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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-25
(54)【発明の名称】ニック－連結ＳＴＬＦＲ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240718BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503572
(86)(22)【出願日】2022-07-22
(85)【翻訳文提出日】2024-03-15
(86)【国際出願番号】 CN2022107241
(87)【国際公開番号】W WO2023001262
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】63/224,731
(32)【優先日】2021-07-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516122667
【氏名又は名称】深▲セン▼華大智造科技股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＭＧＩ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｍａｉｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄ Ｆｌｏｏｒ ｏｆ Ｎｏ．１１ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｂｅｉｓｈａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｏｎｅ，Ｙａｎｔｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０８３，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ドルマナッチ，ラドイェ ティー
(72)【発明者】
【氏名】ピータース，ブロック エイ
(72)【発明者】
【氏名】アレクセーエフ，アンドレイ
(72)【発明者】
【氏名】ドルマナッチ，スネジャナ
(72)【発明者】
【氏名】ナニセッティ，アムルヤ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QX01
(57)【要約】
本出願は、配列決定のためのポリヌクレオチドのライブラリーを調製するための方法および組成物に関し、単一の反応混合物において、を含む。本方法は、二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された重複する核酸断片を生成することと、リガーゼの存在下で部分的に二本鎖の第１のアダプターを核酸断片のうちの少なくとも１つと接触させ、それによって第１のアダプターの二本鎖領域の５’末端を、３’分岐連結を介してＤＮＡリガーゼを使用して核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結することとを含む。第１のアダプターは、（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）バーコードを含む一本鎖領域を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列決定のためのアダプター化されたポリヌクレオチドのライブラリーを調製するための方法であって、単一の反応混合物において、二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片を生成することと、（ａ）各々がビーズ上に固定化された複数の分岐連結アダプター（ｂ－ＢＬＡ）を含む複数のビーズを提供し、３’末端に縮重配列を有するＬ－アダプターの集団を提供することであって、
各ｂ－ＢＬＡが、ｂ－ＢＬＡアダプター配列を含むバーコードオリゴヌクレオチド、およびバーコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含み、
各ＬアダプターがＬアダプター配列を含むことと、
（ｂ）リガーゼの存在下でｂ－ＢＬＡを核酸断片のうちの少なくとも１つと接触させ、それによって核酸断片の３’末端にｂ－ＢＬＡを連結することと、
（ｃ）リガーゼの存在下でＬ－アダプターの集団を接触させ、それによって核酸断片の５’末端にＬ－アダプターを連結し、
それによって、５’末端にＬ－アダプター配列を有し、３’末端にｂ－ＢＬＡアダプター配列を有する核酸断片のライブラリーを得ることと
を含む方法。
【請求項2】
Ｌ－アダプターの３’末端が、核酸断片のうちの少なくとも１つの５’末端に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
各ＢＬＡが、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）バーコード配列を含む一本鎖領域を含み、二本鎖平滑末端における鎖の５’末端が、分岐連結を介して、核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
反応混合物に酵素を添加することをさらに含み、酵素が、Ｌ－アダプターを連結する前に、過剰のｂ－ＢＬＡを分解する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
Ｌ－アダプターが３’末端に１～１０個の縮重塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
Ｌ－アダプターが溶液中にあり、バーコードオリゴヌクレオチドがビーズに接合され、
ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドがビーズに接合されない、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ｂ－ＢＬＡがウラシルを含み、ウラシルを除去してビーズからｂ－ＢＬＡを放出することができる、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
各ビーズが複数のｂ－ＢＬＡでその上に固定化され、複数のｂ－ＢＬＡの各々が同じバーコード配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
ｂ－ＢＬＡとＬ－アダプターの両方と連結して伸長された核酸断片を生成する核酸断片のうちの少なくとも１つを伸長することをさらに含み、伸長された核酸断片がバーコードのコピーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
伸長された核酸断片を環状化することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
複数のビーズを含み、各ビーズが固有のバーコード配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項12】
二本鎖領域の３’末端がジデオキシブロッカーヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
核酸断片の平均長が２００ヌクレオチド～１００００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
工程（ａ）において作出された突出型の一本鎖切断の５０％超が、工程（ｂ）における連結によって閉鎖される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
１種以上のニッキング剤が、非特異的ニッキングヌクレアーゼ、部位特異的ニッキングヌクレアーゼ、および化学的ニッキング剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
非特異的ニッカーゼが、Ｖｖｎ、エビｄｓＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡｓｅ Ｉからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
リガーゼがＴ４ ＤＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
配列決定のためのポリヌクレオチドのライブラリーを調製する方法であって、単一の反応混合物において、（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された重複する核酸断片を生成することと、
（ｂ）リガーゼの存在下で、複数の部分的に二本鎖の第１のアダプターを含むビーズを核酸断片と接触させることであって、
各第１のアダプターが、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）ビーズ上に固定化された一本鎖領域を含み、一本鎖領域がバーコードを含み、
それによって、少なくとも１つの第１のアダプターの二本鎖平滑末端における鎖の５’末端を、ＤＮＡリガーゼを用いて核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結して、連結された第１のアダプターを生成し、
連結された第１のアダプターがバーコードおよび少なくとも１つの核酸断片を含むことと、
（ｃ）連結された第１のアダプターを変性させることと、
（ｄ）連結された第１のアダプターにおけるバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズしたプライマーの制御された伸長を行い、それによって連結の第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖を生成することと
を含む方法。
【請求項19】
部分的に二本鎖の第１のアダプターのうちの少なくとも１つが連結されないままであり、制御された伸長を行うことが、連結された第１のアダプターと連結されていない第１のアダプターの両方においてバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズされるプライマーをハイブリダイズすることを含み、それによって、連結された第１のアダプターに相補的である部分的に伸長された鎖、および連結されていない第１のアダプターに相補的である完全に伸長された鎖を生成し、それによって、
より短い鎖およびより長い鎖を含む、連結された第１のアダプターを含む部分的に二本鎖の分子と、
連結されていないアダプターを含む二本鎖分子と
を含む混合物を生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを添加することをさらに含み、それによってエキソヌクレアーゼが二本鎖分子を分解する、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
工程（ｄ）において、連結許容条件下で混合物にヘアピンアダプターを添加することをさらに含み、それによって二本鎖分子が１つのヘアピンアダプターに連結され、部分的に二本鎖の分子がヘアピンアダプターに連結されないままである、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
（ａ）部分的に二本鎖の分子鎖中のより短い鎖を伸長させて、より長い鎖中の核酸断片の配列をコピーし、それによってさらに伸長された鎖を生成することと、（ｂ）第２のアダプターをさらに伸長された鎖の３’末端に連結することと
をさらに含む、請求項２１または２０に記載の方法。
【請求項23】
工程（ｅ）においてより短い鎖を伸長することが、伸長可能なヌクレオチドと３’可逆的ブロッキング基を有するヌクレオチドの混合物の存在下で行われ、工程（ｆ）において第２のアダプターを連結することが、３’ブロッキング基の除去後に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
３’可逆的ブロッキング基を有するヌクレオチドが、異なるサイクルの間に添加される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
第２のアダプターが、分岐連結アダプター（ＢＬＡ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
連結された第２の分岐連結アダプターを鎖置換ポリメラーゼで伸長することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
標的核酸が、工程（ａ）および工程（ｂ）の前にビーズに結合される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
工程（ａ）におけるニッキングの前に、０～３０分間、標的核酸をビーズとともにインキュベートすることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
標的核酸が、３～１２％ＰＥＧを含む緩衝液中でビーズとともにインキュベートされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
単一の反応混合物のｐＨが７～９である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
工程（ａ）がリガーゼの存在下で起こる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
１種以上のニッキング剤およびリガーゼが、連結率がニッキング率よりも高いように選択される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
工程（ｂ）の後に、反応混合物を変性させることによって、核酸断片に連結されていない第１のアダプターのＤＮＡ鎖を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項34】
工程（ａ）が、突出型の一本鎖切断のギャップを増加させるためにエキソヌクレアーゼを単一の反応混合物に添加することをさらに含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
増加したギャップが１～３０塩基の長さを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
標的核酸にニックを入れ、ｂ－ＢＬＡおよびＬ－アダプターを核酸断片に連結することが、少なくとも３０分間持続する、請求項１に記載の方法。
【請求項37】
二本鎖標的核酸にニックを入れ、第１のアダプターを核酸断片に連結することが、少なくとも３０分間持続する、請求項１８に記載の方法。
【請求項38】
（１）１種以上のニッキング剤、（２）１種以上のリガーゼ、
（３）突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片、
（４）互いにハイブリダイズして部分的に二本鎖の核酸分子を形成する、バーコードオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含む部分的に二本鎖の分岐アダプターを含む反応混合物であって、
バーコードオリゴヌクレオチドがビーズに接合され、バーコードを含み、
ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドがビーズに接合されず、
部分的に二本鎖の核酸分子が、
（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖平滑末端、ならびに
（ｉｉ）バーコードを含み、一本鎖末端を有する一本鎖領域
を含み、二本鎖平滑末端の５’末端が、重複する核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結される、反応混合物。
【請求項39】
核酸断片のうちの少なくとも１つの５’末端がＬ－アダプターに連結される、請求項３８に記載の反応混合物。
【請求項40】
Ｌ－アダプターが、３’末端に１～１０個の縮重塩基を含む、請求項３８に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年７月２２日に出願された米国仮出願第６３／２２４，７３１号の優先権および利益を主張する。前記仮出願の全内容は、すべての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年７月２２日に出願された米国仮出願第６３／２２４，７３１号の優先権および利益を主張する。前記仮出願の全内容は、すべての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
一般的に使用される次世代シークエンシングプラットフォームのための配列決定ライブラリーを構築するには、しばしば、標的核酸の両端にアダプターを付加する必要がある。これらのアダプターは、典型的には、試料または分子の同定のためのバーコードを含有する。場合によっては、全ゲノム配列決定を容易にするために、単一の長いゲノムＤＮＡ分子のサブ断片に同じバーコードを付加するために、同時バーコードが行われる。配列決定ライブラリーの構築の現在のプロセスは、しばしば、アダプターを付加するためのマルチ工程手法を必要とする。各工程は、しばしば、労働集約的で非効率的な別々の反応または容器内で行われる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
一態様では、本開示は、配列決定のためのアダプター化されたポリヌクレオチドのライブラリーを調製するための方法を提供し、単一の反応混合物において、（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片を生成することと、（ｂ）各々がビーズ上に固定化された複数の分岐連結アダプターを含む複数のビーズ（ｂ－ＢＬＡ）を提供し、３’末端に縮重配列を有するＬ－アダプターの集団を提供することと、（ｃ）リガーゼの存在下で、ｂ－ＢＬＡを核酸断片の少なくとも１つと接触させることであって、それによって、核酸断片の３’末端にｂ－ＢＬＡを連結することと、（ｄ）リガーゼの存在下でＬ－アダプターの集団を接触させ、それによってＬ－アダプターを核酸断片の５’末端に連結し、それによって、５’末端にＬ－アダプター配列を有し、３’末端にｂ－ＢＬＡアダプター配列を有する核酸断片のライブラリーを得ることとを含む。
【0004】
別の態様では、本明細書には、配列決定のためのポリヌクレオチドのライブラリーを調製するための方法が開示され、単一の反応混合物において：
（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された重複する核酸断片を生成することと、（ｂ）リガーゼの存在下で、複数の部分的に二本鎖の第１のアダプターを含むビーズを核酸断片と接触させることであって、各第１のアダプターは、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、および（ｉｉ）ビーズ上に固定化された一本鎖領域を含み、一本鎖領域がバーコードを含み、それによって、少なくとも１つの第１のアダプターの二本鎖平滑末端における鎖の５’末端を、ＤＮＡリガーゼを用いて核酸断片の少なくとも１つの３’末端に連結して、連結された第１のアダプターを生成し、連結された第１のアダプターがバーコードおよび少なくとも１つの核酸断片を含むことと、（ｃ）連結された第１のアダプターを変性させることと、（ｄ）連結された第１のアダプター内のバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズするプライマーの制御された伸長を行い、それによって連結の第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖を生成することとを含む。
（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された重複する核酸断片を生成することと、（ｂ）リガーゼの存在下で、複数の部分的に二本鎖の第１のアダプターを含むビーズを核酸断片と接触させることであって、各第１のアダプターは、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、および（ｉｉ）ビーズ上に固定化された一本鎖領域を含み、一本鎖領域がバーコードを含み、それによって、少なくとも１つの第１のアダプターの二本鎖平滑末端における鎖の５’末端を、ＤＮＡリガーゼを用いて核酸断片の少なくとも１つの３’末端に連結して、連結された第１のアダプターを生成し、連結された第１のアダプターがバーコードおよび少なくとも１つの核酸断片を含むことと、（ｃ）連結された第１のアダプターを変性させることと、（ｄ）連結された第１のアダプター内のバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズするプライマーの制御された伸長を行い、それによって連結の第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖を生成することとを含む。
【0005】
さらに別の態様では、本明細書には、（１）１種以上のニッキング剤、（２）１種以上のリガーゼ、（３）突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片、および（４）互いにハイブリダイズして部分的に二本鎖の核酸分子を形成する、バーコードオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含む部分的に二本鎖の分岐アダプターを含む反応混合物が開示され、バーコードオリゴヌクレオチドはビーズに接合され、バーコードを含み、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドはビーズに接合されず、部分的に二本鎖の核酸分子は、（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）バーコードを含み、一本鎖末端を有する一本鎖領域を含み、二本鎖平滑末端の５’末端は、核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結される。
【0006】
図面およびその説明は、本発明の例示的な実施形態を示す。本開示において提供される発明は、これらの図面に示される実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【0008】
【0009】
【図3A】図３Ａおよび３Ｂは、分岐連結（３２０）を介して標的ＤＮＡ（３１０）の３’末端にｂ－ＢＬＡアダプター（３２０）を付加し、１つの単一反応混合物中で標的ＤＮＡの５’末端にＬ－アダプター（３４０）を付加する例示的な方法を示す。図３Ａは、ビーズ（３００）が、その上に固定化されたｂ－ＢＬＡを含むことを示す。各ｂ－ＢＬＡは、１）バーコード配列（３３０）と３’末端にジデオキシブロッカーヌクレオチドを含むバーコードオリゴヌクレオチド、および２）バーコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドの２本の鎖からなる。バーコードオリゴヌクレオチドの５’をビーズ（３００）に接合する。よりよい例証および説明のために、別の工程で示したが、ｂ－ＢＬＡアダプターとＬ－アダプターの付加は１つの単一反応において起こり得る。ｂ－ＢＬＡアダプター（３４０）由来のバーコード（３３０）は、ビーズに接合されていない鎖（３５０）を伸長することによってコピーされ、伸長された核酸断片（３６０）を生成する。過剰なｂ－ＢＬＡアダプター（３７０）（すなわち、断片に連結されていないｂ－ＢＬＡアダプター）はまた、伸長される。伸長された核酸断片（３６０）は、ｂ－ＢＬＡアダプター配列にアニーリングされた２つのプライマー、および２つの末端におけるＬ－アダプター配列を用いて増幅することができる。あるいは、伸長された核酸断片（３６０）は、以下にさらに記載されるように、両方のアダプター配列にアニーリングする分割オリゴを使用することによって環状化され得る。「増幅」と題されたセクション１０を参照されたい。過剰なアダプター（３７０）は、Ｌ－アダプターを有さず、したがって、ＰＣＲによって増幅されず、また環状化され得ない。
【図3B】同上。
【0010】
【図4】図４は、１つの単一反応において、標的ＤＮＡの３’にｂ－ＢＬＡ（４１０）を付加し、５’にＬ－アダプター（４２０）を付加する例示的な方法を示す。Ｌ－アダプターは、エキソヌクレアーゼ消化（＊で示される）を妨げるための保護結合（例えば、ホスホロチオエート結合など）を含む。各ｂ－ＢＬＡのバーコードオリゴヌクレオチドは、３末端でブロックされる（例えば、ジデオキシブロッカーヌクレオチドを有することによる）。同じｂ－ＢＬＡのハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは、３’分岐連結を介して標的核酸断片に連結することができる。ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドおよび標的核酸断片を連結することによって形成された連結された生成物（４５０）を伸長して、ｂ－ＢＬＡからバーコード（４３０）を取り込み、伸長された核酸断片（４６０）を形成する。伸長された核酸断片（４６０）は、変性によってビーズから放出され得、次に、放出された断片は、ＰＣＲによって増幅されるかまたは環状化される。適宜、過剰なｂ－ＢＬＡ（４４０）は、ラムダエキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって分解され、連結されていないアダプターの増幅を回避することができる。
【0011】
【図5】図５は、３’にｂ－ＢＬＡ（５１０）を付加し、図４に示されるものと同様の１つの単一反応において標的ＤＮＡの５’にＬ－アダプター（５２０）を付加する別の例示的な方法を示す。ｂ－ＢＬＡをビーズ（５００）上に固定化する。バーコードオリゴヌクレオチドが伸長することからブロックされる図４とは異なり、図５において、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドはブロックされ、バーコードオリゴヌクレオチドは標的核酸断片に連結されて、バーコード化された核酸断片（５５０）を生成することができ；伸長によってバーコードをコピーする必要はない。次に、過剰なｂ－ＢＬＡ（５６０）と連結された生成物の両方を変性させ、一本鎖バーコード核酸断片（５３０）をもたらし、ビーズに接合されたままである。１つのアプローチにおいて、ｂ－ＢＬＡは、バーコードオリゴヌクレオチドの３’末端付近にウラシルを含み；上記のように生成されたバーコード化された核酸断片（５３０）は、ＵＳＥＲと接触することによってビーズから放出され得る。次に、この放出された鎖（５４０）を増幅または直接環状化することができる。適宜、過剰なｂ－ＢＬＡ（５７０）は、ＲｅｃＪまたはＥｘｏ７処理によって除去することができる。「＊」はホスホロチオエート結合を表す。
【0012】
【図6】図６は、ニッカーゼ処理中にｂ－ＢＬＡが標的ＤＮＡと接触する本発明の例示的な実施形態を示す。図４と同様に、各ｂ－ＢＬＡのバーコードオリゴヌクレオチドは、伸長することからブロックされるが、図６においては、各バーコードオリゴヌクレオチドはまた、バーコード配列（６２０）とジデオキシブロッカーヌクレオチドの間に１つ以上のウラシル（６１０）を含み得る。ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（６３０）は、分岐連結を介して標的核酸断片に連結することができる。次に、ＵＳＥＲを添加して、バーコードオリゴヌクレオチドを切断し、ジデオキシブロッカーヌクレオチドを放出させ、伸長性末端を有するバーコードオリゴヌクレオチド（６５０）をもたらす。連結された生成物（６３０）を伸長してバーコードを取り込み、バーコード化された核酸断片（６４０）を形成する。３’のブロッカーヌクレオチドを含まないバーコードオリゴヌクレオチド（６５０）も伸長される。次に、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＥｘｏＩＩＩを添加して、過剰なｂ－ＢＬＡ（６６０）を完全に分解し、さらに、バーコード化された核酸断片を３’→５’方向から部分的に分解し、部分的にハイブリダイズしたバーコード化された標的核酸断片（６７０）をもたらす。次に、前記部分的にハイブリダイズしたバーコード化された標的核酸断片（６７０）を伸長して、二本鎖のバーコード化された核酸断片（６８０）を形成し、次に、平滑末端連結を介して第２のアダプターと連結する。場合によっては、第２のアダプターは、自己連結を最小限にするために５’リン酸基を含まない。連結生成物を変性させて一本鎖核酸断片（６９０）を形成し、ここで両端にアダプター配列を有する。一本鎖核酸断片（６９０）は、ここでＰＣＲによって増幅されるかまたは環状化され得る。
【0013】
