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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-25
(54)【発明の名称】ＶＣＰ阻害剤及び治療のためのその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240718BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240718BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/517 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/426 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/425 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/4166 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20240718BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61P21/00
A61P21/04
A61P43/00 111
A61P25/00
A61P25/28
A61K31/517
A61K31/426
A61K31/519
A61K31/496
A61K31/454
A61K31/425
A61K31/4166
A61K31/352
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500190
(86)(22)【出願日】2022-07-07
(85)【翻訳文提出日】2024-02-21
(86)【国際出願番号】 EP2022069011
(87)【国際公開番号】W WO2023281030
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】2109830.6
(32)【優先日】2021-07-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519041013
【氏名又は名称】ザ フランシス クリック インスティテュート リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃｒｉｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【住所又は居所原語表記】１ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｒｏａｄ Ｌｏｎｄｏｎ Ｇｒｅａｔｅｒ Ｌｏｎｄｏｎ ＮＷ１ １ＡＴ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パターニ リッキー
(72)【発明者】
【氏名】ハーレー ジャスミン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZC021
4C084ZC022
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086BC38
4C086BC46
4C086BC50
4C086BC60
4C086BC79
4C086BC82
4C086CB09
4C086CB22
4C086GA02
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA10
(57)【要約】
ＶＣＰ阻害剤及び治療のためのその使用。本発明は、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ又はｐ９７）の阻害剤及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の疾患の治療又は予防におけるその使用に関する。特に、本発明は、対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有さない（非ＶＣＰ関連ＡＬＳ）と特定されている、ＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。本発明は、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないとして患者を特定する方法にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ（バロシン含有タンパク質）阻害剤。
【請求項2】
前記対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有すると特定されていない、請求項１に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項3】
前記対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されている、請求項１に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項4】
前記ＡＬＳが非ＶＣＰ関連ＡＬＳである、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項5】
前記対象が、位置Ｒ１５５及びＲ１９１のいずれにおいてもＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有さないと特定されている、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項6】
前記対象が、Ｒ１５５Ｃ及びＲ１９１Ｑからなるリストから選択される病因性遺伝子突然変異をＶＣＰ遺伝子中に有さないと特定されている、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項7】
前記対象が、位置Ｒ９５、Ｉ１１４、Ｉ１５１、Ｒ１５５、Ｇ１５６、Ｍ１５８、Ｒ１５９、Ｒ１９１、Ｎ３８７、Ｎ４０１、Ｒ４８７、Ｄ５９２、Ｒ６６２及びＮ７５０のいずれにおいてもＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有さないと特定されている、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項8】
前記対象が、Ｒ９５Ｃ、Ｒ９５Ｇ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１５１Ｖ、Ｒ１５５Ｈ、Ｒ１５５Ｃ、Ｇ１５６Ｃ、Ｍ１５８Ｖ、Ｒ１５９Ｇ、Ｒ１５９Ｃ、Ｒ１５９Ｈ、Ｒ１９１Ｇ、Ｒ１９１Ｑ、Ｎ３８７Ｔ、Ｎ４０１Ｓ、Ｒ４８７Ｈ、Ｄ５９２Ｎ、Ｒ６６２Ｃ及びＮ７５０Ｓからなるリストから選択されるいかなる病因性遺伝子突然変異もＶＣＰ遺伝子中に有さないと特定されている、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項9】
前記対象がＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有すると特定されている、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項10】
前記筋萎縮性側索硬化症が、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及び／又はＳＦＰＱの１つ以上の核対細胞質の比の低減と関連し、場合により、前記ＶＣＰ阻害剤が、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及び／又はＳＦＰＱの１つ以上の核対細胞質の比の低減と関連する１つ以上の症状を改善する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項11】
前記筋萎縮性側索硬化症が、ＴＤＰ－４３の核対細胞質の比の低減と関連し、場合により、前記ＶＣＰ阻害剤が、ＴＤＰ－４３の核対細胞質の比の低減と関連する１つ以上の症状を改善する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項12】
前記筋萎縮性側索硬化症が、ＦＵＳの核対細胞質の比の低減と関連し、場合により、前記ＶＣＰ阻害剤が、ＦＵＳの核対細胞質の比の低減と関連する１つ以上の症状を改善する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項13】
前記筋萎縮性側索硬化症が、ＳＦＰＱの核対細胞質の比の低減と関連し、場合により、前記ＶＣＰ阻害剤が、ＳＦＰＱの核対細胞質の比の低減と関連する１つ以上の症状を改善する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項14】
ＡＬＳを治療又は予防することが、ＡＬＳを患っているか又はＡＬＳに罹りやすい患者における神経学的機能障害の部分的又は完全な軽減、改善、除去、阻害、発症の遅延、重症度及び／又は発生率の低減を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項15】
神経学的機能障害が、中枢神経系の機能障害と関連する症状、例えば、発達遅延、進行性認知機能障害、聴力損失、言語発達障害、運動技能の欠如、活動亢進、攻撃性及び／又は睡眠障害の１つ以上を含む、請求項１４に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項16】
ＶＣＰ阻害剤でＡＬＳを治療又は予防することによって、ＶＣＰ阻害剤がない場合の神経学的機能障害症状と比較して約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％を超える、１つ以上の神経学的機能障害症状の好転又は改善がもたらされる、請求項１５に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項17】
ＶＣＰのＤ２ ＡＴＰアーゼドメインを阻害する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項18】
ＭＬ２４０（２－（２－アミノ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－１－イル）－８－メトキシ－Ｎ－（フェニルメチル）－４－キナゾリンアミン）、ＭＬ２４１、２－アニリノ－４－アリール－１，３－チアゾール、３，４－メチレンジオキシ－６－ニトロスチレン、ＤＢｅＱ（Ｎ２，Ｎ４－ジベンジルキナゾ－リン－２，４－ジアミン）、ＣＢ－５０８３（１－［７，８－ジヒドロ－４－［（フェニルメチル）アミノ］－５Ｈ－ピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチル－１Ｈ－インドール－４－カルボキサミド）、ＣＢ－５３３９（１－［４－（ベンジルアミノ）－５，６，７，８－テトラヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチルインドール－４－カルボキサミド）、ＵＰＣＤＣ－３０２４５（１－（３－（５－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）フェニル）－Ｎ－（２－（４－イソプロピルピペラジン－１－イル）エチル）ピペリジン－４－アミン）、ＮＭＳ－８７３、ＮＭＳ－８５９、イイヤレスタチンＩ及びキサントフモールからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項19】
ＭＬ２４０（２－（２－アミノ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－１－イル）－８－メトキシ－Ｎ－（フェニルメチル）－４－キナゾリンアミン）、ＭＬ２４１、２－アニリノ－４－アリール－１，３－チアゾール、３，４－メチレンジオキシ－６－ニトロスチレン、ＤＢｅＱ（Ｎ２，Ｎ４－ジベンジルキナゾ－リン－２，４－ジアミン）、ＮＭＳ－８７３、ＮＭＳ－８５９、イイヤレスタチンＩ及びキサントフモールからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項20】
ＭＬ２４０（２－（２－アミノ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－１－イル）－８－メトキシ－Ｎ－（フェニルメチル）－４－キナゾリンアミン）である、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項21】
ＣＢ－５０８３（１－［７，８－ジヒドロ－４－［（フェニルメチル）アミノ］－５Ｈ－ピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチル－１Ｈ－インドール－４－カルボキサミド）又はＣＢ－５３３９（１－［４－（ベンジルアミノ）－５，６，７，８－テトラヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチルインドール－４－カルボキサミド）である、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項22】
非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有するか又は有する疑いがあると対象を診断する方法であって、前記対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有するかどうかを決定することと、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異がないことに基づいて非ＶＣＰ関連ＡＬＳの診断を提供することとを含む、方法。
【請求項23】
位置Ｒ９５、Ｉ１１４、Ｉ１５１、Ｒ１５５、Ｇ１５６、Ｍ１５８、Ｒ１５９、Ｒ１９１、Ｎ３８７、Ｎ４０１、Ｒ４８７、Ｄ５９２、Ｒ６６２及びＮ７５０のうちのいずれにおいてもＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異がないことを特定することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
Ｒ９５Ｃ、Ｒ９５Ｇ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１５１Ｖ、Ｒ１５５Ｈ、Ｒ１５５Ｃ、Ｇ１５６Ｃ、Ｍ１５８Ｖ、Ｒ１５９Ｇ、Ｒ１５９Ｃ、Ｒ１５９Ｈ、Ｒ１９１Ｇ、Ｒ１９１Ｑ、Ｎ３８７Ｔ、Ｎ４０１Ｓ、Ｒ４８７Ｈ、Ｄ５９２Ｎ、Ｒ６６２Ｃ及びＮ７５０Ｓからなるリストから選択されるいかなる病因性遺伝子突然変異もＶＣＰ遺伝子中にないことを特定することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法を使用して、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると、又は非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有する疑いがあると患者を診断することと、前記患者にＶＣＰ阻害剤を投与することとを含む、対象において非ＶＣＰ関連ＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項26】
請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法を使用して、患者が非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると、又は非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有する疑いがあると決定されており、前記患者にＶＣＰ阻害剤を投与することを含む、対象において非ＶＣＰ関連ＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤。
【請求項27】
場合により１つ以上の賦形剤を含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項28】
ＶＣＰ阻害剤を、それらを必要とする対象に投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療又は予防する方法。
【請求項29】
前記対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有すると特定されていない、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
前記ＡＬＳが非ＶＣＰ関連ＡＬＳである、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有するかどうかを決定する手段を含む、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有するか又は有する疑いがあると対象を診断するためのキット。
【請求項33】
１つ以上のＶＣＰ阻害剤を含む１つ以上の容器及び場合により情報資料を更に含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項34】
前記情報資料が、非ＶＣＰ関連ＡＬＳの診断及び治療における前記キットの使用のための指示を含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項35】
前記ＶＣＰ阻害剤が請求項１７～２１のいずれか一項に記載のＶＣＰ阻害剤である、請求項２５若しくは２６に記載の使用のためのＶＣＰ阻害剤、請求項２７に記載の医薬組成物、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法又は請求項３３若しくは３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ又はｐ９７）の阻害剤及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の疾患の治療又は予防におけるその使用に関する。特に、本発明は、対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有さない（非ＶＣＰ関連ＡＬＳ）と特定されている、ＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。本発明は、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないとして患者を特定する方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの選択的かつ進行性の変性である、常に致死的な神経学的疾患である。調節解除されたＲＮＡ代謝、特に、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の細胞内局在及び機能は、ＡＬＳの病態形成で中心的役割を果たす。ＲＢＰはＲＮＡのライフサイクルを調整し、転写、スプライシング、ＲＮＡ局在、機能及び減衰を制御する。
【0003】
いくつかのＡＬＳを引き起こす遺伝子突然変異は、トランスアクティブ応答ＤＮＡ結合タンパク質４３（transactive response DNA-binding protein 43）（ＴＡＲＤＢＰ、ＴＤＰ－４３をコードする）、ＦＵＳ／ＴＬＳ（fused in sarcoma/translocated in liposarcoma）又はＦＵＳ、及びヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰＡ１）を含めて、ＲＢＰをコードする。ＲＢＰの細胞内の誤局在もＡＬＳの病理学的特徴であり、ＴＤＰ－４３は、ＡＬＳの症例の９７％で核から細胞質へ誤局在している［１］。
【0004】
ごく最近、様々なＡＬＳモデル及び孤発性ＡＬＳの死後組織にわたる広範なＳＦＰＱ及びＦＵＳの誤局在も報告された［２、３］。細胞質におけるＲＢＰの蓄積は、ＡＬＳで見られるＲＢＰオリゴマー及び線維性の病理学的細胞質内封入体の形成に寄与すると考えられる［４、５］。１つのＲＢＰは単独で何千ものＲＮＡ標的に結合することができるので、単一のＲＢＰの障害でさえもＲＮＡ代謝に対して幅広くかつ多様な影響がある可能性がある［６］。
【0005】
バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ又はｐ９７）は、細胞生理のほとんどすべての態様を包含する多種多様な細胞内機能を有する豊富なＡＡＡ＋ＡＴＰアーゼ（多様な細胞活動と関連するＡＴＰアーゼ）である。ＶＣＰの機能としては、タンパク質の恒常性の維持、ミトコンドリアの品質管理及びアポトーシスが挙げられる［７］。ＶＣＰの構造はその多くの機能に重要であり、これは六量体タンパク質であり、各サブユニットは１つのＮ末端ドメインと、２つのＡＴＰアーゼドメイン（Ｄ１及びＤ２）と、障害を受けた（disordered）１つのＣ末端ドメインとを有する。常染色体優性のＶＣＰ突然変異は家族性ＡＬＳの症例の約２％を占める［８］。
【0006】
限られてはいるが、ＶＣＰの病原性変異体がこの疾患の孤発性症例でも特定されている［９］。多くの細胞経路におけるその役割が理由で、ＶＣＰ機能の破壊は、いくつかの疾患形態をもたらし得る。例えば、ＶＣＰ中の突然変異は、封入体ミオパシー、ページェット病及び前頭側頭型認知症（ＩＢＭＰＦＤ）を含めた他の神経変性疾患でも特定されている。
【0007】
ＶＣＰの病原性突然変異は、補助因子及びユビキチン化基質の結合に関与するＮ末端ドメインに最も一般的に見出されるが、Ｄ１ドメイン及びＤ２ドメイン中にも存在する［１０］。ＶＣＰ突然変異の大部分は、細胞モデルにおいて正常な又は増加したＡＴＰアーゼ活性と関連していることが生化学的に示されており、Ｒ１５５Ｃ突然変異は、その野生型対応物の２倍を超える活性を有することが示された［１１］。しかし、ＡＴＰアーゼ活性が増加した疾患突然変異体がドミナントアクティブ又はドミナントネガティブな機構のどちらを通して疾患を引き起こすかは議論の余地が残されている。さらに、これは、病態生理学的なレベルで突然変異を伝達するという利点を持つ患者由来の運動ニューロンにおいて、まだ系統的に対処されていない。
【0008】
ＶＣＰのミスセンス突然変異は家族性ＡＬＳの１～２％を占めるが、封入体ミオパシー、ページェット病及び前頭側頭型認知症（ＩＢＭＰＦＤ）として知られる常染色体優性疾患を更に引き起こし得る。ＡＬＳを引き起こすＶＣＰ突然変異は、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱを含めた重要なＲＢＰの核から細胞質への誤局在を含めて、孤発性ＡＬＳの重要な特徴を再現する［２、３、８、２９］。しかし、ＶＣＰ突然変異がＡＬＳにおいてＲＢＰの誤局在をもたらす機構は理解しづらいままである。
【0009】
