特表 2024-527585 アルファ－シヌクレイン凝集抑制用組成物及び凝集抑制方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-25

(54)【発明の名称】アルファ－シヌクレイン凝集抑制用組成物及び凝集抑制方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20240718BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 5/079 20100101ALI20240718BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20240718BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240718BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240718BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12N5/079

A61P43/00

A61K48/00

A61K35/30

A61P25/16

A61P25/00

C12N15/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500527

(86)(22)【出願日】2022-04-21

(85)【翻訳文提出日】2024-01-09

(86)【国際出願番号】 KR2022005687

(87)【国際公開番号】W WO2023286983

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】10-2021-0092446

(32)【優先日】2021-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0163358

(32)【優先日】2021-11-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521460387

【氏名又は名称】イノピューティクス コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】リ，サン フン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ユン ソン

(72)【発明者】

【氏名】ソク，ミン ジョン

(72)【発明者】

【氏名】キム，テ ギュン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ソンフン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA221

4C084ZA222

4C084ZC411

4C084ZC412

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB45

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA22

4C087ZC41

(57)【要約】

本発明は、アルファ－シヌクレイン凝集抑制用組成物及び凝集抑制方法に関し、より詳細には、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を脳細胞に導入して共に発現させてアルファ－シヌクレイン凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）及びリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を抑制する技術に関し、本発明に係る組成物は、アルファ－シヌクレインの凝集及びリン酸化を抑制する効果に優れ、パーキンソン病の治療及び予防に利用可能である。
【選択図】 図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体；及び
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）
からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制剤。

【請求項2】

前記遺伝子伝達体は、ウイルスベクターである、請求項１に記載のアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制剤。

【請求項3】

前記ウイルスベクターは、
アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターからなる群から選ばれる一つである、請求項２に記載のアルファ－シヌクレインタンパク質凝集抑制剤。

【請求項4】

前記脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）は、
ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｓ）、及び星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は微細膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を含む膠細胞（ｇｌｉａ）である、請求項１に記載のアルファ－シヌクレインタンパク質凝集抑制剤。

【請求項5】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体；及び
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）
からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質リン酸化抑制剤。

【請求項6】

前記遺伝子伝達体は、ウイルスベクターである、請求項５に記載のアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質リン酸化抑制剤。

【請求項7】

前記ウイルスベクターは、
アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターからなる群から選ばれる一つである、請求項６に記載のアルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制剤。

【請求項8】

前記脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）は、
ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｓ）、及び星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は微細膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を含む膠細胞（ｇｌｉａ）である、請求項５に記載のアルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制剤。

【請求項9】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体；及び
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）
からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。

【請求項10】

前記遺伝子伝達体は、ウイルスベクターである、請求項９に記載のアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。

【請求項11】

前記ウイルスベクターは、
アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターからなる群から選ばれる一つである、請求項１０に記載のアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。

【請求項12】

前記脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）は、
ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｓ）、及び星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は微細膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を含む膠細胞（ｇｌｉａ）である、請求項９に記載のアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。

【請求項13】

前記アルファ－シヌクレインタンパク質凝集によって発病する疾患は、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）及びレビー小体型認知症（Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｉｅｓ）からなる群から選ばれる疾患である、請求項９に記載のアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。

【請求項14】

組成物を対象に投与するステップ、および組成物は以下からなる群から選択されるいずれか１つを含む, アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集によって発病する疾患の治療する方法：
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体；及び
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アルファ－シヌクレイン凝集抑制用組成物及び凝集抑制方法に関し、より詳細には、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入して発現を誘導することによってアルファ－シヌクレイン凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）及びリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を抑制する技術に関する。

【背景技術】

【0002】

パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）は、発病時に筋肉の震え及び筋肉の剛直などの運動障害が発生する神経退行性疾患の一つである。パーキンソン病は主に高齢者層に発病し、対象の年齢が増加するにつれてパーキンソン病の発病危険も大きくなることが知られている。韓国では、人口１０００に約１～２人がかかると推定され、高齢者層に発病する大部分のパーキンソン病は、遺伝的な要素の影響がほとんどないことが知られている。パーキンソン病は中脳の黒質と呼ばれる部位におけるドパミン細胞が死滅しながら発病するものと知られているが、黒質部位のドパミン細胞が破壊される理由については正確に知られていないのが現状である。最近では、人間の平均寿命が延びているに伴って、パーキンソン病の頻度も増加すると予想される。

【0003】

また、パーキンソン病の管理及び治療に莫大な費用が発生し、患者の精神的苦痛も相当である。このため、効果的なパーキンソン病の予防及び治療方法が必要な状況である。

【0004】

近年、パーキンソン病と関連してアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質に研究の焦点が多く当てられている。アルファ－シヌクレインは人間の脳に豊富なタンパク質で、シナプス前末端と呼ばれる特殊な構造の神経細胞の端から主に発見される。進行した研究結果によれば、パーキンソン病は、ニューロン内部のアルファ－シヌクレインの生成と除去とのバランスが崩れることによってアルファ－シヌクレインの凝集が形成され、レビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）形成と関連があることが明らかになった。レビー小体はニューロンの膜透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を変形させることにより、カルシウムイオンを流入させ、ミトコンドリア損傷による酸化ストレスを誘発し、正常な微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の形成を妨害するため、ニューロンの死滅を招いてパーキンソン病の発病に影響を与えるものと知られている。そのため、アルファ－シヌクレインを抑制するための試みが行われているが、今のところ、アルファ－シヌクレインの凝集を効果的に抑制できる治療剤又は方法についての開発は皆無な現状である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

そこで、本発明者らは、転写因子Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されて脳細胞に発現する時にアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質の凝集を抑制することを実験的に究明し、本発明を完成するに至った。特に、Ｎｕｒｒ１発現単独効果よりは、補助活性剤（ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ）であるＦｏｘａ２が併合発現した時にシナジー効果による強力なアルファ－シヌクレインタンパク質集積抑制効果があることを確認した。

