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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-25
(54)【発明の名称】神経線維腫症２型症候群の予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
C07D 249/06 20060101AFI20240718BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/4192 20060101ALI20240718BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240718BHJP
【ＦＩ】
C07D249/06 CSP
A61P43/00 105
A61P25/00 ZNA
A61K31/4192
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024501973
(86)(22)【出願日】2022-01-24
(85)【翻訳文提出日】2024-01-12
(86)【国際出願番号】 KR2022001200
(87)【国際公開番号】W WO2022196927
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】10-2021-0033149
(32)【優先日】2021-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519379835
【氏名又は名称】ピーアールジー エスアンドテック インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＧ Ｓ＆ＴＥＣＨ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100167623
【弁理士】
【氏名又は名称】塚中 哲雄
(72)【発明者】
【氏名】パク ポムチュン
(72)【発明者】
【氏名】ユン ファヨン
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC60
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZB21
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、神経線維腫症２型症候群の予防または治療用組成物に関するものであって、本発明による化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物、その立体異性体、またはこれらの組み合わせは、既存のＴβＲ１キナーゼ抑制剤であるＴＥＷ７１９７とは異なって、正常なＴＧＦ－β信号は妨害せずとも、ＴＧＦ－β受容体１（ＴβＲ１）媒介ＲＫＩＰ減少を抑制するので、正常なＴＧＦ－β信号抑制によって引き起こされる副作用の問題を解決することができる新たな形態の神経線維腫症２型症候群の治療剤として活用されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物またはその立体異性体から選択された化合物：【化1】
Ｒ１は、ＮＲ５Ｒ６またはＣＮであり、Ｒ５またはＲ６は、それぞれ同一または異なり、水素または（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ２は、ハロ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、
Ｒ３またはＲ４は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、
ｎは、０～３の整数である。
【請求項2】
前記化学式１で表される化合物で、Ｒ１は、ＮＨ２またはＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ５またはＲ６は、それぞれ同一または異なり、（Ｃ１～Ｃ２）アルキルであり、Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、Ｒ３またはＲ４は、それぞれ同一または異なり、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、ｎは、１～２の整数であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
前記化学式１で表される化合物で、Ｒ１は、ＮＨ２であり、Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ２）アルコキシであり、Ｒ３及びＲ４は、（Ｃ１～Ｃ２）アルキルであり、ｎは、１～２の整数であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項4】
下記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物またはその立体異性体から選択された化合物を含む、神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の予防または治療用薬学組成物：【化1】
Ｒ１は、ＮＲ５Ｒ６またはＣＮであり、Ｒ５またはＲ６は、それぞれ同一または異なり、水素または（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ２は、ハロ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、
Ｒ３またはＲ４は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、
ｎは、０～３の整数である。
【請求項5】
前記化合物は、ＴＧＦ－β受容体１（ＴβＲ１）とＲＫＩＰとの相互作用を抑制することを特徴とする、請求項４に記載の神経線維腫症２型症候群の予防または治療用薬学組成物。
【請求項6】
前記化合物は、正常なＴＧＦ－β信号は妨害せずとも、ＴＧＦ－β受容体１（ＴβＲ１）媒介ＲＫＩＰ減少を抑制することを特徴とする、請求項４に記載の神経線維腫症２型症候群の予防または治療用薬学組成物。
【請求項7】
前記化合物は、細胞周期を抑制して神経鞘細胞への分化を促進することを特徴とする、請求項４に記載の神経線維腫症２型症候群の予防または治療用薬学組成物。
【請求項8】
前記化合物は、ＲＫＩＰを誘導して神経鞘腫細胞の幹細胞能を抑制することを特徴とする、請求項４に記載の神経線維腫症２型症候群の予防または治療用薬学組成物。
【請求項9】
下記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物またはその立体異性体から選択された化合物を含む、神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の予防または改善用健康食品組成物：【化1】
Ｒ１は、ＮＲ５Ｒ６またはＣＮであり、Ｒ５またはＲ６は、それぞれ同一または異なり、水素または（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ２は、ハロ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、
Ｒ３またはＲ４は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、
ｎは、０～３の整数である。
【請求項10】
下記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物、その立体異性体、またはこれらの組み合わせを投与する段階を含む、神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の治療方法：【化1】
Ｒ１は、ＮＲ５Ｒ６またはＣＮであり、Ｒ５またはＲ６は、それぞれ同一または異なり、水素または（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ２は、ハロ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、
Ｒ３またはＲ４は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、
ｎは、０～３の整数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、正常なＴＧＦ－β信号は妨害せずとも、ＴＧＦ－β受容体１（ＴβＲ１）媒介ＲＫＩＰ減少を抑制する新規な化合物及びそれを含む神経線維腫症２型症候群（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＮＦ２ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
神経線維腫症（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ；ＮＦ）は、骨、軟組織、皮膚及び神経系に影響を及ぼす遺伝疾患であって、神経線維腫症１型（ＮＦ１）及び神経線維腫症２型（ＮＦ２）に分類される。神経線維腫症２型は、８番目の神経である脳神経（ｃｒａｎｉａｌ ｎｅｒｖｅ）で発生する良性腫瘍であって、難聴、耳鳴り及び均衡障害の症状が表われる疾患であり、中枢神経系内の神経鞘細胞（ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌｓ）内で発生するために、前庭神経鞘腫（ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ ｓｃｈｗａｎｎｏｍａｓ）とも呼ばれる。神経線維腫症２型が発病する平均年齢は、１８～２４歳であり、３０歳になれば、ほとんどあらゆる患者に両側性前庭神経鞘腫が発生すると知られている。また、脳神経と末梢神経、髄膜腫、脳室膜細胞腫、そして、非常に珍しく、星状細胞腫のような神経鞘腫が進行しうる。
【0003】
神経線維腫症２型の原因は、染色体２２番の長腕（２２ｑ１２．２）に位置したＮＦ２遺伝子の突然変異によって発生する。ＮＦ２遺伝子は、マーリン（ｍｅｒｌｉｎ）と呼ばれるタンパク質を構成する役割を行うが、マーリンは、神経系内の脳と脊髄の神経細胞とを取り囲んでいる神経鞘細胞から生成される。
【0004】
本発明者の以前の研究で、ＮＦ２症候群でＮＦ２とＲＫＩＰとの間の関連性を報告し、ＮＦ２の損失は、ＴβＲ２発現を減少させ、ＴβＲ１及びＴβＲ２間の不均衡を引き起こし、増加したＴβＲ１は、ＲＫＩＰをリン酸化させ、ＲＫＩＰの不安定性を促進する。
【0005】
代表的なＴＧＦ－β抑制剤であるＴＥＷ７１９７は、ＴβＲ１キナーゼ活性を抑制してＮＦ２症候群マウスモデルで神経鞘腫を抑制したが（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １７，２２７１－２２８４，２０１８）、平均発病が青少年期またはその以前であり、小児遺伝疾患に分類されるＮＦ２症候群の生理的－病理学的特徴を考慮すれば、標準ＴＧＦ－βが正常な恒常性及び発達に重要であるために、ＴＥＷ７１９７によるＴＧＦ－βの抑制は、副作用の問題を引き起こし得る。