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ＶＣＰ関連ＡＬＳの時間分解的分子表現型が特定された、非常に豊富な、機能的に検証された脊髄運動ニューロンに確実に分化することができることが以前に報告された［２、３、１２、１３］。本明細書においては、ＶＣＰ突然変異関連ＡＬＳのこの確立されたヒト幹細胞モデルを使用して、対照の運動ニューロンと比較して、重要なＲＢＰの核細胞質分布を最初に調べた。
【0010】
本発明者らは、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱは、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて核対細胞質の比の異常な低減を示し、これが神経突起内の異常な存在にまで拡大することを明らかにする。本発明者らは、目的とされるＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼ阻害剤による対照の運動ニューロンの処理がＡＬＳ ＲＢＰの誤局在表現型を再現せず、これは、疾患におけるその機能の喪失と相反することを見出した。重要なことに、本発明者らは、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３とＦＵＳの両方の核から細胞質への誤局在並びにＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱの核から神経突起への誤局在は、ＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインの薬理学的阻害剤による処理によって可逆的であることを見出す。
【0011】
まとめると、これらの所見は、ＶＣＰ突然変異がＤ２ ＡＴＰアーゼ活性の増加を引き起こし、次にこれが、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱの核からサイトゾルへの誤局在をもたらすモデルを支持する。本発明者らの研究は、ＶＣＰ関連ＡＬＳの治療において、Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインを標的にするＦＤＡ承認ＶＣＰ阻害剤を利用する公算を高める。
【発明の概要】
【0012】
本概要は、詳細な説明で更に記載される概念を紹介する。これは、主張される主題の必須の特色を特定するために使用されるべきではなく、主張される主題の範囲を限定するために使用されるべきでもない。
【0013】
実施例３で述べるように、本発明は、ＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインの薬理学的阻害が、健常なヒト運動ニューロン（例えば、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さない運動ニューロン）においてＡＬＳ表現型を誘導しないという最初の開示である。それどころか、本発明は、ＶＣＰ阻害剤が、対照（非ＶＣＰ突然変異体）運動ニューロンにおいてＲＮＡ結合タンパク質の誤局在を反転させることができるという最初の実証である。したがって、本出願は、ＶＣＰ阻害剤が、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さない（非ＶＣＰ関連ＡＬＳ）と特定された対象において、ＡＬＳを治療又は予防するのに使用することができるという最初の開示を提供する。
【0014】
重大な結果は、実施例３で示される、ＴＤＰ－４３及びＦＵＳの局在の変化である。ＴＤＰ－４３の誤局在はＡＬＳの重要な疾患特徴である。これは、９７％を超えるＡＬＳの症例で核から細胞質へ誤局在されている。図２（実施例３で述べる）は、ＶＣＰ阻害剤は健常なヒト運動ニューロンにおいてＴＤＰ－４３の核局在を増強することができることを初めて実証し、非ＶＣＰ関連ＡＬＳのための治療経路の根拠である。
【0015】
本発明は、対象において筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ（バロシン含有タンパク質）阻害剤を提供する。いくつかの実施の形態において、ＡＬＳは非ＶＣＰ関連ＡＬＳである。
【0016】
いくつかの実施の形態において、対象はＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有すると特定されていない。いくつかの実施の形態において、対象はＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されている。いくつかの実施の形態において、ＡＬＳは非ＶＣＰ関連ＡＬＳである。
【0017】
いくつかの実施の形態において、対象は、ＶＣＰ遺伝子中に或る特定の病因性遺伝子突然変異を有さない可能性がある。いくつかの実施の形態において、対象は、位置Ｒ１５５及びＲ１９１のいずれにおいてもＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有さないと特定されている。いくつかの実施の形態において、対象は、Ｒ１５５Ｃ及びＲ１９１Ｑからなるリストから選択される病因性遺伝子突然変異をＶＣＰ遺伝子中に有さないと特定されている。いくつかの実施の形態において、対象は、位置Ｒ９５、Ｉ１１４、Ｉ１５１、Ｒ１５５、Ｇ１５６、Ｍ１５８、Ｒ１５９、Ｒ１９１、Ｎ３８７、Ｎ４０１、Ｒ４８７、Ｄ５９２、Ｒ６６２及びＮ７５０のいずれにおいてもＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有さないと特定されている。いくつかの実施の形態において、対象は、Ｒ９５Ｃ、Ｒ９５Ｇ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１５１Ｖ、Ｒ１５５Ｈ、Ｒ１５５Ｃ、Ｇ１５６Ｃ、Ｍ１５８Ｖ、Ｒ１５９Ｇ、Ｒ１５９Ｃ、Ｒ１５９Ｈ、Ｒ１９１Ｇ、Ｒ１９１Ｑ、Ｎ３８７Ｔ、Ｎ４０１Ｓ、Ｒ４８７Ｈ、Ｄ５９２Ｎ、Ｒ６６２Ｃ及びＮ７５０Ｓからなるリストから選択されるいかなる病因性遺伝子突然変異もＶＣＰ遺伝子中に有さないと特定されている。
【0018】
いくつかの実施の形態において、対象は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有していてもよい。いくつかの実施の形態において、対象は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有すると特定されている。
【0019】
いくつかの実施の形態において、筋萎縮性側索硬化症は、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及び／又はＳＦＰＱの１つ以上の核対細胞質の比の低減と関連する。いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及び／又はＳＦＰＱの１つ以上の核対細胞質の比の低減と関連する１つ以上の症状を改善する。
【0020】
いくつかの実施の形態において、筋萎縮性側索硬化症は、ＴＤＰ－４３の核対細胞質の比の低減と関連する。いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＴＤＰ－４３の核対細胞質の比の低減と関連する１つ以上の症状を改善する。
【0021】
いくつかの実施の形態において、筋萎縮性側索硬化症は、ＦＵＳの核対細胞質の比の低減と関連する。いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＦＵＳの核対細胞質の比の低減と関連する１つ以上の症状を改善する。
【0022】
いくつかの実施の形態において、筋萎縮性側索硬化症は、ＳＦＰＱの核対細胞質の比の低減と関連する。いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＳＦＰＱの核対細胞質の比の低減と関連する１つ以上の症状を改善する。
【0023】
いくつかの実施の形態において、ＡＬＳを治療又は予防することは、ＡＬＳを患っているか又はＡＬＳに罹りやすい患者における神経学的機能障害の部分的又は完全な軽減、改善、除去、阻害、発症の遅延、重症度及び／又は発生率の低減を含む。いくつかの実施の形態において、神経学的機能障害は、中枢神経系の機能障害と関連する症状、例えば、発達遅延、進行性認知機能障害、聴力損失、言語発達障害、運動技能の欠如、活動亢進、攻撃性及び／又は睡眠障害の１つ以上を含む。
【0024】
いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤でＡＬＳを治療又は予防することによって、ＶＣＰ阻害剤がない場合の神経学的機能障害症状と比較して約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％を超える、１つ以上の神経学的機能障害症状の好転又は改善がもたらされる。いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤でＡＬＳを治療又は予防することによって、約５０％、約８０％、約９０％又は約９５％を超える１つ以上の神経学的機能障害症状の好転又は改善がもたらされる。
【0025】
いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰのＤ２ ＡＴＰアーゼドメインを阻害する。
【0026】
いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＭＬ２４０（２－（２－アミノ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－１－イル）－８－メトキシ－Ｎ－（フェニルメチル）－４－キナゾリンアミン）、ＭＬ２４１、２－アニリノ－４－アリール－１，３－チアゾール、３，４－メチレンジオキシ－６－ニトロスチレン、ＤＢｅＱ（Ｎ２，Ｎ４－ジベンジルキナゾ－リン－２，４－ジアミン）、ＣＢ－５０８３（１－［７，８－ジヒドロ－４－［（フェニルメチル）アミノ］－５Ｈ－ピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチル－１Ｈ－インドール－４－カルボキサミド）、ＣＢ－５３３９（１－［４－（ベンジルアミノ）－５，６，７，８－テトラヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチルインドール－４－カルボキサミド）、ＵＰＣＤＣ－３０２４５（１－（３－（５－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）フェニル）－Ｎ－（２－（４－イソプロピルピペラジン－１－イル）エチル）ピペリジン－４－アミン）、ＮＭＳ－８７３、ＮＭＳ－８５９、イイヤレスタチンＩ及びキサントフモールからなる群から選択される。
【0027】
いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＭＬ２４０（２－（２－アミノ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－１－イル）－８－メトキシ－Ｎ－（フェニルメチル）－４－キナゾリンアミン）である。
【0028】
いくつかの実施の形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＣＢ－５０８３（１－［７，８－ジヒドロ－４－［（フェニルメチル）アミノ］－５Ｈ－ピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチル－１Ｈ－インドール－４－カルボキサミド）又はＣＢ－５３３９（１－［４－（ベンジルアミノ）－５，６，７，８－テトラヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチルインドール－４－カルボキサミド）である。
【0029】
本発明はまた、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有するか又は有する疑いがあると対象を診断する方法であって、対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有するかどうかを決定することと、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異がないことに基づいて非ＶＣＰ関連ＡＬＳの診断を提供することとを含む、方法を提供する。
【0030】
いくつかの実施の形態において、方法は、位置Ｒ９５、Ｉ１１４、Ｉ１５１、Ｒ１５５、Ｇ１５６、Ｍ１５８、Ｒ１５９、Ｒ１９１、Ｎ３８７、Ｎ４０１、Ｒ４８７、Ｄ５９２、Ｒ６６２及びＮ７５０のうちのいずれにおいてもＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異がないことを特定することを含む。いくつかの実施の形態において、方法は、Ｒ９５Ｃ、Ｒ９５Ｇ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１５１Ｖ、Ｒ１５５Ｈ、Ｒ１５５Ｃ、Ｇ１５６Ｃ、Ｍ１５８Ｖ、Ｒ１５９Ｇ、Ｒ１５９Ｃ、Ｒ１５９Ｈ、Ｒ１９１Ｇ、Ｒ１９１Ｑ、Ｎ３８７Ｔ、Ｎ４０１Ｓ、Ｒ４８７Ｈ、Ｄ５９２Ｎ、Ｒ６６２Ｃ及びＮ７５０Ｓからなるリストから選択されるいかなる病因性遺伝子突然変異もＶＣＰ遺伝子中にないことを特定することを含む。
【0031】
本発明はまた、本発明の方法による方法を使用して、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると、又は非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有する疑いがあると患者を診断することと、患者にＶＣＰ阻害剤を投与することとを含む、対象において非ＶＣＰ関連ＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。
【0032】
本発明はまた、本発明の方法による方法を使用して、患者が非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると、又は非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有する疑いがあると決定されており、患者にＶＣＰ阻害剤を投与することを含む、対象において非ＶＣＰ関連ＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。
【0033】
本発明はまた、場合により１つ以上の賦形剤を含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
【0034】
本発明はまた、ＶＣＰ阻害剤を、それらを必要とする対象に投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの実施の形態において、対象はＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有すると特定されていない。いくつかの実施の形態において、対象はＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されている。いくつかの実施の形態において、ＡＬＳは非ＶＣＰ関連ＡＬＳである。ＶＣＰ阻害剤は、治療的有効量で投与され得る。
【0035】
本発明はまた、対象がＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有するかどうかを決定する手段を含む、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有するか又は有する疑いがあると対象を診断するためのキットを提供する。いくつかの実施の形態において、キットは、１つ以上のＶＣＰ阻害剤を含む１つ以上の容器及び場合により情報資料を更に含む。いくつかの実施の形態において、情報資料は、非ＶＣＰ関連ＡＬＳの診断及び／又は治療におけるキットの使用のための指示を含む。
【0036】
これより、本発明の実施形態を、例にすぎないが、添付の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３及びＳＦＰＱの誤局在を示す図である。Ａ）対照及びＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３の免疫標識。Ｂ）ＴＤＰ－４３の核：細胞質の比の個々の細胞の解析によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンが核：細胞質の比（Ｎ／Ｃ）の低下を示すことが確認される。Ｃ）運動ニューロンの神経突起におけるＴＤＰ－４３の定量化によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンは核：神経突起の比（Ｎｕ／Ｎｅ）が低下していることが示される。Ｄ）対照及びＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるＳＦＰＱの免疫標識。Ｅ）ＳＦＰＱの核：細胞質の比の個々の細胞の解析によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンに小さいが有意な低下があることが示される。Ｆ）運動ニューロンの神経突起におけるＳＦＰＱの定量化によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンは核：神経突起の比が減少していることが確認される。Ｇ）対照及びＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるｈｎＲＮＰＡ１の免疫標識。Ｈ）ｈｎＲＮＰＡ１の個々の細胞の定量化によって、対照及びＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて核：細胞質の比の差がないことが示される。Ｉ）対照及びＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるｈｎＲＮＰＫの局在。Ｊ）ｈｎＲＮＰＫの定量化によって、対照及びＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて核：細胞質の比の差がないことが示される。スケールバー＝１０μｍ。データは、３つの対照細胞株及び４つのＶＣＰ突然変異体株から収集される。グラフＢ、Ｅ、Ｈ及びＪについては、データはバイオリンプロットとして示され、各データ点は、６回の独立の実験反復由来のウェル（ＣＴＲＬ ｎ＝３４、ＶＣＰ ｎ＝４５）を示し、ｐ値は対応のないＴ検定から示される。およそ以下の数の細胞を解析した：Ｂ）ＣＴＲＬ１：１００００、ＣＴＲＬ２：１００００、ＣＴＲＬ３：１４０００、ＭＵＴ１：１３０００、ＭＵＴ２：１５０００、ＭＵＴ３：１４０００、ＭＵＴ４：１１０００、Ｅ）ＣＴＲＬ１：９０００、ＣＴＲＬ２：１００００、ＣＴＲＬ３：１３０００、ＭＵＴ１：１２０００、ＭＵＴ２：１４０００、ＭＵＴ３：１４０００、ＭＵＴ４：１２０００、Ｈ）ＣＴＲＬ１：９０００、ＣＴＲＬ２：１００００、ＣＴＲＬ３：１３０００、ＭＵＴ１：１２０００、ＭＵＴ２：１２０００、ＭＵＴ３：１３０００、ＭＵＴ４：９０００、Ｊ）ＣＴＲＬ１：９０００、ＣＴＲＬ２：９０００、ＣＴＲＬ３：１２０００、ＭＵＴ１：１１０００、ＭＵＴ２：１２０００、ＭＵＴ３：１２０００、ＭＵＴ４：９０００。グラフＣ及びＦについては、データは、３つの対照及び４つのＶＣＰ突然変異体株の３回の独立の実験から収集され、各細胞株について５０００を超えるニューロンが解析される。データはバイオリンプロットとして示され、データ点は視野を示し、ｐ値はマン・ホイットニー検定から計算される。すべてのデータは、各実験反復における対照値の平均に対して正規化される。
【図2】ＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼの薬理学的阻害が、対照の運動ニューロンにおいてＡＬＳ ＲＢＰ誤局在表現型を再現しないことを示す図である。Ａ）１μＭのＭＬ２４０（２－（２－アミノ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－１－イル）－８－メトキシ－Ｎ－（フェニルメチル）－４－キナゾリンアミン）で処理し、ＴＤＰ－４３及びβＩＩＩ－チューブリンで免疫標識した対照の運動ニューロン及びＤＡＰＩ染色。Ｂ）ＴＤＰ－４３の個々の細胞の定量化によって、ＭＬ２４０で処理した対照運動ニューロンは核：細胞質の比（Ｎ／Ｃ）が増加することが示された。Ｃ）ＭＬ２４０処理の際にＴＤＰ－４３の核：神経突起の比（Ｎｕ／Ｎｅ）の差はなかった。Ｄ）１μＭのＭＬ２４０で処理し、ＦＵＳ及びβＩＩＩ－チューブリンで免疫標識した対照の運動ニューロン及びＤＡＰＩ染色。Ｅ）対照の運動ニューロンへのＭＬ２４０の処理は、ＦＵＳの核局在：細胞質局在の差を示さなかった。Ｆ）ＭＬ２４０処理の際にＦＵＳの核：神経突起の比のわずかな増加が観察された。ＭＬ２４０処理の際にＳＦＰＱのＧ）核：細胞質の比又はＨ）核：神経突起の比の差はなかった。対照の運動ニューロンにおいて、ＭＬ２４０処理の際にＩ）ｈｎＲＮＰＡ１又はＪ）ｈｎＲＮＰＫの核：細胞質の比の差はなかった。スケールバー＝１０μｍ。データは、各実験反復における対照の未処理の値に対して正規化されたバイオリンプロットとして示される。データは、未処理条件と処理条件の両方においておよそ以下の数の細胞を使用して、３回の独立の実験反復にわたって３つの対照株から収集される：ＣＴＲＬ１：３０００、ＣＴＲＬ２：６０００、ＣＴＲＬ３：６０００。グラフＢ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｊについて、各データ点は、ウェル（ＵＴ ｎ＝１６、ＭＬ２４０ ｎ＝１６）を示し、ｐ値は対応のないＴ検定から計算され、グラフＣ、Ｆ、Ｈについて、各データ点は視野を示し、ｐ値はマン・ホイットニー検定から計算される。
【図3】ＶＣＰ Ｄ２－ＡＴＰアーゼドメインの阻害は、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいてＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱの誤局在表現型を反転させることを示す図である。Ａ）１μＭのＭＬ２４０で処理し、ＴＤＰ－４３及びβＩＩＩ－チューブリンで免疫標識したＶＣＰ突然変異体運動ニューロン。Ｂ）核：細胞質の比（Ｎ／Ｃ）の細胞ごとの定量化によって、ＶＣＰ運動ニューロンの低下している核：細胞質の比が、ＭＬ２４０処理の際に対照値を超えて増加することが示される。Ｃ）神経突起におけるＴＤＰ－４３の定量化によって、ＭＬ２４０処理の際に核：神経突起の比（Ｎｕ／Ｎｅ）の増加が示される。Ｄ）ＭＬ２４０で処理したＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるＦＵＳ及びβＩＩＩ－チューブリンの免疫標識。Ｅ）核及び細胞質におけるＦＵＳの定量化によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて、ＭＬ２４０処理の際に核：細胞質の比の増加が確認される。Ｆ）神経突起におけるＦＵＳの定量化によって、ＭＬ２４０処理の際に、対照値に対して核：神経突起の比の増加が示される。Ｇ）ＭＬ２４０で処理し、ＳＦＰＱ及びβＩＩＩ－チューブリンで免疫標識したＶＣＰ突然変異体運動ニューロン。ＭＬ２４０の処理は、ＳＦＰＱの細胞内分布を、Ｈ）核：細胞質の比を調べた場合は変化させないが、Ｉ）核：神経突起の比を調べた場合は増加させる。Ｊ）ｈｎＲＮＰＡ１の定量化によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて、ＭＬ２４０処理の際に核：細胞質の比の変化は示されない。Ｋ）ｈｎＲＮＰＫの定量化によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて、ＭＬ２４０処理の際に核：細胞質の比の変化は示されない。スケールバー＝１０μｍ。データは、４つのＶＣＰ ＡＬＳ突然変異体株の３回の独立の実験反復から収集され、およそ以下の数の細胞を解析した：ＭＵＴ１：７０００、ＭＵＴ２：６０００、ＭＵＴ３：７０００、ＭＵＴ４：６０００。データは、各実験反復について対照の未処理の値に対して正規化される。データはバイオリンプロットとして示され、各データ点は、グラフＢ、Ｅ、Ｈ、Ｊ及びＫでウェル（ＵＴ ｎ＝２４、ＭＬ２４０ ｎ＝２４）を、グラフＣ、Ｆ及びＩで視野を示す。グラフＢ、Ｅ、Ｈ及びＫ、ｐ値は対応のないＴ検定から計算され、グラフＣ、Ｆ、Ｉ及びＪについて、ｐ値はマン・ホイットニー検定から計算される。
