特表2024-527634酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞、この製造方法および用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-25
(54)【発明の名称】酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞、この製造方法および用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240718BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240718BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240718BHJP
A61K 35/50 20150101ALI20240718BHJP
A61K 35/51 20150101ALI20240718BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240718BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240718BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240718BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240718BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240718BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240718BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240718BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20240718BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240718BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/0775
A61K35/28
A61K35/50
A61K35/51
A61P9/10
A61P3/10
A61P19/08
A61P1/00
A61P13/12
A61P1/16
A61P29/00
A61P25/00
A61P11/00
A61P31/14
C12N15/12
C12N15/10 210Z
C12N15/63 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524971
(86)(22)【出願日】2022-07-08
(85)【翻訳文提出日】2024-01-09
(86)【国際出願番号】 KR2022009918
(87)【国際公開番号】W WO2023282688
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】10-2021-0090522
(32)【優先日】2021-07-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523300218
【氏名又は名称】ツールゲン インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＯＯＬＧＥＮ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】シン，ウン ジ
(72)【発明者】
【氏名】イ，カン イン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ユ リ
(72)【発明者】
【氏名】シン，ヘ ジョン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジェ ヨン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA36
4C087ZA59
4C087ZA66
4C087ZA75
4C087ZA96
4C087ZB11
4C087ZB33
4C087ZC35
(57)【要約】
ＮｒＦ２の陰性調節因子（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であるＫＥＡＰ１の発現または活性水準が減少または抑制されてＮｒＦ２の活性度が増加することによって、酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞、この製造方法を提案し、前記間葉系幹細胞は体内で生存率が増加し老化が抑制されて虚血性疾患に対する改善された治療効果を有する細胞治療剤として利用され得る点が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
人為的に操作されたＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子を含む人為的に操作された間葉系幹細胞であって、前記人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子は野生型間葉系幹細胞のＫｅａｐ １遺伝子配列と異なり、
前記人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子は核酸配列内に一つ以上のインデル（ｉｎｄｅｌ）を含み、
この時、前記インデルはＫｅａｐ１遺伝子のエキソン第２領域またはエキソン第３領域でプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列内、またはＰＡＭ配列の５′末端または３′末端と隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列内に位置し、
前記人為的に操作された間葉系幹細胞は酸化ストレス抵抗性が向上したことを特徴とする、人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項2】
前記人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子の配列は、配列番号１～１５および配列番号４９～５６からなる群から選択された一つ以上の配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項3】
前記人為的に操作された間葉系幹細胞内で、前記人為的に操作されたＫｅａｐ １遺伝子から転写されるｍＲＮＡは野生型間葉系幹細胞のＫｅａｐ １遺伝子から転写されるｍＲＮＡ発現水準と比較して、そのｍＲＮＡ発現水準がさらに低いかまたは配列が異なることを特徴とする、請求項１に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項4】
前記人為的に操作された幹細胞は酸化的ストレス環境で高い生存性を有することを特徴とする、請求項１に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項5】
前記人為的に操作された間葉系幹細胞は脂肪、骨髓、臍帯、胎盤、羊水、羊膜、組織、臍帯血または出産前後組織（ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ）由来であることを特徴とする、請求項１に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項6】
間葉系幹細胞のＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列を標的化できるガイド配列を含むガイド核酸またはこれを暗号化する核酸配列；およびエディタ蛋白質またはこれを暗号化する核酸配列を含む、酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項7】
前記標的配列は配列番号１～１５および配列番号４９～５６からなる群から選択された選択された一つ以上の配列であることを特徴とする、請求項６に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項8】
前記組成物は前記エディタ蛋白質および前記ガイド核酸をリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）形態で含む、請求項６に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項9】
前記組成物は前記エディタ蛋白質を暗号化する核酸配列および前記ガイド核酸を暗号化する核酸配列を１以上のベクター形態で含む、請求項６に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項10】
前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択されたことを特徴とする、請求項９に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項11】
（１）Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列を標的化できるガイド核酸またはこれを暗号化する核酸配列；およびエディタ蛋白質またはこれを暗号化する核酸配列を含む酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物を分離された間葉系幹細胞に導入する段階；および（２）前記間葉系幹細胞のゲノム内に位置したＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列にインデルを発生させることによって、Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）蛋白質の発現または活性が減少または抑制されるようにＫｅａｐ１遺伝子を編集する段階を含む、酸化ストレス抵抗性を有する幹細胞の製造方法。
【請求項12】
前記標的配列は配列番号１～１５および配列番号４９～５６からなる群から選択された一つ以上の配列であることを特徴とする、請求項１１に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項13】
前記インデルはＫｅａｐ１遺伝子のエキソン第２領域またはエキソン第３領域でプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列内、またはＰＡＭ配列の５′末端または３′末端と隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列内に位置するように発生させる、請求項１１に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項14】
前記組成物は前記エディタ蛋白質を暗号化する核酸配列および前記ガイド配列を暗号化する核酸配列を１以上のベクター形態で含む、請求項１１に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項15】
前記間葉系幹細胞のゲノム内に位置したＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列に、ストレプトコッカスピオゲネス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９蛋白質およびＫｅａｐ１遺伝子の標的配列を標的化できるガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を接触させることによってインデルを発生させる、請求項１１に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項16】
請求項１～請求項５のいずれか一項に記載された人為的に操作された間葉系幹細胞を有効性分として含む、虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項17】
前記虚血性疾患は虚血性心臓疾患（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）臨界下肢虚血（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ、ＣＬＩ）、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎ）、糖尿病性末梢血管病症、骨壊死（ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、腸間膜虚血（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、虚血性大腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ）、虚血性腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、急性腎障害（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血再灌流傷害（ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性肝炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、虚血性膵臓炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、虚血視神経病（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、慢性閉鎖性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔ４ｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９感染症、新生児低酸素性虚血性脳症（ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、または脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）である、請求項１６に記載の虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項18】
哺乳動物に治療学的に有効な量の請求項１～請求項５のいずれか一項に記載された人為的に操作された間葉系幹細胞を投与することを含む、虚血性疾患の治療方法。
【請求項19】
前記虚血性疾患は虚血性心臓疾患（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）臨界下肢虚血（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ、ＣＬＩ）、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎ）、糖尿病性末梢血管病症、骨壊死（ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、腸間膜虚血（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、虚血性大腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ）、虚血性腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、急性腎障害（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血再灌流傷害（ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性肝炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、虚血性膵臓炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、虚血視神経病（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、慢性閉鎖性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔ４ｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９感染症、新生児低酸素性虚血性脳症（ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、または脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）である、請求項１８に記載の虚血性疾患の治療方法。
