代及び細胞増殖曲線
ｉＰＳＣ－ＭＳＣは、Ｐ５から細胞が紡錘形態を帯び、Ｐ１３まで継代できた（図５）。その後、細胞は、貯蔵液を作ってＬＮ２に貯蔵した。細胞増殖曲線は、対照群であるｈＷＪ－ＭＳＣ及びＡＤ－ＭＳＣと比較し、その結果、ＡＤ－ＭＳＣは、Ｐ９まで細胞数が増加した後で減少し、ｈＷＪ－ＭＳＣは、Ｐ１３でも着実に細胞が増殖した。ｉＰＳＣ－ＭＳＣは、対照群よりもＣＰＤ及び累積細胞数が遥かに高く、倍加時間も対照群より速かった（図６）。
ｉＰＳＣ－ＭＳＣは、Ｐ５から細胞が紡錘形態を帯び、Ｐ１３まで継代できた（図５）。その後、細胞は、貯蔵液を作ってＬＮ２に貯蔵した。細胞増殖曲線は、対照群であるｈＷＪ－ＭＳＣ及びＡＤ－ＭＳＣと比較し、その結果、ＡＤ－ＭＳＣは、Ｐ９まで細胞数が増加した後で減少し、ｈＷＪ－ＭＳＣは、Ｐ１３でも着実に細胞が増殖した。ｉＰＳＣ－ＭＳＣは、対照群よりもＣＰＤ及び累積細胞数が遥かに高く、倍加時間も対照群より速かった（図６）。
【0149】
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を用いた免疫表現型の検査
ＦＡＣＳ分析の結果、対照群であるＡＤ－ＭＳＣと比較して、ｉＰＳＣ－ＭＳＣが抗－ＣＤ７３及び抗－ＣＤ９０に対して陽性であり、抗－ＣＤ３４及び抗－ＣＤ４５は陰性であることを確認した（図７）。これにより、ＢＡＭシステムを通じて作られたｉＰＳＣ－ＭＳＣが間葉系幹細胞の明確な特性を有することが分かった。
ＦＡＣＳ分析の結果、対照群であるＡＤ－ＭＳＣと比較して、ｉＰＳＣ－ＭＳＣが抗－ＣＤ７３及び抗－ＣＤ９０に対して陽性であり、抗－ＣＤ３４及び抗－ＣＤ４５は陰性であることを確認した（図７）。これにより、ＢＡＭシステムを通じて作られたｉＰＳＣ－ＭＳＣが間葉系幹細胞の明確な特性を有することが分かった。
【0150】
免疫細胞化学染色によるｉＰＳＣ－ＭＳＣの間葉系幹細胞の確認
ｉＰＳＣ－ＭＳＣ細胞に対して、万能性マーカーであるＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４と、間葉系幹細胞マーカーであるＰＤＧＦＲβとを用いてＩＣＣを進行した。ｉＰＳＣ－ＭＳＣでは、緑色に染色されたＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４マーカーでは、緑色に染色された細胞が少なく、緑色ＰＤＦＧＲβマーカーでは、緑色に染色された細胞が多く分布した（図８）。これにより、ｉＰＳＣ－ＭＳＣが全分化能を失いながら間葉系幹細胞に転換されたことが分かった。
ｉＰＳＣ－ＭＳＣ細胞に対して、万能性マーカーであるＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４と、間葉系幹細胞マーカーであるＰＤＧＦＲβとを用いてＩＣＣを進行した。ｉＰＳＣ－ＭＳＣでは、緑色に染色されたＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４マーカーでは、緑色に染色された細胞が少なく、緑色ＰＤＦＧＲβマーカーでは、緑色に染色された細胞が多く分布した（図８）。これにより、ｉＰＳＣ－ＭＳＣが全分化能を失いながら間葉系幹細胞に転換されたことが分かった。
【0151】
抗炎症細胞モデル
幹細胞の炎症制御効果を確認するための実験手順の模式図によって実験を行った（図９）。炎症実験の結果、Ｒａｗ ２６４．７細胞にＬＰＳを処理し、炎症を誘発したＬＰＳ群では巨大な多核細胞を観察できた。そして、ＬＰＳ処理と共にＤＥＸを処理した陽性対照群（ＬＰＳ＋ＤＥＸ）、ＬＰＳ処理と共にそれぞれｈＷＪ－ＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｈＷＪ－ＭＳＣＣＭ）、及びｉＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｉＭＳＣ ＣＭ）では多核細胞を観察できなかった（図１０）。また、それぞれの実験群に対してＲＴ－ＰＣＲを行った結果、ＩＬ－６の発現がＬＰＳ群で最も高く現れ、ＬＰＳ処理と共にそれぞれｈＷＪ－ＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｈＷＪ－ＭＳＣ ＣＭ）及びｉＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｉＭＳＣ ＣＭ）では、ＬＰＳ群よりもＩＬ－６の発現が有意に減少したことを確認した（図１０）。一方、ＬＰＳ処理と共にＤＥＸを処理した陽性対照群（ＬＰＳ＋ＤＥＸ）では、ＩＬ－６の発現が著しく低く現れた。