【図4】対照の運動ニューロン及び突然変異ニューロンにおけるＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱの局在、並びにＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼ阻害の効果の図による描写である。
【図5】画像解析で使用したニューロンのセグメント化の画像例である。Ａ）核：細胞質の比の解析で使用した核コンパートメント及び細胞質コンパートメントの例。細胞ごとに核：細胞質の比を計算する。Ｂ）核：神経突起の比の解析で使用した核コンパートメント及び神経突起コンパートメントの例。視野ごとに核：神経突起の比を計算する。
【図6】運動ニューロンの特徴づけを示す図である。運動ニューロン特異的マーカーＳＭＩ－３２及びＣｈＡＴ並びにニューロンマーカーβＩＩＩ－チューブリンで免疫標識した、対照及びＶＣＰ突然変異体ｉＰＳＣ由来運動ニューロンの代表的な画像。スケールバー＝２０μｍ。
【図7】ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３及びＦＵＳのコンパートメント解析を示す図である。Ａ）核コンパートメント解析によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンは、ＤＡＰＩと比較した場合に、核においてＴＤＰ－４３が低下していることが示される。Ｂ）神経突起コンパートメント解析によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンは、ニューロンマーカーβＩＩＩ－チューブリンと比較した場合に、ニューロン突起においてＴＤＰ－４３が増加していることが示される。Ｃ）コンパートメント解析によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンの核においてＳＦＰＱタンパク質の低下が示される。Ｄ）コンパートメント解析によって、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンの神経突起においてＳＦＰＱの増加が示される。データは、各実験反復における対照の未処理の値に対して正規化されたバイオリンプロットとして示される。データは、３回の独立の実験反復にわたって６ウェルからの３つの対照株から収集される。データは視野ごとにプロットされ、ｐ値はマン・ホイットニー検定から計算される。
【図8】ウエスタンブロット解析によって、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱタンパク質のレベルが、ＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインの阻害の際に変化しないことが示されることを示す図である。Ａ）ＭＬ２４０ １μＭで処理していない及び処理した対照及びＶＣＰ突然変異体ＭＮのＳＰＦＱ、ＦＵＳ及びＴＤＰ－４３の代表的な免疫ブロット。Ｂ）ＧＡＰＤＨに対して正規化した、３つの対照及び３つのＶＣＰ突然変異体株からのＳＰＦＱ、ＦＵＳ及びＴＤＰ－４３の定量化によって、ＭＬ２４０処理は全タンパク質レベルを変化させないことが示された。
【図9】本研究で使用したｉＰＳＣ細胞株の詳細を示す図である。ＭＵＴ１及びＭＵＴ２はＶＣＰ中にＲ１９１Ｑ突然変異を有する細胞株であり、ＭＵＴ３及びＭＵＴ４はＶＣＰ中にＲ１５５Ｃ突然変異を有する細胞株であり、ＭＵＴ５及びＭＵＴ６はＴＡＲＤＢＰ中にＧ２９８Ｓ突然変異を有する細胞株である。
【図10】例示的ＶＣＰタンパク質配列を示す図である。この図は、例示的ヒトＶＣＰタンパク質配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５５０７２）を開示する。
【図11】ＶＣＰ突然変異体及びＴＡＲＤＢＰ突然変異体運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３のコンパートメント解析を示す図である。Ａ）ＴＤＰ－４３の個々の細胞の定量化によって、ＤＢＥＱで処理した対照の運動ニューロンは核：細胞質の比（Ｎ／Ｃ）が増加することが示された。Ｂ）ＴＤＰ－４３の個々の細胞の定量化によって、ＣＢ－５０８３で処理した対照の運動ニューロンは核：細胞質の比（Ｎ／Ｃ）が増加することが示された。Ｃ）ＴＤＰ－４３の個々の細胞の定量化によって、ＤＢＥＱで処理したＶＣＰ突然変異体運動ニューロンは核：細胞質の比（Ｎ／Ｃ）が増加することが示された。Ｄ）ＴＤＰ－４３の個々の細胞の定量化によって、ＣＢ５０８３で処理したＶＣＰ突然変異体運動ニューロンは核：細胞質の比（Ｎ／Ｃ）が増加することが示された。Ｅ）ＴＤＰ－４３の個々の細胞の定量化によって、ＣＢ５０８３で処理したＴＡＲＤＰ突然変異体運動ニューロンは核：細胞質の比（Ｎ／Ｃ）が増加することが示された。データは、４つのＣＴＲＬ株（ＣＴＲＬ２、ＣＴＲＬ３、ＣＴＲＬ４、ＣＴＲＬ５）、３つのＶＣＰ ＡＬＳ突然変異体株（ＭＵＴ１、ＭＵＴ３、ＭＵＴ４）及び２つのＴＡＲＤＢＰ ＡＬＳ突然変異体株（ＭＵＴ５、ＭＵＴ６）の２回の独立の実験反復から収集される。データは、各実験反復について未処理の値に対して正規化される。データは平均±ＳＤとしてプロットされ、示されるｐ値は対応のないＴ検定から計算される。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明がより容易に理解されるように、まず或る特定の用語を以下に定義する。以下の用語及び他の用語に対する更なる定義は、本明細書を通して記載される。
【0039】
本明細書において使用する場合、１以上の目的の値に適用される用語「およそ」又は「約」は、規定の基準値に類似する値を指す。或る特定の実施形態において、用語「およそ」又は「約」は、（かかる数が可能性のある値の１００％を超える場合を除いて）別段の指定がない限り又は文脈から明らかでない限り、規定の基準値のいずれかの方向の（より大きい又はより少ない）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％）、６％）、５％、４％、３％、２％、１％）以内に含まれる値の範囲を指す。
【0040】
本明細書において使用する場合、用語「改善」は、状態の予防、低減若しくは緩和又は対象の状態の好転を意味する。改善は、疾患状態の完全な回復又は完全な予防を含むが、これらを必要とするわけではない。
【0041】
本明細書において使用する場合、用語「比較可能な」は、科学的に合理的な比較を可能にするために、試験システム、条件のセット、効果又は結果と十分に類似しているシステム、条件のセット、効果又は結果を指す。どのシステム、条件のセット、効果又は結果が、本明細書に記載の任意の特定の試験システム、条件のセット、効果又は結果と「比較可能な」ほど十分に類似しているかを当業者は認識し、理解するであろう。
【0042】
本明細書において使用する場合、用語「相関する」は、「と相関を示す」というその通常の意味を有する。２つの特色、項目又は値は、これらが一緒に出現及び／又は変動する傾向を示す場合、互いに相関を示すことを当業者は認識するであろう。いくつかの実施形態において、相関は、そのｐ値が０．０５未満である場合に統計学的に有意であり、いくつかの実施形態において、相関は、そのｐ値が０．０１未満である場合に統計学的に有意である。いくつかの実施形態において、相関は、回帰分析によって評価される。いくつかの実施形態において、相関は相関係数である。
【0043】
本明細書において使用する場合、用語「向上させる」、「増加させる」若しくは「低減させる」又は文法的同等物は、参照に対する値｛例えば、ベースライン）測定値、例えば、本明細書に記載される、比較可能な条件で取られた測定値｛例えば、本明細書に記載の治療の開始より前の同じ個体において、又は治療がない場合の１対照個体（又は複数の対照個体）の測定値）を示す。
【0044】
本明細書において使用する場合、「ポリペプチド」は、一般的に言えば、ペプチド結合によって互いに結合した少なくとも２つのアミノ酸の列（string）である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは少なくとも３個～５個のアミノ酸を含むことができ、それらのそれぞれは、少なくとも１つのペプチド結合によって他のアミノ酸に結合している。ポリペプチドは、場合により、「非天然」アミノ酸又は他のエンティティを含むこともあり、これらは任意でポリペプチド鎖に組み込むことができることを当業者は認識するであろう。
【0045】
本明細書において使用する場合、用語「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに連結した少なくとも２つのアミノ酸の列）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン等であってもよい）を含むことができ、及び／又はそうでなければプロセッシング若しくは修飾を受けていてもよい。「タンパク質」は、細胞によって産生される（シグナル配列を有するか又は有さない）完全なポリペプチド鎖であってもよく、又はその特徴的な部分であってもよいことを当業者は認識するであろう。タンパク質は、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって連結した、又は他の手段によって結合した、２つ以上のポリペプチド鎖を含むことができることもあることを当業者は認識するであろう。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸又は両方を含有することができ、当該技術分野で既知の様々なアミノ酸修飾又は類似体のうちのいずれかを含有することができる。有用な修飾としては、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化等が挙げられる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸及びこれらの組み合わせを含むことができる。用語「ペプチド」は、一般に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満又は１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すのに使用される。
【0046】
「参照」エンティティ、システム、量、条件のセット等は、試験エンティティ、システム、量、条件のセット等が本明細書に記載のように比較されるものである。例えば、いくつかの実施形態において、「参照」個体は、いかなる形態のＡＬＳ疾患も患っていないし、該ＡＬＳ疾患に罹りやすくもない対照個体であり、いくつかの実施形態において、「参照」個体は、治療される個体と同じ形態のＡＬＳ疾患に罹患しており、場合により、（治療される個体と対照個体（複数の場合もある）における疾患のステージが比較可能であることを確実にするために）治療される個体と略同じ年齢である対照個体である。
【0047】
本明細書において使用する場合、用語「対象」、「個体」又は「患者」は、例えば、実験的、診断的、予防的及び／又は治療的な目的のために、本発明の実施形態を使用する又は施すことができる任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物｛例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類及びヒト；昆虫；蠕虫等）が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【0048】
本明細書において使用する場合、用語「標的細胞」又は「標的組織」は、治療されるＡＬＳの影響を受ける任意の細胞、組織若しくは生物、又はＡＬＳに関与するタンパク質が発現している任意の細胞、組織若しくは生物を指す。いくつかの実施形態において、標的細胞、標的組織又は標的生物としては、検出可能な又は異常に多い｛例えば、ＡＬＳを患っているか又はＡＬＳに罹りやすい患者で観察されるものと比較可能な）量のＦＵＳ又はＴＤＰ－４３が存在する細胞、組織又は生物が挙げられる。いくつかの実施形態において、標的細胞、標的組織又は標的生物としては、疾患と関連する病態、症状又は特色を呈する細胞、組織又は生物が挙げられる。
【0049】
本明細書において使用する場合、語句「薬剤」又は「治療剤」は、対象に投与される場合に、治療効果がある及び／又は所望の生物学的及び／又は薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態において、治療剤はＶＣＰ阻害剤である。いくつかの実施形態において、主要な治療剤は、１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用することができるＶＣＰ阻害剤である。
【0050】
本明細書において使用する場合、用語「治療レジメン」は、部分的に又は完全に、特定の疾患、障害及び／又は状態の１つ以上の症状若しくは特色を軽減する、該症状若しくは特色を改善する、該症状若しくは特色を除去する、該症状若しくは特色を阻害する、該症状若しくは特色を予防する、該症状若しくは特色の発症を遅延させる、該症状若しくは特色の重症度を低減させる、及び／又は該症状若しくは特色の発生率を低減させる任意の方法を指す。これは、場合により、規則的な又は変化のある時間間隔によって間隔があけられた１つ以上の用量の投与を含むことができる。いくつかの実施形態において、治療レジメンは、その実行が、｛例えば、細胞、組織又は生物の関連する集団にわたって）特定の効果、例えば、ＡＬＳ等の有害な状態若しくは疾患の低減若しくは排除を達成する、及び／又は該低減若しくは排除の達成と相関するように設計されているものである。いくつかの実施形態において、治療は、同じ又は異なる時間量にわたって、同時に、連続して、又は異なる時点のいずれかでの１つ以上の治療剤の投与を含む。いくつかの実施形態において、「治療レジメン」は、遺伝学的方法、例えば、遺伝子療法、遺伝子破壊、又は発現（例えば、特定の遺伝子産物、例えば、一次転写産物又はｍＲＮＡの転写、プロセシング及び／又は翻訳）を誘導する若しくは低減させることが知られている他の方法を含む。
【0051】
本明細書において使用する場合、用語「治療有効量」は、任意の医療的治療に適用可能な合理的な利益／危険比で、治療される対象に治療効果を与える治療剤の量を指す。そのような治療効果は、客観的（すなわち、何らかの試験又はマーカーによって測定可能）又は主観的（すなわち、対象が効果の指標を示すか又は効果を感じる）であってもよい。いくつかの実施形態において、「治療有効量」は、例えば、疾患と関連する症状を改善することによって、疾患の発症を予防する若しくは遅延させることによって、及び／又は疾患の症状の重症度若しくは頻度を減らすことによっても、関連する疾患若しくは状態を治療する、改善する若しくは予防する（例えば、関連する疾患若しくは状態の発症を遅延させる）のに、及び／又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すのに有効な、治療剤又は組成物の量を指す。治療有効量は、一般に、複数の単位用量を含むことができる投与レジメンで投与される。任意の特定の治療剤に関して、治療有効量（及び／又は有効な投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路又は他の治療剤との組み合わせに応じて変動してもよい。代替的に又は付加的に、任意の特定の患者のための特定の治療有効量（及び／又は単位用量）は、治療されるＡＬＳの特定の形態；ＡＬＳの重症度；用いられる特定の治療剤の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別及び食事；用いられる特定の治療剤の投与時間、投与経路及び／又は排出若しくは代謝の速度；治療の継続期間；医療技術分野で既知であるような因子を含めて、様々な因子に依存してもよい。
【0052】
本明細書において使用する場合、用語「治療」（さらに「治療する」又は「治療すること」）は、部分的に又は完全に、特定の疾患、障害及び／又は状態（例えば、ＡＬＳ）の１つ以上の症状若しくは特色を軽減する、該症状若しくは特色を改善する、該症状若しくは特色を除去する、該症状若しくは特色を阻害する、該症状若しくは特色の発症を遅延させる、該症状若しくは特色の重症度を低減させる及び／又は該症状若しくは特色の発生率を低減させるという点において所望の効果を達成する、治療レジメンによる治療剤の任意の投与を指し、いくつかの実施形態において、治療レジメンによる治療剤の投与が、所望の効果の達成と相関している。そのような治療は、関連する疾患、障害及び／又は状態の徴候を示さない対象のもの、及び／又は疾患、障害及び／又は状態の初期徴候しか示さない対象のものであってもよい。代替的に又は付加的に、そのような治療は、関連する疾患、障害及び／又は状態の１つ以上の確立された徴候を示す対象のものであってもよい。いくつかの実施形態において、治療は、関連する疾患、障害及び／又は状態を患っていると診断された対象のものであってもよい。いくつかの実施形態において、治療は、関連する疾患、障害及び／又は状態の発生の危険性の増大と統計的に相関している１つ以上の罹病性因子を有すると知られている対象のものであってもよい。
【0053】
本明細書において使用する場合、神経保護剤という用語は、ニューロン変性の進行を予防するか若しくは遅くする、及び／又は神経細胞死を予防する薬剤を指す。
【0054】
ＶＣＰ阻害性薬剤（ＶＣＰ阻害剤）
ＶＣＰ阻害剤はＶＣＰに結合することができる。ＶＣＰポリペプチドへの結合は、当業者に知られている任意の技法によって評価することができる。適切なアッセイの例としては、ｉｎ ｖｉｖｏで相互作用を測定するツーハイブリッドアッセイシステム、例えばカラム上に固定化されたポリペプチドへの結合を含むアフィニティークロマトグラフィーアッセイ、薬剤（複数の場合もある）とＶＣＰポリペプチドの結合が結合対の一方又は両方のパートナーの蛍光の変化と関連する蛍光アッセイ等が挙げられる。細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで行われるアッセイ、例えば、ツーハイブリッドアッセイが好ましい。本実施形態の好ましい態様では、本発明は、ＡＬＳの治療で有用な医薬品用の薬剤を特定する方法であって、試験される薬剤（単数又は複数）と細胞をインキュベートすることと、ＡＬＳと関係がある１つ以上の機能的パラメーターを改善する又は好転する薬剤を選択することとを含む、方法を提供する。
ＶＣＰ阻害剤はＶＣＰに結合することができる。ＶＣＰポリペプチドへの結合は、当業者に知られている任意の技法によって評価することができる。適切なアッセイの例としては、ｉｎ ｖｉｖｏで相互作用を測定するツーハイブリッドアッセイシステム、例えばカラム上に固定化されたポリペプチドへの結合を含むアフィニティークロマトグラフィーアッセイ、薬剤（複数の場合もある）とＶＣＰポリペプチドの結合が結合対の一方又は両方のパートナーの蛍光の変化と関連する蛍光アッセイ等が挙げられる。細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで行われるアッセイ、例えば、ツーハイブリッドアッセイが好ましい。本実施形態の好ましい態様では、本発明は、ＡＬＳの治療で有用な医薬品用の薬剤を特定する方法であって、試験される薬剤（単数又は複数）と細胞をインキュベートすることと、ＡＬＳと関係がある１つ以上の機能的パラメーターを改善する又は好転する薬剤を選択することとを含む、方法を提供する。
【0055】
ＶＣＰの機能的効果をモジュレートすることができる薬剤の例としては、ＶＣＰ及び／又はＶＣＰアダプタータンパク質の阻害剤である薬剤が挙げられる。
【0056】
ＶＣＰ阻害剤としては、上述の薬剤、並びに以下の表１に示す薬剤及びＶＣＰアダプタータンパク質を阻害及び／又は破壊する薬剤が挙げられる。
【0057】
【0058】
いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＭＬ２４０（２－（２－アミノ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－１－イル）－８－メトキシ－Ｎ－（フェニルメチル）－４－キナゾリンアミン）、ＭＬ２４１、２－アニリノ－４－アリール－１，３－チアゾール、３，４－メチレンジオキシ－６－ニトロスチレン、ＤＢｅＱ（Ｎ２，Ｎ４－ジベンジルキナゾ－リン－２，４－ジアミン）、ＮＭＳ－８７３、ＮＭＳ－８５９、イイヤレスタチンＩ及びキサントフモールからなる群から選択される。
【0059】
いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＭＬ２４０（２－（２－アミノ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－１－イル）－８－メトキシ－Ｎ－（フェニルメチル）－４－キナゾリンアミン）、ＭＬ２４１、２－アニリノ－４－アリール－１，３－チアゾール、３，４－メチレンジオキシ－６－ニトロスチレン、ＤＢｅＱ（Ｎ２，Ｎ４－ジベンジルキナゾ－リン－２，４－ジアミン）、ＣＢ－５０８３（１－［７，８－ジヒドロ－４－［（フェニルメチル）アミノ］－５Ｈ－ピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチル－１Ｈ－インドール－４－カルボキサミド）、ＣＢ－５３３９（１－［４－（ベンジルアミノ）－５，６，７，８－テトラヒドロピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－２－イル］－２－メチルインドール－４－カルボキサミド）、ＵＰＣＤＣ－３０２４５（１－（３－（５－フルオロ－１Ｈ－インドール－２－イル）フェニル）－Ｎ－（２－（４－イソプロピルピペラジン－１－イル）エチル）ピペリジン－４－アミン）、ＮＭＳ－８７３、ＮＭＳ－８５９、イイヤレスタチンＩ及びキサントフモールからなる群から選択される。
