特表 2024-527631 Ｂ７－Ｈ３抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-25

(54)【発明の名称】Ｂ７－Ｈ３抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240718BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240718BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240718BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240718BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C07K16/18

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 E

A61K39/395 T

C07K16/28 ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024504010

(86)(22)【出願日】2022-07-19

(85)【翻訳文提出日】2024-01-22

(86)【国際出願番号】 CN2022106546

(87)【国際公開番号】W WO2023001154

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】202110817833.7

(32)【優先日】2021-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520262652

【氏名又は名称】▲広▼州▲愛▼思▲邁▼生物医▲薬▼科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】張文軍

(72)【発明者】

【氏名】劉敏

(72)【発明者】

【氏名】田文武

(72)【発明者】

【氏名】李峰

(72)【発明者】

【氏名】華亜南

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB41

4C085BB42

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4H045AA11

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本願は、Ｂ７－Ｈ３抗体およびその使用を提供する。前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６～８に示すアミノ酸配列を含み、前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む。前記Ｂ７－Ｈ３抗体は、Ｂ７－Ｈ３抗原およびＢ７－Ｈ３抗原を発現する細胞に高親和性に結合し、ＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷を効率的に媒介することができる。前記Ｂ７－Ｈ３抗体を用いてＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体を構築し、前記二重特異性抗体は、高親和性と安定性を有し、ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷を効果的に媒介することができる。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ７－Ｈ３抗体であって、
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６～８に示すアミノ酸配列を含み
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とするＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項2】

前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すアミノ酸配列を含み、
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする請求項１に記載のＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項3】

請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体から変異処理によって調製される
ことを特徴とする親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項4】

前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体は、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～２５のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６～３７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８～４８のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、
前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする請求項３に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項5】

前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含み、
前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖のフレームワーク領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～５に示すアミノ酸配列を含む
請求項３または４に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項6】

２つの重鎖と２つの軽鎖を含み、
前記重鎖は、請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体の重鎖または請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖と、抗ＣＤ３の重鎖とを含み、
前記軽鎖は、請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖または請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の軽鎖とを含み、
前記重鎖は、ジスルフィド結合によって前記軽鎖に結合しており、
前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖は、ジスルフィド結合によって前記抗ＣＤ３の重鎖に結合している
ことを特徴とするバイスペシフィック抗体。

【請求項7】

前記抗ＣＤ３の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９に示すアミノ酸配列を含み、
前記抗ＣＤ３の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする請求項６に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項8】

前記バイスペシフィック抗体は、Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ヘテロ二量体のＦｃ領域とを含み、
前記Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、前記抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、
前記ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、前記抗ＣＤ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、
前記ヘテロ二量体のＦｃ領域は、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントと、抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントとを含む
ことを特徴とする請求項６または７に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項9】

前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントは、ヒトＦｃフラグメントまたはヒト化Ｆｃフラグメントを含む
ことを特徴とする請求項８に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項10】

前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄの変異、Ｐ３９５Ｄの変異、Ｐ３９６Ｄの変異を含む
ことを特徴とする請求項８または９に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項11】

前記抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋの変異、Ｐ３９６Ｋの変異、Ｖ３９７Ｋの変異を含む
ことを特徴とする請求項８～１０のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項12】

前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ２は、Ｌ２３４Ａの変異、Ｌ２３５Ａの変異、Ｐ３２９Ｇの変異を含む
ことを特徴とする請求項８～１１のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項13】

Ｂ１）： （ｂ１）請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ２）請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ３）請求項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体、のいずれか１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、または前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、
Ｂ２）： Ｂ１）の核酸分子を含む発現カセット、
Ｂ３）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換えベクター、またはＢ２）の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｂ４）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換え微生物、Ｂ２）の発現カセットを含む組換え微生物、またはＢ３）の組換えベクターを含む組換え微生物、
Ｂ５）： Ｂ１）の核酸分子を含む細胞株、Ｂ２）の発現カセットを含む細胞株、またはＢ３）の組換えベクターを含む細胞株、
Ｂ６）： 前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子、または前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子
の前記Ｂ１）～Ｂ６）のいずれか１つである
ことを特徴とする生物材料。

【請求項14】

請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、または請求項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体のいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む
ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項15】

神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む腫瘍に対する
請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、請求項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体、または請求項１４に記載の医薬組成物の抗腫瘍薬剤の調製における使用。

【請求項16】

好ましくは、神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む
腫瘍を治療するための、請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、請求項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体、または請求項１４に記載の医薬組成物の使用。

【請求項17】

腫瘍関連疾患の治療方法であって、
腫瘍関連疾患の治療方法を必要とする被験者に請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、請求項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体、または請求項１４に記載の医薬組成物を投与し、
好ましくは、前記腫瘍関連疾患は、神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む
ことを特徴とする腫瘍関連疾患の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、腫瘍の治療および分子免疫学の技術分野に属し、Ｂ７－Ｈ３抗体およびその使用に関する。

【0002】

関係出願の相互参照
本開示は、２０２１年０７月２０日に中国専利局に提出された出願番号がＣＮ２０２１１０８１７８３３．７であり、名称が「Ｂ７－Ｈ３抗体およびその使用」である中国出願に基づいて優先権を主張し、その全ての内容は、参照として本開示に取り込まれる。

【背景技術】

【0003】

Ｂ７－Ｈ３（Ｂ７ ｈｏｍｏｌｏｇ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＤ２７６とも呼ばれる）は、Ｂ７／ＣＤ２８免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、１回膜貫通構造を有する蛋白質であり（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ Ｐ、 Ｍａｊｄｉｃ Ｏ、 Ｄｅｒｄａｋ Ｓ Ｖ、 ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ４Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３、 ａ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ７ Ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ Ｆｏｕｒ Ｉｇ－Ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ２００４、 １７２（４）：２３５２－２３５９．を参照）、３１６アミノ酸からなり、アミノ末端にシグナルペプチドを持ち、細胞外領域にある免疫グロブリン様可変部領域（ＩｇＶ）と、定常部領域（ＩｇＣ）と、膜貫通領域と、４５アミノ酸からなる細胞質領域とを含む。また、Ｂ７－Ｈ３は、単球や樹状細胞、活性化されたＴ細胞で発現している。

【0004】

現在、Ｂ７－Ｈ３の受容体は、まだ特定されていないが、骨髄細胞で発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ）ファミリーに属するタイプＩ膜貫通型タンパク質のＴＬＴ－２であると報告されている（Ｋｉｎｇ Ｒ Ｇ、 Ｈｅｒｒｉｎ Ｂ Ｒ、 Ｊｕｓｔｅｍｅｎｔ Ｌ Ｂ． Ｔｒｅｍ－ｌｉｋｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ２ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｅｌｏｉｄ／ｇｒａｎｕｌｏｉｄ ａｎｄ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｉｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ２００６、 １７６（１０）：６０１２－６０２１．を参照）。ＴＲＥＭファミリーは、細胞応答を調節する機能を持ち、自然免疫と獲得免疫において機能する（Ｋｌｅｓｎｅｙ－Ｔａｉｔ Ｊ、 Ｔｕｒｎｂｕｌｌ Ｉ Ｒ、 Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ． Ｔｈｅ ＴＲＥＭ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ２００６、 ７（１２）：１２６６を参照）。ＴＬＴ－２タンパク質は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に構造的に発現しており、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化によって発現が誘導される。

【0005】

Ｂ７－Ｈ３は、部分的な共刺激機能を持つＴ細胞の共抑制分子であり、抗ＣＤ３抗体が存在する場合に、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増殖を促進し、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の生成を選択的に刺激することができる。ＴＬＴ－２は、Ｔ細胞に移行すると、Ｂ７－Ｈ３との相互作用によりインターロイキン（ＩＬ）－２やＩＦＮ－γの生成を促進し、Ｂ７－Ｈ３との相互作用を阻害することによってＣＤ８＋Ｔ細胞が介在する過敏症反応を制御することができる。一方、ヒト実験やマウス実験では、Ｂ７－Ｈ３は、共抑制作用を有し、Ｔｒｅｇ細胞を抑制することで腫瘍を免疫から逃避させたり、組織培養におけるＮＫ細胞の活性を抑制することでＮＫ細胞の機能を低下させることが証明されている。

【0006】

Ｂ７－Ｈ３は、正常組織では発現量が低いが、様々ながん、特に非小細胞性肺がん、腎臓がん、尿路上皮がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、多形膠芽腫、卵巣がん、膵臓がんでは過剰発現している。Ｂ７－Ｈ３は、Ｔ細胞に対する抑制作用を通して腫瘍の免疫逃避に重要な役割を果たしており、腫瘍進行やがん細胞の転移を促進することが既に証明された。なお、Ｂ７－Ｈ３は、がん細胞だけでなく、腫瘍や周辺の血管にも発現している。さらに、Ｂ７－Ｈ３は、自己免疫疾患にも関連しており、リウマチやその他の自己免疫疾患において、線維芽細胞様滑膜細胞と活性化されたＴ細胞との相互作用に重要な役割を果たしている（Ｔｒａｎ Ｃ Ｎ、 Ｔｈａｃｋｅｒ Ｓ Ｇ、 Ｌｏｕｉｅ Ｄ Ｍ、 ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－Ｌｉｋｅ Ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ： Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ７ Ｆａｍｉｌｙ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｂ７－Ｈ３［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ２００８、 １８０（５）：２９８９－２９９８．を参照）。そして、Ｂ７－Ｈ３は、マクロファージがサイトカインを放出する際に共刺激因子として作用するため、敗血症の発症に関与している。

【0007】

現在、免疫療法やがん治療の分野において、新規Ｂ７－Ｈ３抗体の開発が求められている。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、Ｂ７－Ｈ３抗体を提供し、前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６～８に示すアミノ酸配列を含み、前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すアミノ酸配列を含み、前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む。

【0010】

本開示は、親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体をさらに提供し、前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体は、前記Ｂ７－Ｈ３抗体から変異処理によって調製される。

【0011】

いくつかの実施形態において、前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体は、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～２５のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６～３７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８～４８のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含み、前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖のフレームワーク領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～５に示すアミノ酸配列を含む。