幹細胞の炎症制御効果を確認するための実験手順の模式図によって実験を行った（図９）。炎症実験の結果、Ｒａｗ ２６４．７細胞にＬＰＳを処理し、炎症を誘発したＬＰＳ群では巨大な多核細胞を観察できた。そして、ＬＰＳ処理と共にＤＥＸを処理した陽性対照群（ＬＰＳ＋ＤＥＸ）、ＬＰＳ処理と共にそれぞれｈＷＪ－ＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｈＷＪ－ＭＳＣＣＭ）、及びｉＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｉＭＳＣ ＣＭ）では多核細胞を観察できなかった（図１０）。また、それぞれの実験群に対してＲＴ－ＰＣＲを行った結果、ＩＬ－６の発現がＬＰＳ群で最も高く現れ、ＬＰＳ処理と共にそれぞれｈＷＪ－ＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｈＷＪ－ＭＳＣ ＣＭ）及びｉＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｉＭＳＣ ＣＭ）では、ＬＰＳ群よりもＩＬ－６の発現が有意に減少したことを確認した（図１０）。一方、ＬＰＳ処理と共にＤＥＸを処理した陽性対照群（ＬＰＳ＋ＤＥＸ）では、ＩＬ－６の発現が著しく低く現れた。
【0152】
免疫細胞化学染色による多核細胞の有無の確認
前記抗炎症細胞モデルの試験後、それぞれの試験群に対してＴＲＡＰ抗体を用いた多核細胞の有無を確認した。多核細胞は、炎症反応の進行時、細胞が集まりながら生成されるものであって、多核細胞の存在有無を通じて炎症の有無を確認することができる。実験の結果、ＬＰＳ群では、ＴＲＡＰ染色された細胞（ＴＲＡＰ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の比率が非常に高く、ＬＰＳ処理と共にそれぞれｈＷＪ－ＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｈＷＪ－ＭＳＣ ＣＭ）及びｉＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｉＭＳＣ ＣＭ）では、前記ＬＰＳ群に比べてＴＲＡＰ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞が著しく少なかった（図１１）。
前記抗炎症細胞モデルの試験後、それぞれの試験群に対してＴＲＡＰ抗体を用いた多核細胞の有無を確認した。多核細胞は、炎症反応の進行時、細胞が集まりながら生成されるものであって、多核細胞の存在有無を通じて炎症の有無を確認することができる。実験の結果、ＬＰＳ群では、ＴＲＡＰ染色された細胞（ＴＲＡＰ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の比率が非常に高く、ＬＰＳ処理と共にそれぞれｈＷＪ－ＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｈＷＪ－ＭＳＣ ＣＭ）及びｉＭＳＣのコンディション培地を処理した試験群（ＬＰＳ＋ｉＭＳＣ ＣＭ）では、前記ＬＰＳ群に比べてＴＲＡＰ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞が著しく少なかった（図１１）。
【0153】
エクソソームの分離及びＮＴＡ分析
ＮＴＡ装備を用いてエクソソームの大きさ及び濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ）を測定した結果、本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣから分離したエクソソームの粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）の大きさは約１００ｎｍに該当し、ＷＪ－ＭＳＣから分離したエクソソームに比べて全体の粒子の数が約４倍ほど多いことを確認した（図１２）。
ＮＴＡ装備を用いてエクソソームの大きさ及び濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ）を測定した結果、本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣから分離したエクソソームの粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）の大きさは約１００ｎｍに該当し、ＷＪ－ＭＳＣから分離したエクソソームに比べて全体の粒子の数が約４倍ほど多いことを確認した（図１２）。
【0154】
