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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-25
(54)【発明の名称】治療用ムテイン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/26 20060101AFI20240718BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20240718BHJP
C12N 15/19 20060101ALI20240718BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240718BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20240718BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20240718BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240718BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240718BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240718BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240718BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240718BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20240718BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240718BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240718BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240718BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240718BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240718BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240718BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240718BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240718BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240718BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240718BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240718BHJP
A61K 31/56 20060101ALI20240718BHJP
【ＦＩ】
C12N15/26
C07K14/55 ZNA
C12N15/19
C07K19/00
C07K14/52
C07K14/54
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/0783
C12N15/24
C07K16/00
C07K16/30
C12N5/10
C12P21/00 K
A61P35/00
A61P31/00
A61P37/04
A61P43/00 121
A61K48/00
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/39
A61K38/20
A61K47/68
A61K39/395 U
A61K39/395 G
A61K47/60
A61K39/395 Y
A61K39/395 W
A61K35/17
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K31/56
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503765
(86)(22)【出願日】2022-07-21
(85)【翻訳文提出日】2024-03-01
(86)【国際出願番号】 EP2022070548
(87)【国際公開番号】W WO2023001987
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】2110547.3
(32)【優先日】2021-07-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2203600
(32)【優先日】2022-04-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】510162322
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ダンディー
(71)【出願人】
【識別番号】522359811
【氏名又は名称】サントル オスピタリエ ルジョナル ユニヴェルシテール ドゥ リール
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＲＥＧＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＬＩＬＬＥ
(71)【出願人】
【識別番号】518338518
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・リール
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＬＬＥ
(71)【出願人】
【識別番号】517007264
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル）
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100195556
【弁理士】
【氏名又は名称】柿沼 公二
(72)【発明者】
【氏名】イグナシオ モラガ ゴンザレス
(72)【発明者】
【氏名】スーマン ミトラ
(72)【発明者】
【氏名】シルヴィア ガジェロ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG02
4B064AG03
4B064AG05
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA93Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
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4B065CA25
4B065CA44
4C076AA94
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC31
4C076CC41
4C076EE59
4C076EE59M
4C076EE59Q
4C076FF31
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA44
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4C084DA14
4C084MA02
4C084NA03
4C084NA05
4C084NA12
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB021
4C084ZB091
4C084ZB261
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA25
4C085AA26
4C085AA33
4C085AA38
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB12
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4C085BB42
4C085BB50
4C085CC03
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C085EE06
4C085FF13
4C085GG06
4C086AA01
4C086DA08
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB02
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087CA04
4C087NA05
4C087NA13
4C087ZB02
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB31
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA57
4H045CA40
4H045DA01
4H045DA02
4H045DA04
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
野生型に対して、１つ以上のアミノ酸改変を含む改変サイトカインが開示される。これらの改変サイトカインは、野生型サイトカインの活性と比較して、酸性ｐＨで活性の向上を示し、中性ｐＨではしばしば活性の低下を示す。本開示の改変サイトカインは、医薬として、ならびに／または免疫学的状態もしくはがんの治療および／もしくは予防に使用するものである。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
耐ｐＨ ＩＬ－２ムテインであって、該ムテインのアミノ酸配列が、野生型ＩＬ－２配列に対して１つ以上のアミノ酸改変を含む、ムテイン。
【請求項2】
前記ＩＬ－２ムテインが、酸性ｐＨにおいてより高い親和性でＩＬ－２Ｒαに結合する、請求項１に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項3】
前記ＩＬ－２ムテインが、約４．０～約７、好ましくは約５～約６．５のｐＨから選択されるｐＨにおいて、ｐＨ約７．２～約７．５から選択されるｐＨよりも高い親和性でＩＬ－２Ｒαに結合する、請求項１または２に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項4】
前記ＩＬ－２ムテインが、（ｉ）ｐＨ約７．２～約７．５において、野生型ＩＬ－２分子と比較して低い親和性でＩＬ－２受容体もしくはＩＬ－２Ｒαに、および／または
（ii）ｐＨ約４．０～約７．０、好ましくは約５～約６．５のｐＨから選択されるｐＨにおいて、野生型ＩＬ－２分子と比較して高い親和性でＩＬ－２受容体もしくはＩＬ－２Ｒαに
結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項5】
前記ＩＬ－２ムテインが、ｐＨ７．２よりもｐＨ６．５においてより強力なＳＴＡＴ５の活性化を誘発する、請求項１～３のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項6】
酸性ｐＨにおいて、前記ムテインが、野生型ＩＬ－２分子と比較して細胞傷害性Ｔ細胞の増殖の誘導に優れる、請求項１～４のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項7】
中性ｐＨにおいて、野生型ＩＬ－２分子と比較して、前記ムテインが、ＩＬ－２Ｒα結合の減少および／または細胞傷害性Ｔ細胞を増殖させる能力の減少および／またはＳＴＡＴ５の活性化の低下を示す、請求項１～５のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項8】
前記野生型ＩＬ－２配列が配列番号１、３～８を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項9】
前記ムテインが、配列番号１、４、５、８の残基３７、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸置換を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項10】
前記ムテインが、非保守的置換または保守的置換を含み、好ましくは、前記非保守的置換が、配列番号１、４、５、８の残基３７、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基における正に荷電したアミノ酸への置換である、請求項８に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項11】
前記ムテインが、配列番号１または８の残基３７において、スレオニンからヒスチジン、アルギニンまたはセリンへの置換を含む、請求項１０に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項12】
前記ムテインが、配列番号１、４、５、８の残基３８または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸置換を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項13】
前記ムテインが、非保守的置換または保守的置換、好ましくは、配列番号１、４、５、８の残基３８または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基において、アルギニンからロイシン、バリン、イソロイシンまたはアラニンへの置換を含む、請求項１２に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項14】
前記ムテインが、配列番号１、４、５、８の残基４１または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸置換を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項15】
前記ムテインが、保守的または非保守的置換、好ましくは、配列番号１、４、５、８の残基４１または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基において、スレオニンからセリン、グリシンまたはアスパラギン酸への置換を含む、請求項１４に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項16】
前記ムテインが、配列番号１、４、５、８の残基４２または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸置換を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項17】
前記ムテインが、非保守的置換、好ましくは、配列番号１、４、５、８の残基４２または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基において極性中性アミノ酸への置換を含む、請求項１６に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項18】
前記ムテインが、残基４２においてフェニルアラニンからチロシンへの置換を含む、請求項１７に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項19】
前記ムテインが、配列番号１、４、５、８の残基４３または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸置換を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項20】
前記ムテインが、非保守的置換、好ましくは、配列番号１、４、５、８の残基４３または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基において極性中性アミノ酸に対する置換を含む、請求項１９に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項21】
前記ムテインが、配列番号１、４、５、８の残基４３または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてリジンからグリシンへの置換を含む、請求項２０に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項22】
前記ムテインが、配列番号１、４、５、８の残基６４または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸置換を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項23】
前記ムテインが、保守的または非保守的アミノ酸置換、好ましくは、配列番号１、４、５、８の残基６４または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基において酸性アミノ酸に対する置換を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項24】
前記ムテインが、残基６４においてリジンからグルタミン酸への置換を含む、請求項２３に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項25】
前記ムテインが、１つ以上の他の残基において１つ以上の改変をさらに含む、請求項９～２４のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項26】
前記ムテインが、配列番号１、４、５、８の３７位、３８位、４１位、４２位、４３位、および／もしくは６５位、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基のいずれかにおいて１つ以上の改変をさらに含む、請求項２５に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項27】
前記ムテインが、少なくとも配列番号１、４、５、８の３７位、３８位、４１位、４３位における改変と、４２位および６４位から選択される少なくとも１つまたは配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基における少なくとも１つのさらなる改変とを含む、請求項９～２４のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項28】
配列番号１の配列に対して、前記ＩＬ－２ムテインが、配列番号１、４、５、８の３７位、３８位、４１位、４２位および４３位の各残基、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸改変を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項29】
前記ＩＬ－２ムテインが、配列番号１、４、５、８の３７位、３８位、４１位、４３位および６４位の各残基、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸改変を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項30】
配列番号１または８の配列に対して、前記ＩＬ－２ムテインが、以下のアミノ酸置換：（ｉ）Ｔ３７Ｈ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｌ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｓ；および／または
（iv）Ｆ４２Ｙ；および／または
（ｖ）Ｋ４３Ｇ
の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項31】
配列番号１または８の配列に対して、前記ＩＬ－２ムテインが、以下のアミノ酸置換：（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ａ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｄ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ；および／または
（ｖ）Ｋ６５Ｅ
の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項32】
配列番号１または８の配列に対して、前記ＩＬ－２ムテインが、以下のアミノ酸置換：（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｌ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｆ４２Ｙ；および／または
（ｖ）Ｋ４３Ｇ
の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項33】
配列番号１または８の配列に対して、前記ＩＬ－２ムテインが、以下のアミノ酸置換：（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｖ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ
の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項34】
配列番号１または８の配列に対して、前記ＩＬ－２ムテインが、以下のアミノ酸置換：（ｉ）Ｔ３７Ｒ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｖ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ
の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項35】
配列番号１または８の配列に対して、前記ＩＬ－２ムテインが、以下のアミノ酸置換：（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｉ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ
の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項36】
前記ムテインが、配列番号２、９、１０、１１、１２もしくは１３またはその機能性フラグメントを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン。
【請求項37】
請求項１～３６のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテインまたはその機能性フラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項38】
前記融合タンパク質が、さらなるポリペプチド分子またはポリペプチドフラグメントを含む、請求項３７に記載の融合タンパク質。
【請求項39】
前記さらなるポリペプチド分子またはペプチドフラグメントが、前記ＩＬ－２ムテインまたはその機能性フラグメントに融合されている、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項40】
前記さらなるポリペプチド分子またはポリペプチドフラグメントが、サイトカインまたはそのフラグメント；または
インターロイキン分子またはそのフラグメント
である、請求項３８～３９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項41】
前記さらなるポリペプチド分子またはポリペプチドフラグメントが、ポリペプチド結合ドメイン；
抗体またはそのフラグメント；
一本鎖抗体；または
ＶＨＨ
を含む、請求項３７～３９に記載の融合タンパク質。
【請求項42】
前記ポリペプチド結合ドメインが、腫瘍抗原またはチェックポイント分子に結合する、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項43】
前記ポリペプチド結合ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＣＤ１６０、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯｌ、ＩＤ０２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、またはＶＩＳＴＡから選択される少なくとも１つのチェックポイント分子に結合する、請求項４１または４２に記載の融合タンパク質。
【請求項44】
前記ポリペプチド結合ドメインが、制御性Ｔ細胞によって発現される抗原に結合する、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項45】
前記抗体が、アンタゴニスト抗体もしくはそのアンタゴニストフラグメント；または
アゴニスト抗体もしくはそのアゴニストフラグメント
である、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項46】
前記抗体またはそのフラグメントが、ｐＨ応答性抗体またはそのフラグメントである、請求項４１または４５に記載の融合タンパク質。
【請求項47】
前記ＩＬ－２ムテインが、該ＩＬ－２ムテインを条件的に不活性化するポリペプチドドメインに融合されている、請求項３７～４６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項48】
前記ＩＬ－２ムテインまたは機能性フラグメントが、半減期延長型分子に融合され、任意に、前記半減期延長型分子が、免疫グロブリンフラグメント、Ｆｃ分子、血液血清タンパク質に結合するポリペプチド結合ドメイン、アルブミンに結合するポリペプチド結合ドメイン、またはポリマーを含む、請求項３７～４６に記載の融合タンパク質。
【請求項49】
前記ポリマーがポリエチレングリコール分子を含む、請求項４８に記載の融合タンパク質。
【請求項50】
請求項１～４９のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質をエンコードする、核酸。
【請求項51】
配列番号２、９、１０、１１、１２または１３をエンコードする、核酸。
【請求項52】
請求項５０または請求項５１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項53】
請求項５０～５１に記載の核酸または請求項５２に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項54】
前記宿主細胞がＴ細胞、好ましくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞である、請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項55】
ＩＬ－２ムテインの作製方法であって、該方法が、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の核酸またはベクターを宿主細胞に導入することと、前記核酸を発現させることとを含む、方法。
【請求項56】
耐ｐＨサイトカインムテインの同定方法であって、該方法が、サイトカイン分子を変異または改変させてサイトカインムテインを生成することと、
サイトカイン受容体に結合しｐＨ耐性を有するムテインを同定するために、酸性条件下で前記サイトカインムテインをサイトカイン受容体と接触させることと、を含む方法。
【請求項57】
前記耐ｐＨサイトカインムテインがＩＬ－２ムテインである、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
野生型サイトカイン分子を変異または改変させてサイトカインムテインを生成することと、該サイトカインムテインを酸性条件下で当該サイトカインに対するリガンドと接触させることとを含む方法によって得ることができる耐ｐＨサイトカインムテインであって、酸性条件下で前記リガンドに結合した任意のサイトカインムテインが耐ｐＨサイトカインムテインである、耐ｐＨサイトカインムテイン。
【請求項59】
野生型ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成することと、該ＩＬ－２ムテインを酸性条件下でＩＬ－２Ｒαと接触させることとを含む方法によって得ることができる耐ｐＨ ＩＬ－２ムテインであって、酸性条件下でＩＬ－２Ｒαに結合した任意のＩＬ－２ムテインが耐ｐＨ ＩＬ－２ムテインである、耐ｐＨ ＩＬ－２ムテイン。
【請求項60】
医薬に使用するための、請求項１～４９、５８または５９のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質またはサイトカインムテイン。
【請求項61】
医薬に使用するための、配列番号２、９、１０、１１、１２もしくは１３またはそのフラグメントを含むタンパク質、融合タンパク質または組成物。
【請求項62】
医薬に使用するための、請求項５０～５１のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項63】
医薬に使用するための、配列番号２、９、１０、１１、１２もしくは１３またはそのフラグメントを含むタンパク質をエンコードする核酸。
【請求項64】
免疫学的状態の治療または予防に使用するための、請求項１～５１、５８または５９のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質、核酸またはサイトカインムテイン。
【請求項65】
がんの治療または予防に使用するための、請求項１～５１、５８または５９のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質、核酸またはサイトカインムテイン。
【請求項66】
感染症の治療または予防に使用するための、請求項１～５１、５８または５９のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質、核酸またはサイトカインムテイン。
【請求項67】
アジュバントとして使用するためのものであって、任意に、前記アジュバントがワクチンアジュバントである、請求項１～５１、５８または５９のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質、核酸またはサイトカインムテイン。
【請求項68】
請求項１～５１、５８または５９のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質、核酸またはサイトカインムテインを含む組成物。
【請求項69】
前記組成物が医薬組成物であり、任意に１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項70】
前記組成物または医薬組成物が、別の治療的部分または薬学的に活性な薬剤を含む、請求項６８および６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項71】
免疫学的状態および／またはがんの治療または予防方法であって、該方法が、治療有効量の請求項１～５１、５８または５９のいずれか１項に記載のＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質、サイトカインムテイン、または核酸を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項72】
前記ＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質、サイトカインムテイン、または核酸が、抗腫瘍抗原抗体、チェックポイント分子、チェックポイント分子に対する抗体、腫瘍抗原、ステロイド、および／またはＣＡＲ Ｔ細胞と組み合わせて投与される、請求項７１に記載の免疫学的状態および／またはがんの治療または予防方法。
【請求項73】
前記チェックポイント分子または抗体が、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＣＤ１６０、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯｌ、ＩＤ０２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、またはＶＩＳＴＡから選択されるチェックポイント分子に対するものである、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記ＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質、サイトカインムテイン、またはヌクレオチドを投与する前に、患者のＴＭＥの細胞外ｐＨを決定するステップを含む、請求項７１～７３のいずれか１項に記載の免疫学的状態および／またはがんの治療または予防方法。
【請求項75】
免疫学的状態および／またはがんの治療または予防に使用するための、請求項５４に記載の宿主細胞。
【請求項76】
免疫学的状態および／またはがんを治療または予防するための医薬品の製造における、請求項５４に記載の宿主細胞の使用。
【請求項77】
免疫学的状態および／またはがんの治療または予防方法であって、該方法が、それを必要とする対象に請求項５４に記載の宿主細胞を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、様々な疾患および／または状態の治療に使用するための、酸性ｐＨにおいて活性が改善されている改変分子を提供する。より詳細には、本開示は、がんの治療に使用するためのＩＬ－２を含む改変サイトカインを提供する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍の分化および免疫回避に重要な働きをし、このためサイトカインによって誘導される抗腫瘍反応に拮抗する（非特許文献１）。ＴＭＥの免疫抑制特性を規定する細胞的および分子的な基礎が広く研究されている（非特許文献２、３）。しかし、その独特な生理化学的特性がサイトカイン応答にどのように影響するかについては、まだほとんど解明されていない。ＴＭＥの特徴としてアシドーシスが挙げられる。腫瘍細胞は解糖活性が高いため、乳酸が過剰に産生され、ｐＨ６．２～６．５程度の酸性環境となる。これは正常組織のｐＨ７．４とは対照的である（非特許文献１、４）。酸性ＴＭＥがサイトカイン－受容体の結合およびサイトカインシグナル伝達にどのような影響を及ぼすかについては、現時点ではわかっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Hanahan, D. & Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell 144, 646-674 (2011).
【非特許文献2】Brand, A. et al. LDHA-Associated Lactic Acid Production Blunts Tumor Immunosurveillance by T and NK Cells. Cell Metabolism 24, 657-671 (2016).
【非特許文献3】Huber, V. et al. Cancer acidity: An ultimate frontier of tumor immune escape and a novel target of immunomodulation. Seminars in Cancer Biology 43, 74-89 (2017).
【非特許文献4】Renner, K. et al. Restricting Glycolysis Preserves T Cell Effector Functions and Augments Checkpoint Therapy. Cell Reports 29, 135-150.e9 (2019).
【非特許文献5】Mitra, S. & Leonard, W. J. Biology of IL-2 and its therapeutic modulation: Mechanisms and strategies. J. Leukoc. Biol. 103, 643-655 (2018).
【非特許文献6】Rosenberg, S. A. IL-2: The First Effective Immunotherapy for Human Cancer. The Journal of Immunology 192, 5451-5458 (2014).
【非特許文献7】Smith, K. A. & Cantrell, D. A. Interleukin 2 regulates its own receptors.PNAS 82, 864-868 (1985).
【非特許文献8】Pipkin, M. E. et al. Interleukin-2 and Inflammation Induce Distinct Transcriptional Programs that Promote the Differentiation of Effector Cytolytic T Cells. Immunity 32, 79-90 (2010).
【非特許文献9】Calcinotto, A. et al. Modulation of microenvironment acidity reverses anergy in human and murine tumor-infiltrating T lymphocytes.Cancer Res. 72, 2746-2756 (2012).
【非特許文献10】Mitra, S. et al. Interleukin-2 Activity Can Be Fine Tuned with Engineered Receptor Signaling Clamps. Immunity 42, 826-838 (2015).
【非特許文献11】Krieg, C., Letourneau, S., Pantaleo, G. & Boyman, O. Improved IL-2 immunotherapy by selective stimulation of IL-2 receptors on lymphocytes and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 11906- 11911 (2010).
【非特許文献12】Wu, H. et al. T-cells produce acidic niches in lymph nodes to suppress their own effector functions. Nature Communications 11, 4113 (2020).
【非特許文献13】Caudana, P. et al. IL2/Anti-IL2 Complex Combined with CTLA-4, But Not PD-1, Blockade Rescues Antitumor NK Cell Function by Regulatory T-cell Modulation. Cancer Immunol Res 7, 443-457 (2019).
【非特許文献14】Wang, X., Rickert, M. & Garcia, K. C. Structure of the Quaternary Complex of Interleukin-2 with Its α, β, and γc Receptors. Science 310, 1159-1163 (2005).
【非特許文献15】Krutzik, P. O. & Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods 3, 361-368 (2006).
【非特許文献16】Boder, E. T. & Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nature Biotechnology 15, 553 (1997).
【非特許文献17】You, C., Richter, C. P., Loechte, S., Wilmes, S. & Piehler, J. Dynamic submicroscopic signaling zones revealed by pair correlation tracking and localization microscopy. Anal Chem 86, 8593-8602 (2014).
【非特許文献18】Moraga, I. et al. Tuning cytokine receptor signaling by re-orienting dimer geometry with surrogate ligands. Cell 160, 1196-1208 (2015).
【非特許文献19】Wilmes, S. et al. Receptor dimerization dynamics as a regulatory valve for plasticity of type I interferon signaling. J Cell Biol 209, 579-593 (2015).
【非特許文献20】Vogelsang, J. et al. A reducing and oxidizing system minimizes photobleaching and blinking of fluorescent dyes. Angew Chem Int Ed Engl 47, 5465-5469 (2008).
【非特許文献21】Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H. & Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods 5, 687-694 (2008).