【請求項20】
哺乳動物で虚血性疾患の予防または治療に使うための薬剤の製造における請求項１～請求項５のいずれか一項に記載された人為的に操作された間葉系幹細胞の用途。
【請求項21】
前記虚血性疾患は虚血性心臓疾患（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）臨界下肢虚血（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ、ＣＬＩ）、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎ）、糖尿病性末梢血管病症、骨壊死（ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、腸間膜虚血（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、虚血性大腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ）、虚血性腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、急性腎障害（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血再灌流傷害（ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性肝炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、虚血性膵臓炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、虚血視神経病（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、慢性閉鎖性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔ４ｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９感染症、新生児低酸素性虚血性脳症（ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、または脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）である、請求項２０に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
Ｎｒｆ２の陰性調節因子（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であるＫＥＡＰ１の発現または活性水準が減少または抑制されてＮｒｆ２の活性度が増加することによって、酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞、この製造方法および用途が提供される。
【背景技術】
【0002】
間葉系幹細胞は自家増殖能、多分化能（ｍｕｌｔｙ－ｐｏｔｅｎｃｙ）を有しており、多様な種類の前駆細胞があるので幹細胞株の確保が容易であり、多分化性幹細胞として、胚胎幹細胞などの万能幹細胞に比べてはるかに遺伝的に安定化しているという長所を有している。また、抗炎症能、免疫調節能のため、軟骨の再生、心筋梗塞の治療、移植片対宿主疾患の治療などのための細胞治療剤として開発されてきた。
【0003】
しかし、虚血（ｉｓｃｈｅｍｉｃ）、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）のような体内病変環境では血液の供給が悪いため酸素濃度が低かったり（Ｈｙｐｏｘｉａ）、活性酸素（Ｒｅａｃｔ４ｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）による酸化的ストレスが高くなって間葉系幹細胞の体内生存率が低くなる。また、酸化的ストレス環境では幹細胞の自己複製（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）が阻害されて細胞老化が蓄積され、老化した間葉系幹細胞は低い治療効果を示す。
【0004】
このように、体内生存率が低くなった間葉系幹細胞に対する治療効果を持続させ増進させるためには反復投与がなされなければならないが、反復投与は患者に負担となり得、生産率も高くなければならない問題がある。
【0005】
活性酸素（ＲＯＳ）は細胞代謝過程で自然的に生産される分子であって、細胞の正常な機能と信号伝達システムで重要な役割をする。しかし、過度なＲＯＳの生産は酸化ストレスを誘導し、細胞内分子の損傷を起こして細胞の正常な機能と役割を妨害する。細胞は過度な活性酸素（ＲＯＳ）による細胞内ストレスと毒性を緩和する調節システムを有しており、代表的なものがｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ－ｄｅｒ４ｅｄ ２）－ｌｉｋｅ ２（Ｎｒｆ２）／Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（Ｋｅａｐ１）信号伝達体系である。Ｎｒｆ２の主要調節役割をするＫｅａｐ１は人体内坑酸化システムを調節する蛋白質で存在し、細胞質でＮｒｆ２－Ｋｅａｐ１の蛋白質－蛋白質相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、ＰＰＩ）は炎症および炎症媒介体によって引き起こされる多くの病理学的状態を起こす坑酸化経路調節に重要な要素である。Ｎｒｆ２は酸化ストレスから細胞を保護する役割をする転写因子であって、正常な状態では細胞質でＫｅａｐ１と複合体を形成していて、細胞毒性剤や酸化的ストレスによってＫｅａｐ１が非活性化されるとＮｒｆ２が放出されて核内に進入することになる。以後、Ｎｒｆ２はＨＯ－１、ＳＯＤ、ｃａｔａｌａｓｅおよびＧＰｘ－１／２等の坑酸化酵素を活性化させて酸化損傷から細胞を保護するものと知られている。
【0006】
（特許文献１）大韓民国公開特許１０－２０１９－００６９２３８号
【0007】
（非特許文献１）Ｘｉａｏｚｈｅｎ Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０２０ Ｆｅｂ；２６（２）：１８５－２００、Ｎｒｆ２：Ｒｅｄｏｘ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｔｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
【0008】
（非特許文献２）Ｄ Ｓ Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｓｅａｓｅ ｖｏｌｕｍｅ ７、ｐａｇｅｅ２０９３（２０１６）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＲＦ２ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＳＣｓ ｖｉａ ｔｈｅ Ｐ５３－ＳＩＲＴ１ ａｘｉｓ
【0009】
（非特許文献３）Ｙｉｌｉｎｇ Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１８ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０２０、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｋｅａｐ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔ Ａｄｉｐｏｓｅ－Ｄｅｒ４ｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ
【0010】
（非特許文献４）Ｍｏｈａｍｍａｄ Ｍｏｈａｍｍａｄｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｖｏｌｕｍｅ １７、ｐａｇｅｓ５５３－５６５（２０１２）、Ｎｒｆ－２ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｏｘｉｄａｔ４ｅ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
【0011】
（非特許文献５）Ｓｈｏｕｑｉｎ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１８ Ｆｅｂ；１１９（２）：１６２７－１６３６、Ｎｒｆ２ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｒｅｐａｉｒ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の課題は、虚血（ｉｓｃｈｅｍｉｃ）、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）のような体内病変環境で活性酸素（Ｒｅａｃｔ４ｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）により高くなった酸化的ストレスに対する抵抗性を有する間葉系幹細胞、この製造方法およびこれを利用した細胞治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
前記課題を達成するために、本発明は
【0014】
過度な活性酸素（ＲＯＳ）による細胞内ストレスと毒性を緩和する調節システムであるＮｆｒ２－Ｋｅａｐ１経路でＮｆｒ２と結合して分解を起こすＫＥＡＰ１蛋白質の発現または活性が減少または抑制された間葉系幹細胞を提供する。
【0015】
また、本発明は人為的に操作されたＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子を含む人為的に操作された間葉系幹細胞であって、前記人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子は野生型間葉系幹細胞のＫｅａｐ１遺伝子配列と異なり、前記人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子は核酸配列内に一つ以上のインデル（ｉｎｄｅｌ）を含み、この時、前記インデルはＫｅａｐ１遺伝子のエキソン第２領域またはエキソン第３領域でプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列内、またはＰＡＭ配列の５′末端または３′末端と隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列内に位置し、前記人為的に操作された間葉系幹細胞は酸化ストレス抵抗性が向上したことを特徴とする人為的に操作された間葉系幹細胞を提供する。
【0016】
また、本発明は間葉系幹細胞のＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列を標的化できるガイド配列を含むガイド核酸またはこれを暗号化する核酸配列；およびエディタ蛋白質またはこれを暗号化する核酸配列を含む酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物を提供する。
【0017】
また、本発明は（１）前記酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物を分離された間葉系幹細胞に導入する段階；および（２）前記間葉系幹細胞のゲノム内に位置したＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列にインデルを発生させることによって、Ｋｅａｐ１蛋白質の発現または活性が減少または抑制されるようにＫｅａｐ１遺伝子を編集する段階を含む酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法を提供する。
【0018】
また、本発明は前記酸化ストレス抵抗性を有するように人為的に操作された間葉系幹細胞を有効性分として含む虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0019】
また、本発明は哺乳動物に治療学的に有効な量の前記酸化ストレス抵抗性を有するように人為的に操作された間葉系幹細胞を投与することを含む虚血性疾患の治療方法を提供する。
【0020】
本発明はまた、哺乳動物で虚血性疾患の予防または治療に使うための薬剤の製造における前記酸化ストレス抵抗性を有するように人為的に操作された間葉系幹細胞の用途を提供する。
【発明の効果】
【0021】
本発明の人為的に操作された間葉系幹細胞は、ＮｒＦ２と結合して分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を起こすＫｅａｐ１蛋白質を暗号化する遺伝子を遺伝子ハサミ技術で人為的に変形して、Ｋｅａｐ１蛋白質の発現または活性が減少または抑制されることによって、ＮｒＦ２の活性度が増加し得る。前記Ｋｅａｐ１蛋白質の発現または活性が減少または抑制された間葉系幹細胞は、虚血（ｉｓｃｈｅｍｉｃ）、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）のような体内病変環境で活性酸素（Ｒｅａｃｔ４ｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）により高くなった酸化的ストレスに対する抵抗性を示し、体内で生存率が増加し老化が抑制されて虚血性疾患に対して改善された治療効果を有する細胞治療剤として利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】Ｋｅａｐ１遺伝子の配列番号１～１５の標的配列を標的化するそれぞれのガイドＲＮＡに対するインデル効率を標的化ディープシーケンシング方法を通じて測定した結果を示したグラフである。
【図2】ＫＥＡＰ１遺伝子の標的配列のうち配列番号１５（ｓｇＫｅａｐ１－ＢＲ－＃５）位置で人為的に操作されたＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣの標的化ディープシーケンシングを遂行したし、代表的シークエンシング結果で上位配列パターンを示したものである。
【図3】スクリーニングしたＫｅａｐ１ ｔａｒｇｅｔ ｓｇＲＮＡを使ってＫＥＡＰ１遺伝子がノックアウトされた間葉系幹細胞でインデル頻度とＫＥＡＰ１ ｍＲＮＡの発現程度を示すグラフ、および遺伝子編集による間葉系幹細胞の細胞性状を比較した写真を示したものである。
【図4】ＮＲＦ２遺伝子の標的配列に対するｓｇＲＮＡのインデル効率を標的化ディープシーケンシング方法で測定した結果を示したグラフである。
【図5】Ｋｅａｐ１遺伝子の配列番号４９～５６の標的配列を標的化するそれぞれのガイドＲＮＡに対するインデル効率を標的化ディープシーケンシング方法を通じて測定した結果を示したグラフである。
【図6】ＫＥＡＰ１遺伝子の各標的配列を標的化するｓｇＲＮＡを使ってＫＥＡＰ１遺伝子がノックアウトされた間葉系幹細胞でＫＥＡＰ１遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現程度をｑＲＴ－ＰＣＲを利用して比較して示したグラフである。
【図7】ＫＥＡＰ１遺伝子内の配列番号１５と配列番号５０の標的配列を示したものである。
