特表 2024-527742 アデノ随伴ウイルス粒子及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-26

(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルス粒子及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20240719BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240719BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240719BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240719BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240719BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/12 ZNA

A61K35/76

A61K48/00

A61K38/17

A61P21/04

A61P9/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024501135

(86)(22)【出願日】2022-08-05

(85)【翻訳文提出日】2024-01-25

(86)【国際出願番号】 US2022074622

(87)【国際公開番号】W WO2023015304

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】63/229,936

(32)【優先日】2021-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/239,881

(32)【優先日】2021-09-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513204012

【氏名又は名称】インスメッド インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】カスパー，ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】カスパー，アラン

(72)【発明者】

【氏名】トムセン，グレッチェン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA35

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA36

4C084ZA94

4C084ZC51

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA36

4C087ZA94

4C087ZC51

(57)【要約】

本発明は、ＡＡＶ粒子を含む髄腔内組成物、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーを含むジストロフィノパチーなどの単一遺伝子筋肉障害を治療するためのそれらの使用を提供する。
【選択図】図１１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、髄腔内組成物であって、前記ＡＡＶ粒子が、ベクターゲノムをカプシド封入するカプシドを含み、前記ベクターゲノムが、５’から３’まで、
５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、
プロモーターと、
ＳＶ４０イントロンと、
マイクロジストロフィン（μＤｙｓ）導入遺伝子と、
ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、
３’ＩＴＲと、を含み、
前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、静脈内組成物中のμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する有効量のＡＡＶ粒子よりも約９０％以下のベクターゲノムを含む、髄腔内組成物。

【請求項2】

有効量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、髄腔内組成物であって、前記ＡＡＶ粒子が、ベクターゲノムをカプシド封入するカプシドを含み、前記ベクターゲノムが、５’から３’まで、
５’ＩＴＲと、
エンハンサーと、
プロモーターと、
マイクロジストロフィン（μＤｙｓ）導入遺伝子と、
ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、
３’ＩＴＲと、を含み、
前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、静脈内組成物中のμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する有効量のＡＡＶ粒子よりも約９０％以下のベクターゲノムを含む、髄腔内組成物。

【請求項3】

前記エンハンサーが、ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーである、請求項２に記載の髄腔内組成物。

【請求項4】

前記ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーが、配列番号８を含む配列を有する、請求項３に記載の髄腔内組成物。

【請求項5】

前記エンハンサーが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーである、請求項２に記載の髄腔内組成物。

【請求項6】

前記サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーが、配列番号９を含む配列を有する、請求項５に記載の髄腔内組成物。

【請求項7】

前記ベクターゲノムが、前記マイクロジストロフィン導入遺伝子の５’（上流）及び前記プロモーターの３’（下流）にＳＶ４０イントロンを更に含む、請求項２に記載の髄腔内組成物。

【請求項8】

前記ベクターゲノムが、（ｉ）アクチン結合部位を含むＮ末端領域（ＮＴＤ）と、（ｉｉ）２～４個のヒンジ領域及び４～６個のスペクトリン反復を含む中央ロッドドメインと、（ｉｉｉ）システイン豊富ドメインと、を含む、μＤｙｓタンパク質をコードするマイクロジストロフィン（μＤｙｓ）導入遺伝子を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項9】

前記ベクターゲノム静脈内組成物が、（ｉ）アクチン結合部位を含むＮ末端領域（ＮＴＤ）と、（ｉｉ）３個のヒンジ領域及び４個のスペクトリン反復を含む中央ロッドドメインと、（ｉｉｉ）システイン豊富ドメインと、を含む、μＤｙｓタンパク質をコードするマイクロジストロフィン（μＤｙｓ）導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項10】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１６及び１７を含む、請求項８又は９に記載の髄腔内組成物。

【請求項11】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１及び２４を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項12】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復２を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項13】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復２２を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項14】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復２３を含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項15】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１、１６、１７、２３、及び２４を含む、請求項８に記載の髄腔内組成物。

【請求項16】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１、２、３、及び２４を含む、請求項８に記載の髄腔内組成物。

【請求項17】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１、２、２２、２３、及び２４を含む、請求項８に記載の髄腔内組成物。

【請求項18】

前記ヒンジ領域が、ジストロフィンヒンジ領域１及び４を含む、請求項８～１７のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項19】

前記ヒンジ領域が、ヒンジ領域１、３、及び４を含む、請求項８～１７のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項20】

前記マイクロジストロフィン導入遺伝子が、配列番号５を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項21】

前記マイクロジストロフィン導入遺伝子が、配列番号５からなる、請求項１～９のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項22】

前記５’ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項23】

前記５’ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号１を含む配列を有する、請求項２２に記載の髄腔内組成物。

【請求項24】

前記５’ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号１からなる配列を有する、請求項２２又は２３に記載の髄腔内組成物。

【請求項25】

前記３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項26】

前記３’ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号７を含む配列を有する、請求項２５に記載の髄腔内組成物。

【請求項27】

前記３’ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号７からなる配列を有する、請求項２５又は２６に記載の髄腔内組成物。

【請求項28】

前記プロモーターが、ＭＨＣＫ７プロモーターである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項29】

前記プロモーターが、ニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーターである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項30】

前記ニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーターが、配列番号３に記載される配列を含む、請求項２９に記載の髄腔内組成物。

【請求項31】

前記ＭＨＣＫ７プロモーターが、配列番号２に記載される配列を含む、請求項２８に記載の髄腔内組成物。

【請求項32】

前記ＭＨＣＫ７プロモーターが、配列番号２に記載される配列からなる、請求項２８に記載の髄腔内組成物。

【請求項33】

前記ＳＶ４０イントロンが、配列番号４に記載される核酸配列を含む、請求項１及び３～３２のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項34】

前記ＳＶ４０イントロンが、配列番号４に記載される核酸配列からなる、請求項１及び３～３２のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項35】

前記ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールが、配列番号６に記載される核酸配列を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項36】

前記ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールが、配列番号６に記載される核酸配列からなる、請求項１～３５のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項37】

前記カプシドが、１つ以上のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項38】

前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ９粒子であり、前記カプシドが、ＡＡＶ９カプシドタンパク質からなる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項39】

前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ９粒子であり、前記カプシドが、ＡＡＶ９カプシドタンパク質からなる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項40】

前記カプシドが、１つ以上のＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項41】

前記１つ以上のＡＡＶ９カプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１を含む、請求項４０に記載の髄腔内組成物。

【請求項42】

前記１つ以上のＡＡＶ９カプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ２を含む、請求項４０又は４１に記載の髄腔内組成物。

【請求項43】

前記１つ以上のＡＡＶ９カプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ３を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項44】

前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ９粒子である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項45】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、前記静脈内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子よりも約８０％以下のベクターゲノムを含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項46】

前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、前記静脈内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子よりも約７０％以下のベクターゲノムを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項47】

前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、前記有効量の前記静脈内組成物よりも約１０～４０倍少ないベクターゲノムを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の髄腔内組成物。

【請求項48】

ジストロフィノパチーの治療を必要とする対象においてジストロフィノパチーを治療する方法であって、請求項１～４７のいずれか一項に記載の髄腔内組成物を単回用量で前記対象に髄腔内投与することを含む、方法。

【請求項49】

前記対象が、約６ヶ月～約７歳の男性対象である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記対象が、約１歳～約７歳の男性対象である、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記対象が、約２歳～約７歳の男性対象である、請求項４８に記載の方法。

【請求項52】

前記対象が、約３歳～約７歳の男性対象である、請求項４８に記載の方法。

【請求項53】

前記対象が、約４歳～約７歳の男性対象である、請求項４８に記載の方法。

【請求項54】

前記対象が、約５歳～約７歳の男性対象である、請求項４８に記載の方法。

【請求項55】

前記対象が、約２歳～約６歳の男性対象である、請求項４８に記載の方法。

【請求項56】

前記対象が、約２歳～約５歳の男性対象である、請求項４８に記載の方法。

【請求項57】

前記ジストロフィノパチーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記ジストロフィノパチーが、ベッカー型筋ジストロフィーである、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記ジストロフィノパチーが、ＤＭＤ関連拡張型心筋症（ＤＣＭ）である、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記対象が、前記治療中にトレンデレンブルグ位に配置される、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記髄腔内組成物が、非イオン性低浸透圧造影剤の非存在下で投与される、請求項４８～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、静脈内投与される同一のベクターゲノム用量の同じＡＡＶ粒子よりも優れた治療応答を提供する、請求項４５～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、静脈内投与されたときの前記静脈内組成物中の同一のベクターゲノム用量の前記ＡＡＶ粒子よりも優れた治療応答を提供する、請求項４８～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記髄腔内組成物が、前記静脈内組成物中の有効ベクターゲノム用量の前記ＡＡＶ粒子よりも約９０％、約９０％以下、約７５％、約７５％以下、約５０％、約５０％以下、約２５％、又は約２５％以下の有効ベクターゲノム用量を含む、請求項４８～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

髄腔内組成物が、前記静脈内組成物中の前記有効ベクターゲノム用量の前記ＡＡＶ粒子よりも約９０％以下の有効ベクターゲノム用量を含む、請求項４８～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

髄腔内組成物が、前記静脈内組成物中の前記有効ベクターゲノム用量の前記ＡＡＶ粒子よりも約８０％以下の有効ベクターゲノム用量を含む、請求項４８～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

髄腔内組成物が、前記静脈内組成物中の前記有効ベクターゲノム用量の前記ＡＡＶ粒子よりも約７５％以下の有効ベクターゲノム用量を含む、請求項４８～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

髄腔内組成物が、前記静脈内組成物中の前記有効ベクターゲノム用量の前記ＡＡＶ粒子よりも約５０％以下の有効ベクターゲノム用量を含む、請求項４８～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

髄腔内組成物が、前記静脈内組成物中の前記有効ベクターゲノム用量の前記ＡＡＶ粒子よりも約２５％以下の有効ベクターゲノム用量を含む、請求項４８～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

治療することが、前記対象のベースラインノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）スコアと比較して、治療後の前記対象のＮＳＡＡスコアを増加させることを含む、請求項４８～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記スコアを増加させることが、前記スコアを約５～約２５、又は約５～約２０、約５～約１５、又は約５～約１０だけ増加させることを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記スコアを増加させることが、前記スコアを約２～約１２点増加させることを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項73】

前記スコアを増加させることが、前記スコアを約２～約１０点増加させることを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項74】

前記スコアを増加させることが、前記スコアを約３～約１０点増加させることを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項75】

前記スコアを増加させることが、前記スコアを約４～約１０点増加させることを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項76】

前記スコアを増加させることが、前記スコアを約２～約８点増加させることを含む、請求項０に記載の方法。

【請求項77】

前記スコアを増加させることが、前記スコアを約２～約６点増加させることを含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項78】

前記対象の前記ベースラインＮＳＡＡスコアが、前記対象が前記治療方法を受ける前に測定される、請求項７０～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

治療後の前記ＮＳＡＡスコアが、前記組成物の髄腔内投与の６ヶ月後に測定される、請求項７０～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

治療後の前記ＮＳＡＡスコアが、前記組成物の髄腔内投与の１２ヶ月後に測定される、請求項７０～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

治療後の前記ＮＳＡＡスコアが、前記組成物の髄腔内投与の１８ヶ月後に測定される、請求項７０～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

治療後の前記ＮＳＡＡスコアが、前記組成物の髄腔内投与の２４ヶ月後に測定される、請求項７０～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

治療することが、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）において前記対象が歩くベースラインメートル数と比較して、治療後の前記６ＭＷＴにおいて前記対象が歩くメートル数を増加させることを含む、請求項４８～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記６ＭＷＴにおいて前記対象が歩く前記ベースラインメートル数が、前記対象が前記治療方法を受ける前に測定される、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

治療後の前記６分間歩行試験（６ＭＷＴ）が、前記組成物の髄腔内投与の６ヶ月後に評価される、請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項86】

治療後の前記６分間歩行試験（６ＭＷＴ）が、前記組成物の髄腔内投与の１２ヶ月後に評価される、請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項87】

治療後の前記６分間歩行試験（６ＭＷＴ）が、前記組成物の髄腔内投与の１８ヶ月後に評価される、請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項88】

治療後の前記６分間歩行試験（６ＭＷＴ）が、前記組成物の髄腔内投与の２４ヶ月後に評価される、請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項89】

治療後の前記６分間歩行試験（６ＭＷＴ）が、前記組成物の髄腔内投与の３６ヶ月後に評価される、請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項90】

治療後の前記６分間歩行試験（６ＭＷＴ）が、前記組成物の髄腔内投与の４８ヶ月後に評価される、請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項91】

治療後の前記６分間歩行試験（６ＭＷＴ）が、前記組成物の髄腔内投与の６０ヶ月後に評価される、請求項８３又は８４に記載の方法。

【請求項92】

前記６ＭＷＴにおいて前記対象が歩くメートル数を増加させることが、約５メートル～約５０メートル、約５メートル～約４５メートル、約５メートル～約４０メートル、約５メートル～約３５メートル、約５メートル～約３０メートル、約５メートル～約２５メートル、約５メートル～約２０メートル、約５メートル～約１５メートル、又は約５メートル～約１０メートル増加させることを含む、請求項８３～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記有効量の髄腔内に投与された前記ＡＡＶ粒子が、有効用量で静脈内投与されるμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子と比較して、副作用の数の減少、又は１つ以上の副作用の重症度の低減をもたらす、請求項４８～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記髄腔内組成物が、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、骨格筋及び心筋においてより優れたμＤｙｓ導入遺伝子発現を提供する、請求項４８～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記有効量の前記髄腔内組成物が、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、骨格筋又は心筋においてより優れたμＤｙｓ導入遺伝子発現を提供する、請求項４８～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記有効量の前記髄腔内組成物が、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、骨格筋においてより優れたμＤｙｓ導入遺伝子発現を提供する、請求項４８～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記有効量の前記髄腔内組成物が、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、心筋においてより優れたμＤｙｓ導入遺伝子発現を提供する、請求項４８～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記より優れたμＤｙｓ導入遺伝子発現が、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％優れた発現である、請求項９４～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記髄腔内組成物の投与の１８ヶ月後に測定された前記治療応答が、前記髄腔内組成物の投与の１２ヶ月後に測定された前記治療応答と実質的に同じであるか、又はそれよりも良好である、請求項４８～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記髄腔内組成物の投与の２４ヶ月後に測定された前記治療応答が、前記髄腔内組成物の投与の１２ヶ月後に測定された前記治療応答と実質的に同じであるか、又はそれよりも良好である、請求項４８～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

対象の骨格筋及び／又は心筋にマイクロジストロフィン（μＤｙｓ）導入遺伝子を優先的に送達するための方法であって、
有効量のアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）粒子と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、髄腔内組成物を、単回用量で対象に髄腔内投与することを含み、前記ＡＡＶ９粒子が、ベクターゲノムをカプシド封入するＡＡＶ９カプシドを含み、前記ベクターゲノムが、５’から３’まで、
５’ＩＴＲと、
プロモーターと、
μＤｙｓ導入遺伝子と、
ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、
３’ＩＴＲと、を含み、
投与後、前記μＤｙｓ導入遺伝子が、前記対象の肝組織における導入遺伝子発現と比較して、前記対象の骨格筋又は心筋においてより高いレベルで発現される、方法。

【請求項102】

投与後、前記μＤｙｓ導入遺伝子が、前記対象の肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現と比較して、前記対象の骨格筋においてより高いレベルで発現される、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

投与後、前記μＤｙｓ導入遺伝子が、前記対象の肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現と比較して、前記対象の心筋においてより高いレベルで発現される、請求項１０１又は１０２に記載の方法。

【請求項104】

投与後、前記μＤｙｓ導入遺伝子が、前記対象の肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現と比較して、前記対象の骨格筋及び心筋においてより高いレベルで発現される、請求項１０１に記載の方法。

【請求項105】

前記より高いレベルが、肝組織における導入遺伝子発現の量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％高い、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記５’ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項１０１～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記５’ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号１の配列を含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記５’ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号１からなる配列を有する、請求項１０６又は１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項１０１～１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

前記３’ＡＡＶ２ ＩＴＲが、配列番号７を含む配列を有する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記プロモーターが、ＭＨＣＫ７プロモーターである、請求項１０１～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記ＭＨＣＫ７プロモーターが、配列番号２を含む配列を有する、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記プロモーターが、ニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーターである、請求項１０１～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記ニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーターが、配列番号３を含む配列を有する、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

前記ベクターゲノムが、前記導入遺伝子の５’（上流）及び前記プロモーターの３’（下流）にＳＶ４０イントロンを更に含む、請求項１０１～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記ＳＶ４０イントロンが、配列番号４を含む配列を有する、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記ＳＶ４０イントロンが、配列番号４からなる配列を有する、請求項１１５又は１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールが、配列番号６を含む配列を有する、請求項１０１～１１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記ベクターゲノムが、エンハンサーが前記５’ＩＴＲの３’（下流）及び前記プロモーターの５’（上流）にあることを更に含む、請求項１０１～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記エンハンサーが、ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーが、配列番号８を含む配列を有する、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記エンハンサーが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項123】

前記サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーが、配列番号９を含む配列を有する、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記対象が、前記投与中にトレンデレンブルグ位に配置される、請求項１０１～１２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項125】

前記髄腔内組成物が、非イオン性低浸透圧造影剤の非存在下で投与される、請求項１０１～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

髄腔内投与された前記ＡＡＶ９粒子の用量が、静脈内投与される同一用量の同じＡＡＶ９粒子と比較して、骨格筋及び／又は心筋においてより優れた導入遺伝子発現を提供する、請求項１０１～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記髄腔内投与されたＡＡＶ９粒子によって提供される［（骨格筋及び／又は心筋導入遺伝子発現）］／（肝臓導入遺伝子発現）］の比が、同一用量の同じＡＡＶ９粒子が静脈内投与されるときの同じ比よりも大きい、請求項１０１～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

前記導入遺伝子が、（ｉ）アクチン結合部位を含むＮＴＤと、（ｉｉ）２～４個のヒンジ領域及び４～６個のスペクトリン反復を含む中央ロッドドメインと、（ｉｉｉ）システイン豊富ドメインと、を含む、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするマイクロジストロフィン導入遺伝子である、請求項１０１～１２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項129】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１６及び１７を含む、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１及び２４を含む、請求項１２８又は１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復２を含む、請求項１２８～１３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項132】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復２２を含む、請求項１２８～１３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項133】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復２３を含む、請求項１２８～１３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項134】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１６及び１７を含む、請求項１２８に記載の方法。

【請求項135】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１、１６、１７、２３、及び２４を含む、請求項１２８に記載の方法。

【請求項136】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１、２、３、及び２４を含む、請求項１２８に記載の方法。

【請求項137】

前記スペクトリン反復が、スペクトリン反復１、２、２２、２３、及び２４を含む、請求項１２８に記載の方法。

【請求項138】

前記ヒンジ領域が、ジストロフィンヒンジ領域１及び４を含む、請求項１２８～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記ヒンジ領域が、ヒンジ領域１、３、及び４を含む、請求項１２８～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記マイクロジストロフィン導入遺伝子が、配列番号５を含む、請求項１２８に記載の方法。