【非特許文献22】Chen LQ, Pagel MD. Evaluating pH in the Extracellular Tumor Microenvironment Using CEST MRI and Other Imaging Methods. Adv Radiol. 2015;2015:206405
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
インターロイキン－２（ＩＬ－２）サイトカインは、免疫活性の強力なマスターレギュレーターとして機能するため、ＩＬ－２は、疾患とより有効に闘うために免疫反応を調整する強力な媒介物となっている。静止リンパ球では、ＩＬ－２はＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγからなる中程度の親和性を有するＩＬ－２受容体（Ｋｄ：約１０～９Ｍ）を介してシグナルを伝達する。これに対し、活性化リンパ球はさらにＩＬ－２Ｒαを発現し、ＩＬ－２ＲαはＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγに結合して親和性の高い受容体（Ｋｄ：約１０～１１Ｍ）を形成し、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－２に強く反応し、腫瘍を効果的に退縮させる（非特許文献５）。このため、ＩＬ－２は悪性腫瘍の免疫療法の一環として３０年間にわたり臨床で使用されている（非特許文献６）。しかし、主として、そのエフェクターＴ細胞および制御Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の両方の同時促進における役割など、ＩＬ－２の広範な多面性の結果、有効性が限られかつ毒性が高いため、これを広く使用することができない（非特許文献６）。このため、がんの治療のためエフェクター細胞の増殖を選択的に促進するＩＬ－２活性を操作するべく、数多くの取り組みがなされている。しかし、細胞外の化学的環境（腫瘍内腔にみられる酸性ｐＨなど）がＩＬ－２活性にどのような影響を及ぼすかは、十分に理解されていない。酸性ｐＨを用いてＴリンパ球表面からのＩＬ－２結合を破壊した先行研究から、このサイトカインはｐＨの変化に応答性を有することが示唆された。しかし、ＩＬ－２結合受容体のいずれがｐＨ応答性を有するのか、および酸性ｐＨがＩＬ－２反応にどのような影響を与えるのかはわかっていない。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示は、野生型に対して、１つ以上のアミノ酸改変（例えば、１つ以上のアミノ酸の置換）を含む改変サイトカインを提供する。本発明者らは、これらの改変サイトカインは、野生型サイトカインの活性と比較して、酸性ｐＨで活性が向上し、中性ｐＨではしばしば活性が低下することを見出した。本開示において、改変サイトカインはサイトカインムテインとも呼ぶ。
【0006】
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍の分化および免疫回避に重要な働きをし、サイトカインによって誘導される特定の抗腫瘍反応に拮抗することができる。ＴＭＥの特徴としてアシドーシスが挙げられる。腫瘍細胞は解糖活性が高いため、乳酸が過剰に産生され、ｐＨ６．２～６．５程度の酸性環境となる。これは正常組織にみられる中性ｐＨ（例えばｐＨ７．４）とは対照的である。
【0007】
特定のサイトカイン、例えばインターロイキン２（ＩＬ－２）の活性は、例えばＴ細胞免疫など、疾患に対する宿主免疫応答の各種側面の発達および維持に重要である。サイトカインは、免疫細胞および免疫プロセスの増殖および誘導を促進する。しかし、サイトカインの機能はｐＨの変化に応答性を有し得る。例えば、サイトカインとその受容体との結合は、ｐＨ応答性またはｐＨ依存性のプロセスであることがある。上述したように、がんを含む特定の疾患の特徴として、サイトカイン受容体の結合に悪影響を及ぼし、最終的にサイトカインをベースとする治療法の有効性を低下させ得る酸性微小環境の生成が挙げられる。
【0008】
前述のように、ｐＨに応答性を有するサイトカイン（すなわち、酸性条件下で活性／受容体結合の低下を示すサイトカイン）が、野生型一次配列の１つ以上のアミノ酸の変更（例えば置換）によって改変されてよい。本開示に係る改変サイトカインは、酸性ｐＨにおいて活性の向上、および／または中性ｐＨにおいて活性の低下を示してよい。この特徴により、改変サイトカインは医薬、特に免疫学的疾患および／またはがんの治療および／または予防に有用となる。
【0009】
治療上の可能性を有する、例えば、医薬に使用するための改変サイトカインは、
野生型サイトカイン配列を改変して改変サイトカインを生成することと、
改変サイトカインをリガンドまたは細胞と接触させることと、
改変サイトカインがリガンドに結合するかどうか、および／または細胞を活性化させるかどうかを決定することと、を含む方法によって同定または取得されてよく、リガンドに結合する、および／または細胞を活性化させる改変サイトカインは、医薬において、または免疫学的状態もしくはがんの治療および／もしくは予防のために使用されてよい。
野生型サイトカイン配列を改変して改変サイトカインを生成することと、
改変サイトカインをリガンドまたは細胞と接触させることと、
改変サイトカインがリガンドに結合するかどうか、および／または細胞を活性化させるかどうかを決定することと、を含む方法によって同定または取得されてよく、リガンドに結合する、および／または細胞を活性化させる改変サイトカインは、医薬において、または免疫学的状態もしくはがんの治療および／もしくは予防のために使用されてよい。
【0010】
改変サイトカインをリガンドと接触させるステップは、改変サイトカインをリガンドフラグメントと接触させることを含んでよく、リガンドフラグメントはサイトカイン結合フラグメントである。同様に、細胞がリガンドおよび／またはそのサイトカイン結合フラグメントを発現してよい。
【0011】
サイトカインムテイン、好ましくは耐ｐＨサイトカインムテインの同定方法は、サイトカインムテインまたはそのフラグメントをエンコードする核酸を含むライブラリーを作製するステップをさらに含んでよく、サイトカインムテインは、１つ以上のアミノ酸の置換（例えば、保守的置換を含む）；（ii）１つ以上のアミノ酸の欠失；（iii）１つ以上のアミノ酸の付加；および（iv）１つ以上の配列の逆位（これらはすべて、本明細書において後に記載／定義される）を含む。
【0012】
変異は、サイトカインと、その対応するリガンドまたは受容体との結合に関与する少なくとも１つの残基において行われてよい。異なるサイトカインの結合プロファイルに関与する残基は、それらのサイトカインとその受容体との機能的相互作用の構造のデータの解析によって決定することができる。変異は、ランダムな変異でも、あらかじめ規定された変異でもよい。
【0013】
本方法はさらに、核酸ライブラリーを発現させてサイトカインムテインライブラリーを得るステップを含んでよい。ライブラリーに含まれるサイトカインムテインは、細胞、ファージのウイルス、例えば酵母細胞などの発現ビヒクルの表面で発現されてよい。
【0014】
（本明細書中に記載の方法または手順のいずれかによる）改変がなされるサイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、成長ホルモン（ＧＦ１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン（ＯＳＭ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはこれらのサイトカインのいずれかの機能性フラグメント／バリアントから選択されてよい。
【0015】
一教示において、改変がなされるサイトカインは、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬｌｅ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸ３ＣＬ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、またはこれらのサイトカインのいずれかの機能性フラグメント／バリアントであってよい。
改変がなされるサイトカインは、ＩＦＮ－α（アルファ）、ＩＦＮ－β（ベータ）、ＩＦＮ－γ（ガンマ）、ＩＦＮ－ε（イプシロン）、ＩＦＮ－κ（カッパ）、ＩＦＮ－ω（オメガ）、ＩＦＮ－τ（タウ）、ＩＦＮ－ζ（ゼータ）、ＩＦＮ－δ（デルタ）、ＩＦＮ－λ（ラムダ）、またはこれらのサイトカインのいずれかの機能性フラグメント／バリアントからなる群から選択されてよい。
改変がなされるサイトカインは、ＩＦＮ－α（アルファ）、ＩＦＮ－β（ベータ）、ＩＦＮ－γ（ガンマ）、ＩＦＮ－ε（イプシロン）、ＩＦＮ－κ（カッパ）、ＩＦＮ－ω（オメガ）、ＩＦＮ－τ（タウ）、ＩＦＮ－ζ（ゼータ）、ＩＦＮ－δ（デルタ）、ＩＦＮ－λ（ラムダ）、またはこれらのサイトカインのいずれかの機能性フラグメント／バリアントからなる群から選択されてよい。
【0016】
改変がなされるサイトカインは、ＩＦＮ－α（アルファ）、ＩＦＮ－β（ベータ）、ＩＦＮ－γ（ガンマ）、ＩＦＮ－ε（イプシロン）、ＩＦＮ－κ（カッパ）、ＩＦＮ－ω（オメガ）、ＩＦＮ－τ（タウ）、ＩＦＮ－ζ（ゼータ）、またはＩＦＮ－δ（デルタ）、ＩＦＮ－λ（ラムダ）の機能性フラグメントまたはバリアントを含んでよい。
【0017】
別の教示において、改変がなされるサイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－１７Ｃ、ＩＬ－１７Ｄ、ＩＬ－１７Ｅ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１７Ｌ、ＩＬ－１７Ａ／Ｌ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、またはこれらのサイトカインのいずれかの機能性フラグメント／バリアントであってよい。
【0018】
改変がなされるサイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＬ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＬ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＬ－α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＬ－β）、ＩＬＮ－γ（ガンマ）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、またはこれらのサイトカインのいずれかの機能性フラグメント／バリアントであってよい。
【0019】
一教示において、サイトカインは、ＴＮＦ－α（アルファ）、ＴＮＦ－β（ベータ）、ＴＮＦ－γ（ガンマ）、ＣＤ２５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１７８、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、４－１ＢＢ－Ｌ、ＬＴａ、ｉΤβ、ＬＩＧＨＴ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＦＬＴ３リガンド、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮα／β／ω、ＩＦＮｙ、ＬＩＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＯＳＭ、幹細胞因子、ＴＧＦｐｉ、ＴＧＦｐ２、ＴＧＦ３３、ＴＳＬＰリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＡＰ０３Ｌ、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＴＬ１、ＡＩＴＲＬ、ＥＤＡ１、またはこれらのサイトカインの機能性フラグメント／バリアントからなる群から選択されてよい。サイトカインは、ＴＮＦ－α（アルファ）、ＴＮＦ－β（ベータ）、ＴＮＦ－γ（ガンマ）、ＣＤ２５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１７８、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、４－１ＢＢ－Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＡＰ０３Ｌ、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＴＬ１、ＡＩＴＲＬ、ＥＤＡＬ、またはこれらのサイトカインのいずれかの機能性フラグメント／バリアントであってよい。好ましい実施形態では、サイトカインはインターロイキンであり、より好ましくはＩＬ－２またはＩＬ－１０である。
【0020】
野生型サイトカインを改変するステップは、
（ｉ）野生型一次配列のアミノ酸を別のアミノ酸で置換すること。このタイプの置換は保守的な置換であってよい；および／または
（ii）野生型一次配列から別のアミノ酸によりアミノ酸を欠失させること；および／または
（iii）野生型一次配列にアミノ酸を付加すること；および／または
（iv）野生型一次アミノ酸配列の一部を逆位させること、を含む。
（ｉ）野生型一次配列のアミノ酸を別のアミノ酸で置換すること。このタイプの置換は保守的な置換であってよい；および／または
（ii）野生型一次配列から別のアミノ酸によりアミノ酸を欠失させること；および／または
（iii）野生型一次配列にアミノ酸を付加すること；および／または
（iv）野生型一次アミノ酸配列の一部を逆位させること、を含む。
【0021】
改変サイトカインをリガンドまたは細胞と接触させるステップは、酸性条件下で行われてよく、例えばｐＨは、例えば約７．５～約７．２未満、例えば約ｐＨ７．４またはｐＨ７．３未満である。あるいは、改変サイトカインをリガンドまたは細胞と接触させるステップは、約４．０～約７．０のｐＨで行われてよい。改変サイトカインをリガンドまたは細胞と接触させるステップは、ｐＨ約４．５もしくはｐＨ約４．８～ｐＨ約５．５もしくはｐＨ約６．５、またはｐＨ約５．０～ｐＨ約６．９、例えば約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３または約６．４のｐＨで行われてよい。改変サイトカインが細胞を活性化させるかどうかを決定する任意のステップは、細胞を改変サイトカインと接触させることと、例えば、細胞の増殖および／もしくは増大、細胞表面マーカーの発現の上昇、あるいは／または細胞からの他のサイトカインもしくは分子の発現を検出することとを含んでよい
【0022】
サイトカイン受容体／リガンドの濃度を低下させながらサイトカインムテインと接触させる指向性進化法／反復選択サイクルを用いて、有用なサイトカインムテインが同定されてよい。これにより、受容体への結合親和性が最も良好なサイトカインムテインを同定することができる。
【0023】
反復選択サイクルは、最初に（１サイクルまたは数サイクルで）サイトカイン受容体多量体、好ましくは受容体四量体に結合させることと、続いて（１サイクルまたは数サイクルで）サイトカイン受容体単量体に結合させることとを含む。受容体多量体は、例えば、ビオチン化受容体をストレプトアビジンに結合させるか、他のリガンド／バインダー相互作用を介して得ることができる。
【0024】
反復選択ラウンドは、受容体濃度を低下させながら（例えば、１００ｎＭの四量体、１μＭの四量体、１００ｎＭの単量体；図２ｂも参照）結合させることを含んでよい。理論に束縛されることを望むものではないが、受容体濃度を低下させることにより、受容体親和性の高いムテインを同定することができる。
【0025】
次に、様々な選択ラウンドで受容体に結合したサイトカインムテインが、関連するムテインをエンコードする核酸を含む発現ベクター／ヒビクルを用いて発現されてよい。したがって、本方法は、発現されたムテインを介して、受容体に結合した発現ビヒクル／ベクターに含まれる核酸を単離および／またはシークエンシングするステップをさらに含んでよい。
【0026】
本方法は、少なくともｐＨ７．２、好ましくは約ｐＨ７．４で、サイトカインムテインを対応する受容体またはその結合フラグメントと接触させるステップをさらに含んでよい。さらに、本方法は、対応する野生型サイトカインを、該対応する受容体またはその結合フラグメントと接触させることを含んでよい。これらの方法ステップのいずれかまたは両方を用いて、ユーザーはそれぞれの条件下でサイトカインムテインおよび野生型サイトカインの結合親和性を決定することができる。本方法はさらに、各ｐＨにおいて、対応する受容体に野生型サイトカインと比較して低い親和性で結合するムテインを選択するステップを含んでよい。
【0027】
本方法はさらに、少なくともｐＨ７．２、好ましくはｐＨ約７．４よりも、約４．０～約７．０のｐＨにおいて、対応する受容体またはその結合フラグメントに高い親和性で結合するサイトカインムテインを選択するステップを含んでよい。好ましくは、このステップでは、少なくともｐＨ７．２、好ましくはｐＨ約７．４において、対応する受容体に野生型サイトカインと比較して低い親和性で結合することを特徴とするムテインが選択されてよい。
【0028】
本発明はさらに、上記のサイトカインムテインをエンコードする核酸を含むライブラリー、およびサイトカインムテインライブラリーに関する。
【0029】
本明細書に記載の技術は、Ｔ細胞の増殖を促進し、様々なエフェクター機能を制御するインターロイキン－２（ＩＬ－２）に適用されてよい。ＩＬ－２は、例えばＩＦＮγの産生を含む細胞傷害性機能を誘導する。ＩＬ－２の機能にとって重要なのは、その結合活性である。ＩＬ－２受容体としては、例えばＩＬ２Ｒα、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２Ｒγが挙げられる。便宜上、これらの受容体を「ＩＬ－２受容体」と総称する。
【0030】
ＩＬ－２は悪性腫瘍の免疫療法として用いられている。しかし、ＩＬ－２の重要な機能の一部はｐＨの変化に応答性を有し、特に、ＩＬ－２とその受容体との結合はｐＨ応答性プロセスである。理論に束縛されるものではないが、ＴＭＥにみられる酸性ｐＨは、例えばＩＬ－２Ｒαへの結合を阻害することによってＩＬ－２応答を阻害する。酸性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）はＩＬ－２受容体結合に悪影響を及ぼし、ＩＬ－２シグナル伝達に影響を及ぼす。その結果、腫瘍ではＩＬ－２によるＳＴＡＴ５の活性化が低下し、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ／ＴＮＦαの分泌が減少する。この組み合わせは、ＩＬ－２ベースの治療、特にがんの治療に使用する場合の有効性を低下させ得る。
【0031】
本開示は、ｐＨに耐性を有し、酸性の細胞外ｐＨにおいて重要な治療的機能を保持するＩＬ－２ムテインを提供する。さらに、これらのＩＬ－２ムテインに与えられた特定の治療的機能は、中性または他のｐＨよりも酸性ｐＨにおいて強力または有効である。理論に束縛されるものではないが、このことは、本明細書に記載のＩＬ－２ムテインが、疾患細胞／組織、特に酸性微小環境を誘導または生成する細胞／組織の治療に対して選択的であるという利点を有する。
【0032】
本開示のＩＬ－２ムテインは、
開示されたＩＬ－２受容体のいずれか１つに結合する；および／または
ＩＬ－２Ｒαに結合する；および／または
ｐＨ約７．２～約７．５から選択されるｐＨよりも、ｐＨ約４．０～約７．０、好ましくは約５～約６．５から選択されるｐＨにおいて高い親和性でＩＬ－２受容体もしくはＩＬ－２Ｒαに結合する；および／または
ｐＨ約７．２～約７．５において、野生型ＩＬ－２分子と比較して低い親和性でＩＬ－２受容体もしくはＩＬ－２Ｒαに結合する；および／または
ｐＨ約４．０～約７．０、好ましくは約５～約６．５から選択されるｐＨにおいて、野生型ＩＬ－２分子と比較して高い親和性でＩＬ－２受容体またはＩＬ－２Ｒαに結合する；および／または
ＳＴＡＴ５の活性化を引き起こす；および／または
ｐＨ７．２よりもｐＨ６．５において、より強力なＳＴＡＴ５の活性化を引き起こす。
開示されたＩＬ－２受容体のいずれか１つに結合する；および／または
ＩＬ－２Ｒαに結合する；および／または
ｐＨ約７．２～約７．５から選択されるｐＨよりも、ｐＨ約４．０～約７．０、好ましくは約５～約６．５から選択されるｐＨにおいて高い親和性でＩＬ－２受容体もしくはＩＬ－２Ｒαに結合する；および／または
ｐＨ約７．２～約７．５において、野生型ＩＬ－２分子と比較して低い親和性でＩＬ－２受容体もしくはＩＬ－２Ｒαに結合する；および／または
ｐＨ約４．０～約７．０、好ましくは約５～約６．５から選択されるｐＨにおいて、野生型ＩＬ－２分子と比較して高い親和性でＩＬ－２受容体またはＩＬ－２Ｒαに結合する；および／または
ＳＴＡＴ５の活性化を引き起こす；および／または
ｐＨ７．２よりもｐＨ６．５において、より強力なＳＴＡＴ５の活性化を引き起こす。
【0033】
本開示に係るＩＬ－２ムテインは、ｐＨ約４．０～約７．０から選択されるｐＨにおいてより高い親和性でＩＬ－２受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒαを含む）に結合し、ｐＨ約４．０～約７．０においてより高い親和性を有する結合は、ｐＨ約７．２～約７．５における結合の結合定数Ｋｄよりも、約０．３；約０．５；約０．８；約１；約１．５；約２；約２．５または約３のオーダーで低い結合定数Ｋｄを特徴とする。
【0034】
さらに、ｐＨ約７．２～約７．５において野生型ＩＬ－２分子と比較して低い親和性を有するＩＬ－２受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒα）へのＩＬ－２ムテインの結合は、野生型ＩＬ－２分子と比較して、ＩＬ－２ムテインに対して約０．３；約０．５；約０．８；約１；約１．５；約２；約２．５または約３のオーダーで高い結合定数Ｋｄを特徴としてよい。
【0035】
ｐＨ約４．０～約７．０から選択されるｐＨにおいて野生型ＩＬ－２分子と比較して高い親和性を有するＩＬ－２受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒα）へのＩＬ－２ムテインの結合は、野生型ＩＬ－２分子と比較して、ＩＬ－２ムテインに対して約０．３；約０．５；約０．８；約１；約１．５；約２；約２．５または約３のオーダーで低い結合定数Ｋｄを特徴としてよい。
【0036】
理論に束縛されることを望むものではないが、ＩＬ－２ムテインとその高親和性受容体複合体との結合は、サイトカイン－サイトカイン受容体複合体を安定化させることによって、ｐＨ７．２よりもｐＨ６．５においてより強力なＳＴＡＴ５のリン酸化を引き起こし得る。さらに、（この場合も理論に拘束されるものではないが）、ＩＬ－２ムテインは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）および三次リンパ様構造（ＴＬＳ）にみられるような酸性の微小環境において、高親和性受容体複合体を発現する活性化されたＴ細胞の増殖を強力に誘導し得る。
【0037】
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）および三次リンパ様構造（ＴＬＳ）における本発明に係るＩＬ－２ムテインの高い活性、ならびに血液中などの末梢における比較的に低い活性により、本発明に係るＩＬ－２ムテインは、先行技術のＩＬ－２療法に関連する用量制限毒性の問題を解消することができる。さらに、他の治療分子、例えばチェックポイント阻害剤に対する抗体と併用する場合、先行技術のＩＬ－２分子の作用は、末梢における複合毒性により、そのような他の分子の投与量を制限する。このため、ＩＬ－２ムテインの選択的活性は、併用治療における毒性を軽減し、他の治療分子、例えばチェックポイント阻害剤に対する抗体の高用量を可能にし、これにより、そのような治療の治療効果を増大させることができる。併用療法（本開示のサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテイン、およびいくつかの他の治療／活性薬剤を含む）は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0038】
次に、本発明を以下の図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1A】［図１ａ］、［図１ｂ］、［図１ｃ］、［図１ｄ］、［図１ｅ］、［図１ｆ］、［図１ｇ］、［図１ｈ］、［図１ｉ］、［図１ｊ］、［図１ｋ］低ｐＨはＩＬ－２の活性を低下させる。（図１Ａ）ｐＨ７．５または６．５においてＩＬ－２で刺激した予め活性化された状態のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の用量反応（上図）、ならびに最適用量未満（１０ｐＭ）および飽和用量（１０ｎＭ）におけるシグナル伝達動態（下図）。グラフは３回の独立した二重実験の平均±標準偏差を表す。
【図1D】（図１Ｄ）１００μｌのＰＢＳまたは２０μｇのＦｃ４－ＩＬ－２（７μｇのＩＬ－２に相当）をｉ．ｐ．注射により５日間処置したＢ１６．ＳＩＹ ＷＴまたはＬＤＨＡ／Ｂ ＤＫＯ担持マウスの腫瘍増殖を示す。腫瘍のサイズが５０～１００ｍｍ３に達した時点で治療を開始した。グラフは３回の独立した実験のうち代表的な１回の結果を示す（各群ｎ＝６）。＊ｐ＝０．０２３８（Ｂ１６．ＳＩＹ ＷＴ＋Ｆｃ４－ＩＬ－２とＢ１６．ＳＩＹ ＤＫＯ＋Ｆｃ４－ＩＬ－２との比較）；＊ｐ＝０．０２４２（Ｂ１６．ＳＩＹ ＤＫＯ＋ＰＢＳとＢ１６．ＳＩＹ ＤＫＯ＋Ｆｃ４－ＩＬ－２との比較）。データは平均値±標準偏差（ｓ．ｅ．ｍ．）で、有意差はテューキーの補正を加えた一元配置分散分析によって決定した。ｎｓ＝有意差なし。
【図1E】（図１Ｅ～Ｋ）腫瘍接種後１５日目に犠牲にしたマウスから得た腫瘍の分析を示す。（図１Ｅ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。＊＊ｐ＝０．００１（Ｂ１６．ＳＩＹ ＷＴ＋ＰＢＳとＢ１６．ＳＩＹ ＷＴ＋Ｆｃ４－ＩＬ－２との比較）；＊＊ｐ＝０．００１８（Ｂ１６．ＳＩＹ ＤＫＯ＋ＰＢＳとＢ１６．ＳＩＹ ＤＫＯ＋Ｆｃ４－ＩＬ－２との比較）。
【図1G】（図１Ｇ～１Ｉ）ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した細胞をサイトカイン産生について分析した。ＩＦＮ－γ＋（図１Ｇ）、ＴＮＦ＋（図１Ｈ）、ＩＦＮ－γ＋ＴＮＦ＋（図１Ｉ）とＣＤ８＋Ｔ細胞との割合を示す。（図１Ｇ）＊＊ｐ＝０．００１３；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図1J】ＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。＊ｐ＝０．０１９１（Ｂ１６．ＳＩＹ ＷＴ＋ＰＢＳとＢ１６．ＳＩＹ ＷＴ＋Ｆｃ４－ＩＬ－２）；＊ｐ＝０．０１０２（Ｂ１６．ＳＩＹ ＷＴ＋Ｆｃ４－ＩＬ－２とＢ１６．ＳＩＹ ＤＫＯ＋Ｆｃ４－ＩＬ－２）；＊＊ｐ＝０．００７４。
【図1K】（図１Ｋ）ＴＩＭ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。＊＊ｐ＝０．００６７。（図１Ｅ～Ｋ）グラフは３つの独立した実験の結果をプールしたものである。有意差は、テューキーの補正を加えた一元配置分散分析によって求めた。ｎｓ＝有意差なし。データは平均値±標準偏差で、各記号は１種類の腫瘍（図１Ｅ、Ｆ、Ｊ、Ｋ）または２種類の腫瘍をプールしたもの（図１Ｇ～Ｉ）を表す。