【0013】

本開示は、バイスペシフィック抗体をさらに提供し、前記バイスペシフィック抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖を含み、前記重鎖は、前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖または上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖と、抗ＣＤ３の重鎖とを含み、前記軽鎖は、前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖または上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の軽鎖とを含み、前記重鎖は、ジスルフィド結合によって前記軽鎖に結合しており、前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖は、ジスルフィド結合によって前記抗ＣＤ３の重鎖に結合している。

【0014】

いくつかの実施形態において、前記抗ＣＤ３の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９に示すアミノ酸配列を含み、前記抗ＣＤ３の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、前記バイスペシフィック抗体は、Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ヘテロ二量体のＦｃ領域とを含み、前記Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、前記抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、前記ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、前記抗ＣＤ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、前記ヘテロ二量体のＦｃ領域は、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントと、抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントとを含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントは、ヒトＦｃフラグメントまたはヒト化Ｆｃフラグメントを含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄの変異、Ｐ３９５Ｄの変異、Ｐ３９６Ｄの変異を含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、前記抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋの変異、Ｐ３９６Ｋの変異、Ｖ３９７Ｋの変異を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ２は、Ｌ２３４Ａの変異、Ｌ２３５Ａの変異、Ｐ３２９Ｇの変異を含む。

【0020】

本開示は、生物材料をさらに提供し、前記生物材料は、Ｂ１）： （ｂ１）上記のＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ２）上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ３）上記のいずれか一項のバイスペシフィック抗体、のいずれか１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、または上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、Ｂ２）： Ｂ１）の核酸分子を含む発現カセット、Ｂ３）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換えベクター、またはＢ２）の発現カセットを含む組換えベクター、Ｂ４）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換え微生物、Ｂ２）の発現カセットを含む組換え微生物、またはＢ３）の組換えベクターを含む組換え微生物、Ｂ５）： Ｂ１）の核酸分子を含む細胞株、Ｂ２）の発現カセットを含む細胞株、またはＢ３）の組換えベクターを含む細胞株、Ｂ６）： 上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体、の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子、または上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子、のいずれか１つである。

【0021】

本開示は、医薬組成物をさらに提供し、前記医薬組成物は、前記Ｂ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、または上記のバイスペシフィック抗体のいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む。

【0022】

本開示は、前記Ｂ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項のバイスペシフィック抗体、または前記医薬組成物の抗腫瘍薬剤の調製における使用をさらに提供する。

【0023】

前記腫瘍は、神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む。

【0024】

本開示は、腫瘍を治療するための、前記Ｂ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項のバイスペシフィック抗体、または前記医薬組成物の使用をさらに提供する。

【0025】

いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む。

【0026】

本開示は、腫瘍関連疾患の治療方法をさらに提供し、前記腫瘍関連疾患の治療方法を必要とする被験者に、前記Ｂ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項のバイスペシフィック抗体、または前記医薬組成物を投与する。

【0027】

いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】ＥＬＩＳＡ法による５Ｄ９のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2A】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（４４Ｆ２、４３Ｇ１１、４６Ｈ７、４５Ｂ１１）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2B】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（４３Ｄ４、４２Ｆ７、４５Ｆ４）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2C】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（４６Ｈ９、４７Ｈ４、４６Ｄ４、４３Ｇ５）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2D】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（４４Ｃ５、４２Ａ１、４７Ｃ８）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2E】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（４８Ｅ９、４９Ｃ３、４９Ｃ８、４９Ｅ１）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2F】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（４９Ｆ６、５０Ａ１、５０Ｅ３、４９Ｈ５）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2G】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（５０Ｂ１０、４８Ｇ２、４９Ｄ１２、４８Ｄ１０）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2H】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（４８Ａ６、４８Ｂ１２、４９Ｂ２、４９Ｃ７）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図2I】ＥＬＩＳＡ法による親和性成熟バリアント（５０Ａ４、５０Ａ６、５０Ａ１１）のＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の検出図である。

【図3A】ＦＡＣＳによる親和性成熟バリアント（４４Ｆ２、４３Ｇ１１）のＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を過剰発現する細胞に対する結合活性の検出図である。

【図3B】ＦＡＣＳによる親和性成熟バリアント（４５Ｂ１１、４３Ｄ４、４６Ｈ７）のＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を過剰発現する細胞に対する結合活性の検出図である。

【図3C】ＦＡＣＳによる親和性成熟バリアント（４３Ｇ５、４２Ｆ７、４５Ｆ４）のＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を過剰発現する細胞に対する結合活性の検出図である。

【図3D】ＦＡＣＳによる親和性成熟バリアント（４６Ｈ９、４７Ｈ４、４６Ｄ４）のＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を過剰発現する細胞に対する結合活性の検出図である。

【図3E】ＦＡＣＳによる親和性成熟バリアント（４４Ｃ５、４２Ａ１、４７Ｃ８）のＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を過剰発現する細胞に対する結合活性の検出図である。

【図4A】親和性成熟バリアント（４４Ｆ２、４３Ｇ１１、４６Ｈ７、４５Ｂ１１、４３Ｄ４、４２Ｆ７、４５Ｆ４、４６Ｈ９）が媒介するＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷効果を示す図である。

【図4B】親和性成熟バリアント（４６Ｄ４、４７Ｈ４、４８Ｅ９、４９Ｃ３、４９Ｅ１、５０Ａ１、５０Ａ６、５Ｄ９）が媒介するＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷効果を示す図である。

【図5】Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の構造の模式図である。

【図6】Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の結合活性を示す図である。

【図7】Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体によるＴ細胞活性化の効果図である。

【図8A】Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体（４９Ｅ１×ＣＤ３、４２Ｆ７×ＣＤ３、４３Ｇ１１×ＣＤ３、８Ｈ９×ＣＤ３、４６Ｈ７×ＣＤ３）が媒介するＰＢＭＣによるＮＣＩ－Ｎ８７細胞の殺傷効果を示す図である。

【図8B】Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体（４２Ｆ７×ＣＤ３、４３Ｇ１１×ＣＤ３、４９Ｅ１×ＣＤ３、８Ｈ９×ＣＤ３、４６Ｈ７×ＣＤ３）が媒介するＰＢＭＣによるＡ４９８細胞の殺傷効果を示す図である。

【図8C】Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体（４２Ｆ７×ＣＤ３、４３Ｇ１１×ＣＤ３、４９Ｅ１×ＣＤ３、８Ｈ９×ＣＤ３、４６Ｈ７×ＣＤ３）が媒介するＰＢＭＣによるＨｅｐＧ２細胞の殺傷効果を示す図である。

【図9A】４６Ｈ７×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の安定性試験結果図である。

【図9B】４３Ｇ１１×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の安定性試験結果図である。

【図9C】４９Ｅ１×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の安定性試験結果図である。

【図9D】４２Ｆ７×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の安定性試験結果図である。

【図10】Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体のマウスインビボでの抗腫瘍効果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下、本開示において用いられる技術的手段およびその効果をさらに詳しく説明するために、実施形態、実施例並びに図面を参照しながら本開示をさらに説明する。また、ここで説明される実施形態は、本開示を説明するためのものに過ぎず、本開示を限定しない。

【0030】

実施形態および実施例において具体的な技術または条件が示されていない場合、当該分野の文献に記載された技術または条件、あるいは製品仕様書にしたがって実施する。使用される試薬または機器について製造メーカが示されていない場合、いずれも通常のルートで市販されている従来の製品である。

【0031】

別段の定義のない限り、本開示に関連して用いられている科学用語および技術用語ならびにそれらの略語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとし、本開示で使用される用語および略語の一部を以下に列挙する。

【0032】

抗体：ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂ
免疫グロブリン：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ
重鎖：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＨＣ
軽鎖：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＬＣ
重鎖可変領域：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ、ＶＨ
重鎖定常領域：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ、ＣＨ
軽鎖可変領域：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ、ＶＬ
軽鎖定常領域：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ、ＣＬ
抗原結合領域：ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｆａｂ
ヒンジ領域：ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ
Ｆｃフラグメント：ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ
モノクローナル抗体：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｍＡｂｓ
抗体依存性細胞傷害：ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ
補体依存性細胞傷害：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ
ナチュラルキラー細胞：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＮＫ細胞
バイスペシフィック抗体：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｓＡｂ
Ｔ細胞受容体：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ
主要組織適合性遺伝子複合体：ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ
相補性決定領域：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ、抗体の抗原相補結合領域
免疫受容体チロシン活性化モチーフ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ
単鎖可変領域フラグメント（一本鎖抗体とも呼ばれる）：ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ
養子免疫療法：ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、ＡＣＩ
リンホカイン活性化キラー細胞：ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＬＡＫ細胞
腫瘍浸潤リンパ球：Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ細胞
サイトカイン誘導キラー細胞：ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＣＩＫ細胞

【0033】

本開示に記載された分子クローニング、細胞培養、タンパク質精製、免疫学的実験、微生物学的実験、動物モデルの実験などの操作ステップは、当該分野で広く用いられている従来のステップである。文脈により特に断りのない限り、本開示の単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。特に断りのない限り、本開示に記載されたヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端方向へと左から右に配列され、書かれている。特に断りのない限り、本開示に記載されたアミノ酸配列は、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）方向へと左から右に配列され、書かれている。本開示に言及されたアミノ酸の３文字略号およびヌクレオチドの１文字略号は、当該技術分野で一般に認められた形式であり、アミノ酸の１文字略号は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される形式である。

【0034】

「アミノ酸」という用語は、２０種の天然アミノ酸のうちの１種または特定の所定の位置に存在し得る任意の非天然類似体のことを意味する。本開示に記載された「アミノ酸変異」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、欠失、および修飾、並びに、アミノ酸置換、挿入、欠失、および修飾の任意の組み合わせを意味する。本願明細書において好ましいアミノ酸修飾は置換である。本開示において、「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸に置き換えることを意味する。例えば、置換Ｃ２２０Ｓとは、ポリペプチドの２２０位のシステインがセリンに置換された変異体ポリペプチドを意味する。アミノ酸変異は、ＰＣＲ、部位特異的変異、全遺伝子合成などを含む分子クローニングまたは化学的手法によって実現可能である。

【0035】

「タンパク質」、「ペプチド鎖」、「ポリペプチド鎖」という用語は、天然タンパク質、人工タンパク質、タンパク質断片、変異タンパク質、融合タンパク質などを含む、２つ以上のアミノ酸がペプチド結合で連結された分子を意味する。