【請求項141】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１．０×１０^９～約１×１０^１６ベクターゲノムである、請求項４８～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項142】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１．０×１０^９～約１×１０^１５ベクターゲノムである、請求項４８～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１．０×１０^９～約１×１０^１４ベクターゲノムである、請求項４８～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項144】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１．０×１０^９～約１×１０^１３ベクターゲノムである、請求項４８～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項145】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１．０×１０^９～約１×１０^１２ベクターゲノムである、請求項４８～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項146】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１．０×１０^９～約１×１０^１１ベクターゲノムである、請求項４８～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項147】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１．０×１０^９～約１×１０^１０ベクターゲノムである、請求項４８～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項148】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１０～約１×１０^１６ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項149】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１０～約１×１０^１５ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項150】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１０～約１×１０^１４ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項151】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１０～約１×１０^１３ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項152】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１０～約１×１０^１２ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項153】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１０～約１×１０^１１ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項154】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１１～約１×１０^１６ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項155】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１２～約１×１０^１６ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項156】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１３～約１×１０^１６ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項157】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１４～約１×１０^１６ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項158】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約１×１０^１５～約１×１０^１６ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項159】

前記髄腔内組成物中の前記有効量の前記ＡＡＶ粒子が、約２．５×１０^１３～約１×１０^１４ベクターゲノムである、請求項１４１に記載の方法。

【請求項160】

治療応答を提供するために十分な髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物のベクターゲノム用量よりも約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍低い、請求項４８～１５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも約１０倍～４０倍低い、請求項１６０に記載の方法。

【請求項162】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも約２０倍低い、請求項１６０に記載の方法。

【請求項163】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも約４０倍低い、請求項１６０に記載の方法。

【請求項164】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも約１００倍低い、請求項１６０に記載の方法。

【請求項165】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍低い、請求項４８～１５９のいずれか一項に記載の方。

【請求項166】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも約１０倍低い、請求項１６５に記載の方法。

【請求項167】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも約２０倍低い、請求項１６５に記載の方法。

【請求項168】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも約４０倍低い、請求項１６５に記載の方法。

【請求項169】

治療応答を提供するために十分な前記髄腔内ベクターゲノム用量が、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な前記静脈内組成物の前記ベクターゲノム用量よりも約１００倍低い、請求項１６５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２２９，９３６号、及び２０２１年９月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２３９，８８１号の優先権を主張するものであり、その各々の内容は、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる。

【発明の分野】

【0002】

本発明は、概して、マイクロジストロフィン導入遺伝子を送達するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ＡＡＶ粒子を産生する方法、ＡＡＶ粒子を産生する細胞、並びにジストロフィノパチー、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための骨格筋及び／又は心筋へのマイクロジストロフィン導入遺伝子の送達のためにＡＡＶ粒子を使用する方法に関する。

【0003】

配列表の組み込み
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにＸＭＬ形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むＸＭＬファイルの名称は、ＩＮＭＤ＿１６６＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６．ｘｍｌである。ＸＭＬファイルは、約４０，５３２バイトであり、２０２２年８月３日に作成され、ＵＳＰＴＯ特許センターを介して電子的に提出されている。

【背景技術】

【0004】

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、Ｘ連鎖劣性パターンで遺伝し、筋肉が適切に機能するために必要とするタンパク質であるジストロフィンを身体が産生することを妨げる、遺伝子変異によって引き起こされる。ＤＭＤは、部分的に進行性筋肉変性を特徴とする。疾患が進行するにつれて、最初は大腿、骨盤、及び腕の筋肉に影響を及ぼし、ＤＭＤは、最終的に全ての随意筋に影響を及ぼし、後の段階では心筋及び呼吸筋に関与する。欧州及び北米では、ＤＭＤの有病率は、３，６００件の男性の出生に約１件である。ＤＭＤは、最も高頻度の小児型筋ジストロフィーであり、ほぼ独占的に男性に影響を及ぼす。ＤＭＤの既知の治療法はなく、現在の治療基準は、主に、ステロイド、免疫抑制剤、抗痙攣薬、ブレース、矯正手術、及び補助換気を含む、症状の管理を目的としている。ＤＭＤに関連する拡張型心筋症の積極的な管理には、重度の症例における抗うっ血薬及び心臓移植が含まれる。

【0005】

遺伝子療法は、核酸が変異遺伝子又は非機能的遺伝子を保有する細胞に送達されて、変異細胞の欠陥を補正する、急速に加速している治療アプローチである。ある特定の遺伝子療法では、核酸は、核酸を細胞に送達するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内にパッケージ化される。細胞核の内側に入ると、次いで、核酸は、適切なタンパク質産生を誘導し、ウイルスは、安全に分解される。ＤＭＤの治療のための遺伝子療法が提案されているが、患者の毒性につながる高い全身ウイルス価の送達を必要とし、患者当たり必要とされる大量のウイルスに起因する高い製造コストを有する。

【0006】

動物モデル及びヒトにおける、修飾されているが機能的な短縮ジストロフィン核酸配列である、マイクロジストロフィン（μＤｙｓ）の送達は、筋機能を促進することが報告されている。μＤｙｓ導入遺伝子は、４２７ｋＤａのジストロフィンタンパク質の固有の機能ドメインの様々な組み合わせをコードするように設計されている。概して、長さが５キロベース未満である、μＤｙｓ配列は、ＤＭＤ研究のための最も広く使用されている動物モデルであるｍｄｘマウスを使用して、ＤＭＤのマウスモデルにおいてμＤｙｓ導入遺伝子を送達するためにＡＡＶを使用して試験されている。ｍｄｘマウスにおける変異は、完全長ジストロフィン発現を中止したエクソン２３におけるナンセンス点変異（ＣからＴへの移行）である（参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｓｉｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，ｐｐ．１５７８－１５８０）。μＤｙｓの送達が示している有望性にもかかわらず、新規の治療法が、ＤＭＤの治療のために必要とされる。本発明は、この必要性及び他の必要性に対処する。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、部分的に、マイクロジストロフィン（μＤｙｓ）導入遺伝子をパッケージ化する（すなわち、カプシド封入する）カプシドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、及び例えば、髄腔内投与によって、同粒子を用いて様々なジストロフィノパチーを治療するための方法に関する。一実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、（ｉ）アクチン結合部位を含むＮ末端領域（ＮＴＤ）と、（ｉｉ）３個のヒンジ領域及び４個のスペクトリン反復を含むドメインと、（ｉｉｉ）システイン豊富ドメインと、を含む、μＤｙｓポリペプチドをコードする。μＤｙｓ導入遺伝子は、一実施形態では、配列番号５に記載される核酸配列を含む。

【0008】

一態様では、ベクターゲノムをカプシド封入するカプシドを含む、ＡＡＶ粒子が提供される。ベクターゲノムは、一実施形態では、５’から３’まで、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、プロモーターと、μＤｙｓ導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、３’ＩＴＲと、を含む。μＤｙｓ導入遺伝子は、一実施形態では、（ｉ）アクチン結合部位を含むＮ末端領域（ＮＴＤ）と、（ｉｉ）２～４個のヒンジ領域及び４～６個のスペクトリン反復を含む中央ロッドドメインと、（ｉｉｉ）システイン豊富ドメインと、を含む、ポリペプチドをコードする。更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ＮＴＤと、ヒンジ領域１、２、及び４と、スペクトリン反復１、２、３、及び２４と、システイン豊富ドメインと、を含む、μＤｙｓポリペプチドをコードする。その上更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、配列番号５に記載される核酸配列を含む。ＡＡＶ粒子は、一実施形態では、ＡＡＶ９粒子であり、髄腔内組成物中に有効量で存在する。有効量のＡＡＶ粒子は、一実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子、例えば、髄腔内組成物中に存在する同じμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含む静脈内（ＩＶ）組成物の有効ベクターゲノム量よりも約９０％以下のベクターゲノムを含む。

【0009】

一実施形態では、ベクターゲノムは、μＤｙｓ導入遺伝子の５’（上流）及びプロモーターの３’（下流）にＳＶ４０イントロンを更に含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、エンハンサーが５’ＩＴＲの３’（下流）及びプロモーターの５’（上流）にあることを更に含む。

【0010】

プロモーターは、一実施形態では、ＭＨＣＫ７又はニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーターである。

【0011】

好ましい実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９粒子であり、すなわち、ＡＡＶ粒子は、１つ以上のＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。ＡＡＶ９粒子のカプシドは、一実施形態では、ＡＡＶ９カプシドタンパク質からなる。更に別の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ７４粒子である。

【0012】

いくつかの実施形態では、本発明の組み換えＡＡＶベクターゲノムは、５’から３’まで、５’ＩＴＲと、ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーと、プロモーターと、μＤｙｓ導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、３’ＩＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーは、配列番号８を含むか、又はそれからなる配列を有する。いくつかの実施形態では、μＤｙｓコード配列は、アクチン結合ドメインと、少なくとも４個のスペクトリン反復、例えば、４～６個のスペクトリン反復と、を含む、μＤｙｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、配列番号５の核酸配列を含むか、又はそれからなる。

【0013】

いくつかの実施形態では、本発明のカプシド封入ベクターゲノムは、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ及び３’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲは、配列番号１を含むか、又はそれからなる配列を有する。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは、配列番号７を含むか、又はそれからなる配列を有する。

【0014】

いくつかの実施形態では、カプシド封入ベクターゲノムは、ＭＨＣＫ７プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＫ７プロモーターは、配列番号２を含むか、又はそれからなる配列を有する。別の実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーターである。更なる実施形態では、ニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーターは、配列番号３に記載される核酸配列を有する。

【0015】

いくつかの実施形態では、本発明のカプシド封入ベクターゲノムは、配列番号４を含むか、又はそれからなる配列を有するＳＶ４０イントロンを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、カプシド封入ベクターゲノムは、配列番号６を含むか、又はそれからなる配列を有するＳＶ４０ポリ（Ａ）テールを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子のカプシドは、１つ以上のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含む。好ましい実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドであり、ＡＡＶ９カプシドは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質からなる。

【0018】

別の態様では、本発明は、ジストロフィノパチーの治療を必要とする対象においてジストロフィノパチーを治療する方法であって、本明細書に更に記載されるように、μＤｙｓ導入遺伝子を含むベクターゲノムをカプシド封入する有効量のＡＡＶ粒子のうちの１つを含む組成物を、単回用量で対象に髄腔内投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、ジストロフィノパチーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、又はＤＭＤ関連拡張型心筋症（ＤＣＭ）である。その上更なる実施形態では、ジストロフィノパチーは、ＤＭＤである。有効量のＡＡＶ粒子は、更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子、例えば、髄腔内投与された組成物中に存在する同じμＤｙｓ導入遺伝子を含むベクターゲノムをカプシド封入するＡＡＶ粒子を含む、有効量の対応するＩＶ組成物（例えば、静脈内投与された組成物）よりも約９０％以下のベクターゲノムを含む。

【0019】

一実施形態では、対象は、トレンデンブルク位にあるときに組成物を投与される。更なる実施形態では、投与は、非イオン性低浸透圧造影剤の非存在下にある。

【0020】

本明細書に記載されるジストロフィノパチーを治療する方法の一実施形態では、有効用量の髄腔内投与されたＡＡＶ粒子は、μＤｙｓ導入遺伝子、例えば、髄腔内投与されたＡＡＶ粒子中に存在する同じμＤｙｓ導入遺伝子を含むベクターゲノムをカプシド封入する同一用量の静脈内投与されたＡＡＶ粒子よりも優れた治療応答を提供する。治療応答は、一実施形態では、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）上のベースラインからの増加である。

【0021】

本明細書に記載されるジストロフィノパチーを治療する方法の別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子を含むベクターゲノムをカプシド封入する有効量のＡＡＶ粒子の髄腔内投与は、第２の対象が、μＤｙｓ導入遺伝子を含むベクターゲノムをカプシド封入する有効量の対応するＡＡＶ粒子を静脈内投与されるときに、第２の対象によって体験される副作用の数又は副作用の重症度と比較して、対象において副作用の数の減少、又は１つ以上の副作用の重症度の低減をもたらす。更なる実施形態では、ジストロフィノパチーは、ＤＭＤである。その上更なる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９粒子である。

【0022】

ジストロフィノパチーを治療する方法の更に別の実施形態では、有効量の髄腔内投与されたＡＡＶ粒子は、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、骨格筋及び／又は心筋においてより優れたμＤｙｓ導入遺伝子発現を提供する。更なる実施形態では、ジストロフィノパチーは、ＤＭＤである。その上更なる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９粒子である。なおもその上更なる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号５に記載される核酸配列を有するμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する。

【0023】

本発明の別の態様では、μＤｙｓ導入遺伝子を対象の骨格筋及び／又は心筋に優先的に送達するための方法が提供される。本方法は、ＡＡＶ９カプシドを含む有効量のＡＡＶ９粒子と、ＡＡＶ９カプシドによってカプシド封入されたμＤｙｓ導入遺伝子を含むベクターゲノムと、を含む、組成物を、単回用量で対象に髄腔内投与することを伴う。カプシド封入ゲノムは、５’から３’まで、５’ＩＴＲと、プロモーターと、μＤｙｓ導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、３’ＩＴＲと、を含む。投与後、μＤｙｓ導入遺伝子は、対象の肝組織における導入遺伝子発現と比較して、対象の骨格筋及び／又は心筋においてより高いレベルで発現される。

【0024】

本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、対象において本明細書に記載されるＡＡＶ粒子によって送達されるμＤｙｓ導入遺伝子の発現は、対象の骨格筋及び／又は心筋と比較して、対象の肝組織では著しく少ない。更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子発現は、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、対象の骨格筋及び／又は心筋では少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％優れている。別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子発現は、骨格筋及び／又は心筋におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、対象の肝臓では少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％少ない。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】例示的なμＤｙｓコード遺伝子構築物（ＩＮＳ１２０１）の概略図を示す。

【図1B】代替的なμＤｙｓコード遺伝子構築物（ＩＮＳ１２１２）の概略図を示す。

【図1C】ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓａＩ及びＳｍａＩで消化された（それぞれ、レーン１及び２）ｐｓＺ０１ベクター骨格（ｐＳＺ０１－ＩＮＳ１２０１）制限部にクローニングされたＩＮＳ１２０１遺伝子構築物、並びにＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓａＩ及びＳｍａＩで消化された（それぞれ、レーン３及び４）ｐｓＺ０１ベクター骨格（ｐＳＺ０１－ＩＮＳ１２１２）制限部にクローニングされたＩＮＳ１２１２遺伝子構築物のアガロースゲル電気泳動を示す。

【図2】１μｌのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９調製物（レーン１）、１μｌのＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９調製物（レーン２）、並びに０．５μｌ、１μｌ、２μｌ、及び４μｌの１×１０^１３ｖｇ／ｍｌ ＡＡＶ２標準（それぞれ、レーン３、４、５、及び６）の銀染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示す。

【図3A】２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９（ｉｉｉ）又はＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９（ｉｖ）を用いた筋肉内注射の２１日後にｍｄｘマウスから取得され、ジストロフィンについて免疫蛍光染色された腓腹筋切片を示す。非注射ｍｄｘマウス（ｉ）及び野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス（ｉｉ）から取得され、ジストロフィンについて免疫蛍光染色された腓腹筋切片が、比較のために示される。

【図3B】２．７×１０^１１ベクターゲノム（ｖｇ）のＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いた筋肉内注射の２１日後にｍｄｘマウスから取得され、ＤＡＰＩ（ｉ）で、及びジストロフィン（ｉｉ）について染色された腓腹筋切片を示す。マージされた画像が、（ｉｉｉ）に示される。

【図4A】２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の２１日後にｍｄｘマウスから取得され、ジストロフィンについて免疫蛍光染色された、腓腹筋（ｉ）、前脛骨筋（ｉｉ）、大腿四頭筋（ｉｉｉ）、臀筋（ｉｖ）、三頭筋（ｖ）、横隔膜（ｖｉ）、心臓（ｖｉｉ）、及び肝臓（ｖｉｉｉ）切片を示す。

【図4B】９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の２１日後にｍｄｘマウスから取得され、ジストロフィンについて免疫蛍光染色された、腓腹筋（ｉ）、前脛骨筋（ｉｉ）、大腿四頭筋（ｉｉｉ）、臀筋（ｉｖ）、三頭筋（ｖ）、横隔膜（ｖｉ）、心臓（ｖｉｉ）、及び肝臓（ｖｉｉｉ）切片を示す。

【図5】９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の２１日後にｍｄｘマウスから取得され、ジストロフィンについて免疫蛍光染色された、腓腹筋（ｉ）、前脛骨筋（ｉｉ）、大腿四頭筋（ｉｉｉ）、臀筋（ｉｖ）、三頭筋（ｖ）、横隔膜（ｖｉ）、心臓（ｖｉｉ）、及び肝臓（ｖｉｉｉ）切片を示す。

【図6A】９×１０^１０ｖｇ（ｉｉ）又は２．７×１０^１１ｖｇ（ｉｉｉ）のＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後にｍｄｘマウスから取得され、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された腓腹筋切片を示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス（ｉ）及び非注射ｍｄｘマウス（ｉｖ）から取得され、Ｈ＆Ｅ染色された腓腹筋切片が、比較のために示される。

【図6B】９×１０^１０ｖｇ（ｉｉ）又は２．７×１０^１１ｖｇ（ｉｉｉ）のＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後にｍｄｘマウスから取得され、ジストロフィンについて染色された腓腹筋切片を示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス（ｉ）及び非注射ｍｄｘマウス（ｉｖ）から取得され、ジストロフィンについて染色された腓腹筋切片が、比較のために示される。

【図7A】９×１０^１０ｖｇ（ｉｉ）のＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後にｍｄｘマウスから取得され、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された腓腹筋切片を示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス（ｉ）及び非注射ｍｄｘマウス（ｉｉｉ）から取得され、Ｈ＆Ｅ染色された腓腹筋切片が、比較のために示される。

【図7B】９×１０^１０ｖｇ（ｉｉ）のＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後にｍｄｘマウスから取得され、ジストロフィンについて染色された腓腹筋切片を示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス（ｉ）及び非注射ｍｄｘマウス（ｉｉｉ）から取得され、ジストロフィンについて染色された腓腹筋切片が、比較のために示される。

【図8A】９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける腓腹筋細胞の平均線維直径（μｍ）の棒グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける腓腹筋細胞の平均線維直径（μｍ）が、比較のために示される。

【図8B】９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける腓腹筋細胞の細胞直径（μｍ）の相対頻度（％）の折れ線グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける腓腹筋細胞の細胞直径の相対頻度が、比較のために示される。

【図8C】９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける三頭筋細胞の平均線維直径（μｍ）の棒グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける三頭筋細胞の平均線維直径（μｍ）が、比較のために示される。