【図8】ＫＥＡＰ１ノックアウトされた間葉系幹細胞Ｐ６で配列番号１５と、配列番号５０の標的配列を標的化する各ガイドＲＮＡに対する各標的配列のインデル効率（図８（ａ））と、ＫＥＡＰ１ノックアウトされた間葉系幹細胞Ｐ６およびＰ７でｑＲＴ－ＰＣＲを利用して測定したＫＥＡＰ１遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現程度（図８（ｂ））を示したものである。
【図10】ＫＥＡＰ１ノックアウト間葉系幹細胞とＫＥＡＰ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎであるＮＲＦ２ ｅｘｏｎ ２がｓｋｉｐ ｅｄｉｔｉｎｇされた間葉系幹細胞の酸化的ストレス環境での生存率を示すグラフである。
【図11】標的配列の差によるＫＥＡＰ１ノックアウト間葉系幹細胞の酸化的ストレス環境での生存率を示すグラフである。
【図12】配列番号１５および配列番号５０を標的配列としたＫＥＡＰ１ノックアウト間葉系幹細胞Ｐ７の酸化的ストレス環境での生存率を示すグラフである。
【図13】配列番号１５（ｓｇＫｅａｐ１－ＢＲ＃５）と配列番号５０（ｓｇＫＥＡＰ１－ｅｘｏｎ３－＃２３）の標的配列をノックアウトした幹細胞の生存率（図１３（ａ））、成長率（図１３（ｂ））、ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）（図１３（ｃ））およびＰｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ（ＰＤＴ）（図１３（ｄ））を示すグラフである。
【図14】ＢｒｄＵ分析でＫＥＡＰ１ノックアウト間葉系幹細胞の細胞増殖程度と細胞周期を観察したグラフである。
【図15】ＫＥＡＰ１ノックアウト間葉系幹細胞のテロメア長さ分析結果を示したグラフである。
【図16】サイトカイン分析を通じてＫＥＡＰ１ノックアウト間葉系幹細胞で発現が増加したサイトカインを確認した結果を示すグラフである。
【図17】ｍｉｃｅにＫＥＡＰ１ノックアウトＭＳＣをＩＶで投与した後、肺組織を採取して染色し分析した結果を示した写真、グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0024】
本明細書で使われる「約」という用語は、参照量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１程度に変わる量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
【0025】
本明細書で使われる「人為的に操作された」という用語は、自然界にすでに存在する構成を有する物質、分子などと区分するために使う用語であって、前記物質、分子などに人為的な変形が加えられたことを意味する。例えば、「人為的に操作された遺伝子」の場合、自然界に存在する遺伝子の構成に人為的な変形が加えられた遺伝子を意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0026】
本明細書で使われる「野生型」は、自然的に発生する塩基配列を含む遺伝子およびその遺伝子から発現する蛋白質が正常な機能的特性を有することを意味する。野生型遺伝子は自然的または人為的突然変異が発生していない形態を有し、集団で最も頻繁に観察される。本明細書で「野生型」という用語が人為的に操作された遺伝子、および／または人為的に操作された細胞と対比して使われるのであれば、これは人為的に操作された遺伝子、および／または人為的に操作された細胞と相応する同種の「人為的に操作されていない」自然的に発生する塩基配列を含む遺伝子およびこれを有する細胞を意味するものと解釈され得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0027】
本明細書で使われる「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）」、あるいは「ノックアウトされた遺伝子」という表現は、野生型遺伝子に突然変異または人為的変形が発生して、その結果、野生型遺伝子が発現する蛋白質が転写および／または翻訳過程を経て生成されることができないことを意味する。例えば、ノックアウトされた遺伝子Ａを含む細胞は野生型遺伝子Ａによって発現するｍＲＮＡおよび／または蛋白質を発現できないものであり得る。ノックアウトされたＡ遺伝子を含む細胞とは、細胞内存在する遺伝子Ａのうち一つのみノックアウトされたものであり得、二つ以上ノックアウトされたものであり得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0028】
本明細書で使われる「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）」、あるいは「ノックダウンされた遺伝子」という表現は、野生型遺伝子に突然変異または人為的変形が発生して、その結果、野生型遺伝子より少ない量で物質を発現することを意味する。例えば、ノックダウンされた遺伝子Ａを含む細胞は野生型遺伝子Ａによって発現するｍＲＮＡより少ない量のｍＲＮＡを発現するものであり得る。さらに他の例として、ノックダウンされた遺伝子Ａを含む細胞は野生型遺伝子Ａによって発現する蛋白質より少ない量の蛋白質を発現するものであり得る。Ａ遺伝子がノックダウンされた細胞とは、細胞内存在する遺伝子Ａのうち一つのみノックダウンされたものであり得、二つ以上ノックダウンされたものであり得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が認識できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
【0029】
本明細書において、「発現減少」は野生型で測定されたｍＲＮＡおよび／または蛋白質の発現水準より低い程度の発現を示すことを意味する。前記減少は遺伝的変形を有さない細胞または野生型細胞に比べて約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、または約１００％以上減少したものであり得る。
【0030】
本明細書で使われた用語「活性減少」、または「減少した活性」は蛋白質または酵素の活性を測定した時、相対的な活性の減少を意味し得る。具体的には、「活性減少」、または「減少した活性」は与えられた母細胞または野生型細胞に比べてさらに低い水準の蛋白質、または酵素の活性を意味する。
【0031】
本明細書において、「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、多様な種類の身体組織細胞に分化できる能力、すなわち、幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する未分化細胞を総称する広義の概念をいう。この時、前記幹細胞は誘導万能幹細胞、胚胎幹細胞、および成体幹細胞であり得る。また、前記細胞はヒト由来であり得るが、これに制限されるものではない。
【0032】
本明細書において、「間葉系幹細胞」は人間または哺乳類の組織から分離した未分化した幹細胞であって、多様な組織から由来し得る。特に、臍帯由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、骨髓由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、筋肉由来間葉系幹細胞、神経由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞、羊水由来間葉系幹細胞、出産前後組織（ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ）由来間葉系幹細胞または胎盤由来間葉系幹細胞であり得、各組織で幹細胞を分離する技術は当業界ですでに公知である。
【0033】
本発明はＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）蛋白質の発現または活性が減少または抑制された間葉系幹細胞を提供する。
【0034】
前記ＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）蛋白質の発現または活性が減少または抑制された間葉系幹細胞は、過度な活性酸素（ＲＯＳ）による細胞内ストレスと毒性を緩和する調節システムであるＮｆｒ２－Ｋｅａｐ１経路でＮｆｒ２と結合して分解を起こすＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）蛋白質の発現または活性が減少または抑制されてＮｒＦ２の活性が増加することになり、虚血（ｉｓｃｈｅｍｉｃ）、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）のような体内病変環境で活性酸素（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）により高くなった酸化的ストレスに対する抵抗性を示して、前記ＫＥＡＰ１蛋白質の発現または活性が減少または抑制された間葉系幹細胞を細胞治療剤で使用時、間葉系幹細胞の体内生存率が増加し老化が抑制されて、野生型間葉系幹細胞または従来技術で選別された間葉系幹細胞より改善された治療効果を示すことができる。
【0035】
具体的には、本発明は間葉系幹細胞のＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子を人為的に操作して、ＫＥＡＰ１ ｍＲＮＡおよび／またはＫＥＡＰ１蛋白質の発現または活性が減少または抑制されることによって、酸化的ストレス環境で高い生存性を有することを特徴とする酸化ストレス抵抗性を有する人為的に操作された間葉系幹細胞を提供する。
【0036】
本発明はＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の核酸配列が人為的に変形されたものを含む人為的に操作された間葉系幹細胞を提供する。
【0037】
本発明で、遺伝子核酸配列の「人為的な変形」または「人為的な操作」は、遺伝子を構成する核酸配列の変形または単一塩基の化学的変形を通じてなされ得る。これは遺伝子の一部又は全部が変異、置換、削除されるか前記遺伝子に一つ以上の塩基が挿入されることによるものであり得、ＣＲＩＳＰＲ－ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍなどの遺伝子ハサミ技術を利用してなされ得る。一例として、前記遺伝子核酸配列の人為的な変形は非相同的な末端連結（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ、ＨＤＲ）メカニズムによってなされ得る。
【0038】
一例として、前記人為的に操作された間葉系幹細胞はＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）されたものであり得る。
【0039】
本明細書において、「非相同的な末端連結（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）」は切断された二本鎖または一本鎖の両末端が共に結合することで、ＤＮＡ内二本鎖の破損を修復または修繕する方法であり、一般的に二本鎖の破損（例えば、切断）により形成された２個の適合性末端が頻繁な接触を繰り返して２個の末端が完全に結合される場合に破損した二本鎖が復旧する。
【0040】
前記ＮＨＥＪを利用した損傷した遺伝子または核酸の修復過程で、ＮＨＥＪ修繕部位に核酸配列の一部の「挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）および／または欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」（または「インデル」、ＩｎＤｅｌ）が発生し得、インデルが発生した遺伝子は野生型遺伝子と同一の配列を有さない。このような挿入および／または欠失は遺伝子のリーディングフレームを変更させ、フレームシフトされた転写体ｍＲＮＡを作り出し、その結果、ナンセンス－媒介崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ）を体験したり正常な蛋白質の合成に失敗することによって本来の機能を喪失することになる。または追加的に、リーディングフレームを維持するが、相当の量の配列を挿入または欠失させる突然変異を招いて蛋白質の機能性を破壊し得る。さらに他の例示において、遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域のような転写調節領域にインデルが発生する場合、ｍＲＮＡが転写しないか、転写量が減少し、これに伴い、蛋白質が発現しないか、発現量が減少し得る。またはＮＨＥＪの突然変異発生メカニズムを活用して、特異的最終配列の生成が必要でない場合、一部の配列モチーフのみ欠失させるのに使われ得る。例えば、特定エキソンの５′および３′部分のイントロン部位をそれぞれ標的とする二以上のガイドＲＮＡを利用して各イントロン部分に二本鎖切断を起こし、ＮＨＥＪによって、遺伝子のエキソンの一部のみ欠失されると、他部分は正常に発現して蛋白質の主要な機能性は維持され得る。
【0041】
このようなＮＨＥＪを利用すると、遺伝子ハサミ技術を活用して目的とする遺伝子を特異的にノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）したりノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）することができる。
【0042】
例えば、遺伝子ハサミの一種であるＣａｓ９またはＣｐｆ１のようなＣＲＩＳＰＲ酵素を利用して標的遺伝子または標的核酸の二本鎖または二つの一本鎖を切断し、破損した標的遺伝子または破損した標的核酸の二本鎖または二つの一本鎖はＮＨＥＪによってインデルが生成され、これを通じて標的遺伝子または核酸の特異的ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）またはノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）を誘導することができる。
【0043】
一例として、前記人為的に操作された間葉系幹細胞はＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子がノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）されたものであり得る。
【0044】
本発明の一具現例において、前記人為的に操作された間葉系幹細胞のｋｅａｐ１遺伝子は核酸配列内に一つ以上のインデル（ｉｎｄｅｌ）を含むことができる。
【0045】
本発明の一具現例において、前記インデルはＫｅａｐ１遺伝子のエキソン第２領域またはエキソン第３領域でプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列内、またはＰＡＭ配列の５′末端または３′末端と隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列内に位置することができる。
【0046】
本発明の一具現例において、前記人為的に操作された間葉系幹細胞のＫｅａｐ１遺伝子の配列は、配列番号１～１５および配列番号４９～５６からなる群から選択された一つ以上の配列を含まなくてもよい。
【0047】
本発明の一具現例において、前記人為的に操作された間葉系幹細胞はＫｅａｐ１ ｍＲＮＡの発現が起きないものであり得る。
【0048】
本発明の一具現例において、前記人為的に操作された間葉系幹細胞の人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子から転写されるｍＲＮＡは野生型間葉系幹細胞のＫｅａｐ１遺伝子から転写されるｍＲＮＡ水準と比較して、そのｍＲＮＡの発現水準がさらに低いこともある。
【0049】
本発明の一具現例において、前記人為的に操作された間葉系幹細胞は野生型幹細胞と比較して、Ｋｅａｐ１ ｍＲＮＡ配列が異なり得る。
【0050】
本発明の一具現例において、前記人為的に操作された間葉系幹細胞は野生型幹細胞と比較して、Ｋｅａｐ１蛋白質の発現または活性が減少したものであり得る。これを通じて本発明の幹細胞はＫｅａｐ１蛋白質の機能が低下または喪失され得る。
【0051】