【0006】
これにより、副作用のないＮＦ２症候群の治療剤の開発のためには、正常なＴＧＦ－β信号を妨害せずとも、ＴβＲ１媒介ＲＫＩＰ減少を抑制するＮＦ２症候群の新規な候補物質を掘り出すことが非常に重要な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、神経線維腫症２型（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｔｙｐｅ ２；ＮＦ２）症候群の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【0008】
本発明の他の目的は、神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の予防または治療用健康食品組成物を提供することである。
【0009】
本発明のさらに他の目的は、神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を果たすために、本発明は、下記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物またはその立体異性体から選択された化合物を提供する：
【0011】
【化1】
【0012】
前記化学式１において、Ｒ１は、ＮＲ５Ｒ６またはＣＮであり、Ｒ５またはＲ６は、それぞれ同一または異なり、水素または（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、Ｒ２は、ハロ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、Ｒ３またはＲ４は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、ｎは、０～３の整数である。
【0013】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物またはその立体異性体から選択された化合物を含む神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の予防または治療用薬学組成物、または神経線維腫症２型症候群の予防または改善用健康食品組成物を提供する。
【0014】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物、その立体異性体、またはこれらの組み合わせを投与する段階を含む神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の治療方法を提供する。
【発明の効果】
【0015】
本発明による化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物、その立体異性体、またはこれらの組み合わせは、既存のＴβＲ１キナーゼ抑制剤であるＴＥＷ７１９７とは異なって、正常なＴＧＦ－β信号は妨害せずとも、ＴＧＦ－β受容体１（ＴβＲ１）媒介ＲＫＩＰ減少を抑制するので、正常なＴＧＦ－β信号抑制によって引き起こされる副作用の問題を解決することができる新たな形態の神経線維腫症２型症候群の治療剤として活用されうる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ＮＦ２症候群細胞でＲＫＩＰ誘導剤をスクリーニングした結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で化合物（１０μＭ）を２４時間反応させた後、ＲＫＩＰ発現をウェスタンブロット分析したものであり、（Ｂ）は、ＨＥＩ－１９３細胞またはマウス神経鞘腫細胞で化合物（１０μＭ）を４８時間反応させた後、ＭＴＴ分析を通じて細胞生存率を測定したものである。
【図2】ＮＦ２症候群細胞で各化合物（１０μＭ）を７２時間反応させて１４個の化合物（赤色表示）がＲＫＩＰ発現を誘導するということを確認したものである。
【図3】正常線維芽細胞で各化合物（１０μＭ）を４８時間反応させた後、ＭＴＴ分析を通じて細胞生存率を測定したものである。
【図4】ＨＥＩ－１９３細胞（Ａ）、マウス神経鞘腫細胞（Ｂ）または正常線維芽細胞（Ｃ）でＮｆ－０８００１関連３９個の誘導体をそれぞれ４８時間処理した後、ＭＴＴ分析を通じて細胞生存率を測定した結果である（ＴβＲ１抑制剤－ＴＥＷ７１９７、ＳＢ４３１５４２、ＬＹ２１５７２９９；ｍＴＯＲ抑制剤－Ｒａｄ００１）。
【図5】Ｎｆ－０８００１の最適化を通じた化合物の導出結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞または正常線維芽細胞で表記された濃度の化合物を７日間処理した後、ＭＴＴ分析を通じて細胞生存率を測定したものであり、（Ｂ）は、ビーズ－結合ＧＳＴ ＲＫＩＰ組換えタンパク質をＴβＲ１－形質感染されたＨＥＫ２９３細胞溶出物及び表記された化合物と２時間共培養した後、ウェスタンブロット分析したものであり（＋：５μＭ、＋＋：１０μＭ、ＳＵＰ：上澄み液）、（Ｃ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で濃度別の化合物を２４時間反応させたものであり、（Ｄ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で１０μＭの化合物を処理し、１２時間後、ＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１２時間反応させたウェスタンブロット分析したものであり、（Ｅ）は、３ＴＰ－ルシフェラーゼベクターをＨＥＫ２９３細胞に形質感染させて３ＴＰ－ルシフェラーゼ活性を検討したものであって、２４時間後、１０μＭの化合物を処理し、１２時間後、ＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１２時間反応させたものである。
【図6】Ｎｆ－０８００１の最適化を通じた化合物の導出関連のさらに他の結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で定められた化合物を２４時間反応させたものであり、（Ｂ）は、ビーズ－結合ＧＳＴ ＲＫＩＰ組換えタンパク質をＴβＲ１－形質感染されたＨＥＫ２９３細胞溶出物及び表記された化合物と２時間共培養した後、ウェスタンブロット分析したものであり（ＳＵＰ：上澄み液）、（Ｃ）は、正常線維芽細胞で１０μＭの化合物を２４時間処理した後、免疫ブロットしたものである。
【図7】最適化されたＮｆ－０８００１は、他の信号経路を妨害しないということを確認した結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で１０μＭの化合物を反応させ、１２時間後、ＩＧＦ－１（５μｇ／ｍｌ）を添加し、細胞を１２時間培養した後、免疫ブロットしたものであり、（Ｂ）は、ＰＲＧ－Ｎ－０１の分子構造を示したものである。
【図8】ＮＦ２－欠乏状態でＰＲＧ－Ｎ－０１の選択的効果を示したものであって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞をＦＬＡＧタギングされたＴβＲ１発現ベクターで形質感染させ、２４時間後、表記された濃度の化合物を処理し、６時間後、細胞を溶出し、ＩＰ分析及びウェスタンブロット分析を行った結果であり、（Ｂ）は、ＨＥＩ－１９３細胞をＦＬＡＧタギングされたＮＦ２発現ベクターで形質感染させ、２４時間後、定められた濃度の化合物を４８時間処理した後、細胞生存率をＭＴＴ分析を通じて測定した結果であり、（Ｃ）は、ＨＥＩ－１９３細胞をＦＬＡＧタギングされたＮＦ２発現ベクターで形質感染させ、２４時間後、表記された化合物（１０μＭ）を２４時間処理した後、免疫ブロット分析を行った結果であり、（Ｄ）は、３ＴＰ－ルシフェラーゼベクターをＨＥＩ－１９３細胞に形質感染させて３ＴＰ－ルシフェラーゼ活性を検討したものであって、２４時間後、表記された化合物を処理し、１２時間後、ＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加し、１２時間反応させたものであり（ＴβＲ１抑制剤－ＴＥＷ７１９７、ＬＹ２１５７２９９）、（Ｅ）は、ＨＥＩ－１９３細胞及びマウス神経鞘腫細胞を定められた発現ベクター（ＷＴ：野生型、ＴＡ：Ｔ１０１Ａ突然変異、ＴＤ：Ｔ１０１Ｄ突然変異）で形質感染させ、２４時間後、表記された化合物（１０μＭ）を２４時間処理した後、免疫ブロット分析を行った結果である。
【図9】ＰＲＧ－Ｎ－０１の効果を検討したものであって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞でＨＡタギングされたＲＫＩＰ発現ベクターで形質感染させ、２４時間後、表記された濃度の化合物を処理し、６時間後、細胞を溶出し、ＩＰ分析及びウェスタンブロット分析を行った結果であり、（Ｂ）は、細胞にＰＲＧ－Ｎ－０１またはＴＥＷ７１９７を３６時間処理した後、免疫ブロットした結果であり、（Ｃ）は、マウス神経鞘腫細胞をＦＬＡＧタギングされたＮＦ２発現ベクターで形質感染させ、２４時間後、定められた化合物（１０μＭ）を２４時間処理し、免疫ブロット分析を行った結果であり、（Ｄ）は、マウス神経鞘腫細胞をＦＬＡＧタギングされたＮＦ２発現ベクターで形質感染させ、定められた濃度の化合物を４８時間処理した後、細胞生存率をＭＴＴ分析を通じて測定した結果であり、（Ｅ）は、ＨＥＩ－１９３細胞を表記された発現ベクター（ＷＴ：野生型、ＲＫＩＰ Ｔ１０１Ａ：突然変異）で形質感染させ、２４時間後、定められた化合物（２μＭ）を４８時間処理した後、ＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍｌ）を１２時間さらに反応させ、免疫ブロット分析を行った結果である。
【図10】ＰＲＧ－Ｎ－０１処理されたＮＦ２症候群細胞での遺伝子発現プロファイルの結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で表記された濃度のＰＲＧ－Ｎ－０１を表記された時間処理した後、マイクロアレイした結果であり、Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａは、上向き調節遺伝子セットであり、Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｂは、下向き調節遺伝子セットであり、（Ｂ－Ｃ）は、対照群と２μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１処理ＨＥＩ－１９３細胞とで異なって発現される遺伝子のＧＯ ｔｅｒｍ分析結果であり（赤い棒：脂質代謝関連工程；青い棒：細胞周期アレスト関連工程）、（Ｄ）は、脂質代謝または細胞周期関連代表的遺伝子を記載した表である。
【図11】ＰＲＧ－Ｎ－０１処理ＮＦ２症候群細胞での遺伝子発現プロファイルのさらに他の結果であって、（Ａ－Ｂ）は、対照群と２μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１を６日間処理されたＨＥＩ－１９３細胞とで異なって発現される遺伝子のＧＯ ｔｅｒｍ分析での細胞成分（ＣＣ）または分子機能（ＭＦ）を示したものであり、（Ｃ－Ｆ）は、対照群と１μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１を６日間処理されたＨＥＩ－１９３細胞とで異なって発現される遺伝子のＧＯ ｔｅｒｍ分析結果を示したものである。