【図8D】９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける三頭筋細胞の細胞直径（μｍ）の相対頻度（％）の折れ線グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける三頭筋細胞の細胞直径の相対頻度が、比較のために示される。

【図8E】９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける前脛骨筋細胞の平均線維直径（μｍ）の棒グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける前脛骨筋細胞の平均線維直径（μｍ）が、比較のために示される。

【図8F】９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける前脛骨筋細胞の細胞直径（μｍ）の相対頻度（％）の折れ線グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける前脛骨筋細胞の細胞直径の相対頻度が、比較のために示される。

【図8G】９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける横隔膜筋細胞の平均線維直径（μｍ）の棒グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける横隔膜筋細胞の平均線維直径（μｍ）が、比較のために示される。

【図8H】９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける横隔膜筋細胞の細胞直径（μｍ）の相対頻度（％）の折れ線グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける横隔膜筋細胞の細胞直径の相対頻度が、比較のために示される。

【図9A】９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける腓腹筋細胞の平均線維直径（μｍ）の棒グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける横隔膜筋細胞の平均線維直径（μｍ）が、比較のために示される。

【図9B】９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける腓腹筋細胞の細胞直径（μｍ）の相対頻度（％）の折れ線グラフを示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及び非注射ｍｄｘマウスにおける横隔膜筋細胞の細胞直径の相対頻度が、比較のために示される。

【図10A】野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、生後１日目（ｐ１）にビヒクルを用いた脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウス、生後１日目ｐ１に２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９のＩＣＶ注射を受けたｍｄｘマウス、及びｐ１に９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９のＩＣＶ注射を受けたｍｄｘマウスにおける偏心収縮（ＥＣ）から生じるＥＤＬ筋の収縮力の割合の折れ線グラフである。

【図10B】（ｉ）野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、及び生後１日目（ｐ１）に（ｉｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖ）ビヒクル対照を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおける偏心収縮（ＥＣ）前応力に対するＥＤＬ筋のＥＣ後応力の割合の折れ線グラフである。

【図10C】（ｉ）野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、及び生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉ）ビヒクル対照のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおける偏心収縮（ＥＣ）数の関数としてのＥＤＬ筋の収縮力の割合（偏心収縮１（ＥＣ１）％）を示すグラフである。

【図10D】（ｉ）野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、及び生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉ）ビヒクル対照のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおけるＥＤＬ筋の力の割合（［ＥＣ５後／ＥＣ１後］）を示す棒グラフである。

【図10E】（ｉ）野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、及び生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖｉ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉｉ）ビヒクル対照のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおける偏心収縮（ＥＣ）から生じるＥＤＬ筋の最大張力（ｋＰａ）のグラフである。

【図10F】（ｉ）野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、及び生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖｉ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉｉ）ビヒクル対照のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおける様々な周波数（Ｈｚ）での偏心収縮（ＥＣ）から生じるピーク応力（ｋＰａ）のグラフである。

【図11A】非注射カニクイザル（ｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、５×１０^１３ｖｇ（ｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された腓腹筋切片を示す。

【図11B】非注射カニクイザル（ｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、５×１０^１３ｖｇ（ｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された大腿四頭筋切片を示す。

【図11C】非注射カニクイザル（ｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、５×１０^１３ｖｇ（ｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された三角筋切片を示す。

【図11D】非注射カニクイザル（ｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、５×１０^１３ｖｇ（ｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された三頭筋切片を示す。

【図11E】非注射カニクイザル（ｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、５×１０^１３ｖｇ（ｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された二頭筋切片を示す。

【図11F】５×１０^１３ｖｇ（ｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｉｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された前脛骨筋切片を示す。

【図11G】５×１０^１３ｖｇ（ｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｉｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された横隔膜筋切片を示す。

【図11H】５×１０^１３ｖｇ（ｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｉｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された心筋切片を示す。

【図11I】５×１０^１３ｖｇ（ｉ）若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｉｉ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた静脈内（ＩＶ）注射の２１日後のカニクイザル、又は２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｉｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、若しくは１×１０^１４ｖｇ（ｖ）のＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後のカニクイザルから取得され、ＧＦＰ発現の検出のためにＮｏｖａＲｅｄ（商標）で免疫染色された肝臓切片を示す。

【図12A】２．５×１０^１３ｖｇのＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後にカニクイザルから取得され、抗ＧＦＰ抗体でプローブされた、二頭筋（１）、三頭筋（２）、三角筋（３）、大腿四頭筋（４）、腓腹筋（５）、前脛骨筋（６）、横隔膜（７）、及び心臓（８）の筋タンパク質試料のポンソー染色（上のパネル）又はウェスタンブロット（下のパネル）を示す。

【図12B】５×１０^１３ｖｇのＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後にカニクイザルから取得され、抗ＧＦＰ抗体でプローブされた、二頭筋（１）、三頭筋（２）、三角筋（３）、大腿四頭筋（４）、腓腹筋（５）、前脛骨筋（６）、横隔膜（７）、及び心臓（８）の筋タンパク質試料のポンソー染色（上のパネル）又はウェスタンブロット（下のパネル）を示す。

【図12C】１×１０^１４ｖｇのＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後にカニクイザルから取得され、抗ＧＦＰ抗体でプローブされた、二頭筋（１）、三頭筋（２）、三角筋（３）、大腿四頭筋（４）、腓腹筋（５）、前脛骨筋（６）、横隔膜（７）、及び心臓（８）の筋タンパク質試料のポンソー染色（上のパネル）又はウェスタンブロット（下のパネル）を示す。

【図12D】非注射カニクイザルから取得され、抗ＧＦＰ抗体でプローブされた、二頭筋（１）及び三頭筋（２）のポンソー染色（上のパネル）又はウェスタンブロットを示す。

【図13】２．５×１０^１３ｖｇのＡＡＶ９ ＣＢＡ－ＧＦＰを用いた髄腔内（ＩＴ）注射の２１日後にカニクイザルから取得され、逆転写酵素の存在下（＋）又は非存在下（－）でＲＴ－ＰＣＲを受けた、二頭筋（１）、三頭筋（２）、三角筋（３）、前脛骨筋（４）、腓腹筋（５）、大腿四頭筋の外側広筋（６）、横隔膜筋（７）、及び心筋（８）、並びに肝臓（９）組織試料のアガロースゲル電気泳動を示す。非注射カニクイザルから取得され、逆転写酵素の存在下（＋）又は非存在下（－）でＲＴ－ＰＣＲを受けた、二頭筋（１０）、三頭筋（１１）、三角筋（１２）、及び大腿四頭筋（１３）の筋組織試料が、比較のために示される。

【図14】本明細書で提供されるμＤｙｓ導入遺伝子によってコードされる様々なμＤｙｓタンパク質ドメインを示す。

【図15】生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖｉ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉｉ）ビヒクル対照のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおける２倍体ゲノム当たりのＩＮＳ１２０１ ＤＮＡコピーの数を示すグラフである。

【図16】生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖｉ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉｉ）ビヒクル対照のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおけるＲＰＰ３０のコピー数に対して正規化されたＩＮＳ１２０１ ＲＮＡ転写物コピーの数を示すグラフである。

【図17】（ｉ）野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、及び生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖｉ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉｉ）ビヒクル対照のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおける生後１２０日目（ｐ１２０）でのＥＤＬ筋細胞の平均線維直径（μｍ）のグラフである。

【図18】（ｉ）野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、及び生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖｉ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉｉ）ビヒクル対照のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおける生後１２０日目（ｐ１２０）での前脛骨筋の平均線維直径（μｍ）のグラフである。

【図19】様々な用量のＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射後のピクロシリウスレッドで染色された横隔膜筋切片を示す。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及びビヒクルを投与されたｍｄｘマウスから取得された横隔膜切片が、上部セクションに比較のために示される。

【図20】（ｉ）野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス、及び生後２８日目（ｐ２８）に（ｉｉ）ビヒクル対照、（ｉｉｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注射を受けたｍｄｘマウスにおける生後１２０日目（ｐ１２０）での横隔膜筋のコラーゲン率を示すグラフである。

【図21】上部は、生後２８日目（ｐ２８）での５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射後のｐ１２０にｍｄｘマウスから取得され、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（左端）、ラミニン／ｄａｐｉ（左から２番目）、ジストロフィン（右から２番目）で染色された長趾伸（ＥＤＬ）筋切片、及びマージされた画像（右端）を示す。図２１の下部は、生後２８日目（ｐ２８）での５ビヒクル対照を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射後のｐ１２０にｍｄｘマウスから取得され、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（左端）、ラミニン／ｄａｐｉ（左から２番目）、ジストロフィン（右から２番目）で染色されたＥＤＬ筋切片、及びマージされた画像（右端）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、部分的には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、並びに単一遺伝子筋肉疾患、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、又はＤＭＤ関連拡張型心筋症（ＤＣＭ）などのジストロフィノパチーの治療を必要とする対象に、同粒子を心筋及び／又は骨格筋に優先的に送達するための方法に関する。理論に束縛されることを所望することなく、粒子、及び例えば、ジストロフィノパチーなどの単一遺伝子筋肉疾患を治療するために、同粒子の送達を必要とする対象に同粒子を送達するための方法は、少なくとも本発明が、（ｉ）実質的に同じ又はより良好な治療利益を達成するために、ＩＶ送達よりも著しく低い投与量を可能にし、それによって、ウイルス負荷及び毒性並びに他の副作用を低減し、かつ／又は（ｉｉ）肝組織と比較して、心筋及び／又は骨格筋組織における優先的な導入遺伝子標的化及び発現を可能にし、それによって、導入遺伝子を目的の細胞に標的化し、静脈内送達されるＡＡＶベクターと比較して、より優れた治療利益を提供し、（ｉｉｉ）製造負担の減少に対応する、必要とされる低投与量により、ＩＶ製剤と比較して、より大きな患者集団に利益をもたらすことができるため、既知のＡＡＶ粒子及び治療方法よりも優れた利益を提供する。

【0027】

本発明の態様は、ＡＡＶ粒子、同粒子を産生するための方法、及び治療を必要とする対象にＡＡＶ粒子を送達するための方法に関する。ＡＡＶ粒子、例えば、ＡＡＶ９粒子は、１つ以上のＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むカプシドと、ＡＡＶ９カプシドによってカプシド封入されたベクターゲノムと、を含む。ベクターゲノムは、導入遺伝子と、筋細胞、例えば、骨格筋及び／又は心筋細胞内に送達されると導入遺伝子の遺伝子発現を促進する、調節エレメントと、を含む。一実施形態では、導入遺伝子は、マイクロジストロフィン（μＤｙｓ）導入遺伝子である。

【0028】

本明細書に記載される方法は、ジストロフィノパチーの治療を必要とする対象に、有効量の本明細書に記載されるＡＡＶ粒子を含む組成物を単回用量で髄腔内投与することを含む。一実施形態におけるジストロフィノパチーは、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、又はＤＣＭである。好ましい実施形態では、ジストロフィノパチーは、ＤＭＤである。本明細書に記載される実施形態では、筋細胞への本発明のＡＡＶ粒子の髄腔内送達は、μＤｙｓの堅調な発現をもたらすことができ、筋肉の健康及び機能を著しく改善することができる。本発明はまた、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子を産生するための方法及び細胞も提供する。本明細書に記載される方法の一実施形態では、ＡＡＶ粒子の髄腔内投与後に、導入遺伝子は、対象の肝組織における導入遺伝子発現と比較して、対象の骨格筋及び／又は心筋においてより高いレベルで発現される。

【0029】

本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語及び語句が以下に定義される。

【0030】

本明細書で使用される場合の「ａ」及び「ａｎ」という用語は、「１つ以上」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。

【0031】

「核酸」、「ヌクレオチド」、又は「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、本用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、並びに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される、配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。

【0032】

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖を産生又はコードすることに関与するＤＮＡのセグメントを指し得る。これは、コーディング領域（リーダー及びトレーラー）並びに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）の前後の領域を含み得る。代替的に、「遺伝子」という用語は、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの非翻訳ＲＮＡを産生又はコードすることに関与するＤＮＡのセグメントを指し得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、細胞のゲノムに人工的に導入される、ベクターゲノム中に存在する外因性遺伝子、又は細胞のゲノム中の非天然遺伝子座に人工的に導入される内因性遺伝子を指す。導入遺伝子は、ポリペプチド鎖を産生又はコードすることに関与するＤＮＡのセグメントを指し得る。導入遺伝子は、コーディング領域（リーダー及びトレーラー）並びに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）の前後の領域を含み得る。本明細書に記載される実施形態による導入遺伝子は、μＤｙｓである。μＤｙｓ導入遺伝子は、一実施形態では、Ｎ末端領域、約２～３個のヒンジ領域、約４～６個のスペクトリン反復、及びシステイン豊富ドメインを含む、μＤｙｓポリペプチドをコードする。

【0034】

本明細書で使用される場合の「ベクターゲノム」は、１つ以上の異種核酸配列を含む核酸ゲノムである。１つ以上の異種核酸配列は、導入遺伝子を含む。本発明のいくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ配列）、任意選択的に、２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、これらは典型的には、ベクターゲノムの５’末端及び３’末端にあり、１つ以上の異種核酸に隣接するであろう。ＩＴＲは、互いに同じであるか、又は異なり得る。

【0035】

本明細書で使用される場合、核酸、例えば、遺伝子、又は細胞中のタンパク質に関する「内因性」という用語は、例えば、その天然遺伝子位置又は遺伝子座において自然界で見出されるように、その特定の細胞で生じる核酸又はタンパク質である。更に、核酸又はタンパク質を「内因的に発現する」細胞は、自然界で見出されるように、その核酸又はタンパク質を発現する。

【0036】

「プロモーター」は、核酸、例えば、導入遺伝子の転写を誘導し、ベクターゲノム内に存在し得る、１つ以上の核酸制御配列として定義される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位の付近に核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意選択的に、転写の開始部位から数千個もの塩基対に位置し得る、遠位エンハンサー又はリプレッサー要素を含む。

【0037】

本明細書で使用される場合の「調節エレメント」は、遺伝子（例えば、導入遺伝子）の転写を調節し、かつ／又は転写されたｍＲＮＡ産物の安定性若しくは翻訳を調節することが可能な核酸配列を指し、ベクターゲノム内に存在し得る。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、遺伝子の組織特異的転写を調節することができる。調節エレメントは、少なくとも１つの転写因子結合部位、例えば、筋肉特異的転写因子のための転写因子結合部位を含むことができる。本明細書で使用される場合の調節エレメントは、調節エレメントの非存在下でのプロモーター単独からの遺伝子の転写と比較すると、プロモーター駆動型遺伝子発現を増加させるか、又は増強する。本明細書で使用される場合の調節エレメントは、それらが調節する導入遺伝子まで任意の距離（すなわち、近位又は遠位）に生じ得る。本明細書で使用される場合の調節エレメントは、転写制御に関与するより大きな配列の一部、例えば、プロモーター配列の一部を含み得る。しかしながら、調節エレメント単独は、典型的には、独力で転写を開始するためには十分ではなく、プロモーターの存在を必要とする。

【0038】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるときに、「動作可能に連結される」。例えば、プロモーター若しくはエンハンサーが、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に動作可能に連結されるか、又はリボソーム結合部位が、翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に動作可能に連結される。

【0039】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、本用語は、全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖、及びその機能的断片を包含し、アミノ酸残基は、共有ペプチド結合によって連結される。

【0040】

本明細書で使用される場合、「相補的」又は「相補性」という用語は、ヌクレオチド又は核酸間の具体的な塩基対合を指す。相補的ヌクレオチドは、概して、Ａ及びＴ（又はＡ及びＵ）、並びにＧ及びＣである。本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ゲノム配列に対して完全に相補的又は実質的に相補的である（例えば、ほんのわずかなミスマッチ塩基を有する）配列、例えば、ＤＮＡ標的化配列を含むことができる。

【0041】

本明細書で使用される場合、核酸、例えば、ＡＡＶベクターとの関連での「導入すること」又は「送達すること」という用語は、細胞の外側から細胞の内側、例えば、筋細胞への核酸の転座を指す。いくつかの場合では、導入することは、細胞の外側から細胞の核の内側への核酸の転座を指す。エレクトロポレーション、ナノワイヤ又はナノチューブとの接触、受容体媒介性内部化、細胞透過性ペプチドを介した転座、リポソーム媒介性転座、及び同等物を含むがこれらに限定されない、そのような転座の様々な方法が企図される。

【0042】

本明細書で使用される場合、「パッケージ化される」又は「カプシド封入される」という用語は、ＡＡＶ粒子を形成するためのウイルスカプシドタンパク質を含むカプシド内のベクターゲノムの包含を指す。

【0043】

ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との関連で使用される場合の「実質的な同一性」又は「実質的に同一」という用語は、参照配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を指す。代替的には、同一性率は、６０％～１００％の任意の整数であり得る。例示的な実施形態は、本明細書に記載されるプログラム、好ましくは、以下に記載される標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用して、参照配列と比較すると、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含む。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置付け、及び同等物を考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するように適切に調整され得ることを認識するであろう。

【0044】

配列比較については、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要である場合、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができるか、又は代替的パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性率を計算する。

【0045】

配列同一性率及び配列類似性を決定するため好適であるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通して公的に利用可能である。アルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さのワードと整列されたときに、ある正の値の閾値スコアＴに一致するか、又はそれを満たすかのいずれかである、クエリ配列内の長さＷの短いワードを識別することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別することを伴う。Ｔは、近接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、検索を開始して、それらを含むより長いＨＳＰを見出すためのシードとして作用する。次いで、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、ワードヒットは、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対の一致残基に対する報酬スコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因してゼロ以下になるか、又はいずれか一方の配列の終端に達するときに、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、２８のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝１、Ｎ＝－２、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。

【0046】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指示を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．０１未満、より好ましくは約１０^－５未満、最も好ましくは約１０^－２０未満である場合、核酸は、参照配列と類似するとみなされる。

【0047】

本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載される方法及び組成物によって治療される生物を指す。そのような生物には、ヒト、サル、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、及び同等物などの哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象又は患者は、ヒトである。本明細書で提供される治療の方法における対象は、一実施形態では、男性対象である。

【0048】

対象が男性のヒトである実施形態では、男性ヒト対象は、約４歳～約７歳、新生児、約１歳～約７歳、約２歳～約７歳、約２歳～約６歳、約２歳～約５歳、約２歳～約４歳、約３歳～約７歳、約３歳～約６歳、約１ヵ月～約６歳、約１ヵ月～約５歳、約１ヵ月～約４歳、約１ヵ月～約３歳、約１ヵ月～約２歳、又は約１ヵ月～約１２ヵ月である。

【0049】

一実施形態では、対象は、約４歳～約７歳の男性ヒト患者である。一実施形態では、対象は、約３歳～約７歳の男性ヒト患者である。一実施形態では、対象は、約２歳～約７歳の男性ヒト患者である。