【図7A】図７Ａおよび７Ｂは、ｂ－ＢＬＡがビーズ（７００）に固定化される本発明の別の実施形態を示す。各ｂ－ＢＬＡは、バーコードオリゴヌクレオチド（７１０）および互いにハイブリダイズするハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（７２０）を含む。ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは、３’末端にジデオキシブロッカーヌクレオチドを含み、バーコードオリゴヌクレオチドは、バーコード配列（７９０）の５’側にある座位にウラシルを含む。図７Ａおよび７Ｂは以下の事象を示す：１）バーコードオリゴヌクレオチドをニッカーゼ処理された標的核酸断片に連結し、分岐連結を介してバーコード化された核酸断片（７３０）を形成する；２）ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは変性により除去される；３）ＲｅｃＪまたはＥｘｏＶＩＩなどのヌクレアーゼを添加して、一本鎖の過剰ｂ－ＢＬＡ（７４０）を分解する；４）Ａプライマー（７５０）をバーコード化された核酸断片（７３０）上のバーコードの配列５’にアニーリングさせ、伸長させて二本鎖ＤＮＡ分子（７６０）を形成する；次に、二本鎖ＤＮＡ分子を第２の二本鎖アダプター（７７０）に連結して、両端にアダプター配列を有する二本鎖アダプター分子（７８０）を形成させ、一方のアダプター配列は分岐アダプター由来であり、他方のアダプター配列は第２の二本鎖アダプター由来である。適宜、第２のアダプターは、自己連結を回避するために５’リン酸を含まない。次に、ｄｕａＬ－アダプター配列を有する二本鎖分子（７８０）を変性させ、ＵＳＥＲによりビーズから放出させ、一本鎖分子（７８１）を生じ、次に、増幅および／または環状化することができる。
【図7B】同上。
【0014】
【図8】図８は、ｂ－ＢＬＡがビーズ（８００）に固定化される本発明の例示的な実施形態を示す。各ｂ－ＢＬＡは、バーコードオリゴヌクレオチド（８２０）およびハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（８１０）を含む。バーコードオリゴヌクレオチド（８２０）は、３’にジデオキシブロッカーヌクレオチドを含む。ｂ－ＢＬＡ中のハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは、ニッカーゼ処理中に分岐連結を介して標的核酸断片に連結される。ラムダエキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼＩを反応に添加し、過剰なｂ－ＢＬＡ（８３０）を除去する。ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドと標的核酸断片を連結することによって形成される連結生成物を伸長してバーコードをコピーし、バーコード化された核酸断片（８４０）をもたらし、変性によりバーコードオリゴヌクレオチドから分離される。プライマーは、バーコード配列に対して３’の配列で一本鎖分子にアニーリングされ、伸長される。伸長は二本鎖分子（８５０）を形成し、次に、第２のアダプターに連結され、両端にアダプター配列を有する二本鎖核酸断片（８６０）を形成する。次に、二本鎖核酸断片（８６０）をＰＣＲによって増幅することができる。あるいは、二本鎖核酸断片を変性させて、一本鎖核酸断片を形成することができ、次に環状化される。適宜、第２のアダプターは、個々の第２のアダプターの自己連結を最小限にすることができる５’リン酸を欠いている。
【0015】
【図9A】図９Ａおよび図９Ｂは、ｂ－ＢＬＡがビーズ（９００）に固定化される本発明の別の実施形態を示す。各ｂ－ＢＬＡは、バーコードオリゴヌクレオチド（９１０）および互いにハイブリダイズするハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（９２０）を含む。ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（９２０）は、３’末端にジデオキシブロッカーヌクレオチドを含む。第１に、バーコードオリゴヌクレオチドをニッカーゼ処理された標的核酸断片に連結し、分岐連結を介してバーコード核酸断片（９３０）を形成する。第２に、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは変性によって除去される。第３に、制御されたポリメラーゼ伸長が行われ、３’分岐連結に使用することができる５’オーバーハング（９４０）を残す。制御された伸長は、約１００～１５０塩基にしか進行せず、３～５’エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼによって行われ、鋳型の末端にＡ尾部（９５０）が生じる。これは、過剰なアダプターの完全な伸長およびＡ尾部が生じるが、ゲノム断片に連結されたアダプターは不完全である。次に、伸長された過剰アダプターのＡ尾部に相補的なＴ尾部を有するヘアピンアダプターを用いて連結を行い、その結果、過剰なアダプター（９６０）が連結または伸長からブロックされ、一方、標的核酸断片（９７０）に連結された残りのアダプターはブロックされない（すなわち、これらの残りのアダプターはヘアピンアダプターに連結することができない）。ターミネーターは、異なる濃度で、または異なるサイクルの間の異なる時点で添加されて、異なる長さを有する伸長生成物を生成することができ、配列決定プロセスの間、各断片のほとんどの塩基にわたって重複する範囲を提供することができる。
【0016】
残りのアダプター（９７０）をさらに可逆的ターミネーターで伸長し、続いてターミネーターブロッキング基を除去する反応を行い、次に、３’分岐連結を行い、末端の標的核酸断片に第２のアダプター（９８０）を付加する。次に、反応物を変性させ、両端（９９０）に２つのアダプター配列を含む一本鎖分子を、ＰＣＲによって増幅されるかまたは環状化され得る。
【図9B】同上。
【0017】
【図10A】図１０Ａおよび図１０Ｂは、制御された伸長を行うことを伴う、本発明の別の実施形態を示す。図９Ａおよび９Ｂと同様である。この実施形態において使用されるｂ－ＢＬＡはまた、バーコードオリゴヌクレオチドおよび互いにハイブリダイズしたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（１０２０）を含む分岐アダプターである。ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（１０２０）は、３’末端にジデオキシブロッカーヌクレオチドを含む。第１に、バーコードオリゴヌクレオチドをニッカーゼ処理された標的核酸断片に連結し、分岐連結を介してバーコード核酸断片（１０３０）を形成する。第２に、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは変性によって除去される。第３に、伸長を約１００～１５０塩基に制限する条件下で、３～５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて、制御されたポリメラーゼ伸長を行う。これは、３’分岐連結に使用することができる５’オーバーハング（１０４０）を残す。これは、標的核酸断片（１０４０）に連結されたアダプターの不完全な伸長、および過剰アダプター（１０５０）の完全な伸長をもたらし、５’リン酸を有する平滑末端ｄｓＤＮＡアダプターを形成する。次に、ラムダエキソヌクレアーゼを反応に添加し、ラムダは平滑末端ｄｓＤＮＡアダプターを５’リン酸（１０５０）で分解する。ラムダエキソヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡよりもリン酸化された二本鎖ＤＮＡを好むため、アダプター化された短い挿入物（１０５０など）は、長い挿入物（１０４０など）よりも優先的に分解される。本方法の残りの工程は、図１０Ｂに示されるように、図９Ａおよび９Ｂに示されるものと同様である。
【図10B】同上。
【0018】
【図11A】図１１Ａは、過剰なアダプター（１１５０）を完全に伸長し、連結された生成物（１１４０）を部分的に伸長する、図１０Ａに記載される制御された伸長を行うことを示す。図１１Ｂは、部分的に伸長された連結生成物（１１４０）が、次に、可逆的ターミネーターの存在下でさらに伸長され、続いて、可逆的ターミネーター内のターミネーターブロッキング基を除去し、次に、第２のアダプター（１１６０）と連結されることを示す。これは、過剰なアダプター（１１５０）の平滑末端連結およびバーコードされた標的核酸断片（１１７０）の３’分岐連結をもたらし、両端（１１８０）にアダプター配列を有する核酸断片を形成する。連結されていない鎖（１１９０）は、伸長制御条件下でポリメラーゼを置換する鎖によって伸長され、その結果、連結されていない鎖は、約１００～１５０塩基だけ伸長する。この伸長は、ビーズ上に固定化されたままであるアダプター化された核酸断片の鎖置換およびアダプター化された核酸断片（１１９０）の放出をもたらす。アダプター化された核酸断片の放出は、溶液中で回収することができる。ビーズは、制御された伸長の次のサイクルのために再利用することができる。可逆的ターミネーターを伴う上述の他の実施形態と同様に、ターミネーターは、異なる濃度で、または異なるサイクルの間の異なる時点で添加して、異なる長さを有する伸長生成物を生成することができる。これは、有利には、配列決定プロセスの間、各断片のほとんどの塩基にわたって重複する範囲を提供する。
【図11B】同上。
【0019】
【図12A】図１２Ａおよび図１２Ｂは、本明細書に開示される方法を用いて形成されたニック－連結生成物の電気泳動の結果を示す。セグメンターゼ（Ｓｅｇｍｅｎｔａｓｅ）（ＭＧＩ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａから入手可能）は、図１２Ａに示される異なる反応において徐々に増加する量で使用され、マスターアーゼ（Ｍａｓｔｅｒａｓｅ）（Ｑｉａｇｅｎ）は、図１２Ｂに示される異なる反応において徐々に増加する量で使用された。図１２Ｃおよび図１２Ｄは、ニック－連結反応の２ラウンドから形成された生成物の電気泳動の結果を示す。セグメンターゼを図１２Ｃに示される反応に使用し、マスターアーゼを図１２Ｄに示される反応に使用した。
【図12B】同上。
【図12C】同上。
【図12D】同上。
【発明を実施するための形態】
【0020】
Ｉ．概要
本明細書には、配列決定ライブラリーを調製するための「ニック－連結する」または「ニック－連結」単一チューブＬＦＲ法が記載される。本方法は、制御された速度、頻度、または両方で、二本鎖標的核酸に一本鎖切断（例えば、ニックまたはギャップ）を導入する。本方法はまた、以下にさらに説明するように、切断の３’（３－プライム）側、切断の５’（５－プライム）側、またはニックもしくはギャップの両側にアダプター（複数可）を連結する。１つ以上のアダプターの付加は、「アダプター化された断片」を生成する。ライブラリーの調製に関与する酵素反応、例えば、ニッキングおよび連結は、所望のアダプターおよびバーコードを有する標的核酸のライブラリーを生成するために、１つの単一混合物中で行うことができる。
本明細書には、配列決定ライブラリーを調製するための「ニック－連結する」または「ニック－連結」単一チューブＬＦＲ法が記載される。本方法は、制御された速度、頻度、または両方で、二本鎖標的核酸に一本鎖切断（例えば、ニックまたはギャップ）を導入する。本方法はまた、以下にさらに説明するように、切断の３’（３－プライム）側、切断の５’（５－プライム）側、またはニックもしくはギャップの両側にアダプター（複数可）を連結する。１つ以上のアダプターの付加は、「アダプター化された断片」を生成する。ライブラリーの調製に関与する酵素反応、例えば、ニッキングおよび連結は、所望のアダプターおよびバーコードを有する標的核酸のライブラリーを生成するために、１つの単一混合物中で行うことができる。
【0021】
ニック－連結法は、大きなゲノム断片配列決定のための配列読み取りのデノボアセンブリーに特に適した特定の利点を有する。
【0022】
第１に、このプロセスは、ライブラリー調製の全プロセスの間、互いに関連したままである重複する一本鎖核酸断片を作出する。ＤＮＡ鎖切断部位で二本鎖切断を作出する方法（例えば、トランスポゾン挿入に基づく方法）と比較して、本明細書に開示される方法は、材料の喪失を回避し、標的核酸のクローン範囲を増加させる。
【0023】
第２に、トランスポゾンを介した同時バーコード法（例えば、Zhang et al., Nature Biotechnology, June 2017, doi 10.1038/nbt.3897に記載される）と比較して、ニック－連結法は、特定のＤＮＡ配列に対するトランスポーゼース優先性によって引き起こされるバイアスを回避する。
【0024】
第３に、マルチ工程トランスポゾンベースの同時バーコード法とは異なり、本明細書に開示されるライブラリー調製および同時バーコーディングプロセスは、単一工程の単一チューブ調製として行うことができる。
【0025】
第４に、本明細書に開示される方法によって作出されるアダプター化された断片のサイズは、標的核酸にかかわらず、反応中の成分を制御することによって制御することができる。他の既存のトランスポゾンベースの方法によって生成される標的核酸断片のサイズは、反応における高分子量ゲノムＤＮＡの量によって影響され、したがって、しばしば制御が困難である。対照的に、本明細書に開示される方法では、サイズは、例えば、ニッキング剤およびリガーゼの量を均衡させることによって制御することができる。
【0026】
例示的なワークフローを図１に示す。工程１および２において、二本鎖核酸がニックを入れられ、突出型の一本鎖切断（２２０）が生じる。工程３において、クレノウ断片などの「ギャッピング酵素」（ヌクレオチドが存在しない場合）によって切断が伸長される（同等に、「広がる」または「ギャップが開く」）。図２に示されるように、これらのニッキングおよびギャッピングプロセスは、一本鎖のギャップおよび重複する核酸断片（２４０）（「断片」）を生成する。これらの断片の各々の一部は、相補的配列を有する別の断片の一部にハイブリダイズしたままである。
【0027】
工程３において、断片をアダプターに連結する。アダプターの１つは、ビーズに連結した分岐連結アダプターまたはＢ－ＢＬＡと呼ばれるビーズ上に固定化された分岐連結アダプターであり得る。他のアダプターは、溶液中に提供されるＬ－アダプターであり得る。適宜、過剰なアダプター（すなわち、いずれの断片にも連結されていないアダプター）は、ヌクレアーゼによって除去され得る（工程４）。
【0028】
工程５において、場合によっては、バーコード配列を含む二本鎖断片を生成するために、アダプター化された断片が拡大される。本明細書には別々の工程として開示されているが、ニッキングおよび連結は単一の反応において起こり得、同時に起こり得る。一部の実施形態では、ニッキングおよび連結反応は、少なくとも３０分間、例えば、少なくとも６０分間、少なくとも９０分間、または少なくとも１２０＋分間持続することができる。一部の実施形態では、二本鎖断片は、一本鎖分子を形成するために変性される。
【0029】
工程６において、変性された核酸断片は、例えば、断片の両端のアダプター配列にアニーリングされたプライマーを用いるＰＣＲによって増幅される。あるいは、変性された核酸断片を環状化し、増幅することができる。
【0030】
このワークフローの変形はまた、本開示によって包含される。例示的な変形を図３～８に示す。
【0031】
ＩＩ．定義
成分または「単一の反応混合物」中の反応は、反応が、タグ付け工程の間に、別々のチューブ、容器、アリコート、ウェル、チャンバー、または液滴へのコンパートメント化なしに、単一の混合物中で起こることを意味する。成分は、単一の反応混合物を作製するために、同時にまたは任意の順序で添加させることができる。
成分または「単一の反応混合物」中の反応は、反応が、タグ付け工程の間に、別々のチューブ、容器、アリコート、ウェル、チャンバー、または液滴へのコンパートメント化なしに、単一の混合物中で起こることを意味する。成分は、単一の反応混合物を作製するために、同時にまたは任意の順序で添加させることができる。
【0032】
用語「突出型の一本鎖切断」とは、二本鎖または部分的に二本鎖のＤＮＡ分子の一本鎖に導入された切断（ニッキングまたはギャッピングにより生じる）を指し、その結果、他の一本鎖核酸断片にハイブリダイズした複数の重複する一本鎖核酸断片が生じる。核酸断片の少なくとも一部について、５’配列の一部は、別の核酸断片の５’配列の少なくとも一部と相補的であり、３’配列の少なくとも一部は、ハイブリダイゼーション条件下で複数の核酸断片が互いにハイブリダイズして核酸複合体を形成するように、さらに別の核酸断片の３’配列の少なくとも一部と相補的である。限定ではなく例示のために、突出型の一本鎖切断によって分離された４つの核酸断片を含む核酸複合体を図２に示す。核酸複合体（または「複合体」）は、４つを超える核酸断片を含み得る、および典型的には含み得ることが理解される。
【0033】
用語「部分的に二本鎖の」とは、互いにハイブリダイズし、一方の鎖の少なくとも一部が他方の鎖とハイブリダイズしない２本のＤＮＡ鎖を指す。部分的に二本鎖のＤＮＡの２本のＤＮＡ鎖は、異なる長さであり得るか、または同じ長さであり得る。
【0034】
本明細書で使用される場合、「固有の分子識別子」（ＵＭＩ）とは、個々のＤＮＡ分子を互いに区別するために使用され得る、ＤＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの配列を指す。例えば、Kivioja, Nature Methods 9, 72-74 (2012)を参照されたい。ＵＭＩは、それらが関連しているＤＮＡ配列とともに配列決定され、同じ供給源核酸由来である配列読み取りを同定することができる。用語「ＵＭＩ」は、文脈から明らかなように、本明細書では、ＵＭＩのヌクレオチド配列と物理的ヌクレオチドの両方を指すために使用される。ＵＭＩは、ランダム、擬似ランダムまたは部分的にランダム、またはアダプターに挿入されるか、または他には配列決定されるべき供給源核酸（例えば、ＤＮＡ）分子に組み込まれる非ランダムヌクレオチド配列であり得る。一部の実装では、各ＵＭＩは、試料中に存在する任意の所与の供給源ＤＮＡ分子を固有に同定することが期待される。
【0035】
本明細書で使用される場合、用語「単一チューブＬＦＲ」または「ｓｔＬＦＲ」とは、例えば、米国特許公開第２０１４／０３２３３１６号およびWang et al., Genome Research, 29: 798-808 (2019)に記載されるプロセスを指し、その全内容は全体として参照により本明細書に組み込まれ、その中で、とりわけ、同一の固有のバーコード配列（または「ｔａｇ」）の複数コピーが、個々の長い核酸断片と関連する。単一チューブＬＦＲの一実施形態では、長い核酸断片は、規則的な間隔で「挿入オリゴヌクレオチド」で標識される。一実施形態では、挿入オリゴヌクレオチドは、１種以上の酵素、例えば、トランスポーゼース、ニッカーゼ、およびリガーゼによって、長い核酸分子に導入される。異なる長い核酸断片間のバーコード配列は異なる。したがって、個々の長い核酸断片を標識するためのプロセスは、コンパートメント化することなく、例えば、単一の容器内で都合よく行うことができる。このプロセスは、タグ付け工程中に、断片を別々のチューブ、容器、アリコート、ウェル、または液滴に分離する必要なしに多数の個々のＤＮＡ断片の分析を可能にする。
【0036】
本明細書で使用される場合、「固有の」バーコードとは、個々のビーズに関連し、それを区別するために使用することができるヌクレオチド配列を指す。各々が固有のバーコードを有するビーズの集団において、１つのビーズに関連するバーコード配列は、集団中のビーズの少なくとも９０％、より頻繁には集団中のビーズの少なくとも９９％、より頻繁には集団中のビーズの少なくとも９９．５％、最も頻繁には集団中のビーズの少なくとも９９．９％のバーコード配列とは異なる。
【0037】
ポリヌクレオチドおよび基質（例えば、ビーズ）と関連して使用される用語「接合する」とは、ポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチドの１つの末端）が基質と直接接触するか、または共有結合的に連結することを指す。例えば、表面は、ポリヌクレオチド分子上の官能性と反応して共有結合的な連結を形成する反応性官能基を有し得る。例示的な一例として、ｂ－ＢＬＡは、バーコードオリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドのいずれかをビーズに接合させることによってビーズ上に固定化される。
【0038】
本明細書に開示される方法または組成物において使用されるアダプター（または任意の他のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド複合体）に関して使用される場合の「溶液中」という用語は、アダプター（または任意の他のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド複合体）が基質上に固定化されておらず、溶液中で自由に移動できることを指す。「溶液中で行われる反応」におけるように、反応を記載するために使用する場合、反応がすべて溶液中にある核酸間で起こったことを指す。
【0039】
用語「アダプター」は、文脈から明らかなように、本明細書では異なる趣旨で使用される。一部の実施形態では、「アダプター」とは、以下で検討される「分岐連結アダプター（ＢＬＡ）」を指す。一部の実施形態では、「アダプター」とは、以下に検討される「Ｌアダプター」を指す。ビーズ上に固定化されるＢＬＡは、ビーズに結合した分岐連結アダプター（「ｂ－ＢＬＡ」）と呼ばれる。溶液中にあるＢＬＡは、溶液分岐連結アダプター（「ｓ－ＢＬＡ」）と呼ばれる。
【0040】
用語「アダプター化された核酸断片」とは、１つの標的核酸断片と１つ以上のアダプター配列を含むポリヌクレオチドを指す。例えば、１つ以上のアダプター配列は、ｂ－ＢＬＡ内の配列もしくはＬ－アダプター内の配列、またはその両方であり得る。
【0041】
用語「過剰なアダプター」（例えば、過剰なｂ－ＢＬＡアダプター）または「連結されていない（ｕｎｌｉｇｈｔｅｄ）アダプター」とは、ビーズ上に固定化されているが、他のビーズアダプターが標的核酸断片に連結されている状態にあるにもかかわらず標的核酸断片に連結されていないアダプターを指す。
【0042】
用語「伸長された核酸断片」または「バーコード化された伸長生成物」は、アダプターに連結され、バーコードのコピーを含むように伸長された断片を指す。
【0043】
用語「連結された生成物」または「連結されたアダプター」とは、標的核酸断片と少なくともｂ－ＢＬＡアダプター由来のアダプター配列を含む生成物を指す。場合によっては、連結された生成物は、一端においてｂ－ＢＬＡ由来のアダプター配列と、他端において別のアダプター（例えば、Ｌ－アダプター）由来のアダプター配列をさらに含むことができる。
【0044】
用語「連結された第１のアダプター」とは、標的核酸断片と第１のアダプターの配列の連結によって形成される生成物を指す。
【0045】
用語「アダプター配列」とは、文脈から明らかなように、アダプターのいずれかの鎖上の配列を指す。すなわち、「アダプター配列」とは、一方の鎖上のアダプターの配列と第２の鎖上の相補的配列の両方を指すことができる。例えば、ｂ－ＢＬＡアダプター配列は、バーコードオリゴヌクレオチド上の配列、またはハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド上の配列であり得る。
【0046】
用語「分岐連結アダプター」、「分岐アダプター」または「ＢＬＡ」とは、部分的に二本鎖のアダプターを指す。前記部分的に二本鎖のアダプターは、（ｉ）一方の鎖の５’末端と相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、および（ｉｉ）バーコード配列を含む一本鎖領域を含む。分岐アダプターの二本鎖領域の５’末端は、以下にさらに記載されるように、分岐連結を介して、核酸断片の３’末端に連結することができる。
【0047】
用語「ビーズに固定化された分岐連結アダプター」または「ｂ－ＢＬＡ」とは、ビーズ上に固定化された分岐連結アダプターを指す。本明細書に開示されるｂ－ＢＬＡは、互いにハイブリダイズされるバーコードオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含む。
【0048】
用語「バーコードオリゴヌクレオチド」とは、バーコード配列を含むｂ－ＢＬＡの鎖を指す。
【0049】
用語「ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド」とは、バーコードオリゴヌクレオチドに相補的な分岐連結アダプターの鎖を指す。
【0050】
用語「可逆的ターミネーターヌクレオチド」または「可逆的ターミネーター」とは、３’可逆的ブロッキング基を有するヌクレオチドを指す。「可逆的ブロッキング基」とは、別のヌクレオチドの５’リン酸基に連結することができるヌクレオチドの３’位にヒドロキシル基を提供するために切断され得る基を指す。可逆的なブロッキング基は、酵素、化学反応、熱、および／または光によって切断することができる。３’可逆的ブロッキング基を有する例示的なヌクレオチドは、当該技術分野において公知であり、米国特許第１０，９８８，５０１号に開示され、関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【0051】
用語「コピー」とは、プライマー伸長により鋳型の相補的ヌクレオチド鎖を生成することを指す。
【0052】
ＩＩＩ．本方法の例示的な実施形態
ニック－連結法は、種々のスキームに従って行うことができる。このセクションは、本方法の例示的な実施形態を提供する。この開示によって導かれる分子生物学および配列決定の当業者は、個々の工程の多数の変形を認識し、試薬を以下のスキームに組み込むことができる。
ニック－連結法は、種々のスキームに従って行うことができる。このセクションは、本方法の例示的な実施形態を提供する。この開示によって導かれる分子生物学および配列決定の当業者は、個々の工程の多数の変形を認識し、試薬を以下のスキームに組み込むことができる。
【0053】
方法
１．ニッキング
１つのアプローチでは、標的核酸は、１種以上のニッキング剤と組み合わされ、二本鎖ＤＮＡ中に突出型の一本鎖切断を作出する。一部の実施形態では、ニッキング剤は、酵素（一般に「ニッカーゼ」と呼ばれる）であり、例えば、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断するか、またはポリヌクレオチド鎖から１つ以上の隣接ヌクレオチドを除去するエンドヌクレアーゼである。場合によっては、ニッカーゼは非配列特異的エンドヌクレアーゼであり、ランダムな位置でＤＮＡ鎖にニックを入れる。ニッキング剤の非限定的な例としては、ビブリオ・ブルニフィカス・ヌクレアーゼ（Ｖｖｎ）、エビｄｓＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡｓｅ Ｉ、セグメンターゼ（ＭＧＩ）、およびマスターアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。一部の実施形態では、ニッキング剤は、その認識配列でＤＮＡにニックを入れる、制限エンドヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼである。部位特異的ニッカーゼの非限定的な例としては、全開示が参照により本明細書に組み込まれるShuang-yong Xu, BioMol Concepts 2015; 6(4): 253-267に記載されるＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＣＣＤ）、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、およびＮｔ．ＢｂｖＣＩが挙げられる。
１．ニッキング
１つのアプローチでは、標的核酸は、１種以上のニッキング剤と組み合わされ、二本鎖ＤＮＡ中に突出型の一本鎖切断を作出する。一部の実施形態では、ニッキング剤は、酵素（一般に「ニッカーゼ」と呼ばれる）であり、例えば、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断するか、またはポリヌクレオチド鎖から１つ以上の隣接ヌクレオチドを除去するエンドヌクレアーゼである。場合によっては、ニッカーゼは非配列特異的エンドヌクレアーゼであり、ランダムな位置でＤＮＡ鎖にニックを入れる。ニッキング剤の非限定的な例としては、ビブリオ・ブルニフィカス・ヌクレアーゼ（Ｖｖｎ）、エビｄｓＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡｓｅ Ｉ、セグメンターゼ（ＭＧＩ）、およびマスターアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。一部の実施形態では、ニッキング剤は、その認識配列でＤＮＡにニックを入れる、制限エンドヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼである。部位特異的ニッカーゼの非限定的な例としては、全開示が参照により本明細書に組み込まれるShuang-yong Xu, BioMol Concepts 2015; 6(4): 253-267に記載されるＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＣＣＤ）、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、およびＮｔ．ＢｂｖＣＩが挙げられる。