すなわち、前記人為的に操作された間葉系幹細胞において、Ｋｅａｐ１蛋白質の発現または活性が野生型間葉系幹細胞の発現または活性より約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％減少したものであり得る。
【0052】
本発明は間葉系幹細胞のＫｅａｐ１蛋白質の発現または活性を減少させる段階を含む酸化ストレス抵抗性を有する人為的に操作された間葉系幹細胞製造方法を提供する。
【0053】
前記ＫＥＡＰ１蛋白質の発現または活性の増加、減少はＫＥＡＰ１遺伝子の人為的な変形によってなされ得、一例として遺伝子ハサミ技術を利用することができる。
【0054】
一例として、前記遺伝子ハサミ技術はＴＡＬエフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔ４ａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒまたはＴＡＬＥ）ドメインと切断ドメインが融合したＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔ４ａｔｏｒｌｉｋｅ ｅｆｆｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、または微生物免疫体系であるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）から由来したＣＲＩＳＰＲ－ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍを活用することができ、これに制限されるものではない。
【0055】
前記ＴＡＬＥＮに関連して国際公開特許ＷＯ２０１２／０９３８３３号またはアメリカ公開特許２０１３－０２１７１３１号に開示された内容の全文が本明細書に参考資料として含まれる。前記ＺＦＮに関連して、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、アメリカ特許登録７，８８８，１２１、８，４０９，８６１、６，４７９，６２６、６，９０３，１８５、７，１５３，９４９が本明細書の参考資料として含まれ得る。
【0056】
前記「ＣＲＩＳＰＲ－ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ」はガイド核酸および／またはエディタ蛋白質で構成される。
【0057】
「ガイド核酸」は標的核酸、標的遺伝子または標的染色体を認知し、エディタ蛋白質と相互作用できる核酸を意味する。この時、前記ガイド核酸は標的核酸、標的遺伝子または標的染色体内の一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成することができる。
【0058】
前記ガイド核酸は標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ、前記ガイドＲＮＡをコーディングするＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡの混合形態であり得る。
【0059】
前記ガイド核酸はガイドＲＮＡであり得る。一例として、「ガイドＲＮＡ」は生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写されたものであり得、特にオリゴヌクレオチド二本鎖、またはプラスミド鋳型から転写されたものであり得る。他の一例として、前記ガイドＲＮＡはベクターの形態で暗号化され得、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ環境で細胞内に伝達されてベクターから転写されたものであり得るが、これに制限されない。
【0060】
前記ガイドＲＮＡの設計および構成は当業者に公知であり、韓国登録特許１０－１６５６２３６、１０－１６５６２３７、１０－１７０６０８５、１０－２０５２２８６、１０－２１８２８４７に詳細に説明され、前記登録特許の全文が本発明の参考資料として本明細書に含まれる。
【0061】
前記ガイド核酸はスキャフォールド配列部分とガイド配列部分を含むことができる。前記スキャフォールド配列部分はＣａｓ蛋白質と相互作用する部分であり、Ｃａｓ蛋白質とガイド核酸が結合して複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）をなすことができるようにする。一般的に、前記スキャフォールド配列部分はｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの一部の配列部分を含み、前記スキャフォールド配列はどのようなＣａｓ蛋白質を使うかによって決定される。
【0062】
前記「ガイド配列部分」は、標的遺伝子または核酸の二本鎖のうちいずれか一つの鎖の一部の配列に相補的に結合できるヌクレオチド配列部分であって、人為的に変形できるヌクレオチド配列部分であり、関心がある標的ヌクレオチド配列によって決定される。この時、前記ガイド配列は標的遺伝子または標的核酸のガイド核酸結合配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性を有するかまたは完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。前記ガイド配列はガイド核酸のガイドドメインに含まれた配列であり得る。
【0063】
前記ガイド配列部分はｃｒＲＮＡに含まれ得る。一例として、前記ガイド核酸は二つのＲＮＡ、すなわち、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔ４ａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）を構成要素として含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）であり得る。
【0064】
他の一例として、前記ガイド核酸はｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分が連結された形態であるｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）であり得る。
【0065】
前記標的配列は標的遺伝子または標的核酸内に存在する一定の長さのヌクレオチド配列であり、具体的には標的遺伝子の調節領域（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）、暗号化領域（ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；またはＣＤＳ、ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または非暗号化領域（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；またはＵＴＲ、ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）に区分される標的領域内の一部のヌクレオチド配列であるか、前記標的領域の組み合わせから選択される一つ以上の一部のヌクレオチド配列であり得る。前記標的配列はガイド核酸－エディタ蛋白質複合体（ＲＮＰ）のターゲットとなり得る。
【0066】
本発明の一具現例において、前記標的配列は野生型ＫＥＡＰ１遺伝子のエキソン第２領域またはエキソン第３領域に含まれた配列であり得る。
【0067】
本発明の一具現例において、前記標的配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のうち選択された一つ以上の配列である。
【0068】
前記標的配列はエディタ蛋白質が認識するプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列と隣接した周辺のヌクレオチド配列であり、ＰＡＭの全体または一部を含むことができるが、これに制限されない。
【0069】
標的配列とは、二つのヌクレオチド配列情報すべてを意味する用語として使われ得る。例えば、標的遺伝子の場合、標的配列は標的遺伝子ＤＮＡのｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄの配列情報を意味するものであってもよく、またはｎｏｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄのヌクレオチド配列情報を意味するものであってもよい。
【0070】
標的配列はガイド核酸結合配列またはガイド核酸非結合配列を含む。「ガイド核酸結合配列」はガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と一部または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的な結合ができる。標的配列およびガイド核酸結合配列は標的遺伝子または核酸により、すなわち遺伝子操作または校正しようとする対象により変わり得るヌクレオチド配列であり、ガイド核酸は標的遺伝子または標的核酸により多様に設計され得る。
【0071】
「ガイド核酸非結合配列」はガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と一部または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的な結合ができない。また、ガイド核酸非結合配列はガイド核酸結合配列と相補性を有するヌクレオチド配列であり、ガイド核酸結合配列と相補的な結合ができる。ガイド核酸結合配列は標的配列のうち一部のヌクレオチド配列であり、標的配列の二つの互いに異なる配列順序を有するヌクレオチド配列、すなわち、互いに相補的な結合ができる二つのヌクレオチド配列のうち一つのヌクレオチド配列であり得る。この時、ガイド核酸非結合配列は標的配列のうちガイド核酸結合配列を除いた残りのヌクレオチド配列であり得る。
【0072】
ガイド核酸結合配列は標的配列、すなわち、ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄと同一のヌクレオチド配列およびｎｏｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄと同一のヌクレオチド配列のうち選択された一つのヌクレオチド配列であり得る。この時、ガイド核酸非結合配列は標的配列のうちガイド核酸結合配列、すなわち、ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄと同一のヌクレオチド配列およびｎｏｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄと同一のヌクレオチド配列のうち選択された一つのヌクレオチド配列を除いた残りのヌクレオチド配列であり得る。
【0073】
ガイド核酸結合配列は標的配列の長さと同一であり得る。ガイド核酸非結合配列は標的配列またはガイド核酸結合配列の長さと同一であり得る。ガイド核酸結合配列は５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0074】
一具体例として、前記ガイド核酸結合配列は１６個のヌクレオチド配列、１７個のヌクレオチド配列、１８個のヌクレオチド配列、１９個のヌクレオチド配列、２０個のヌクレオチド配列、２１個のヌクレオチド配列、２２個のヌクレオチド配列、２３個のヌクレオチド配列、２４個のヌクレオチド配列または２５個のヌクレオチド配列であり得る。ガイド核酸非結合配列は５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0075】
一具体例として、前記ガイド核酸非結合配列は１６個のヌクレオチド配列、１７個のヌクレオチド配列、１８個のヌクレオチド配列、１９個のヌクレオチド配列、２０個のヌクレオチド配列、２１個のヌクレオチドソヨル、２２個のヌクレオチド配列、２３個のヌクレオチド配列、２４個のヌクレオチド配列または２５個のヌクレオチド配列であり得る。
【0076】
ガイド核酸結合配列はガイド核酸のガイドドメインに含まれたガイド配列と一部または完全な相補的な結合ができ、前記ガイド核酸結合配列の長さはガイド配列の長さと同一であり得る。
【0077】
前記ガイド核酸結合配列はガイド核酸のガイドドメインに含まれたガイド配列に相補的なヌクレオチド配列であり得、例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補的であるかまたは完全に相補的なヌクレオチド配列であり得る。
【0078】
一例として、前記ガイド核酸結合配列はガイド核酸のガイドドメインに含まれたガイド配列に相補的でない１～８個のヌクレオチド配列を有するかまたは含むことができる。
【0079】
ガイド核酸非結合配列はガイド核酸のガイドドメインに含まれたガイド配列と一部または完全な相同性を有することができ、前記ガイド核酸非結合配列の長さはガイド配列の長さと同一であり得る。一例として、前記ガイド配列はガイド核酸非結合配列と相同性を有する配列に基づいて設計され得る。
【0080】
前記ガイド核酸非結合配列はガイド核酸のガイドドメインに含まれたガイド配列に相同性を有するヌクレオチド配列であり得、例えば少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性を有するかまたは完全に相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【0081】
一例として、前記ガイド核酸非結合配列はガイド核酸のガイドドメインに含まれたガイド配列に相同的でない１～８個のヌクレオチド配列を有するか含むことができる。ガイド核酸非結合配列はガイド核酸結合配列と相補的結合ができ、前記ガイド核酸非結合配列はガイド核酸結合配列の長さと同一であり得る。
【0082】
前記ガイド核酸非結合配列はガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列であり得、例えば少なくとも９０％または９５％以上の相補的であるかまたは完全に相補的なヌクレオチド配列であり得る。
【0083】
一例として、前記ガイド核酸非結合配列はガイド核酸結合配列に相補的でない１～２個のヌクレオチド配列を有するか含むことができる。また、前記ガイド核酸結合配列はエディタ蛋白質が認識できるヌクレオチド配列（ＰＡＭ配列）と相補的な配列に近接した位置のヌクレオチド配列であり得る。
【0084】
一例として、前記ガイド核酸結合配列はエディタ蛋白質が認識できるヌクレオチド配列（ＰＡＭ配列）と相補的な配列の５′末端または／および３′末端に隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0085】
また、前記ガイド核酸非結合配列はエディタ蛋白質が認識できるヌクレオチド配列（ＰＡＭ配列）に近接した位置のヌクレオチド配列であり得る。
【0086】
一例として、前記ガイド核酸非結合配列はエディタ蛋白質が認識できるヌクレオチド配列（ＰＡＭ配列）の５′末端または／および３′末端に隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。
【0087】
「エディタ蛋白質」は核酸と直接的に結合するか、または直接結合はしないが相互作用できるペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を意味する。前記エディタ蛋白質に対して、概念的に「人為的に操作されたヌクレアーゼ」またはＲＧＥＮ（ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）と称したりもする。
【0088】
一具体例で、前記エディタ蛋白質はＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）酵素であり得る。「ＣＲＩＳＰＲ酵素」はＣＲＩＳＰＲ－ｅｎｚｙｍｅシステムの主要蛋白質構成要素であり、「Ｃａｓ蛋白質（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」と称したりもし、ガイドＲＮＡと混合または複合体を形成して標的配列を認知しＤＮＡを切断できるヌクレアーゼをいう。