【0036】

「ドメイン」という用語は、生体高分子中の独立した機能を持った特異的構造領域を意味する。ドメインは、独立した三次構造を有し、その機能が生体高分子中の他の部分に依存しない。本開示において、ドメインは、重鎖可変領域ＶＨドメイン、軽鎖可変領域ＶＬドメインのようなタンパク質中の領域を指し、ドメイン同士が互いに結合して大きなドメインを形成することができる。

【0037】

「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原認識部位を含み、抗原を特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。ここで、「抗原」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ハプテン、またはこれらの組み合わせなどの生体内で免疫応答を誘発し、抗体に特異的に結合することができる物質を意味する。抗体と抗原の結合は、水素結合、ファンデルワールス力、イオン結合、疎水的結合を含む両者間の相互作用によって媒介される。抗原表面の抗体に結合する領域は、「抗原決定基」または「エピトープ」である。一般的に、抗原ごとに複数の決定基が存在する。本開示に言及された「抗体」という用語は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、少なくとも２つの異なるエピトープ結合ドメインを含むマルチスペシフィック抗体（例えば、バイスペシフィック抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、翻訳後修飾抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、抗体の抗原決定基を含む融合タンパク質、および、抗原認識部位を含む他の任意の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン分子の免疫活性フラグメントを含み、すなわち、少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子を含む。

【0038】

「バイスペシフィック抗体」という用語は、２つの異なる抗原結合部位に同時に結合すことができる、２つの異なる抗原結合部位を含有する抗体を意味する。

【0039】

「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ領域」、「Ｆａｂフラグメント」、「Ｆａｂ分子」という用語は、抗原結合フラグメントを意味し、免疫グロブリンの重鎖のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、並びに、軽鎖のＶＬドメイン、ＣＬドメインを含む。重鎖の第１定常領域ドメインＣＨ１が軽鎖の定常領域ドメインＣＬに結合し、重鎖の可変領域ドメインＶＨが軽鎖の可変領域ドメインＶＬに結合する。

【0040】

「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」、「Ｆｃ分子」という用語は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、サイトカインの放出などを引き起こすことができる抗体のエフェクター領域を意味する。天然の抗体Ｆｃは通常、２つまたは３つの免疫グロブリンの定常領域ドメインを含む２つの同一蛋白フラグメントが結合して形成する。本開示において、上記Ｆｃは、天然型Ｆｃおよび変異体Ｆｃを含む。Ｆｃ領域の境界はさまざまでありうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、位置Ｃ２２６またはＰ２３０から、そのカルボキシ末端までの残基を含むと定められている。実験条件下では、免疫グロブリンモノマーがパパイヤプロテアーゼによって切断され生成されたフラグメントは、それぞれＦａｂとＦｃである。抗体の「ヒンジ」または「ヒンジ領域」とは、抗体の第１と第２の定常ドメイン（ＣＨ１とＣＨ２）との間のアミノ酸を含む柔軟なポリペプチドを意味する。

【0041】

特に断りのない限り、本開示に記載された抗体の可変領域のアミノ酸の番号付けには、Ｋａｂａｔらが１９９１年に発表したコード方法、すなわち「Ｋａｂａｔインデクス」または「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」（Ｋａｂａｔ、 Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、 ５ｔｈ ｅｄ．、 ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 ＭＤ．：１９９１）を使用する。特に断りのない限り、本開示に記載された抗体の定常領域のアミノ酸の番号付けには、ＥＵインデクス（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭ、 ｅｔ．ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９６９、６３：７８－８５．）を使用する。

【0042】

「抗原結合部位」という用語は、抗原結合分子の抗原と直接相互作用する１つまたは複数のアミノ酸残基を意味する。抗体の抗原結合部位は、抗原の相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる。天然の免疫グロブリン分子は通常、２つの抗原結合部位を含み、Ｆａｂ分子は通常、１つの抗原結合部位を含む。

【0043】

「Ｔ細胞活性化」という用語は、Ｔリンパ球、特にキラーＴ細胞の、増殖、分化、サイトカインの放出、エフェクターキラー分子の分泌、細胞殺傷などの１つまたは複数の免疫反応を意味する。

【0044】

「ＥＣ_５０」という用語は、つまり半数効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）のことで、抗体が最大反応の５０％を示す濃度を意味する。

【0045】

本開示で使用される「特異的結合」とは、抗体とそれに対応する抗原との反応のような、異なる分子の非ランダムな結合を意味する。いくつかの実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（またはある抗原に特異的な抗体）とは、抗体が約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、またはそれ以下の親和性（ＫＤ）でこの抗原に結合することを意味する。本開示のいくつかの実施形態において、「標的」という用語は、特異的結合を意味する。

【0046】

本開示で使用される「ＫＤ」とは、特定の抗体と抗原との相互作用の平衡解離定数を意味し、抗原に対する抗体の結合親和性を表す。平衡解離定数が小さいほど、抗体と抗原の結合が強固であり、抗体と抗原の親和性が高い。通常、抗体は、約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、またはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原に結合する。

【0047】

「単鎖可変領域フラグメント」または「ｓｃＦｖ」という用語は、免疫グロブリンの重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬの融合タンパク質を意味し、ＶＨまたはＶＬのＮ末端の異なる組み合わせを含み、組換えタンパク質を構築するための従来の分子クローニング法で調製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＪＦ、 Ｅ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ４ｔｈ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ２０１２）。

【0048】

「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲの一部または全部を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲで置換して得られる抗体または抗体フラグメントを意味する。ただし、ドナー抗体は、期待される特異性、親和性、反応性を有する非ヒト（マウス、ラット、ウサギなど）抗体であってもよい。なお、受容体抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸残基も、抗体の１つまたは複数の特性をさらに改善または最適化するために、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基または他の抗体のアミノ酸残基で置換されてもよい。

【0049】

「宿主細胞」という用語は、外因性核酸が導入された細胞およびその子孫を意味し、ポリペプチドをコードするヌクレオチドで形質転換又はトランスフェクションすることで、外因性ポリペプチドを発現することができる。本開示に記載された宿主細胞は、ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ、チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＨＥＫ２９３細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ ２９３、ヒト胎児腎細胞２９３）、ＢＨＫ細胞（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ、ベビーハムスター腎臓細胞）、骨髄腫細胞、酵母、昆虫細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような原核細胞などを含むがこれらに限定されない。また、本開示に記載された「宿主細胞」は、外因性核酸が導入された細胞だけでなく、その細胞の子孫も含む。細胞分裂中の子孫細胞に変異が起こるが、本開示に記載された用語の範囲に属する。

【0050】

本願明細書で使用される「有効量」とは、研究者、獣医、医師又は他の臨床医が求めている組織、系、動物、植物、原生動物、細菌、酵母またはヒトの所望の生物学的又は医学的応答を誘発する、本願明細書に記載された組成物または製剤の量を意味することができる。

【0051】

本願明細書で使用される「被験者」という用語は、脊椎動物、任意で哺乳動物、任意でヒトを意味する。哺乳動物は、齧歯類、ヒト上科、ヒト、家畜類、競技用動物、およびペット動物を含むがこれらに限定されない。生体内で得られた、または体外で培養された生物学的実体の組織、細胞、およびそれらの子孫も含まれる。

【0052】

本願明細書で使用される用語は、実施形態や実施例などの本開示の文脈を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。

【0053】

本開示のいくつかの実施形態は、Ｂ７－Ｈ３抗体を提供し、上記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖相補性決定領域（ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６～８に示すアミノ酸配列を含み、上記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域（ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む。

【0054】

本開示に係るＢ７－Ｈ３抗体は、Ｂ７－Ｈ３抗原に高親和性に結合し、Ｔ細胞を活性化することができるため、免疫療法とがん治療の分野において重要な使用価値を有する。

【0055】

いくつかの実施形態において、上記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、上記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む。

【0057】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＬＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＶＶＡＴＳＧＶＮＦＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６（ＶＨ－ＣＤＲ１）：ＧＧＴＦＳＮＹＡ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７（ＶＨ－ＣＤＲ２）：ＩＩＰＬＦＧＴＡ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８（ＶＨ－ＣＤＲ３）：ＡＲＤＱＶＶＡＴＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９：
ＤＩＱＭＴＱＥＰＳＬＴＴＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＧＫＡＡＬＴＩＴＧＶＱＰＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４（ＶＬ－ＣＤＲ１）：ＴＧＡＶＴＴＳＮＹ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５（ＶＬ－ＣＤＲ２）：ＧＴＮ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６（ＶＬ－ＣＤＲ３）：ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ

【0058】

本開示のいくつかの実施形態は、上記のＢ７－Ｈ３抗体をコードするＤＮＡフラグメントをさらに提供する。

【0059】

いくつかの実施形態において、Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０に示すヌクレオチド配列を有し、Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１に示すヌクレオチド配列を有する。

【0060】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０：
ｇａｔａｔｔｃａｇａｔｇａｃａｃａａｇａａｃｃａａｇｔｃｔｃａｃｔａｃａａｇｃｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｃｇｔｔａｃａｃｔｇａｃｃｔｇｔｃｇｃｔｃｔｔｃｃａｃｔｇｇｃｇｃｃｇｔｇａｃｃａｃｔｔｃｃａａｃｔａｔｇｃａａａｃｔｇｇｇｔｇｃａｇｇａｇａａａｃｃｔｇｇａｃａｇｇｃｔｃｃｔａｇａｇｇｔｃｔｇａｔｔｇｇａｇｇｃａｃｔａａｃａａｇａｇａｇｃｔｃｃａｇｇｇａｃｔｃｃｔｇｃｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇａｔｃｔｃｔｇａｔｃｇｇｔｇｇｇａａｇｇｃａｇｃｔｃｔｇａｃａａｔｃａｃｔｇｇａｇｔｇｃａａｃｃｃｇａｇｇａｔｇａｇｇｃｔａｔｃｔａｃｔｔｃｔｇｔｇｃｔｃｔｃｔｇｇｔａｃｔｃａａａｔｃｔｇｔｇｇｇｔｇｔｔｃｇｇａｇｇｔｇｇａａｃａａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃａａｇ

【0061】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１：
ｃａｇｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇｇｇｃｔｇａｇｇｔｇａａｇａａｇｃｃｔｇｇｇｔｃｃｔｃｇｇｔｇａａｇｇｔｃｔｃｃｔｇｃａａｇｇｃｔｔｃｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｃａｇｃａａｃｔａｔｇｃｔａｔｃａａｃｔｇｇｇｔｇｃｇａｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇａｃａａｇｇｇｃｔｔｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇａｇｇｇａｔｃａｔｃｃｃｔｃｔｃｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａａａｃｔａｃｇｃａｃａｇａａｇｔｔｃｃａｇｇｇｃａｇａｇｔｃａｃｇａｔｔａｃｃｇｃｇｇａｃｇａａｔｃｃａｃｇａｇｃａｃａｇｃｃｔａｃａｔｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃｃｔｇａｇａｔｃｔｇａｃｇａｃａｃｇｇｃｃｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａｃｃａｇｇｔａｇｔｇｇｃａａｃｇａｇｔｇｇｃｇｔｃａａｃｔｔｃｇｇｔａｔｇｇａｃｇｔｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｇａｃｃａｃｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａ

【0062】

本開示のいくつかの実施形態は、発現ベクターをさらに提供し、上記発現ベクターは、上記のようなＤＮＡフラグメントのコピーを少なくとも１つ含む。

【0063】

本開示のいくつかの実施形態は、宿主細胞をさらに提供し、上記宿主細胞は、上記のような発現ベクターを含む。

【0064】

本開示のいくつかの実施形態は、親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体をさらに提供し、上記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体は、上記のＢ７－Ｈ３抗体から変異処理によって調製される。

【0065】

いくつかの実施形態において、変異処理は、Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域へのランダム変異を含む。理論に束縛されるものではないが、本開示に係る変異処理は、Ｂ７－Ｈ３抗体の親和性をさらに向上させることができる。

【0066】

いくつかの実施形態において、上記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体は、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～２５のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６～３７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８～４８のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む。

【0067】

いくつかの実施形態において、上記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む。

【0068】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７：ＧＧＴＬＲＰＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８：ＧＧＴＳＧＶＡＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９：ＧＧＴＲＰＡＡＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０：ＧＧＴＶＲＰＡＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１：ＧＧＴＧＧＩＹＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２：ＧＧＴＧＧＡＹＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３：ＧＧＴＳＲＰＶＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４：ＧＧＴＲＰＰＡＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５：ＧＧＴＴＧＲＹＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６：ＩＩＰＧＦＹＳＬ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２７：ＩＩＰＭＷＱＳＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８：ＩＩＰＬＦＲＳＳ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９：ＩＩＰＲＦＧＧＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０：ＩＩＰＮＦＥＳＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１：ＩＩＰＫＦＲＳＱ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２：ＩＩＰＶＦＲＳＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３：ＩＩＰＧＦＤＡＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４：ＩＩＰＤＦＮＳＡ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５：ＩＩＰＲＦＡＳＲ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６：ＩＩＰＮＦＨＳＳ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７：ＩＩＰＮＦＹＳＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８：ＡＲＤＲＦＴＰＲＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９：ＡＲＤＲＥＡＲＥＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０：ＡＲＤＦＤＡＰＧＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１：ＡＲＤＶＶＶＰＲＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２：ＡＲＤＩＥＶＭＡＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３：ＡＲＤＱＶＶＰＬＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４：ＡＲＤＶＮＮＰＧＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４５：ＡＲＤＶＥＶＦＮＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４６：ＡＲＤＥＶＶＶＧＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４７：ＡＲＤＡＶＶＰＮＳＧＶＮＦＧＭＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４８：ＡＲＤＱＶＶＰＲＳＧＶＮＦＧＭＤＶ

【0069】

いくつかの実施形態において、上記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、上記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖のフレームワーク領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～５に示すアミノ酸配列を含む。

【0071】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：ＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４：ＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５：ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

【0072】

いくつかの実施形態において、親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖のフレームワーク領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０～１３に示すアミノ酸配列を含む。

【0073】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０：ＤＩＱＭＴＱＥＰＳＬＴＴＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１：ＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２：ＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＧＫＡＡＬＴＩＴＧＶＱＰＥＤＥＡＩＹＦＣ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３：ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ

【0074】

理論に束縛されるものではないが、本開示に係る上記のＢ７－Ｈ３抗体と上記の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体は、以下の特性を有する。
ａ．ヒトＢ７－Ｈ３抗原に特異的に結合する。
ｂ．ヒトＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を過剰発現する細胞に特異的に結合する。
ｃ．ＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷を媒介する。

【0075】

本開示のいくつかの実施形態は、２つの重鎖と２つの軽鎖を含むバイスペシフィック抗体をさらに提供し、重鎖が抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖と抗ＣＤ３の重鎖とを含み、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖が上記のＢ７－Ｈ３抗体の重鎖または上記の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖を含み、軽鎖が抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と抗ＣＤ３の軽鎖とを含み、抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖が上記のＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖または上記の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖を含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、上記重鎖は、ジスルフィド結合によって上記軽鎖に結合している。

【0077】

いくつかの実施形態において、上記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖は、ジスルフィド結合によって上記抗ＣＤ３の重鎖に結合している。

【0078】

いくつかの実施形態において、上記抗ＣＤ３の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９に示すアミノ酸配列を含む。

【0079】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＴＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0080】

上記抗ＣＤ３の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む。

【0081】

図５は、バイスペシフィック抗体の構造を示す。いくつかの実施形態において、バイスペシフィック抗体は、Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ヘテロ二量体のＦｃ領域とを含む。上記Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、上記抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、Ｂ７－Ｈ３抗原に特異的に結合する特性を有する。上記ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、上記抗ＣＤ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、免疫細胞の表面抗原であるＣＤ３に特異的に結合する特性を有する。上記ヘテロ二量体のＦｃ領域は、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントと、抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントとを含み、上記Ｆｃフラグメントが定常領域ＣＨ２とＣＨ３からなる。

【0082】

いくつかの実施形態において、上記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントは、ヒトＦｃフラグメントまたはヒト化Ｆｃフラグメントを含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、上記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、上記抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントは、ヒトＦｃフラグメントまたはヒト化Ｆｃフラグメントを含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、上記抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、上記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄの変異、Ｐ３９５Ｄの変異、Ｐ３９６Ｄの変異を含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、上記抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋの変異、Ｐ３９６Ｋの変異、Ｖ３９７Ｋの変異を含む。

【0088】

いくつかの実施形態において、上記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ２は、Ｌ２３４Ａの変異、Ｌ２３５Ａの変異、Ｐ３２９Ｇの変異を含む。

【0089】

本開示のいくつかの実施形態によるバイスペシフィック抗体は、以下の特性を有する。
ａ．Ｂ７－Ｈ３とＣＤ３に結合する。
ｂ．Ｔ細胞を活性化する。
ｃ．Ｔ細胞によるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷を媒介する。
ｄ．インビボでＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の成長を抑制する。

【0090】

本開示は、生物材料をさらに提供し、上記生物材料は、以下のＢ１）～Ｂ６）のうちのいずれか１つである。
Ｂ１）： （ｂ１）上記のＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ２）上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ３）上記のいずれか一項のバイスペシフィック抗体のいずれか１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、または上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの上記抗体の抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子
Ｂ２）： Ｂ１）の核酸分子を含む発現カセット
Ｂ３）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換えベクター、または、Ｂ２）の発現カセットを含む組換えベクター
Ｂ４）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換え微生物、Ｂ２）の発現カセットを含む組換え微生物、または、Ｂ３）の組換えベクターを含む組換え微生物
Ｂ５）： Ｂ１）の核酸分子を含む細胞株、Ｂ２）の発現カセットを含む細胞株、または、Ｂ３）における組換えベクターを含む細胞株
Ｂ６）： 上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子、または上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子

【0091】

本開示のいくつかの実施形態は、医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、上記のＢ７－Ｈ３抗体、上記の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、上記のバイスペシフィック抗体のいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む。

【0092】

いくつかの実施形態において、上記医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤のいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせをさらに含む。

【0093】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示に係る抗体または抗体フラグメント、バイスペシフィック抗体または抗体コンジュゲート、並びに任意の薬学的に許容される担体、界面活性剤および／または希釈剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本開示に係る抗体、バイスペシフィック抗体または抗体コンジュゲートに加えて、１つまたは複数の他の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記他の治療剤は、化学療法剤、成長抑制剤、細胞毒性剤、放射線療法に用いる製剤、血管新生阻害剤、アポトーシス剤、微小管阻害剤および癌の治療のための他の製剤を含むがこれらに限定されない。

【0094】

本開示のいくつかの実施形態は、上記のＢ７－Ｈ３抗体、上記の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、上記のバイスペシフィック抗体、上記の医薬組成物の抗腫瘍薬剤の調製における使用をさらに提供する。

【0095】

本開示のいくつかの実施形態は、上記Ｂ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項のバイスペシフィック抗体、上記医薬組成物の腫瘍の治療にける使用をさらに提供する。

【0096】

本開示のいくつかの実施形態は、腫瘍関連疾患の治療方法をさらに提供し、上記腫瘍関連疾患の治療方法を必要とする被験者に、上記Ｂ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、上記のいずれか一項のバイスペシフィック抗体、上記医薬組成物を投与する。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む。

【0097】

本開示は、高親和性にＢ７－Ｈ３抗原に結合するＢ７－Ｈ３抗体およびその使用を提供し、免疫療法とがん治療の分野において重要な使用価値を有し、従来技術の欠点を解決し、実際のニーズを満たす。

【0098】

（１）本開示に係るＢ７－Ｈ３抗体は、Ｂ７－Ｈ３抗原およびＢ７－Ｈ３抗原を発現する細胞に高親和性に結合し、ＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷を効率的に媒介することができる。
（２）本開示は、Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖相補性決定領域を変異させることにより、Ｂ７－Ｈ３抗体の親和性をさらに向上させる。
（３）本開示は、Ｂ７－Ｈ３抗体を用いてＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体を構築し、上記二重特異性抗体は、高親和性と安定性を有し、ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷を効果的に媒介することができるため、腫瘍増殖を有意に抑制する。