【0050】

本明細書で使用される場合、「効率的な送達」又は「効率的に送達すること」という用語は、所望の細胞又は組織において導入遺伝子の発現をもたらす導入遺伝子をコードするベクターゲノムをカプシド封入するＡＡＶカプシドを含む、ＡＡＶ粒子の投与を指す。

【0051】

本明細書で使用される場合、「有効量」又は「有効用量」という用語は、有益な又は所望の結果（例えば、タンパク質の発現、又は所望の予防若しくは治療効果）をもたらすために十分な物質（例えば、本発明のＡＡＶ粒子）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用、又は投与量で投与することができ、特定の処方又は投与経路に限定されることを意図していない。用量が「ベクターゲノム」で提供される場合、「有効用量」は、本明細書では、「有効ベクターゲノム用量」と称され得る。

【0052】

本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、状態、疾患、障害、若しくは同等物の改善をもたらす、任意の効果、例えば、低減すること、軽減すること、調節すること、改善すること、若しくは排除すること、又はその症状を改善することを含む。

【0053】

説明の全体を通して、組成物が、具体的な成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、若しくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ものとして説明される場合、又はプロセス及び方法が、具体的なステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、若しくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ものとして説明される場合、加えて、記載された成分から本質的になるか、又はそれらからなる本発明の組成物が存在し、記載された処理ステップから本質的になるか、又はそれらからなる本発明によるプロセス及び方法が存在することが企図される。

【0054】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子
本明細書に記載されるように、本発明の一態様は、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質と、１つ以上のカプシドタンパク質によってカプシド封入されたベクターゲノムと、を含む、ＡＡＶ粒子、及び同粒子を含む髄腔内組成物に関する。ゲノムは、５’から３’まで、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、プロモーターと、導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、３’ＩＴＲと、を含む。治療を必要とする対象に髄腔内投与されると、一実施形態では、導入遺伝子は、対象の肝組織における導入遺伝子発現と比較して、対象の骨格筋及び／又は心筋においてより高いレベルで発現される。別の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子によって提供される［（骨格筋及び／又は心筋導入遺伝子発現）］／（肝臓導入遺伝子発現）］の比は、同一用量の同じＡＡＶ粒子が静脈内投与されるときの同じ比よりも大きい。１つの好ましい実施形態では、ＡＡＶ粒子は、１つ以上のＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ９粒子である。

【0055】

本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子」は、ＡＡＶカプシドと、ＡＡＶカプシドによって封入されたベクターゲノムと、を含む、ＡＡＶビリオンを指す。ベクターゲノムは、典型的には、プロモーターと、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している１つ以上の導入遺伝子と、を含む。ＡＡＶカプシドは、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質を含む。ＡＡＶカプシドタンパク質は、同じ又は異なるＡＡＶ血清型に由来し得、野生型であるか、又は操作され得る。本明細書に記載されるベクターゲノムは、複製され、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコードする１つ以上のプラスミドも含む宿主細胞に導入されたときにウイルスベクター（粒子）にパッケージ化され得る。一実施形態では、ヘルパープラスミドも宿主細胞にトランスフェクトされて、宿主細胞によるベクター産生を補助する。一実施形態では、本明細書で使用されるＡＡＶベクターは、例えば、その開示があらゆる目的のために参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９０６，１１１号に記載されるＡＡＶ９ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。

【0056】

「空のカプシド」、「空のバイアル粒子」、及び「空のＡＡＶ」という用語は、その中にパッケージ化されたベクターゲノムを欠くＡＡＶカプシドシェルを指す。

【0057】

本明細書に記載されるカプシド封入ベクターゲノムは、１つ以上の調節エレメント、例えば、導入遺伝子の上流に１つ以上の調節エレメントを含むことができる。カプシド封入ゲノムは、一実施形態では、５’から３’まで、５’ＩＴＲと、プロモーターと、導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、３’ＩＴＲと、を含む。別の実施形態では、封入ゲノムは、５’から３’まで、５’ＩＴＲと、エンハンサーと、プロモーターと、導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、３’ＩＴＲと、を含む。カプシド封入ゲノムは、更に別の実施形態では、５’から３’まで、５’ＩＴＲと、プロモーターと、ＳＶ４０イントロンと、導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、３’ＩＴＲと、を含む。その上更に別の実施形態では、カプシド封入ゲノムは、５’から３’まで、５’ＩＴＲと、エンハンサーと、プロモーターと、ＳＶ４０イントロンと、導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、３’ＩＴＲと、を含む。

【0058】

逆位末端反復
逆位末端反復（ＩＴＲ）は、導入遺伝子に隣接するパリンドローム１４５ヌクレオチド配列である。ＡＡＶベクターゲノムの５’及び３’ＩＴＲは、宿主細胞ゲノム（例えば、ヒトにおける１９番染色体）への導入遺伝子の統合及びＡＡＶ粒子への導入遺伝子のカプシド封入の両方のために必要である。

【0059】

いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、いずれか１つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３由来のＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターゲノムは、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列及び３’ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターゲノムは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する５’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲは、配列番号１からなる。

【0061】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターゲノムは、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する３’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは、配列番号７からなる。

【0062】

プロモーター
プロモーターは、導入遺伝子の発現を駆動し、典型的には、それらが発現を調節する導入遺伝子の上流（又は５’）に位置する。

【0063】

いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、哺乳動物プロモーター、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、ネコ、及びイヌプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組換えＡＡＶベクターゲノムは、導入遺伝子の高レベル発現を駆動するための強力で構成的に活性なプロモーターを含む。例えば、いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーター、又はＣＡＧプロモーターである。

【0064】

プロモーターは、一実施形態では、ＭＨＣＫ７又はニワトリβ－アクチンハイブリッドプロモーターである。

【0065】

ある特定の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、導入遺伝子に動作可能に連結されて、筋細胞において高レベルかつ組織特異的な発現をもたらす、筋肉特異的プロモーターを含む。例えば、本発明の筋肉特異的プロモーターには、デスミン（ＤＥＳ、ＣＳＭ１又はＣＳＭ２としても知られる）プロモーター、アルファ２アクチニン（ＡＣＴＮ２、ＣＭＤ１ＡＡとしても知られる）プロモーター、フィラミン－Ｃ（ＦＬＮＣ、アクチン結合様タンパク質（ＡＢＬＰ）、フィラミン－２（ＦＬＮ２）、ＡＢＰ－２８０、ＡＢＰ２８０Ａ、ＡＢＰＡ、ＡＢＰＬ、ＭＦＭ５、又はＭＰＤ４としても知られる）プロモーター、筋形質／小胞体カルシウムＡＴＰａｓｅ １（ＡＴＰ２Ａ１、ＡＴＰ２Ａ又はＳＥＲＣＡ１としても知られる）プロモーター、トロポニンＩ型１（ＴＮＮＩ１、ＳＳＴＮＩ又は２５ＴＴＮＩとしても知られる）プロモーター、ミオシン－１（ＭＹＨ１）プロモーター、リン酸化可能な高速骨格筋ミオシン軽鎖（ＭＹＬＰＦ）プロモーター、ミオシン１（ＭＹＨ１、ＭＹＨＳＡ１、ＭＹＨａ、ＭｙＣ－２Ｘ／Ｄ、又はＭｙＨＣ－２ｘとしても知られる）プロモーター、アルファ－３鎖トロポミオシン（ＴＰＭ３、ＣＦＴＤ、ＮＥＭ１、ＯＫ／Ｓｃｌ．５、ＴＭ－５、ＴＭ３、ＴＭ３０、ＴＭ３０ｎｍ、ＴＭ５、ＴＰＭｓｋ３、ＴＲＫ、ｈ ＴＭ５、又はｈｓｃｐ３０としても知られる）プロモーター、アンキリン反復ドメイン含有タンパク質２（ＡＮＫＲＤ２、ＡＲＰＰとしても知られる）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）プロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２４１－２４５）に記載される合成筋プロモーター、例えば、ＳＰｃ５－１２プロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター（それぞれ、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：１４８９－１４９９）に記載されるように、ＭＣＫ基礎プロモーターへのＭＣＫエンハンサーの二重又は三重タンデムからなる）、及びハイブリッドプロモーター、例えば、ハイブリッドアルファ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサー（ＭＨＣＫ７、７７０ｂｐ）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：１４８９－１４９９）に記載されるＭＣＫ－Ｃ５－１２プロモーター、並びにＲｕｄｅｃｋ Ｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６，Ｇｅｎｅｓｉｓ．５４（８）：４３１－８）に記載される心筋及び骨格筋特異的ミオシンシャペロンＵｎｃ４５ｂ（１９５ｂｐ）プロモーターから選択されるプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。心臓特異的プロモーターの非限定的な例としては、カルセクエストリン２（ＰＤＩＢ２、ＦＬＪ２６３２１、ＦＬＪ９３５１４、又はＣＡＳＱ２（ヒト遺伝子についてはＧｅｎｅＩＤ ８４５）としても知られる）プロモーター、アンキリン反復ドメイン１（心臓アンキリン反復タンパク質としても知られる）プロモーター、サイトカイン誘導性核タンパク質プロモーター、肝臓アンキリン反復ドメイン１（ＡＮＫＲＤ１、ヒト遺伝子についてはＧｅｎｅＩＤ ２７０６３）、ミオシン、軽鎖２、調節性、心臓、低速（ＭＹＬ２、ヒト遺伝子についてはＧｅｎｅＩＤ ４６３３）プロモーター、ミオシン、軽鎖３、アルカリ、脳室、骨格１０低速（ＭＹＬ３、ヒト遺伝子についてはＧｅｎｅＩＤ ４６３４）プロモーター、ブロモドメイン含有７（ＢＰ７５、ＣＥＬＴＩＸ１、ＮＡＧ４（ＢＲＤ７、ヒト遺伝子についてはＧｅｎｅＩＤ ２９１１７としても知られる））プロモーター、アルファミオシン重鎖（αＭＨＣ）プロモーター、心臓トロポニンＣプロモーター、及び心臓特異性を付与する心臓ナトリウム－カルシウム交換体（ＮＣＸ１）のプロモーターが挙げられる。

【0066】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターゲノムは、ＭＨＣＫ７プロモーターを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＨＣＫ７プロモーターは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＫ７プロモーターは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＫ７プロモーターは、配列番号２からなる。

【0067】

ＳＶ４０イントロン
いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、ＳＶ４０イントロンを含む。ＳＶ４０イントロンは、遺伝子療法ベクターにおける一般的に使用されている調節エレメントであり、発現されたＲＮＡ転写物の翻訳及び安定性を増強する。

【0068】

ある特定の実施形態では、ＳＶ４０イントロンは、プロモーターの下流（すなわち、３’）及び導入遺伝子の上流（すなわち、５’）にある。他の実施形態では、ＳＶ４０イントロンは、導入遺伝子の下流（すなわち、３’）にあり得る。

【0069】

いくつかの実施形態では、ＳＶ４０イントロンは、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０イントロンは、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０イントロンは、配列番号４からなる。

【0070】

ＳＶ４０－ポリ（Ａ）テール
いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールをコードする核酸配列を含む。ＳＶ４０－ポリ（Ａ）テール配列は、核からのＲＮＡ輸出、ＲＮＡの翻訳、及びＲＮＡ安定性を支援する、遺伝子療法ベクターにおける一般的に使用されている核酸要素である。

【0071】

いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＳＶ４０ポリ（Ａ）テールをコードする配列を含む（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールをコードする配列は、配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールをコードする配列は、配列番号６からなる。

【0072】

エンハンサー
いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、１つ以上のエンハンサー配列を含む。エンハンサー配列は、一実施形態では、例えば、ＤＮＡループ形成及びプロモーターへの転写機構の動員を支援する転写因子及び共調節因子のための結合部位として機能することによって、導入遺伝子の転写レベルを増加させることができる。

【0073】

いくつかの実施形態では、エンハンサーは、５’ＩＴＲの下流（すなわち、３’）及びプロモーターの上流（すなわち、５’）にある。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、プロモーターの下流（すなわち、３’）及び導入遺伝子の上流（すなわち、５’）にある。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、導入遺伝子の下流（すなわち、３’）及び３’ＵＴＲの上流（すなわち、５’）にある。

【0074】

いくつかの実施形態では、本発明の組換えＡＡＶベクターゲノムは、筋細胞、例えば、骨格筋及び／又は心筋細胞における導入遺伝子の転写を著しく促進するエンハンサーを含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換えＡＡＶベクターは、骨格シス調節モジュール４（ＳＫ－ＣＲＭ４）エンハンサーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーは、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーは、配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーは、配列番号８からなる。

【0076】

更に別の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー核酸配列を含む。更なる実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、プロモーター配列の上流にある。例えば、一実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号９からなる。

【0077】

導入遺伝子
本発明とともに使用するための導入遺伝子は、導入遺伝子が送達される細胞（例えば、筋細胞）において発現されるポリペプチド又はその機能断片をコードする核酸配列である。

【0078】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、それが送達される宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又はエピソーム的に発現され得る。

【0079】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子が送達される細胞によって内因的に発現されないポリペプチド又はその機能断片をコードすることができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子が送達される細胞によって内因的に発現されるポリペプチド又はその機能断片の変異型をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子が送達される細胞によって内因的に発現されるが、低レベルで発現されるタンパク質又はその機能断片をコードし、導入遺伝子の発現は、タンパク質又はその機能断片のより高い発現レベルをもたらす。いくつかの実施形態では、導入遺伝子が送達される細胞は、内因性タンパク質及び／又は機能的欠陥タンパク質の発現レベルの低下をもたらす１つ以上の変異を保有し、導入遺伝子の発現は、内因性タンパク質の発現の回復及び／又は欠陥タンパク質の機能的補充をもたらす。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子が送達され、発現が誘導され得る細胞に導入されたときにサイレントである。

【0080】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に記載される組換えＡＡＶベクター中に存在するプロモーター及び／又は他の調節エレメントに対して異種（すなわち、異なる種に由来する）又は同種（すなわち、同じ種に由来する）であり得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子が送達される細胞に対して異種又は同種であり得る。

【0081】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、全長ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ配列、又は機能的活性を有するその断片若しくは変異体であり得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ミニ遺伝子、すなわち、そのイントロン配列の一部、大部分、若しくは全てを欠く遺伝子配列であり得るか、又はそのイントロン配列の全てを含み得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、同種及び／又は異種ｃＤＮＡ断片並びに／若しくはゲノムＤＮＡ断片を含む、ハイブリッド核酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、野生型配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、及び／又は挿入を含み得る。

【0082】

いくつかの実施形態では、本発明の導入遺伝子は、治療用タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、構造タンパク質をコードし得る。

【0083】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、μＤｙｓポリペプチドをコードするマイクロジストロフィン（μＤｙｓ）導入遺伝子である。更なる実施形態では、導入遺伝子によってコードされるμＤｙｓポリペプチドは、（ｉ）アクチン結合部位を含むＮ末端領域（ＮＴＤ）と、（ｉｉ）２～４個のヒンジ領域及び４～６個のスペクトリン反復を含む中央ロッドドメインと、を含む。更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、配列番号５に記載される核酸配列を含む。その上更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、配列番号５に記載される核酸配列からなる。別の実施形態では、μＤｙｓタンパク質をコードする配列は、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。

【0084】

一実施形態におけるμＤｙｓ導入遺伝子は、あらゆる目的のために参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，３５１，６１１号の配列番号４に記載される核酸配列を含む。別の実施形態では、μＤｙｓタンパク質をコードする配列は、米国特許第１０，３５１，６１１号の配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。

【0085】

一実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、（ｉ）アクチン結合部位を含むＮ末端領域（ＮＴＤ）と、（ｉｉ）３個のヒンジ領域及び４個のスペクトリン反復を含むドメインと、（ｉｉｉ）システイン豊富ドメインと、を含む、μＤｙｓポリペプチドをコードする。μＤｙｓ導入遺伝子は、更なる実施形態では、アクチン結合部位を含むＮ末端領域（ＮＴＤ）と、（ｉｉ）ヒンジ領域１、２、及び４、並びにスペクトリン反復１、２、３、及び２４を含む中央ロッドドメインと、（ｉｉｉ）システイン豊富ドメインと、を含む、μＤｙｓポリペプチドをコードする。

【0086】

μＤｙｓ導入遺伝子は、一実施形態では、筋線維鞘神経一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）標的化のための足場として報告されている、ジストロフィンスペクトリン反復１６及び１７をコードする。更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１及び２４をコードする。別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１、１６及び１７、２３並びに２４をコードする。更に別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１、２、３及び２４をコードする。その上更に別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１、２、２２、２３及び２４をコードする。

【0087】

μＤｙｓ導入遺伝子は、一実施形態では、ジストロフィンヒンジ領域１及び４をコードする。別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンヒンジ領域１、３及び４をコードする。

【0088】

一実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、図１４に記載されるμＤｙｓドメインの組み合わせのうちの１つを含む、μＤｙｓタンパク質をコードする。

【0089】

本明細書に記載されるＡＡＶベクターゲノムは、（ｉ）アクチン結合部位を含むＮＴＤと、（ｉｉ）２～４個のヒンジ領域及び４～６個のスペクトリン反復を含む中央ロッドドメインと、（ｉｉｉ）システイン豊富ドメインと、を含む、μＤｙｓタンパク質をコードするμＤｙｓ導入遺伝子を含む。例えば、一実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１６及び１７をコードする。更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１及び２４をコードする。別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１、１６及び１７、２３及び２４をコードする。更に別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１、２、３及び２４をコードする。その上更に別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンスペクトリン反復１、２、２２、２３及び２４をコードする。

【0090】

一実施形態におけるμＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンヒンジ領域１及び４をコードする。別の実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、ジストロフィンヒンジ領域１、３及び４をコードする。

【0091】

本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、一実施形態では、μＤｙｓタンパク質をコードするカプシド封入導入遺伝子を含む。例えば、いくつかの実施形態では、μＤｙｓタンパク質をコードする配列は、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、μＤｙｓタンパク質をコードする配列は、配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、μＤｙｓタンパク質をコードする配列は、配列番号５からなる。

【化1】

【化2】

【化3】

【0092】

本明細書に開示される核酸要素は、標準的な分子生物学技術を使用してともにライゲーションされて、遺伝子構築物を形成することができる（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．”（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を参照されたい）。

【0093】

本明細書に記載される遺伝子構築物は、最小限に（５’から３’まで）、（ｉ）プロモーターと、（ｉｉ）導入遺伝子と、を含む。例えば、いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＭＨＣＫ７プロモーターである。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、μＤｙｓをコードする核酸を含む。更なる実施形態では、当該遺伝子構築物は、１つ以上の追加の調節エレメントを含むことができる。一実施形態では、遺伝子構築物は、５’から３’まで、プロモーターと、導入遺伝子と、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、を含む。別の実施形態では、遺伝子構築物は、５’から３’まで、エンハンサーと、プロモーターと、導入遺伝子と、ＳＶ４０イントロンと、ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールと、を含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、（５’から３’まで）、（ｉ）プロモーターと、（ｉｉ）ＳＶ４０イントロンと、（ｉｉｉ）導入遺伝子と、を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＭＨＣＫ７プロモーターである。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、μＤｙｓをコードする核酸である。更なる実施形態では、当該遺伝子構築物は、１つ以上の追加の調節エレメントを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子構築物は、配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する連続核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号１０を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号１０からなる。