【0054】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるニッキング剤はまた、化学的ニッキング剤であり得る。化学的ニッキング剤の非限定的な例としては、ジペプチドセリル－ヒスチジン（Ｓｅｒ－Ｈｉｓ）、Ｆｅ２＋／Ｈ２Ｏ２、またはＣｕ（ＩＩ）複合体／Ｈ２Ｏ２が挙げられる。
【0055】
したがって、ニッキング剤は、非特異的ニッカーゼ、部位特異的ニッカーゼ、または化学的ニッキング剤などのカテゴリーにグループ化することができる。一部の実施形態では、本方法は、２種以上のニッキング剤を使用する。一部の実施形態では、本方法は、ニッキング剤の同じカテゴリーからの２種以上のニッキング剤を使用した。一部の実施形態では、本方法は、異なるカテゴリーからのニッキング剤を使用する。
【0056】
多数のパラメータが、切断によって分離された核酸断片の長さに影響し得る。典型的には、ニッキング剤の濃度が高いほど、ニッキング剤による処理時間が長くなるほど、断片の長さは短くなる。これらのパラメータのうちの１つ以上を調整することによって、断片の長さを所望の範囲内で制御することができる。一部の実施形態では、ニッキングから生じる核酸断片の平均長は、２００～１００００ヌクレオチド、例えば、２００～５００ヌクレオチドまたは４００～１０００ヌクレオチドまたは１０００～１００００ヌクレオチドである。
【0057】
２．ギャッピング
一部の実施形態では、ニッカーゼによって作出されるニックは、エキソヌクレアーゼによって伸長（拡大）され、ギャップを形成する。このプロセスは「ギャッピング」と呼ぶことができ、プロセスで使用されるエキソヌクレアーゼは「ギャッピング酵素」と呼ぶことができる。３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の例としては、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片（ヌクレオチドが存在しない場合）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、および当該技術分野において公知である他のものが挙げられる。５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の例としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ切断型、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、および当該技術分野において公知である他のエキソヌクレアーゼが挙げられる。低プロセッシビティエキソヌクレアーゼ（すなわち、比較的低い速度でポリヌクレオチドの末端からヌクレオチドを除去するエキソヌクレアーゼ）は、短いギャップ（例えば、２～７塩基、３～１０塩基、または３～２０塩基）を開き、ＤＮＡから解離してアダプター連結を可能にするより好ましい。エキソヌクレアーゼを用いる場合、必要に応じて、エキソヌクレアーゼ消化からＤＮＡアダプターを保護は、アダプターの５’末端および３’末端に塩基（または修飾塩基）間にホスホロチオエート結合を導入することによって達成することができる。
一部の実施形態では、ニッカーゼによって作出されるニックは、エキソヌクレアーゼによって伸長（拡大）され、ギャップを形成する。このプロセスは「ギャッピング」と呼ぶことができ、プロセスで使用されるエキソヌクレアーゼは「ギャッピング酵素」と呼ぶことができる。３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の例としては、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片（ヌクレオチドが存在しない場合）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、および当該技術分野において公知である他のものが挙げられる。５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の例としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ切断型、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、および当該技術分野において公知である他のエキソヌクレアーゼが挙げられる。低プロセッシビティエキソヌクレアーゼ（すなわち、比較的低い速度でポリヌクレオチドの末端からヌクレオチドを除去するエキソヌクレアーゼ）は、短いギャップ（例えば、２～７塩基、３～１０塩基、または３～２０塩基）を開き、ＤＮＡから解離してアダプター連結を可能にするより好ましい。エキソヌクレアーゼを用いる場合、必要に応じて、エキソヌクレアーゼ消化からＤＮＡアダプターを保護は、アダプターの５’末端および３’末端に塩基（または修飾塩基）間にホスホロチオエート結合を導入することによって達成することができる。
【0058】
図２は、１つ以上のニッキング剤および１つ以上のギャッピング酵素を使用して、突出型の一本鎖切断（２３０）によって分離された重複する核酸断片（２４０）を生成するプロセスを示す。
【0059】
３．アダプターの付加（連結）
上記で検討し、図２に示されるように、ニッキングおよびギャッピングは、各々５’末端および３’末端を有する複数の断片（２４０）を生成する。一部の実施形態では、「断片」は、一本鎖であるが、上記および本明細書の他の箇所で検討されるように、断片は、相補鎖にハイブリダイズして、例えば、核酸複合体を形成することができる。第１のアダプターは、断片の一方の末端（５’末端または３’末端であり得る）に連結され、第２のアダプター（第１のアダプターとは異なる）は、他方の末端に連結される。結果は、２つの異なるアダプター配列を有する複数のアダプター化された断片であり；反応中に生成されたアダプター化された断片のすべては、同一の定義された配列（例えば、５’の第１アダプター配列および３’の第２アダプター配列、または、５’の第２アダプター配列および３’の第１アダプター配列）を有する。
上記で検討し、図２に示されるように、ニッキングおよびギャッピングは、各々５’末端および３’末端を有する複数の断片（２４０）を生成する。一部の実施形態では、「断片」は、一本鎖であるが、上記および本明細書の他の箇所で検討されるように、断片は、相補鎖にハイブリダイズして、例えば、核酸複合体を形成することができる。第１のアダプターは、断片の一方の末端（５’末端または３’末端であり得る）に連結され、第２のアダプター（第１のアダプターとは異なる）は、他方の末端に連結される。結果は、２つの異なるアダプター配列を有する複数のアダプター化された断片であり；反応中に生成されたアダプター化された断片のすべては、同一の定義された配列（例えば、５’の第１アダプター配列および３’の第２アダプター配列、または、５’の第２アダプター配列および３’の第１アダプター配列）を有する。
【0060】
本発明の一態様では、第１のアダプターは、断片の３’末端に連結され、第２のアダプターは、断片の５’末端に連結される。一部の実施形態では、第１のアダプターは、ｂ－ＢＬＡであり、「３’分岐連結」のプロセスにおいて断片に連結される。一部の実施形態では、第２のアダプターは「Ｌ－アダプター」である。一部の実施形態では、第１のアダプターと第２のアダプターの連結は、ニッキングおよびギャッピング反応と同じ反応混合物中で起こる。
【0061】
第１のアダプター連結
一部の実施形態では、第１のアダプターはＢＬＡである。ＢＬＡは当該技術分野において公知であり、上記で定義される。ＢＬＡは、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）バーコード配列を含む一本鎖領域を含む。二本鎖平滑末端は、３’分岐連結を介して標的核酸断片の３’に連結することができる５’リン酸を提供する。３’分岐連結は、平滑末端アダプター（ドナーＤＮＡ）から３’凹型鎖、ギャップ、またはニックでの二重鎖ＤＮＡアクセプターの３’ヒドロキシル末端への５’リン酸の共有結合的な接合を伴う。従来のＤＮＡ連結とは対照的に、３’分岐連結は相補的な塩基対形成を必要としない。３’分岐連結は、Wang et al., BioRxiv, June 29, 2018, doi:https//doi.org/10.1101/357863；ＰＣＴ国際公開第２０１９／２１７４５２号；米国特許出願公開第２０１８／００４４６６８号および国際出願公開第２０１６／０３７４１８号、米国特許出願公開第２０１８／００４４６６７号、ならびにWang et al., June 29, 2018, http://dx.doi.org/10.1101/357863に記載され、これらのすべてはすべての目的のために参照により組み込まれる。
一部の実施形態では、第１のアダプターはＢＬＡである。ＢＬＡは当該技術分野において公知であり、上記で定義される。ＢＬＡは、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）バーコード配列を含む一本鎖領域を含む。二本鎖平滑末端は、３’分岐連結を介して標的核酸断片の３’に連結することができる５’リン酸を提供する。３’分岐連結は、平滑末端アダプター（ドナーＤＮＡ）から３’凹型鎖、ギャップ、またはニックでの二重鎖ＤＮＡアクセプターの３’ヒドロキシル末端への５’リン酸の共有結合的な接合を伴う。従来のＤＮＡ連結とは対照的に、３’分岐連結は相補的な塩基対形成を必要としない。３’分岐連結は、Wang et al., BioRxiv, June 29, 2018, doi:https//doi.org/10.1101/357863；ＰＣＴ国際公開第２０１９／２１７４５２号；米国特許出願公開第２０１８／００４４６６８号および国際出願公開第２０１６／０３７４１８号、米国特許出願公開第２０１８／００４４６６７号、ならびにWang et al., June 29, 2018, http://dx.doi.org/10.1101/357863に記載され、これらのすべてはすべての目的のために参照により組み込まれる。
【0062】
３’分岐連結を用いて、理論的には、補足されたゲノム分子のすべてのサブ断片を増幅し、配列決定することが可能である。したがって、３’分岐連結は、例えば、ＮＧＳライブラリー調製中のＤＮＡまたはＲＮＡへのアダプターの付着を含む、広範囲の分子的応用を有する。
【0063】
さらに、この連結工程は、試料バーコードを、サンプリング多重化のためにゲノム配列に隣接して配置することを可能にする。試料バーコード化のためにこれらのアダプターを使用する利点は、バーコードをゲノムＤＮＡに隣接して配置することにより、同じプライマーを用いてバーコードおよびゲノムＤＮＡを配列決定することができ、バーコードを読み取るために追加の配列決定プライマーを必要としないことである。試料バーコード化により、複数の試料由来の調製物を、配列の前にプールし、バーコードにより区別することができる。３’分岐連結アダプターは、９６、３８４、または１５３６プレートフォーマットで合成することができ、各ウェルは、同じバーコードを担持するアダプターの多数のコピーを含有し、各バーコードはウェル間で異なる。ビーズ上で補足後、これらのアダプターは、９６、３８４、または１５３６プレートフォーマットでの連結のために使用することができる。
【0064】
３’分岐連結は、標準配列決定ライブラリー調製のための、またはバーコードビーズの存在下（ビーズへの付着はバーコードアダプターの３’または５’末端上にあり得る）で、同時バーコードライブラリー調製方法として、単純であり、低コストのバイアスフリー法として行うことができる。この戦略は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの特性に依存し、ニックまたはギャップ中のＤＮＡの３’末端に二本鎖ＤＮＡアダプターを連結することができる、Wang et al., DNA Research, 2019 Feb 1 16(1):45-53に記載されている、いわゆる「３’分岐連結」である。この新規な連結は、ギャップにおいてハイブリダイズするためにアダプターの末端上の縮重一本鎖塩基を必要としないため、制限されたアダプター結合能力を有するビーズ上のより効率的なアダプター連結を可能にする。より大きなギャップ（例えば、４～７塩基）を必要とするＬ－アダプターの連結とは異なり、３’分岐連結はニックまたは非常に小さなギャップ（１塩基ギャップ）で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの前にリガーゼがＬ－アダプターの一本鎖５’－リン酸末端に結合できないという事実を補償するために、高濃度のこの５’縮重Ｌ－アダプターを必要とし得る５’縮重Ｌ－アダプターの連結とは異なっている。
【0065】
ビーズ上の最も効率的な３’－分岐連結を可能にするために、これらのアダプターは、各ビーズの周囲に不完全に包まれた標的ＤＮＡ（例えば、遊離ルースループ）へのアクセスを改善するために、同じ塩基のストレッチまたは単純な反復のストレッチを有することができる。一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、ビーズをゲノムＤＮＡと混合する前に、各アダプターの一本鎖部分に結合させることができる。
【0066】
一部の実施形態では、第１のアダプターは、本明細書では「バーコードオリゴヌクレオチド」および「ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド」と称する２本のポリヌクレオチド鎖を含むｂ－ＢＬＡである。バーコードオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドよりも長く、少なくとも１つのバーコードを含む。バーコードオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、部分的に二本鎖であり、平滑末端を有する複合体を形成する。
【0067】
一部の実施形態では、バーコードオリゴヌクレオチドは、分岐連結において３’凹型断片の３’末端に連結することができる５’リン酸を有し、ビーズに接合される３’末端を有する；一方、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは、ビーズに接合されず、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合の形成を妨げ、したがって、分岐アダプターの自己連結を妨げる３’ブロッカーヌクレオチド（例えば、ジデオキシブロッカーヌクレオチド）を有する。３’分岐連結は、断片に連結されたバーコードオリゴヌクレオチドをもたらす。
図９Ａを参照されたい。
図９Ａを参照されたい。
【0068】
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは、分岐連結において３’凹型断片の３’に連結され得、ビーズに接合される３’末端を有する５’リン酸を有する；一方、バーコードオリゴヌクレオチドはビーズに接合されず、バーコードオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合の形成を妨げる３’ブロッカーヌクレオチドを有する。３’分岐連結（後述）は、断片に連結されたハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドをもたらす。図３および図４を参照されたい。
【0069】
一部の実施形態では、第１のアダプターは溶液中にある。一部の実施形態では、第１のアダプターの一部はビーズ上に固定化され、第１のアダプターの一部は溶液中にある。
【0070】
第２のアダプター連結
ニックが入り、ギャップが形成されたＤＮＡ（互いに関連している）の断片を第２のアダプターに連結する。第２のアダプターは、Ｌ－アダプター、ｓ－ＢＬＡ、または任意の二本鎖もしくは部分的に二本鎖のアダプターであり得る。
ニックが入り、ギャップが形成されたＤＮＡ（互いに関連している）の断片を第２のアダプターに連結する。第２のアダプターは、Ｌ－アダプター、ｓ－ＢＬＡ、または任意の二本鎖もしくは部分的に二本鎖のアダプターであり得る。
【0071】
一部の実施形態では、第２のアダプターはＬアダプターである。一部の実施形態では、Ｌアダプターは溶液中にある。Ｌ－アダプターは米国特許第１０，４７９，９９１号に記載され、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。本方法において使用されるＬ－アダプターは、ハイブリダイゼーション領域および尾部領域を含む一本鎖アダプターである。Ｌ－アダプターのハイブリダイゼーション領域は、３’末端での縮重塩基、例えば、１～１０個、例えば、３～８個、または４～７個の縮重ヌクレオチド（Ｎｓ）を含む。したがって、Ｌ－アダプターは様々な標的配列にハイブリダイズすることができる。上述のニックが入り、ギャップが形成されたＤＮＡ中の核酸断片と接触された場合、Ｌ－アダプターのハイブリダイゼーション領域は、標的核酸中の相補的配列にアニーリングし、一方、尾部領域は一本鎖のままである。連結許容条件下では、Ｌ－アダプターの３’末端は核酸断片の５’末端に連結される。図３～５を参照されたい。
【0072】
一部の実施形態では、Ｌ－アダプターは、連結効率およびアーチファクトの減少を改善するために、ハイブリダイゼーション領域に隣接する特定の塩基を含む。例えば、反応に使用されるニッカーゼが特定の塩基または配列で優先的に切断する場合、連結効率を増加させるために、同じ塩基（または相補的塩基）をＬ－アダプターの末端に操作することができる。一部の実施形態では、異なる配列を有する、例えば異なる数の縮重ヌクレオチドを有する、２つ以上のＬ－アダプターを同じ反応において使用することができる。
【0073】
一部の実施形態では、第２のアダプターは、部分的に鎖にされたアダプターである（図６、７Ｂ、および８）。一部の実施形態では、第２のアダプターは、二本鎖平滑末端を有する。一部の実施形態では、ニックが入り、ギャップが形成されたＤＮＡ中の断片を第１のアダプターに連結し、プライマー伸長を介して二本鎖ＤＮＡを形成した後、第２のアダプターを第１のアダプターとは反対の末端に連結することができる。図５、６Ｂ、および７を参照されたい。一部の実施形態では、第２のアダプターは、平滑末端連結によって断片に接合される。一部の実施形態では、第２のアダプターは、ポリメラーゼがＡ尾部を残す伸長工程中に使用されるという条件で、単一の塩基オーバーハング連結によって断片に接合される。
【0074】
同じ反応におけるニックまたはギャップの５’側および３’側への２つのアダプターの連結
一部の実施形態では、第１のアダプター（例えば、ｂ－ＢＬＡ）は、断片の３’末端に付加することができ、第２のアダプター（例えば、Ｌ－アダプター）は、ニックが入り、ギャップが形成されたＤＮＡの断片の５’末端に連結することができる。連結は同じ混合物中で行われ、一方、ニッキングおよびギャッピングも起こる。一部の実施形態では、ニック－連結反応の１ラウンド後、ゲノムＤＮＡで包まれたビーズを、追加の第１および／または第２のアダプターの存在下で、ニッカーゼおよび／またはギャッピング酵素とともにインキュベートして、ニック－連結反応の第２ラウンドが起こるようにすることができる。このニック－連結プロセスは、複数ラウンド、例えば、２ラウンド、３ラウンド、または４ラウンドについて繰り返して、２つのアダプターで連結された生成物の収率を改善することができる。例示的な例を実施例６および７に示す。
一部の実施形態では、第１のアダプター（例えば、ｂ－ＢＬＡ）は、断片の３’末端に付加することができ、第２のアダプター（例えば、Ｌ－アダプター）は、ニックが入り、ギャップが形成されたＤＮＡの断片の５’末端に連結することができる。連結は同じ混合物中で行われ、一方、ニッキングおよびギャッピングも起こる。一部の実施形態では、ニック－連結反応の１ラウンド後、ゲノムＤＮＡで包まれたビーズを、追加の第１および／または第２のアダプターの存在下で、ニッカーゼおよび／またはギャッピング酵素とともにインキュベートして、ニック－連結反応の第２ラウンドが起こるようにすることができる。このニック－連結プロセスは、複数ラウンド、例えば、２ラウンド、３ラウンド、または４ラウンドについて繰り返して、２つのアダプターで連結された生成物の収率を改善することができる。例示的な例を実施例６および７に示す。
【0075】
条件は、Ｌ－アダプターの濃度、温度、サイクリング、ｐＨ、塩濃度、他の添加物を調節して、ゲノム断片に連結されている分岐アダプターを用いて３’末端のＤＮＡ呼吸を増強し、Ｌ－アダプターハイブリダイゼーションおよび連結のための短い一本鎖領域を可能にすることによって、ニック中の両方のアダプターの同時連結のために最適化することができる。下記のセクション５「同時ニッキングおよび連結のための条件」を参照されたい。一部の実施形態では、より完全な連結を達成し、したがって、より重複しない読み取り範囲を達成するために、追加の分岐連結アダプターを、ｂ－ＢＬＡに加えて、反応に溶液（ｓ－ＢＬＡ）中で添加することができる。
【0076】
一部の実施形態では、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を反応に添加して、過剰な第１のアダプターを除去する。これは、Ｌ－アダプター連結の前に、またはＬ－アダプター連結と同時に行うことができる。過剰なアダプターを除去しなければならないため、より高い濃度のＬ－アダプター、例えば、０．０１～１００μＭ、０．１～５０μＭ、０．５～３０μＭ、１～２０μＭを、実質的な量のビーズ－アダプター＋Ｌ－アダプター連結アーチファクトを生成することなく使用することができる。第１のアダプター配列と第２のアダプター配列（例えば、Ｌ－アダプター）の両方を有するアダプター化された断片は、イルミナタイプ、および環状化を必要としない他のシステムで配列決定することができる。配列決定の態様を以下にさらに記載する。
【0077】
場合によっては、３’エキソヌクレアーゼ活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ヌクレオチドを含まないクレノウ断片、エキソヌクレアーゼＩＩＩなど）または５’エキソヌクレアーゼ活性（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ全長またはヌクレオチドを含まないＴａｑポリメラーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ切断型、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼなど）を有するさらなる酵素を添加して、第２のアダプター（例えば、Ｌ－アダプター）の連結のためのスペースをより多くするためにニックの開口を増加させることもできる。３’と５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する酵素または酵素の組合せは、分岐アダプターがニック内で連結したとしても、Ｌ－アダプター連結のためのギャップを作る利点を有する。エキソヌクレアーゼを用いる場合、必要に応じて、アダプターの５’末端および３’末端における塩基および／または修飾塩基の間のホスホロチオエート結合を介して、ＤＮＡアダプターの保護を達成することができる。上述したように、この反応は、ポリエチレングリコールまたはベタインの存在下で行われ、連結および／またはニッカーゼ酵素の活性を増加させることができる。
【0078】
この時点で、必要に応じて、上記で検討した過剰なアダプターを除去することができる。低濃度のＬ－アダプターおよび他の条件を使用して、アダプター－アダプター連結（例えば、Ｌ－アダプター自体間の連結、またはｂ－ＢＬＡとＬ－アダプター間の連結）を減少させ、エキソヌクレアーゼによる過剰なアダプター除去をスキップすることができる。さもなければ、ここではサブ断片の両側にアダプター配列があるため、ＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲが行われた後か、またはＰＣＲがＰＣＲを含まないプロセスのためにスキップされた場合には、前のセクションで説明したように、環状化に続いてローリングサークル増幅が次の工程である。
【0079】
１つの例示的な実施形態では、単一の反応混合物において、非特異的なニッキングヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、および第１のアダプター、および第２のアダプターは、二本鎖標的核酸と混合されて、両末端にアダプター配列を有する断片を生成する。好ましい実施形態では、第１および第２のアダプターのうちの１つは、ミクロンサイズのビーズに結合され、他のアダプターは溶液中にある。
【0080】
単一の反応混合物中に２つのアダプターを添加するプロセスは、標準的な配列決定ライブラリー調製のための単純であり、低コストのバイアスフリー方法として溶液中で行うことができる。このプロセスはまた、アダプターが付着したバーコードビーズとともに使用される場合、同時バーコードライブラリー調製方法として使用することができる。
【0081】
４．ニッキングと連結を同時に行うための条件
一部の実施形態では、リガーゼの活性、ニッキング剤の活性、またはその両方を増加させるために、標的核酸をニッキングおよびギャッピングし、ニッキングおよびギャッピングによって生成された断片に１つ以上のアダプターを連結することを、添加物（例えば、ポリエチレングリコールまたはベタイン）の存在下で行うことができる。一部の実施形態では、連結することは、少なくともビーズに結合された第１アダプター（例えば、ｂ－ＢＬＡ）を核酸断片に連結することを含む。一部の実施形態では、連結は、溶液中のビーズに結合された第１アダプターと、第２アダプター（例えば、Ｌ－アダプター）の両方を核酸断片に連結することを含む。
一部の実施形態では、リガーゼの活性、ニッキング剤の活性、またはその両方を増加させるために、標的核酸をニッキングおよびギャッピングし、ニッキングおよびギャッピングによって生成された断片に１つ以上のアダプターを連結することを、添加物（例えば、ポリエチレングリコールまたはベタイン）の存在下で行うことができる。一部の実施形態では、連結することは、少なくともビーズに結合された第１アダプター（例えば、ｂ－ＢＬＡ）を核酸断片に連結することを含む。一部の実施形態では、連結は、溶液中のビーズに結合された第１アダプターと、第２アダプター（例えば、Ｌ－アダプター）の両方を核酸断片に連結することを含む。
【0082】
４．１ 温度
反応は、５～６５℃、例えば、５～４２℃、１０～３７℃、または５～１５℃の範囲内の温度に維持することができる。一部の実施形態では、反応は、室温、３７℃に維持される。一部の実施形態では、サーモスタバイルリガーゼおよびニッキング酵素を使用する場合、反応は、３７℃より高い温度に維持することができる。一部の実施形態では、反応は、複数のサイクル（例えば、５～１００サイクル、または２０～６０サイクル、３０～５５サイクルなど）について、より低い温度（５℃～２５℃、例えば、１０℃から１５℃）とより高い温度（例えば、３７℃またはそれ以上）の間で条件サイクリングに供される。例示的な例を実施例１～７に示す。
反応は、５～６５℃、例えば、５～４２℃、１０～３７℃、または５～１５℃の範囲内の温度に維持することができる。一部の実施形態では、反応は、室温、３７℃に維持される。一部の実施形態では、サーモスタバイルリガーゼおよびニッキング酵素を使用する場合、反応は、３７℃より高い温度に維持することができる。一部の実施形態では、反応は、複数のサイクル（例えば、５～１００サイクル、または２０～６０サイクル、３０～５５サイクルなど）について、より低い温度（５℃～２５℃、例えば、１０℃から１５℃）とより高い温度（例えば、３７℃またはそれ以上）の間で条件サイクリングに供される。例示的な例を実施例１～７に示す。
【0083】
４．２ ｐＨ
一部の実施形態では、反応混合物のｐＨは、ライブラリー調製に必要なすべての酵素機能を収容するために、５．０～９．０の範囲内、例えば７．０～９．０の範囲内のｐＨに維持される。ニッキングおよび連結反応の持続時間は、核酸断片の所望のサイズ、および他の条件、例えば、酵素（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはその両方を含む）の濃度、時間、温度、入力ＤＮＡ量に依存して変化し得る。