【0099】

本開示は、これらのポリペプチド鎖をコードする核酸配列をさらに含む。抗体を発現させる過程において、核酸配列を適切なベクターに挿入する。ベクターは、プラスミド、ファージベクター、コスミド、人工染色体、ファージ、および動物ウイルスを含むがこれらに限定されない。発現ベクターは、発現調節のためのエレメントを含み、プロモーター、転写開始配列、エンハンサー、シグナル配列などを含むがこれらに限定されない。プロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、β－ａｃｔｉｎプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＳＶ４０プロモーターを含むがこれらに限定されない。発現ベクターを宿主細胞に導入するには、該当技術分野で公知の適切な方法を用いてもよく、リン酸カルシウム共沈殿法、ポリエチレンイミントランスフェクション法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）トランスフェクション法を含むがこれらに限定されない。

【0100】

実施例
実施例１
本実施例は、Ｂ７－Ｈ３抗体を提供し、上記Ｂ７－Ｈ３抗体の調製方法は、以下のステップを含む。

【0101】

（１）ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｑ５ＺＰＲ３ （ＣＤ２７６＿ＨＵＭＡＮ）に由来する配列を有するＢ７－Ｈ３細胞外領域（２９－４６１）抗原を調製し、この抗原配列を真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－ＴＥＶ－ｃＦｃ－Ｈｉｓにクローニングし、ｈＢ７－Ｈ３－ＴＥＶ－ｃＦｃ－Ｈｉｓ組換え真核発現プラスミドを作製した。ＰＥＩトランスフェクション法により２９３Ｆ宿主細胞に遺伝子導入し、５日間培養後、細胞上清を回収し、上清をプロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）でアフィニティー精製してＢ７－Ｈ３－ ＴＥＶ－ｃＦｃ－Ｈｉｓ融合タンパク質を得た。そしてＴＥＶプロテアーゼにより切断し、ニッケルカラムによる精製を行った後、ヒトＢ７－Ｈ３抗原を得た。

【0102】

（２）ヒト末梢血を採取し、末梢血単核球を分離し、全ＲＮＡを抽出し、逆転写キットによりｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、Ｌｉｍ、 Ｔ． Ｓ． 、 ｅｔ ａｌ．（Ｌｉｍ Ｔ Ｓ、 Ｍｏｌｌｏｖａ Ｓ、 Ｒｕｂｅｌｔ Ｆ、 ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｓｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｏｔｙｐｅｓ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ２０１０、 ２７（２）：１０８－１１７．）を参照しながらＰＣＲ用の特異的プライマーを設計し、そのＶＨフラグメントをＰＣＲ増幅し、ヒトＶＨ遺伝子を得た。

【0103】

（３）本願発明者の公開された特許（ＣＮ１１０５５１２２１Ａ）におけるＣＤ３に結合した軽鎖配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９）を用いて、特異的プライマーを設計してＰＣＲ増幅し、ＣＤ３ ＶＬ遺伝子を得た。

【0104】

（４）上記ヒトＶＨ遺伝子とＣＤ３ ＶＬ遺伝子とから、Ｇ４Ｓ－ｌｉｎｋｅｒを介してオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によりｓｃＦｖライブラリーを作製し、ヒト－ＶＨ：ＣＤ３－ＶＬ抗体ライブラリーを構築した。ライブラリーをファージベクターにクローニングした後、宿主細胞（ＴＧ１ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ：Ｌｕｃｉｇｅｎ．）をエレクトロポレーションにより形質転換してヒト－ＶＨ：ＣＤ３－ＶＬ抗体ライブラリーファージライブラリーを得た。ファージライブラリーをヘルパーファージによりパッケージングし、ＰＥＧ沈殿法により沈殿させた。９６ウェルプレートに適量の組換えヒトＢ７－Ｈ３抗原を加えて一晩インキュベートし、ＰＢＳＴ（ＴＷＥＥＮ２０を含むリン酸塩緩衝液）で数回洗浄した後、ファージライブラリーを加えてふるい分けした。ふるいを重ねて濃縮された抗体陽性のクローンのシークエンスにより、５Ｄ９と命名されたＢ７－Ｈ３抗体を得た。表１は、抗体５Ｄ９の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を示す。

【0105】

【表1】

【0106】

実施例２
本実施例では、実施例１に記載された抗体５Ｄ９を発現、精製、検証した。

【0107】

本開示において、全ての抗体を２９３Ｆ細胞を用いて一過的に発現させ、抗体５Ｄ９の重鎖と軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ合成し、それを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。ＰＥＩトランスフェクション法により、抗体５Ｄ９の重鎖と軽鎖を発現したプラスミドを、２９３Ｆ細胞に遺伝子導入した。６日間培養後、細胞培養上清を遠心分離により回収し、その後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で上清液における抗体を精製した。

【0108】

本開示において、ポジティブコントロール抗体としてのエノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）の模倣物は、配列がＷＯ２０１１ＵＳ２６６８９に由来し、上記方法で発現、精製した。本開示において、ポジティブコントロール抗体としてのモノクローナル抗体８Ｈ９の模倣物は、配列がＷＯ２００３ＵＳ０７００４に由来し、また上記方法で発現、精製した。

【0109】

ＥＬＩＳＡ法によって５Ｄ９とＢ７－Ｈ３抗原との結合を検出した。ヒトＢ７－Ｈ３抗原を９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。抗体５Ｄ９およびコントロールサンプルを１０μｇ／ｍＬに希釈し、４倍の段階希釈を行って合計８濃度とし、抗原をコーティングしたウェルに添加してインキュベートした。洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を添加し、ＴＭＢ（３、３’、５、５’－テトラメチルベンジジン）により発色させた。マイクロプレートリーダーにより検出された波長が４５０ｎｍで、吸光度ＯＤ値を読み取り、サンプル濃度の対数をＸ軸、吸光度ＯＤ_４５０値をＹ軸とし、用量反応曲線をプロットし、ＥＣ_５０を算出した。ＥＣ_５０は、抗体のＢ７－Ｈ３抗原に結合する能力を表す。実験は、ネガティブコントロールＩｇＧ群、ポジティブコントロール抗体のエノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）の模倣物群を同時に設定し、その結果を図１に示す。

【0110】

図１に示すように、５Ｄ９とＢ７－Ｈ３抗原との結合が良好であり、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）の模倣物とＢ７－Ｈ３抗原との結合よりもわずかに弱い。

【0111】

実施例３
本実施例は、親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体を提供する。

【0112】

上記からわかるように、本開示によるＢ７－Ｈ３抗体５Ｄ９は、Ｂ７－Ｈ３抗原との結合活性がエノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）の模倣物よりもわずかに弱い。本実施例は、さらにＢ７－Ｈ３抗原に対して高親和性を有する抗体を得るために、抗体５Ｄ９の重鎖可変領域をインビトロで親和性成熟させることで、親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体を得る。その調製方法は以下のステップを含む。

【0113】

（１）親和性成熟ライブラリーの作製
５Ｄ９の重鎖相補性決定領域ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ３のトリプレットコドンの上流および下流のランダムプライマーをそれぞれ合成し、ＳＯＥ－ＰＣＲによって５Ｄ９の重鎖相補性決定領域のランダム変異ライブラリーを得た。そして、得られたランダム変異ライブラリーをファージベクターにクローニングし、宿主細胞（ＴＧ１ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ：Ｌｕｃｉｇｅｎ．）をエレクトロポレーションにより形質転換して、５Ｄ９の重鎖相補性決定領域ランダム変異のファージライブラリーを得た。

【0114】

（２）親和性成熟ライブラリーのふるい分け
上記の実施例の方法のように、ファージディスプレイにより親和性成熟による抗体を作製し、親和性成熟ライブラリーファージライブラリーをパッケージングし、３回ふるい分けした後、濃縮された抗体陽性のクローンのシークエンスにより、３３個の親和性成熟バリアントを得た。ただし、３３個の親和性成熟バリアントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を有し、重鎖のフレームワーク領域ＶＨ－ＦＲ１、ＶＨ－ＦＲ２、ＶＨ－ＦＲ３、ＶＨ－ＦＲ４がそれぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示すアミノ酸配列を有する。

【0115】

表２は、各バリアントの重鎖相補性決定領域ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３が有するアミノ酸配列を示す。

【0116】

【表2-1】

【0117】

【表2-2】

【0118】

実施例４
本実施例は、実施例３に記載された親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体を発現、精製した。

【0119】

実施例２に記載された方法にしたがい、実施例４で調製する各親和性成熟バリアントの重鎖と軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ合成し、それを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。ＰＥＩトランスフェクション法により、各親和性成熟バリアントの重鎖と軽鎖を発現したプラスミドを、２９３Ｆ細胞に遺伝子導入した。５～６日間培養後、細胞培養上清を遠心分離により回収し、その後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で上清液における抗体を精製した。抗親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体を計３３個得た。

【0120】

実施例５
本実施例は、実施例４で調製された各親和性成熟バリアントの機能検証を行った。

【0121】

（１）ＥＬＩＳＡ法による各親和性成熟バリアントのヒトＢ７－Ｈ３抗原に対する結合活性の測定
ＥＬＩＳＡ法によって親和性成熟バリアントとヒトＢ７－Ｈ３抗原との結合活性を検出し、サンプル濃度の対数をＸ軸、吸光度ＯＤ_４５０値をＹ軸とし、用量反応曲線をプロットし、ＥＣ_５０を算出した。ＥＣ_５０は、サンプルのヒトＢ７－Ｈ３抗原に結合する能力を表す。実験は、ポジティブコントロール群のエノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）の模倣物およびネガティブコントロール群のｈＩｇＧを設定し、その結果を図２Ａ～図２Ｉに示す。

【0122】

図２Ａ～図２Ｉに示すように、各親和性成熟バリアントは、ヒトＢ７－Ｈ３抗原に対して高い結合活性を有し、その結合活性がエノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）の模倣物とほぼ同様である。表３は、結合活性（ＥＣ_５０）を示す。