【図12】ＰＲＧ－Ｎ－０１が細胞周期を抑制し、神経鞘細胞への分化を促進する結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で１０μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１を４日間処理し、細胞周期分析を行った結果であり、（Ｂ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で１０μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１を表記された時間処理し、細胞をカウンティングした結果であり、（Ｃ）は、分化を誘導するために、ＨＥＩ－１９３細胞でＰＲＧ－Ｎ－０１を７日間処理するか、ＦＬＡＧタギングされたＮＦ２発現ベクターで形質感染させたものであり、（Ｄ－Ｅ）は、定められた化合物で反応させたＨＥＩ－１９３細胞をＲＴ－ＰＣＲ（Ｄ）またはウェスタンブロット分析（Ｅ）に適用したものであり（ＴＥＷ：ＴＥＷ７１９７；ＳＢ：ＳＢ４３１５４２）、（Ｆ－Ｇ）は、ＨＥＩ－１９３細胞を抗神経鞘細胞マーカータンパク質抗体で染色し、ＦＡＣＳ分析（Ｆ）または免疫蛍光分析（Ｇ）を行った結果である。
【図13】ＰＲＧ－Ｎ－０１が細胞周期を抑制し、神経鞘細胞への分化を促進するさらに他の結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で１０μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１を４日間処理し、細胞周期分析を行った結果であり、（Ｂ）は、分化を誘導するために、ＨＥＩ－１９３細胞で１０μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１を７日間処理した後、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ファロイジンで染色したものであり、（Ｃ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で表記された濃度別にＰＲＧ－Ｎ－０１を７日間処理し、神経鞘細胞マーカー（ＭＰＺ及びＰＭＰ２２）を確認したものであり、（Ｄ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で１０μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１を７日間処理し、抗神経鞘細胞マーカータンパク質抗体で染色した結果である。
【図14】ＰＲＧ－Ｎ－０１がＲＫＩＰの発現を誘導して神経鞘腫の幹細胞能を抑制する結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で定められた濃度のＰＲＧ－Ｎ－０１またはＴＥＷ７１９７を４日間処理した後、ウェスタンブロットした結果であり、（Ｂ）は、ＨＥＩ－１９３細胞または神経鞘腫細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で定められた化合物（１０μＭ）で反応させた後、１０日目の腫瘍球イメージをキャプチャーしたものであり、（Ｃ－Ｄ）は、ＨＥＩ－１９３細胞または神経鞘腫細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で定められた化合物（１０μＭ）で反応させた後、１０日目の腫瘍球を溶解させ、表記された抗体で免疫ブロットした結果であり、（Ｅ）は、腫瘍球のウェスタンブロット分析結果であり、（Ｆ）は、核流出抑制のために、Ｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｂ（２ｎｇ／ｍｌ）をＨＥＩ－１９３細胞に処理し、６時間後、１０μＭの定められた化合物を添加し、２４時間培養し、免疫ブロットしたものであり、（Ｇ）は、プロテアソーム分解抑制のために、ＭＧ１３２（５μＭ）をＨＥＩ－１９３細胞に処理し、６時間後、１０μＭの表記された化合物を添加し、２４時間培養し、免疫ブロットしたものである。
【図15】ＰＲＧ－Ｎ－０１がＲＫＩＰを誘導して神経鞘腫の幹細胞能を抑制するさらに他の結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で表記された化合物（１０μＭ）で表記された日付間処理した後、４日目の腫瘍球イメージをキャプチャーしたものであり、（Ｂ）は、ＨＥＩ－１９３細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で表記された化合物（１０μＭ）で処理した後、１０日目の腫瘍球を溶解させ、表記された抗体で免疫ブロットした結果であり、（Ｃ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で表記された化合物（２μＭ）を２４時間処理し、抗ＳＯＸ２抗体で染色したものであり、（Ｄ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で表記された化合物（２μＭ）を２４時間処理し、細胞分画化後、ウェスタンブロットした結果であり、（Ｅ）は、ＨＥＩ－１９３細胞を表記された発現ベクターで（ＷＴ：野生型、ＴＡ：ＲＫＩＰ Ｔ１０１Ａ突然変異、ＴＤ：ＲＫＩＰ Ｔ１０１Ｄ突然変異）形質感染させ、２４時間後、表記された化合物（１０μＭ）を２４時間処理した後、免疫ブロットした結果であり、（Ｆ）は、ＨＥＩ－１９３細胞を表記されたｓｉＲＮＡで形質感染させ、２４時間後、表記された化合物（２μＭ）を２４時間処理した後、免疫ブロットした結果である。
【図16】ＲＫＩＰが神経鞘腫細胞でＳＯＸ２減少及びＴＧＦ－β信号に重要な因子であるということを糾明した結果であって、（Ａ）は、ＨＥＩ－１９３細胞で１０μＭのＰＲＧ－Ｎ－０１を処理し、１２時間後、ＴＧＦ－β１（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、表記された時間反応させ、免疫ブロット分析を行った結果であり、（Ｂ）は、ＨＥＩ－１９３細胞を４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、抗ホスホ－ＳＭＡＤ２／３抗体で染色したものであり、（Ｃ－Ｄ）は、ＨＥＩ－１９３細胞を表記された発現ベクターで形質感染させ、１２時間後、表記された濃度のＴＧＦ－β１を添加し、表記された時間反応させ、免疫ブロット分析を行った結果である。
【図17】ＰＲＧ－Ｎ－０１のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果を示したものであって、（Ａ）は、腫瘍体積が３００ｍｍ３に達する時、マウスにキャリアまたはＰＲＧ－Ｎ－０１（２０ｍｇ／ｋｇ）を５週間（週当たり３回）投与し、投与５週の腫瘍イメージを示したものであり、（Ｂ）は、投与５週後、マウスを切開し、分離した腫瘍の重量を定量したものであり、（Ｃ）は、毎週腫瘍体積を測定したものであり、（Ｄ－Ｅ）は、分離した腫瘍からタンパク質及びｍＲＮＡを抽出して免疫ブロット及びＲＴ－ＰＣＲを行った結果である。
【図18】ＰＲＧ－Ｎ－０１のさらに他のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果を示したものであって、（Ａ）は、ＰＲＧ－Ｎ－０１投与５週の時、腫瘍移植されたマウスのイメージを示したものであり、（Ｂ）は、ＰＲＧ－Ｎ－０１の毒性検討のために高濃度のＰＲＧ－Ｎ－０１（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔投与した後、マウス重量を測定したものである。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0018】
本発明者は、正常なＴＧＦ－β信号を妨害せずとも、ＴβＲ１媒介ＲＫＩＰ減少を抑制するＮＦ２症候群の治療のための新規な候補物質を掘り出すことを目標として鋭意努力した結果、新たな化合物であるＰＲＧ－Ｎ－０１がＮＦ２症候群細胞の分化を促進し、正常なＴＧＦ－β信号の妨害なしに同種移植腫瘍モデルで腫瘍成長を抑制することを確認することにより、本発明を完成した。
【0019】
本発明は、下記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物またはその立体異性体から選択された化合物を提供する：
【0020】
【化1】
【0021】
前記化学式１において、
【0022】
Ｒ１は、ＮＲ５Ｒ６またはＣＮであり、Ｒ５またはＲ６は、それぞれ同一または異なり、水素または（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、Ｒ２は、ハロ、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、Ｒ３またはＲ４は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、ｎは、０～３の整数である。
【0023】
望ましくは、前記化学式１で表される化合物で、Ｒ１は、ＮＨ２またはＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ５またはＲ６は、それぞれ同一または異なり、（Ｃ１～Ｃ２）アルキルであり、Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシであり、Ｒ３またはＲ４は、それぞれ同一または異なり、（Ｃ１～Ｃ４）アルキルであり、ｎは、１～２の整数である。
【0024】
より望ましくは、前記化学式１で表される化合物で、Ｒ１は、ＮＨ２であり、Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ２）アルコキシであり、Ｒ３及びＲ４は、（Ｃ１～Ｃ２）アルキルであり、ｎは、１～２の整数である。
【0025】
さらに望ましくは、前記化合物は、次の化学式２の化合物（ＰＲＧ－Ｎ－０１）である。
【0026】
【化2】
【0027】
本発明は、前記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物またはその立体異性体から選択された化合物を含む神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0028】
本発明による化合物は、ＴＧＦ－β受容体１（ＴβＲ１）とＲＫＩＰとの相互作用を抑制することができ、特に、正常なＴＧＦ－β信号は妨害せずとも、ＴＧＦ－β受容体１（ＴβＲ１）媒介ＲＫＩＰ減少を抑制することができる。
【0029】
また、本発明による化合物は、細胞周期を抑制して神経鞘細胞への分化を促進することができ、ＲＫＩＰを誘導して神経鞘腫細胞の幹細胞能を抑制することができる。
【0030】
本発明において、前記薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、セシウム塩、アミニウム（ａｍｉｎｉｕｍ）塩、アンモニウム塩、トリエチルアミニウム塩、及びピリジニウム塩からなる群から選択された１つ以上の塩基性塩であるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【0031】