【図2A】［図２ａ］、［図２ｂ］、［図２ｃ］、［図２ｄ］、［図２ｅ］、［図２ｆ］、［図２ｇ］耐ｐＨ ＩＬ－２バリアントの選択を示す。（図２Ａ）酵母表面に発現し、ビオチン化ＩＬ－２Ｒα四量体（黄色）と相互作用するＩＬ－２タンパク質ライブラリー（青色）を示す。ＩＬ－２ライブラリーの作成中に変異したアミノ酸は赤で表示されている。
【図2E】（図２Ｅ）標識されたＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２を用いた２色ＴＩＲＦ顕微鏡による生細胞の細胞膜でのＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒα相互作用の定量化（左図）、ならびにＩＬ－２結合をＩＬ－２Ｒα細胞表面発現で正規化したグラフである。データは平均値±標準偏差であり、各データ点は１つの細胞の結果を表す。有意差はコルモゴロフ・スミルノフ検定により算出した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図2F】（図２Ｆ、Ｇ）新鮮単離ＣＤ８ Ｔ細胞（図２Ｆ）および予め活性化された状態のＣＤ８ Ｔ細胞（図２Ｇ）において、ｐＨ７．５およびｐＨ６．５でＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２により誘導されたリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の用量反応曲線である。グラフは３回の独立した二重実験の平均±標準偏差を表す。
【図2G】（図２Ｆ、Ｇ）新鮮単離ＣＤ８ Ｔ細胞（図２Ｆ）および予め活性化された状態のＣＤ８ Ｔ細胞（図２Ｇ）において、ｐＨ７．５およびｐＨ６．５でＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２により誘導されたリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の用量反応曲線である。グラフは３回の独立した二重実験の平均±標準偏差を表す。
【図3A】［図３Ａ］、［図３Ｂ］、［図３Ｃ］酸性ｐＨにおけるＩＬ－２ Ｃ１の機能的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示す。（図３Ａ～Ｃ）１０ｎＭのＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｔｉｃｈ－２の存在下、ｐＨ７．５または６．５で３日間培養した後、予め活性化された状態のＣＤ８＋Ｔ細胞により発現したサイトカインの解析を示す。細胞はＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した。（図３Ａ）刺激した細胞の上清をＬｕｍｉｎｅｘアッセイで分析した。○は、放出されたサイトカインの量をコントロール条件（ＩＬ－２ ＷＴ ｐＨ７．５＝１００）で正規化したものである。データは３の異なるドナーの平均値である。
【図3B】（図３Ｂ、Ｃ）グラフはＩＦＮ－γ＋細胞（図３Ｂ）およびＴＮＦ＋細胞（図３Ｃ）の割合を示す。データは平均値±標準偏差で、各記号は１のドナーを表す。（図３Ｂ）＊ｐ＝０．０４１４（ＩＬ－２ ＷＴ ｐＨ７．５とＩＬ－２ ＷＴ ｐＨ６．５との比較）；＊ｐ＝０．０２３３（ＩＬ－２ ＷＴ ｐＨ６．５とＳｗｉｔｃｈ－２ ｐＨ６．５との比較）；＊ｐ＝０．０１９５（Ｓｗｉｔｃｈ－２ ｐＨ７．５とＳｗｉｔｃｈ－２ ｐＨ６．５との比較）、テューキーの補正を加えた一元配置分散分析。
【図3C】（図３Ｃ）＊＊ｐ＝０．００２７（ＩＬ－２ ＷＴ ｐＨ７．５とＩＬ－２ ＷＴ ｐＨ６．５との比較）；＊＊ｐ＝０．００１５（ＩＬ－２ ＷＴ ｐＨ６．５とＳｗｉｔｃｈ－２ ｐＨ６．５との比較）、テューキーの補正を加えた一元配置分散分析。
【図4A】［図４ａ］、［図４ｂｃ］、［図４ｄ］、［図４ｅ］、［図４ｆ］、［図４ｇ］、［図４ｉ］、［図４ｊ］Ｓｗｉｔｃｈ－２は生存率を改善し、抗腫瘍免疫応答を刺激する。（図４Ａ）ＰＢＳ、２０μｇもしくは５０μｇのＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２で処置したマウスにおいて、乾燥前後の肺の重量を測定することにより肺浮腫（肺湿重量）を評価した。データは２つの独立した実験の平均±標準偏差であり、各記号はマウスを表す。＊＊＊ｐ＝０．０００２（Ｆｃ４－ＩＬ－２ ＷＴ ２０μｇとＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２ ２０μｇとのと比較）；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4B】（図４Ｂ、Ｃ）ＰＢＳ、２０μｇもしくは５０μｇのＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２で処置したマウスの血液（図４Ｂ）およびリンパ節（図４Ｃ）中のＮＫの割合を示す。（図４Ｂ）＊ｐ＝０．０３３８（Ｆｃ４－ＩＬ－２ ＷＴ ２０μｇとＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２ ２０μｇとの比較）；＊＊＊ｐ＝０．０００６（Ｆｃ４－ＩＬ－２ ＷＴ ５０μｇとＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２ ５０μｇとの比較）；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4C】（図４Ｃ）＊＊ｐ＝０．００３１（Ｆｃ４－ＩＬ－２ ＷＴ ２０μｇとＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２ ２０μｇとの比較）；＊＊＊ｐ＝０．００１４（ＰＢＳとＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴ ２０μｇとの比較）；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4E】（図４Ｅ）１００μｌのＰＢＳまたは２０μｇのＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴまたはＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２をｉ．ｐ．注射により５日間処置したＢ１６．ＳＩＹ ＷＴ担持マウスの腫瘍増殖を示す。腫瘍のサイズが５０～１００ｍｍ３に達した時点で治療を開始した（各群ｎ＝６）。グラフは３つの独立した実験の代表的な結果を示す。＊＊＊ｐ＝０．０００５（ＰＢＳとＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２との比較）、＊＊＊ｐ＝０．０００７（Ｆｃ４－ＩＬ－２ ＷＴとＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２との比較）。データは平均値±標準偏差であり、有意差はテューキーの補正を加えた一元配置分散分析によって決定した。
【図4G】（図４Ｇ）ＮＫ１．１＋ＣＤ１２２＋細胞の割合を示す。＊ｐ＝０．０３５９（ＰＢＳとＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴとの比較）；＊ｐ＝０．０３３４（Ｆｃ４－ＩＬ－２ ＷＴとＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２との比較）；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（図４Ｉ、図４Ｊ）。
【図4I】ＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激後のＣＤ８＋ＩＦＮ－γ＋（図４ｉ）およびＣＤ８＋ＴＮＦ＋（図４Ｊ）Ｔ細胞の割合を示す。（図４Ｉ）＊ｐ＝０．０４６５；＊＊ｐ＝０．００３５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4L】（図４Ｌ）ＴＩＭ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。（図４Ａ～Ｃ、Ｅ～Ｌ）データは平均値±標準偏差であり、各記号は２回（図４Ａ～Ｃ）および３回（図４Ｆ～Ｌ）の独立した実験のマウス１匹（図４Ａ～Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ）または２匹をプールしたもの（図４Ｉ、Ｊ）を表す。有意差は、テューキーの補正を加えた一元配置分散分析によって求めた。
【図5】［図５ａｂ］、［図５ｃｄ］フローサイトメトリーによる、ｐＨ７（図５ａ）およびｐＨ５（図５ｃ）においてＩＬ－２ ＷＴまたはｐＨ７（図５ｂ）およびｐＨ５（図５ｄ）においてＩＬ－２ ＭＵＴ１を示した酵母のｐＨ依存性結合の解析を示す。図５Ｂは、フローサイトメトリーによる、ｐＨ７（図５ａ）およびｐＨ５（図５ｃ）においてＩＬ－２ ＷＴまたはｐＨ７（図５ｂ）およびｐＨ５（図５ｄ）においてＩＬ－２ ＭＵＴ１を示した酵母のｐＨ依存性結合の解析を示す。図５Ｃは、フローサイトメトリーによる、ｐＨ７（図５ａ）およびｐＨ５（図５ｃ）においてＩＬ－２ ＷＴまたはｐＨ７（図５ｂ）およびｐＨ５（図５ｄ）においてＩＬ－２ ＭＵＴ１を示した酵母のｐＨ依存性結合の解析を示す。図５Ｄは、フローサイトメトリーによる、ｐＨ７（図５ａ）およびｐＨ５（図５ｃ）においてＩＬ－２ ＷＴまたはｐＨ７（図５ｂ）およびｐＨ５（図５ｄ）においてＩＬ－２ ＭＵＴ１を示した酵母のｐＨ依存性結合の解析を示す。
【図6】配列ＩＤ１、２～８のアラインメントを示す。配列番号１：成熟ヒトＩＬ－２、アクセッション番号Ｐ６０５６８；配列番号３：成熟マウスＩＬ－２、アクセッション番号Ｐ０４３５１；配列番号４：成熟ラットＩＬ－２、アクセッション番号Ｐ１７１０８；配列番号５：成熟ブタＩＬ－２、アクセッション番号Ｐ２６８９１；配列番号６：成熟キツネＩＬ－２、アクセッション番号Ｑ２５ＢＣ３；配列番号７：成熟イヌＩＬ－２、アクセッション番号ＮＰ＿００１００３３０５；および配列番号８：成熟マカクＩＬ－２、アクセッション番号Ｐ６８２９１。配列番号１の残基３７、３８、４１、４２、４３、６４および他の配列番号のそれぞれの残基を太字で示す。
【図7】追加のＩＬ－２ ｐＨ耐性変異を示す。ｐＨ５およびｐＨ７においてＩＬ－２Ｒαに結合したＩＬ－２変異のドットプロットである。
【発明を実施するための形態】
【0040】
「含む」、「備える」、および／または「有する」という用語は、本発明の態様および実施形態が特定の１以上の特徴を「含む」ことを示すために使用されることに留意されたい。上記用語は、関連する１以上の特徴から「本質的になる」または「なる」態様および／または実施形態も包含してよいことを理解されたい。
【0041】
本開示のＩＬ－２ムテインは、野生型または基準ＩＬ－２配列に対して改変されている。例えば、本開示のＩＬ－２ムテインは、野生型または基準配列に対して、１以上のアミノ酸改変を含む。アミノ酸改変は、別のアミノ酸による、野生型または基準アミノ酸の置換を含む。このような置換は、野生型の残基（redidue）を、同一または類似の構造的、化学的、および／または生理化学的特性を有する別の残基により置き換えるという点で、保守的であってよい。「保守的な」アミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行われる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられ、正に電荷した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンが挙げられ、負に電荷した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。
【0042】
また、野生型の残基が、異なるクラスのアミノ酸、例えば構造的に非類似、化学的に非類似および／または生理化学的に異種または非類似のアミノ酸に置換されるという点で、置換が「非保守的」であってよい。
【0043】
アミノ酸改変は、野生型または基準配列からのアミノ酸残基の欠失を含んでよい。他のアミノ酸改変としては、野生型／参照配列への１つ以上のアミノ酸の挿入が挙げられる。アミノ酸改変はさらに、野生型／参照配列の特定の部分または一部の逆位を含んでよい。
【0044】
本開示のＩＬ－２ムテインは、（野生型または基準配列に対して）１つ以上のこれらの改変、例えば、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６もしくはそれ以上）のアミノ酸置換、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６もしくはそれ以上）のアミノ酸残基の欠失、および／または１つ以上（例えば、２、３、４、５、６もしくはそれ以上）のアミノ酸残基の付加を含んでよい。改変された配列が、野生型または基準配列の１つ以上（例えば２、３、４、５、６またはそれ以上）の部分の逆位をさらに含んでよい。
【0045】
参照または野生型ＩＬ－２配列は、ここで配列番号１で表されるヒト成熟ＩＬ－２配列を含んでよい。
【0046】
図６に示した配列アラインメントから明らかなように、ＩＬ－２の配列は様々な哺乳動物の種にわたって高度に保存されている。したがって、代替の実施形態において、野生型ＩＬ－２配列は、表１に開示するマウス（配列番号３）、ラット（配列番号４）、ブタ（配列番号５）、キツネ（配列番号６）、イヌ（配列番号７）、またはマカク（配列番号８）由来の成熟ＩＬ－２配列を含んでよい。
【0047】
【表1-1】
【表1-2】
【0048】
上記に鑑みて、本開示に係る改変ＩＬ－２分子またはＩＬ－２ムテインは、配列番号１、２～８の配列に対して、１つ以上のアミノ酸改変を含んでよい。
【0049】
一教示において、１以上のアミノ酸改変は、
（ｉ）１つ以上のアミノ酸の置換（例えば、保守的置換を含む）；
（ii）１つ以上のアミノ酸の欠失；
（iii）１つ以上のアミノ酸の付加；および
（iv）１つ以上の配列の逆位から選択される。
（ｉ）１つ以上のアミノ酸の置換（例えば、保守的置換を含む）；
（ii）１つ以上のアミノ酸の欠失；
（iii）１つ以上のアミノ酸の付加；および
（iv）１つ以上の配列の逆位から選択される。
【0050】
改変ＩＬ－２分子またはＩＬ－２ムテインは、配列番号１、４、５、８の残基３５から残基４５、残基５８から残基７１、および／もしくは残基１０７から残基１１２、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基から選択されるいずれか１つ以上の残基に変異を含んでよい。一教示において、改変ＩＬ－２分子またはＩＬ－２ムテインは、配列番号１、４、５、もしくは８の残基３７から残基４３、残基６０から残基６９、残基１０９から残基１１０、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基のいずれか１つ以上に変異を含んでよい。改変ＩＬ－２分子またはＩＬ－２ムテインは、配列番号１、４、５、もしくは８の残基３７、残基３８、残基４１、残基４２、残基４３、残基６０、残基６１、残基６３、残基６４、残基６６、残基６８、残基６９、残基１０９、および残基１１０、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基のいずれか１つ以上に変異を含んでよい。改変ＩＬ－２分子またはＩＬ－２ムテインは、配列番号１、４、５、もしくは８の残基３７、残基３８、残基４１、残基４２、残基４３、および残基６４のいずれか１つ以上、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基に変異を含んでよい。「それぞれの残基」という用語は、配列番号３、６、もしくは７における、配列番号１、４、５、８の対応する残基を定義し、以下のとおりである、
【0051】
【表2】
【0052】
本開示は、（配列番号１、４、５、もしくは８、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基、または野生型／参照配列に対して）残基３７にアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインを提供する。例として、本開示のＩＬ－２ムテインは、残基３７にスレオニンからヒスチジン、アルギニンまたはセリンへの置換を含んでよい。一教示において、および３７位のアミノ酸改変に加えて、ＩＬ－２ムテインは、１つ以上の他の残基に１つ以上の改変をさらに含んでよい。例えば、ＩＬ－２ムテインは、残基３７におけるアミノ酸改変と、３８位、４１位、４２位、４３位および／または６４位のいずれかにおける１つ以上の追加のアミノ酸改変とを含んでよい。
【0053】
本開示は、（配列番号１、４、５、もしくは８または野生型／参照配列に対して）残基３８にアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインを提供する。例として、本開示のＩＬ－２ムテインは、残基３８にアルギニンからロイシン、バリン、イソロイシンまたはアラニンへの置換を含んでよい。一教示において、および３８位のアミノ酸改変に加えて、ＩＬ－２ムテインは、１つ以上の他の残基に１つ以上の改変をさらに含んでよい。例えば、ＩＬ－２ムテインは、残基３８におけるアミノ酸修飾と、３７位、４２位、４１位、４３位および／または６４位のいずれかにおける１つ以上の追加のアミノ酸改変とを含んでよい。同様に、配列番号３、６、または７、および配列番号３、６、または７のそれぞれの残基に基づいて同じ実施形態が提供される。
【0054】
本開示は、（配列番号１、４、５、もしくは８または野生型／参照配列に対して）残基４１にアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインを提供する。例として、本開示のＩＬ－２ムテインは、残基４１にスレオニンからセリン、グリシン、またはアスパラギン酸への置換を含んでよい。一教示において、および４１位のアミノ酸改変に加えて、ＩＬ－２ムテインは、１つ以上の他の残基に１つ以上の改変をさらに含んでよい。例えば、ＩＬ－２ムテインは、残基４１におけるアミノ酸修飾と、３７位、３８位、４２位、４３位および／または６４位のいずれかにおける１つ以上の追加のアミノ酸改変とを含んでよい。同様に、配列番号３、６、または７、および配列番号３、６、または７のそれぞれの残基に基づいて、同じ実施形態が提供される。
【0055】
本開示は、（配列番号１、４、５、もしくは８または野生型／参照配列に対して）残基４２にアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインを提供する。例として、本開示のＩＬ－２ムテインは、残基４２にフェニルアラニンからチロシンへの置換を含んでよい。一教示において、および４２位のアミノ酸改変に加えて、ＩＬ－２ムテインは、１つ以上の他の残基に１つ以上の改変をさらに含んでよい。例えば、ＩＬ－２ムテインは、残基４２におけるアミノ酸修飾と、３７位、３８位、４１位、４３位および／または６４位のいずれかにおける１つ以上の追加のアミノ酸改変とを含んでよい。同様に、配列番号３、６、または７、および配列番号３、６、または７のそれぞれの残基に基づいて、同じ実施形態が提供される。
【0056】
本開示は、（配列番号１、４、５、もしくは８または野生型／参照配列に対して）残基４３にアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインを提供する。例として、本開示のＩＬ－２ムテインは、残基４３にリジンからグリシンへの置換を含んでよい。一教示において、および４３位のアミノ酸改変に加えて、ＩＬ－２ムテインは、１つ以上の他の残基に１つ以上の改変をさらに含んでよい。例えば、ＩＬ－２ムテインは、残基４３におけるアミノ酸改変と、３７位、３８位、４１位、４２位および／または６４位のいずれかにおける１つ以上の追加のアミノ酸改変とを含んでよい。
【0057】
本開示は、（配列番号１、４、５、もしくは８または野生型／参照配列に対して）残基６４にアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインを提供する。例として、本開示のＩＬ－２ムテインは、リジンの非保守的アミノ酸置換、好ましくは酸性アミノ酸による置換、最も好ましくは残基６４にグルタミン酸置換を含んでよい。一教示において、および６４位のアミノ酸改変に加えて、ＩＬ－２ムテインは、１つ以上の他の残基に１つ以上の改変をさらに含んでよい。例えば、ＩＬ－２ムテインは、残基６４におけるアミノ酸改変と、３７位、３８位、４１位、４２位および／または４３位のいずれかにおける１つ以上の追加のアミノ酸改変とを含んでよい。
【0058】
要約すると、本開示は以下のＩＬ－２ムテインを含む。
【0059】
【表3】
【0060】
本開示は、配列番号１、４、５、８の３７位、３８位、４１位、４３位において少なくとも改変と、４２位もしくは６４位、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基に少なくとも１つのさらなる改変を含む、ＩＬ－２ムテインを提供する。
【0061】
本開示は、配列番号１、４、５、８の３７位、３８位、４１位、４３位、および６４位の各残基、または配列番号３、６、もしくは７のそれぞれの残基においてアミノ酸改変を含むＩＬ－２ムテインを提供する。
【0062】
本開示のＩＬ－２ムテインは、（配列番号１もしくは８または野生型／参照配列に対して）、以下のアミノ酸変異の１つ以上を特徴とする配列を含んでよい。
（ｉ）Ｔ３７Ｈ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｌ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｓ；および／または
（iv）Ｆ４２Ｙ；および／または
（ｖ）Ｋ４３Ｇ。
（ｉ）Ｔ３７Ｈ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｌ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｓ；および／または
（iv）Ｆ４２Ｙ；および／または
（ｖ）Ｋ４３Ｇ。
【0063】
したがって、本開示に係るＩＬ－２ムテインは、配列番号２を含んでよい。
【0064】
配列番号２
【0065】
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLHLML SYGFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS
【0066】
本開示のＩＬ－２ムテインは、（配列番号１もしくは８または野生型／参照配列に対して）、以下のアミノ酸変異の１つ以上を特徴とする配列を含んでよい。
（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ａ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｄ；および／または
（iv）－Ｋ４３Ｇ；および／または
（ｖ）－Ｋ６４Ｅ。
したがって、本開示に係るＩＬ－２ムテインは、配列番号９を含んでよい。
配列番号９
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLSAML DFGFYMPKKA TELKHLQCLE EELEPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS
（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ａ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｄ；および／または
（iv）－Ｋ４３Ｇ；および／または
（ｖ）－Ｋ６４Ｅ。
したがって、本開示に係るＩＬ－２ムテインは、配列番号９を含んでよい。
配列番号９
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLSAML DFGFYMPKKA TELKHLQCLE EELEPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS
【0067】
本開示のＩＬ－２ムテインは、（配列番号１もしくは８または野生型／参照配列に対して）、以下のアミノ酸変異の１つ以上を特徴とする配列を含んでよい。
（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｌ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）－Ｆ４２Ｙ；および／または
（ｖ）－Ｋ４３Ｇ。
（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｌ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）－Ｆ４２Ｙ；および／または
（ｖ）－Ｋ４３Ｇ。
【0068】
したがって、本開示に係るＩＬ－２ムテインは、配列番号１０を含んでよい。
【0069】
配列番号１０
【0070】
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLSLML GYGFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS
【0071】
本開示のＩＬ－２ムテインは、（配列番号１もしくは８または野生型／参照配列に対して）、以下のアミノ酸変異の１つ以上を特徴とする配列を含んでよい。
（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｖ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ。
（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｖ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ。
【0072】
したがって、本開示に係るＩＬ－２ムテインは、配列番号１１を含んでよい。
【0073】
配列番号１１
【0074】
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLSVML GFGFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS
【0075】
本開示のＩＬ－２ムテインは、（配列番号１もしくは８または野生型／参照配列に対して）、以下のアミノ酸変異の１つ以上を特徴とする配列を含んでよい。
（ｉ）Ｔ３７Ｒ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｖ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ。
（ｉ）Ｔ３７Ｒ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｖ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ。
【0076】
したがって、本開示に係るＩＬ－２ムテインは、配列番号１２を含んでよい。
【0077】
配列番号１２
【0078】
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLRVML GFGFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS
【0079】
本開示のＩＬ－２ムテインは、（配列番号１もしくは８または野生型／参照配列に対して）、以下のアミノ酸変異の１つ以上を特徴とする配列を含んでよい。