【0123】

【表3】

【0124】

（２）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による各親和性成熟バリアントとＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を過剰発現する細胞との結合活性の測定
本開示は、上記の各親和性成熟バリアントとヒトＢ７－Ｈ３抗原の機能領域との結合活性をさらに研究するために、ＦＡＣＳを用いてそれのＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を過剰発現する細胞に対する結合活性を検出する。まず、Ｂ７－Ｈ３の膜近位側（２４３～５３４ｂｐ）を安定に発現する細胞株を構築し、陽性（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞と命名した。Ｂ７－Ｈ３の膜近位側を発現しない同種の細胞を陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞と命名した。

【0125】

陽性（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞および陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞を回収し、予め４℃に冷却した２％ＦＢＳ／ＰＢＳ（希釈液）で１回洗浄した後、細胞密度が５．０×１０^６個細胞／ｍＬになるように希釈液で再懸濁した。１００μＬ／ウェル（ｗｅｌｌ）、つまり５．０×１０５／ウェルで細胞を９６ウェルプレートに接種し、濃度が５μｇ／ｍＬとなるように上記各親和性成熟バリアントを希釈液で調製した。抗体溶液を１００μＬ採取し、同体積の陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞または陽性（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞とそれぞれ均一に混合し、最終濃度が２．５μｇ／ｍＬとなった。９６ウェルプレートを４℃で１時間インキュベートした後、５００×ｇ、４℃で５分間遠心して上清を除去した。そして、２００μＬの希釈液で２回洗浄し、ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＦＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）希釈液で細胞を再懸濁し、遮光して４℃で１時間インキュベートした。その後、９６ウェルプレートを５００×ｇ、４℃で５分間遠心して上清を除去し、再び２００μＬの希釈液で２回洗浄し、２００μＬ希釈液で細胞を再懸濁した後、直ちに装置によって検出した。図３Ａ～図３Ｅは、その結果を示す。

【0126】

図３Ａ～図３Ｅは、結果の一部を示す。各親和性成熟バリアントは、いずれもＢ７－Ｈ３の膜近位側抗原を発現する陽性（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞に結合したが（図右側の実線）、陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞に結合しなかった（図左側の実線）。

【0127】

（３）親和性成熟バリアントが媒介するＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷活性の測定
上記のＥＬＩＳＡとＦＡＣＳの結果に基づいて、ヒトＢ７－Ｈ３抗原に対して高い親和性を有する１５個の親和性成熟バリアント（４４Ｆ２、４３Ｇ１１、４６Ｈ７、４５Ｂ１１、４３Ｄ４、４２Ｆ７、４５Ｆ４、４６Ｈ９、４６Ｄ４、４７Ｈ４、４８Ｅ９、４９Ｃ３、４９Ｅ１、５０Ａ１および５０Ａ６）を選択し、Ｂ７－Ｈ３陽性ヒト胃がん細胞ＮＣＩ－Ｎ８７を標的細胞とし、ヒト末梢血単核球ＰＢＭＣをエフェクター細胞とし、各親和性成熟バリアントが媒介するＰＢＭＣによるＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍細胞の殺傷活性を測定した。

【0128】

ＮＣＩ－Ｎ８７細胞をトリプシンで消化し、単細胞懸濁液を調製し、フェノールレッドを含まない５％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞密度を０．４０×１０^６個細胞／ｍＬに調整し、５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。エフェクター細胞ＰＢＭＣの細胞密度を４．００×１０^６個細胞／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。フェノールレッドを含まない５％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地で測定対象の抗体を４０μｇ／ｍＬに希釈した後、体積比で１：４の倍数希釈を行い、それぞれ４０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、０．６２５μｇ／ｍＬ、０．１５６３μｇ／ｍＬ、０．０３９１μｇ／ｍＬ、０．００９８μｇ／ｍＬ、０．００２４μｇ／ｍＬ、０．０００６μｇ／ｍＬ、および０．０００１５μｇ／ｍＬの１０濃度を得た。そして５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。９６ウェルプレートで均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに一晩インキュベートし、翌日（約２０時間後）、乳酸脱水素酵素細胞毒性アッセイキット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）で細胞毒性を測定した。さらに、抗体の殺傷活性を測定し、殺傷率の計算式は以下である。細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）％＝（ＯＤサンプル－ＳＲ）／（ＭＲ－ＳＲ）×１００％、ただし、ＳＲがＯＤ自然遊離ウェル（標的細胞＋エフェクター細胞）、ＭＲがＯＤ最大遊離ウェル（標的細胞）である。図４Ａおよび図４Ｂは、結果を示す。

【0129】

図４Ａおよび図４Ｂに示すように、１５個の各親和性成熟バリアントは、いずれもＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性ヒト胃がん細胞ＮＣＩ－Ｎ８７の殺傷を媒介することができる。

【0130】

実施例６
本実施例は、ＣＤ３およびＢ７－Ｈ３を標的とするバイスペシフィック抗体を提供する。

【0131】

（１）Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の配列設計
ＣＤ３およびＢ７－Ｈ３を標的とするバイスペシフィック抗体を調製するには、上記のように調製された親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体（４２Ｆ７、４３Ｇ１１、４９Ｅ１、４６Ｈ７）を選択した。本開示の実施例に係るバイスペシフィック抗体は、共通の軽鎖と２つの異なる重鎖に基づいて構築され、図５に示すような構造を有し、それぞれ抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖（Ｎ末端からＣ末端まで順にＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）－ＣＨ２－ＣＨ３－）、抗ＣＤ３の重鎖（Ｎ末端からＣ末端まで順にＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－）、抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで順にＶＬ－ＣＬ）、抗ＣＤ３の軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで順にＶＬ－ＣＬ）と命名された４本のポリペプチド鎖を含み、１つのＢ７－Ｈ３に特異的に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメイン、１つのＣＤ３に特異的に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメイン、および１つのヘテロ二量体のＦｃ領域を形成した。ただし、抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と抗ＣＤ３の軽鎖は、共通の軽鎖であり、２本の重鎖のＣＨ３ドメインは、反対電荷を有する非対称アミノ酸修飾を含み、上記のヘテロ二量体のＦｃ領域を形成する。

【0132】

Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖および軽鎖を含み、その配列が上記の実施例で調製された親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体（４２Ｆ７、４３Ｇ１１、４９Ｅ１、４６Ｈ７）の重鎖および軽鎖に由来する。

【0133】

ＣＤ３に特異的に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、抗ＣＤ３の重鎖（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９）および軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）を含む。

【0134】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＴＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

【0135】

ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９：
ＤＩＱＭＴＱＥＰＳＬＴＴＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＧＫＡＡＬＴＩＴＧＶＱＰＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ

【0136】

抗体のＦｃ部分は、本願発明者の公開特許であるＰＣＴ（ＷＯ２０１７０３４７７０Ａ１）における方法にしたがって部分的に配列改変された。ただし、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインは、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ（ＥＵ）のように変異され、変異がＯＢとマークされて負電荷を有する。抗ＣＤ３の重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインは、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋ（ＥＵ）のように変異され、変異がＯＡとマークされて正電荷を有する。また、Ｆｃとその受容体ＦｃγＲの結合を低下させるために、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖と抗ＣＤ３の重鎖とのＦｃ部分のＣＨ２ドメインは、いずれもＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）変異を含む。

【0137】

（２）発現プラスミドの分子クローニング
Ｂ７－Ｈ３抗体４２Ｆ７、４３Ｇ１１、４９Ｅ１、４６Ｈ７の重鎖と軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ合成し、それらのＦａｂ遺伝子フラグメントを真核発現ベクターｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１－Ｆｃ１（ＯＢ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異およびＰ３２９Ｇ変異を含む）に構築し、プラスミド１と命名された発現プラスミドを得た。抗ＣＤ３の重鎖をプラスミドｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２（ＯＡ、Ｎ１０６Ｔ変異、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、およびＰ３２９Ｇ変異を含む）にクローニングし、プラスミド２と命名された発現プラスミドを得た。抗ＣＤ３の軽鎖をｐＣＤＮＡ３．１にクローニングし、プラスミド３と命名されたプラスミドを得た。

【0138】

（３）発現、精製
組換えプラスミド１、プラスミド２、プラスミド３を抽出し、ＰＥＩとＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いてコトランスフェクトを行い、３７℃、５％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍのインキュベーターシェーカーで、共導入された細胞懸濁液を遮光して６日間培養し、培養上清を高速遠心した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー用カラムに充填して精製した。各種のＢｓＡｂのサイズと純度を検出、確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行い、４２Ｆ７×ＣＤ３、４３Ｇ１１×ＣＤ３、４９Ｅ１×ＣＤ３、および４６Ｈ７×ＣＤ３と命名されたＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体を得た。ポジティブコントロール抗体のモノクローナル抗体８Ｈ９の模倣物についても、同様な手法で８Ｈ９×ＣＤ３バイスペシフィック抗体を構築した。

【0139】

実施例７
本実施例は、実施例６で調製されたＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の機能検証を行った。

【0140】

（１）Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の結合活性
間接ＥＬＩＳＡ法により上記の調製されたＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体のＢ７－Ｈ３抗原に結合する活性を測定した。操作方法は以下である。１μｇ／ｍＬに希釈されたＢ７－Ｈ３抗原を１００μＬ／ウェルでマイクロプレートに添加し、コーティングしたまま４℃で一晩放置した。翌日０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、室温で２時間ブロッキングした。再び０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、段階希釈されたＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体（ＰＢＳ希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートした。結合しないものを０．０５％ＰＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ．ＳＡ０００１－１７）を添加し、室温で１時間インキュベートした。０．０５％ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ発色液を添加し、室温で遮光して５分間インキュベートし、Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度を測定し、ｌｏｇ（抗体濃度）を横座標、吸光度ＯＤ_４５０を縦座標とし、用量反応曲線をプロットした結果を図６に示す。図６から分かるように、試験したすべてのＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体は、ヒトＢ７－Ｈ３抗原に対していずれも高い結合活性を有する。