【化4】

【化5】

【0095】

いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、（５’から３’まで）（ｉ）エンハンサーと、（ｉｉ）プロモーターと、（ｉｉｉ）導入遺伝子と、（ｉｖ）ＳＶ４０ポリ（Ａ）テールをコードする配列と、を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサーは、ＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＭＨＣＫ７プロモーターである。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、μＤｙｓをコードする核酸である。更なる実施形態では、当該遺伝子構築物は、１つ以上の追加の調節エレメントを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子構築物は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する連続核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号１１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号１１の核酸配列からなる。

【0096】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるベクターゲノムは、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号１２からなる。いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１２の核酸配列からなる。

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【0097】

ＡＡＶベクター骨格
いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、標準的な分子生物学技術を使用して、本明細書に記載される遺伝子構築物を適切なアデノウイルスプラスミド骨格に挿入することによって組み立てることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．”、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）．“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”を参照されたい）。アデノウイルスプラスミド骨格は、一実施形態では、本明細書に記載される５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。遺伝子構築物は、ＩＴＲ配列間、５’ＩＴＲ配列の下流、及び３’ＩＴＲ配列の上流で、アデノウイルスプラスミド骨格に挿入される。

【0098】

例えば、一実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、配列番号１０の配列を含む遺伝子構築物を、配列番号１３の配列を含むアデノウイルスプラスミド骨格に挿入することによって組み立てることができる。

【0099】

別の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターゲノムは、配列番号１１の配列を含む遺伝子構築物を、配列番号１３の配列を含むアデノウイルスプラスミド骨格に挿入することによって組み立てることができる。

【0100】

いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスプラスミド骨格は、配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスプラスミド骨格は、配列番号１３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスプラスミド骨格は、以下に提供される配列番号１３の核酸配列からなる。

【化10】

【化11】

【化12】

【0101】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子産生
ＡＡＶ粒子は、任意の標準的な方法によって産生することができる（例えば、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００１／０８３６９２、Ｍａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許 第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許 第６，２５８，５９５号を参照されたい）。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターゲノムは、ＤＮＡ産生を拡張するためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに形質転換し、任意の標準的な方法（例えば、Ｍａｘｉ－Ｐｒｅｐ Ｋ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製し、制限消化又は配列決定によって検証することができる。次いで、精製されたＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、並びにＡＡＶヘルパープラスミドと組み合わせて、標準的な方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリエチレンイミン、エレクトロポレーション、及び同等物）を使用して、適切なパッケージング細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、又はＰｅｒＣ．６、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、Ｖｅｒａ、及びＦＲｈＬ－２細胞）にトランスフェクトすることができる。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は、任意のＡＡＶ血清型に由来し得、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３を含むがこれらに限定されない、組換えＡＡＶベクターＩＴＲのものと同じであるか、又は異なり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、それぞれ、ＡＡＶ２及びＡＡＶ９に由来するＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、パッケージング細胞から採取され、塩化セシウム超遠心分離勾配又はカラムクロマトグラフィーなどによる、当該技術分野において標準的な方法（例えば、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７）によって精製することができる。

【0103】

医薬組成物
本明細書で提供される医薬組成物は、髄腔内医薬組成物であり、すなわち、髄腔内経路を介した送達のために意図される。髄腔内組成物は、本明細書に記載されるように、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する有効量のＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、本発明のＡＡＶ粒子と、薬学的に許容可能な担体と、任意選択的に、他の薬剤、医薬品、安定剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含む。「薬学的に許容可能な」とは、有毒ではないか、又は別様に有害ではない材料を意味し、すなわち、材料は、いずれの望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく対象に投与され得る。医薬組成物は、髄腔内医薬組成物である。有効量のＡＡＶ粒子は、同じベクターゲノム成分、又は同じ導入遺伝子を含むＩＶ ＡＡＶ医薬組成物と比較して、より低用量のベクターゲノムを含む。例えば、一実施形態では、有効量の本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、同じＡＡＶ粒子又は同じマイクロジストロフィン導入遺伝子を含む有効量のＩＶ組成物のよりも約９０％以下のベクターゲノムである。

【0104】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、任意選択的に、医薬組成物が送達される対象の血液と等張である、滅菌水性及び非水性注射溶液を含む。医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び組成物を投与される意図された対象の血液と等張にする溶質を含有することができる。水性及び非水性滅菌懸濁液、溶液、並びにエマルションは、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール溶液／水溶液、エマルション、又は懸濁液が挙げられ、生理食塩水及び緩衝媒体を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能なビヒクルを含み、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油を含むことができる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス、並びに同等物などの防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。

【0105】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単位／用量又は複数回用量容器、例えば、密封アンプル及びバイアル中で提示することができ、使用の直前に、滅菌液体担体、例えば、生理食塩水又は注射用蒸留水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。

【0106】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、ＩＶ、筋肉内、又は脳室内（ＩＣＶ）投与のために代替的に処方することができる。

【0107】

治療の方法
本発明の一態様は、有効量の本明細書に記載されるＡＡＶ粒子を含む髄腔内組成物を単回用量で髄腔内投与することを含む、ジストロフィノパチーの治療を必要とする対象においてジストロフィノパチーを治療する方法に関する。本方法は、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、又はＤＭＤ関連拡張型心筋症（ＤＣＭ）などのジストロフィノパチーを治療するために、ＡＡＶ粒子を対象の心臓及び／又は骨格に優先的に送達するために採用することができる。理論に束縛されることを所望することなく、ＡＡＶ粒子、及びジストロフィノパチーを治療するために、同粒子の送達を必要とする対象に同粒子を送達するための方法は、少なくとも本発明が、（ｉ）実質的に同じ又はより良好な治療利益を達成するために、ＩＶ送達よりも著しく低い投与量を可能にし、それによって、ウイルス負荷及び毒性並びに他の副作用を低減し、かつ／又は（ｉｉ）肝組織と比較して、心筋及び／又は骨格筋組織における優先的な導入遺伝子標的化及び発現を可能にし、それによって、導入遺伝子を目的の細胞に標的化し、静脈内送達されるＡＡＶベクターと比較して、より優れた治療利益を提供し、（ｉｉｉ）製造負担の減少に対応する、必要とされる低投与量により、ＩＶ製剤と比較して、より大きな患者集団に利益をもたらすことができるため、既知のＡＡＶ粒子及び治療方法よりも優れた利益を提供する。

【0108】

一実施形態では、治療を必要とする対象を治療する方法であって、μＤｙｓ導入遺伝子を含むベクターゲノムをカプシド封入するＡＡＶカプシドを含む有効量のＡＡＶ粒子を含む組成物を、単回用量で対象に髄腔内投与することを含む、方法が提供される。更なる実施形態では、対象は、髄腔内投与の前にトレンデレンブルク位に位置付けられる。一実施形態では、組成物の髄腔内投与は、非イオン性低浸透圧造影剤の非存在下にある。別の実施形態では、髄腔内投与は、非イオン性低浸透圧造影剤の存在下にある。

【0109】

本発明は、部分的に、有効量の本明細書に記載されるＡＡＶ粒子の髄腔内投与が、対象の肝組織における導入遺伝子発現と比較して、対象の骨格筋及び／又は心筋においてより高いレベルでμＤｙｓ導入遺伝子発現を可能にするという所見に基づく。例えば、一実施形態では、有効量のＡＡＶ粒子、例えば、ＡＡＶ９粒子の投与後に、μＤｙｓ導入遺伝子は、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現のレベルと比較して、対象の骨格筋においてより高いレベルで発現される。別の実施形態では、有効量のＡＡＶ粒子、例えば、組換えＡＡＶ９粒子の投与後に、μＤｙｓ導入遺伝子は、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現のレベルと比較して、対象の心筋においてより高いレベルで発現される。更に別の実施形態では、有効量のＡＡＶ粒子、例えば、組換えＡＡＶ９粒子の投与後に、μＤｙｓ導入遺伝子は、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現のレベルと比較して、対象の骨格筋及び心筋においてより高いレベルで発現される。

【0110】

本明細書に記載される実施形態によれば、導入遺伝子発現は、遺伝子発現（すなわち、ｍＲＮＡレベルを測定することによる）又は対応するタンパク質の発現を指し得る。異なる組織型における導入遺伝子発現のレベルを決定するために、実質的に同じ量の組織、又は実質的に同じ数の細胞が、遺伝子発現レベルについて比較されるべきであることが当業者によって理解されるであろう。骨格筋及び／又は心筋におけるより高いレベルのμＤｙｓ導入遺伝子発現は、一実施形態では、肝組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現の量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％高い。更なる実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子は、配列番号５に記載される核酸配列を含む。

【0111】

本明細書に記載される方法の一実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する有効用量のＡＡＶ粒子を送達する方法は、静脈内投与されるμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する実質的に同一用量のＡＡＶ粒子と比較して、骨格筋及び／又は心筋においてより優れたμ導入遺伝子発現を提供する。別の実施形態では、有効用量のＡＡＶ粒子を送達する方法は、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する有効用量のＡＡＶ粒子が静脈内送達されるときと比較して、骨格筋及び／又は心筋においてより優れたμＤｙｓ導入遺伝子発現を提供する。導入遺伝子発現は、一実施形態では、有効量のＡＡＶ粒子を含む組成物の投与の約１週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１８ヶ月、又は約２４ヶ月後に測定される。導入遺伝子は、一実施形態では、配列番号５に示される核酸配列を含む。

【0112】

別の実施形態では、本発明のμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子は、髄腔内投与されると、同一のベクターゲノム用量が静脈内投与されるときの同じ組織型における導入遺伝子発現と比較して、骨格筋及び／又は心筋において少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％優れた導入遺伝子発現を提供する。同一のベクターゲノムは、同じ調節エレメント及び／又は同一の導入遺伝子配列若しくは同じＡＡＶカプシドを含む必要はない。しかしながら、髄腔内及び静脈内投与される導入遺伝子は、μＤｙｓポリペプチドをコードする。

【0113】

更に別の実施形態では、髄腔内投与されたＡＡＶ粒子の投与後に測定される［（骨格筋及び／又は心筋μＤｙｓ導入遺伝子発現）］／（肝臓μＤｙｓ導入遺伝子発現）］の比は、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する同一用量のＡＡＶ粒子が静脈内投与されるときの同じ比よりも大きい。導入遺伝子発現は、一実施形態では、有効量のＡＡＶ粒子を含む組成物の投与の約１週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１８ヶ月、約２４ヶ月、約３６ヶ月、約４８ヶ月、又は約６０ヶ月後に測定される。

【0114】

一実施形態では、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する有効量のＡＡＶ粒子は、髄腔内投与されると、同じ用量で静脈内投与されるμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子と比較して、より優れた有効性又はより優れた治療利益を提供する。

【0115】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分な髄腔内（ＩＴ）ベクターゲノム（ｖｇ）用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なμＤｙｓ導入遺伝子をコードするベクターゲノムの静脈内（ＩＶ）ｖｇ用量の約９０％、約９０％以下、約８５％、約８５％以下、約８０％、約８０％以下、約７５％、約７５％以下、約７０％、約７０％以下、約６０％、約６０％以下、約５０％、約５０％以下、約４０％、約４０％以下、約３０％、約３０％以下、約２５％、約２５％以下、約１０％、又は約１０％以下である。ＩＴベクターゲノムは、μＤｙｓ導入遺伝子を含む。ＩＴ及びＩＶ μＤｙｓ導入遺伝子は、同じ核酸配列を含む必要はない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約９０％以下である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約７５％以下である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約５０％以下である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約２５％以下である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約１０％以下である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約１０～４０倍少ない。一実施形態における治療応答は、筋組織、例えば、心筋及び／又は骨格筋組織におけるμＤｙｓ導入遺伝子発現である。別の実施形態では、治療応答は、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）におけるベースライン（すなわち、治療前）からの対象のスコアの増加である。更なる実施形態では、導入遺伝子は、μＤｙｓポリペプチドをコードする。

【0116】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分な髄腔内（ＩＴ）ベクターゲノム（ｖｇ）用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分な静脈内（ＩＶ）ｖｇ用量よりも低く、ＩＴベクターゲノム及びＩＶベクターゲノムは各々、μＤｙｓポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。しかしながら、それぞれの導入遺伝子は、同じ核酸配列を含む必要はない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約５００倍、又は約１０００倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約１０倍～約２０倍、約１０倍～約３０倍、約１０倍～約４０倍、約１０倍～約５０倍、約１０倍～約７５倍、約１０倍～約１００倍、又は約１０倍～約１０００倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約２５倍～約３０倍、約２５倍～約４０倍、約２５倍～約５０倍、約２５倍～約７５倍、約２５倍～約１００倍、約２５倍～約５００倍、又は約２５倍～約１０００倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約５０倍～約７５倍、約５０倍～約１００倍、約５０倍～約２５０倍、約５０倍～約５００倍、又は約５０倍～約１０００倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約１００倍～約２００倍、約１００倍～約２５０倍、約１００倍～約５００倍、又は約１００倍～約１０００倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約１０～４０倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約２５～４０倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約１０倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約２５倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約４０倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約５０倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法のうちの１つについて治療応答を提供するために十分なＩＴ ｖｇ用量は、同じ又は実質的に同じ治療応答を提供するために十分なＩＶ ｖｇ用量よりも約１００倍低い。一実施形態における治療応答は、筋組織、例えば、心筋及び／又は骨格筋組織における導入遺伝子発現である。

【0117】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含む、髄腔内（ＩＴ）組成物の有効用量は、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含む、静脈内（ＩＶ）組成物の有効用量よりも低い。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効用量は、ＩＶ組成物の有効量よりも約９０％、約９０％以下、約８５％、約８５％以下、約８０％、約８０％以下、約７５％、約７５％以下、約７０％、約７０％以下、約６０％、約６０％以下、約５０％、約５０％以下、約４０％、約４０％以下、約３０％、約３０％以下、約２５％、約２５％以下、約１０％、又は約１０％以下のベクターゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、ＩＶ組成物の有効量よりも約９０％以下のベクターゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、ＩＶ組成物の有効量よりも約７５％以下のベクターゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、ＩＶ組成物の有効量よりも約５０％以下のベクターゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、ＩＶ組成物の有効量よりも約２５％以下のベクターゲノムである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、ＩＶ組成物の有効量よりも約１０％以下のベクターゲノムである。

【0118】

いくつかの実施形態では、ＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子の有効用量は、ＩＶ組成物中のＡＡＶ粒子の有効用量よりも低用量であり、各ＡＡＶ粒子は、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する。いくつかの実施形態では、ＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子の有効用量は、ＩＶ組成物中のＡＡＶ粒子の有効用量よりも約２倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約５００倍、又は約１０００倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量（有効用量）は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量（有効用量）よりも約１０倍～約２０倍、約１０倍～約３０倍、約１０倍～約４０倍、約１０倍～約５０倍、約１０倍～約７５倍、約１０倍～約１００倍、又は約１０倍～約１０００倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含む髄腔内組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約２５倍～約３０倍、約２５倍～約４０倍、約２５倍～約５０倍、約２５倍～約７５倍、約２５倍～約１００倍、約２５倍～約５００倍、又は約２５倍～約１０００倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含む髄腔内組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約５０倍～約７５倍、約５０倍～約１００倍、約５０倍～約２５０倍、約５０倍～約５００倍、又は約５０倍～約１０００倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約１００倍～約２００倍、約１００倍～約２５０倍、約１００倍～約５００倍、又は約１００倍～約１０００倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約２５倍～約４０倍低い。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約１０倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約２５倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約４０倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約５０倍低い用量である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子を含むＩＴ組成物の有効量は、同じＡＡＶ粒子、又はＩＴ組成物中のＡＡＶ粒子によってカプシド封入された導入遺伝子と同じポリペプチドをコードする導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ粒子を含むＩＶ組成物の有効量よりも約１００倍低い用量である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、μＤｙｓ導入遺伝子である。

【0119】

本明細書で提供される治療方法の一実施形態では、治療することは、治療前の血清ＣＫレベルと比較して、対象における血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを減少させることを含む。いくつかの実施形態では、血清ＣＫレベルは、治療前の血清ＣＫレベルと比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上減少する。更なる実施形態では、血清ＣＫレベルは、ＡＡＶ粒子を用いた治療の前に、及びＡＡＶ粒子の投与後約１２ヶ月、約１８ヶ月、約２４ヶ月、又は約３０ヶ月で評価される。更なる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶ９カプシドを含む。

【0120】

本明細書で提供される髄腔内治療方法の別の実施形態では、治療することは、有効量の同じＡＡＶ粒子、又はμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する異なるＡＡＶ粒子のＩＶ投与を介して治療される対象と比較して、治療されている対象における副作用の数を減少させること、又は１つ以上の副作用の重症度を減少させることを含む。髄腔内投与されるＡＡＶ粒子は、一実施形態では、ＡＡＶ９粒子である。

【0121】

いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子、又は同粒子を含む医薬組成物を使用して、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、及びＤＣＭを含むがこれらに限定されない、ジストロフィノパチーを治療することができる。

【0122】

いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子は、治療を必要とする対象、例えば、ＤＭＤを有する対象に、１回又は複数回投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、治療を必要とする対象に、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれ以上投与される。好ましい実施形態では、ＡＡＶ粒子を含む本明細書で提供される髄腔内組成物は、治療を必要とする対象に１回投与される。更なる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９粒子である。

【0123】

一実施形態では、本明細書に記載されるμＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶカプシドを含む、有効量のＡＡＶ粒子が、治療を必要とする対象においてＤＭＤを治療するための方法で使用される。更なる実施形態では、対象は、ＡＡＶ粒子を含む組成物を単回用量で髄腔内投与される。更なる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９粒子である。その上更なる実施形態では、対象は、投与前にトレンデレンブルク位に位置付けられる。

【0124】

ＤＭＤを治療するための方法の一実施形態では、治療を必要とする対象は、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶカプシドを含む有効量のＡＡＶ粒子を含む組成物を、単回用量で髄腔内投与される。μＤｙｓ導入遺伝子は、一実施形態では、図１４に記載されるジストロフィン要素の組み合わせを含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号５、１０、１１、又は１２に記載される核酸配列を含む。