【0060】
いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＭＬ２４０、ＤＢｅＱ及びＣＢ－５０８３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤はＭＬ２４０である。いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤はＤＢｅＱである。いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤はＣＢ－５０８３である。いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤はＣＢ－５０８３又はＣＢ－５３３９である。
【0061】
本明細書に記載のＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰ関連又は非ＶＣＰ関ＡＬＳを治療するために使用することができる。好ましくは、ＡＬＳは非ＶＣＰ関連ＡＬＳであり、ＶＣＰ阻害剤はＶＣＰのＤ２ ＡＴＰアーゼドメインを阻害する。したがって、好ましい態様において、本発明は、ＶＣＰのＤ２ ＡＴＰアーゼドメインを阻害する、対象において非ＶＣＰ関連ＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＬＳは非ＶＣＰ関連ＡＬＳであり、ＶＣＰ阻害剤はＣＢ－５０８３又はＣＢ－５３３９である。いくつかの実施形態において、対象はＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されており、ＶＣＰ阻害剤はＶＣＰのＤ２ ＡＴＰアーゼドメインを阻害する。いくつかの実施形態において、対象はＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されており、ＶＣＰ阻害剤はＣＢ－５０８３又はＣＢ－５３３９である。
【0062】
いくつかの実施形態において、対象は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有するか又は有すると特定されており、ＶＣＰ阻害剤はＶＣＰのＤ２ ＡＴＰアーゼドメインを阻害する。いくつかの実施形態において、対象は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有するか又は有すると特定されており、ＶＣＰ阻害剤はＣＢ－５０８３又はＣＢ－５３３９である。いくつかの実施形態において、対象は、位置Ｇ２９８でＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有するか又は有すると特定されており、ＶＣＰ阻害剤はＶＣＰのＤ２ ＡＴＰアーゼドメインを阻害する。いくつかの実施形態において、位置Ｇ２９８の突然変異はＧ２９８Ｓ突然変異である。いくつかの実施形態において、対象は、位置Ｇ２９８でＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有するか又は有すると特定されており、ＶＣＰ阻害剤はＣＢ－５０８３又はＣＢ－５３３９である。いくつかの実施形態において、位置Ｇ２９８の突然変異はＧ２９８Ｓ突然変異である。
【0063】
ＶＣＰアダプタータンパク質は当該技術分野で既知である。例えば、［２１］、特にその中の表１を参照されたい。さらに、ＶＣＰアダプタータンパク質を特定する方法が知られている。例えば［２２］は、ＶＣＰとＵＢＸＤ１補助因子の間の複合体を特定するのに用いられる、不偏質量分析に基づく方法を記載している。
【0064】
ＶＣＰの活性又は局在に影響する薬剤は、直鎖状、環状、多環式又はこれらの組み合わせであり得る有機薬剤、ペプチド、抗体を含むポリペプチド、又はタンパク質を含めた、低分子量薬剤を含む略すべての一般的な種類のものであってもよい。一般に、本明細書において使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義語とみなされる。或る特定のＶＣＰ阻害剤は表１で上述されている。他の有用なＶＣＰ阻害剤の例について、［２３］も参照されたい。
【0065】
本明細書において使用する場合、「ＶＣＰ阻害剤」は、正常な神経細胞機能に必要とされるＶＣＰの活性を阻害することができる薬物である。ＶＣＰの阻害剤は当該技術分野で既知であり、ＶＣＰは癌療法及び他の医療分野の標的でもあるので定期的に発見されている。例示的阻害剤としては上記のものが挙げられ、ＶＣＰ阻害剤を特定する方法は従来技術に記載されている。いくつかの実施形態において、本発明のＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰのＤ２ ＡＴＰアーゼドメインを阻害することによってＶＣＰの活性を阻害することができる。
【0066】
ＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰアンタゴニストと呼ぶことができる。
【0067】
薬剤の医薬組成物
薬剤は医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物は、薬剤（すなわち、ＶＣＰ阻害剤）を含むことができる。医薬組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）～約１０ミリグラム（ｍｇ）の薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は約２５ｎｇ～約５ｍｇの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約５０ｎｇ～約１ｍｇの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約０．１マイクログラム～約５００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１マイクログラム～約３５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約５マイクログラム～約２５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１０マイクログラム～約２００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１５マイクログラム～約１５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２０マイクログラム～約１００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２５マイクログラム～約７５マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約３０マイクログラム～約５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約３５マイクログラム～約４０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１００マイクログラム～約２００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１０マイクログラム～約１００マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２０マイクログラム～約８０マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２５マイクログラム～約６０マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約３０ｎｇ～約５０マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約３５ｎｇ～約４５マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約０．１マイクログラム～約５００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１マイクログラム～約３５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２５マイクログラム～約２５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１００マイクログラム～約２００マイクログラムの薬剤を含有する。
薬剤は医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物は、薬剤（すなわち、ＶＣＰ阻害剤）を含むことができる。医薬組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）～約１０ミリグラム（ｍｇ）の薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明による医薬組成物は約２５ｎｇ～約５ｍｇの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約５０ｎｇ～約１ｍｇの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約０．１マイクログラム～約５００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１マイクログラム～約３５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約５マイクログラム～約２５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１０マイクログラム～約２００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１５マイクログラム～約１５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２０マイクログラム～約１００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２５マイクログラム～約７５マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約３０マイクログラム～約５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約３５マイクログラム～約４０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１００マイクログラム～約２００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１０マイクログラム～約１００マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２０マイクログラム～約８０マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２５マイクログラム～約６０マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約３０ｎｇ～約５０マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約３５ｎｇ～約４５マイクログラムの薬剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約０．１マイクログラム～約５００マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１マイクログラム～約３５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約２５マイクログラム～約２５０マイクログラムの薬剤を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は約１００マイクログラム～約２００マイクログラムの薬剤を含有する。
【0068】
他の実施形態において、医薬組成物は、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４５ｎｇ、５０ｎｇ、５５ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、８５ｎｇ、９０ｎｇ、９５ｎｇ又は１００ｎｇまで（その数値を含む）の薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１マイクログラム、５マイクログラム、１０マイクログラム、１５マイクログラム、２０マイクログラム、２５マイクログラム、３０マイクログラム、３５マイクログラム、４０マイクログラム、４５マイクログラム、５０マイクログラム、５５マイクログラム、６０マイクログラム、６５マイクログラム、７０マイクログラム、７５マイクログラム、８０マイクログラム、８５マイクログラム、９０マイクログラム、９５マイクログラム、１００マイクログラム、１０５マイクログラム、１１０マイクログラム、１１５マイクログラム、１２０マイクログラム、１２５マイクログラム、１３０マイクログラム、１３５マイクログラム、１４０マイクログラム、１４５マイクログラム、１５０マイクログラム、１５５マイクログラム、１６０マイクログラム、１６５マイクログラム、１７０マイクログラム、１７５マイクログラム、１８０マイクログラム、１８５マイクログラム、１９０マイクログラム、１９５マイクログラム、２００マイクログラム、２０５マイクログラム、２１０マイクログラム、２１５マイクログラム、２２０マイクログラム、２２５マイクログラム、２３０マイクログラム、２３５マイクログラム、２４０マイクログラム、２４５マイクログラム、２５０マイクログラム、２５５マイクログラム、２６０マイクログラム、２６５マイクログラム、２７０マイクログラム、２７５マイクログラム、２８０マイクログラム、２８５マイクログラム、２９０マイクログラム、２９５マイクログラム、３００マイクログラム、３０５マイクログラム、３１０マイクログラム、３１５マイクログラム、３２０マイクログラム、３２５マイクログラム、３３０マイクログラム、３３５マイクログラム、３４０マイクログラム、３４５マイクログラム、３５０マイクログラム、３５５マイクログラム、３６０マイクログラム、３６５マイクログラム、３７０マイクログラム、３７５マイクログラム、３８０マイクログラム、３８５マイクログラム、３９０マイクログラム、３９５マイクログラム、４００マイクログラム、４０５マイクログラム、４１０マイクログラム、４１５マイクログラム、４２０マイクログラム、４２５マイクログラム、４３０マイクログラム、４３５マイクログラム、４４０マイクログラム、４４５マイクログラム、４５０マイクログラム、４５５マイクログラム、４６０マイクログラム、４６５マイクログラム、４７０マイクログラム、４７５マイクログラム、４８０マイクログラム、４８５マイクログラム、４９０マイクログラム、４９５マイクログラム、５００マイクログラム、６０５マイクログラム、６１０マイクログラム、６１５マイクログラム、６２０マイクログラム、６２５マイクログラム、６３０マイクログラム、６３５マイクログラム、６４０マイクログラム、６４５マイクログラム、６５０マイクログラム、６５５マイクログラム、６６０マイクログラム、６６５マイクログラム、６７０マイクログラム、６７５マイクログラム、６８０マイクログラム、６８５マイクログラム、６９０マイクログラム、６９５マイクログラム、７００マイクログラム、７０５マイクログラム、７１０マイクログラム、７１５マイクログラム、７２０マイクログラム、７２５マイクログラム、７３０マイクログラム、７３５マイクログラム、７４０マイクログラム、７４５マイクログラム、７５０マイクログラム、７５５マイクログラム、７６０マイクログラム、７６５マイクログラム、７７０マイクログラム、７７５マイクログラム、７８０マイクログラム、７８５マイクログラム、７９０マイクログラム、７９５マイクログラム、８００マイクログラム、８０５マイクログラム、８１０マイクログラム、８１５マイクログラム、８２０マイクログラム、８２５マイクログラム、８３０マイクログラム、８３５マイクログラム、８４０マイクログラム、８４５マイクログラム、８５０マイクログラム、８５５マイクログラム、８６０マイクログラム、８６５マイクログラム、８７０マイクログラム、８７５マイクログラム、８８０マイクログラム、８８５マイクログラム、８９０マイクログラム、８９５マイクログラム、９００マイクログラム、９０５マイクログラム、９１０マイクログラム、９１５マイクログラム、９２０マイクログラム、９２５マイクログラム、９３０マイクログラム、９３５マイクログラム、９４０マイクログラム、９４５マイクログラム、９５０マイクログラム、９５５マイクログラム、９６０マイクログラム、９６５マイクログラム、９７０マイクログラム、９７５マイクログラム、９８０マイクログラム、９８５マイクログラム、９９０マイクログラム、９９５マイクログラム又は１０００マイクログラムまで（その数値を含む）の薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、５ｍｇ、５．５ｍｇ、６ｍｇ、６．５ｍｇ、７ｍｇ、７．５ｍｇ、８ｍｇ、８．５ｍｇ、９ｍｇ、９．５ｍｇ又は１０ｍｇまで（その数値を含む）の薬剤を含むことができる。
【0069】
いくつかの実施形態において、本発明の薬剤の用量は約０．５ｍｇから約５０００ｍｇである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物で使用される本発明の薬剤の用量は、約５０００ｍｇ未満又は約４０００ｍｇ未満又は約３０００ｍｇ未満又は約２０００ｍｇ未満又は約１０００ｍｇ未満又は約８００ｍｇ未満又は約６００ｍｇ未満又は約５００ｍｇ未満又は約２００ｍｇ未満又は約５０ｍｇ未満である。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の第２の薬剤の用量は、約１０００ｍｇ未満又は約８００ｍｇ未満又は約６００ｍｇ未満又は約５００ｍｇ未満又は約４００ｍｇ未満又は約３００ｍｇ未満又は約２００ｍｇ未満又は約１００ｍｇ未満又は約５０ｍｇ未満又は約４０ｍｇ未満又は約３０ｍｇ未満又は約２５ｍｇ未満又は約２０ｍｇ未満又は約１５ｍｇ未満又は約１０ｍｇ未満又は約５ｍｇ未満又は約２ｍｇ未満又は約１ｍｇ未満又は約０．５ｍｇ未満、及びそれらのありとあらゆる全体又は部分的増分である。
【0070】
一実施形態において、本発明の薬剤は、１日あたり１回～５回又はそれ以上の範囲の投薬量で患者に投与される。別の実施形態において、本発明の薬剤は、限定されないが、１日に１回、２日ごと、３日ごとから１週に１回及び２週に１回を含めた投薬量の範囲で患者に投与される。本発明の様々な組み合わせ組成物の投与頻度は、限定されないが、年齢、治療される疾患又は障害、性別、全体的な健康状態及び他の因子を含めた多くの因子に応じて、対象によって異なることが当業者に容易に明らかになるであろう。したがって、本発明は、任意の特定の投薬レジメンに限定されると解釈されるべきではなく、任意の患者に投与される正確な投薬量及び組成物は、主治医が、患者に関するすべての他の因子を考慮することによって決定される。
【0071】
医薬組成物は、使用される投与様式に従って、製剤化の目的で他の薬剤を更に含むことができる。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合は、これは、無菌であり、発熱物質を含まず、かつ微粒子を含まない。等張製剤が好ましくは使用される。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。或る場合には、リン酸緩衝食塩水等の等張液が適切である。安定化剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
【0072】
薬剤は、医薬的に許容可能な賦形剤を更に含むことができる。医薬的に許容可能な賦形剤は、機能性分子、例えば、ビヒクル、アジュバント、担体又は希釈剤であり得る。
【0073】
適切な組成物及び剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、丸剤、ゲルカプセル剤（gel caps）、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ剤、経皮吸収型製剤、ゲル剤、粉末剤、ペレット剤、マグマ剤、ロゼンジ剤、クリーム剤、ペースト剤、硬膏剤、ローション剤、ディスク剤、坐剤、鼻又は経口投与用の液体噴霧剤、吸入用の乾燥粉末剤又はエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物及び製剤等が挙げられる。本発明で有用であると思われる製剤及び組成物は、本明細書に記載の特定の製剤及び組成物に限定されないことを理解されたい。
【0074】
経口適用については、錠剤、糖衣錠、液剤、ドロップ剤、可溶性錠剤（suppositories）、又はカプセル剤、カプレット剤及びゲルカプセル剤が特に適している。経口投与に適した他の製剤としては、限定されないが、粉末化若しくは顆粒状製剤、水性若しくは油性懸濁剤、水性若しくは油性溶液剤、ペースト剤、ゲル剤、練り歯磨き、口腔洗浄薬、コーティング剤、含嗽液又は乳剤が挙げられる。経口使用を意図とした組成物は、当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、錠剤の製造に適した不活性な無毒の医薬的賦形剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含むことができる。そのような賦形剤としては、例えば、ラクトース等の不活性な希釈剤；コーンスターチ等の造粒剤及び崩壊剤；デンプン等の結合剤；並びにステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤が挙げられる。
【0075】
錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は対象の消化管において遅延崩壊を達成し、それによって、活性成分の持続放出及び吸収をもたらすように、既知の方法を使用してコーティングされていてもよい。例として、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の材料を使用して、錠剤をコーティングすることができる。錠剤は、美味な調製物を提供するために、甘味剤、着香剤、着色剤、防腐剤、又はこれらの何らかの組み合わせを更に含むことができる。
【0076】
制御放出製剤及び薬物送達システム
本発明の医薬組成物の制御又は持続放出製剤は、従来の技術を使用して作製することができる。或る場合には、使用される剤形は、様々な比率で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透性システム、多層コーティング、マイクロ粒子、リポソーム若しくはミクロスフェア又はこれらの組み合わせを使用して、その中の１つ以上の活性成分の徐放又は制御放出として提供することができる。本明細書に記載のものを含めて、当業者に既知の適切な制御放出製剤を、本発明の医薬組成物との使用のために容易に選択することができる。したがって、制御放出に適している、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤及びカプレット剤等の経口投与に適した単一単位剤形が本発明に包含される。