（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｉ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ。
（ｉ）Ｔ３７Ｓ；および／または
（ii）Ｒ３８Ｉ；および／または
（iii）Ｔ４１Ｇ；および／または
（iv）Ｋ４３Ｇ。
【0080】
したがって、本開示に係るＩＬ－２ムテインは、配列番号１３を含んでよい。
【0081】
配列番号１３
【0082】
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLSIML GFGFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS
【0083】
ＩＬ－２ムテインは、本明細書中に記載の改変分子またはムテインのいずれかの機能性フラグメントを含んでよい。一教示において、本開示のＩＬ－２ムテインは、配列番号２、９、１０、１１、１２または１３によって提供される配列の機能性フラグメントを含んでも、本質的にそれらからなっても、またはそれらからなってもよい。「機能性」フラグメントは、より長い／フルのまたは完全なＩＬ－２ムテインに与えられた１つ以上の機能を保持するフラグメントを含んでよい。例えば、本開示のフラグメントは、配列番号２、９、１０、１１、１２または１３の全配列を含むムテインの１つ以上の機能を保持してよい。このような機能としては、例えば、ＩＬ－２Ｒαに結合する能力；および／またはｐＨ７．２よりもｐＨ６．５においてより高い親和性でＩＬ－２Ｒαに結合する能力；および／またはｐＨ７．２よりもｐＨ６．５においてより強力なＳＴＡＴ５の活性化を誘発する能力などが挙げられる。
【0084】
ムテインフラグメントは、任意の機能（例えば、結合機能、Ｔ細胞の活性化機能、および／または免疫エフェクター機能）について、任意の数の異なるアッセイを用いて試験されてよい。例として、結合アッセイは、試験対象のＩＬ－２ムテインフラグメントをＩＬ－２Ｒαと接触させることを含んでよく、このようなアッセイにおいて、フラグメントとＩＬ－２Ｒαとの結合の検出は、フラグメントが必要な結合機能を保持していることを示す。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させるアッセイ法を用いて、Ｔ細胞の増殖および／または免疫エフェクター機能を促進する能力についてフラグメントが試験されてよい。機能性フラグメントはＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、増殖させたり、および／またはエフェクターサイトカインを産生させたりする。結合、Ｔ細胞の活性化および／またはエフェクター機能のアッセイのいずれも、酸性ｐＨ、例えばｐＨ７．４未満のｐＨ、例えば約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５のｐＨ（または本明細書に記載の他のいずれかのｐＨ）で実施されてよい。これは、フラグメントの機能的能力を試験するだけでなく、フラグメントが耐酸性という特徴を保持しているかどうかも判定する。これらのアッセイの結果が、例えば、既知または所定の機能を有する野生型ＩＬ－２、ＩＬ－２ムテインおよび／またはＩＬ－２（ムテイン）フラグメントを使用した陽性および／または対照アッセイの結果と比較されてよい。対照アッセイは、中性ｐＨよりも酸性ｐＨにおいてより強力な活性／機能を示すフラグメントを試験するために、異なるｐＨ、例えば中性ｐＨで実施されてもよい。
【0085】
配列番号２、９、１０、１１、１２または１３のフラグメントは、約１０から約ｎ－１（ここで、ｎ＝１３０；すなわち、配列番号２、９、１０、１１、１２または１３の残基の総数）の間の任意の数の残基を有してよい。例として、フラグメントが、配列番号２、９、１０、１１、１２または１３の１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５または１２９のアミノ酸残基を含んでよい。
【0086】
配列番号２のフラグメントは、少なくとも残基番号５７、５８、６１、６２および６３を含んでよい。一教示において、配列番号２、９、１０、１１、１２または１３のフラグメントは、残基５７～６３を含んでよい。これらの選択残基のいずれかを含むフラグメントが、そのすぐ上流および／または下流にある配列のフラグメントをさらに含んでいてもよい。
【0087】
さらに、本開示のＩＬ－２ムテインは、配列番号２、９、１０、１１、１２または１３の配列と、ある程度の配列同一性または相同性を示してよい。例えば、有用なフラグメントは、配列番号２、９、１０、１１、１２または１３の配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一または相同である配列を含んでよい。
【0088】
上記に鑑みて、ＩＬ－２ムテインという用語は、配列番号２、９、１０、１１、１２もしくは１３によって提供される特定の例だけでなく、その機能性フラグメント、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３と、ある程度の配列同一性／相同性を有する分子、および／または記載のアミノ酸改変の１つ以上を含む他のＩＬ－２由来の分子を包含する。
【0089】
本開示はさらに、本明細書中に記載の改変されたＩＬ－２ムテインのいずれかをエンコードする核酸を提供する。例えば、本開示は、基準または野生型配列に対して、１つ以上のアミノ酸改変を有するＩＬ－２ムテインをエンコードする核酸を提供する。核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、好ましくはｍＲＮＡである。
【0090】
本開示は、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３またはそのいずれかの機能性フラグメントをエンコードする核酸を提供する。
【0091】
本開示の核酸は、宿主細胞、例えば微生物宿主細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。
【0092】
本明細書に、本開示の核酸を含むベクターが開示される。例えば、本開示は、ＩＬ－２ムテイン、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３またはその機能性フラグメントをエンコードする核酸を含むベクターを提供する。
【0093】
また、本開示の核酸またはベクターで形質転換された宿主細胞も開示される。宿主細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞であってよい。宿主細胞は微生物細胞、例えば細菌（大腸菌など）であってよい。宿主細胞はＴ細胞であってもよく、好ましくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞である。
【0094】
また、本明細書において、本開示の核酸を含むウイルスも開示される。
【0095】
本開示のムテインの作製方法は、本開示のＩＬ－２ムテインをエンコードする核酸またはベクターで宿主細胞を形質転換することと、ＩＬ－２ムテインをエンコードする核酸の発現を誘導することとを含んでよい。このような方法において、発現されたＩＬ－２ムテインは、宿主細胞または宿主細胞を培養した培地から採取、抽出または精製することができる。
【0096】
また、本開示は、耐ｐＨ ＩＬ－２ムテインの同定方法を提供し、該方法は、
ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成することと、
ＩＬ－２Ｒαに結合し、ｐＨ耐性を有するムテインを同定するために、ＩＬ－２ムテインを酸性条件下でＩＬ－２Ｒαと接触させることと、を含む。
ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成することと、
ＩＬ－２Ｒαに結合し、ｐＨ耐性を有するムテインを同定するために、ＩＬ－２ムテインを酸性条件下でＩＬ－２Ｒαと接触させることと、を含む。
【0097】
変異または改変させるＩＬ－２分子は、野生型ＩＬ－２配列またはその他のＩＬ－２基準配列を含んでよい。例えば、改変または変異させるＩＬ－２分子が、配列番号１またはその機能性フラグメントを含んでよい。
【0098】
ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成するステップは、野生型または基準ＩＬ－２配列に１つ以上のアミノ酸改変を導入することを含んでよい。このために、例えば、野生型ＩＬ－２配列内の特定の残基をランダムに変異させるため、縮退コドン（例えば、ＮＤＴ）を含むプライマーの使用を利用するＰＣＲに基づく方法など、種々の技術が使用されてよい。どのムテインもＩＬ－２Ｒαへの結合能力を試験することができる。
【0099】
改変されたＩＬ－２（ＩＬ－２ムテイン）をＩＬ－２Ｒαと接触させるステップは、改変されたＩＬ－２をＩＬ－２Ｒαフラグメントと接触させることを含んでよく、ＩＬ－２Ｒαフラグメントは、ＩＬ－２結合フラグメントである。ＩＬ－２ＲαのＩＬ－２結合フラグメントは、エクトドメインを含んでよい。ＩＬ－２Ｒαまたはその任意の結合フラグメントは、例えばビオチンなどの結合部位に結合してよい。ＩＬ－２Ｒαは、検出可能な標識、例えば、受容体に結合したムテインを同定するための蛍光標識を含んでよい。
【0100】
耐ｐＨ ＩＬ－２ムテインの同定方法は、ＩＬ－２ムテインまたはそのフラグメントをエンコードする核酸を含むライブラリーを作製するステップをさらに含んでよく、ＩＬ－２ムテインは、１つ以上のアミノ酸の置換（例えば、保守的置換を含む）；（ii）１つ以上のアミノ酸の欠失；（iii）１つ以上のアミノ酸の付加；および（iv）１つ以上の配列の逆位（これらはすべて、本明細書において後に記載／定義する）を含む。
【0101】
ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成するステップは、配列番号１の残基３５から残基４５、残基５８から残基７１および／または残基１０７から残基１１２のいずれか１つ以上の残基に変異（例えば、置換、付加、欠失または逆位）を導入することを含んでよい。一教示において、ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成するステップは、配列番号１の残基３７から残基４３、残基６０から残基６９、残基１０９から残基１１０のいずれか１つ以上の残基に変異を導入することを含んでよい。ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成するステップは、配列番号１の残基３７、残基３８、残基４１、残基４２、残基４３、残基６０、残基６１、残基６３、残基６４、残基６６、残基６８、残基６９、残基１０９、および残基１１０のいずれか１つ以上に変異を導入することを含んでよい。ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成するステップは、配列番号１の残基３７、残基３８、残基４１、残基４２および残基４３のいずれか１つ以上に変異を導入することを含んでよい。
【0102】
作成されたライブラリーの核酸は、天然型または野生型アミノ酸の他のアミノ酸への置換；例えば、天然型または野生型アミノ酸の、アミノ酸Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｃ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｎ、Ｆ、およびＹから選択される他のアミノ酸による置換を含むムテインをエンコードしてよい。核酸ライブラリーは、上記のアミノ酸のいずれか１つ以上に対する縮退コドンを有するプライマーを使用するネステッドＰＣＲによって作製することができる。
【0103】
本方法は、核酸ライブラリーを発現させてＩＬ－２ムテインライブラリーを得るステップをさらに含んでよい。ライブラリーに含まれるＩＬ－２ムテインは、細胞、ファージのウイルス、例えば酵母細胞などの発現ビヒクルの表面で発現されてよい。
【0104】
ＩＬ－２ムテインをＩＬ－２Ｒαと接触させるステップが、異なるｐＨの範囲で実施されてよい。例えば、ＩＬ－２ムテインをＩＬ－２Ｒαと接触させるステップが、約ｐＨ７．４未満のｐＨで実施されてよい。例えば、接触させるステップが、約ｐＨ４．０またはｐＨ５．０と約ｐＨ７．０またはｐＨ７．３との間のｐＨで行われてよい。例えば、接触させるステップが、約ｐＨ４．５またはｐＨ４．８と約ｐＨ６．０またはｐＨ６．５との間のｐＨで行われてよい。接触させるステップが、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１またはｐＨ７．２で行われてよい。この種の方法において、酸性のｐＨでＩＬ－２Ｒαに結合したムテインを、耐酸性を有し得るＩＬ－２ムテインとして同定することができる。上記に加えてまたは上記に替えて、酸性ｐＨで、それぞれの野生型よりもより強い受容体（ＩＬ－２Ｒα）結合を示すＩＬ－２ムテインが、耐酸性を有し得るＩＬ－２ムテインとして同定されてもよい。
【0105】
有用なＩＬ－２ムテインが、ＩＬ－２Ｒα（例えばＩＬ－２Ｒαエクトドメイン）の濃度を減少させながらＩＬ－２ムテインと接触させる指向性進化法／反復選択サイクルを用いて同定されてよい。これにより、受容体への結合親和性が最も良好なＩＬ－２ムテインを同定することができる。
【0106】
反復選択サイクルは、最初に（１サイクルまたは数サイクルで）サイトカイン受容体多量体、好ましくは受容体四量体に結合させることと、続いて（１サイクルまたは数サイクルで）サイトカイン受容体単量体に結合させることとを含む。受容体多量体は、例えば、ビオチン化受容体をストレプトアビジンに結合させるか、他のリガンド／バインダー相互作用を介して得ることができる。
【0107】
反復選択ラウンドは、受容体濃度を低下させながら（例えば、１００ｎＭの四量体、１μＭの四量体、１００ｎＭ単量体；図２ｂも参照）結合させることを含んでよい。理論に束縛されることを望むものではないが、受容体濃度を低下させることにより、受容体親和性の高いムテインを同定することができる。
【0108】
次に、選択ラウンドにおいて受容体に結合し、同定されたＩＬ－２ムテインが、関連するムテインをエンコードする核酸を含む発現ビヒクル／ベクターを用いて発現されてよい。したがって、本方法は、発現されたムテインを介して、受容体に結合した発現ビヒクルに含まれる核酸を単離および／またはシークエンシングするステップをさらに含んでよい。
【0109】
本方法は、それぞれのｐＨにおいて、対応する受容体に野生型サイトカインと比較して低い親和性で結合するムテインを同定するために、少なくとも７．２、好ましくは約７．４のｐＨ下で、同定されたＩＬ－２ムテインを、対応する受容体またはその結合フラグメントと接触させるステップをさらに含んでよい。
【0110】
本発明はさらに、上記のサイトカインムテインをエンコードする核酸を含むライブラリー、およびサイトカインムテインライブラリーに関する。
【0111】
酸耐性ＩＬ－２ムテインは、がんを含む様々な疾患および／または状態の治療および／または予防への応用することができる。
【0112】
このように、本開示は、がんの治療に使用するためのＩＬ－２ムテインの同定方法を提供し、該方法は、
ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成することと、
ＩＬ－２ムテインをＩＬ－２Ｒαと接触させ、ＩＬ－２Ｒαに結合するムテインを同定することと、を含む。
ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成することと、
ＩＬ－２ムテインをＩＬ－２Ｒαと接触させ、ＩＬ－２Ｒαに結合するムテインを同定することと、を含む。
【0113】
この場合も、ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成するステップは、野生型または基準ＩＬ－２配列に１以上のアミノ酸改変を導入することを含んでよい。さらに、ＩＬ－２ムテインをＩＬ－２Ｒαと接触させるステップが酸性ｐＨで行われてよい。その目的は、酸性ｐＨでＩＬ－２Ｒαに結合可能なＩＬ－２ムテインを同定することにある。腫瘍微小環境は酸性であり得るので、ｐＨ耐性を有するＩＬ－２ムテインは、がんの治療および／または予防に最も有用であろう。
【0114】
また、本開示は、ＩＬ－２分子を変異または改変させてＩＬ－２ムテインを生成することと、ＩＬ－２Ｒαに結合し、このためｐＨ耐性を有するムテインを同定するために、ＩＬ－２ムテインを酸性条件下でＩＬ－２Ｒαと接触させるステップとを含む方法によって得ることができる、耐ｐＨ ＩＬ－２ムテインを提供する。変異または改変させるＩＬ－２分子は、野生型ＩＬ－２配列またはその他のＩＬ－２基準配列を含んでよい。例えば、改変させるＩＬ－２分子が、配列番号１またはその機能性フラグメントを含んでよい。酸性条件は前述のように調整されてよい。酸性条件下でＩＬ－２Ｒαに結合する能力を保持するムテインは、ＴＭＥが酸性であり、標準的なＩＬ－２ベースの治療薬の機能を阻害するがんの治療に使用する薬剤として非常に有用であろう。好ましくは、開示のＩＬ－２ムテインおよび融合タンパク質は、がんの腫瘍におけるＴＭＥの細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）が約ｐＨ７．４未満、７．２未満、好ましくは７．０未満、好ましくは約６．８未満、最も好ましくは約６．６未満である前記がんの治療に使用するためのものである。このようながんの種類は、例えばリンパ腫がんまたは固形がんであってよい。がんの治療は、本明細書に開示のＩＬ－２ムテイン、融合タンパク質または関連する組成物を投与する前に、患者のＴＭＥの細胞外ｐＨを決定するステップを含んでよい。ＴＭＥのｐＨｅは、蛍光イメージング、ＰＥＴ、１Ｈ磁気共鳴スペクトル法（ＭＲＳ）、３１Ｐ ＭＲＳ、１９Ｆ ＭＲＳ、過分極１３Ｃ ＭＲＳ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、特にＣｈｅｎ（非特許文献２２）（同開示の内容全体が参照により本明細書に援用される）に開示されたようなＣＥＳＴ ＭＲＩを含む、当該技術分野で公知の様々な方法に従って決定することができる。好ましくは、ＴＭＥのｐＨｅはＭＲＩによって決定される。
【0115】
本開示はさらに、種々の疾患および／または状態の治療および／または予防のための方法、組成物および医薬品に使用するための改変ＩＬ－２分子を提供する。
【0116】
したがって、本開示は、医薬に使用するためのＩＬ－２ムテインを提供する。
【0117】
一教示において、本開示は、医薬に使用するための、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３、またはその機能性フラグメントを含むタンパク質を提供する。機能性フラグメントの定義は、本明細書の別の箇所に記載されている。
【0118】
本開示はさらに、医薬に使用するための、開示されたＩＬ－２ムテインのいずれかをエンコードする核酸を提供する。一教示において、本開示は、医薬に使用するための、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３またはそのフラグメントを含むタンパク質をエンコードする核酸を提供する。
【0119】
本開示は、
医薬品として使用するための、
開示されたＩＬ－２ムテインのいずれか；および／または
配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくはそれらのフラグメントを含むタンパク質；および／または
開示されたＩＬ－２ムテインのいずれかをエンコードする核酸；および／または
配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくはそのフラグメントを含むタンパク質をエンコードする核酸を提供する。
医薬品として使用するための、
開示されたＩＬ－２ムテインのいずれか；および／または
配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくはそれらのフラグメントを含むタンパク質；および／または
開示されたＩＬ－２ムテインのいずれかをエンコードする核酸；および／または
配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくはそのフラグメントを含むタンパク質をエンコードする核酸を提供する。
【0120】
この点において、本明細書に記載のＩＬ－２ムテインは、免疫療法として利用または使用されてよい。
【0121】
本開示は、免疫学的状態の治療または予防に使用するための改変ＩＬ－２分子を提供する。
【0122】
本開示は、がんの治療または予防に用いる改変ＩＬ－２分子を提供する。
【0123】
一教示において、「がん」という用語には、乳酸の過剰産生を特徴とする（腫瘍）細胞のがんが含まれる。「がん」という用語には、酸性の微小環境を形成する腫瘍をもたらすがんも含まれる。
【0124】
また、（ｉ）がん、または（ii）免疫学的状態の治療または予防のための医薬品の製造における、本開示の改変ＩＬ－２分子の使用も開示される。
【0125】
本開示はさらに、がんの治療または予防方法を提供し、該方法は、治療有効量の本明細書中に記載の改変ＩＬ－２分子のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0126】
本開示の改変分子を投与する対象には、免疫学的状態および／またはがんに罹患しているヒトまたは動物の対象が含まれる。また、対象は、免疫学的状態もしくはがんに罹患する素因のある、および／または罹患しやすいヒトまたは動物のいずれかの対象であってもよく、このがんはＩＬ－２の使用により治療および／または予防することができる。
【0127】
理論に束縛されることを望むものではないが、本開示のムテインに関連するさらなる利点は、野生型または未改変のＩＬ－２分子よりも毒性が低いことにある。本開示のムテインは、酸性ｐＨでより高い親和性でＩＬ－２Ｒαに結合し、ｐＨ７．２よりもｐＨ６．５においてより強力なＳＴＡＴ５の活性化を誘発し、野生型ＩＬ－２分子と比較して細胞傷害性Ｔ細胞の増殖の誘導に優れる。このように、高いレベルの全身毒性がＩＬ－２の治療的使用を妨げてきたが、本開示により提供されるムテインは中性ｐＨで活性が低下するため、酸性の腫瘍微小環境内で選択的に活性を示す。要約すると、ここでも理論に束縛されるものではないが、本開示のＩＬ－２ムテインは、酸性腫瘍微小環境内で強力な応答を誘導するが、中性ｐＨでは活性が低下するため、（野生型（または未改変）ＩＬ－２分子よりも）全身毒性を生じにくい。
【0128】
本開示はさらに、本明細書に記載のサイトカインムテインまたはＩＬ－２ムテインを含む融合タンパク質を提供してよい。
【0129】
融合タンパク質は、サイトカインムテインまたはＩＬ－２ムテインに結合、連結または融合された１つ以上の他の分子をさらに含んでよい。一教示において、他の分子が、サイトカインムテインまたはＩＬ－２ムテインのＣ末端、Ｎ末端またはＮ末端およびＣ末端に結合、連結または融合されてよい。別の教示において、融合体が、サイトカインムテインまたはＩＬ－２ムテインを対象とする別の分子を含んでいてもよい。
【0130】
したがって、本開示は、以下を含む融合タンパク質を提供する。
（ｉ）サイトカインムテイン；または
（ii）開示されたＩＬ－２ムテインのいずれか；または
（iii）配列番号２、９、１０、１１、１２、１３またはそのフラグメントを含むタンパク質。
（ｉ）サイトカインムテイン；または
（ii）開示されたＩＬ－２ムテインのいずれか；または
（iii）配列番号２、９、１０、１１、１２、１３またはそのフラグメントを含むタンパク質。
【0131】
本開示の融合タンパク質の他の分子は、
サイトカイン、サイトカインムテイン、またはそれらのフラグメント；
インターロイキン分子またはそのフラグメント
ポリペプチド結合ドメイン
抗体またはそのフラグメント；
一本鎖抗体；
ＶＨＨを含んでよい。
サイトカイン、サイトカインムテイン、またはそれらのフラグメント；
インターロイキン分子またはそのフラグメント
ポリペプチド結合ドメイン
抗体またはそのフラグメント；
一本鎖抗体；
ＶＨＨを含んでよい。
【0132】
本開示の融合タンパク質は、本明細書に記載のように、ＩＬ－２ムテインおよび少なくとも１つ以上のさらなる異なるサイトカインを含んでよい。
【0133】
本開示の融合タンパク質に含まれるポリペプチド結合ドメインは、腫瘍抗原またはチェックポイント分子に結合するか、またはこれらに対する特異性／親和性を示してよい。チェックポイント分子とは、いくつかの免疫細胞の表面に存在する共刺激性受容体や、前記受容体に対するリガンドなど、免疫反応の負の制御因子である。（ポリペプチド結合分子が結合する、またはこれらに対して特異性／親和性を示す）チェックポイント分子は、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＣＤ１６０、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯｌ、ＩＤ０２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、またはＶＩＳＴＡから選択されてよい。
【0134】
前述のように、本発明の融合体に含まれるポリペプチド結合ドメインは、腫瘍抗原に結合するか、または腫瘍抗原に対する特異性／親和性を示してよく、「腫瘍抗原」という用語は、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦｏＩＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６ Ｅ６、ＨＰＶ－１６ Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２、またはＷＴ１から選択される抗体を含んでよい。ポリペプチド結合ドメインは血液腫瘍抗原に結合してよく、血液腫瘍抗原はリンパ球によって発現されてよい。この種の腫瘍抗原としては、例えば、ＡＤＩＲ、ＡＵＲＫＡ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＭＩ１、ＣＭＬ２８、ＣＭＬ６６、サイクリンＡｌ、ＤＤＸ３Ｙ、ＤＫＫ１、ＦＭＯＤ、ＦＲＡＭＥ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＡＧＥ、ＨＭ１．２４、ｈＴＥＲＴ、ＬＰＰ、ＭＡＧ ＥＡ３、ＭＡＧＥＡ３、ＭＥＦ２Ｄ、ＭＬＬ、ＭＰＰ１、ＭＵＣ１、ミエロペルオキシダーゼ、ＮＥＷＲＥＮ６０、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＡＮＥ１、ＰＲＡＭＥ、プロテナーゼ３、ＰＴＰＮ２０Ａ／Ｂ、ＲＨＡＭＭ、ＲＯＲ１、ＳＬＡＭＦ７、サバイビン、ＴＥＸ１４、ＷＴ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ１２３、ＣＤ２６９、ＣＤ１３８、ＨＭ１．２４、ＳＬＡＭＦ７が挙げられる。（血液）腫瘍抗原という用語には、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ１２３、ＣＤ２６９、ＣＤ１３８、ＨＭ１．２４、ＳＬＡＭＦ７などの表面抗原が含まれる。
【0135】
本開示の融合体に使用するためのポリペプチドドメインは、制御性Ｔ細胞によって発現される抗原に結合するか、またはこれらに対して親和性／特異性を示す。制御性Ｔ細胞によって発現される抗原は、制御性Ｔ細胞の細胞表面マーカーに含まれてよい。制御性Ｔ細胞によって発現される抗原は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＮＦＲＩＩ、ＮＲＰ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＣＲ８、ＬＡＹＮ、ＭＡＧＥＨ１、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＤ３０、ＩＬ－１Ｒ２、ＩＬ－２１Ｒ、４－１ＢＢ、ＰＤＬ－ｌ、およびＰＤＬ－２から選択されてよい。