【0125】

ＤＭＤを治療するための方法の一実施形態では、治療することは、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）におけるベースライン（すなわち、治療前）から対象のスコアを増加させることを含む。ＮＳＡＡは、歩行可能なＤＭＤ対象における機能的運動能力を測定するために使用される１７項目の評定尺度である。本尺度は、完全に独立した機能を示す最大スコアとして３４を含む、序数である。各活動は、０（独立して達成することができない）、１（修正された方法であるが、別の人からの身体的支援を受けずに目標を達成する）、又は２（正常－活動の明らかな修正なし）のいずれかとして等級分けされる。例えば、各々の開示が、あらゆる目的のために参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｍａｚｏｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １９，ｐｐ．４５８－４６１、及びｒｅｓｅａｒｃｈｒｏｍ．ｃｏｍ／ｍａｓｔｅｒｌｉｓｔ／ｖｉｅｗ／１８＃ｆｏｒｍ２を参照されたい。ベースラインからの変化は、一実施形態では、髄腔内組成物の投与の１２ヶ月後に測定される。別の実施形態では、ベースラインからの変化は、髄腔内組成物の投与の１８ヶ月後に測定される。別の実施形態では、ベースラインからの変化は、髄腔内組成物の投与の２４ヶ月後に測定される。更に別の実施形態では、投与の１２ヶ月後に測定されるＮＳＡＡにおけるベースラインからの対象のスコアの増加は、投与後１８ヶ月で実質的に変化していないか、又は増加する。その上更に別の実施形態では、投与の１２ヶ月後に測定されるＮＳＡＡにおけるベースラインからの対象のスコアの増加は、投与後２４ヶ月で実質的に変化していないか、又は増加する。その上更に別の実施形態では、投与の１２ヶ月後に測定されるＮＳＡＡにおけるベースラインからの対象のスコアの増加は、投与後６０ヶ月で実質的に変化していないか、又は増加する。

【0126】

ＮＳＡＡスコアを増加させることは、一実施形態では、ＮＳＡＡスコアを約５～約２５、約５～約２０、約５～約１５、又は約５～約１０だけ増加させることを含む。別の実施形態では、ＮＳＡＡスコアを増加させることは、ＮＳＡＡスコアを約２点～約１２点増加させることを含む。別の実施形態では、ＮＳＡＡスコアを増加させることは、ＮＳＡＡスコアを約２点～約１０点増加させることを含む。更に別の実施形態では、ＮＳＡＡスコアを増加させることは、ＮＳＡＡスコアを約３点～約１０点増加させることを含む。更に別の実施形態では、ＮＳＡＡスコアを増加させることは、スコアを約４点～約１０点増加させることを含む。その上更に別の実施形態では、ＮＳＡＡスコアを増加させることは、スコアを約２点～約８点増加させることを含む。別の実施形態では、ＮＳＡＡスコアを増加させることは、ＮＳＡＡスコアを約２点～約６点増加させることを含む。

【0127】

ＤＭＤを治療するための方法の一実施形態では、治療を必要とする対象は、μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入する有効量のＡＡＶベクターを、単回用量で髄腔内投与される。μＤｙｓ導入遺伝子は、一実施形態では、図１４に記載されるジストロフィン要素の組み合わせを含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号５、１０、１１、又は１２に記載される核酸配列を含む。μＤｙｓ導入遺伝子をカプシド封入するＡＡＶベクターの有効量は、一実施形態では、治療前に歩行したメートル数と比較して、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）において歩行したメートル数を増加させるために十分な量である。

【0128】

本発明のＡＡＶ粒子、又は同粒子を含む医薬組成物は、単回用量として、又は分割用量として投与される。いくつかの実施形態では、用量は、単回投与として、又は分割投与として送達される、１×１０^９～１×１０^１６ベクターゲノム（ｖｇ）、２．５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、７．５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、１×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、２．５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、７．５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、１×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇである。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、２．５×１０^１３ｖｇの単回用量として投与される。別の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、５×１０^１３ｖｇの単回用量として投与される。更に別の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、１×１０^１４ｖｇの単回用量として投与される。

【0129】

本発明のＡＡＶ粒子、又は同粒子を含む医薬組成物は、単回髄腔内用量として投与される。いくつかの実施形態では、髄腔内送達のための用量は、単回用量又は分割用量として送達される、１×１０^９～１×１０^１６ベクターゲノム（ｖｇ）、１×１０^１０～１×１０^１６ｖｇ、１×１０^１１～１×１０^１６ｖｇ、１×１０^１２～１×１０^１６ｖｇ、１×１０^１３～１×１０^１６ｖｇ、１×１０^１４～１×１０^１６ｖｇ、１×１０^１５～１×１０^１６ｖｇ、１×１０^９～１×１０^１５ｖｇ、１×１０^９～１×１０^１４ｖｇ、１×１０^９～１×１０^１３ｖｇ、１×１０^９～１×１０^１２ｖｇ、１×１０^９～１×１０^１１ｖｇ、１×１０^９～１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１３～１×１０^１５ベクターｖｇ、２．５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、７．５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、１×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、２．５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、７．５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、１×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、２．５×１０^１３ｖｇの単回髄腔内用量として投与することができる。別の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、５×１０^１３ｖｇの単回髄腔内用量として投与することができる。更に別の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、１×１０^１４ｖｇの単回髄腔内用量として投与することができる。

【0130】

他の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、単回又は分割脳室内用量として投与することができる。いくつかの実施形態では、脳室内送達のための用量は、１×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、２．５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、７．５×１０^１３～１×１０^１５ｖｇ、１×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、２．５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、７．５×１０^１４～１×１０^１５ｖｇ、１×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～７．５×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～５．０×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～２．５×１０^１４ｖｇ、１×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、２．５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ、７．５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、２．５×１０^１３ｖｇの単回脳室内用量として投与することができる。別の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、５×１０^１３ｖｇの単回脳室内用量として投与することができる。更に別の実施形態では、本発明のＡＡＶ粒子又は同粒子を含む医薬組成物は、１×１０^１４ｖｇの単回脳室内用量として投与することができる。

【実施例】

【0131】

ここで一般的に記載されている本発明は、本発明のある特定の態様及び実施形態の例証の目的のためのみに含まれる、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解され、本発明を限定することを意図していない。

【0132】

厳選した方法
生後１日目（ｐ１）での脳室内（ＩＣＶ）注射
大脳半球を介して新生子マウス（ｐ１）の脳室内注射（ＩＣＶ）を実施する。新生マウスは、完全に覚醒して注射される。針が２ｍｍの注射深度について印付けられていることを確認する。注射部位は、耳と眼との間の中間点である（場所は、矢状縫合の約０．７～１．０ｍｍ外側、及び新生前項から０．７～１．０ｍｍ尾側である）。Ｐ０が、マウスの出生日（ＤｏＢ）として指定される。動物は、同腹の子の発見の３６時間以内に注射され得る。

【0133】

過剰な量の投薬溶液が、注射部位から漏出していると判定されるか、又は注射部位が完全に見失われた場合、動物は研究から除外される。

【0134】

生後２８日目（ｐ２８）での脳室内（ＩＣＶ）注射
ハミルトンシリンジが、所望の体積の投薬溶液を装填される。標準体積は、注射部位当たり８μｌである。動物が、ケージから個々に取り出され、麻酔チャンバーに入れられる。チャンバーに入ると、動物は、麻酔される。管類が、注射中の継続的な麻酔を可能にするために、麻酔器から定位固定装置に接続される。それぞれの動物は、取り出されて定位固定装置上に配置される前に、約２分間チャンバー内に留まる。動物が定位固定装置上に置かれると、注射のための座標は、内側／外側（Ｍ／Ｌ）：＋／－１．００ｍｍ、前方／後方（Ａ／Ｐ）：－０．５～－０．８ｍｍ、背側／腹側（Ｄ／Ｆ）：－２．５ｍｍに設定される。

【0135】

ヨードスワブが、滅菌目的のために動物の頭皮上の切開部位に適用される。メスを使用して、小切開が動物の頭皮に加えられ、頭皮が穏やかに剥がされて、頭蓋領域を露出させる。針が所望の場所に来ると、シリンジプランジャーが、ゆっくりと押し下げられ、投薬溶液を頭蓋腔に注入する。注射部位は、注射の品質を確認するために注射中及び注射直後に監視される。

【0136】

筋肉の準備
動物が適切な年齢に達すると、計量され、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を介して麻酔される（ケタミン［８０ｍｇ／ｋｇ］、アセプロマジン［０．５ｍｇ／ｋｇ］、及びキシラジン［１６ｍｇ／ｋｇ］）。次いで、組織の切開が実行される。鋏が、足首の皮膚を切断するために使用され、次いで、両方の下腿の皮膚が後方に引かれて、下腿筋及び上腿筋を露出させる。片側の前脛骨筋が、その挿入点の近くで解離され、最も近い０．１ｍｇまで計量され、次いで、廃棄される。次いで、４．０縫合糸が、長趾伸筋（ＥＤＬ）の近位端及び遠位端の筋腱間接合部において結ばれ、次いで、解離され、リンゲル溶液（１３７ｍｍのＮａＣｌ、５ｍｍのＫＣｌ、２ｍｍのＣａＣｌ_２、１ｍｍのＭｇＳＯ_４、１ｍｍのＮａＨ_２ＰＯ_４、２４ｍｍのＮａＨＣＯ_３、１０ｍｇ／リットルのクラーレを含む１１ｍｍのグルコース）に入れられ、これが、室温で保たれる。

【0137】

ＥＤＬを解離した後、腹部が開かれ、１ｃｃシリンジを使用して、下大静脈から採血される（約３００～５００μＬ）。血液は、室温で２５～３５分間静置し、次いで、４℃において３，５００×ｇで１０分間遠心分離される。上清を回転させた後、血清が単離され、微小遠心管に入れられ、－８０℃で凍結される。

【0138】

次いで、アキレス腱が切断され、後方に引かれて、ヒラメ筋、足底筋、及び腓腹筋を露出させる。ヒラメ筋が、解離され、管に入れられ、液体窒素冷却イソペンタン中で凍結される。足底筋が、腓腹筋がない状態で鈍的解離され、次いで、可能な限り近位に切断され、管に入れられ、液体窒素冷却イソペンタン中で凍結され、－８０℃で保管される。

【0139】

腓腹筋が、可能な限り近位に切断され、最も近い０．１ｍｇまで計量され、管に入れられ、凍結される。反対側からの前脛骨筋が、遊離した状態で解離され、最も近い０．１ｍｇまで計量され、静止長においてコルク上でピン留めされる。同じ側からのＥＤＬもまた、遊離した状態で解離され、静止長において同じコルク上でピン留めされる。次いで、コルクは、液体窒素冷却イソペンタンに浸漬される。約３０～約４５秒後、コルクは、ドライアイス上に置かれ、箔に包まれ、－８０℃で保管される。大腿四頭筋が、解離され、管に入れられ、液体窒素冷却イソペンタン中で凍結され、－８０℃で保管される。肝臓の小片が、解離され、管に入れられ、液体窒素冷却イソペンタン中で凍結され、－８０℃で保管される。横隔膜が、解離され、半分に折り畳まれ、次いで、再び折り畳まれ、次いで、コルクの上に置かれ、ピン留めされる。次いで、コルクは、液体窒素冷却イソペンタンに浸漬される。３０～４５秒後、コルクは、ドライアイス上に置かれ、箔に包まれ、－８０℃で保管される。

【0140】

心臓全体が、解離され、最も近い０．１ｍｇまで計量され、管に入れられ、液体窒素冷却イソペンタン中で凍結される。管は、キャップを付けられ、－８０℃で保管するまで液体窒素に入れられる。

【0141】

実施例１：組換えアデノ随伴ウイルス粒子の生成
マイクロジストロフィン遺伝子構築物の分子クローニング
ＭＨＣＫ７プロモーター及びＳＶ４０イントロンを、μＤｙｓ及びＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結することによって、本明細書ではＩＮＳ１２０１と称され、以前はＭＴＳ－００１として知られていた、マイクロジストロフィン（μＤｙｓ）をコードする遺伝子構築物を合成した（図１Ａ）。ＭＨＣＫ７プロモーターを含むＳＫ－ＣＲＭ４エンハンサーを、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結することによって、代替的なμＤｙｓをコードする遺伝子構築物（本明細書ではＩＮＳ１２１２と称され、以前はＭＴＳ－００３として知られていた）を合成した（図１Ｂ）。ＩＮＳ１２０１及びＩＮＳ１２１２遺伝子構築物を、Ｐｕｃ５７ベクター骨格において生成した。ＩＮＳ１２０１及びＩＮＳ１２１２構築物を、ＤＮＡ配列決定法によって確認し、４５４２ｂｐ及び４７１４構築物を、それぞれ、ＮｒｕＩ制限消化によって単離し、適切なＡＡＶ骨格への後続のクローニングのためにゲル精製した。

【0142】

単離されたＩＮＳ１２０１及びＩＮＳ１２１２遺伝子構築物を各々、独立して、ＩＴＲ部位を含むゲル精製されたｐＳＺ０１ベクター骨格、及びＮｒｕＩ制限消化によって線形化／単離されたカナマイシン耐性遺伝子に鈍的クローニングした。ｐＳＺ０１ベクター骨格を有するＩＮＳ１２１２構築物及びｐＳＺ０１ベクター骨格を有するＩＮＳ１２１２構築物のＴ４ライゲーション後、ＮＥＢ Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、増殖させ、精製した。完全なｐＳＺ０１－ＩＮＳ１２０１又はｐｓＺ０１－ＩＮＳ１２１２プラスミドクローンを産生するためにライゲーションに成功した遺伝子構築物を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓａＩ制限消化によって識別した。

【0143】

Ｍａｘｉ－Ｐｒｅｐキット（ＧｅｎｅＪＥＴ Ｅｎｄｏ－ｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細菌形質転換によって、ｐＳＺ０１－ＩＮＳ１２０１及びｐｓＺ０１－ＩＮＳ１２１２クローンを拡張した。正しいプラスミド配列を、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって再確認した（図１Ｃ、レーン１及び３）。加えて、ｐＳＺ０１ベクター骨格内にＩＮＳ１２０１及びＩＮＳ１２１２を含むＩＴＲ部位の正しい組み込みの更なる確認として、ＳｍａＩを使用した制限消化（図１Ｃ、レーン２及び４）を実施した。
一過性のトランスフェクション及びウイルスパッケージング

【0144】

標準的なリン酸カルシムトランスフェクション法（例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００７．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ５：１６－２４）に記載される）を使用して、アデノウイルスヘルパープラスミド、及びＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子とともにＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子を送達するキメラパッケージング構築物と組み合わせて、確認されたｐＳＺ０１－ＩＮＳ１２０１及びｐｓＺ０１－ＩＮＳ１２１２ ＡＡＶベクターをＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、ＡＡＶ粒子を採取し、連続２回の塩化セシウム密度勾配超遠心分離を使用して精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分解され、銀染色された１×１０^１３ｖｇ ＡＡＶ２標準（図２、レーン３（０．５μｌ）、レーン４（１μｌ）、レーン５（２μｌ）、レーン６（４μｌ））と比較することによって、各１μｌの精製されたＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９（図２、レーン１）及びＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９（図２、レーン２）を滴定した。

【0145】

実施例２：ＡＡＶ９ μＤｙｓ（ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９及びＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９）の筋肉内送達が、ＭＴＸマウスにおけるμＤｙｓ発現の増加をもたらす。
ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９及びＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの一般的なマウスモデルであるｍｄｘマウスの腓腹筋に筋肉内注射した（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２２（２４）：４９２９－３７を参照されたい）。図３Ａに示されるように、筋肉内注射の２１日後、２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９（ｉｉｉ）又はＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９（ｉｖ）を注射された腓腹筋は、非注射ｍｄｘマウスよりも著しく高いレベルで（ｉ）、及び野生型Ｃ５７／Ｂｌマウスと同等のレベルで（ｉｉ）、μＤｙの広範な発現を示した。図３Ｂは同様に、２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いた筋肉内注射の２１日後にｍｄｘマウスにおいてμＤｙｓの高レベル発現を示す。

【0146】

実施例３：ＡＡＶ９ μＤｙｓ（ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９及びＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９）の脳室内送達が、ＭＤＸマウスにおいてμＤｙｓ発現の増加をもたらす。
ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を、生後１日目（ｐ１）にｍｄｘマウスに脳室内注射し、組織試料を収集し、ジストロフィンについて分析した。図４Ａに示されるように、１．８×１０^１１ｖｇのＡＡＶを用いた脳室内（ＩＣＶ）注射の２１日後、ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９は、ｍｄｘ動物の腓腹筋（ｉ）、前脛骨筋（ｉｉ）、大腿四頭筋（ｉｉｉ）、臀筋（ｉｖ）、三頭筋（ｖ）、横隔膜（ｖｉ）、及び心臓（ｖｉｉ）の筋細胞におけるμＤｙｓの発現を効率的に標的化してもたらし、肝臓（ｖｉｉｉ）では発現がほとんど又は全くなかった。同様に、図４Ｂに示されるように、９×１０^１０ｖｇのＡＡＶを用いたＩＣＶ注射の２１日後、ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９は、腓腹筋（ｉ）、前脛骨筋（ｉｉ）、大腿四頭筋（ｉｉｉ）、臀筋（ｉｖ）、三頭筋（ｖ）、横隔膜（ｖｉ）、及び心臓（ｖｉｉ）の筋細胞におけるμＤｙｓの発現を効率的に標的化してもたらし、肝臓（ｖｉｉｉ）では発現がほとんど又は全くなかった。

【0147】

ＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９も、ｐ１でｍｄｘマウスに脳室内注射し、組織試料を収集し、ジストロフィンについて免疫蛍光染色した。図５に示されるように、９×１０^１０ｖｇのＡＡＶを用いたＩＣＶ注射の２１日後、ＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９は、腓腹筋（ｉ）、前脛骨筋（ｉｉ）、大腿四頭筋（ｉｉｉ）、臀筋（ｉｖ）、三頭筋（ｖ）、横隔膜（ｖｉ）、及び心臓（ｖｉｉ）の筋細胞におけるμＤｙｓの発現を効率的に標的化してもたらし、肝臓（ｖｉｉｉ）では発現がほとんど又は全くなかった。

【0148】

図６Ａのヘマトキシリン及びエオシン染色試料に示されるように、９×１０^１０ｖｇ（ｉｉ）及び２．７×１０^１１ｖｇ（ｉｉｉ）のＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いたＩＣＶ注射の８０日後、腓腹筋組織は、野生型Ｃ５７／Ｂｌ（ｉ）及び非注射ｍｄｘマウス対照（ｉｖ）と比較して、正常な組織構造の回復及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーの組織病理学的特徴の補正を示した。図６Ｂに示されるように、９×１０^１０ｖｇ（ｉｉ）及び２．７×１０^１１ｖｇ（ｉｉｉ）のＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いたＩＣＶ注射後８０日目に、腓腹筋組織は、野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス（ｉ）におけるジストロフィンレベルに匹敵し、非注射ｍｄｘマウス（ｉｖ）におけるジストロフィンレベルよりも著しく高いμＤｙｓのレベルを示した。