本発明の医薬組成物の制御又は持続放出製剤は、従来の技術を使用して作製することができる。或る場合には、使用される剤形は、様々な比率で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透性システム、多層コーティング、マイクロ粒子、リポソーム若しくはミクロスフェア又はこれらの組み合わせを使用して、その中の１つ以上の活性成分の徐放又は制御放出として提供することができる。本明細書に記載のものを含めて、当業者に既知の適切な制御放出製剤を、本発明の医薬組成物との使用のために容易に選択することができる。したがって、制御放出に適している、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤及びカプレット剤等の経口投与に適した単一単位剤形が本発明に包含される。
【0077】
大抵の制御放出医薬製品は、その非制御対応物によって達成されるものよりも薬物療法を向上させるという共通の目標がある。理想的には、医療的治療における最適に設計された制御放出調製物の使用は、最小限の薬物物質を用いて、最小限の時間量で状態を治癒させる又は制御することを特徴とする。
【0078】
制御放出製剤の利点としては、薬物の活性の延長、投与頻度の低減及び患者コンプライアンスの増大が挙げられる。さらに、制御放出製剤を使用して、作用の発現時間又は他の特性、例えば薬物の血中レベルに影響を及ぼすことができ、それにより、副作用の出現に影響を及ぼすことができる。
【0079】
大抵の制御放出製剤は、所望の治療効果を迅速にもたらす量の薬物を最初に放出し、長期間にわたってこのレベルの治療効果を維持するための他の量の薬物を徐々にかつ絶えず放出するように設計される。体内で薬物のこの一定レベルを維持するために、薬は、代謝され、体から排出される薬物の量に取って代わる速度で剤形から放出されなければならない。
【0080】
活性成分の制御放出は、様々な誘導因子、例えば、ｐＨ、温度、酵素、水若しくは他の生理的条件又は化合物によって刺激することができる。本発明の文脈における用語「制御放出成分」は、限定されないが、活性成分の制御放出を促す、ポリマー、ポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、リポソーム若しくはミクロスフェア又はこれらの組み合わせを含めた化合物（単数又は複数）と本明細書で定義される。
【0081】
或る特定の実施形態において、本発明の製剤は、限定されないが、短期製剤、急速オフセット製剤、並びに制御放出製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤及びパルス放出製剤であってもよい。
【0082】
持続放出という用語は、その従来の意味で使用されて、長期間にわたって段階的に薬物を放出し、必ずではないが、長期間にわたって実質的に一定の薬物血中レベルをもたらすことができる薬物製剤を指す。期間は、１か月以上にも及んでもよく、ボーラス形態で投与される同じ量の薬剤よりも長く放出されなければならない。
【0083】
持続放出については、化合物に持続放出性をもたらす適切なポリマー又は疎水性材料とともに化合物を製剤化することができる。したがって、本発明の方法で使用するための化合物は、例えば注射によってマイクロ粒子の形態で、又は埋植によってカシェ剤若しくはディスク剤の形態で投与することができる。本発明の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、持続放出製剤を使用して、単独で又は別の医薬品と組み合わせて患者に投与される。
【0084】
遅延放出という用語は、その従来の意味で本明細書において使用されて、薬物投与に続いていくらかの遅延後に薬物の最初の放出をもたらし、約１０分から約１２時間までの遅延を含む薬物製剤を指す。
【0085】
即時放出という用語は、その従来の意味で使用されて、薬物投与の直後に薬物の放出をもたらす薬物製剤を指す。
【0086】
本明細書において使用する場合、短期は、薬物投与後の約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４０分、約２０分又は約１０分まで（その数値を含む）、及びそれらのありとあらゆる全体又は部分的増分の任意の期間を指す。
【0087】
本明細書において使用する場合、急速オフセットは、薬物投与後の約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４０分、約２０分又は約１０分まで（その数値を含む）、及びそれらのありとあらゆる全体又は部分的増分の任意の期間を指す。
【0088】
キット
本明細書に記載の薬剤は、キットで提供することができる。いくつかの例では、キットは、（ａ）本明細書に記載の薬剤を含む容器と、場合により（ｂ）情報資料とを含む。情報資料は、本明細書に記載の方法及び／又は例えば治療的利益のための薬剤の使用に関する、説明資料、指示的資料、マーケティング資料又は他の資料であり得る。
本明細書に記載の薬剤は、キットで提供することができる。いくつかの例では、キットは、（ａ）本明細書に記載の薬剤を含む容器と、場合により（ｂ）情報資料とを含む。情報資料は、本明細書に記載の方法及び／又は例えば治療的利益のための薬剤の使用に関する、説明資料、指示的資料、マーケティング資料又は他の資料であり得る。
【0089】
キットの情報資料は、その形式が制限されない。いくつかの例では、情報資料は、治療剤の製造、治療剤の分子量、濃度、有効期限、バッチ又は製造場所の情報等に関する情報を含むことができる。他の局面では、情報資料は、例えば、投与の適切な量、方式又は様式（例えば、本明細書に記載の投与の用量、剤形又は様式）で治療剤を投与する方法に関する。方法は、ＡＬＳを有する対象を治療する方法であり得る。
【0090】
或る場合には、情報資料、例えば指示書は、印刷物、例えば、印刷された文章、図面及び／又は写真、例えば、ラベル又は印刷されたシートで提供される。情報資料は、他の型式、例えば、点字、コンピュータ可読資料、ビデオ録画物又は録音物で提供することもできる。他の例では、キットの情報資料は、キットの使用者が、その中の治療剤及び／又は本明細書に記載の方法におけるその使用に関して本質的な情報を得ることができる、問い合わせ先、例えば、物理アドレス、電子メールアドレス、ウェブサイト又は電話番号である。情報資料は、型式の任意の組み合わせで提供することもできる。
【0091】
治療剤に加えて、キットは、他の成分、例えば、溶媒若しくは緩衝液、安定化剤又は防腐剤を含むことができる。キットは、更なる薬剤、例えば、第２又は第３の薬剤、例えば、他の治療剤を含むこともできる。成分は、任意の形態、例えば、液体、乾燥又は凍結乾燥形態で提供することができる。成分は、実質的に純粋（しかし、これらを、一緒に組み合わせるか若しくは互いに別々に送達することができる）及び／又は無菌であり得る。成分が液状溶液で提供される場合、液状溶液は、水溶液、例えば、無菌の水溶液であり得る。成分が乾燥形態として提供される場合、再構成は、一般に、適切な溶媒の添加による。溶媒、例えば、無菌の水又は緩衝液を、場合によりキット中に提供することができる。
【0092】
キットは、治療剤又は他の薬剤のための１つ以上の容器を含むことができる。或る場合には、キットは、治療剤及び情報資料のための別々の容器、ディバイダー又はコンパートメントを含む。例えば、治療剤をボトル、バイアル又はシリンジに入れることができ、情報資料をプラスチック製のスリーブ又はパケットに入れることができる。他の局面では、キットの別々の要素は単一の分割されていない容器に含まれる。例えば、ラベルの形態で情報資料が添付されたボトル、バイアル又はシリンジに治療剤を入れることができる。或る場合には、キットは、それぞれ治療剤の１つ以上の単位剤形（例えば、本明細書に記載の剤形）を含む、複数（例えば、１パック）の個々の容器を含むことができる。容器は、単位用量、例えば、治療剤を含む単位を含むことができる。例えば、キットは、例えば、それぞれ単位用量を含む、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、ブリスターパック又は医療装置を含むことができる。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、湿気又は蒸発の変化に対して不浸透性）及び／又は遮光性であり得る。
【0093】
キットは、場合により、治療剤の投与に適した装置、例えば、シリンジ又は他の適切な送達装置を含むことができる。装置は、例えば単位用量の治療剤を予め充填して提供することができ、又は空であってもよいが、充填に適しているものとする。
【0094】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、成人発症型の致死的な神経変性障害であり、一次運動野の上位運動ニューロンと脳幹及び脊髄の下位運動ニューロンの両方の変性を特徴とする。ＡＬＳの症状は、初期に、筋肉の萎縮及び衰弱を含む。続いて、随意筋、最終的に呼吸筋の麻痺の広がりが発生することが多い。ＡＬＳを有する患者のおよそ５０％は、しばしば呼吸不全により、症状発症の３０か月以内に死ぬが、患者の約１０％は、１０年間より長く生存することができる［２４］。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、成人発症型の致死的な神経変性障害であり、一次運動野の上位運動ニューロンと脳幹及び脊髄の下位運動ニューロンの両方の変性を特徴とする。ＡＬＳの症状は、初期に、筋肉の萎縮及び衰弱を含む。続いて、随意筋、最終的に呼吸筋の麻痺の広がりが発生することが多い。ＡＬＳを有する患者のおよそ５０％は、しばしば呼吸不全により、症状発症の３０か月以内に死ぬが、患者の約１０％は、１０年間より長く生存することができる［２４］。
【0095】
ＡＬＳ患者の約１０％～１５％は家族型の疾患を有し、少なくとも２人の第一度又は第二度近親者がＡＬＳを有する［２５］。家族歴が確認されない場合、診断は、孤発性（又は非家族性）であると考えられる。孤発性ＡＬＳの発生率は、西洋諸国において変動をほとんど示さず、１０００００人年あたり１人～２人の範囲であり、推定される生涯リスクは４００人に１人である。ＡＬＳは、４０歳前はまれであり、その後年齢とともに指数関数的に増加する。平均発症年齢は孤発性ＡＬＳについて５８歳～６３歳であり、家族性ＡＬＳについて４０歳～６０歳であり、７０歳～７９歳の年齢で発生率がピークとなる。男性は、女性よりもＡＬＳの危険性が高く、１．２～１．５の男性対女性の比をもたらす［２４］。
【0096】
いくつかの実施形態において、ＡＬＳは家族性ＡＬＳであり得る。いくつかの実施形態において、ＡＬＳは孤発性ＡＬＳであり得る。いくつかの実施形態において、家族性ＡＬＳは、家族歴において２回以上の本疾患の出現がある患者と定義される。いくつかの実施形態において、孤発性ＡＬＳは、本疾患を有する他の家族の病歴が判明していない患者と定義される。いくつかの実施形態において、ＡＬＳは、ＶＣＰタンパク質中の１つ以上の病因性遺伝子突然変異と関連し得る。いくつかの実施形態において、ＡＬＳは、ＶＣＰタンパク質中の１つ以上の病因性遺伝子突然変異と関連する家族性ＡＬＳであり得る。いくつかの実施形態において、ＡＬＳは、ＶＣＰタンパク質中の１つ以上の病因性遺伝子突然変異と関連する孤発性ＡＬＳであり得る。
【0097】
いくつかの実施形態において、対象は、ＶＣＰ遺伝子以外の遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有する。病因性突然変異は既知の病因性突然変異とすることができる。病因性突然変異はＡＬＳを引き起こす突然変異であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、対象は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有する。したがって、いくつかの実施形態において、ＡＬＳは、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子中の１つ以上の遺伝子突然変異と関連していてもよい。いくつかの実施形態において、対象は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有すると特定されている。そのような突然変異は当該技術分野で既知であろう。いくつかの実施形態において、対象は、位置Ｓ２９２、Ｇ２９４、Ｇ２９５、Ｇ２９８、Ａ３１５、Ａ３８２、Ｍ３３７、Ｇ３４８又はＳ３９３のいずれか１つ以上でＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有するか又は有すると特定されている。いくつかの実施形態において、対象は、Ｓ２９２Ｎ、Ｇ２９４Ｖ、Ｇ２９５Ｓ、Ｇ２９８Ｓ、Ａ３１５Ｔ、Ａ３８２Ｔ、Ｍ３３７Ｖ、Ｇ３４８Ｃ及びＳ３９３Ｌからなるリストから選択される１つ以上の病因性遺伝子突然変異をＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に有するか又は有すると特定されている。いくつかの実施形態において、対象は、位置Ｇ２９８でＴＡＲＤＢＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有するか又は有すると特定されている。いくつかの実施形態において、位置Ｇ２９８の突然変異はＧ２９８Ｓ突然変異である。
【0098】
ＶＣＰ中の病因性遺伝子突然変異
ＡＬＳの対象は、ＶＣＰ遺伝子中に１つ以上の既知の病因性突然変異を有すると特定することができる。そのような対象は、ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると特徴づけすることができる。ＡＬＳの対象は、ＶＣＰ遺伝子中に１つ以上の既知の病因性突然変異を有さないと特定することができる。そのような対象は、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると特徴づけすることができる。本発明は、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有すると特定されていない対象においてＡＬＳを治療又は予防する方法を提供する。本発明はまた、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されている対象においてＡＬＳを治療又は予防する方法を提供する。本発明はまた、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有すると特定されていない対象においてＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。本発明はまた、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されている対象においてＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。
ＡＬＳの対象は、ＶＣＰ遺伝子中に１つ以上の既知の病因性突然変異を有すると特定することができる。そのような対象は、ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると特徴づけすることができる。ＡＬＳの対象は、ＶＣＰ遺伝子中に１つ以上の既知の病因性突然変異を有さないと特定することができる。そのような対象は、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると特徴づけすることができる。本発明は、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有すると特定されていない対象においてＡＬＳを治療又は予防する方法を提供する。本発明はまた、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されている対象においてＡＬＳを治療又は予防する方法を提供する。本発明はまた、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有すると特定されていない対象においてＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。本発明はまた、ＶＣＰ遺伝子中に病因性突然変異を有さないと特定されている対象においてＡＬＳを治療又は予防する方法で使用するためのＶＣＰ阻害剤を提供する。
【0099】
いくつかの実施形態において、対象は、表２に列挙されるＶＣＰ病因性遺伝子突然変異のうちのいずれも有さないと特定されている。いくつかの実施形態において、対象は、位置Ｒ９５、Ｉ１１４、Ｉ１５１、Ｒ１５５、Ｇ１５６、Ｍ１５８、Ｒ１５９、Ｒ１９１、Ｎ３８７、Ｎ４０１、Ｒ４８７、Ｄ５９２、Ｒ６６２及びＮ７５０のいずれにおいてもＶＣＰ遺伝子中に病因性遺伝子突然変異を有さないと特定されている。いくつかの実施形態において、患者は、Ｒ９５Ｃ、Ｒ９５Ｇ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１５１Ｖ、Ｒ１５５Ｈ、Ｒ１５５Ｃ、Ｇ１５６Ｃ、Ｍ１５８Ｖ、Ｒ１５９Ｇ、Ｒ１５９Ｃ、Ｒ１５９Ｈ、Ｒ１９１Ｇ、Ｒ１９１Ｑ、Ｎ３８７Ｔ、Ｎ４０１Ｓ、Ｒ４８７Ｈ、Ｄ５９２Ｎ、Ｒ６６２Ｃ及びＮ７５０Ｓからなるリストから選択される病因性遺伝子突然変異をＶＣＰ遺伝子中に有さないと特定されている。
【0100】
ＡＬＳの推定５パーセント～１０パーセントは家族性であり、いくつかの遺伝子のうちの１つにおける突然変異によって引き起こされる。遺伝のパターンは、関与する遺伝子に応じて変動する。大抵の場合は常染色体優性のパターンで遺伝し、これは、各細胞中の１コピーの変化した遺伝子が、障害を引き起こすのに十分であることを意味する。大抵の場合、罹患した人にはその状態を有する親が１人いる。ＡＬＳを引き起こすことが既知の家族性遺伝子突然変異を受け継ぐ一部の人は、その状態の特色を一切発生しないことがある。なぜ突然変異遺伝子を有する人の中で該疾患を発生する人もいれば、発生しない人もいるかは不明である。
【0101】
頻度は低いが、ＡＬＳは常染色体劣性のパターンで遺伝し、これは、各細胞の遺伝子の両方のコピーが突然変異を有することを意味する。常染色体劣性状態を有する個体の親は、それぞれ、１コピーの突然変異遺伝子を保有するが、これらは、典型的には、該状態の徴候及び症状を示さない。罹患した人の親は罹患していないので、常染色体劣性ＡＬＳは、家族性遺伝子突然変異によって引き起こされるにもかかわらず、孤発性ＡＬＳと間違われることが多い。
【0102】
非常にまれに、ＡＬＳはＸ連鎖性の優性パターンで遺伝する。Ｘ連鎖性の状態は、その状態と関連する遺伝子が２つの性染色体のうちの１つであるＸ染色体上に位置する場合に生じる。女性（２つのＸ染色体を有する）では、各細胞中の２コピーの遺伝子のうちの１つにおける突然変異が、障害を引き起こすのに十分である。男性（１つのＸ染色体しか有さない）では、各細胞中の遺伝子のたった１つのコピーの突然変異が障害を引き起こす。大抵の場合、男性は、女性と比較して、該疾患を早期に発生し、余命が短い傾向がある。Ｘ連鎖遺伝の特徴は、父親が、Ｘ連鎖形質を息子に伝えることがないことである。
【0103】
ＡＬＳの症例の約９０パーセント～９５パーセントは孤発性であり、これは、これらが遺伝性でないことを意味する。
【0104】
孤発性ＡＬＳと家族性ＡＬＳの両方で、患者は、ＶＣＰ遺伝子中に１つ以上の病因性遺伝子突然変異を有している可能性がある。ＶＣＰ遺伝子中のいくつかの病因性突然変異は従来技術で十分に特徴づけられており、当業者は、病因性突然変異を保有する患者を同定するために使用することができる適切な遺伝子パネルを知っている。表２は、ＶＣＰ遺伝子中のいくつかの既知の病因性突然変異の非網羅的リストを示す。
【0105】
【0106】
診断方法
対象がＶＣＰ遺伝子中に任意の病因性突然変異を有するかどうかを確かめるために、本発明は、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると対象を診断する方法も包含する。したがって、本発明の実施形態は、対象がＶＣＰ遺伝子中に任意の病因性突然変異を有するかどうかを決定することを含むことができる。対象由来の生体試料中のＶＣＰ遺伝子の配列を確かめるためのいくつかの適切な方法が、当業者に既知であろう。いくつかの実施形態において、対象がＶＣＰ遺伝子中に任意の病因性突然変異を有するかどうかを決定することが、ＶＣＰ遺伝子の配列を確かめる工程を含み、ここで、ＶＣＰ遺伝子の配列は、以下の技法のいずれか１つ以上を使用して確かめられる：ＤＮＡシークエンシング、ＲＮＡシークエンシング、マイクロアレイ解析、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び／又は結合分子の検出及び定量化。好ましい実施形態において、対象がＶＣＰ遺伝子中に任意の病因性突然変異を有するかどうかを確かめることは、ＤＮＡシークエンシングの使用を含む。対象に治療を提供する又は対象に治療を推奨する決定は、ＶＣＰ遺伝子における１つ以上の病因性突然変異の存在の決定に基づいて行うことができる。治療を提供するための推奨は、報告書の形で提供してもよい。したがって、本発明の実施形態は、報告書を提供する工程を含んでもよく、ここで、報告書は、ＶＣＰ遺伝子における１つ以上の病因性突然変異の対象における有無に関する情報を含む。報告書は、例えば、ＶＣＰ遺伝子における１つ以上の病因性突然変異の存在に基づいて、対象へ治療（例えば、ＶＣＰ阻害剤）を提供するための推奨、又は例えば、ＶＣＰ遺伝子における１つ以上の病因性突然変異がないことに基づいて、対象に治療（例えば、ＶＣＰ阻害剤）を提供しないための推奨を付加的に又は代替的に含んでいてもよい。
対象がＶＣＰ遺伝子中に任意の病因性突然変異を有するかどうかを確かめるために、本発明は、非ＶＣＰ関連ＡＬＳを有すると対象を診断する方法も包含する。したがって、本発明の実施形態は、対象がＶＣＰ遺伝子中に任意の病因性突然変異を有するかどうかを決定することを含むことができる。対象由来の生体試料中のＶＣＰ遺伝子の配列を確かめるためのいくつかの適切な方法が、当業者に既知であろう。いくつかの実施形態において、対象がＶＣＰ遺伝子中に任意の病因性突然変異を有するかどうかを決定することが、ＶＣＰ遺伝子の配列を確かめる工程を含み、ここで、ＶＣＰ遺伝子の配列は、以下の技法のいずれか１つ以上を使用して確かめられる：ＤＮＡシークエンシング、ＲＮＡシークエンシング、マイクロアレイ解析、リアルタイム定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び／又は結合分子の検出及び定量化。好ましい実施形態において、対象がＶＣＰ遺伝子中に任意の病因性突然変異を有するかどうかを確かめることは、ＤＮＡシークエンシングの使用を含む。対象に治療を提供する又は対象に治療を推奨する決定は、ＶＣＰ遺伝子における１つ以上の病因性突然変異の存在の決定に基づいて行うことができる。治療を提供するための推奨は、報告書の形で提供してもよい。したがって、本発明の実施形態は、報告書を提供する工程を含んでもよく、ここで、報告書は、ＶＣＰ遺伝子における１つ以上の病因性突然変異の対象における有無に関する情報を含む。報告書は、例えば、ＶＣＰ遺伝子における１つ以上の病因性突然変異の存在に基づいて、対象へ治療（例えば、ＶＣＰ阻害剤）を提供するための推奨、又は例えば、ＶＣＰ遺伝子における１つ以上の病因性突然変異がないことに基づいて、対象に治療（例えば、ＶＣＰ阻害剤）を提供しないための推奨を付加的に又は代替的に含んでいてもよい。