【0089】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は当業者に公知であり、韓国登録特許１０－１６５６２３６、１０－１６５６２３７、１０－１７０６０８５、１０－２０５２２８６、１０－２１８２８４７を参照する。前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は天然型蛋白質の他にもガイドＲＮＡと協同して活性化されたエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）またはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）として作用できる変異体をすべて含む概念で本明細書で使われる。活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼである場合、標的ＤＮＡ切断をもたらし得、これを利用して遺伝体校正をもたらし得る。また、不活性化された変異体である場合、これを利用して転写調節あるいは目的とするＤＮＡの分離をもたらし得る。
【0090】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣＲＩＳＰＲ酵素を暗号化する配列を有する核酸またはポリペプチド（または蛋白質）であり、代表的にはＴｙｐｅ II ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＴｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ酵素が多く使われ、前記Ｔｙｐｅ II ＣＲＩＳＰＲ酵素としてはＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）蛋白質がある。
【0091】
前記Ｃａｓ９蛋白質はストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカスアウリクラーリス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などの多様な微生物から由来したものであり得る。
【0092】
Ｃａｓ９蛋白質が二本鎖ＤＮＡ切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｒｅａｋ）を誘導するためには、Ｃａｓ９蛋白質が一定の長さのヌクレオチド配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列を認識し、ガイドＲＮＡの一部（前記ガイド配列部分）が標的配列が位置するＤＮＡ一本鎖（前記ガイド核酸非結合配列）の相補的な鎖（前記ガイド核酸結合配列）と相補的に結合しなければならない。
【0093】
このＰＡＭ配列はＣａｓ９蛋白質の種類や起源により決定される配列であり、例えばストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９蛋白質（ＳｐＣａｓ９）は標的核酸内５′－ＮＧＧ－３′配列（相補的配列：５′－ＣＣＮ－３′）を認識することができる。この時、前記Ｎは前記Ｎはアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。また、前記ＳｐＣａｓ９は標的核酸内５′－ＮＡＧ－３′配列（相補的配列：５′－ＣＴＮ－３′）を低い活性で認識することができる。
【0094】
また、前記Ｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ酵素としてはＣｐｆ１があり、前記Ｃｐｆ１はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、ｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、ＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ由来のＣｐｆ１であり得る。
【0095】
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１蛋白質などのＣＲＩＳＰＲ酵素は、自然状態で存在する微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法で非自然的に生産されたものであり得る。前記Ｃａｓ蛋白質はまた、細胞内に導入され易い形態であり得る。その例として、Ｃａｓ蛋白質は細胞浸透ペプチドまたは蛋白質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）と連結され得る。前記蛋白質伝達ドメインはポリアルギニンまたはＨＩＶ由来のＴＡＴ蛋白質であり得るが、これに制限されない。細胞浸透ペプチドまたは蛋白質伝達ドメインは前記記述された例の他にも多様な種類が当業界に公知であるので、当業者は前記例に制限されず多様な例を本明細書に適用することができる。また、前記Ｃａｓ蛋白質はＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｓｉｇｎａｌ）のような機能的ドメインと融合することができる。また、前記Ｃａｓ９蛋白質はベクターの形態で暗号化されて細胞内で発現するものであり得る。
【0096】
本発明は間葉系幹細胞のＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列を標的化できるガイド配列を含むガイド核酸またはこれを暗号化する核酸配列；およびエディタ蛋白質またはこれを暗号化する核酸配列を含む酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物を提供する。
【0097】
また、前記組成物は挿入を望む特定ヌクレオチド配列を含むドナーまたはこれを暗号化する核酸配列を選択的にさらに含むことができる。
【0098】
前記ドナー（ｄｏｎｏｒ）は特定ペプチドまたは蛋白質を発現させることができる外因性ヌクレオチド配列（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を意味し、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ、ＨＤＲ）を通じてゲノムＤＮＡに挿入され得る。
【0099】
前記ドナーは二本鎖核酸または一本鎖核酸であり得る。前記ドナーは線形または円形であり得る。
【0100】
前記ドナーはウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）の形態であり得る。
【0101】
前記ウイルスはＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。この時、前記ＤＮＡウイルスは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。この時、前記ＲＮＡウイルスは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【0102】
前記ウイルスベクターはレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（Ｌｅｎｔ４ｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）および単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）で構成された群から選択される一つ以上のウイルスベクターであり得る。
【0103】
前記標的配列はガイド核酸－エディタ蛋白質複合体のターゲットとなり得、前記標的配列はエディタ蛋白質が認識するＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列を含むことができるが、これに制限されない。
【0104】
前記ガイド核酸は組成物はＫＥＡＰ１遺伝子の標的配列を標的化できるガイドドメインを含むことができる。
【0105】
本発明の一具現例として、前記組成物の前記標的配列は配列番号１～１５のうち選択された一つ以上の配列であるものであり得る。
【0106】
本明細書で、ガイド核酸、エディタ蛋白質またはガイド核酸－エディタ蛋白質複合体（リボヌクレオプロテイン、ＲＮＰ）および／またはドナーは多様な形態で対象内に伝達または導入され得る。
【0107】
この時「対象」はガイド核酸、エディタ蛋白質またはガイド核酸－エディタ蛋白質複合体が導入される有機体；ガイド核酸、エディタ蛋白質またはガイド核酸－エディタ蛋白質複合体が作動する有機体；または有機体から獲得した検体または試料を意味する。
【0108】
前記対象はガイド核酸－エディタ蛋白質複合体の標的遺伝子、標的核酸または標的染色体を含む有機体であり得る。
【0109】
前記有機体は動物、動物の組織または動物細胞であり得る。この時、前記組織は眼球、皮膚、肝、腎臓、心臓、肺、脳、筋肉または血液であり得る。
【0110】
前記細胞は幹細胞、肝細胞、心筋細胞、内皮細胞または膵臓細胞であり得る。
【0111】
前記検体または試料は唾、血液、肝組織、脳組織、肝細胞、神経細胞、食細胞、大食細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、星性膠細胞、癌細胞または幹細胞などの標的遺伝子、標的核酸または標的染色体を含む有機体で獲得したものであり得る。
【0112】
前記ガイド核酸、エディタ蛋白質またはガイド核酸－エディタ蛋白質複合体はＤＮＡ、ＲＮＡまたはこの混合形態で対象内に伝達または導入され得る。
【0113】
この時、ガイド核酸および／またはエディタ蛋白質を暗号化するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこの混合形態は当業界に公知の方法によって対象内に伝達または導入され得る。
【0114】
またはガイド核酸および／またはエディタ蛋白質を暗号化するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこの混合形態はベクター、非ベクターまたはこれらの組み合わせによって対象内に伝達または導入され得る。
【0115】
前記ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）であり得る。
【0116】
前記ウイルスはＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。この時、前記ＤＮＡウイルスは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。この時、前記ＲＮＡウイルスは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【0117】
前記ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される１以上であり得る。
【0118】
前記非ベクターはネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。
【0119】
本発明の一具現例として、前記ガイド核酸および／またはエディタ蛋白質を暗号化する核酸配列は１以上のベクターの形態で対象内に伝達または導入され得る。
【0120】
前記ベクターはガイド核酸および／またはエディタ蛋白質を暗号化する核酸配列を含むことができる。一例として、前記ベクターはガイド核酸とエディタ蛋白質を暗号化する核酸配列を同時に含むことができる。他の一例として、前記ベクターはガイド核酸を暗号化する核酸配列を含むことができる。例えば、前記ガイド核酸を暗号化する核酸配列は一つのベクターにすべて含まれるかまたはガイド核酸を暗号化する核酸配列が分割されて複数個のベクターに含ませることができる。他の一例として、前記ベクターはエディタ蛋白質を暗号化する核酸配列を含むことができる。例えば、前記エディタ蛋白質の場合、エディタ蛋白質を暗号化する核酸配列は一つのベクターに含まれるかまたはエディタ蛋白質を暗号化する核酸配列が分割されて複数個のベクターに含まれ得る。
【0121】
前記エディタ蛋白質はペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質の形態で対象内に伝達または導入され得る。
【0122】
前記エディタ蛋白質はペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質の形態で当業界に公知の方法によって対象内に伝達または導入され得る。
【0123】
前記ガイド核酸およびエディタ蛋白質は核酸－蛋白質混合の形態で対象内に伝達または導入され得る。
【0124】
前記ガイド核酸およびエディタ蛋白質はガイド核酸－エディタ蛋白質複合体の形態で対象内に伝達または導入され得る。例えば、前記ガイド核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたはこの混合形態であり得る。前記エディタ蛋白質はペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質の形態であり得る。一例として、ガイド核酸およびエディタ蛋白質はＲＮＡ形態のガイド核酸と蛋白質形態のエディタ蛋白質がガイド核酸－エディタ蛋白質複合体、すなわちｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＮＰ）の形態で対象内に伝達または導入され得る。
【0125】
また、本発明は（１）前記酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物を分離された間葉系幹細胞に導入する段階；および（２）前記間葉系幹細胞のゲノム内に位置したＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列にインデルを発生させることによって、Ｋｅａｐ１蛋白質の発現または活性が減少または抑制されるようにＫＥＡＰ１遺伝子を編集する段階を含む酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法を提供する。
【0126】
この時、前記「導入」は電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法、遺伝子銃、リポソーム、陽性リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合蛋白質方法、免疫リポソーム、多価陽イオンまたは脂質：核酸接合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの製剤向上吸収方法のうち選択された一つ以上の手段で遂行され得るが、これに制限されはしない。
【0127】
本発明の一具現例として、前記酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物を分離された間葉系幹細胞に電気穿孔法で導入して酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞を製造することができる。
【0128】
本発明の一具現例として、前記間葉系幹細胞のゲノム内に位置したＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子に、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９蛋白質およびＫｅａｐ１遺伝子の標的配列を標的化できるガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を接触させることによってインデルを発生させることができる。
【0129】
本発明の一具現例において、前記標的配列は配列番号１～１５からなる群から選択された一つ以上の配列であり得る。
【0130】