【0136】
本開示の融合タンパク質は、抗Ｏｘ４０抗体またはそのフラグメントを含んでよい。有用な例としては、国際公開第２０１５／１３２５８０号または米国特許出願公開第２０１９／２７５０８４号明細書（これらの開示の全内容が参照により本明細書に援用される）に開示されている抗体を挙げることができる。
【0137】
本開示の融合タンパク質に使用するための抗体は、アンタゴニスト抗体またはそのアゴニストフラグメントを含んでよい。これらの抗体のいずれのフラグメントが使用されてもよく、このフラグメントも必要なアンタゴニスト／アゴニスト活性を示す。有用なアゴニスト抗体は、例えば、国際公開第２０２０／００６５０９号、国際公開第２０１８／０４５１１０号、国際公開第２０１７／２１４０９２号、国際公開第２０１９／０７２８６８号（これら全ての文書の関連する内容が本明細書に援用される）に開示されたものであってよい。
【0138】
本開示の融合タンパク質に使用するための抗体は、ｐＨ応答性抗体またはそのフラグメントを含んでいてもよく、このフラグメントはｐＨ応答性であるという特徴を保持してよい。ｐＨ応答性抗体は、異なるｐＨで異なる抗原結合動態を示す。例えば、理論に束縛されることを望むものではないが、ｐＨ応答性抗体は、酸性のｐＨでは、異なる（例えば中性またはアルカリ性の）ｐＨで同じ抗原に結合するよりも高い親和性または低い親和性で抗原に結合してよい。一教示において、ｐＨ応答性抗体は、酸性のｐＨにおいて抗原に対し高い親和性を示してよい（その増大は、異なる（例えば中性またはアルカリ性の）ｐＨでの同じ抗原に対する当該抗体の親和性と比較した増加である）。ｐＨ応答性抗体（またはそのフラグメント）は、ＣＴＬＡ－４（国際公開第２０１９／１５２４１３号に開示されており、同開示の全内容が参照により本明細書に援用される）、ＰＤ－Ｌ１（国際公開第２０１７／１６１９７６号に記載されており、同開示の全内容が参照により本明細書に援用される）、ＶＩＳＴＡ（米国特許出願公開第２０２０／２００５５９３６号明細書および国際公開第２０１９／１８３０４０号に開示されており、これらの開示の全内容が参照により本明細書に援用される）に結合してよい（または親和性／特異性を有してよい）。本開示の融合タンパク質は、国際公開第２０２０／２４７９３２号に開示された抗ＣＤ３抗体、国際公開第２０２０／２５２０９５号に開示された抗ＥＰＣＡＭ抗体、または国際公開第２０１８／２１８０７６号に開示されたｐＨ応答性抗体を含んでよい。
【0139】
腫瘍部位に存在する条件下では、特定のサイトカイン、例えばＩＬ－２は条件的に活性化する。したがって、本開示の融合タンパク質は、本開示のサイトカインムテイン／ＩＬ－２ムテインを条件的に不活性化するポリペプチドドメインを含んでよい。ＩＬ－２を条件的に不活性化するポリペプチドドメインは、ＩＬ－２とその受容体との結合を阻止するかまたは減少させるポリペプチドであってよい。インターロイキンを条件的に不活性化するポリペプチドドメインは、マスキング部位またはドメインとして当該技術分野において公知である。活性化は、融合タンパク質の立体的変化、あるいは融合タンパク質からのポリペプチドドメインの放出によって促進される。マスキングドメインは、ポリペプチドリンカーを介してＩＬ－２に融合されてよい。ポリペプチドリンカーは、好ましくは腫瘍微小環境の条件下で切断される。放出可能なマスキング部位を含むインターロイキン融合タンパク質は、例えばＸｉｌｉｏによる国際公開第２０２０／０６９３９８号に開示されている。
【0140】
本開示の融合タンパク質（この融合タンパク質は、本開示のサイトカインムテインまたはＩＬ－２ムテインを含む）は、半減期延長型分子を含んでよい。例えば、本開示の融合体は、半減期延長型分子に融合または結合された（本明細書で定義のような）サイトカインムテインまたはＩＬ－２ムテインを含んでよい。半減期延長型分子は、免疫グロブリンフラグメント、好ましくはＦｃ分子、血液血清タンパク質に結合するポリペプチド結合ドメイン、好ましくはアルブミンまたはポリマーに結合するポリペプチド結合ドメインを含む。
【0141】
この点において、「Ｆｃ分子」という用語は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含んでよい。一教示において、有用なＩｇＧ１ Ｆｃ分子は、該Ｆｃのエフェクター機能を変化させる１つ以上の変異を含んでよい。例として、ヒトＩｇＧ１はＮ２９７の置換、例えばＮ２９７Ｇの置換を含んでよい。他の教示において、有用なヒトＩｇＧ Ｆｃ分子は、Ｃ末端リジンの置換または欠失を含んでよい。
【0142】
本開示の融合体は、ムテイン成分と融合体の他の成分とを連結するリンカー部分を含んでよい。好適なリンカーは、国際公開第２０２１／０３０６０２号（その関連する内容が本明細書に援用される）に開示されたリンカーを含んでよい。一教示において、本開示の融合体は、前記タンパク質のＦｃおよびヒトＩＬ－２ムテイン部分を連結するリンカーに（何らかの短いペプチドリンカーを介して）連結されたサイトカイン／ＩＬ－２ムテインを含んでよい。
【0143】
（本開示の融合体に含まれる）ポリマーは、ポリエチレングリコール分子を含んでよい。
【0144】
本開示はさらに、様々な疾患および／または状態の治療および／または予防のための方法、組成物および医薬品に使用するための本開示の融合タンパク質を提供する。
【0145】
例として、本開示は、医薬に使用するための開示された融合タンパク質のいずれかを提供する。一教示において、本開示は、医薬に使用するための、サイトカインムテインもしくはＩＬ－２ムテイン、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３、またはこれらのいずれかのフラグメントを含むタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。
【0146】
開示された融合タンパク質は、免疫療法として利用または使用することができる。
【0147】
本開示は、免疫学的状態の治療に使用するための、開示された融合タンパク質のいずれか１つを提供する。
【0148】
本開示は、がんの治療に使用するための本開示の融合タンパク質を提供する。一教示において、「がん」という用語は、その（腫瘍）細胞が乳酸の過剰産生を特徴とするがんを含む。「がん」という用語は、酸性の微小環境を形成する腫瘍をもたらすどのようながんも含む。
【0149】
また、（ｉ）がん、または（ii）免疫学的状態の治療のための医薬品の製造における、本開示の融合タンパク質の使用も開示される。
【0150】
本開示はさらに、がんの治療方法を提供し、該方法は、治療有効量の本明細書に開示の融合タンパク質のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0151】
本開示の融合タンパク質を投与する対象には、免疫学的状態および／またはがんに罹患しているヒトまたは動物の対象が含まれる。また、対象は、本開示の融合タンパク質を用いて治療および／または予防することができる免疫学的状態もしくはがんに罹患する素因のある、および／または罹患しやすい任意のヒトまたは動物対象であってよい。
【0152】
開示されたサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質のいずれもが、組成物の形態で提供されてよいことに留意されたい。このような組成物は医薬品として使用することができる。本開示の組成物は、例えば、１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であってよい。
【0153】
あるいは、本開示に係る医薬品として使用される組成物は、開示されたサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質のいずれかをエンコードするポリヌクレオチド、好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡを含んでよい。
【0154】
タンパク質またはポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡを含む開示の組成物は、例えば、全身投与されても、または腫瘍内または腫瘍外投与により局所投与されてよい。
【0155】
開示されたサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質のいずれかを含む組成物は、１種以上の追加の活性剤または治療剤をさらに含んでよい。例えば、本組成物は、抗腫瘍抗原抗体、チェックポイント分子、チェックポイント分子に対する抗体、腫瘍抗原、ステロイドおよび／またはＣＡＲ Ｔ細胞を含んでよい。
【0156】
本明細書に記載の治療的処置のいずれもが、１以上の追加の活性または治療的部分、例えば、抗腫瘍抗原抗体、チェックポイント分子、チェックポイント分子に対する抗体、腫瘍抗原、ステロイドおよび／またはＣＡＲ Ｔ細胞の使用をさらに含んでよく、これらは、本開示のサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質の投与前、投与中（同時または一緒に）、または投与後に、別々に投与されてよい。
【0157】
一教示において、追加の活性または治療的部分は、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＣＤ１６０、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯｌ、ＩＤ０２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、またはＶＩＳＴＡから選択され、最も好ましくはＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、またはＰＤ－Ｌ２である。
【0158】
例えば、本開示は、（本明細書において定義されるような）がんおよび／または免疫学的状態の治療および予防のための方法、組成物および医薬品に使用するための、本開示のサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインおよび／または融合タンパク質と、１以上の追加の治療的または薬学的に活性な部分とを提供する。
【0159】
開示されたサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質のいずれも、アジュバントとして使用されてよい。「アジュバント」とは、アジュバントと共投与される１以上の抗原に対する宿主免疫応答を増強、調節、または強化する化合物である。したがって、開示されたサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質は、１以上の抗原に対する宿主免疫応答を増強、調節または強化するために、１以上の抗原と組み合わせて使用されてよい。１以上の抗原は、例えば微生物、細菌および／またはウイルスの抗原を含んでよい。
【0160】
したがって、本開示は、宿主において抗原に対する免疫応答を向上させる方法をさらに提供し、該方法は、抗原と、開示されたサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質のいずれかとを宿主に投与することを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、サイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質は、宿主において抗原に対する免疫応答を増強、調節または強化するアジュバントとして作用する。
【0161】
本開示はさらに、抗原と、開示されたサイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質のいずれかとを含むワクチン組成物を提供する。この種のワクチン組成物では、サイトカインムテイン、ＩＬ－２ムテインまたは融合タンパク質成分がアジュバントとして作用するか、またはその役割を果たす。一教示において、ワクチンは腫瘍ワクチンである。
【実施例】
【0162】
材料と方法
細胞培養および培地
Ｂ１６．ＳＩＹ ＷＴおよびＢ１６．ＳＩＹ ＬＤＨＡ／Ｂ ＤＫＯ（レーゲンスブルク大学Ｍａｒｉｎａ Ｋｒｅｕｔｚの好意により提供）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＧｌｕｔａＭＡＸ入りＲＰＭＩ１６４０で培養した。ＳＮＡＰｆ－ＩＬ－２Ｒαを安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、アール平衡塩、グルタミン、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、およびＨＥＰＥＳバッファーを添加したＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。バキュロウイルスの調製およびタンパク質の産生には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）の細胞をそれぞれＳＦ９００ ＩＩＩ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１２６５８０２７）およびＩｎｓｅｃｔ Ｘｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ；ＢＥＬＮ１２－７３０Ｑ）で培養した。ヒトＴ細胞は、１０％ＦＢＳ、最小限の非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、６１８７００３６）入りＲＰＭＩ１６４０で培養した。短期または長期の実験を行うために培地のｐＨを調整する際には、ＨＣｌを使用して培地を酸性化し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５を添加してｐＨを６．５に安定させた。同量のＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５をｐＨ７．５の培地に加えた。マウスＴ細胞の場合、培地にはさらに５０μＭのβ－メルカプトエタノールを添加した。
細胞培養および培地
Ｂ１６．ＳＩＹ ＷＴおよびＢ１６．ＳＩＹ ＬＤＨＡ／Ｂ ＤＫＯ（レーゲンスブルク大学Ｍａｒｉｎａ Ｋｒｅｕｔｚの好意により提供）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＧｌｕｔａＭＡＸ入りＲＰＭＩ１６４０で培養した。ＳＮＡＰｆ－ＩＬ－２Ｒαを安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、アール平衡塩、グルタミン、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、およびＨＥＰＥＳバッファーを添加したＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。バキュロウイルスの調製およびタンパク質の産生には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）の細胞をそれぞれＳＦ９００ ＩＩＩ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１２６５８０２７）およびＩｎｓｅｃｔ Ｘｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ；ＢＥＬＮ１２－７３０Ｑ）で培養した。ヒトＴ細胞は、１０％ＦＢＳ、最小限の非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、６１８７００３６）入りＲＰＭＩ１６４０で培養した。短期または長期の実験を行うために培地のｐＨを調整する際には、ＨＣｌを使用して培地を酸性化し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５を添加してｐＨを６．５に安定させた。同量のＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５をｐＨ７．５の培地に加えた。マウスＴ細胞の場合、培地にはさらに５０μＭのβ－メルカプトエタノールを添加した。
【0163】
タンパク質の産生
ヒトＩＬ－２野生型（ＷＴ；残基１～１３３）およびＳｗｉｔｃｈ－２を、Ｎ末端ｇｐ６７およびＣ末端ヒスチジンタグを有するフレームでｐＦＢ－ＣＴ１０ＨＦベクターにクローニングし、ヒトＩＬ－２Ｒαエクトドメイン（残基１～２１７）を、Ｃ末端ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）－ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＷおよびこれに続くヒスチジンタグとともに同じベクターにクローニングし、ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分をＩＬ－２ ＷＴのＮ末端およびＳｗｉｔｃｈ－２にクローニングした。バキュロウイルス発現系を用いてタンパク質を産生させた。簡単に説明すると、ベクターをＤＨ１０Ｂａｃ菌（Ｇｉｂｃｏ）で組み換え、生成したバクミドを用いてバキュロウイルスを産生させた。バキュロウイルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞で産生および増幅し、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）細胞に感染させてタンパク質発現に使用した。感染２日後、Ｈｉｓ－Ｐｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；８８２２２）を用いて、細胞培養上清中に放出されたタンパク質を捕捉した。タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥヘルスケア；２９－１４８７－２１）でサイズ排除して精製した。タンパク質を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＨＢＳバッファー）で保存した。ＩＬ－２Ｒαの場合、タンパク質を１０ｍＭのシステインで還元し、２０ｍＭのヨードアセトアミド１４でアルキル化し、１００μＭのビオチン存在下でＢｉｒＡリガーゼを用いてビオチン化した。顕微鏡実験のために、ＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２を、Ｎ末端マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびＹｂｂＲタグ（ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡペプチド）、ならびにＣ末端ヒスチジンタグを持つフレームでｐＭＡＬベクターにクローニングした。ＢＬ２１大腸菌細胞を用い、２０℃で１ｍＭ ＩＰＴＧによるＯ／Ｎ誘導によりタンパク質を発現させた。ペリプラズム画分を浸透圧ショックで分離し、組換えタンパク質をＨｉｓ－Ｐｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ 樹脂で捕捉した。タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムでサイズ排除により精製した。
ヒトＩＬ－２野生型（ＷＴ；残基１～１３３）およびＳｗｉｔｃｈ－２を、Ｎ末端ｇｐ６７およびＣ末端ヒスチジンタグを有するフレームでｐＦＢ－ＣＴ１０ＨＦベクターにクローニングし、ヒトＩＬ－２Ｒαエクトドメイン（残基１～２１７）を、Ｃ末端ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）－ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＷおよびこれに続くヒスチジンタグとともに同じベクターにクローニングし、ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分をＩＬ－２ ＷＴのＮ末端およびＳｗｉｔｃｈ－２にクローニングした。バキュロウイルス発現系を用いてタンパク質を産生させた。簡単に説明すると、ベクターをＤＨ１０Ｂａｃ菌（Ｇｉｂｃｏ）で組み換え、生成したバクミドを用いてバキュロウイルスを産生させた。バキュロウイルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞で産生および増幅し、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）細胞に感染させてタンパク質発現に使用した。感染２日後、Ｈｉｓ－Ｐｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；８８２２２）を用いて、細胞培養上清中に放出されたタンパク質を捕捉した。タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥヘルスケア；２９－１４８７－２１）でサイズ排除して精製した。タンパク質を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＨＢＳバッファー）で保存した。ＩＬ－２Ｒαの場合、タンパク質を１０ｍＭのシステインで還元し、２０ｍＭのヨードアセトアミド１４でアルキル化し、１００μＭのビオチン存在下でＢｉｒＡリガーゼを用いてビオチン化した。顕微鏡実験のために、ＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２を、Ｎ末端マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびＹｂｂＲタグ（ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡペプチド）、ならびにＣ末端ヒスチジンタグを持つフレームでｐＭＡＬベクターにクローニングした。ＢＬ２１大腸菌細胞を用い、２０℃で１ｍＭ ＩＰＴＧによるＯ／Ｎ誘導によりタンパク質を発現させた。ペリプラズム画分を浸透圧ショックで分離し、組換えタンパク質をＨｉｓ－Ｐｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ 樹脂で捕捉した。タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムでサイズ排除により精製した。
【0164】
マイクロスケールサーモフォレーシス（ＭＳＴ）
赤および青のフィルターセットを備えたＮＴ．１１５ Ｐｉｃｏ ＭＳＴ装置（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ）を用いてＭＳＴを実施した。ＩＬ２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２を０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳバッファー（ＰＢＳ－Ｔ）で２００ｎＭに希釈し、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ＲＥＤ－ｔｒｉｓ－ＮＴＡ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ；ＭＯ－Ｌ０１８）で標識した。ＲＥＤ－ｔｒｉｓ－ＮＴＡ色素をＰＢＳ－Ｔで１００ｎＭに希釈した。この混合液を暗所にて、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。ＩＬ－２Ｒαエクトドメイン（２５μＭ）を１：１の比率で１６グラジエントで希釈した。その後、標識したタンパク質とＩＬ－２Ｒαエクトドメインとを１：１の割合で混合し、暗所にて１５分間インキュベートした。その後、キャピラリーを個々に充填し、装置にロードする。中程度のＭＳＴパワーおよび２０％のＬＥＤを用いてデータを取得した。ＭＯ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ）を用いてデータを分析した。ＭＳＴの図を、ＭＯ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いて作図した。
赤および青のフィルターセットを備えたＮＴ．１１５ Ｐｉｃｏ ＭＳＴ装置（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ）を用いてＭＳＴを実施した。ＩＬ２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２を０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳバッファー（ＰＢＳ－Ｔ）で２００ｎＭに希釈し、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ＲＥＤ－ｔｒｉｓ－ＮＴＡ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ；ＭＯ－Ｌ０１８）で標識した。ＲＥＤ－ｔｒｉｓ－ＮＴＡ色素をＰＢＳ－Ｔで１００ｎＭに希釈した。この混合液を暗所にて、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。ＩＬ－２Ｒαエクトドメイン（２５μＭ）を１：１の比率で１６グラジエントで希釈した。その後、標識したタンパク質とＩＬ－２Ｒαエクトドメインとを１：１の割合で混合し、暗所にて１５分間インキュベートした。その後、キャピラリーを個々に充填し、装置にロードする。中程度のＭＳＴパワーおよび２０％のＬＥＤを用いてデータを取得した。ＭＯ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ）を用いてデータを分析した。ＭＳＴの図を、ＭＯ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いて作図した。
【0165】
ヒトＴ細胞の分離および培養