また、前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸、臭素酸、硫酸、亜硫酸、リン酸、クエン酸、酢酸、マイレン酸、フマル酸、グルコサン、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マロン酸、グルタル酸、酢酸、グリコール酸、コハク酸、酒石酸、４－トルエンスルホン酸、ガラクツロン酸、エンボン酸、グルタミン酸、クエン酸、及びアスパラギン酸からなる群から選択された１つ以上の酸性塩であるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【0032】
本発明の薬学組成物は、投与のために、前記記載した成分以外に薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含みうる。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。
【0033】
本発明の薬学組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤型、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。詳細には、剤形化する場合、通常使う充填剤、重量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固型製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などを含むが、これらに限定されるものではない。このような固型製剤は、前記有効成分の以外に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われる。経口のための液状物、流動パラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを添加して調剤される。非経口投与のための製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤を含む。非水性溶剤及び懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール、マクロゴール、トウイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
【0034】
本発明の薬学組成物は、経口型または非経口型製剤で製造することができ、経口、静脈、脳室内、真皮内、筋肉内、腹膜内、鼻腔または硬膜外（ｅｉｄｕｒａｌ）経路で投与することができるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【0035】
本発明の薬学組成物の適した投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、時間によって異なるが、当業者によって適切に選択されうるので、前記組成物の一日投与量は、望ましくは、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇであり、必要に応じて一日１回ないし数回に分けて投与することができる。
【0036】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物またはその立体異性体から選択された化合物を含む神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の予防または改善用健康食品組成物を提供する。
【0037】
前記健康食品組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含有することができる。その他に天然果汁、合成果汁及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。また、健康機能食品組成物は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料水、お茶、機能水、ドリンク剤、アルコール及びビタミン複合剤のうち何れか１つの形態である。
【0038】
また、前記健康食品組成物は、食品添加物をさらに含むことができ、食品添加物としての適否は、他の規定がない限り、食品医薬品安全処に承認された食品添加物公典の総則及び一般試験法などによって当該品目に関する規格及び基準によって判定する。
【0039】
前記食品添加物公典に収載された品目として、例えば、ケトン類、グリシン、クエン酸カリウム、ニコチン酸、ケイ皮酸などの化学的合成品、紺色素、甘草抽出物、結晶セルロース、コウリャン色素、グアーガムなどの天然添加物、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム製剤、麺類添加アルカリ剤、保存料製剤、タール色素製剤などの混合製剤類などが挙げられる。
【0040】
この際、健康食品組成物を製造する過程で食品に添加される本発明による組成物は、必要に応じて、その含量を適切に加減することができる。
【0041】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒化物、その立体異性体、またはこれらの組み合わせを投与する段階を含む神経線維腫症２型（ＮＦ２）症候群の治療方法を提供する。
【0042】
以下、実施例及び実験例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例及び実験例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これらの実施例及び実験例によって制限されないということは当業者にとって自明である。
【0043】
[反１]
【0044】
合成例１：ＮＦ－０８００１の合成
【0045】
１．２－（４－（２－（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）アセトニトリル（ａ）の合成
【0046】
ＴＨＦに２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトニトリル（１当量）とＰＰｈ３（１．３当量）とを混合した溶液にアルゴン大気下でアゾジカルボン酸ジイソプロピル（１．５当量）と２－（ジエチルアミノ）エタン－１－オル（１．３当量；３００ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）とを０℃で添加した。３時間常温で撹拌した後、水で反応を中止させた後、ＥｔＯＡｃで抽出した。抽出して得られた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。残渣をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ＝１：９）によって精製して、黄色オイル化合物ａ［５３０ｍｇ（９９％）］を収得した。
【0047】
２．１－（４－（ベンジルオキシ）ベンジル）－４－（４－（２－（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－５－アミン（ｂ）の合成
【0048】
ＤＭＳＯに２－（４－（２－ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）アセトニトリル（ａ）［１当量；１１８ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ］と１－（アジドメチル）－４－（ベンジルオキシ）ベンゼン［１当量；９８．８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ］とを混合した溶液にアルゴン大気下に常温でｔ－ＢｕＯＫ（０．２５当量；ＴＨＦに溶解された１．０Ｍ）を添加した。同じ温度で６時間撹拌した後、ＮＨ４Ｃｌで反応を中止させた後、ＥｔＯＡｃで抽出した。抽出して得られた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。残渣をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝１：１０）によって精製して、アイボリー色固体化合物ｂ［１．１２ｇ（７０％）］を収得した。
【0049】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ７．５４（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．３８（ｍ、４Ｈ）、７．３２（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、７．２０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、６．９５（ｍ、４Ｈ）、５．３６（ｓ、２Ｈ）、５．０３（ｓ、２Ｈ）、４．１０（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．１Ｈｚ）、３．６４（ｓ、２Ｈ）、２．９３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．１Ｈｚ）、２．７０（ｑ、４Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．１０（ｔ、６Ｈ、７．１Ｈｚ）；
【0050】
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１５９．０、１５７．９、１３６．８、１３６．７、１３１．６、１２８．９、１２８．７、１２８．２、１２７．６、１２７．２、１２６．６、１２４．４、１１５．６、１１５．１、７０．２、６６．２、５１．７、５０．４、４７．８、１１．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ３４Ｎ５Ｏ２ ４７２．２７０７、ｆｏｕｎｄ ４７２．２７１３。
【0051】
３．ｔｅｒｔ－ブチル（１－（４－（ベンジルオキシ）ベンジル）－４－（４－（２－ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－５－イル）カーバメート［ＮＦ－０８００１］の合成
【0052】
ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍｌ）に１－（４－（ベンジルオキシ）ベンジル）－４－（４－（２－（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－５－アミン（ｂ）を溶解させた溶液に常温でＴＥＡ（７３．０μＬ、０．５２ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ２Ｏ（６０．２μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３．０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を添加した。同じ温度で３日間撹拌した後、水で反応を中止させた後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。抽出して得られた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。残渣をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ＝１：１０）によって精製して、化合物［ＮＦ－０８００１］［１５．０ｍｇ（１０％）］を収得した。