一部の実施形態では、反応混合物のｐＨは、ライブラリー調製に必要なすべての酵素機能を収容するために、５．０～９．０の範囲内、例えば７．０～９．０の範囲内のｐＨに維持される。ニッキングおよび連結反応の持続時間は、核酸断片の所望のサイズ、および他の条件、例えば、酵素（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはその両方を含む）の濃度、時間、温度、入力ＤＮＡ量に依存して変化し得る。
【0084】
４．３ 時間
典型的には、ニッキングおよび連結反応の持続時間は、５分～５時間、例えば、１５～９０分間、または３０～１２０分間であり得る。反応は、当該技術分野において周知である方法を用いて終結させることができる。一部の実施形態では、ニッキングおよび連結は、溶液中で行われ、反応は、ＤＮＡ精製方法（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズなど）を介して終結させることができる。一部の実施形態では、ニッキングおよび連結は、ビーズ上で行われ、反応は、ニッキングおよび連結反応に必要な酵素および成分を除去するために、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ ＮａＣｌ緩衝液）でビーズを洗浄することによって終結され得る。
典型的には、ニッキングおよび連結反応の持続時間は、５分～５時間、例えば、１５～９０分間、または３０～１２０分間であり得る。反応は、当該技術分野において周知である方法を用いて終結させることができる。一部の実施形態では、ニッキングおよび連結は、溶液中で行われ、反応は、ＤＮＡ精製方法（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズなど）を介して終結させることができる。一部の実施形態では、ニッキングおよび連結は、ビーズ上で行われ、反応は、ニッキングおよび連結反応に必要な酵素および成分を除去するために、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ ＮａＣｌ緩衝液）でビーズを洗浄することによって終結され得る。
【0085】
４．４ 酵素
本明細書に記載される方法および組成物は、単一の反応混合物中でニッキングおよび連結を行うことを可能にする。一部の実施形態では、連結がニッキング／ギャッピングよりも高い速度で起こるように、条件および酵素が選択される。これにより、最初にギャップが形成されたニックの一部が、その後のギャッピングの前にアダプターがそのほとんどに連結され、したがって、ＤＮＡの喪失を最小限にすることが保証される。本明細書に開示される方法および組成物は、高いニック再密封率、例えば、７０～１００％のニック再密封率、例えば、７０～９０％、８０～９０％、８０～９５％、９０～９９％を可能にする。本明細書に開示されているニック再密封率とは、開かれているギャップのパーセンテージがリガーゼによって再密封されることを指す。高いニック再密封率は、多くの方法によって達成され得る。一部の実施形態では、ニッキングは、低活性ニッカーゼを用いて行われる。一部の実施形態では、ニッキングは、低濃度、例えば、００００００１～１０Ｕ／ｕｌでニッカーゼを用いて行われる。一部の実施形態では、連結は、高い連結率を有するリガーゼを用いて行われる。一部の実施形態では、連結は、高濃度、例えば、１～１００Ｕ／μｌのリガーゼを用いて行われる。
本明細書に記載される方法および組成物は、単一の反応混合物中でニッキングおよび連結を行うことを可能にする。一部の実施形態では、連結がニッキング／ギャッピングよりも高い速度で起こるように、条件および酵素が選択される。これにより、最初にギャップが形成されたニックの一部が、その後のギャッピングの前にアダプターがそのほとんどに連結され、したがって、ＤＮＡの喪失を最小限にすることが保証される。本明細書に開示される方法および組成物は、高いニック再密封率、例えば、７０～１００％のニック再密封率、例えば、７０～９０％、８０～９０％、８０～９５％、９０～９９％を可能にする。本明細書に開示されているニック再密封率とは、開かれているギャップのパーセンテージがリガーゼによって再密封されることを指す。高いニック再密封率は、多くの方法によって達成され得る。一部の実施形態では、ニッキングは、低活性ニッカーゼを用いて行われる。一部の実施形態では、ニッキングは、低濃度、例えば、００００００１～１０Ｕ／ｕｌでニッカーゼを用いて行われる。一部の実施形態では、連結は、高い連結率を有するリガーゼを用いて行われる。一部の実施形態では、連結は、高濃度、例えば、１～１００Ｕ／μｌのリガーゼを用いて行われる。
【0086】
４．５ 成分を添加する順番
単一の反応混合物に成分を加える順番を変化させることができる。一部の実施形態では、ニッカーゼを添加する前に、またはニッカーゼを添加すると同時に、リガーゼを添加する。リガーゼを添加し、標的核酸をビーズに装填する順番を変化させることができる。一部の実施形態では、リガーゼは、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を添加する前に、アダプターで固定化されたビーズに添加される。一部の実施形態では、標的核酸は、リガーゼを添加する前にビーズに装填される。
単一の反応混合物に成分を加える順番を変化させることができる。一部の実施形態では、ニッカーゼを添加する前に、またはニッカーゼを添加すると同時に、リガーゼを添加する。リガーゼを添加し、標的核酸をビーズに装填する順番を変化させることができる。一部の実施形態では、リガーゼは、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を添加する前に、アダプターで固定化されたビーズに添加される。一部の実施形態では、標的核酸は、リガーゼを添加する前にビーズに装填される。
【0087】
一部の実施形態では、ニッキングおよび連結の前に標的核酸がビーズに結合されるように、ニッカーゼ、リガーゼのいずれかを添加する前に、ビーズ上に標的核酸を装填することが望ましい。ゲノムＤＮＡは、典型的には、ミクロンサイズの常磁性ビーズの周りに非常に速く、典型的には約１～１０分間で包むことができる。一部の実施形態では、追加の手順を採用して、長いＤＮＡ（例えば、２００ｋｂより長いもの）を大きなビーズ（例えば、直径３ミクロン以上を有するビーズ）に結合させるために特に有用であり得る、ビーズに対する標的核酸の結合効率を増加させることができる。一部の実施形態では、標的核酸は、ＰＥＧを含む緩衝液中のビーズに結合され、比較的高い濃度、例えば、３～１２％、例えば、５～１０％を有し、より高いＰＥＧ濃度は一般に高い結合をもたらす。一部の実施形態では、標的核酸は、ビーズへの標的核酸の吸収を増強するために、比較的高いｐＨを有する緩衝液中でビーズに結合される。一部の実施形態では、ｐＨは、７．５より大きく、例えば、７．５～９、８．０～９．０、または８．０～８．５である。高いｐＨは、特に、より低いＰＥＧ濃度、例えば、５％を有する緩衝液におけるＤＮＡ吸着を増加させる。一部の実施形態では、緩衝液は、低塩濃度、例えば、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む。本明細書に開示される方法および組成物は、これらの条件下で迅速に（例えば、５～１５分、ＤＮＡの大部分が１～５分または２～１０分で結合する）長いＤＮＡがビーズ周囲で包むことを可能にし、ビーズに結合する前に長いＤＮＡ（例えば、＞２００ｋｂ、または＞３００ｋｂ、または＞５００ｋｂ）の破砕を最小限にすることを可能にする。一例では、１Ｍｂを超える長さを有するｇＤＮＡは、約３ｕｍの直径を有するビーズと結合することができる。
【0088】
ビーズに結合された標的核酸は、ニッキング、ギャッピング、またはアダプター連結などの酵素反応にアクセス可能であり続けることができる。これにより、１０～１０００の接触点でビーズに結合した長いＤＮＡ断片（例えば、２０～５００ｋｂ）の同時バーコード化が可能となる。これにより、ビーズに吸着されたＤＮＡ上の複数の連続した酵素反応の一般的なプロトコール、特に上述のようにビーズへのＤＮＡ結合を維持する条件が可能になる。
【0089】
ＤＮＡは、配列決定のための調製において、ビーズから放出され得る。ＤＮＡを放出する方法は、限定されないが、７～８の範囲のｐＨ、例えば、１０分～１時間、例えば、約１５分～約４５分、約１５分～約４５分、または約３０分で約７．５である低塩緩衝液（＜２００ｍＭ）を使用することを含む。
【0090】
５．過剰なビーズに結合したアダプターを除去するための任意の工程
ニッキングおよび連結後、種々の酵素を使用して、過剰なアダプター、すなわち、標的核酸断片と連結されていないアダプターを除去してもよい。一部の実施形態では、ビーズに結合したアダプターは、部分的に二本鎖であり、その各々は、比較的短い二本鎖領域（例えば、６～２０塩基）を含み、比較的容易に変性され得る。すなわち、ビーズ上に固定化された二本鎖ゲノムＤＮＡの破壊をもたらさない条件下で、アダプターを一本鎖ＤＮＡに変性させることができる。これは、短い二本鎖領域の融点まで温度を上げることによって、最も容易に達成することができる。
ニッキングおよび連結後、種々の酵素を使用して、過剰なアダプター、すなわち、標的核酸断片と連結されていないアダプターを除去してもよい。一部の実施形態では、ビーズに結合したアダプターは、部分的に二本鎖であり、その各々は、比較的短い二本鎖領域（例えば、６～２０塩基）を含み、比較的容易に変性され得る。すなわち、ビーズ上に固定化された二本鎖ゲノムＤＮＡの破壊をもたらさない条件下で、アダプターを一本鎖ＤＮＡに変性させることができる。これは、短い二本鎖領域の融点まで温度を上げることによって、最も容易に達成することができる。
【0091】
表１は、この目的のために使用され得る種々の酵素を示す。
表１．過剰なビーズに結合したアダプターを除去するために使用され得る例示的な酵素
表１．過剰なビーズに結合したアダプターを除去するために使用され得る例示的な酵素
【表1】
【0092】
次に、エキソヌクレアーゼを用いて、変性させた一本鎖のビーズに結合したアダプターを除去することができる。一部の実施形態では、ビーズに付着した３’末端を有する過剰なビーズに結合したアダプターは、５’から３’方向に一本鎖ＤＮＡからヌクレオチドを除去することができるエキソヌクレアーゼ（例えば、ＲｅｃＪまたはＥｘｏＶＩＩ）を用いて除去される。一部の実施形態では、ビーズに接合した５’末端を有する過剰なビーズに結合したアダプターは、３’から５’方向に一本鎖ＤＮＡからヌクレオチドを除去することができるエキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅｘｏ１、ＥｘｏＴ）を用いて除去される。
【0093】
あるいは、変性を必要とせず、過剰な、部分的に二本鎖のビーズに結合したアダプターを、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼと、ｄＳＤＮＡ上に３’～５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えば、ＥｘｏＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼの混合物によって、ｄＮＴＰが存在しない場合、消化することができる。この実施形態では、ゲノムｄｓＤＮＡは、ＤＮＡニックまたはギャップの３’末端に連結されたアダプターによって、これらの酵素による分解から保護される。連結は、これらのｄｓＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼの基質ではない、一本鎖末端を有する核酸断片をもたらす。
【0094】
別のアプローチでは、ビーズに結合したアダプターの短い二本鎖領域は、特定の塩基（例えば、ウラシルまたはイノシン）で設計することができ、これらの塩基は、対応するＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、ＵＤＧまたはｈＡＡＧ）（脱塩基部位を作出するため）、次に、ＥｎｄｏＩＶ、ＥｎｄｏＶＩＩＩ、ＡＰＥ１、または脱塩基部位を除去することができる任意の他の酵素による処理によって除去することができる。この戦略を用いると、短い二本鎖領域の融解温度は、連続する二本鎖領域の長さが、これらの塩基の除去後にさらに減少するにつれて、さらに低下させることができる。
【0095】
さらに別のアプローチでは、反応が溶液中で行われ、過剰なアダプターがＤＮＡ精製方法（例えば、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ）によって除去され得る場合。さらに別のアプローチでは、反応がビーズ上で行われる場合、アダプターに連結された過剰なアダプターおよび生成物は、酵素的放出を介してビーズから放出され得る。一部の実施形態では、ビーズに結合したアダプターは、ビーズの近位位置にウラシル、またはイノシン、またはその両方を含み、酵素を添加して、これらの塩基を放出し、したがって、ビーズからアダプターを放出することができる。一部の実施形態では、アダプターは、化学的処理に感受性である結合を介してビーズに結合され、化学物質は、アダプターを放出するために添加され得る。一例において、アダプターは、ビオチンストレプトアビジン相互作用を介してビーズに結合され、熱され、またはビーズに結合したアダプターをホルムアミドで処理することによって、相互作用を破壊することができる。別の例において、アダプターは光切断可能なリンカーを介してビーズに結合され、光は、リンカーを切断し、アダプターをビーズから放出するために使用され得る。
【0096】
一部の実施形態では、本方法は、過剰なビーズに結合したアダプターを除去する工程を含まず；上述のようにニッキングおよび連結工程の後、プライマー伸長工程が行われる。一部の実施形態では、プライマー伸長工程は、過剰なビーズに結合したアダプターの除去後に行われる。
【0097】
６．バーコードをコピーするための伸長
一部の実施形態では、分岐アダプターで連結された核酸断片は、次に、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、バーコードをコピーする。１つの例示的な実施形態が図６に示される。
一部の実施形態では、分岐アダプターで連結された核酸断片は、次に、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、バーコードをコピーする。１つの例示的な実施形態が図６に示される。
【0098】
一部の実施形態では、プライマー伸長工程は、ビーズ上でまたは溶液中で、バーコードをコピーするために行うことができる。一部の実施形態では、変性工程（例えば、熱による）を行って、アダプターと連結された一本鎖断片を生成し、鎖置換活性を有さないポリメラーゼ（例えば、ｐｆｕ、ｐｆｕＣｘ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＤＮＡ ｐｏｌ１）を用いて、バーコードをコピーするために核酸断片と連結された鎖を伸長する。図３および図４。一部の実施形態では、変性工程は行われず、プライマーは、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔ）を用いて伸長される。例示的な一例では、反応を９５℃で３分間変性させ、続いて、プライマーを５５℃で３分間アニーリングし、プライマーをｐｆｕＣｘを用いて７２℃で１０分間伸長する。
【0099】
一部の実施形態では、バーコード化された伸長生成物が溶液中にある場合、別の精製ラウンドをこの工程で行うことができる。ビーズにまだ結合している場合は、ビーズをＴｒｉｓ ＮａＣｌ緩衝液中で洗浄することができる。
【0100】
伸長された核酸断片が、図３および４に示されるように、核酸断片の各末端に１つずつ、すでに２つのアダプターを含有するシナリオにおいて、伸長された断片は、以下に記載されるように、さらなる処理のためにビーズから放出され得る。一部の実施形態では、図６および７Ａに示されるような伸長生成物中には、１つのアダプターのみが存在し、第１のアダプターからの核酸断片の反対の末端への第２のアダプターの連結が行われ得る。一部の実施形態では、第２のアダプターは、平滑末端連結によって核酸断片に連結される。一部の実施形態では、Ａ尾部を残す伸長工程中にポリメラーゼが使用された場合、第２のアダプターは、単一の塩基オーバーハング連結によって核酸断片に連結され得る。重要なことに、これをＰＣＲフリーの方法で行う目的で、アダプターの３’ＯＨが生成物の５’ＰＯ４に連結される。これが元のＤＮＡ鎖である（伸長の過程で作製されたコピーではない）。ＰＣＲに基づくライブラリー準備戦略のために、別ラウンドのＤＮＡ精製が、典型的には、この時点で行われ、続いてＰＣＲ増幅が行われる。
【0101】
７．連結されたアダプターと連結されていないアダプターを分離するための制御された伸長
７．１ 制御された伸長
別の態様では、第１のアダプター（例えば、ｂ－ＢＬＡ）の、上述される一本鎖切断によって分離された核酸断片への分岐連結を行った後、本方法は、伸長反応の程度の制御を可能にする条件下で、第１のアダプター配列にハイブリダイズされるプライマーを伸長することを含む。これらの伸長制御条件は、限定されないが、適切な重合速度または他の特性を有するポリメラーゼ（複数可）を選択すること、および（限定されないが）反応温度、反応の持続時間、プライマー組成物、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびヌクレオチド濃度、添加剤、ならびに緩衝組成物を含む種々の反応パラメータを使用することを含む。場合によっては、伸長は可逆的ターミネーターと伸長のための正常なヌクレオチドの混合物によって制御することができる。可逆的ターミネーターヌクレオチドの量と正常なヌクレオチドの量の比は、伸長の程度を達成するように調整することができる；一般に、正常なヌクレオチドの量に対する可逆的ターミネーターヌクレオチドの量のより高い比は、完全とはいえない伸長をもたらす。一部の実施形態では、伸長は、約１００～１５０塩基のみを追加するように制御される。
７．１ 制御された伸長
別の態様では、第１のアダプター（例えば、ｂ－ＢＬＡ）の、上述される一本鎖切断によって分離された核酸断片への分岐連結を行った後、本方法は、伸長反応の程度の制御を可能にする条件下で、第１のアダプター配列にハイブリダイズされるプライマーを伸長することを含む。これらの伸長制御条件は、限定されないが、適切な重合速度または他の特性を有するポリメラーゼ（複数可）を選択すること、および（限定されないが）反応温度、反応の持続時間、プライマー組成物、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびヌクレオチド濃度、添加剤、ならびに緩衝組成物を含む種々の反応パラメータを使用することを含む。場合によっては、伸長は可逆的ターミネーターと伸長のための正常なヌクレオチドの混合物によって制御することができる。可逆的ターミネーターヌクレオチドの量と正常なヌクレオチドの量の比は、伸長の程度を達成するように調整することができる；一般に、正常なヌクレオチドの量に対する可逆的ターミネーターヌクレオチドの量のより高い比は、完全とはいえない伸長をもたらす。一部の実施形態では、伸長は、約１００～１５０塩基のみを追加するように制御される。
【0102】
一部の実施形態では、プライマーは、第１のアダプターにおけるバーコード配列に対して３’であり、伸長制御条件下で伸長される配列にハイブリダイズする。このような条件下で、第１のアダプターを標的断片に連結することによって産生される連結生成物をコピーするためのプライマーの伸長は不完全であり、その結果、部分的に二本鎖の分子が生じる；一方、プライマーの伸長によって連結されていないｂ－ＢＬＡをコピーすることが完了し、その結果、二本鎖分子が生じる。制御された伸長を用いてアダプター化された核酸断片を調製する例示的な例を図１０Ａ～１０Ｂおよび図１１Ａ～１１Ｂに示す。
【0103】
連結された第１のアダプターをコピーするためのプライマーの不完全な伸長は、３’分岐連結のために用いることができる５’オーバーハングを残す。可逆的ターミネーターを用いると、伸長反応の終わりに可逆的ターミネーターのブロック基が除去され、３’ＯＨ基が回復する。この時点で、第２のアダプターを断片の３’末端に連結するために３’分岐連結を行うことができ、したがって、一方の末端に第１のアダプター配列を有し、他方の末端に第２のアダプター配列を有するアダプター化された断片を生成する。一部の実施形態では、可逆的ターミネーターは、核酸断片中のほとんどのヌクレオチドにわたって重複する範囲を提供するために、異なる濃度、異なる時点、または異なるサイクルで添加することができる。
【0104】
プライマーを完全に伸長させて、連結していない第１のアダプターをコピーすると、二本鎖分子が生じ、二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって分解および除去され得る。表１を参照されたい。
【0105】
７．２ 過剰なアダプターの除去
以下の例示的なアプローチは、ライブラリー調製におけるこれらの連結されていないアダプターの負の干渉を最小限にするために、過剰の連結されていないアダプター（すなわち、いずれの核酸断片にも連結されていないアダプター）を除去するために使用することができる。
以下の例示的なアプローチは、ライブラリー調製におけるこれらの連結されていないアダプターの負の干渉を最小限にするために、過剰の連結されていないアダプター（すなわち、いずれの核酸断片にも連結されていないアダプター）を除去するために使用することができる。
【0106】
７．２．１ ビーズ精製による連結されていないアダプターの除去
一部の実施形態では、溶液中の過剰なアダプターは、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）によって除去することができる。
一部の実施形態では、溶液中の過剰なアダプターは、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）によって除去することができる。
【0107】
７．２．２ ヘアピンアダプターを有する連結されていないアダプターのブロック
一部の実施形態では、過剰なアダプターは、限定されないが、以下のアプローチを含む方法を用いて、分解またはブロックされ得る。図９Ａおよび９Ｂに記載される第１の方法は、伸長が約１００～１５０塩基のみを付加するように制御されたプライマー伸長を使用する。この伸長に用いられるポリメラーゼ（例えば、Ｔａｇポリメラーゼ）は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性をもたず、平滑末端を生成し、３’末端にＡ尾部を付加することができる。これにより、完全な伸長を引き起こし、過剰なアダプターのＡ尾部（すなわち、アダプターの３’末端にＡを加える）（９５０）が生じるが、アダプター化された断片をコピーするための伸長（９４０）は不完全である。次に、完全に伸長された過剰アダプター（９５０）のＡ尾部に相補的なＴ尾部を有するヘアピンアダプターを用いて連結を行い、これらの過剰アダプターの伸長を阻止する。しかしながら、ヘアピンアダプターは、不完全に伸長されたアダプター化された核酸断片（９７０）に連結することができない。したがって、これらの断片（９７０）は、さらに、一緒に伸長することができる。一部の実施形態では、伸長は、正常なヌクレオチドおよび可逆的ターミネーターの混合物の存在下で行われ、続いて、ターミネーターブロッキング基を除去するための反応、次に、ＢＬＡ（９８０）との３’分岐連結が行われる。この生成物（９９０）を変性させ、ビーズから分離し、配列決定のために保存することができる。ビーズは、可逆的ターミネーター、ブロック基の除去、３’分岐連結、および変性を伴うプライマー伸長の別のラウンドのために再利用することができる。このプロセスは、様々な濃度のターミネーターを用いて、複数回繰り返すことができ、ゲノム断片のほぼ完全な重複するＤＮＡ範囲を可能にする。
一部の実施形態では、過剰なアダプターは、限定されないが、以下のアプローチを含む方法を用いて、分解またはブロックされ得る。図９Ａおよび９Ｂに記載される第１の方法は、伸長が約１００～１５０塩基のみを付加するように制御されたプライマー伸長を使用する。この伸長に用いられるポリメラーゼ（例えば、Ｔａｇポリメラーゼ）は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性をもたず、平滑末端を生成し、３’末端にＡ尾部を付加することができる。これにより、完全な伸長を引き起こし、過剰なアダプターのＡ尾部（すなわち、アダプターの３’末端にＡを加える）（９５０）が生じるが、アダプター化された断片をコピーするための伸長（９４０）は不完全である。次に、完全に伸長された過剰アダプター（９５０）のＡ尾部に相補的なＴ尾部を有するヘアピンアダプターを用いて連結を行い、これらの過剰アダプターの伸長を阻止する。しかしながら、ヘアピンアダプターは、不完全に伸長されたアダプター化された核酸断片（９７０）に連結することができない。したがって、これらの断片（９７０）は、さらに、一緒に伸長することができる。一部の実施形態では、伸長は、正常なヌクレオチドおよび可逆的ターミネーターの混合物の存在下で行われ、続いて、ターミネーターブロッキング基を除去するための反応、次に、ＢＬＡ（９８０）との３’分岐連結が行われる。この生成物（９９０）を変性させ、ビーズから分離し、配列決定のために保存することができる。ビーズは、可逆的ターミネーター、ブロック基の除去、３’分岐連結、および変性を伴うプライマー伸長の別のラウンドのために再利用することができる。このプロセスは、様々な濃度のターミネーターを用いて、複数回繰り返すことができ、ゲノム断片のほぼ完全な重複するＤＮＡ範囲を可能にする。
【0108】
７．２．３ 過剰なアダプターの分解
別の実施形態では、図１０Ａおよび１０Ｂに開示されるように、制御された伸長は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ、Ｑ５、Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｔ７、Ｖｅｎｔ、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ４）を用いて行われる。伸長は、約１００～１５０塩基に限定される。この場合も、結果は、ゲノム断片に連結されたアダプターでは不完全な伸長が起こり、これらの過剰なアダプター（すなわち、連結されていないアダプター）では完全な伸長が起こるということである。ポリメラーゼの３－５’エキソヌクレアーゼ活性のため、結果は、５’リン酸を有する平滑末端ｄｓＤＮＡアダプターである。これはラムダエキソヌクレアーゼの完全な基質であるが、それらのアダプター化された断片の不完全な伸長生成物はラムダエキソヌクレアーゼの良好な基質ではない。結果として、ラムダエキソヌクレアーゼによる処理を用いて、連結されていない過剰アダプターのすべてを分解することができる。図９Ａおよび９Ｂに記述されたものと本質的に同一である残りの工程は、第２のアダプターをゲノム断片に連結するために使用される。
別の実施形態では、図１０Ａおよび１０Ｂに開示されるように、制御された伸長は、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ、Ｑ５、Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｔ７、Ｖｅｎｔ、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ４）を用いて行われる。伸長は、約１００～１５０塩基に限定される。この場合も、結果は、ゲノム断片に連結されたアダプターでは不完全な伸長が起こり、これらの過剰なアダプター（すなわち、連結されていないアダプター）では完全な伸長が起こるということである。ポリメラーゼの３－５’エキソヌクレアーゼ活性のため、結果は、５’リン酸を有する平滑末端ｄｓＤＮＡアダプターである。これはラムダエキソヌクレアーゼの完全な基質であるが、それらのアダプター化された断片の不完全な伸長生成物はラムダエキソヌクレアーゼの良好な基質ではない。結果として、ラムダエキソヌクレアーゼによる処理を用いて、連結されていない過剰アダプターのすべてを分解することができる。図９Ａおよび９Ｂに記述されたものと本質的に同一である残りの工程は、第２のアダプターをゲノム断片に連結するために使用される。
【0109】
さらに別の実施形態では、連結されていないアダプターの完全な伸長および連結された生成物の不完全な伸長をもたらす制御された伸長の後（図１１Ａ）、制御された伸長は、反応に添加される可逆的ターミネーターとともに継続される。一定時間後、ターミネーターブロッキング基を伸長生成物から除去し、第２のアダプターを、連結許容条件下（例えば、リガーゼおよび連結緩衝液の存在下）で反応物に添加する。図１１Ｂ。これは、過剰なアダプターの平滑末端連結およびアダプター化された断片の３’分岐連結をもたらす。この時点で、鎖置換ポリメラーゼを用いて、新たに連結された分岐連結アダプターの一方の鎖（１１９０）を伸長することによって、制御されたプライマー伸長が行われる。前述のように、この伸長は、時間、温度、および／またはヌクレオチド濃度によって制御され、約１００～１５０塩基だけ伸長する。この伸長は、第１のアダプター（例えば、ｂ－ＢＬＡ）の鎖置換およびｄｓＤＮＡアダプター（１１８０＋１１９０）のコピーの放出をもたらし、ビーズから分離して回収することができる。前の実施例と同様に、ビーズを保存することができ、このプロセスを繰り返して、ゲノムＤＮＡ断片に連結された各アダプターから重複する断片を生成する。