【0107】
対象が１つ以上の病因性突然変異を有するかどうかを決定する工程は、対象由来の試料に関して行うことができる。方法は、対象から該試料を得る工程を含んでいてもよく、又は試料は、より早期の時点で対象から得ていてもよい。試料としては、例えば、血漿又は血液試料を挙げることができる。
【0108】
本発明の薬剤によるＡＬＳの治療
いくつかの実施形態において、対象、例えば、ＡＬＳを患っているか又はＡＬＳに罹りやすい対象の中枢神経系に薬剤が与えられる。いくつかの実施形態において、脳、脊髄及び／又は末梢器官の標的細胞又は組織の１つ以上に薬剤が与えられる。いくつかの実施形態において、標的細胞又は組織としては、疾患と関連する病態、症状又は特色を呈する細胞又は組織が挙げられる。いくつかの実施形態において、標的細胞又は組織としては、ＴＤＰ－４３又はＦＵＳ／ＴＬＳが上昇したレベルで発現している細胞又は組織、例えば、ＴＤＰ－４３又はＦＵＳ／ＴＬＳが細胞の細胞質で上昇したレベルで発現している細胞が挙げられる。本明細書において使用する場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織及び／又は末梢標的組織であってもよい。
いくつかの実施形態において、対象、例えば、ＡＬＳを患っているか又はＡＬＳに罹りやすい対象の中枢神経系に薬剤が与えられる。いくつかの実施形態において、脳、脊髄及び／又は末梢器官の標的細胞又は組織の１つ以上に薬剤が与えられる。いくつかの実施形態において、標的細胞又は組織としては、疾患と関連する病態、症状又は特色を呈する細胞又は組織が挙げられる。いくつかの実施形態において、標的細胞又は組織としては、ＴＤＰ－４３又はＦＵＳ／ＴＬＳが上昇したレベルで発現している細胞又は組織、例えば、ＴＤＰ－４３又はＦＵＳ／ＴＬＳが細胞の細胞質で上昇したレベルで発現している細胞が挙げられる。本明細書において使用する場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織及び／又は末梢標的組織であってもよい。
【0109】
本明細書に記載の組成物は、ＡＬＳを患っているか又はＡＬＳを発生する危険性がある対象のＣＮＳ中に直接与えることができ、それによってＣＮＳ（例えば、脳）の罹患した細胞及び組織内で治療的濃度を達成する。例えば、ＡＬＳを治療するために、１つ以上の薬剤を脳、脊髄及び／又は末梢器官の標的細胞又は組織に与えることができる。本明細書において使用する場合、用語「治療する」又は「治療」は、疾患と関連する１つ以上の症状の改善、ＡＬＳの１つ以上の症状の発症の予防又は遅延を指す。
【0110】
いくつかの実施形態において、治療は、ＡＬＳを患っているか又はＡＬＳに罹りやすい患者における神経学的機能障害の部分的又は完全な軽減、改善、除去、阻害、発症の遅延、重症度及び／又は発生率の低減を指す。本明細書において使用する場合、用語「神経学的機能障害」は、中枢神経系｛例えば、脳及び脊髄）の機能障害と関連する様々な症状を含む。神経学的機能障害の症状は、中でも、例えば、発達遅延、進行性認知機能障害、聴力損失、言語発達障害、運動技能の欠如、活動亢進、攻撃性及び／又は睡眠障害を含み得る。
【0111】
いくつかの実施形態において、治療は、様々な細胞又は組織の毒性の低下を指す。いくつかの実施形態において、治療は、脳標的組織、脊髄ニューロン及び／又は末梢標的組織におけるＦＵＳ又はＴＤＰ－４３によるニューロン毒性の低下を指す。或る特定の実施形態において、毒性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上低下する。いくつかの実施形態において、毒性は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍低下する。いくつかの実施形態において、毒性は、限定されないが、神経画像処理方法（例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、機能的ＭＲＩ等）を含めて、当業者に既知の試験によって測定される。
【0112】
或る特定の実施形態において、本開示による治療は、ＡＬＳと関連する１つ以上の病理学的、臨床的若しくは生物学的マーカーの低減（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又はそれ以上の低減）若しくは該マーカーの存在の完全な排除、又は代替的に該マーカーの蓄積をもたらす。例えば、いくつかの実施形態において、対象への投与の際に、本明細書に記載の医薬組成物は、筋喪失、筋攣縮、筋衰弱、痙縮、異常な腱反射、バビンスキー徴候、呼吸困難、顔面脱力、不明瞭発語、知覚の喪失、推理力の喪失、判断力の喪失及び／又は想像力の喪失の低減を示すか又は達成する。
【0113】
いくつかの実施形態において、治療は、生存（例えば、生存期間）の増加を指す。例えば、治療は、患者の余命の増加をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、治療は、治療をしていない、ＡＬＳを有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％、約２００％又はそれ以上を超える患者の余命の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、治療は、治療をしていない、ＡＬＳを有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約６か月、約７か月、約８か月、約９か月、約１０か月、約１１か月、約１２か月、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年又はそれ以上を超える患者の余命の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、治療は患者の長期生存をもたらす。本明細書において使用する場合、用語「長期生存」は、約４０年、４５年、５０年、５５年、６０年又はそれ以上より長い生存期間又は余命を指す。
【0114】
本明細書において使用する場合、用語「向上させる」、「増加させる」又は「低減させる」は、対照と比較した値を示す。いくつかの実施形態において、適切な対照は、ベースライン測定値、例えば、本明細書に記載の治療の開始より前の同じ個体の測定値、又は本明細書に記載の治療がない場合の１対照個体（又は複数の対照個体）の測定値である。「対照個体」は、ＡＬＳに罹患しており、（治療される個体と対照個体（複数の場合もある）における疾患のステージが比較可能であることを確実にするために）治療される個体と略同じ年齢及び／又は性別である個体である。
【0115】
いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、細胞質内のタンパク質恒常性のＶＣＰ依存的エンドサイトーシス機構の喪失と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、ＲＢＰ（例えば、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及び／又はＳＦＰＱ）の誤局在と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及び／又はＳＦＰＱの１つ以上の核対細胞質の比の低減と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、ＴＤＰ－４３の核対細胞質の比の低減と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、ＦＵＳの核対細胞質の比の低減と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、ＳＦＰＱの核対細胞質の比の低減と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、ＶＣＰの上述の正常な機能の１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上）と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、ＶＣＰタンパク質中の１つ以上の点変異と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、Ｒ９５、Ｉ１１４、Ｉ１５１、Ｒ１５５、Ｇ１５６、Ｍ１５８、Ｒ１５９、Ｒ１９１、Ｎ３８７、Ｎ４０１、Ｒ４８７、Ｄ５９２、Ｒ６６２及びＮ７５０からなるリストから選択される１つ以上の位置の突然変異と関連する。いくつかの実施形態において、病因性遺伝子突然変異は、Ｒ９５Ｃ、Ｒ９５Ｇ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１５１Ｖ、Ｒ１５５Ｈ、Ｒ１５５Ｃ、Ｇ１５６Ｃ、Ｍ１５８Ｖ、Ｒ１５９Ｇ、Ｒ１５９Ｃ、Ｒ１５９Ｈ、Ｒ１９１Ｇ、Ｒ１９１Ｑ、Ｎ３８７Ｔ、Ｎ４０１Ｓ、Ｒ４８７Ｈ、Ｄ５９２Ｎ、Ｒ６６２Ｃ及びＮ７５０Ｓからなるリストから選択される１つ以上の突然変異と関連する。
【0116】
用語「と関連する」は、２つの項目又は事象の間の観察された相関を説明するために本明細書において使用される。例えば、ＶＣＰ中の病因性遺伝子突然変異は、その存在又はレベルが特定の神経学的機能不全又は障害の存在又はレベルと相関する場合、その機能不全又は障害「と関連する」とみなすことができる。
【0117】
治療される個体（「患者」又は「対象」とも呼ばれる）は、ＡＬＳを有するか又はＡＬＳを発生する可能性を有する個体（胎児、乳児、小児、青年又は成人）である。いくつかの例では、治療される対象は、遺伝的にＡＬＳを発生する素因がある。例えば、治療される対象は、ＶＣＰ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子、ＡＬＳ２遺伝子、ＶＡＰＢ遺伝子、ＳＥＴＸ遺伝子、ＴＤＰ－４３遺伝子、ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子及び／又はＯＰＴＮ遺伝子中に突然変異を有し得る。いくつかの実施形態において、患者は、ＡＬＳを発生する遺伝的素因がない。いくつかの実施形態において、治療される対象は、ＶＣＰ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子、ＡＬＳ２遺伝子、ＶＡＰＢ遺伝子、ＳＥＴＸ遺伝子、ＴＤＰ－４３遺伝子、ＦＵＳ／ＴＬＳ遺伝子及び／又はＯＰＴＮ遺伝子中に既知の病因性突然変異を有していなくてもよい。好ましい実施形態において、治療される対象は、ＶＣＰ遺伝子中に既知の病因性突然変異を有していなくてもよい。
【0118】
併用療法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬剤（例えば、ＶＣＰ阻害剤）は、ＡＬＳ又はＡＬＳの１つ以上の症状を治療するための１つ以上の更なる療法と組み合わせて対象に投与される。例えば、薬剤は、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、トリヘキシフェニジル又はアミトリプチリンと組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬剤（例えば、ＶＣＰ阻害剤）は、ＡＬＳ又はＡＬＳの１つ以上の症状を治療するための１つ以上の更なる療法と組み合わせて対象に投与される。例えば、薬剤は、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、トリヘキシフェニジル又はアミトリプチリンと組み合わせて投与することができる。
【0119】
いくつかの実施形態において、第１の薬剤（例えば、ＶＣＰ阻害剤）と第２の薬剤の併用投与は、第１の薬剤又は第２の薬剤のいずれか単独によってもたらされるものを越える程度まで、ＡＬＳ又はその症状の好転をもたらす。併用効果と各薬剤単独の効果の差は、統計的に有意な差であり得る。
【0120】
いくつかの実施形態において、第１の薬剤と第２の薬剤の併用投与によって、第２の薬剤について承認されている標準的投与レジメンと比較して、低減した用量での、低減した用量数での、及び／又は低減した投薬頻度での第２の薬剤の投与が可能になる。
【0121】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬剤と組み合わせて、当業者に既知の免疫抑制剤を対象に投与することができる。例示的免疫抑制剤としては、限定はされないが、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、抗ＴＮＦ剤（例えば、エタネルセプト）、ダクリズマブ（例えば、ゼナパックス（商標））、抗ＣＤ２剤、抗ＣＤ４剤及び抗ＣＤ４０剤が挙げられる。
【0122】
投与経路
薬剤又は医薬組成物は、経口的、非経口的、舌下的、経皮的、直腸的、経粘膜的、局所的、経吸入、経バッカル投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、及び／又は関節内又はこれらの組み合わせを含めた様々な経路によって、投与することができる。いくつかの実施形態において、薬剤又は医薬組成物は経口的に投与される。
薬剤又は医薬組成物は、経口的、非経口的、舌下的、経皮的、直腸的、経粘膜的、局所的、経吸入、経バッカル投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、及び／又は関節内又はこれらの組み合わせを含めた様々な経路によって、投与することができる。いくつかの実施形態において、薬剤又は医薬組成物は経口的に投与される。
【0123】
本発明を以下の実施例で更に例示する。これらの実施例は、本発明の実施形態を示すが、例示のためのみに与えられることを理解されたい。上記の議論及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の必須の特徴を確認することができ、様々な使用法及び条件に適合させるために、それらの趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることも意図される。さらに、本発明の各態様の特色は、必要な変更を加えて、他の態様のそれぞれに関するものとなる。例えば、本発明による使用のためのＶＣＰ阻害剤の文脈で提供される、ＶＣＰ阻害剤のタイプ、病因性突然変異、ＡＬＳのタイプ等に関する実施形態は、本発明の診断方法、組成物及びキットに等しく適用される。
【実施例】
【0124】
実施例１－材料及び方法
ヒト線維芽細胞及びｉＰＳＣ。ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地中で真皮線維芽細胞を培養した。ｉＰＳＣの生成のために、エピソームプラスミド、ｐＣＸＬＥ ｈＯｃｔ４ ｓｈｐ５３、ｐＣＸＬＥ ｈＳＫ及びｐＣＸＬＥ ｈＵＬ（Addgene）［２６］を真皮線維芽細胞にトランスフェクトした。使用した３つの対照株は商業的に入手可能であり（対照２、対照３及び対照５）、Coriell（カタログ番号ＮＤ４１８６６＊Ｃ）、ThermoFisher Scientific（カタログ番号Ａ１８９４５）及びCedars-Sinai（ＣＳ０２ｉＣＴＲ－ＮＴｎ４）から購入した。使用したＴＡＲＤＢＰ突然変異体株（ＭＵＴ５及びＭＵＴ６）は市販されており、NINDS（ＮＤ５０００７）及びCedars-Sinai（ＣＳ４７ｉ）から購入した。本研究で使用したｉＰＳＣ株の詳細は、図９に見ることができる。
ヒト線維芽細胞及びｉＰＳＣ。ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地中で真皮線維芽細胞を培養した。ｉＰＳＣの生成のために、エピソームプラスミド、ｐＣＸＬＥ ｈＯｃｔ４ ｓｈｐ５３、ｐＣＸＬＥ ｈＳＫ及びｐＣＸＬＥ ｈＵＬ（Addgene）［２６］を真皮線維芽細胞にトランスフェクトした。使用した３つの対照株は商業的に入手可能であり（対照２、対照３及び対照５）、Coriell（カタログ番号ＮＤ４１８６６＊Ｃ）、ThermoFisher Scientific（カタログ番号Ａ１８９４５）及びCedars-Sinai（ＣＳ０２ｉＣＴＲ－ＮＴｎ４）から購入した。使用したＴＡＲＤＢＰ突然変異体株（ＭＵＴ５及びＭＵＴ６）は市販されており、NINDS（ＮＤ５０００７）及びCedars-Sinai（ＣＳ４７ｉ）から購入した。本研究で使用したｉＰＳＣ株の詳細は、図９に見ることができる。
【0125】
細胞培養及び運動ニューロンの分化。ｉＰＳＣは、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Life Technologies）上でＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Life Technologies）を用いて維持し、ＥＤＴＡ（Life Technologies、０．５ｍＭ）を使用して継代した。３７℃及び５％二酸化炭素でｉＰＳＣ培養を維持した。Hall et al, 2017［１２］に記載されているように、ｉＰＳＣを脊髄運動ニューロンへ分化させた。
【0126】
ｉＰＳＣを１００％培養密度までプレーティングし、次いで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｌ－グルタミン、Ｎ２サプリメント、非必須アミノ酸、Ｂ２７サプリメント、β－メルカプトエタノール（すべてLife Technologiesから）及びインスリン（Sigma）からなる培地中で神経上皮に分化させた。小分子、すなわち、０日目～７日目：１μＭドルソモルフィン（Millipore）、２μＭ ＳＢ４３１５４２（Tocris Bioscience）及び３．３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Miltenyi Biotec）、７日目～１４日目：０．５μＭレチノイン酸（Sigma）及び１μＭパルモルファミン（Sigma）、１４日目～１８日目：０．１μＭパルモルファミンで細胞を連続的に処理した。１８日間の神経変換及びパターニングに続いて、０．１μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｅ（Enzo Life Sciences）中で神経前駆体に最終分化させた。
【0127】
ディスパーゼ（ＧＩＢＣＯ、１ｍｇ／ｍｌ）を使用して、全体にわたって神経上皮層を酵素的に解離した。アキュターゼ（Life Technologies）で神経前駆体を解離して、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（０．１Ｍのホウ酸ナトリウム中に２．２ｍｇ／ｍｌ（Sigma））及びＧｅｌｔｒｅｘでコーティングした９６ウェルプレート（Falcon）上に最終的にプレーティングした。６日間の最終分化に続いて、免疫標識のために、４％パラホルムアルデヒド中に細胞を固定した。
【0128】
阻害剤処理。運動ニューロン培養物を１μＭのＭＬ２４０（Sigma；ＳＭＬ１０７１；ＣＡＳ：１３４６５２７－９８－７）で２時間、５μＭのＤＢｅＱで３時間、又は１μＭのＣＢ－５０８３で３時間処理した。
【0129】
免疫蛍光染色。ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中に室温（ＲＴ）で１５分間細胞を固定した。透過処理及び非特異的抗体のブロッキングのために、ＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma）を含む０．３％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを６０分間加えた。５％ＢＳＡ中で一次抗体を調製し、次いで、これを４℃で一晩加えた。使用した一次抗体は、ＳＭＩ－３２（BioLegend；８０１７０１；マウス；１：１０００）、ＣｈＡＴ（Millipore；ＡＢ１４４Ｐ；ヤギ；１：１００）、βＩＩＩ－チューブリン（abcam；ａｂ４１４８９；ニワトリ；１：１０００）、ＴＤＰ－４３（ProteinTech；１２８９２－１－ＡＰ；ウサギ；１：４００）、ＳＦＰＱ（abcam；ａｂ１１８２５；マウス；１：４００）、ＦＵＳ（Santa Cruz；ｓｃ－４７７１１；マウス；１：２００）、ｈｎＲＮＰＡ１（Cell Signaling；８４４３Ｓ；ウサギ；１：５００）、ｈｎＲＮＰＫ（Santa Cruz；ｓｃ－２８３８０；マウス；１：５００）であった。５％ＢＳＡ中に１：１０００希釈した種特異的Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート化二次抗体（Life Technologies）を暗所においてＲＴで９０分間加えた。ＤＡＰＩ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール核染色剤（１：１０００）を含むＰＢＳ中で細胞を１０分間１回洗浄した。
【0130】
画像取得及び解析。Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔスクリーニングシステム（Perkin Elmer）を使用して、画像を取得した。４０×対物レンズを用いて、１μｍのｚステップの共焦点ｚスタックとして画像を取得した。最大値投影を得るようにスタックを処理した。各ウェルに対して最低でも１２視野を撮った。単一細胞におけるＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の核：細胞質の比を計算するために、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ画像解析システム（Perkin Elmer）を使用して画像を解析した。ＤＡＰＩマスクが核を画定し、核の性状に基づいて、訓練された機械学習機能が自動的にニューロンを選択した。個々の細胞のそれぞれについて、目的のＲＢＰの平均核強度を測定した。細胞質の測定については、細胞質マスク内の核の周囲に１．５μｍの細胞質領域を画定し、平均強度を測定した。この解析によって画定された、この核コンパートメント及び細胞質コンパートメントの例は、図５のＡに見ることができる。核：細胞質の平均強度測定値の比を細胞ごとに計算した。各視野の平均を計算し、次いで、ウェル全体で平均化した。
【0131】