【0053】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ７．６１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．３８（ｍ、５Ｈ）、７．３１（ｍ、１Ｈ）、７．２６（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）、６．９２（ｍ、４Ｈ）、５．３１（ｓ、２Ｈ）、５．０２（ｓ、２Ｈ）、４．０７（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．２Ｈｚ）、２．８９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．２Ｈｚ）、２．６６（ｑ、４Ｈ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、１．２５（ｓ、１Ｈ）、１．１６（ｓ、９Ｈ）、１．０７（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）；
【0054】
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１５９．１、１５９．０、１４８．７、１４１．０、１３６．７、１３１．２、１２９．８、１２８．８、１２８．２、１２７．５、１２７．１、１２６．２、１２２．６、１１５．３、１１５．０、８４．７、７０．１、６６．５、５１．６、５１．４、４７．９、２７．６、１１．７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３３Ｈ４２Ｎ５Ｏ４ ５７２．３２３１、ｆｏｕｎｄ ５７２．３２３３。
【0055】
合成例２：ＰＲＧ－Ｎ－０１の合成
【0056】
４－（４－（２－（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）－１－（４－エトキシベンジル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－５－アミノ［ＰＲＧ－Ｎ－０１］の合成
【0057】
ＤＭＳＯに２－（４－（２－ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）アセトニトリル（ａ）［１当量；６５９ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ］と１－（アジドメチル）－４－エトキシベンゼン［１当量；８６４ｍｇ、３．７２ｍｍｏｌ］とを混合した溶液にアルゴン大気下に常温でｔ－ＢｕＯＫ（０．２５当量；ＴＨＦに溶解された１．０Ｍ）を添加した。同じ温度で６時間撹拌した後、ＮＨ４Ｃｌで反応を中止させた後、ＥｔＯＡｃで抽出した。抽出して得られた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。残渣をシリカゲル上フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２＝１：１０）によって精製して、アイボリー色固体化合物［ＰＲＧ－Ｎ－０１］［１．１２ｇ（７０％）］を収得した。
【0058】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ７．５３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．９Ｈｚ）、７．１９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、６．９４（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、６．８７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、５．３６（ｓ、２Ｈ）、４．０７（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．２Ｈｚ）、３．７７（ｓ、３Ｈ）、３．６４（ｓ、２Ｈ）、２．８９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．２Ｈｚ）、２．６６（ｑ、４Ｈ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、１．０７（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）；
【0059】
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１５９．８、１５８．０、１３６．７、１３１．６、１２８．９、１２７．２、１２６．３、１２４．３、１１５．１、１１４．７、６６．５、５５．４、５１．７、５０．４、４７．９、１１．８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ３０Ｎ５Ｏ２ ３９６．２３９４、ｆｏｕｎｄ ３９６．２４０２。
【0060】
実施例１：細胞株及びマウス準備
【0061】
１．細胞株準備
【0062】
ＨＥＫ２９３細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。ヒト神経鞘腫細胞株であるＨＥＩ－１９３（ＮＦ２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）は、Ｄｒ．Ｚａｄｅｈｇ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）から提供された。ＮＦ２ｆｌｏｘマウスから由来したマウス神経鞘細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ，Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｒｅ－媒介欠乏に適用した後、細胞を全長マーリンアイソフォーム１（Ｍｅｒｌｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ １）または空きベクターのうち何れか１つでコーディングされたｐＭＳＣＶ－ｈｙｇｒｏレトロウイルスｒｅｓｃｕｅ構造体で形質導入させた（それぞれＭＳｃｈｗ－ＷＴとＭｓｃｈｗ－ＫＯと名付ける）。このような細胞株は、Ｄｒｇｒｅｅｒ Ｐ（Ｑｕｅｅｎ’ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡＮＡＤＡ）から提供された。正常線維芽細胞（ＧＭ０００３８、９－ｙｅａｒ－ｏｌｄ ｆｅｍａｌｅ Ｎ９）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から提供されて１５％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）と抗生剤なしに２ｍＭグルタミンで補強されたＥＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）で培養された。
【0063】
あらゆる細胞は、３７℃で５％ ＣＯ２加湿インキュベーターで保持させた。ＨＥＩ－１９３、ＨＥＫ２９３及びマウス神経鞘細胞は、１０％ ＦＢＳ及び１％抗生剤が含まれた液状ＤＭＥＭ培地を用いて培養した。本実験で用いられたあらゆる細胞の形状と成長特性は、公開された情報と比較して真偽有無を確認した。
【0064】
２．マウス準備
【0065】
動物実験のあらゆる実験手続きは、大韓民国の釜山大学校動物管理委員会の承認を受けた。ＦＶＢ／ＮＪマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから提供された。実験前、あらゆるマウスは、温度及び光調節の条件（２０－２３℃、１２時間／１２時間の明暗サイクル）下で保持させ、滅菌した食べ物及び水を自在に提供した。
【0066】
実施例２：ベクター及び形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ｓｉＲＮＡ及び抗体準備
【0067】
１．ベクター及び形質感染
【0068】
ｐＣＭＶ ＲＫＩＰ－ＨＡは、Ｋｅｕｍｇ（Ｄａｖｉｄ Ｇｅｆｆｅｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から提供された。ｐＣＭＶ ＲＫＩＰ－Ｔ１０１Ａ－ＨＡ及びｐＣＭＶ ＲＫＩＰ－Ｔ１０１Ｄ－ＨＡは、ファン・ジヒ（Ｐｕｓａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）博士によって製造された。ｐｃＤＮＡ３ ＮＦ２－ＦＬＡＧ、ｐＲＫ５ ＴＧＦベータ１型受容体－ＦＬＡＧ及びＴＧＦベータ２型受容体－ＨＡは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）から提供された。形質感染は、このようなベクターの哺乳類発現のために、Ｊｅｔｐｅｉ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【0069】
すなわち、細胞を１２ウェルプレート上で２ｘ１０５細胞／ｗｅｌｌの密度で分注し、形質感染前、一晩中培養した。ベクター（１．５μｇ）を１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液に溶解された１．５μＬのＪｅｔｐｅｉ試薬と混合した。混合物は、室温で１５分間反応させた後、細胞に添加した。３時間後、無血清培地を１０％ ＦＢＳが含まれた培地に置き換えた。
【0070】
２．ｓｉＲＮＡ準備
【0071】
生体外遺伝子ノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）のために、標的タンパク質に対するｓｉＲＮＡを製造した（Ｃｏｓｍｏ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）。ｓｉ－ＲＫＩＰの配列は、［ＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＧＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＧＡＡＡＴＧＣＴＧＧＴＧ］であった。ｓｉＲＮＡの形質感染のために、ＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ(R)形質感染試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を使用した。すなわち、細胞を１２ウェルプレート上で２ｘ１０５細胞／ｗｅｌｌの密度で分注し、形質感染前、一晩中培養した。総１．５ｐｍｏｌｅのｓｉＲＮＡ（２１ｎｇ）二本鎖を血清なしに１００μＬの培地で４μＬのＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ(R)形質感染試薬と混合した。混合物は、室温で１５分間反応させてＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ(R)／ｓｉＲＮＡ複合体を形成した。このような複合体を細胞に添加し、４時間さらに反応させた後、無血清培地を１０％ ＦＢＳが含まれた培地に置き換えた。