創傷治癒能分析
前記本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣから分離したエクソソームを、スクラッチ（Ｓｃｒａｔｃｈ）された正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に入れ、４８時間にわたって観察したとき、４８時間後、対照群であるＰＢＳ群では５０％程度の創傷が治癒されたが、本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣから分離したエクソソームを処理した試験群（Ｅｘｏｓｏｍｅ）では、９０％以上の創傷が治癒されたことを確認できた（図１３ａ及び図１３ｂ）。このような結果から、本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣから分離したエクソソームの創傷治癒能は、対照群であるＰＢＳに比べて著しく高いことが分かる。
前記本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣから分離したエクソソームを、スクラッチ（Ｓｃｒａｔｃｈ）された正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に入れ、４８時間にわたって観察したとき、４８時間後、対照群であるＰＢＳ群では５０％程度の創傷が治癒されたが、本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣから分離したエクソソームを処理した試験群（Ｅｘｏｓｏｍｅ）では、９０％以上の創傷が治癒されたことを確認できた（図１３ａ及び図１３ｂ）。このような結果から、本発明のｉＰＳＣ－ＭＳＣから分離したエクソソームの創傷治癒能は、対照群であるＰＢＳに比べて著しく高いことが分かる。
【0155】
ＲＮＡシーケンスの分析
ＲＮＡシーケンスデータを用いてボルケーノプロットを描いた結果、上位調節遺伝子１８３個、下位調節遺伝子３２２個を探すことができた。これらを用いて、それぞれストリングデータ（Ｓｔｒｉｎｇ ｄａｔａ）及びベンダイアグラムで示した。
ＲＮＡシーケンスデータを用いてボルケーノプロットを描いた結果、上位調節遺伝子１８３個、下位調節遺伝子３２２個を探すことができた。これらを用いて、それぞれストリングデータ（Ｓｔｒｉｎｇ ｄａｔａ）及びベンダイアグラムで示した。
【0156】
まず、上位調節遺伝子１８３個を用いたストリングデータにおいて、発現が増加したマーカー（Ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ）であるＳＰＰ１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ １；Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、ＰＬＡＵ（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ、Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ＩＴＧＡ６（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ ６）、ＣＥＮＰＩ（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉ）、ＢＵＢ１（Ｂｕｄｄｉｎｇ Ｕｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄ Ｂｙ Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ １ Ｈｏｍｏｌｏｇ；Ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）などの遺伝子が多く相互作用していることが分かった（図１４ａ）。これらの遺伝子のボルケーノプロット（ｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔ）の発現差は、次の通りである。ＳＰＰ１の発現は、対照群（ｈＷＪ－ＭＳＣ）に比べて約３．０倍乃至４．０倍、具体的には３．５０倍乃至４．００倍、さらに具体的には３．８０倍乃至３．９０倍の重量に増加し、ＰＬＡＵの発現は、約１．５倍乃至２．２倍、具体的には１．８０倍乃至２．１０倍、さらに具体的には１．９０倍乃至２．００倍の重量に増加し、ＩＴＧＡ６の発現は、約２．１倍乃至３．０倍、具体的には２．３０倍乃至２．６０倍、さらに具体的には２．