【0006】

したがって、本発明の一目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体（ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｒ）を含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制用組成物を提供することである。

【0007】

そこで、本発明の一目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体を含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制剤を提供することである。

【0008】

本発明の他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含むアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制用組成物を提供することである。

【0009】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含むアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制剤を提供することである。

【0010】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集抑制用組成物を提供することである。

【0011】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集抑制剤を提供することである。

【0012】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供することである。

【0013】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制剤を提供することである。

【0014】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供することである。

【0015】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制剤を提供することである。

【0016】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供することである。

【0017】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制剤を提供することである。

【0018】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集によって発病する疾患予防又は治療用組成物を提供することである。

【0019】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集によって発病する疾患予防又は治療用組成物を提供することである。

【0020】

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集によって発病する疾患予防又は治療用組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0021】

本発明者らは、パーキンソン病の主要原因として知られたアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集の抑制のための方法について鋭意研究した。その結果、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入して発現させた場合に、Ｎｕｒｒ１遺伝子単独で導入して発現させた場合に比べてアルファ－シヌクレインタンパク質の凝集及びリン酸化をより抑制できることを究明した。

【0022】

本発明の一態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質の凝集抑制用組成物である。

【0023】

本発明の一態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質の凝集抑制剤である。

【0024】

本発明の他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質の凝集抑制用組成物である。

【0025】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質の凝集抑制剤である。

【0026】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質の凝集抑制用組成物である。

【0027】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質の凝集抑制剤である。

【0028】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制用組成物である。

【0029】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクター、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制用組成物である。

【0030】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集抑制剤である。

【0031】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたウイルスベクター、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集抑制剤である。

【0032】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質のリン酸化抑制用組成物である。

【0033】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質のリン酸化抑制剤である。

【0034】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質のリン酸化抑制用組成物である。

【0035】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質のリン酸化抑制剤である。

【0036】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質のリン酸化抑制用組成物である。

【0037】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質のリン酸化抑制剤である。

【0038】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制用組成物である。

【0039】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたウイルスベクター、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制用組成物である。

【0040】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制剤である。

【0041】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたウイルスベクター、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレインタンパク質リン酸化抑制剤である。

【0042】

本明細書において、用語「アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質」は、脳に豊富なタンパク質の一つで、シナプス前末端と呼ばれる神経細胞の端から主に発見される。アルファ－シヌクレインはリン脂質及びタンパク質と相互作用するものと知られており、神経伝達物質であるドパミンの放出を調節することを手伝うものと知られている。ヒトのアルファ－シヌクレインは、１４０余個のアミノ酸からなり、ＳＮＣＡ遺伝子によってコードされる。

【0043】

本明細書において、「アルファ－シヌクレインタンパク質凝集」は、２個以上のアルファ－シヌクレインタンパク質が凝集することを意味する。本発明の一具現例において、アルファ－シヌクレイン凝集体は、非凝集したアルファ－シヌクレインタンパク質に比べて大きい分子量及び／又はサイズを有するものであってよい。

【0044】

本明細書において、「アルファ－シヌクレインのタンパク質凝集抑制」は、それぞれのアルファ－シヌクレインタンパク質が周辺のアルファ－シヌクレインタンパク質と凝集して凝集体を形成する現象を抑制したり又は既に生成された凝集体を分解して抑制することと理解されてよい。又は、アルファ－シヌクレインのタンパク質凝集抑制は、凝集を抑制することの他、アルファ－シヌクレインタンパク質又はその凝集体の分解速度を速くしたり、又はアルファ－シヌクレイン又はその凝集体の生成と分解速度とのバランスを正常な状態に調節することも含んでよい。

【0045】

本明細書において、用語「遺伝子伝達体」は、核酸配列又は核酸配列を含む組成物を細胞又は組織に伝達する手段を意味する。例えば、遺伝子伝達体は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、及び他の核酸ベースの伝達体）、ネイキッド（ｎａｋｅｄ）核酸の注入又は微細注入、重合体ベースの伝達システム（例えば、リポソーム及び金属性粒子システム）、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注入脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ；ＬＮＰ）などを含むものであってよいが、これに限定されない。

【0046】

本発明の一具現例において、遺伝子伝達体は、ウイルスベクターであってよい。

【0047】

本明細書において、用語「脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）」は、脳に位置している細胞を意味し、脳細胞は神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ，ｎｅｕｒｏｎ ｃｅｌｌｓ）及び膠細胞（ｇｌｉａ，ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を含んでよい。

【0048】

本明細書において、用語「神経細胞」は、神経系の細胞である。本明細書において、用語「神経細胞」は、「ニューロン」又は「ニューロン細胞」と同じ意味て使われてよい。

【0049】

本明細書において、用語「膠細胞」は、脳に存在する細胞のうち、最も多い部分を占める細胞で、膠細胞は星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は微細膠（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）細胞を含んでよい。星状膠細胞は、神経細胞の保護及び栄養供給、炎症に関与し、微細膠細胞は、脳において炎症を担当する細胞で、アルツハイマー病のような脳疾患において重要な役割を担う細胞群として知られている。

【0050】

本明細書において、用語「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、バクテリオファージを媒介にして遺伝的形質が一つの細胞から他の細胞に移って遺伝形質が導入される現象であり、ある型の細菌にバクテリオファージが感染されると、ファージＤＮＡが宿主ＤＮＡと結合し、溶菌現象によってファージが出てくる際に自分のＤＮＡを一部失う代わりに宿主ＤＮＡの一部を有して出てくる場合がある。このようなファージが他の細菌に感染されると、前宿主の遺伝子を新しく導入することにより、新しい形質が現れる。生物学的研究において「形質導入」という用語は一般に、ウイルスベクターを用いて標的細胞における特定外因性遺伝子を導入して発現させることを意味する。