【0072】
３．抗体
【0073】
ＲＫＩＰ（１：２０００免疫ブロット用途、ａｂ７６５８２）、ＳＯＸ１０（１：１０００免疫ブロット用途、１：２００免疫染色用途、ａｂ１５５２７９）、Ｍｙｅｌｉｎ ＰＬＰ（１：５００免疫ブロット用途、１：３００免疫染色用途、ａｂ１５５２７９）、ＭＢＰ（１：５００免疫ブロット用途、１：３００免疫染色用途、１：２００ ＦＡＣＳ用途、ａｂ６２６３１）、ＭＰＺ（１：５００免疫染色用途、ａｂ３１８５１）、ＧＦＡＰ（１：１００ ＦＡＣＳ用途、１：３００免疫染色用途、ａｂ２７０２７０）、ＴβＲ１（１：５００免疫ブロット用途、ａｂ３１０１３）及びＴｅｎａｓｃｉｎ Ｃ（１：１０００免疫ブロット用途、ａｃ１０８９３０）に対する抗体は、それぞれＡｂｃａｍから購入した。
【0074】
ＳＯＸ２（１：１０００免疫ブロット用途、１：３００免疫染色用途、３５７９）、Ｏｃｔ－４Ａ（１：１０００免疫ブロット用途、２８４０）、ＮＡＮＯＧ（１：１０００免疫ブロット用途、４９０３）、ｃ－Ｍｙｃ（１：１０００免疫ブロット用途、５６０５）、ｐ－ＳＭＡＤ２／３（１：１０００免疫ブロット用途、８８２８）、Ｅｒｋ（１：１０００免疫ブロット用途、９１０２）、ｐ－Ｅｒｋ（１：１０００免疫ブロット用途、９１０１）、ｐ－ＡＫＴ Ｓ４７３（１：１０００免疫ブロット用途、９２７１）、ＧＦＡＰ（１：５００免疫ブロット用途、１：３００免疫染色用途、３６７０）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。Ａｎｔｉ－β－Ａｃｔｉｎ（１：３０００免疫ブロット用途、６６００９－１－Ｉｇ）とＨＡ（１：１０００免疫ブロット用途、５１０６４－２－ＡＰ）に対する抗体は、それぞれＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈから購入した。
【0075】
Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ（１：２０００、Ｆ１８０４）抗体は、Ｓｉｇｍａから購入し、ＧＳＴ（１：１０００免疫ブロット用途、ｓｃ－１３８）特異的抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、Ａｎｔｉ－ＴβＲ２（１：５００免疫ブロット用途、ｂｓ－０１１７Ｒ）抗体は、Ｂｉｏｓｓから購入した。
【0076】
４．試薬準備
【0077】
シリカ（Ｓｉｌｉｃａ、Ｓ５６３１、二酸化ケイ素）、ＴβＲ１キナーゼ抑制剤（ＳＢ４３１５４２及びＬＹ２１５７２９９）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）から購入した。Ｐｒｏｃｒｉｎｅ ＴＧＦ－β１は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。Ｎ－（（４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）－２－フルオロアニリン（ＴＥＷ７１９７）は、キム・ソンス博士（ＣＨＡ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｎｇｎａｍ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から提供された。前記ＴＥＷ７１９７は、以前の論文（Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１４ Ｍａｙ ２２；５７（１０）：４２１３－３８）を参考にして合成された。
【0078】
［ＴＥＷ７１９７構造］
【0079】
実施例３：ＲＴ－ＰＣＲ分析
【0080】
ＲＴ－ＰＣＲのために、総細胞ＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。遺伝子発現分析は、ＭＭＬＶ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）とランダムヘキサマーとを用いて総ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて行った。ゲノムＤＮＡのＰＣＲは、ＤｉａＳｔａｒ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳｏｌＧｅｎｔ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いて行い、遺伝子発現分析は、次の特異的プリマーを用いて行った：
【0081】
ｈＳＯＸ２（Ｆｏｒｗａｒｄ）５’－ＴＣＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＧＧ－３’
【0082】
ｈＳＯＸ２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＡＣＡＴＧＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＧ－３’
【0083】
ｈＳＯＸ１０（Ｆｏｒｗａｒｄ）５’－ＣＡＴＧＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＴＧＧＣ－３’
【0084】
ｈＳＯＸ１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＴＣＡＧＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧ－３’
【0085】
ｈＭＢＰ（Ｆｏｒｗａｒｄ）５’－ＣＡＡＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＴＧＣＣ－３’
【0086】
ｈＭＢＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＴＴＴＡＴＡＧＴＣＧＧＡＣＧＣＴＣＴＧＣＣ－３’
【0087】
ｈＭＰＺ（Ｆｏｒｗａｒｄ）５’－ＣＡＡＣＣＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＧＴＧ－３’
【0088】
ｈＭＰＺ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＣＡＣＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣ－３’
【0089】
ｈＰＭＰ２２（Ｆｏｒｗａｒｄ）５’－ＧＣＡＡＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣ－３’
【0090】
ｈＰＭＰ２２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＣＧＡＡＡＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴＡＡＴＣＣＧ－３’
【0091】
ｍＳＯＸ２（Ｆｏｒｗａｒｄ）５’－ＡＧＧＡＴＡＡＧＴＡＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧ－３’
【0092】
ｍＳＯＸ２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＴＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＴＡＧＧＴＧＧＧ－３’
【0093】
ｍＳＯＸ１０（Ｆｏｒｗａｒｄ）５’－ＡＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡＡＣＣＴＣＧＧＣ－３’
【0094】
ｍＳＯＸ１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＧＴＴＧＧＡＣＡＴＴＡＣＣＴＣＧＴＧＧＣ－３’
【0095】
ｍＭＢＰ（Ｆｏｒｗａｒｄ）５－’ＴＴＣＴＴＴＡＧＣＧＧＴＧＡＣＡＧＧＧＧ－３’
【0096】
ｍＭＢＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＴＡＡＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣ－３’
【0097】
ｍＭＰＺ（Ｆｏｒｗａｒｄ）５－’ＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＧＡＡ－３’
【0098】
ｍＭＰＺ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＡＧＧＴＴＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＴＡＧＴＧＧ－３’
【0099】
ｍＰＭＰ２２（Ｆｏｒｗａｒｄ）５’－ＣＧＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡ－３’
【0100】
ｍＰＭＰ２２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）５’－ＧＣＣＴＴＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＣ－３’
【0101】
実施例４：タンパク質－タンパク質間の相互作用分析
【0102】
タンパク質－タンパク質間の相互作用分析のために、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ－プルダウン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）－ｐｕｌｌ ｄａｗｎ）分析を行った。ｇＳＴプルダウンのために、アガロースビーズが接合されたＧＳＴ ＲＫＩＰ組換えタンパク質をＰＢＳ緩衝液で４℃で１時間ＦＬＡＧ－タグＴβＲ１－形質感染ＨＥＫ ２９３細胞溶出物と反応させた。免疫沈降（ＩＰ）分析は、ＰＢＳ緩衝液でＦＬＡＧ－タグＴβＲ１－またはＨＡ－タグＲＫＩＰ－形質感染ＨＥＩ－１９３細胞溶出物と反応させた。総溶出物は、４℃で２時間適切な１次抗体と反応させ、２時間アガロスビーズ接合タンパク質Ａ／Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）と反応させた。遠心分離後、沈殿物をＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析に利用した。
【0103】
実施例５：ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析
【0104】