核：神経突起の比について、Ｉｌａｓｔｉｋ［２７］、Ｃｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒ［２８］及びＩｍａｇｅＪを組み合わせた半自動化画像解析パイプラインを実行した。核の検出の向上を可能するためにＩｍａｇｅＪにおいて強度が０～５００にスケーリングされたＤＡＰＩ染色画像を使用して、核のセグメント化を行った。バイナリー核セグメント化マスクの生成のために、無作為に選択した画像のサブセットをＩｌａｓｔｉｋで使用した。神経突起コンパートメントを画定するために、βＩＩＩ－チューブリンが信頼できる軸索及び樹状突起のマーカーであるので、βＩＩＩ－チューブリンを使用してニューロンマスクを作出した。βＩＩＩ－チューブリンマスクから核及び細胞質を除去するために、核を３０ピクセル拡大し、除去し、これによって、神経突起のみが解析に含まれることが確実になった。この解析によって画定されたコンパートメントの例は、図５のＢに見ることができる。目的のタンパク質の強度測定は、核及び神経突起マスクを使用してＣｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒで行った。強度の値及び比の計算は、カスタムＲスクリプトを使用して行った。
【0132】
核：細胞質又は核：神経突起の比を調べるときに、比の増加又は減少が検出された場合、どの細胞内コンパートメントがその変化に寄与しているかは明らかでない。核：神経突起の比についてこれに対処するために、本発明者らはコンパートメント特異的マーカーの存在を利用した。上記のように、核：神経突起の比について同じ半自動化画像解析パイプラインを実行したが、目的のタンパク質に加えて、ＤＡＰＩ及びβＩＩＩ－チューブリンについて強度測定を行い、これを特定の比を計算するために使用した。
【0133】
ウエスタンブロット解析。ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱのタンパク質レベルを対照及びＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて細胞全体で評価した。タンパク質抽出より前に、細胞を未処理条件又は１μＭのＭＬ２４０の処理に２時間供した。細胞を溶解し、ＲＩＰＡによる破壊によってタンパク質を抽出した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Sigma）を使用して、全タンパク質濃度を定量化した。次いで、等量のタンパク質試料をゲルにロードし、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーした。次いで、試料をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、５％乾燥粉乳を用いてＲＴで１時間ブロッキングし、続いて、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。以下の抗体をＰＢＳ ５％ＢＳＡ中に希釈した：ＴＤＰ－４３（ProteinTech；１２８９２－１－ＡＰ；ウサギ；１：１０００）、ＳＦＰＱ（Abcam；１１８２５；マウス；１：２５０）、ＦＵＳ（Santa Cruz；ｓｃ－４７７１１；マウス；１：５００）、ＧＡＰＤＨ（GeneTex；ＧＴ２３９；マウス；１：１００００）。検出のために、種特異的近赤外蛍光抗体（ＩＲＤｙｅ、Licor）とともに膜をＲＴで１時間インキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃイメージングシステム（Licor）を使用して、イメージングした。
【0134】
統計解析。３つの対照及び４つのＶＣＰ突然変異体ｉＰＳＣ株があり、詳細は図９で見られる。各実験で使用した細胞の数を図の説明文に記載する。少なくとも、各株について、３回の独立の実験反復にわたって６ウェルからの３４視野からデータを収集する。バイオリンプロットとしてデータをプロットし、視野ごと又はウェルごととしてデータをプロットした。データが未処理の対照に対して正規化されたものとして示される場合、生の各値を各実験反復内の未処理の対照の平均で割った。ガウス分布をともなう２つの個々の群を比較する場合、対応のないスチューデントの両側ｔ検定を使用した。ガウス分布が達成されなかった場合、マン・ホイットニー検定を使用した。Ｐｒｉｓｍ８によって統計解析を行った。０．０５以下のｐ値を統計学的に有意であるとみなした（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0135】
実施例２－ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３、ＳＦＰＱ及びＦＵＳは神経突起に誤局在される
本発明者らは、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、ＳＭＩ－３２及びβＩＩＩ－チューブリン（ＴＵＪ１）に陽性である、非常に豊富な、特徴づけされた脊髄運動ニューロン（ＭＮ）へのヒトｉＰＳＣの本発明者らの確立された確実な分化を利用した（図６）。
本発明者らは、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、ＳＭＩ－３２及びβＩＩＩ－チューブリン（ＴＵＪ１）に陽性である、非常に豊富な、特徴づけされた脊髄運動ニューロン（ＭＮ）へのヒトｉＰＳＣの本発明者らの確立された確実な分化を利用した（図６）。
【0136】
重要なことに、本発明者らは、ｉ）生理的なカルシウム刺激（グルタミン酸及びＫＣｌ）に対するサイトゾルのカルシウム応答を実証すること、ｉｉ）ホールセルパッチクランプ法、ｉｉｉ）多電極アレイ（ＭＥＡ）解析［１２］神経筋接合部形成の実証をともなうｉＰＳＣ由来骨格筋との共培養［１３］によって、本発明者らの豊富なＭＮ培養物を以前に機能的に検証している。このモデルを使用して、本発明者らは、ＡＬＳの新しい特徴、例えば、突然変異体神経前駆体におけるＳＦＰＱ及びＦＵＳの核対細胞質の比の低減を含めて、ＶＣＰ関連ＡＬＳの時間分解病理表現型（time-resolved pathogenic phenotypes）を以前に報告している［２、３、１２］。さらに、本発明者らは、最終分化した運動ニューロンにおいて細胞内のＴＤＰ－４３及びＦＵＳの誤局在表現型を確認している［１２、２９、３０］。
【0137】
しかし、本発明者らの先行研究及び他の者の先行研究の大部分は、これらの前述のＲＢＰを一緒に系統的に調べておらず、神経突起内のその存在に関して、これらのＲＢＰの誤局在の特定の部位にも対処していない。この背景の下、本発明者らは、本発明者らのＶＣＰ突然変異体ｉＰＳＣ由来運動ニューロンを利用して、５つのＡＬＳ関連ＲＢＰの細胞内局在を包括的に調査した。７００００ニューロンを超える核対細胞質の比の単一細胞解析によって、ＶＣＰ突然変異体ヒト運動ニューロンにおいてＴＤＰ－４３及びＳＦＰＱの減少が明らかになり（図１のＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）、これは、ＦＵＳの核対細胞質の比の低減に関する本発明者らの最近の報告［２９］に基づくものである。
【0138】
更なる解析に基づいて、ＴＤＰ－４３及びＳＦＰＱは核対神経突起の比の低減が更にあり、それにより、やはりＶＣＰ突然変異体運動ニューロンの神経突起内に異常に局在していることを本発明者らは検出した（図１のＣ、Ｆ）。コンパートメント特異的マーカー（核：ＤＡＰＩ、神経突起：βＩＩＩ－チューブリン）の存在によって、次いで、核コンパートメント及び神経突起コンパートメントを独立に調べることが可能になり、これらのＲＢＰの核対神経突起の比の低減は、それらの核での低下と神経突起での増加の両方によって引き起こされることが明らかになった（図７のＡ～Ｄ）。
【0139】
ｉＰＳＣモデルにおいてＲＢＰが一般的に誤局在されるという可能性を除外するために、本発明者らは次に、以前にＡＬＳに関係があるとされた［３１、３２］ｈｎＲＮＰＡ１及びｈｎＲＮＰＫの細胞内局在を調べた。しかし、ｈｎＲＮＰＡ１及びｈｎＲＮＰＫは、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて、それらの核から細胞質への局在の検出可能な変化を示さず、これは、ｉＰＳＣ由来のＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱの選択的誤局在と一致している（図１のＧ～Ｊ）。
【0140】
実施例３－健常なヒト運動ニューロンにおいて、ＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインの薬理学的阻害はＡＬＳ表現型を誘導しない
ＶＣＰ疾患突然変異がドミナントアクティブ効果を発揮するか又はドミナントネガティブ効果を発揮するかどうかは、本分野において議論の余地が残されている。ヒト運動ニューロンにおけるＶＣＰ突然変異の効果への機構的洞察を得るために、本発明者らは、ＶＣＰタンパク質のＤ２ ＡＴＰアーゼドメインの強力かつ選択的な阻害剤であるＭＬ２４０を利用した［３３］。
ＶＣＰ疾患突然変異がドミナントアクティブ効果を発揮するか又はドミナントネガティブ効果を発揮するかどうかは、本分野において議論の余地が残されている。ヒト運動ニューロンにおけるＶＣＰ突然変異の効果への機構的洞察を得るために、本発明者らは、ＶＣＰタンパク質のＤ２ ＡＴＰアーゼドメインの強力かつ選択的な阻害剤であるＭＬ２４０を利用した［３３］。
【0141】
対照運動ニューロンを１μＭのＭＬ２４０で２時間処理してから、固定及び免疫細胞化学試験を行った。興味深いことに、Ｄ２ ＡＴＰアーゼの阻害はＴＤＰ－４３の核対細胞質の比を増加させた（図２のＡ、Ｂ）。しかし、そのような増加は、ＴＤＰ－４３の核対神経突起の比では観察されず、これは、おそらく、この状況において、タンパク質分布における近位＞遠位の変化を示唆するものである（図２のＣ）。
【0142】
興味深いことに、ＦＵＳの核対細胞質の比は変化しないが、小さいが統計学的に有意なＦＵＳの核対神経突起の比の増加が観察されることを本発明者らは見出した（図２のＤ～Ｆ）。これは、Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインが細胞コンパートメント特異的な方式でＲＢＰ特異的な役割を有する可能性があることを示唆する。更なる前述のＲＢＰ；ＳＦＰＱ、ｈｎＲＮＰＡ１及びｈｎＲＮＰＫの解析によって、ＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼ阻害の際に、これらの核対細胞質の比又は核対神経突起の比（ＳＦＰＱ）に変化がないことが明らかになった（図２のＧ～Ｉ）。まとめると、これらのデータは、観察されるＲＢＰ誤局在表現型に対する機構としてのＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインの機能欠損と相反するものである。
【0143】
実施例４－ヒト運動ニューロンにおいて、Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインの薬理学的阻害は、ＶＣＰ突然変異に関連したＴＤＰ－４３及びＦＵＳの誤局在を反転させる
対照の運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３に対するＭＬ２４０の明らかな効果に注目して、本発明者らは、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンへのその適用が、そのＲＢＰ誤局在表現型を改善することができると推論した。特に、本発明者らは、ＡＬＳ ＶＣＰを引き起こす突然変異（ＶＣＰ Ｒ１５５Ｃ及びＶＣＰ Ｒ１９１Ｑ）がＤ２ ＡＴＰアーゼドメインのドミナントアクティブ効果をもたらすと仮定した。
対照の運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３に対するＭＬ２４０の明らかな効果に注目して、本発明者らは、ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンへのその適用が、そのＲＢＰ誤局在表現型を改善することができると推論した。特に、本発明者らは、ＡＬＳ ＶＣＰを引き起こす突然変異（ＶＣＰ Ｒ１５５Ｃ及びＶＣＰ Ｒ１９１Ｑ）がＤ２ ＡＴＰアーゼドメインのドミナントアクティブ効果をもたらすと仮定した。
【0144】
ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおけるＭＬ２４０の適用は、核から細胞質への誤局在と核から神経突起への誤局在両方を調べた場合、実際に、ＴＤＰ－４３とＦＵＳの両方の誤局在を確実に反転させた（図３のＡ～Ｆ）。
【0145】
ＳＦＰＱについては、ＭＬ２４０処理は核から神経突起への誤局在も有意に反転させた。しかし、ＭＬ２４０処理は核対細胞質の比（平均；ＵＴ＝０．９０、ＭＬ２４０＝０．９７）を増加させたが、この差は、ＳＦＰＱについて統計的有意性に達しなかった（図３のＧ～Ｉ）。
【0146】
本データは、この反転は、ＭＬ２４０処理の際に全タンパク質レベルが変化しなかったので、神経突起及び／又は細胞質から核へのＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱの再局在によるものであることを更に実証する（図８のＡ、Ｂ）。
【0147】
特に、ｈｎＲＮＰＡ１及びｈｎＲＮＰＫは核対細胞質の比の変化を示さず、ＭＬ２４０処理は、ＶＣＰ突然変異の結果として有意に誤局在されたＲＢＰの局在に影響を及ぼしただけであった（図３のＪ、Ｋ）。
【0148】
本研究では、本発明者らの非常に豊富な、機能的に検証された、ｉＰＳＣ由来の患者特異的運動ニューロンモデル［２、１２、１３］を使用して、ＲＢＰの核細胞質局在に対するＡＬＳを引き起こすＶＣＰ突然変異の効果、及びＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼの阻害剤がこれらのＶＣＰ関連疾患表現型を抑制する能力を系統的に調査した。重要なことに、このモデルは、病態生理学的レベルの突然変異を伝え、かつ人工の過剰発現に依拠しないので、ＡＬＳ運動ニューロンの生理機能に非常に近いものである。
【0149】
本明細書に提示するデータは、ＶＣＰ突然変異（Ｒ１５５Ｃ及びＲ１９１Ｑ）が、最終分化した運動ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱの核対細胞質の比の選択的低減を引き起こす（ここでは、ｈｎＲＮＰＫとｈｎＲＮＰＡ１の両方の正常な核細胞質分布が観察される）ことを実証する最初のものである。本発明者らは、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱが運動ニューロンの神経突起にも誤局在されることを更に示す（図１）。最近の研究によって、軸索のｍＲＮＡ翻訳及び生存率におけるこれらのＲＢＰの新たな役割が示されており、これにより、損なわれた軸索のＲＮＡプロセシングが運動ニューロンにおける特定の病態生理に寄与し得ることが示唆される［３４、３５、３６］。
【0150】
しかし、本発明者らの研究の主な所見は、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及び（部分的に）ＳＰＦＱのＶＣＰ突然変異関連誤局在は、強力かつ選択的な阻害剤ＭＬ２４０を使用した、ＶＣＰタンパク質のＤ２ ＡＴＰアーゼドメインの薬理学的阻害によって、可逆的であるいうことである［１１、３３、３７］。このドミナントアクティブなＶＣＰ突然変異機構は、他の表現型に関しても示された［３８、３９］。しかし、本分野において論議があり、いくつかの研究によって、ＶＣＰ突然変異体がドミナントネガティブとして機能することが示唆されている［４０、４１、４２］。
【0151】
これらの見たところ対照的な研究は、ＡＴＰ加水分解の阻害が、過剰なＡＴＰ加水分解と関連する下流の効果を反転させることができる一方で、ＡＴＰアーゼ活性化に対するドミナントネガティブ効果も高めるという仮説をたてることによって、調和させることができる。さらに、ＶＣＰには幅広い細胞内機能があるので、ＶＣＰ突然変異は、補助因子の結合、それに続く下流の細胞経路に依存して、ドミナントアクティブ効果又はドミナントネガティブ効果の両方をもたらすことができると仮定することができる。
【0152】
どのようにしてＶＣＰがＴＤＰ－４３、ＦＵＳ及びＳＦＰＱと相互作用するかという根底にある分子メカニズムは不明であり、更なる研究よってこれを調査するべきである。現在までに、研究によって、ＴＤＰ－４３［４３］及びＦＵＳ［４４］を含めて、ＶＣＰとＲＢＰの間の直接相互作用が示されているが、これらの相互作用の分子的結果（molecular consequences）の理解は限られている。
【0153】
酵母における最近の研究によって、ＴＤＰ－４３及びＦＵＳのエンドサイトーシス依存的ターンオーバーにおけるＣｄｃ４８／ＶＣＰの役割が示された［４５］。本研究とあわせると、これによって、Ｄ２ ＡＴＰアーゼ活性の増加が細胞質内のタンパク質恒常性のＶＣＰ依存的エンドサイトーシス機構を破壊することができるという可能性が高まる。ＲＢＰとのＶＣＰの相互作用の正確な結果（consequences）の理解は、病態におけるその誤局在を支持する機構を解くのに役立つであろう。
【0154】
ＶＣＰ疾患突然変異体がＤ２ ＡＴＰアーゼ活性の増大を示すという本発明者らの所見は、重要な治療的意味を持つ可能性がある。実際に、ＶＣＰ阻害剤は、ショウジョウバエモデル及び患者の線維芽細胞において複数のＶＣＰ疾患表現型を救済する（rescue）ことが見出されている［３９］。
【0155】
特に、救済は、ミトコンドリア表現型、ｐ６２及びユビキチン病態の改善を含めて、多面的であった。本発明者らの所見において、これは、ＶＣＰ Ｄ２ ＡＴＰアーゼの薬理学的阻害剤が、ＶＣＰ突然変異によって引き起こされる多系統病態の範囲にわたって有効であり得ることを示唆する。これは、ＡＬＳ及びＩＢＭＰＦＤを越えて、ＶＣＰ関連シャルコー・マリー・トゥース病及び遺伝性痙性対麻痺のいくつかの症例に及ぶ［４６、４７］。しかし、研究により、ＶＣＰ阻害剤が、用量依存的に細胞の恒常性の維持を乱し得ることが示されたので、将来の研究において治療的バランスが調査され、最適化されるべきである。しかし、ＶＣＰ阻害剤は癌治療のための第ＩＩ相臨床試験に既にあるので、これらの壊滅的で、今までのところ不治の疾患に対する治療的可能性を認識することは重要である。
【0156】
実施例５－更なるＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰ突然変異体及びＴＡＲＤＢＰ突然変異体ヒト運動ニューロンにおけるＴＤＰ－４３の誤局在を反転させる
運動ニューロンにおけるＶＣＰ阻害の役割への更なる洞察を得るために、運動ニューロンを更なるＶＣＰ阻害剤であるＤＢｅＱ及びＣＢ－５０８３で処理した。ＤＢｅＱは、ＶＣＰのＤ１及びＤ２ ＡＴＰアーゼドメインの両方を標的にする、可逆的なＡＴＰ競合的ＶＣＰ阻害剤である。ＣＢ－５０８３は、Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインを選択的に標的にする、強力で可逆的なＡＴＰ競合的ＶＣＰ阻害剤である。
運動ニューロンにおけるＶＣＰ阻害の役割への更なる洞察を得るために、運動ニューロンを更なるＶＣＰ阻害剤であるＤＢｅＱ及びＣＢ－５０８３で処理した。ＤＢｅＱは、ＶＣＰのＤ１及びＤ２ ＡＴＰアーゼドメインの両方を標的にする、可逆的なＡＴＰ競合的ＶＣＰ阻害剤である。ＣＢ－５０８３は、Ｄ２ ＡＴＰアーゼドメインを選択的に標的にする、強力で可逆的なＡＴＰ競合的ＶＣＰ阻害剤である。
【0157】
対照運動ニューロンを５μＭのＤＢｅＱで３時間又は１μＭのＣＢ－５０８３で３時間処理してから、固定及び免疫細胞化学試験を行った。ＤＢｅＱ及びＣＢ－５０８３のそれぞれによるＶＣＰの阻害は、ＴＤＰ－４３の核対細胞質の比を増加させ（図１１のＡ、Ｂ）、これは、ＭＬ２４０処理の際に観察された所見（実施例３を参照されたい）を支持するものである。
【0158】
ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンにおいて、ＭＬ２４０は、ＴＤＰ－４３の誤局在を確実に反転させることが示された（実施例４を参照されたい）。ＶＣＰ突然変異体運動ニューロンをＤＢｅＱ及びＣＢ－５０８３のそれぞれで処理した。これらの更なるＶＣＰ阻害剤もＴＤＰ－４３の核から細胞質への誤局在を反転させることができた（図１１のＣ、Ｄ）。
【0159】
ＡＬＳの他の遺伝的背景（すなわち、非ＶＣＰ突然変異体）においてＶＣＰ阻害がＴＤＰ－４３の核から細胞質への誤局在を反転させるかどうかを調査するために、ＴＡＲＤＢＰ突然変異体（Ｇ２９８Ｓ）運動ニューロンをＣＢ－５０８３で処理した。ＣＢ－５０８３によるＶＣＰ阻害は、これらの細胞株でＴＤＰ－４３の核対細胞質の比を増加させた（図１１のＥ）。
【0160】
これらのデータは、ＭＬ２４０以外のＶＣＰ阻害剤が、ＶＣＰ突然変異体と非ＶＣＰ突然変異体の両方について、ＡＬＳ突然変異体細胞株でＴＤＰ－４３の誤局在を反転させるのに有効であることを実証する。
【0161】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願のそれぞれが、引用することにより本明細書の一部をなすことが具体的及び個々に示される場合と同じ程度に、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。さらに、本出願における任意の参考文献の引用又は特定は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用される限りにおいて、これらは、必ずしも限定として解釈されるべきではない。
【0162】
参考文献
[1] Neumann M, Sampathu DM, Kwong LK, et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 2006;314(5796):130-133.
[2] Luisier R, Tyzack GE, Hall CE, et al. Intron retention and nuclear loss of SFPQ are molecular hallmarks of ALS. Nat Commun. 2018;9(1):2010.
[3] Tyzack GE, Luisier R, Taha DM, et al. Widespread FUS mislocalization is a molecular hallmark of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 2019;142(9):2572-2580.
[4] Smethurst P, Newcombe J, Troakes C, et al. In vitro prion-like behaviour of TDP-43 in ALS. Neurobiol Dis. 2016;96:236-247.
[5] Smethurst P, Risse E, Tyzack GE, et al. Distinct responses of neurons and astrocytes to TDP-43 proteinopathy in amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 2020;143(2):430-440.