４０倍乃至２．５０倍の重量に増加し、ＣＥＮＰＩの発現は、約１．５倍乃至２．０倍、具体的には１．６０倍乃至１．９０倍、さらに具体的には１．７０倍乃至１．８０倍の重量に増加し、ＢＵＢ１の発現は、約１．４倍乃至２．１倍、具体的には１．５０倍乃至１．９０倍、さらに具体的には１．６５倍乃至１．７５倍の重量に増加した。前記発現が増加した各マーカー（Ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ）を用いたボルケーノプロットデータ（ｖｏｃａｎｏ ｐｌｏｔ ｄａｔａ）のＧＯＴＥＲＭを用いてベンダイアグラムで示した結果、陽性ＲＮＡ重合プロモーターによる転写調節関連遺伝子と、細胞付着及び増殖関連遺伝子にＩＴＧＡ６遺伝子が重なることを確認できた（図１５ａ）。ＳＳＰ１は、骨分化マーカーとして使用するものであって、骨分化が促進されることを見ることができ、ＰＬＡＵは、小便から分離した酵素で凝固された血液や繊維素によって遮断された静脈路の血流回復のための治療剤として使用することができ、ＩＴＧＡ６は、上皮細胞におけるラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）に対する受容体として、ヘミデスモゾーム（ｈｅｍｉｄｅｓｍｏｓｏｍｅ）で重要な構造的役割をし、ＣＥＮＰＩは、卵胞刺激ホルモンに対する生殖腺組織の反応に関与し、ＢＵＢ１は、有糸分裂紡錘チェックポイント及び染色体凝集の重要な役割をするものとして知られている。
【0157】
次に、下位遺伝子３２２個を用いたストリングデータにおいて、発現が減少したマーカー（Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ）であるＰＴＧＳ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ－Ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ２、ｏｒ ＣＯＸ２；）が多く相互作用していることを確認した（図１４ｂ）。前記ＰＴＧＳ２遺伝子のボルケーノプロットの発現差は、次の通りである。ＰＴＧＳ２の発現は、対照群（ｈＷＪ－ＭＳＣ）に比べて約２．０倍乃至３．０倍、具体的には２．３０倍乃至２．９０倍、さらに具体的には２．５０倍乃至２．７０倍の重量に減少した。前記発現が減少したマーカーを用いたボルケーノプロットデータのＧＯＴＥＲＭを用いてベンダイアグラムで示した結果、陰性細胞増殖調節関連遺伝子とＬＰＳ反応及び炎症関連遺伝子にＰＴＧＳ２が重なることを確認できた（図１６ａ）。ＰＴＧＳ２は、炎症反応中にプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）の生成を担当する酵素である。
【0158】
前記上向き調節遺伝子５個と下向き調節遺伝子１個の相対的発現量の差を数値化し、これらを下記の表２に示した。
【0159】
【表2】
【0160】
前記表２を検討すると、前記５個の上向き調節遺伝子は、ｈＷＪ－ＭＳＣに比べて本発明のｉＭＳＣで発現が著しく増加し、前記１個の下向き調節遺伝子は、ｈＷＪ－ＭＳＣに比べて本発明のｉＭＳＣで発現が著しく減少したことを確認することができる。
【0161】
このような結果から、本発明のｉＭＳＣが従来のｈＷＪ－ＭＳＣと差別化された効能を有することは、前記遺伝子発現の差によるものであると類推することができる。
【0162】
間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデル
マウスの膀胱組織を切開し、Ｈ＆Ｅ染色をした結果、ＩＣ／ＢＰＳ誘導マウスでは、膀胱内壁が崩れていることを確認し、ｉＭＳＣ及びｈＷＪ－ＭＳＣを処理したグループでは、膀胱内壁が回復されたことを確認した。さらに、マッソン・トリクローム染色及びトルイジンブルー染色を通じて線維化の程度（％）とマスト細胞の浸透を確認し、ｉＭＳＣ及びｈＷＪ－ＭＳＣを処理したグループで炎症程度が緩和されたことを確認した（図１７ａ、図１７ｂ）。特に、本発明のｉＭＳＣを処理したグループは、ｈＷＪ－ＭＳＣを処理したグループに比べて線維化の程度（％）とマスト細胞の浸透が約５０％レベルに著しく減少することが確認され、本発明のｉＭＳＣが、ｈＷＪ－ＭＳＣに比べて炎症の予防、改善又は治療にさらに効果的であることが分かる。