【0141】

（２）Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体によるＴ細胞活性化作用の測定
Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター遺伝子細胞株とＢ７－Ｈ３陽性ヒト腎臓がん細胞Ａ４９８からなる測定系により、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３によるＴ細胞活性化を評価した。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞株において、ルシフェラーゼ遺伝子がＮＦＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌ）転写因子により制御され、これをエフェクター細胞とし、Ｂ７－Ｈ３陽性Ａ４９８細胞を標的細胞とした。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞をＡ４９８細胞と共培養した場合、ルシフェラーゼが発現しなかったが、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３を添加すると、Ａ４９８細胞上のＢ７－Ｈ３がＢ７－Ｈ３×ＣＤ３を介してＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞内のＣＤ３シグナル経路を活性化させ、ルシフェラーゼの発現を促進するため、細胞内のルシフェラーゼの発現量を検出することによりＪｕｒｋａｔＴ細胞の活性化の強さを判断することができる。

【0142】

実験では、Ａ４９８細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞を９６ウェル細胞培養用プレートに順次添加し、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３を１０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、０．６２５μｇ／ｍＬ、０．１５６２５μｇ／ｍＬ、０．０３９０μｇ／ｍＬ、０．００９７μｇ／ｍＬ、０．００２４μｇ／ｍＬ、０．０００６μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。異なる濃度のＢ７－Ｈ３×ＣＤ３を上記細胞培養用プレートに添加し、３７℃で６時間培養した。ＯＮＥ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ測定試薬を添加し、多機能マイクロプレートリーダーにより化学発光値を測定した。抗体濃度の対数を横座標、化学発光値の平均値を縦座標とし、４パラメータフィッティングを行い、用量反応曲線をプロットし、各曲線のＥＣ_５０値を求めた。ＥＣ_５０は、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３によるＴ細胞活性化の活性を表す。実験は、ポジティブコントロール抗体８Ｈ９×ＣＤ３群を設定した。

【0143】

結果は、図７に示すように、本開示による４個のＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体は、Ｂ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞Ａ４９８と、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞と共インキュベートした場合、ＪｕｒｋａｔＴ細胞に対していずれも優れた活性化効果を示した。

【0144】

（３）Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体のＢ７－Ｈ３陽性細胞に対する殺傷効果の測定
バイスペシフィック抗体Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３のＣＤ３結合アームは、Ｔ細胞表面のＣＤ３複合体に特異的に結合し、他端のＢ７－Ｈ３結合アームは、腫瘍細胞表面のＢ７－Ｈ３分子に特異的に結合することにより、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間に免疫の橋渡しが形成され、Ｔ細胞が活性化され、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）やグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）などの細胞傷害性タンパク質が放出されることで、腫瘍細胞を殺傷する。腫瘍細胞の細胞膜が損傷を受けると、細胞膜の透過性が高まり、細胞質内の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が培養上清に放出される。一定量の上清を取り、乳酸脱水素酵素の反応基質である乳酸を加えると、乳酸脱水素酵素が脱水素反応を促進し、４９０ｎｍに吸収ピークを生じることができる赤い生成物のホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）が生成した。細胞上清における乳酸脱水素酵素の含有量が多いほど、その色は濃くなり、吸光度も大きくなる。故に、吸光度を測定することにより、腫瘍細胞から放出された乳酸脱水素酵素の量を定量し、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３が媒介するＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷活性を算出することができる。殺傷率の計算式は以下である。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ％＝（ＯＤサンプル－ＳＲ）／（ＭＲ－ＳＲ）×１００％、ただし、ＳＲがＯＤ自然遊離ウェル（標的細胞＋エフェクター細胞）であり、ＭＲがＯＤ最大遊離ウェル（標的細胞）である。

【0145】

本開示では、Ｂ７－Ｈ３が異なって発現されるヒト胃がん細胞ＮＣＩ－Ｎ８７、Ａ４９８、ＨｅｐＧ２を標的細胞とし、ヒト末梢血単核球ＰＢＭＣをエフェクター細胞とし、４個のＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体が媒介するＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷活性を測定した。

【0146】

新鮮単離ヒト末梢血単核球ＰＢＭＣを採取し、密度を２．００×１０^６個細胞／ｍＬに調整した。増殖状態の良いＮＣＩ－Ｎ８７、Ａ４９８、ＨｅｐＧ２細胞を採取し、細胞濃度を２．００×１０^５個細胞／ｍＬに調整した。１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）でサンプルを３０μｇ／ｍＬに希釈した後、４倍段階希釈を行い、その濃度を順に３０μｇ／ｍＬ、７．５μｇ／ｍＬ、１．８７５μｇ／ｍＬ、０．４６８８μｇ／ｍＬ、０．１１７２μｇ／ｍＬ、０．０２９３μｇ／ｍＬ、０．００７３μｇ／ｍＬ、０．００１８μｇ／ｍＬ、０．０００５μｇ／ｍＬ、および０．０００１μｇ／ｍＬの合計１０段階とした。９６ウェル細胞培養用プレートに、標的細胞５０μＬ／ウェル、ＰＢＭＣ１００μＬ／ウェル、段階希釈されたサンプル５０μＬ／ウェルを順に添加し、ＰＢＭＣと標的細胞の単位体積の細胞数の比が２０：１になるように均一に混合した。サンプルの初期濃度を１０μｇ／ｍＬとし、コントロールウェルにフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地を２００μＬまで添加した。培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内に置いて２１±１時間インキュベートした後、乳酸脱水素酵素細胞毒性アッセイキット（碧雲天）で細胞毒性を測定した。抗体濃度の対数を横座標、殺傷活性を縦座標とし、４パラメータフィッティングを行った。用量反応曲線をプロットし、各曲線のＥＣ_５０値を求めた。ＥＣ_５０は、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３の標的細胞に対する殺傷活性を表す。結果を図８Ａ－図８Ｃに示す。

【0147】

８Ａ～図８Ｃに示すように、本開示によるバイスペシフィック抗体Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３は、Ｂ７－Ｈ３が異なって発現されるＮＣＩ－Ｎ８７、Ａ４９８、ＨｅｐＧ２細胞に対していずれも優れた殺傷効果を示した。

【0148】

（４）Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の安定性に関する検討
Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の４０℃で異なる時間放置後の安定性を評価するため、十分シールされたサンプル（１ｍｇ／ｍＬ）を４０℃の恒温器（ＢＩＮＤＥＲ ＫＢＦ２４０）に放置した。所定の時点（ベースライン（０日目）、１４日目）でサンプルを２０μｇ採取し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで純度を測定した。上記ＳＥＣ－ＨＰＬＣの条件は以下である。

【0149】

サイズ排除クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ ｉｎｃｒｅａｓｅ
移動相：５０ｍＭ ＮａＡｃ、５１ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ５．５
流速：０．５ｍＬ／分間
ＵＶ検出波長：２８０ｎｍ
採取時間：３５分間

【0150】

使用した装置は、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ Ｌ１クロマトグラフであり、グラフを記録し残存モノマーの割合を算出するためのソフトウェアは、ＵＮＩＣＯＲＮである。

【0151】

図９Ａ～図９Ｄに示すように、図９Ａは、４６Ｈ７×ＣＤ３の４０℃で１４日間放置後のＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度測定の結果を表す。ただし、液相の４６Ｈ７×ＣＤ３バイスペシフィック抗体のピークの保持時間が２８．５分間で、ピーク面積比が１００％で、４６Ｈ７×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の純度が９８％よりも高い。図９Ｂは、４３Ｇ１１×ＣＤ３の４０℃で１４日間放置後のＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度測定の結果を表す。ただし、液相中の４３Ｇ１１×ＣＤ３バイスペシフィック抗体のピークの保持時間が２８．５分間で、ピーク面積比が１００％で、４３Ｇ１１×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の純度が＞９８％である。図９Ｃは、４９Ｅ１×ＣＤ３の４０℃で１４日間放置後のＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度測定の結果を表す。ただし、液相中の４９Ｅ１×ＣＤ３バイスペシフィック抗体のピークの保持時間が２８．５分間で、ピーク面積比が１００％で、４９Ｅ１×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の純度が＞９８％である。図９Ｄは、４２Ｆ７×ＣＤ３の４０℃で１４日間放置後のＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度測定の結果を表す。ただし、液相中の４２Ｆ７×ＣＤ３バイスペシフィック抗体のピークの保持時間が２８．５分間で、ピーク面積比が１００％で、４２Ｆ７×ＣＤ３バイスペシフィック抗体の純度が９８％よりも高い。以上の結果から、４０℃の実験条件では、上記抗体の多量体の割合が時間とともに増加することはないので、上記四価の二重特異性抗体は、熱安定性に優れ、開発可能であると考えられた。

【0152】

（５）Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体のマウスインビボでの抗腫瘍効果の測定
上記実施例の結果に基づいて、そのうち１つのＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体（すなわち４２Ｆ７×ＣＤ３バイスペシフィック抗体）を選択して、マウスインビボでの抗腫瘍効果の測定を行った。

【0153】

８週齢のメスＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（北京維通利華実験動物有限公司より購入）を用いて、対数増殖期におけるＭＣ３８／ｈＢ７－Ｈ３細胞および新鮮単離ＰＢＭＣを採取し、マウスの右前肢に１００μＬ／匹で接種し、接種翌日に群分けを行った。群分けした日をＤ０日目とし、Ｄ０日目に薬剤投与を開始した。実験は、マウスをそれぞれアイソタイプコントロールｈＩｇＧ群（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）と、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３群（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の２群、各６匹に分けた。Ｄ１、Ｄ５、Ｄ８、Ｄ１１、Ｄ１５に尾静脈注射で薬剤を投与した（ｉ．ｖ．）。薬剤投与開始後、腫瘍の大きさを観察してマウスの体重を秤量した。腫瘍体積を以下のように算出した。腫瘍体積（ｍｍ^３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径^２）。腫瘍体積から腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）および腫瘍抑制率（ＴＧＩ）を算出し、腫瘍抑制率（ＴＧＩ）から治療効果の判定を行った。図１０は、結果を示す。

【0154】

図１０に示すように、Ｂ７－Ｈ３×ＣＤ３は、ＰＢＭＣによりヒト免疫系を再構築したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下移植によるＭＣ３８／ｈＢ７－Ｈ３異種移植モデルにおいて、マウス腫瘍モデルに対し、腫瘍増殖を有意に抑制する効果を示した。