ＲＩＰＡ緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、０．１％ ＳＤＳ及び１０％デオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）］を用いて細胞を集め、溶解させて細胞信号を分析した。サンプルでタンパク質の濃度は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）のタンパク質分析キットとＢＳＡ標準物とを用いて測定した。サンプル（レーン当たり２０μｇタンパク質）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ）で分離した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，ＭＡ，ＵＳＡ）に移し、３％脱脂乳を含むＴＢＳ－Ｔ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｂａｓｅｄ ｂｕｆｆｅｒ）で室温１時間培養した後、４℃、一晩中ＴＢＳ－Ｔで１次抗体と反応させた。その後、メンブレンを洗浄し、ＴＢＳ－Ｔで室温２時間ＨＲＰが接合された２次抗体［ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ及びｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）］と反応させた。ブロッ分析は、ＥＣＬ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）によるＨＲＰ－接合２次抗体を用いて検出した。
【0105】
実施例６：免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
【0106】
細胞をカバーグラス（ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ）に接種し、ＰＢＳで洗浄し、室温で３０分間４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した後、室温で５分間０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過化した。ブロッキング緩衝液［ＰＢＳで希釈させた３％ｇｏａｔ血清］で１時間処理した後、４℃で一晩中ブロッキング緩衝液で指定された抗体で反応させた。最後に、細胞をＦＩＴＣが接合されるか、ローダミンが接合された２次抗体と共に４℃で７時間反応させた。核は、ＤＡＰＩで室温で１０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、カバーグラスをマウント溶液（Ｈ－５５０１、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）でマウントさせ、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じて免疫蛍光信号を検出した。
【0107】
実施例７：ＭＴＴ分析法
【0108】
細胞生存率を測定するために、ＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）分析法を利用した。すなわち、細胞を９６ウェルプレート上に分注し、定められた時間、指定された化学物質を処理した。培地を除去した後、ＰＢＳに溶解させた２００μＬのＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。その後、プレートを３７℃で４時間培養し、ＭＴＴ溶液を除去し、沈殿された物質を溶液（ＤＭＳＯ：エタノール＝１：１）を用いて溶解させた後、形成されたホルマザン染料生成物の量をＥＬＩＳＡ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて５６０ｎｍで吸光度を測定して定量化した。
【0109】
実施例８：同種移植腫瘍成長分析、腫瘍球体形成分析及び流細胞分析
【0110】
同種移植のために、ＦＶＢ／ＮＪマウス（８週齢）の皮下に１～１０７個のマウス神経鞘腫細胞を接種した。腫瘍を有するマウスに５週間（週当たり３回）腹腔内にキャリア（ｎ＝８）またはＰＲＧ－Ｎ－０１（２０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝８）を注射した。毎週腫瘍体積と体重とを測定した。各グループの実験終了後、マウスを切開し、腫瘍組織を分離した。
【0111】
腫瘍球体形成分析のために、Ｈｅｉ－１９３またはマウス神経鞘腫細胞（３ｘ１０６細胞／プレート）をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（２％ Ｂ２７及び４０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦで補強される）で培養し、指定された日の間、コーティングされていないプレートで指定された化学物質を添加した。
【0112】
また、流細胞分析のために、細胞を６ウェルプレートに分注し、ＤＭＳＯ（対照群）、ＰＲＧ－Ｎ－０１（５μＭ）またはＴＥＷ７１９７（５μＭ）でそれぞれ反応させた。４日後、細胞を７０％エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで標識した。このようなサンプルは、細胞周期分析のために、ＦＡＣＳによって分析した。表記された濃度のＤＭＳＯ（対照群）、ＰＲＧ－Ｎ－０１またはＴＥＷ７１９７処理７日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、指定された抗体で染色した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で最小１０，０００個の細胞を分析した。
【0113】
実施例９：ルシフェラーゼ分析（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ）
【0114】
ＴＧＦ－β信号の転写活性を評価するために、３ＴＰ－Ｌｕｃベクターを細胞内に２４時間形質感染させ、細胞を表記された化学物質で処理した。洗浄緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で洗浄した後、細胞を溶出緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で溶解させた。ルシフェラーゼ活性は、ｌｕｍｉｎｉｍｅｔｅｒ（ＭｉｃｒｏＤｉｇｉｔａｌ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ，Ｋｏｒｅａ）を用いて測定した。
【0115】
実施例１０：細胞増殖
【0116】
６ウェルプレート上に細胞を２ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを分注して細胞成長曲線を分析した。定められた日の後、細胞にトリプシン処理し、単一細胞で解離した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ流細胞分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて最小１０，０００個の細胞をカウンティングした。
【0117】
実施例１１：マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析
【0118】
総ＲＮＡ（５００ｎｇ）をＲＮＡｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出した。ＲＮＡ標識、ヒト遺伝子１．０ ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で混成化及びデータ分析をＤＮＡ Ｌｉｎｋ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）によって行った。各細胞株で最小２倍の差を示す遺伝子を以後分析のために選別した。
【0119】
実験例１：ＮＦ２症候群細胞株でＲＫＩＰ誘導化合物のスクリーニング
【0120】
ＮＦ２細胞でＲＫＩＰ減少が明確に知られているために（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １７，２２７１－２２８４，２０１８）、まず、２６０個の新規な合成化合物を処理した後、ヒトＮＦ２症候群細胞株であるＨＥＩ－１９３でＲＫＩＰ発現を測定した。ウェスタンブロットを通じて１４個の化合物がＨＥＩ－１９３細胞でＲＫＩＰ発現を誘導することを確認した（図１のＡ及び図２）。そのうちから、４個の化合物がＴβＲ１キナーゼ抑制剤と知られているＴＥＷ７１９７と類似にＨＥＩ－１９３細胞とマウスＮＦ２症候群細胞とで細胞生存率を抑制した（図１のＢ）。そして、ＴβＲ１とＲＫＩＰとの結合抑制の効果を有する化合物でＳＲ０８００２（Ｎｆ－０８００１と再名付ける）を探した。
【0121】
［ＳＲ０８００２（Ｎｆ－０８００１）構造］
【0122】
実験例２：Ｎｆ－０８００１の最適化
【0123】
ＲＫＩＰ誘導及びＮＦ２症候群細胞で抗増殖効果にも拘らず、図３に示すように、Ｎｆ－０８００１は、正常細胞毒性を示してＮｆ－０８００１に対する最適化（変形）が必要であった。
【0124】
したがって、Ｎｆ－０８００１に対する３９個の誘導体を合成し、ＮＦ２症候群細胞及び正常線維芽細胞での細胞増殖効果を検討し（図４）、このような結果から、２個の化合物（ＰＲＧ－Ｎ－０１及びＮｆ１８０１１）が正常線維芽細胞で毒性を引き起こせず、ＮＦ２症候群細胞に対する明確な抗増殖効果を示すことを確認した（図５のＡ）。また、これらの化合物は、ＲＫＩＰ発現を誘導し、Ｅｒｋ活性化を抑制した（図６のＡ）。
【0125】
そして、ＴβＲ１及びＲＫＩＰ間の相互作用に対する効果を検討した結果、ＰＲＧ－Ｎ－０１及びＮｆ１８０１１を含む４個の化合物が濃度依存的にＴβＲ１及びＲＫＩＰ間の相互作用を抑制し（図５のＢ）、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、低い濃度でも抑制効果を示した（図６のＢ）。そして、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、ヒト及びマウスＮＦ２症候群細胞株でＲＫＩＰ発現を増加させた（図５のＣ及び図６のＣ）。
【0126】
一方、ＴＥＷ７１９７は、ＴＧＦ－β信号抑制によって薬物候補物質から排除されたために、Ｓｍａｄ２／３リン酸化及び３ＴＰ－ルシフェラーゼ分析を通じてＴＧＦ－β信号に対する化合物の効果を検討した。ＴＥＷ７１９７とは異なって、本化合物は、ＴＧＦ－βと反応してＳｍａｄ２／３リン酸化及びルシフェラーゼ活性の増加を妨害しなかった（図５のＤ及び図５のＥ）。また、本化合物は、ＨＥＩ－１９３でＩＧＦ－１誘導ＡＫＴ活性化のような他の信号カスケードを変化させなかった（図７のＡ）。
【0127】
このような化合物スクリーニング及び最適化の結果から、ＰＲＧ－Ｎ－０１を以後分析のための候補物質として選択した（図７のＢ）。
【0128】
実験例３：ＮＦ２－欠乏状態でＰＲＧ－Ｎ－０１の効果
【0129】