【0051】

本明細書において、用語「細胞治療剤」は、ヒトから分離、培養及び特殊な操作によって作製された細胞及び組織を含む、治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品（米国ＦＤＡ規定）であり、細胞或いは組織の機能を復元させるために、生きている自己、同種、又は異種細胞を体外で増殖、選別したり、又は他の方法で細胞の生物学的特性を変化させたりするなどの一連の行為によって治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品のことを指す。細胞治療剤は、細胞の分化程度によって、体細胞治療剤、幹細胞治療剤とに大別される。

【0052】

本明細書において、用語「Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入（形質導入）する」とは、両遺伝子をコードする核酸を脳細胞に共に導入することを意味する。両遺伝子は遺伝子伝達体によって個別に又は共に導入されてよい。遺伝子伝達体としてベクターが用いられる場合に、両遺伝子はそれぞれの発現ベクターで個別に又は単一の発現ベクターで同時に導入されてよい。

【0053】

本発明の一実施例では、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が両方とも導入される場合に、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の相互間の相乗効果により、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２遺伝子が単独で導入される場合に比べて、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集の抑制能に顕著に優れていることを確認した。具体的には、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を同時に細胞に導入した場合に、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２遺伝子が単独で導入された場合に比べて、アルファ－シヌクレインタンパク質単量体及び凝集体がいずれも顕著に減少することを確認した（図５及び図６参照）。

【0054】

本明細書において、用語「Ｎｕｒｒ１導入（形質導入）する」とは、Ｎｕｒｒ１遺伝子をコードする核酸を脳細胞に導入することを意味する。

【0055】

脳細胞にＮｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする遺伝子を導入するために当分野に公知の遺伝子伝達体を用いた細胞内導入技術が用いられてよく、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、アデノウイルスを用いる方法など、ウイルスベクターが用いられてよい。

【0056】

Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２を搭載する時に、ウイルス性ベクターを用いることができる。ウイルス性ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、及び／又はレンチウイルスなどが用いられてよいが、これに限定されない。したがって、本発明に係るＮｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２導入は、一具体例として、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸をそれぞれ別個の発現ベクター又は単一の発現ベクターに挿入させた後、それを脳細胞に導入することを含んでよい。

【0057】

Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする各核酸は、当業界に公知のＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をコードする塩基配列を有するものであれば制限なく用いられてよい。また、核酸は、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２の各機能的同等物をコードする塩基配列を有してよい。機能的同等物とは、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上の配列相同性（すなわち、同一性）を有するポリペプチドのことを指す。例えば、機能的同等物は、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。機能的同等物は、アミノ酸配列の一部が付加、置換又は欠失の結果として生成されるものであってよい。アミノ酸の欠失又は置換は、本発明のポリペプチドの生理活性に直接関連しない領域に位置していてよい。

【0058】

また、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸は、当業界に公知の遺伝子組換え方法によって製造されてよい。例えば、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸は、ゲノムから核酸を増幅させるためのＰＣＲ増幅、化学的合成法又はｃＤＮＡ配列を製造する技術によって製造されてよい。

【0059】

Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸は、発現調節配列に作動可能に連結されて発現ベクター内に挿入されてよい。用語「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合してそれの機能又は発現が他の核酸断片によって影響を受けることを意味する。また、発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、特定の宿主細胞において作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味する。かかる調節配列は、転写を開始するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでよい。これらを総称して「Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸を含むＤＮＡ構造物」と表現することもできる。

【0060】

本明細書において、用語「発現ベクター」は、構造遺伝子をコードする核酸が挿入されてよく、宿主細胞内で核酸を発現させ得る当業界に公知のウイルスベクター又はその他媒介体を意味する。

【0061】

本発明において、ベクターはウイルスベクターであってよい。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アビポックススウイルスベクターなどであってよく、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターであってよいが、これに限定されない。

【0062】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、特定細胞にウイルスを作り得る材料を導入して作製されてよい。レンチウイルスベクターも特定細胞株にウイルスを生産できるように諸段階を経て作製されてよい。

【0063】

本発明に係る核酸を含む発現ベクターは、当業界に公知の方法、例えば、次に限定されないが、ウイルス形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、一時的形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射などの方法を用いて核酸を細胞内に流入させるための公知の方法によって脳細胞内に導入可能である。例えば、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスベクターに遺伝子組換え技術で挿入して発現ベクターを作製した後、このベクターを包装（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細胞に形質導入し、形質導入された包装細胞を培養後に分離精製し、ＡＡＶ又はレンチウイルス溶液を得ることができる。そして、これを用いて脳細胞（神経細胞及び／又は膠細胞）を感染させることにより、脳細胞にＮｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２遺伝子を導入することができる。続いて、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターに含まれた選別マーカーを用いて、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２が単独発現又は同時発現することを確認後に所望の脳細胞を得ることができる。

【0064】

本発明に係るＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が導入されて発現する脳細胞は、下記の段階を含む製造方法によって製造されてよい：

【0065】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をコードする核酸を含むＤＮＡ構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含む組換え遺伝子伝達体を製造する製造段階；

【0066】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が含まれた遺伝子伝達体で脳細胞を感染させる形質感染段階。

【0067】

本発明に係るＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が導入されて発現する脳細胞は、下記の段階を含む製造方法によって製造されてよい：

【0068】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をコードする核酸を含むＤＮＡ構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含む組換えウイルスベクターを製造する製造段階；

【0069】

組換えウイルスベクターをウイルス生産細胞株に形質感染させてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現組換えウイルスを製造する生産段階；及び

【0070】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現組換えウイルスで脳細胞を感染させる形質感染段階。