【0155】

上記のように、本開示に係るＢ７－Ｈ３抗体は、Ｂ７－Ｈ３抗原に高親和性に結合し、重鎖相補性決定領域を変異させることにより、Ｂ７－Ｈ３抗体の親和性をさらに向上させ、ＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷を効率的に媒介することができる。さらに、本開示は、Ｂ７－Ｈ３抗体を用いてＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体を構築し、上記二重特異性抗体は、高親和性と安定性を有し、ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷を効果的に媒介することができるため、腫瘍増殖を有意に抑制した。

【0156】

本出願人は、本開示が上記の実施例によって本開示の詳細な方法を説明したが、本開示が上記の詳細な方法に限定されなく、つまり上記の詳細な方法に依存することなく本開示を実施可能である。当業者は、本開示の如何なる改良、本開示に係る製品の各原料の均等置換および補助成分の添加、形態の選択などがすべて、本開示の保護範囲に属することを理解すべきである。

【産業上の利用可能性】

【0157】

本開示は、Ｂ７－Ｈ３抗体およびその使用を提供する。本開示によるＢ７－Ｈ３抗体は、Ｂ７－Ｈ３抗原およびＢ７－Ｈ３抗原を発現する細胞に高親和性に結合し、ＰＢＭＣによるＢ７－Ｈ３陽性腫瘍細胞の殺傷を効率的に媒介することができる。上記Ｂ７－Ｈ３抗体を用いてＢ７－Ｈ３×ＣＤ３バイスペシフィック抗体を構築し、上記二重特異性抗体は、高親和性と安定性を有し、ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷を効果的に媒介することができるため、腫瘍増殖を有意に抑制した。そのため、本開示によるＢ７－Ｈ３抗体は、実用性が高いものである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-01-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ７－Ｈ３抗体であって、
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６～８に示すアミノ酸配列を含み
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とするＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項2】

前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すアミノ酸配列を含み、
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする請求項１に記載のＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項3】

請求項１に記載のＢ７－Ｈ３抗体から変異処理によって調製される
ことを特徴とする親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項4】

前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体は、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～２５のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６～３７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８～４８のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、
前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする請求項３に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項5】

前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含み、
前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖のフレームワーク領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～５に示すアミノ酸配列を含む
請求項４に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。

【請求項6】

２つの重鎖と２つの軽鎖を含み、
前記重鎖は、請求項１に記載のＢ７－Ｈ３抗体の重鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖と、抗ＣＤ３の重鎖とを含み、
前記軽鎖は、請求項１に記載のＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の軽鎖とを含み、
前記重鎖は、ジスルフィド結合によって前記軽鎖に結合しており、
前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖は、ジスルフィド結合によって前記抗ＣＤ３の重鎖に結合している
ことを特徴とするバイスペシフィック抗体。

【請求項7】

２つの重鎖と２つの軽鎖を含み、
前記重鎖は、請求項３に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖と、抗ＣＤ３の重鎖とを含み、
前記軽鎖は、請求項３に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の軽鎖とを含み、
前記重鎖は、ジスルフィド結合によって前記軽鎖に結合しており、
前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖は、ジスルフィド結合によって前記抗ＣＤ３の重鎖に結合している
ことを特徴とするバイスペシフィック抗体。

【請求項8】

前記抗ＣＤ３の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９に示すアミノ酸配列を含み、
前記抗ＣＤ３の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする請求項６または７に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項9】

前記バイスペシフィック抗体は、Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ヘテロ二量体のＦｃ領域とを含み、
前記Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、前記抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、
前記ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、前記抗ＣＤ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、
前記ヘテロ二量体のＦｃ領域は、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントと、抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントとを含む
ことを特徴とする請求項８に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項10】

前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントは、ヒトＦｃフラグメントまたはヒト化Ｆｃフラグメントを含む
ことを特徴とする請求項９に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項11】

前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄの変異、Ｐ３９５Ｄの変異、Ｐ３９６Ｄの変異を含む
ことを特徴とする請求項１０に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項12】

前記抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋの変異、Ｐ３９６Ｋの変異、Ｖ３９７Ｋの変異を含む
ことを特徴とする請求項１１に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項13】

前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ２は、Ｌ２３４Ａの変異、Ｌ２３５Ａの変異、Ｐ３２９Ｇの変異を含む
ことを特徴とする請求項１２に記載のバイスペシフィック抗体。

【請求項14】

Ｂ１）： （ｂ１）請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ２）請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ３）請求項６または７に記載のバイスペシフィック抗体、のいずれか１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、または前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、
Ｂ２）： Ｂ１）の核酸分子を含む発現カセット、
Ｂ３）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換えベクター、またはＢ２）の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｂ４）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換え微生物、Ｂ２）の発現カセットを含む組換え微生物、またはＢ３）の組換えベクターを含む組換え微生物、
Ｂ５）： Ｂ１）の核酸分子を含む細胞株、Ｂ２）の発現カセットを含む細胞株、またはＢ３）の組換えベクターを含む細胞株、
Ｂ６）： 前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子、または前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子
の前記Ｂ１）～Ｂ６）のいずれか１つである
ことを特徴とする生物材料。

【請求項15】

請求項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、請求項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、または請求項６または７に記載のバイスペシフィック抗体のいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む
ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項16】

神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む腫瘍に対する
請求項１５に記載の医薬組成物の抗腫瘍薬剤の調製における使用。

【請求項17】

神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む
腫瘍を治療するための、請求項１５に記載の医薬組成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0156】

本出願人は、本開示が上記の実施例によって本開示の詳細な方法を説明したが、本開示が上記の詳細な方法に限定されなく、つまり上記の詳細な方法に依存することなく本開示を実施可能である。当業者は、本開示の如何なる改良、本開示に係る製品の各原料の均等置換および補助成分の添加、形態の選択などがすべて、本開示の保護範囲に属することを理解すべきである。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
項１：
Ｂ７－Ｈ３抗体であって、
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６～８に示すアミノ酸配列を含み
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とするＢ７－Ｈ３抗体。
項２：
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すアミノ酸配列を含み、
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする項１に記載のＢ７－Ｈ３抗体。
項３：
項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体から変異処理によって調製される
ことを特徴とする親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。
項４：
前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体は、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７～２５のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ２がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６～３７のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、重鎖相補性決定領域ＣＤＲ３がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８～４８のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含み、
前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４～１６に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする項３に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。
項５：
前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含み、
前記親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖のフレームワーク領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～５に示すアミノ酸配列を含む
項３または４に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体。
項６：
２つの重鎖と２つの軽鎖を含み、
前記重鎖は、項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体の重鎖または項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の重鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖と、抗ＣＤ３の重鎖とを含み、
前記軽鎖は、項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖または項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体の軽鎖を含む抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の軽鎖とを含み、
前記重鎖は、ジスルフィド結合によって前記軽鎖に結合しており、
前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖は、ジスルフィド結合によって前記抗ＣＤ３の重鎖に結合している
ことを特徴とするバイスペシフィック抗体。
項７：
前記抗ＣＤ３の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９に示すアミノ酸配列を含み、
前記抗ＣＤ３の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に示すアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする項６に記載のバイスペシフィック抗体。
項８：
前記バイスペシフィック抗体は、Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインと、ヘテロ二量体のＦｃ領域とを含み、
前記Ｂ７－Ｈ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、前記抗Ｂ７－Ｈ３の軽鎖と、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、
前記ＣＤ３に結合している免疫グロブリンのＦａｂドメインは、前記抗ＣＤ３の軽鎖と、抗ＣＤ３の重鎖可変領域ＶＨおよび定常領域ＣＨ１とを含み、
前記ヘテロ二量体のＦｃ領域は、抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントと、抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントとを含む
ことを特徴とする項６または７に記載のバイスペシフィック抗体。
項９：
前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントは、ヒトＦｃフラグメントまたはヒト化Ｆｃフラグメントを含む
ことを特徴とする項８に記載のバイスペシフィック抗体。
項１０：
前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｔ３９４Ｄの変異、Ｐ３９５Ｄの変異、Ｐ３９６Ｄの変異を含む
ことを特徴とする項８または９に記載のバイスペシフィック抗体。
項１１：
前記抗ＣＤ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ３は、Ｐ３９５Ｋの変異、Ｐ３９６Ｋの変異、Ｖ３９７Ｋの変異を含む
ことを特徴とする項８～１０のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体。
項１２：
前記抗Ｂ７－Ｈ３の重鎖に連結されたＦｃフラグメントのＣＨ２は、Ｌ２３４Ａの変異、Ｌ２３５Ａの変異、Ｐ３２９Ｇの変異を含む
ことを特徴とする項８～１１のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体。
項１３：
Ｂ１）： （ｂ１）項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ２）項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、（ｂ３）項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体、のいずれか１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、または前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、
Ｂ２）： Ｂ１）の核酸分子を含む発現カセット、
Ｂ３）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換えベクター、またはＢ２）の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｂ４）： Ｂ１）の核酸分子を含む組換え微生物、Ｂ２）の発現カセットを含む組換え微生物、またはＢ３）の組換えベクターを含む組換え微生物、
Ｂ５）： Ｂ１）の核酸分子を含む細胞株、Ｂ２）の発現カセットを含む細胞株、またはＢ３）の組換えベクターを含む細胞株、
Ｂ６）： 前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子、または前記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれか１つの抗体の抗原結合部分の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子
の前記Ｂ１）～Ｂ６）のいずれか１つである
ことを特徴とする生物材料。
項１４：
項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、または項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体のいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む
ことを特徴とする医薬組成物。
項１５：
神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む腫瘍に対する
項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体、または項１４に記載の医薬組成物の抗腫瘍薬剤の調製における使用。
項１６：
好ましくは、神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む
腫瘍を治療するための、項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体、または項１４に記載の医薬組成物の使用。
項１７：
腫瘍関連疾患の治療方法であって、
腫瘍関連疾患の治療方法を必要とする被験者に項１または２に記載のＢ７－Ｈ３抗体、項３～５のいずれか一項に記載の親和性成熟によるＢ７－Ｈ３抗体、項６～１２のいずれか一項に記載のバイスペシフィック抗体、または項１４に記載の医薬組成物を投与し、
好ましくは、前記腫瘍関連疾患は、神経腫瘍、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、肺がん、悪性黒色腫、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がんのいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせを含む
ことを特徴とする腫瘍関連疾患の治療方法。

【国際調査報告】