ＰＲＧ－Ｎ－０１の効果を再確認するために、ＴβＲ１及びＲＫＩＰ間の相互作用を検討した。ＰＲＧ－Ｎ－０１は、容量依存的にこれらの結合を抑制した（図８のＡ及び図９のＡ）。ＴβＲ１及びＲＫＩＰ間の相互作用は、ＮＦ２またはＴβＲ２欠乏状態で発生するために、ＮＦ２の回復がＲＫＩＰ誘導、Ｅｒｋ抑制及び抗増殖効果のような化学的効果を無くすと予想し、ＰＲＧ－Ｎ－０１によって実際マウス神経鞘腫のみでＲＫＩＰ誘導及びｐ－Ｅｒｋ抑制が観察され、正常線維芽細胞では観察されていない（図９のＢ）。また、図８のＢと図８のＣとのように、ＮＦ２－形質感染ＨＥＩ－１９３細胞と、図９のＣ及び図９のＤのように、ＮＦ２－形質感染マウス神経鞘腫細胞で化学的効果（抗増殖効果、ＲＫＩＰ誘導及びｐ－Ｅｒｋ抑制）を観察することができなかった。もちろん、ＮＦ２形質感染自体がＲＫＩＰ発現を増加させた（図８のＣ及び図９のＣ）。そして、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、高濃度でもＴＧＦ－β信号を抑制しなかった（図８のＤ）。
【0130】
ＰＲＧ－Ｎ－０１のより詳細な作用機転を調査するために、ＲＫＩＰ突然変異に対するＰＲＧ－Ｎ－０１の効果を検討した。以前の研究でＴβＲ１キナーゼによってスレオニン１０１部位でのリン酸化がＲＫＩＰ不安定化を促進すると確認した（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １７，２２７１－２２８４，２０１８）。ＰＲＧ－Ｎ－０１は、野生型ＲＫＩＰ発現を誘導するとしても、２種のＲＫＩＰ突然変異（ＲＫＩＰ Ｔ１０１Ａ；安定した形態、ＲＫＩＰ Ｔ１０１Ｄ；不安定な形態）の発現を変化させなかった（図８のＥ）。このような結果から、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、ＴβＲ１－媒介不安定化からＲＫＩＰを保護するということが分かる。
【0131】
実験例４：ＰＲＧ－Ｎ－０１処理されたＮＦ２症候群細胞の遺伝子発現プロファイル
【0132】
遺伝子発現プロファイルに対するＰＲＧ－Ｎ－０１の効果を調査するために、ＰＲＧ－Ｎ－０１処理されたＨＥＩ－１９３細胞を利用したマイクロアレイ分析を行い（図１０のＡ）、ＰＲＧ－Ｎ－０１処理されたＨＥＩ－１９３細胞で対照群と比較して多種の遺伝子が減少（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａ）するか、増加した（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｂ）。クラスターーされた遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を通じて「細胞分裂」を含む細胞周期関連工程と、「コレステロール生合成過程」を含む脂質代謝関連工程と、に２個のカテゴリーに分類することができた（図１０のＢ及び図１１）。経路分析でも類似している結果、すなわち、細胞周期とステロイド経路とを確認した（図１０のＣ及び図１１）。また、ＰＲＧ－Ｎ－０１によって大きく上向き調節された遺伝子クラスターは、ＰＮＩＬＰＲＰ３、ＮＲ４Ａ２、ＡＢＣＡ１のような脂質代謝関連遺伝子を含む一方、ＰＬＫ１、ＣＥＮＰＥのような細胞周期関連遺伝子は、ほとんど下向き調節された遺伝子クラスターで含まれた（図１０のＤ）。そして、大きく上向き調節された遺伝子として標準ＴＧＦ－β信号判読Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃが観察されて、ＰＲＧ－Ｎ－０１がＨＥＩ－１９３細胞でＴＧＦ－β信号活性化を促進するという以前の結果を裏付けた（表１）。
【0133】
【表1】
【0134】
実験例５：ＰＲＧ－Ｎ－０１が細胞周期を抑制し、神経鞘細胞への分化を促進する。
【0135】
遺伝子発現プロファイルに基づいて、ＰＲＧ－Ｎ－０１の処理後、細胞周期をモニタリングし、Ｇ１上で細胞周期アレストを誘導した（図１２のＡ及び図１３のＡ）。ＰＲＧ－Ｎ－０１処理は、細胞成長を完全に抑制し（図１２のＢ）、形状変化を誘導した（図１２のＣ及び図１３のＢ）。ＰＲＧ－Ｎ－０１による形状変化は、ＴＥＷ７１９７処理群またはＮＦ２形質感染されたＨＥＩ－１９３と非常に類似しているために、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、細胞分化を誘導すると予想された。
【0136】
細胞周期関連遺伝子だけではなく、神経鞘細胞マーカーの発現を検討し、マイクロアレイ分析と同様に細胞周期関連遺伝子（ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＢ１及びＰＬＫ４）は、ＰＲＧ－Ｎ－０１によって減少し（図１２のＤ）、逆に、神経鞘細胞マーカー（ＰＬＰ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰＭＰＺ、ＰＭＰ２２及びＳＯＸ１０）は、ＰＲＧ－Ｎ－０１によって増加した（図１２のＤ及び図１３のＣ）。そして、タンパク質レベルで神経鞘細胞マーカー及びＴβＲ２の増加と幹細胞マーカーであるＳＯＸ２の減少とを観察することができた（図１２のＥ）。
【0137】
ＰＲＧ－Ｎ－０１が神経鞘細胞への分化を誘導することを再確認するために、ＦＡＣＳ分析とＩＦ染色とを通じた分化マーカー発現を再び検討した。ＦＡＣＳ分析でＰＲＧ－Ｎ－０１は、ＴＥＷ７１９７と比較して明確に神経鞘細胞マーカーを増加させ（図１２のＦ）、ＩＦ染色結果でも、類似した結果を得た（図１２のＧ及び図１３のＤ）。このような結果から、ＰＲＧ－Ｎ－０１の生理的効果は、細胞周期アレスト及び分化促進剤であることを確認することができた。
【0138】
実験例６：ＰＲＧ－Ｎ－０１がＲＫＩＰを誘導することにより、神経鞘腫細胞の幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を抑制する。
【0139】
ＳＯＸ２は、生理学的及び病理学的状態いずれもで幹細胞能を保持させるよく知られた幹細胞因子であり、ＳＯＸ１０は、ＳＯＸ２を用いて神経鞘細胞の分化を調整すると知られており、ＮＦ２－ｎｕｌｌマウスモデルで神経鞘細胞は、低いレベルのＳＯＸ１０を示した。
【0140】
以前の実験を通じてＰＲＧ－Ｎ－０１の処理によってＳＯＸ１０の誘導及びＳＯＸ２の減少を観察した。これにより、ＰＲＧ－Ｎ－０１がｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ４のような他の幹細胞因子に対する効果を検討し、この因子の発現を変化させなかった（図１４のＡ）。そして、ＰＲＧ－Ｎ－０１の抗腫瘍効果を検討するために、腫瘍球形成分析を行った。ＨＥＩ－１９３及びマウス神経鞘腫細胞は、容易に腫瘍球を形成し、ＴＥＷ７１９７は、このような腫瘍球に対して抑制効果が微弱な一方、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、腫瘍球形成を明確に抑制した（図１５のＡ及び図１４のＢ）。図１４のＣ及び図１４のＤによれば、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、腫瘍球の数だけではなく、腫瘍球のサイズも減少させた。このような状態で、幹細胞因子（ＳＯＸ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ４）の発現は、ＰＲＧ－Ｎ－０１の処理によって測定することができない程度に減少した一方、ＳＯＸ１０発現は、明確に増加した（図１５のＢ及び図１４のＥ）。
【0141】
ＳＯＸ２減少の分子機転を調査するために、ＩＦ及び細胞分画化を通じてＳＯＸ２の局在化を検討し、核内ＳＯＸ２は、ＰＲＧ－Ｎ－０１及びＴＥＷ７１９７に反応して細胞質に移動したということを確認した（図１５のＣ及び図１５のＤ）。Ｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｂまたはプロテアソーム抑制剤（ＭＧ３１２）による核内物質の流出抑制は、ＰＲＧ－Ｎ－０１／ＴＥＷ７１９７によって誘導されたＳＯＸ２減少を遮断することができた（図１４のＦ及び図１４のＧ）。このような結果から、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、ＳＯＸ２流出及び分解を促進させるということが分かった。
【0142】
また、ＳＯＸ２減少及びＳＯＸ１０誘導に対するＲＫＩＰの効果を検討した結果、野生型及び安定化されたＲＫＩＰ（Ｔ１０１Ａ）の異所性発現は、ＳＯＸ２発現を減少させ、ＲＫＩＰ Ｔ１０１Ａは、ＳＯＸ１０を誘導する一方、ＲＫＩＰ Ｔ１０１Ｄは、ＳＯＸ２発現を減少させなかった（図１５のＥ）。そして、ｓｉ－ＲＫＩＰは、ＰＲＧ－Ｎ－０１誘導ＳＯＸ２減少及び細胞質局在化を防いだ（図１５のＦ）。このような結果から、ＲＫＩＰは、ＰＲＧ－Ｎ－０１誘導ＳＯＸ２減少及びＳＯＸ１０増加に非常に重要なことが分かった。
【0143】
本発明者らは、ＴＧＦ－β信号の妨害なしにＮＦ２症候群の治療のための新規な薬物候補を開発するために、標準ＴＧＦ－β信号カスケードに対するＰＲＧ－Ｎ－０１の効果を検討し、ＨＥＩ－１９３でＰＲＧ－Ｎ－０１の処理によってＳｍａｄ２／３リン酸化は延長された（図１６のＡ及び図１６のＢ）。ＲＫＩＰまたはＮＦ２形質感染されたＨＥＩ－１９３細胞でも、類似している特徴が観察された（図１６のＣ及び図１６のＤ）。このような結果から、ＴＧＦ－β信号に対するＰＲＧ－Ｎ－０１の効果は、ＮＦ２復元誘導特徴と非常に類似したことが分かった。
【0144】
実験例７：ＰＲＧ－Ｎ－０１は、ｉｎ ｖｉｖｏで抗癌効果を示す。
【0145】
ＰＲＧ－Ｎ－０１のｉｎ ｖｉｖｏ効果を検討するために、ＮＦ２症候群モデルマウス由来の神経鞘腫細胞を８週齢マウスに同種移植し、ＰＲＧ－Ｎ－０１を腹腔内注射（２０ｍｇ／ｋｇ、週３回）で投与した。ＰＲＧ－Ｎ－０１の処理は、腫瘍成長を抑制し（図１７のＡ及び図１８のＡ）。腫瘍サイズ及び重量が明確に抑制された（図１７のＢ及び図１７のＣ）。
【0146】
正常マウスに治療容量よりも１０倍多くの投与量である２００ｍｇ／ｋｇのＰＲＧ－Ｎ－０１を注射し、体重変化を引き起こせず（図１８のＢ）、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、激しい毒性を示さないと確認された。
【0147】
そして、腫瘍でＲＫＩＰ及び関連遺伝子の発現を分析した結果、ＰＲＧ－Ｎ－０１処理腫瘍組織では、タンパク質レベルでＲＫＩＰ、神経鞘細胞マーカー（ＰＬＰ、ＭＢＰ、ａｎｄＭＰＺ）及びＳＯＸ１０の誘導が観察された（図１７のＤ）。ＲＴ－ＰＣＲ分析でも、神経鞘細胞マーカーとＳＯＸ１０の誘導及びＳＯＸ２の減少が観察された（図１７のＥ）。
【0148】
以前のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を総合すれば、ＰＲＧ－Ｎ－０１は、ＮＦ２症候群由来の神経鞘腫に対する非常に有望な候補薬物であるということを確認することができた。
【0149】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。
【0150】
本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、そして、その均等概念から導出される、あらゆる変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれていると解釈されねばならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【国際調査報告】