【0071】

ＤＮＡ構造物を発現調節配列、例えばプロモーターに作動可能に連結し、当業界に公知のウイルスベクターに挿入させて組換えウイルスベクターを製造することができる。その後、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターをウイルス生産細胞株に導入し、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２を発現させる組換えウイルスを製造する。ウイルス生産細胞株は、使用したウイルスベクターに該当するウイルスを生産する細胞株を使用することができる。その後、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２又はＮｕｒｒ１を発現させる組換えＡＡＶ又はレンチウイルスを脳細胞に感染させることができる。上記の過程は当業界に公知の方法によって行われてよい。

【0072】

本発明に係るＮｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２が発現する脳細胞は、当業界に公知の方法によって増殖及び培養されてよい。

【0073】

本発明に係る脳細胞は、目的細胞タイプの生存又は増殖を手伝う培養液中で培養されてよい。脳細胞の持続的な培養のために開発された添加剤を培養液に補充してよい。例えば、Ｇｉｂｃｏ社から販売するＮ２培地及びＢ２７添加剤、ウシ血清などがある。培養時に培地と細胞の状態を観察しながら培地を交換して脳細胞を培養することができる。この時、脳細胞が継続増殖して互いに固まって神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を形成すれば継代培養を実施することができる。継代培養は状況によって約７～８日ごとに行うことができる。

【0074】

本発明に係る組成物は、アルファ－シヌクレインの凝集及びリン酸化を抑制して神経細胞及び膠細胞を含む脳細胞を損傷から保護し、神経細胞が補充（再生）されたり又は構築（復元）されたりすることを可能にする。

【0075】

本明細書において、用語「再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」とは、形成された器官又は個体の一部が喪失された時にその部分が補充される現象を意味する。また、「復元」とは、「再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」ともいえ、これは組織の再構築を意味するもので、一応解離した細胞や組織から組織や器官を再び構築することを意味する。

【0076】

本発明の組成物又は細胞治療剤は、投与方式によって許容可能な担体を含むことによって適切な製剤として製造されてよい。投与方式に適切な製剤は公知であり、典型的に膜を通過する、移動を容易にする製剤を含んでよい。

【0077】

また、本発明の組成物は一般の医薬品製剤の形態で用いられてよい。非経口用製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤又は凍結乾燥製剤、経口投与時には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ又はウエハーなどの形態で製造でき、注射剤の場合には、単位投薬アンプル又は多回投薬形態で製造できる。また、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容される担体と共に投与されてよい。例えば、経口投与時には、結合体、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素又は香料などを使用することができる。注射剤は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用では、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。

【0078】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物である。

【0079】

本発明のさらに他の態様は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクター、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物である。

【0080】

本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集によって発病する疾患の治療又は緩和方法である。

【0081】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つを含む組成物を対象に投与する段階。

【0082】

本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む、アルファ－シヌクレインタンパク質凝集によって発病する疾患の治療又は緩和方法である。

【0083】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたウイルスベクター、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つを含む組成物を対象に投与する段階。

【0084】

本明細書において、用語「対象」は、治療、観察又は実験の対象である脊椎動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、ウサギ、ギニアピッグ、ヒトなどであってよい。

【0085】

本明細書において、用語「治療」は、有益である又は好ましい臨床的結果を得るための接近を意味する。本発明の目的のために、有益である又は好ましい臨床的結果は、次に限定されないが、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾病進行の遅延又は速度の減少、疾病状態の改善又は一時的緩和及び軽減（部分的に又は全体的に）、検出可能であるか又は検出されないことを含む。また、「治療」は、治療を受けなかった時に予想される生存率と比較して生存率を伸ばすことを意味することもできる。「治療」は、治療学的治療及び予防的又は予防措置方法のいずれをも指す。治療は、予防される障害の他、既に発生した障害においても要求される治療を含む。疾病を「緩和（Ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」することは、治療をしていない場合と比較して、疾病状態の範囲及び／又は好ましくない臨床的徴候が減少する、及び／又は進行の時間的推移（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）が遅延されたり伸びることを意味する。

【0086】

本発明の一具現例において、アルファ－シヌクレインによって発病した疾患は、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）及びレビー小体型認知症（Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｉｅｓ）からなる群から選ばれる疾患であってよいが、これに限定されない。

【0087】

また、本発明の治療用組成物を用いて、アルファ－シヌクレインによって発病した疾患を治療する方法は、適切な方法によって対象体又は患者に所定の物質が導入される一般的な経路を通じて投与することを含んでよい。

【0088】

投与方法としては、脳内投与、中脳投与、脳室内投与、脊椎腔投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、血内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与があるが、これに限定されない。

【0089】

また、本発明に係る組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてよい。投与方式及び製剤は、定位固定器（Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて脳中脳注射剤、脳黒質注射剤、脳室注射剤、脳脊髓液注射剤、静脈注射剤、皮下注射剤、血内注射剤、筋肉注射剤又は点滴注射剤であってよい。注射剤は、生理食塩液又はリンゲル液などの水性溶剤、植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール又はグリセリンなど）などの非水性溶剤などを用いて製造できる。注射剤は、変質防止のための安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなど）、乳化剤、ｐＨ調節のための緩衝剤、微生物発育を阻止するための保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなど）などの薬剤学的担体を含んでよい。

【0090】

本発明に係る組成物は、対象に薬学的有効量で投与されてよい。薬学的有効量は、疾患の種類、対象体（患者）の年齢、体重、健康、性別、対象体（患者）の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合又は同時使用される薬物など、医学分野によく知られた要素によって当業者にとって容易に決定されてよい。