【0149】

同様に、図７Ａ（ｉｉ）のヘマトキシリン及びエオシン染色試料に示されるように、９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いたＩＣＶ注射の８０日後、腓腹筋組織は、野生型Ｃ５７／Ｂｌ（図７Ａ（ｉ））及び非注射ｍｄｘマウス対照（図７Ａ（ｉｉｉ））と比較して、正常な組織構造の回復及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーの組織病理学的特徴の補正を示した。図７Ｂ（ｉｉ）に示されるように、９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いたＩＣＶ注射後８０日目に、腓腹筋組織は、野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス（図７Ｂ（ｉ））におけるジストロフィンレベルに匹敵し、非注射ｍｄｘマウス（図７Ａ（ｉｉｉ））におけるジストロフィンレベルよりも著しく高いμＤｙｓのレベルを示した。

【0150】

図８に示されるように、９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いたＩＣＶ注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける腓腹筋（図８Ａ）、三頭筋（図８Ｃ）、前脛骨筋（図８Ｅ）、及び横隔膜（図８Ｆ）の筋組織は、非注射ｍｄｘマウスと比較して平均線維直径の増加を示した。９×１０^１０ｖｇ又は２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を脳室内注射されたｍｄｘマウスはまた、非注射マウスと比較して、腓腹筋（図８Ｂ）、三頭筋（図８Ｄ）、前脛骨筋（図８Ｆ）、及び横隔膜（図８Ｈ）において、注射の８０日後に、より大きな直径（例えば、２５μｍ～６０μｍ）を有する細胞の頻度の増加を示した。

【0151】

同様に、図９Ａに示されるように、腓腹筋組織は、９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２１２－ＡＡＶ９を用いたＩＣＶ注射の８０日後のｍｄｘマウスにおける腓腹筋組織は、より大きな直径（例えば、２５μｍ～６０μｍ）を有する細胞の頻度の同時増加（図９Ｂ）とともに、非注射ｍｄｘマウスと比較して平均線維直径の増加を示した。

【0152】

実施例４：ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９の脳室内送達が、ｍｄｘマウスにおけるμＤｙｓ発現の増加、筋組織学の改善、及び線維化の低減をもたらす。
生後２８日目（ｐ２８）のｍｄｘマウス（注射時にいずれの動物もＰ２７未満ではなく、いずれの動物もＰ３５を超えないように、－１日及び＋７日の時間帯を有する）に、脳室内（ＩＣＶ）注射を介して、以下の治療のうちの１つを投与した：（ｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９（ｎ＝６）、（ｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９（ｎ＝７）、（ｉｉｉ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９（ｎ＝１０）、（ｉｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９（ｎ＝７）、（ｖ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９（ｎ＝８）、又は（ｖｉ）ビヒクル対照（ＴＦＦ製剤緩衝液、ｎ＝１１）。Ｃ５７／ＢＬ１同齢マウスを、野生型（ＷＴ）比較対象（ｎ＝１０）として使用した。

【0153】

組織を、生後約１２０日目に上記に記載されるように解離した。

【0154】

ＩＮＳ１２０１導入遺伝子に特異的なプライマーを使用した液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を介して、２倍体ゲノム当たりのＩＮＳ１２０１コピーを測定した。ＩＮＳ１２０１のＤＮＡコピーが、図１５で提供される。ＲＮＡ転写物コピーが、図１６で提供される。ＴＡ：前脛骨筋、ＥＤＬ：長趾伸筋、ＧＡＳ：腓腹筋、ＤＩＡ：横隔膜。ＲＰＰ３０：リボヌクレアーゼＰ／ＭＲＰサブユニットＰ３０。

【0155】

図１７に示されるように、試験された全ての用量でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を投与されたｍｄｘマウスは、非注射ｍｄｘマウスと比較して、平均ＥＤＬ線維直径の増加を示した。これらの所見と一致して、全ての用量でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を脳室内注射されたｍｄｘマウスはまた、非注射マウスと比較して、ＥＤＬ筋においてより大きな直径（例えば、２５μｍ～６０μｍ）を有する細胞の頻度の増加を示した。

【0156】

図１８に示されるように、試験された４回の最高用量でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を投与されたｍｄｘマウスは、非注射ｍｄｘマウスと比較して、平均ＴＡ線維直径の増加を示した。これらの所見と一致して、試験された４回の最高用量（９×１０^１０ｖｇ、２．７×１０^１１ｖｇ、５．４×１０^１１ｖｇ、１．２×１０^１２ｖｇ）でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を脳室内注射されたｍｄｘマウスは、非注射マウスと比較して、ＴＡ筋においてより大きな直径を有する細胞の頻度の増加を示した。

【0157】

図１９は、様々な用量のＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射後のピクロシリウスレッドで染色された横隔膜筋切片を示す。ピクロシリウスレッドが、コラーゲン含有量を可視化するために使用される。野生型Ｃ５７／Ｂｌマウス及びビヒクルを投与されたｍｄｘマウスから取得された横隔膜切片が、比較のために示される（上部パネル）。図１９の下部パネルに示されるように、試験された５回の用量（９×１０^９ｖｇ、９×１０^１０ｖｇ、２．７×１０^１１ｖｇ、５．４×１０^１１ｖｇ、１．２×１０^１２ｖｇ）でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を投与されたｍｄｘマウスは、コラーゲン含有量によって測定されると、ビヒクルを投与されたｍｄｘマウスと比較して線維化の減少を示した。横隔膜筋におけるコラーゲン率も、図２０で提供される。

【0158】

図２１の上部は、生後２８日目（ｐ２８）での５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射後のｐ１２０にｍｄｘマウスから取得され、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（左端）、ラミニン／ｄａｐｉ（左から２番目）、ジストロフィン（右から２番目）で染色されたＥＤＬ切片、及びマージされた画像（右端）を示す。図２１の下部は、生後２８日目（ｐ２８）でのビヒクル対照を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射後のｐ１２０にｍｄｘマウスから取得され、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）（左端）、ラミニン／ｄａｐｉ（左から２番目）、ジストロフィン（右から２番目）で染色されたＥＤＬ筋切片、及びマージされた画像（右端）を示す。染色は、対照マウスから採取された試料と比較して、ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９で処置されたマウスから取得された試料において、より優れたジストロフィン発現を示す。ＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９処置マウス由来の筋肉も、Ｈ＆Ｅ及びラミニン／ｄａｐｉ染色から明白であるように、より健康に見える。

【0159】

実施例５：ＩＮＳ－１２０１ ＡＡＶ９のＩＣＶ送達が、ｍｄｘマウスにおいて筋肉生理学の改善をもたらす。
生後１日目（ｐ１）のｍｄｘマウスに、脳室内（ＩＣＶ）注射を介して以下の治療のうちの１つを投与した：（ｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ－１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）ビヒクル対照（ＴＦＦ製剤緩衝液）。Ｃ５７／ＢＬ１０同齢マウス（ＷＴ）を比較対象として使用した。

【0160】

生後２８日目（ｐ２８）のｍｄｘマウス（注射時にいずれの動物もＰ２７未満ではなく、いずれの動物もＰ３５を超えないように、－１日及び＋７日の時間帯を有する）に、脳室内（ＩＣＶ）注射を介して、以下の治療のうちの１つを投与した：（ｉ）９×１０^９ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉ）９×１０^１０ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｉｉ）２．７×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｉｖ）５．４×１０^１１ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、（ｖ）１．２×１０^１２ｖｇのＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９、又は（ｖｉ）ビヒクル対照（ＴＦＦ製剤緩衝液）。Ｃ５７／ＢＬ１同齢マウスを、野生型（ＷＴ）比較対象として使用した。

【0161】

動物が１２０～１３５日齢であったときに、筋肉の解離及び準備を上記に記載されるように実行した。

【0162】

筋生理学実験設計
ＥＤＬにおける筋力学
ＥＤＬが、室温でリンゲル溶液（１３７ｍｍのＮａＣｌ、５ｍｍのＫＣｌ、２ｍｍのＣａＣｌ_２、１ｍｍのＭｇＳＯ_４、１ｍｍのＮａＨ_２ＰＯ_４、２４ｍｍのＮａＨＣＯ_３、１０ｍｇ／リットルのクラーレを含む１１ｍｍのグルコース）を含む特殊チャンバー内に搭載される。筋起始が、剛性支柱に縛られ、付着部が、筋肉長の正確な制御を可能にする、デュアルモードエルゴメーター（モデル３００Ｂ、Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）のアームに固定される。

【0163】

筋肉の活性化が、筋肉の長さを延長させる平行白金平板電極を使用した電気刺激装置を介して提供される。最大上刺激条件は、力が実験的試験について水平状態に達した値よりも＋５０％大きい値を使用して、増加する電圧の単一の０．３ミリ秒収縮パルスによって各実験について確立される。力の特性を評価するための最適な筋肉長は、筋肉長を漸進的に増加させながら（弛緩長から１０％増分）一連の収縮を使用して決定され、最大上刺激が最大収縮力を生じさせる長さとして定義される。最適な長さを確立した後、筋線維長（Ｌ_ｆ）が測定され、筋肉が２分間休止される。

【0164】

次いで、筋肉は、収縮特性（収縮張力、半弛緩時間、及びピーク張力までの時間）を評価するために、６０秒間隔（０．３ミリ秒のパルス持続時間）の２回の収縮で刺激される。

【0165】

筋肉は、力－周波数（Ｆ－Ｆ）関係を決定するために、収縮間に１２０秒間隔で増加する周波数（４００ミリ秒のパルス列持続時間及び０．３ミリ秒のパルス持続時間、（ｉ）ＥＤＬ：１Ｈｚ、１０Ｈｚ、３０Ｈｚ、５０Ｈｚ、７０Ｈｚ、１２０Ｈｚ、（ｉｉ）ヒラメ筋：１Ｈｚ、５Ｈｚ、１０Ｈｚ、２０Ｈｚ、４０Ｈｚ、６０Ｈｚ、８０Ｈｚ、及び１００Ｈｚ）において刺激される。

【0166】

Ｆ－Ｆ試験後に、最大収縮力を試験終了時の長さの最大±２０％まで実験的に試験することによって、最適な長さが再検証される。

【0167】

偏心収縮
Ｆ－Ｆ曲線を完成させた後、全ての伸張又は収縮が、２分間隔で実施され、刺激が、等角及び偏心収縮について４００ミリ秒のパルス列持続時間及び０．３ミリ秒のパルス持続時間で１００Ｈｚにおいて実施される。具体的には、Ｆ－Ｆ評価の終了から２分間の休止期間後に、開始筋肉長に戻る前に５００ミリ秒の保留を伴って０．７Ｌｆ／秒で１０％Ｌ_ｆ伸張を２回付与することによって、筋肉の受動的な機械的特性が測定される。次いで、２回の等角収縮が、偏心収縮（ＥＣ）前の最大等角力の測定として取得される。

【0168】

次いで、各筋肉は、１０回の収縮のＥＣ発作を受け、その間に、筋肉は、最初の２００ミリ秒間等角的に刺激され、その後、１５％Ｌｆ長変化が、２Ｌｆ／秒の速度で付与される。次いで、筋肉は、開始筋肉長に戻る前に、この長さで５００ミリ秒間保持される。１０回のＥＣ収縮後、２回の等角収縮が、ＥＣ後の最大等角力を決定するために取得される。最終的な等角測定の完了時に、２回の追加の受動的伸張が、ＥＣ後の受動的な機械的測定を決定するために取得される。

【0169】

収縮試験後、筋肉が、外腱から切り取られ、乾燥状態でブロットされ、最も近い０．０１ｍｇまで計量される。筋肉の生理学的断面積が、線維長及び筋肉量の関数として計算される。全ての分析について、力が、筋肉の生理学的断面積に対して正規化され、応力として報告される。

【0170】

生後１日目（ｐ１）に試験された全ての用量（９×１０^９ｖｇ、９×１０^１０ｖｇ、２．７×１０^１１ｖｇ）でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９のＩＣＶ注射を受けたｍｄｘマウスは、ビヒクルで処置されたｍｄｘマウスと比較して、ＥＣから生じる収縮力率の減弱した減少を示した（図１０Ａ）。図１０Ｂは同様に、ｐ１に試験された３回の用量（９×１０^９ｖｇ、９×１０^１０ｖｇ、２．７×１０^１１ｖｇ）でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９のＩＣＶ注射を受けたマウスが、ビヒクル処置マウスと比較して、偏心収縮前応力に対する偏心収縮後応力率の増加によって示される、筋生理学の増加を示した。

【0171】

生後２８日目（ｐ２８）に試験された３回の最高用量（２．７×１０^１１ｖｇ、５．４×１０^１１ｖｇ、１．２×１０^１２ｖｇ）でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９のＩＣＶ注射を受けたｍｄｘマウスは、ビヒクルで処置されたｍｄｘマウスと比較して、ＥＣから生じる収縮力率の減弱した減少を示した（図１０Ｃ、１０Ｄ）。

【0172】

生後２８日目（ｐ２８）に試験された３回の最高用量（２．７×１０^１１ｖｇ、５．４×１０^１１ｖｇ、１．２×１０^１２ｖｇ）でＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９のＩＣＶ注射を受けたｍｄｘマウスは、ビヒクルで処置されたｍｄｘマウスと比較して、様々な周波数における刺激後にピーク筋力の増加によって示される筋機能の改善及び安定化を示した（図１０Ｅ、１０Ｆ）。

【0173】

実施例６：ＡＡＶ９の１回用量髄腔内投与が、骨格筋及び心筋組織への導入遺伝子送達を標的化する
ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰを、高度に特異的な抗ＡＡＶ９ ＥＬＩＳＡを使用して抗ＡＡＶ９抗体についてスクリーニングされたカニクイザルに髄腔内投与した。カニクイザル対象を、単回髄腔内用量を介して２．５×１０^１３ｖｇ、５×１０^１３ｖｇ、又は１×１０^１４ｖｇのＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰで処置し、ＧＦＰ発現を、ＮｏｖａＲｅｄ ＧＦＰ免疫染色及びＶｅｃｔｏｒ（登録商標）ＨＲＰ基質を用いた免疫組織化学分析、ＲＴ－ＰＣＲ、並びにウェスタンブロット分析によって決定した。

【0174】

図１１に示されるように、２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、５×１０^１３ｖｇ（ｖ）、又は１×１０^１４ｖｇ（ｖｉ）でＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰの単回髄腔内用量を受けたカニクイザルは、静脈内投与された５×１０^１３ｖｇ（ｉｉ）又は１×１０^１４ｖｇ（ｉｉｉ）のＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰを受けたカニクイザル対象と比較して、腓腹筋（図１１Ａ）、大腿四頭筋（図１１Ｂ）、三角筋（図１１Ｃ）、三頭筋（図１１Ｄ）、及び二頭筋（図１１Ｅ）の筋組織においてＧＦＰの染色の増加を示した。同様に、２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｉｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、又は１×１０^１４ｖｇ（ｖ）でＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰの単回髄腔内投与を受けたカニクイザルは、静脈内投与された５×１０^１３ｖｇ（ｉ）又は１×１０^１４ｖｇ（ｉｉ）のＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰを受けたカニクイザル対象と比較して、横隔膜（図１１Ｆ）、前脛骨筋（図１１Ｇ）、及び心臓（図１１Ｈ）の筋組織においてＧＦＰの染色の増加を示した。図１１Ａ～Ｅ（ｉ）に示されるように、非注射カニクイザル対象は、ＧＦＰ染色をほとんど又は全く示さなかった。

【0175】

図１１Ｉに示されるように、５×１０^１３ｖｇ（ｉ）、又は１×１０^１４ｖｇ（ｉｉ）でＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰの単回静脈内用量を受けたカニクイザルが、肝組織において高レベルのＧＦＰ染色を示した一方で、２．５×１０^１３ｖｇ（ｉｉｉ）、５×１０^１３ｖｇ（ｉｖ）、又は１×１０^１４ｖｇ（ｖ）でＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰの単回髄腔内用量を受けた対象は、著しく低いＧＦＰ染色を示した。

【0176】

図１２に示されるように、図１１に示されるＧＦＰの免疫組織化学染色は、抗ＧＦＰウェスタンブロットによって検出されるタンパク質レベルに対応した。２．５×１０^１３ｖｇ（図１２Ａ）、５×１０^１３ｖｇ（図１２Ｂ）、又は１×１０^１４ｖｇ（図１２Ｃ）でＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰの単回髄腔内投与を受けたカニクイザルが、二頭筋（１）、三頭筋（２）、三角筋（３）、大腿四頭筋（４）、腓腹筋（５）、前脛骨筋（６）、横隔膜（７）、及び心臓（８）の筋組織においてＧＦＰレベルの増加を示した一方で、非注射対象の二頭筋（図１２Ｄ、１）又は三頭筋（図１２Ｄ、２）ではウエスタンブロットによってＧＦＰタンパク質が検出されなかった。

【0177】

図１３に示されるように、図１１及び１２に示されるＧＦＰタンパク質レベルは、ＧＦＰ ｍＲＮＡレベルに対応し、ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＧＦＰの単回髄腔内用量を受けたカニクイザルは、ＲＴ－ＰＣＲによって分析される、二頭筋（１）、三頭筋（２）、三角筋（３）、前脛骨筋（４）、腓腹筋（５）、大腿四頭筋の外側広筋（６）、横隔膜（７）、及び心臓（８）の筋組織において検出可能なＧＦＰ ｍＲＮＡ発現を示した。最小ＧＦＰ ｍＲＮＡが、肝組織（９）で検出され、ＧＦＰ ｍＲＮＡは、非注射対象から収集された二頭筋（１０）、三頭筋（１１）、三角筋（１２）、及び大腿四頭筋（１３）の筋組織では検出可能ではなかった。

【0178】

実施例７：若年Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける脳室内注射の単回投与後のＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９の毒性及び生体内分布研究
試験システム
・ 種：ハツカネズミ
・ 株：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ
・ 性別：オス
・ 年齢：１日目に約４週齢
・ 体重：年齢に相応する
・ 数：１９２匹（＋６０匹余分）
・ ケージング：ＡＳＣ ＳＯＰに準拠
・ 最小順化：５日

【0179】

種／株、数、性別。研究開始時に約４週齢の最大２５２匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（株番号０００６６４）マウスが、この研究のために入手される。意図された患者集団がオスのみであるため、オスのマウスのみが研究で使用される。

【0180】

開始年齢及び体重範囲。この研究で使用するために選択される動物は、研究の開始時に可能な限り年齢及び体重が均一であろう。動物は、納入時に約３週齢であり、研究の１日目に約４週齢であろう。

【0181】

動物は、種特異的な食事を給餌され、自由に給餌されるであろう。いずれの汚染物質も、この研究の結果を妨げるレベルで食事中に存在しないことが知られている。照射水が、各動物に自由に利用可能であろう。