本発明の酸化ストレス抵抗性を有する人為的に操作された間葉系幹細胞は、虚血性心臓疾患（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）臨界下肢虚血（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ、ＣＬＩ）、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎ）、糖尿病性末梢血管病症、骨壊死（ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、腸間膜虚血（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、虚血性大腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ）、虚血性腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、急性腎障害（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血再灌流傷害（ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性肝炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、虚血性膵臓炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、虚血視神経病（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、慢性閉鎖性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔ４ｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９感染症、新生児低酸素性虚血性脳症（ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）のような虚血性疾患の予防または治療のための薬学組成物の有効性分として含まれて細胞治療剤として利用され得る。
【0131】
前記虚血再灌流傷害は一般的に臓器または組織への血液供給が中断されて組織への酸素供給が低下する虚血損傷と虚血状態で再灌流による血液循環を再開する時に発生し、急性炎症反応が誘発される再灌流障害の連続した複合結果である。
【0132】
本明細書において、「細胞治療剤」は個体から分離、培養および特殊な操作を通じて製造された細胞および組織で治療、診断および予防の目的で使われる医薬品（アメリカＦＤＡ規定）であり、細胞あるいは組織の機能を復元させるために生きている自家、同種、または異種細胞を体外で増殖選別したり他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を通じて治療、診断および予防の目的で使われる医薬品を意味する。
【0133】
本発明の細胞治療剤組成物の投与経路は、目的の組織に到達できる限り何らかの一般的な経路を通じて投与され得る。非経口投与、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、血内投与され得るが、これに制限されはしない。
【0134】
前記組成物は細胞治療に一般的に使われる薬剤学的坦体とともに適合した形態に剤形化され得る。「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され人間に投与される時、通常的に胃腸障害、めまいなどのようなアレルギー反応またはこれと類似する反応を起こさない組成物をいう。薬学的に許容される坦体としては例えば、水、適合したオイル、食塩水、水性グルコースおよびグリコールなどのような非経口投与用坦体などがあり、安定化剤および保存剤をさらに含むことができる。適合した安定化剤としては亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合した保存剤としてはベンザルコニウムクロリド、メチル－またはプロピルパラベンおよびクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される坦体としては次の文献に記載されているものを参照することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５）。
【0135】
また、前記組成物は細胞治療剤が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてもよい。
【0136】
本発明の細胞治療剤組成物は疾患の治療のために治療学的に有効な量の細胞治療剤を含むことができる。「治療学的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔ４ｅ ａｍｏｕｎｔ）」は研究者、獣医師、医師またはその他臨床によって考えられる組織系、動物または人間で生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量を含む。
【0137】
本発明の組成物に含まれる細胞治療剤は望む効果により変化されることは当業者に自明である。したがって、最適な細胞治療剤の含量は当業者によって容易に決定され得、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれた他の成分の含量、剤形の種類、および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時に使われる薬物をはじめとする多様な因子により調節され得る。前記要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を含むことが重要である。例えば、本発明の幹細胞の１日投与量は１．０×１０５～１．０×１０３０細胞／ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０１０～１．０×１０２０細胞／ｋｇ体重を１回または数回に分けて投与することができる。しかし、有効性分の実投与量は治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢および性別などの多様な関連因子に照らして決定されなければならないものと理解されるべきであり、したがって、前記投与量はいずれの面であれ、本発明の範囲を限定するものではない。
【0138】
また、本発明の細胞治療剤を有効性分として含む組成物は直腸、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ、ｉ．ｖ）、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、局所、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で投与することができる。
【0139】
本発明は哺乳動物に治療学的に有効な量の前記人為的に操作された間葉系幹細胞を投与することを含む虚血性疾患の治療方法を提供する。ここで使われた用語哺乳動物は、治療、観察または実験の対象である哺乳動物をいい、好ましくは人間をいう。この時、虚血性疾患は前記したものに従う。
【0140】
本発明はまた、哺乳動物で虚血性疾患の予防または治療に使うための薬剤の製造における前記人為的に操作された間葉系幹細胞の用途を提供する。この時、虚血性疾患は前記したものに従う。
発明の実施のための形態
発明の実施のための形態
【0141】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとする。
【0142】
これら実施例はひとえに本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者において自明であろう。
【0143】
実施例１：ＫＥＡＰ１ノックアウトされた間葉系幹細胞製造
【0144】
ｓｇＲＮＡ設計
【0145】
ＫＥＡＰ１遺伝子をノックアウトするために、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｄｅｓｉｇｎｅｒ／で予測されたガイド配列のうちオフターゲット効果が少なく予想されるｍｉｓｍａｔｃｈ １、０、０であるガイドＲＮＡの標的配列を選別した。
【0146】
ＫＥＡＰ１遺伝子の標的配列は下記の表１に整理して示した。
【0147】
【表1】
【0148】
前記配列番号１～１５の標的配列を標的化するそれぞれのガイドＲＮＡを合成して、以後の実験に使った。各ガイドＲＮＡに対する各標的配列のインデル効率は下記の標的化ディープシーケンシング方法を通じて測定し、その結果は図１に示した。
【0149】
ガイドＲＮＡはＭＥＧＡ ｓｈｏｒｔ ｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を利用してメーカーの指針により生体外転写した。ｓｇＲＮＡに対する鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は二つの相補的なオリゴヌクレオチドの結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）および伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を通じて製造した。
【0150】
ＲＮＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）伝達
【0151】
ＲＮＰ複合体は４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を利用して電気穿孔法で導入された。具体的には、ＲＮＰ複合体は４ｕｇ Ｃａｓ９蛋白質とｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｇＲＮＡ（Ｔ７ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を活用、メーカープロトコルにより製作）４ｕｇを混合して形成し、室温で１０分の間混合物をインキュベーティングした。前記ＲＮＰ複合体は２０ｕｌ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｐ１ ｂｕｆｆｅｒ処理された４×１０５ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＴ－２５０１）とともに核小体プログラム（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｇｒａｍ）ＥＷ－１０４を使って電気穿孔を遂行した。その結果ＫＥＡＰ１遺伝子がノックアウト（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）された間葉系幹細胞（ＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣ）を収得した。
【0152】
本明細書で人為的に操作された間葉系幹細胞の対照群としてＳＨＳ２３１遺伝配列位置が操作された細胞を使った。具体的には、ＳＨＳ２３１標的配列５′－ＧＡＴＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＧ－３′（配列番号１６）（アンダーライン：ＰＡＭ配列）を標的化できるガイドＲＮＡを前述した実験方法により合成し、間葉系幹細胞にＲＮＰ形態でガイドＲＮＡとＣａｓ９蛋白質を導入して、ＳＨＳ２３１遺伝配列が操作されたＭＳＣを収得した。
【0153】
標的化ディープシーケンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
【0154】
収得したＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣにＢｌｏｏｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｆａｖｏｒｇｅｎ）を利用してメーカープロトコルによりｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。標的部位の増幅のためにＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を使って１００ｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を増幅させた。ディープシーケンシングライブラリー生成のためにＴｒｕＳｅｑ ＨＴ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使ってアンプリコンをもう一度増幅させた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｎｉｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍを利用してＰａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを遂行し、インデル頻度は「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／」で計算した。
【0155】
標的化ディープシーケンシング結果、各標的配列に対するＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣの変異位置は野生型ＫＥＡＰ１遺伝子の配列を基準として表示した。一例として、配列番号１５（ｓｇＫｅａｐ１－ＢＲ－＃５）の標的化ディープシーケンシング結果は図２のように示された。
【0156】
標的化ディープシーケンシングに使った各標的配列に対するｐｒｉｍｅｒ配列は表２～４に示した。
【0157】
【表2】
【0158】
【表3】
【0159】
【表4】
【0160】
ＫＥＡＰ１ ｍＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ａｓｓａｙ
【0161】
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して得たし、このうち１ｕｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡにＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（ｔｏｙｏｂｏ）を使ってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してｑｕａｎｔｉｔａｔ４ｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ温度と時間およびｃｙｃｌｅ数は次の通りである。ＤＮＡ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９５℃１０分、ｐｒｉｍｅｒ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ５５－６０℃３０秒、ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ７２℃３０秒の間遂行し、４０ ｃｙｃｌｅ反復で増幅した。Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌとしてはＨｕｍａｎ ＧＡＰＤＨを使った。ｑＲＴ－ＰＣＲに使った各遺伝子に対するｐｒｉｍｅｒ配列は表５～６に示した。
【0162】
【表5】
【0163】
【表6】
【0164】
スクリーニングしたＫｅａｐ１ ｔａｒｇｅｔ ｓｇＲＮＡによって、Ｋｅａｐ１遺伝子内標的配列（配列番号１５）位置でのインデルが高くよく示されたし、ＫＥＡＰ１ ｍＲＮＡの発現も０に近く低くなったものと示された。また、ＷＴおよびＣｏｎｔｒｏｌとＫｅａｐ１ ＫＯ ＭＳＣを比較した時、外観上でもｓｐｉｎｄｌｅ－ｌｉｋｅ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅ ｓｈａｐｅの大きな差は示さなかった（図３参照）。
【0165】
比較例１：ＮＲＦ２がエディティングされた間葉系幹細胞製造
【0166】