【0091】

本発明に係るＦｏｘａ２及び／又はＮｕｒｒ１遺伝子が導入された脳細胞は、組成物の形態で治療学的有効量によって病変部位に直接移植されてよい。

【0092】

本明細書において、用語「治療学的有効量」は、アルファ－シヌクレインの凝集又はリン酸化によって誘発される対象体又は患者の生理学的効果を中止又は軽減させるのに十分な量を意味する。使用された細胞の治療学的有効量は、対象体（患者）のニーズ、対象体（患者）の年齢、生理学的状態及び健康、所定の治療効果、治療に標的される組織のサイズ及び面積、病変の程度及び選択された伝達経路によって決定されてよい。また、細胞は、低細胞投与量の多重小型移植片で、所定の標的組織内の一箇所以上の部位に投与されてよい。本発明の細胞は移植前に完全に分離され、例えば単一細胞の懸濁液を形成したり、又は移植前に略完全に分離され、例えば細胞の小型凝集物を形成できる。細胞はそれらを所定の組織部位に移植又は移動させ、機能的に欠乏した領域を再構成又は再生する方式で投与できる。

【0093】

治療学的に有効に達成するように投与できる細胞の適当な範囲は、当業者の通常の知識内で対象体又は患者に合わせて適切に決定されてよい。例えば、本発明に係る組成物に含み得る細胞は、約１０～１，０００，０００，０００であってよいが、これに限定されない。

【0094】

本発明の組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、対象体（患者）の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって決定されてよい。普通に熟練した医師は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の薬剤学的組成物は、１×１０^１～１×１０^１３ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ（ｖｇ）／μｌ、１×１０^２～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^３～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^４～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^５～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^６～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^７～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^８～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^９～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^１０～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^１１～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^１２～１×１０^１３ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^１２ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^１１ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^１０ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^９ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^８ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^７ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^６ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^５ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^４ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^３ｖｇ／μｌ、１×１０^１～１×１０^２ｖｇ／μｌ、１×１０^２～１×１０^１２ｖｇ／μｌ、１×１０^３～１×１０^１１ｖｇ／μｌ、１×１０^４～１×１０^１０ｖｇ／μｌ、１×１０^５～１×１０^９ｖｇ／μｌ、１×１０^６～１×１０^８ｖｇ／μｌ、１×１０^２～１×１０^３ｖｇ／μｌ、１×１０^３～１×１０^４ｖｇ／μｌ、１×１０^４～１×１０^５ｖｇ／μｌ、１×１０^５～１×１０^６ｖｇ／μｌ、１×１０^６～１×１０^７ｖｇ／μｌ、１×１０^７～１×１０^８ｖｇ／μｌ、１×１０^８～１×１０^９ｖｇ／μｌ、１×１０^９～１×１０^１０ｖｇ／μｌ、１×１０^１０～１×１０^１１ｖｇ／μｌ、１×１０^１１～１×１０^１２ｖｇ／μｌのウイルスベクター、又はウイルス遺伝子を含んでよい。一般に、１×１０^６～２×１０^１６ｖｇ／ｄｏｓｅを患者に１回～５回注射できる。効果の持続のために数カ月又は数年後に類似の方法で再び注射できる。

【発明の効果】

【0095】

本発明は、アルファ－シヌクレイン凝集抑制用組成物及び凝集抑制方法に関し、より詳細には、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入して発現を誘導することによってアルファ－シヌクレイン凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）及びリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を抑制する技術に関し、本発明に係る組成物は、アルファ－シヌクレインの凝集及びリン酸化を抑制する効果に優れ、パーキンソン病の治療及び予防に利用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0096】

【図1】一実施例によって、対照群（Ｃｏｎｔ）とＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたドパミンニューロン及び膠細胞（ＮＦ）にアルファ－シヌクレインＰＦＦ（Ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｆｉｂｒｉｌ）を処理した後、ウェスタンブロットを行った結果を示す写真である。

【0097】

【図2】一実施例によって、ウェスタンブロットを行った後、対照群とＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入した群（ＮＦ）のアルファ－シヌクレイン凝集程度を比較したグラフである。

【0098】

【図3】一実施例によって、ウェスタンブロットを行った後、対照群とＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入した群（ＮＦ）のリン酸化されたアルファ－シヌクレイン単量体レベルを示すグラフである。

【0099】

【図4】一実施例によって、ウェスタンブロットを行った後、対照群とＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入した群（ＮＦ）のリン酸化されたアルファ－シヌクレイン凝集体レベルを示すグラフである。

【0100】

【図5】一実施例によって、対照群（Ｃｏｎｔ）、Ｎｕｒｒ１遺伝子単独導入（Ｎ）、Ｆｏｘａ２遺伝子単独導入（Ｆ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子の両方が導入（ＮＦ）されたドパミンニューロン及び膠細胞にアルファ－シヌクレインＰＦＦ（Ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｆｉｂｒｉｌ）を処理した後、ウェスタンブロットを行った結果を示す写真である。

【0101】

【図6】一実施例によって、ウェスタンブロットを行った後、対照群（Ｃｏｎ）、Ｆｏｘａ２単独導入群（Ｆ）、Ｎｕｒｒ１単独導入群（Ｎ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入した群（ＮＦ）のアルファ－シヌクレイン凝集体と単量体のレベルを比較したグラフである。

【0102】

【図7】一実施例によって、野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（Ｃｏｎｔ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）のポールテスト（Ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）結果を示すグラフである。

【0103】

【図8】一実施例によって、野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（Ｃｏｎｔ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）のポールテスト結果を示す写真である。

【0104】

【図9】一実施例によって、野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）の８週目におけるビームテスト（Ｂｅａｍ ｔｅｓｔ）結果を示すグラフである。

【0105】

【図10】一実施例によって、野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）の１２週目におけるビームテスト結果を示すグラフである。

【0106】

【図11】一実施例によって、野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）のビームテスト結果を示す写真である。

【0107】

【図12】一実施例によって、オープンフィールドテスト（Ｏｐｅｎ Ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ；ＯＦＴ）によって野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）の移動した総距離（Ｔｏｔａｌ ｄｉｓｔａｎｃｅ）を示すグラフである。

【0108】

【図13】一実施例によって、オープンフィールドテストによって野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）の平均速度（Ａｖｅｒａｇｅ ｓｐｅｅｄ）を示すグラフである。

【0109】

【図14】一実施例によって野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）のオープンフィールドテスト結果を示す図である。