【0110】
一部の実施形態では、連結された第１のアダプターが上述のように伸長された後（例えば、伸長制御条件下で）、第２のアダプター（図８、８９０）は、例えば、ブラント連結または分岐連結を介して伸長された生成物の末端に連結され得る。
【0111】
８．放出
各末端に１つずつ２つのアダプターを有する伸長された断片は、ビーズから放出される。ビーズからの放出は、ビーズを分解することによって、またはアダプターオリゴヌクレオチドとビーズの間の化学連結を切断することによって行うことができる。場合によっては、放出は、ＥｎｄｏＶ酵素を用いて捕捉オリゴヌクレオチドからイノシン残基を除去するか、またはウラシルデグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＩＶ／ＥｎｄｏＶＩＩＩまたは同様の機能を有する他の酵素によるウラシルヌクレオチドの除去によって行われる。場合によっては、捕捉オリゴヌクレオチドは、１つ以上のジスルフィド結合を介してビーズに架橋される。このような場合、放出は、ビーズを還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））に曝露させることによって行うことができる。
各末端に１つずつ２つのアダプターを有する伸長された断片は、ビーズから放出される。ビーズからの放出は、ビーズを分解することによって、またはアダプターオリゴヌクレオチドとビーズの間の化学連結を切断することによって行うことができる。場合によっては、放出は、ＥｎｄｏＶ酵素を用いて捕捉オリゴヌクレオチドからイノシン残基を除去するか、またはウラシルデグリコシラーゼおよびＥｎｄｏＩＶ／ＥｎｄｏＶＩＩＩまたは同様の機能を有する他の酵素によるウラシルヌクレオチドの除去によって行われる。場合によっては、捕捉オリゴヌクレオチドは、１つ以上のジスルフィド結合を介してビーズに架橋される。このような場合、放出は、ビーズを還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））に曝露させることによって行うことができる。
【0112】
９．増幅
一部の実施形態では、上述の方法工程で生成された伸長された断片が増幅される。このような増幅方法には、限定されないが、多置換増幅（ＭＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結連鎖反応（オリゴヌクレオチドリガーゼ増幅ＯＬＡとも呼ばれる）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、鎖置換アッセイ（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＲ）（環状化断片の場合）、および侵襲的切断技術が含まれる。増幅は、断片化後、または本明細書において概説する任意の工程の前後に行うことができる。
一部の実施形態では、上述の方法工程で生成された伸長された断片が増幅される。このような増幅方法には、限定されないが、多置換増幅（ＭＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結連鎖反応（オリゴヌクレオチドリガーゼ増幅ＯＬＡとも呼ばれる）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、鎖置換アッセイ（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＲ）（環状化断片の場合）、および侵襲的切断技術が含まれる。増幅は、断片化後、または本明細書において概説する任意の工程の前後に行うことができる。
【0113】
図３の一例において、標的核酸断片とビーズアダプターおよびＬ－アダプターとの連結によって形成された連結された生成物は、プライマーをＬ－アダプターおよび分岐アダプターにアニーリングすることによって増幅される。
【0114】
一部の実施形態では、伸長された断片は、最初に、一本鎖核酸分子に変性され得る。いくつかの一本鎖核酸分子の各々について、次に、スプリントオリゴを添加し、標的核酸断片の両末端に付加されたアダプター配列にハイブリダイズし、次に、一本鎖核酸は、リガーゼ（例えば、Ｔ４またはＴａｑリガーゼ）の存在下で環状化される。ＲＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する任意のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、およびＤｅｅｐ－ＶｅｎｔＲ ＮＤＡポリメラーゼ（ＮＥＢ＃ＭＯ２５８）であり得る。これらのＤＮＡポリメラーゼは、異なる強度の鎖置換活性を有することが公知である。本発明に使用される１種以上の適切なＤＮＡポリメラーゼを選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【0115】
１０．配列決定
増幅された伸長された断片は、当該技術分野において周知である配列決定方法を用いて配列決定することができ、例えば、限定されないが、合成によるポリメラーゼベースの配列決定（例えば、ＨｉＳｅｑ ２５００システム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、連結ベースの配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ ５５００，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、イオン半導体配列決定（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭまたはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ゼロモードウェーブガイド（例えば、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）、ナノポア配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ピロ配列決定（例えば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ， ＣＴ）、または他の配列決定技術が含まれる。これらの配列決定技術のいくつかは短い読み取り技術であるが、他の技術は長い読み取りを生成し、例えば、ＧＳ ＦＬＸ＋（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；最大１０００ｂｐ）、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；約１０００ｂｐ）およびナノポア配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．；１００ｋｂ）である。ハプロタイプ相化のためには、より長い読み取りが有利であり、計算をより少なくする必要があるが、ハプロタイプ相化の前に、本明細書中に記載される方法に従って、より長い読み取りにおけるより高いエラー率およびエラーを同定し、修正する必要がある場合がある。
増幅された伸長された断片は、当該技術分野において周知である配列決定方法を用いて配列決定することができ、例えば、限定されないが、合成によるポリメラーゼベースの配列決定（例えば、ＨｉＳｅｑ ２５００システム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、連結ベースの配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ ５５００，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、イオン半導体配列決定（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭまたはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ゼロモードウェーブガイド（例えば、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）、ナノポア配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ピロ配列決定（例えば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ， ＣＴ）、または他の配列決定技術が含まれる。これらの配列決定技術のいくつかは短い読み取り技術であるが、他の技術は長い読み取りを生成し、例えば、ＧＳ ＦＬＸ＋（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；最大１０００ｂｐ）、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；約１０００ｂｐ）およびナノポア配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．；１００ｋｂ）である。ハプロタイプ相化のためには、より長い読み取りが有利であり、計算をより少なくする必要があるが、ハプロタイプ相化の前に、本明細書中に記載される方法に従って、より長い読み取りにおけるより高いエラー率およびエラーを同定し、修正する必要がある場合がある。
【0116】
一実施形態に従って、配列決定は、例えば、米国特許第２０１４００５１５８８号、米国特許第２０１３０１２４１００号に記載されているように、コンビナトリアルプローブ－アンカー連結（ｃＰＡＬ）を用いて行われ、両者はすべての目的で全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0117】
一部の実施形態では、アダプターと連結された断片、またはその増幅生成物を変性させて一本鎖分子を生成することができる。例えば、８～４０塩基のスプリントオリゴヌクレオチドは、一本鎖分子の両端にアニーリングされる。これらのアニーリングされたオリゴは、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化後に作出されたオーバーハングと同様に、生成物の２つの末端間で１～１０塩基の重なりを可能にする。次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結を行い、連結部位に二本鎖ＤＮＡの小さな領域を有する一本鎖の環を作出することができる。これらのサークルは、ＤＮＢｓｅｑシークエンサー用のＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）の製造に使用できるようになる。
【0118】
一部の実施形態では、断片は、上記のように、３’末端にｂ－ＢＬＡアダプター配列と５’末端にＬ－アダプター配列の両方を含有する。これらのアダプター化された断片は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ型、および環状化を必要としない他のシステムで配列決定することができる。
【0119】
組成物
１．試料
標的核酸を含有する試料は、任意の適切な供給源から得ることができる。例えば、試料は、目的とする任意の生物から得られ得るか、または提供され得る。このような生物には、例えば、植物；動物（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類を含む哺乳動物）；または病原体、例えば、細菌およびウイルスが含まれる。場合によっては、試料は、目的とするこのような生物の集団の細胞、組織、またはポリヌクレオチドであり得るか、またはそれから得ることができる。別の例として、試料は、微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）または微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）であり得る。適宜、試料は、水、空気、または土壌の試料などの環境試料である。
１．試料
標的核酸を含有する試料は、任意の適切な供給源から得ることができる。例えば、試料は、目的とする任意の生物から得られ得るか、または提供され得る。このような生物には、例えば、植物；動物（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類を含む哺乳動物）；または病原体、例えば、細菌およびウイルスが含まれる。場合によっては、試料は、目的とするこのような生物の集団の細胞、組織、またはポリヌクレオチドであり得るか、またはそれから得ることができる。別の例として、試料は、微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）または微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）であり得る。適宜、試料は、水、空気、または土壌の試料などの環境試料である。
【0120】
目的とする生物または目的とするこのような生物の集団由来の試料には、限定されないが、体液の試料（限定されないが、血液、尿、血清、リンパ、唾液、肛門および膣分泌物、発汗ならびに精液を含む）；細胞；組織；生検、研究試料（例えば、ＰＣＲ増幅反応などの核酸増幅反応の生成物）；精製された試料、例えば、精製されたゲノムＤＮＡ；ＲＮＡ調製物；および生試料（細菌、ウイルス、ゲノムＤＮＡなど）が含まれる。生物から標的ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡ）を得る方法は、当該技術分野において周知である。
【0121】
２．標的核酸
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」（もしくはポリヌクレオチド）または「目的とする核酸」とは、本明細書に記載される方法によるプロセシングおよび配列決定に適した任意の核酸（またはポリヌクレオチド）を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の公知の核酸を含み得る。標的核酸は、限定されないが、ウイルス、細菌、酵母、植物、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および哺乳動物（限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、サルおよび他の非ヒト霊長類、およびヒトを含む）のいずれかの生物のものであり得る。標的核酸は、個体から、または複数の個体（すなわち、集団）から得ることができる。核酸が得られる試料は、ヒト細胞および細菌細胞を含むヒト唾液試料；マウス細胞および移植されたヒト腫瘍由来の細胞を含むマウス異種移植片などの、細胞またはさらには生物の混合物由来の核酸を含有し得る。標的核酸は、未増幅であり得るか、または当該技術分野において公知である任意の適切な核酸増幅方法によって増幅され得る。標的核酸は、細胞および細胞内汚染物質（脂質、タンパク質、炭水化物、配列決定される核酸以外の核酸など）を除去するために当該技術分野において公知である方法に従って精製され得るか、または精製され得ないで、すなわち、限定されないが、プロセシングおよび配列決定のためにそれらの核酸を放出するために破壊される無傷な細胞を含む、少なくともいくつかの細胞および細胞内汚染物が含まれる。標的核酸は、当該技術分野において公知である方法を用いて任意の適切な試料から得ることができる。このような試料には、限定されないが、生体試料、例えば、組織、単離された細胞または細胞培養物、体液（限定されないが、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、発汗および精液を含む）；ならびに環境試料、例えば、空気、農業、水および土壌試料が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」（もしくはポリヌクレオチド）または「目的とする核酸」とは、本明細書に記載される方法によるプロセシングおよび配列決定に適した任意の核酸（またはポリヌクレオチド）を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の公知の核酸を含み得る。標的核酸は、限定されないが、ウイルス、細菌、酵母、植物、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および哺乳動物（限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、サルおよび他の非ヒト霊長類、およびヒトを含む）のいずれかの生物のものであり得る。標的核酸は、個体から、または複数の個体（すなわち、集団）から得ることができる。核酸が得られる試料は、ヒト細胞および細菌細胞を含むヒト唾液試料；マウス細胞および移植されたヒト腫瘍由来の細胞を含むマウス異種移植片などの、細胞またはさらには生物の混合物由来の核酸を含有し得る。標的核酸は、未増幅であり得るか、または当該技術分野において公知である任意の適切な核酸増幅方法によって増幅され得る。標的核酸は、細胞および細胞内汚染物質（脂質、タンパク質、炭水化物、配列決定される核酸以外の核酸など）を除去するために当該技術分野において公知である方法に従って精製され得るか、または精製され得ないで、すなわち、限定されないが、プロセシングおよび配列決定のためにそれらの核酸を放出するために破壊される無傷な細胞を含む、少なくともいくつかの細胞および細胞内汚染物が含まれる。標的核酸は、当該技術分野において公知である方法を用いて任意の適切な試料から得ることができる。このような試料には、限定されないが、生体試料、例えば、組織、単離された細胞または細胞培養物、体液（限定されないが、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、発汗および精液を含む）；ならびに環境試料、例えば、空気、農業、水および土壌試料が含まれる。
【0122】
標的核酸は、ゲノムＤＮＡ（例えば、単一個体由来）、ｃＤＮＡであり得、および／または複数個体由来の核酸もしくはゲノム由来の核酸を含む複合核酸であり得る。複合核酸の例には、妊娠中の母親の血流中の微生物叢、循環胎児細胞（例えば、Kavanagh et al., J. Chromatol. B 878: 1905-1911, 2010を参照されたい）、がん患者の血流からの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）が含まれる。一実施形態では、このような複合核酸は、少なくとも１ギガ塩基（Ｇｂ）（二倍体ヒトゲノムは、配列の約６Ｇｂを含む）を含む完全な配列を有する。
【0123】
場合によっては、標的核酸または第１の複合体はゲノム断片である。一部の実施形態では、ゲノム断片は１０ｋｂより長く、例えば、１０～１００ｋｂ、１０～５００ｋｂ、２０～３００ｋｂ、５０～２００ｋｂ、１００～４００ｋｂ、または５００ｋｂより長い。場合によっては、標的核酸または第１の複合体は５，０００～１００，０００Ｋｂの長さである。単一混合物において使用されるＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ）の量は、ＤＮＡの＜１０ｎｇ、＜３ｎｇ、＜１ｎｇ、＜０．３ｎｇ、または＜０．１ｎｇであり得る。一部の実施形態では、単一混合物において使用されるＤＮＡの量は、３，０００×未満、例えば、９００×未満、３００×未満、１００×未満、または３０×未満の一倍体ＤＮＡ量であり得る。一部の実施形態では、単一混合物において使用されるＤＮＡの量は、少なくとも１×一倍体ＤＮＡ、例えば、少なくとも２×、または少なくとも１０×の一倍体ＤＮＡ量であり得る。
【0124】
標的核酸は、例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに開示されているような通常の技術を用いて単離することができる。場合によっては、特に、少量の核酸が特定の工程で採用される場合、担体ＤＮＡ、例えば、無関係の環状合成の二本鎖ＤＮＡを、少量の試料核酸のみが入手可能であり、非特異的結合、例えば、容器壁などを介して損失の危険があるときはいつでも、試料核酸と混合して使用するように提供することが有利である。
【0125】
本発明の一部の実施形態によれば、ゲノムＤＮＡまたは他の複合核酸は、任意の公知の方法により、精製の有無にかかわらず、個々の細胞または少数の細胞から得られる。
【0126】
本発明の方法には長い断片が望ましい。ゲノムＤＮＡの長い断片は、任意の公知の方法によって細胞から単離することができる。ヒト細胞からの長いゲノムＤＮＡ断片を単離するためのプロトコールは、例えば、Peters et al., Nature 487:190-195 (2012)に記載される。一実施形態では、細胞は溶解され、無傷の核は、穏やかな遠心分離工程でペレット化される。次に、ゲノムＤＮＡは、数時間にわたるプロテイナーゼＫとＲＮアーゼによる消化を経て放出される。材料は、例えば、一定期間（すなわち、２～１６時間）の透析および／または希釈によって、残存する細胞廃棄物の濃度を低下させるように処理することができる。このような方法は、多くの破壊的プロセス（エタノール沈殿、遠心分離、およびボルテックスなど）を使用する必要がないため、ゲノム核酸は、ほとんど無傷のままであり、１５０キロ塩基を超える長さを有する断片の大部分を生じさせる。一部の実施形態、断片は、約５～約７５０キロ塩基の長さである。さらなる実施形態では、断片は、長さが約１５０～約６００、約２００～約５００、約２５０～約４００、および約３００～約３５０キロ塩基である。ハプロタイピングに用いることができる最小の断片は約２～５ｋｂである；最大の理論的サイズはないが、断片長は出発核酸調製物の操作に起因するせん断によって制限することができる。
【0127】
他の実施形態では、長いＤＮＡ断片は、例えば、アガロースゲルプラグもしくは油中のアガロース中の細胞を単離すること、または特別にコーティングされたチューブおよびプレートを使用することを含む、容器へのＤＮＡのせん断または吸収を最小限にする方法で単離および操作される。
【0128】
別の実施形態によれば、少数の細胞（例えば、微生物生検または循環腫瘍細胞もしくは胎児細胞由来の１、２、３、４、５、１０、１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００個の細胞）を含む試料の場合に均一なゲノム範囲を得るために、細胞から得られるすべての長い断片は、本明細書に開示される方法を使用してバーコード化される。
【0129】
３．バーコード
一実施形態によれば、２つ、３つまたはそれ以上のセグメントを有するバーコード含有配列が使用され、そのうち、例えば１つはバーコード配列である。例えば、導入された配列は、公知の配列の１つ以上の領域、およびバーコード（複数可）またはタグ（複数可）として作用する縮重配列のうちの１つ以上の領域を含み得る。公知の配列（Ｂ）は、例えば、ＰＣＲプライマー結合部位、トランスポゾン末端、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（例えば、稀なカッターのための部位、例えば、Ｎｏｔ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ、Ｍｌｕ Ｉ、ＢｓｓＨ ＩＩなど）、または他の配列を含み得る。タグとして作用する縮重配列（Ｎ）は、分析される標的核酸の断片の数と等しいか、または好ましくはそれよりも大きい異なる配列タグの集団を提供するのに十分な長さである。
一実施形態によれば、２つ、３つまたはそれ以上のセグメントを有するバーコード含有配列が使用され、そのうち、例えば１つはバーコード配列である。例えば、導入された配列は、公知の配列の１つ以上の領域、およびバーコード（複数可）またはタグ（複数可）として作用する縮重配列のうちの１つ以上の領域を含み得る。公知の配列（Ｂ）は、例えば、ＰＣＲプライマー結合部位、トランスポゾン末端、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（例えば、稀なカッターのための部位、例えば、Ｎｏｔ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ、Ｍｌｕ Ｉ、ＢｓｓＨ ＩＩなど）、または他の配列を含み得る。タグとして作用する縮重配列（Ｎ）は、分析される標的核酸の断片の数と等しいか、または好ましくはそれよりも大きい異なる配列タグの集団を提供するのに十分な長さである。
【0130】
一実施形態によれば、バーコード含有配列は、任意の選択された長さの公知配列のうちの１つの領域を含む。別の実施形態によれば、バーコード含有配列は、選択された長さの縮重配列の領域に隣接する選択された長さの公知配列の２つの領域、すなわち、ＢｎＮｎＢｎを含み、Ｎは、標的核酸の長い断片をタグ化するのに十分な長さを有することができ、例えば、限定されないが、Ｎ＝１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり、Ｂは、トランスポゾン末端、プライマー結合部位などの所望の配列を収容する任意の長さを有し得る。例えば、このような実施形態はＢ２０Ｎ１５Ｂ２０であり得る。
【0131】
一実施形態では、長い断片にタグ化するために使用されるバーコードのために、２セグメントまたは３セグメント設計が利用される。この設計は、組合せバーコードセグメントを、異なるバーコードセグメントを互いに連結して完全バーコードセグメントを形成することによって、またはオリゴヌクレオチド合成における試薬としてセグメントを使用することによって生成することを可能にすることにより、より広範囲の可能なバーコードを可能にする。この組合せ設計は、より大きなレパートリーの可能なバーコードを提供し、一方、生成される必要のあるフルサイズバーコードの数を減少させる。さらなる実施形態では、各長い断片の固有の同定は、８～１２塩基対（またはそれより長い）バーコードで達成される。
【0132】
一実施形態では、２つの異なるバーコードセグメントが使用される。ＡセグメントとＢセグメントは、各々が異なるハーフバーコード配列を含むように容易に修飾され、数千の組合せを生成する。さらなる実施形態では、バーコード配列は、同じアダプター上に組み込まれる。これは、Ｂアダプターを２つの部分に分割することによって達成され得、各々は、連結に使用される共通の重複する配列によって分離されたハーフバーコード配列を有する。２つのタグ成分は、各々４～６塩基を有する。８塩基（２×４塩基）のタグセットは、６５，０００個の配列を一意にタグ化することができる。２×５塩基と２×６塩基タグの両方は、最適な復号化効率を達成するために縮重塩基（すなわち、「ワイルドカード」）の使用を含み得る。
【0133】
さらなる実施形態では、各配列の固有の同定は、８～１２塩基対誤り訂正バーコードを用いて達成される。バーコードは、例示的であるが限定されない、５～２０の情報塩基、通常は８～１６の情報塩基の長さを有することができる。
【0134】
４．ＵＭＩ
様々な実施形態では、固有の分子識別子（ＵＭＩ）が、個々のＤＮＡ分子を互いに区別するために使用される。例えば、ＵＭＩは、第１のビーズ上に固定化された捕獲オリゴヌクレオチドの間を区別するために使用される。アダプターの集合体が生成され、各々がＵＭＩを有し、これらのアダプターは、配列決定されるべき断片または他の供給源ＤＮＡ分子に付着され、個々の配列決定された分子は、各々、他のすべての断片と区別するのを助けるＵＭＩを有する。このような実装では、非常に多数の異なるＵＭＩ（例えば、数千から数百万）を用いて、試料中のＤＮＡ断片を一意に同定することができる。
様々な実施形態では、固有の分子識別子（ＵＭＩ）が、個々のＤＮＡ分子を互いに区別するために使用される。例えば、ＵＭＩは、第１のビーズ上に固定化された捕獲オリゴヌクレオチドの間を区別するために使用される。アダプターの集合体が生成され、各々がＵＭＩを有し、これらのアダプターは、配列決定されるべき断片または他の供給源ＤＮＡ分子に付着され、個々の配列決定された分子は、各々、他のすべての断片と区別するのを助けるＵＭＩを有する。このような実装では、非常に多数の異なるＵＭＩ（例えば、数千から数百万）を用いて、試料中のＤＮＡ断片を一意に同定することができる。
【0135】
ＵＭＩは、各々のおよびすべての供給源ＤＮＡ分子の固有さを保証するのに十分な長さである。一部の実施形態では、固有の分子識別子は、約３～１２ヌクレオチドの長さ、または３～５ヌクレオチドの長さである。場合によっては、各々の固有の分子識別子は、約３～１２ヌクレオチドの長さ、または３～５ヌクレオチドの長さである。したがって、固有の分子識別子は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。
【0136】
５．バーコードビーズ