ＮＲＦ２蛋白質を暗号化するＮＦＥ２Ｌ２遺伝子のｅｘｏｎ ２はＫＥＡＰ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎに関連しており、前記ＮＦＥ２Ｌ２ ｅｘｏｎ２が欠失される突然変異が発生すると、Ｎｒｆ２の標的遺伝子が活性化することが知られている（Ｌｅｏｎａｒｄ Ｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１６ Ｓｅｐ ６；１６１０：２６０５－２６１７．）。ＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣの酸化ストレス抵抗性がＫＥＡＰ１ ＫＯによるものであるか、Ｎｒｆ２の活性増加によるものであるかを確認するためにと比較実験を遂行した。Ｎｒｆ２活性モデル細胞を製作するために遺伝子編集を遂行してＮＲＦ２のｅｘｏｎ ２がｓｋｉｐされた間葉系幹細胞（Ｎｒｆ２ ｅｄｉｔｅｄ ＭＳＣ）を製造し、ＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣとＮｒｆ２ ｅｄｉｔｅｄ ＭＳＣのＨ２Ｏ２（酸化ストレス）抵抗性比較実験を進めた。
【0167】
具体的な実験方法は次の通りである。
【0168】
ｓｇＲＮＡ設計
【0169】
ＮＲＦ２遺伝子を標的 とするために、Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｆｉｌｅ上１－０－０ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ（０、１、２）に該当しつつ、ｉｎｔｒｏｎ １またはｉｎｔｒｏｎ ２を標的とすることができるガイドＲＮＡを選別した。
【0170】
ＮＲＦ２遺伝子の標的配列は下記の表７に整理して示した。
【0171】
【表7】
【0172】
ｓｇＮＲＦ２＃１～＃４はＮＲＦ２ ｅｘｏｎ２（ＫＥＡＰ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｅｘｏｎ）を標的部位とし、ｓｇＮＲＦ２＃５～＃１０はＮＲＦ２ ｉｎｔｒｏｎ ｓｉｔｅ（＃６、＃９を同時に使ってＮＲＦ２ ｅｘｏｎ２のｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎを誘導する）を標的部位とする。
【0173】
前記標的配列のうち配列番号４３～４８をそれぞれ標的とするｓｇＲＮＡを合成して、前記実施例１と同じ標的化ディープシーケンシング方法でＮＲＦ２遺伝子に対するインデル効率を測定し、その結果は図４に示した。
【0174】
前記標的配列のうち配列番号４４および配列番号４７の標的配列をそれぞれ標的化できる２種のｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｇＲＮＡを前記実施例１と同じ電気穿孔法を活用して一つの間葉系幹細胞に前記２種のｓｇＲＮＡをエディタ蛋白質と同時に導入することによって、Ｎｒｆ２遺伝子のｅｘｏｎ２がｓｋｉｐされたＭＳＣを製造した。
【0175】
実施例２：ＫＥＡＰ１ノックアウトされた間葉系幹細胞製造
【0176】
ｓｇＲＮＡ設計
【0177】
前記実施例１と同じ方法でＫＥＡＰ１遺伝子の標的配列を選別し、下記の表８に示した。
【0178】
【表8】
【0179】
ＲＮＰ（ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ）伝達、標的化ディープシーケンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）およびＫＥＡＰ１ ｍＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ａｓｓａｙ
【0180】
ＲＮＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）伝達、標的化ディープシーケンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）およびＫＥＡＰ１ ｍＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ａｓｓａｙは前記実施例１と同じ方法で遂行した。
【0181】
標的化ディープシーケンシングに使った各標的配列に対するｐｒｉｍｅｒ配列は表９に示した。
【0182】
【表9】
【0183】
前記配列番号１５と、配列番号４９～５６の標的配列を標的化する各ガイドＲＮＡに対する各標的配列のインデル効率は下記の標的化ディープシーケンシング方法を通じて測定し、その結果は図５に示した（図５で＃ＢＲ５は合成ｓｇＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｇｏ）であり残りは生体外転写したＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）である）。
【0184】
図６は、ＫＥＡＰ１遺伝子の各標的配列を標的化するｓｇＲＮＡを使ってＫＥＡＰ１遺伝子がノックアウトされた間葉系幹細胞でＫＥＡＰ１遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現程度をｑＲＴ－ＰＣＲを利用して比較して示したグラフである。
【0185】
ＫＥＡＰ１ノックアウトされた間葉系幹細胞Ｐ６で前記配列番号１５と、配列番号５０の標的配列を標的化する各ガイドＲＮＡに対する各標的配列のインデル効率（図８（ａ））と、ＫＥＡＰ１ノックアウトされた間葉系幹細胞Ｐ６およびＰ７でｑＲＴ－ＰＣＲを利用して測定したＫＥＡＰ１遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現程度（図８（ｂ））は図８に示した。
【0186】
実験例１：細胞生存性および成長率分析
【0187】
ＣＣＫ８ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ ｕｎｄｅｒ ｏｘｉｄａｔ４ｅ ｓｔｒｅｓｓ
【0188】
酸化ストレス（Ｏｘｉｄａｔ４ｅ ｓｔｒｅｓｓ）による細胞の生存率を確認するためにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）を利用して各群の生存細胞を測量した。具体的には、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで培養された細胞にＨ２Ｏ２を濃度別に処理し、２４ｈの間さらに培養した後、各ｗｅｌｌ当たりＣＣＫ－８溶液を１０μＬずつ添加し２ｈの間反応させた。以後ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒを利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0189】
ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）、ＰＤＴ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ）
【0190】
細胞の成長度を調べるために継代培養前、後の細胞数を測量した。Ｈａｒｖｅｓｔ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ数（Ｃｔ）をＳｅｅｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ数（Ｃｉ）で割った値をＧｒｏｗｔｈ ｒａｔｅと見て、ＰＤＬ（ｎ）を次の数学式１のような公式で計算した。
【0191】
【数1】
【0192】
培養時間（ｈｒ）をＰＤＬで割った値をＰｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ（ＰＤＴ）で表示した。
【0193】
成長率はＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣがＷＴに比べて多少高いと観測されたが、一般環境での生存性は大きな差は示さなかった（図９（ａ）参照）。反面、過酸化水素の濃度を次第に高くして添加した結果（酸化的ストレス環境造成）ＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣは過酸化水素が相当に多く投与された時も（４５０μＭ）高い生存性を示した（図９（ｂ）参照）。
【0194】
ＮＲＦ２ ｅｘｏｎ２ ｓｋｉｐ ｅｄｉｔｅｄ ＭＳＣ（ｓｇＮＲＦ２－＃６＋＃９同時標的）はＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣ（ｓｇＫｅａｐ１－ＢＲ＃５標的）のようにＨ２Ｏ２ ４００ｕＭまで類似する生存効果を示したがＨ２Ｏ２ ４５０ｕＭではＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣがさらに高い生存効果を示した。これはＫＥＡＰ１ノックアウトはＮＲＦ２活性化だけでなくＨ２Ｏ２抵抗性に対する他の生存効果があると見られる（図１０参照）。
【0195】
ＫＥＡＰ１標的配列によるＨ２Ｏ２抵抗性を比較してみた結果、配列番号１５（ｓｇＫｅａｐ１－ＢＲ＃５）の標的配列をノックアウトした間葉系幹細胞が高い濃度のＨ２Ｏ２で相対的にさらに高い生存効果を示した（図１１、図１２参照）。
【0196】
配列番号１５（ｓｇＫｅａｐ１－ＢＲ＃５）と配列番号５０（ｓｇＫＥＡＰ１－ｅｘｏｎ３－＃２３）の標的配列をノックアウトした幹細胞の生存率（図１３（ａ））、成長率（図１３（ｂ））、ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）（図１３（ｃ））およびＰｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ（ＰＤＴ）（図１３（ｄ））を図１３に示した。
【0197】
実験例２：細胞周期分析
【0198】
ＢｒｄＵ（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）Ａｓｓａｙ
【0199】
培養された細胞をｈａｒｖｅｓｔする前に１時間の間１０ｕＭ ＢｒｄＵを処理した。ＢｒｄＵを処理した後、ＰＢＳに希釈された３％ホルムアルデヒドで４℃で１時間固定させた後、ｈａｒｖｅｓｔして１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を室温で５分間処理した。再び細胞を遠心分離してＰＢＳでｗａｓｈｉｎｇし、４Ｎ ＨＣＬを１０分間室温で処理してＤＮＡ二本鎖を解いた後ＰＢＳでｗａｓｈｉｎｇした。室温で３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（３０％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）を処理した後、ｈａｒｖｅｓｔした。ＰＢＳに１００倍希釈したａｎｔｉ－ＢｒｄＵ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧを３０分間４℃で反応させた。これをＰＢＳに希釈された０．２％ｔｗｅｅｎ ２０で洗って遠心分離された後、集められた細胞を最後にＰＢＳで希釈してフローサイトメーターで分析した。
【0200】
ＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓ
【0201】
前記にてＢｒｄＵ処理されたＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣをｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で２回洗浄後、０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを使って細胞をカルチャープレートから離して１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００ｕｌのＦＡＣＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅでｃｅｌｌをｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎさせａｎｔｉｂｏｄｙを混合して１時間の間４度で反応後、ＰＢＳで２回ｗａｓｈｉｎｇし、５００ｕｌのＰＢＳで浮遊させてＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓした。
【0202】
ＢｒｄＵ Ａｓｓａｙで細胞周期を観測した結果、ＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣはＳ ｐｈａｓｅが頻繁に観測されて細胞増殖が活発に起きることが分かった（図１４参照）。
【0203】
実験例３：テロメア長さ分析（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ｑＰＣＲ）
【0204】
ＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣのｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルはＢｌｏｏｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ）を利用して得たし、このうち５ｎｇ ｇＤＮＡをＡｂｓｏｌｕｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｌｅｎｇｔｈ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｑＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）を使ってＴｅｌｏｍｅｒｅ Ｌｅｎｇｔｈ値を測定した。Ｋｉｔ内Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡと実験ｇＤＮＡ ｓａｍｐｌｅをＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してｑｕａｎｔｉｔａｔ４ｅ ＲＴ－ＰＣＲを遂行してその長さを比較した。ＰＣＲ温度と時間およびｃｙｃｌｅ数は次の通りである。ＤＮＡ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９５℃１０分、ｐｒｉｍｅｒ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ５２℃２０秒、ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ７２℃４５秒の間遂行し、３２ ｃｙｃｌｅ反復で増幅した。
【0205】
テロメア長さ分析結果、ＫＥＡＰ１ノックアウトによる抗老化作用の結果で細胞増殖が活発であると同時に、テロメアの長さが長くなったことが分かった（図１５参照）。
【0206】
実験例４：サイトカイン分析を使ったプロテオミクスデータ検証
【0207】
サイトカイン分析はＨｕｍａｎ ＸＬ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．ｎｏ．ＡＲＹ０２２、Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使ってメーカーのマニュアルにより遂行した。まず、アレイ分離膜を４ ｗｅｌｌ ｍｕｌｔｉ－ｄｉｓｈに入れてａｒｒａｙ ｂｕｆｆｅｒ ６と共にｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｓｈａｋｅｒで一時間の間ｂｌｏｃｋｉｎｇさせた。ｂｌｏｃｋｉｎｇした後、分離膜はＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣ培養液サンプルと共にｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｓｈａｋｅｒで２～８℃を維持しながら、一晩中（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）インキュベーティングした。以後、分離膜は１Ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで１０分ずつ３回洗浄した。希釈されたＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌを各ｗｅｌｌ当たり１．５ｍｌずつ入れてｓｈａｋｅｒで１時間インキュベーティングした。以後、１Ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。洗浄後、２ｍｌ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを各ｗｅｌｌに入れて３０分間反応させた。最後に、１ｍｌ Ｃｈｅｍｉ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍｉｘ溶液を各分離膜に均一に噴射した後、自家放射分析を遂行した。収得したＸ線フィルムをスキャンし、フィルム上のピクセル密度をイメージ分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を利用して分析した。