【0110】

【図15】一実施例によって野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）の８週目におけるローターロッドテスト（Ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）結果を示すグラフである。

【0111】

【図16】一実施例によって、野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）の１２週目におけるローターロッドテスト結果を示すグラフである。

【0112】

【図17】一実施例によって、野生型（ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入した実験群（ＮＦ）のローターロッドテスト結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0113】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたウイルスベクター；及び
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）
からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質凝集抑制剤。

【実施例】

【0114】

以下、本発明を下記の実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0115】

実施例１：ベクター製造

【0116】

レンチウイルスを形質導入するためにベクターを製造した。Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２を発現させるレンチウイルスベクターは、ＣＭＶ促進遺伝子（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の統制の下に、それぞれのｃＤＮＡをｐＣＤＨ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の多重クローニング部位に挿入して生成した。ｐＧＩＰＺ－ｓｈＮｕｒｒ１とｐＧＩＰＺ－ｓｈＦｏｘａ２レンチウイルスベクターをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。空の（ｅｍｐｔｙ）構造体（ｂａｃｋｂｏｎｅ）ベクター、ｐＣＤＨ又はｐＧＩＰＺは陰性対照として使用された。レンチウイルスの力価は、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ^ＴＭ ＨＩＶレンチウイルス定量キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて測定され、１０６個の形質導入単位（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｔ，ＴＵ）／ｍｌ（６０～７０ｎｇ／ｍｌ）を含む２００μｌ／ｗｅｌｌ（２４ウェル皿）又は２ｍｌ／６ｃｍ皿がそれぞれの形質導入反応に用いられた。

【0117】

定位方法の（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）注射によって生体内発現を誘導するために、ＣＭＶ促進者の統制の下にＮｕｒｒ１又はＦｏｘａ２を発現するＡＡＶは、それぞれのｃＤＮＡをｐＡＡＶ－ＭＣＳベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）にサブクローニングすることによって生成した。伝達された遺伝子発現効率を評価するために、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）を発現させるＡＡＶも生成した。ＡＡＶ（血清型９又は２）の生産及び分離精製は、韓国科学技術研究院（大韓民国ソウル）で行った。ＡＡＶ力価は、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ^ＴＭ ＡＡＶ定量キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）で測定された。共同発現研究は個別ウイルス製剤の混合物（１：１，ｖ：ｖ）で細胞を感染させて行われた。

【0118】

実施例２：細胞培養

【0119】

２－１．中脳性神経幹細胞（ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ；ＶＭ ＮＰＣ）培養

【0120】

ポリ－Ｌ－オルニチン－フィブロネクチン（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｉｎｅ－ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ；ＰＬＯ－ＦＮ）でコートされた６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に、ドパミン性ポテンシャル（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を持つ中脳性神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を４×１０^５／ｗｅｌｌでシード（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。２４時間後に、シナプシン（ｓｙｎａｐｓｉｎ）プロモーター統制下にＮｕｒｒ１、Ｆｏｘａ２を発現するレンチウイルスをそれぞれ１０^６ＴＵ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ｍｌ（６０～７０ｎｇ／ｍｌ）、１：１（ｖ：ｖ）でそれぞれ形質導入した。対照群としては、ＧＦＰを発現するレンチウイルスを同量で処理した。その後、３日間培養してニューロンに分化させた。

【0121】

２－２．中脳性膠細胞（Ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｇｌｉａ）の培養

【0122】

中脳性膠細胞（Ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｇｌｉａ）の培養のために、ポリ－Ｌ－オルニチン－フィブロネクチンでコートされた１００ｍｍ×２０ｍｍ培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）に、ネズミの中脳性膠細胞を３×１０^６個でシードし、２４時間後に、ＣＭＶプロモーター統制下にＮｕｒｒ１とＦｏｘａ２を個別に発現するレンチウイルスを１０^６ＴＵ／ｍｌ（６０～７０ｎｇ／ｍｌ）ずつ１：１（ｖ：ｖ）に混合して形質導入した。対照群としては対照ウイルスを同量で処理した。その後、５日間培養した。

【0123】

２－３．共同培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）

【0124】

実施例２－１で培養されたドパミン性中脳ニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ＶＭ ｎｅｕｒｏｎ）に、実施例２－２で培養された膠細胞（ＶＭ ｇｌｉａ）を２：１の割合でシードした（ＶＭ Ｎｅｕｒｏｎ：ＶＭ ｇｌｉａ＝２：１）。翌日、アルファ－シヌクレインＰＦＦ（Ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｆｉｂｒｉｌ）を最終濃度が２μｇ／ｍｌになるように処理し、７日後にアルファ－シヌクレインのタンパク質の量をウェスタンブロットで確認した。

【0125】

実施例３：ウェスタンブロット

【0126】

プレーティングされた細胞に１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液にタンパク質分解酵素阻害因子（Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；Ｒｏｃｈｅ）とリン酸加水分解酵素抑制剤カクテル（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ，Ｓｉｇｍａ）を入れてタンパク質を抽出した。遠心分離後に、ペレットを１％ ＳＤＳサンプルバッファで溶かした後、１５μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１６％勾配ゲル）にロードした。メンブレインにトランスファー後に５％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴにブロッキングし、１次抗体を４℃で一晩インキュベーションし、２次抗体を常温で１時間インキュベーションした。１次抗体は次のように使用した：α－ｓｙｎ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１０７８７）；ｐＳ１２９－α－ｓｙｎ（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ，８２５７０１）。そして、ウェスタンブロット実験結果は図１に示した。ウェスタンブロット後に、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いてウェスタンブロット結果を定量的に測定し、それを図２～図４及び表１～表３に示した。

【0127】

【表1】

【0128】

【表2】

【0129】

【表3】

【0130】

実施例４：Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２のアルファ－シヌクレイン凝集及びリン酸化抑制確認