【0182】

本研究で使用される被験物質及び対照物質が、それぞれ、表２及び表３で提供される。

【表1】

【表2】

【0183】

実験設計
研究設計
本研究は、３つのコホートからなる：コホート１に割り当てられた動物は、注射手技後８５±１０日目に殺処分され、コホート２に割り当てられた動物は、注射手技後４３±７日目に殺処分され、コホート３は、注射手技後２２±３日目に殺処分される。全体的な研究設計が、表４に提示される。余分な動物が投薬され、手技活動（すなわち、注射、拘束、並びに注射及び／又は採血中の取扱）の直接的な結果として生じる研究群動物の任意の予定外の死亡に取って代わるために使用され得る。被験物質投与手技を生き延びないか、死亡するか、又は４日目の前に（注射の３日後に）早期終了を必要とする動物は、交代され得る。これらの動物は、肉眼的剖検を受けない。年齢の包含基準を満たさない動物は、必要に応じて交代され得る。全ての動物の死亡は、注射後の死亡のタイミングにかかわらず報告される。各所与の時点における第１～４群については、５匹の動物が、血液学、血液ｄｄＰＣＲ、及び組織ｄｄＰＣＲに使用され、５匹の動物が、臨床化学及び組織病理学に使用され、５匹の動物が、凝固検査及び組織病理学に使用される（ｎ＝１５／群／時点）。全ての第５群の動物が、血液学、臨床化学、及び凝固のために１２週目に安楽死させられる（各試験についてｎ＝４）。第５群からの５匹の動物が、組織病理学に使用される一方で、残りの動物からの組織は、収集及び保存される。

【表3】

【0184】

コホート１－８５±１０日目の終了。本研究のコホート１については、第１～４群に指定された６０匹の動物が、その群割り当てに基づいて、１日目に脳室内（ＩＣＶ）注射を受ける（表１）。コホート１の追加の１２匹の動物は、注射されない第５群の動物（「ナイーブ／未処置」、表１）の一部である。研究の８５±１０日目に、全ての第１～５群内の動物が殺処分され、血液及び組織試料が表５に記載されるように収集される。

【表4】

【0185】

コホート２－４３±７日目の終了。コホート２については、６０匹の動物が、その群割り当てに基づいて、１日目にＩＣＶ注射を受ける（表１）。研究の４３±７日目に、動物が殺処分され、血液及び組織試料が表６に記載されるように収集される。

【表5】

【0186】

コホート３－２２±３日目の終了。コホート３については、６０匹の動物が、その群割り当てに基づいて、１日目にＩＣＶ注射を受ける（表１）。研究の２２±３日目に、動物が殺処分され、血液及び組織試料が表７に記載されるように収集される。

【表6】

【0187】

群割り当て。動物が、表５、６、及び７によって、順序付けされ、３つの別個のコホートにおける試験群に割り当てられる。１群当たり最大１２匹の余分な動物を含む動物の各コホートが、計量され、体重に従って減少順で１～Ｘの数値ランクを割り当てられる（最も重い動物はランク＝１を割り当てられる）。次いで、動物は、研究設計によって、終了コホートに基づいて各試験群に順次割り当てられる（表５、６、７を参照）。

【0188】

バイアスのための対照。全ての試行は、（ａ）適切な対照群の包含、（ｂ）研究群への動物の無作為化された割り当て、及び（ｃ）群にわたる動物の適切な交互投薬を含む、潜在的な研究バイアスを最小限にするために行われる。

【0189】

被験物質の投与及び研究手順
麻酔及び外科的準備。動物は、吸入麻酔を使用して麻酔される（誘導のための１００％の酸素を含む１～５％のイソフルラン、外科手技中の維持のための１～３％）。代替的に、動物は、腹腔内投与されるケタミン（最大８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（最大１２ｍｇ／ｋｇ）カクテルで麻酔される。

【0190】

被験物質の調製及び送達。全ての被験物質の調製及び投与は、スポンサーが指定した人員によって実施される。１日目に、各コホート（表５～７）について、ビヒクル及び被験物質は、その群割り当てに基づいて、脳室内への定位固定注射を介して全ての動物に投与される。被験物質及び対照物質は、使用の準備ができるまで氷上又は２～８℃で保持される。

【0191】

コホート注射方略。各終了日コホートのための注射は、３～４日間にわたって行われる。各個々の注射日に、約１５～３０匹のマウスが注射される。被験物質用量製剤を考慮すると、各コホートの第１日目に、用量１の全てのマウスの注射が完了し、続いて、時間が許す限り、第１群の動物のサブセットへのビヒクル注射が行われる。各コホートの第２日目に、全ての用量２マウスの注射が完了し、続いて、注射チームに時間が許す限り、動物の第２のサブセットへのビヒクル注射が行われる。各コホートの第３日目に、全ての用量３マウスの注射が完了し、続いて、注射チームに時間が許す限り、動物の第３のサブセットへのビヒクル注射が行われる。全てのビヒクル注射マウスが最初の３日間にわたって注射されているわけではない場合、残りのビヒクル注射は、第４日目に行われる。

【0192】

治療。治療が、表５、６、及び７に従って、側脳室内への治療の直接注射によって動物に投与される。各動物は、投薬群に応じて、単一の外科手技において、１回の片側注射、又は２回の注射（両側／側面当たり１回の注射）のいずれかを受ける。外科手技が、定位固定器具を使用して実施される。注射装置、手術器具、ドレープ、及びガウンが、適切な場合に滅菌されている。以下に記載される手順の修正が、外科医の裁量で実施され得る。単回用量のメロキシカム（１ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ／ＩＭ）及び／又はブプレノルフィン（０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇ ＳＣ）が、頭蓋骨切開前の麻酔の誘導後に手術からの痛みを緩和することに役立つために投与される。動物が麻酔されると、頭蓋上の皮膚が（必要に応じて）削られ、動物が定位固定フレームに搭載され、適宜、耳棒及び切歯棒の使用によって頭部が位置付けられた状態で麻酔のためにノーズコーン上で動物を維持する。無菌技術が、全ての外科手技に使用される。皮膚が、ベタジン溶液、続いて、７０％アルコールワイプ又は同等物で消毒される。

【0193】

約２ｃｍの切開が、頭蓋骨上の正中線に加えられる。電気焼灼が、切開部位からの任意のわずかな出血の止血を達成するために使用され得る。ハミルトン２インチ、２６ゲージ（又はそれより小さい）、１２度ベベルステンレス鋼針を有するハミルトンシリンジが、定位固定装置のＺ軸に取り付けられる。前項に基づく以下の近似定位固定座標が、片側又は両側のいずれかで側脳室を標的とするために使用される。
・ 注射座標：
ｏ 前後（ＡＰ）：－０．５～－０．８ｍｍ
ｏ 内外側（ＭＬ）：＋／－１．０ｍｍ＊
ｏ 片側注射を投与するとき、注射は脳の右側である。両側注射を投与するとき、第１の注射は右側であり、第２の注射は左側である。
ｏ 背腹側（ＤＶ）：－２．５ｍｍ

【0194】

注射の実際の場所は、必要に応じて外科医によって調整され得る。座標が上記に記載されるものと異なる場合、未加工データの外科記録内に記録される。

【0195】

針が所望の場所に来ると、シリンジプランジャーが、ゆっくりと押し下げられて、投薬溶液を頭蓋腔に注射する。注射部位は、注射の品質を確認するために、注射中及び注射直後に監視される。

【0196】

所望の注射体積は、注射部位当たり８μＬである。注射は、側脳室を標的とし、合計１回又は２回の注射を含む。針は、逆流を防止するために、治療を送達した後に約１分間定位置に残される。任意の注射異常（漏出、逆流など）が、注射されている動物の注射用紙上に記述される。注射及び針の除去の完了後、ＶｅｔＢｏｎｄ（商標）外科用接着剤を使用して切開が閉鎖され、縫合糸で補強され得る。動物のリアルタイム状態に基づく外科手技のわずかな変更が行われてもよく、研究プロトコルの逸脱とみなされない。

【0197】

術後のケア。外科手技後に、動物は、回復を通して熱支持体上で維持され、必要に応じて交互に横向きに寝た状態で配置される。マウスに、滅菌生理食塩水が皮下投与される（約０．５～１ｍＬ）。動物はまた、その外科的回復中に補足飼料としてケージ床上でその飼料及びＤｉｅｔ－Ｇｅｌを提供され得る。
生存中の観察及び測定

【0198】

日常的な全般的健康観察。動物が、飼育スタッフによって、順化期間中の全身外観、行動、及び疾病の兆候の変化について観察され、記録が、施設記録の一部としてファイルに保持される。毎日の観察が、１日目に開始して、その指定された終了日まで研究の過程の全体を通して記録される。１日目の前に非正常臨床兆候を示す任意の動物が、研究から除外される。

【0199】

研究前臨床観察 全ての動物が、１日目の前に臨床兆候について詳細な検査を受ける。健康不良、ストレス、又は他の異常を示す臨床兆候が注目され、動物は、研究責任者／担当獣医及びスポンサー代表の裁量で研究から除外され得る。

【0200】

臨床観察。全ての研究動物は、予定された終了まで、術後６～１０日間、次いで、その後週に１回、体重と併せて詳細な臨床観察を受ける。予定された観察外で注目された観察は、予定外として入力される。評価には、自発運動、神経学的観察、姿勢、呼吸、水分補給状態、外科手術部位、常同行動、膀胱及び腸（便）観察、並びに全体的身体状態の評価が含まれるが、これらに限定されない。

【0201】

予定された臨床観察中の所見の非存在又は存在が記録される。健康不良、ストレス、及び疼痛を示す臨床兆候が注目され、担当獣医に報告される。最終的な詳細な検査が、切迫安楽死させた任意の動物について担当獣医によって行われる。

【0202】

体重。個々の体重が、動物の到着の直後に初期群割り当てのために記録される。ベースライン体重が、投薬前４日以内に得られる。体重が、予定された終了まで週に１回実施され（臨床観察と同時に起こる）、最終的な体重が、予定された終了前に測定される。研究責任者の裁量により、有害な健康又は体重減少の兆候（すなわち、前週の体重の１０％以上）が観察される場合、体重は、より頻繁に測定され得る。

【0203】

予定された犠牲。その予定された終了日、研究の２２±３日目、４３±７日目、８５±１０日目まで生存する動物が、人道的に安楽死させられ、剖検され、血液及び組織試料が、以下に記載されるように収集される。動物は、ＡＶＭＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ：２０２０ Ｅｄｉｔｉｏｎに従って安楽死させられる。

【0204】

試料／検体収集
採血。剖検前に、動物は、麻酔ボックスに移され、血液学及び液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）、血清化学、並びに凝固のための採血のために、イソフルラン（１～２％）を使用して麻酔され得る。適切な量の全血が、心臓穿刺又は他の適切な血管を介して、各動物から２５ｇ針及び１ｃｃシリンジ、又は類似物を使用して収集される。血液試料が、その予定された終了日に全ての研究動物から収集される。血液が、ＡＳＣ ＳＯＰによって処理され、分析のためにＱＶＬに送られる。

【0205】

血液学及びｄｄＰＣＲのための試料
血液学については、約２５０～５００μＬの全血が、抗凝固剤としてＫ_２ＥＤＴＡを含むバイアルに入れられ、混合するために数回穏やかに反転され、２℃～８℃を維持するように設定された冷蔵庫内で保管するまで湿潤氷上に置かれる。

【0206】

血液学
収集量：約２５０～５００μＬ
抗凝固剤：Ｋ_２ＥＤＴＡ

【0207】

分析される血液学パラメータが、表８で提供される。

【表7】

【0208】

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）による生体内分布。加えて、約２５０～５００μＬの全血が、ｄｄＰＣＲ分析による生体内分布のために収集される。全血が、抗凝固剤としてのＫ２ＥＤＴＡに入れられ、混合するために数回穏やかに反転され、－８０℃±１０℃で保管するまでドライアイス上に置かれる。

【0209】

臨床化学のための試料。臨床化学については、約５００～１０００μＬの全血が、抗凝固剤を含まない管の中に収集され、遠心分離前に室温で少なくとも３０分間凝固させられる。凝固した全血が、４℃の温度において約３０００×ｇで５分間遠心分離されて、血清を生じさせる。血清試料が、遠心分離後に分離され、収集直後にドライアイス上で凍結され、－８０℃±１０℃で凍結して保管される。

【0210】

分析される血清化学パラメータが、表９で提供される。

【表8】

【0211】

凝固のための試料。血漿試料が、遠心分離後に分離され、－１０℃～－３０℃を維持するように設定された冷凍庫内に保管される。

【0212】

凝固。収集量：約３００～８００μＬ、抗凝固剤：３．２％クエン酸ナトリウム、処理：血漿まで。分析されるパラメータ：プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノゲン。

【0213】

肉眼的剖検。剖検は、動物の全般的身体状態及び組織（呼吸器系、心血管系、消化系、及び泌尿生殖器系）の系統的な巨視的外部及び内部検査からなる。これは、全ての予定された犠牲及び予定外の犠牲について実施される。任意の肉眼的病変が、文書記録され、温存される。組織収集についての詳細が、以下に詳細に記載される。訓練を受けた適任の研究人員が、肉眼的剖検及び組織収集を行う。

【0214】

組織収集。終了時に収集され、組織病理学又はｄｄＰＣＲのいずれかによって分析される組織が、表１０に提示される。

【表9】

【0215】

組織収集：組織病理学。組織病理学のための組織が、表２、３、及び４により、その指定された終了日に動物から収集される。肉眼的病変／異常組織を含む、組織病理学のために表６にマークされた全ての組織（眼球を除く）が収集され、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定される。眼球が、Ｄａｖｉｄｓｏｎ溶液中で２４～４８時間固定され、次いで、７０％エタノールに移される。

【0216】

組織が、切り取られ、処理され、パラフィンに包埋され、ミクロトームで切断され、Ｈ＆Ｅで染色され、カバースリップで覆われる。可能な場合、筋肉は、横方向及び縦方向の両方で切片化される。結果として得られるスライドは、顕微鏡によって品質チェックされる。全ての調製されたスライドは、ＡＣＶＰ獣医病理学者によって評価される。表集計された顕微鏡データ及び注目に値する変化の考察からなる、病理報告書草案が発行される。顕微鏡写真が撮影され、注釈を付けられる。

【0217】

ｄｄＰＣＲ分析。表１０に列挙される組織の代表的な試料が、ｄｄＰＣＲ分析のために収集され、保持される。１つの大きな部分として収集された検体が、管に入れられ、液体窒素中で急速凍結され、－６０℃～８０℃を維持するように設定された冷凍庫に入れられるまで、ドライアイスを含む冷却器に入れられる。

【0218】

実施例８：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における髄腔内送達後のＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９の生体内分布
試験システム
・ 属：マカク属
・ 種：カニクイザル
・ 性別：オス
・ 体重：約２～５ｋｇ

【0219】

末梢及び骨格筋におけるＩＮＳ１２０１－ＡＡＶ９生体内分布が、髄腔内投与に応答して測定される。

【0220】

全ての注射が、脊髄の腰椎腔内へ髄腔内に実施される。合計１２匹の動物が、表１１で提供されるように使用される。

【表10】

【0221】

研究のために選択される動物は、体重が約３ｋｇである２ヶ月～５歳の若年又は成体サルである。動物は、事前にスクリーニングされ、ＡＡＶ９抗体について陰性である。スクリーニング前の採血が、注射手技前２ヶ月以内に行われる。スクリーニングのための動物が鎮静状態にされ、血液試料が収集される。

【0222】

選択された動物が、注入の数週間前に病院エリアに運ばれる。注入日（ｄ０）に、対象が鎮静状態にされ、血液試料が化学分析及び細胞血球計数（ＣＢＣ）のために収集される。次いで、対象は、上記の投薬表に従って単回用量のＩＮＳ１２０１－－ＡＡＶ９を注射される。９ヵ月未満の全ての動物は、堰堤を用いて収容される。９ヶ月を超える動物は、小さい群で収容される。

【0223】

注射は、腰部鞘嚢のくも膜下腔内への腰椎穿刺によって実施される。髄腔内（ＩＴ）注射については、対象が側臥位に配置され、約Ｌ４／５レベルにおける（脊髄の円錐の下方の）後正中線注射部位が識別される。滅菌条件下では、スタイレットを有する脊髄針が挿入され、針からの明瞭なＣＳＦの流れ、並びに少量のイオヘキソールの注射、続いて、手技中脊髄造影法により、くも膜下挿管が確認される。約１ｍｌのＣＳＦが、ベースライン試料として排出され、収集され、凍結される。これは、後続の被験物質の注射によって生成される圧力の増加を軽減するものである。被験物質の吻側流分布を改善するために、次いで、対象は、トレンデンベルグ位（軽く頭部を下げた位置）で傾転される。これは、ヒト対象においてＣＴ骨髄造影を実施するときの日常的な手順である。ＣＳＦタップ／ＩＴ注入については、皮下注射針（２２Ｇ ３／４又は１ １／２”）も、この目的のために使用することができる。

【0224】

生存中の観察：処置されたＮＨＰは、交絡毒性源への曝露を低減するために孤立状態で保たれる。対象は、獣医スタッフによって、活動、相対的な皮膚の色、及び全般的健康について、１日２回観察される。動物は、注射後約２１日間保持される。生体内分布及び臨床化学検査が、安楽死時に収集された試料に実施される。

【0225】

以下のセグメントが、生体内分布研究のために脊髄から収集される：頸髄、胸髄、腰髄、仙髄、後根神経節（ＤＲＧ）根頸部レベル、ＤＲＧ根胸部レベル、ＤＲＧ根腰部レベル。各脊髄セグメントについて、合計２つの断片が収集される。１つの断片が４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で保管され、１つが瞬間凍結される。

【0226】

筋肉及び器官については、各々の４つの試料が収集される。２つが４％ＰＦＡに入れられ、２つが瞬間凍結される。以下の筋肉の試料が収集される：横隔膜、肋間筋及び神経を含む第６／第７肋骨、腰筋、三角筋、大胸筋、上腕二頭筋、上腕三頭筋、大腿直筋、内側広筋、外側広筋、腓腹筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、舌、咬筋、指伸筋、腹直筋。以下の器官の試料が収集される：心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓。

【0227】

臨床化学検査は、以下の通りである：ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、Ａｌｋ Ｐｈｏｓ、カリウム、ナトリウム、塩化物、クレアチニン、血中尿素窒素、ＣＢＣ。

【0228】

脳試料が、以下のように収集される。小脳が、脳の残りの部分から分離される。小脳が４つの四分円に切断され、右の２つの四分円が４％ＰＦＡ中に保管され、左の２つの四分円が瞬間凍結される。脳が、右半球及び左半球に分割される。次いで、脳が４つの四分円に切断され（冠状切断）、右の２つの四分円が４％ＰＦＡ中に保管され、左の２つの四分円が瞬間凍結される。

【0229】

６つの試料が、後続の筋肉生検のために大腿四頭筋から採取される。３つが４％ＰＦＡ中に保管され、３つが瞬間冷凍される。

【0230】

脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血清も、生体内分布研究のために収集される。

【0231】

生体内分布研究が、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によって前述の試料に実行される。

【0232】

参照による組み込み
本明細書で言及される特許文献及び科学論文の各々の開示全体は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。

【0233】

同等物
本発明は、その趣旨又は本質的な特性から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定するのではなく、あらゆる点に関して例証的とみなされるものである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の同等性の意味及び範囲内にある全ての変更は、その中に包含されることを意図している。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図11I】

【図12A-B】

【図12C-D】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

2024527742000001.xml

【国際調査報告】