健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｐａｎｃｏｌｌ ｈｕｍａｎ（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ０４－６０５００）を用いた密度勾配遠心分離により、バフィーコート（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ）から分離した。２００ｘ１０６のＰＢＭＣを１５μｌの抗ＣＤ８ ＦＩＴＣ抗体（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ８ａ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３００９０６）で４℃で１５分間染色し、洗浄後、７０μｌの抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０４８－７０１）とインキュベートした。ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０４２－４０１）を用いた磁気分離によりＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、コート抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１７３２６）および２μｇ／ｍｌ可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローンＣＤ２８．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０２９３４）を用いて完全培地中で３日間活性化させた。活性化は、特段の指定のない限り、常に中性ｐＨ７．５で行った。増殖アッセイのために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞の活性化前にＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ３４５５７）で標識した。ｍＲＮＡを精製するために、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞をＯ／Ｎで休ませ、完全培地ｐＨ７．５または６．５に移し、１０ｎＭ ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２で４時間刺激した。プロテオーム解析に用いるＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、活性化した細胞を１０ｎＭ ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２の存在下、ｐＨ７．５または６．５の培地で４８時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄した後、乾燥した細胞ペレットを凍結した。サイトカイン発現解析およびセクレトーム解析に用いた活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０ｎＭ ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２の存在下、ｐＨ７．５または６．５の培地で３日間培養し、その後４時間刺激した。フローサイトメトリーによるサイトカイン発現解析には、輸送阻害剤を含む細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；００－４９７５－９３）を用いた。Ｌｕｍｉｎｅｘ分析用の上清は、細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；００－４９７０－９３）で刺激して回収した。ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離と同じプロトコールに従って、４０μｌの抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ抗体（クローンＡ１６１Ａ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３５７４０６）を用いて分離した。
健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｐａｎｃｏｌｌ ｈｕｍａｎ（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ０４－６０５００）を用いた密度勾配遠心分離により、バフィーコート（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ）から分離した。２００ｘ１０６のＰＢＭＣを１５μｌの抗ＣＤ８ ＦＩＴＣ抗体（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ８ａ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３００９０６）で４℃で１５分間染色し、洗浄後、７０μｌの抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０４８－７０１）とインキュベートした。ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０４２－４０１）を用いた磁気分離によりＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、コート抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１７３２６）および２μｇ／ｍｌ可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローンＣＤ２８．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０２９３４）を用いて完全培地中で３日間活性化させた。活性化は、特段の指定のない限り、常に中性ｐＨ７．５で行った。増殖アッセイのために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞の活性化前にＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ３４５５７）で標識した。ｍＲＮＡを精製するために、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞をＯ／Ｎで休ませ、完全培地ｐＨ７．５または６．５に移し、１０ｎＭ ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２で４時間刺激した。プロテオーム解析に用いるＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、活性化した細胞を１０ｎＭ ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２の存在下、ｐＨ７．５または６．５の培地で４８時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄した後、乾燥した細胞ペレットを凍結した。サイトカイン発現解析およびセクレトーム解析に用いた活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０ｎＭ ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２の存在下、ｐＨ７．５または６．５の培地で３日間培養し、その後４時間刺激した。フローサイトメトリーによるサイトカイン発現解析には、輸送阻害剤を含む細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；００－４９７５－９３）を用いた。Ｌｕｍｉｎｅｘ分析用の上清は、細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；００－４９７０－９３）で刺激して回収した。ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分離と同じプロトコールに従って、４０μｌの抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ抗体（クローンＡ１６１Ａ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３５７４０６）を用いて分離した。
【0166】
シグナル伝達実験
シグナル伝達実験では、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞をＯ／Ｎで休ませ、その後ｐＨ７．５または６．５の培地中で、示した量のＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２で１５分間刺激した。時間経過実験の場合、細胞を１０ｎＭまたは１０ｐＭのＩＬ－２で６時間、３時間、２時間、１時間、３０分、１５分間刺激した。新鮮単離総ＣＤ４細胞を１５分間刺激した後に、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を評価した。
シグナル伝達実験では、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞をＯ／Ｎで休ませ、その後ｐＨ７．５または６．５の培地中で、示した量のＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２で１５分間刺激した。時間経過実験の場合、細胞を１０ｎＭまたは１０ｐＭのＩＬ－２で６時間、３時間、２時間、１時間、３０分、１５分間刺激した。新鮮単離総ＣＤ４細胞を１５分間刺激した後に、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を評価した。
【0167】
フローサイトメトリー分析
ヒトＣＤ８細胞を、Ｚｏｍｂｉｅ ａｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；４２３１０１）を用いて４℃で２０分間インキュベートした後、ＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；１３０－０９１－２２１）中で３０分間、抗ヒトＣＤ８ ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ３ ＢＶ７１１（クローンＵＣＨＴ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３００４６３）、抗ヒトＣＤ２５ ＡＰＣ（クローンＭ－Ａ２５１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５６１１０）、抗ヒトＣＤ１２２ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＴＵ２７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３３９０１３）、抗ヒトＣＤ１３２ ＰＥ（クローンＴＵＧｈ４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３３８６０５）、および抗ヒトＣＤ６９ ＢＶ６５０（クローンＦＮ５０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３１０９３３）を用いて表面マーカーで染色した。サイトカイン発現の解析のため、表面マーカーで染色した細胞を、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５５４７１４）を用いて固定し、透過化した。抗ヒトＩＬ－２ ＢＶ４２１（クローンＭＱ１－１７Ｈ１２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５００３２８）、抗ヒトＴＮＦα ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ ５９４（クローンＭａｂ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０２９４６）、および抗ヒトＩＦＮγ ＡＰＣ（クローンＢ２７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０６５１０）を用いた。抗体はすべて１：１００で使用した。用量反応および速度論的実験のために、刺激した細胞を直ちに２％ＰＦＡで１５分間室温で固定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールで３０分間氷上で透過化した後、既述の方法で蛍光バーエンコードを付けた（非特許文献１５）。簡単に説明すると、個々のウェルを異なる濃度のＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１０１６３）およびＤｙＬｉｇｈｔ８００ ＮＨＳ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；４６４２１）の組み合わせで染色した。１６個のバーエンコード付きサンプルをプールし、ＭＡＣＳバッファー中で１：１００抗ＳＴＡＴ５ ＰＥ（クローン４７／Ｓｔａｔ５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；６１２５６７）、１：１００抗ＥＲＫ１／２ ＡＦ６４７（クローン４Ｂ１１Ｂ６９；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、６７７５０４）、１：５０抗Ａｋｔ ＡＦ６４７（クローン１９３Ｈ２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２３３７Ｓ）、および１：１００抗Ｓ６Ｒ ＰＥ（クローンＤ５７．２．２Ｅ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；５３１６Ｓ）で１時間室温で染色した。Ｔｒｅｇ細胞のシグナル伝達実験の場合、サンプルを洗浄し、ＦｏｘＰ３／転写因子染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；００－５５２３－００）を用いて、１：１０の抗ヒトＦｏｘＰ３ ＡＦ６４７（クローン２５９Ｄ／Ｃ７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５６００４５）で染色した。マウスの脾臓およびリンパ節の単一細胞懸濁液を機械的破砕により得た。腫瘍をコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６８８５）およびＤＮａｓｅ Ｉ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、０７４７０）で消化させた。ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／３２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１０１３２０）で処理した後、前述と同じ手順でサンプルを染色した。使用した抗体は、抗マウスＣＤ３ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローン１７Ａ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００２１８）、抗マウスＣＤ４ ＢＶ６０５（クローンＲＭ４－５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００５４８）、抗マウスＣＤ４ ＡＦ７００（クローンＧＫ１．５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００４３０）、抗マウスＣＤ８ ＡＦ４８８（クローン５３－６．７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００７２３）、抗マウスＣＤ４５ ＢＶ７１１（クローン３０－Ｆ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１０３１４７）、抗マウスＣＤ１２２ ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ ５９４（クローンＴＭ－β１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１２３２１７）、抗マウスＰＤ－１ ＢＶ７８５（クローン２９Ｆ－１Ａ１２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１３５２２５）、抗マウスＴＩＭ３ ＢＶ４２１（クローンＲＭＴ３－２３；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１１９７２３）、抗マウスＦｏｘＰ３ ＰＥ（クローンＦＪＫ－１６ｓ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１２－５７７３－８２）、抗マウスＫｉ６７ ＰＥ－Ｃｙ５（クローンＳｏｌＡ１５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１５－５６９８－８２）、抗マウスＮＫ１．１ ＢＶ６０５（クローンＰＫ１３６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１０８７３９）、抗マウスＴＮＦα ＢＶ６０５（クローンＭＰ６－ＸＴ２２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；５０６３２９）、抗マウスＩＦＮγ ＡＰＣ（クローンＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；５０５８０９）である。ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリーを行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ、バージョン１０）を用いて解析した。
ヒトＣＤ８細胞を、Ｚｏｍｂｉｅ ａｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；４２３１０１）を用いて４℃で２０分間インキュベートした後、ＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；１３０－０９１－２２１）中で３０分間、抗ヒトＣＤ８ ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ３ ＢＶ７１１（クローンＵＣＨＴ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３００４６３）、抗ヒトＣＤ２５ ＡＰＣ（クローンＭ－Ａ２５１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５６１１０）、抗ヒトＣＤ１２２ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＴＵ２７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３３９０１３）、抗ヒトＣＤ１３２ ＰＥ（クローンＴＵＧｈ４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３３８６０５）、および抗ヒトＣＤ６９ ＢＶ６５０（クローンＦＮ５０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３１０９３３）を用いて表面マーカーで染色した。サイトカイン発現の解析のため、表面マーカーで染色した細胞を、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５５４７１４）を用いて固定し、透過化した。抗ヒトＩＬ－２ ＢＶ４２１（クローンＭＱ１－１７Ｈ１２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５００３２８）、抗ヒトＴＮＦα ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ ５９４（クローンＭａｂ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０２９４６）、および抗ヒトＩＦＮγ ＡＰＣ（クローンＢ２７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０６５１０）を用いた。抗体はすべて１：１００で使用した。用量反応および速度論的実験のために、刺激した細胞を直ちに２％ＰＦＡで１５分間室温で固定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールで３０分間氷上で透過化した後、既述の方法で蛍光バーエンコードを付けた（非特許文献１５）。簡単に説明すると、個々のウェルを異なる濃度のＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１０１６３）およびＤｙＬｉｇｈｔ８００ ＮＨＳ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；４６４２１）の組み合わせで染色した。１６個のバーエンコード付きサンプルをプールし、ＭＡＣＳバッファー中で１：１００抗ＳＴＡＴ５ ＰＥ（クローン４７／Ｓｔａｔ５；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；６１２５６７）、１：１００抗ＥＲＫ１／２ ＡＦ６４７（クローン４Ｂ１１Ｂ６９；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、６７７５０４）、１：５０抗Ａｋｔ ＡＦ６４７（クローン１９３Ｈ２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２３３７Ｓ）、および１：１００抗Ｓ６Ｒ ＰＥ（クローンＤ５７．２．２Ｅ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；５３１６Ｓ）で１時間室温で染色した。Ｔｒｅｇ細胞のシグナル伝達実験の場合、サンプルを洗浄し、ＦｏｘＰ３／転写因子染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；００－５５２３－００）を用いて、１：１０の抗ヒトＦｏｘＰ３ ＡＦ６４７（クローン２５９Ｄ／Ｃ７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５６００４５）で染色した。マウスの脾臓およびリンパ節の単一細胞懸濁液を機械的破砕により得た。腫瘍をコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６８８５）およびＤＮａｓｅ Ｉ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、０７４７０）で消化させた。ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／３２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１０１３２０）で処理した後、前述と同じ手順でサンプルを染色した。使用した抗体は、抗マウスＣＤ３ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローン１７Ａ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００２１８）、抗マウスＣＤ４ ＢＶ６０５（クローンＲＭ４－５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００５４８）、抗マウスＣＤ４ ＡＦ７００（クローンＧＫ１．５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００４３０）、抗マウスＣＤ８ ＡＦ４８８（クローン５３－６．７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００７２３）、抗マウスＣＤ４５ ＢＶ７１１（クローン３０－Ｆ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１０３１４７）、抗マウスＣＤ１２２ ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ ５９４（クローンＴＭ－β１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１２３２１７）、抗マウスＰＤ－１ ＢＶ７８５（クローン２９Ｆ－１Ａ１２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１３５２２５）、抗マウスＴＩＭ３ ＢＶ４２１（クローンＲＭＴ３－２３；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１１９７２３）、抗マウスＦｏｘＰ３ ＰＥ（クローンＦＪＫ－１６ｓ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１２－５７７３－８２）、抗マウスＫｉ６７ ＰＥ－Ｃｙ５（クローンＳｏｌＡ１５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１５－５６９８－８２）、抗マウスＮＫ１．１ ＢＶ６０５（クローンＰＫ１３６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１０８７３９）、抗マウスＴＮＦα ＢＶ６０５（クローンＭＰ６－ＸＴ２２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；５０６３２９）、抗マウスＩＦＮγ ＡＰＣ（クローンＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；５０５８０９）である。ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリーを行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ、バージョン１０）を用いて解析した。
【0168】
動物モデル
６週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６ＪＲｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）に、ＰＢＳおよびマトリゲル（１：１）（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３５６２３２）に溶解させた３０．０００ Ｂ１６．ＳＩＹ ＷＴまたはＢ１６．ＳＩＹ ＬＤＨＡ／Ｂ ＤＫＯを右脇腹に皮下注射した。７日目から１１日目まで２０μｇのＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ノギスを用いて腫瘍を計測し、長さ×幅２／２の式を用いて腫瘍体積を算出した。ＴＩＬｓの解析のために、マウスを腫瘍注射後１５日目に犠牲にした。毒性試験のために、２０μｇまたは５０μｇのＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２を５日間連続でｉ．ｐ．投与し、最後の注射の翌日にマウスを犠牲にした。肺採取後の湿重量を測定し、８０℃でＯ／Ｎ乾燥させた後の乾燥重量を減算することで肺浮腫（肺湿重量）を評価した。
６週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６ＪＲｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）に、ＰＢＳおよびマトリゲル（１：１）（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３５６２３２）に溶解させた３０．０００ Ｂ１６．ＳＩＹ ＷＴまたはＢ１６．ＳＩＹ ＬＤＨＡ／Ｂ ＤＫＯを右脇腹に皮下注射した。７日目から１１日目まで２０μｇのＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ノギスを用いて腫瘍を計測し、長さ×幅２／２の式を用いて腫瘍体積を算出した。ＴＩＬｓの解析のために、マウスを腫瘍注射後１５日目に犠牲にした。毒性試験のために、２０μｇまたは５０μｇのＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２を５日間連続でｉ．ｐ．投与し、最後の注射の翌日にマウスを犠牲にした。肺採取後の湿重量を測定し、８０℃でＯ／Ｎ乾燥させた後の乾燥重量を減算することで肺浮腫（肺湿重量）を評価した。
【0169】
ＩＬ－２ライブラリーの作製および選択