【0131】

ウェスタンブロットの結果、図１から確認できるように、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が形質導入されたニューロン及び膠細胞にアルファ－シヌクレインＰＦＦを処理した場合に、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が処理されていないニューロン及び膠細胞に比べて、アルファ－シヌクレインタンパク質の凝集が対照群に比べて減少していることを確認した。また、アルファ－シヌクレインタンパク質のリン酸化された単量体及び凝集体のレベルも対照群に比べて大幅に減少していることを確認した。

【0132】

具体的には、図２及び表１から確認できるように、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が形質導入された場合に、凝集されたアルファ－シヌクレインタンパク質の量及び凝集が対照群に比べて減少した。また、図３及び図４と表２及び表３から確認できるように、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が形質導入された場合に、リン酸化されたアルファ－シヌクレイン凝集体のレベルが対照群の約６０％のレベルに減少したし、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）においては約３０％レベルまで減少していることを確認した。

【0133】

実施例５：Ｎｕｒｒ１単独投与とＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２併用投与のアルファ－シヌクレイン凝集体形成抑制効果の比較

【0134】

Ｎｕｒｒ１単独、Ｆｏｘａ２単独、又はＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２両方が導入されたそれぞれのニューロン及び膠細胞をプレーティングし、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液にタンパク質分解酵素阻害因子（Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；Ｒｏｃｈｅ）とリン酸加水分解酵素抑制剤カクテル（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ，Ｓｉｇｍａ）を入れてタンパク質を抽出した。

【0135】

対照群は、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２を導入していない細胞を使用した。遠心分離後に、ペレットを１％ ＳＤＳサンプルバッファで溶かした後、１５μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１６％勾配ゲル）にロードした。メンブレインにトランスファー後に５％ ＢＳＡ／ＴＢＳＴにブロッキングし、１次抗体を４℃で一晩インキュベーションし、２次抗体を常温で１時間インキュベーションした。１次抗体は次のように使用した：α－ｓｙｎ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１０７８７）；ｐＳ１２９－α－ｓｙｎ（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ，８２５７０１）。そして、ウェスタンブロット実験結果は図５に示した。ウェスタンブロット後に、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いてウェスタンブロット結果を定量的に測定し、それを図６及び表４に示した。

【0136】

【表4】

【0137】

実験の結果、図６及び表４から確認できるように、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子両方を形質導入した群（Ｎ＋Ｆ）は、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２を単独で形質導入した群（Ｎ又はＦ）に比べてアルファ－シヌクレイン凝集が顕著に減少していることを確認した。具体的には、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子両方を形質導入した群は、対照群に比べてアルファ－シヌクレイン凝集を４８％以上減少させたし、特に、Ｎｕｒｒ１単独投入群に比べてアルファ－シヌクレイン凝集を３２％以上減少させたことを確認した。結果的に、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子両方を形質導入する場合に、Ｎｕｒｒ１を単独で導入する場合に比べてアルファ－シヌクレイン凝集を顕著に減少させ得ることが確認されたし、さらには、パーキンソン病治療においてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子両方を導入することがより効果的であると予想される。

【0138】

実施例６：パーキンソン病モデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２導入による行動改善確認

【0139】

６－１．パーキンソン病モデル（ＰＤ ｍｏｄｅｌ）マウスの作製

【0140】

ＩＣＲマウスＡＡＶ２－ＣＭＶ－αｓｙｎ－ＨＡとα－ｓｙｎ ＰＦＦ ５μｇを混ぜてマウスの黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ；ＳＮ）に注入した。具体的には、定位方法機械（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）でマウスを固定させた後、頭部位の皮膚を約１ｃｍ正中切開してブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）を確認した。ブレグマを基準に－３．３ｍｍ前部、１．２ｍｍ後部の位置に電気ドリルで頭蓋骨を開けてＡＡＶ２－ＣＭＶ－α－ｓｙｎ－ＨＡ（１．３ｘ１０^１３ｇｃ／μｌ）２μｌとα－ｓｙｎ ＰＦＦ（５ｍｇ／ ｍＬ）２μｌをｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒにロードし、頭蓋骨から４．６ｍｍ深さに進入して黒質部位両側のそれぞれに２μｌずつ（両側投与部位別の各ベクター別投与量は１．３ｘ１０^１３ｇｃ／ｓｉｔｅである。）０．５μｌ／ｍｉｎの速度で徐々に投与した。両側黒質部位に投与２０分後に、ｉｎｊｅｃｔｏｒを、１０分当たりに１．５ｍｍずつ後に抜きながら、投与された混合物の漏れ（ｌｅａｋｉｎｇ）を最小化した。医療用皮膚ステープラーを用いてマウス頭蓋骨の皮膚を縫合し、ポビドンで消毒し、回復後にケージに入れた。

【0141】

投与４週後に、Ｎｕｒｒ１、Ｆｏｘａ２を発現するウイルスベクターを用いてＮｕｒｒ１とＦｏｘａ２を形質導入した。具体的には、定位投与装備（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）でＰＤマウスモデルを固定させた後、頭部位の皮膚を約１ｃｍ正中切開してブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）を確認した。ブレグマを基準に－３．３ｍｍ前部、１．２ｍｍ後部の位置に電気ドリルで頭蓋骨を開け、ＡＡＶ９－ｈＮｕｒｒ１及びＡＡＶ９－ｈＦｏｘａ２をベクター別の各濃度を１×１０^１０ｇｃ／μｌにしてｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒにロードした。頭蓋骨から４．６ｍｍ深さに進入して黒質部位両側のそれぞれに２μｌずつ（両側投与部位別の各ベクター別投与量は１．０×１０^１０ｇｃ／ｓｉｔｅである。）０．５μｌ／ｍｉｎの速度で徐々に投与した。両側黒質部位に投与２０分後に、ｉｎｊｅｃｔｏｒを１０分当たりに１．５ｍｍ後に抜きながら、投与された混合物の漏れ（ｌｅａｋｉｎｇ）を最小化した。医療用皮膚ステープラーを用いて頭蓋骨の皮膚を縫合し、ポビドンで消毒し、回復後にケージに入れた。