【0208】
ＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣはオステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＯＰＮ）、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＩＬ－８、ＶＥＧＦ、ｕＰＡＲのような多くのサイトカインの発現が増加したし、そのうちオステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）とアンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）の発現が大きく増加した（図１６参照）。オステオポンチン（ＯＰＮ）の一時的増加は血管新生を促進させて傷の治療に利点を示し、また、発現が大きく増加したアンジオポエチン－１は血漿漏水／血管炎症／内皮細胞壊死防止などの強力な血管保護効果を示すため、各種心血管系疾患に肯定的な影響を与えると予想される。
【0209】
実験例５：ｉｎ ｖｉｖｏ生存能確認
【0210】
ＭＳＣはＩＶ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）投与時に主に肺に蓄積されるので、一般ｍｉｃｅにＫＥＡＰ１ノックアウトＭＳＣをＩＶで投与して、肺組織を採取して染色し分析した結果を図１１に示した。具体的には、対照群およびＫＥＡＰ１ ＫＯ ＭＳＣはｉｎ ｖｉｖｏでＩＶ経路投与時の体内の各部に蓄積される程度をｔｒａｃｋｉｎｇするためにＶｙｂｒａｎｔ ＤｉＤ ｃｅｌｌ－ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを通じて染色された（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。各実験グループの染色されたＭＳＣは２×１０５ ｃｅｌｌｓだけそれぞれ６－８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６ ｍｏｕｓｅ（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ）にｔａｉｌ ｖｅｉｎを通じて血管注射された。注射後１日目および２日目にそれぞれマウスの肺を摘出してＤｉＤに対するｅｘ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇをＦＯＢＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＬＬＧＥＮＴＥＫ）を利用して進めた。ＤｉＤ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ測定を通じてＭＳＣの残存度を測定した。
【0211】
図１７を参照すると、ＫＥＡＰ１ノックアウト間葉系幹細胞は比較対象に比べて、ｉｎ ｖｉｖｏ環境で優れた生存能を示した。このように優れた効果を示すＫＥＡＰ１ノックアウト間葉系幹細胞は、心臓、血管、肺、脳などの生体内環境で、多様な虚血性疾患および炎症性疾患の治療に使われ得るものと考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
人為的に操作されたＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子を含む人為的に操作された間葉系幹細胞であって、前記人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子は野生型間葉系幹細胞のＫｅａｐ １遺伝子配列と異なり、
前記人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子は核酸配列内に一つ以上のインデル（ｉｎｄｅｌ）を含み、
この時、前記インデルはＫｅａｐ１遺伝子のエキソン第２領域またはエキソン第３領域でプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列内、またはＰＡＭ配列の５′末端または３′末端と隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列内に位置し、
前記人為的に操作された間葉系幹細胞は酸化ストレス抵抗性が向上したことを特徴とする、人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項2】
前記人為的に操作されたＫｅａｐ１遺伝子の配列は、配列番号１～１５および配列番号４９～５６からなる群から選択された一つ以上の配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項3】
前記人為的に操作された間葉系幹細胞内で、前記人為的に操作されたＫｅａｐ １遺伝子から転写されるｍＲＮＡは野生型間葉系幹細胞のＫｅａｐ １遺伝子から転写されるｍＲＮＡ発現水準と比較して、そのｍＲＮＡ発現水準がさらに低いかまたは配列が異なることを特徴とする、請求項１に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項4】
前記人為的に操作された幹細胞は酸化的ストレス環境で高い生存性を有することを特徴とする、請求項１に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項5】
前記人為的に操作された間葉系幹細胞は脂肪、骨髓、臍帯、胎盤、羊水、羊膜、組織、臍帯血または出産前後組織（ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ）由来であることを特徴とする、請求項１に記載の人為的に操作された間葉系幹細胞。
【請求項6】
間葉系幹細胞のＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列を標的化できるガイド配列を含むガイド核酸またはこれを暗号化する核酸配列；およびエディタ蛋白質またはこれを暗号化する核酸配列を含む、酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項7】
前記標的配列は配列番号１～１５および配列番号４９～５６からなる群から選択された選択された一つ以上の配列であることを特徴とする、請求項６に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項8】
前記組成物は前記エディタ蛋白質および前記ガイド核酸をリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）形態で含む、請求項６に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項9】
前記組成物は前記エディタ蛋白質を暗号化する核酸配列および前記ガイド核酸を暗号化する核酸配列を１以上のベクター形態で含む、請求項６に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項10】
前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択されたことを特徴とする、請求項９に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物。
【請求項11】
（１）Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列を標的化できるガイド核酸またはこれを暗号化する核酸配列；およびエディタ蛋白質またはこれを暗号化する核酸配列を含む酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞製造用組成物を分離された間葉系幹細胞に導入する段階；および（２）前記間葉系幹細胞のゲノム内に位置したＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列にインデルを発生させることによって、Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）蛋白質の発現または活性が減少または抑制されるようにＫｅａｐ１遺伝子を編集する段階を含む、酸化ストレス抵抗性を有する幹細胞の製造方法。
【請求項12】
前記標的配列は配列番号１～１５および配列番号４９～５６からなる群から選択された一つ以上の配列であることを特徴とする、請求項１１に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項13】
前記インデルはＫｅａｐ１遺伝子のエキソン第２領域またはエキソン第３領域でプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ、ＰＡＭ）配列内、またはＰＡＭ配列の５′末端または３′末端と隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列内に位置するように発生させる、請求項１１に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項14】
前記組成物は前記エディタ蛋白質を暗号化する核酸配列および前記ガイド配列を暗号化する核酸配列を１以上のベクター形態で含む、請求項１１に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項15】
前記間葉系幹細胞のゲノム内に位置したＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の標的配列に、ストレプトコッカスピオゲネス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９蛋白質およびＫｅａｐ１遺伝子の標的配列を標的化できるガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を接触させることによってインデルを発生させる、請求項１１に記載の酸化ストレス抵抗性を有する間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項16】
請求項１～請求項５のいずれか一項に記載された人為的に操作された間葉系幹細胞を有効性分として含む、虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項17】
前記虚血性疾患は虚血性心臓疾患（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）臨界下肢虚血（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ、ＣＬＩ）、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎ）、糖尿病性末梢血管病症、骨壊死（ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、腸間膜虚血（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、虚血性大腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ）、虚血性腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、急性腎障害（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血再灌流傷害（ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性肝炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、虚血性膵臓炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、虚血視神経病（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、慢性閉鎖性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔ４ｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９感染症、新生児低酸素性虚血性脳症（ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、または脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）である、請求項１６に記載の虚血性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項18】
非ヒト哺乳動物に治療学的に有効な量の請求項１～請求項５のいずれか一項に記載された人為的に操作された間葉系幹細胞を投与することを含む、虚血性疾患の治療方法。
【請求項19】
前記虚血性疾患は虚血性心臓疾患（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）臨界下肢虚血（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ、ＣＬＩ）、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎ）、糖尿病性末梢血管病症、骨壊死（ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、腸間膜虚血（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ）、虚血性大腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ）、虚血性腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、急性腎障害（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血再灌流傷害（ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性肝炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、虚血性膵臓炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、虚血視神経病（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、慢性閉鎖性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔ４ｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９感染症、新生児低酸素性虚血性脳症（ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｏｘｉｃ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、または脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）である、請求項１８に記載の虚血性疾患の治療方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0024】
本明細書で使われる「約」という用語は、参照量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１程度に変わる量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
【国際調査報告】