ビーズは、その上に固定化されたｂ－ＢＬＡ中のバーコードオリゴヌクレオチドによりバーコード化される。各ビーズは、複数のｂ－ＢＬＡ、したがって複数のバーコードオリゴヌクレオチドを含む。各バーコードオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのバーコードを含む。同一ビーズ上のバーコードオリゴヌクレオチドは同じバーコード配列を共有し、異なるビーズ上のバーコードオリゴヌクレオチドは異なるバーコード配列を有する。それ自体、各ビーズは、上述の方法を用いて標的核酸断片に移すことができる、固有のバーコード配列の多数のコピーを担持する。
ビーズは、その上に固定化されたｂ－ＢＬＡ中のバーコードオリゴヌクレオチドによりバーコード化される。各ビーズは、複数のｂ－ＢＬＡ、したがって複数のバーコードオリゴヌクレオチドを含む。各バーコードオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのバーコードを含む。同一ビーズ上のバーコードオリゴヌクレオチドは同じバーコード配列を共有し、異なるビーズ上のバーコードオリゴヌクレオチドは異なるバーコード配列を有する。それ自体、各ビーズは、上述の方法を用いて標的核酸断片に移すことができる、固有のバーコード配列の多数のコピーを担持する。
【0137】
使用されるビーズは、１～２０ｕｍ、代替的に２～８ｕｍ、３～６ｕｍまたは１～３ｕｍ、例えば約２．８μｍの範囲の直径を有することができる。例えば、ビーズ上のバーコード化オリゴヌクレオチドの間隔は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６または少なくとも７ｎｍであり得る。一部の（ｃｏｍｅ）実施形態では、間隔は、１０ｎｍ未満（例えば、５～１０ｎｍ）、１５ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、または５０ｎｍ未満である。一部の実施形態では、混合物あたりに使用される異なるバーコードの数は、＞１Ｍ、＞１０Ｍ、＞３０Ｍ、＞１００Ｍ、＞３００Ｍ、または＞１Ｂであり得る。以下に検討されるように、本発明において使用するために、例えば、本明細書に記載される方法を使用して、非常に多数のバーコードを生成することができる。一部の実施形態では、混合物あたりに使用される異なるバーコードの数は、＞１Ｍ、＞１０Ｍ、＞３０Ｍ、＞１００Ｍ、＞３００Ｍ、または＞１Ｂであり得、それらは、少なくとも１０倍より大きな多様性のプール（例えば、ビーズ上の＞１０Ｍ、＞０．１Ｂ、＞０．３Ｂ、＞０．５Ｂ、＞１Ｂ、＞３Ｂ、＞１０Ｂの異なるバーコード）からサンプリングされる。一部の実施形態では、ビーズあたりのバーコードの数は、１００ｋ～１０Ｍ、例えば、２００ｋ～１Ｍ、３００ｋ～８００ｋ、または約４００ｋである。
【0138】
一部の実施形態では、バーコード領域は、約３～１５ヌクレオチドの長さ、例えば、５～１２、８～１２、または１０ヌクレオチドの長さである。場合によっては、バーコード領域の各バーコードは、約３～１２ヌクレオチドの長さ、または３～５ヌクレオチドの長さである。したがって、バーコードは、試料バーコード、細胞バーコードまたは他のバーコードのいずれかであり、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。１つの特定の例では、各バーコード領域は３つのバーコードを含み、各バーコードは１０塩基からなり、３つのバーコードは共通配列の６塩基によって分離される。
【0139】
バーコードビーズを標的核酸配列に移動させる。一部の実施形態では、移動は、開示されるニッキングおよびギャッピングによって作出された核酸断片へのアダプターオリゴヌクレオチドの３’末端の連結を介して、一定の間隔で生じさせた。
【0140】
一部の実施形態では、バーコードビーズは、３セットの二本鎖バーコードＤＮＡ分子を用いて、分割およびプール連結に基づく戦略を介して構築される。一部の実施形態では、二本鎖バーコードＤＮＡ分子の各セットは、１０塩基対からなり、３セットは核酸配列が異なる。バーコードビーズを生成するための分割およびプール連結の例示的な方法は、ＰＣＴ出願公開第２０１９／２１７４５２号に記載され、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。また、国際公開第２０１９／２１７４５２号の図１２および１３は、分割およびプール法の方法論を示す。１つのアプローチにおいて、ＰＣＲプライマーアニーリング部位を含む共通のアダプター配列は、５’二重ビオチンリンカーを有するＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）磁性ビーズに付着された。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により、重複する配列の領域を含有する３セットの１，５３６個のバーコードオリゴを構築した。連結は、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、２．５％のＰＥＧ－８０００、５７１ユニットのＴ４リガーゼ、５８０ｐｍｏｌのバーコードオリゴ、および６５００万個のＭ－２８０ビーズを含有する１５μＬの反応において３８４ウェルプレート中で行われた。連結反応は、回転子上で１時間、室温にてインキュベートされた。連結の間、ビーズを遠心分離により単一容器にプールし、磁石を用いて容器の側面に回収し、高塩洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１回、および低塩洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄した。ビーズを１×連結緩衝液中に再懸濁し、３８４ウェルプレートに分散させ、連結工程を繰り返した。
【0141】
一態様では、本発明は、付着したクローンバーコードを含むアダプターオリゴヌクレオチドを有するビーズを含む組成物を提供し、組成物は、３０億を超える異なるバーコードを含み、バーコードは、構造５’－ＣＳ１－ＢＣ１－ＣＳ２－ＢＣ２－ＣＳ３－ＢＣ３－ＣＳ４を有する三分化バーコードである。一部の実施形態では、ＣＳ１およびＣＳ４は、ＣＳ２およびＣＳ３よりも長い（ｌｏｎｅｒ）。一部の実施形態では、ＣＳ２およびＣＳ３は、４～２０塩基であり、ＣＳ１およびＣＳ４は、５または１０～４０塩基、例えば、２０～３０であり、ＢＣ配列は、４～２０塩基（例えば、１０塩基）の長さである。一部の実施形態では、ＣＳ４は、スプリントオリゴヌクレオチドに相補的である。一部の実施形態では、組成物は、架橋オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、架橋オリゴヌクレオチド、上述の三分化バーコードを含むビーズ、および架橋オリゴヌクレオチドに相補的な領域を有するハイブリダイゼーション配列を含むゲノムＤＮＡを含む。
【0142】
タグの多数のコピーに関連したビーズまたは他の支持体などのクローンバーコードの別の供給源は、エマルジョンＰＣＲもしくはＣＰＧ（制御された孔ガラス）または化学合成によって調製することができ、他の粒子は、調製された適合バーコードのコピーとともに調製することができる。タグ含有ＤＮＡ配列の集団は、公知の方法により、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョン中のビーズ上でＰＣＲ増幅することができる。例えば、Tawfik and Griffiths Nature Biotechnology 16: 652-656 (1998); Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8820, 2003；およびShendure et al., Science 309:1728-1732 (2005)を参照されたい。これは、各ビーズ上の各単一のタグ含有配列の多数のコピーをもたらす。
【0143】
クローンバーコードの供給源を作製する別の方法は、マイクロビーズまたはＣＰＧ上でのオリゴヌクレオチド合成による「混合および分割」コンビナトリアルプロセスである。このプロセスを使用して、各々がバーコードのコピーの集団を有するビーズのセットを作出することができる。例えば、平均して、１００個のビーズの各々に約１０億個の各々が約１０００個以上のコピーで表されるすべてのＢ２０Ｎ１５Ｂ２０を作製するために、約１，０００億個のビーズから開始し、それらすべてでＢ２０共通配列（アダプター）を合成し、次に、それらを１０２４個の合成カラムに分割して各々で異なる５マーを作製し、次にそれらを混合し、次にそれらを再度１０２４カラムに分割して、追加の５マーを作製し、次にそれをもう一度繰り返してＮ１５を完成させ、次にそれらを混合し、１つの大きなカラムで、最後のＢ２０を第２のアダプターとして合成することができる。したがって、３０５０回の合成において、１つの大きなエミュレーションＰＣＲ反応では、約１０，０００億個のビーズ（１１２のビーズ）と同じ「クローン様」のバーコードセットを作製することができ、それは１０個中１個のビーズのみが開始鋳型を有し（他の９個は有しない）、ビーズあたり異なるバーコードを有する２個の鋳型を有することを防止するためである。
【0144】
バーコード配列アセンブリーの例示的なプロセスは、ＰＣＴ出願公開第２０１９／２１７４５２号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0145】
６．固定化
ポリヌクレオチドは、共有結合および非共有結合的な付着を含む種々の技術によって、基質（例えば、ビーズ）上に固定化することができる。ポリヌクレオチドは、種々の技術によって基質に固定化することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質（例えば、ビーズ）に接合され、すなわち、ポリヌクレオチドの１つの末端が直接接触するか、または基質に連結される。例えば、表面は、ポリヌクレオチド分子上の相補的官能基と反応して共有結合を形成する反応性官能基を有し得る。長いＤＮＡ分子、例えば、数ヌクレオチドまたはそれより大きいものはまた、疎水性表面、例えば、－ＯＨ基などの低濃度の種々の反応性官能基を有する清浄なガラス表面に効率的に付着され得る。なお別の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、表面との非特異的相互作用を介するか、または水素結合、ファンデルワールス力などの非共有結合相互作用を介して表面に吸着され得る。
ポリヌクレオチドは、共有結合および非共有結合的な付着を含む種々の技術によって、基質（例えば、ビーズ）上に固定化することができる。ポリヌクレオチドは、種々の技術によって基質に固定化することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、基質（例えば、ビーズ）に接合され、すなわち、ポリヌクレオチドの１つの末端が直接接触するか、または基質に連結される。例えば、表面は、ポリヌクレオチド分子上の相補的官能基と反応して共有結合を形成する反応性官能基を有し得る。長いＤＮＡ分子、例えば、数ヌクレオチドまたはそれより大きいものはまた、疎水性表面、例えば、－ＯＨ基などの低濃度の種々の反応性官能基を有する清浄なガラス表面に効率的に付着され得る。なお別の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、表面との非特異的相互作用を介するか、または水素結合、ファンデルワールス力などの非共有結合相互作用を介して表面に吸着され得る。
【0146】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表面上で捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、捕捉オリゴヌクレオチドの成分と複合体、例えば、二本鎖の二重鎖または部分的に二本鎖の二重鎖を形成することによって、表面に固定化される。
【0147】
７．反応混合物
本明細書には、１種以上のニッキング剤、１種以上のリガーゼ、複数のビーズ、突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片を含む、反応混合物が提供される。各ビーズは、その上に固定化された少なくとも１つの分岐連結アダプターを含む。各分岐連結アダプターは、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドおよびバーコードオリゴヌクレオチドを含む。バーコードオリゴヌクレオチドはバーコードを含み、ビーズに接合され、一方、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドはビーズに接合されない。複数のビーズの各々は、固有のバーコード配列を含み、すなわち、同一ビーズ上の分岐連結アダプターが同じバーコード配列を共有し、異なるビーズ上の分岐連結アダプターが異なるバーコード配列を有する。
本明細書には、１種以上のニッキング剤、１種以上のリガーゼ、複数のビーズ、突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片を含む、反応混合物が提供される。各ビーズは、その上に固定化された少なくとも１つの分岐連結アダプターを含む。各分岐連結アダプターは、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドおよびバーコードオリゴヌクレオチドを含む。バーコードオリゴヌクレオチドはバーコードを含み、ビーズに接合され、一方、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドはビーズに接合されない。複数のビーズの各々は、固有のバーコード配列を含み、すなわち、同一ビーズ上の分岐連結アダプターが同じバーコード配列を共有し、異なるビーズ上の分岐連結アダプターが異なるバーコード配列を有する。
【0148】
バーコードオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、一本鎖領域および二本鎖領域を含む部分的に二本鎖の核酸分子を形成する。二本鎖領域は、５’末端および３’末端を有する二本鎖平滑末端を含み、二本鎖平滑末端の５’末端は、核酸断片の３’末端に連結される。
【0149】
例示的な実施形態
以下は、本明細書に開示される方法および組成物の非限定的な例示的な実施形態である。
以下は、本明細書に開示される方法および組成物の非限定的な例示的な実施形態である。
【0150】
実施形態１．配列決定のためのアダプター化されたポリヌクレオチドのライブラリーを調製する方法であって、単一の反応混合物において、（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片を生成することと、（ｂ）各々がビーズ上に固定化された複数の分岐連結アダプター（ｂ－ＢＬＡｓ）を含む複数のビーズを提供し、３’末端に縮重配列を有するＬ－アダプターの集団を提供することと、（ｃ）リガーゼの存在下で、ｂ－ＢＬＡを核酸断片のうちの少なくとも１つと接触させ、それによって、核酸断片の３’末端にｂ－ＢＬＡを連結することと、（ｄ）リガーゼの存在下でＬ－アダプターの集団を接触させ、それによって核酸断片の５’末端にＬ－アダプターを連結し、それによって、５’末端にＬ－アダプター配列と３’末端にｂ－ＢＬＡアダプター配列を有する核酸断片のライブラリーを得ることとを含み、各ｂ－ＢＬＡは、ｂ－ＢＬＡアダプター配列を含むバーコードオリゴヌクレオチド、およびバーコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含み、各ＬアダプターがＬ－アダプター配列を含む方法。適宜、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドの３’末端はブロッカーヌクレオチドである。
【0151】
実施形態２．Ｌ－アダプターの３’末端が、核酸断片のうちの少なくとも１つの５’末端に連結される、実施形態１に記載の方法。
【0152】
実施形態３．各ＢＬＡが、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）バーコード配列を含む一本鎖領域を含み、二本鎖平滑末端における鎖の５’末端が、分岐連結を介して、核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結される、実施形態１に記載の方法。
【0153】
実施形態４．反応に酵素を添加することをさらに含み、酵素が、Ｌ－アダプターを連結する前に、過剰のｂ－ＢＬＡを分解する、実施形態１に記載の方法。
【0154】
実施形態５．Ｌ－アダプターが３’末端に１～１０個の縮重塩基を含む、実施形態１に記載の方法。
【0155】
実施形態６．Ｌ－アダプターが溶液中にあり、バーコードオリゴヌクレオチドがビーズに接合され、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドがビーズに接合されない、実施形態１に記載の方法。
【0156】
実施形態７．ｂ－ＢＬＡがウラシルを含み、ウラシルを除去してビーズからｂ－ＢＬＡを放出することができる、実施形態５に記載の方法。
【0157】
実施形態８．各ビーズが複数のｂ－ＢＬＡでその上に固定化され、複数のｂ－ＢＬＡの各々が同じバーコード配列を有する、実施形態５に記載の方法。
【0158】
実施形態９．ｂ－ＢＬＡとＬ－アダプターの両方と連結して伸長された核酸断片を生成する核酸断片のうちの少なくとも１つを伸長することをさらに含み、伸長された核酸断片がバーコードのコピーを含む、実施形態１に記載の方法。
【0159】
実施形態１０．伸長された核酸断片を環状化することをさらに含む、実施形態８に記載の方法。
【0160】
実施形態１１．複数のビーズを含み、各ビーズが固有のバーコード配列を含む、実施形態５に記載の方法。
【0161】
実施形態１２．二本鎖領域の３’末端、またはハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドの３’末端がジデオキシブロッカーヌクレオチドである、実施形態１に記載の方法。
【0162】
実施形態１３．核酸断片の平均長が２００ヌクレオチド～１００００ヌクレオチドである、実施形態１に記載の方法。
【0163】
実施形態１４．工程（ａ）において作出された突出型の一本鎖切断の５０％超が、工程（ｂ）における連結によって閉鎖される、実施形態の方法。
【0164】
実施形態１５．１種以上のニッキング剤が、非特異的ニッキングヌクレアーゼ、部位特異的ニッキングヌクレアーゼ、および化学的ニッキング剤からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
【0165】
実施形態１６．非特異的ニッカーゼが、Ｖｖｎ、エビｄｓＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡｓｅ Ｉからなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
【0166】
実施形態１７．リガーゼがＴ４ ＤＮＡリガーゼである、実施形態１に記載の方法。
【0167】
実施形態１８．配列決定のためのポリヌクレオチドのライブラリーを調製するための方法は、単一の反応混合物において、
（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された重複する核酸断片を生成することと、
（ｂ）リガーゼの存在下で、複数の部分的に二本鎖の第１のアダプターを含むビーズを核酸断片と接触させることであって、各第１のアダプターが、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）ビーズ上に固定化された一本鎖領域を含み、一本鎖領域はバーコードを含み、それによって少なくとも１つの第１のアダプターの二本鎖平滑末端における鎖の５’末端を、ＤＮＡリガーゼを用いて核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結し、連結された第１のアダプターを生成し、連結された第１のアダプターは、バーコードおよび少なくとも１つの核酸断片を含むことと、
（ｃ）連結された第１のアダプターを変性させることと、
（ｄ）連結された第１のアダプターにおけるバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズしたプライマーの制御された伸長を行い、それによって連結第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖を生成することと
を含む。
（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された重複する核酸断片を生成することと、
（ｂ）リガーゼの存在下で、複数の部分的に二本鎖の第１のアダプターを含むビーズを核酸断片と接触させることであって、各第１のアダプターが、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）ビーズ上に固定化された一本鎖領域を含み、一本鎖領域はバーコードを含み、それによって少なくとも１つの第１のアダプターの二本鎖平滑末端における鎖の５’末端を、ＤＮＡリガーゼを用いて核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結し、連結された第１のアダプターを生成し、連結された第１のアダプターは、バーコードおよび少なくとも１つの核酸断片を含むことと、
（ｃ）連結された第１のアダプターを変性させることと、
（ｄ）連結された第１のアダプターにおけるバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズしたプライマーの制御された伸長を行い、それによって連結第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖を生成することと
を含む。
【0168】
実施形態１９．部分的に二本鎖の第１のアダプターのうちの少なくとも１つが連結されないままであり、制御された伸長を行うことが、連結された第１のアダプターと連結されていない第１のアダプターの両方においてバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズされるプライマーをハイブリダイズすることを含み、それによって、連結された第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖および連結されていない第１のアダプターに相補的な完全に伸長された鎖を生成し、それによって、より短い鎖およびより長い鎖を含む、連結された第１のアダプターを含む部分的に二本鎖の分子と、連結されていないアダプターを含む二本鎖分子とを含む混合物を生成する、実施形態１８に記載の方法。
【0169】
実施形態２０．二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを添加することをさらに含み、それによって、エキソヌクレアーゼが二本鎖分子を分解する、実施形態１９に記載の方法。
【0170】
実施形態２１．工程（ｄ）において、連結許容条件下でヘアピンアダプターを混合物に添加することをさらに含み、それによって二本鎖分子が１つのヘアピンアダプターに連結され、部分的に二本鎖の分子がヘアピンアダプターに連結されないままである、実施形態１９に記載の方法。
【0171】
実施形態２２．（ｅ）部分的に二本鎖の分子鎖中のより短い鎖を伸長して、より長い鎖中の核酸断片の配列をコピーし、それによってさらに伸長された鎖を生成することと、（ｆ）第２のアダプターをさらに伸長された鎖の３’末端に連結することとをさらに含む、実施形態２１または実施形態２０に記載の方法。
【0172】
実施形態２３．工程（ｅ）においてより短い鎖を伸長することが、伸長可能なヌクレオチドおよび３’可逆的ブロッキング基を有するヌクレオチドの混合物の存在下で行われ、工程（ｆ）において第２のアダプターを連結することが、３’ブロッキング基の除去後に行われる、実施形態２２に記載の方法。
【0173】
実施形態２４．３’可逆的ブロッキング基を有するヌクレオチドが、異なるサイクルの間に添加される、実施形態２３に記載の方法。
【0174】
実施形態２５．第２のアダプターが、分岐連結アダプター（ＢＬＡ）である、実施形態２３に記載の方法。
【0175】
実施形態２６．連結された第２の分岐連結アダプターを鎖置換ポリメラーゼで伸長することをさらに含む、実施形態２３に記載の方法。
【0176】
実施形態２７．標的核酸が、工程（ａ）および工程（ｂ）の前にビーズに結合している、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法。
【0177】
実施形態２８．工程（ａ）におけるニッキングの前に、０～３０分間、標的核酸をビーズとともにインキュベートすることを含む、実施形態２７に記載の方法。
【0178】
実施形態２９．標的核酸が、３～１２％ＰＥＧを含む緩衝液中でビーズとともにインキュベートされる、実施形態２８に記載の方法。
【0179】
実施形態３０．単一の反応混合物のｐＨが７～９である、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法。
【0180】
実施形態３１．工程（ａ）がリガーゼの存在下で起こる、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法。
【0181】
実施形態３２．１種以上のニッキング剤およびリガーゼが、連結率がニッキング率よりも高いように選択される、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法。
【0182】
実施形態３３．工程（ｂ）の後に、反応混合物を変性させることによって、核酸断片に連結されていない第１のアダプターのＤＮＡ鎖を除去することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【0183】
実施形態３４．工程（ａ）が、突出型の一本鎖切断のギャップを増加させるためにエキソヌクレアーゼを単一の反応物に添加することをさらに含む、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法。
【0184】
実施形態３５．増加したギャップが、突出型の一本鎖切断において１～３０塩基の長さを有する、実施形態３４に記載の方法。
【0185】
実施形態３６．（１）１種以上のニッキング剤、（２）１種以上のリガーゼ、および（３）突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片、ならびに（４）部分的に二本鎖の核酸分子を形成するために、互いにハイブリダイズされるバーコードオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含む部分的に二本鎖の分岐アダプターを含む反応混合物であって、バーコードオリゴヌクレオチドがビーズに接合され、バーコードを含み、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドがビーズに接合されておらず、部分的に二本鎖の核酸分子は、（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）バーコードを含み、一本鎖末端を有する一本鎖領域を含み、二本鎖平滑末端の５’末端は、核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結される反応混合物。
【0186】
実施形態３７．核酸断片のうちの少なくとも１つの５’末端がＬ－アダプターに連結される、実施形態３６に記載の反応混合物。
【0187】
実施形態３８．Ｌ－アダプターが３’末端に１～１０個の縮重塩基を含む、実施形態３７に記載の反応混合物。
【0188】
実施形態３９．配列決定のためのポリヌクレオチドのライブラリーを調製するための方法は、単一の反応混合物において、
（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片を生成することと、
（ｂ）リガーゼの存在下で部分的に二本鎖の第１のアダプターを核酸断片のうちの少なくとも１つと接触させることであって、
第１のアダプターは、（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖領域、および（ｉｉ）バーコードを含む一本鎖領域を含み、
それによって、第１のアダプターの二本鎖領域の５’末端を、３’分岐連結を介してＤＮＡリガーゼを使用して核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に接合することと、
（ｃ）第２のアダプターを、核酸断片のうちの少なくとも１つの反対側の末端に接触させることであって、第１および第２のアダプターの連結は、単一の反応において起こることと
を含む。
（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片を生成することと、
（ｂ）リガーゼの存在下で部分的に二本鎖の第１のアダプターを核酸断片のうちの少なくとも１つと接触させることであって、