【0142】

６－２．ポールテスト（Ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）

【0143】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を形質導入して４週、８週及び１２週後にポールテストを行った。テストは、テスト２～３日前にあらかじめマウスをトレーニングして適応させた後に行われた。試験時に、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ；ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（Ｃｏｎｔ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスがポールの上端から下に降りる時間を測定した。実験中にポールから落ちたり滑りる場合は、負の値（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）に設定し、当該週において最大値と同じ値に設定してデータを作った。この時、野生型マウスは６匹、対照群とＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群のマウスは８匹を実験した。測定された時間は一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＣＡ）によって有意な効果を決定した。

【0144】

【表5】

【0145】

実験の結果、図７及び図８と表５から確認できるように、対照群のマウスが野生型及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスに比べて、ポールを降りるまでより時間がかかったし、ポールから落ちたり滑りる頻度が高かった。

【0146】

６－３．ビームテスト（Ｂｅａｍ ｔｅｓｔ）

【0147】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を形質導入し、８週及び１２週後にビームテストを行った。テストは、テスト２～３日前にあらかじめマウスをトレーニングして適応させた後に行われた。試験に用いられたビームは四角形状であり、厚さは１０ｍｍであった。試験時に、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ；ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスがビームの端から端まで移動する時間を２回ずつ測定した。実験中にビームから落ちたり滑りる場合は、負の値（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）に設定し、当該週において最大値と同じ値に設定してデータを作った。この時、野生型マウス、対照群（ＰＤ群）、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群のマウスはいずれも６匹を使用した。測定された時間は、一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＣＡ）を用いて有意な効果を決定した。

【0148】

【表6】

【0149】

実験の結果、図７及び図８と表６から確認できるように、対照群のマウスは、野生型及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスに比べて、ビームを通過する時間がより所要された。

【0150】

６－４．オープンフィールドテスト（Ｏｐｅｎ Ｆｉｅｌｄ Ｔｅｓｔ；ＯＦＴ）

【0151】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を形質導入して８週後にオープンフィールドテストを行った。野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ；ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスをオープンフィールドに入れた後、各群のマウスが５分間動く動線、速度及び距離などを測定した。このとき、野生型マウス、対照群（ＰＤ群）、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群のマウスはいずれも６匹を使用した。測定された時間は、一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＣＡ）を用いて有意な効果を決定した。

【0152】

【表7】

【0153】

【表8】

【0154】

実験の結果、図１２～図１４と表７及び表８から確認できるように、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスは、野生型と比較して、移動した総距離及び平均速度においてほとんど差がない程度に行動が改善されていることを確認した。また、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスは、対照群（ＰＤ）と比較して、移動した総距離及び移動時平均速度が著しく上昇した。

【0155】

６－５．ローターロッドテスト（Ｒｏｔａｒｏｄ Ｔｅｓｔ）

【0156】

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を形質導入して８週及び１２週後にローターロッドテストを行った。テストは、テスト２～３日前にあらかじめマウスをトレーニングして適応させた後に行われた。試験は、４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで速度を徐々に上げながら野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ；ＷＴ）、パーキンソン病モデルである対照群（ＰＤ）、及びＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスが円筒から落ちる時間を２回測定することによって行われた。この時、野生型マウス、対照群（ＰＤ群）、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群のマウスはいずれも６匹を使用した。測定された時間は、一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＣＡ）を用いて有意な効果を決定した。

【0157】

【表9】

【0158】

【表10】

【0159】

実験の結果、図１５～図１７と表９及び表１０から確認できるように、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスは、８週目と１２週目において対照群に比べて円筒から落ちるまで遥かに多い時間がかかった。

【0160】

６－６．小結

【0161】

以上、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２形質導入群（ＮＦ）のマウスは、パーキンソン病モデルである対照群に比べて、ポールテスト、ビームテスト、オープンフィールドテスト及びローターロッドテストのいずれにおいても運動能力及び行動が顕著に改善されていることを確認した。上記の結果から、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子導入は、パーキンソン病の特徴的な硬直、運動緩除、姿勢不安のような運動能力の低下を回復させ得ることを確認し、よって、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子導入はパーキンソン病の治療に利用可能であると期待される。

【産業上の利用可能性】

【0162】

本発明は、アルファ－シヌクレイン凝集抑制用組成物及び凝集抑制方法に関し、より詳細には、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入して発現を誘導することによってアルファ－シヌクレインの凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）及びリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を抑制する技術に関する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【手続補正書】

【提出日】2024-01-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質の凝集またはリン酸化抑制用組成物であって、
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体；及び
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）、
からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、組成物。

【請求項2】

前記遺伝子伝達体は、ウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ウイルスベクターは、
アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターからなる群から選ばれる一つである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）は、
ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｓ）、及び星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は微細膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を含む膠細胞（ｇｌｉａ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）タンパク質の凝集又はリン酸化によって発病する疾患の予防又は治療用組成物であって、
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が含まれた遺伝子伝達体；及び
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）
からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、予防又は治療用組成物。

【請求項6】

前記遺伝子伝達体は、ウイルスベクターである、請求項５に記載の予防又は治療用組成物。

【請求項7】

前記ウイルスベクターは、
アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターからなる群から選ばれる一つである、請求項６に記載の予防又は治療用組成物。

【請求項8】

前記脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）は、
ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｓ）、及び星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は微細膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を含む膠細胞（ｇｌｉａ）である、請求項５に記載の予防又は治療用組成物。

【請求項9】

アルファ－シヌクレインタンパク質の凝集によって発病する前記疾患は、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）及びレビー小体型認知症（Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｉｅｓ）からなる群から選ばれる疾患である、請求項５に記載の予防又は治療用組成物。

【国際調査報告】