マウスの膀胱組織を切開し、Ｈ＆Ｅ染色をした結果、ＩＣ／ＢＰＳ誘導マウスでは、膀胱内壁が崩れていることを確認し、ｉＭＳＣ及びｈＷＪ－ＭＳＣを処理したグループでは、膀胱内壁が回復されたことを確認した。さらに、マッソン・トリクローム染色及びトルイジンブルー染色を通じて線維化の程度（％）とマスト細胞の浸透を確認し、ｉＭＳＣ及びｈＷＪ－ＭＳＣを処理したグループで炎症程度が緩和されたことを確認した（図１７ａ、図１７ｂ）。特に、本発明のｉＭＳＣを処理したグループは、ｈＷＪ－ＭＳＣを処理したグループに比べて線維化の程度（％）とマスト細胞の浸透が約５０％レベルに著しく減少することが確認され、本発明のｉＭＳＣが、ｈＷＪ－ＭＳＣに比べて炎症の予防、改善又は治療にさらに効果的であることが分かる。
【0163】
ｑＰＣＲ
ＩＣ／ＢＰＳ誘導マウスの膀胱組織からｍＲＮＡを抽出し、炎症関連サイトカイン（ＩＬ６、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ）、本発明のｉＭＳＣを処理した群で発現度が低くなったことを確認した（図１８ａ）。また、尿路上皮（Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ）マーカー（ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２）の発現を確認した結果、本発明のｉＭＳＣを処理した群で発現度が高くなったことを確認した（図１８ｂ）。最後に、本発明者等の先行研究で発見したＩＣ／ＢＰＳマーカー（ＫＬＲＢ１、ＰＳＭＢ９、ＩＴＧＡＬ）が、本発明のｉＭＳＣを処理した群で低く発現することを確認した（図１８ｃ）（韓国公開特許公報第１０－２３３１１３８号参照）。
ＩＣ／ＢＰＳ誘導マウスの膀胱組織からｍＲＮＡを抽出し、炎症関連サイトカイン（ＩＬ６、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ）、本発明のｉＭＳＣを処理した群で発現度が低くなったことを確認した（図１８ａ）。また、尿路上皮（Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ）マーカー（ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２）の発現を確認した結果、本発明のｉＭＳＣを処理した群で発現度が高くなったことを確認した（図１８ｂ）。最後に、本発明者等の先行研究で発見したＩＣ／ＢＰＳマーカー（ＫＬＲＢ１、ＰＳＭＢ９、ＩＴＧＡＬ）が、本発明のｉＭＳＣを処理した群で低く発現することを確認した（図１８ｃ）（韓国公開特許公報第１０－２３３１１３８号参照）。
【0164】
前記各実験結果から、本発明のｉＭＳＣが、間質性膀胱炎（ＩＣ）などの膀胱痛症候群（ＢＰＳ）の治療に有用に利用可能であると類推することができる。
【0165】
本発明は、上記で言及した好ましい実施例として説明したが、発明の要旨と範囲から逸脱しない範囲で多様な修正や変形が可能である。また、添付の特許請求の範囲は、本発明の要旨に属するこのような修正や変形を含む。
【図面の簡単な説明】
【0166】
【図3】図３は、微小重力生物培養器であるＢＡＭ（Ｂｉｏ Ａｒｒａｙ Ｍａｔｒｉｘ）装置を通じて形成されたスフェロイドの形態（上端）と、ＯＣＴ４及びＤＡＰＩ抗体を用いた染色結果（下端）とを示す図である。
【図6】図６は、本発明の方法で分化された間葉系幹細胞の累積細胞増殖曲線を示す図であって、各継代別ＣＰＤ（Ｃｕｍｍｕｌａｔｉｖｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ）（図６ａ）、倍加時間（Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）（図６ｂ）、及びＬｏｇ細胞数（図６ｃ）をそれぞれ示す。
【図13】図１３ａは、本発明の間葉系幹細胞から分離したエクソソームをスクラッチ（Ｓｃｒａｃｈ）したＮＨＤＦ細胞に処理した後、時間の経過による細胞移動程度を示す写真で、図１３ｂは、前記細胞移動程度を数値化して示したグラフである。
【図14】図１４ａは、本発明の間葉系幹細胞に含有されたそれぞれの上向き調節遺伝子のタンパク質間相互作用（Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を確認するために、データベース基盤のストリング（Ｓｔｒｉｎｇ）－ｄｂツール（ｔｏｏｌ）を用いてネットワーク分析した結果を示し、図１４ｂは、各下向き調節遺伝子をネットワーク分析した結果を示す図である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【図15d】
【図16a】
【図16b】
【図16c】
【図16d】
【図17a】
【図17b】
【図18a】
【図18b】
【図18c】
【配列表】
【国際調査報告】