第１のアダプターは、（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖領域、および（ｉｉ）バーコードを含む一本鎖領域を含み、
それによって、第１のアダプターの二本鎖領域の５’末端を、３’分岐連結を介してＤＮＡリガーゼを使用して核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に接合することと、
（ｃ）第２のアダプターを、核酸断片のうちの少なくとも１つの反対側の末端に接触させることであって、第１および第２のアダプターの連結は、単一の反応において起こることと
を含む。
【0189】
実施形態４０．第２のアダプターがＬ－アダプターであり、Ｌ－アダプターが標的核酸の一本鎖領域にハイブリダイズする３’末端の核酸配列を含み、
Ｌアダプターの３’末端は、核酸断片のうちの少なくとも１つの５’に連結される、実施形態３９に記載の方法。
Ｌアダプターの３’末端は、核酸断片のうちの少なくとも１つの５’に連結される、実施形態３９に記載の方法。
【0190】
実施形態４１．反応に酵素を添加することをさらに含み、酵素が、第２のアダプターを連結する前に、過剰な第１のアダプターを分解する、実施形態３９に記載の方法。
【0191】
実施形態４２．第２のアダプターが３’末端に１～１０個の縮重塩基を含む、実施形態３９に記載の方法。
【0192】
実施形態４３．実施形態３９に記載の方法は、第１のアダプターおよび第２のアダプターの一方または両方と接合されて、伸長された核酸断片を生成する核酸断片のうちの少なくとも１つを伸長することをさらに含み、伸長された核酸断片はバーコードのコピーを含む。
【0193】
実施形態４４．第１のアダプターが、バーコードを含む一本鎖領域を介してビーズ上に固定化され、ビーズが、各々が同じバーコード配列を含む第１のアダプターの複数のコピーで固定化される、実施形態３９に記載の方法。
【0194】
実施形態４５．二本鎖領域の３’末端がジデオキシブロッカーヌクレオチドである、実施形態３９に記載の方法。
【0195】
実施形態４６．配列決定のためのポリヌクレオチドのライブラリーを調製するための方法は、単一の反応混合物において、（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された重複する核酸断片を生成することと、（ｂ）リガーゼの存在下で、複数の部分的に二本鎖の第１のアダプターを含むビーズを核酸断片と接触させることであって、
各第１のアダプターは、（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖領域、および（ｉｉ）ビーズ上に固定化された一本鎖領域を含み、一本鎖領域はバーコードを含み、
それによって、第１のアダプターの少なくとも１つの二本鎖領域の５’末端を、３’分岐連結を介してＤＮＡリガーゼを用いて、核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に接合し、連結された第１のアダプターを生成し、
連結された第１のアダプターは、バーコードおよび少なくとも１つの核酸断片を含み、
第１のアダプターのうちの少なくとも１つは、連結されていない第１のアダプターとして残ることと、
（ｃ）反応混合物を変性させることであって、連結された第１のアダプターおよび連結されていない第１のアダプターが一本鎖形態であることと、
（ｄ）（ｉ）連結された第１のアダプター中、および（ｉｉ）連結されていない第１のアダプター中のバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズされるプライマーの制御された伸長を行うことであって、それによって、連結第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖、および連結されていない第１のアダプターに相補的な完全に伸長された鎖を生成し、それによって、連結された第１のアダプターを含む部分的に二本鎖の分子と、連結されていないアダプターを含む二本鎖分子とを含む第１の混合物を生成することと
を含む。
各第１のアダプターは、（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖領域、および（ｉｉ）ビーズ上に固定化された一本鎖領域を含み、一本鎖領域はバーコードを含み、
それによって、第１のアダプターの少なくとも１つの二本鎖領域の５’末端を、３’分岐連結を介してＤＮＡリガーゼを用いて、核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に接合し、連結された第１のアダプターを生成し、
連結された第１のアダプターは、バーコードおよび少なくとも１つの核酸断片を含み、
第１のアダプターのうちの少なくとも１つは、連結されていない第１のアダプターとして残ることと、
（ｃ）反応混合物を変性させることであって、連結された第１のアダプターおよび連結されていない第１のアダプターが一本鎖形態であることと、
（ｄ）（ｉ）連結された第１のアダプター中、および（ｉｉ）連結されていない第１のアダプター中のバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズされるプライマーの制御された伸長を行うことであって、それによって、連結第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖、および連結されていない第１のアダプターに相補的な完全に伸長された鎖を生成し、それによって、連結された第１のアダプターを含む部分的に二本鎖の分子と、連結されていないアダプターを含む二本鎖分子とを含む第１の混合物を生成することと
を含む。
【0196】
実施形態４７．制御された伸長がタグポリメラーゼを用いて行われ、方法が、ヘアピンアダプターを二本鎖分子に連結するための許容条件下で、工程（ｄ）において第１の混合物にヘアピンアダプターを添加することをさらに含み、それによって、ヘアピンアダプターに連結された二本鎖分子と、ヘアピンアダプターに連結されない部分的に二本鎖の分子とを含む第２の混合物を生成する、実施形態４６に記載の方法。
【0197】
実施形態４８．二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを添加することをさらに含み、それによって、エキソヌクレアーゼが二本鎖分子を分解する、実施形態４６に記載の方法。
【0198】
実施形態４９．（ｅ）部分的に伸長された鎖を伸長して、核酸断片の配列を取り込み、さらなる伸長された生成物を生成すること、および（ｆ）第２の分岐アダプターをさらなる伸長された生成物の末端に連結することをさらに含む、実施形態４８の請求項４７に記載の方法。
【0199】
実施形態５０．（１）標的核酸にニックを入れ、ｂ－ＢＬＡとＬ－アダプターの両方を核酸断片に連結することが少なくとも３０分間持続するか、または二本鎖標的核酸にニックを入れ、第１のアダプターを核酸断片に連結することが少なくとも３０分間持続する、上記の実施形態のうちのいずれかに記載の方法。
＊＊＊
＊＊＊
【0200】
本発明を特定の態様および実施形態を参照して開示したが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変形を当業者によって考案することができることは明らかである。
【0201】
本開示において引用される各々のおよびすべての刊行物および特許文献は、このような各々の刊行物または文献が、参照により本明細書に組み込まれるように、具体的であり、個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、任意のこのような文献が関連する先行技術である旨の表示として意図されたものではなく、また、その内容または日付についての自認を構成するものでもない。
【実施例】
【0202】
以下の実施例は、この出願において開示される実施形態を例示するために提供されるが、これらに限定されるものではない。
【0203】
［実施例１］
セグメンターゼを用いるニック連結プロトコール
１．ビーズへのゲノムＤＮＡの前結合
１マイクロリットルあたり１００万個のビーズを含有するバーコード化されたビーズストック溶液。ビーズは、https://doi.org/10.1038/protex.2018.116で利用可能なCheng, et al. 2018, A simple bead-based method for generating cost-effective co-barcoded sequence reads. Protocol Exchange；Wang, et al. Genome Res. 2019 May;29(5):798-808. doi: 10.1101/gr.245126.118. Epub Aprl 2., 2019に記載される方法を用いて、バーコード配列を含む分岐アダプターで固定化され、最初にＬＳＷＢ緩衝液（低塩洗浄緩衝液：０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回、次に１×ＨＢ緩衝液（３×ＨＢ緩衝液は３０％ＰＥＧ８０００、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．８、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＡＴＰ、および０．１５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ８．３）で１回洗浄された。
セグメンターゼを用いるニック連結プロトコール
１．ビーズへのゲノムＤＮＡの前結合
１マイクロリットルあたり１００万個のビーズを含有するバーコード化されたビーズストック溶液。ビーズは、https://doi.org/10.1038/protex.2018.116で利用可能なCheng, et al. 2018, A simple bead-based method for generating cost-effective co-barcoded sequence reads. Protocol Exchange；Wang, et al. Genome Res. 2019 May;29(5):798-808. doi: 10.1101/gr.245126.118. Epub Aprl 2., 2019に記載される方法を用いて、バーコード配列を含む分岐アダプターで固定化され、最初にＬＳＷＢ緩衝液（低塩洗浄緩衝液：０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回、次に１×ＨＢ緩衝液（３×ＨＢ緩衝液は３０％ＰＥＧ８０００、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．８、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＡＴＰ、および０．１５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ８．３）で１回洗浄された。
【0204】
分岐アダプターは、互いにアニーリングされたバーコードオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含む。バーコードオリゴヌクレオチドの５末端はリン酸基を有し、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドの３末端はジデオキシヌクレオチドである。
バーコードオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する。
／５Ｐｈｏｓ／ＧＴＧＣＡＣＴ＊ＧＡ＊ＣＧ＊ＡＣ＊ＡＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＣＣＡＴＧＣＴＡ［Ｂａｒｃｏｄｅ］ＧＧＡＡＧＧ［Ｂａｒｃｏｄｅ］ＣＧＣＡＧＡ［Ｂａｒｃｏｄｅ］ＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／３ＢｉｏＴＥＧ／（各＊は、ヌクレアーゼに耐性であるホスホチオレート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｌａｔｅ）結合を表す）
バーコードオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する。
／５Ｐｈｏｓ／ＧＴＧＣＡＣＴ＊ＧＡ＊ＣＧ＊ＡＣ＊ＡＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＣＣＡＴＧＣＴＡ［Ｂａｒｃｏｄｅ］ＧＧＡＡＧＧ［Ｂａｒｃｏｄｅ］ＣＧＣＡＧＡ［Ｂａｒｃｏｄｅ］ＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ／３ＢｉｏＴＥＧ／（各＊は、ヌクレアーゼに耐性であるホスホチオレート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｌａｔｅ）結合を表す）
【0205】
ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドは、Ｇ＊ＴＣ＊ＧＴ＊ＣＩＧＴＧＣ＊Ａ＊／３ｄｄＣ／の配列を有し、３ｄｄＣは３プライムにおけるジデオキシシトシンを表す。
【0206】
約１ｎｇのゲノムＤＮＡを含有する各試料に２０μＬの３×ＨＢ緩衝液および水を添加し、全容量４５μＬの混合物を得た。上記のように調製した３，０００万個のビーズを各試料に添加し、室温で１５分間インキュベートした。
【0207】
２．一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）とのインキュベーション
ＳＳＢ混合物は、ＳＳＢストック溶液（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃ＮＢＰ２－３５３１４－１ｍｇ）の４．７５μＬ（総量７．５ｕｇ）を１０．２５μＬの１×ＨＢ緩衝液中に混合することによって調製された。１５μＬのＳＳＢ混合物を、前の工程からゲノムＤＮＡおよびビーズ混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。
ＳＳＢ混合物は、ＳＳＢストック溶液（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＃ＮＢＰ２－３５３１４－１ｍｇ）の４．７５μＬ（総量７．５ｕｇ）を１０．２５μＬの１×ＨＢ緩衝液中に混合することによって調製された。１５μＬのＳＳＢ混合物を、前の工程からゲノムＤＮＡおよびビーズ混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。
【0208】
３．ニック－連結
Ｌ－オリゴ、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、セグメンターゼ作業溶液（ＭＧＩＥａｓｙ ＦＳ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔ－ＭＧＩ－Ｌｅａｄｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，ＭＧＩ，アイテム番号１００００１３４５４または１００００１３４５５に含まれるニッカーゼ）、およびＥｘｏ ＩＩＩ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０６Ｓ）は、以下の表２に従って１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈することにより調製された。Ｌ－オリゴは、ＧＡＧＡＣＧＴＴＣＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＡＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ＊Ｎ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇのいずれか１つを表し、各＊は、ヌクレアーゼに対して耐性であるホスホチオレート結合を表す）の配列を有する。
表２．
Ｌ－オリゴ、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、セグメンターゼ作業溶液（ＭＧＩＥａｓｙ ＦＳ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔ－ＭＧＩ－Ｌｅａｄｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，ＭＧＩ，アイテム番号１００００１３４５４または１００００１３４５５に含まれるニッカーゼ）、およびＥｘｏ ＩＩＩ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０６Ｓ）は、以下の表２に従って１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈することにより調製された。Ｌ－オリゴは、ＧＡＧＡＣＧＴＴＣＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＡＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ＊Ｎ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇのいずれか１つを表し、各＊は、ヌクレアーゼに対して耐性であるホスホチオレート結合を表す）の配列を有する。
表２．
【表2】
【0209】
調製したＬ－オリゴ、リガーゼ、セグメンターゼ、およびＥｘｏＩＩＩ作業溶液は、６０μＬのビーズ－ｇＤＮＡ混合物に添加され、各ビーズは、氷上に形成され、混合されたバーコードを含む分岐アダプターで固定化された。反応混合物の全容量は７５μＬであった。表３を参照されたい。
表３
表３
【表3】
【0210】
反応混合物を、合計５４サイクルである、１５℃にて３０秒～３７℃にて３０秒間でサイクルする条件に供した。反応混合物を短時間スピンダウンし、磁石上に２分間置いた。次に、混合物中のビーズを４０μＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した。次に、ビーズを１００μＬのＬＳＷＢで２回洗浄した。ビーズを５０μＬのＬＳＷＢ中に再懸濁し、ビーズ懸濁液を、以下にさらに記載されるＰＣＲ増幅前に４℃に維持した。
【0211】
４．ＰＣＲ
ＬＳＷＢ緩衝液をビーズ懸濁液から除去し、次に、ビーズをプライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ２（以下の配列）ならびに２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ（Ｒｏｃｈｅ ＃７９５８９３５００１）を含有するＰＣＲ混合物中に再懸濁して、ニック－連結反応において形成された生成物を増幅した。表４に記載される通りである。
表４
ＬＳＷＢ緩衝液をビーズ懸濁液から除去し、次に、ビーズをプライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ２（以下の配列）ならびに２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ（Ｒｏｃｈｅ ＃７９５８９３５００１）を含有するＰＣＲ混合物中に再懸濁して、ニック－連結反応において形成された生成物を増幅した。表４に記載される通りである。
表４
【表4】
【0212】
ＰＣＲサイクルは、以下の表５の条件に従って行われた。
表５．
表５．
【表5】
【0213】
次に、ＰＣＲ生成物は、０．８×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（１６０μＬ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＃Ａ６３８８１）を用いて精製された。ビーズは、２００ｕｌの０．８×Ａｍｐｕｒｅ洗浄緩衝液（８００ｕｌの新鮮なＡｍｐｕｒｅビーズおよび１ｍｌのＴＥを混合し、ビーズを磁石上に置き、上清を回収する。これは洗浄緩衝液である）中で１回洗浄された。残りの工程は、製造業者のプロトコールに従って行われた。精製された生成物は、６０μＬのＴＥ緩衝液中でＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズから溶出された。第２ラウンドのＰＣＲは、表６および７の混合およびサイクル条件を用いて行われた。
表６．
表７．
表６．
【表6】
表７．
【表7】
【0214】
ＰＣＲ生成物は、上記と同じ工程を用いて０．８×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（３２０ｕｌ）を用いて再度精製され、５０ｕｌのＴＥ中で溶出された。精製された生成物を電気泳動により分析した。
【0215】
［実施例２］
生成物サイズにおけるセグメンターゼ濃度の影響
ニック連結反応は、表８に示されるように、異なる濃度のセグメンターゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、実施例１に記載されるように行われた。
表８
生成物サイズにおけるセグメンターゼ濃度の影響
ニック連結反応は、表８に示されるように、異なる濃度のセグメンターゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、実施例１に記載されるように行われた。
表８
【表8】
【0216】
ニック－連結生成物（増幅後）の電気泳動結果を図１２Ａに示す。結果は、セグメンターゼの量が増加すると、挿入物の平均サイズが次第に短くなり、一方、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの量が増加すると、挿入物の平均サイズが次第に長くなることを示す。これらの個々の反応＃１～＃１０において形成された生成物は、３００ｂｐ～２ｋｂの範囲の長さを有し、配列決定に適していた。
【0217】
［実施例３］
マスターアーゼを用いたニック連結プロトコール
１．ビーズへのゲノムＤＮＡの前結合
分岐アダプターで固定化されたビーズへのゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｃｉ ＤＮＡ）の前結合は、実施例１に記載されるように行われた。
マスターアーゼを用いたニック連結プロトコール
１．ビーズへのゲノムＤＮＡの前結合
分岐アダプターで固定化されたビーズへのゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｃｉ ＤＮＡ）の前結合は、実施例１に記載されるように行われた。
【0218】
２．一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）とのインキュベーション
ゲノムＤＮＡおよびビーズを伴うＳＳＢのインキュベーションは、実施例１に記載されるように行われた。
ゲノムＤＮＡおよびビーズを伴うＳＳＢのインキュベーションは、実施例１に記載されるように行われた。
【0219】
３．ニック－連結
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載したものと同じ配列）、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、マスターアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ ＃ＥＮ３１－００５）、およびＥｘｏ ＩＩＩ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０６Ｓ）を下記の表９に従って別々に１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表９
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載したものと同じ配列）、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、マスターアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ ＃ＥＮ３１－００５）、およびＥｘｏ ＩＩＩ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０６Ｓ）を下記の表９に従って別々に１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表９
【表9】
【0220】
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載したものと同じ）、リガーゼ、セグメンターゼ、およびＥｘｏＩＩＩを、氷上で形成された５５μＬビーズ－ｇＤＮＡ混合物に添加し、混合した。反応の全容量は７５μＬであった。上記の表３を参照されたい。
表３
表３
【表10】
【0221】
反応混合物を、合計５４サイクルである、１０℃にて３０秒～３７℃にて３０秒間でサイクルする条件に供した。反応混合物を短時間スピンダウンし、磁石上に２分間置いた。次に、混合物中のビーズを４０μＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した。次に、ビーズを１００μＬのＬＳＷＢで２回洗浄した。ビーズを５０μＬのＬＳＷＢ中に再懸濁し、ビーズ懸濁液を、以下にさらに記載されるＰＣＲ増幅前に４℃に維持した。
【0222】
４．ＰＣＲ
ＬＳＷＢ緩衝液をビーズ懸濁液から除去し、次に、ビーズをプライマーＰＣＲ１（配列番号１）および２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ（Ｒｏｃｈｅ ＃７９５８９３５００１）を含有するＰＣＲ混合物中に再懸濁した。下記の表１０に記載される通りである。
表１０
プライマー伸長は、上記表５の条件に従って行われた。
ＬＳＷＢ緩衝液をビーズ懸濁液から除去し、次に、ビーズをプライマーＰＣＲ１（配列番号１）および２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ（Ｒｏｃｈｅ ＃７９５８９３５００１）を含有するＰＣＲ混合物中に再懸濁した。下記の表１０に記載される通りである。
表１０
【表11】
【0223】
プライマー伸長反応を磁気ラック上に２分間置いた。上清を回収し、表１１に列挙された成分を含む混合物を添加した。
表１１
表１１
【表12】
【0224】
伸長の１サイクルを表５に示される以下のサイクル条件で行った。
【0225】
ＥｘｏＶＩＩを添加して、下記の成分を含む混合物を用いていずれの一本鎖アーチファクト生成物も除去し（表１２）、次に、反応を３０分間インキュベートした。
表１２
表１２
【表13】
【0226】
次に、伸長生成物を、上述のように、０．８×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（８５μＬ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＃Ａ６３８８１）を用いて精製した。精製された生成物を６０μＬのＴＥ緩衝液中で溶出させた。ＰＣＲを９サイクル行ったことを除いて、表５に示されるサイクル条件下で混合物を用いてＰＣＲの最終ラウンドを行った。
【表14】
【0227】
ＰＣＲ生成物を、上記と同じ工程を用いて０．８×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（３２０ｕｌ）を用いて再度精製し、４０ｕｌのＴＥ中で溶出した。精製された生成物を電気泳動により分析した。
［実施例４］
［実施例４］
【0228】
生成物サイズにおけるマスターアーゼ濃度の影響
ニック連結反応は、種々の濃度のマスターアーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で実施例３に記載されるプロトコールに従って行われた。以下の表１３を参照されたい。
表１３
ニック連結反応は、種々の濃度のマスターアーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で実施例３に記載されるプロトコールに従って行われた。以下の表１３を参照されたい。
表１３
【表15】
【0229】
ニック連結生成物（増幅後）の電気泳動結果を図１２Ｂに示す。結果は、マスターアーゼの量が増加すると、挿入物の長さが次第に短くなることを示す。反応＃１～＃６において形成された生成物は、３００ｂｐ～３ｋｂの範囲の長さを有し、配列決定に適していた。
【0230】
［実施例５］
セグメンターゼを用いたニック連結の２ラウンド
１．ビーズへのゲノムＤＮＡの前結合
分岐アダプターで固定化されたビーズへのゲノムＤＮＡの前結合は、実施例１に記載されるように行われた。
セグメンターゼを用いたニック連結の２ラウンド
１．ビーズへのゲノムＤＮＡの前結合
分岐アダプターで固定化されたビーズへのゲノムＤＮＡの前結合は、実施例１に記載されるように行われた。
【0231】
２．一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）とのインキュベーション