[6] Tollervey JR, Curk T, Rogelj B, et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nat Neurosci. 2011;14(4):452-458.
[7] Meyer H, Bug M, Bremer S. Emerging functions of the VCP/p97 AAA-ATPase in the ubiquitin system. Nat Cell Biol. 2012;14(2):117-123.
[8] Johnson JO, Mandrioli J, Benatar M, et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 2010;68(5):857-864.
[9] Abramzon Y, Johnson JO, Scholz SW, et al. Valosin-containing protein (VCP) mutations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Aging. 2012;33(9):2231.e1-e2231.e6.
[10] Nalbandian A, Donkervoort S, Dec E, et al. The multiple faces of valosin-containing protein-associated diseases: inclusion body myopathy with Paget’s disease of bone, frontotemporal dementia, and amyotrophic lateral sclerosis. J Mol Neurosci. 2011;45(3):522-531.
[11] Niwa H, Ewens CA, Tsang C, Yeung HO, Zhang X, Freemont PS. The role of the N-domain in the ATPase activity of the mammalian AAA ATPase p97/VCP. J Biol Chem. 2012;287(11):8561-8570.
[12] Hall CE, Yao Z, Choi M, et al. Progressive Motor Neuron Pathology and the Role of Astrocytes in a Human Stem Cell Model of VCP-Related ALS. Cell Rep. 2017;19(9):1739-1749.
[13] Maffioletti SM, Sarcar S, Henderson ABH, et al. Three-Dimensional Human iPSC-Derived Artificial Skeletal Muscles Model Muscular Dystrophies and Enable Multilineage Tissue Engineering. Cell Rep. 2018;23(3):899-908.
[14] Bursavich MG, Parker DP, Willardsen JA, et al (2010). 2-Anilino-4aryl-1,3-thiazole inhibitors of valosin-containing protein(VCP or p97). Bioorg Med Chem Lett, 20, 1677-9.
[15] Chou and Deshaies, Quantitative cell-based protein degradation assays to identify and classify drugs that target the ubiquitin-proteasome system, J Biol Chem. 2011 May 13;286(19):16546-54. doi: 10.1074/jbc.M110.215319. Epub 2011 Feb 22.
[16] Chou et al., Reversible inhibitor of p97, DBeQ, impairs both ubiquitin-dependent and autophagic protein clearance pathways, PNAS, March 22, 2011 108 (12) 4834-4839
[17] Magnaghi et al., Abstract 2940: Identification of potent VCP/p97/CDC48 inhibitors with distinct biochemical mechanisms including a reversible, allosteric inhibitor that activates the unfolded protein response, induce autophagy and cancer cell death, Proceedings: AACR 103rd Annual Meeting 2012‐‐ Mar 31‐Apr 4, 2012; Chicago, IL
[18] Wang, Q., Li, L, and Ye, Y. (2008). Inhibition of p97-dependent protein degradation by Eeyarestatin I. J Biol Chem 283, 7445-7454.
[19] Wang, Q., Shinkre, B.A., Lee, J.G., Weniger, M.A., Liu, Y., Chen, W., Wiestner, A., Trenkle, W.C., and Ye, Y. (2010). The ERAD inhibitor Eeyarestatin I is a bifunctional compound with a membrane-binding domain and a p97A CP inhibitory group. PLoS One 5, e15479.
[20] Sasazawa et al., Xanthohumol Impairs Autophagosome Maturation through Direct Inhibition of Valosin-Containing Protein, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 5, 892-900.
[21] Madsen et al., New ATPase regulators--p97 goes to the PUB, Int J Biochem Cell Biol. 2009 Dec;41(12):2380-8. doi: 10.1016/j.biocel.2009.05.017. Epub 2009 Jun 2.
[22] Ritz, D., Vuk, M., Kirchner, P., Bug, M., Schutz, S., Hayer, A., Bremer, S., Lusk, C, Baloh, R.H., Lee, H et al. (2011). Endolysosomal sorting of ubiquitylated caveolin-1 is regulated by VCP and UBXD1 and impaired by VCP disease mutations. Nat Cell Biol 13, 1116-1123.
[23] Yamanaka et al., Recent advances in p97/VCP/Cdc48 cellular functions, (2012) Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1823(1):130-7.
[24] Ingre et al., Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis, Clin Epidemiol. 2015; 7: 181-193. Published online 2015 Feb 12. doi: 10.2147/CLEP.S37505
[25] Byrne S, Bede P, Elamin M, et al. Proposed criteria for familial amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler. 2011;12(3):157-159.
[26] Okita, K., Matsumura, Y., Sato, Y. et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods 8, 409-412 (2011). https://doi.org/10.1038/nmeth.1591
[27] Berg S, Kutra D, Kroeger T, et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 2019;16(12):1226-1232.
[28] Carpenter AE, Jones TR, Lamprecht MR, et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 2006;7(10):R100.
[29] Harley J, Hagemann C, Serio A, Patani R. FUS is lost from nuclei and gained in neurites of motor neurons in a human stem cell model of VCP-related ALS. Brain. 2020;143(12):e103.
[30] Harley J, Patani R. Stress-Specific Spatiotemporal Responses of RNA-Binding Proteins in Human Stem-Cell-Derived Motor Neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(21). doi:10.3390/ijms21218346
[31] Purice MD, Taylor JP. Linking hnRNP Function to ALS and FTD Pathology. Front Neurosci. 2018;12:326.
[32] Moujalled D, Grubman A, Acevedo K, et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Hum Mol Genet. 2017;26(9):1732-1746.
[33] Chou T-F, Li K, Frankowski KJ, Schoenen FJ, Deshaies RJ. Structure-activity relationship study reveals ML240 and ML241 as potent and selective inhibitors of p97 ATPase. ChemMedChem. 2013;8(2):297-312.
[34] Briese M, Saal-Bauernschubert L, Lueningschroer P, et al. Loss of Tdp-43 disrupts the axonal transcriptome of motoneurons accompanied by impaired axonal translation and mitochondria function. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):116.
[35] Cosker KE, Fenstermacher SJ, Pazyra-Murphy MF, Elliott HL, Segal RA. The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability. Nature Neuroscience. 2016;19(5):690-696. doi:10.1038/nn.4280.
[36] Lopez-Erauskin J, Tadokoro T, Baughn MW, et al. ALS/FTD-Linked Mutation in FUS Suppresses Intra-axonal Protein Synthesis and Drives Disease Without Nuclear Loss-of-Function of FUS. Neuron. 2020;106(2):354.
[37] Manno A, Noguchi M, Fukushi J, Motohashi Y, Kakizuka A. Enhanced ATPase activities as a primary defect of mutant valosin-containing proteins that cause inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia. Genes Cells. 2010;15(8):911-922.
[38] Chang Y-C, Hung W-T, Chang Y-C, et al. Pathogenic VCP/TER94 Alleles Are Dominant Actives and Contribute to Neurodegeneration by Altering Cellular ATP Level in a Drosophila IBMPFD Model. PLoS Genetics. 2011;7(2):e1001288. doi:10.1371/journal.pgen.1001288
[39] Zhang T, Mishra P, Hay BA, Chan D, Guo M. Valosin-containing protein (VCP/p97) inhibitors relieve Mitofusin-dependent mitochondrial defects due to VCP disease mutants. Elife. 2017;6. doi:10.7554/eLife.17834
[40] Bartolome F, Wu H-C, Burchell VS, et al. Pathogenic VCP Mutations Induce Mitochondrial Uncoupling and Reduced ATP Levels. Neuron. 2013;78(1):57-64. doi:10.1016/j.neuron.2013.02.028.
[41] Ritz D, Vuk M, Kirchner P, et al. Endolysosomal sorting of ubiquitylated caveolin-1 is regulated by VCP and UBXD1 and impaired by VCP disease mutations. Nat Cell Biol. 2011;13(9):1116-1123.
[42] Rycenga HB, Wolfe KB, Yeh ES, Long DT. Uncoupling of p97 ATPase activity has a dominant negative effect on protein extraction. Sci Rep. 2019;9(1):1-11.
[43] Gitcho MA, Strider J, Carter D, et al. VCP mutations causing frontotemporal lobar degeneration disrupt localization of TDP-43 and induce cell death. J Biol Chem. 2009;284(18):12384-12398.
[44] Wang T, Jiang X, Chen G, Xu J. Interaction of amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal lobar degeneration-associated fused-in-sarcoma with proteins involved in metabolic and protein degradation pathways. Neurobiol Aging. 2015;36(1):527-535.
[45] Liu G, Byrd A, Warner AN, et al. Cdc48/VCP and Endocytosis Regulate TDP-43 and FUS Toxicity and Turnover. Mol Cell Biol. 2020;40(4). doi:10.1128/MCB.00256-19.
[46] Gonzalez MA, Feely SM, Speziani F, et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 2014;137(Pt 11):2897-2902.
[47] de Bot ST, Schelhaas HJ, Kamsteeg E-J, van de Warrenburg BPC. Hereditary spastic paraplegia caused by a mutation in the VCP gene. Brain. 2012;135(Pt 12):e223; author reply e224.
[1] Neumann M, Sampathu DM, Kwong LK, et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 2006;314(5796):130-133.
[2] Luisier R, Tyzack GE, Hall CE, et al. Intron retention and nuclear loss of SFPQ are molecular hallmarks of ALS. Nat Commun. 2018;9(1):2010.
[3] Tyzack GE, Luisier R, Taha DM, et al. Widespread FUS mislocalization is a molecular hallmark of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 2019;142(9):2572-2580.
[4] Smethurst P, Newcombe J, Troakes C, et al. In vitro prion-like behaviour of TDP-43 in ALS. Neurobiol Dis. 2016;96:236-247.
[5] Smethurst P, Risse E, Tyzack GE, et al. Distinct responses of neurons and astrocytes to TDP-43 proteinopathy in amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 2020;143(2):430-440.
[6] Tollervey JR, Curk T, Rogelj B, et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nat Neurosci. 2011;14(4):452-458.
[7] Meyer H, Bug M, Bremer S. Emerging functions of the VCP/p97 AAA-ATPase in the ubiquitin system. Nat Cell Biol. 2012;14(2):117-123.
[8] Johnson JO, Mandrioli J, Benatar M, et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 2010;68(5):857-864.
[9] Abramzon Y, Johnson JO, Scholz SW, et al. Valosin-containing protein (VCP) mutations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Aging. 2012;33(9):2231.e1-e2231.e6.
[10] Nalbandian A, Donkervoort S, Dec E, et al. The multiple faces of valosin-containing protein-associated diseases: inclusion body myopathy with Paget’s disease of bone, frontotemporal dementia, and amyotrophic lateral sclerosis. J Mol Neurosci. 2011;45(3):522-531.
[11] Niwa H, Ewens CA, Tsang C, Yeung HO, Zhang X, Freemont PS. The role of the N-domain in the ATPase activity of the mammalian AAA ATPase p97/VCP. J Biol Chem. 2012;287(11):8561-8570.
[12] Hall CE, Yao Z, Choi M, et al. Progressive Motor Neuron Pathology and the Role of Astrocytes in a Human Stem Cell Model of VCP-Related ALS. Cell Rep. 2017;19(9):1739-1749.
[13] Maffioletti SM, Sarcar S, Henderson ABH, et al. Three-Dimensional Human iPSC-Derived Artificial Skeletal Muscles Model Muscular Dystrophies and Enable Multilineage Tissue Engineering. Cell Rep. 2018;23(3):899-908.
[14] Bursavich MG, Parker DP, Willardsen JA, et al (2010). 2-Anilino-4aryl-1,3-thiazole inhibitors of valosin-containing protein(VCP or p97). Bioorg Med Chem Lett, 20, 1677-9.
[15] Chou and Deshaies, Quantitative cell-based protein degradation assays to identify and classify drugs that target the ubiquitin-proteasome system, J Biol Chem. 2011 May 13;286(19):16546-54. doi: 10.1074/jbc.M110.215319. Epub 2011 Feb 22.
[16] Chou et al., Reversible inhibitor of p97, DBeQ, impairs both ubiquitin-dependent and autophagic protein clearance pathways, PNAS, March 22, 2011 108 (12) 4834-4839
[17] Magnaghi et al., Abstract 2940: Identification of potent VCP/p97/CDC48 inhibitors with distinct biochemical mechanisms including a reversible, allosteric inhibitor that activates the unfolded protein response, induce autophagy and cancer cell death, Proceedings: AACR 103rd Annual Meeting 2012‐‐ Mar 31‐Apr 4, 2012; Chicago, IL
[18] Wang, Q., Li, L, and Ye, Y. (2008). Inhibition of p97-dependent protein degradation by Eeyarestatin I. J Biol Chem 283, 7445-7454.
[19] Wang, Q., Shinkre, B.A., Lee, J.G., Weniger, M.A., Liu, Y., Chen, W., Wiestner, A., Trenkle, W.C., and Ye, Y. (2010). The ERAD inhibitor Eeyarestatin I is a bifunctional compound with a membrane-binding domain and a p97A CP inhibitory group. PLoS One 5, e15479.
[20] Sasazawa et al., Xanthohumol Impairs Autophagosome Maturation through Direct Inhibition of Valosin-Containing Protein, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 5, 892-900.
[21] Madsen et al., New ATPase regulators--p97 goes to the PUB, Int J Biochem Cell Biol. 2009 Dec;41(12):2380-8. doi: 10.1016/j.biocel.2009.05.017. Epub 2009 Jun 2.
[22] Ritz, D., Vuk, M., Kirchner, P., Bug, M., Schutz, S., Hayer, A., Bremer, S., Lusk, C, Baloh, R.H., Lee, H et al. (2011). Endolysosomal sorting of ubiquitylated caveolin-1 is regulated by VCP and UBXD1 and impaired by VCP disease mutations. Nat Cell Biol 13, 1116-1123.
[23] Yamanaka et al., Recent advances in p97/VCP/Cdc48 cellular functions, (2012) Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1823(1):130-7.
[24] Ingre et al., Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis, Clin Epidemiol. 2015; 7: 181-193. Published online 2015 Feb 12. doi: 10.2147/CLEP.S37505
[25] Byrne S, Bede P, Elamin M, et al. Proposed criteria for familial amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler. 2011;12(3):157-159.
[26] Okita, K., Matsumura, Y., Sato, Y. et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods 8, 409-412 (2011). https://doi.org/10.1038/nmeth.1591
[27] Berg S, Kutra D, Kroeger T, et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 2019;16(12):1226-1232.
[28] Carpenter AE, Jones TR, Lamprecht MR, et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 2006;7(10):R100.
[29] Harley J, Hagemann C, Serio A, Patani R. FUS is lost from nuclei and gained in neurites of motor neurons in a human stem cell model of VCP-related ALS. Brain. 2020;143(12):e103.
[30] Harley J, Patani R. Stress-Specific Spatiotemporal Responses of RNA-Binding Proteins in Human Stem-Cell-Derived Motor Neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(21). doi:10.3390/ijms21218346
[31] Purice MD, Taylor JP. Linking hnRNP Function to ALS and FTD Pathology. Front Neurosci. 2018;12:326.
[32] Moujalled D, Grubman A, Acevedo K, et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Hum Mol Genet. 2017;26(9):1732-1746.
[33] Chou T-F, Li K, Frankowski KJ, Schoenen FJ, Deshaies RJ. Structure-activity relationship study reveals ML240 and ML241 as potent and selective inhibitors of p97 ATPase. ChemMedChem. 2013;8(2):297-312.
[34] Briese M, Saal-Bauernschubert L, Lueningschroer P, et al. Loss of Tdp-43 disrupts the axonal transcriptome of motoneurons accompanied by impaired axonal translation and mitochondria function. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):116.
[35] Cosker KE, Fenstermacher SJ, Pazyra-Murphy MF, Elliott HL, Segal RA. The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability. Nature Neuroscience. 2016;19(5):690-696. doi:10.1038/nn.4280.
[36] Lopez-Erauskin J, Tadokoro T, Baughn MW, et al. ALS/FTD-Linked Mutation in FUS Suppresses Intra-axonal Protein Synthesis and Drives Disease Without Nuclear Loss-of-Function of FUS. Neuron. 2020;106(2):354.
[37] Manno A, Noguchi M, Fukushi J, Motohashi Y, Kakizuka A. Enhanced ATPase activities as a primary defect of mutant valosin-containing proteins that cause inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia. Genes Cells. 2010;15(8):911-922.
[38] Chang Y-C, Hung W-T, Chang Y-C, et al. Pathogenic VCP/TER94 Alleles Are Dominant Actives and Contribute to Neurodegeneration by Altering Cellular ATP Level in a Drosophila IBMPFD Model. PLoS Genetics. 2011;7(2):e1001288. doi:10.1371/journal.pgen.1001288
[39] Zhang T, Mishra P, Hay BA, Chan D, Guo M. Valosin-containing protein (VCP/p97) inhibitors relieve Mitofusin-dependent mitochondrial defects due to VCP disease mutants. Elife. 2017;6. doi:10.7554/eLife.17834
[40] Bartolome F, Wu H-C, Burchell VS, et al. Pathogenic VCP Mutations Induce Mitochondrial Uncoupling and Reduced ATP Levels. Neuron. 2013;78(1):57-64. doi:10.1016/j.neuron.2013.02.028.
[41] Ritz D, Vuk M, Kirchner P, et al. Endolysosomal sorting of ubiquitylated caveolin-1 is regulated by VCP and UBXD1 and impaired by VCP disease mutations. Nat Cell Biol. 2011;13(9):1116-1123.
[42] Rycenga HB, Wolfe KB, Yeh ES, Long DT. Uncoupling of p97 ATPase activity has a dominant negative effect on protein extraction. Sci Rep. 2019;9(1):1-11.
[43] Gitcho MA, Strider J, Carter D, et al. VCP mutations causing frontotemporal lobar degeneration disrupt localization of TDP-43 and induce cell death. J Biol Chem. 2009;284(18):12384-12398.
[44] Wang T, Jiang X, Chen G, Xu J. Interaction of amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal lobar degeneration-associated fused-in-sarcoma with proteins involved in metabolic and protein degradation pathways. Neurobiol Aging. 2015;36(1):527-535.
[45] Liu G, Byrd A, Warner AN, et al. Cdc48/VCP and Endocytosis Regulate TDP-43 and FUS Toxicity and Turnover. Mol Cell Biol. 2020;40(4). doi:10.1128/MCB.00256-19.
[46] Gonzalez MA, Feely SM, Speziani F, et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 2014;137(Pt 11):2897-2902.
[47] de Bot ST, Schelhaas HJ, Kamsteeg E-J, van de Warrenburg BPC. Hereditary spastic paraplegia caused by a mutation in the VCP gene. Brain. 2012;135(Pt 12):e223; author reply e224.
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】