前述した酵母提示のプロトコール（非特許文献１６）を適用して、酵母で発現させるために、ＩＬ－２ ｃＤＮＡをｐＣＴ３０２ベクターにクローニングした。８つの重複プライマーを組み立てて、ｐＣＴ３０２ベクターとの組み合わせに必要なホモロジー領域を含む２つのプライマーを含むＩＬ－２ライブラリを生成した。（表１参照）。プライマーのうち３つは、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４３、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｅ６３、Ｌ６６、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｄ１０９、およびＥ１１０残基をランダムに変異させるためのＮＤＴコドン（Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ Ｃ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｎ、Ｆ、Ｙの各アミノ酸をエンコードする）を有するものを用いた。このＰＣＲ産物を、Ｌｉｂ ＦｗおよびＬｉｂ Ｒｖプライマー（表１）を用いて最終濃度１０μＭでさらに増幅し、少なくとも２５μｇのＤＮＡを得た。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＢＹ１００株を、２５μｇのインサートＤＮＡおよび５μｇの直鎖化精製プラスミドでエレクトロポレーションにより形質転換させた。トランスフェクトした酵母を、それぞれの選択ラウンドで、ＳＤＣＡＡ培地で３０℃、１日間、ＳＧＣＡＡ培地で２０℃、２日間増殖させた。５ｘ１０７のサイズのライブラリを、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；１３０－０４２－４０１）を用いて磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりスクリーニングした。最初の選別ラウンドでは１０１０の細胞を使用し、その後のラウンドでは１０８の細胞を使用して、各ラウンドにおいて少なくとも１０倍のカバレッジを確保した。ビオチン化ＩＬ－２Ｒαエクトドメインを異なる濃度で用いて、耐ｐＨ ＩＬ－２バリアントを選択した。より詳細には、最初の２ラウンドはｐＨ５で１００ｎＭのＩＬ－２Ｒα四量体を用い、３ラウンド目では１μＭ、４ラウンド目では１００ｎＭのＩＬ－２Ｒα単量体をそれぞれ用いた。ＩＬ－２Ｒα四量体は、ＩＬ－２Ｒαおよびストレプトアビジン（ＳＡ）－Ａｌｅｘａ６４７を４：１の割合でインキュベートすることにより作製した。
前述した酵母提示のプロトコール（非特許文献１６）を適用して、酵母で発現させるために、ＩＬ－２ ｃＤＮＡをｐＣＴ３０２ベクターにクローニングした。８つの重複プライマーを組み立てて、ｐＣＴ３０２ベクターとの組み合わせに必要なホモロジー領域を含む２つのプライマーを含むＩＬ－２ライブラリを生成した。（表１参照）。プライマーのうち３つは、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４３、Ｅ６０、Ｅ６１、Ｅ６３、Ｌ６６、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｄ１０９、およびＥ１１０残基をランダムに変異させるためのＮＤＴコドン（Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ Ｃ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｎ、Ｆ、Ｙの各アミノ酸をエンコードする）を有するものを用いた。このＰＣＲ産物を、Ｌｉｂ ＦｗおよびＬｉｂ Ｒｖプライマー（表１）を用いて最終濃度１０μＭでさらに増幅し、少なくとも２５μｇのＤＮＡを得た。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＢＹ１００株を、２５μｇのインサートＤＮＡおよび５μｇの直鎖化精製プラスミドでエレクトロポレーションにより形質転換させた。トランスフェクトした酵母を、それぞれの選択ラウンドで、ＳＤＣＡＡ培地で３０℃、１日間、ＳＧＣＡＡ培地で２０℃、２日間増殖させた。５ｘ１０７のサイズのライブラリを、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；１３０－０４２－４０１）を用いて磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりスクリーニングした。最初の選別ラウンドでは１０１０の細胞を使用し、その後のラウンドでは１０８の細胞を使用して、各ラウンドにおいて少なくとも１０倍のカバレッジを確保した。ビオチン化ＩＬ－２Ｒαエクトドメインを異なる濃度で用いて、耐ｐＨ ＩＬ－２バリアントを選択した。より詳細には、最初の２ラウンドはｐＨ５で１００ｎＭのＩＬ－２Ｒα四量体を用い、３ラウンド目では１μＭ、４ラウンド目では１００ｎＭのＩＬ－２Ｒα単量体をそれぞれ用いた。ＩＬ－２Ｒα四量体は、ＩＬ－２Ｒαおよびストレプトアビジン（ＳＡ）－Ａｌｅｘａ６４７を４：１の割合でインキュベートすることにより作製した。
【0170】
【表4-1】
【表4-2】
【0171】
ナノディファレンシャルスキャニングフルオリメトリ（ＮａｎｏＤＳＦ）
Ｔｙｃｈｏ ＮＴ．６（ドイツ国ミュンヘン所在ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）を用いて、各ＨＢＳバッファー条件（ｐＨ７～４）について標準キャピラリー（１０μｌ）を適用してＩＬ２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２（１０μＭ）を分析した。３５℃～９５℃の間の温度勾配内で熱アンフォールディングプロファイルを記録した。統合ソフトウェアを使用して変曲温度（Ｔｉ）の値を自動的に決定した。
Ｔｙｃｈｏ ＮＴ．６（ドイツ国ミュンヘン所在ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）を用いて、各ＨＢＳバッファー条件（ｐＨ７～４）について標準キャピラリー（１０μｌ）を適用してＩＬ２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２（１０μＭ）を分析した。３５℃～９５℃の間の温度勾配内で熱アンフォールディングプロファイルを記録した。統合ソフトウェアを使用して変曲温度（Ｔｉ）の値を自動的に決定した。
【0172】
単一分子蛍光イメージング
顕微鏡実験では、ＳＮＡＰｆ－ＩＬ－２Ｒαを安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、非特異的結合を最小化するためにＲＧＤで官能基化したポリ－Ｌ－リジン－グラフト（ポリエチレングリコール）コポリマーでコートした２５ｍｍのガラスカバースリップに移した（非特許文献１７）。先行文献に記載されているように（非特許文献１８，１９）、三重線全反射（ＴＩＲ）照明コンデンサー（オリンパス）およびｂａｃｋ－７照明電子増倍（ＥＭ）ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ ＤＵ８９７Ｄ、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を備えた倒立顕微鏡（オリンパスＩＸ７１）を用いて、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法により、単一分子イメージング実験を行った。試料のＴＩＲ照明には、倍率１５０倍、開口数１．４５の対物レンズ（ＵＡＰＯ １５０×／１．４５ ＴＩＲＦＭ、オリンパス）を使用した。実験はすべて、光劣化を最小限に抑えるため（非特許文献２０）、フェノールレッドを含まない培地中で、酸素捕捉剤および酸化還元活性を有する光保護剤を加え、常温で行った。
顕微鏡実験では、ＳＮＡＰｆ－ＩＬ－２Ｒαを安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、非特異的結合を最小化するためにＲＧＤで官能基化したポリ－Ｌ－リジン－グラフト（ポリエチレングリコール）コポリマーでコートした２５ｍｍのガラスカバースリップに移した（非特許文献１７）。先行文献に記載されているように（非特許文献１８，１９）、三重線全反射（ＴＩＲ）照明コンデンサー（オリンパス）およびｂａｃｋ－７照明電子増倍（ＥＭ）ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ ＤＵ８９７Ｄ、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を備えた倒立顕微鏡（オリンパスＩＸ７１）を用いて、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法により、単一分子イメージング実験を行った。試料のＴＩＲ照明には、倍率１５０倍、開口数１．４５の対物レンズ（ＵＡＰＯ １５０×／１．４５ ＴＩＲＦＭ、オリンパス）を使用した。実験はすべて、光劣化を最小限に抑えるため（非特許文献２０）、フェノールレッドを含まない培地中で、酸素捕捉剤および酸化還元活性を有する光保護剤を加え、常温で行った。
【0173】
ＳＮＡＰｆタグ付きＩＬ－２Ｒαの化学量論的細胞表面標識のために、あらかじめ混合しておいた８０ｎＭのＢＧ－色素溶液（９５％ＢＧ－４８８および５％ＢＧ－Ｄｙ５４７）と共に細胞を３７℃で１５分間インキュベートし、あらかじめ温めておいたＰＢＳで５回洗浄し未反応の色素を除去した。イメージング実験の５分前に濃度１ｎＭのＤｙ５４７Ｐ１／Ｄｙ６４７Ｐ１結合ｙｂｂＲ－ＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２を添加した。単一分子の実験では、オレンジ（Ｄｙ５４７／Ｄｙ５４７Ｐ１）および赤（ＤＹ６４７Ｐ１）に発光する蛍光色素を、５６１ｎｍファイバーレーザー（２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－５００－５６０－Ｂ１Ｒ、ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）および６４２ｎｍファイバーレーザー（２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－５００－６４２－Ｂ１Ｒ、ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）で同時に励起した。蛍光をペンタバンドポリクロミックミラー（ｚｔ４０５／４８８／５６１／６４０／７３０ｒｐｃ、Ｓｅｍｒｏｃｋ）でフィルターし、励起光をペンタバンドバンドパスエミッションフィルター（ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ４４０／５２１／６０７／６９４／８０９、Ｓｅｍｒｏｃｋ）で遮断した。１台の裏面照射型ＥＭＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ Ｕｌｔｒａ ８９７、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で両チャンネルを同時に取得するために、５６５ｎｍ、６３０ｎｍ、７３５ｎｍの３つのダイクロイックビームスプリッタ（４８０ｄｃｘｒ、５６５ｄｃｘｒ、６４０ｄｃｘｒ、Ｃｈｒｏｍａ）および４つのシングルバンドパス発光フィルタ（ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ４３８／２４、ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ５２０／３５、ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ６００／３７、ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ６８５／４０、Ｃｈｒｏｍａ）を備えた４色イメージスプリッタ（ＱｕａｄＶｉｅｗ、ＱＶ２、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用した。各細胞について、３２ｍｓ／フレームの時間分解能で１５０フレームの画像スタックを記録した。
【0174】
マルチプルターゲットトレーシング（ＭＴＴ）アルゴリズム（非特許文献２１）を用いて単一分子局在化を行った。リガンド結合をレシオメトリックに定量するために、３０フレームのＤｙ６４７Ｐ１（ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２）の局在化を、それぞれＤｙ５４７（ＩＬ－２Ｒα）またはＤｙ５４７Ｐ１（ＩＬ－２ ＷＴ）の局在化に正規化した。
【0175】
単一分子蛍光イメージング
顕微鏡実験では、ＳＮＡＰｆ－ＩＬ－２Ｒαを安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、非特異的結合を最小化するためにＲＧＤで官能基化したポリ－Ｌ－リジン－グラフト（ポリエチレングリコール）コポリマーでコートした２５ｍｍのガラスカバースリップに移した（非特許文献１７）。先行文献に記載されているように（非特許文献１８，１９）、三重線全反射（ＴＩＲ）照明コンデンサー（オリンパス）およびｂａｃｋ－７照明電子増倍（ＥＭ）ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ ＤＵ８９７Ｄ、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を備えた倒立顕微鏡（オリンパスＩＸ７１）を用いて、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法により、単一分子イメージング実験を行った。試料のＴＩＲ照明には、倍率１５０倍、開口数１．４５の対物レンズ（ＵＡＰＯ １５０×／１．４５ ＴＩＲＦＭ、オリンパス）を使用した。実験はすべて、光劣化を最小限に抑えるため（非特許文献２０）、フェノールレッドを含まない培地中で、酸素捕捉剤および酸化還元活性を有する光保護剤を加え、常温で行った。
顕微鏡実験では、ＳＮＡＰｆ－ＩＬ－２Ｒαを安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、非特異的結合を最小化するためにＲＧＤで官能基化したポリ－Ｌ－リジン－グラフト（ポリエチレングリコール）コポリマーでコートした２５ｍｍのガラスカバースリップに移した（非特許文献１７）。先行文献に記載されているように（非特許文献１８，１９）、三重線全反射（ＴＩＲ）照明コンデンサー（オリンパス）およびｂａｃｋ－７照明電子増倍（ＥＭ）ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ ＤＵ８９７Ｄ、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を備えた倒立顕微鏡（オリンパスＩＸ７１）を用いて、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法により、単一分子イメージング実験を行った。試料のＴＩＲ照明には、倍率１５０倍、開口数１．４５の対物レンズ（ＵＡＰＯ １５０×／１．４５ ＴＩＲＦＭ、オリンパス）を使用した。実験はすべて、光劣化を最小限に抑えるため（非特許文献２０）、フェノールレッドを含まない培地中で、酸素捕捉剤および酸化還元活性を有する光保護剤を加え、常温で行った。
【0176】
ＳＮＡＰｆタグ付きＩＬ－２Ｒαの化学量論的細胞表面標識のために、あらかじめ混合しておいた８０ｎＭのＢＧ－色素溶液（９５％ＢＧ－４８８および５％ＢＧ－Ｄｙ５４７）と共に細胞を３７℃で１５分間インキュベートし、あらかじめ温めておいたＰＢＳで５回洗浄し未反応の色素を除去した。イメージング実験の５分前に濃度１ｎＭのＤｙ５４７Ｐ１／Ｄｙ６４７Ｐ１結合ｙｂｂＲ－ＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２を添加した。単一分子の実験では、オレンジ（Ｄｙ５４７／Ｄｙ５４７Ｐ１）および赤（ＤＹ６４７Ｐ１）に発光する蛍光色素を、５６１ｎｍファイバーレーザー（２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－５００－５６０－Ｂ１Ｒ、ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）および６４２ｎｍファイバーレーザー（２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－５００－６４２－Ｂ１Ｒ、ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）で同時に励起した。蛍光をペンタバンドポリクロミックミラー（ｚｔ４０５／４８８／５６１／６４０／７３０ｒｐｃ、Ｓｅｍｒｏｃｋ）でフィルターし、励起光をペンタバンドバンドパスエミッションフィルター（ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ４４０／５２１／６０７／６９４／８０９、Ｓｅｍｒｏｃｋ）で遮断した。１台の裏面照射型ＥＭＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ Ｕｌｔｒａ ８９７、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で両チャンネルを同時に取得するために、５６５ｎｍ、６３０ｎｍ、７３５ｎｍの３つのダイクロイックビームスプリッタ（４８０ｄｃｘｒ、５６５ｄｃｘｒ、６４０ｄｃｘｒ、Ｃｈｒｏｍａ）および４つのシングルバンドパス発光フィルタ（ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ４３８／２４、ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ５２０／３５、ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ６００／３７、ＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ ＨＣ ６８５／４０、Ｃｈｒｏｍａ）を備えた４色イメージスプリッタ（ＱｕａｄＶｉｅｗ、ＱＶ２、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用した。各細胞について、３２ｍｓ／フレームの時間分解能で１５０フレームの画像スタックを記録した。マルチプルターゲットトレーシング（ＭＴＴ）アルゴリズム（非特許文献２１）を用いて単一分子局在化を行った。リガンド結合をレシオメトリックに定量するために、３０フレームのＤｙ６４７Ｐ１（ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２）の局在化を、それぞれＤｙ５４７（ＩＬ－２Ｒα）またはＤｙ５４７Ｐ１（ＩＬ－２ ＷＴ）の局在化に正規化した。
【0177】
ルミネックス分析
ダンディー大学のイムノアッセイバイオマーカーコアラボラトリーで、細胞上清を、カスタム３６マルチプレックスＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓＬｕｍｉｎｅｘパネル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。サンプルをアッセイの説明書の指示に従って２倍に希釈した。Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ洗浄ステーションを使用して洗浄ステップを実施した。マルチプレックスアッセイプレートを、Ｂｉｏ－ｐｌｅｘ ２００アナライザーでＢｉｏ－ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ６．１を用いて測定した。３６種類の分析対象物特異的抗体が微小粒子にプレコートされている。
ダンディー大学のイムノアッセイバイオマーカーコアラボラトリーで、細胞上清を、カスタム３６マルチプレックスＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓＬｕｍｉｎｅｘパネル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。サンプルをアッセイの説明書の指示に従って２倍に希釈した。Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ洗浄ステーションを使用して洗浄ステップを実施した。マルチプレックスアッセイプレートを、Ｂｉｏ－ｐｌｅｘ ２００アナライザーでＢｉｏ－ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ６．１を用いて測定した。３６種類の分析対象物特異的抗体が微小粒子にプレコートされている。
【0178】
標準、サンプル、およびすべての微粒子のカクテルを各ウェルに添加した。このプレートをホイルプレートシーラーで覆い、８００±５０ｒｐｍで振とうしながら、２時間室温でインキュベートした。この段階で、固定化した抗体が目的の分析物に結合する。Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ洗浄ステーションを使用し、アッセイの指示に従ってプレートを３回洗浄した。
【0179】
目的の分析物に特異的な希釈ビオチン化抗体カクテルを各ウェルに添加した。このプレートをホイルプレートシーラーで覆い、８００±５０ｒｐｍで振とうしながら、１時間室温でインキュベートした。
【0180】
この後、プレートを前述のように洗浄した。希釈したストレプトアビジン－フィコエリトリン結合体（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥ）を各ウェルに添加した。このプレートをホイルプレートシーラーで覆い、８００±５０ｒｐｍで振とうしながら、３０分間インキュベートした。この後、プレートを前述のように洗浄した。微小粒子を洗浄バッファーに再懸濁した。プレートを８００±５０ｒｐｍに設定したプレートシェーカーに２分間置いた。Ｂｉｏ－ｐｌｅｘ ２００アナライザーを用いてプレートを直ちに読み取った。各標準物質およびサンプルの平均重複（duplicate）蛍光強度（ＭＦＩ）の測定値からブランクの平均ＭＦＩを減算した。Ｂｉｏ－ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ６．１ソフトウェアを使用して、各分析物について５パラメータロジスティック（５－ＰＬ）曲線フィットの標準曲線を作成した。また、同ソフトウェアを用いてサンプルの希釈を考慮した結果も算出した。
【0181】
ＲＮＡシークエンスの解析
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｒ１０５１）を用いて精製した。ライブラリーの調製およびシークエンシングはＮｏｖｏｇｅｎｅ社が行った。
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｒ１０５１）を用いて精製した。ライブラリーの調製およびシークエンシングはＮｏｖｏｇｅｎｅ社が行った。
【0182】
マウスＣＤ８＋Ｔ細胞の分離および活性化
ＭａｇｎｉＳｏｒｔマウスＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；８８０４－６８２２－７４）を用いてマウス脾臓からマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。コート抗ＣＤ３抗体（クローン１４５－２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００３４０）および２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローン３７．５１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１０２１１６）を用いて、完全培地中で細胞を３日間活性化させた。
ＭａｇｎｉＳｏｒｔマウスＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；８８０４－６８２２－７４）を用いてマウス脾臓からマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。コート抗ＣＤ３抗体（クローン１４５－２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１００３４０）および２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローン３７．５１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１０２１１６）を用いて、完全培地中で細胞を３日間活性化させた。
【0183】
統計分析
複数群の比較は、テューキーの補正を加えた一元配置分散分析を用いて行った。生存曲線をカプラン・マイヤー曲線で表し、統計学的有意差をＬｏｇ－ｒａｎｋ検定で判定した。すべての解析は、Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。
複数群の比較は、テューキーの補正を加えた一元配置分散分析を用いて行った。生存曲線をカプラン・マイヤー曲線で表し、統計学的有意差をＬｏｇ－ｒａｎｋ検定で判定した。すべての解析は、Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。
【0184】
結果
ＴＭＥの酸性ｐＨはＩＬ－２免疫療法を阻害した
先行研究は、ＩＬ－２の受容体への結合はｐＨに応答性を有するプロセスであることを示唆していた（非特許文献７）。そこで、本発明者らは、ＴＭＥにみられるような酸性ｐＨが、ＩＬ－２のシグナル伝達および活性に影響を及ぼすかを調べた。ＩＬ－２は、ｐＨ６．５で培養した予め活性化された状態のＣＤ８＋Ｔ細胞において、ｐＨ７．５で培養した細胞よりもＳＴＡＴ５リン酸化を引き起こすレベルが有意に低かった（図１ａおよび拡張データ図１ａ）。同様の結果は、乳酸を用いて培地を酸性化した場合にも見られた（拡張データ図１ｂ）。ＨＣｌまたは乳酸をＮａＣｌに置き換えたところ、ＩＬ－２シグナル伝達に対する酸性ｐＨの効果は、等モル濃度のＮａＣｌではシグナル伝達に対するｐＨの影響を再現できなかったことから、張性に依存しないことがわかった。しかしながら、ＩＬ－２との反応が弱いＩＬ－２Ｒα陰性細胞では、ＩＬ－２はｐＨ６．５とｐＨ７．５とで同程度までＳＴＡＴ５を活性化した。このことは、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの結合がｐＨ応答性であることを示唆している（拡張データ図１ｃ、ｄ）実際、酵母提示したＩＬ－２は、ｐＨ６およびｐＨ５ではｐＨ７よりもＩＬ－２Ｒαとの結合が一貫して悪かった（図１ｂ）。本発明者らは、組み換えタンパク質の解離定数（Ｋｄ）を測定することでこれらの結果を確認した（拡張データ図１ｅ）。次に、ＴＭＥにみられる酸性ｐＨがＩＬ－２治療に悪影響を及ぼすかを調べた。腫瘍による乳酸の放出は、ＴＭＥにおける酸性の主な原因の１つであるため、ＩＬ－２治療に対するｐＨの影響を評価するために、先行技術に記載された、乳酸脱水素酵素ＡおよびＢ（ＬＤＨＡ／Ｂ）を発現していないＢ１６メラノーマ細胞を使用した（非特許文献４）。マウスにＢ１６野生型（ＷＴ）またはＢ１６ ＬＤＨＡ／Ｂダブルノックアウト（ＤＫＯ）を注射し、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分に結合したＩＬ－２（Ｆｃ４－ＩＬ－２）で処置した（図１ｃ）。Ｆｃ４－ＩＬ－２療法は、Ｂ１６ ＷＴ腫瘍を有するマウスにおいて、腫瘍の成長を最小限に抑えるか、または生存率を増加させた（図１ｄ、ｅおよび拡張データ図２ａ）しかし、Ｂ１６ ＤＫＯ腫瘍担持マウスでは、Ｆｃ４－ＩＬ－２療法は腫瘍の成長を有意に抑制し、生存期間を延長させた（図１ｄ、ｅおよび拡張データ図２ａ）Ｆｃ４－ＩＬ－２で処置したマウスは、Ｂ１６ ＷＴおよびＤＫＯ腫瘍の両方において、無処置マウスと比較して浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤の割合が高く、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ細胞がわずかに増加した（図１ｆ、ｇおよび拡張データ図２ｂ）Ｆｃ４－ＩＬ－２で処置したＢ１６ ＷＴおよびＤＫＯの腫瘍を比較したところ、有意差は認められなかった（図１ｆ、ｇ）。一方、Ｆｃ４－ＩＬ－２で処置したＢ１６ ＤＫＯ腫瘍からのＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、Ｆｃ４－ＩＬ－２で処置したＢ１６ ＷＴ腫瘍と比較して、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生が顕著に高く（図１ｈ、ｉおよび拡張データ図２ｃ、ｄ）、ＰＤ１およびＴＩＭ３の発現が低いことが示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型がさほど低下していなかった（図１ｊ，ｋ）。本発明者らのデータは、ＴＭＥにみられる酸性のｐＨが、ＩＬ－２Ｒαへの結合を阻害することによってＩＬ－２応答を大きく阻害し、最終的にＩＬ－２免疫療法を阻害することを示する。