ゲノムＤＮＡおよびビーズを伴うＳＳＢのインキュベーションは、実施例１に記載されるように行われた。
ゲノムＤＮＡおよびビーズを伴うＳＳＢのインキュベーションは、実施例１に記載されるように行われた。
【0232】
３．ニック－連結
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載したものと同じ）、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、セグメンターゼ（ＭＧＩ）、およびＥｘｏ ＩＩＩ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０６Ｓ）を下記の表１４に従って別々に１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表１４．
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載したものと同じ）、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、セグメンターゼ（ＭＧＩ）、およびＥｘｏ ＩＩＩ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０６Ｓ）を下記の表１４に従って別々に１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表１４．
【表16】
【0233】
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載したものと同じ）、リガーゼ、セグメンターゼ、およびＥｘｏＩＩＩを、氷上で形成された６０μＬビーズ－ｇＤＮＡ混合物に添加し、混合した。反応の全容量は、実施例１に記載したように７５μＬであった。
【0234】
反応混合物を、合計３６サイクルである、１５℃にて３０秒～３７℃にて３０秒間でサイクルする条件に供した。反応混合物を短時間スピンダウンし、磁石上に２分間置いた。次に、ビーズを１００μＬのＬＳＷＢで１回洗浄した。ビーズを６０μＬ １×ＨＢ中に再懸濁した。
【0235】
４．第２のＬ－オリゴ連結
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載したものと同じ）、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、およびＴ７ ｅｘｏ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２６３Ｓ）を下記の表１５に従って別々に１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表１５．
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載したものと同じ）、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、およびＴ７ ｅｘｏ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２６３Ｓ）を下記の表１５に従って別々に１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表１５．
【表17】
【0236】
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載される）、リガーゼ、およびＴ７ ｅｘｏを、前の工程からの６０μＬのビーズに添加した。反応の全容量は７５μＬであった。上記の表３を参照されたい。
【0237】
反応混合物を、合計３６サイクルである、１０℃にて３０秒～３７℃にて３０秒間でサイクルする条件に供した。反応混合物を短時間スピンダウンし、磁石上に２分間置いた。次に、ビーズを１００μＬのＬＳＷＢで２回洗浄した。ビーズを６０μＬのＬＳＷＢ中に再懸濁した。
【0238】
５．ＰＣＲ
ＬＳＷＢ緩衝液をビーズ懸濁液から除去し、次にビーズをプライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ２（以下の配列）ならびに２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ（Ｒｏｃｈｅ ＃７９５８９３５００１）を含有するＰＣＲ混合物中に再懸濁した。下記の表１６に記載される通りである。
表１６．
ＬＳＷＢ緩衝液をビーズ懸濁液から除去し、次にビーズをプライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ２（以下の配列）ならびに２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ（Ｒｏｃｈｅ ＃７９５８９３５００１）を含有するＰＣＲ混合物中に再懸濁した。下記の表１６に記載される通りである。
表１６．
【表18】
【0239】
ＰＣＲサイクルは、表５の条件に従って５サイクル行われた。次に、ＰＣＲ生成物は、上述のように、０．８×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（１６０μＬ）を用いて精製された。精製された生成物は、６０μＬのＴＥ緩衝液中で溶出された。表１７に示される成分および表５に示されるサイクル条件を含む混合物を用いて、５サイクルの第２ラウンドのＰＣＲを行った。
表１７．
表１７．
【表19】
【0240】
ＰＣＲ生成物は、上記と同じ工程を用いて０．８×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（３２０ｕｌ）を用いて再度精製され、６０ｕｌのＴＥ中で溶出された。精製生成物を電気泳動により分析した。
【0241】
［実施例６］
２工程プロトコールを用いた生成物サイズにおけるセグメンターゼ濃度の影響
ニック連結反応は、実施例５に記載されるプロトコールに従って、異なる濃度のセグメンターゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われた。以下の表１８を参照されたい。
表１８
２工程プロトコールを用いた生成物サイズにおけるセグメンターゼ濃度の影響
ニック連結反応は、実施例５に記載されるプロトコールに従って、異なる濃度のセグメンターゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われた。以下の表１８を参照されたい。
表１８
【表20】
【0242】
ニック連結生成物（増幅後）の電気泳動結果を図１２Ｃに示す。
【0243】
結果は、セグメンターゼの量が増加すると挿入物の長さが次第に短くなり、断片はこれらの反応において形成され、配列決定に適していることを示す。
【0244】
［実施例７］
マスターアーゼを用いたニック連結の２ラウンド
１．ビーズへのゲノムＤＮＡの前結合
１マイクロリットルあたり１００万個のビーズを含有するバーコード化されたビーズストック溶液［ビーズを作製するための記載およびプロトコールについては（Cheng, et al. 2018; Wang, et al. 2019）を参照されたい］は、ＬＳＷＢ緩衝液（低塩洗浄緩衝液：０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて最初に２回、次に１×ＨＢ緩衝液（３×ＨＢ：３０％ＰＥＧ８０００、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．８、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＡＴＰ、および０．１５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ ８．３）を用いて１回洗浄された。
マスターアーゼを用いたニック連結の２ラウンド
１．ビーズへのゲノムＤＮＡの前結合
１マイクロリットルあたり１００万個のビーズを含有するバーコード化されたビーズストック溶液［ビーズを作製するための記載およびプロトコールについては（Cheng, et al. 2018; Wang, et al. 2019）を参照されたい］は、ＬＳＷＢ緩衝液（低塩洗浄緩衝液：０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて最初に２回、次に１×ＨＢ緩衝液（３×ＨＢ：３０％ＰＥＧ８０００、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．８、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＡＴＰ、および０．１５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ ８．３）を用いて１回洗浄された。
【0245】
約１ｎｇのゲノムＤＮＡを含有する各試料に２０μＬの３×ＨＢ緩衝液および水を添加し、全容量４５μＬの混合物を得た。上記のように調製した３，０００万個のビーズを各試料に添加し、室温で１５分間インキュベートした。
【0246】
２．一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）とのインキュベーション
ＳＳＢ反応は、２．３７μＬ（総量３．７５ｕｇ）のＳＳＢストック溶液を７．６３μＬの１×ＨＢ緩衝液中に混合して、１０μＬのＳＳＢ混合物を生成することによって調製した。１０μＬのＳＳＢ混合物を、前の工程からゲノムＤＮＡおよびビーズ混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。
ＳＳＢ反応は、２．３７μＬ（総量３．７５ｕｇ）のＳＳＢストック溶液を７．６３μＬの１×ＨＢ緩衝液中に混合して、１０μＬのＳＳＢ混合物を生成することによって調製した。１０μＬのＳＳＢ混合物を、前の工程からゲノムＤＮＡおよびビーズ混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。
【0247】
３．ニック－連結
Ｌ－オリゴ、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、マスターアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ ＃ＥＮ３１－００５）、およびＥｘｏ ＩＩＩ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０６Ｓ）を表１９に従って別々に１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表１９．
Ｌ－オリゴ、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、マスターアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ ＃ＥＮ３１－００５）、およびＥｘｏ ＩＩＩ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０６Ｓ）を表１９に従って別々に１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表１９．
【表21】
【0248】
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載される）、リガーゼ、セグメンターゼ、およびＥｘｏ ＩＩＩを、氷上で形成された５５μＬビーズ－ｇＤＮＡ混合物に添加し、混合した。反応の全容量は７５μＬであった。表３を参照されたい。
【0249】
反応混合物を、合計３６サイクルである、１０℃にて３０秒～３７℃にて３０秒間でサイクルする条件に供した。反応混合物を短時間スピンダウンし、磁石上に２分間置いた。次に、ビーズを１００μＬのＬＳＷＢで１回洗浄した。ビーズを６０μＬ １×ＨＢ中に再懸濁した。
【0250】
４．第２のＬ－オリゴ連結
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載される）、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、およびＴ７ ｅｘｏ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２６３Ｓ）を、別々に下記の表２０に従って１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表２０
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載される）、リガーゼ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２０２Ｔ）、およびＴ７ ｅｘｏ（ＮＥＢ ＃Ｍ０２６３Ｓ）を、別々に下記の表２０に従って１×ＨＢ（「希釈濃度」）中で希釈した。
表２０
【表22】
【0251】
Ｌ－オリゴ（実施例１に記載される）、リガーゼ、およびＴ７ ｅｘｏを、前の工程からの６０μＬのビーズに添加した。表３に示されるように、反応の全容量は７５μＬであった。
【0252】
反応混合物を、合計３６サイクルである、１０℃にて３０秒～３７℃にて３０秒間でサイクルする条件に供した。反応混合物を短時間スピンダウンし、磁石上に２分間置いた。次に、ビーズを１００μＬのＬＳＷＢで２回洗浄した。ビーズを６０μＬのＬＳＷＢ中に再懸濁した。
【0253】
５．ＰＣＲ
ＬＳＷＢ緩衝液をビーズ懸濁液から除去し、次にビーズをプライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ２（以下の配列）および２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ（Ｒｏｃｈｅ ＃７９５８９３５００１）を含有するＰＣＲ混合物中に再懸濁した。下記の表２１に記載される通りである。
表２１
ＬＳＷＢ緩衝液をビーズ懸濁液から除去し、次にビーズをプライマーＰＣＲ１およびＰＣＲ２（以下の配列）および２×ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ（Ｒｏｃｈｅ ＃７９５８９３５００１）を含有するＰＣＲ混合物中に再懸濁した。下記の表２１に記載される通りである。
表２１
【表23】
【0254】
ＰＣＲサイクルは、下記の表５の条件に従って行われた。
【0255】
次に、ＰＣＲ生成物は、０．８×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（１６０μＬ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＃Ａ６３８８１）を用いて精製された。ビーズは、２００μｌの０．８×Ａｍｐｕｒｅ洗浄緩衝液（８００ｕｌの新鮮なＡｍｐｕｒｅビーズおよび１ｍｌのＴＥを混合し、ビーズを磁石上に置き、上清を回収する。これは洗浄緩衝液である）中で１回洗浄された。残りの工程は、製造業者のプロトコールに従って行われた。生成物は、６０μＬのＴＥ緩衝液中で溶出された。ＰＣＲを７サイクル行ったことを除いて、表２２の成分を含む混合物および表５に示されるサイクル条件でＰＣＲの第２ラウンドを行った。
表２２．
表２２．
【表24】
【0256】
ＰＣＲ生成物は、上記と同じ工程を用いて０．８×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（３２０ｕｌ）を用いて再度精製され、６０ｕｌのＴＥ中で溶出された。精製生成物を電気泳動により分析した。
【0257】
［実施例８］
２工程プロトコールによる生成物サイズにおけるマスターアーゼ濃度の影響
ニック連結反応は、実施例７に記載されるプロトコールに従って、異なる濃度のマスターアーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われた。下記の表２３および表２４を参照されたい。
表２３
表２４．
２工程プロトコールによる生成物サイズにおけるマスターアーゼ濃度の影響
ニック連結反応は、実施例７に記載されるプロトコールに従って、異なる濃度のマスターアーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われた。下記の表２３および表２４を参照されたい。
表２３
【表25】
【表26】
【0258】
ニック連結生成物（増幅後）の電気泳動の結果は、マスターアーゼの量が増加すると挿入物の長さが次第に短くなり、Ｔ４リガーゼの量が増加すると挿入物の長さが次第に長くなることを示す。断片は、これらの反応において形成され、配列決定に適していた。図１２Ｄを参照されたい。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列決定のためのアダプター化されたポリヌクレオチドのライブラリーを調製するための方法であって、単一の反応混合物において、二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片を生成することと、（ａ）各々がビーズ上に固定化された複数の分岐連結アダプター（ｂ－ＢＬＡ）を含む複数のビーズを提供し、３’末端に縮重配列を有するＬ－アダプターの集団を提供することであって、
各ｂ－ＢＬＡが、ｂ－ＢＬＡアダプター配列を含むバーコードオリゴヌクレオチド、およびバーコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含み、
各ＬアダプターがＬアダプター配列を含むことと、
（ｂ）リガーゼの存在下でｂ－ＢＬＡを核酸断片のうちの少なくとも１つと接触させ、それによって核酸断片の３’末端にｂ－ＢＬＡを連結することと、
（ｃ）リガーゼの存在下でＬ－アダプターの集団を接触させ、それによって核酸断片の５’末端にＬ－アダプターを連結し、
それによって、５’末端にＬ－アダプター配列を有し、３’末端にｂ－ＢＬＡアダプター配列を有する核酸断片のライブラリーを得ることと
を含む方法。
【請求項2】
Ｌ－アダプターの３’末端が、核酸断片のうちの少なくとも１つの５’末端に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
各ＢＬＡが、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）バーコード配列を含む一本鎖領域を含み、二本鎖平滑末端における鎖の５’末端が、分岐連結を介して、核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
反応混合物に酵素を添加することをさらに含み、酵素が、Ｌ－アダプターを連結する前に、過剰のｂ－ＢＬＡを分解する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
Ｌ－アダプターが３’末端に１～１０個の縮重塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
Ｌ－アダプターが溶液中にあり、バーコードオリゴヌクレオチドがビーズに接合され、
ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドがビーズに接合されない、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ｂ－ＢＬＡがウラシルを含み、ウラシルを除去してビーズからｂ－ＢＬＡを放出することができる、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
各ビーズが複数のｂ－ＢＬＡでその上に固定化され、複数のｂ－ＢＬＡの各々が同じバーコード配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
ｂ－ＢＬＡとＬ－アダプターの両方と連結して伸長された核酸断片を生成する核酸断片のうちの少なくとも１つを伸長することをさらに含み、伸長された核酸断片がバーコードのコピーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
伸長された核酸断片を環状化することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
複数のビーズを含み、各ビーズが固有のバーコード配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項12】
二本鎖領域の３’末端がジデオキシブロッカーヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
核酸断片の平均長が２００ヌクレオチド～１００００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
工程（ａ）において作出された突出型の一本鎖切断の５０％超が、工程（ｂ）における連結によって閉鎖される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
１種以上のニッキング剤が、非特異的ニッキングヌクレアーゼ、部位特異的ニッキングヌクレアーゼ、および化学的ニッキング剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
非特異的ニッカーゼが、Ｖｖｎ、エビｄｓＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡｓｅ Ｉからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
リガーゼがＴ４ ＤＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
配列決定のためのポリヌクレオチドのライブラリーを調製する方法であって、単一の反応混合物において、（ａ）二本鎖標的核酸を１種以上のニッキング剤と接触させて、突出型の一本鎖切断によって分離された重複する核酸断片を生成することと、
（ｂ）リガーゼの存在下で、複数の部分的に二本鎖の第１のアダプターを含むビーズを核酸断片と接触させることであって、
各第１のアダプターが、（ｉ）一方の鎖の５’末端および相補鎖の３’末端を含む二本鎖平滑末端、ならびに（ｉｉ）ビーズ上に固定化された一本鎖領域を含み、一本鎖領域がバーコードを含み、
それによって、少なくとも１つの第１のアダプターの二本鎖平滑末端における鎖の５’末端を、ＤＮＡリガーゼを用いて核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結して、連結された第１のアダプターを生成し、
連結された第１のアダプターがバーコードおよび少なくとも１つの核酸断片を含むことと、
（ｃ）連結された第１のアダプターを変性させることと、
（ｄ）連結された第１のアダプターにおけるバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズしたプライマーの制御された伸長を行い、それによって連結の第１のアダプターに相補的な部分的に伸長された鎖を生成することと
を含む方法。
【請求項19】
部分的に二本鎖の第１のアダプターのうちの少なくとも１つが連結されないままであり、制御された伸長を行うことが、連結された第１のアダプターと連結されていない第１のアダプターの両方においてバーコードに対して３’である配列にハイブリダイズされるプライマーをハイブリダイズすることを含み、それによって、連結された第１のアダプターに相補的である部分的に伸長された鎖、および連結されていない第１のアダプターに相補的である完全に伸長された鎖を生成し、それによって、
より短い鎖およびより長い鎖を含む、連結された第１のアダプターを含む部分的に二本鎖の分子と、
連結されていないアダプターを含む二本鎖分子と
を含む混合物を生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを添加することをさらに含み、それによってエキソヌクレアーゼが二本鎖分子を分解する、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
工程（ｄ）において、連結許容条件下で混合物にヘアピンアダプターを添加することをさらに含み、それによって二本鎖分子が１つのヘアピンアダプターに連結され、部分的に二本鎖の分子がヘアピンアダプターに連結されないままである、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
（ａ）部分的に二本鎖の分子鎖中のより短い鎖を伸長させて、より長い鎖中の核酸断片の配列をコピーし、それによってさらに伸長された鎖を生成することと、（ｂ）第２のアダプターをさらに伸長された鎖の３’末端に連結することと
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
工程（ｅ）においてより短い鎖を伸長することが、伸長可能なヌクレオチドと３’可逆的ブロッキング基を有するヌクレオチドの混合物の存在下で行われ、工程（ｆ）において第２のアダプターを連結することが、３’ブロッキング基の除去後に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
３’可逆的ブロッキング基を有するヌクレオチドが、異なるサイクルの間に添加される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
第２のアダプターが、分岐連結アダプター（ＢＬＡ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
連結された第２の分岐連結アダプターを鎖置換ポリメラーゼで伸長することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
標的核酸が、工程（ａ）および工程（ｂ）の前にビーズに結合される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
工程（ａ）におけるニッキングの前に、０～３０分間、標的核酸をビーズとともにインキュベートすることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
標的核酸が、３～１２％ＰＥＧを含む緩衝液中でビーズとともにインキュベートされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
単一の反応混合物のｐＨが７～９である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
工程（ａ）がリガーゼの存在下で起こる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
１種以上のニッキング剤およびリガーゼが、連結率がニッキング率よりも高いように選択される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
工程（ｂ）の後に、反応混合物を変性させることによって、核酸断片に連結されていない第１のアダプターのＤＮＡ鎖を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項34】
工程（ａ）が、突出型の一本鎖切断のギャップを増加させるためにエキソヌクレアーゼを単一の反応混合物に添加することをさらに含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
増加したギャップが１～３０塩基の長さを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
標的核酸にニックを入れ、ｂ－ＢＬＡおよびＬ－アダプターを核酸断片に連結することが、少なくとも３０分間持続する、請求項１に記載の方法。
【請求項37】
二本鎖標的核酸にニックを入れ、第１のアダプターを核酸断片に連結することが、少なくとも３０分間持続する、請求項１８に記載の方法。
【請求項38】
（１）１種以上のニッキング剤、（２）１種以上のリガーゼ、
（３）突出型の一本鎖切断によって分離された複数の重複する核酸断片、
（４）互いにハイブリダイズして部分的に二本鎖の核酸分子を形成する、バーコードオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドを含む部分的に二本鎖の分岐アダプターを含む反応混合物であって、
バーコードオリゴヌクレオチドがビーズに接合され、バーコードを含み、
ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドがビーズに接合されず、
部分的に二本鎖の核酸分子が、
（ｉ）５’末端および３’末端を有する二本鎖平滑末端、ならびに
（ｉｉ）バーコードを含み、一本鎖末端を有する一本鎖領域
を含み、二本鎖平滑末端の５’末端が、重複する核酸断片のうちの少なくとも１つの３’末端に連結される、反応混合物。
【請求項39】
核酸断片のうちの少なくとも１つの５’末端がＬ－アダプターに連結される、請求項３８に記載の反応混合物。
【請求項40】
Ｌ－アダプターが、３’末端に１～１０個の縮重塩基を含む、請求項３８に記載の反応混合物。
【国際調査報告】