ＴＭＥの酸性ｐＨはＩＬ－２免疫療法を阻害した
先行研究は、ＩＬ－２の受容体への結合はｐＨに応答性を有するプロセスであることを示唆していた（非特許文献７）。そこで、本発明者らは、ＴＭＥにみられるような酸性ｐＨが、ＩＬ－２のシグナル伝達および活性に影響を及ぼすかを調べた。ＩＬ－２は、ｐＨ６．５で培養した予め活性化された状態のＣＤ８＋Ｔ細胞において、ｐＨ７．５で培養した細胞よりもＳＴＡＴ５リン酸化を引き起こすレベルが有意に低かった（図１ａおよび拡張データ図１ａ）。同様の結果は、乳酸を用いて培地を酸性化した場合にも見られた（拡張データ図１ｂ）。ＨＣｌまたは乳酸をＮａＣｌに置き換えたところ、ＩＬ－２シグナル伝達に対する酸性ｐＨの効果は、等モル濃度のＮａＣｌではシグナル伝達に対するｐＨの影響を再現できなかったことから、張性に依存しないことがわかった。しかしながら、ＩＬ－２との反応が弱いＩＬ－２Ｒα陰性細胞では、ＩＬ－２はｐＨ６．５とｐＨ７．５とで同程度までＳＴＡＴ５を活性化した。このことは、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの結合がｐＨ応答性であることを示唆している（拡張データ図１ｃ、ｄ）実際、酵母提示したＩＬ－２は、ｐＨ６およびｐＨ５ではｐＨ７よりもＩＬ－２Ｒαとの結合が一貫して悪かった（図１ｂ）。本発明者らは、組み換えタンパク質の解離定数（Ｋｄ）を測定することでこれらの結果を確認した（拡張データ図１ｅ）。次に、ＴＭＥにみられる酸性ｐＨがＩＬ－２治療に悪影響を及ぼすかを調べた。腫瘍による乳酸の放出は、ＴＭＥにおける酸性の主な原因の１つであるため、ＩＬ－２治療に対するｐＨの影響を評価するために、先行技術に記載された、乳酸脱水素酵素ＡおよびＢ（ＬＤＨＡ／Ｂ）を発現していないＢ１６メラノーマ細胞を使用した（非特許文献４）。マウスにＢ１６野生型（ＷＴ）またはＢ１６ ＬＤＨＡ／Ｂダブルノックアウト（ＤＫＯ）を注射し、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分に結合したＩＬ－２（Ｆｃ４－ＩＬ－２）で処置した（図１ｃ）。Ｆｃ４－ＩＬ－２療法は、Ｂ１６ ＷＴ腫瘍を有するマウスにおいて、腫瘍の成長を最小限に抑えるか、または生存率を増加させた（図１ｄ、ｅおよび拡張データ図２ａ）しかし、Ｂ１６ ＤＫＯ腫瘍担持マウスでは、Ｆｃ４－ＩＬ－２療法は腫瘍の成長を有意に抑制し、生存期間を延長させた（図１ｄ、ｅおよび拡張データ図２ａ）Ｆｃ４－ＩＬ－２で処置したマウスは、Ｂ１６ ＷＴおよびＤＫＯ腫瘍の両方において、無処置マウスと比較して浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤の割合が高く、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ細胞がわずかに増加した（図１ｆ、ｇおよび拡張データ図２ｂ）Ｆｃ４－ＩＬ－２で処置したＢ１６ ＷＴおよびＤＫＯの腫瘍を比較したところ、有意差は認められなかった（図１ｆ、ｇ）。一方、Ｆｃ４－ＩＬ－２で処置したＢ１６ ＤＫＯ腫瘍からのＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、Ｆｃ４－ＩＬ－２で処置したＢ１６ ＷＴ腫瘍と比較して、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生が顕著に高く（図１ｈ、ｉおよび拡張データ図２ｃ、ｄ）、ＰＤ１およびＴＩＭ３の発現が低いことが示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型がさほど低下していなかった（図１ｊ，ｋ）。本発明者らのデータは、ＴＭＥにみられる酸性のｐＨが、ＩＬ－２Ｒαへの結合を阻害することによってＩＬ－２応答を大きく阻害し、最終的にＩＬ－２免疫療法を阻害することを示する。
【0185】
耐ｐＨ ＩＬ－２バリアントのエンジニアリング
次に、ＩＬ－２が酸性の細胞外ｐＨで機能するには限界があることから、酸性ｐＨにおけるＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαへの結合を改善することを目的として、酵母表面提示について、Ａｇａ２ｐに結合したＩＬ－２のバリアントライブラリーを作成した（図２ａ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの指向性進化を、各ラウンドでＩＬ－２Ｒαエクトドメインの濃度を減少させながらｐＨ５で行い（図２ｂ）、Ｔ３７Ｈ、Ｒ３８Ｌ、Ｔ４１Ｓ、Ｆ４２Ｙ、およびＫ４３Ｇの各変異を特徴とする、Ｓｗｉｔｃｈ－２と呼ぶ単一のＩＬ－２バリアントを同定した（図２ｃおよび拡張データ図３ａ）。Ｓｗｉｔｃｈ－２は、低ｐＨでＩＬ－２Ｒαに対しより強い結合を示しただけではなく、ＩＬ－２ ＷＴと比較して中性ｐＨでより低い結合を特徴とする、ｐＨにより切り替え可能な挙動も示した（図２ｄおよび拡張データ図３ｂ）。次に、単分子全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）を用いて、中性ｐＨ（７）および酸性ｐＨ（６）で、ＩＬ－２が生きた細胞の膜上でＩＬ－２Ｒαと相互作用する能力を評価した（図２ｅ）。この目的のために、Ｎ末端ＳＮＡＰｆタグに融合したＩＬ－２Ｒαを生理的に適切な密度（コピー／細胞）でＨｅＬａ細胞に安定発現させ、ＤＹ５４７およびＢＧ－ＤＹ６４７の混合蛍光色素で標識した。次に、Ｄｙ５４７Ｐ１／Ｄｙ６４７Ｐ１コンジュゲートｙｂｂＲ－ＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２を加え、個々のサイトカイン受容体二量体のデュアルカラー共追跡により、ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒαの相互作用を単一細胞レベルで動的にモニターした（図２ｅ、拡張データ図２ｃ、および動画Ｓ１）。これらの実験から、中性ｐＨではＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα受容体へのリクルートメントが増加するが、ｐＨ６．５では弱い相互作用しかしないことが示された。対照的に、Ｓｗｉｔｃｈ－２は反対の関係を示し、酸性ｐＨでは強いリガンド－受容体相互作用を示し、中性ｐＨでは相互作用が最小限であったことから、やはりｐＨにより切り替え可能なＩＬ－２Ｒα結合特性が確認された。
次に、ＩＬ－２が酸性の細胞外ｐＨで機能するには限界があることから、酸性ｐＨにおけるＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαへの結合を改善することを目的として、酵母表面提示について、Ａｇａ２ｐに結合したＩＬ－２のバリアントライブラリーを作成した（図２ａ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの指向性進化を、各ラウンドでＩＬ－２Ｒαエクトドメインの濃度を減少させながらｐＨ５で行い（図２ｂ）、Ｔ３７Ｈ、Ｒ３８Ｌ、Ｔ４１Ｓ、Ｆ４２Ｙ、およびＫ４３Ｇの各変異を特徴とする、Ｓｗｉｔｃｈ－２と呼ぶ単一のＩＬ－２バリアントを同定した（図２ｃおよび拡張データ図３ａ）。Ｓｗｉｔｃｈ－２は、低ｐＨでＩＬ－２Ｒαに対しより強い結合を示しただけではなく、ＩＬ－２ ＷＴと比較して中性ｐＨでより低い結合を特徴とする、ｐＨにより切り替え可能な挙動も示した（図２ｄおよび拡張データ図３ｂ）。次に、単分子全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）を用いて、中性ｐＨ（７）および酸性ｐＨ（６）で、ＩＬ－２が生きた細胞の膜上でＩＬ－２Ｒαと相互作用する能力を評価した（図２ｅ）。この目的のために、Ｎ末端ＳＮＡＰｆタグに融合したＩＬ－２Ｒαを生理的に適切な密度（コピー／細胞）でＨｅＬａ細胞に安定発現させ、ＤＹ５４７およびＢＧ－ＤＹ６４７の混合蛍光色素で標識した。次に、Ｄｙ５４７Ｐ１／Ｄｙ６４７Ｐ１コンジュゲートｙｂｂＲ－ＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２を加え、個々のサイトカイン受容体二量体のデュアルカラー共追跡により、ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒαの相互作用を単一細胞レベルで動的にモニターした（図２ｅ、拡張データ図２ｃ、および動画Ｓ１）。これらの実験から、中性ｐＨではＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα受容体へのリクルートメントが増加するが、ｐＨ６．５では弱い相互作用しかしないことが示された。対照的に、Ｓｗｉｔｃｈ－２は反対の関係を示し、酸性ｐＨでは強いリガンド－受容体相互作用を示し、中性ｐＨでは相互作用が最小限であったことから、やはりｐＨにより切り替え可能なＩＬ－２Ｒα結合特性が確認された。
【0186】
次に、酸性のｐＨがＩＬ－２の安定性に影響を及ぼしているかを検証した。熱アンフォールディングプロファイルの解析から、ＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２は、低ｐＨに影響されない同等の安定性を示した（拡張データ図３ｄ）。これは、低ｐＨが、タンパク質の安定性を減少させることによってではなく、特にサイトカイン受容体の相互作用を阻害することによってＩＬ－２シグナル伝達を特異的に阻害することを示す。次に、酸性ｐＨにおけるＳｗｉｔｃｈ－２の機能を調べた。まず、新鮮単離ＣＤ８＋Ｔ細胞および予め活性化された状態のＣＤ８＋Ｔ細胞において、ｐＨ７．５およびｐＨ６．５でＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２によって誘導されるＳＴＡＴ５のリン酸化レベルを調べた。ＩＬ－２Ｒαを発現していない新鮮単離ＣＤ８＋Ｔ細胞では、ＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２の両方が、ｐＨ６．５およびｐＨ７．５で同等のＳＴＡＴ５の活性化を誘導した（図２ｆ、ｇ）。しかし、予め活性化された状態のＣＤ８＋Ｔ細胞では、ＩＬ－２ ＷＴはｐＨ６．５よりもｐＨ７．５においてより強いＳＴＡＴ５の活性化を引き起こした（図２ｆ、ｇ）。一方、Ｓｗｉｔｃｈ－２は逆の挙動を示し、ｐＨ７．５よりもｐＨ６．５においてより強力なＳＴＡＴ５の活性化を引き起こした（図２ｆ、ｇ）。カイネティクス研究でも同様の結果が得られた（拡張データ図４ａ）。興味深いことに、ＩＬ－２ ＷＴが介在するＥＲＫ１／２のリン酸化は酸性ｐＨにも影響されたが、対照的にＬ－２が介在するＡｋｔおよびＳ６Ｒのリン酸化には明らかな差は認められなかった（拡張データ図４ｂ～ｄ）。また、ｐＨ６．５で刺激した予め活性化された状態のＣＤ８＋Ｔ細胞において、Ｓｗｉｔｃｈ－２はより強力なＥＲＫ１／２およびＡｋｔのリン酸化を誘導した（拡張データ図４ｂ、ｄ）。さらに、ｐＨ６．５およびｐＨ７．５でＩＬ－２ ＷＴおよびＳｗｉｔｃｈ－２によりＴｒｅｇ細胞を刺激すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞で得られた結果と同等の結果が得られた（拡張データ図４ｅ）。
【0187】
Ｓｗｉｔｃｈ－２は酸性ｐＨで機能性Ｔ細胞を誘導した
ＩＬ－２は、ＩＦＮγ８の産生を含む細胞傷害性機能の誘導により、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を促進する。しかし酸性ｐＨは、活性化期におけるＴ細胞の増殖（拡張データ図５ａ）（非特許文献９）、およびＴ細胞のエフェクター機能を阻害することが報告されている（非特許文献２）。そこで、ＩＬ－２またはＳｗｉｔｃｈ－２のいずれかで刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞が、中性および酸性ｐＨ条件下で増殖し、エフェクターサイトカインを産生する能力を調べた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、まずｐＨ７．５で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８活性化ビーズを用いて活性化し、その後ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２の存在下でｐＨ７．５または６．５のいずれかの培地に切り替えた。予想したとおり、ＩＬ－２ ＷＴはｐＨ７．５ではＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導したが、ｐＨ６．５では誘導しなかった（拡張データ図５ｂ）。一方、Ｓｗｉｔｃｈ－２はｐＨ７．５およびｐＨ６．５の両方でＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（拡張データ図５ｂ）。次に、ｐＨ７．５または６．５においてＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２で刺激した活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン分泌プロファイルを調べた。この場合も、ＩＬ－２ ＷＴはｐＨ７．５でＣＤ８＋Ｔ細胞によってサイトカイン分泌を強く誘発したが、細胞をｐＨ６．５で培養すると活性をほぼ失った（図３ａ）。一方、Ｓｗｉｔｃｈ－２はＩＬ－２ ＷＴとほぼ鏡像のように、ｐＨ７．５よりもｐＨ６．５において、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン放出を強く誘発した（図３ａ）。さらに、酸性ｐＨでは、Ｓｗｉｔｃｈ－２で増殖させた細胞からＩＦＮγ８、ＧＭＣＳＦ、およびＴＮＦαなどのエフェクター機能に関連するサイトカインが分泌されたが、ＩＬ－２で増殖させた細胞は、これらのサイトカインをほとんど発現しなかった。次に、細胞内染色およびフローサイトメトリーを用いて、ＩＦＮγおよびＴＮＦαについてこれらの結果を確認した（図３ｂ～ｄ）。
ＩＬ－２は、ＩＦＮγ８の産生を含む細胞傷害性機能の誘導により、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を促進する。しかし酸性ｐＨは、活性化期におけるＴ細胞の増殖（拡張データ図５ａ）（非特許文献９）、およびＴ細胞のエフェクター機能を阻害することが報告されている（非特許文献２）。そこで、ＩＬ－２またはＳｗｉｔｃｈ－２のいずれかで刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞が、中性および酸性ｐＨ条件下で増殖し、エフェクターサイトカインを産生する能力を調べた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、まずｐＨ７．５で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８活性化ビーズを用いて活性化し、その後ＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２の存在下でｐＨ７．５または６．５のいずれかの培地に切り替えた。予想したとおり、ＩＬ－２ ＷＴはｐＨ７．５ではＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導したが、ｐＨ６．５では誘導しなかった（拡張データ図５ｂ）。一方、Ｓｗｉｔｃｈ－２はｐＨ７．５およびｐＨ６．５の両方でＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導した（拡張データ図５ｂ）。次に、ｐＨ７．５または６．５においてＩＬ－２ ＷＴまたはＳｗｉｔｃｈ－２で刺激した活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン分泌プロファイルを調べた。この場合も、ＩＬ－２ ＷＴはｐＨ７．５でＣＤ８＋Ｔ細胞によってサイトカイン分泌を強く誘発したが、細胞をｐＨ６．５で培養すると活性をほぼ失った（図３ａ）。一方、Ｓｗｉｔｃｈ－２はＩＬ－２ ＷＴとほぼ鏡像のように、ｐＨ７．５よりもｐＨ６．５において、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン放出を強く誘発した（図３ａ）。さらに、酸性ｐＨでは、Ｓｗｉｔｃｈ－２で増殖させた細胞からＩＦＮγ８、ＧＭＣＳＦ、およびＴＮＦαなどのエフェクター機能に関連するサイトカインが分泌されたが、ＩＬ－２で増殖させた細胞は、これらのサイトカインをほとんど発現しなかった。次に、細胞内染色およびフローサイトメトリーを用いて、ＩＦＮγおよびＴＮＦαについてこれらの結果を確認した（図３ｂ～ｄ）。
【0188】
Ｓｗｉｔｃｈ－２は強力な抗腫瘍効果を示し、毒性は低い
一連のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、酸性ｐＨでは活性が増大し、中性ｐＨでは活性を低下したという印象的な効果を示したことから、本発明者らは、Ｓｗｉｔｃｈ－２が酸性組織ニッチで活性を増大させるものの、全身毒性はさほど誘導しないのではないかという仮説を立てた。マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を検証するため、まずマウスＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＳｗｉｔｃｈ－２の活性を調べた。重要なことに、Ｓｗｉｔｃｈ－２はマウスＣＤ８＋Ｔ細胞において、ｐＨ７．５よりもｐＨ６．５でより強力なＳＴＡＴ５の活性化を引き起こした（拡張データ図６ａ）。遊離ＩＬ－２の半減期が短いことを考慮し、本発明者らはＩＬ－２または「Ｓｗｉｔｃｈ－２」を非溶解性Ｆｃに結合させ、半減期を延長することで機能を改善した（非特許文献１０）。末梢血および組織ニッチにおける免疫細胞の活性化に加えて、全身毒性を媒介するＩＬ－２バリアントの効果を比較するために、ＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを高用量のＩＬ－２バリアントで処置した。高用量ＩＬ－２療法の主な副作用の一つは血管漏出症候群である（非特許文献１１）。予想通り、高用量のＩＬ－２ ＷＴはかなりの肺浮腫を誘発した（図４ａ）。驚くべきことに、Ｓｗｉｔｃｈ－２の高用量投与は肺浮腫を大幅に減少させた（図４ａ）。このことは、Ｓｗｉｔｃｈ－２を注射したマウスでは、末梢におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴｒｅｇ細胞の割合が低いことと一致しており（図４ｂおよび拡張データ図６ｂ～ｃ）、Ｓｗｉｔｃｈ－２がｐＨ７．５において活性が低いことと一致している。リンパ節（ＬＮ）は酸性ｐＨを特徴とする（非特許文献１２）。このことと一致して、本発明者らは、Ｓｗｉｔｃｈ－２はＩＬ－２ ＷＴよりも、ＬＮ中のＮＫ細胞およびＴｒｅｇ細胞の数をより多く、あるいは同程度に増加させることを見出した（図４ｃおよび拡張データ図６ｄ）。これらのデータは、Ｓｗｉｔｃｈ－２がｉｎ ｖｉｖｏでも酸性ｐＨニッチに偏った活性を示すことを示している。
一連のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、酸性ｐＨでは活性が増大し、中性ｐＨでは活性を低下したという印象的な効果を示したことから、本発明者らは、Ｓｗｉｔｃｈ－２が酸性組織ニッチで活性を増大させるものの、全身毒性はさほど誘導しないのではないかという仮説を立てた。マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を検証するため、まずマウスＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＳｗｉｔｃｈ－２の活性を調べた。重要なことに、Ｓｗｉｔｃｈ－２はマウスＣＤ８＋Ｔ細胞において、ｐＨ７．５よりもｐＨ６．５でより強力なＳＴＡＴ５の活性化を引き起こした（拡張データ図６ａ）。遊離ＩＬ－２の半減期が短いことを考慮し、本発明者らはＩＬ－２または「Ｓｗｉｔｃｈ－２」を非溶解性Ｆｃに結合させ、半減期を延長することで機能を改善した（非特許文献１０）。末梢血および組織ニッチにおける免疫細胞の活性化に加えて、全身毒性を媒介するＩＬ－２バリアントの効果を比較するために、ＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを高用量のＩＬ－２バリアントで処置した。高用量ＩＬ－２療法の主な副作用の一つは血管漏出症候群である（非特許文献１１）。予想通り、高用量のＩＬ－２ ＷＴはかなりの肺浮腫を誘発した（図４ａ）。驚くべきことに、Ｓｗｉｔｃｈ－２の高用量投与は肺浮腫を大幅に減少させた（図４ａ）。このことは、Ｓｗｉｔｃｈ－２を注射したマウスでは、末梢におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴｒｅｇ細胞の割合が低いことと一致しており（図４ｂおよび拡張データ図６ｂ～ｃ）、Ｓｗｉｔｃｈ－２がｐＨ７．５において活性が低いことと一致している。リンパ節（ＬＮ）は酸性ｐＨを特徴とする（非特許文献１２）。このことと一致して、本発明者らは、Ｓｗｉｔｃｈ－２はＩＬ－２ ＷＴよりも、ＬＮ中のＮＫ細胞およびＴｒｅｇ細胞の数をより多く、あるいは同程度に増加させることを見出した（図４ｃおよび拡張データ図６ｄ）。これらのデータは、Ｓｗｉｔｃｈ－２がｉｎ ｖｉｖｏでも酸性ｐＨニッチに偏った活性を示すことを示している。
【0189】
高用量のＩＬ－２投与は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を介する腫瘍の殺傷を強力に活性化させることができる。しかし、ＴＭＥ内でのＴＩＬの活性化が不十分なため、その治療効果は制限されている。本発明者らのデータは、腫瘍内ｐＨがＴＭＥ内のＩＬ－２活性を大きく制限していることを示す（図１ｄ～ｋおよび拡張データ図２）実際、腫瘍内の多数のＴＩＬは機能不全に陥っている（Ｒｅｓ：Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ）。重要なことに、腫瘍から単離したＴＩＬはＩＬ－２の存在下で再活性化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることができる。これらのデータは、ＴＭＥ内でのＩＬ－２の不適切な標的化および機能化が、ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を制限している可能性を示唆している。本発明者らは、Ｓｗｉｔｃｈ－２の循環細胞への中和ｐＨでの結合の低下が、ＴＭＥおよびリンパ系ニッチ内でＣＤ２５を発現する活性化された免疫細胞へのその標的化を改善するという仮説を立てた。そこで次に、ＮＫおよび細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が介在する殺傷に感受性を有するＢ１６メラノーマ腫瘍モデル（非特許文献１３）を用い、Ｓｗｉｔｃｈ－２の抗腫瘍活性を調べた。Ｂ１６を有するマウスにＦｃ４－ＩＬ－２ ＷＴまたはＦｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２を注射し、腫瘍の成長および生存率を測定した（図４ｄ）。Ｆｃ４－ＩＬ－２ ＷＴ療法は腫瘍の成長の抑制および生存期間の延長がわずかであった（図４ｅ、ｆ）。一方、Ｆｃ４－Ｓｗｉｔｃｈ－２療法は、腫瘍の成長を強力に遅延させ、生存期間を延長させた（図４ｅ、ｆ）。ＩＬ－２療法とＳｗｉｔｃｈ－２療法との免疫反応の差を調べるため、治療終了４日後にＢ１６浸潤Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析した（図４ｇおよび拡張データ図６ｅ～ｇ）。Ｓｗｉｔｃｈ－２およびＩＬ－２ ＷＴは、ＰＢＳ処置マウスと比較して、ＣＤ８－Ｔｒｅｇ比をわずかに増加させたが、その差は有意ではなかった（拡張データ図６ｅ）。しかしながら、Ｓｗｉｔｃｈ－２はより強いＣＤ８＋ＴＩＬの増殖および浸潤ＮＫ細胞数の増加を誘導した（図４ｇ、ｈ）。さらに、Ｓｗｉｔｃｈ－２はＩＬ－２ ＷＴよりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞による強力なＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生を誘発した（図４ｉ、ｊ）。注目すべきことに、Ｓｗｉｔｃｈ－２処置群のＣＤ８＋ＴＩＬは、ＩＬ－２ ＷＴ群と比較して、ＰＤ１の発現およびＴＩＭ３発現によって測定される消耗マーカーのレベルが大幅に減少した（拡張データ図６ｆ、ｇ）。これらのデータを総合すると、Ｓｗｉｔｃｈ－２はＩＬ－２ ＷＴよりも全身毒性が少ない一方で、酸性ＴＭＥではより強力な反応を誘導することが示される。重要なことに、これらの結果は、ＩＬ－２の中間的なＩＬ－２Ｒα親和性の受容体複合体への選択的結合がその抗腫瘍効果に必要であるとするドグマに異議を唱えるものであり、腫瘍内の酸性ｐＨが、ＣＤ２５を付加的に発現する高親和性受容体複合体を介した最適なＩＬ－２応答に対する負の障壁であることを示した。さらに、本発明者らは、免疫原性の乏しいＢ１６メラノーマ腫瘍に単剤で有効な免疫応答を媒介するＴＩＬを強力に活性化できる「Ｓｗｉｔｃｈ－２」を設計および開発するための合理的なタンパク質エンジニアリングアプローチを示した。
【産業上の利用可能性】
【0190】
実用的な可能性は、ＩＬ－２のｐＨ応答性を治療に利用できることにある。Ｓｗｉｔｃｈ－２は細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を強力に活性化し、強力な抗腫瘍免疫応答をもたらすが、毒性はわずかであり、現在のＩＬ－２療法を革新する可能性がある。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【図1K】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4I】
【図4J】
【図4K】
【図4L】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】